ES2287277T3

ES2287277T3 - Variantes de proteasas alcalinas y agentes de lavado y de limpieza que contienen estas variantes de proteasas alcalinas.

Info

Publication number: ES2287277T3
Application number: ES02730196T
Authority: ES
Inventors: Beatrix Kottwitz; Karl-Heinz Maurer; Roland Breves
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2001-05-02
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2022-04-24
Also published as: JP2004534528A; JP4444566B2; EP1385943A2; DE50210382D1; HUP0304049A3; EP1385943B1; DE10121463A1; AU2002302564A1; HU229959B1; ATE365795T1; DK1385943T3; CN1505679A; WO2002088340A2; WO2002088340A3; HUP0304049A2; US20050026269A1

Abstract

Proteasa alcalina, del tipo subtilisina, caracterizada porque presenta isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211, según la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483 y, además, presenta uno de los aminoácidos correspondientes a la treonina, en la posición 3, o a la isoleucina, en la posición 4.

Description

Variantes de proteasas alcalinas y agentes de lavado y de limpieza que contienen estas variantes de proteasas alcalinas.

La presente invención se refiere a nuevas variantes de proteasas alcalinas, que se derivan de proteasas de subtilisina naturales o modificadas. Éstas presentan las dos posiciones de aminoácidos 199I y 211G frente a las subtilisinas conocidas hasta ahora, en la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus y, al menos, una modificación que contribuye a una estabilización de la molécula, en concreto tras la mutación puntual, los aminoácidos correspondientes a la treonina en la posición 3 y/o a la isoleucina en la posición 4. Es especialmente preferente la variante de la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G procedente de B. lentus. Estas variantes se caracterizan, frente a otras variantes de proteasa por una mejor contribución al rendimiento del lavado en los agentes de lavado y de limpieza. Por lo tanto, la presente invención se refiere, además de a estas enzimas, a sus posibilidades de aplicación en diversos procesos industriales y, especialmente, en agentes de lavado y de limpieza con estas nuevas variantes de proteasas
alcalinas.

Las proteasas del tipo subtilisina (subtilasas, subtilopeptidasas, EC 3.4. 21. 62) se asocian a las proteasas de serina debido a los aminoácidos con actividad catalítica. Éstas se forman y se secretan de manera natural por microorganismos, especialmente por especies de Bacillus. Éstas actúan como endopeptidasas no específicas, es decir que hidrolizan cualquier enlace de amida de ácido, que se encuentre en el interior de péptidos o de proteínas. Su óptimo al pH se encuentra en la mayoría de los casos en la región claramente alcalina. Una recopilación sobre esta familia se encuentra, por ejemplo, en el artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", publicado por R. Bott y C. Betzel, New York, 1998. Las subtilisinas son adecuadas para una pluralidad de posibilidades de aplicación industrial, especialmente como componentes activos para los agentes de lavado o de limpieza.

Desde hace décadas se emplean ya las proteasas como componentes activos en los agentes de lavado y de limpieza, además de enzimas tales como por ejemplo las amilasas, las lipasas o las celulasas. Éstas disponen de una capacidad de degradación de impurezas que contienen proteínas sobre los objetos a ser limpiados, tales como, por ejemplo, artículos textiles o la vajilla.

Los productos de hidrólisis son arrastrados por flotación con el baño de lavado debido a su elevada solubilidad o son atacados, disueltos, emulsionados o suspendidos por los restantes componentes de los agentes de lavado o de limpieza. Por lo tanto, pueden presentarse efectos sinérgicos entre los enzimas y los restantes componentes de los agentes de lavado y de limpieza correspondientes.

Las subtilisinas adquieren una posición preponderante entre las proteasas para los agentes de lavado y de limpieza debido a sus propiedades enzimáticas favorables tales como la estabilidad o el óptimo al pH. A continuación se enumerarán las proteasas de subtilisina más importantes, empleadas actualmente en los agentes de lavado, que están constituidas, en parte, por moléculas naturales, en parte por variantes, que se derivan por mutagénesis de estos enzimas naturales.

La subtilisina BPN', que procede de Bacillus amyloliquefaciens, o bien de B. subtilis, se conoce por los trabajos de Vasantha et al. (1984) en J. Bacteriol. Volume 159, páginas 811-819 y de J. A. Wells et al. (1983) en Nucleic Acids Research, Volume 11, páginas 7911-7925. En las solicitudes de patente WO 95/07991 y WO 95/30010 se presentan variantes de este enzima, obtenidas mediante mutaciones puntuales en las regiones del bucle, con un enlace disminuido sobre el substrato, simultáneamente con una elevada velocidad de hidrólisis. En la solicitud de patente WO 95/29979 se divulgan, por ejemplo, agentes de lavado con dichas variantes de la BPN'.

En las regiones del bucle no se encuentran dos de las posiciones de aminoácidos consideradas en la presente solicitud de patente, concretamente las posiciones 3 y 4; los restos 199 y 211 son homólogos en las posiciones 205, respectivamente 217 de la BPN', que se encuentran en el 6º bucle de la molécula, como se ha descrito, por ejemplo, en las solicitudes citadas. Éste participa en el enlace con el substrato. En la posición 205 se encuentra naturalmente una isoleucina (I) en la BPN'. En la solicitud WO 95/07991 se han propuesto numerosos aminoácidos posibles, con los que puede intercambiarse la tirosina (Y), que se encuentra, de manera natural, en la posición 217, sin embargo no se reivindica en combinación con mutaciones estabilizantes de la molécula; en el caso que se reivindique una variante 217G, esto se ha hecho únicamente en relación con otras mutaciones puntuales, catalíticamente compensadoras en este bucle de enlace con el substrato. La única variante realmente divulgada (página 14) con intercambios en las posiciones 205 y/o 217 son aquellas en las que ambos restos han sido intercambiados por aminoácidos voluminosos, incluso alifáticos en la mayoría de los casos. Lo mismo ocurre con la solicitud WO 95/29979. Las subtilisinas de la solicitud WO 95/30010 presentan, cuando tienen una mutación en el 6º bucle, al menos también otra mutación en otro bucle. Como variantes 217G se han divulgado, por ejemplo la Y217G/S188D o aquellas con un número mayor de intercambios en otro bucle diferente del 6º, cuyos aminoácidos homólogos permanecen inalterados en las variantes según la invención.

La subtilisina BPN' sirve como enzima de referencia de las subtilisinas, especialmente en lo que se refiere a la enumeración de las posiciones. De este modo se indicarán, por ejemplo, también las mutaciones puntuales relacionadas con todas las subtilisinas de la solicitud EP 130756 en la enumeración de la BPN'. Entre éstas se encuentra también la posición 217, que corresponde a la posición 211 en el enzima según la invención. Otras posiciones relevantes no han sido preestablecidas por esta descripción.

La proteasa subtilisina de Calrsberg ha sido presentada en las publicaciones de E. L. Smith et al. de 1968 en J. Biol. Chem., Volume 243, páginas 2184-2191 y de Jacobs et al. (1985), Nucl. Acids Res., tomo 13, páginas 8913-8926. Ésta se forma de manera natural por Bacillus licheniformis y puede adquirirse bajo la marca registrada Alcalase® de la firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca. Se conocen, por ejemplo, por la solicitud WO 96/28566 las variantes de la misma, obtenidas mediante mutaciones puntuales, con enlace disminuido sobre el substrato, simultáneamente con velocidad de hidrólisis acrecentada. En este caso se trata de variantes, como en el caso de las solicitudes anteriormente consideradas de la BPN', en las que se han realizado intercambios simples o múltiples en las regiones del bucle de la molécula; en dicha publicación no ha sido descrita una variante 204I/216G (en la enumeración de
Carlsberg).

La proteasa PB92 es producida, de manera natural, por la bacteria alcalífila Bacillus nov. spec. 92 y puede adquirirse bajo la marca registrada Maxacal® de la firma Gist-Brocades, Delft, Países Bajos. Ésta se describe, en su secuencia original, en la solicitud de patente EP 283075. En las solicitudes WO 94/02618 y EP 328229 se divulgan variantes de este enzima, obtenidas por mutación puntual, que son adecuadas para su empleo en agentes de lavado y de limpieza. Entre las primeras, únicamente la variante L211G/N212D tiene un intercambio idéntico al de las variantes aquí reivindicadas; en las segundas no se encuentra ninguna variante relevante.

Las subtilisinas 147 y 309 se comercializan bajo las marcas registradas Esperase®, o bien Savinase® de la firma Novozymes. Éstas proceden de cepas de Bacillus clausii, que han sido divulgadas en la solicitud GB 1243784. Se divulgan, por ejemplo, en las solicitudes WO 89/06279, WO 95/30011, WO 99/27082 y WO 00/37599 variantes de estos enzimas, desarrolladas por medio de mutagénesis puntual desde punto de vista de su aplicación en los agentes de lavado y de limpieza.

La solicitud WO 89/06279 trataba de conseguir una mayor estabilidad de las proteasas frente a la oxidación, mayores velocidades de proteólisis y mejores rendimientos de lavado. De esta publicación se desprende (página 14) que únicamente los intercambios en determinadas posiciones modificarían las propiedades físicas o químicas de las moléculas de subtilisina 147 o 309; entre éstas no se han citado las posiciones 3, 4 o 211. En la solicitud WO 95/30011 se han propuesto variantes de la subtilisina 309, que presentan mutaciones puntuales en las regiones del bucle de la molécula y, por lo tanto, presentan una absorción disminuida sobre el substrato simultáneamente con una mayor velocidad de hidrólisis; entre éstas no se encuentran mutaciones en las posiciones 3 o 4; la única mutación puntual, realmente coincidente con las variantes de la presente solicitud, es el intercambio L211G, que, sin embargo, no se correlaciona en modo alguno con un intercambio V199I. En la solicitud WO 99/27082 se desarrollan variantes tomándose como ejemplo la subtilisina 309, cuyo rendimiento del lavado se mejora por acrecentamiento de los bucles activos mediante inserción de más de un aminoácido. Por lo tanto, no se trata de substituciones como es el caso en la presente
solicitud.

Otras proteasas estabilizadas para la utilización en los agentes de lavado y de limpieza son, por ejemplo:

\bullet: la proteasa 164-A1, que puede obtenerse a partir de Bacillus spec. de las firmas Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, y Vista Chemical Company, Austin, TX, USA (WO 93/07276);

\bullet: la proteasa alcalina procedente de Bacillus sp. PD138 NCIMB 40338 de la firma Novozymes (WO 93/ 18140);

\bullet: la proteinasa K-16 procedente de Bacillus sp. ferm. BP-3376 de la firma Kao Corp., Tokio, Japón, (US 5344770);

\bullet: la subtilisina DY descrita por Nedkov et al. 1985 en Biol. Chem Hoppe-Seyler, tomo 366, páginas 421-430, que ha sido optimizada en la solicitud WO 96/28557 especialmente para su empleo en agentes de lavado y de limpieza y, en concreto, también por medio de mutaciones puntuales específicas en los bucles activos, desde luego sin que se encuentre entre las mismas una variante V204I sola o en combinación con otros intercambios (que corresponde a la posición 199 en el enzima según la invención); y

\bullet: la termitasa formada por Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., FEBS Lett. 1983, páginas 195-200) y optimizada por ejemplo según la solicitud WO 96/28558.

En la publicación citada en último lugar se describe también, entre un gran número de posibles variantes de la termitasa, la que presenta el intercambio L221G (que corresponde a la posición 211 en el enzima según la invención). Puesto que el enzima presenta, de manera natural, isoleucina en la posición 209 (que corresponde a la 199 en el enzima según la invención), han sido descritos con anterioridad, de este modo, dos de los aminoácidos, esenciales según la invención, en las posiciones correspondientes (que corresponden a 199I/L211G), sin embargo sin la característica adicional de que se estabiliza adicionalmente la molécula en presencia de estos dos aminoácidos en estas posiciones. En particular, no se han descrito con anterioridad estabilizaciones realizadas por medio de treonina en la posición 3 y/o por medio de isoleucina en la posición 4 (según la proteasa alcalina de B. lentus). En las posiciones 10 y 11, homólogas con estas dos posiciones de la proteasa alcalina procedente de B. lentus, la termitasa presenta, sin embargo, los aminoácidos formados por serina y arginina (véase la alineación en la publicación WO
91/00345).

Además, la termitasa está constituida por una molécula que presenta, en conjunto, considerables desviaciones secuenciales con relación a las subtilisinas restantes (Meloun et al., página 198). De este modo, la homología entre las proteínas maduras formadas por la termitasa y la proteasa alcalina de B. lentus tiene una identidad del 45% (62% de aminoácidos similares). Algo parecido ocurre con la proteinasa K (WO 96/28556). Cuya homología con respecto a la proteasa alcalina procedente de B. lentus en el plano de las proteínas maduras es, únicamente, de un 33% de identidad (46% de aminoácidos similares).

Otras proteasas han sido descritas, por ejemplo, en las solicitudes EP 199404, EP 251446, WO 91/06637 y WO 95/10591, que han sido denominadas por la firma Procter & Gamble Comp., Cincinnati, OH, USA, como "Protease A", "Protease B", "Protease C", o bien como "Protease D" y que pueden ser empleadas en los agentes de lavado y de limpieza (véase la publicación WO 00/47707, página 73). Las proteasas de la solicitud EP 199404 son diversas variantes, que están basadas en la patente EP 130756, que, sin embargo, no presentan variaciones en las posiciones relevantes para la presente solicitud (véase la publicación EP 199404 A2, columna 20). En el ejemplo 10 de la patente EP 251446 B1 (página 49) se indica que las variantes Y217G son menos estables que el enzima natural y, por lo tanto, no se ha continuado con este intercambio. Las "proteasas C" se caracterizan, según la solicitud WO 91/06637 por mutaciones puntuales en las posiciones 123 y 274. Todas las variantes de la "proteasa D" portan, según la publicación WO 95/10591, mutaciones en la posición 76, que permanece invariable en las proteasas presentes y que es idéntica a la de la BPN'; lo mismo es válido en la solicitud, respectivamente en las patentes WO 95/10615, US 6017871 y US 6066611.

Otras proteasas conocidas son los enzimas, que pueden ser adquiridos bajo las marcas registradas Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase® y Kannase® de la firma Novozymes, bajo las marcas registradas Purafect®, Purafect OxP® y Properase® de la firma Genencor, bajo las marcas registradas Protosol® de la firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien y bajo las marcas registradas Wuxi® de la firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.,
China.

Para mejorar el rendimiento de limpieza de las subtilisinas se ha seguido en un gran número de solicitudes la estrategia de la inserción de aminoácidos adicionales en los bucles activos, por ejemplo también en las solicitudes que han sido publicadas bajo los números WO 00/37599, WO 00/37621 hasta WO00/37627 y WO 00/71683 hasta WO 00/71691, además de las que ya han sido citadas.

Otra estrategia consiste en modificar las cargas superficiales de la molécula. De este modo, se ha propuesto en las solicitudes WO 91/00334, WO 91/00335, WO 91/00345, EP 479870, EP 945502 o EP 563103 un gran número de intercambios de aminoácidos, con los cuales puede aumentarse o disminuirse el punto isoeléctrico de la molécula. La solicitud WO 00/24924 deriva de las mismas un procedimiento para la identificación de las variantes adecuadas correspondientes. Lo mismo es válido con relación a la publicación WO 96/34935, según la cual puede variarse también la hidrofobicidad de la molécula de acuerdo con el mismo principio.

Otra estrategia, para mejorar el rendimiento del lavado de las subtilisinas consiste en introducir, de manera estadística, mutaciones puntuales en moléculas conocidas y en ensayar las variantes obtenidas en cuanto a su contribución al rendimiento del lavado. La patente US 5700676 sigue, por ejemplo, esta estrategia; en esta publicación se describe respectivamente, además de otros muchos intercambios, un intercambio en la posición 217 (en la enumeración de la BPN'), como la única posición que corresponde a la presente invención. Lo mismo sucede también con las patentes US 5310675, US 5801038 US 5955340 y para las solicitudes WO 99/20723 y WO 99/20727. También en la patente US 4760025 se ha propuesto como única mutación, relevante para la presente invención, una mutación en la posición 217 y, concretamente, debido a que con la misma queda afectado el centro activo. En ninguna de estas publicaciones se ha sugerido que los otros intercambios, según la invención, podrían jugar un papel con relación al rendimiento del lavado.

Una orientación moderna del desarrollo de los enzimas consiste en combinar elementos procedentes de proteínas conocidas, emparentadas entre sí, por medio de procedimientos estadísticos para dar nuevos enzimas, que presenten propiedades no alcanzadas hasta ahora. Tales procedimientos quedan abarcados también por el concepto de evolución dirigida -Directed Evolution-. A éstos pertenecen, por ejemplo, los siguientes procedimientos: el método StEP (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., tomo 16, páginas 258-261), Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., tomo 26, páginas 681-683), DNA-Shuffling (Stemmer, W.P.C. (1994), Nature, tomo 370, páginas 389-391) o RACHITT (Coco, W.M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., tomo 19, páginas 354-
359).

Otra estrategia, especialmente complementaria, consiste en aumentar la estabilidad de las proteasas correspondientes y, de este modo, en aumentar su actividad. Una estabilización de este tipo ha sido descrita para proteasas, que se emplean en productos cosméticos, por ejemplo en la publicación US 5230891. Por el contrario, se conocen estabilizaciones mediante mutaciones puntuales para los agentes de lavado y de limpieza. De este modo pueden estabilizarse las proteasas, según las publicaciones US 6087315 y US 6110884, por intercambio de determinados restos de tirosina por otros restos. Otras posibilidades consisten, por ejemplo en:

\bullet: el intercambio de determinados restos de aminoácidos por prolina según la publicación EP 583339;

\bullet: la inserción de grupos polares o cargados sobre la superficie de la molécula según la publicación EP 995801;

\bullet: la modificación del enlace de los iones metálicos, especialmente de los puntos de enlace para el calcio, por ejemplo según las enseñanzas de las solicitudes WO 88/08028 y WO 88/08033;

Otras posibilidades para la estabilización de las subtilisinas, especialmente de aquellas que se derivan de Bacillus lentus, han sido dadas en las patentes US 5340735, US 5500364, US 5985639 y US 6136553.

Las proteasas alcalinas procedentes de B.lentus están constituidas por proteasas de elevada alcalinidad procedentes de Bacillus species. Una de estas cepas ha sido depositada con el número DSM 5483 (publicación WO 91/02792, respectivamente EP 493398 y US 5352604). En las publicaciones WO 92/21760, WO 95/23221 y WO 98/30669 se publican variantes de este enzima que se obtienen mediante mutación puntual, que pueden emplearse en los agentes de lavado y de limpieza.

El enzima natural procede de un productor, que ha sido obtenido originalmente por medio de un cribado para la obtención de cepas de Bacillus alcalifilas, y presenta incluso una estabilidad frente a la oxidación comparativamente elevada y frente el efecto de los detergentes. En las solicitudes WO 91/02792, respectivamente EP 493398 y US 5352604, se describe su expresión heteróloga en el huésped Bacillus licheniformis ATCC 53926. En las reivindicaciones de la patente US citada se citan las posiciones 208, 210, 212, 213 y 268 como características para la proteasa alcalina de B. lentus, sin embargo no se ha indicado ninguna variante con intercambios en las posiciones 61 y
211.

Del mismo modo, la solicitud WO 92/21760 divulga el enzima natural de la proteasa alcalina de B. lentus en la SEQ ID NO:52 en su secuencia de aminoácidos y en la SEQ ID NO:106 en su secuencia de nucleótidos. Además, se divulgan en esta solicitud 51 variantes diferentes, que se diferencian, con respecto al tipo natural, en un gran número de posiciones, encontrándose entre las mismas también la S3T, la V41 y la V199I.

Se deduce de las solicitudes WO 95/23221 y WO 98/30669 el empleo en agentes de lavado y de limpieza de variantes adecuadas de la proteasa alcalina de B. lentus, que coinciden con el enzima según la invención en las posiciones S3T, V41 y V199I. Además, todas ellas tienen dos o tres mutaciones puntuales adicionales con relación al enzima natural procedente de B. lentus DSM 5483. En parte portan una mutación adicional en la posición 211, concretamente la 211 D (variantes F49, F54 y F55); por lo tanto se reivindican en esta solicitud los intercambios 211 D y
211 E.

Tal como han demostrado todos estos trabajos, que se han desarrollado durante un prolongado período de tiempo, existe una gran necesidad de proteasas alternativas para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza. Las publicaciones más recientes, tales como por ejemplo las WO 00/71683 hasta WO 00/71691 demuestran que existe todavía la necesidad de efectuar una optimación en lo que se refiere a sus posibilidades de aplicación en los agentes de lavado y de limpieza incluso para la familia de las proteasas de subtilisina establecidas desde hace mucho tiempo. Esto está relacionado con un gran número de trabajos relativos a la variación en la secuencia de aminoácidos de los enzimas correspondientes. Desde luego no puede deducirse, sin más, el comportamiento de estos enzimas en el contexto de una receta para agentes de lavado o de limpieza a partir de las propiedades enzimáticas posiblemente calculables (véanse las publicaciones US 5801039, US 5985639 y US 6136553). En este caso juegan un papel otros factores tales como la estabilidad frente a los agentes oxidantes, la desnaturalización provocada por los tensioactivos, los efectos de pliegue o las sinergias deseadas con otros componentes.

La tarea, en la que está basada la presente invención, consistía en encontrar subtilisinas que mostrasen rendimientos mejorados en las aplicaciones industriales. Especialmente deberían encontrarse aquellas que mejorasen el rendimiento del lavado y respectivamente de la limpieza de los agentes de lavado y/o de limpieza.

Una tarea parcial consistía en mejorar las proteasas no solamente desde el punto de vista de su actividad a la hidrólisis sino también en su obtención estable en las recetas correspondientes para agentes de lavado y de limpieza.

La presente solicitud de patente ha seguido, con relación a este problema, la estrategia de mejorar adicionalmente la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483 especialmente con respecto a las moléculas divulgadas en las solicitudes WO 91/02792, WO 92/21760 y WO 95/23221, para el empleo en los agentes de lavado y de
limpieza.

Sorprendentemente, se ha encontrado que los aminoácidos que constituyen la isoleucina y la glicina en las posiciones 199 y 211 proporcionan una elevada contribución al rendimiento del lavado y éste se refuerza por los aminoácidos constituidos por la treonina y por la isoleucina en las posiciones 3 y respectivamente 4 probablemente por medio de un efecto de estabilidad.

Según la invención, se resuelve esta tarea mediante proteasas alcalinas del tipo subtilisina, caracterizadas porque presentan isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211 de acuerdo con la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483 y, adicionalmente, presentan uno o ambos de los aminoácidos treonina en la posición 3 e isoleucina en la posición 4.

Igualmente se resuelve por medio de variantes de la subtilisina, caracterizadas porque presentan treonina en la posición 3, isoleucina en la posición 4, isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211 de acuerdo con la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483.

Especialmente se resuelve por medio de las correspondientes proteasas alcalinas del tipo subtilisina, caracterizadas porque se forman de manera natural por un Bacillus o pueden derivarse de una subtilisina de este tipo, especialmente de Bacillus lentus.

De manera muy especialmente preferente se resolverá por medio de las proteasas alcalinas, que se forman, de manera natural, por Bacillus lentus DSM 5483 o que pueden derivarse de tales proteasas alcalinas y entre éstas, especialmente, la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus según la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 (variante según la invención).

La variante de la proteasa alcalina M131 de B. lentus, con los intercambios caracterizantes, S3T/V4I/A188P/
V193M/V199I, debe ser considerada como la variante de la publicación WO 92/21760, que presenta la máxima coincidencia con respecto a la variante, según la invención, de la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus. Ésta coincide en tres posiciones con la variante según la invención. La diferencia está constituida por ambos intercambios A188P y V193M, en cuyos puntos son idénticas la variante según la invención y la variante natural. Tal como puede verse por ejemplo por la solicitud WO 95/30011, el aminoácido 193 de la subtilisina de B. lentus se encuentra al principio del 6º bucle, mientras que el aminoácido 188 no está asociado con un bucle, sino que está asociado con la región compacta de la proteína, situada entremedias. Por lo tanto ambas mutaciones se encuentran en regiones estructuralmente diferentes de la molécula. Con la presente invención se encontró, sorprendentemente, que una inversión de ambas posiciones 188 y 193 con respecto a los aminoácidos del tipo natural y que una mutación adicional en la posición 211, es decir en la región situada por detrás del 6º bucle, se produce un enzima que sobrepasa a los enzimas conocidos hasta el presente, especialmente a las variantes conocidas hasta ahora de la proteasa alcalina de B. lentus en cuanto a su rendimiento del lavado y respectivamente de
limpieza.

El enzima especialmente preferente, según la invención, se diferencia de las variantes de las solicitudes WO 95/23221 y WO 98/30669 en que están invertidas varias posiciones, es decir que son idénticas a las del tipo natural y se encuentra en la posición 211 el aminoácido constituido por la glicina, que no es voluminoso y que no está cargado, en lugar de la leucina del tipo natural o del aspartato de las variantes citadas.

