CN107365781A - 刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法 - Google Patents

刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种刺槐的Subtilisin1基因，通过对刺槐总RNA进行提取和反转录后合成cDNA，并采用Race技术得到了刺槐Subtilisin1基因序列(SEQ ID NO：1)，对该序列进行全长扩增得到了刺槐Subtilisin1基因。本发明得到的刺槐Subtilisin1基因主要在刺槐的花和叶中表达，在刺槐的根和茎、荚中表达量相对较低。刺槐Subtilisin1基因在老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量，表明该基因是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老；该基因的克隆为刺槐及其他林木分子育种的研究垫定理论基础。

Description

刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法
技术领域
本发明涉及一种遗传工程的RNA的分离、制备、纯化和应用，特别涉及一种编码植物蛋白质的基因的分离、制备纯化和应用，属于分子生物学的遗传工程领域。
背景技术
枯草杆菌蛋白酶是一类催化活性依赖于丝氨酸残基的蛋白水解酶，该酶参与生物发育的很多过程：种子萌发、胁迫相应、果实成熟、器官衰老、果实成熟、细胞凋亡及细胞程序性死亡等过程。类枯草杆菌蛋白酶类有200多个不同的家族成员构成。植物中已有大量关于类枯草杆菌蛋白酶基因的研究报道，包括大豆、番茄、拟南芥、木麻黄、柑橘等。
在植物中，拟南芥的类枯草杆菌蛋白酶基因研究的较为清楚。在拟南芥基因组中总共有56个Subtilisin家族成员，SUT1在拟南芥气孔前体细胞中强烈表达，影响叶片的分布和密度。Subtilisin家族在拟南芥中的发育调控、细胞周转和信号传导三个方面发挥功能。介导细胞与其他细胞之间的信号传导，促进拟南芥胚发育时期的表皮形成。燕麦中的Subtilisin-like基因参与细胞程序化死亡过程中的蛋白水解级联反应。
刺槐(Robinia pseudoacacia)属于雌雄同花植物，原生于北美洲，后被广泛引种到欧洲、亚洲等地。刺槐叶片含有大量粗蛋白，可作饲料；刺槐木质坚硬且具有发达的根系；刺槐根部有根瘤，有提高地力之效；刺槐具有很强的抗旱能力，能够适应石质山地的干旱环境。槐的花属于蝶形花，开花时香气四溢，并且可供食用。综上所述，刺槐具有很好的生态和经济价值。目前关于刺槐抗性的分子生物学研究基础还比较薄弱。
类枯草杆菌蛋白酶是植物受胁迫后诱导表达的一类蛋白质，他在植物受到抗旱、抗寒、抗盐、机械损伤等胁迫响应途径中具有重要作用[13]。转基因研究也证明Subtilisin1基因在提高植物抗逆性中具有重要的作用。本文以刺槐Subtilisin1基因为研究对象，以刺槐的花为材料，克隆刺槐Subtilisin1基因并进行了生物信息学分析、表达模式分析，为将来刺槐抗性育种研究和分子育种工作提供理论基础。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因(即刺槐Subtilisin1基因)、刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白、刺槐Subtilisin1基因克隆的引物以及克隆刺槐Subtilisin1基因的方法，本发明的刺槐Subtilisin1基因同源基因能在刺槐生长的各个阶段表达，而且能在刺槐的老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量，推测这是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老，同时为刺槐抗性育种研究和分子育种工作提供理论基础和科学依据，具有重要意义。
为实现本发明的上述目的，本发明一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明首先以刺槐的花为原料，提取总RNA，接着进行RNA的反转录，合成cDNA第一链；接着根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列(即EST序列片段)设计PCR扩增引物，以合成的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，得到刺槐Subtilisin1基因的序列中间片段(即EST系列片段)；然后再根据获得的保守序列中间片段分别设计5′-race扩增引物进行5′-端扩增；设计3′-race扩增引物进行3′-端扩增，得到刺槐Subtilisin1基因。
其中，进行PCR扩增的引物具体如下：
正向引物(SBTF)：5′-TGTTGTGAAGAAAGCCG-3′；
反向引物(SBTR)：5′-GTGAGGGCAAGCCATTGA-3′。
特别是，5′-race扩增引物包括一对5′-race锚定引物和一对扩增5′端引物。
尤其是，所述5′-race锚定引物具体如下：
AAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′；
AUAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′。
尤其是，所述扩增5′端引物具体如下：
5′race1R：5′-GAAGAAGATGAGCATCTC-3′；
5′race2R：5′-TTCCGTTAGCCAGAATCA-3′。
