ES2277364T3 - Enzimas quimicamente modificadas. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA ENZIMAS MODIFICADAS EN LAS CUALES AL MENOS UN AMINOACIDO DE UNA ENZIMA, COMO ASPARRAGINA, LEUCINA, METIONINA O SERINA, ES REEMPLAZADO POR UNA CISTEINA, Y EL HIDROGENO DEL TIOL ES REEMPLAZADO POR UN GRUPO SUSTITUYENTE QUE PROPORCIONA UNA CADENA LATERAL DE TIOL, SELECCIONADO A PARTIR DEL GRUPO FORMADO POR: A) - SR 1 R 2 , DONDE R 1 ES UN ALQUILO Y R 2 ES UNA FRACCION POLAR CARGADA; B) SR SUP,3 , DONDE R 3 ES UN FENILO SUSTITUIDO O SIN SUSTITUIR; C) - SR 4 , DONDE R 4 ES CICLOHEXILO SUSTITUIDO O SIN SUSTITUIR; D) - SR 5 , DONDE R 5 ES ALQUILO C 10 C 15 ; Y E) - SR 6 , DONDE R 6 ES ALQUILO C 16 . ASIMISMO, SE PROPORCIONAN PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION DE ENZIMAS MODIFICADAS, ASI COMO ADITIVOS DETERGENTES Y ALIMENTARIOS, Y UNA COMPOSICION PARA EL TRATAMIENTO DE MATERIAS TEXTILES. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO DE UTILIZACION DE DICHAS ENZIMAS MODIFICADAS EN UNA SINTESIS ORGANICA. POR ULTIMO, SE PROPORCIONAN ENZIMAS CON UNA ACTIVIDAD MEJORADA, UN PERFIL DE PH Y/OUNA EFICACIA DE LAVADO MODIFICADOS.
Description
Enzimas químicamente modificadas.
La modificación de las propiedades de las
enzimas por mutagénesis dirigida al sitio se ha limitado a
reemplazamientos de aminoácidos naturales, aunque recientemente se
han derivado estrategias biológicas moleculares para superar esta
restricción (Comish, V.W. y col. (1995) Angew. Chem., Int.
Ed. Engl. 34:621). Sin embargo, los últimos procedimientos
no son fáciles de aplicar en general en la mayoría de los
laboratorios. En contraposición, la modificación química controlada
de enzimas ofrece amplio potencial para modificación fácil y
sencilla de la estructura de las enzimas, abriendo con ello
extensas posibilidades para confección controlada a medida de la
especificidad de las enzimas.
El cambio de las propiedades de las enzimas por
modificación química se ha explorado previamente, siendo el primer
informe de 1986 de los grupos de Bender (Polgar, L. y col. (1986) J.
Am. Chem. Soc. 88:3153) y Koshland (Neet, K.E. y col. (1966)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:1606), quienes crearon una
tiosubtilisina por transformación química (CH_{2}OH \rightarrow
CH_{2}SH) del resto serina del sitio activo de subtilisina BNP' a
cisteína. El interés en enzimas artificiales producidas
químicamente, incluyendo algunas con potencial sintético, fue
renovado por Wu, Z.-P. y col. (1989) J. Am. Chem. Soc.
111:4514; Bell, I.M. y col. (1993) Biochemistry
32:3754 y Peterson, E.B. y col. (1995) Biochemistry
34:6616, y más recientemente por Suckling, C.J. y col. (1993)
Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:531.
Las enzimas se aceptan ahora ampliamente como
catalizadores útiles en síntesis orgánica. Sin embargo, las enzimas
naturales, de tipo nativo, nunca pueden esperar aceptar todas las
estructuras de interés sintético químico, ni transformarlas siempre
de modo estereoespecífico en los materiales enantioméricamente puros
deseados que se necesitan para síntesis. Esta limitación potencial
en las aplicabilidades sintéticas de las enzimas se ha reconocido,
y se ha hecho algún progreso en el cambio de sus especificidades de
una manera controlada usando las técnicas de mutagénesis dirigida
al sitio y al azar de la ingeniería de proteínas. Sin embargo, la
modificación de las propiedades de las enzimas por ingeniería de
proteínas se limita a hacer reemplazamientos de aminoácidos
naturales, y los procedimientos biológicos moleculares diseñados
para superar esta restricción no son fácilmente viables para
aplicación normal o síntesis a gran escala. La generación de nuevas
especificidades o actividades obtenidas por modificación química de
enzimas ha intrigado a los químicos durante muchos años, y continúa
haciéndolo. Los presentes inventores han adoptado la estrategia
combinada de mutagénesis dirigida al sitio- modificación química
puesto que ofrece posibilidades virtualmente ilimitadas para crear
nuevos entornos estructurales en la localización de cualquier
aminoácido.
aminoácido.
La Patente de EE.UU. 5.208.158 describe enzimas
de detergentes modificadas químicamente en las que una o más
metioninas han sido mutadas a cisteínas. Las cisteínas se modifican
posteriormente con el fin de conferir a la enzima estabilidad
mejorada respecto a los agentes oxidantes. La modificación química
reivindicada es el reemplazamiento del hidrógeno de tiol con un
alquilo C_{1-6}.
Aunque la Patente de EE.UU. 5.208.158 ha
descrito el cambio de la estabilidad a oxidantes de una enzima,
también sería deseable desarrollar una o más enzimas con
propiedades cambiadas tales como actividad, especificidad
nucleófila, especificidad de sustrato, estereoselectividad,
estabilidad térmica, perfil de actividad al pH, y propiedades de
ligamiento a la superficie para uso, por ejemplo, en detergentes o
síntesis orgánica.
Berglund y col., (1996) Bioorg. Med. Chem.
Lett. 6(21):2507-2512 describen, entre
otras, mutación de metionina en la subtilisina de Bacillus
lentus para dar los mutantes
M222C-SCH_{2}CH_{2}NH_{3}^{+} y
M222C-SCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-} modificados
químicamente.
El documento WO 91/16423 describe, entre
otras, modificaciones químicas de alquilo inferior de M222C en
subtilisina-309.