Desde el punto de vista enzimológico es sorprende que el efecto del rendimiento mejorado en el lavado y respectivamente en la limpieza se consiga por medio de un intercambio de un aminoácido, que participa, probablemente, en el enlace con el substrato y/o en la catálisis de la reacción y, concretamente, mediante la substitución de la cadena lateral hidrófoba, voluminosa, de la leucina por la cadena lateral de una glicina, reducida a un protón. Simultáneamente, no era necesario invertir en este caso la segunda posición del 6º bucle, mutada con respecto al tipo natural, concretamente la 199, de la isoleucina por la valina del tipo natural. En comparación con las solicitudes WO 95/23221 o WO 98/30669, la mutagénesis puntual para dar un grupo ácido, es decir L211D o L211E, hubiese sido más evidente que la inversión para dar la secuencia del tipo natural en otras posiciones mutadas. Las publicaciones citadas al principio, relativas a la variación del bucle activo de las diversas subtilisinas, especialmente la WO 95/30011, habrían sugerido en el caso de la variación de la posición 211 una modificación adicional en otro bucle activo, o una modificación drástica dentro del mismo bucle, tal como por ejemplo la V199S/L211D, la P204E/L211G o la G196S/L211G, para compensar la modificación desde el punto de vista catalítico pero, en ningún modo, han sugerido la retención del intercambio V199I.

Desde el punto de vista de la aplicación industrial, especialmente en los agentes de lavado y de limpieza, es sorprendente que esto conduzca a una mejora del rendimiento, especialmente a una mejora de la contribución de tales enzimas al rendimiento en el lavado y en la limpieza sobre las suciedades más diversas. El gran éxito del empleo de la subtilisina según la invención, en las correspondientes recetas de los agentes de lavado o bien de limpieza (véanse los ejemplos 2 a 5) permite suponer que también es suficientemente elevada la estabilidad de las variantes correspondientes como para mantener activo el enzima durante un período de tiempo suficientemente prolongado y, por lo tanto, ha contribuido a mejorar el rendimiento.

Un objeto de la presente invención consiste en una proteasa alcalina del tipo subtilisina, caracterizada porque presenta isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211, según la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483 y, adicionalmente, presenta uno de los aminoácidos constituidos por la treonina en la posición 3, o por la isoleucina en la posición 4.

Otras formas de realización del objeto de la invención son proteasas alcalinas del tipo subtilisina, caracterizadas porque presentan treonina en la posición 3, isoleucina en la posición 4, isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211, de acuerdo con la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483; porque son subtilisinas, que se forman de manera natural por un Bacillus, especialmente de Bacillus lentus, o que se derivan de un Bacillus de este tipo; porque son subtilisinas formadas de manera natural por Bacillus lentus DSM 5483 o que se derivan del mismo, especialmente la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus según la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 (variante según la invención).

Otras formas de realización del objeto de la invención son las proteasas alcalinas, derivadas de las correspondientes proteasas alcalinas del tipo subtilisina, especialmente mediante fermentación o mediante mutagénesis por deleción, mediante mutagénesis por inserción, mediante mutagénesis por substitución o mediante fusión de una parte, al menos, con, al menos, otra proteína; aquellas, que están caracterizadas, además, porque están derivatizadas adicionalmente, porque presentan una actividad proteolítica, preferentemente una actividad proteolítica acrecentada frente a la molécula de partida, o bien frente a la molécula no derivatizada, y de manera muy especialmente preferente presentan un rendimiento mejorado; y/o porque están estabilizadas adicionalmente.

Otro objeto de la invención está constituido por los ácidos nucleicos, que codifican las proteasas alcalinas citadas en el primer objeto de la invención, especialmente los ácidos nucleicos que codifican proteasas de subtilisina, cuya secuencia de nucleótidos coincide con la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 3, especialmente en las regiones que codifican la 199 isoleucina y la 211 glicina y, de manera muy especialmente preferente, en las regiones que codifican la 3 treonina, la 4 isoleucina, la 199 isoleucina y la 211 glicina.

Otro objeto de la invención está constituido por vectores, que contienen una región de los ácidos nucleicos anteriormente indicada y que contienen, especialmente, una región de los ácidos nucleicos que codifica una de las proteasas indicadas en el primer objeto de la invención o derivados de la misma. En las formas preferentes de realización, éstos son vectores de clonación, que contienen una región de ácidos los nucleicos citada precedentemente y, especialmente, que contienen una región de los ácidos nucleicos que codifica una de las proteasas, citadas en el primer objeto de la invención, o sus derivados; o están constituidos por vectores de expresión, que contienen una región de los ácidos nucleicos citada precedentemente y, especialmente, que contienen una región de los ácidos nucleicos, que codifique una de las proteasas, citadas en el primer objeto de la invención, o sus derivados y que posibilita su
biosíntesis.

Otro objeto de la invención consiste en células, que contienen un vector según el objeto de la invención citado precedentemente; que expresen, preferentemente, una de las proteasas citadas en el primer objeto de la invención, o sus derivados o que puedan estimularse para producir esta expresión, especialmente con empleo de un vector de expresión citado precedentemente; caracterizadas preferentemente porque son bacterias, especialmente aquellas que secretan al medio circundante la proteína formada; caracterizadas, preferentemente, porque son bacterias del género Bacillus, especialmente de las especies Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus; o caracterizadas porque son células eucariotas, especialmente aquellas que modifican post-traducción a la proteína formada.

Otro objeto de la invención consiste en procedimientos para la obtención de un enzima proteolítico o un derivado del mismo según el primer objeto de la invención con empleo de una célula huésped, anteriormente citada y/o con empleo de un vector anteriormente citado y/o con empleo de un ácido nucleico anteriormente citado.

Otro objeto de la invención consiste en agentes caracterizados porque contienen enzimas proteolíticos según el primer objeto de la invención, especialmente agentes de lavado o de limpieza, de forma muy especialmente preferente en una cantidad desde 2 \mug hasta 20 mg por g del agente; preferentemente aquellos caracterizados porque contienen, adicionalmente, otros enzimas, especialmente otras proteasas, amilasas, celulasas, hemicelulasas y/o
lipasas.

Otro objeto de la invención está constituido por agentes para el tratamiento de materias primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, caracterizados porque contienen solo, o junto con otros componentes activos, un enzima proteolítico según el primer objeto de la invención, especialmente para fibras o para artículos textiles con componentes naturales y, de forma muy especialmente preferente, con lana o seda.

Otro objeto de la invención está constituido por procedimientos para la limpieza mecánica de los artículos textiles o de las superficies duras, caracterizados porque se activa, al menos en una de las etapas del procedimiento, un enzima proteolítico según el primer objeto de la invención, preferentemente en una cantidad desde 40 \mug hasta 4 g, de forma especialmente preferente desde 400 \mug hasta 400 mg por aplicación.

Otro objeto de la invención está constituido por procedimientos para el tratamiento de materias primas para los artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, caracterizados porque se activa en, al menos, una de las etapas del procedimiento, un enzima proteolítico según el primer objeto de la invención, especialmente para materias primas para los artículos textiles o para artículos textiles con componentes naturales, especialmente para aquellos con lana o seda.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para la limpieza de los artículos textiles o de las superficies duras, preferentemente en una cantidad desde 40 \mug hasta 4 g, de forma especialmente preferente desde 400 \mug hasta 400 mg por aplicación.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para la activación o para la desactivación de los componentes de los agentes de lavado o de
limpieza.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para el análisis bioquímico o para la síntesis de compuestos de bajo peso molecular o de
proteínas.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para la preparación, para la purificación o para la síntesis de productos naturales o de materiales biológicos.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para el tratamiento de las materias primas naturales, especialmente para el tratamiento de superficies, de manera muy especialmente preferente en un procedimiento para el tratamiento del cuero.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para la obtención o para el tratamiento de materiales en bruto o de productos semielaborados en la fabricación de artículos textiles, especialmente para la eliminación de capas protectoras sobre los
tejidos.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para el tratamiento de las materias primas los artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, especialmente para el tratamiento de lana o de seda o de los artículos textiles mixtos, que contengan lana o que contengan seda.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para el tratamiento de películas fotográficas, especialmente para la eliminación de las capas protectoras de tipo gelatina o similares.

Otro objeto de la invención está constituido por las aplicaciones de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, para la obtención de artículos comestibles o de piensos para los animales.

Otro objeto de la presente invención está constituido por productos cosméticos con un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, o por procedimientos cosméticos con incorporación de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, o por el empleo de un enzima proteolítico, según el primer objeto de la invención, con fines cosméticos, especialmente en el ámbito de los procedimientos correspondientes o en agentes
correspondientes.

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por proteína un polímero constituido por aminoácidos naturales, formado ampliamente de manera lineal, que adquiere, en la mayoría de los casos, una estructura tridimensional para ejercer su función. En la tabla 1 se han reunido los 19 aminoácidos L proteinógenos, que se presentan de manera natural, junto con los códigos con 1 y 3 letras, con los que se han abreviado en la presente solici-
tud.

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TABLA 1 Los aminoácidos proteinógenos

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1

2

La combinación de una de estas denominaciones con un número designa en la proteína correspondiente, qué resto de aminoácido porta en la posición correspondiente. De este modo, S3 significa, por ejemplo, un resto serina en la posición 3, comenzándose con la enumeración por el extremo N de la proteína correspondiente. Una mutación puntual en este punto, por ejemplo por el aminoácido constituido por la treonina, se abreviará, según esta nomenclatura, con la denominación S3T. Para la designación de variantes con varias mutaciones puntuales se separarán entre sí estos intercambios con barras inclinadas.

La variante S3TN4I se caracteriza, por lo tanto, porque en la misma ha sido intercambiada la serina, inicialmente presente en la posición 3, por una treonina y se ha intercambiado por isoleucina la valina en la posición 4.

Las indicaciones de posición en la presente invención se refieren, en tanto en cuanto no se diga otra cosa, a las correspondientes formas maduras de la proteína correspondiente, es decir sin el péptido de señal (véase más adelante).

En el sentido de la presente invención se entenderá por un enzima, una proteína que ejerce una determinada función bioquímica. A modo de ejemplo, deberán entenderse por enzimas proteolíticas o enzimas con función proteolítica, en general, aquellas que hidrolicen los enlaces de amida de ácido de las proteínas, especialmente aquellas que se encuentran en el interior de la proteína y que pueden llamarse también, por lo tanto, endo-peptidasas. Las proteasas de subtilisina son aquellas endo-peptidasas, que se forman y que son secretadas, en la mayoría de los casos, de manera natural por las bacterias gram-positivas, o que se derivan de las mismas, por ejemplo a través de métodos de la biología molecular y que pueden homologarse a lo largo de regiones parciales, como las regiones estructurantes o portadoras de funciones, con las proteasas naturales de la subtilisina. Éstas se han descrito, por ejemplo, en el artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", publicado por R. Bott y C. Betzel, New York, 1996.

Muchas proteínas se forman como las denominadas preproteínas, es decir junto con un péptido de señal. Bajo este concepto debe entenderse entonces la parte N-terminal de la proteína, cuya función consiste, en la mayoría de los casos, en garantizar la segregación de la proteína formada, a partir de la célula productora, en el periplasma o en el medio circundante y/o en garantizar su plegado correcto. A continuación se recorta de la proteína restante el péptido de señal bajo condiciones naturales por medio de una peptidasa de señal, de tal manera que éste ejerza su actividad catalítica propiamente dicha sin los aminoácidos N-terminales inicialmente presentes. Según la figura 1 de la publicación WO 91/02792, la preproteína de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483 contiene 380 aminoácidos. Por el contrario, la proteína madura tiene únicamente 269; la enumeración comienza por el primer aminoácido de la proteína madura, por lo tanto en este caso con la alanina, que recibiría el número 112 tras la secuencia de la preproteína. Según las SEQ ID NO. 1 y 2, el péptido de señal de la subtilisina procedente de B. licheniformis ATCC 68614 tiene una longitud de 111 aminoácidos y el péptido maduro tiene 269 aminoácidos. En ausencia de esta subdivisión, la proteína completa tiene una longitud de 380 aminoácidos, como puede verse en la SEQ ID NO. 2. Lo mismo sucede en el caso de las SEQ ID NO. 3 y 4 para las formas de realización especialmente preferentes.

Los péptidos maduros son preferentes frente a las preproteínas, para las aplicaciones industriales, debido a su actividad enzimática, es decir los enzimas procesados tras su obtención.

Las pro-proteínas son precursores inactivos de las proteínas. Sus precursores con secuencia de señal se denominan como pre-pro-proteínas.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por ácidos nucleicos las moléculas, que sirven como portadores de información, constituidas, de manera natural, por nucleótidos, que codifican la serie lineal de los aminoácidos en las proteínas o en los enzimas. Éstos pueden presentarse en forma de cadena simple, en forma de una cadena simple complementaria de esta cadena simple o en forma de cadena doble. El ácido nucleico ADN es preferente para los trabajos en biología molecular como el portador de informaciones duradero, de manera natural. Por el contrario, se formará un ARN para la realización de la invención en un ambiente natural, tal como por ejemplo en una célula expresante, por lo cual las moléculas de ARN, esenciales según la invención, representan, igualmente, formas de realización de la presente invención.

También se denominará como gen, en el sentido de la presente solicitud, a la unidad de información de un ácido nucleico, correspondiente a una proteína. En el ADN deben tenerse en consideración las secuencias de ambas cadenas complementarias en cada uno de los tres marcos de lectura posibles. Además, debe tenerse en consideración que diferentes tripletes de codón pueden codificar los mismos aminoácidos de tal manera, que una determinada serie de aminoácidos puede derivarse de varias secuencias de nucleótidos diferentes y que presenten, posiblemente, sólo una pequeña identidad (degenerabilidad del código genético). Además, diversos organismos presentan diferencias en la utilización de este codón. Por estos motivos deben incluirse en la consideración del ámbito de la protección tanto las secuencias de aminoácidos como también las secuencias de nucleótidos y las secuencias dadas de los nucleótidos deben considerarse, respectivamente, sólo como una codificación ejemplificativa de una serie determinada de aminoácidos.

Un técnico en la materia tiene la posibilidad de preparar genes completos, por medio de las secuencias conocidas de ADN y/o de aminoácidos, con ayuda de los métodos actualmente conocidos en general, tales como, por ejemplo, la síntesis química o la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) en combinación con los métodos usuales de la biología molecular y/o de la química de proteínas. Un punto de partida ideal a este respecto lo constituyen las preparaciones de ADN procedente de microorganismos depositados y/o comercialmente adquiribles. Tales métodos son conocidos, por ejemplo, por la publicación "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, tomo 1, páginas 267-271 y tomo 2, páginas 227-229.

Se denominarán mutaciones a las variaciones de la secuencia de nucleótidos, como las que pueden provocarse, por ejemplo, con ayuda de los métodos de la biología molecular en sí conocidos. Según el tipo de la modificación se conocen, por ejemplo, las mutaciones por deleción, por inserción o por substitución o aquellas en las que se fusionan entre sí (shuffling) diversos genes o partes de genes; éstas son mutaciones génicas. Los organismos correspondientes se denominan mutantes. Las proteínas, derivadas de los ácidos nucleicos mutados se denominan variantes. De este modo, por ejemplo, las mutaciones por deleción, por inserción o por substitución o las fusiones conducen a genes mutados por deleción, por inserción, por substitución o a genes de fusión y, en el plano de las proteínas, conducen a las variaciones correspondientes por deleción, por inserción o por substitución, o bien a las proteínas de fusión.

En el sentido de la presente invención se entenderán como vectores aquellos elementos constituidos por ácidos nucleicos, que contengan un gen interesante como región de ácidos nucleicos, caracterizante. Éstos son capaces de establecer al mismo en una especie o en una línea celular a través de varias generaciones o divisiones celulares como elemento genéticamente estable, que se replica independientemente del resto del genoma. Los vectores son plásmidos especiales especialmente para la utilización en bacterias, es decir que son elementos genéticos circulares. En la ingeniería genética se distingue, por un lado, entre aquellos vectores que sirven para el almacenamiento y, por lo tanto, en cierta medida sirven también para el trabajo en ingeniería genética, que se denominan vectores de clonación y, por otro lado, aquellos que cumplen la función de realizar el gen interesante en la célula huésped, es decir que posibilitan la expresión de la proteína correspondiente. Estos vectores se denominan vectores de expresión.

Mediante la homologación, es decir la comparación con enzimas conocidos, como la que se lleva a cabo, por ejemplo, por medio de una alineación, puede deducirse la actividad enzimática de un enzima considerado a partir de la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos. Ésta puede modificarse de manera cualitativa o cuantitativa por medio de otras regiones de la proteína, que no participen en la reacción propiamente dicha. Esto podría corresponder, por ejemplo, a la estabilidad del enzima, a la actividad, a las condiciones de la reacción o a la especificidad del substrato.

Por lo tanto, debe entenderse por el concepto de un enzima proteolítico o de una proteasa, mas allá de las funciones de algunos pocos restos de aminoácidos del centro catalíticamente activo, todas aquellas funciones como las que se producen bajo la acción de toda la proteína restante, o de una parte o de varias partes de la proteína restante, sobre la región catalíticamente activa, propiamente dicha. También se considerarán como actividad proteolítica, en el sentido de la invención, únicamente aquellas funciones modificadoras o actividades parciales, en tanto en cuanto favorezcan una reacción de proteólisis. A tales funciones auxiliares o actividades parciales pertenecen, por ejemplo, el enlace de un substrato, de un producto semielaborado o de un producto final, la activación o la inhibición o la inducción de un efecto regulador sobre la actividad hidrolítica. En este caso puede tratarse, por ejemplo, también de la formación de un elemento estructural que se encuentre alejado del centro activo. La segunda condición previa para que se trate de una proteína según la invención consiste, desde luego, en que se produzca una hidrólisis de los enlaces péptidos mediante el comportamiento químico del resto activo propiamente dicho, solo o además mediante la acción de la parte modificadora. Además, es posible modificar también de manera cualitativa o cuantitativa las actividades de otras proteasas por medio de una o varias partes, por ejemplo de la proteína según la invención. Este influjo de otros factores se considerará como actividad proteolítica. Los enzimas con actividad proteolítica son también aquellos, cuya actividad queda bloqueada en un instante dado, por ejemplo por medio de un inhibidor. Es decisiva su adecuación en principio con respecto a la correspondiente reacción de proteólisis.

Se entenderá por fragmentos todas las proteínas o los péptidos, que sean menores que la proteína natural o aquellos que correspondan a genes completamente traducidos, y que pueden obtenerse, por ejemplo, también sintéticamente. Debido a sus secuencias de aminoácidos pueden asociarse a las correspondientes proteínas completas. Éstas pueden adquirir, por ejemplo, las mismas estructuras o pueden ejercer actividades proteolíticas o actividades parciales, tales como, por ejemplo, la formación de complejos con un substrato. En principio son equivalentes los fragmentos y las variantes por deleción de las proteínas de partida; mientras que los fragmentos representan un trozo más pequeño, los mutantes por deleción carecen, por el contrario, únicamente de regiones cortas y, por lo tanto, carecen únicamente de algunas funciones parciales.

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por proteínas quiméricas o híbridas aquellas proteínas que estén constituidas por elementos que procedan, de manera natural, de diversas cadenas polipéptidas del mismo organismo o que procedan de organismos diferentes. Este proceder se denomina también Shuffling o mutagénesis por fusión. El objeto de una fusión de este tipo puede consistir, por ejemplo, en incorporar o modificar una función enzimática con ayuda de la parte de la proteína incorporada por fusión según la invención. En el sentido de la presente invención carece de importancia el que una proteína quimérica de este tipo esté constituida por una cadena polipéptida individual o por varias subunidades, sobre las cuales pueden distribuirse diversas funciones. Para la realización de la alternativa, indicada en último lugar, es posible, por ejemplo, trocear post-traducción una cadena polipéptida quimérica individual en varias o hacerlo solamente después de una etapa de purificación, por medio de un corte proteolítico específico.

Se entenderán por proteínas obtenidas mediante mutación por inserción, aquellas variantes que se obtengan, con ayuda de métodos en sí conocidos, mediante la inserción de un fragmento de ácido nucleico, o bien de un fragmento de proteína en las secuencias de partida. Éstas deben clasificarse como proteínas quiméricas debido a su equivalencia de principio. Éstas se diferencian de aquellas únicamente en la relación de tamaño entre la parte no modificada de la proteína y el tamaño de la proteína en su conjunto. En tales proteínas moduladas por inserción, la parte de proteína foránea es menor que en las proteínas quiméricas.

La mutagénesis por inversión, es decir una inversión parcial de la secuencia, puede considerarse como forma especial tanto de la deleción así como, también, de la inserción. Lo mismo es válido para una nueva agrupación de diversas partes de la molécula que se desvíe de la serie original de los aminoácidos. Ésta puede considerarse como variante por deleción, como variante por inserción, así como, también, como variante Shuffling de la proteína original.

En el sentido de la presente solicitud, se entenderán por derivados, aquellas proteínas cuya cadena pura de aminoácidos haya sido modificada químicamente. Tales derivatizaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, biológicamente en conjunción con la biosíntesis de la proteína por medio de los organismos huésped. En este caso pueden emplearse métodos industriales de la biología molecular. Sin embargo, también pueden llevarse a cabo por vía química, por ejemplo mediante una transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o mediante el enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Un compuesto de este tipo puede estar constituido, por ejemplo, por otras proteínas que se enlacen, por ejemplo, con la proteína según la invención a través de compuestos químicos bifuncionales. Tales modificaciones pueden influenciar, por ejemplo, la especificidad con el substrato o las fuerzas de enlace sobre el substrato o pueden provocar un bloqueo provisional de la actividad enzimática, cuando la substancia acoplada esté constituida por un inhibidor. Esto puede ser conveniente, por ejemplo, para el período de tipo del almacenamiento. Del mismo modo, debe entenderse por derivatización, el enlace covalente sobre un soporte macromolecular.

En el sentido de la presente invención se agruparán todos los enzimas, las proteínas, los fragmentos y los derivados, en tanto en cuanto no sea preciso citarlos expresamente como tales, bajo el concepto de proteínas.

Se entenderá por rendimiento de un enzima su actividad en el sector industrial considerado en cada caso. Esta se basa en la actividad enzimática propiamente dicha, dependiendo además de otros factores relevantes para el proceso correspondiente. A éstos pertenecen, por ejemplo, la estabilidad, el enlace con el substrato, la interacción con el material que porta el substrato o las interacciones con otros componentes, especialmente las sinergias.

En el sentido de la presente solicitud se entenderá por rendimiento del lavado o por rendimiento de la limpieza de un agente, el efecto que ejerce el agente considerado sobre los artículos ensuciados, por ejemplo los artículos textiles o los objetos con superficies duras. Los componentes individuales de tales agentes, por ejemplo los enzimas individuales, se evaluarán con relación a su contribución al rendimiento del lavado o de la limpieza del conjunto del agente. Así pues, no puede deducirse, sin más, a partir de las propiedades enzimáticas de un enzima, su contribución al rendimiento del lavado de un agente. En este caso juegan un papel, como factores adicionales, por ejemplo la estabilidad, el enlace con el substrato, el enlace con el producto a ser limpiado o las interacciones con otros componentes del agente, especialmente las sinergias, para la eliminación de las suciedades.

Según el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos del 28 de abril de 1977 se ha depositado el 10.8.1989 en relación con la solicitud WO 91/02792 el siguiente microorganismo en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y de Cultivos Celulares S.L.) en Braunschweig (DSMZ): el Bacillus lentus DSM 5483. Éste ha recibido allí el número de registro DSM 5483 (PA5-A0155, cepa 2-1). Los datos fundamentales sobre las características de este material biológico se han agrupado en la publicación WO 91/02792, tabla 1 (páginas 5 a 7). La secuencia de ADN y de aminoácidos de las proteasas alcalinas, especialmente relevantes para la presente solicitud, de este organismo pueden verse en la SEQ ID NO:106, respectivamente en la SEQ ID NO:52.

Son especialmente esenciales para la invención las posiciones 3, 4, 199 y 211 de las proteínas maduras, según la enumeración de la subtilisina de Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760). Éstas pueden homologarse, según la tabla 2, con las de las subtilisinas más importantes; esta homologación puede extrapolarse a todas las demás subtilisinas. De este modo, se ha representado en el artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", publicado por R. Bott y C. Betzel, New York, 1996, una alineación de 20 subtilisinas con relación a la secuencia conocida de la subtilisina BPN'.

TABLA 2 Homologación de las cuatro posiciones especialmente esenciales según la invención

3

Una alineación de las secuencias de aminoácidos de una variante de proteasa alcalina de B.lentus, según la invención, con estas subtilisinas más importantes, descritas precedentemente, en concreto la subtilisina 309 (Savinase®), la subtilisina PB92, la subtilisina de Carlsberg y la subtilisina BPN' se muestra, también, en la figura 1 de esta solicitud de patente.

Debido a la elevada coincidencia estructural entre las diversas subtilisinas conocidas y a que es idéntico el mecanismo de reacción, ejercido por las mismas, para la hidrólisis de los enlaces endógenos de las amidas de ácido, es de esperar que las citadas mutaciones puntuales desarrollen efectos comparables respectivamente en el contexto de la molécula correspondiente. Especialmente es de esperar, en base a las enseñanzas de la presente solicitud de patente, que quedan adicionalmente mejoradas aquellas subtilisinas, que ya han sido desarrolladas en el estado de la técnica, en lo que se refiere a su empleo en los agentes de lavado y de limpieza, respecto a su contribución al rendimiento del lavado y respectivamente de limpieza mediante la adquisición de estas mutaciones puntuales.