特别是，3′-race扩增引物包括一对3′-race锚定引物和扩增3′端引物。
尤其是，所述3′-race锚定引物具体如下：
B26：5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′；
B25：5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′。
尤其是，所述扩增3′端引物具体如下：
3′race1F：5′-TTGGACCGACGCTGTGGGT-3′；
3′race2F：5′-ATTCTAGAAGAACCGAAT-3′。
特别是，所述刺槐Subtilisin1基因片段序列即是刺槐Subtilisin1基因的EST序列片段。
尤其是，根据所述刺槐Subtilisin1基因的EST序列片段，利用primer5软件设计所述PCR扩增引物。
本发明另一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白组，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
本发明又一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因克隆的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、和SEQ ID No.12。
其中，所述SEQ ID No.3的核苷酸序列为5′-TGTTGTGAAGAAAGCCG-3′；所述SEQ IDNo.4的核苷酸序列为5′-GTGAGGGCAAGCCATTGA-3′；所述SEQ ID No.5的核苷酸序列为5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGG GGGGGGGG-3′；所述SEQ ID No.6的核苷酸序列为5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′；所述SEQ ID No.7的核苷酸序列为5′-GAAGAAGATGAGCATCTC-3′；所述SEQ ID No.8的核苷酸序列为5′-TTCCGTTAGCCAGAATCA-3′；所述SEQ ID No.9的核苷酸序列为5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′；所述SEQ ID No.10的核苷酸序列为5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′；所述SEQ IDNo.11的核苷酸序列为5′-TTGGACCGACGCTGTGGGT-3′；所述SEQ ID No.12的核苷酸序列为5′-ATTCTAGAAGAACCGAAT-3′。
本发明提供一种刺槐Subtilisin1基因的克隆方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)提取刺槐花中的总RNA，纯化后进行反转录，合成cDNA第一链；
2)以刺槐cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段；
3)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行5′-race扩增，获得5′-端扩增产物；
4)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行3′-race扩增，获得3′端扩增产物；
5)扩增产物进行拼接，即得。
其中，步骤2)中所述PCR扩增包括如下步骤：
2-1)根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列设计一对中间片段扩增引物；
2-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；
2-3)扩增产物进行拼接，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段。
特别是，步骤2-1)中刺槐Subtilisin1基因片段序列为刺槐Subtilisin1基因的EST序列片段。
尤其是，根据所述刺槐Subtilisin1基因的EST序列片段，利用primer5软件设计所述中间片段扩增引物。
特别是，步骤2-1)中所述的保守序列中间片段引物分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
其中，步骤3)中所述5′-race扩增包括如下步骤：
3-1)根据步骤2)获得的刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段设计5′-race扩增引物，其中5′-race扩增引物包括一对5′-race锚定引物、一对扩增5′端引物；
3-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，利用一个5′-race锚定引物和一个扩增5′端引物进行第一轮5′-race扩增，获得第一轮5′-race扩增产物；
3-3)以第一轮5′-race扩增产物为模板，利用另一个5′-race锚定引物和另一个扩增5′端引物进行第二轮5′-race扩增，获得5′-端扩增产物。
特别是，步骤3-1)中所述5′-race锚定引物分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述扩增5′端引物分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
