CN106047894A - 蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106047894A
CN106047894A CN201610594794.8A CN201610594794A CN106047894A CN 106047894 A CN106047894 A CN 106047894A CN 201610594794 A CN201610594794 A CN 201610594794A CN 106047894 A CN106047894 A CN 106047894A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mte1l
gene
truncatula
seq
medicago truncatula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610594794.8A
Other languages
English (en)
Inventor
夏正俊
张兴政
翟红
吴红艳
吕世翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Original Assignee
Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS filed Critical Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority to CN201610594794.8A priority Critical patent/CN106047894A/zh
Publication of CN106047894A publication Critical patent/CN106047894A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Abstract

蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用，涉及一种蒺藜苜蓿基因及其编码蛋白和应用。MtE1L基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。MtE1L基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。该基因在促进蒺藜苜蓿开花中的应用。本发明通过蒺藜苜蓿品种R108的遗传及分子功能分析，蒺藜苜蓿MtE1L基因具有促进蒺藜苜蓿开花的生理功能。

Description

蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明涉及一种蒺藜苜蓿基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
蒺藜苜蓿是一种长日照一年生豆科植物，且现已完成大规模基因组测序。蒺藜苜蓿因其生长周期短、倍性小(2n＝16)、基因组小(470Mb)、自花授粉等特点，使蒺藜苜蓿称为豆科植物生物学和基因组学研究的重要模式植物。蒺藜苜蓿比较基因组学研究证实，蒺藜苜蓿与大豆在宏线性水平和微线性水平有较高的共线性关系。除此之外，蒺藜苜蓿也与其他大部分豆科植物遗传相似性很高，从蒺藜苜蓿获得的信息对于其他豆科植物的研究具有重要的借鉴意义。
发明内容
本发明是提供一种蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用。
本发明的蒺藜苜蓿MtE1L基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
本发明的蒺藜苜蓿MtE1L基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
本发明蒺藜苜蓿MtE1L基因的应用是指MtE1L基因在促进蒺藜苜蓿开花中的应用。
本发明的有益效果：
本发明公开了蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用。本发明通过MtE1L基因在大豆遗传背景的功能研究以及MtE1L突变株系的表型及表达分析，确定了MtE1L基因对蒺藜苜蓿生开花具有促进作用。本发明的MtE1L基因在转基因大豆株系中得到了异源表达，但MtE1L基因并未影响大豆正常开花调控。表明MtE1L基因与大豆生育期E1基因(E1基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能)功能存在显著差异。
附图说明
图1表示载体构建大肠杆菌单菌落PCR鉴定结果；
图2表示构建后pTF101:35S:MtE1L载体经过Xba I和Sac I双酶切鉴定结果；
图3为MtE1L基因在MtE1L基因异源表达大豆转基因株系中的表达水平；
图4为长日照条件下MtE1L转基因大豆花期表型；
图5为图4的放大图；
图6为短日照条件下MtE1L转基因大豆花期表型；
图7为图6的放大图；
图8为长日照和短日照条件下，e1-as在MtE1L转基因大豆中的表达水平；
图9为长日照条件下，GmFTs基因在MtE1L转基因大豆中的表达水平；
图10为短日照条件下，GmFTs基因在MtE1L转基因大豆中的表达水平；