Especialmente, la adquisición de los aminoácidos constituidos por la isoleucina 199 y por la glicina 211 en las posiciones homólogas debería contribuir, en el caso de los enzimas conocidos por el estado de la técnica, a una mejora de su contribución al rendimiento del lavado y respectivamente de la limpieza en los agentes correspondientes. Tomando como base las experiencias realizadas con la proteasa alcalina de B. lentus, estos intercambios favorecen, sin embargo, al menos una estabilización adicional de las moléculas correspondientes.

La estabilidad de las proteasas según la invención con las posiciones de los aminoácidos 199I y 211G puede aumentarse, por ejemplo, mediante copulación sobre polímeros. Un método de este tipo ha sido descrito, por ejemplo, en la publicación US 5230891. Éste requiere que las proteínas sean enlazadas con un polímero de este tipo por medio de una etapa de copulación química, como paso previo a su empleo en los agentes correspondientes.

Son preferentes las estabilizaciones que sean posibles por medio de la propia mutagénesis de la molécula. Dado que éstas no requieren otras etapas de trabajo después de la obtención de la proteína. Algunas mutaciones puntuales, adecuadas a este respecto, son conocidas en sí mismas por el estado de la técnica. De este modo pueden estabilizarse las proteasas, según las publicaciones US 6087315 y US 6110884, por intercambio de determinados restos de tirosina por otros restos. Extrapolado a las proteínas según la invención, derivadas de Bacillus lentus, esto significaría el intercambio de los restos de tirosina en las posiciones 89, 161, 165, 208 y 257 según la SEQ ID NO. 2; las otras dos posiciones allí indicadas están ocupadas ya en la proteasa alcalina de B. lentus, en cualquier caso, por tirosina.

Otras posibilidades son, por ejemplo:

\bullet: el intercambio de determinados restos de aminoácidos por prolina según la publicación EP 583339; esto significaría los intercambios S55P, A96P, A166P, A188P y/o S253P para los enzimas, que se derivan de B. lentus);

\bullet: la modificación del enlace de los iones metálicos, especialmente de los puntos de enlace del calcio, por ejemplo según las enseñanzas de las solicitudes WO 88/08028 y WO 88/08033. Según la primera de estas publicaciones tendrían que intercambiarse uno o varios de los restos de aminoácido, participantes en el enlace del calcio, por aminoácidos cargados negativamente. Según las enseñanzas de la segunda publicación tendrían que incorporarse, simultáneamente, mutaciones puntuales de arginina/glicina en al menos una de las series de ambos restos; esto corresponde, por ejemplo, a las series NG, en subtilisinas procedentes de Bacillus lentus, en las posiciones 60/61, 115/116 y 212/213.

\bullet: según la patente US 5453372 pueden protegerse las proteínas contra el efecto de agentes desnaturalizantes, tales como los tensioactivos, con ayuda de determinadas mutaciones sobre la superficie; las posiciones allí indicadas corresponden en la proteasa alcalina de B. lentus a las posiciones 134, 155, 158, 164, 188 y/o 189.

: Otras posibilidades, comparables, han sido indicadas en las patentes US 5340735, US 5500364, US 5985639 y US 6136553.

Según la invención se lleva a cabo la estabilización por medio de los restos de aminoácidos de la treonina en la posición 3 y/o de la isoleucina en la posición 4 según la enumeración de la subtilisina de Bacillus lentus DSM 5483.

Las variantes, ensayadas en los ejemplos de la presente invención, permiten suponer que su mayor estabilidad es el factor decisivo para proporcionarles un rendimiento del lavado mejor en conjunción con los aminoácidos 199I y 211G.

Independientemente de esta teoría, todas las proteasas alcalinas del tipo subtilisina, caracterizadas porque presentan isoleucina en posición 199 y glicina en la posición 211, según la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483, y que presentan, además, uno de los dos aminoácidos formados por la treonina en la posición 3 y por la isoleucina en la posición 4, representan soluciones de la tarea según la invención.

Además, son preferentes aquellas variantes que presenten, además de la 199 isoleucina y de la 211 glicina, tanto la treonina en la posición 3 como también la isoleucina en la posición 4.

Son preferentes las variantes correspondientes de aquellas proteasas alcalinas, que estén formadas de manera natural por un Bacillus o que se deriven del mismo. Puesto que las proteasas de Bacillus presentan, desde un principio, propiedades favorables para diversas posibilidades de aplicación industrial. A éstas pertenece una cierta estabilidad frente a la temperatura, frente a los agentes oxidantes o desnaturalizantes. Además, se han adquirido las máximas experiencias con las proteasas microbianas en lo que se refiere a su producción biotecnológica, lo cual está relacionado, por ejemplo, con la construcción de vectores de clonación convenientes, con la elección de las células huésped y con las condiciones de fermentación o con la estimación de los riesgos, tal como por ejemplo la alergenicidad.

Las subtilisinas de Bacillus lentus, o bien las subtilisinas, que se derivan de estas proteasas formadas de manera natural, se han establecido, de forma muy preferente, en el estado de la técnica, por ejemplo para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza. A éstas pertenecen las proteasas citadas al principio formadas por la subtilisina 147, la subtilisina 309 y por la proteasa alcalina de B. lentus. Las experiencias que han sido adquiridas para la obtención y el empleo de estas proteasas son favorables, según la invención, para ulteriores desarrollos de estos enzimas. A éstas pertenecen, por ejemplo, su compatibilidad con otros compuestos químicos, tales como, por ejemplo, los componentes de los agentes de lavado o de limpieza.

Una forma de realización especialmente preferente se refiere a las proteasas según la invención, que puedan derivarse de aquellas que están formadas por Bacillus lentus DSM 5483. Entre éstas quedan abarcadas, por ejemplo, las de las variantes que han sido descritas en las solicitudes WO 92/21760 o WO 95/23221 o WO 98/30669. Las formas de realización especialmente preferentes de la presente invención están caracterizadas por los desarrollos adicionales de estos enzimas con las substituciones, según la invención, en las posiciones 199, 211, 3 y/o 4.

La proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus, ensayada en la presente solicitud, es un desarrollo adicional de la subtilisina de B. lentus DSM 5483, que ha sido divulgada en el protocolo de secuencias de la solicitud WO 92/21760 bajo la SEQ ID NO:52 en su secuencia de aminoácidos y en la SEQ ID NO:106 en su secuencia de nucleótidos.

Se ha podido comprobar la contribución de estas nuevas variantes al rendimiento del lavado, respectivamente al rendimiento de la limpieza de los agentes correspondientes, mayor que la de los enzimas comparables y establecidos para esta finalidad en el estado de la técnica de la proteasa alcalina de B. lentus F49 y Savinase® (ejemplos 2-5). En el protocolo de secuencias se ha indicado la secuencia de aminoácidos de esta variante con el número SEQ ID NO. 2. El gen, que codifica esta serie de aminoácidos, ha sido indicado en el protocolo de secuencias con el número SEQ ID NO. 1. Como consecuencia de la tendencia a la degeneración del código genético puede imaginarse, además, un gran número de otros ácidos nucleicos, que codifiquen igualmente esta variante y que representen, simultáneamente, alternativas preferentes dentro de este objeto de la invención.

Una cepa bacteriana, especialmente una cepa de Bacillus, que forma la variante proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/
L211G de B. lentus con las secuencias de ADN y de aminoácidos indicadas en el protocolo de secuencias, puede prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el ejemplo 1 del procedimiento indicado en la presente solicitud.

Con ayuda de los métodos de biología molecular, establecidos en el estado de la técnica, pueden derivarse otras proteínas de las proteasas alcalinas citadas hasta ahora. Tales métodos han sido tratados detalladamente por ejemplo en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.

A éstas pertenecen, por ejemplo, aquellas variantes a las que se les ha proporcionado propiedades adicionales por medio de mutagénesis de substitución o por medio de otras mutaciones puntuales, que están predestinadas en lo que se refiere a sus posibilidades específicas de aplicación, por ejemplo por medio de modificaciones de las cargas superficiales, como las que se han divulgado en la publicación WO 00/36069, o por medio de modificaciones de los bucles que participan en la catálisis o en los enlaces con el substrato, como se han divulgado por ejemplo en la publicación WO 99/27082. También pueden someterse a una mutagénesis regiones parciales mayores de las variantes. De este modo, por ejemplo, puede ser el objetivo de una formación de fragmentos o de una mutagénesis por deleción, la elección de funciones parciales específicas de la proteasa o, por el contrario, su exclusión, por ejemplo el enlace con el substrato, o bien las interacciones con otros compuestos ejercidas a través de determinadas regiones de la molécula.

Mediante la inserción, la substitución o la fusión pueden dotarse las proteasas según la invención con funciones adicionales. Entre éstas pueden imaginarse, por ejemplo, la copulación con determinados dominios, por ejemplo el enlace sobre dominios para el enlace con la celulosa, como se ha descrito, por ejemplo en las publicaciones WO 99/57154 hasta WO 99/57159. Los enlazadores de los aminoácidos, aquí descritos, pueden realizarse por formación de una proteína unitaria de fusión, constituida por la proteasa, por la región del enlazador y por el dominio para el enlace. Un dominio para el enlace de este tipo podría proceder, también, de la misma proteasa o de otra proteasa, por ejemplo para reforzar el enlace de la proteína según la invención sobre un substrato de proteasa. Esto aumenta la concentración local en proteasa, lo cual puede ser ventajoso en algunas aplicaciones, por ejemplo en el tratamiento de materias primas.

Adicionalmente, las proteasas citadas pueden estar derivatizadas, especialmente para optimizarlas para su respectiva finalidad de aplicación. Entre éstas se encuentran las modificaciones químicas, como las que se han descrito, por ejemplo, en la solicitud DE 40 13 142. También pueden modificarse, por ejemplo, por copulación de compuestos químicos de bajo peso molecular o de elevado peso molecular, como se lleva a cabo de manera natural por parte de diversos organismos en conjunción con la biosíntesis de las proteínas, tal como por ejemplo el enlace de un resto de ácido graso cerca del extremo N o la glicosilación en la síntesis por medio de células huésped eucariotas. Por lo tanto, los enzimas o los fragmentos proteolíticos, que estén derivatizados adicionalmente, representan formas de realización de la presente invención.

En relación con el empleo de las proteínas según la invención en los agentes de lavado o de limpieza es especialmente conveniente, por ejemplo, la copulación con otras substancias o enzimas con actividad de lavado. En las solicitudes de patente WO 00/18865 y WO 00/57155 se han descrito, por ejemplo, combinaciones por copulación comparables para los dominios del enlace de la celulosa. De manera análoga, pueden efectuarse también copulaciones sobre compuestos macromoleculares, tal como por ejemplo el polietilenglicol, para modificar la molécula en lo que se refiere a otras propiedades tales como la estabilidad o la compatibilidad con la piel.

Una modificación de este tipo ha sido descrita, por ejemplo, en la patente US 5230891, para adecuar mejor a las proteasas correspondientes para su empleo en productos cosméticos.

Podrán entenderse por derivados de las proteínas según la invención, en el sentido más amplio de la palabra, también las preparaciones de estos enzimas. Según la manera de obtención, la elaboración o la preparación de una proteína, podrá asociarse la misma con otros productos diferentes, por ejemplo procedentes del cultivo de microorganismos productores. Puesto que los sobrenadantes del cultivo de los microorganismos productores de proteasas presentan ya una actividad proteolítica, esto indica que pueden encontrar ya una aplicación correspondiente los extractos en bruto, por ejemplo para la inactivación de otras actividades proteinógenas.

Una proteína puede combinarse también específicamente con otros productos determinados, por ejemplo para aumentar su estabilidad al almacenamiento. Por lo tanto, corresponden a la invención también todas las preparaciones de la proteína según la invención propiamente dicha. Esto es independiente también de que ésta desarrolle o no su actividad enzimática en una preparación determinada. Puesto que puede ser deseable que no tenga actividad o que únicamente tenga una baja actividad durante el almacenamiento y que únicamente desarrolle su función proteolítica en el momento de su aplicación. Esto puede depender, por ejemplo, del estado en que se encuentre plegada la proteína o del enlace reversible de uno o varios productos acompañantes de la preparación sobre una proteína según la invención. Especialmente, se conoce por el estado de la técnica (WO 00/01826) la preparación conjunta de proteasas con inhibidores de la proteasa. Entre éstas se encuentran también las proteínas de fusión, en las cuales están enlazados con las proteasas correspondientes los inhibidores a través de enlazadores, especialmente enlazadores de aminoácidos (WO 00/01831).

Son especialmente deseables los desarrollos ulteriores citados, las derivatizaciones y las preparaciones de proteínas según la invención, cuando ejerzan, además, actividad proteolítica puesto que esto constituye la condición previa para sus posibilidades de aplicación según la invención. Preferentemente, las proteasas, obtenidas por medio de todos los tipos de mutagénesis y/o de derivatizaciones, disponen de una mayor actividad proteolítica con relación a la molécula de partida, o bien con relación a la molécula no derivatizada y, de forma muy especialmente preferente, tienen un rendimiento mejorado en lo que se refiere a su respectivo campo de aplicación industrial, previsto. A este respecto pertenece, especialmente, la mejora de su rendimiento del lavado y/o de la limpieza para el empleo en los agentes de lavado o de limpieza.

Esto es posible, por ejemplo, mediante la combinación de las mutaciones puntuales según la invención con otras mutaciones puntuales, que se refieran a la reacción catalítica, por ejemplo en el centro activo. De este modo, sería posible, por ejemplo, mediante la aplicación de las enseñanzas de la solicitud WO 95/30011 someter a una mutación en las regiones del bucle a las proteasas según la invención constituidas por aquellas que se deriven de la subtilisina de Bacillus lentus o sería posible la inserción de aminoácidos adicionales. Estos trabajos han sido descritos en las solicitudes que han sido publicadas con los números WO 00/37599, WO 00/37621 hasta WO 00/37627 y WO 00/71683 hasta WO 00/71691.

La deleción de una región del enzima, que interaccione con otros productos activos en el medio de la reacción y que, por lo tanto, tenga un efecto negativo sobre el conjunto de la reacción, por ejemplo a través del efecto de pliegue, podría representar un desarrollo deseado de este tipo. De manera análoga puede imaginarse la fusión con otros enzimas activos, por ejemplo con otras proteasas, para conseguir una mayor velocidad de hidrólisis.

A modo de ejemplo, el bloqueo reversible de una actividad proteolítica durante el almacenamiento puede impedir la autoproteólisis por enlace de un inhibidor y, de este modo, puede provocar una elevada velocidad de proteólisis en el instante de la dilución en el medio de la reacción. A modo de ejemplo, la copulación con dominios especiales de enlace puede aumentar, durante el proceso de limpieza, la concentración de la proteasa en las proximidades del substrato con relación a la del baño y, por lo tanto, puede aumentar la contribución del enzima al rendimiento del agente.

Se conoce por el estado de la técnica un gran número de posibilidades para aumentar la estabilidad de los enzimas, especialmente de aquellos que se utilizan en los agentes de lavado y de limpieza (véase más arriba). Entre éstos son especialmente relevantes, por motivos de practicabilidad, aquellos métodos que estén basados en la mutagénesis puntual. También pueden emplearse en combinación todas las posibilidades, ya citadas anteriormente, en las variantes según la invención. Puesto que puede suponerse, según la publicación WO 89/09819, que varias mutaciones estabilizantes tienen una acción aditiva. De este modo, pueden estabilizarse adicionalmente aquellas variantes según la invención que estén estabilizadas ya por uno de los dos aminoácidos formados por 3T o por 4I, o por ambos, mediante copulación con un polímero. No obstante pueden presentar también una mutación estabilizante adicional sobre otro punto de la molécula, por ejemplo mediante substitución de uno o varios de los restos de tirosina, anteriormente descritos, inserción de determinados restos de prolina, modificación de las cargas superficiales o mediante la modificación de los puntos de enlace para el calcio.

Los ácidos nucleicos forman el punto de partida prácticamente de todos los ensayos usuales de biología molecular y de los desarrollos ulteriores de las proteínas así como para su producción. A éstos pertenecen, especialmente, la secuenciación de los genes y la derivación de las secuencias correspondientes de aminoácidos, cualquier tipo de mutagénesis y la expresión de las proteínas. Tales métodos han sido descritos, como ya se ha indicado más arriba, por ejemplo en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. El segundo objeto de la invención está constituido, por lo tanto, por los ácido nucleicos que codifican las proteínas del primer objeto de la invención o sus derivados.

En el plano de los ADN pueden someterse a una optimación a los enzimas esenciales para la invención por medio de todos los métodos agrupados bajo el concepto de "ingeniería de las proteínas -Protein Engineering-" con relación a diversas aplicaciones. Especialmente, pueden alcanzarse de este modo las propiedades siguientes, que se realizan en el plano de las proteínas: una mejora de la estabilidad frente a la oxidación de la proteína derivada, la estabilidad frente a los agentes o proteasas desnaturalizantes, frente a las temperaturas elevadas, frente a condiciones ácidas o fuertemente alcalinas, una modificación de la sensibilidad frente al calcio o frente a otros cofactores, una reducción de la inmunogenidad o del efecto alergénico.

A los genes, mutados según la invención, pertenecen, por ejemplo, aquellos que sean responsables de intercambios específicos de bases individuales, o de mutaciones puntuales estadísticas, de las deleciones de bases individuales o de secuencias parciales, de fusiones con otros genes o con fragmentos génicos o de las inversiones. Tales mutaciones o modificaciones pueden predestinar para aplicaciones específicas al enzima derivado de los ácidos nucleicos correspondientes. Una mutagénesis de este tipo puede llevarse a cabo en los genes clonados de una manera específica o por métodos estadísticos, por ejemplo con un procedimiento subsiguiente de reconocimiento y/o de selección (cribado y selección), dirigidos a la actividad.

Especialmente en el caso de los ácidos nucleicos, que codifican fragmentos de proteína, deben tenerse en consideración los tres marcos de lectura tanto en la orientación codificante (sense) así como también en la orientación no codificante (antisense). Dado que tales oligonucleótidos pueden emplearse a través de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) como punto de partida para la síntesis de ácidos nucleicos emparentados. Tales ácidos nucleicos quedarán incluidos expresamente en el ámbito de protección de la presente invención cuando cubran, especialmente, una de las regiones que correspondan a las cuatro posiciones de los aminoácidos 3, 4, 199 y/o 211. Esto es válido, también, para aquellos que presenten ya en estas posiciones secuencias variables de tal manera, que pueda estar presente dentro de una población de muchos cebadores también, al menos, uno que codifique una posición de este tipo para una secuencia parcial correspondiente a la SEQ ID NO. 3. Lo mismo es válido para los oligonucleótidos no codificantes (antisentido), que pueden ser empleados, por ejemplo, para la regulación de la expresión.

El desarrollo ulterior de las proteasas según la invención puede dirigirse especialmente a los razonamientos presentados en la publicación "Protein engineering" de P.N.Bryan (2000) en Biochim. Biophys. Acta, tomo 1543, páginas 203-222.

Son preferentes los ácidos nucleicos que codifiquen proteasas de subtilisina, cuya secuencia de nucleótidos coincida con la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 3. Esto es válido, especialmente, para las regiones que codifiquen la 199 isoleucina y la 211 glicina, y de una manera muy especialmente preferente para las que codifiquen la 3 treonina, la 4 isoleucina, la 199 isoleucina y la 211 glicina.

Esto es válido, preferentemente, para las que pueden derivarse de una secuencia para una proteasa de Bacillus lentus y, especialmente, cuando puedan derivarse de una secuencia para una proteasa de Bacillus lentus DSM 5483. En el caso muy especialmente preferente, el ácido nucleico codifica la variante según la invención de la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus y/o coincide con la secuencia de nucleótidos dada en la SEQ ID NO. 3.

En el ámbito de protección quedan abarcados, por ejemplo, también aquellos ácidos nucleicos que codifiquen mutantes por inserción o por fusión con actividad proteolítica. De este modo, pueden estar fusionadas las regiones responsables de esta actividad, por ejemplo con dominios enlazantes de la celulosa o portan mutaciones puntuales en regiones sin actividad catalítica para posibilitar la copulación de la proteína derivada sobre el polímero o para reducir su alergenicidad.

Para manipular los ácidos nucleicos según la invención, éstos se encajarán, adecuadamente, en vectores. A éstos pertenecen, por ejemplo, los vectores que se deriven de plásmidos bacterianos, de virus o de bacteriófagos, o de vectores preponderantemente sintéticos. Éstos forman puntos de partida adecuados para los ensayos de biología molecular y bioquímicos del gen correspondiente, de su expresión o de la proteína correspondiente. Un objeto inventivo de la presente invención corresponde, por lo tanto, a las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente citadas, especialmente a aquellas que codifiquen los enzimas proteolíticos anteriormente citados.

Los vectores de clonación son formas de realización preferentes de este objeto de la invención. Éstos son adecuados para la caracterización por biología molecular del gen correspondiente, además de para el almacenamiento, para la amplificación biológica o para la selección del gen interesante. Simultáneamente, representan formas transportables y almacenables de los ácidos nucleicos reivindicados y constituyen, también, puntos de partida para técnicas de biología molecular, que no estén relacionadas con la célula, tales como por ejemplo la RCP o los procedimientos de mutagénesis In-vitro. Son preferentes aquellos vectores de clonación que contengan regiones de ácidos nucleicos que codifiquen los enzimas proteolíticos anteriormente citados.

Los vectores de expresión, según la invención, son la base para realización de los ácidos nucleicos del segundo objeto de la invención en sistemas de producción biológicos y, de este modo, para producir las proteínas del primer objeto de la invención. Las formas preferentes de realización de este objeto de la invención consisten en vectores de expresión, que porten todos los elementos genéticos necesarios para la expresión, por ejemplo el promotor natural, localizado originalmente por delante de este gen, o un promotor procedente de otro organismo. Estos elementos pueden ordenarse, por ejemplo, en forma de un denominado casete de expresión. Son preferentes aquellos vectores de expresión que contengan regiones de ácidos nucleicos, que codifiquen los enzimas proteolíticos anteriormente citados.

Otra posibilidad de aplicación de la presente invención corresponde a las células, que contengan un vector según el tercer objeto de la invención. Éstas forman, por lo tanto, la dimensión microbiológica de la presente invención posibilitando, por ejemplo, la amplificación de los genes correspondientes, así como, también, su mutagénesis o su transcripción y su traducción y, finalmente, la producción biotecnológica.

Una forma de realización de este objeto de la invención consiste en células huésped, que expresen una de las proteínas según la invención o que puedan ser estimuladas para su expresión. Por lo tanto, estas posibilitan su producción biotecnológica. Para ello deben contener el gen correspondiente, en el caso más adecuado por medio de un vector, es decir que se presenten en estado transformado. Este vector puede presentarse en la célula huésped en estado extracromosomal a modo de elemento genético propio o puede integrarse en un cromosoma. Preferentemente se trata en este caso de uno de los vectores de expresión anteriormente descritos.

Como células huésped son adecuados, en principio, todos los organismos, es decir los procariotas, los eucariotas o los cianofitos. Son preferentes aquellas células huésped que puedan manipularse perfectamente por vía genética en lo que se refiere, por ejemplo, a la transformación con el vector de expresión y a su establecimiento estable, por ejemplo hongos o bacterias monocelulares. Además, las células huésped se caracterizan preferentemente por una buena aptitud a la manipulación microbiológica y biotecnológica. Esto se refiere, por ejemplo, a la fácil posibilidad de cultivo, a las elevadas velocidades de crecimiento, a los reducidos requisitos con respecto a los medios de fermentación y a las buenas velocidades de producción y de secreción para las proteínas foráneas. Frecuentemente debe determinarse experimentalmente, para cada caso individual, el sistema óptimo de expresión entre la pluralidad de los distintos sistemas disponibles según el estado de la técnica. Cada proteína, según la invención, puede obtenerse, de este modo, a partir de una pluralidad de organismos huésped.

Las formas preferentes de realización corresponden a aquellas células huésped que puedan regularse en cuanto a su actividad debido a los elementos genéticos correspondientes, por ejemplo mediante adición controlada de compuestos químicos, mediante modificación de las condiciones de cultivo o en función de la correspondiente densidad celular. Esta expresión controlable posibilita una producción muy económica de las proteínas interesantes.

Una forma preferente de realización está constituida por células huésped bacterianas, especialmente aquellas que secreten la proteína formada en el medio circundante. Puesto que las bacterias se caracterizan por tiempos cortos para la generación y por pequeños requisitos en relación a las condiciones de cultivo. De este modo pueden establecerse procedimientos de bajo coste. En el caso de las bacterias gram-negativas, tal como por ejemplo E. coli, se secretará una pluralidad de proteínas en el recinto periplasmático. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. Las bacterias gram-positivas, tales como por ejemplo los Bacillus, emiten, por el contrario, proteínas secretadas igualmente en el medio nutriente que circunda a la célula, a partir de cual pueden purificarse directamente las proteínas expresadas, según la invención, de acuerdo con otra forma preferente de realización. En la solicitud WO 01/81597 se divulga incluso un procedimiento según el cual se consigue que incluso las bacterias gram-negativas descarguen proteínas expresadas.

