CN104245728B - 用于富集iga的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含有IgA的材料富集IgA(和IgM)的方法。具体地，它涉及阴离子交换剂的连续洗脱方法，其导致单体和二聚体IgA的有利富集和分离。

Description

用于富集IGA的方法
本发明涉及从含有IgA的材料富集IgA(和IgM)的方法。具体地，它涉及阴离子交换剂(anion exchanger)的连续洗脱方法，其导致单体和二聚体IgA的有利富集和分离。
背景技术
众所周知，免疫球蛋白在对抗感染的哺乳动物免疫系统中起重要作用。免疫球蛋白(Ig)是由B-淋巴细胞合成的特异性免疫蛋白，其存在于所有脊椎动物的血浆、淋巴和其它身体分泌物中。免疫球蛋白占人类的血浆蛋白的大约20％。
独立于它们的特异性，所有免疫球蛋白具有含4个多肽链的共同结构：2个相同的重(H)链，每个重链携带共价连接的寡糖基团，和2个相同的、通常未糖基化的轻(L)链；所述链通过二硫键共价地连接。所有4个多肽链含有恒定(C)区和可变(V)区，分别存在于羧基端和氨基端。重链和轻链具有单个V区，而轻链具有单个C区且重链含有3个C区。重链和轻链的V区组合以形成2个相同的抗原结合位点(即抗体的与抗原结合的部分)。在免疫球蛋白的Fc区内的结构决定簇介导效应子功能诸如胎盘运输或抗原依赖性的细胞毒性。
根据它们的H链组分，将免疫球蛋白分成5个具有不同生化和生理学性能的大类：IgG(γ重链)、IgA(α)、IgM(μ)、IgD(δ)和IgE(ε)。存在2类轻链：κ和λ。各个分子可能含有κ或λ链，但是不会含有二者。在人类中，含有κ或λ轻链的免疫球蛋白的比率为约60:40。
由于可用性和应用范围，3类免疫球蛋白IgG、IgA和IgM比其它免疫球蛋白更重要。人IgG代表在血浆中最丰富的免疫球蛋白，而IgA代表在外分泌物(诸如唾液、泪液以及呼吸道和肠道的粘液)中的主要抗体类别。IgA形成对抗细菌性和病毒性病原体的一线防御之一。IgM是在人循环系统中物理上最大的抗体，在感染过程中的早期出现，且经常在进一步暴露以后在更低的程度上再现。
纯的单体形式的IgA由2个轻(L)链和2个重(H)链组成；在真实的二聚体形式中，2个这样的单体通过所谓的J链(连接链)而偶联。在血浆中，IgA单体与非共价地结合的IgA二聚体平衡地存在；但是，也存在含有J链的IgA二聚体。总二聚体IgA(即含有J链的真实二聚体和非共价地结合的IgA二聚体)占总IgA的大约10-25％。在粘膜和腺体的分泌物中，具有额外分泌组分(SC)的含有J-链的IgA二聚体占优势。IgA存在2个子类：IgA1和IgA2，它们通常以约80-90重量％:10-20重量％的相对比例存在于人血清中。在IgA分离过程中，可以改变该关系。免疫球蛋白制品中κ:λ轻链的自然比率为大约1:1。IgA仅占正常人血清的总蛋白的大约3-4％。
IgM形成聚合物，其中多个单体用二硫键共价地连接在一起，主要是作为五聚体，但是也作为六聚体。发现J链存在于五聚体IgM中，但是不存在于六聚体形式中，可能是由于六聚体复合物中的空间约束。还可以在没有J链存在下制备五聚体IgM。目前，仍然不确定正常五聚体的哪种级分含有J链，且在该程度上也不确定含有J链的五聚体是否含有一个或超过一个J链(Erik J.Wiersma等人(1998)J.Immunol.160:5979-5989)。因为IgM是大分子；它不可以适当地扩散，并且发现其仅以非常低的量存在于间质组织中。发现IgM主要存在于血清中，但是因为J链的存在，它作为分泌型免疫球蛋白也是重要的。由于它的高分子性质，IgM具有高亲合力，且对于补体激活而言是特别有效的。
在最近的一个世纪中，免疫球蛋白制品被成功地用于预防和治疗不同的感染性疾病。传统地，开发了用于全身施用的免疫球蛋白制品，且其主要包含IgG。但是，母乳用于预防和治疗婴儿腹泻的成功应用突出显示了血浆和粘膜(分泌型)IgA的潜在益处(Hammarstrom L.等人(1994)Immunol.Rev.139:43-70)。
Eibl等人(Eibl,M.等人(1988)N Engl J Med 319:1-7)进行的临床试验指示，经口饲喂血浆衍生出的富含IgA的免疫球蛋白制品(IgAbulin 73％IgA和26％IgG)可以预防坏死性小肠结肠炎的发展。其它适应症，例如涉及粘膜感染的适应症，也可以受益于IgA治疗。但是，IgAbulin不再可得到，并且目前不可得到IgA产品。
用于分离和纯化免疫球蛋白的已知和常见的方法主要是基于属于该组的分子的物理化学和生物学特性(诸如它们的分子质量、等电点、在不同条件下的溶解度)的差异；另外，必须考虑它们对某些物质(例如细菌A-和G-蛋白)的亲和力。凝胶色谱法、亲和色谱法和离子交换色谱法、透析、盐沉淀和有机溶剂是基于免疫球蛋白分子的不同性能。在文献中描述的最广泛使用的方案组合成几个方案。
用于从血浆库分离免疫球蛋白的商业方法通常从乙醇分级分离开始，例如如Cohn所开发的(Cohn等人(1946)J.Am.Chem.Soc.68,459；Oncley等人(1949),J.Am.Chem.Soc.71,541)。已经描述了原始的Cohn方法的众多变体。
Steinbuch等人(Rev.Franc.Et.Clin.et Biol.1969,XIV,1054)描述了乙醇沉淀的一个替代方案。该方案使用辛酸进行沉淀，从而将免疫球蛋白留在上清液中。使用阴离子交换剂DEAE-纤维素通过吸附(“分批”)进一步纯化免疫球蛋白。
已经探究了色谱方法用于从IVIG产物的富含免疫球蛋白的血浆级分纯化IgG的用途。具体地，在从血浆或其级分纯化IgG的专利方法中，描述了在单独步骤中或串联的阳离子和阴离子交换色谱法。在大多数专利方法中，以负模式使用阴离子交换色谱法，即，使用条件来实现污染性蛋白(例如IgA、IgM、白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白)的结合，而IgG是在未吸附的产品中。例如通过增加离子强度，可以从阴离子交换柱洗脱IgA和IgM。
另外，已经开发了不同的色谱分离方法来增加产品的纯度。产生最佳性能的那些(尤其是EP 0703922、WO 99/64462)包括至少2个连续色谱法步骤，一个使用阴离子交换，且另一个使用阳离子交换。在常规的实现条件下，这些方法的特异性由未吸附IgG的阴离子交换剂的性能提供，但是会结合在预纯化步骤中共纯化的大多数其它蛋白。
在关于从血浆或其级分(例如Cohn级分II+III)纯化IgG的专利US 6,307,028 B1中，在用辛酸预处理以后，存在2个色谱步骤。在第一个步骤中，使用强阴离子交换剂来结合IgA；在第二个步骤中，使用弱阴离子交换剂来结合IgM。发明人声明，他们可以用高盐分别洗脱IgA和IgM。
尽管已经在文献中描述了众多IgA分级分离方法，令人惊讶的是，制药工业尚未将IgA免疫疗法产品投放市场。IgA用于免疫治疗用途的可用性似乎已经受到技术约束的限制。用于大规模分级分离IgA的方法未能产生高度纯化的制品(即大于90％)，并且小规模纯化方法(例如抗-IgA亲和柱)不可提供商业上可行的产品。因此，用于大规模纯化IgA(其产生适合用于免疫治疗用途的高度纯化的IgA制品)的方法是合乎需要的。具体地，由于IgG可以不利地影响IgA的抗炎性能的事实，不含IgG的IgA是非常合乎需要的。
使用不同的沉淀组合(包括硫酸铵、乙醇、辛酸、聚乙二醇)和色谱技术，可以从血浆或其它生物流体分级分离IgA。用于分离IgA的色谱树脂包括：DEAE纤维素，Sephadex G-200，DEAE-SephadexA-50，在抗-IgG和抗-IgM免疫吸附剂上的亲和色谱法，Jacalin-Sepharose，蛋白G-Sepharose，Fastflow-S Sepharose，Superose6，亲硫吸附，SephacrylS-300，与溴化氰活化的Sepharose 4B缀合的抗-IgA抗体，蛋白-A和蛋白-G亲和色谱法(Cripps,A.W.等人(1983)J.Immunol.Methods 57:197-204；Doellgast,D.J.等人(1976)Immunochemistry.13:135-139；Kobayashi,K.等人(1987)Adv.Exp.Med.Biol.216B:1193-1197；Leibl,H.等人(1995)Protein Expressionand Purification 6:408-410；Pejaudier,L.等人(1972)Vox.Sang.23:165-175；Roque-Barriera,M.等人(1985)J.Immunol.134:1740-1743)。但是，到目前为止这些技术都没有提供使得从血浆或其它含有IgA的材料纯化IgA在商业上可行的大规模纯化方法。
WO 97/25352描述了将含有免疫球蛋白的起始原料中的免疫球蛋白IgG和IgA彼此分离、与它们的高分子聚集体分离以及与其它高分子污染性物质分离的方法，所述其它高分子污染性物质已经存在于起始原料中或在使用羟基磷灰石、特别是陶瓷羟基磷灰石的纯化步骤和其它纯化步骤中形成。尽管在该专利申请中描述的方法适合于大规模生产含有IgA的溶液，它具有几个缺点，所述缺点使得开发改进的方法是合乎需要的。例如，用作起始原料的材料是从级分II+III得到的Cohn级分III，这意味着，该级分此后不可用于IgG生产，从而使得商业吸引力降低。另外，得到的IgA溶液需要几个其它纯化步骤(色谱法)才能达到可接受的纯度的制品。
因此，申请人已经开发了从含有IgA的组合物和/或含有免疫球蛋白的材料制备免疫球蛋白A和M的新色谱方法。有利地，在IgG的纯化和分离方法中得到的副级分(sidefraction)和/或废料可以用于分离和纯化IgA(和IgM)。
与在文献中描述的其它方法相比，该新方法会提供几个优点。该方法的特征在于，没有盐梯度的简单连续和选择性洗脱。二羧酸和/或二羟基-二羧酸以及羟基-三羧酸(或其盐)在弱酸性至弱碱性条件下的应用，允许针对阴离子交换树脂的带电荷表面的高竞争性作用。另外，在各个峰级分的洗脱过程中，pH保持恒定。另外，洗脱缓冲液的pH保持恒定。
所述方法可以将免疫球蛋白分离成亚级分，所述亚级分可以充当用于生产高纯IgA和IgM浓缩物的起始原料。另外，所述方法会导致单体和二聚体/聚合的免疫球蛋白在单独亚级分中的富集。通过该方法，可能通过单个离子交换色谱法步骤生产几种有用的免疫球蛋白浓缩物，它们然后可以根据需要进一步加工以产生富含单体IgA或二聚体IgA的组合物。有利地，所述的方法会提供相对于用于制备高纯IgA的当前现有技术纯化方法的显著改善。
发明内容
因此，本发明的一个方面是，一种用于从含有IgA的组合物富集IgA的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)在允许IgA结合的条件下，将所述组合物加载至阴离子交换剂之上，
(b)施加碱性洗脱溶液，其包含具有至少2个酸基的物质，
其中在步骤b中洗脱的蛋白富含单体IgA。
优选地，通过向所述阴离子交换剂施加低电导率溶液，在步骤(a)和(b)之间进行预洗脱步骤(a1)。优选地，在弱酸性至中性pH进行该步骤(a1)。
优选地，步骤(b)中的物质选自多价羧酸或多价羟基-羧酸或其盐和/或磷酸盐/酯，更优选地，所述物质选自：二羟基-二羧酸和/或二羧酸或其盐诸如酒石酸/酒石酸盐、草酸/草酸盐、马来酸/马来酸盐、丙二酸/丙二酸盐，羟基-三羧酸或其盐诸如柠檬酸/柠檬酸盐和/或磷酸盐。所述二羟基-二羧酸或其盐优选地选自酒石酸/酒石酸盐、草酸/草酸盐、丙二酸/丙二酸盐和马来酸/马来酸盐。更优选地，所述二羟基-二羧酸或其盐是酒石酸/酒石酸盐或草酸/草酸盐。在一个优选的实施方案中，通过加入额外缓冲液组分(优选pH 7.6±0.4的Tris缓冲液)至1-20mM、优选2-15mM、更优选5-10mM的终浓度，稳定步骤(b)中的碱性溶液的pH。
优选地，在步骤b中收集的洗脱液基本上不含有IgM。
本发明的另一个方面是上述的方法，其具有一个额外的(任选的)步骤(c)，即通过施加酸性洗脱溶液进行的另一个洗脱步骤，所述酸性洗脱溶液包含阴离子交换剂的强竞争剂。优选地，在步骤c中洗脱的蛋白富含二聚体IgA。
优选地，步骤(c)中的阴离子交换剂的强竞争剂选自柠檬酸盐、苯磺酸、苯甲酸和硫酸氢盐的盐(salts of hydrogen sulfates)或其混合物。更优选地，阴离子交换剂的强竞争剂是柠檬酸盐。
在本发明的方法中使用的阴离子交换剂可以是强阴离子交换剂或弱阴离子交换剂。优选地，所述阴离子交换剂包含阴离子交换配体诸如季铵、季氨基乙基、二乙基氨基乙基、三甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基。更优选地，所述阴离子交换剂选自MPHQ、DEAESepharose FF、Q Sepharose(HP和FF)、ANX Sepharose FF(低和高取代)、Capto Q、Capto QXP、Capto DEAE、Capto ANX、Macro Cap Q、Source30 Q和15 Q、Q Hyper Cel、Giga Cap Q650M、QAE 550 C、DEAE Biogel A、Fractogel DEAE、Fractogel TMAE和Fractogel DMAE。
优选地，所述含有IgA的组合物是或衍生自血液、血清、血浆或其它生物流体。更优选地，所述含有IgA的组合物是在血浆分级分离或从血浆纯化IgG的过程中得到的中间体或副级分。
在本发明的一个优选方面，所述含有IgA的组合物是IgG纯化方法的中间体，且在本发明的方法中使用的阴离子交换剂是IgG生产方法的一部分。IgG将主要存在于阴离子交换剂的穿流液(flow-through)中，而IgA根据上述方法洗脱。
在本发明的另一个优选方面，所述含有IgA的组合物通过溶解沉淀物而得到。优选地，所述沉淀物是在IgG纯化过程中得到的辛酸沉淀物。通常进一步加工辛酸沉淀物的上清液以纯化IgG。优选地，所述溶解步骤选择性地使IgA和IgG进入溶液中。优选地，使用具有1-15mS/cm的电导率和3.5-6或7-9.5的pH的溶液进行溶解。更优选地，用磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液和/或这些缓冲液中的2种或更多种的组合进行溶解。甚至更优选地，所述缓冲液选自0.22M乙酸盐缓冲液或0.15M磷酸盐缓冲液，pH 4.8。
优选地，以在1:5至1:12之间的比率使用缓冲液和中间体沉淀物。
本发明的另一个方面是，阴离子交换色谱法通过连续洗脱用于分离单体和二聚体IgA的用途。
具体实施方式
本发明涉及一种改进的从含有IgA的组合物制备富含IgA级分的方法。从用本发明的方法得到的级分，可以生产用于治疗用途的高纯IgA浓缩物。所述方法包括在弱酸性至中性pH进行的单个阴离子交换色谱法步骤，由此使IgA能被保留在色谱支持物上，而大部分IgG被以相对纯的形式收集在穿流液中。此后，使用在弱酸性至碱性pH的连续选择性洗脱，将保留的IgA和其它污染物分级分离。本发明也涉及一种用于分离单体和二聚体IgA的色谱方法。
所述含有IgA的组合物可以是含有IgA的任意材料，优选生物流体。优选地，所述含有IgA的组合物是或衍生自血液、血浆或血清。所述含有IgA的组合物可以是以下物质的溶液：得自冷乙醇分级分离方法的糊料或沉淀物，优选级分(FI+II+III)、(FII+III)或FIII，例如如在Cohn/Oncley中所述(Cohn等人(1946)J.Am.Chem.Soc.68,459；Oncley等人(1949),J.Am.Chem.Soc.71,541)，或如在Kistler和Nitschman方法中所述的沉淀物A、沉淀物B和沉淀物G(H.Nitschmann等人(1954)Helvetica Chimica Acta 37,866-73)，或它们的改进。
所述含有IgA的组合物优选地是：使用辛酸沉淀、聚乙二醇沉淀和/或硫酸铵沉淀从血浆开始纯化IgG的过程中得到的中间体沉淀物或中间体溶液或废级分的溶液，或任何含有IgA的中间体或废级分。但是，在本发明中也意图包括使用其它含有IgA的起始原料的方法。例如，使用本发明的方法，还可以从其它生物流体(诸如奶或唾液)富集IgA。
优选地，所述起始原料是通过上游方法步骤已经富含免疫球蛋白的中间体溶液，其被制备用于在上述的从血浆或血浆级分纯化IgG的方法中施加于阴离子交换剂。优选地，大多数IgG不会结合阴离子交换剂，且可以直接进一步加工用于IgG纯化。然后可以根据本发明的方法洗脱结合的材料，其包含在中间体溶液中含有的大多数IgA。
当将沉淀物用作起始原料时，通过将所述沉淀物在缓冲液中再悬浮数小时，可以从沉淀物(加工级分或副/废级分)提取IgA。优选地，在再悬浮步骤中选择性地溶解IgA和IgG。优选使用具有1-15mS/cm、更优选5-15mS/cm的电导率的溶液进行溶解。pH是在3.5-6之间或7-9.5之间。如果选择酸性pH，它优选地是在4-5.5之间，更优选地在4.5-5.2之间，最优选约4.8。如果选择碱性pH，它优选地是在7-9之间，更优选7.5-8.5之间。优选地，使用pH为约4.8的磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或Tris缓冲液，还可以使用这些缓冲液中的2种或更多种的组合。更优选地，用pH为4.8的0.1-0.2M、优选0.15M磷酸盐缓冲液或0.1-0.3M、优选0.2M乙酸盐缓冲液进行溶解。但是，技术人员将能够鉴别其它合适的缓冲液。缓冲液和沉淀物的比率为约1:5至1:12，优选1:5、1:7、1:10或1:12，但是还可以使用其它比率。使用合适的混合器(例如得自例如Graber的Vibro混合器，或得自例如Ekato的Viscoprop)在强搅拌下进行溶解至少2小时，优选至少4小时，甚至更优选地过夜。
任选地，在溶解以后可以进行澄清步骤，例如通过深度过滤。
根据本发明的方法的第一个步骤是，将含有IgA的组合物加载至阴离子交换剂之上。所述阴离子交换剂可以提供为柱、膜、任意类型的基质、树脂或其它基础材料，且包含阴离子交换配体。本发明的方法可以在任意类型的阴离子交换剂、弱、强或混合模式阴离子交换剂上进行，只要它在特定条件下进行，所述特定条件使IgA能在加载阶段中被保留在阴离子交换剂上，而IgG以相对纯的形式被收集在穿流液中。
阴离子交换配体是带正电荷的基团。例如，阴离子交换剂可以包含诸如季铵、季氨基乙基、二乙基氨基乙基、三甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基等基团作为配体。合适的阴离子交换剂的例子是MPHQ、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose(HP和FF)、ANX Sepharose FF(低和高取代)、Capto Q、Capto Q XP、Capto DEAE、Capto ANX、Macro Cap Q、Source 30 Q和15 Q、Q Hyper Cel、Giga Cap Q 650M、QAE550 C、DEAE Biogel A、Fractogel DEAE、Fractogel TMAE和Fractogel DMAE。最优选的阴离子交换剂是MPHQ或Fractogel DEAE MD。
在允许IgA结合阴离子交换剂的条件下进行加载(步骤(a))。通常，将阴离子交换剂在使用前平衡，经常使用双缓冲液系统(平衡缓冲液1和2)，其中在加载之前使用平衡缓冲液2。经常将含有IgA的溶液调节成具有与平衡缓冲液(当使用双缓冲液系统时，平衡缓冲液2)类似的pH和电导率。所述平衡缓冲液是适合于使用的阴离子交换剂的普通缓冲液系统。平衡缓冲液1的电导率是在5-50mS/cm之间，更优选地在5-45mS/cm之间。pH是在3-8之间。合适的缓冲液的例子是磷酸盐或乙酸盐缓冲液或它们的组合。优选地，所述缓冲液是乙酸盐缓冲液(pH 3-5)或磷酸盐缓冲液(pH 7-8)。平衡缓冲液1的最优选选择是：具有约8mS/cm的电导率的约0.8 M乙酸盐缓冲液(pH 3.5-4.5)，具有约40mS/cm的电导率的约0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7-8)，或具有约10mS/cm的电导率的约0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7-8)。平衡缓冲液2的电导率是在0.5-1.5mS/cm之间，更优选在0.7-1.3mS/cm之间。pH是在5-8.5之间。平衡缓冲液2的合适选择的例子是磷酸盐、乙酸盐和它们的组合。优选地，所述缓冲液是乙酸盐缓冲液(pH 6-7)或磷酸盐/乙酸盐缓冲液(pH 7-8)。平衡缓冲液2的最优选缓冲液是：具有约1mS/cm的电导率的约10mM乙酸盐缓冲液(pH 6-6.6)，具有约1mS/cm的电导率的约7.5mM磷酸盐和2.5mM乙酸盐缓冲液(pH 6-6.6)，或具有约1mS/cm的电导率的约5mM磷酸盐和10mM乙酸盐缓冲液(pH 6-6.6)。
在加载阴离子交换剂以后，通常用平衡缓冲液2洗脱以除去任何未结合的物质。
任选地，可以进行预洗脱步骤以除去松散地结合的材料。这可以用含有磷酸盐、乙酸盐和它们的组合的缓冲液进行。在本发明中，优选地用低电导率溶液进行预洗脱，优选地在弱酸性或中性pH。更优选地，使用磷酸盐/乙酸盐缓冲液，优选地在约5-15mM磷酸盐和15-45mM乙酸盐的浓度，更优选地在约10mM磷酸盐和30mM乙酸盐。预洗脱缓冲液的pH是约6.0-6.8，优选地使用6.0的pH，但是技术人员将能够选择其它合适的缓冲液。在本发明中，预洗脱级分主要含有IgG，且当所述含有IgA的组合物含有大量IgG(与IgA的量相比)时，优选地使用预洗脱。
任选的预洗脱步骤以后，将缓冲液改成第一洗脱缓冲液(步骤(b))。发明人已经有利地发现，使用多价羧酸或多价羟基羧酸、优选二羟基-二羧酸或羟基-三羧酸或其盐，会产生IgA(主要是单体IgA)在第一洗脱期间收集的材料(通常是级分)中的良好富集。可替换地，可以将磷酸盐缓冲液用于该洗脱步骤。优选地，在第一洗脱期间收集的材料基本上不含有IgM。优选地，使用碱性pH，例如7.2-9.0的pH，更优选7.4-7.8，最优选约7.6的pH。优选地，二羟基-二羧酸或羟基-三羧酸或其盐选自酒石酸/酒石酸盐、草酸/草酸盐、丙二酸/丙二酸盐、马来酸/马来酸盐或柠檬酸/柠檬酸盐。优选地，所述第一洗脱缓冲液含有以下浓度的多价羧酸或多价羟基-二羧酸或其盐：5-100mM，更优选20-80mM，甚至更优选25-65mM，最优选约55mM。另外，所述第一洗脱缓冲液可以含有其它缓冲物质诸如乙酸钠。例如，所述第一洗脱溶液可以含有1-20mM乙酸钠，优选1-10mM乙酸钠，最优选约5mM乙酸钠。优选地，所述第一洗脱溶液可以包含额外缓冲液组分(pH 7.6±0.4)，优选Tris，达到1-20mM、优选2-15mM、更优选5-10mM的终浓度。技术人员将能够选择适合实现第一洗脱溶液的期望pH和电导率的其它物质及其合适浓度。
更优选地，第一洗脱溶液中的二羟基-二羧酸或其盐是酒石酸盐或草酸盐，最优选地，它是酒石酸盐。
优选地，在第一洗脱期间收集的材料富含单体IgA，且基本上不含有IgM，即除去了IgM。
在本发明的一个更优选的实施方案中，进行额外步骤(c)，其为第二洗脱步骤。在步骤(c)中洗脱的材料(通常是级分)富含二聚体IgA，包括含有J-链的IgA。如果IgM存在于含有IgA的组合物中，在该步骤中也可能洗脱IgM。
如果第二洗脱步骤是期望的，然后将缓冲液改成第二洗脱缓冲液。优选地，所述第二洗脱缓冲液将含有阴离子交换剂的强竞争剂，以便从阴离子交换剂替换结合的蛋白。这样的强竞争剂的例子是柠檬酸盐、苯磺酸、苯甲酸和硫酸氢盐的盐或其混合物。最优选的竞争剂是柠檬酸盐。优选地，第二洗脱缓冲液的pH是约3.0-6.0，更优选约4.5-5.5，最优选地pH是5.0。优选地，第二洗脱缓冲液中的柠檬酸盐的浓度是1-100mM，更优选1-50mM，甚至更优选约25mM。另外，第二洗脱缓冲液可以含有其它缓冲物质诸如磷酸盐，优选地浓度为40-50mM。最优选地，第二洗脱缓冲液可以含有50mM磷酸钠和25mM柠檬酸盐，pH为5.0。
然后根据需要将富含IgA、或富含单体IgA或富含二聚体IgA的材料或级分合并，并任选地进一步加工。例如，可以进行尺寸排阻色谱法以例如从IgM和单体IgA分离二聚体IgA，可以使用亲和色谱法除去剩余的IgG和/或IgM(例如通过蛋白A亲和色谱法，CaptureSelect IgM)，和/或可以使用第二离子交换色谱法分离杂质(例如阴离子交换剂，通常优选整体料(monolith)乙二胺(EDA))。技术人员可以设计其它步骤来衍生出期望的纯度。
另外，在任何商业方法中将包括除去任何病原体(诸如病毒或朊病毒蛋白)的步骤。这样的方法步骤是技术人员众所周知的，且可以选自诸如纳米过滤、溶剂/去污剂处理、巴氏消毒等方法和其它方法。
本发明还提供了阴离子交换色谱法用于将在第一洗脱步骤中洗脱的单体IgA与在第二洗脱步骤中洗脱的二聚体IgA分离的用途。预见到，其在适当调整以后也适用于尤其是起始原料，适用于其它免疫球蛋白同种型。具有挑战性的是，可以在工业规模进行以提供单体和二聚体或聚合免疫球蛋白的分离的方法，因为需要分离的蛋白的性能是非常类似的，且经常不顺从用适合在工业规模使用的方法来分离。
本发明的另一个方面是，可通过本发明方法得到的组合物和从其得到的产品。这样的组合物可以进一步加工，例如通过其它纯化步骤和/或通过配制。例如，可以加入药学上可接受的赋形剂或载体，如果需要的话，可以加入稳定剂，可以根据需要加入粘度增强剂或粘度降低剂。低压冻干法也是任选的。根据产品的期望医学用途来选择合适的制剂。
在本发明的一个优选实施方案中，从副级分和/或废料得到IgA，所述副级分和/或废料可在从人血浆纯化IgG的方法中得到。通常，将得自多个供体的血浆样品合并，并在使用前冷冻。然后将血浆融化，离心，并根据Cohn或Kistler Nitschmann或其变体对上清液(冷上清血浆(cryo-poor plasma))进行乙醇分级分离。通常，将pH调至特定范围，并加入乙醇至特定浓度，沉淀物在几小时温育(通常在4℃)期间形成，将沉淀物和可溶部分分离并用于进一步加工。通常用较高乙醇浓度等对可溶部分重复该步骤，直到得到期望的沉淀物和溶液。
通常使用0.1-0.3M、优选0.2M乙酸盐缓冲液(pH 4.8)，在搅拌下溶解含有免疫球蛋白的沉淀物过夜。然后进行辛酸沉淀，并将上清液进一步加工用于纯化IgG。所述沉淀物含有IgA，且可以溶解，然后根据本发明的方法进一步加工。
如上所述，使用上清液来进一步纯化血浆IgG。通常，进行缓冲液改变，然后将所述材料施加于阴离子交换色谱法。纯化的IgG被收集在穿流液中，并且如果仅希望纯化IgG的话，将与阴离子交换剂结合的蛋白在使用苛刻条件(例如1M NaCl或1M NaOH)的清洁规程中除去，并抛弃。
但是，如果希望额外纯化IgA，然后可以如上所述洗脱阴离子交换剂，以得到富含单体和/或二聚体IgA的洗脱液。如果需要的话，还可以回收IgM。通常，在合适的洗涤步骤以后，使用磷酸盐/乙酸盐缓冲液(pH 6.0)进行预洗脱。在预洗脱过程中收集的材料被称作F3，且主要含有IgG。
通常，然后使用酒石酸盐/乙酸盐缓冲液(pH 7.3-7.8)进行第一洗脱。在该步骤中，洗脱材料F4，其富含单体IgA，但是也含有IgG。有利地，在该材料中没有发现IgM。如上面公开的，在本发明中还可以使用其它缓冲液。
如果需要的话，然后使用pH为约5的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液进行第二洗脱步骤。上面公开了可以根据本发明用于该步骤的其它缓冲液。第二洗脱会提供含有IgG、IgA和IgM的材料F5。在该材料中富含二聚体IgA。
在适当阶段将病原体灭活和/或除去步骤(诸如纳米过滤)整合进这些方法中，以确保得到的材料的安全性。已经描述了许多用于病原体灭活和除去的方法，且技术人员将能够在没有不适当负担的情况下将这样的步骤整合进方法中。
如上所述，辛酸沉淀物也是本发明的方法的合适起始原料。发明人已经有利地发现，用pH在3.5-6或7-9.5之间的低电导率溶液溶解，优先使IgA和IgG进入溶液中。例如，所述缓冲液可以是乙酸盐或磷酸盐缓冲液，但是可以使用其它缓冲液。
本发明的一个优选实施方案是，一种用于从含有IgA的组合物和/或含有免疫球蛋白的材料分离IgA(和IgM)的方法，其中所述方法的特征在于：
(i)将含有IgA的组合物加载至大孔阴离子交换树脂之上，
(ii)在连续选择性解吸/洗脱以后，从所述交换树脂分离IgA，
(iii)所述连续洗脱由以下步骤组成：
A)在弱酸性至天然pH的预洗脱步骤，产生IgG级分，
B)使用弱碱性pH的二羧酸或二羟基-二羧酸或其盐和/或磷酸盐的第一洗脱步骤，产生含有至少40-60％的单体IgA和至多60％的IgG的级分。该级分被除去了IgM。
C)使用酸性pH的羟基-三羧酸或其盐、苯磺酸或苯甲酸和硫酸氢盐的盐或其混合物的第二洗脱步骤，产生含有大约45％IgM、25％IgA(主要是二聚体/聚合的)、25％IgG和5％除了免疫球蛋白以外的污染物的级分。
所述方法可以任选地以非常直接的方式整合在不同的血浆分级分离方法中，且总是导致相同的中间体IgA组合物。
从得到的级分，可以生产用于可能治疗用途的高度纯化的IgA(和IgM)浓缩物。已经在中试工厂规模评价了所述连续和选择性洗脱。
定义
术语“含有IgA的组合物”是指含有IgA的任何液体组合物。具体地，这些组合物将是生物流体诸如唾液、泪液或粘液、任何血浆级分或副/废级分，其可以例如在加工血浆以纯化用于治疗目的的血浆蛋白(诸如IgG)的过程中得到。该术语也包括在体外生产的IgA(例如单克隆IgA或重组生产的IgA，例如由细胞系分泌的IgA)的组合物。
术语“富集”或“富含”在本发明范围内是指组合物中靶蛋白的量相对应总蛋白含量的显著增加，例如在纯化步骤以后。如果靶蛋白的纯度增加了至少20％、优选至少30％、甚至更优选至少50％、最优选超过75％，则实现富集。
术语“纯的”是指基本上仅包含靶蛋白的组合物。在本发明范围内，如果溶液含有超过90％(w/w)IgA、优选地超过95％IgA、更优选地超过98％IgA，则所述溶液是纯的IgA溶液。
术语“离子交换色谱法”是指这样的方法：其允许基于它们的电荷来分离离子。在本发明中，使用阴离子交换色谱法，其中用共价地结合至固体基质上的阳离子基团(阴离子交换配体)选择性地保留带负电荷的分子(例如在特定pH的溶液中的蛋白，它们在所述pH表现出带负电荷的结构域)。所述固体基质可以是任意合适的载体材料，且可以呈珠子、膜或其它合适的固体支持物构型的形状。通常，所述固体基质呈珠子的形式，且被用作柱。但是，在本发明中也包括执行阴离子交换的其它方法。强阴离子交换剂在宽pH范围内带电荷，而弱阴离子交换剂的电荷将随pH而变化。
“加载至阴离子交换剂之上”是指，使要进行阴离子交换色谱法的溶液与它们的固体支持物上的阴离子交换配体接触。通常，在本发明的上下文中，该术语表示在色谱法步骤中进料的柱。但是，如上面已经提及的，本发明不限于用于阴离子交换剂的柱构型。例如，它也可以以分批模式进行。
术语“穿流液”表示在色谱法步骤中没有被保留的物质。在本发明范围内，它是未结合的或仅被阴离子交换剂松散地结合的级分。任何给定阴离子交换剂的穿流液将根据使用的缓冲液系统而变化。
术语“洗脱液”表示这样的物质：其被阴离子交换剂结合，但是然后在改变条件以后(即将“洗脱溶液”施加于阴离子交换剂以后)从阴离子交换剂释放。在将洗脱溶液施加于阴离子交换剂以后，它通常收集在级分中。
术语“中性pH”是指约7的pH。通常，将6.0-7.5的范围视作中性，优选6.5-7.5的范围，更优选6.8-7.2的范围，最优选6.9-7.1的范围。
术语“弱酸性”表示约4.0-6.5的pH范围，优选5.0-6.0的范围，更优选5.5-6.0的范围。
术语“低电导率”表示低于15mS/cm、优选地低于10mS/cm的电导率。
术语“基本上不含有IgM”表示存在的总蛋白中小于10％IgM(w/w)，优选地小于5％，甚至更优选地小于2％，最优选地小于1％IgM。
术语“生物流体”包括源自脊椎动物体内的液体，包括从身体排泄或分泌的流体，诸如奶、唾液、粘液、泪液。
术语“血浆”表示血液的液体组分(总血液体积的约55％)。它含有血浆蛋白诸如白蛋白、免疫球蛋白(抗体)、凝固因子、激素和其它组分诸如葡萄糖或矿物离子。
术语“血清”是指除去了纤维蛋白原和凝固因子的血浆，即在发生凝血以后的液体级分。
术语“血浆分级分离”是指血浆蛋白的分离方法。通常，它是指血浆蛋白的工业规模纯化方法中的初始处理步骤，该步骤允许首先分离主要种类的血浆蛋白，然后对它们进行其它纯化方法。通常，如Cohn、Oncley或Kistler Nitschmann或其变体所述，通过乙醇进行分级分离。其它分级分离方法是基于使用其它试剂(诸如辛酸、聚乙二醇或硫酸铵)的沉淀。
术语“中间体沉淀物”是指作为血浆分级分离或其它沉淀的结果的沉淀物，所述血浆分级分离或其它沉淀可以在血浆蛋白的下游纯化方法中进行。它通常含有不同血浆蛋白的混合物。
术语“沉淀物的溶解”是指，向沉淀物添加液体、通常为缓冲液，以使所述沉淀物中含有的蛋白回到溶液中用于其它纯化步骤。
术语“副/废级分”是指血浆分级分离或下游过程的中间体，其通常不进一步加工，即被抛弃。
现在将参考以下附图用以下非限制性实施例例证本发明：
图1：IgA富集方法的程序框图，所述方法基于血浆分级分离的不同中间体沉淀物或从血浆纯化IgG得到的副级分。已经例证了2种起始原料(实施例1中的方法1和实施例2中的方法2)。
图2：根据图1所示的方法1，用于阴离子交换色谱法的加载的材料(原料)的组成的HPLC分析。x-轴显示了洗脱时间，y-轴显示了在280nm的吸光度(mAu：毫吸收单位)。
图3:阴离子交换柱的洗脱曲线，x-轴上显示了以毫升为单位的保留体积，在y-轴上显示了在280nm的吸光度(mAu：毫吸收单位)。在曲线上面指示了洗脱溶液，垂直线指示施加于柱的溶液的改变。
图4：根据方法1，级分F4A的组成的HPLC分析。
图5：通过亲和色谱法除去IgG以后，F4的组成的HPLC分析。
图6：通过亲和色谱法得到的IgG和IgM的级分F5的组成的HPLC分析。
图7：使用不同的缓冲液作为洗脱缓冲液1，阴离子交换柱的方法的洗脱曲线。垂直虚线指示施加于柱的溶液的改变。*乙酸盐缓冲液洗脱的负载减少。
图8：相对于总负载蛋白，当用不同洗脱缓冲液进行洗脱1时得到的级分中IgA和IgM的含量的分析。
实施例
以下实施例用于例证本发明，但是无意限制本发明。
在以下实施例中，将源自从血浆和/或血浆级分中纯化IgG的方法的材料用作本发明的起始原料。图1显示了IgG纯化方法的程序框图，并指示了在所述方法中可以引入根据本发明的IgA纯化方法的实施例。
简而言之，进行下述步骤以从血浆纯化IgG：对血浆或冷上清血浆进行冷乙醇分级分离(例如根据Cohn或Kistler–Nitschmann)，并将含有免疫球蛋白的级分进一步加工。进行辛酸沉淀，然后对含有大多数IgG的混悬液进行过滤、病毒灭活和阴离子交换(AIEX)色谱法。将大多数IgG收集在AIEX穿流液中并进一步加工，包括最终的配制和包装。
如在图1中所示，根据本发明的IgA纯化方法可以从冷乙醇分级分离分支，例如FI+II+III、FI的上清液、FII+III、沉淀物A或它们的亚级分。但是，优选地，对从辛酸沉淀物(辛酸饼)溶解的材料进行本发明的方法，或对与阴离子交换柱结合的材料进行根据本发明的连续洗脱以得到血浆IgA。后述材料是优选的，因为它们目前被抛弃。进行从这些材料纯化IgA的方法不会干扰IgG方法，所以IgG或其它血浆蛋白的收率不会降低或以任何方式受损。尽管如此，本发明不限于那些起始原料。
实施例1：使用酒石酸盐缓冲液作为洗脱缓冲液1从阴离子交换(AIEX)柱连续洗脱IgA
基本上如在图1中所示和在上面简要描述的，进行从血浆纯化IgG的方法。在IgG纯化方法中，用2种缓冲液平衡AIEX柱(MPHQ)：使用0.78M乙酸钠(pH 4.0±0.1,电导率8-10mS/cm)进行前2个柱体积(CV)，继之以8个柱体积的10mM乙酸钠(pH 6.5±0.1,电导率0.8-1.2mS/cm)。图2显示了AIEX原料组合物，将其加载至AIEX柱(约180g蛋白/L树脂)之上，此后用2个柱体积的平衡缓冲液2洗涤。该步骤以后，对AIEX柱进行连续洗脱。
因此，使用8个柱体积的磷酸盐乙酸盐缓冲液(10mM磷酸盐+30mM乙酸钠,pH 6.0,电导率2-7mS/cm)进行预洗脱步骤。如在图3中所见，在预洗脱步骤中，洗脱级分F3，其主要含有IgG。
该预洗脱步骤以后，将缓冲液改成第一洗脱缓冲液(5-8个柱体积的55mM酒石酸盐,5mM乙酸钠,pH 7.6±0.2,电导率5-15mS/cm)。在转换成酒石酸盐缓冲液以后，收集级分F4，其含有约60:40比例的IgG和IgA，且基本上不含有IgM。在该级分中洗脱的IgA主要是单体IgA。如在图3中所见，如果需要的话，在该步骤中可以收集几个亚级分(峰级分)。图4显示了F4亚级分F4A的组成。但是，所有亚级分仅含有不同比例的IgG和单体IgA。
此后，施加6个柱体积的50mM磷酸盐和25mM柠檬酸盐(pH 5.0,电导率5-15mS/cm)作为第二洗脱缓冲液。在转换成第二洗脱缓冲液以后，洗脱级分F5，其可以收集成2个富含二聚体IgA的亚级分(峰级分)(图3)。级分F5含有IgM、IgA和IgG，比例为：20-30％IgA(主要是二聚体/聚合的)、35-50％IgM和20-35％IgG。
通过亲和色谱法(1个或2个步骤)精制级分F4和F5，以选择性地除去IgG和IgM。HPLC分析表明，从级分F4得到的产物是高纯单体IgA(图5)，而级分F5富含二聚体IgA(图6)。因此，该洗脱方法提供了单体IgA在级分F4中和二聚体IgA在级分F5中的优良富集。
还试验了其它AIEX材料(Fractogel、HyperCel Star AX、QHyperCel)，且已经给出类似的洗脱曲线。
实施例2：试验用于第一洗脱步骤的不同缓冲液
在第一洗脱步骤中评价了几种不同缓冲液，并与酒石酸盐缓冲液洗脱曲线进行了对比。
基本上如在实施例1中所述进行实验，蛋白负载是在100-180g蛋白/L AIEX树脂之间。但是，对于第一洗脱，用草酸盐、丙二酸盐、马来酸盐、磷酸盐、乙酸盐缓冲液(55mM每种物质+5mM乙酸钠，pH 7.6±0.2)替代酒石酸盐缓冲液。
得到的洗脱曲线显示在图7中。只要在第一洗脱中使用具有至少2个酸基的物质，级分F4似乎对于所有缓冲液都是类似的，而乙酸盐和磷酸盐洗脱曲线看起来非常不同。但是，第一洗脱也会影响使用柠檬酸盐缓冲液的第二洗脱。可以看出，草酸盐缓冲液产生了类似的F5峰(图7)。使用丙二酸盐、马来酸盐或磷酸盐缓冲液，在第二洗脱过程中没有洗脱IgM。使用乙酸盐缓冲液作为第一洗脱缓冲液，几乎所有的IgA和全部量的IgM被洗脱在F5中。
在图8中解释了这些级分中的IgA和IgM的量与总负载蛋白的对比。酒石酸盐和草酸盐提供了优选的洗脱曲线，其中单体IgA被洗脱在F4中，且IgM和二聚体IgA被洗脱在F5中。仅使用羟基二羧酸(hydroxydicarbon acid)的洗脱产生了所有3种F4亚级分和单体IgA洗脱。使用磷酸盐缓冲液的第一洗脱步骤仅表现出2个亚级分和1个减弱的IgA洗脱，而乙酸盐缓冲液产生了具有少量IgA的F4峰。如果用丙二酸盐、马来酸盐或磷酸盐缓冲液进行第一洗脱，在条带(strip)级分中得到大峰，其中使用苛刻的洗脱条件(1M NaCl)。
在表1中也显示了不同级分的免疫球蛋白含量:
*浊度分析方法，**ELISA分析方法
我们有利地发现，通过添加Tris缓冲液(pH 7.6±0.4)至1-20mM、优选2-15mM、更优选5-10mM的终浓度，可以稳定这样的缓冲液(例如酒石酸盐缓冲液)的pH。
实施例3：从辛酸沉淀物溶解IgA
如在图1中所示，辛酸沉淀物(OA饼)是在IgG纯化方法中产生的另一种废级分。发现该沉淀物含有显著量的IgA，因此是用于纯化IgA的良好起始原料。
以1:6(OA沉淀物:缓冲液)的比率，将OA饼与0.15M磷酸盐缓冲液(pH 4.8)混合。但是，还可以将其它缓冲液用于IgA提取，例如Tris缓冲液。对溶解的物质进行过滤，然后加载至AIEX柱(MPHQ)之上。然后基本上如在实施例1中所述，将柱依次洗脱。洗脱曲线看起来基本上如已经在图3中所示。
与所述的实施例1相比，用于AIEX柱的含有IgA的原料的组成在IgG:IgA比率方面不同。如在表2中所示，在级分F4中的IgG:IgA比率已经迁移有利于IgA(15％:85％)。预洗脱级分F3中的IgA的量也增加。两种级分不含有IgM。
二聚体的/聚合的化合物的洗脱由于起始物质的组成而受到限制。
在表2中也显示了不同级分中的免疫球蛋白：
*浊度分析方法，**ELISA分析方法
为了证实这同样适用于其它含有IgA的沉淀物，我们还试验了其它沉淀物。还从2种不同的乙醇沉淀物溶解IgA，并进行AIEX色谱法，并且用本发明的方法得到了非常类似的洗脱曲线。
实施例4：单体IgA的精制
连续洗脱产生了含有IgG作为污染物的富集的单体IgA级分(F4)。通过亲和色谱法(IgSelect)选择性地除去IgG，进行精制步骤。
将级分F4收集在2个亚级分F4A和F4B中(图3)。但是，对得到的F4A级分进行超滤/渗滤以浓缩蛋白并将它转移至具有中性pH的普通缓冲液系统，优选PBS(磷酸盐缓冲盐水)。将该蛋白溶液用作用于亲和色谱法的原料。IgA没有结合亲和树脂，被收集在穿流液级分中。用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合的IgG。最后，可以将IgA产物配制成稳定的药物组合物。图5显示了经精制的不含IgG(和IgM)的IgA级分。

Claims (27)

1.从含有IgA的组合物富集IgA的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)在允许IgA结合的条件下，将所述组合物加载至阴离子交换剂之上；
(b)施加碱性洗脱溶液，其包含具有至少2个酸基的物质，所述物质选自多价羧酸或其盐，和/或多价羟基-羧酸或其盐；
(c)任选地施加酸性洗脱溶液，其包含阴离子交换剂的强竞争剂，
其中在步骤(b)中洗脱的蛋白富含单体IgA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)和(b)之间，通过向所述阴离子交换剂施加低电导率溶液，进行预洗脱步骤(a1)，所述低电导率溶液是具有低于15mS/cm的电导率的溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在弱酸性/中性pH进行步骤(a1)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中的所述物质选自：二羟基-二羧酸或其盐，和/或二羧酸或其盐，或羟基-三羧酸或其盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述二羧酸或其盐，或二羟基-二羧酸或其盐选自：酒石酸/酒石酸盐、草酸/草酸盐、丙二酸/丙二酸盐和马来酸/马来酸盐。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述二羧酸或其盐，或二羟基-二羧酸或其盐是酒石酸/酒石酸盐或草酸/草酸盐。
7.根据权利要求4的方法，其中所述羟基-三羧酸或其盐是柠檬酸/柠檬酸盐。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中在步骤(b)中收集的洗脱液基本上不含有IgM，所述基本上不含有IgM表示在总蛋白中存在小于10％IgM(w/w)。
9.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(c)中洗脱的蛋白富含二聚体IgA。
10.根据权利要求1-7和9中任一项所述的方法，其中步骤(c)中阴离子交换剂的强竞争剂选自：柠檬酸盐、苯磺酸、苯甲酸和硫酸氢盐或它们的混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述阴离子交换剂的强竞争剂是柠檬酸盐。
12.根据权利要求1-7、9和11中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换剂是强阴离子交换剂或弱阴离子交换剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述阴离子交换剂包含阴离子交换配体诸如季铵、季氨基乙基、二乙基氨基乙基、三甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述阴离子交换剂选自：MPHQ、DEAE SepharoseFF、Q Sepharose、ANX Sepharose FF、Capto Q、Capto Q XP、Capto DEAE、Capto ANX、MacroCap Q、Source 30Q、Source 15Q、Q Hyper Cel、Giga Cap Q 650M、QAE 550C、DEAE BiogelA、Fractogel DEAE、Fractogel TMAE和Fractogel DMAE。
15.根据权利要求1-7、9、11和13-14中任一项所述的方法，其中所述含有IgA的组合物是或衍生自血液、血清、血浆或其它生物流体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述含有IgA的组合物是血浆分级分离的中间体沉淀物的溶液或从血浆纯化IgG的过程中得到的副级分。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述含有IgA的组合物是IgG纯化方法中的中间体，且其中在阴离子交换剂上进行根据权利要求1所述的方法的步骤(a)和(b)，其为IgG生产方法的一部分。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述含有IgA的组合物是IgG纯化方法中的中间体，且其中在阴离子交换剂上进行根据权利要求1所述的方法的步骤(a)和(b)，其为IgG生产方法的一部分。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述含有IgA的组合物通过溶解沉淀物来得到。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述含有IgA的组合物通过溶解沉淀物来得到。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述沉淀物是在IgG纯化过程中得到的辛酸沉淀物。
22.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述溶解步骤选择性地使IgA和IgG进入溶液中。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述溶解步骤选择性地使IgA和IgG进入溶液中。
24.根据权利要求21所述的方法，其中使用具有1-15mS/cm之间的电导率和3.5-6或7-9.5的pH的溶液进行溶解。
25.根据权利要求24所述的方法，其中用磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液和/或这些缓冲液中的2种或更多种的组合进行溶解。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述缓冲液选自：0.22M乙酸盐缓冲液或0.15M磷酸盐缓冲液，pH 4.8。
27.阴离子交换色谱法通过没有使用盐梯度的连续洗脱来分离单体和二聚体IgA的用途，其中在所述连续洗脱中使用洗脱溶液，所述洗脱溶液包含具有至少2个酸基的物质，所述物质选自多价羧酸或其盐，和/或多价羟基-羧酸或其盐。
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