Bech y Beddam (1988) Carlsberg Research
Communications 53:381-393 describen
mutaciones basadas en M398C en el sitio S_{1} de carboxipeptidasa
Y e incluye, entre otras, preparación de un mutante cargado
basado en la modificación del mutante Cys
(AeS-CyS-CPD-Y=CSCH_{2}CH_{2}NH_{3}).
Procedimientos para modificar químicamente
tioles de proteínas usando disulfuros, alquil tiol sulfonatos y
disulfuros mixtos de tiopiridina para producir disulfuros mixtos de
proteína están descritos por Wynn y Richards (1995) Methods in
Enzymology 251:351-356.
El documento WO 96/27671 describe la producción
de mutantes de combinación de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens que incluyen, entre otros, Asn 62 a
Asp y Gly 166 a Asp (N62D/G166D) y opcionalmente, Tyr 104 a Asp.
El documento
EP-A-0328229 describe, entre
otras, la mutación de metionina en la posición 216 de la
proteasa de serina de Bacillus nov. spec. PB92 a serina (M216S).
Bonneau y col., (1991) Journal of the
American Chemical Society 113:1026-1030
describe la mutación de Gly166 a Asn o Ser, Met222 a Phe, Tyr217 a
Leu y mutación triple de Glu156 a Ser, Gly169 Ala y Tyr217 a Leu en
subtilisina BPN'de Bacillus amyloliquefaciens.
Gloss y Kirsch (1995) Biochemistry
34:12323-12332 describen mutaciones basadas
en K258C en una cisteína-sin AATasa denominada
"Quint", que incluye entre otros un mutante cargado
basado en modificación del mutante Cys
(K258C_{Q}-DTA =
C-SCH_{2}CH_{2}NH_{3}).
Un procedimiento combinado de
mutagénesis/modificación química que permita la introducción de una
serie de cadenas laterales de disulfuro de
cisteína-n-alcano en la posición 23
de nucleasa estafilococal por unión de disulfuro a cisteína 23, que
ha sido introducida en la proteína por procedimientos de mutagénesis
convencionales (para dar una V23C nucleasa) se describe por Wynn y
col. (1996) Protein Science
5:1026-1031.
Existe necesidad de enzimas tales como proteasas
que tengan propiedades alteradas. Como tal, la presente invención
proporciona una proteasa modificada de Bacillus subtilisina que
tiene uno o más restos aminoácido de asparagina en el subsitio
S_{2} de la proteasa reemplazados por restos de cisteína. Los
restos de cisteína se modifican reemplazando el hidrógeno de tiol
con un grupo sustituyente que proporciona una cadena lateral de
tiol:
- -SR^{1}R^{2}, en la que R^{1} es un alquilo y R^{2} es un resto cargado o polar;
Con respecto al grupo -SR^{1}R^{2} de la
cadena lateral de tiol, R^{2} puede estar cargado positivamente o
negativamente. Preferiblemente, R^{2} es SO_{3}^{-}, o
NH_{3}^{+}. Además, R^{1} es preferiblemente un alquilo
C_{1-10}.
De la forma más preferida, el aminoácido que ha
de ser reemplazado es N62, donde la posición numerada corresponde a
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens natural o a restos
de aminoácidos equivalentes en otras subtilisinas tales como
subtilisina de Bacillus lentus.
En una realización particularmente preferida, la
enzima es una subtilisina de Bacillus lentus. En las
realizaciones más preferidas, el aminoácido que se ha de reemplazar
por cisteína es N62 y el grupo de cadena lateral de tiol es
- -SR^{1}R^{2}, en el que R^{1} es CH_{2}CH_{2} y R^{2} es SO_{3}^{-}.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir una proteasa modificada, que incluye
proporcionar proteasa de Bacillus subtilisina en la que uno o más
aminoácidos de asparagina en el subsitio S_{2} de la proteasa han
sido reemplazados con restos de cisteína y reemplazar el hidrógeno
de tiol del resto de cisteína con un grupo sustituyente que
proporciona la cadena lateral de tiol:
- -SR^{1}R^{2}, en la que R^{1} es un alquilo y R^{2} es un resto cargado o polar;
Con respecto al grupo -SR^{1}R^{2} de la
cadena lateral de tiol, R^{2} puede estar cargado positivamente o
negativamente. Preferiblemente, R^{2} es SO_{3}^{-}, o
NH_{3}^{+}. Además, R^{1} es preferiblemente un alquilo
C_{1-10}.
De la forma más preferida, el aminoácido que ha
de ser reemplazado es N62, donde la posición numerada corresponde
a subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens que sucede en la
naturaleza o a restos de aminoácidos equivalentes en otras
subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus.
En una realización particularmente preferida, la
enzima es una subtilisina de Bacillus lentus. En las
realizaciones más preferidas, el aminoácido que se ha de reemplazar
por cisteína es N62 y el grupo de cadena lateral de tiol es
- -SR^{1}R^{2}, en el que R^{1} es CH_{2}CH_{2} y R^{2} es SO_{3}^{-}.
Se proporcionan adicionalmente aditivos de
detergentes que incluyen la proteasa modificada.
Se proporcionan aditivos de alimentos que
incluyen la proteasa modificada.
Se proporcionan procedimientos para usar las
enzimas modificadas en formulación de detergentes.
Se proporcionan procedimientos para usar la
proteasa modificada en el tratamiento de un material textil.
Se describen en la memoria descriptiva
procedimientos para usar las enzimas modificadas en la preparación
de un aditivo de alimentos.
Se describen en la memoria descriptiva enzimas
modificadas que tienen actividad aumentada.
Se describen en la memoria descriptiva enzimas
modificadas que tienen perfiles al pH cambiados.
Se describen en la memoria descriptiva enzimas
modificadas que tienen eficacia de lavado mejorada.
Se describen en la memoria descriptiva
procedimientos para usar las enzimas modificadas en síntesis
orgánica.
La Figura 1 es un gráfico de barras de los
resultados obtenidos después de probar mutantes S156C modificados
con inhibidores borónicos a pH 8,6.
La Figura 2 es un gráfico de barras de los
resultados obtenidos después de probar mutantes S166C modificados
con inhibidores borónicos a pH 8,6.
La Figura 3 es un gráfico de los perfiles al pH
de subtilisina de tipo nativo de Bacillus lentus
(SBL-WT; cuadrados) y un mutante de N62C modificado
(N62C-Scy; círculos). Los puntos se hicieron por
duplicado.