Una forma de realización de la presente invención aprovecha el propio Bacillus lentus DSM 5483, para expresar proteínas según la invención (homólogos). Por el contrario, es preferente, sin embargo, la expresión heteróloga. A las bacterias, que son preferentes para la expresión heteróloga, pertenecen aquellas del género Bacillus, especialmente aquellas de las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis u otras especies o cepas de Bacillus alcalophilus. Puesto que éstas forman las propias subtilisinas comparables, puede obtenerse a través de este procedimiento una mezcla de proteínas según la invención con las subtilisinas endógenas formadas por las cepas huésped. A modo de ejemplo, se ha descrito en la solicitud WO 91/02792 (EP 493398 B1) dicha coexpresión de la proteasa alcalina de B. lentus en Bacillus licheniformis ATCC 53926; en dicha publicación se encuentra también un gran número de posibles vectores de expresión. Es de esperar que puedan prepararse con ayuda de estos vectores y/o en este sistema huésped las nuevas variantes encontradas según la invención, especialmente las de Bacillus lentus y de manera muy especialmente preferente la proteasa alcalina S3TN41N199I/L211G de B. lentus.

Otra forma preferente de realización de este objeto de la invención está constituido por células huésped eucariotas, especialmente aquellas que modifiquen post-traducción a la proteína formada. Ejemplos de eucariotas adecuados son los hongos tales como los actinomicetos o las levaduras tales como Saccharomyces o Kluyveromyces. A las modificaciones, que llevan a cabo tales sistemas especialmente en conjunción con la síntesis de las proteínas pertenecen, por ejemplo, el enlace de compuestos de bajo peso molecular tales como anclajes con la membrana o los oligosacáridos. Tales modificaciones con oligosacáridos pueden ser deseables, por ejemplo, para reducir la alergenicidad de las proteínas preparadas.

Un objeto independiente de la invención está constituido por procedimientos para la obtención de un enzima proteolítico o sus derivados, según la invención. De este modo pueden sintetizarse, por ejemplo, los oligopéptidos o los oligonucleótidos correspondientes hasta incluso los genes y proteínas completos según los métodos conocidos de la biología molecular, por medio de las secuencias de ADN y de aminoácidos anteriormente citadas, como las que pueden deducirse, por ejemplo, también del protocolo se secuencias. A partir de los microorganismos conocidos, productores de la subtilisina, pueden aislarse también otros productores naturales de las subtilisinas, pueden determinarse sus secuencias de subtilisina y pueden desarrollarse adicionalmente de acuerdo con las premisas aquí dadas. Tales especies de bacterias pueden cultivarse y emplearse también para los procedimientos de obtención correspondientes. De manera análoga pueden desarrollarse nuevos vectores de expresión, de acuerdo con la muestra de los vectores divulgados por ejemplo en la solicitud WO 91/02792. También pueden ser formas de realización de la presente invención los sistemas de expresión exentos de células, en base a las secuencias correspondientes de ácidos nucleicos, en los que se imagine la biosíntesis de proteínas in vitro. Todos los elementos ya indicados anteriormente pueden combinarse para dar nuevos procedimientos, para la preparación de las proteínas según la invención. En este caso puede imaginarse una pluralidad de posibilidades de combinación de las etapas del procedimiento para cada proteína según la invención de tal manera, que deberá determinarse por vía experimental el procedimiento óptimo para cada caso particular concreto.

Un objeto de independiente de la invención consiste en agentes caracterizados porque contienen un enzima proteolítico según la invención.

Prácticamente todas las posibilidades de aplicación industrial de los enzimas, según la invención, dependen de que utilice el enzima capaz de funcionar en un medio correspondiente. De este modo, las posibilidades de empleo microbiológico requieren, por ejemplo, agentes en los que se ponga en contacto el enzima, en la mayoría de los casos en forma de preparaciones de gran pureza, con los participantes necesarios de la reacción o con los cofactores. Los agentes para el tratamiento de materiales en bruto o las preparaciones cosméticas están caracterizados igualmente por recetas específicas. Todas estas recetas deben considerarse, según la invención, como agentes con el enzima según la invención.

Se asocian con este objeto de la invención los agentes de lavado o de limpieza como formas preferentes de realización. Dado que, tal como se ha mostrado en los ejemplos de realización de la presente solicitud, se ha podido observar, sorprendentemente, que una variante de la subtilisina 199I/211G (numeración según la proteasa alcalina de B. lentus), o bien una variante de Bacillus lentus con los intercambios S3T/V4I/V199I/L211G, especialmente la variante de proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus,derivada de Bacillus lentus DSM 5483, proporciona un claro aumento del rendimiento sobre diversas suciedades (véanse los ejemplos 2 y 3). Esto sobrepasa el nivel de las proteasas establecidas en los agentes de lavado con empleo de igual actividad. Lo mismo es válido para los agentes para el fregado a máquina de la vajilla correspondientes (véanse los ejemplos 4 y 5). Este efecto se presenta, de manera reproducible, tanto a temperaturas diferentes así como, también, a concentraciones diferentes.

A este objeto de la invención pertenecen todos los tipos imaginables de agentes de limpieza, tanto concentrados así como también agentes que deban ser empleados sin dilución; para el empleo a escala comercial, en las máquinas lavadoras o en la colada a mano, o bien en la limpieza a mano. A éstos pertenecen, por ejemplo, los agentes de lavado para los artículos textiles, las alfombras o las fibras naturales, para los que se utiliza la denominación de agente de lavado según la presente invención. A éstos pertenecen, por ejemplo, también los agentes para el fregado de la vajilla para las máquinas friegaplatos o los agentes para el fregado a mano de la vajilla o limpiadores para superficies duras tales como metal, vidrio, porcelana, cerámica, baldosines, piedra, superficies barnizadas, materiales sintéticos, madera o cuero; para éstos se utilizará la denominación de agentes de limpieza según la presente invención. Cada tipo de agente de limpieza representa una forma de realización de la presente invención en tanto en cuanto esté enriquecido con una proteína según la invención.

Las formas de realización de la presente invención abarcan todas las formas de administración establecidas según el estado de la técnica y/o todas las formas de administración convenientes de los agentes según la invención. A éstas pertenecen, por ejemplo, los agentes sólidos, en forma de polvo, líquidos, en forma de gel o pastosos, en caso dado incluso con varias fases, comprimidos o no comprimidos; además a éstos pertenecen, por ejemplo: los cuerpos extruidos, los granulados, las tabletas o las bolsitas, tanto en recipientes de gran tamaño como también empaquetados en forma de porciones.

Los agentes según la invención contienen los enzimas según la invención en una cantidad desde 2 \mug hasta 20 mg y de manera más preferente desde 5 \mug hasta 17,5 mg, desde 20 \mug hasta 15 mg, desde 50 \mug hasta 10 mg, desde 100 \mug hasta 7,5 mg, desde 200 \mug hasta 5 mg y desde 500 \mug hasta 1 mg por gramo del agente. De este modo se presentan desde 40 \mug hasta 4 g y de manera más preferente desde 50 \mug hasta 3 g, desde 100 \mug hasta 2 g, desde 200 \mug hasta 1 g y, de forma especialmente preferente, desde 400 \mug hasta 400 mg por aplicación.

La actividad de las proteasas en tales agentes puede determinarse de acuerdo con los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132. Por lo tanto, se indicará en PE (unidades de proteasa). La actividad de la proteasa de los agentes puede tomar un valor de hasta 1.500.000 unidades de proteasa por gramo de preparación.

Además de un enzima según la invención, un agente según la invención contiene, en caso dado, otros componentes tales como los tensioactivos, por ejemplo los tensioactivos no iónicos, aniónicos y/o anfóteros, y/o los agentes de blanqueo y/o los adyuvantes así como, en caso dado, otros componentes usuales.

Como tensioactivos no iónicos se emplearán, preferentemente, alcoholes alcoxilados, preferentemente etoxilados, especialmente primarios con, preferentemente, 8 hasta 18 átomos de carbono y en promedio 1 hasta 12 moles de óxido de etileno (EO) por mol de alcohol, en los que el resto alcohólico puede ser lineal o puede estar ramificado por metilo en la posición 2, o bien puede contener en mezcla restos lineales y ramificados con metilo de tal manera que esté presente usualmente un resto de oxoalcohol. Sin embargo son especialmente preferentes los alcoholetoxilatos con restos lineales procedentes de alcoholes de origen natural con 12 hasta 18 átomos de carbono, por ejemplo de alcohol de coco, de palma, de grasa de sebo o alcohol oleílico y, en promedio, 2 hasta 8 EO por mol de alcohol. A los alcoholes etoxilados preferentes pertenecen, por ejemplo, los alcoholes con 12 hasta 14 átomos de carbono con 3 EO o con 4 EO, los alcoholes con 9 hasta 11 átomos de carbono con 7 EO, los alcoholes con 13 hasta 15 átomos de carbono con 3 EO, con 5 EO, con 7 EO o con 8 EO, los alcoholes con 12 hasta 18 átomos de carbono con 3 EO, con 5 EO o con 7 EO y mezclas de los mismos, tales como mezclas formadas por alcoholes con 12 a 14 átomos de carbono con 3 EO y alcoholes con 12 a 18 átomos de carbono con 5 EO. Los grados de etoxilación indicados representan valores estadísticos medios, que pueden ser un número entero o un número fraccionario para un producto especial. Los alcoholetoxilatos preferentes presentan una distribución estrecha de los homólogos (narrow range ethoxylates, NRE). Además de estos tensioactivos no iónicos pueden emplearse también alcoholes grasos con más de 12 EO. Ejemplos a este respecto son alcoholes grasos de sebo con 14 EO, con 25 EO, con 30 EO o con
40 EO.

Otra clase preferente de tensioactivos no iónicos, empleables, que se emplean bien como únicos tensioactivos no iónicos o en combinación con otros tensioactivos no iónicos, son los ésteres de alquilo de los ácidos grasos alcoxilados, preferentemente etoxilados o etoxilados y propoxilados, preferentemente con 1 hasta 4 átomos de carbono en la cadena alquilo, especialmente los ésteres de metilo de los ácidos grasos.

Otra clase de tensioactivos no iónicos que pueden ser empleados de manera ventajosa son los alquilpoliglicósidos (APG). Los alquilpoliglicósidos empleables cumplen la fórmula general RO(G)_{z}, en la que R significa un resto alifático lineal o ramificado, especialmente ramificado con metilo en la posición 2, saturado o insaturado, con 8 hasta 22, preferentemente con 12 hasta 18 átomos de carbono y G es el símbolo que significa una unidad de glicosa con 5 o con 6 átomos de carbono, preferentemente significan glucosa. El grado de glicosilación z está comprendido, en este caso, entre 1,0 y 4,0, preferentemente entre 1,0 y 2,0 y, especialmente, entre 1,1 y 1,4. Preferentemente se emplearán alquilpoliglucósidos, es decir alquilpoliglicósidos en los cuales el resto de poliglicosilo es un resto de glucosa y el resto alquilo es un resto n-alquilo.

También pueden ser adecuados los tensioactivos no iónicos del tipo de los óxidos de amina, especialmente los óxidos de N-cocoalquil-N,N-dimetilamino y los óxidos de N-seboalquil-N,N-dihidroxietilamina, y del tipo de las alcanolamidas de los ácidos grasos. La proporción de estos tensioactivos no iónicos no se encuentra, preferentemente, por encima de la de los alcoholes grasos etoxilados, especialmente no es mayor que la mitad de los mismos.

Otros tensioactivos adecuados son las amidas de los ácidos polihidroxigrasos de la fórmula (II),

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en la que RCO significa un resto acilo alifático con 6 hasta 22 átomos de carbono, R^{1} significa hidrógeno, un resto alquilo o hidroxialquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono y [Z] significa un resto polihidroxialquilo lineal o ramificado con 3 hasta 10 átomos de carbono y con 3 hasta 10 grupos hidroxilo. Las amidas de los ácidos polihidroxigrasos están constituidas por productos conocidos que, usualmente, pueden obtenerse por aminación por reducción de un azúcar reductor con amoníaco, con una alquilamina o con una alcanolamina y subsiguiente acilación con un ácido graso, con un éster de alquilo de ácido graso o con un cloruro de ácido graso.

Al grupo de las amidas de los ácidos polihidroxigrasos pertenecen, también, los compuestos de la fórmula (III),

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en la que R significa un resto alquilo o alquenilo lineal o ramificado con 7 hasta 12 átomos de carbono, R^{1} significa un resto alquilo lineal, ramificado o cíclico o un resto arilo con 2 hasta 8 átomos de carbono y R^{2} significa un resto alquilo, lineal, ramificado o cíclico o significa un resto arilo o un resto oxi-alquilo con 1 hasta 8 átomos de carbono, siendo preferentes los restos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono o los restos fenilo y [Z] significa un resto polihidroxialquilo lineal, cuya cadena alquilo está substituida con, al menos, dos grupos hidroxilo, o derivados alcoxilados, preferentemente etoxilados o propoxilados de estos restos.

Preferentemente, [Z] se obtiene mediante aminación por reducción de un azúcar reductor, por ejemplo la glucosa, la fructosa, la maltosa, la lactosa, la galactosa, la manosa o la xilosa. Los compuestos substituidos por N-alcoxi o por N-ariloxi pueden transformarse, por ejemplo, mediante reacción con ésteres de metilo de los ácidos grasos en presencia de un alcóxido a modo de catalizador para dar las amidas de los ácidos polihidroxigrasos deseadas.

Como tensioactivos aniónicos se emplearán, por ejemplo, aquellos del tipo de los sulfonatos y de los sulfatos. Como tensioactivos del tipo sulfonato entran en consideración en este caso, preferentemente, los bencenosulfonatos de alquilo con 9 hasta 13 átomos de carbono, los olefinasulfonatos, es decir mezclas formadas por alquenosulfonatos e hidroxialcanosulfonatos así como disulfonatos, tales como por ejemplo los que están constituidos por monoolefinas con 12 hasta 18 átomos de carbono con el doble enlace situado en el extremo o en el interior de la cadena por sulfonación con trióxido de azufre gaseoso y subsiguiente hidrólisis alcalina o ácida de los productos de la sulfonación. También son adecuados los alcanosulfonatos, que se obtienen a partir de alcanos con 12 hasta 18 átomos de carbono, por ejemplo, mediante sulfocloración o mediante sulfoxidación con hidrólisis o bien neutralización subsiguiente. Del mismo modo son adecuados los ácidos \alpha-sulfograsos (éstersulfonatos), por ejemplo los ésteres de metilo \alpha-sulfonados de los ácidos grasos de coco, de semillas de palma o de sebo, hidrogenados.

Otros tensioactivos aniónicos adecuados son los ésteres de glicerina de los ácidos grasos, sulfonados. Se entenderá por ésteres de glicerina de los ácidos grasos los monoésteres, los diésteres y los triésteres así como sus mezclas, como las que se obtienen en la fabricación por esterificación de una monoglicerina con 1 hasta 3 moles de ácido graso o en la transesterificación de los triglicéridos con 0,3 hasta 2 moles de glicerina. Los ésteres de glicerina de los ácidos grasos, sulfonados, preferentes son en este caso los productos de sulfonación de los ácidos grasos saturados, con 6 hasta 22 átomos de carbono, por ejemplo del ácido caprónico, del ácido caprílico, del ácido caprínico, del ácido mirístico, del ácido láurico, del ácido palmítico, del ácido esteárico o del ácido behénico.

Como sulfatos de alqu(en)ilo serán preferentes las sales alcalinas y, especialmente, las sales de sodio de los semiésteres del ácido sulfúrico con alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono, por ejemplo constituidos por los alcoholes grasos de coco, los alcoholes grasos de sebo, el alcohol laurílico, el alcohol miristílico, el alcohol cetílico o el alcohol estearílico o de los oxoalcoholes con 10 hasta 20 átomos de carbono y aquellos semiésteres de alcoholes secundarios con estas longitudes de la cadena. Además son preferentes los sulfatos de alqu(en)ilo con las longitudes de las cadenas citadas, que contengan un resto alquilo de cadena lineal sintético, fabricado sobre la base petroquímica, que tengan un comportamiento a la degradación similar al de los compuestos adecuados a base de materias primas de la química de grasas. Desde el punto de vista industrial para el lavado son preferentes los sulfatos de alquilo con 12 hasta 16 átomos de carbono y los sulfatos de alquilo con 12 hasta 15 átomos de carbono así como los sulfatos de alquilo con 14 hasta 15 átomos de carbono. También los sulfatos de 2,3-alquilo son tensioactivos aniónicos
adecuados.

Del mismo modo son adecuados los monoésteres del ácido sulfúrico de los alcoholes con 7 hasta 21 átomos de carbono de cadena lineal o de cadena ramificada, etoxilados con 1 hasta 6 moles de óxido de etileno, tales como los alcoholes con 9 a 11 átomos de carbono ramificados con 2-metilo con un promedio de 3,5 moles de óxido de etileno (EO) o los alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono con 1 hasta 4 EO. Éstos se emplearán en los agentes de limpieza únicamente en cantidades relativamente pequeñas, debido a su elevado comportamiento a la formación de espuma, por ejemplo en cantidades de hasta un 5% en peso, usualmente desde un 1 hasta 5% en peso.

Otros tensioactivos aniónicos adecuados son también las sales de los ácidos alquilsulfosuccínicos, que se denominan también como sulfosuccinatos o como ésteres del ácido sulfosuccínico y que representan monoésteres y/o diésteres del ácido sulfosuccínico con alcoholes, preferentemente con alcoholes grasos y, especialmente, con alcoholes grasos etoxilados. Los sulfosuccinatos preferentes contienen restos de alcoholes grasos con 8 hasta 18 átomos de carbono o mezclas formadas por los mismos. Son especialmente preferentes los sulfosuccinatos que contengan un resto de alcohol graso, que se derive de alcoholes grasos etoxilados, que considerados en sí mismos sean tensioactivos no iónicos (para la descripción véase más arriba). En este caso son especialmente preferentes, a su vez, los sulfosuccinatos, cuyos restos de alcohol graso se derivan de alcoholes grasos etoxilados con una distribución estrecha de los homólogos. Del mismo modo, es posible, también, emplear ácidos alqu(en)ilsuccínicos preferentemente con 8 hasta 18 átomos de carbono en la cadena de alqu(en)ilo o sus sales.

Como otros tensioactivos aniónicos entran en consideración especialmente los jabones. Son adecuados los jabones de ácidos grasos saturados, tales como las sales del ácido láurico, del ácido mirístico, del ácido palmítico, del ácido esteárico, del ácido erúcico hidrogenado y del ácido behénico así como, especialmente, las mezclas de jabones derivadas de los ácidos grasos naturales, tales como los ácidos grasos de coco, de semillas de palma o de sebo.

Los tensioactivos aniónicos con inclusión de los jabones pueden presentarse en forma de sus sales de sodio, de potasio o de amonio así como en forma de sales solubles de bases orgánicas, tales como la monoetanolamina, la dietanolamina o la trietanolamina. Preferentemente los tensioactivos aniónicos se presentan en forma de sus sales de sodio, de potasio, especialmente en forma de sus sales de sodio.

Los tensioactivos pueden estar contenidos en los agentes de lavado o de limpieza, según la invención, en total en una cantidad desde aproximadamente un 5% en peso hasta un 50% en peso, especialmente desde un 8% en peso hasta un 30% en peso, referido al agente acabado.

Los agentes según la invención pueden contener agentes de blanqueo. Entre los compuestos suministradores de H_{2}O_{2} en agua, que sirven como agentes de blanqueo, tienen un significado especial el percarbonato de sodio, el tetrahidrato de perborato de sodio y el monohidrato de perborato de sodio. Otros agentes de blanqueo empleables son, por ejemplo, los peroxopirofosfatos, los citratoperhidratos así como las sales perácidas o los perácidos suministradores de H_{2}O_{2}, tales como los persulfatos o bien el ácido persulfúrico. También puede emplearse el peroxohidrato de urea percarbamida, que puede describirse por medio de la fórmula H_{2}N-CO-NH_{2}\cdotH_{2}O_{2}. Especialmente podrán estar contenidos también, en caso deseado, agentes de blanqueo del grupo de los agentes de blanqueo orgánicos, cuando se utilicen los agentes para la limpieza de superficies duras, por ejemplo en el fregado a máquina de la vajilla, aún cuando su empleo sea posible en principio, también, en los agentes para el lavado de los artículos textiles. Los agentes de blanqueo orgánicos típicos son los peróxidos de diacilo, tal como por ejemplo el peróxido de dibenzoilo. Otros agentes de blanqueo orgánicos típicos son los peroxiácidos, citándose como ejemplos especialmente los alquilperoxiácidos y los arilperoxiácidos. Los representantes preferentes son el ácido peroxibenzoico y sus derivados de substitución en el anillo, tales como los ácidos alquilperoxibenzoicos, así como también el ácido peroxi-\alpha-naftoico y el monoperftalato de magnesio, los peroxiácidos alifáticos o alifáticos substituidos, tales como el ácido peroxiláurico, el ácido peroxiesteárico, el ácido \varepsilon-ftalimidoperoxicaprónico (ácido ftalimidoperoxihexanoico, PAP), el ácido o-carboxibenzamidoperoxicaprónico, el ácido N-nonenilamidoperadípico y el N-nonenilamidopersuccinato, y los ácidos peroxidicarboxílicos alifáticos y aralifáticos, tales como el ácido 1,12-diperoxicarboxílico, el ácido 1,9-diperoxiazelaico, el ácido diperoxisebácico, el ácido diperoxibrasílico, los ácidos diperoxiftálicos, el ácido 2-decildiperoxibutano-1,4-dioico, el ácido N,N-tereftaloil-di(6-aminopercaprónico).

El contenido de los agentes en agentes de blanqueo puede estar comprendido entre un 1 y un 40% en peso y, especialmente, entre un 10 y un 20% en peso, empleándose ventajosamente el monohidrato de perborato o el percarbonato.

Con el fin de conseguir un efecto de blanqueo mejorado cuando se lleve a cabo la colada a temperaturas de 60ºC y por debajo de este valor y, especialmente, en el tratamiento previo de la colada, los agentes podrán contener también activadores de blanqueo. Como activadores de blanqueo pueden emplearse compuestos que generen, bajo condiciones de perhidrólisis, ácidos peroxocarboxílicos alifáticos con, preferentemente, 1 hasta 10 átomos de carbono, especialmente con 2 hasta 4 átomos de carbono, y/o ácidos perbenzoicos substituidos en caso dado. Son adecuadas las substancias que porten grupos de O-acilo y/o de N-acilo con el número de átomos de carbono citado y/o que porten grupos benzoilo substituidos en caso dado. Son preferentes las alquilendiaminas poliaciladas, especialmente la tetraacetiletilendiamina (TAED), los derivados de triazina acilados, especialmente la 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina (DADHT), los glicolurilos acilados, especialmente el 1,3,4,6-tetraacetilglicolurilo (TAGU), las N-acilimidas, especialmente la N-nonanoilsuccinimida (NOSI), los fenolsulfonatos acilados, especialmente los oxibencenosulfonatos de n-nonanoilo o de isononanoilo (n- respectivamente iso-NOBS), los ácidos hidroxicarboxílicos acilados, tales como el citrato de trietil-O-acetilo (TEOC), los anhídridos de los ácidos carboxílicos, especialmente el anhídrido del ácido isatoico y/o el anhídrido del ácido succínico, las amidas de los ácidos carboxílicos, tal como la N-metildiacetamida, los glicoluros, los alcoholes polivalentes acilados, especialmente la triacetina, el diacetato de etilenglicol, el acetato de isopropenilo, el 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurano y los ésteres de enol, conocidos por las solicitudes de patente alemanas DE 196 16 693 y DE 196 16 767 así como el sorbitol y el manitol acetilados o bien sus mezclas (SORMAN) descritas en la solicitud de patente europea EP 0 525 239, los derivados sacáricos acilados, especialmente la pentaacetilglucosa (PAG), la pentaacetilfructosa, la tetraacetilxilosa y la octaacetillactosa así como la glucamina acetilada, en caso dado N-alquilada o bien la gluconolactona, el triazol o bien los derivados de triazol y/o las caprolactamas y/o los derivados de caprolactama, en forma de partículas, preferentemente las lactamas N-aciladas, por ejemplo la N-benzoilcaprolactama y la N-acetilcaprolactama, que se conocen por las solicitudes de patente internacionales WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 y WO 95/17498. Del mismo modo se emplearán, preferentemente, los acilacetales substituidos de manera hidrófila, conocidos por la solicitud de patente alemana DE 196 16 769 y las acillactamas descritas en la solicitud de patente alemana DE 196 16 770 así como en la solicitud de patente internacional WO 95/14075. También pueden emplearse las combinaciones de los activadores de blanqueo convencionales conocidas por la solicitud de patente alemana DE 4443 177. Del mismo modo pueden emplearse derivados del nitrilo tales como las cianopiridinas, los nitrilquats, por ejemplo los N-alquilamonioacetonitrilos, y/o los derivados de cianamida. Los activadores de blanqueo preferentes son el 4-(octanoiloxi)-bencenosulfonato de sodio, el oxibencenosulfonato de n-nonanoilo o de isononanoilo (n- respectivamente iso-NOBS), el oxibencenosulfonato de undecenoilo (UDOBS), el dodecanoiloxibencenosulfonato de sodio (DOBS), el ácido decanoiloxibenzoico (DOBA, OBC 10) y/o el oxibencenosulfonato de dodecanoilo (OBS 12), así como el acetonitrilo de N-metilmorfolino (MMA). Dichos activadores de blanqueo pueden estar contenidos en las cantidades usuales desde un 0,01 hasta un 20% en peso, preferentemente en cantidades desde un 0,1 hasta un 15% en peso, especialmente desde un 1% en peso hasta un 10% en peso, referido al conjunto de la composición.