尤其是，步骤3-2)中所述5′-race锚定引物为SEQ ID NO：5；所述扩增5′端引物为SEQID NO：7；步骤3-3)中所述另一个5′-race锚定引物为SEQ ID NO：6；所述另一个扩增5′端引物为SEQ ID NO：8。
特别是，步骤4)中所述3′-race扩增包括如下步骤：
4-1)根据步骤2)获得的刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段设计3′-race扩增引物，其中3′-race扩增引物包括一对3′-race锚定引物、一对扩增3′端引物；；
4-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，利用一个3′-race锚定引物和一个扩增3′端引物进行第一轮3′-race扩增，获得第一轮3′-race扩增产物；；
4-3)以第一轮3′-race扩增产物为模板，利用另一个3′-race锚定引物和另一个扩增3′端引物进行第二轮3′-race扩增，获得3′-端扩增产物。
特别是，步骤4-1)中所述4′-race锚定引物分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；所述扩增3′端引物分别为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。
尤其是，步骤4-2)中所述3′-race锚定引物为SEQ ID NO：9；所述扩增3′端引物为SEQID NO：11；步骤3-3)中所述另一个3′-race锚定引物为SEQ ID NO：10；所述另一个扩增3′端引物为SEQ ID NO：12。
本发明根据刺槐Subtilisin1基因EST序列使用RACE技术获得了该基因的全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，生物信息学分析表明，刺槐Subtilisin1基因序列全长为2702bp，该序列5′和3′端的非编码序列长度分别为61bp和318bp，开放阅读框长度为2322bp，编码843个氨基酸。刺槐Subtilisin1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，对其推测氨基酸序列进行系统进化树分析证明该基因具有保守的类枯草杆菌蛋白酶家族蛋白的保守PA结构域和4个高度保守区(D区、H区、N区、S区)，与大豆、苜蓿、菜豆(Phaseolusvulgaris)、葡萄(Vitis vinifera)、甜橙(Citrus clementina])等物种的Subtilisin1氨基酸序列相似度都达到了80％以上，说明刺槐Subtilisin1基因全长序列的扩增是成功的。
对本发明的刺槐Subtilisin1基因在不同组织器官中的相对表达量的研究发现，刺槐Subtilisin1基因在刺槐不同组织器官中均有表达，其中，刺槐Subtilisin1基因在花盛开期表达量最高，其次是叶片期，而在根、茎、豆荚中的表达量都相对较低，即在老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量，表面刺槐Subtilisin1基因是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老，对用于植物抗冻、抗寒、抗病虫害等抗性研究具有重要的指导意义。
附图说明
图1是本发明刺槐花样总RNA提取、纯化后的RNA的琼脂糖凝胶电泳分析图；
图2A是本发明刺槐Subtilisin1蛋白序列与其他植物(菜豆、赤豆、大豆、绿豆、苜蓿、鹰嘴豆)的Subtilisin1基因蛋白序列的比对图；
图2B是本发明刺槐Subtilisin1蛋白序列与其他植物(菜豆、赤豆、大豆、绿豆、苜蓿、鹰嘴豆)的Subtilisin1基因蛋白序列的比对图，其中图2B中蛋白顺序接着图2A中蛋白顺序；
图3是植物刺槐Subtilisin1基因的系统发育树分析；
图4是刺槐Subtilisin1蛋白疏水性分析；
图5是刺槐Subtilisin1基因跨膜蛋白预测；
图6是刺槐Subtilisin1蛋白质分子的3D结构模型；
图7是刺槐Subtilisin1基因在不同组织器官中的相对表达量比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为重组遗传学技术领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版.Cold Spring HarborLab Press,2001)。王关林，方宏筠，《植物基因工程原理与技术》(第2版，科学出版社，2002)。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1刺槐花总RNA的提取与纯化
1、2015年6月份，在北京延庆县米家堡苗圃(南北方向，种植密度为4m×3m，常规管理)中采集生长良好、树龄为10年，株高和地径分别约为7m和0.15m的刺槐花，收集当天开花的刺槐花。
采集的刺槐花样品迅速置于液氮中速冻，然后保存于-80℃超低温冰箱中，备用。
2、利用天根植物RNA试剂盒提取刺槐花样品的总RNA，使用天根生物有限公司的RNA纯化试剂盒纯化总RNA，提取、纯化总RNA分别按照相应试剂盒说明书进行，具体方法如下：
2-1)将新鲜植物组织(刺槐花)100mg迅速剪成小块放入研钵内，加入10倍体积(即1ml)的RLT和1倍体积(即0.1ml)的PLANTaid，于室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13,000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid；
2-2)吸取离心上清液(即裂解物)480μL，转到另一新离心管；
2-3)加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，立即吹打混匀；
2-4)将混合物(每次小于720μL，如果混合物量大，则可以分多次次加入)加入到一个基因组清除柱中，(并且基因组清除柱置于收集管中)，13,000rpm离心2分钟，弃掉废液；
2-5)将基因组DNA清除柱放置于干净的离心管(2ml)内，在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000rpm离心30秒，收集滤液，用微量移液器精确的确定滤液体积，加入0.5倍体积的无水乙醇，立即吹打混匀；
2-6)将混合物加入到吸附柱RA中，13,000rpm离心2分钟，弃掉废液；
2-7)加入700μL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm离心30秒，弃掉废液；
2-8)加入500μL已加入无水乙醇的漂洗液RW，13,000rpm离心30秒，弃掉废液；然后再加入500μl漂洗液RW，重复一遍；
2-9)将吸附柱RA放入空的收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
2-10)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase free water,室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，吸取上清液至新离心管中，即得到提取的RNA样品。
2-11)采用Nanodrop ND-1000紫光分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；RNA的完整性通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，具体方法如下：
取5μl RNA样品在1％琼脂糖凝胶、120V电压下，电泳20min，在凝胶成像系统下拍照检测RNA的完整性。
检测结果如下：刺槐花样品提取的总RNA经Nanodrop ND-1000紫光分光光度计检测，所测样品的A260/A280比值均为2.0左右，且浓度均较高。琼脂糖凝胶电泳显示(图1)，刺槐花的RNA电泳图谱清晰，28SrRNA的亮度约为18SrRNA的2倍。表明所提取的RNA提取质量好，可用于后续的分子生物学实验。
实施例2合成cDNA第一链
采用Aidlab公司的的反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，cDNA第一链的合成按照Aidlab反转录cDNA第1链试剂盒的操作方法进行，具体方法如下：
1、反应体系为：
在PCR管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量为20μ1，
2、将PCR管放入PCR仪中，于42℃温育50min，65℃温育15min,后冰上冷却，获得的产物(cDNA第一链)直接用于PCR或-20℃储藏备用。
实施例3刺槐Subtilisin1基因保守中间片段的PCR扩增
1、中间片段PCR扩增引物设计
根据本实验室(北京林业大学林木遗传育种国家工程实验室)前期建立的刺槐转录组文库所获得的刺槐Subtilisin1基因的片段序列(即EST序列)(参见J.X.Wang et，Characterization ofESTs from black locust for gene discovery and marker development,Genetics and MolecularResearch,14(4):12684-12691(2015))，设计一对中间片段扩增引物SBTF和SBTR(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，如表1)，利用PCR技术，从实施例2得到的反转录产物中分离刺槐Subtilisin1基因的同源序列，其中：
正向引物(SBTF)：5′-TGTTGTGAAGAAAGCCG-3′；
反向引物(SBTR)：5′-GTGAGGGCAAGCCATTGA-3′。
表1刺槐Subtilisin1基因克隆全长序列引物
2、中间片段PCR扩增反应程序如表2所示：
表2刺槐Subtilisin1基因保守片段的PCR扩增反应程序
将离心管至于PCR仪中进行PCR反应，PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35循环；72℃延伸7min；4℃保存。
3、PCR扩增产物结果分析
PCR产物使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并使用DNA回收试剂盒(Easy Pure QuickGel Extraction Kit)回收扩增产物条带(即凝胶电泳从上至下的第一条亮带)。将回收的扩增产物分别连接于pMD18-T vector载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞(TransGenBiotech公司)后，进行蓝白斑筛选，取白色菌斑进行PCR扩增鉴定，选取阳性重组克隆载体的菌株质粒测序(睿博兴科生物技术有限公司)，其中，回收的扩增产物条带与克隆载体连接，大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化具体方法参照Sambrook的方法进行，质粒DNA的提取采用碱裂解法，用EcoRI和SalI双酶切鉴定。
4、PCR扩增中间保守扩增片段生物信息学分析
使用DNAMAN、NCBI/blastx软件对该序列进行生物信息学分析，比对结果表明：从所构建cDNA-AFLP文库中筛选出与大豆Subtilisin1基因相似性达85％，即刺槐Subtilisin1基因的扩增片段与大豆Subtilisin1基因具有85％同源性，从而得到本发明的刺槐Subtilisin1基因的同源保守序列中间片段(即EST序列)，刺槐Subtilisin1保守序列中间片段长度为460bp，核苷酸序列片段记作SEQ ID NO：15。
实施例4刺槐Subtilisin1基因5′-race扩增
1、5′-race扩增引物设计
根据实施例3获得的刺槐Subtilisin1基因的中间片段序列SEQ ID NO：15，采用primerpremier 5.0生物信息学软件，设计5′-race扩增的PCR引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8，如表1所示。
5′-race扩增方法参照Clontech公司的BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。
A：5′-race锚定引物：
AAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′；
AUAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′；
B：扩增5′端引物：
5′race1：5′-GAAGAAGATGAGCATCTC-3′；
5′race2R：5′-TTCCGTTAGCCAGAATCA-3′；
2、第一轮5′-race扩增
以实施例2制备的cDNA第一链为模板，利用5′-race锚定引物AAP和扩增5′端引物5′Race1R进行第一轮嵌套PCR扩增，即第一轮5′-race扩增，获得第一轮5′-race扩增产物；
第一轮5′-race扩增反应体系：
其中，第一轮PCR扩增过程中的Forward primer为APP；ReversePrimer为5′Race1R；
3、第二轮5′-race扩增
以第一轮5′-race扩增产物为模板，利用引物5′Race2R和AUAP进行第二轮嵌套PCR扩增，即第二轮5′-race扩增，获得5′-端扩增产物；
第二轮5′-race扩增反应体系：
其中，第二轮PCR扩增过程中的Forward primer为AUAP；ReversePrimer为5′Race2R。
4、第一、第二轮5′-race扩增反应程序：
5、5′-race扩增结果分析
5′-race扩增产物使用使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并使用DNA回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收扩增产物条带(即在凝胶电泳从上至下的第一条亮带)。将回收的扩增产物分别连接于pMD18-T vector载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞(TransGenBiotech公司)后，进行蓝白斑筛选，取白色菌斑进行PCR扩增鉴定，选取阳性重组克隆载体的菌株质粒测序(睿博兴科生物技术有限公司)，其中，回收的扩增产物条带与克隆载体连接，大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化具体方法参照Sambrook的方法进行，质粒DNA的提取采用碱裂解法，用EcoRI和SalI双酶切鉴定，选取阳性克隆进行测序(上海生工公司)；测序结果表明：5’-race扩增得到的片段大小为1393bp，核苷酸序列SEQ ID NO：16。
实施例5刺槐Subtilisin1基因3′-race扩增
1、3′-race扩增引物设计
根据实施例3获得的刺槐Subtilisin1基因的中间片段序列(EST序列)SEQ ID NO：15，采用primer premier 5.0生物信息学软件，设计3′-race扩增的PCR引物SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，如表1所示。
3′-race扩增方法参照Clontech公司的BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。
A：3′-race锚定引物：
B26：5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′；
B25：5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′；
B：扩增3′引物：
3′race1F：5′-TTGGACCGACGCTGTGGGT-3′；
3′race2F：5′-ATTCTAGAAGAACCGAAT-3′；
2、第一轮3′-race扩增
以实施例2制备的cDNA第一链为模板，利用3′-race锚定引物B26和扩增3′端引物3′Race1F进行第一轮嵌套PCR扩增，即第一轮3′-race扩增，获得第一轮3′-race扩增产物；
第一轮3′-race扩增反应体系：
其中，第一轮PCR扩增过程中的Forward primer为3′Race1F；ReversePrimer为B26；
3、第二轮3′-race扩增
以第一轮3′-race扩增产物为模板，利用引物3′Race2F和B25进行第二轮嵌套PCR扩增，即第二轮3′-race扩增，获得3′-端扩增产物；
第二轮3′-race扩增反应体系：