图11为mte1l突变株系NF16583基因分型PCR鉴定；
图12为mte1l突变株系NF20110基因分型PCR鉴定；
图13为MtE1L基因在mte1l纯合突变体中的表达检测；
图14为长日照条件下，mte1l纯合突变体花期表型；
图15为图14的放大图；
图16为对杂交F2群体NF1-2-4进行PCR基因分型；
图17为对杂交F2群体NF2-4-4进行PCR基因分型；
图18为F2突变体杂交群体花期统计分析。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式蒺藜苜蓿MtE1L基因的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示。
具体实施方式二：本实施方式本发明的蒺藜苜蓿MtE1L基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
以下实施例中如无特别说明均为常规方法。
实施例1：蒺藜苜蓿MtE1L基因的获得与鉴定方法如下：
以蒺藜苜蓿R108品系的刚展开三出复叶为材料，提取全基因组作为模板，以MtE1L-F1(Seq ID No：3)和MtE1L-R1(Seq ID No：4)为引物，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的高保真酶FastPfu Fly DNA Polymeras，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸80s，共30循环，再72℃延伸5min；并对扩增后获得的PCR产物，采用购买自Promega公司的SV Gel and PCR Clean Up System进行凝胶回收，并交由英维捷基(上海)贸易有限公司进行测序鉴定。
经检测，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该基因片段即为蒺藜苜蓿MtE1L基因，由555bp个碱基组成。其编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。
蒺藜苜蓿开花调控MtE1L基因编码蛋白在氨基酸序列71～177区域存在着一个与B3结构域远缘相似的区域。其中B3是能够与DNA结合的蛋白结构域，依据前人研究，B3结构域中含有与DNA相结合的特殊位点，一般与DNA分子的大沟起作用，含有B3结构域的蛋白质在植物逆境胁迫、生长素及ABA信号通路中起重要作用。
实施例2：蒺藜苜蓿MtE1L基因的功能验证
(一)大豆转基因进行基因功能验证
一、将测序后的PCR产物稀释10倍作为PCR模板，以MtE1L-F2(Seq ID No：5)和MtE1L-R2(Seq ID No：6)为引物，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的高保真酶FastPfu Fly DNA Polymeras，并通过PCR反应进行基因扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，2循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，2循环，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸40s，26循环，再72℃延伸5min，最终获得含有Xba I和Sac I酶切位点的蒺藜苜蓿MtE1L基因序列。
二、通过特异性内切酶处理将获得的蒺藜苜蓿MtE1L基因克隆到pTF101质粒中，获得重组质粒pTF101:35S:MtE1L，pTF101:35S:MtE1L载体鉴定如图1和2所示，结果表明pTF101:35S:MtE1L载体构建成功。其中图1表示大肠杆菌单菌落PCR鉴定结果，图2表示构建后载体经过Xba I和Sac I双酶切鉴定结果。
并将pTF101:35S:MtE1L质粒通过根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法转入大豆东农50品种基因组中，获得MtE1L异源表达大豆株系。其中pTF101质粒由美国爱荷华州立大学王康教授馈赠，该质粒已用于公开发表论文。
三、转基因大豆中RT-PCR进行功能验证
1、取MtE1L异源表达大豆株系的刚展开三出复叶为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取大豆叶片总RNA；
2、采用DNase处理步骤一提取的总RNA，处理后的总RNA采用购买自Toyobo公司的NanoDrop检测其DNA含量及质量；
3、取经步骤2NanoDrop检测到达标准后的2μg总RNA，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，以及试验盒配带的dT18引物，按照试剂盒的操作手册合成cDNA；
4、取2μl步骤3稀释5倍后的cDNA作为RT-PCR模板，以MtE1L-F3(Seq ID No：7)和MtE1L-R3(Seq ID No：8)为引物，操作步骤按购买自北京全式金生物科技有限公司的Top Green qPCR SuperMix试剂盒中所介绍的操作步骤进行，每个样品的总反应体积为20μL；