Además de los activadores de blanqueo convencionales o en su lugar pueden estar contenidos también los denominados catalizadores de blanqueo. Estos productos están constituidos por sales de los metales de transición o bien complejos de los metales de transición, que refuerzan el blanqueo, tales como por ejemplo los complejos de sales o los complejos de carbonilo de Mn, de Fe, de Co, de Ru o de Mo. También son adecuados como catalizadores de blanqueo los complejos de Mn, de Fe, de Co, de Ru, de Mo, de Ti, de V y de Cu con ligandos tripodo que contengan N así como los complejos de amina con Co, con Fe, con Cu y con Ru, empleándose preferentemente aquellos compuestos que han sido descritos en la publicación DE 197 09 284 A1. Según la publicación WO 99/63038 los derivados del acetonitrilo y los compuestos de los complejos de los metales de transición, activadores de blanqueo según la publicación WO 99/63041 pueden desplegar un efecto activador del blanqueo en combinación con amilasas.

Los agentes según la invención contienen, por regla general, uno o varios adyuvantes, especialmente zeolitas, silicatos, carbonatos, coadyuvantes orgánicos y -cuando no se opongan a su empleo motivos ecológicos- también los fosfatos. Estos últimos son productos estructurantes a ser empleados preferentemente en particular en los agentes de limpieza para el fregado a máquina de la vajilla.

En este caso deben citarse los silicatos de sodio estratificados de la fórmula general NaMSi_{x}O_{2x+1}\cdotyH_{2}O, en la que M significa sodio o hidrógeno, x significa un número desde 1,6 hasta 4, preferentemente desde 1,9 hasta 4,0 e y significa un número desde 0 hasta 20 y siendo preferentes para x los valores 2, 3 o 4. Tales silicatos estratificados cristalinos han sido descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0164 514. Los silicatos estratificados cristalinos preferentes de la fórmula indicada son aquellos en los cuales M significa sodio y x toma los valores 2 o 3. Son especialmente preferentes tanto los disilicatos de sodio \beta así como también los disilicatos de sodio \delta Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O. En el comercio se encuentran tales compuestos por ejemplo bajo la denominación SKS® (firma Clariant). De este modo el SKS-6® está constituido preponderantemente por un disilicato de sodio \delta con la fórmula Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, en el caso del SKS-7® se trata preponderantemente del disilicato de sodio \beta. Mediante la reacción con ácidos (por ejemplo con el ácido cítrico o con el ácido carbónico) se obtienen a partir de los disilicatos de sodio \delta la canemita NaHSi_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, que se encuentra en el comercio bajo las denominaciones SKS-9® o bien SKS-10® (firma Clariant). También puede ser ventajoso emplear modificaciones químicas de estos silicatos estratificados. De este modo puede influenciarse adecuadamente la alcalinidad de los silicatos estratificados. Los silicatos estratificados dopados con fosfato o bien con carbonato presentan, en comparación con el disilicato de sodio \delta, morfologías cristalinas modificadas, se disuelven más rápidamente y presentan, en comparación con el disilicato de sodio \delta, una mayor capacidad de enlace con el calcio. De este modo se han descrito silicatos estratificados con la fórmula empírica general x Na_{2}O \cdot y SiO_{2} \cdot z P_{2}O_{5}, en la que la relación entre x e y corresponde a un número desde 0,35 hasta 0,6, la relación entre x y z corresponde a un número desde 1,75 hasta 1.200 y la relación entre y con respecto a z corresponde a un número desde 4 hasta 2.800, en la solicitud de patente DE 196 01 063. La solubilidad de los silicatos estratificados puede aumentarse también si se emplean silicatos estratificados especialmente finos. También pueden emplearse mixturas constituidas por silicatos estratificados cristalinos con otros componentes. En este caso deben citarse, especialmente, las mixturas con los derivados de la celulosa, que presentan ventajas en cuanto a su acción desintegradora y, especialmente, que se emplean en las tabletas de agentes de lavado, así como mixturas con policarboxilatos, por ejemplo el ácido cítrico, o bien con ácidos policarboxílicos polímeros, por ejemplo copolímeros del ácido acrílico.

También pueden emplearse silicatos de sodio amorfos con un módulo Na_{2}O : SiO_{2} desde 1:2 hasta 1:3,3, preferentemente desde 1:2 hasta 1:2,8 y, especialmente, desde 1:2 hasta 1:2,6, que se disuelven de manera retardada y que presentan propiedades de lavado secundario. El retardo de la disolución frente a los silicatos de sodio amorfos tradicionales puede provocarse en este caso de diversas maneras, por ejemplo mediante el tratamiento superficial, mediante la formación de mixturas, por compactación/recalcado o mediante sobresecado. En el ámbito de esta invención se entenderá por el concepto "amorfo" también "amorfo a los rayos X". Es decir que los silicatos no proporcionan reflejos nítidos a los rayos X en los experimentos de difracción de los rayos X, como los que son típicos para las substancias cristalinas, sino que, en todo caso, presentan uno o varios máximos en la irradiación dispersada de los rayos X, que presentan una anchura de varias unidades de grado en el ángulo de difracción. Sin embargo puede conducir incluso a propiedades adyuvantes especialmente buenas el que las partículas de silicato proporcionen en los experimentos de difracción electrónica máximos de difracción acrecentados e incluso nítidos. Esto debe interpretarse de tal manera, que los productos presentan zonas microcristalinas con un tamaño de 10 hasta algunos cientos de nm, siendo preferentes valores de hasta 50 nm como máximo y, especialmente preferentes, de hasta 20 nm como máximo. Son especialmente preferentes los silicatos amorfos recalcados/compactados, los silicatos amorfos en forma de mixturas y los silicatos amorfos a los rayos X sobresecados.

Una zeolita, empleable en caso dado, finamente cristalina, sintética y que contenga agua enlazada es, por ejemplo, la zeolita A y/o P. Como zeolita P será especialmente preferente la zeolita MAP® (producto comercial de la firma Crosfield). Sin embargo son adecuadas también la zeolita X así como las mezclas formadas por A, X y/o P. También puede obtenerse en el comercio y puede emplearse en el ámbito de la presente invención, preferentemente, por ejemplo un cocristalizado formado por zeolita X y por zeolita A (aproximadamente 80% en peso de zeolita X), que se comercializa por la firma CONDEA Augusta S.p.A. bajo la marca registrada VEGOBOND AX® y que puede describirse por medio de la fórmula

nNa_{2}O \cdot (1-n)K_{2}O \cdot Al_{2}O_{3} \cdot (2 - 2.5)SiO_{2} \cdot (3.5 - 5.5) H_{2}O.

Las zeolitas adecuadas presentan un tamaño medio de las partículas menor que 10 \mum (distribución en volumen; método de medición: Coulter Counter) y preferentemente contienen desde un 18 hasta un 22% en peso, especialmente desde un 20 hasta un 22% en peso de agua enlazada.

Evidentemente, es posible también el empleo de los fosfatos conocidos en general como substancias adyuvantes, en tanto en cuanto un empleo de este tipo no deba ser evitado por motivos ecológicos. Entre la pluralidad de fosfatos adquiribles en el comercio han adquirido un gran significado los fosfatos de los metales alcalinos y han adquirido un significado especialmente preferente los trifosfatos de pentasodio y respectivamente de pentapotasio (tripolifosfato de sodio y respectivamente tripolifosfato de potasio) en la industria para los agentes de lavado y de limpieza.

La expresión fosfatos de metales alcalinos abarca en este caso las sales de los metales alcalinos (especialmente de sodio y de potasio) de los diversos ácidos fosfóricos, entre los cuáles se puede distinguir entre el ácido metafosfórico (HPO_{3})_{n} y el ácido ortofosfórico H_{3}PO_{4} además de representantes de mayor peso molecular. Los fosfatos reúnen en este caso varias ventajas en sí mismos: actúan como portadores de álcali, impiden los depósitos de cal sobre las partes de las máquinas o bien las incrustaciones de cal en los tejidos y contribuyen, además, a la potencia de limpieza.

El hidrógenofosfato de sodio, NaH_{2}PO_{4}, existe en forma de dihidrato (densidad 1,91 gcm^{-3}, punto de fusión 60ºC) y a modo de monohidrato (densidad 2,04 gcm^{-3}). Ambas sales son blancas, polvos muy fácilmente solubles en agua, que pierden el agua de cristalización por calentamiento y que se transforman en 200ºC en el difosfato débilmente ácido (hidrógenodifosfato disódico, Na_{2}H_{2}P_{2}O_{7}), a temperaturas más elevadas en el trimetafosfato de sodio (Na_{3}P_{3}O_{9}) y en la sal de Maddrell (véase más adelante). El NaH_{2}PO_{4} tiene reacción ácida; se forma cuando se ajusta ácido fosfórico con lejía de hidróxido de sodio a un valor del pH de 4,5 y se pulveriza el caldo. El dihidrógenofosfato de potasio (fosfato de potasio primario o monobásico, bifosfato de potasio, KDP), KH_{2}PO_{4}, es una sal blanca con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 253ºC [descomposición con formación de polifosfato de potasio (KPO_{3})_{x}] y es fácilmente soluble en agua.

El hidrógenofosfato disódico (fosfato sódico secundario), Na_{2}HPO_{4}, es una sal incolora, cristalina, muy fácilmente soluble en agua. Existe en estado anhidro y con 2 moléculas de agua (densidad 2,066 gmc^{-3}, pérdida de agua a 95ºC), con 7 moléculas de agua (densidad 1,68 gcm^{-3}, punto de fusión 48ºC con pérdida de 5 H_{2}O) y con 12 moléculas de agua (densidad 1,52 gcm^{-3}, punto de fusión 35ºC con pérdida de 5 H_{2}O), a 100ºC se vuelve anhidro y se transforma, por calentamiento más pronunciado, en el difosfato Na_{4}P_{2}O_{7}. El hidrógenofosfato disódico se prepara por neutralización de ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio con empleo de fenolftaleína como indicador. El hidrógenofosfato dipotásico (fosfato de potasio secundario o dibásico), K_{2}HPO_{4}, es una sal blanca, amorfa, que es fácilmente soluble en agua.

El fosfato trisódico, fosfato de sodio terciario, Na_{3}PO_{4}, está constituido por cristales incoloros, que presentan, en forma de dodecahidrato, una densidad de 1,62 gcm^{-3} y un punto de fusión de 73-76ºC (descomposición), a modo de decahidrato (lo que corresponde a un 19-20% de P_{2}O_{5}) un punto de fusión de 100ºC y en forma anhidra (lo que corresponde a un 39-40% de P_{2}O_{5}), presenta una densidad de 2,536 gcm^{-3}. El fosfato trisódico es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina y se prepara por concentración por evaporación de una solución formada exactamente por 1 mol de fosfato disódico y 1 mol de NaOH. El fosfato tripotásico (fosfato de potasio terciario o tribásico) K_{3}PO_{4}, es un polvo blanco, granular, esparcible, con una densidad de 2,56 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 1.340ºC y es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina. De manera ejemplificativa se forma por calentamiento de escoria de Thomas con carbón y sulfato de potasio. A pesar del precio mayor son preferentes muchas veces en la industria de los agentes de limpieza los fosfatos de potasio más fácilmente solubles, por lo tanto más activos, frente a los compuestos de sodio correspondientes.

El difosfato tetrasódico (pirofosfato de sodio), Na_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma anhidra (densidad 2,534 gcm^{-3}, punto de fusión 988ºC, también se ha dado con 880ºC) y a modo de decahidrato (densidad 1,815-1,836 gcm^{-3}, punto de fusión 94ºC con pérdida de agua). Ambas substancias son cristales incoloros, solubles en agua con reacción alcalina. El Na_{4}P_{2}O_{7} se forma por calentamiento de fosfato disódico a temperaturas de > 200ºC o por reacción de ácido fosfórico con carbonato de sodio en proporción estequiométrica y eliminación del agua de la solución mediante pulverización. El decahidrato forma sales complejas con los metales pesados y con los formadores de la dureza y reduce, por lo tanto, la dureza del agua. El difosfato de potasio (pirofosfato de potasio), K_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma de trihidrato y representa un polvo incoloro, higroscópico, con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, que es soluble en agua, siendo el pH de la solución al 1%, a 25ºC, de 10,4.

Mediante condensación del NaH_{2}PO o bien del KH_{2}PO_{4} se forman fosfatos de sodio y de potasio de elevado peso molecular, entre los cuales pueden distinguirse representantes cíclicos, los metafosfatos de sodio o bien de potasio y tipos en forma de cadenas, los polifosfatos de sodio o bien de potasio. Especialmente se utiliza una gran cantidad de denominaciones para estos últimos: fosfato por fusión o por calcinación, sal de Graham, sal de Kurrol y de Maddrell. Todos los fosfatos de sodio y de potasio superiores se denominan, en conjunto, fosfatos condensados.

El trifosfato pentasódico, industrialmente importante, Na_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de sodio), es una sal anhidra o que cristaliza con 6 H_{2}O, no higroscópica, blanca, soluble en agua de la fórmula general NaO-[P(O)(ONa)-O]_{n}-Na con n=3. A temperatura ambiente se disuelven, en 100 g de agua, aproximadamente 17 g, a 60ºC, aproximadamente 20 g, a 100ºC aproximadamente 32 g de la sal exenta de agua de cristalización; al cabo de un calentamiento de dos horas de la solución a 100ºC se forma, por hidrólisis, aproximadamente un 8% de ortofosfato y un 15% de difosfato. En la fabricación del trifosfato pentasódico se hace reaccionar ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio o con lejía de hidróxido de sodio en proporción estequiométrica y se libera la solución del agua, mediante pulverización. De manera similar a lo que ocurre en el caso de la sal de Graham y del difosfato de sodio, el trifosfato pentasódico disuelve muchos compuestos metálicos insolubles (también jabones de cal, etc.). El trifosfato pentapotásico, K_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato de potasio), se comercializa por ejemplo en forma de una solución al 50% en peso (> 23% de P_{2}O_{5}, 25% de K_{2}O). Los polifosfatos de potasio encuentran una amplia aplicación en la industria de los agentes de lavado y de limpieza. Además existen también tripolifosfatos de sodio y de potasio que igualmente pueden emplearse en el ámbito de la presente invención. Éstos se forman, por ejemplo, cuando se hidroliza con KOH el trimetafosfato de
sodio:

(NaPO_{3})_{3} + 2\ KOH \rightarrow Na_{3}K_{2}P_{3}O_{10} + H_{2}O

Estos fosfatos pueden emplearse, según la invención, exactamente igual que el tripolifosfato de sodio, el tripolifosfato de potasio o las mezclas de ambos, también pueden emplearse, según la invención, mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio y de potasio o mezclas constituidas por tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y de potasio o mezclas constituidas por tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y de potasio.

Como coadyuvantes orgánicos pueden utilizarse en los agentes de lavado y de limpieza según la invención, especialmente policarboxilatos o ácidos policarboxílicos, policarboxilatos polímeros, ácido asparagínico, poliacetales, dextrinas oxidadas en caso dado, otros coadyuvantes orgánicos (véase lo expuesto posteriormente), así como fosfonatos. Estas clases de substancias se describen a continuación.

Las substancias estructurantes orgánicas, adecuadas son, por ejemplo, los ácidos policarboxílicos que pueden utilizarse en forma de sus sales de sodio, entendiéndose por ácidos policarboxílicos aquellos ácidos carboxílicos que llevan más de una función ácida. Éstos son, por ejemplo, el ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácidos sacáricos, ácidos aminocarboxílicos, ácido nitrilotriacético (NTA), siempre que este tipo de uso no pueda rechazarse por motivos ecológicos, así como mezclas de los mismos. Las sales preferidas son las sales de los ácidos policarboxílicos, tales como ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido tartárico, ácidos sacáricos y mezclas de las mismas.

También pueden utilizarse los ácidos en sí mismos. Además de su efecto de adyuvante, los ácidos tienen también típicamente la propiedad de un componente de acidificación y, con ello, sirven también para el ajuste de un valor de pH bajo y suave de los agentes de lavados y de los agentes de limpieza. Aquí deben nombrarse especialmente el ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido málico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido glucónico y cualquier mezcla de éstos. Además pueden servir como reguladores del pH, también, los ácidos minerales, especialmente el ácido sulfúrico o las basas, especialmente los hidróxidos de amonio o alcalinos. Tales reguladores están contenidos en los agentes, según la invención, en cantidades preferentemente no mayores que el 20% en peso, especialmente desde un 1,2% en peso hasta un 17% en peso.

Además, como adyuvante son adecuados los policarboxilatos polímeros, estos son, por ejemplo, las sales de metales alcalinos del ácido poliacrílico o del ácido polimetacrílico, por ejemplo aquellas con un peso molecular relativo de 500 a 70.000 g/mol.

En cuanto a los pesos moleculares indicados para los policarboxilatos polímeros se trata, en el sentido de este documento, de pesos moleculares M_{w} promedio en peso de la forma respectiva del ácido, que se determinaron básicamente mediante la cromatografía de permeación en gel (GPC), para lo cual se utilizó un detector de rayos UV. A este respecto, la medición se realizó frente a un patrón externo de ácido poliacrílico, que proporciona valores de peso molecular similares a los reales debido a su afinidad estructural con los polímeros analizados. Estos datos difieren marcadamente de los datos de pesos moleculares para los cuales se utiliza un patrón de ácidos poliestirenosulfónicos. Los pesos moleculares medidos frente a los ácidos poliestirenosulfónicos son en general marcadamente más altos que los pesos moleculares indicados en este documento.

Los polímeros adecuados son especialmente poliacrilatos, que presentan preferentemente un peso molecular de 2.000 a 20.000 g/mol. Debido a su solubilidad superior, de este grupo pueden preferirse a su vez los poliacrilatos de cadena corta, que presentan pesos moleculares de 2.000 a 10.000 g/mol y, de forma especialmente preferente, de 3.000 a 5.000 g/mol.

Además, son adecuados los policarboxilatos copolímeros, especialmente aquellos del ácido acrílico con ácido metacrílico y del ácido acrílico o el ácido metacrílico con ácido maleico. Han demostrado ser especialmente adecuados los copolímeros del ácido acrílico con ácido maleico, que contienen del 50 al 90% en peso de ácido acrílico y del 50 al 10% en peso de ácido maleico. Su peso molecular relativo, referido al ácido libre, es generalmente de 2.000 a 70.000 g/mol, preferentemente de 20.000 a 50.000 g/mol y especialmente de 30.000 a 40.000 g/mol. Los policarboxilatos (co)polímeros pueden utilizarse o bien como polvo o bien como solución acuosa. El contenido de policarboxilatos (co)polímeros en los agentes es preferentemente del 0,5 al 20% en peso, especialmente del 1 al 10% en peso.

Para mejorar la solubilidad, los polímeros pueden contener también ácidos alilsulfónicos como monómeros, como por ejemplo ácido aliloxibencenosulfónico y ácido metalilsulfónico.

También se prefieren especialmente los polímeros biodegradables de más de dos unidades de monómeros diferentes, por ejemplo aquellos que contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido maleico, así como alcohol vinílico o derivados del alcohol vinílico, o contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido 2-alquilalilsulfónico, así como derivados sacáricos.

Otros copolímeros preferentes son aquellos que presentan como monómeros preferentemente acroleína y ácido acrílico/sales del ácido acrílico o bien acroleína y acetato de vinilo.

También deben mencionarse como substancias adyuvantes preferidas los ácidos aminodicarboxílicos polímeros, sus sales o sus substancias precursoras. Se prefieren especialmente los ácidos poliasparagínicos o sus sales y derivados.

Otras substancias adyuvantes adecuadas son los poliacetales, que pueden obtenerse por reacción de dialdehídos con ácidos policarboxílicos, que presentan de 5 a 7 átomos de carbono y al menos 3 grupos hidroxilo. Los poliacetales preferentes se obtienen a partir de dialdehídos, tales como glioxal, glutaraldehído, tereftalaldehído, así como sus mezclas, y a partir de ácidos poliolcarboxílicos, tales como ácido glucónico y/o ácido glucoheptónico.

Otras substancias adyuvantes orgánicas adecuadas son dextrinas, por ejemplo oligómeros o polímeros de hidratos de carbono, que pueden obtenerse por hidrólisis parcial de almidones. La hidrólisis puede realizarse según procedimientos usuales, por ejemplo catalizados por ácidos o enzimas. Preferentemente se trata de productos de hidrólisis con pesos moleculares promedio en el intervalo de 400 a 500.000 g/mol. En este sentido, se prefiere un polisacárido con un equivalente de dextrosa (ED) en el intervalo de 0,5 a 40, especialmente de 2 a 30, con lo que ED es una medida usual para el efecto reductor de un polisacárido en comparación con la dextrosa, que tiene un ED de 100. Son aptas, tanto las maltodextrinas con un ED de entre 3 y 20 y los jarabes de glucosa secos con un ED de entre 20 y 37, como también las denominadas dextrinas amarillas y dextrinas blancas con mayores pesos moleculares en el intervalo de 2.000 a 30.000 g/mol.

En cuanto a los derivados oxidados de este tipo de dextrinas se trata de sus productos de reacción con agentes oxidantes, que sean capaces de oxidar al menos una función de alcohol del anillo del sacárido para dar una función de ácido carboxílico. Los adyuvantes orgánicos, especialmente preferentes para los agentes, según la invención, son los almidones oxidados, o bien sus derivados conocidos por las solicitudes EP 472 042, WO 97/25399 y EP 755 944.

Otros coadyuvantes adecuados son también los oxidisuccinatos y otros derivados de los disuccinatos, preferentemente etilendiaminodisuccinato. En este caso, el ácido N,N'-etilendiamino-N,N-disuccínico (EDDS) se utiliza preferentemente en forma de sus sales de sodio o magnesio. En este contexto se prefieren además los disuccinatos de glicerina y trisuccinatos de glicerina. Las cantidades de uso adecuadas son del 3 al 15% en peso, en formulaciones que contienen zeolita y/o silicato.

Otros adyuvantes orgánicos adecuados son, por ejemplo, los ácidos hidroxicarboxílicos acetilados o sus sales, que, en caso dado, también pueden estar presentes en forma de lactona y que contienen al menos 4 átomos de carbono y al menos un grupo hidroxilo, así como un máximo de dos grupos ácidos.

Otra clase de substancias con propiedades de coadyuvante son los fosfonatos. En este caso se trata especialmente de fosfonatos de hidroxialcanos o aminoalcanos. Bajo los fosfonatos de hidroxialcanos, el 1,1-difosfonato de 1-hidroxietano (HEDP) tiene una especial importancia como coadyuvante. Se utiliza preferentemente como sal de sodio, reaccionando la sal disódica neutra y la sal tetrasódica alcalina (pH 9). Como fosfonatos de aminoalcano se consideran preferentemente el fosfonato de etilendiaminotetrametileno (EDTMP), el fosfonato de dietilentriaminopentametileno (DTPMP), así como sus homólogos superiores. Se utilizan preferentemente en forma de las sales de sodio de reacción neutra, por ejemplo como la sal hexasódica de EDTMP o como sal heptasódica y octasódica de DTPMP. En este sentido, de la clase de los fosfonatos se utiliza preferentemente como adyuvante el HEDP. Además, los fosfonatos de aminoalcano tienen un marcado poder de unión de metales pesados. De manera correspondiente puede preferirse el uso de fosfonatos de aminoalcano, especialmente de DTPMP, especialmente cuando los agentes también contienen agentes de blanqueo, o el uso de mezclas de los fosfonatos mencionados.

Además, todos los compuestos capaces de formar complejos con iones alcalinotérreos pueden utilizarse como coadyuvante.

Las substancias adyuvantes pueden estar contenidas en los agentes, según la invención, en caso dado en cantidades de hasta un 90% en peso. Preferentemente éstas están contenidas en cantidades de hasta un 75% en peso. Los agentes de lavado, según la invención, presentan contenidos en adyuvantes especialmente desde un 5% en peso hasta un 50% en peso. En los agentes según la invención para la limpieza de superficies duras, especialmente para la limpieza mecánica de la vajilla, el contenido en las substancias adyuvantes se encuentra preferentemente entre un 5% en peso y un 88% en peso, no empleándose materiales adyuvantes solubles en agua preferentemente en tales agentes. En una forma preferente de realización de los agentes según la invención especialmente para la limpieza mecánica de la vajilla está contenido desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de adyuvantes orgánicos solubles en agua, especialmente de citratos alcalinos, desde un 5% en peso hasta un 15% en peso de carbonatos alcalinos y desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de disilicatos alcalinos.

Los disolventes, que pueden ser empleados en las composiciones líquidas hasta en forma de gel de los agentes de lavado y de limpieza proceden, de manera ejemplificativa, del grupo de alcoholes monovalentes o polivalentes, de las alcanolaminas o de los glicoléteres, en tanto en cuanto éstos sean miscibles con agua en el intervalo de concentración indicado. Preferentemente se seleccionan los disolventes entre el etanol, el n- o i-propanol, los butanoles, el etilenglicolmetiléter, el etilenglicoletiléter, el etilenglicolpropiléter, el etilenglicolmono-n-butiléter, el dietilenglicol-metiléter, el dietilenglicoletiléter, el propilenglicolmetil-, -etil- o -propil-éter, el dipropilenglicolmonometil- o -etiléter, el metoxi-, etoxi- o butoxitriglicol, el 1-butoxietoxi-2-propanol, el 3-metil-3-metoxibutanol, el propilen-glicol-t-butiléter, así como mezclas de estos disolventes.