En una realización de la invención, se
proporcionan una proteasa de Bacilus subtilisina modificada y
un procedimiento para proporcionarla que tiene uno o más restos
aminoácido de asparagina en el subsitio S_{2} de una subtilisina
reemplazada por restos de cisteína. Los restos de cisteína se
modifican luego reemplazando el hidrógeno de tiol con un grupo
sustituyente que proporciona la cadena lateral de tiol:
- -SR^{1}R^{2}, en la que R^{1} es un alquilo y R^{2} es un resto cargado o polar.
Con respecto al grupo -SR^{1}R^{2} de cadena
lateral de tiol, R^{2} puede estar cargado positivamente o
negativamente. Preferiblemente, R^{2} es SO_{3}^{-}, o
NH_{3}^{+}. Además, R^{1} es preferiblemente un alquilo
C_{1-10}.
Preferiblemente, el aminoácido que ha de ser
reemplazado es N62, donde la posición numerada corresponde a
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens que sucede en la
naturaleza o a restos de aminoácidos equivalentes en otras
subtilisinas, tales como subtilisina de Bacillus lentus.
En una realización particularmente preferida, la
enzima es una subtilisina de Bacillus lentus. En las
realizaciones más preferidas, el aminoácido que se ha de reemplazar
por cisteína es N62 y el grupo de cadena lateral de tiol se
selecciona entre el grupo:
- -SR^{1}R^{2}, en el que R^{1} es CH_{2}CH_{2} y R^{2} es SO_{3}^{-}.
Una "enzima modificada" es una enzima que
ha sido cambiada reemplazando un resto aminoácido tal como
asparagina, serina, o leucina, con un resto de cisteína y
reemplazando luego el hidrógeno de tiol de la cisteína con un grupo
sustituyente que proporciona una cadena lateral de tiol, es decir,
un grupo tal como un alquilo C_{1-6} o un alquilo
C_{10-15} o un grupo que incluye un grupo fenilo,
un grupo ciclohexilo o un resto cargado o polar. Después de la
modificación, las propiedades de la enzima, es decir, actividad o
especificidad al sustrato, puede que cambien. Preferiblemente, la
actividad de la enzima se aumenta.
El término "enzima" incluye proteínas que
son capaces de catalizar cambios químicos en otras sustancias sin
ser cambiadas ellas mismas. Las enzimas pueden ser de tipo nativo o
enzimas variantes. Las enzimas dentro del alcance de la presente
invención son proteasas. La enzima es una proteasa mutante. Las
proteasas de tipo nativo se pueden aislar, por ejemplo, de
Bacillus lentus o Bacillus amyloliquefaciens (también
mencionado como BPN'). Se pueden elaborar proteasas mutantes según
las enseñanzas, por ejemplo, de las Publicaciones PCT N^{os} WO
95/10615 y
WO 91/06637.
WO 91/06637.
Se pueden usar varios tipos de restos para
reemplazar el hidrógeno de tiol del resto de cisteína. Éstos
incluyen -SR^{1}R^{2}, en el que R^{1} se define como un
alquilo C_{1-10} sustituido o no sustituido,
R^{2} es un grupo cargado o polar. R^{1} puede ser sustituido o
no sustituido y/o cadena lineal o cadena ramificada. Un grupo
cargado es uno o más átomos que juntos forman una molécula cargada,
es decir, SO_{3}^{-}, COO^{-}, ó NH_{3}^{+}.
Las expresiones "grupo de cadena lateral de
tiol", "grupo sustituyente que proporciona una cadena lateral
de tiol", "grupo que contiene tiol" y "cadena lateral de
tiol" son expresiones que se pueden usar de manera
intercambiable e incluyen grupos que se usan para reemplazar el
hidrógeno de tiol de la cisteína usada para remplazar uno de los
aminoácidos en una subtilisina. Comúnmente, el grupo de cadena
lateral de tiol incluye un azufre a través del cual los grupos
R^{x} anteriormente definidos se unen al azufre de tiol de la
cisteína.
El término "sustituido" se refiere a un
grupo del que un hidrógeno del grupo ha sido sustituido con otro
átomo o molécula, por ejemplo, con un grupo metilo, un átomo de
flúor, o un grupo hidroxilo. En la presente invención, los grupos
alquilo, grupo ciclohexilo y grupo fenilo pueden estar sustituidos,
es decir, tener sustituciones de uno o más átomos de hidrógeno con
otro átomo o molécula.
El sitio de ligamiento de una enzima consiste en
una serie de subsitios sobre la superficie de la enzima. Los restos
de sustrato que corresponden a los subsitios se marcan P y los
subsitios se marcan S. Por convención, los subsitios se marcan
S_{1}, S_{2}, S_{3}, S_{4}, S_{1}' y S_{2}'. Se puede
encontrar una discusión de subsitios en Seizen y col. (1991)
Protein Engineering 4:719-737 y Fersht, A.E.
(1985) Enzyme Structure and Mechanism 2 ed., Freeman (Nueva
York) págs. 29-30. Los subsitios preferidos son
S_{1}, S_{1}' y S_{2}.
Los restos de aminoácidos de la presente
invención se pueden reemplazar con restos de cisteína usando
procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio u otros
procedimientos bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo,
Publicación PCT Nº WO 95/10615). Un procedimiento para modificar el
hidrógeno de tiol del resto de cisteína se puede encontrar en el
Ejemplo 4 a continuación.
En un aspecto de la invención, la proteasa
modificada tiene actividad proteolítica cambiada en comparación con
la proteasa precursora, por lo que el aumento de dicha actividad
(numéricamente mayor) permite el uso de la enzima para actuar más
eficazmente sobre un sustrato diana. También son de interés las
enzimas modificadas que tienen actividad, especificidad nucleófila,
especificidad al sustrato, estereoselectividad, estabilidad
térmica, perfil de actividad al pH y propiedades de ligamiento a la
superficie cambiadas en comparación con la precursora.
Sorprendentemente, las proteasas modificadas de
la presente invención pueden tener pKas cambiados y por lo tanto
los perfiles al pH que se derivan de los de la proteasa precursora
(véase Ejemplo 7) sin cambiar la carga superficial de la molécula
de proteasa.
