CN102791728A - 抗体的选择性富集 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，其包括以下步骤：e.制备含有标靶蛋白的溶液；f.在允许发生结合的条件下引入精确具有两个结合位点的Fc结合蛋白；g.自液相分离沉淀物；h.解除标靶蛋白与Fc结合蛋白的结合。

Description

抗体的选择性富集
发明背景
技术领域
本发明涉及蛋白、尤其是免疫球蛋白或具有Fc域的其他蛋白的纯化方法。
现有技术
生物分子(例如蛋白、聚核苷酸、多糖等)在作为药物、诊断剂、食品添加剂、清洁剂等、研究试剂方面及对于许多其他应用而言具有日益增加的商业重要性。通过自天然来源分离分子(例如在蛋白的情况下)通常不再能够满足对所述生物分子的需要，而需要使用生物技术制备方法。
蛋白的生物技术制备通常始于将DNA片段克隆至适合的表达载体中。将表达载体转染至适合的原核或真核表达细胞中且随后选择经转染的细胞后，在生物反应器中培养所述经转染的细胞且表达所要蛋白。接着收集细胞或培养物上清液，且处理并纯化其中所含的蛋白。
在真核表达系统的情况下，即当使用哺乳动物细胞培养物(例如CHO或NSO细胞)时，在过去15年中细胞培养物或细胞培养上清液中所要蛋白的浓度显著增加，此可在表达步骤中达成。相比之下，在相同时期，在蛋白的后续纯化中所用的色谱材料的结合能力仅略微增加。为此，迫切需要生物分子、尤其是蛋白的经改良且最佳化的纯化方法，所述方法可在大工业规模上进行。
在生物药物(例如用作药物的蛋白，例如治疗性抗体)的情况下，除产物产率以外，分离杂质亦至关重要。方法依赖性杂质与产物依赖性杂质之间可加以区分。方法依赖性杂质含有宿主细胞的组分，例如蛋白(宿主细胞蛋白，HCP)及核酸，且源于细胞培养(例如培养基的组分)或处理(例如盐或溶解的色谱配位体)。产物依赖性杂质为具有不同特性的产物分子变异体。这些变异体包括截短形式(例如前体及水解分解产物)，以及例如通过脱除氨基、不正确糖基化或误连接二硫桥产生的经修饰形式。产物依赖性变异体亦包括聚合物及聚集物。其他杂质为污染物。此术语涵盖具有化学、生物化学或微生物学性质且不直接属于制备方法的所有其他物质。污染物的实施例包括可能以不需要的方式存在于细胞培养物中的病毒。
在生物药物的情况下，杂质产生安全性问题。若通过注射或输注将治疗性蛋白直接给予血流中，如生物药物中极常发生，则这些问题加剧。因此，宿主细胞组分可能引起过敏反应或免疫病理学影响。此外，杂质亦可能导致所给予的蛋白产生不需要的免疫原性，即其可能在患者体内引发不需要的对治疗剂的免疫反应，从而可能造成危及生命的过敏性休克。因此，需要适合的纯化方法，借助于所述方法可使所有非所需的物质降至无害程度。
另一方面，即使在生物药物的情况下，仍不能忽视经济考虑因素。因此，所用制备及纯化方法不应损害由此制备的生物医药产品的经济生存力。
作为蛋白的处理及加工步骤，(柱)色谱方法以及过滤及沉淀方法至关重要。因此，浓缩抗体的确切操作包括通过亲和色谱纯化的步骤。目前已知许多柱色谱方法及可用于这些方法的色谱材料。
亲和色谱基质在工业纯化各种物质中用作固定相。经固定的配位体可用于特定浓缩及纯化对于所用特定配位体具有特定亲和力的物质。对于抗体(免疫球蛋白)的工业纯化，尤其是单克隆抗体的纯化，经固定的蛋白A常常用于初始纯化步骤。蛋白A为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的约41kDa的蛋白，其以高亲和力(10-8M-10-12M人类IgG)结合于免疫球蛋白Fc区的CH2/CH3域。在蛋白A色谱中，移动相中具有蛋白A结合Fc区的免疫球蛋白或融合蛋白特异性结合于共价偶合至载体(例如琼脂糖(Sepharose))的蛋白A配位体。金黄色葡萄球菌的蛋白A(野生型蛋白A)及经遗传修饰的重组蛋白A经非共价相互作用而与抗体的恒定区(Fc片段)相互作用。此特异性相互作用可用于有效分离杂质与抗体。通过改变pH，可刻意终止抗体与蛋白A配位体之间的相互作用且自固定相释放或洗脱抗体。
除蛋白A作为亲和配位体以外，目前已知许多结合于Fc片段的其他分子。因此，使用蛋白A的个别域替代完整蛋白(8)。已知与蛋白A的B域确切不同的蛋白变异体，其适合结合含Fc片段的分子(16,17)。这些不同变异体基本上不同在于突变，所述突变已插入以提高稳定性或结合亲和力。这些B域的突变体通常称作Z域或蛋白Z。除蛋白A或蛋白G以外，多种肽亦适合选择性结合于Fc片段(14)。现今对Fc片段的亲和配位体的极大关注使得吾人推测会发现更多亲和配位体。
然而，亲和色谱及尤其是经常使用的蛋白A色谱花费高，且确切而言，当发酵槽中产物浓度增加且有大量产物时，可进行的色谱纯化方法有所限制。关键点为：装载量、循环数、处理时间、池体积及缓冲液的量。因此，将来需要替代性纯化方法。包括亲和色谱及亲和色谱的替代方法的常规纯化策略的一般概述可见于以下文章中(7，10)。
新近亲和色谱方法不使用恒定固定的亲和配位体，而是始于与标靶蛋白混合的溶解亲和配位体(11)。该亲和配位体带有融合标记或融合蛋白，可能使该亲和配位体固定于固相上，该固定发生于第二步骤中。在下一步骤中，如在常规亲和色谱中，标靶蛋白与配位体在适合条件下分离且因此自柱洗脱。
在此所述的本发明使用亲和沉淀替代亲和色谱来纯化生物分子。此方法在较大规模使用时确实显示具有极大潜力(1,2)。
亲和沉淀为最有效的蛋白沉淀方法(2)。蛋白自溶液中沉淀一般为经常使用的熟知方法。因此，许多蛋白已通过蛋白混合物进行硫酸铵沉淀而自溶液中分离。在此沉淀期间，大分子(例如蛋白)自溶液移出且转化为粒子。视粒子与溶液之间的密度差异及粒子直径而定，此步骤导致沉淀。然而，此沉淀通常非特异地发生。
因此，为更选择性地浓缩分子(例如蛋白)，开发出亲和沉淀。亲和沉淀是利用亲和分子与标靶分子的选择性结合。亲和分子可为例如蛋白、肽、寡核苷酸或小化学分子。亲和沉淀在两种原理之间有所区别，这两种原理为第一级亲和沉淀及第二级亲和沉淀(7)。在第一级亲和沉淀中，亲和分子与标靶分子均具有两个结合位点，使得两个分子之间有可能形成网络，且形成在特定尺寸下沉降的亲和复合物。在第二级亲和沉淀中，使用例如亲和巨型配位体(AML)。在此类型的沉淀中，亲和分子结合于可刺激性物质(通常为聚合物)。可刺激性物质因环境条件改变(例如pH值或温度变化)而改变其溶解特征，且发生沉淀。不同于第一级亲和沉淀，不需要双官能亲和分子或双官能标靶分子。
在普遍使用的亲和沉淀中，目前亲和配位体偶合至聚合物或其他介质(15)。
含Fc片段的分子的亲和沉淀已描述于许多研究中。目前最常见应用的特征为使用所谓的“智慧型聚合物(smart polymer)”。“智慧型聚合物”(或刺激反应性“智能”聚合物或亲和巨型配位体)为可对外部影响(物理或化学刺激)作出反应而改变特性的聚合物。这些刺激可为例如pH值或温度变化(12-13)。通常，智慧型聚合物对其刺激作出反应而在溶液中沉淀。在上清溶液进行所要分离之后，通过适合条件可使此沉淀逆转。智慧型聚合物可与多种生物分子结合，从而使得可用于各种应用的聚合物/生物分子系统大量积聚。这些生物分子的实施例包括蛋白、寡核苷酸及糖。
另一形式的亲和沉淀为最近公开的“亲和浸没(affinity sinking)”方法。在此形式的亲和沉淀中，使用连接分子骨架使许多亲和配位体彼此结合。此继而使得有可能形成沉淀所需的网络。亲和配位体与网络形成物的结合可以以非共价方式与共价方式进行。此方法最近描述于专利“Compositions andmethods for purifying and crystallizing molecules of interest”中(6)。在此方法中，首先将含有抗体的溶液与共价结合于交联剂的亲和配位体混合。未观察到沉淀。仅在随后添加配位离子或分子之后，方产生沉淀。在第二种类似应用中，亲和配位体连接于生物素结合蛋白，该生物素结合蛋白与介质抗生物素蛋白形成网络(9)。
美国专利7,083,943描述如下亲和沉淀：其中标靶蛋白的结合域连接于骨架域，该骨架域的氨基酸序列预期可有助于发生沉淀的趋势。
Chen及Hoffman(15)描述IgG与聚(N-异丙基丙烯酰胺)-蛋白A结合物的亲和沉淀。然而，抗体与未经修饰的蛋白A的沉淀尚未证实有效。
现有技术中所述的方法的一个缺陷为，在第一级亲和沉淀期间，沉淀仅可能经由交联分子达成；或在第二级亲和沉淀中，需要可刺激性物质。最为熟知的亲和沉淀的其他缺陷一方面为a)位阻，其中标靶蛋白的结合受高分子亲和巨型配位体的结合的限制；b)已沉淀的聚合物复合物的再溶解较缓慢；c)杂质的非特异性共沉淀，此一般需要第二沉淀步骤；d)使亲和蛋白与聚合物或与交联剂结合的额外步骤(2-5)。
发明内容
本发明涉及利用具有两个结合位点的结合蛋白的亲和沉淀，其完全不需要额外的融合蛋白或连接分子。亲和蛋白本身足以用于沉淀，且不需要固定相。在此所用的发明内容亦可较容易地回收亲和蛋白。
本发明尤其涉及一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，其包括以下步骤：
a.制备含有标靶蛋白的溶液；
b.在允许发生结合的条件下引入确切具有两个结合位点的Fc结合蛋白；
c.自液相分离沉淀物；
d.解除标靶蛋白与Fc结合蛋白的结合。
在另一方面中，本发明涉及一种方法，其中Fc结合蛋白为蛋白A或蛋白G的Fc结合域的二聚体。优选地，该二聚体的两个单体经由二硫桥彼此连接。
在另一方面中，本发明涉及一种方法，其中二聚体为均二聚体，其单体具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或与SEQID NO:1的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列。
在另一方面中，所用Fc结合蛋白相对于标靶蛋白的比率为0.5-20。步骤a.中溶液的pH值优选为5.5-8。优选地，步骤d.中的结合解除在2-4.5的pH值进行。
在另一方面中，本发明涉及一种由2个相同亚单元组成的Fc结合蛋白，所述亚单元具有序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:7或与SEQ ID NO:1的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列，该两个亚单元经由共价键彼此连接。优选地，该共价键为二硫键。
附图说明
图1：Z二聚体的SDS-PAGE。为显示经由半胱氨酸达成的二聚，在施用于SDS-PAGE之前添加碘乙酰胺或碘乙酰胺与二硫苏糖醇
  迹线   样品
  1   与0.6μmol碘乙酰胺混合的重组Z-二聚体
  2   与0.3μmol DTT及碘乙酰胺混合的重组Z-二聚体
  3   纯的重组Z-二聚体
  4   科姆比标记物(Kombi marker)
  5   与0.2μmol碘乙酰胺混合的重组Z-二聚体
  6   与0.1μmol DTT及0.2μmol碘乙酰胺混合的重组Z-二聚体
  7   纯的重组Z-二聚体
图2：使用Z-二聚体进行的亲和沉淀。作为第一步骤，使蛋白Z氧化。在第二步骤中，向含有抗体(mAB)的溶液中添加Z-二聚体，这使得抗体选择性沉淀；
图3：在酸性条件下分离Z二聚体与抗体的离子交换色谱的UV图(实验2)。220nm下的UV色谱图以红色显示，280nm下的UV色谱图以蓝色显示，且缓冲液B(20mM磷酸盐，3M NaCl)的递增含量以绿色显示；
图4：实验2的SDS-PAGE
  迹线   样品
  1   经纯化的抗体
  2   蛋白Z二聚体
  3   沉淀后的上清液
  4   任选的洗涤步骤之后的上清液
  5   再悬浮的沉淀块(pellet)(抗体与Z-二聚体)
  6   酸性pH值下的离子交换色谱的峰1(抗体)
  7   酸性pH值下的酸性离子交换色谱的峰2(Z-二聚体)
  8   科姆比标记物
发明详述
本发明涉及自一定种类的蛋白组合物中去除杂质、尤其是宿主细胞蛋白(HCP)及DNA的方法，所述蛋白组合物自重组或内源表达蛋白的细胞培养物获得。具体而言，本发明涉及通过结合具有至少两个结合位点的Fc结合蛋白或其多聚体而纯化或浓缩蛋白(标靶蛋白)的方法。在其他步骤中，分离出沉淀物，接着使用合适的条件解除Fc结合蛋白与标靶蛋白的结合。
本发明涉及一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，其包括以下步骤：
a.制备含有标靶蛋白的溶液；
b.在允许发生结合的条件下引入确切具有两个结合位点的Fc结合蛋白；
c.自液相分离沉淀物；
d.解除标靶蛋白与Fc结合蛋白的结合。
具体而言，标靶蛋白可为免疫球蛋白或含有免疫球蛋白Fc域的蛋白，且可结合于蛋白A或蛋白A的片段。免疫球蛋白由两条重链及两条轻链组成。视免疫球蛋白而定，重链各具有一个可变域及三至四个恒定域。这些域类似地称作VH及CH1、CH2、CH3。轻链及重链的可变域形成抗原结合位点。CH2域含有形成补体系统结合位点的碳水化合物链。CH3域含有Fc受体结合位点。可应用于本发明方法的标靶蛋白为所有具有Fc域的蛋白。含有CH2/CH3区的蛋白的实施例为抗体、免疫粘合素及融合蛋白，其中相关蛋白连接于CH2/CH3区。在本发明的一个实施方案中，标靶蛋白为例如具有CH2/CH3区且因此能够结合于蛋白A的抗体。术语CH2/CH3区是指抗体Fc区中与蛋白A相互作用的氨基酸。
根据本发明，Fc结合蛋白确切包含一个Fc域的两个结合位点。
在另一方面中，本发明涉及一种方法，其中Fc结合蛋白为蛋白A或蛋白G的Fc结合域的二聚体。该二聚体的两个单体优选由二硫桥连接在一起。
Fc结合蛋白是指能够结合于Fc区的蛋白或肽。优选地，Fc结合蛋白以10-2-10-13M范围内的解离常数(KD值)结合。
在本发明的优选实施方案中，Fc结合蛋白为Fc结合域的均二聚体或杂二聚体，所述Fc结合域包含或含有表1中所列的序列：
Figure BDA00002094909900071
Figure BDA00002094909900081
在上下文中，均二聚体是指由两个具有相同序列的亚单元构成的Fc结合蛋白。
在上下文中，杂二聚体是指由两个具有不同序列的亚单元构成的Fc结合蛋白，各亚单元具有Fc域的结合位点。亚单元优选含有选自表1中的序列的序列。
在另一方面中，本发明涉及一种方法，其中二聚体为均二聚体，其单体具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7或与SEQID NO:1的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列。与SEQ ID NO:1的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的单体的特性为以10-2-10-13M范围内的KD值结合Fc域。KD值的测定方法为本领域技术人员所知。
结合条件为如下条件：其中Fc结合蛋白与标靶蛋白的结合优选在pH5.5-9、优选pH 6-8的pH值范围内发生。
沉淀在结合条件下自发发生，例如，在例如无细胞真核培养物上清液中所发现的情况。不需要使本发明的二聚体连接于聚合物(例如聚乙二醇)以促进与聚合物一起沉淀。
在另一方面中，所用Fc结合蛋白相对于标靶蛋白的摩尔比为0.5-20。
分离沉淀物可通过离心及随后移除上清液来进行，但亦可通过过滤技术进行。
解除与标靶蛋白的结合在能够使Fc结合蛋白与标靶蛋白分离的条件下进行。其可优选通过调整pH值至pH 2至4.5的范围来进行。
在另一方面中，本发明涉及一种由2个相同亚单元组成的Fc结合蛋白，所述亚单元具有序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:7或与SEQ ID NO:1的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列，其中该两个亚单元由共价键连接在一起。共价键优选为二硫键。
实施例
设备与方法：
制备二聚蛋白Z
自大肠杆菌获得重组蛋白形式的蛋白Z。通过离子交换色谱分离细胞碎片之后移除杂质。
使用的Z域的蛋白序列：
Met-Val-Asp-Asn-Lys-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-Leu-His-Leu-Pro-Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe-Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln-Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ala-Glu-Ala-Lys-Lys-Leu-Asn-Asp-Ala-Gln-Ala-Pro-Lys-Ser-Ser-Ala-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro
通过将非原生半胱氨酸插入Z域的肽链中，有可能经由二硫桥有意连接两个蛋白Z分子。纯化重组蛋白Z之后，即刻通过氧化获得二聚蛋白形式的重组蛋白Z。
无细胞真核培养物上清液
培养数天之后，通过过滤或离心获得经最佳化以进行分泌性制备的CHO细胞的细胞培养物上清液。
SEC分析
通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)对实验1的样品进行蛋白杂质及抗体含量分析。将TSK-GEL SW 3000与制造商(TOSOH Bioscience)推荐的柱(precolumn)一起使用。在Dionex Ultimate装置上进行分析，于280及220nm下监视UV信号。
分离Z-二聚体与抗体的离子交换色谱
在
Figure BDA00002094909900101
Explorer 10装置(GE Healthcare)上进行离子交换色谱，于220及280nm下观察UV吸收。所用柱材料为SP Sepharose FF(19mL凝胶床体积)。施用在酸性pH值下再悬浮的沉淀块之后，用20mM磷酸盐缓冲液(pH 3.3)平衡柱，接着使抗体与Z-二聚体经25个柱体积的长梯度彼此分离。使用含3M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH 3.3)进行洗脱。
蛋白A HPLC
在Waters或Dionex设备(注射泵及柱温箱W2790/5，UV检测器W2489)上使用蛋白A HPLC测定无细胞培养物上清液及经纯化抗体的抗体含量。使用酸性洗脱峰的UV信号测定溶液的抗体含量。
浓缩
将试验中获得的溶液部分地浓缩以供分析方法(Amicon Ultra，排阻尺寸3kD)所用。
SDS-PAGE：
使用20%均质SDS凝胶来测试个别洗脱份及上清液。通过根据Heukeshoven的银染色法来检测蛋白色带。
通过ELISA测试分析宿主细胞蛋白
在实验3中，使用ELISA测试进行宿主细胞蛋白分析。
DNA分析
产生单股之后，通过酶催化的检测反应进行DNA分析。
UF/DF
在实验3中使用Messrs Pall制造的表面积为180cm2的50kDa CentramateSheet PES(聚醚砜)进行UF/DF测试。进行UF/DF，以将抗体初始浓缩六倍，接着透析过滤(换成6体积的缓冲液)，随后在完全打开滞留阀(retentate valve)下循环10分钟。重复透析过滤两次。整个UF/DF用50mM乙酸盐缓冲液+100mM精氨酸+150mM NaCl(pH 3.0)进行。
疏水相互作用色谱(HIC)
在装置上用27mL柱进行疏水相互作用色谱(实验3)。所用柱材料为Tosoh制造的Toyopearl Phenyl 650M。为此目的，进行UF/DF之后，向滞留物中添加3.5M硫酸铵缓冲液直至获得165mS/cm的电导率。向经缓冲液(50mM乙酸盐+1.2M硫酸铵，pH 4)平衡的柱中加入来自UF/DF的滞留物，接着经40个床体积使梯度达到50mM乙酸盐缓冲液(pH 4)。
实验：
检测经半胱氨酸达成的蛋白Z二聚
通过SDS-PAGE分析来检测经半胱氨酸达成的蛋白Z二聚(图1)。为确保处理不会诱导蛋白Z发生任何氧化，首先用碘乙酰胺使游离半胱氨酸基团烷基化。为了检测单体，另外用二硫苏糖醇(DTT)进行还原。将2.6nmol Z-二聚体与DTT或相应体积的缓冲液混合，且在95℃下培育5分钟。接着冷却混合物至环境温度，且添加碘乙酰胺或相应体积的缓冲液，且在黑暗中再培育混合物20分钟。与SDS-PAGE缓冲液一起培育5分钟之后，将该制剂施用于SDS-PAGE。
SDS-PAGE分析显示，通过添加还原剂DTT形成Z单体且Z二聚体的凝胶色带消失。
使用Z-二聚体进行选择性沉淀
下文所述的测试显示，抗体的选择性沉淀可用Z-二聚体达成(图2，实验1)。Z-二聚体为来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的二聚B域，该二聚B域经由两个非原生半胱氨酸连接，所述非原生半胱氨酸相比于野生型带有突变(参看设备与方法)。此外，实验2显示，所得沉淀块可通过于酸性pH值范围内再悬浮而返回溶液中，接着可通过在酸性pH值下进行离子交换色谱自Z-二聚体再次移除抗体。
实验1：
测试无细胞真核培养物上清液中所存在的不同比率的蛋白Z与抗体。此外，个别批次的体积存在变化。在测试1中，于振荡下将0.13μmol Z-二聚体与含于无细胞真核培养物上清液中的0.065μmol IgG4一起培育2小时，总体积为5.47mL。在测试2中，于振荡下将16.25nmol Z-二聚体与含于无细胞真核培养物上清液中的16.25nmol IgG1一起再培育2小时，总体积为5.2mL。接着以4000rpm离心混合物10分钟，且使上清液与沉淀块分离。借助于分析型SEC的UV信号且通过蛋白A色谱(设备与方法)测定上清液的抗体含量。通过用所用抗体的总含量减去上清液的抗体含量来测定沉淀块中抗体的含量。观察到多达99%的抗体沉淀(测试1：99%/测试2：76%)。此外，在沉淀之前及之后通过分析型SEC检查培养物上清液的蛋白杂质。将无细胞真核培养物上清液的色谱图与沉淀后的上清液直接比较。观察到去除90-99%范围内的蛋白杂质(测试190%/测试299%)。这意味着1%或10%的蛋白杂质已发生共沉淀。此处蛋白杂质既可为宿主细胞蛋白又可为标靶蛋白的片段或聚集物。
实验2：
使用阳离子交换剂(SP Sepharose FF)来分离Z-二聚体与抗体。将0.2μmol经纯化的抗体与0.2μmol Z-二聚体一起培育36分钟，体积为10.1mL。随后离心(4000rpm，10分钟)之后，移除上清液。接着将沉淀块分批溶解于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，且再次离心(4000rpm，10分钟)。将由此获得的沉淀块再悬浮于20mL磷酸盐缓冲液(20mM磷酸盐，pH 3.3)中，且使用离子交换剂纯化。可经由经25个床体积的梯度分离Z-二聚体与抗体(图3和图4)。
实验3：
进行多步抗体纯化方法，其中使用亲和沉淀作为捕获步骤。
自无细胞培养物上清液沉淀时，使用500mg抗体(3.3μmol)，其与Z-二聚体(6.6μmol)的比率为1:2。在缓缓搅拌下培育1小时之后，将整个悬浮液添加至0.22μm过滤器(Millipore)中，且以此方式通过过滤分离沉淀物的上清液。接着用缓冲液(231mL 50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)洗涤沉淀物，且在下一步骤中再悬浮于含乙酸盐缓冲液(179mL 50mM乙酸盐缓冲液+100mM精氨酸+150mM NaCl，pH 3.0)的过滤器中。为分离Z-二聚体与抗体，用50kDa膜进行UF/DF。在下一步骤中进行HIC以分开Z-二聚体及其他杂质。
沉淀之后抗体的总产率为98%，UF/DF之后降至87%，且HIC之后降至64%。除使用抗体的选择性沉淀获得良好产率以外，DNA及宿主细胞蛋白分析显示，相比于初始值(无细胞培养物上清液)，可通过沉淀步骤、继之以UF/DF使DNA减少99%，且宿主细胞蛋白含量可减少99.9%。
文献
1)Labrou N,Clonis YD.(1994)J Biotechnol.36(2),95-119.
2)Hilbrig F，Freitag R.(2003)J Chromatogr B Analyt Technol Biomed LifeSci.790(1-2),79-90.
3)Mattiasson B,Kumar A,Galaev IYu.(1998)J Mol Recognit.11(1-6),211-6.
4)Vaidya AA,Lele BS,Kulkarni MG,Mashelkar RA.(1999)BiotechnolBioeng.64(4),418-25.
5)Garret-Flaudy F，Freitag R.(2000-2001)Biotechnol Bioeng.71(3),223-34.
6)US 2006/0121519 A1“Compositions and Methods for purifying andcrystallizing molecules of interest”
7)H.Chmiel,Bioprozesstechnik,Spektrum Akademischer Verlag,2ndedition 2006
8)EP1179014B1
9)Patchornik,G.和Albeck A.(2005),Bioconjugate Chem.16,1310-1315.
10)Wilchek,M.和Gorecki,M.(1973),FEBS Letters.31,1,149-152.
11)WO2009062942 KYHSE-ANDERSEN JAN[DK]“DUAL AFFINITYPOLYPEPTIDES FOR PURIFICATION”
12)Hoffman,Controlled release(1987)6,297-305.
13)Hoffmann(1997)Intelligent polymers.In:Park K,ed.Controlled drugdelivery.Washington:ACS Publications 485-98.
14)Haiou Yang,Patrick V.Gurgel和Ruben G.Carbonell(2009)Journal ofChromatography A 1216,910-918.
15)Chen和Hoffman(1990),Biomaterials 11(9),631-634.
16)Nilsson等人，1987.B.Nilsson,T.Moks,B.Jansson,L.Abrahmsen,A.Elmblad,E.Holmgren,C.Henrichson,T.A.Jones and M.Uhlén,A syntheticIgG-binding domain based on staphylococcal protein A.protein Eng.1(1987),pp.107-113
17)Tashiro,M.,Tejero,R.,Zimmerman,D.E.,Celda,B.,Nilsson,B.,和Montelione,G.T.1997.High-resolution solution NMR structure of the Z domainof staphylococcal protein A.J.Mol.Biol.272:573-590.
Figure IDA00002094910400021
Figure IDA00002094910400031
Figure IDA00002094910400041

Claims (10)

1.一种选择性浓缩免疫球蛋白或含有Fc域的其他蛋白(标靶蛋白)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.制备含有该标靶蛋白的溶液；
b.在允许发生结合的条件下引入确切具有两个结合位点的Fc结合蛋白；
c.自液相分离沉淀物；
d.解除该标靶蛋白与该Fc结合蛋白的结合。
2.权利要求1的方法，其特征在于该Fc结合蛋白为蛋白A或蛋白G的Fc结合域的二聚体。
3.权利要求2的方法，其特征在于该Fc结合域包含或含有序列SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:11之一。
4.权利要求2或3的方法，其特征在于该二聚体的两个单体由二硫桥连接在一起。
5.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于该二聚体为均二聚体，其单体具有序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:1不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列。
6.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于使用该Fc结合蛋白相对于该标靶蛋白的摩尔比为0.5-20。
7.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤a.中该溶液的pH为5.5-9，优选为6-8。
8.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤d.中的结合解除在2-4.5的pH发生。
9.一种Fc结合蛋白，其由2个相同亚单元组成，所述亚单元具有序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:1不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的序列，其中该两个亚单元经由共价键连接在一起。
10.权利要求9的Fc结合蛋白，其特征在于该共价键为二硫键。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106084062A (zh) * 2015-04-28 2016-11-09 烟台荣昌生物工程有限公司 桥连的双特异性融合蛋白

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
EP3455243B1 (en) 2016-05-11 2021-03-24 Cytiva BioProcess R&D AB Separation matrix
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
CN109311948B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 清洁和/或消毒分离基质的方法
WO2017194592A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of storing a separation matrix
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
ES2914278T3 (es) * 2016-05-11 2022-06-08 Cytiva Bioprocess R & D Ab Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
EP3604341A4 (en) * 2017-03-31 2020-12-09 Kaneka Corporation AFFINITY DISSOCIATION MATRIX FOR IMMUNOLOGICAL PURIFICATION PURPOSES
WO2020018732A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 Ab Studio Inc. Novel systems for screening internalizing antibody and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070072307A1 (en) * 2005-06-17 2007-03-29 Ranganathan Godavarti Methods of purifying Fc region containing proteins
EP2157099A1 (en) * 2008-08-11 2010-02-24 Millipore Corporation Novel immunoglobulin-binding proteins with improved specificity

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0560807A1 (en) * 1990-11-26 1993-09-22 The Public Health Laboratory Service Board Immunoglobulin-binding proteins and recombinant dna molecules coding therefor
JP2584697B2 (ja) * 1991-08-23 1997-02-26 オリエンタル酵母工業株式会社 ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ
WO1995006125A1 (en) * 1993-08-23 1995-03-02 Applied Immune Sciences, Inc. CHIMERIC RECEPTOR CONTAINING ONE IgG BINDING DOMAIN OF BOTH PROTEIN A AND PROTEIN G
US6949244B1 (en) 1995-12-20 2005-09-27 The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Murine monoclonal anti-idiotype antibody 11D10 and methods of use thereof
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
US20040077017A1 (en) * 2001-01-12 2004-04-22 Amelie Karlstrom Detection methods
US7709209B2 (en) * 2002-03-25 2010-05-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein ligands
WO2004072258A2 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 University Of Washington Stimuli-responsive polymer conjugates and related methods
IL157086A0 (en) 2003-07-24 2004-02-08 Guy Patchornik Multivalent ligand complexes
CA2586803C (en) 2004-12-14 2012-12-11 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
CN101287503A (zh) * 2005-08-03 2008-10-15 Rq生物科技有限公司 用于诊断IgA和IgM介导的肾脏疾病的方法和组合物
JP4481260B2 (ja) * 2006-03-16 2010-06-16 株式会社カネカ 抗体結合性ペプチド
EP2066419B1 (en) 2006-09-29 2015-11-11 GE Healthcare Bio-Sciences AB Chromatography ligand comprising domain c from staphyloccocus aureus protein a for antibody isolation
CA2671264C (en) * 2006-11-30 2015-11-24 Research Development Foundation Improved immunoglobulin libraries
EP2099932A4 (en) 2006-12-06 2009-11-18 Repligen Corp NUCLEIC ACIDS ENCODING THE RECOMBINANT PROTEIN A
SI2220107T1 (sl) 2007-11-12 2017-02-28 Chreto Aps Polipeptidi z dvojno afiniteto za čiščenje
JP2012515160A (ja) * 2009-01-12 2012-07-05 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070072307A1 (en) * 2005-06-17 2007-03-29 Ranganathan Godavarti Methods of purifying Fc region containing proteins
EP2157099A1 (en) * 2008-08-11 2010-02-24 Millipore Corporation Novel immunoglobulin-binding proteins with improved specificity

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JING PING CHEN ET AL: "Polymer-protein conjugatesII. Affinity precipitation separation of human immunogammaglobulin by a poly(N-isopropylacrylamide)-protein A conjugate", 《BIOMATERIALS》 *
NILSSON B ET AL: "A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A", 《PROTEIN ENGINEERING》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106084062A (zh) * 2015-04-28 2016-11-09 烟台荣昌生物工程有限公司 桥连的双特异性融合蛋白
CN106084062B (zh) * 2015-04-28 2021-04-02 荣昌生物制药（烟台）有限公司 桥连的双特异性融合蛋白

Also Published As

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EP2542567A2 (de) 2013-01-09
US10894806B2 (en) 2021-01-19
US20120071637A1 (en) 2012-03-22
AU2011222991A1 (en) 2012-09-20
KR101855714B1 (ko) 2018-05-10

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