其中，第二轮PCR扩增过程中的Forward primer为3′Race2F；ReversePrimer为B25。
4、3′-race扩增反应体系、反应程序如下：
第一、第二轮3′-race扩增反应条件如下：
5、3′-race扩增结果分析
3′-race扩增产物使用使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并使用DNA回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收扩增产物条带。将回收的扩增产物分别连接于pMD18-Tvector载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞(TransGenBiotech公司)后，进行蓝白斑筛选，取白色菌斑进行PCR扩增鉴定，选取阳性重组克隆载体的菌株质粒测序(睿博兴科生物技术有限公司)，其中，回收的扩增产物条带与克隆载体连接，大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化具体方法参照Sambrook的方法进行，质粒DNA的提取采用碱裂解法，用EcoRI和SalI双酶切鉴定，选取阳性克隆进行测序(上海生工公司)；测序结果表明：3’-race扩增得到的片段大小为1049bp，核苷酸序列SEQ ID NO：17。
实施例6刺槐Subtilisin1基因全序列拼装
使用DNAMAN生物软件进行序列的比较、翻译，全序列拼装；经DNAMAN软件拼装后获得了刺槐Subtilisin1基因，命名为SEQ ID NO：1。
DNAMAN软件拼装后获得的刺槐Subtilisin1基因序列在NCBI上进行BLAST比对后分析表明：该基因包含了2322bp的完整开放阅读框，编码含有774个氨基酸残基的蛋白质。改基因的起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA，表明已经获得全长开放阅读框。该基因具有保守的类枯草杆菌蛋白酶家族蛋白的保守PA结构域和4个高度保守区(D区、H区、N区、S区)，与大豆、苜蓿、菜豆(Phaseolus vulgaris)、葡萄(Vitis vinifera)、甜橙(Citrusclementina])等物种的Subtilisin1氨基酸序列相似度都达到了80％以上，说明刺槐Subtilisin1基因全长序列的扩增是成功的。
刺槐Subtilisin1基因全长为2702bp，其中开放阅读框2322bp编码774个氨基酸，5′和3′端的非编码序列长度分别为61bp和318bp。
刺槐Subtilisin1基因的蛋白序列与大豆、鹰嘴豆、赤豆、苜蓿、葡萄等相似性比较高，都达到了80％以上。表达分析发现，该基因主要在花和叶中表达，在根和茎、荚中表达量相对较低。该基因的克隆为刺槐及其他林木分子育种的研究垫定理论基础。
使用DNAStar软件分析刺槐Subtilisin1基因对应编码蛋白的氨基酸序列，命名为SEQ IDNO：2。
从所构建cDNA-AFLP文库中筛选出与大豆Subtilisin1基因相似性高达85％的基因片段。以此片段为基础进行RACE扩增，经过两轮扩增，5’-RACE扩增得到的片段大小为852bp，3’-RACE扩增得到的片段大小为965bp，用DNAman软件拼接后得到序列大小为2702bp的全长序列。此序列包含2322的开放阅读框，5’长度为62bp，3’长度为318bp，编码774个氨基酸。
通过NCBI在线分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)氨基酸序列的相似性可知，刺槐Subtilisin1氨基酸序列与大豆、番茄、拟南芥等植物的Subtilisin1氨基酸序列相似性都比较高(图2A、图2A，其中图2A为图2A的续图，即图2A中的氨基酸顺序与图2A中的蛋白质氨基酸顺序相连接)，达到了80％以上。刺槐Subtilisin1基因的氨基酸序列与大豆(Glycine max)相似性最高，达到了90％，其次是鹰嘴豆(Cicer arietinum)、苜蓿(Medicago truncatula)、赤豆(Vigna angularis)分别达到了89％、88％、87％，其次是与菜豆(Phaseolus vulgaris)、葡萄(Vitis vinifera)、甜橙(Citrus clementina])、香瓜(Cucumis melo)等相似性都比较高都达到了80％以上，说明Subtilisin1基因是保守性比较强的一类基因。
实施例7刺槐Subtilisin1基因对应编码蛋白质的分析
采用Pfam24.0在线软件(http//:pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)对刺槐Subtilisin1基因对应编码蛋白序列进行初步家族分类和功能预测；利用Protparam在线软件(http//:au.expasy.org/tools/protparam.html)对目标蛋白质的分子质量、等电点及基本性质等信息进行分析和预测；采用ChloroP在线软件(http//：www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)对目标蛋白质是否含有转运肽进行分析；采用TargetP在线软件(http//:www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对目标蛋白质在细胞中的亚细胞定位进行分析和预测；采用ProtScale在线软件(http//:web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)对目标蛋白的疏水性进行分析；采用TMHMMServer v.2.0在线软件(http//:www.cbs.dtu.dk/services/HMHMM)对目标蛋白的跨膜区进行分析和预测；采用Phyre2在线软件(http//:www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)对目标蛋白的二级序列和分子的3D结构进行分析和预测。测定结果如下：
采用Protparam在线软件对刺槐Subtilisin1蛋白的分子质量、等电位点及基本性质等信息进行分析和预测。结果表明：刺槐Subtilisin1蛋白含有氨基酸770个；分子量为81.91kDa；理论等电位点PI为9.13；280nm下水溶液中消光系数为77405/M﹒cm；0.1％浓度下吸光值为0.937；不稳定系数为36.34，比较稳定；室温体外半衰期为30h；脂肪族系数为85.22；总平均亲水性为-0.002。
用ChloroP软件对刺槐Subtilisin1蛋白是否含有叶绿体转运肽(cTP)进行分析。ChloroP界面中：得分Score数值在0.4-0.6之间，数值大于0.5时cTP显示为Y，表示含有叶绿体转运肽，当显示为-时表示不含有叶绿体转运肽，结果刺槐Subtilisin1蛋白得分为0.452，cTP显示为-，表示其不含叶绿体转运肽。
用TargetP在线软件对刺槐Subtilisin1蛋白在细胞中的亚细胞定位进行分析和预测。TargetP软件界面中：cTP代表叶绿体转运肽，mTP代表线粒体转运肽，SP代表信号肽，代表细胞其他部位，Loc代表预测结果，RC表示预测可信度(1—5,1代表最可信，5代表最不可信)。结果表明：刺槐Subtilisin1蛋白得分为mTP为0.067，SP(0.988)，other(0.122)，Loc(S),RC得分为1；上述结果表明刺槐Subtilisin1蛋白定位于植物细胞的细胞质等结构中。这与我们对其功能的预测是一致的。
采用ProtScale在线软件，以默认算法对刺槐Subtilisin1蛋白的疏水性进行分析。结果表明(图4)，Subtilisin1蛋白最小亲水性为-2.678，最大亲水性为2.522，具有刺槐Subtilisin1蛋白具有一定的亲水性。
用TMHMM Server2.0在线软件对刺槐Subtilisin1蛋白的跨膜区进行分析和预测。结果表明(图5)，Subtilisin1蛋白结构中不存在跨膜区，不是跨膜结合蛋白。
用Phyre2软件对Subtilisin1蛋白的二级序列和高级序列的3D结构进行分析和预测。结果表明(图6)，Subtilisin1蛋白中有超过97％的氨基酸残基可以找到相匹配的模型用于建模，其二级结构中共含有13个a-螺旋和35个β-长带，并且我们预测了Subtilisin1蛋白分子的3D结构，如图5所示。
实施例8刺槐Subtilisin1基因系统进化树分析
利用DNAman软件构建了几种植物的延伸因子基因的系统进化树(图3)，结果表明所分析植物的枯草杆菌蛋白酶可分为4类：葡萄(vitis vinfera)单独分为一类，玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等四个物种属于同一个分支，川桑(Morus notabilis)和胡杨(Populus euphratica)属于另外一个分支，刺槐(Robinia pseudoacacia)与大豆(Glycine max)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、苜蓿(Medicago truncatula)等其他物种属于另一个分支。
实施例9刺槐Subtilisin1基因在不同组织器官中的表达
采用TAKARA公司的SYBR Green I荧光定量PCR试剂和ABI公司的7500Fast荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR分析试验，其中反应体系20μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10μL；ROX 0.5μL；ddH2O 7.5μL；cDNA template 1μL；正、反引物(SEQ ID NO：13、SEQID NO：14，见表1)各0.5μL。采用两步法进行PCR扩增，扩增条件如下：95℃预变性30s；95℃变性3s，60℃退火30s，共40个循环；之后进行55～95℃溶解曲线分析。每个样品3次生物学重复，试验获得CT值。根据公式Q＝E△Ct，其中Q为基因在组织器官内的相对表达量；E为基因扩增效率，E一般默认为2即扩增效率为100％，△Ct＝Ct组织-CtACT，Ct组织为每个样品的Ct值，CTACT为内参基因的CT值。
实时荧光定量分析表明，Subtilisin1因子基因在花盛开期表达量最高，其次是叶片期，而在根、茎、豆荚中的表达量都相对较低，老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量(如图7)初步推测这是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老。
研究者已从多种植物中克隆分析了多种Subtilisin1蛋白酶，拟南芥中含有56个Subtilisin1家族成员，水稻中有63个，西红柿中有15个。其中拟南芥中是研究最多也是最详细的。Rantengarten等将Subtilisin1基因56个不同的家族成员分为6个不同的亚族，其中5个家族的亚成员与pyrolysins具有较高的相似性，其中还有两个基因与动物的kexins具有很高的相似性。
尽管枯草杆菌蛋白酶在结构上有相似性，但其在表达和功能上存在差异，在番茄P69A中，除根和花之外的所有植物器官中表达且与细胞延伸相关；在拟南芥中，该基因在气孔前体细胞中表达强烈，与调节气孔密度的信号传导有关；在大豆中，Subtilisin1基因在种皮中表达量最高，与厚壁组织的分化有关；在水稻中，该基因在在雌蕊及雄花丝中大量表达，而在叶、根其他部位未发现有Subtilisin1基因的表达。本实验中Subtilisin1基因在花和叶中表达量比较高，而在根、茎、荚中表达量比较低，说明该基因在幼嫩组织中的表达量要高于老的组织器官中的表达量。
综合上述，植物类枯草杆菌蛋白酶在植物生长发育和抗性反应中扮演者重要角色。且我国林木材质形成、开花调控相关的基因克隆研究有一定的进展，但抗冻、抗寒、抗病虫害等抗性方面的研究还很薄弱。
在本实验中，我们分离克隆并分析了类枯草杆菌基因的序列蛋白质功能鉴定和表达模式，为将来该基因的同源转化，分子育种，提供刺槐抗逆性具有重要的理论意义和应用价值。这为开展刺槐分子育种，提高刺槐抗性具有重要的理论和应用价值。而且本实验对其他木本植物遗传改良具有很大的借鉴意义。

Claims (10)

1.一种刺槐Subtilisin1基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.一种刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
3.一种刺槐Subtilisin1基因克隆的引物，其特征是所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、和SEQ ID No.12。
4.一种刺槐Subtilisin1基因的克隆方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：
1)提取刺槐花中的总RNA，纯化后进行反转录，合成cDNA第一链；
2)以刺槐cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段；
3)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行5′-race扩增，获得5′-端扩增产物；
4)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行3′-race扩增，获得3′端扩增产物；
5)扩增产物进行拼接，即得该基因全长。
5.如权利要求4所述的克隆方法，其特征是，步骤2)中所述PCR扩增包括如下步骤：
2-1)根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列设计一对中间片段扩增引物；
2-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；
2-3)扩增产物进行拼接，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段。
6.如权利要求4所述的克隆方法，其特征是，步骤2-1)中所述的引物分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
7.如权利要求4或5所述的克隆方法，其特征是，步骤3)中所述5′-race扩增包括如下步骤：
3-1)根据步骤2)获得的刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段设计5′-race扩增引物，其中5′-race扩增引物包括一对5′-race锚定引物、一对扩增5′端引物；
3-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，利用一个5′-race锚定引物和一个扩增5′端引物进行第一轮5′-race扩增，获得第一轮5′-race扩增产物；
3-3)以第一轮5′-race扩增产物为模板，利用另一个5′-race锚定引物和另一个扩增5′端引物进行第二轮5′-race扩增，获得5′-端扩增产物。
8.如权利要求7所述的的克隆方法，其特征是，步骤3-1)中所述5′-race锚定引物分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述扩增5′端引物分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
9.如权利要求5或6所述的克隆方法，其特征是，步骤4)中所述3′-race扩增包括如下步骤：
4-1)根据步骤2)获得的刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段设计3′-race扩增引物，其中3′-race扩增引物包括一对3′-race锚定引物、一对扩增3′端引物；
4-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，利用一个3′-race锚定引物和一个扩增3′端引物进行第一轮3′-race扩增，获得第一轮3′-race扩增产物；
4-3)以第一轮3′-race扩增产物为模板，利用另一个3′-race锚定引物和另一个扩增3′端引物进行第二轮3′-race扩增，获得3′-端扩增产物。
10.如权利要求9所述的克隆方法，其特征是，步骤4-1)中所述3′-race锚定引物分别为SEQID NO：9和SEQ ID NO：10所示；所述扩增5′端引物分别为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。
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