Proteasas modificadas de la invención se pueden
formular en detergentes líquidos y en polvo conocidos que tienen pH
entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 a aproximadamente
5% (preferiblemente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones
limpiadoras o aditivos de detergentes también pueden incluir otras
enzimas tales como proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o
endoglicosidasas conocidas, así como agentes reforzantes de
detergencia y estabilizantes.
Proteasas modificadas de la invención son útiles
para formular diversas composiciones de detergentes. Un cierto
número de compuestos conocidos son tensioactivos adecuados útiles en
composiciones que comprenden enzimas modificadas. Éstos incluyen
detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos o de iones híbridos,
según se describen en los documentos US 4.404.128 a Barry J.
Anderson y US 4.261.868 a Jiri Flora y col. Una formulación de
detergente adecuada es la que se describe en el Ejemplo 7 de la
Patente de EE.UU. 5.204.015. La técnica está familiarizada con
diferentes formulaciones que se pueden usar como composiciones
limpiadoras. Además de las composiciones limpiadoras típicas, se
entiende fácilmente que las proteasas modificadas de la presente
invención se pueden usar para cualquier finalidad para la que se
usan las proteasas naturales o de tipo nativo. Así, estas proteasas
modificadas se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones de jabones
líquidos o en barra, formulaciones de lavavajillas, soluciones o
productos limpiadores de lentes de contacto, síntesis de péptidos,
aplicaciones alimentarias tales como aditivos de alimentos o
preparación de aditivos de alimentos, tratamiento de residuos,
aplicaciones textiles tales como el tratamiento de telas, como
enzimas de fusión-escisión en producción de
proteínas, etc. Las proteasas modificadas de la presente invención
pueden comprender eficacia de lavado mejorada en una composición de
detergente (en comparación con la precursora). Según se usa en este
documento, eficacia de lavado mejorada en un detergente se define
como el aumento de limpieza de ciertas manchas sensibles a las
enzimas tales como hierba o sangre, según se determina por
evaluación de reflectancia de la luz después de un ciclo de lavado
convencional.
La adición de la proteasa modificada de la
invención a composiciones limpiadoras convencionales no crea ninguna
limitación de uso especial. En otras palabras, cualquier
temperatura y pH adecuados para el detergente también son adecuados
para las presentes composiciones en tanto en cuanto el pH esté
dentro del intervalo anterior y la temperatura esté por debajo de
la temperatura de desnaturalización de la enzima modificada que se
describe. Además, las proteasas modificadas de la invención se
pueden usar en una composición limpiadora sin detergentes,
nuevamente tanto solas como en combinación con agentes reforzantes
de detergencia y estabilizantes.
En otro aspecto de la invención, la proteasa
modificada se usa en la preparación de un alimento para animales,
por ejemplo, un alimento basado en cereal. El cereal puede ser al
menos uno de trigo, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, triticale
y arroz. Aunque el componente de cereal de un alimento a base de
cereal constituye una fuente de proteína, habitualmente es
necesario incluir fuentes de proteína suplementarias en el alimento
tales como las que se derivan de harina de pescado, harina de carne
o vegetales. Fuentes de proteínas vegetales incluyen al menos una
de las semillas de soja, semillas de colza, canola, harina de
semilla de soja, harina de semilla de colza y harina de canola con
todo su contenido graso.
La inclusión de una proteasa modificada de la
presente invención en un alimento para animales puede facilitar el
que aumenten el valor de proteína en bruto y/o la digestibilidad y/o
el contenido de aminoácidos y/o los coeficientes de digestibilidad
del alimento, lo que permite una reducción en las cantidades de
fuentes de proteína alternativas y/o suplementos de aminoácidos que
habían sido previamente ingredientes necesarios de los alimentos
para
animales.
animales.
Los alimentos proporcionados por la presente
invención también pueden incluir otros suplementos de enzimas tales
como uno o más de \beta-glucanasa, glucoamilasa,
mananasa, \alpha-galactosidasa, fitasa, lipasa,
\alpha-arabinofuranosidasa, xilanasa,
\alpha-amilasa, esterasa, oxidasa,
óxido-reductasa y pectinasa. Se prefiere
particularmente incluir una xilanasa como suplemento de una enzima
adicional tal como una subtilisina derivada del género
Bacillus. Xilanasa de este tipo se describe con detalles, por
ejemplo, en la publicación de Patente PCT WO 97/20920.
Un aspecto de la invención es una composición
para tratamiento de un material textil que incluye MP. La
composición se puede usar para tratar por ejemplo seda o lana según
se describe en publicaciones tales como RD 216.034; EP 134.267; US
4.533.359; y EP 344.259.
Las proteasas modificadas de la presente
invención se pueden usar en síntesis orgánica, por ejemplo, para
catalizar una reacción deseada y/o favorecer una cierta
estereoselectividad. Véase, por ejemplo, Noritomi y col.
Biotech. Bioeng. 51:95-99 (1996); Dabulis y
col. Biotech. Bioeng. 41:566-571 (1993);
Fitzpatrick y col. J. Am. Chem. Soc.
113:3166-3171 (1991).
Lo siguiente se presenta a manera de ejemplo y
no se ha de interpretar como limitación al alcance de las
reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen para subtilisina de B. lentus
(SBL) se clonó en el vector bacteriófago M13mp19 para mutagénesis.
(Patente de EE.UU. 5.185.258). Se realizó mutagénesis dirigida de
oligonucleótido según se describe en Zoller y col. (1983)
Methods Enzymol. 100:468-500. Se clonaron las
secuencias mutadas, se escindieron y se reintrodujeron en la
expresión plasmídica GG274 en el anfitrión de B. subtilis. Se
añadió PEG (50%) como estabilizante. El concentrado de proteína en
bruto obtenido se purificó por medio de una primera pasada a través
de una matriz desaladora de Sephadex® G-25 con
tampón de pH 5,2 (acetato sódico 20 mM, CaCl_{2} 2mM) para
eliminar contaminantes de bajo peso molecular. Las fracciones
reunidas de la columna de desalación se aplicaron luego a una
columna intercambiadora de cationes fuertes (SP Sepharose® FF) en
el tampón de acetato sódico (anterior), y se eluyó SBL con un
gradiente de una etapa de NaCl 0-200 mM tampón de
acetato, pH 5,2. Se obtuvo polvo de enzima exento de sal después de
diálisis del eluyente frente a agua purificada de Millipore, y
posterior liofilización. La pureza del mutante y de las enzimas de
tipo nativo, que habían sido desnaturalizadas por incubación con
HCl 0,1 M a 0º durante 30 minutos, se comprobó por
SDS-PAGE sobre geles homogéneos usando el Phast®
System de Pharmacia (Upsala, Suecia). La concentración de SBL se
determinó usando el kit de reactivo colorante
Bio-Rad (Hemules, CA) que se basa en el
procedimiento de Bradford (1976) Analytical Biochemistry
72:248-254. La actividad específica de las enzimas
se determinó en tampón de pH 8,6 usando el procedimiento que se
describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción de
1-bromo-3-metilbutano
(1,7520 g, 0,0116 mol), metanotiosulfonato sódico (1,554 g, 0,0116
mol) en DMF seca (5 ml) se calentó a 50°C durante 2 hr. Se añadió
agua (15 ml) a temperatura ambiente, y la mezcla se extrajo con
éter (3x30 ml). Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se
secaron, se concentraron. El residuo se sometió a cromatografía de
columna de resolución rápida sobre gel de sílice con
EtOAc-hexanos (1:4). Se obtuvo el producto como un
líquido incoloro (1,4777 g, 70%). IR (película): 3030 (w), 3011
(w), 2958 (st), 2932 (st), 2873 (st), 1468 (m) 1410 (w), 1388 (w),
1367 (w), 1319 (st), 1136 (st), 955 (st), 748 cm^{-1} (st); RMN
^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,33 (s, 3H,
CH_{3}SO_{2}S); 3,19 (t, J=7,1 Hz, 2H, SCH_{2}CH_{2}),
1,70-1,58 (m, 3H, SCH_{2}CH_{2}CHMe_{2}), 0,95
(d, J=5,3 Hz, 6H, CHMe_{2}); RMN ^{13}C (50 MHz, CDCl_{3}):
\delta 50,60, 38,19, 34,59, 27,40, 22,06.
La mezcla de reacción de yoduro de neopentilo
(3,054 g, 0,0154 mol), metanotiosulfonato sódico (2,272 g, 0,0170
mol) y DMF seca (4 ml) se calentó a 90°C durante 90 hr. Se envolvió
el matraz de reacción con hoja de aluminio para evitar la luz solar
directa sobre la mezcla de reacción, puesto que el yoduro era
sensible a la luz solar. Al final del calentamiento, la mezcla de
reacción era de color rojo-marrón. Se añadió agua
(15 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se extrajo con éter
(3x30 ml). Los extractos de éter combinados se lavaron dos veces
con salmuera, se secaron, se concentraron y el residuo se sometió a
cromatografía de columna sobre gel de sílice con
EtOAc-hexanos (1:2) para ofrecer un aceite incoloro
que se solidificó lentamente (1,2395 g, 44%). El producto se
recristalizó con EtOH al 95%. pf 28,5-29,0°C; IR
(moldeado con CH_{2}CH_{2}): 3021 (m), 2956 (m), 2868 (m), 1467
(m), 1433 (m), 1321 (st) 1310 (st), 1125 (st), 951 (m), 757 (m) y
724 cm^{-1} (m); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,32
(s, 3H, CH_{3}SO_{2}S), 3,13 (s, 2H, SCH_{2}C), 1,05 (s, 9H,
CMe_{3}); RMN ^{13}C (50 MHz, CDCl_{3}): \delta 50,23,
50,09, 32,14, 28,79, MS (EI): 182 (M^{+}), 57 (pico de base,
CMe_{3}^{+}).
La mezcla de reacción de
1-bromohexano (1,046 g, 0,00635 mol),
metanotiosulfonato sódico (0,850 g, 0,00635 mol) y DMF seca (6 ml)
se calentó a 60°C durante 2 hr. Se añadió agua (15 ml) a temperatura
ambiente y la mezcla resultante se extrajo con éter (3x30 ml). Los
extractos se lavaron con salmuera, se secaron, se concentraron y el
residuo se sometió a cromatografía de columna de resolución rápida
sobre gel de sílice con EtOAc-hexanos (1:4) para
ofrecer un líquido incoloro (2,057 g, 82%). IR (moldeado con
CDCl_{3}): 3030 (w), 3010 (w), 2955 (st), 2930 (st), 2860 (st),
1460 (m) 1320 (st), 1133 (st), 955 (st), 747 cm^{-1} (st); RMN
^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta 3,33 (s, 3H,
CH_{3}SO_{2}S); 3,18 (t, J=7,4 Hz, 2H, SCH_{2}CH_{2}), 1,77
(seudo p, J=7,2 Hz, 2H, SCH_{2}CH_{2}),
1,50-1,20 (m, 6H, CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}),
0,90 (m, 3H, CH_{2}CH_{3}); RMN ^{13}C (50 MHz, CDCl_{3}):
\delta 50,64, 36,50, 31,13, 29,46, 28,26, 22,44, 13,96.
La mezcla de reacción de bromometilciclohexano
(1,560 g, 0,00881 mol), metanotiosulfonato sódico (1,180 g, 0,00881
mol) y DMF seca (6 ml) se calentó a 50°C durante 24 hr. Se añadió
agua (15 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se extrajo con éter
(3 x 30 ml). Los extractos se lavaron con salmuera, se secaron, se
concentraron y el residuo se sometió a cromatografía de columna de
resolución rápida sobre gel de sílice con
EtOAc-hexanos (1:4) para ofrecer un aceite incoloro
(1,5033 g, 82%). IR (moldeado con CDCl_{3}): 3030 (w), 3012 (w),
2926 (st), 2853 (st), 1446 (m), 1410 (m) 1320 (st), 1134 (st), 955
(st), 746 cm^{-1} (st); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}):
\delta 3,32 (s, 3H, CH_{3}SO_{2}S); 3,07 (d, J=6,9 Hz, 2H,
SCH_{2}CH), 1,95-1,55 (m, 6H),
1,40-0,90 (m, 5H); RMN ^{13}C (50 MHz,
CDCl_{3}): \delta 50,42, 43,30, 37,83, 32,43, 26,02, 25,82.
La mezcla de 1-bromohexano
(2,095 g, 0,00947 mol), metanotiosulfonato sódico y DMF seca (6 ml)
se calentó a 60°C durante 2 hr. Se añadió agua (15 ml) a
temperatura ambiente y la mezcla se extrajo con éter (3 x 30 ml).
Los extractos de éter se lavaron con salmuera, se secaron, se
concentraron y el residuo se sometió a cromatografía de columna de
resolución rápida sobre gel de sílice con
EtOAc-hexanos (1:4) para ofrecer un sólido blanco
(2,063 g, 94%). Se recristalizó con EtOH al 95%. pf
28,0-29,5°C. IR (moldeado con CDCl_{3}): 2954
(m), 2921 (st), 2852 (st), 1469 (m), 1305 (st), 1128 (st), 965 (m),
758 (m) y 720 cm^{-1} (m); RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}):
\delta 3,32 (s, 3H, CH_{3}SO_{2}S); 3,17 (t, J=7,4 Hz, 2H,
SCH_{2}CH_{2}), 1,77 (m, 2H, SCH_{2}CH_{2}),
1,50-1,20 (m, 14H, -(CH_{2}C)_{7}-), 0,88
(m, 3H, CH_{2}CH_{3}); RMN ^{13}C (50 MHz, CDCl_{3}):
\delta 50,64, 36,49, 31,84, 29,45 (dos carbonos), 29,37, 29,23,
28,94, 28,57, 22,64, 14,08.
Se añadió gota a gota cloruro de mesilo (46,6
ml, 0,602 mol) a una solución de Na_{2}S·9H_{2}O (142,2 g,
0,592 mol) en agua (150 ml). Después de la adición, la mezcla
resultante se calentó a reflujo y cambió de amarillo pálido a
amarillo en 15 horas. Durante este tiempo, también se formaron
algunos precipitados amarillos. La mezcla de reacción se enfrió a
temperatura ambiente y se evaporó el agua. A continuación, el sólido
se trituró con un mortero y una mano de mortero y se secó el polvo
adicionalmente a 50°C y 133,3 Pa. Se usó etanol absoluto (700 ml)
para triturar el polvo en 4 porciones y el filtrado de etanol se
concentró y se enfrió con un baño de hielo para obtener un
precipitado que se recogió por filtración al vacío. Se concentró
adicionalmente el filtrado para obtener una segunda cosecha de
precipitados. Después de repetidas concentraciones y filtraciones
(4 X), el volumen final de filtrado fue aproximadamente 10 ml. Los
precipitados combinados se redisolvieron en etanol absoluto a
temperatura ambiente y se filtraron para eliminar las cantidades
traza de cloruro sódico y sulfuro sódico. El filtrado se concentró
y enfrió y los sólidos se recogieron por filtración al vacío.
Nuevamente, se repitió 3 veces el proceso de concentración,
enfriamiento y filtración para dar cristales blancos en escamas,
que se secaron adicionalmente a 133,3 Pa toda la noche. (24,51 g,
31%). IR (KBr): 3004, 2916, 1420, 1326, 1203, 1095, 980, 772
cm^{-1}. RMN ^{1}H (200 MHz, D_{2}O): \delta 3,23 (s). RMN
^{13}C (50 MHz, D_{2}O, con DMSO-d_{6} como
patrón interno): \delta 39,72 ppm.
Se añadió lentamente bromuro de bencilo (9,07 g,
0,053 mol) a una suspensión de metanotiosulfonato sódico (7,10 g,
0,0530 mol) en EtOH absoluto (100 ml) y la mezcla de reacción se
calentó a reflujo durante toda la noche. Se enfrió la mezcla de
reacción con un baño de hielo y se filtró el sólido (bromuro sódico
y metanotiosulfonato sódico). Se concentró el filtrado para dar un
producto en bruto que era principalmente el producto deseado. Se
obtuvo producto puro por cromatografía de resolución rápida sobre
gel de sílice con EtOAc-hexanos (1:6) (7,92 g,
74%). El producto se purificó adicionalmente por recristalización
con etanol absoluto. pf 39,5-40,2°C (lit.
40-42,5°C). IR (KBr): 3089, 3068, 3017, 3000, 2981,
2936, 2918, 1602, 1582, 1496, 1305, 1131, 960, 771, 741, 702
cm^{-1}. RMN ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,38 (m, 5H,
fenilo), 4,38 (s, 2H, SCH_{2}), 2,91 (s, 3H, CH_{3}SO_{2}).
RMN ^{13}C (50 MHz, CDCl_{3}): \delta 135,12, 129,14, 129,03,
128,26, 51,09, 40,79.
Los reactivos
CH_{3}SO_{2}-SCH_{2}CH_{2})SO_{3}^{-}Na^{+}
y
CH_{3}SO_{2}-SCH_{2}CH_{2})NH_{3}^{+}Br^{-}
fueron comprados a Toronto Research Chemicals (Toronto,
Ontario).
Lo siguiente es ejemplo del procedimiento usado
para modificar los mutantes-Cys, es decir, N62C.
A una solución de mutante-Cys,
M222C B. Lentus (25,1 mg, 0,94 \mumol) en tampón (250 ml;
CHES 70 mM, MES 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, pH 9,5) en un tubo de ensayo
de polipropileno que había sido revestido previamente con una
solución acuosa de polietilenglicol 10.000 (0,1% peso/volumen), se
añadió una solución de metanotiosulfonato de metilo que se describe
en el Ejemplo 2 en EtOH al 95% (100 \muL, 92,4 \mumol). La
solución se agitó en remolino y se dejó agitar lentamente en un
agitador por volteo a temperatura ambiente (22°C). Una muestra para
ensayo en blanco que contenía etanol en lugar de la solución de
reactivo se hizo actuar en paralelo. La modificación fue seguida
por medio de mediciones de actividad sobre muestras retiradas de 10
\muL y se determinó según el procedimiento anteriormente
descrito. La reacción se terminó después de 2,5 horas cuando la
adición de otra parte alícuota de reactivo a la reacción no cambió
la actividad de la proteasa. La solución (2,5 ml) se purificó en
una columna de desalación desechable (Pharmacia Biotech
PD-10®, Sephadex® G-25M). La
columna se equilibró con tampón (25 ml; MES 5 mM, CaCl_{2}, 2 mM,
pH 6,5) y la muestra se cargó en la parte superior. Se descartaron
los 2,5 ml iniciales recogidos. La proteína se eluyó con tampón de
MES (3,5 ml) y se recogió en tres fracciones. Todas las fracciones
aparecieron como una banda única cuando se comprobaron sobre gel
(SDS-PAGE, Pharmacia Phast-System®)
y no se pudieron diferenciar del mutante-Cys ni el
tipo nativo que se habían hecho actuar ambos como referencias. Las
tres fracciones se mezclaron y se dializaron frente a agua
desionizada (3 x 11) a 0°C seguidas por liofilización durante toda
la noche, lo que dio el mutante modificado (14,3 mg). La actividad
específica fue 64,3 U/mg en comparación con el mutante Cys
(47,1 U/mg).
(47,1 U/mg).
Se midió la actividad, incluyendo los parámetros
cinéticos k_{cat}, K_{M}, y k_{cat}/K_{M} con respecto a la
hidrólisis de
succinil-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida
de sustrato de péptido sintético usando el procedimiento descrito
en Bonneau, P. y col. (1991) J. Am. Chem. Soc.,
113(3):1030. En resumen, una pequeña parte alícuota de
solución madre de variante de subtilisina se añadió a una cubeta de
1 cm que contenía sustrato disuelto en tampón de fosfato sódico 0,1
M, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M y DMSO al 1%, y se colocó en un
termostato a 25°C o de modo similar a pH 8,6, tampón tris 0,1 M que
contiene Tween®80 al 0,05% y DMSO al 1%. El progreso de la reacción
se siguió espectrofotométricamente vigilando la absorbancia de la
p-nitroanilina del producto de reacción a 410 nm
usando un espectrofotómetro Perkin Elmer \lambda2
(\Delta\varepsilon_{410} 8800 M^{-1} cm^{-1}). Se
obtuvieron parámetros cinéticos midiendo las tasas iniciales a
concentraciones de sustrato de 0,25 mM-4,0 mM (ocho
concentraciones) y ajustando estos datos con la ecuación de
Michaelis-Menten.
La Tabla 1 muestra las abreviaturas para algunos
de los tiosulfonatos. La Tabla 2 muestra los parámetros cinéticos de
las subtilisinas de B. lentus (SBL) modificadas y la
subtilisina precursora (SBL-WT) a pH 7,5. Las
enzimas modificadas se prepararon según se describe anteriormente
por mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar el aminoácido de
interés con una cisteína. Los parámetros cinéticos se determinaron a
pH 7,5 según se describe anteriormente. La proteasa precursora fue
una subtilisina de Bacillus lentus
(SBL-WT).
\vskip1.000000\baselineskip
| Abreviatura | Estructura |
| -SBn | -SCH_{2}C_{6}H_{5} |
| -Siso-butil | -SCH_{2}CH(CH_{3})_{2} |
| -Sneo-pentil | -SCH_{2}C(CH_{3})_{3} |
| -SCH2ciclohexil | -SCH_{2}-c-C_{6}H_{11} |
| -Sdecil | -S-n-C_{10}H_{21} |
\newpage
Ejemplo anterior
4
Se pueden mostrar cambios en la especificidad
del sustrato, particularmente en la especificidad del sustrato
S_{1}, usando diversos ácidos borónicos como inhibidores
competitivos. Cuatro de los mutantes S156C modificados y tres de
los mutantes S166C modificados anteriormente descritos se evaluaron
usando inhibidores de ácido borónico. Los mutantes modificados
fueron S156C-SMe, S156C-SBn,
S156C-SCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-},
S156C-SCH_{2}CH_{2}NH_{3}^{+},
S156C-SCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-},
S166C-SCH_{2}CH_{2}NH_{3}^{+} y
S166C-SBn.
Se prepararon los ácido borónicos, y se midieron
sus constantes de inhibición a pH 8,6 (Waley (1982) Biochem.
J. 205:601-33), según se ha descrito previamente
en Seufer-Wasserthal y col. (1994) Bioorganic and
Medicinal Chemistry 2:35-48. Los resultados se
muestran en las Figuras 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la eficacia de lavado de varias de las
enzimas modificadas que se describen en los ejemplos previos
midiendo la eliminación de manchas de probetas de tela EMPA 116
(sangre/leche/negro de carbono sobre algodón) (Testfabrics, Inc.,
Middlesex, NJ 07030) que habían sido blanqueadas previamente de la
siguiente manera: en un vaso de vidrio de 4 litros se disolvieron
1,9 gramos de perborato tetrahidrato, 1,4 gramos de perborato
monohidrato y 1 gramo de TAED (tetraacetil etilen diamina) en 3
litros de agua desionizada a 60°C durante 1 minuto con agitación.
Se añadieron 36 probetas EMPA 116 y se agitaron durante 3 minutos.
Las probetas se enjuagaron inmediatamente con agua desionizada fría
durante 10 minutos. Las probetas se extendieron planas sobre
toallas de papel absorbente para que se secaran durante toda la
noche.
Cinco probetas de EMPA 116 blanqueadas
previamente se colocaron en cada uno de los vasos de un Tergotometer
Modelo 7243S (United States Testing Co., Inc., Hoboken, NJ) que
contenía 1000 ml de agua 51,3 mg/L de dureza
(Ca++:Mg++::3:1::ponderal), 0,67 g de detergente con blanqueador y
enzima según apropiado. El detergente base fue detergente WFK1 de
wfk-Testgewebe GmbH, Adlerstrasse 42, Postfach 13 07 62,
D-47759 Krefeld, Alemania.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A este detergente base se hicieron las
siguientes adiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Perborato sódico monohidrato y perborato sódico
tetrahidrato se obtuvieron de Degussa Corporation Ridgefield Park,
NJ 07660. TAED (tetraacetil etilen diamina) se obtuvo de Warwick
International, Limited, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE,
England.
Las probetas de EMPA 116 blanqueadas previamente
se lavaron en detergente con 0,1 ppm de enzima durante 20 minutos a
20°C y se enjuagaron posteriormente dos veces durante 5 minutos en
1000 ml de agua. Se secaron y se comprimieron las probetas, y se
midió la reflectancia de las probetas usando el valor L sobre la
escala de laboratorio de un Minolta Chroma Meter, Modelo
CR-200 (Minolta Corporation, Ramsey, NJ 07446). La
eficacia se expresa como porcentaje de eliminación de manchas y
porcentaje de eliminación de manchas relativo a proteasa de B.
lentus nativa. El porcentaje de eliminación de manchas se
calcula usando la ecuación:
\frac{\text{(valor L de probetas
lavadas) - (valor L de probetas sin lavar)}}{\text{(valor L de
probetas EMPA 221 sin manchar) - (valor L de probetas sin lavar)}}
X
100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar los efectos de la modificación
química sobre el perfil al pH de SBL, se hicieron siete mutantes de
N62C modificados según se ha descrito anteriormente. Se emplearon
tampones de etilen diamina 0,02 M de fuerza iónica 0,5 M (ajustada
con KCl) con sustrato de
succinil-AAPF-pNA 1,25 x 10^{-4} M
y se realizaron mediciones de k_{cat}/K_{M} según se describe
anteriormente. k_{cat}/K_{M} refleja el pKa de His64, parte de
la tríada catalítica para SBL, en la enzima libre y no está afectada
por los modos ligantes no productivos. Fersht, A.E. (1985)
Enzyme Structure and Mechanism 2 ed., Freeman (Nueva York).
Se calculó pKa usando Graphlt (McGeary & Associates, Middletown
CT). El desplazamiento en pKa refleja un desplazamiento en el perfil
al pH de SBL. En la Figura 3 se muestran perfiles al pH
representativos de SBL
N62C-Scylcohexil(N62C-Scy) y
SBL-WT ([E]=1x10^{-7} a 5x10^{-8} M a 25°C).
Los puntos se hicieron por duplicado.
La Tabla 4 muestra el pKa de His64, el cambio en
pKa de B. lentus tipo nativo (WT) y el k_{cat}/K_{M} para
siete mutantes de SBL N62C modificados.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Según se muestra en la Tabla 4, se observa una
disminución muy drástica de 0,5 unidades en el pKa de His64 para
SBL modificada de N62C-Scyclohexil en comparación
con el tipo nativo. Como tal, es posible ingeniar perfiles al pH
cambiados sin cambiar la carga superficial.
Aun cuando la invención ha sido descrita en
conexión con realizaciones específicas de la misma, se entenderá
que es susceptible de modificaciones adicionales y que esta
solicitud tiene la intención de cubrir cualquier variación o
adaptación de la invención que sigan, en general, los principios de
la invención y que incluyan derivaciones de la presente descripción
tales como las que vengan dentro de la práctica conocida o
acostumbrada dentro de la técnica a la que pertenece la invención y
que se puedan aplicar a las características esenciales establecidas
hasta ahora, y como se deduce en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Todas las publicaciones y patentes o solicitudes
mencionadas en la anterior memoria descriptiva se incorporan al
presente documento por referencia.
Claims (21)
1. Una proteasa de Bacillus subtilisina
modificada, en la que uno o más restos de aminoácido de asparagina
en el subsitio S_{2} de la proteasa son reemplazados por restos
cisteína, en la que los restos cisteína se modifican reemplazando
el hidrógeno del tiol con un grupo sustituyente que proporciona la
cadena lateral de tiol -SR^{1}R^{2}, en la que R^{1} es un
alquilo y R^{2} es un resto cargado o polar.
2. La proteasa modificada de la reivindicación
1, en la que R^{1} es alquilo C_{1-10}.
3. La proteasa modificada de la reivindicación
1, en la que R^{2} está cargado positivamente.
4. La proteasa modificada de la reivindicación
3, en la que R^{2} es NH_{3}^{+}.
5. La proteasa modificada de la reivindicación
1, en la que R^{2} está cargado negativamente.
6. La proteasa modificada de la reivindicación
5, en la que R^{2} es SO_{3}^{-}.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la proteasa es una subtilisina de Bacillus lentus.
8. La proteasa modificada de la reivindicación
7, en la que la asparagina está en la posición 62.
9. La proteasa modificada de la reivindicación
1, en la que la proteasa es una subtilisina de Bacillus
lentus, el aminoácido es N62 y la cadena lateral de tiol es
-SR^{1}R^{2} en la que R^{1} es un CH_{2}CH_{2} y R^{2}
es SO_{3}^{-}.
10. Un procedimiento para producir una proteasa
modificada que comprende:
- (a)
- proporcionar una proteasa en la que uno o más aminoácidos de asparagina en el subsitio S_{2} de la proteasa han sido reemplazados con cisteína; y
- (b)
- reemplazar el hidrógeno de tiol con un grupo sustituyente que proporciona la cadena lateral de tiol -SR^{1}R^{2}, en la que R^{1} es un alquilo y R^{2} es un resto cargado o polar.
11. El procedimiento de la reivindicación 10,
en el que R^{1} es alquilo C_{1-10}.
12. El procedimiento de la reivindicación 10,
en el que R^{2} está cargado positivamente.
13. El procedimiento de la reivindicación 12,
en el que R^{2} es NH_{3}^{+}.
14. El procedimiento de la reivindicación 10,
en el que R^{2} está cargado negativamente.
15. El procedimiento de la reivindicación 14,
en el que R^{2} es SO_{3}^{-}.
16. El procedimiento de la reivindicación 10,
en el que la proteasa es una subtilisina de Bacillus
lentus.
17. El procedimiento de la reivindicación 16,
en el que el aminoácido reemplazado con una cisteína es una
asparagina que está en la posición 62.
18. El procedimiento de la reivindicación 17,
en el que la proteasa es una subtilisina de Bacillus lentus,
el aminoácido es N62 y la cadena lateral de tiol es -SR^{1}R^{2}
en la que R^{1} es CH_{2}CH_{2} y R^{2} es
SO_{3}^{-}.
19. Un aditivo de detergentes que comprende la
proteasa modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9.
20. Un aditivo de alimentos que comprende la
proteasa modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9.
21. Una composición para el tratamiento de un
material textil que comprende la proteasa modificada de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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