5、采用购买自北京全式金生物科技有限公司的EasyTaq，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30循环，再72℃延伸5min；并以大豆内参基因TUA5作为对照。
在长日照和短日照条件下，MtE1L基因在MtE1L基因异源表达大豆转基因株系(L6和L14)中的表达水平如图3所示，其中大豆TUA5为参照基因。长日照条件下MtE1L转基因大豆花期表型如图4和5所示，图5为图4的放大图；短日照条件下MtE1L转基因大豆花期表型如图6和7所示。可以看出，在长日照和短日照条件下，MtE1L异源表达大豆株系和野生型开花期无明显差异。图8、9、10为长日照和短日照条件下，e1-as和GmFTs基因在MtE1L转基因大豆中的表达水平；可以看出MtE1L基因的异源表达也并未影响大豆內源e1-as和GmFTs(GmFT2a、GmFT5a和GmFT4)的表达。其中大豆GmFT2a、GmFT5a和GmFT4均为大豆成花相关基因。
由图3～10可知，本发明的MtE1L基因转基因大豆株系中得到了异源表达，但MtE1L基因并未影响大豆正常开花调控。对本试验重复操作一次后，获得了相似结果。表明MtE1L基因与大豆生育期E1基因功能存在差异。
(二)mte1l蒺藜苜蓿突变体功能验证
一、对从蒺藜苜蓿R108品种Tnt1突变体库(http://medicago-mutant.noble.org/mutant/)中筛选获得的两个突变株系[NF16583(NF1)和NF20110(NF2)]进行突变位点鉴定。以蒺藜苜蓿突变体叶片为材料，采用CTAB法提取叶片DNA，并以MtE1L-F3(Seq ID No：7)、MtE1L-R3(Seq ID No：8)和MtE1L-F3(Seq ID No：7)、MtE1L-Tnt1-R(Seq ID NO.9)为引物，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的高保真酶FastPfu Fly DNA Polymeras，并分别通过PCR反应进行MtE1L基因扩增以及突变区段扩增，其中MtE1L基因扩增PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30循环，再72℃延伸5min；突变区段扩增PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸80s，共30循环，再72℃延伸10min。
二、将野生型R108子代和基因分型获得的纯合突变株系子代经种皮破损后，置于湿润滤纸上，并于4℃条件下黑暗处理10d，然后移栽至湿润营养土中，置于22℃恒温长日照条件的(16h光照/8h黑暗)人工气候箱内正常培养，并统计其花期。
三、mte1l突变株系中RT-PCR进行功能验证
1、取mte1l纯合突变株系的刚展开三出复叶为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取大豆叶片总RNA；
2、采用DNase处理步骤一提取的总RNA，处理后的总RNA采用购买自Toyobo公司的NanoDrop检测其DNA含量及质量；
3、取经步骤2NanoDrop检测到达标准后的2μg总RNA，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，以及试验盒配带的dT18引物，按照试剂盒的操作手册合成cDNA；
4、取2μl步骤3稀释5倍后的cDNA作为RT-PCR模板，以MtE1L-F3(Seq ID No：7)和MtE1L-R3(Seq ID No：8)为引物，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的EasyTaq，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30循环，再72℃延伸5min；并以蒺藜苜蓿内参基因MSC27作为对照。
四、将基因分型获得的纯合突变株系(其中NF1-2-4和NF2-4-4为分别来源于纯合突变植株NF1-2和NF2-4的子代植株)与野生型植株杂交，通过自交获得F2群体，并对获得的F2群体经上述步骤一和二中提及的基因型鉴定方法和培养方式进行处理，最终进行花期统计及数据分析。
经PCR结果鉴定，由图11和12可知，只扩增获得MtE1L基因目的条带的为野生型，只扩增获得突变序列目的条带的为纯合突变植株，扩增获得两条条带的为杂合突变植株，由此可见分别来源于NF16583(NF1)的F1代植株NF1-1、NF1-2以及来源于NF20110(NF2)的F1代植株NF2-2、NF2-4为纯合突变植株。
图13为MtE1L基因在mte1l纯合突变体中的表达检测，经RT-PCR鉴定，纯合突变体NF1-1和NF2-2子代无MtE1L基因表达。
图14和15为长日照条件下，mte1l纯合突变体花期表型；在长日照条件下，纯合突变株系较之野生型株系表现为晚花表型；
对获得的杂交F2群体进行PCR基因分型(如图16和17所示)，结果表明子代分离比例分别为野生型：杂合体：纯合体＝4:7:4和3:6:4，符合孟德尔遗传定律，且在长日照条件下纯合突变植株较之野生型和杂合突变植株表现为晚花表型(如图18所示)。
由图11～18可知，本发明的MtE1L基因在纯合突变株系中无表达，且较之野生型表现为晚花表型，表明MtE1L基因作为开花促进因子参与蒺藜苜蓿的开花调控。