Los disolventes pueden emplearse en los agentes de lavado y de limpieza líquidos hasta en forma de gel, según la invención, en cantidades comprendidas entre un 0,1 y un 20% en peso, preferentemente sin embargo por debajo del 15% en peso, y, especialmente, por debajo del 10% en peso.

Para el ajuste de la viscosidad pueden añadirse a las composiciones, según la invención, uno o varios espesantes, o bien sistemas espesantes. Estos productos de elevado peso molecular, que se denominan también agentes de hinchamiento, absorben la mayoría de las veces los líquidos y se hinchan para, finalmente, transformarse en soluciones viscosas reales o en soluciones coloidales.

Los espesantes adecuados son compuestos inorgánicos u orgánicos polímeros. A los espesantes inorgánicos pertenecen, por ejemplo, los ácidos polisilícicos, los minerales de arcilla tales como montmorillonita, zeolitas, ácidos silícicos y bentonitas. Los espesantes orgánicos proceden de los grupos de los polímeros naturales, de los polímeros naturales modificados y de los polímeros completamente sintéticos. Los polímeros que proceden de la naturaleza son por ejemplo, el agar-agar, el carrageno, el tragacanto, la goma arábiga, los alginatos, las pectinas, las poliosas, el harina de guar, el harina de algarroba, los almidones, las dextrinas, las gelatinas y las caseínas. Los productos naturales modificados, que se emplean como espesantes, proceden ante todo del grupo de los almidones y de las celulosas modificadas.

De manera ejemplificativa pueden citarse en este caso la carboximetilcelulosa y otros éteres de celulosa, la hidroxi-
etil- y -propilcelulosa así como éteres de flor de harina. Los espesantes completamente sintéticos son polímeros tales como compuestos de poliacrilato y de polimetacrilato, polímeros vinílicos, ácidos policarboxílicos, poliéteres, poliiminas, poliamidas y poliuretanos.

Los espesantes pueden estar contenidos en cantidades de hasta un 5% en peso, preferentemente desde un 0,05 hasta un 2% en peso y, de forma especialmente preferente, desde un 0,1 hasta un 1,5% en peso, referido a la composición acabada.

Los agentes de lavado y de limpieza según la invención pueden contener en caso dado a modo de otros componentes usuales, agentes secuestrantes, electrolitos y otros productos auxiliares tales como abrillantadores ópticos, inhibidores del agrisado, inhibidores de la corrosión de la plata, inhibidores del corrido de los colores, inhibidores de la espuma, productos abrasivos, colorantes y/o productos odorizantes, así como productos activos microbianos y/o absorbedores de los UV.

Los agentes para el lavado de los artículos textiles, según la invención, pueden contener abrillantadores ópticos del tipo de los derivados del ácido diaminoestilbendisulfónico o bien de sus sales de metales alcalinos. Son adecuadas por ejemplo, sales del ácido 4,4'-bis(2-anilino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)estilben-2,2'-disulfónico o compuestos de constitución similar, que porten, en lugar del grupo morfolino, un grupo dietanolamino, un grupo metilamino, un grupo anilino o un grupo 2-metoxietilamino. Además pueden estar presentes abrillantadores del tipo de los difenilestirilos substituidos, por ejemplo las sales alcalinas del 4,4'-bis(2-sulfoestiril)-difenilo, del 4,4'-bis(4-cloro-3-sulfoestiril)-difenilo, o del 4-(4-cloroestiril)-4'-(2-sulfoestiril)-difenilo. También pueden emplearse mezclas de los abrillantadores anteriormente citados.

Los inhibidores del agrisado tienen como cometido mantener en suspensión en el baño la suciedad desprendida de las fibras textiles. Para ello son adecuados los coloides solubles en agua, la mayoría de las veces de naturaleza orgánica, por ejemplo los almidones, las colas, las gelatinas, las sales de los ácidos etercarboxílicos o de los ácidos etersulfónicos de los almidones o de la celulosa o sales de ésteres ácidos del ácido sulfúrico de la celulosa o de los almidones. También son adecuadas para esta finalidad poliamidas que contienen grupos ácidos, solubles en agua. Además pueden emplearse otros derivados del almidón diferentes de los que se han citado precedentemente por ejemplo aldehídoalmidones. Preferentemente se emplearán éteres de celulosa tales como carboximetilcelulosa (sal de Na), metilcelulosa, hidroxialquilcelulosa y éteres mixtos, tales como metilhidroxietilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y sus mezclas, por ejemplo en cantidades desde 0,1 hasta 5% en peso, referido a los agentes.

Con objeto de provocar una protección contra la corrosión de la plata, pueden emplearse en los agentes de limpieza según la invención para la vajilla inhibidores de la corrosión de la plata. Éstos son conocidos por el estado de la técnica, por ejemplo benzotriazoles, cloruro férrico(III) o CoSO_{4}. Tal como se conoce, por ejemplo, por la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 736084 B1, son especialmente adecuados para el empleo conjunto con enzimas los inhibidores de la corrosión de la plata constituidos por sales y/o complejos de manganeso, de titanio, de circonio, de hafnio, de vanadio, de cobalto o de cerio, en los cuales están presentes los metales citados en uno de los niveles de oxidación II, III, IV, V o VI. Ejemplos de tales compuestos son MnSO_{4}, V_{2}O_{5}, V_{2}O_{4}, VO_{2}, TiOSO_{4}, K_{2}TiF_{6}, K_{2}ZrF_{6}, Co(NO_{3})_{2}, Co(NO_{3})_{3}, así como sus mezclas.

Los productos activos "desprendedores de la suciedad" "Soil-Release" o "Soil-Repellents" son, en la mayoría de los casos, polímeros, que proporcionan a las fibras de la colada propiedades que la hacen repeler la suciedad cuando se emplean en un agente de lavado y/o favorecen la capacidad desprendedora de la suciedad de los restantes componentes de los agentes de lavado. Un efecto comparable puede observarse también cuando se emplean en agentes de limpieza para superficies duras.

Los productos activos, desprendedores de la suciedad (Soil-Release) especialmente activos y conocidos desde hace mucho tiempo son copoliésteres con unidades de ácidos dicarboxílicos, de alquilenglicol y de polialquilenglicol. Ejemplos a este respecto son copolímeros o polímeros mixtos constituidos por tereftalato de polietileno y polioxietilenglicol (DT 16 17 141, o bien DT 22 00 911). Se han citado en la solicitud de patente alemana publicada, no examinada DT 22 53 063 agentes ácidos que contienen, entre otras cosas, un copolímero constituido por un ácido carboxílico dibásico y por un alquilen- o cicloalquilenpoliglicol. Los polímeros constituidos por tereftalato de etileno y por tereftalato de óxido de polietileno y su empleo en los agentes de lavado están descritos en las memorias descriptivas de las patentes alemanas DE 28 57 292 y DE 33 24 258 y en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 253 567. La patente europea EP 066944 se refiere a agentes, que contienen un copoliéster constituido por etilenglicol, polietilenglicol, ácidos dicarboxílicos aromáticos y ácidos dicarboxílicos aromáticos sulfonados en determinadas proporciones molares. Se conocen por la patente europea EP 0 185 427 poliésteres cerrados en los extremos con grupos metilo o con grupos etilo con unidades de tereftalato de etileno y/o de propileno y con unidades de tereftalato de óxido de polietileno y agentes de lavado que contienen tales polímeros desprendedores de la suciedad. La patente europea EP 0 241984 se refiere a poliéster que contiene, además de grupos de oxietileno y de unidades de ácido tereftálico, también unidades de etileno substituidas así como unidades de glicerina. Se conocen por la patente europea EP 0 241 985 poliésteres que contienen, además de grupos de óxido de etileno y de unidades de ácido tereftálico, grupos de 1,2-propileno, 1,2-butileno y/o 3-metoxi-1,2-propileno así como unidades de glicerina y que están cerrados en los grupos extremos con grupos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono. Se conocen por la solicitud de patente europea EP 0 272033 poliésteres cerrados en los grupos extremos al menos en parte por restos alquilo o por restos acilo con 1 a 4 átomos de carbono con unidades de tereftalato de poli-propileno y tereftalato de polioxietileno. La patente europea EP 0 274 907 describe poliésteres desprendedores de la suciedad que contienen tereftalato cerrados en los grupos extremos con sulfoetilo. Según la solicitud de patente europea EP 0 357 280 se preparan mediante sulfonación de los grupos extremos insaturados, poliésteres desprendedores de la suciedad con unidades de tereftalato, de alquilenglicol y de poli-glicol con 2 a 4 átomos de carbono. La solicitud de patente internacional WO 95/32232 se refiere a poliésteres ácidos, aromáticos, con capacidad para el desprendimiento de la suciedad. Se conocen por la solicitud de patente internacional WO 97/31085 productos activos no polímeros repelentes a la suciedad para materiales constituidos por algodón con varias unidades funcionales: una primera unidad, que puede ser catiónica, por ejemplo, es capaz de adsorberse sobre la superficie del algodón mediante interacción electrostática, y una segunda unidad, que está formada de manera hidrófoba, que es responsable de la permanencia del producto activo sobre la superficie límite entre el agua/algodón.

A los inhibidores del corrido de los colores que entran en consideración para el empleo en los agentes de lavado de artículos textiles, según la invención, pertenecen, especialmente, las polivinilpirrolidonas, los polivinilimidazoles, los N-óxidos polímeros tal como el poli-(N-óxido de vinilpiridina) y los copolímeros de vinilpirrolidona con vinilimidazol.

Cuando se emplean en procedimientos de limpieza a máquina puede ser ventajoso añadir los agentes inhibidores de la espuma. Como inhibidores de la espuma son adecuados, por ejemplo, jabones de origen natural o sintético, que presenten una elevada proporción en ácidos grasos con 18 a 24 átomos de carbono. Los inhibidores de la espuma de tipo no tensioactivos, adecuados, son, por ejemplo, órganopolisiloxanos y sus mezclas con ácido silícico microfino, en caso dado silanizado así como parafinas, ceras, ceras microcristalinas y sus mezclas con ácido silícico silanizado o biesteariletilendiamida. Ventajosamente se emplearán también mezclas constituidas por diversos inhibidores de la espuma, por ejemplo aquellas constituidas por siliconas, parafinas o ceras. Son preferentes los inhibidores de la espuma, especialmente los inhibidores de la espuma que contienen silicona y/o parafina, enlazados sobre una substancia de soporte granular, soluble en agua o bien dispersable en agua. Son especialmente preferentes en este caso mezclas constituidas por parafinas y por biesteariletilendiamidas.

Un agente de limpieza según la invención para superficies duras puede contener, además, componentes con actividad abrasiva, especialmente del grupo que comprende harina de cuarzo, harina de madera, harina de material sintético, cretas y microesferas así como sus mezclas. Los productos abrasivos están contenidos en los agentes de limpieza según la invención preferentemente en una proporción no mayor que el 20% en peso, especialmente desde el 5% en peso hasta el 15% en peso.

A los agentes de lavado y de limpieza se les añaden colorantes y productos odorizantes para mejorar la impresión estética de los productos y para poner a disposición del usuario, además del rendimiento del lavado y de la limpieza. Un producto "típico e inconfundible" desde el punto de vista estético y sensorial. Como esencias perfumantes o bien productos odorizantes pueden utilizarse compuestos odorizantes individuales, por ejemplo los productos sintéticos del tipo de los ésteres, de los éteres, de los aldehídos, de las cetonas, de los alcoholes y de los hidrocarburos. Los compuestos odorizantes del tipo de los ésteres son, por ejemplo, el acetato de bencilo, el isobutirato de fenoxietilo, el acetato de p-terc.-butilciclohexilo, el acetato de linalilo, el acetato de dimetilbencilcarbinilo, el acetato de feniletilo, el benzoato de linalilo, el formiato de bencilo, el glicinato de etilmetilfenilo, el propionato de alilciclohexilo, el propionato de estiralilo y el salicilato de bencilo. A los éteres pertenecen, por ejemplo, el benciletiléter, a los aldehídos pertenecen, por ejemplo los alcanales lineales con 8 a 18 átomos de carbono, el citral, el citronelal, el citroneliloxiacetaldehído, el ciclamenaldehído, el hidroxicitronelal, el lilial y el bourgeonal, a las cetonas pertenecen, por ejemplo la ionona, la \alpha-isometilionona y la metilcedrilcetona, a los alcoholes pertenecen el anetol, el citronelol, el eugenol, el geraniol, el linalool, el alcohol feniletílico y el terpineol, a los hidrocarburos pertenecen, principalmente, los terpenos, tales como limoneno y el pineno. Sin embargo se prefieren mezclas de diferentes productos odorizantes, que produzcan, en conjunto, una nota de olor agradable. Tales esencias perfumantes también pueden contener mezclas de productos odorizantes naturales, como a las que pueden obtenerse a partir de fuentes vegetales, por ejemplo la esencia de pino, de cítricos, de jazmín, de pachulí, de rosas o Ylang-Ylang. También son adecuadas la esencia de salvia romana, la esencia de manzanilla, la esencia de clavel, la esencia de melisa, la esencia de de menta, la esencia de de hojas de canela, la esencia de pétalos de tilo, la esencia de bayas de enebro, la esencia de vetiver, la esencia de olibano, la esencia de galbano y de labdano, así como esencia de azahar, la esencia de neroli, la esencia de cáscara de naranja y de madera de sándalo. Usualmente el contenido de los colorantes en los agentes de lavado y de limpieza se encuentra por debajo del 0,01% en peso, mientras que los productos odorizantes pueden constituir hasta un 2% en peso del conjunto de la formulación.

Los productos odorizantes pueden incorporarse directamente en los agentes de lavado y de limpieza, no obstante también puede ser ventajoso disponer los productos odorizantes sobre soportes, que refuercen la adherencia del perfume sobre la ropa y que se encarguen de que el olor de los materiales textiles se mantenga por mucho tiempo mediante una liberación lenta del olor, especialmente de los artículos textiles tratados. Se han acreditado, por ejemplo, como materiales de soporte las ciclodextrinas, pudiéndose revestir los complejos de ciclodextrina-perfume adicionalmente con otros agentes auxiliares. Otro soporte preferente para los productos odorizantes es la zeolita X, descrita, que puede absorber también productos odorizantes en lugar de o en mezcla con los tensioactivos. Son preferentes los agentes de lavado y de limpieza, que contengan la zeolita X, descrita, y los productos odorizantes, que estén al menos parcialmente absorbidos en la zeolita.

Los colorantes preferentes, cuya elección no constituye ninguna dificultad para el técnico en la materia, tienen una elevada estabilidad al almacenamiento y son insensibles frente a los restantes componentes del agente y contra la luz así como están exentos de cualquier substantividad marcada frente a las fibras textiles para no colorearlas.

Para la lucha contra los microorganismos, los agentes de lavado o de limpieza pueden contener productos activos antimicrobianos. En este caso se distingue según el espectro antimicrobiano y el mecanismo de actuación entre bacteriostáticos y bactericidas, fungistáticos y fungicidas, etc. Los productos importantes de estos grupos son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio, los alquilarilsulfonatos, los halógenofenoles y el mercuriacetato de fenol. Las expresiones de efecto antimicrobiano y producto activo antimicrobiano tienen en el ámbito de las enseñanzas según la invención el significado usual en el ramo, que se han dado por ejemplo en la publicación de K. H. Wallhäußer en "Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5ª edición - Stuttgart; New York: Thieme, 1995), pudiéndose emplear todas las substancias allí descritas con efecto antimicrobiano. Los productos activos antimicrobianos adecuados se eligen, preferentemente, entre el grupo de los alcoholes, las aminas, los aldehídos, los ácidos antimicrobianos o bien sus sales, los ésteres de los ácidos carboxílicos, las amidas de ácido, los fenoles, los derivados de fenol, los difenoles, los difenilalcanos, los derivados de urea, los acetales así como los formales oxigenados y nitrogenados, las benzamidinas, las isotiazolinas, los derivados de ftalimida, los derivados de piridina, los compuestos tensioactivos antimicrobianos, las guanidinas, los compuestos anfóteros antimicrobianos, las quinolinas, el 1,2-dibromo-2,4-dicianobutano, el yodo-2-propil-butil-carbamato, el yodo, los yodóforos, los compuestos peroxo, los compuestos halogenados así como mezclas arbitrarias de los precedentes.

El producto activo antimicrobiano puede elegirse en este caso entre etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanodiol, fenoxietanol, 1,2-propilenglicol, glicerina, ácido undecilénico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido dihidracético, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonitrilo (MMA), 2-bencil-4-clorofenol, 2,2'-metilen-bis-(6-bromo-4-clorofenol), 4,4'-dicloro-2'-hidroxidifeniléter (Dichlosan), 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifeniléter (Trichlosan), clorohexidina, N-(4-clorofenil)-N-(3,4-diclorofenil)-urea, dihidrocloruro de N,N'-(1,10-decan-diildi-1-piridinil-4-iliden)-bis-(1-octanoamina), N,N'-bis-(4-clorofenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecanodiimidoamida, glucoprotaminas, compuestos cuaternarios tensioactivos antimicrobianos, guanidinas con inclusión de las biguanidinas y de las poliguanidinas, tales como por ejemplo el dihidrocloruro de 1,6-bis-(2-etilhexil-biguanido-hexano), el tetrahidrocloruro del 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenil-N_{1},N_{1}-metildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,6-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-beta-(p-metoxifenil) diguanido-N_{5},N_{5}']-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-alfa-metil-.beta.-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-nitrofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, tetrahidrocloruro de omega:omega'-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-metilfenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4,5-triclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-alfa-(p-clorofenil)etildiguanido-N_{5},N_{5}']hexano, dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')m-xileno, dihidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, tetrahidrocloruro de 1,10-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-decano, tetrahidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, etilen-bis-(1-tolilbiguanido), etilen-bis-(p-tolil biguanida), etilen-bis-(3,5-dimetilfenilbiguanida), etilen-bis-(p-terc.-amilfenilbiguanida), etilen-bis-(nonilfenilbiguanida), etilen-bis-(fe-
nilbiguanida), etilenbis-(N-butilfenilbiguanida), etilen-bis(2,5-dietoxifenilbiguanida), etilen-bis (2,4-dimetilfenil biguanida), etilen-bis (o-difenilbiguanida), etilen-bis (amil naftilbiguanida mixta), N-butil-etilen-bis-(fenilbiguanida), trimetileno bis (o-tolilbiguanida), N-butil-trimetilo-bis-(fenilbiguanida) y las sales correspondientes tales como los acetatos, los gluconatos, los hidrocloruros, los hidrobromuros, los citratos, los bisulfitos, los fluoruros, los polimaleatos, los N-cocoalquilsarcosinatos, los fosfitos, los hipofosfitos, los perflúoroctanoatos, los silicatos, los sorbatos, los salicilatos, los maleatos, los tartratos, los fumaratos, los etilendiaminotetraacetatos, los iminodiacetatos, los cinamatos, los tiocianatos, los arginatos, los piromelitatos, los tetracarboxibutiratos, los benzoatos, los glutaratos, los monoflúorfosfatos, los perflúorpropionatos así como mezclas arbitrarias de los mismos. Además son adecuados los derivados halogenados del xileno y del cresol, tales como el p-clorometacresol o el p-clorometa-xileno, así como productos activos antimicrobianos naturales de origen natural (por ejemplo procedentes de especias o de hierbas aromáticas), de origen animal así como microbiano. Preferentemente pueden emplearse compuestos cuaternarios antimicrobianos, de acción tensioactiva, un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal y/o un producto activo antimicrobiano natural de origen animal, de manera extraordinariamente preferente al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal del grupo que comprende la cofeína, la teobromina y la teofilina así como esencias etéreas tales como eugenol, timol y geraniol, y/o al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen animal del grupo que comprende los enzimas tales como la proteína de leche, la lisozima y la lactoperoxidasa, y/o al menos un compuesto cuaternario antimicrobiano, de acción tensioactiva, con un grupo amonio, sulfonio, fosfonio, yodonio o arsonio, compuestos peroxo y compuestos clorados. También pueden emplearse productos de origen microbiano, las denominadas bacteriocinas.

Los compuestos de amonio cuaternario (QAV), adecuados como productos activos antimicrobianos, de la fórmula general (R^{1})(R^{2})(R^{3})(R^{4}) N^{+} X^{-}, en la que R^{1} hasta R^{4} son restos alquilo con 1 hasta 22 átomos de carbono, restos aralquilo con 7 hasta 28 átomos de carbono o restos heterocíclicos, iguales o diferentes, formando dos restos o, en el caso de un enlace aromático tal como en la piridina, incluso tres restos, junto con el átomo de nitrógeno del heterociclo, por ejemplo un compuesto de piridinio o un compuesto de imidazolinio y X^{-} significa iones halogenuro, iones sulfato, iones hidroxi o iones similares. Para un efecto antimicrobiano óptimo uno de los restos presenta al menos preferentemente una longitud de la cadena de 8 hasta 18, especialmente de 12 hasta 16 átomos de
carbono.

Los QAV pueden obtenerse mediante reacción de aminas terciarias con agentes de alquilación, tales como por ejemplo cloruro de metilo, cloruro de bencilo, sulfato de dimetilo, bromuro de dodecilo así como también con óxido de etileno. La alquilación de las aminas terciarias con un resto alquilo largo y dos grupos metilo se consigue de forma especialmente sencilla, también la cuaternización de las aminas terciarias con dos restos largos y un grupo metilo puede llevarse a cabo con ayuda de cloruro de metilo bajo condiciones suaves. Las aminas, que disponen de un resto alquilo largo o de un resto alquilo substituido por hidroxi, son menos reactivas y se cuaternizarán preferentemente con sulfato de dimetilo.

Los QAV adecuados son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio (cloruro de N-alquil-N,N-dimetil-bencilamonio, CAS No. 8001-54-5), benzalcona B (cloruro de m,p-diclorobencil-dimetil-alquilamonio con 12 átomos de carbono, CAS No. 58390-78-6), cloruro de benzoxonio (cloruro de bencil-dodecil-bis-(2-hidroxietil)-amonio), bromuro de cetrimonio (bromuro de N-hexadecil-N,N-trimetil-amonio, CAS No. 57-09-0), cloruro de bencetonio (cloruro de N,N-dimetil-N-[2-[2-[p-1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-bencilamonio, CAS No. 121-54-0), cloruro de dialquildimetilamonio tales como el cloruro de di-n-decil-dimetil-amonio (CAS No. 7173-51-5-5), bromuro de didecildi-metilamonio (CAS No. 2390-68-3), cloruro de dioctil-dimetil-amonio, cloruro de 1-cetilpiridinio (CAS No. 123-03-5) y yoduro de tiazolinio (CAS No. 15764-48-1) así como sus mezclas. Los QAV especialmente preferentes son los cloruros de benzalconio con restos alquilo con 8 hasta 18 átomos de carbono, especialmente el cloruro de alquil-bencil-dimetil-amonio con 12 hasta 14 átomos de carbono.

Los halogenuros de benzalconio y/o los halogenuros de benzalconio substituidos son obtenibles comercialmente por ejemplo como Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/Sherex y Hyamine® ex Lonza, así como Bardac® ex Lonza. Otros productos activos antimicrobianos, adquiribles en el comercio son el cloruro de N-(3-cloroalil)-hexaminio tales como Dowicide® y Dowicil® ex Dow, cloruro de benzoetonio tal como Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, cloruro de metilbenzoetonio tal como Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, cloruro de cetilpiridinio tal como Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Los productos activos antimicrobianos se emplean en cantidades desde 0,0001% en peso hasta 1% en peso, preferentemente desde 0,001% en peso hasta 0,8% en peso, de forma especialmente preferente desde 0,005% en peso hasta 0,3% en peso y, especialmente, desde 0,01 hasta 0,2% en peso.

Los agentes pueden contener absorbedores de los UV (absorbedores UV), que se absorban en los artículos textiles tratados y que mejoren la estabilidad frente a la luz de las fibras y/o la estabilidad frente a la luz de otros componentes de la receta. Se entenderán por absorbedores de los UV substancias orgánicas (filtros protectores contra la luz), que sean capaces de absorber la irradiación ultravioleta y de desprender de nuevo la energía absorbida por ejemplo en forma de irradiación de longitud de onda más larga, por ejemplo en forma de calor.

Los compuestos que presentan estas propiedades deseadas son, por ejemplo, los compuestos activos mediante desactivación en ausencia de irradiación y los derivados de la benzofenona con substituyentes en la posición 2 y/o en la posición 4. Además son adecuados también los benzotriazoles substituidos, los acrilatos substituidos por fenilo en la posición 3 (derivados del ácido cinámico, en caso dado con grupos ciano en la posición 2), salicilatos, complejos orgánicos de Ni así como productos naturales tales como la umbeliferona y los ácidos urocanoicos corporales. Tienen un significado especial los derivados de bifenilo y, ante todo, los derivados los estilbeno como los que se han descrito por ejemplo en la publicación EP 0728749 A y que pueden adquirirse en el comercio como Tinosorb® FD o Tinosorb® FR ex Ciba. Como absorbedores de las UV-B pueden citarse: el 3-bencilidenalcanfor o bien el 3-bencilidennoralcanfor y sus derivados, por ejemplo el 3-(4-metilbenciliden)alcanfor, como se describe en la publicación EP 10693471 B1; los derivados del ácido 4-aminobenzoico, preferentemente el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-etilhexilo, el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-octilo y el 4-(dimetilamino)benzoato de amilo; los ésteres del ácido cinámico, preferentemente el 4-metoxicinamato de 2-etilhexilo, el 4-metoxicinamato de propilo, el 4-metoxicinamato de isoamilo, el 2-ciano-3-fenil-cinamato de 2-etilhexilo (octocrileno); los ésteres del ácido salicílico, preferentemente el salicilato de 2-etilhexilo, el salicilato de 4-isopropilbencilo, el salicilato de homometilo; los derivados de la benzofenona, preferentemente la 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, la 2-hidroxi-4-metoxi-4'-metilbenzofenona, la 2,2'-dihidroxi-4-metoxibenzofenona; los ésteres del ácido benzalmalónico, preferentemente el 4-metoxibenzalmalonato de 2-etilhexilo; los derivados de triazina, tales como, por ejemplo, la 2,4,6-trianilino-(p-carbo-2'-etil-1'-hexiloxi)-1,3,5-triazina y la octil triazona, como se han descrito en la publicación EP 0818450 A1 o dioctil butamido triazona (Uvasorb® HEB); las propano-1,3-dionas tal como, por ejemplo, la 1-(4-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona; los derivados de cetotriciclo(5.2.1.0)decano, tales como los que se han descrito en la publicación EP 0694521 B1. Además, son adecuados el ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico y sus sales alcalinas, alcalinotérreas, de amonio, de alquilamonio, de alcanolamonio y de glucamonio; los derivados de ácidos sulfónicos de benzofenonas, preferentemente el ácido 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfónico y sus sales; los derivados de ácidos sulfónicos del 3-bencilidenalcanfor tales como, por ejemplo, el ácido 4-(2-oxo-3-bornilidenmetil)bencenosulfónico y el ácido 2-metil-5-(2-oxo-3-borniliden)sulfónico y sus sales.

Como filtros típicos contra los UV-A típicos entran en consideración de derivados del benzoilmetano, tales como, por ejemplo, la 1-(4'-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona, el 4-terc.-butil-4'-metoxidebenzoilmetano (Parsol 1789), la 1-fenil-3-(4'-isopropilfenil)-propano-1,3-diona así como compuestos de enamina, como los que se han descrito en la publicación DE 19712033 A1 (BASF). Los filtros para los UV-AS y UV-B pueden emplearse también, evidentemente, en mezcla. Además de los productos solubles, citados, entran en consideración para esta finalidad también pigmentos insolubles, protectores contra la luz, en concreto óxidos metálicos finamente dispersados o bien sales. Ejemplos de los óxidos metálicos adecuados son, especialmente, el dióxido de titanio y, además, los óxidos de hierro, de circonio, de silicio, de manganeso, de aluminio y de cerio así como sus mezclas. Como sales pueden emplearse silicatos (talco), sulfato de bario o estearato de cinc. Los óxidos y las sales se emplearán en forma de pigmentos listos para emulsiones destinadas al cuidado de la piel y para la protección de la piel y para productos cosméticos decorativos. Las partículas deben presentar en este caso un diámetro medio menor que 100 nm, preferentemente comprendido entre 5 y 50 nm y, especialmente, comprendido entre 15 y 30 nm. Éstas pueden presentar una forma esférica, sin embargo, pueden emplearse también aquellas partículas que tengan una forma elipsoide o que se diferencie de la configuración esférica de otro modo. Los pigmentos pueden presentarse también tratados superficialmente, es decir hidrofilado o hidrofobado, Ejemplos típicos son dióxidos de titanio revestidos, tales como, por ejemplo dióxido de titanio T 805 (Degussa) o Eusolex® T2000 (Merck); como agentes de revestimiento hidrófobos entran en consideración todas las siliconas y, en este caso, especialmente los trialcoxioctilsilanos o simeticonas. Preferentemente se empleará el óxido de cinc micronizado. Otros filtros adecuados, protectores contra la luz UV pueden verse en la recopilación de P.Finkel en SÖFW-Journal 122, (1966), página
543.

Los absorbedores de los UV se emplearán usualmente en cantidades desde 0,01% en peso hasta 5% en peso, preferentemente desde 0,03% en peso hasta 1% en peso.

A los componentes usuales para los agentes de lavado y de limpieza pertenecen, en general, también enzimas con actividad de lavado y respectivamente con actividad de limpieza. Al mismo tiempo los agentes de lavado o de limpieza, que están caracterizados por otros enzimas adicionales, además de la proteína según la invención, representan formas preferentes de realización de la presente invención. A éstas pertenecen otras proteasas, así como también óxidorreductasas, cutinasas, esterasas y/o hemicelulasas y, de forma especialmente preferente, las lipasas, las amilasas, las celulasas y/o las \beta-glucanasas.

Desde hace décadas se utilizan los enzimas tales como las proteasas, las amilasas, las lipasas o las celulasas como componentes activos en los agentes de lavado y de limpieza. Su contribución respectiva con relación al rendimiento del lavado o bien de limpieza del agente correspondiente consiste, en el caso de las proteasas, en la capacidad que tienen para degradar las impurezas que contienen proteína, en el caso de las amilasas, en la degradación de las impurezas que contienen almidón y, en el caso de las lipasas, en la actividad disociadora de la grasa. Las celulasas son empleadas, especialmente, debido a su contribución a las prestaciones secundarias de lavado de un agente de lavado y debido a su efecto sobre las fibras en los artículos textiles, preferentemente en los agentes de lavado. Los respectivos productos de hidrólisis son atacados por los restantes componentes de los agentes de lavado y de limpieza disueltos, emulsionados o suspendidos o, debido a su elevada solubilidad en el baño de lavado, se separan por flotación de tal manera, que se producen efectos sinérgicos entre los enzimas y los restantes componentes.

Las proteasas pueden ejercer sobre las fibras naturales, especialmente sobre lana o sobre seda un efecto comparable con el de la contribución al rendimiento del lavado secundario de un agente por medio de la celulasa. Mediante el efecto sobre la estructura superficial de tales tejidos pueden ejercer un efecto alisante sobre el material y, por lo tanto, oponerse al afieltrado.

Otros enzimas amplían en rendimiento de limpieza del material correspondiente y su correspondiente rendimiento enzimático específico. A éstos pertenecen, por ejemplo, las \beta-glucanasas (WO 99/06515 y WO 99/06516), las lacasas (WO 00/39306) o los enzimas que disuelven la pectina (WO 00/42145), que se utilizan especialmente en agentes de lavado especiales.

Para el empleo en los agentes según la invención entran en consideración, en primer lugar los enzimas obtenidos a partir de microorganismos, tales como bacterias u hongos. Éstos se obtienen, de manera conocida, mediante procesos de fermentación a partir de microorganismos adecuados, que han sido descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patente alemanas publicadas, no examinadas DE 1940488, y DE 2121397, en las memorias descriptivas de las patentes norteamericanas US 3623957, US 4264738, en la solicitud de patente europea EP 006638 así como en la solicitud de patente internacional WO 91/02792.

Una proteína según la invención y/o otra proteína contenida pueden protegerse, especialmente durante el almacenamiento, mediante estabilizantes por ejemplo contra la desnaturalización, contra la descomposición o contra la inactivación por ejemplo debido a influjos físicos, a la oxidación o a la disociación proteolítica.

Un grupo de estabilizantes está constituido por los inhibidores reversibles de la proteasa, que se disocien en el momento de la dilución del agente con el baño de lavado. Para esta finalidad se han establecido el hidrocloruro de benzamidina y la leupeptina. Frecuentemente se emplean borax, ácidos bóricos, ácidos borónicos o sus sales o ésteres, entre ellos ante todo los derivados con grupos aromáticos, por ejemplo los ácidos fenilborónicos ortosubstituidos según la publicación WO 95/12655, metasubstituidos según la publicación WO 92/19707 y para-substituidos según la publicación US 5 972 873, o bien sus sales o ésteres. En las solicitudes WO 98/13460 y EP 583 534 se han divulgado peptidoaldehídos, es decir oligopéptidos con un extremo C reducido y, concretamente, aquellos con 2 hasta 50 monómeros, para la inhibición reversible de las proteasas en los agentes de lavado y de limpieza. A los inhibidores reversibles péptidos de las proteasas pertenecen, entre otros, el Ovomucoid (WO 93/00418). De manera ejemplificativa se han divulgado en la solicitud WO 00/01826 inhibidores reversibles de los péptidos, específicos, para la subtilisina de proteasa para el empleo en agentes que contienen proteasa y en la publicación WO 00/01831 se han divulgado proteínas de fusión, correspondientes, a partir de proteasas e inhibidores.

Otros estabilizantes enzimáticos son los aminoalcoholes tales como la mono-, la di-, la trietanol- y -propanolamina y sus mezclas, los ácidos carboxílicos alifáticos con hasta 12 átomos de carbono, como los que se conocen por ejemplo por las solicitudes EP 0 378 261 y WO 97/05227, tales como el ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos o sales de los ácidos citados. En la solicitud DE 196 50 537 se han divulgado para esta finalidad alcoxilatos de amidas de ácidos grasos cerrados en los grupos extremos. Algunos ácidos orgánicos, empleados como adyuvantes son capaces de estabilizar además un enzima contenido como se ha divulgado en la publicación WO 97/18287.

Los alcoholes alifáticos inferiores, ante todo sin embargo los polioles, tales como por ejemplo la glicerina, el etilenglicol, el propilenglicol o la sorbita son otros estabilizantes de los enzimas empleados frecuentemente. Del mismo modo se utilizan sales de calcio, tal como por ejemplo el acetato de calcio o el formiato de calcio divulgado en la memoria descriptiva de la patente EP 0 028 865 con esta finalidad, y las sales de magnesio, por ejemplo según la solicitud europea EP 0 378 262.

Los oligómeros de poliamida (WO 99/43780) o los compuestos polímeros tales como la lignina (WO 97/00932), los copolímeros de vinilo solubles en agua (EP 828 762) o, como se ha divulgado en la publicación EP 702 712, los éteres de la celulosa, los polímeros acrílicos y/o las poliamidas estabilizan las preparaciones enzimáticas entre otras cosas frente a los efectos físicos o frente a las oscilaciones del valor del pH. Los polímeros que contienen N-óxidos de poliamina (EP 587 550 y EP 581 751) actúan simultáneamente como estabilizantes de los enzimas y como inhibidores del corrido de los colores. Otros estabilizantes polímeros son los polioxialquilenos con 8 hasta 18 átomos de carbono lineales divulgados en la publicación WO 97/05227 junto a otros componentes. Los alquilpoliglicósidos pueden estabilizar los componentes enzimáticos del agente según la invención como en las solicitudes WO 97/43377 y WO 98/45396 e incluso pueden acrecentar su rendimiento. Los compuestos que contienen N, reticulados, como los que se han divulgado en la publicación WO 98/17764, cumplen una doble función como agentes desprendedores de la suciedad (Soil-release) y como estabilizantes de los enzimas. Los polímeros hidrófobos, no iónicos, actúan en una mezcla con otros estabilizantes según la solicitud WO 97/32958 de manera estabilizante sobre una celulasa de tal manera, que también pueden ser adecuados tales componentes u otros componentes similares para el enzima esencial según la invención.

Los agentes reductores y los antioxidantes aumentan la estabilidad de los enzimas frente a la descomposición por oxidación como se ha divulgado entre otras, en la publicación EP 780 466. Los agentes reductores que contienen azufre son conocidos, por ejemplo, por las memorias descriptivas de las patentes EP 0 080 748 y EP 0 080 223. Otros ejemplos son el sulfito de sodio (EP 533 239) y los azúcares reductores (EP 656 058).

Muchas veces se utilizan también combinaciones de estabilizantes, por ejemplo constituidas por polioles, ácido bórico y/o borax como se divulga en la solicitud WO 96/31589, la combinación de ácido bórico o de borato, de sales reductoras y de ácido succínico o sus derivados como se divulga en la solicitud EP 126 505 o la combinación de ácido bórico o de borato con polioles o con compuestos poliamínicos y con sales reductoras como se divulga en la solicitud EP 080 223. El efecto de los estabilizantes aldehídicos de los péptidos se aumenta, según la publicación WO 98/13462 mediante la combinación con ácido bórico y/o con derivados del ácido bórico con polioles y, según la publicación WO 98/13459 se refuerza todavía más mediante el empleo adicional de iones calcio.

Los agentes con actividades enzimáticas estabilizadas representan formas de realización preferentes de la presente invención. Son especialmente preferentes aquellas con enzimas que están estabilizados según varias de las formas indicadas.

Puesto que los agentes según la invención pueden ofrecerse en todas las formas imaginables, representan enzimas según la invención, respectivamente proteínas en todas las formulaciones o respectivamente en todas las formas de realización convenientes para la adición a los agentes correspondientes. A éstas pertenecen, por ejemplo, las formulaciones líquidas, los granulados sólidos o las cápsulas.

La forma encapsulada es adecuada para proteger a los enzimas o a otros componentes contra los otros componentes tales como por ejemplo los agentes de blanqueo o para posibilitar una liberación controlada (controlled release). Según el tamaño de estas cápsulas se distingue entre milicápsulas, microcápsulas y nanocápsulas, siendo especialmente preferentes las microcápsulas para los enzimas. Tales cápsulas han sido divulgadas, por ejemplo, en la solicitudes de patente WO 97/24177 y DE 199 18 267. Un posible método para la encapsulación consiste en encapsular la proteína, a partir de una mezcla de la solución de proteína con una solución o suspensión de almidón o de un derivado el almidón, en esta substancia. Un procedimiento de encapsulación de este tipo ha sido descrito en la solicitud alemana DE 199 56 382 con el título "Procedimiento para la obtención de enzimas microencapsulados".

En el caso de agentes sólidos, las proteínas pueden emplearse, por ejemplo, en forma seca, granulada y/o encapsulada. Éstas pueden emplearse por separado, es decir en forma de una fase propia, o junto con otros componentes en la misma fase, con o sin compactación. Cuando deban administrarse los enzimas microencapsulados en forma sólida, podrá eliminarse el agua con los procedimientos conocidos en el estado de la técnica a partir de las soluciones acuosas que se forman durante la elaboración, tal como mediante secado por pulverización, eliminación por centrifugación o mediante transolubilización. Las partículas obtenidas de este modo tienen usualmente un tamaño de partícula comprendido entre 50 y 200 \mum.

Pueden añadirse a los agentes líquidos, en forma de gel o pastosos, según la invención, los enzimas y también la proteína, esencial según la invención, a partir de una obtención de la proteína llevada a cabo según el estado de la técnica y preparación en soluciones, suspensiones o emulsiones concentradas acuosas o no acuosas, así como también en forma de gel o encapsuladas o como polvo seco. Tales agentes de lavado o de limpieza, según la invención, se preparan, por regla general, mediante simple mezcla de los componentes, que pueden añadirse en substancia o en forma de solución a un mezclador automático.

Además del rendimiento primario de lavado, las proteasas contenidas en los agentes de lavado pueden cumplir también la función de activar otros componentes enzimáticos mediante la disociación proteolítica o desactivarlo después de un tiempo de actuación correspondiente tal como se ha descrito, por ejemplo, en las solicitudes WO 94/29426 o EP 747 471. Son posibles funciones reguladoras comparables también por medio del enzima según la invención. Una forma de realización de la presente invención consiste, además, en aquellos agentes con cápsulas de material sensible a las proteasas, que se hidrolicen por ejemplo por las proteínas según la invención en el momento previsto y que liberen su contenido. Un efecto comparativo puede conseguirse también con otros agentes polifásicos.

Un objeto propio de la invención está representado por agentes para el tratamiento de materias primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, caracterizados porque contienen un enzima proteolítico según la invención solo o junto con otros componentes. Puesto que las fibras, especialmente naturales, tales como por ejemplo la lana o la seda, se caracterizan por una estructura superficial microscópica, singular, ésta puede conducir, como se ha indicado por ejemplo en el caso de la lana en el artículo de R. Breier en Melliand Textilberichte del 1.4.2000 (página 263) a largo plazo a efectos no deseados, tal como por ejemplo el afieltrado. Para evitar tales efectos se tratan las materias primas naturales con los agentes según la invención, que contribuyen por ejemplo a alisar la estructura superficial en forma de escamas basadas en las estructuras proteínicas y, de este modo, se oponen a un afieltrado. Una forma de realización especialmente preferente está representada por aquellos agentes para fibras de artículos textiles con componentes naturales y de forma muy preferente con lana o seda.

En una forma de realización de la presente invención se ha concebido el agente con una proteasa según la invención de tal manera, que pueda emplearse regularmente como agente de mantenimiento, por ejemplo añadiéndose en el proceso de lavado, empleándose tras el lavado o aplicándose independientemente del lavado. El efecto deseado consiste en obtener una estructura superficial lisa del textil y/o en prevenir y/o reducir un deterioro del tejido.

Un objeto propio de la invención consiste en un procedimiento para la limpieza mecánica de artículos textiles o de superficies duras, caracterizado porque se activa un enzima proteolítico, según la invención, al menos en una de las etapas del procedimiento.

Los procedimientos para la limpieza mecánica de los artículos textiles se caracterizan en general porque se aplican sobre el material a ser limpiado en varias etapas del procedimiento diversas substancias con actividad limpiadora y se eliminan por lavado después del tiempo de actuación o porque el producto a ser limpiado se trata de otro modo con un agente de limpieza o con una solución de este agente. Lo mismo es válido para los procedimientos de limpieza mecánica ante todo de otros materiales diferentes de los artículos textiles, que se reúnen bajo el concepto de superficies duras. Tales procedimientos pueden enriquecerse con proteínas según la invención al menos en una de las etapas del procedimiento y representan las formas de partida de la presente invención.

Son preferentes los procedimientos en los que el enzima según la invención se utilice en cantidades desde 40 \mug hasta 4 g y con más preferencia desde 50 \mug hasta 3 g, desde 100 \mug hasta 2 g, desde 200 \mug hasta 1 g y, de forma especialmente preferente, desde 400 \mug hasta 400 mg por aplicación.

Puesto que el enzima según la invención tiene de manera natural ya una actividad disolvedora de las proteínas y la desarrolla también en medios que, en otro caso, no tendrían fuerza limpiadora, tal como por ejemplo en el simple tampón, puede consistir una etapa parcial individual de un procedimiento de este tipo para la limpieza a máquina de los artículos textiles en que, en caso dado, se aplique el enzima según la invención como único componente con actividad limpiadora junto a los compuestos estabilizantes, las sales y las substancias tampón. Esto representa una forma de realización especialmente preferente de la presente invención.

Un objeto propio de la invención consiste en procedimientos para el tratamiento de materias primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles caracterizados porque se activa un enzima proteolítico, según la invención, al menos en una de las etapas del procedimiento. En este caso puede tratarse de procedimientos en los cuales se preparen materiales para la elaboración en artículos textiles, por ejemplo para el acabado antiafieltrante o, por ejemplo, puede tratarse de procedimientos que enriquezcan con un componente de mantenimiento la limpieza de los artículos textiles usados. Debido al efecto, anteriormente descrito, de las proteasas sobre determinados tejidos, las formas preferentes de realización consisten en materias primas para artículos textiles o artículos textiles con componentes naturales, especialmente con lana o seda.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras. Los enzimas según la invención pueden emplearse, especialmente de acuerdo con los procedimientos anteriormente descritos, para eliminar de los artículos textiles o de las superficies duras las impurezas que contengan proteína. Las formas preferentes de realización consisten en el empleo fuera de un procedimiento mecánico, por ejemplo en la colada a mano o en la eliminación a mano de manchas de artículos textiles o de superficies duras.

Es preferente el empleo de un enzima según la invención en una cantidad desde 40 \mug hasta 4 g y de una manera más preferente desde 50 \mug hasta 3 g, desde 100 \mug hasta 2 g, desde 200 \mug hasta 1 g y, de forma especialmente preferente, desde 400 \mug hasta 400 mg por aplicación.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico según la invención para la activación o la desactivación de los componentes de los agentes de lavado o de limpieza. Puesto que, como se sabe, los componentes proteínicos de los agentes de lavado o de limpieza pueden inactivarse mediante la acción de una proteasa. El establecimiento específico de este efecto, que en otro caso no es deseado, constituye un objeto de la presente invención. Del mismo modo es posible activar otro componente solo por medio de la proteólisis, por ejemplo cuando represente una proteína híbrida constituida por el enzima propiamente dicho y por el inhibidor adecuado para el mismo como se ha divulgado por ejemplo en la solicitud WO 00/01831. Otro ejemplo de una regulación de este tipo consiste en que se presente encapsulado en un material un componente activo para la protección o para el control de su actividad, que sea atacado por proteólisis. Las proteínas según la invención pueden emplearse, por lo tanto, para reacciones de inactivación, de activación o de liberación.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para el análisis bioquímico o mediante biología molecular, especialmente en el ámbito de un procedimiento de análisis enzimático. Según la invención y de acuerdo con la publicación Römpp, "Lexikon Chemie" (Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999) es entenderá por análisis enzimático cualquier analítica bioquímica que utilice enzimas o substratos específicos para determinar, por un lado, substratos en cuanto a su identidad o su concentración o, por otro lado, para determinar enzimas en cuanto a su identidad o a su actividad. Los campos de aplicación son todos los campos de trabajo emparentados con la bioquímica. Una forma preferente de realización de este objeto de la invención consiste en el empleo para la determinación de grupos extremos en el ámbito de un análisis
secuencial.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para la preparación, la purificación o la síntesis de artículos comestibles o de materiales biológicos. De este modo puede ser necesario en el transcurso de la elaboración de los artículos comestibles o de los materiales biológicos, por ejemplo, liberar a éstos de impurezas proteínicas. En este caso puede tratarse por ejemplo de compuestos de bajo peso molecular, de todos los componentes celulares o de materiales de reserva o de proteínas. Esto puede llevarse a cabo tanto a escala de laboratorio así como también a escala industrial, por ejemplo tras la fabricación mediante biotecnología de un material valioso.

El empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para la síntesis de proteínas o de otros compuestos químicos de bajo peso molecular se lleva a cabo mediante la inversión de la reacción catalizada de manera natural por los mismos, por ejemplo cuando se enlacen entre sí fragmentos de proteína o deban enlazarse aminoácidos sobre un compuesto que no esté constituido preponderantemente por proteína. Tales posibilidades de aplicación se han presentado por ejemplo en la solicitud EP 380362.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para el tratamiento de materias primas naturales, cuando éstas deban liberarse de impurezas proteínicas. Entre éstas deben entenderse en primer lugar las materias primas que deben ser obtenidas de manera no microbiológica, por ejemplo en la agricultura.

Una forma de realización preferente consiste en el empleo para el tratamiento de superficies y de una manera muy preferente en un procedimiento para el tratamiento de la materia prima económicamente importante constituida por el cuero. De este modo, en el transcurso del procedimiento de curtición, especialmente en la etapa del ablandado alcalino (Römpp, "Lexikon Chemie", Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999) se desprenderán del material de la piel las proteínas solubles en agua con ayuda de los enzimas proteolíticos. Para ello son adecuadas las proteasas según la invención, especialmente cuando reinen condiciones alcalinas y estén presentes agentes desnaturalizantes.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para la obtención o el tratamiento de materiales en bruto o de productos semielaborados en la fabricación de artículos textiles. Un ejemplo a este respecto es la elaboración del algodón, que tiene que liberarse de los componentes de la cápsula en un proceso denominado encolado; otro ejemplo consiste en el tratamiento de la lana; también se ha configurado de manera similar la elaboración de la cera en bruto. Los procedimientos enzimáticos son ventajosos en comparación con los procedimientos químicos especialmente en cuanto a su compatibilidad con el medio ambiente.

En una forma preferente de realización se emplean las proteínas según la invención para eliminar las capas protectoras de los artículos textiles, especialmente de los productos semielaborados o de los materiales valiosos y para alisar su superficie, como paso previo a su elaboración ulterior en la etapa siguiente de transformación.

En un objeto propio de la invención se utilizan las proteínas según la invención para el tratamiento de materias primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, especialmente para el tratamiento de las superficies de lana o de seda o de materiales mixtos que contengan lana o que contengan seda. Esto es válido tanto para la fabricación de tales artículos textiles así como también para el mantenimiento durante el uso, por ejemplo, en relación con la limpieza de los artículos textiles (véase más arriba).

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para el tratamiento de películas fotográficas, especialmente para la eliminación de las capas protectoras que contengan gelatina o similares. Puesto que con tales capas protectoras, especialmente con aquellas que contengan emulsiones de gelatina que contengan sales de plata se recubren películas, tales como por ejemplo las películas para rayos X, que tienen que desprenderse del material de soporte después de la exposición a la luz. A este respecto pueden emplearse especialmente las proteasas según la invención bajo condiciones de la reacción, alcalinas o ligeramente desnaturalizantes.

Un objeto propio de la invención consiste en el empleo de un enzima proteolítico, según la invención, para la obtención de artículos comestibles o de piensos para animales. De este modo se emplean proteasas desde hace mucho tiempo para la fabricación de artículos comestibles. Un ejemplo a este respecto es el empleo de cuajo para el proceso de maduración del queso o de otros productos lácteos. Tales procesos pueden enriquecerse con una proteína según la invención o pueden completarse con la misma. También los artículos comestibles ricos en hidratos de carbono o las materias primas para los artículos comestibles con finalidades no destinadas a la alimentación, tales como por ejemplo el harina o la dextrina, pueden tratarse con proteasas correspondientes para liberarlos de las proteínas acompañantes. También es adecuada para tales aplicaciones una proteasa según la invención, especialmente cuando deban llevarse a cabo bajo condiciones alcalinas o ligeramente desnaturalizantes.

Lo mismo es válido para la fabricación de artículos comestibles. En este caso puede ser interesante además de una liberación completa de las proteínas también tratar durante un corto período de tiempo a los productos de partida o las mezclas de productos que contengan proteína con proteasas para hacerlas digeribles por parte de los animales domésticos.

Un objeto propio de la invención consiste en agentes comestibles con un enzima proteolítico según la invención o procedimientos cosméticos con incorporación de un enzima proteolítico según la invención o el empleo de un enzima proteolítico según la invención con fines cosméticos, especialmente en el ámbito de los procedimientos correspondientes o en los agentes correspondientes.

Puesto que las proteasas juegan también en el procedimiento de renovación celular de la piel humana (desquemación) un papel decisivo (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., tomo 71 (1991), páginas 471-474). Por lo tanto se emplearán las proteasas también como componentes bioactivos en agentes para el cuidado de la piel para favorecer la degradación de las estructuras dermosómicas que proliferan en la piel seca, por ejemplo según las solicitudes WO 95/07688 o WO 99/18219. El empleo de las proteasas de subtilisina, especialmente de las variantes de proteasa alcalina de B. lentus, ya descrita, para finalidades cosméticas se ha descrito, por ejemplo, en la publicación WO 97/07770. También las proteasas según la invención, especialmente aquellas que estén controladas en su actividad por ejemplo tras mutagénesis o por adición de productos correspondientes, que interaccionen con las mismas, son adecuadas como componentes activos en agentes para la limpieza y el cuidado de la piel o del cabello. Son especialmente preferentes aquellas preparaciones de este enzima, que estén estabilizadas, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo mediante la copulación con soportes macromoleculares (véase la publicación US 5230891) y/o que estén derivatizadas mediante mutaciones puntuales en posiciones altamente alergénicas de tal manera, que presenten una elevada compatibilidad con la piel en los seres humanos.

Por lo tanto se incluye también en este objeto de la invención el empleo de tales enzimas proteolíticos para fines cosméticos, especialmente en agentes correspondientes tales como por ejemplo champúes, jabones o lociones para lavado, o en agentes para el mantenimiento, que se comercialicen por ejemplo en forma de cremas. También queda incluido en esta reivindicación el empleo en un medicamento descortezante.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Formación de las proteasas según la invención

Todas las etapas de trabajo de la biología molecular siguen métodos establecidos, como los que se han indicado, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, o en la solicitud de patente internacional WO 92/21760.

Construcción del vector de mutagénesis

La mutagénesis se llevó a cabo a partir de la variante de proteasa alcalina M131 de B. lentus. Esta variante ha sido descrita en la publicación WO 92/21760 y se ha depositado la cepa, que la forma, según esta solicitud bajo la denominación Bacillus licheniformis ATCC 68614 en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. En esta cepa está contenido el gen en un casete de expresión en el plásmido pCB56M131, replicante en Bacillus, constituido por el promotor, por el punto de enlace de los ribozomas así como por el codón de iniciación ATG y por los 22 aminoácidos aminoterminales de la proteasa alcalina de Bacillus licheniformis ATCC 53926, fusionado con la pre-pro-proteína y la secuencia mutada de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483. La variante de la proteasa alcalina M131 de B. lentus presenta las mutaciones siguientes, en comparación con la secuencia natural: S3T, V41, A188P, V193M, V199I.

Para la mutagénesis se recortó todo el casete de expresión por medio de los enzimas de restricción Bam HI y Sac I y se clonaron en el vector pUC18 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) cortado igualmente con Bam HI y Sac I. Con el vector pUC18M131, obtenido de este modo, se llevaron a cabo a continuación las siguientes etapas de mutagénesis. El vector pUC18M131 está representado en la figura 2. El fragmento de ADN, que contiene el casete de expresión de la proteasa alcalina M131 de B. lentus, está documentado en la SEQ ID NO. 1; la SEQ ID NO.2 muestra la secuencia de aminoácidos derivada del anterior. El fragmento Bam HI - Sac 1, mostrado en la SEQ ID NO. 1, se extiende en el vector pUC18M131, mostrado en la figura 2, desde las posiciones 1 hasta 1771; las regiones restantes del vector son idénticas a las del plásmido de partida pUC18.

Mutagénesis

En primer lugar se restableció la secuencia original de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483 en las posiciones 188 y 193. Para ello se utilizó el procedimiento QuikChange® de la firma Stratagene (La Jolla, CA, USA) según las indicaciones del fabricante. De acuerdo con este sistema se formó un plásmido mutado en una reacción de polimerasa, con empleo de, respectivamente, dos cebadores complementarios, que contienen la mutación. Tras la digestión del plásmido de partida por medio de Dpnl se transformó la mezcla de la reacción en E. coli XL-1 blue. Los clones obtenidos pueden reconocerse fácilmente, en caso dado, por medio de un punto de corte por restricción introducido con ayuda de la mutación, en cualquier caso es posible la verificación mediante la secuenciación del ADN con ayuda de un estuche usual, según el método de la interrupción de las cadenas.

Para la transformación del triplete CCA (prolina), que codifica el aminoácido en la posición 188, en GCC (alanina) se utilizaron los dos cebadores constituidos por 5'-TCA CAG TAT GGC GCC GGG CTT GAC ATT-3' así como por 5-AAT GTC AAG CCC GGC GCC ATA CTG TGA-3'. Éstos contienen, directamente junto a la mutación, un punto de corte por restricción Nar I que no modifica a la secuencia de aminoácidos.

Para la transformación del triplete ATG (metionina), que codifica el aminoácido en la posición 193, en ATT (isoleucina) se emplearon los dos cebadores constituidos por 5'-GGG CTT GAC ATT GTG GCA CCC GGG GTA AAC-3' así como por 5'-GTT TAC CCC GGG TGC CAC AAT GTC AAG CCC-3'. Éstos contienen, directamente junto a la mutación, un punto de restricción Xma CI, que no modifica a la secuencia de aminoácidos.

Un clon, que contiene el plásmido doblemente mutado, proporciona entonces la matriz para la mutación siguiente del triplete en la posición 211 TTA (leucina) en GGA (glicina). Para ello se emplearon los dos cebadores complementarios con las secuencias 5'- ACG TAT GCT AGC GGA AAC GGT ACA TCG - 3' así como 5'- CGA TGT ACC GTT TCC GCT AGC ATA CGT - 3'. Éstos contienen, directamente junto al punto de mutación, un punto de restricción Nhe I, que no modifica a la secuencia de aminoácidos. Los clones obtenidos, que proporcionan los fragmentos esperados con Nhe I, se ensayaron a continuación mediante secuenciación del ADN.

La secuencia del ADN del gen de los mutantes BLAP-S3T, V41, V199I, L211G, que codifica toda la proteasa, está indicada en el protocolo de secuencias en SEQ ID NO. 3. A partir de ésta puede derivarse la secuencia de aminoácidos dada en el protocolo de secuencias en SEQ ID NO. 4. Esta variante de la proteasa alcalina de B. lentus se denominará como proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus debido a las posiciones que se diferencian del enzima natural de B. lentus DSM 5483.

Expresión del mutante y preparación de la proteasa

El casete de expresión, con la secuencia mutada, se reclonó en el vector pCB56M131 como fragmento Bam HI-Sac I en lugar del fragmento mostrado en la SEQ ID NO. 1 y se transformó en Bacillus subtilis DB104. La cepa Bacillus subtilis DB 104 presenta el genotipo his, nprR2, nprE18, aprA3 (Kawamura, F. y Doi, R. H. (1984), J. Bacteriol., tomo 160, páginas 442-444). La transformación de ADN en Bacillus se llevó a cabo según la variante, descrita en la publicación WO 91/02792, del método de los protoplastos desarrollado por Chang y Cohen (1979; Molec. Gen. Genet., tomo 168, páginas 111-115).

Los clones positivos a la proteasa, obtenidos de este modo, se incubaron, tras verificación en 500 ml de medio MLBSP (10 g/l de Casiton; 20 g/l de Trypton, 10 g/l de extracto de levadura, todos de la firma Becton Dickinson, Cockeysville; 5 g/l de NaCl; 27 g/l de succinato de sodio; 100 mg/l de MgSO_{4}*7 H_{2}O; 75 mg/l de CaCl_{2}*2 H_{2}O; 0,5 \muM de MnCl_{2}; 0,5 \muM de FeSO_{4}; 2% (p/v) de glucosa; 50 mM de tampón PIPES (procedente de una solución madre 1 M con pH 7,2); 75 mM de KPO_{4} (procedente de una solución madre 1,5 M con pH 7,0); pH = 7,0, ajustado con KOH - así como 10 \mug/ml de tetraciclina) en matraces para la agitación mediante aplicación de sacudidas, de 2.000 ml, durante 72 horas a 37ºC y 200 revoluciones por minuto. El sobrenadante, obtenido tras la separación por centrifugación de las células, se utilizó para los ensayos siguientes, una vez determinada la actividad de la proteasa (según el método descrito en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132).

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Ejemplo 2

Para los dos ejemplos siguientes se emplearon artículos textiles ensuciados de manera normalizada, que se adquirieron en la Cooperativa para la comprobación y el ensayo de materiales -Eidgenössischen Material-Prüfungs-
und -Versuchsanstalt-, St. Gallen, Suiza (EMPA), o en el Instituto para la investigación de las lavanderías
-Wäschereiforschungsanstalt-, Krefeld. En el ejemplo 2 se utilizaron las siguientes suciedades/artículos textiles: A (sangre/leche/hollín sobre algodón), B (sangre/leche/tinta china sobre algodón), C (sangre/leche/tinta china sobre un tejido mixto de poliéster y de algodón) y D (huevo/hollín sobre algodón).

Con este material se ensayaron diversas recetas de agentes de lavado con respecto a su rendimiento del lavado en el launderómetro. Para ello se estableció respectivamente una relación del baño de 1:12 y se llevó a cabo la colada durante 30 minutos a una temperatura de 40ºC. La dosificación fue de 5,88 g del agente correspondiente por cada litro de baño para la colada. La dureza del agua fue de 16º de dureza alemana.

Como agente de lavado de control sirvió una receta básica de agente de lavado con la siguiente composición (todas las indicaciones en por ciento en peso): 4% de alquilbencenosulfonato lineal (sal de sodio), 4% de sulfato de alcoholes grasos con 12 a 18 átomos de carbono (sal de sodio), 5,5% de alcoholes grasos con 12 hasta 18 átomos de carbono con 7 EO, 1% de jabón de sodio, 11% de carbonato de sodio, 2,5% de disilicato de sodio amorfo, 20% de tetrahidrato de clorato de sodio, 5,5% de TAED, 25% de zeolita A, 4,5% de policarboxilato, 0,5% de fosfonato, 2,5% de granulado inhibidor de la espuma, 5% de sulfato de sodio, resto: agua, abrillantadores ópticos, sales. Éstos se combinaron para las diversas series de ensayos con las siguientes proteasas de tal manera, que se estableciese respectivamente una concentración final de 2,250 PE de actividad proteolítica por litro de baño para la colada: proteasa alcalina F49 de B. lentus (WO 95/23221; fabricante: firma Biozym, Kundl, Austria), Savinase® (firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca), o bien la proteasa según la invención constituida por la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus.

Tras el lavado se midió el grado de blancura de los artículos textiles lavados en comparación con el sulfato de bario, que se tomó como el 100%. La medida se llevó a cabo en un espectrómetro SF500-2 a 460 nm (filtro 3 para el bloqueo de los UV), diafragma de 30 mm, sin brillo, tipo de luz D65, 10º, d/8º. Los resultados obtenidos se han reunido en la tabla 3 siguiente como remisión en porcentaje, es decir como indicaciones en porcentaje en comparación con el sulfato de bario, con los correspondientes valores iniciales. Se han dado los valores medios de, respectivamente, cuatro mediciones. Éstos permiten una deducción inmediata de la contribución del enzima contenido con relación al rendimiento del lavado del agente empleado.

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TABLA 3

6

Se observa que la proteasa, según la invención, presenta en el caso de todas las suciedades una contribución claramente mayor al rendimiento del lavado del agente correspondiente que las proteasas tradicionales constituidas por la proteasa alcalina F49 de B. lentus y la Savinase®.

Ejemplo 3

Además de las suciedades/artículos textiles indicados en el ejemplo 2, se utilizó en este caso la muestra E (sangre sobre algodón). Los artículos textiles de ensayo se analizaron de la misma manera que en el ejemplo 2 y con soluciones de lavado correspondientes en el launderómetro. La única diferencia con respecto al ejemplo 2 consistía en que en este caso se llevó a cabo la colada a una temperatura de 60ºC. La evaluación de la serie de ensayos se llevó a cabo igualmente como se ha descrito en el ejemplo precedente; la tabla 4 muestra los resultados.

TABLA 4

7

Tal como muestran estos resultados, la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G, según la invención, sobrepasa a las proteasas establecidas para los agentes de lavado constituidas por la proteasa alcalina F49 de B. lentus y la Savinase® incluso a la temperatura de lavado de 60ºC en cuanto a su contribución al rendimiento del lavado del agente correspondiente o al menos es equivalente dentro de los límites de error.

Ejemplo 4

Se normalizaron recipientes con superficies duras, lisas, dotándolos con (A) huevo blando, (B) huevo/leche, (C) almidones mixtos y (D) carne picada y se fregaron a 45ºC con el programa normal de una máquina friegaplatos doméstica del tipo Miele® G 676. Por cada fregado se utilizaron 20 g de agente para el fregado; la dureza del agua fue de 16º de dureza alemana.

Como agente para el fregado sirvió la receta básica siguiente (todos las indicaciones están dadas respectivamente en porcentaje en peso): 55% de tripolifosfato de sodio (calculado como anhidro), 4% de disilicato de sodio amorfo (calculado como anhidro), 22% de carbonato de sodio, 9% de perborato de sodio, 2% de TAED, 2% de tensioactivo no iónico, resto: agua, colorantes, perfume. Esta receta de base se combinó para los diversos ensayos con la misma actividad por medio de las diversas proteasas formadas por la proteasa alcalina F40 de B. lentus, la Savinase®, o bien la variante de la proteasa según la invención constituida por la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus, de tal manera, que se estableciese respectivamente una actividad de 10.000 PE por fregado. Esto correspondía respectivamente a 0,1 mg aproximadamente de proteína de proteasa por gramo del concentrado del agente de limpieza.

Tras el fregado se determinó el desprendimiento de las suciedades A hasta C por gravimetría en porcentaje. Para ello se relacionaron la diferencia entre el peso del recipiente ensuciado y fregado a continuación y el peso inicial del recipiente con respecto a la diferencia de peso del recipiente no fregado con relación al peso inicial. Esta relación puede considerarse como desprendimiento en porcentaje. Para la suciedad D se llevó a cabo, tras el fregado, una evaluación a simple vista según una escala desde 0 (= invariable, es decir suciedad muy fuerte) hasta 10 (= ausencia completa de suciedad reconocible). Los resultados obtenidos se han reunido en la tabla 5 siguiente. Las indicaciones en la misma corresponden al valor medio de, respectivamente, 9 mediciones. Éstos permiten una deducción inmediata de la contribución del enzima obtenido sobre el rendimiento de limpieza del agente empleado.

TABLA 5

8

Estos resultados muestran que la proteasa alcalina S3T/V4I/N199I/L211G de B. lentus, según la invención, sobrepasa a las otras proteasas ensayadas en lo que se refiere a su contribución al rendimiento de limpieza en los agentes para el fregado a máquina de la vajilla, siendo, al menos, equivalente; y esto ya con una actividad empleada comparativamente menor.

Ejemplo 5

Como en el ejemplo precedente se aplicaron a los recipientes, de manera normalizada, las mismas suciedades y se fregaron de la misma manera respectivamente con las mismas recetas de los agentes de limpieza. La única diferencia consistía en que se emplearon respectivamente 20.000 PE de las proteasas correspondientes. Esto correspondía respectivamente a 0,2 mg aproximadamente de proteasa en el concentrado de agente de limpieza. Los resultados de las medidas obtenidos de la misma manera que en el ejemplo 4, se han reunido en la tabla 6 siguiente.

TABLA 6

10

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También cuando se emplean actividades mayores de proteasa se observa la mayor contribución de la proteasa según la invención al rendimiento total de limpieza del agente correspondiente frente a las proteasas, establecidas para el fregado a máquina de la vajilla, constituidas por la proteasa alcalina F49 de B. lentus y la Savinase®.

Descripción de las figuras

Figura 1: Alineación de las secuencias de aminoácidos de las variantes de las proteasas alcalinas de B. lentus con las subtilisinas más importantes, respectivamente en la forma madura, es decir en la forma procesada.

En este caso significa:

variante según la invención: la variante según la invención de la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus;

Subtilisina 309: la subtilisina procedente de Bacillus lentus según la publicación WO 89/06279;

Subtilisina PB92: la subtilisina procedente de Bacillus nov. spec. 92 según la publicación EP 283075;

Subtilisina de Carlsberg (1968) la subtilisina procedente de Bacillus licheniformis según la publicación de E. L. Smith et al. J. Biol. Chem., volumen 243, páginas 2184-2191;

Subtilisina BPN': la subtilisina procedente de Bacillus amyloliquefaciens según la publicación de J. A. Wells et al. (1983), Nucleic Acids Research, volumen 11, páginas 7911-7925;

Consenso: las posiciones coincidentes en la mayoría de las secuencias indicadas.

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Figura 2: Vector de mutagénesis pUC18M131. El fragmento Bam HI - Sac I, mostrado en la SEQ ID NO. 1, se extiende desde las posiciones 1 hasta 1771; las regiones restantes del vector son idénticas a las del plásmido de partida pUC18 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg).

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<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

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<120> Nuevas variantes de proteasas alcalinas y agentes de lavado y de limpieza que contienen estas nuevas variantes de proteasas alcalinas

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<130> H 4727 PCT

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<140>

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<141>

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<150> DE 10121463.4-41

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<151> 2001-05-02

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1773

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<212> DNA

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<213> Bacillus licheniformis ATCC 68614

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<220>

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<221> CDS

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<222> (233)..(1375)

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<220>

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<221> mat_peptide

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<222> (566)..(1375)

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<400> 1

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11

12

13

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<210> 2

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<211> 380

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<212> PRT

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<213> Bacillus licheniformis ATCC 68614

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<400> 2

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14

15

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<210> 3

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<211> 1143

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de Bacillus lentus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1143)

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<220>

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<221> mat_peptide

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<222> (334)..(1143)

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<400> 3

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16

17

18

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<210> 4

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<211> 380

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de Bacillus lentus

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<400> 4

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19

20

Claims

1. Proteasa alcalina, del tipo subtilisina, caracterizada porque presenta isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211, según la enumeración de la subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483 y, además, presenta uno de los aminoácidos correspondientes a la treonina, en la posición 3, o a la isoleucina, en la posición 4.

2. Proteasa alcalina, del tipo subtilisina, según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta treonina en la posición 3, isoleucina en la posición 4, isoleucina en la posición 199 y glicina en la posición 211, según la enumeración de de subtilisina procedente de Bacillus lentus DSM 5483.

3. Proteasa alcalina según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque es una subtilisina formada, de manera natural, por un Bacillus, especialmente por Bacillus lentus, o derivada de un Bacillus de este tipo.

4. Proteasa alcalina según la reivindicación 3, caracterizada porque es una subtilisina formada de manera natural por Bacillus lentus DSM 5483, o derivada del mismo.

5. Proteasa alcalina según la reivindicación 4, constituida por la proteasa alcalina S3T/V4I/V199I/L211G de B. lentus, según la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 1 (variante según la invención).

6. Proteasa alcalina según una de las reivindicaciones 1 a 5, derivada de una proteasa según una de las reivindicaciones 1 a 5, especialmente por fragmentación o mediante mutagénesis por deleción, mediante mutagénesis por inserción, mediante mutagénesis por substitución o mediante fusión de, al meno, una parte con, al menos, otra proteína, manteniéndose las mutaciones puntuales citadas en la misma.

7. Proteasa alcalina según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque está adicionalmente derivatizada, especialmente por medio de una modificación química, por copulación con compuestos químicos debajo peso molecular o de alto peso molecular y/o mediante asociación con otros productos.

8. Proteasa alcalina según la reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque presenta una actividad proteolítica acrecentada con respecto a la de la molécula de partida o bien con respecto ala de la molécula no derivatizada y, de manera muy especialmente preferente presenta un rendimiento mejorado.

9. Proteasa alcalina según una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque está estabilizada adicionalmente, especialmente por medio de la preparación conjunta con otros productos, en particular con inhibidores de la proteasa, mediante la formación de una proteína de fusión con un inhibidor de la proteasa, por medio de mutaciones estabilizantes y/o por medio de copulación con un polímero.

10. Ácido nucleico, que codifica una de las proteasas citadas en las reivindicaciones 1 a 9.

11. Ácido nucleico, que codifica una proteasa de subtilisina, cuya secuencia de nucleótidos coincide con la secuencia de nucleótidos dada en la SEQ ID NO. 3, especialmente en la regiones que codifican la 199 isoleucina y la 211 glicina y, de una manera muy especial, en las regiones que codifican la 3 treonina, la 4 isoleucina, la 199 isoleucina y la 211 glicina

12. Vector, que contienen una región de ácidos nucleicos citada en las reivindicaciones 10 u 11.

13. Vector de clonación según la reivindicación 12.

14. Vector de expresión según la reivindicación 12, que posibilita, especialmente, la biosíntesis de una de las proteasas citadas en las reivindicaciones 1 a 9.

15. Célula, que contiene un vector según una de las reivindicaciones 12 a 14.

16. Célula huésped, que expresa una de las proteasas citadas en las reivindicaciones 1 a 9 o que puede estimularse para su expresión, especialmente mediante el empleo de un vector de expresión según las reivindicación 14.

17. Célula huésped, según la reivindicación 16, caracterizada porque es una bacteria, especialmente una que secreta la proteína formada en el medio circundante.

18. Célula huésped según la reivindicación 17, caracterizada porque es una bacteria del género Bacillus, especialmente de las especies Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

19. Célula huésped, según la reivindicación 15 o 16, caracterizada porque es una célula eucariota, especialmente una que realiza una modificación post-traducción de la proteína formada.

20. Procedimiento para la obtención de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9, con empleo de una célula huésped, según una de las reivindicaciones 15 a 19 y/o con empleo de un vector, según una de las reivindicaciones 12 a 14 y/o con empleo de un ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 10 u 11.

21. Agente, caracterizado porque contiene un enzima proteolítico según una de las reivindicaciones 1 a 9, especialmente agente de lavado o de limpieza, de manera muy especial en una cantidad desde 2 \mug hasta 20 mg por g del agente.

22. Agente, según la reivindicación 21, caracterizado porque contiene, adicionalmente, otros enzimas, especialmente otras proteasas, amilasas, celulasas, hemicelulasas y/o lipasas.

23. Agente para el tratamiento de materia primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, caracterizado porque contiene un enzima proteolítico solo o junto con otros componentes activos, según una de las reivindicaciones 1 a 9, especialmente para fibras o para artículos textiles con componentes naturales y, de una manera muy especialmente preferente, con lana o con seda.

24. Procedimiento para la limpieza mecánica de artículos textiles o de superficies duras, caracterizado porque se activa un enzima proteolítico, al menos en una de las etapas de procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 9, preferentemente en una cantidad comprendida entre 40 \mug y 4 g, de forma especialmente preferente comprendida entre 400 \mug y 400 mg por aplicación.

25. Procedimiento para el tratamiento de las materia primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, caracterizado porque se activa un enzima proteolítico, al menos en una de las etapas del procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 9, especialmente para materias primas para artículos textiles o para artículos textiles con componentes naturales, especialmente para aquellos que contengan lana o seda.

26. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la limpieza de artículos textiles o de superficies duras, preferentemente en una cantidad comprendida entre 40 \mug y 4 g, de forma especialmente preferente comprendida entre 400 \mug y 400 mg por aplicación.

27. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la activación o para la desactivación de los componentes de los agentes de lavado o de limpieza.

28. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para el análisis bioquímico o para la síntesis de compuestos de bajo peso molecular o de proteínas.

29. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación, para la purificación o para la síntesis de productos naturales o de materiales biológicos.

30. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de materias primas naturales, especialmente para el tratamiento de superficies, de manera muy especialmente preferente en un procedimiento para el tratamiento del cuero.

31. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la obtención o para el tratamiento de materiales en bruto o de productos semielaborados en la fabricación de los artículos textiles, especialmente para el desprendimiento de las capas protectora existentes sobre los tejido.

32. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de materias primas para artículos textiles o para el mantenimiento de los artículos textiles, especialmente para el tratamiento de la lana o de la seda o de artículos textiles mixtos, que contengan lana o seda.

33. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de películas fotográficas, especialmente para el desprendimiento de las capas protectoras de tipo gelatinoso, o similares.

34. Empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de artículos comestibles o de piensos para animales.

35. Productos cosméticos con un enzimas proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9 o procedimientos cosméticos con incorporación de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9, o el empleo de un enzima proteolítico, según una de las reivindicaciones 1 a 9, con fines cosméticos, especialmente en el ámbito de un procedimiento correspondiente o en agentes correspondientes.