Claims (3)

1.蒺藜苜蓿MtE1L基因，其特征在于MtE1L基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的蒺藜苜蓿MtE1L基因编码蛋白的氨基酸序列，其特征在于该氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1所述的蒺藜苜蓿MtE1L基因在促进蒺藜苜蓿开花中的应用。
CN201610594794.8A 2016-07-26 2016-07-26 蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用 Pending CN106047894A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610594794.8A CN106047894A (zh) 2016-07-26 2016-07-26 蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610594794.8A CN106047894A (zh) 2016-07-26 2016-07-26 蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106047894A true CN106047894A (zh) 2016-10-26

Family

ID=57418359

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610594794.8A Pending CN106047894A (zh) 2016-07-26 2016-07-26 蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106047894A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337884A (zh) * 2018-12-21 2019-02-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种丙酮酸激酶基因及其应用
CN114752603A (zh) * 2022-01-30 2022-07-15 中国科学院西双版纳热带植物园 蒺藜苜蓿pinna2基因的突变基因

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRISHNAKUMAR V ET AL.: "MTGD: The Medicago truncatula genome database", 《PLANT CELL PHYSIOL》 *
ZHANG X ET AL.: "Functional conservation and diversification of the soybean maturity gene E1 and its homologs in legumes", 《SCI REP》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337884A (zh) * 2018-12-21 2019-02-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种丙酮酸激酶基因及其应用
CN109337884B (zh) * 2018-12-21 2021-09-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种丙酮酸激酶基因及其应用
CN109337884B9 (zh) * 2018-12-21 2021-10-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种丙酮酸激酶基因及其应用
CN114752603A (zh) * 2022-01-30 2022-07-15 中国科学院西双版纳热带植物园 蒺藜苜蓿pinna2基因的突变基因

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Genome sequencing and CRISPR/Cas9 gene editing of an early flowering Mini‐Citrus (Fortunella hindsii)
Kumar et al. Current knowledge in lentil genomics and its application for crop improvement
Richards et al. Genome-wide patterns of Arabidopsis gene expression in nature
Guo et al. Genomic analyses of diverse wild and cultivated accessions provide insights into the evolutionary history of jujube
Alghamdi et al. Faba bean genomics: current status and future prospects
Zhu et al. The persimmon (Diospyros oleifera Cheng) genome provides new insights into the inheritance of astringency and ancestral evolution
CN106470544A (zh) 果实产量提高的瓜植株
Smýkal Pea (Pisum sativum L.) in biology prior and after Mendel’s discovery
CN108239647A (zh) 一种控制油菜株型的基因、分子标记及应用
Badenes et al. Application of genomic technologies to the breeding of trees
Ye et al. Transcriptomic analysis of drought stress responses of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides subsp. sinensis) by RNA-Seq
Yue et al. Full-length transcriptome sequencing provides insights into the evolution of apocarotenoid biosynthesis in Crocus sativus
Yao et al. Identification of key drought stress-related genes in the hyacinth bean
Ma et al. Identification and application of BhAPRR2 controlling peel colour in wax gourd (Benincasa hispida)
CN107868847A (zh) 与甜瓜黄绿叶色基因ygl紧密连锁的分子标记
CN110777153B (zh) 一种美洲黑杨促雄基因MmS及其应用
Das et al. Current perspectives on reducing the β-ODAP content and improving potential agronomic traits in grass pea (Lathyrus sativus L.)
CN106086036B (zh) 水稻苗期叶片白化性状基因Oscaac1及其应用
CN106047894A (zh) 蒺藜苜蓿MtE1L基因及其编码蛋白和应用
CN107418956A (zh) 水稻光敏感核不育基因pms1的分离克隆及应用
CN105420273B (zh) 一种开花提前的转基因植物的培育方法
CN108239675B (zh) 一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM02及其应用
Woollacott et al. The hooded mutant of Lathyrus odoratus (Fabaceae) is associated with a cycloidea gene mutation
CN110724694B (zh) 一种水稻育性基因saw1及其应用
Vashistha et al. Genetics of sex chromosomes and sex-linked molecular markers in papaya (Carica papaya L.)

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161026

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication