KR20140136028A - Ｉｇａ를 농축시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, IgA-포함 물질로부터 IgA(및 IgM)를 농축시키는 공정에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단량체성 및 이량체성 IgA의 유리한 농축 및 분리를 유도하는 음이온 교환체의 순차적인 용출 공정에 관한 것이다.

Description

ＩＧＡ를 농축시키는 방법{PROCESS FOR ENRICHING IGA}

본 발명은, IgA-포함 물질로부터 IgA(및 IgM)를 농축시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 단량체성 및 이량체성 IgA의 유리한 농축 및 분리를 유도하는 이온 교환체(ion exchanger)의 순차적인 용출 공정에 관한 것이다.

서론

익히 알려져 있는 바와 같이, 면역글로불린은 감염과 싸우는데 있어서 포유동물의 면역계에서 중요한 역할을 한다. 면역글로불린(Ig)은, 모든 척추동물의 혈액 혈장, 림프 및 다른 신체 분비액에서 발견되는 B-림프구에 의해 합성되는 특이적 면역 단백질이다. 면역글로불린은 사람에서 혈장 단백질의 대략 20%를 구성한다.

이들의 특이성과는 독립적으로, 모든 면역글로불린은, 4개의 폴리펩타이드 쇄: 각각 공유결합으로 부착된 올리고사카라이드 그룹을 지니는 2개의 동일한 중(H)쇄들, 및 2개의 동일한, 일반적으로 글리코실화되지 않은 경(L)쇄들을 갖는 일반적인 구조를 가지며; 상기 쇄들은 이황화물 결합에 의해 공유결합으로 연결된다. 모든 4개의 폴리펩타이드 쇄들은, 각각 카복실 및 아미노 말단에서 발견되는, 불변(C) 및 가변(V) 영역을 함유한다. 중쇄 및 경쇄는 단일의 V 영역을 갖고, 한편, 경쇄는 단일의 C 영역을 지니고, 중쇄는 3개의 C 영역들을 함유한다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 V 영역들은 결합하여 2개의 동일한 항원 결합 부위(항원에 결합하는 항체의 부분)들을 형성한다. 면역글로불린의 Fc 영역 내의 구조 결정인자는 태반 수송 또는 항원-의존성 세포 독성과 같은 이펙터 기능(effector function)을 매개한다.

면역글로불린은, 이들의 H 쇄에 따라서, 생화학적 및 생리학적 특성이 상이한 5개의 주요 부류들로 나누어진다: IgG(γ 중쇄), IgA(α), IgM(μ), IgD(δ) 및 IgE(ε). 2가지 유형의 경쇄, κ 및 λ가 존재한다. 개개의 분자들은 κ 또는 λ 쇄를 함유할 수 있지만 둘 다는 절대로 함유할 수 없다. 남성에서, κ 또는 λ 경쇄를 함유하는 면역글로불린의 비는 약 60:40이다.

적용의 유용성 및 범위로 인하여, 3개의 면역글로불린 부류들, IgG, IgA 및 IgM이 다른 것들보다 더 중요하다. 사람 IgG는, 혈장에서 가장 풍부한 면역글로불린을 나타내고, 반면, IgA는, 타액, 눈물 및 호흡관 및 장관의 점액과 같은 외부 분비액에서 주요 항체 부류를 나타낸다. IgA는, 세균 및 바이러스 병원체에 대해 제1 방어선 중 하나를 형성한다. IgM은, 사람 순환계에서 물리적으로 월등히 큰 항체이며, 감염 과정에서 조기에 나타나고, 일반적으로 추가의 노출 후 보다 적은 정도로 다시 나타난다.

IgA의 순수 단량체 형태는 2개의 경(L)쇄들 및 2개의 중(H)쇄들로 이루어지며; 순수(true) 이량체 형태에서 2개의 이러한 단량체들은 소위 J 쇄(결합하는 쇄)에 의해 커플링된다. 혈장에서, IgA 단량체는 비공유결합적으로 회합된 IgA 이량체와 평형 상태로 존재하지만; J 쇄-함유 IgA 이량체도 또한 존재한다. 전체 이량체 IgA(즉, J 쇄-함유 순수 이량체 및 비공유결합적으로 회합된 IgA 이량체)는 전체 IgA 중의 대략 10 내지 25%를 구성한다. 점막 및 점액선의 분비에 있어서, 추가의 분비 성분(SC: secretory component)을 갖는 J-쇄 함유 IgA 이량체가 우세하다. IgA의 2개의 소-부류, IgA1 및 IgA2가 존재하며, 이는 통상적으로 사람 혈청 중에 약 80 내지 90중량% 내지 10 내지 20중량%의 상대적인 비율로 존재한다. 이러한 관계는 IgA 단리 동안 변경될 수 있다. 면역글불부린 제제에서 κ 대 λ 경쇄의 천연 비는 대략 1:1에 해당한다. IgA 만이 정상 사람 혈청의 전체 단백질의 대략 3 내지 4%를 나타낸다.

IgM은, 다수의 단량체가 주로 오량체로서 그러나 또한 육량체로서, 이황화물 결합과 함께 공유결합적으로 연결되는 중합체를 형성한다. J 쇄는 오량체성 IgM에서 발견되지만 육량체 형태에서는 발견되지 않고, 이는 육량체성 복합체 내의 공간 제약에 기인하는 것일 가능성이 있다. 오량체성 IgM은, 또한, J 쇄의 부재 하에 제조될 수 있다. 현재, 정상의 오량체의 어느 분획이 J 쇄를 함유하는지는 여전히 불확실하며, 이 정도로 J 쇄-함유 오량체가 하나 이상의 J 쇄를 함유하는지도 불확실하다[참조: Erik J. Wiersma et al. (1998) J. Immunol. 160: 5979-5989]. IgM은 거대 분자이므로; 이는 잘 확산될 수 없고, 간질에서 극소량으로만 발견된다. IgM은 주로 혈청에서 발견되지만, J 쇄의 존재로 인하여, 이는, 또한, 분비성 면역글로불린으로서 중요하다. 이의 중합체성 특성으로 인하여, IgM은 높은 결합활성(avidity)을 지니며, 상보체 활성화에 특히 효과적이다.

지난 세기 동안에, 면역글로불린 제제는 다양한 감염성 질환의 예방 및 치료에 성공적으로 사용되었다. 전통적으로, 면역글로불린 제제는 전신계 투여용으로 개발되었으며, IgG를 대량으로 포함하였다. 그러나, 유아 설사의 예방 및 치료용의 우유의 성공적인 사용은 혈장 및 점액성(분비성) IgA의 잠재적인 이점을 강조하였다[참조: Hammarstrom L. et al. (1994) Immunol. Rev. 139: 43-70].

Eibl 등에 의해 수행된 임상 시험[참조: Eibl, M. et al. (1988) N Engl J Med 319: 1-7]은, 혈장 유도된 IgA가 풍부한 면역글로불린 제제(IgAbulin 73% IgA 및 26% IgG)를 사용한 경구-공급이 괴사성 소장결장염의 발달을 예방할 수 있음을 나타낸다. 다른 지표, 예를 들면, 점액성 감염을 포함하는 지표는, 또한, IgA를 사용한 치료로부터 이로울 수 있다. 그러나, IgAbulin은 더 이상 이용할 수 없고, 현재 이용가능한 IgA-생성물은 존재하지 않는다.

면역글로불린의 단리 및 정제를 위한 공지되어 있고 일반적인 방법은, 주로, 예를 들면, 분자 질량, 등전점, 상이한 조건 하에서의 가용성과 이 같은 그룹에 속하는 분자의 물리화학적 및 생물학적 특성을 기반으로 하며; 또한, 일부 물질(예를 들면, 세균성 A- 및 G-단백질)에 대한 이들의 친화성은 고려되어야만 한다. 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피, 투석, 염 및 유기 용매에 의한 침전은, 면역글로불린 분자의 상이한 특성을 기반으로 한다. 문헌에 기술된 가장 광범위하게 사용되는 프로토콜은 몇몇의 접근법을 조합한다.

혈장 혼주물(pool)로부터 면역글로불린을 단리하기 위한 통상적인 과정은, 일반적으로, 예를 들면, Cohn에 의해 개발된 바와 같이[참조: Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley et al. (1949), J. Am. Chem. Soc. 71, 541], 에탄올 분획화로 출발한다. 원래의 Cohn 공정의 다수의 변형이 기술되어 왔다.

에탄올 침전에 대한 대안의 접근법은 Steinbuch 등에 의해 기술되어 있다(참조: Rev. Franc. Et. Clin, et Biol. 1969, XIV, 1054). 이러한 접근법은, 상청액 중에 면역글로불린을 남기는 침전을 위해 옥탄산을 사용한다. 면역글로불린은 음이온 교환체(anion exchanger), DEAE-셀룰로스를 사용하는 흡착("배치(batch)")에 의해 추가로 정제된다.

IVIG 생성물에 대해 면역글로불린이 풍부한 혈장 분획으로부터 IgG를 정제하기 위한 크로마토그래피 방법의 사용은 이미 시도되어 왔다. 특히, 별개의 단계들로의 또는 일련으로의 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피는, 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하기 위한 특허된 방법에 기술되어 있다. 대부분의 특허된 방법에서는, 음이온 교환 크로마토그래피가 네거티브 모드(negative mode)로 사용되고, 즉, 오염성 단백질, 예를 들면, IgA, IgM, 알부민, 피브리노겐, 트랜스페린의 결합을 가능하도록 하는 조건들이 사용되고, 반면, IgG는 흡착되지 않은 생성물이다. IgA 및 IgM은, 예를 들면, 이온 강도를 증가시킴으로써 이온 교환 컬럼으로부터 용출될 수 있다.

또한, 생성물의 순도를 증가시키기 위한 각종의 크로마토그래피 분리 공정이 개발되어 왔다. 최고 성능을 수득하는 것들(특히 제EP 0 703 922호, 제WO 99/64462호)은 적어도 2개의 연속적인 크로마토그래피 단계들을 포함하고, 하나는 음이온 교환을 사용하고 다른 하나는 양이온 교환을 사용하는 것이다. 이들 공정들의 특이성은, 통상의 실행 조건 하에서 IgG를 흡착시키지 않지만 예비-정제 단계 동안에 공동-정제된 다른 단백질의 대부분을 결합시키는 음이온 교환체의 특성에 의해 제공된다.

혈장 또는 이의 분획, 예를 들면, Cohn 분획 II + III으로부터의 IgG의 정제에 관한 특허 제US 6,307,028 B1호에서, 카프릴산을 이용한 전처리 후 2개의 크로마토그래피 단계들이 존재한다. 제1 단계에서, 강력한 음이온 교환체를 사용하여 IgA를 결합시키고; 제2 단계에서, 약한 음이온 교환체를 사용하여 IgM을 결합시킨다. 본 발명자들은, 이들이 IgA 및 IgM을 각각 고 염(high salt)으로 용출시킬 수 있음을 주장하고 있다.

비록 다수의 IgA 분획화 방법이 문헌에 기술되어 왔지만, 놀랍게도 IgA 면역치료요법 생성물은 약제 산업에서 거의 시판되지 않고 있다. 면역치료학적 사용을 위한 IgA의 이용가능성은 기술적 제약에 의해 제한되어 온 것으로 여겨진다. IgA의 대규모 분획화 방법은 고도로 정제된 제제(즉, 90% 초과)를 생산하는데 실패하고, 소규모 정제 방법(예를 들면, 항-IgA 친화성 컬럼)은 상업적으로 실행가능한 생성물을 제공할 수 없다. 따라서, 면역치료학적 용도에 적합한 고도로 정제된 IgA 제제를 생성하는, IgA의 대규모 정제 방법이 바람직하다. 특히, IgG가 IgA의 소염 특성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다는 사실로 인하여 IgG가 부재하는 IgA가 매우 바람직하다.

IgA는, 황산암모늄, 에탄올, 카프릴산, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 침전, 및 크로마토그래피 기술의 각종 조합을 사용하여 혈장 또는 다른 생물학적 유액으로부터 분획화될 수 있다. IgA를 단리하는데 사용된 크로마토그래피 수지들로는 DEAE 셀룰로스, 세파덱스(Sephadex) G-200, DEAE-세파덱스 A-50, 항-IgG 및 항-IgM 면역흡착제 상의 친화성 크로마토그래피, 자칼린-세파로즈(Jacalin-Sepharose), 단백질 G-세파로즈, 패스트플로우(Fastflow)-S 세파로즈, 슈퍼로스 6, 티오필릭 흡착, 세파크릴 S-300, 시아노겐 브로마이드-활성화된 세파로즈 4B에 접합된 항-IgA 항체, 단백질-A 및 단백질-G 친화성 크로마토그래피를 포함한다[참조: Cripps, A. W. et al. (1983) J. Immunol. Methods 57: 197-204; DoelIgAst, D. J. et al. (1976) Immunochemistry. 13: 135-139; Kobayashi, K. et al. (1987) Adv. Exp. Med. Biol. 216B: 1193-1197; Leibl, H. et al. (1995) Protein Expression and Purification 6: 408-410; Pejaudier, L. et al. (1972) Vox. Sang. 23: 165-175; Roque-Barriera, M. et al. (1985) J. Immunol. 134: 1740-1743]. 그러나, 이러한 기술들 중 어느 것도 이를 혈장 또는 다른 IgA-포함 물질로부터 IgA를 정제하는데 상업적으로 실행가능하도록 하는 대규모 정제 공정을 지금까지 제공하지 않고 있다.

제WO 97/25352호는, 서로로부터, 그리고 이들의 고분자 응집체로부터, 및 출발 물질 중에 이미 존재했거나 하이드록실아파타이트, 특히, 세라믹 하이드록실아파타이트를 사용하는 정제 단계 및 추가의 정제 단계 동안에 형성되었던 다른 고분자 오염 물질로부터, 면역글로불린-함유 출발 물질 중의 면역글로불린 IgG 및 IgA를 분리하는 방법을 기술하고 있다. 당해 특허 출원에 기술된 공정이 IgA-포함 용액의 대규모 생산에 적합하지만, 이는, 개선된 공정을 개발하는데 바람직하도록 하는 몇몇의 단점을 갖는다. 예를 들면, 출발 물질로서 사용된 물질은 분획 II+III으로부터 수득된 Cohn 분획 III이며, 이는, 당해 분획이 이후 IgG 생산을 위해 사용될 수 없으므로, 상업적으로 거의 매력적이지 않음을 의미한다. 또한, 수득되는 IgA 용액은 허용가능한 순도의 제제를 달성하기 위해 몇몇의 추가 정제 단계(크로마토그래피)들을 필요로 한다.

따라서, 본 출원인은 IgA-포함 조성물 및/또는 면역글로불린-함유 물질로부터 면역글로불린 A 및 M을 제조하기 위한 신규의 크로마토그래피 공정을 개발하였다. 유리하게는, IgG의 정제 및 단리를 위한 공정 동안에 수득되는 부수적 분획(side fraction) 및/또는 폐기물 분획을 IgA(및 IgM)의 단리 및 정제에 사용할 수 있다.

신규 방법은, 문헌에 기술되어 있는 다른 방법들과 비교하여 몇몇의 장점을 제공한다. 당해 방법은, 염 구배없이 단순한 순차적이고 선택적인 용출을 특징으로 한다. 약산성 내지 약 알칼리성 조건에서 디카복실산 및/또는 디하이드록시-디카복실산, 및 하이드록시-트리카복실산(또는 이의 염)의 사용은, 음이온 교환 수지의 하전된 표면에 대해 고도로 경쟁적인 작용을 허용한다. 또한, pH는 각각의 피크 분획의 용출 동안 일정하게 유지된다. 또한, 용출 완충액의 pH는 일정하게 유지된다.

당해 공정은 면역글로불린을 소분획으로 분리할 수 있으며, 이러한 소분획은, 매우 순수한 IgA 및 IgM 농축물을 생산하기 위한 출발 물질로서 작용할 수 있다. 또한, 당해 공정은, 별도의 소분획 중에서 단량체성 및 이량체성/중합체성 면역글로불린을 농축시킨다. 당해 방법에 의해, 1회의 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 면역글로불린의 몇몇의 유용한 농축물을 생산하는 것이 가능하며, 이어서, 이는 추가로 가공되어 필요에 따라 단량체성 IgA, 또는 이량체성 IgA가 농축된 조성물을 수득할 수 있다. 유리하게는, 기술된 방법은, 매우 순수한 IgA의 제조를 위한 당해 분야의 정제 방법의 현재의 상태보다 유의한 개선을 제공한다.

본 발명의 요약

따라서, 본 발명의 한 양상은,

(a) IgA가 결합하도록 하는 조건 하에서 음이온 교환체(anion exchanger)에 조성물을 부하(loading)하는 단계;

(b) 2개 이상의 산 그룹을 지닌 물질을 포함하는 알칼리성 용출 용액을 적용시키는 단계를 포함하는, IgA-포함 조성물로부터 IgA를 농축시키는 방법이고, 여기서, 상기 단계 (b) 동안에 용출된 단백질에는 단량체성 IgA가 농축된다.

바람직하게는, 단계 (a)와 단계 (b) 사이에, 저 전도도 용액을 상기 음이온 교환체에 적용시킴으로써 예비-용출 단계 (a1)이 수행된다. 바람직하게는, 상기 단계 (a1)은 약산성 내지 중성 pH에서 수행된다.

바람직하게는, 단계 (b)에서의 상기 물질은, 다가의 카복실산 또는 다가의 하이드록시-카복실산 또는 이들의 염, 및/또는 포스페이트로부터 선택되고, 보다 바람직하게는, 상기 물질은, 타르타르산/타르트레이트, 옥살산/옥살레이트, 말레산/말레이트, 말론산/말로네이트와 같은 디하이드록시-디카복실산 및/또는 디카복실산 또는 이들의 염, 시트르산/시트레이트와 같은 하이드록시-트리카복실산 또는 이들의 염, 및/또는 포스페이트로부터 선택된다. 디하이드록시-디카복실산 또는 이의 염은 타르타르산/타르트레이트, 옥살산/옥살레이트, 말론산/말로네이트, 및 말레산/말레이트로부터 선택되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 디하이드록시-디카복실산 또는 이의 염은 타르타르산/타르트레이트 또는 옥살산/옥살레이트이다. 바람직한 실시형태에서, 단계 (b)에서의 알칼리성 용액의 pH는 추가의 완충액 성분, 바람직하게는 pH 7.6 ± 0.4에서 트리스 완충액을 1 내지 20mM, 바람직하게는 2 내지 15mM, 보다 바람직하게는 5 내지 10mM의 최종 농도로 첨가함으로써 안정화된다.

바람직하게는, 단계 (b) 동안에 수집된 용출물에는 필수적으로 IgM이 부재한다.

본 발명의 다른 양상은, 추가의(임의의) 단계 (c), 음이온 교환체에 대한 강력한 경쟁인자를 포함하는 산성 용출 용액을 적용시킴으로써 수행되는 추가의 용출 단계를 갖는 상기에 기술되어 있는 방법이다. 바람직하게는, 단계 (c)에서 용출된 단백질에는 이량체성 IgA가 농축된다.

바람직하게는, 단계 (c)에서 음이온 교환체에 대한 강력한 경쟁인자는 시트레이트, 벤젠설폰산, 벤조산, 및 황산수소의 염 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 음이온 교환체에 대한 강력한 경쟁인자는 시트레이트이다.

본 발명의 방법에 사용된 음이온 교환체는 강한 음이온 교환체 또는 약한 음이온 교환체일 수 있다. 바람직하게는, 음이온 교환체는 4급 암모늄, 4급 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸, 또는 디메틸아미노에틸과 같은 음이온 교환 리간드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 음이온 교환체는 MPHQ, DEAE 세파로즈 FF, Q 세파로즈(HP 및 FF), ANX 세파로즈 FF(저 치환 및 고 치환됨), 캡토(Capto) Q, 캡토 Q XP, 캡토 DEAE, 캡토 ANX, 마크로(Macro) Cap Q, 소오스(Source) 30 Q 및 15 Q, Q 하이퍼 셀(Hyper Cel), 기가 캡(Giga Cap) Q 650M, QAE 550 C, DEAE 바이오겔(Biogel) A, 프럭토겔(Fractogel) DEAE, 프럭토겔 TMAE 및 프럭토겔 DMAE로부터 선택된다.

바람직하게는, IgA-포함 조성물은 혈액, 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유액이거나 이들로부터 유도된다. 보다 바람직하게는, IgA-포함 조성물은 혈장 분획화 동안에 또는 혈장으로부터의 IgG의 정제 동안에 수득된 중간체 또는 부수적 분획이다.

본 발명의 바람직한 양상에서, IgA-포함 조성물은 IgG 정제 공정에서의 중간체이며, 본 발명의 방법에서 사용되는 이온 교환체는 IgG 생산 공정의 일부이다. IgG는 음이온 교환체의 통과액(flow-through) 중에서 주로 발견될 것이고, 반면, IgA는 상기에 기술되어 있는 방법에 따라 용출된다.

본 발명의 다른 바람직한 양상에서, IgA-포함 조성물은 침전물을 용해시킴으로써 수득된다. 바람직하게는, 침전물은 IgG 정제 동안에 수득된 옥탄산 침전물이다. 옥탄산 침전물의 상청액은 일반적으로 추가로 가공하여 IgG를 정제한다. 바람직하게는, 가용화 단계는 IgA 및 IgG를 선택적으로 용액화시킨다. 바람직하게는, 가용화는, 전도도가 1 내지 15mS/cm이고, pH가 3.5 내지 6 또는 7 내지 9.5인 용액을 사용하여 수행된다. 보다 바람직하게는, 가용화는, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 트리스 완충액, 및/또는 이들 완충액 중 2개 이상의 조합물로 수행된다. 더욱 더 바람직하게는, 완충액은 0.22M 아세테이트 완충액 또는 0.15M 포스페이트 완충액, pH 4.8로부터 선택된다.

바람직하게는, 완충액 및 중간체 침전물은 1:5 내지 1:12의 비로 사용된다.

본 발명의 다른 양상은, 연속적인 용출에 의해 단량체성 및 이량체성 IgA를 분리하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 용도이다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은, IgA-포함 조성물로부터, IgA가 농축된 분획을 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 수득된 분획으로부터, 고도로 순수한 IgA 농축물이 치료학적 용도를 위해 생산될 수 있다. 당해 방법은 약산성 내지 중성 pH에서 수행됨으로써, IgA는 크로마토그래피 지지체 위에 보유되는 것이 가능하며, 이 동안 대부분의 IgG는 비교적 순수한 형태로 통과액 속에 수집되는 단일의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 이후에, 보유된 IgA 및 다른 오염물질은 약산성 내지 알칼리성 pH에서 순차적이고, 선택적인 용출을 사용하여 분획화한다. 본 발명은 또한 단량체성 및 이량체성 IgA의 분리를 위한 크로마토그래피 공정에 관한 것이다.

IgA-포함 조성물은 임의의 물질, 바람직하게는 IgA를 함유하는 생물학적 유액일 수 있다. 바람직하게는, IgA-포함 조성물은 혈액, 혈장 또는 혈청이거나 이로부터 유도된다. IgA-포함 조성물은 페이스트 또는 침전물, 바람직하게는 예를 들면, 문헌[참조: Cohn / Oncley(Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley et al. (1949), J. Am. Chem. Soc. 71 , 541]에 기술된 바와 같은 냉 에탄올 분획화 공정으로부터의 분획(FI+II+III), (FII+III), 또는 FIII, 또는 키스틀러(Kistler) 및 니츠크만(Nitschman) 공정[참조: H. Nitschmann et al (1954) Helvetica Chimica Acta 37, 866-73], 또는 이의 변형에 기술된 바와 같은 침전물 A, 침전물 B 및 침전물 G의 용액일 수 있다.

IgA-포함 조성물은 바람직하게는 혈장, 또는 어떠한 IgA를 포함하는 중간체 또는 폐기물 분획으로부터 출발하여 옥탄산-, 폴리에틸렌 글리콜- 및/또는 암모늄 설페이트 침전을 사용한 IgG의 정제 동안 수득된 중간체 침전물의 용액, 또는 중간체 용액, 또는 폐기물 분획이다. 그러나, 다른 IgA를 함유하는 출발 물질을 사용하는 방법 또한 본 발명에 포함될 것으로 의도된다. 예를 들어, IgA는 또한 본 발명의 방법을 사용하여 우유 또는 타액과 같은 다른 생물학적 유액으로부터 농축될 수 있다.

바람직하게는, 출발 물질은 위에서 기술된 혈장 또는 혈장 분획으로부터 IgG의 정제를 위한 공정 동안 음이온 교환체에 적용하기 위해 제조한, 상부 공정 단계에 의해 면역글로불린이 이미 농축된 중간체 용액이다. 바람직하게는, 대부분의 IgG는 음이온 교환체에 결합하지 않고 IgG 정제를 위해 추가로 직접 가공될 수 있다. 중간체 용액 속에 함유된 IgA의 대부분을 포함하는 결합된 물질은, 이후에, 본 발명의 방법에 따라 용출될 수 있다.

침전물이 출발 물질로서 사용되는 경우, IgA는 완충액 속에 침전물을 수시간 동안 재현탁시킴으로써 침전물(공정 분획 또는 부수적/폐기물 분획)으로부터 추출될 수 있다. 바람직하게는, IgA 및 IgG는 재현탁 단계 동안에 선택적으로 용해될 것이다. 바람직하게는, 가용화는, 전도도가 1 내지 15 mS/cm, 보다 바람직하게는 5 내지 15 mS/cm인 용액을 사용하여 수행한다. pH는 3.5 내지 6, 또는 7 내지 9.5이다. 산성 pH가 선택되는 경우, 이는 바람직하게는 4 내지 5.5, 보다 바람직하게는 4.5 내지 5.2, 가장 바람직하게는 대략 4.8이다. 알칼리성 pH가 선택되는 경우, 이는 바람직하게는 7 내지 9, 보다 바람직하게는 7.5 내지 8.5이다. 바람직하게는, pH가 약 4.8인 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 또는 트리스 완충액이 사용되는 경우, 2개 이상의 이러한 완충액의 조합물도 또한 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 가용화는 0.1 내지 0.2M, 바람직하게는 0.15M 포스페이트 완충액, 또는 0.1 내지 0.3M, 바람직하게는 0.2 M 아세테이트 완충액으로 pH 4.8에서 수행된다. 그러나, 숙련가는 추가의 적합한 완충액을 확인할 수 있을 것이다. 완충액 및 침전물의 비는 약 1:5 내지 1:12, 바람직하게는 1:5, 1:7, 1:10 또는, 1:12이지만, 다른 비도 또한 사용될 수 있다. 가용화는 적어도 2시간, 바람직하게는 적어도 4시간, 더욱 더 바람직하게는 밤새, 적합한 혼합기[예: 예를 들면, 그라버(Graber)로부터의 비브로 혼합기(Vibro mixer) 또는 예를 들면, 에카토(Ekato)로부터의 비스코프로프(Viscoprop)]를 사용하여 강력한 교반 하에 수행된다.

임의로, 정화 단계는 용해 후에, 예를 들면, 심층 여과(depth filtration)로 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 제1 단계는 IgA-포함 조성물을 음이온 교환체로 부하하는 것이다. 음이온 교환체는 컬럼, 막, 어떠한 유형의 매트릭스, 수지 또는 다른 기재 물질로서 제공될 수 있으며 음이온 교환 액체를 포함한다. 본 발명의 방법은, 이것이 IgA가 부하 국면(phase) 동안에 음이온 교환체 상에 보유될 수 있도록 하는 반면, IgG는 비교적 순수한 형태로 통과액 속에 수집되는 조건하에서 수행되는 한, 임의의 유형의 음이온 교환체, 약하거나, 강하거나 혼합된 방식의 음이온 교환체로 수행할 수 있다.

음이온 교환체 리간드는 양성으로 하전된 그룹이다. 예를 들어, 음이온 교환체는 4급 암모늄, 4급 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸, 또는 디메틸아미노에틸과 같은 그룹을 리간드로서 포함할 수 있다. 적합한 음이온 교환체의 예는 MPHQ, DEAE 세파로즈 FF, Q 세파로즈(HP 및 FF), ANX 세파로즈 FF(저 치환 및 고 치환됨), 캡토 Q, 캡토 Q XP, 캡토 DEAE, 캡토 ANX, 마크로 캡 Q, 소오스 30 Q 및 15 Q, Q 하이퍼 셀, 기가 캡 Q 650M, QAE 550 C, DEAE 바이오겔 A, 프럭토겔 DEAE, 프럭토겔 TMAE 및 프럭토겔 DMAE이다. 가장 바람직한 음이온 교환체는 MPHQ 또는 프럭토겔 DEAE MD이다.

부하는, IgA가 음이온 교환체에 결합하도록 하는 조건 하에서 수행한다[단계 (a)]. 전형적으로, 음이온 교환체는 사용 전에, 2개의 완충액 시스템(평형 완충액 1 및 2)으로 흔히 평형화됨으로써, 평형 완충액 2는 부하 전에 사용된다. IgA를 포함하는 용액은 일반적으로 평형 완충액(2개의 완충액 시스템을 사용하는 경우 평형 완충액 2)과 유사한 pH 및 전도도를 갖도록 조절된다. 평형 완충액은 사용된 음이온 교환체에 대해 채택된 일반적인 완충액 시스템이다. 평형 완충액 1의 전도도는 5 내지 50 mS/cm이고, 보다 바람직하게는 5 내지 45 mS/cm이다. pH는 3 내지 8이다. 적합한 완충액의 예는 포스페이트 또는 아세테이트 완충액 또는 이의 조합물이다. 바람직하게는, 완충액은 아세테이트 완충액, pH 3 내지 5, 또는 포스페이트 완충액, pH 7 내지 8이다. 평형 완충액 1에 대한 가장 바람직한 선택은, 전도도가 약 8mS/cm인 약 0.8M 아세테이트 완충액, pH 3.5 내지 4.5, 전도도가 약 40mS/cm인 약 0.5M 포스페이트 완충액, pH 7 내지 8 또는 전도도가 약 10 mS/cm인 약 0.1M 포스페이트 완충액, pH 7 내지 8이다. 평형 완충액 2의 전도도는 0.5 내지 1.5mS/cm, 보다 바람직하게는 0.7 내지 1.3mS/cm이다. pH는 5 내지 8.5이다. 평형 완충액 2에 대한 적합한 선택의 예는 포스페이트, 아세테이트 및 이의 조합물이다. 바람직하게는, 완충액은 아세테이트 완충액, pH 6 내지 7 또는 포스페이트/아세테이트 완충액, pH 7-8이다. 평형 완충액 2에 대한 가장 바람직한 완충액은, 전도도가 약 1mS/cm인 약 10mM 아세테이트 완충액, pH 6 내지 6.6, 전도도가 약 1 mS/cm인 약 7.5mM 포스페이트 및 2.5mM 아세테이트 완충액, pH 6 내지 6.6, 또는 전도도가 약1 mS/cm인 약 5mM 포스페이트 및 10mM 아세테이트 완충액, pH 6 내지 6.6이다.

음이온 교환체를 부하한 후, 이는 전형적으로 완충액 2로 세척하여 어떠한 결합하지 않은 물질도 제거한다.

임의로, 예비-용출 단계를 수행하여 느슨하게 결합된 물질을 제거할 수 있다. 이는 포스페이트, 아세테이트 및 이의 조합물을 함유하는 완충액으로 수행할 수 있다. 본 발명에서, 예비-용출은 바람직하게는 저 전도도 용액으로, 바람직하게는 약산성 또는 중성 pH에서 수행한다. 보다 바람직하게는, 포스페이트/아세테이트 완충액이 바람직하게는 약 5 내지 15mM 포스페이트 및 15 내지 45mM 아세테이트의 농도, 보다 바람직하게는 약 10mM 포스페이트 및 30mM 아세테이트의 농도에서 사용된다. 예비-용출 완충액의 pH는 약 6.0 내지 6.8이고, 바람직하게는 6.0의 pH가 사용되지만, 숙련가는 다른 적합한 완충액을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서, 예비-용출 분획(들)은 주로 IgG를 함유하며, IgA-포함 조성물이 IgA의 양과 비교하여 높은 양의 IgG를 함유하는 경우 예비-용출이 바람직하게 사용된다.

최적의 예비-용출 단계 후, 당해 완충액은 제1의 용출 완충액으로 변화된다[단계 (b)]. 본 발명의 발명자들은 다가의 카복실산 또는 다가의 하이드록시카복실산, 바람직하게는 디하이드록시-디카복실산 또는 하이드록시-트리카복실산, 또는 이들의 염을 사용하여, 제1의 용출 동안 수집된, 물질, 전형적으로 분획(들) 속에서 IgA, 주로 단량체성 IgA의 우수한 농축을 생산한다. 달리는, 포스페이트 완충액을 당해 용출 단계에서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 제1의 용출 동안 수집된 물질은 필수적으로 IgM을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 알칼리성 pH, 예를 들면, 7.2 내지 9.0의 pH, 보다 바람직하게는 7.4 내지 7.8의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.6의 pH가 사용된다. 바람직하게는, 디하이드록시-디카복실산 또는 하이드록시-트리카복실산 또는 이들의 염은 타르타르산/타르트레이트, 옥살산/옥살레이트, 말론산/말로네이트, 말레산/말레이트, 또는 시트르산/시트레이트로부터 선택된다. 바람직하게는, 제1의 용출 완충액은 다가의 카복실산 또는 다가의 하이드록스-디카복실산 또는 이들의 염을 5 내지 100mM, 보다 바람직하게는 20 내지 80mM, 더욱 더 바람직하게는 25 내지 65mM, 가장 바람직하게는 약 55mM의 농도에서 함유한다. 또한, 제1의 용출 완충액은 아세트산나트륨과 같은 다른 완충액 물질을 함유할 수 있다. 예를 들면, 제1의 용출 용액은 1 내지 20mM의 아세트산나트륨, 바람직하게는 1 내지 10mM의 아세트산나트륨, 가장 바람직하게는 약 5 mM의 아세트산나트륨을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 제1의 용출 용액은 pH 7.6 ± 0.4에서 추가의 완충액 성분, 바람직하게는 트리스(Tris)를 1 내지 20mM, 바람직하게는 2 내지 15mM, 보다 바람직하게는 5 내지 10mM의 최종 농도로 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 제1의 용출 용액의 바람직한 pH 및 전도도를 달성하기에 적합할 다른 물질 및 적합한 이의 농도를 선택할 수 있을 것이다.

보다 바람직하게는, 제1의 용출 용액 중 디하이드록시-디카복실산 또는 이의 염은 타르트레이트 또는 옥살레이트이고, 가장 바람직하게는 이는 타르트레이트이다.

바람직하게는, 제1의 용출 동안에 수집된 물질은 단량체성 IgA이 풍부하고 IgM이 필수적으로 부재하며, 즉, IgM이 고갈되어 있다.

본 발명의 보다 바람직한 실시형태에서, 제2의 용출 단계인 추가의 단계 (c)가 수행된다. 단계 (c)에서 용출된 물질, 전형적으로 분획(들)은 J-쇄를 함유하는 IgA를 포함하는 이량체성 IgA가 농축되어 있다. IgM이 IgA-포함 조성물 속에 존재하는 경우, IgM은 또한 당해 단계에서 유사하게 용출된다.

제2의 용출 단계가 요구되는 경우, 완충액은 이후에 제2의 용출 완충액으로 변화될 것이다. 바람직하게는, 제2의 용출 완충액은 음이온 교환체에 대한 강한 경쟁인자를 함유함으로써 음이온 교환체로부터 결합된 단백질을 대체할 것이다. 이러한 강한 경쟁인자의 예는 시트레이트, 벤젠설폰산, 벤조산, 및 황산수소의 염 또는 이의 혼합물이다. 가장 바람직한 경쟁인자는 시트레이트이다. 바람직하게는, 제2의 용출 완충액의 pH는 약 3.0 내지 6.0, 보다 바람직하게는 약 4.5 내지 5.5, 가장 바람직하게는 pH는 5.0이다. 바람직하게는 제2의 용출 완충액 중의 시트레이트의 농도는 1 내지 100mM, 보다 바람직하게는 1 내지 50mM, 더욱 더 바람직하게는 약 25mM이다. 또한, 제2의 용출 완충액은 포스페이트와 같은 다른 완충액 물질을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 농도는 40 내지 50mM이다. 가장 바람직하게는, 제2의 용출 완충액은 50mM의 인산나트륨 및 25mM의 시트레이트를 5.0의 pH에서 함유할 수 있다.

IgA가 농축되거나, 단량체성 IgA가 농축되거나, 바람직하게는 이량체성 IgA가 농축된 물질 또는 분획을 이후에 경우에 따라 혼주시키고 임의로 추가로 가공한다. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 예를 들면, IgM으로부터 이량체성 IgA 및 단량체성 IgA를 분리하고, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 나머지 IgG 및/또는 IgM(예를 들면, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, CaptureSelect IgM)을 제거할 수 있고/있거나 제2의 이온 교환 크로마토그래피를 불순물[예를 들면, 음이온 교환체, 대부분 바람직하게는 모노리쓰(monolith) 에틸렌 디-아민(EDA)]의 분리를 위해 사용할 수 있다. 다른 단계들은 숙련가가 바람직한 순도를 유도하도록 설계할 수 있다.

또한, 어떠한 병원체, 예를 들면, 바이러스 또는 프리온 단백질을 제거하기 위한 단계가 어떠한 상업적 공정에서도 포함될 것이다. 이러한 공정 단계는 기술자에게 잘 공지되어 있으며 나노여과, 용매/세제 처리, 저온살균법, 및 다른 것과 같은 방법으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 제2 용출 단계에서 용출되는, 이량체성 IgA로부터, 제1의 용출 단계에서 용출되는 단량체성 IgA의 분리를 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 용도를 제공한다. 동일하게 적합한 조절을 다른 면역글로불린 동형에 대한 출발 물질에 대해 적용시킬 수 있었음이 고려된다. 이는 산업적 규모로 수행되어 단량체성 및 이량체성 또는 중합체성 면역글로불린의 분리를 제공할 수 있는 공정에 대해 도전적인데, 그 이유는, 분리할 필요가 있는 단백질의 특성이 매우 유사하고 산업적 규모로 사용하기에 적합한 공정에 의한 분리에 일반적으로 처리할 수 없기 때문이다.

본 발명의 추가의 양상은 본 발명의 방법으로 수득가능한 조성물, 및 이로부터 수득된 생성물이다. 이러한 조성물은 예를 들면, 추가의 정제 단계에 의해, 및/또는 제형에 의해 추가로 가공될 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체가 첨가될 수 있으며, 경우에 따라 안정화제가 첨가될 수 있고, 증점제 또는 점도-감소제가 경우에 따라 첨가될 수 있다. 동결건조 또한 선택 사항이다. 적합한 제형은 생성물의 바람직한 의학적 용도에 따라 선택될 것이다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, IgA는 사람 혈장으로부터 IgG를 정제하는 공정 동안 수득될 수 있는 부수적 분획 및/또는 폐 물질로부터 수득된다. 전형적으로, 다수의 공여자로부터의 혈장 시료를 혼주시키고, 사용할 때까지 동결시킨다. 이후에, 혈장을 해동시키고, 원심분리하고, 에탄올 분획화를 콘(Cohn), 또는 키스틀러 니츠크만에 따라, 또는 이의 변형에 따라 상청액[냉동-결핍성 혈장(cryo-poor plasma)]에서 수행한다. 일반적으로, pH를 특정 범위로 조절하고 에탄올을 특정 농도로 가하면, 침전물이 수 시간의 항온처리 동안에, 전형적으로 4℃에서 형성되며, 침전물과 가용성 부분이 분리되어 추가의 가공을 위해 사용된다. 당해 단계는, 바람직한 침전물 및 용액이 수득될 때까지 고 에탄올 농도를 지닌 가용성 부분에서 전형적으로 반복된다.

면역글로불린을 함유하는 침전물은 전형적으로 0.1 내지 0.3M, 바람직하게는 0.2M 아세테이트 완충액(pH 4.8)을 사용하여, 밤새 교반하면서 용해시킨다. 이후에, 옥탄산 침전을 수행하고, 상청액을 IgG의 정제를 위해 추가로 가공한다. 침전물은 IgA를 함유하며 가용화될 수 있고 이후에 본 발명의 방법에 따라 추가로 가공될 수 있다.

위에서 언급한 바와 같이, 상청액을 사용하여 혈장 IgG를 추가로 정제한다. 전형적으로, 완충액 변화를 수행하고, 이후에, 물질을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용한다. 정제된 IgG를 통과액 속에 수집하고, IgG를 정제하는 것이 단지 바람직한 경우, 음이온 교환체에 결합된 단백질을 엄격한 조건(harsh condition)(예를 들면, 1M NaCl 또는 1M NaOH)을 사용하는 세정 과정 동안 제거하고, 버린다.

그러나, IgA를 추가로 정제하는 것이 바람직한 경우, 음이온 교환체를 이후에 위에서 기술한 바와 같이 용출시켜 단량체성 및/또는 이량체성 IgA가 농축된 용출물을 수득할 수 있다. 경우에 따라, IgM을 또한 회수할 수 있다. 전형적으로, 적합한 세척 단계 후에, 예비-용출을 포스페이트/아세테이트 완충액, pH 6.0을 사용하여 수행한다. 예비-용출 동안 수집된 물질은 F3로 명명되며, 주로 IgG를 함유한다.

전형적으로, 제1 용출을 이후에 타르트레이트/아세테이트 완충액, pH 7.3 내지 7.8을 사용하여 수행한다. 당해 단계 동안에, 단량체성 IgA가 농축되어 있지만, 또한 IgG도 함유하는 물질 F4가 용출된다. 유리하게는, 당해 물질에서 IgM이 발견되지 않는다. 위에 기재된 바와 같이, 다른 완충액을 또한 본 발명에서 사용할 수 있다.

경우에 따라, 이후에 제2의 용출 단계를 시트레이트/포스페이트 완충액을 약 5의 pH에서 수행한다. 당해 단계를 위한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 완충액이 위에 기재되어 있다. 제2의 용출은 물질 F5를 제공하며, 당해 물질은 IgG, IgA 및 IgM을 함유한다. 당해 물질에서 이량체성 IgA가 농축된다.

병원체 불활성화 및/또는 제거 단계, 예를 들면, 나노여과를 당해 공정에서 적절한 단계에 혼입하여 수득되는 물질의 안전성을 보증할 것이다. 병원체 불활성화 및 제거를 위한 많은 방법들이 기술되어 왔으며, 숙련가는 이러한 단계를 공정내로 과도한 부담없이 혼입시킬 수 있을 것이다.

위에서 언급한 바와 같이, 옥탄산 침전물은 또한 본 발명의 방법을 위한 적합한 출발 물질이다. 본 발명의 발명자들은, 3.5 내지 6 또는 7 내지 9.5의 pH에서 전도도가 낮은 용액을 사용한 가용화가 IgA 및 IgG를 우선적으로 용액 속으로 용해시킴을 유리하게도 발견하였다. 예를 들면, 다른 완충액이 사용될 수 있지만, 완충액은 아세테이트 또는 포스페이트 완충액일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태는 IgA-포함 조성물 및/또는 면역글로불린을 함유하는 물질로부터 IgA(및 IgM)을 분리하는 방법이며, 이에 의해 당해 방법은:

(i) IgA-포함 조성물을 거대다공성(macroporous) 음이온 교환 수지에 부하시키는 단계,

(ii) IgA를 순차적인 선택적 탈착/용출 후, 교환 수지로부터 분리하는 단계,

(iii) 순차적인 용출이

A) 약산성 내지 중성 pH에서 예비 용출 단계로 IgG 분획을 생성하고,

B) 약알칼리성 pH에서 디카복실산 또는 디하이드록시-디카복실산 또는 이들의 염 및/또는 포스페이트를 사용한 제1의 용출 단계로 적어도 40 내지 60%의 단량체성 IgA 및 60% 이하의 IgG를 함유하는 분획(당해 분획에는 IgM이 고갈되어 있다)을 수득하며,

C) 하이드록시-트리카복실산 또는 이의 염, 벤젠설폰산 또는 벤조산, 및 황산수소 또는 이의 혼합물을 산성 pH에서 사용하여 대략 45%의 IgM; 25%의 IgA(주로 이량체성/중합체성), 25%의 IgG 및 면역글로불린 이외의 5%의 오염물질을 함유하는분획을 생성하는 제2의 용출 단계로 이루어짐을 특징으로 한다.

당해 방법은 혈장 분획화의 다양한 공정 내로 매우 간단한 방식으로 임의로 통합시킬 수 있으며, 항상 동일한 중간체 IgA 조성물을 생성한다.

수득되는 분획으로부터, 고도로 정제된 IgA(및 IgM) 농축물을 가능한 치료학적 적용을 위해 생산할 수 있다. 순차적이고 선택적인 용출은 파일럿 플랜트 규모(pilot plant scale)에서 이미 평가되어 왔다.

정의

용어 "IgA-포함 조성물"은 IgA를 함유하는 어떠한 액체 조성물에 관한 것이다. 특히, 이들 조성물은 타액, 눈물, 또는 점액, 예를 들면 치료학적 목적을 위해 IgG와 같은 혈장 단백질을 정제하기 위해 혈장의 가공 동안에 수득될 수 있는 어떠한 혈장 분획 또는 부수적/폐기물 분획과 같은 생물학적 유액일 것이다. 당해 용어는 또한 시험관 내에서 생산된 IgA, 예를 들면, 모노클로날 IgA 또는 재조합적으로 생산된 IgA, 예를 들면, 세포주에 의해 분비된 IgA를 포함한다.

본 발명의 내용과 관련하여 용어 "농축하다" 또는 "농축"은 예를 들면, 정제 단계 후에, 조성물 속의 전체 단백질 함량에 대해 표적 단백질의 양의 유의적인 증가에 관한 것이다. 농축은, 표적 단백질의 순도가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 75% 이하까지 증가한 경우 달성될 수 있다.

용어 "순수한"은 표적 단백질만을 필수적으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원 명세서의 맥락에서, 용액이 90%(w/w) 이상의 IgA, 바람직하게는 95% 이상의 IgA, 보다 바람직하게는 98% 이상의 IgA를 함유하는 경우 당해 용액은 순수한 IgA용액일 수 있다.

용어 "이온 교환 크로마토그래피"는 이온들의 전하에 기반하여 이온들이 분리되도록 하는 공정에 관한 것이다. 본 발명에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 사용됨으로써, 음으로 하전된 분자(예를 들면, 이들이 음으로 하전된 도메인을 나타내는 경우, pH에서 용액 속의 단백질)는 고체 매트릭스에 공유결합으로 결합된, 양이온성 그룹(음이온 교환 리간드)에 의해 선택적으로 보유된다. 고체 매트릭스는 어떠한 적합한 담체 물질일 수 있으며, 비드(bead), 막 또는 다른 적합한 고체 지지체 구조의 형태일 수 있다. 전형적으로, 고체 매트릭스는 비드의 형태일 수 있으며, 컬럼으로서 사용될 수 있다. 그러나, 음이온 교환을 수행하는 다른 방법이 또한 본 발명에 포함된다. 그러나, 음이온 교환을 수행하는 다른 방법이 본 발명에 포함된다. 강한 음이온 교환체를 광범위한 pH 범위에 걸쳐 충전하는 반면, 약 음이온 교환체의 전하는 pH에 따라 변화시킬 수 있다.

"음이온 교환체 상에의 부하"는 음이온 교환 크로마토그래피에 적용될 용액을 이온 교환 리간드들의 고체 지지체 상의 이온 교환 리간드와 접촉하게 하는 것을 의미한다. 통상적으로 본원 명세서의 맥락에서 당해 용어는 크로마토그래피 단계 동안의 컬럼 공급물에 대해 말해지는 것일 수 있다. 그러나, 이미 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 음이온 교환체에 대한 컬럼 구성(column configuration)에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이는 또한 배치 방식으로 수행될 수 있었다.

용어 "통과액"은 크로마토그래피 단계 동안에 보유되지 않는 물질을 말한다. 본원 명세서의 맥락에서, 이는 음이온 교환체에 결합되지 않거나 단지 느슨하게 결합되는 분획이다. 어떠한 제공된 음이온 교환체에 대한 통과액은 사용된 완충액 시스템에 따라 변할 것이다.

용어 "용출액(eluate)"은 음이온 교환체에 의해 결합되었지만, 이후에, 조건의 변화 후, 즉 "용출 용액(elution solution)"이 음이온 교환체에 적용된 후, 음이온 교환체로부터 방출되는 물질을 말한다. 용출액은, 용출 용액이 음이온 교환체에 적용된 후의 분획들 속에 통상적으로 수집된다.

용어 "중성 pH"는 약 7의 pH를 말한다. 전형적으로 6.0 내지 7.5의 범위, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 범위, 보다 바람직하게는 6.8 내지 7.2의 범위, 가장 바람직하게는 6.9 내지 7.1의 범위가 중성인 것으로 고려될 수 있다.

용어 "약산"은 약 4.0 내지 6.5의 pH 범위, 바람직하게는 5.0 내지 6.0의 범위, 보다 바람직하게는 5.5 내지 6.0의 범위를 말할 수 있다.

용어 "저 전도도"는 15 mS/cm 이하, 바람직하게는 10 mS/cm 이하의 전도도를 말한다.

용어 "IgM이 필수적으로 부재하는"은 존재하는 전체 단백질 중 10% 미만의 IgM (w/w), 바람직하게는 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 IgM을 말한다.

용어 "생물학적 유액"은 젖, 타액, 점액, 눈물과 같이, 신체로부터 배출되거나 분비되는 유액을 포함하는, 척추동물의 신체 내부로부터 유도된 액체를 포하한다.

용어 "혈장"은 혈액의 액체 성분(전체 혈액 용적의 약 55%)을 말한다. 이는 알부민과 같은 혈장 단백질, 면역글로불린(항체), 응괴 인자, 호르몬, 및 글루코스 또는 무기 이온과 같은 다른 성분을 함유한다.

용어 "혈청"은 피브리노겐 및 응괴 인자, 즉, 응괴가 일어난 후 액체 분획이 고갈되어 있는 혈장에 관한 것이다.

용어 "혈장 분획화"는 혈장 단백질의 분리 공정에 관한 것이다. 전형적으로 이는 주요 부류의 혈장 단백질의 첫번째 분리를 허용한 후 정제를 위해 추가의 공정에 적용되는 혈장 단백질의 산업적 규모의 정제 시 초기 가공 단계에 관한 것이다.

전형적으로 분획화는, 콘, 온클레이 또는 키스틀러 니츠크만에 의해 기술된 바와 같이 또는 이의 변형에 의해 에탄올로 수행된다. 다른 분획화 방법은 옥탄산, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 황산암모늄과 같은 다른 제제를 사용한 침전을 기준으로 한다.

용어 "중간체 침전물"은 혈장 단백질을 위한 하부 정제 공정 동안에 수행될 수 있는 다른 침전 또는 혈장 분획화의 결과인 침전물에 관한 것이다. 이는 상이한 혈장 단백질들의 혼합물을 전형적으로 함유한다.

용어 "침전물의 가용화"는, 침전물 속에 함유된 단백질을, 추가의 정제 단계를 위해 용액으로 되돌리기 위해, 침전물에 대해 액체, 전형적으로 완충액을 첨가하는 것을 말한다.

용어 "부수적/폐기물 분획"은 일반적으로 추가로 가공되지 않는, 즉 폐기되는, 혈장 분획화 또는 하부-스트림 공정의 중간체에 관한 것이다.

본 발명은, 이제, 다음의 도면들을 참조하여, 하기의 비-제한적인 실시예에 의해 나열할 것이다:
도 1: 혈장 분획화의 상이한 중간체 침전물 또는 혈장으로부터의 IgG의 정제 동안 수득된 부수적 분획을 기준으로 한 IgA 농축 공정의 흐름도이다. 2개의 출발 물질이 예시되어 있다(실시예 1에서의 방법 1 및 실시예 2에서의 방법 2).
도 2: 도 1에 나타낸 방법 1에 따라서, 음이온 교환 크로마토그래피에 대해 부하된 물질(공급물 원료)의 조성물의 HPLC 분석. x-축은 용출 시간을 나타내고, y-축은 280nm(mAu 밀리-흡착 단위)에서 흡광도를 나타낸다.
도 3: x-축 상의 밀리리터로의 보유 용적, 및 y-축 상의 280nm(mAu: 밀리-흡착 단위)에서의 흡광도를 나타내는, 음이온 교환 컬럼의 용출 프로파일. 용출 용액은, 상기 프로파일에서 나타내고, 수직선은, 컬럼에 적용된 용액의 변화를 나타낸다.
도 4: 방법 1에 따른 분획 F4A의 조성물의 HPLC 분석.
도 5: 친화성 크로마토그래피에 의한 IgG의 제거 후 F4의 조성물의 HPLC 분석.
도 6: 친화성 크로마토그래피에 의한 IGg 및 IgM의 분획 F5의 조성물의 HPLC 분석.
도 7: 용출 완충액 1로서 상이한 완충액을 사용하는, 음이온 교환 컬럼의 공정의 용출 프로파일. 수직 파선(dashed vertical line)은, 컬럼에 적용된 용액의 변화를 나타낸다. ^*아세테이트 완충액 용출을 위한 부하는 감소되었다.
도 8: 전체의 부하된 단백질에 대해 상이한 용출 완충액으로 용출 1을 수행하는 경우 수득된 분획 중의 IgA 및 IgM의 함량의 분석.

실시예

다음 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해 제공되지만, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

다음의 실시예들에서, 혈장 및/또는 혈장 분획으로부터의 IgG 정제 공정으로부터 유도되는 물질은 본 발명을 위한 출발 물질로서 사용된다. 도 1은 IgG 정제 공정의 흐름도를 나타내며, 공정에서 본 발명에 따른 IgA 정제 방법이 도입될 수 있는 예를 나타낸다.

요약하면, 다음의 단계를 수행하여 혈장으로부터 IgG를 정제한다: 혈장 또는 냉동-결핍성 혈장을, 예를 들면, Cohn 또는 Kistler-Nitschmann에 따라 냉 에탄올 분획화하고, 면역글로불린-함유 분획을 추가로 가공한다. 옥탄산 침전을 수행하고, 이어서, IgG의 대부분을 함유하는 현탁액을 여과, 바이러스 불활성화, 및 음이온 교환(AIEX) 크로마토그래피에 적용시킨다. 대부분의 IgG를 AIEX 통과액 중에서 수집하고, 최종의 제형 및 포장을 포함하여 추가로 가공한다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 IgA 정제 방법은 냉 에탄올 분획화, 예를 들면, FI+II+III, FI의 상청액, FII+III, 침전물 A, 또는 이들의 소분획으로부터 분기될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 옥탄산 침전물(옥탄산 케이크)로부터 가용화된 물질을 본 발명의 방법에 적용시키거나, 음이온 교환 컬럼에 결합된 물질을 본 발명에 따른 순차적인 용출에 적용시켜 혈장 IgA를 수득한다. 후자의 물질은, 이들이 현재 폐기되므로 바람직하다. 이들 물질로부터 IgA 정제를 위한 공정을 수행하는 것은 IgG 공정을 방해하지 않으므로, IgG 또는 다른 혈장 단백질의 수율은 어떠한 방식으로도 감소하거나 절충되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 이러한 출발 물질에 한정되지 않는다.

실시예 1 : 용출 완충액 1로서 타르트레이트 완충액을 사용한 음이온 교환( AIEX ) 컬럼으로부터의 IgA 의 순차적인 용출

혈장으로부터의 IgG의 정제 공정은, 필수적으로, 도 1에 나타내고 상기에 간단히 기술한 바와 같이 수행하였다. IgG 정제 공정에서, AIEX 컬럼(MPHQ)은, 2개의 완충액으로, 처음 두 컬럼 용적(CV)의 경우, 0.78M 아세트산나트륨, pH 4.0 ± 0.1, 8 내지 10mS/cm의 전도도, 이어서, 8 CV 10mM 아세트산나트륨, pH 6.5 ± 0.1, 0.8 내지 1.2mS/cm의 전도도를 사용하여 평형화한다. 도 2는 AIEX 공급 원료 조성물을 나타내며, 이는 AIEX 컬럼(수지 L당 약 180g의 단백질)에 부하하고, 그 후, 2 CV 평형 완충액 2로 세척하였다. 이러한 단계 후, AIEX 컬럼을 순차적인 용출에 적용시켰다.

따라서, 8 CV 포스페이트 아세테이트 완충액(10mM 포스페이트 + 30mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 2 내지 7mS/cm의 전도도)을 사용하여 예비-용출 단계를 수행하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 예비-용출 단계 동안에, 분획 F3이 용출되며, 이는 주로 IgG를 함유한다.

당해 예비-용출 단계 후 완충액을 제1 용출 완충액(5 내지 8 CV 55mM 타르트레이트, 5mM 아세트산나트륨, pH 7.6 ± 0.2, 5 내지 15mS/cm의 전도도)으로 변화시켰다. 타르트레이트 완충액에 대한 스위칭(switching) 후, 분획 F4를 수집하며, 이는 IgG 및 IgA를 약 60:40의 비로 함유하며, 필수적으로 IgM이 부재한다. 당해 분획 중에 용출된 IgA는 주로 단량체성 IgA이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 몇몇의 소분획(피크 분획)을 경우에 따라 당해 단계에서 수집할 수 있다. 도 4는 F4 소분획 F4A의 조성을 나타낸다. 그러나, 모든 소분획은 단지 IgG 및 단량체성 IgA를 다양한 비로 함유한다.

이후에, 제2 용출 완충액으로서 6 CV 50mM 포스페이트 및 25mM 시트레이트(pH 5.0, 5 내지 15mS/cm의 전도도)를 적용시켰다. 제2 용출 완충액에 대한 스위칭 후, 분획 F5를 용출하고, 이를 2개의 소분획(피크 분획) 중에 수집할 수 있고(도 3), 이량체성 IgA가 농축되어 있을 수 있다. 분획 F5는 IgM, IgA 및 IgG를 20 내지 30% IgA(주로 이량체성/다량체성), 35 내지 50% IgM 및 20 내지 35% IgG의 비로 함유한다.

분획 F4 및 F5를 친화성 크로마토그래피(1 또는 2 단계)로 폴리싱(polishing)하여 IgG 및 IgM을 선택적으로 제거하였다. HPLC 분석은, 분획 F4로부터 수득된 생성물이 매우 순수한 단량체성 IgA(도 5)이고, 반면, 분획 F5는 이량체성 IgA가 농축되어 있음(도 6)을 나타내었다. 따라서, 당해 용출 방법은, 분획 F4 중의 단량체성 IgA 및 분획 F5 중의 이량체성 IgA에 대한 우수한 농축을 제공한다.

다른 AIEX 물질[프락토겔, 하이퍼셀 스타(HyperCel Star) AX, Q 하이퍼셀]을, 또한, 시험하여 유사한 용출 프로파일을 제공하였다.

실시예 2: 제1 용출 단계를 위한 상이한 완충액의 시험

몇몇의 상이한 완충액을 제1 용출 단계에서 평가하였고, 타르트레이트 완충액 용출 프로파일과 비교하였다.

당해 실험은, AIEX 수지 L당 100 내지 180g의 단백질의 단백질 부하를 사용하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 필수적으로 수행하였다. 그러나, 제1 용출의 경우, 타르트레이트 완충액을 옥살레이트, 말로네이트, 말레에이트, 포스페이트, 아세테이트 완충액(55mM의 각각의 물질 + 5mM 아세트산나트륨, pH 7.6 ± 0.2)으로 대체하였다.

수득된 용출 프로파일을 도 7에 나타낸다. 분획 F4는, 적어도 2개의 산 그룹을 지닌 물질이 제1 용출에서 사용되는 한 모든 완충액에 대해 유사한 것으로 밝혀지고, 반면, 아세테이트 및 포스페이트 용출 프로파일은 매우 상이한 것으로 보인다. 그러나, 제1 용출은, 또한, 시트레이트 완충액을 사용하는 제2 용출에 영향을 미친다. 옥살레이트 완충액은 유사한 F5 피크를 생성함을 알 수 있다(도 7). 말로네이트, 말레에이트 또는 포스페이트 완충액을 사용하여, IgM은 제2 용출 동안 용출되지 않는다. 제1 용출 완충액으로서 아세테이트 완충액을 사용하여, 거의 모든 IgA 및 전체량의 IgM이 F5에서 용출된다.

총 부하된 단백질에 대한 이들 분획들 중의 IgA 및 IgM의 양은 도 8에 나타낸다. 타르트레이트 및 옥살레이트는 바람직한 용출 프로파일을 제공하며, 여기서, 단량체성 IgA는 F4에서 용출되고, IgM 및 이량체성 IgA는 F5에서 용출된다. 하이드록시디카본산을 사용한 용출만이 모든 3개의 F4 소분획 및 단량체성 IgA 용출에서 생성되었다. 포스페이트 완충액을 사용한 제1 용출 단계는, 단지 2개의 소분획 및 경감된 IgA 용출을 나타낸 반면, 아세테이트 완충액은 소량의 IgA를 지닌 F4 피크를 생성하였다. 제1 용출을 말로네이트, 말레에이트 또는 포스페이트 완충액을 사용하여 수행하는 경우, 거대 피크가 스트립 분획(strip fraction)에서 수득되며, 여기서, 엄격한 용출 조건이 사용된다(1M NaCl)

상이한 분획에서의 면역글로불린 함량을, 또한, 표 1에 나타낸다:

유리하게는, 본 발명자들은, 이러한 완충액, 예를 들면, 타르트레이트 완충액의 pH가, 트리스 완충액 pH 7.6 ± 0.4을 1 내지 20mM, 바람직하게는 2 내지 15mM, 보다 바람직하게는 5 내지 10mM의 최종 농도로 첨가함으로써 안정화될 수 있음을 발견하였다.

실시예 3: 옥탄산 침전물로부터 IgA의 용해

도 1에 나타낸 바와 같이, 옥탄산 침전물(OA 케이크)은 IgG 정제 공정 동안에 발생되는 다른 폐기물 분획이다. 당해 침전물은 유의한 양의 IgA를 함유하는 것으로 밝혀졌고, 따라서, IgA의 정제를 위한 양호한 출발 물질이다.

OA 케이크를 0.15M 포스페이트 완충액, pH 4.8과 1:6(OA 침전물 대 완충액)의 비로 혼합하였다. 그러나, 다른 완충액을, 또한, IgA 추출용으로 사용할 수 있으며, 예를 들면, 트리스 완충액을 사용할 수 있다. 가용화된 물질을 여과에 적용시키고, 이어서, AIEX 컬럼(MPHQ)에 부하하였다. 이어서, 컬럼을 필수적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 순차적으로 용출하였다. 용출 프로파일은 필수적으로 도 3에 이미 나타낸 바와 같은 것으로 여겨진다.

AIEX 컬럼에 대한 IgA-포함 공급 원료의 조성은, 기술된 실시예 1과 비교하여 IgG 대 IgA의 비에 있어서 변한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 분획 F4에서 IgG 대 IgA의 비는 IgA에 대해 이동하였다(15% : 85%). 또한, 예비-용출 분획 F3 중의 IgA의 양은 증가한다. 분획 둘 다에는 IgM이 부재한다.

이량체성/다량체성 화합물의 용출은 출발 물질의 조성으로 인하여 제한된다.

상이한 분획 중의 면역글로불린 함량은, 또한, 표 2에 나타낸다:

이것이 다른 IgA-포함하는 침전물과 함께 작용함을 나타내기 위해, 본 발명자들은, 또한, 다른 침전물을 시험하였다. IgA는, 또한, 2개의 상이한 에탄올 침전물로부터 가용화될 수 있었으며, AIEX 크로마토그래피에 적용되었고, 매우 유사한 용출 프로파일이 본 발명의 방법으로 수득되었다.

실시예 4: 단량체성 IgA의 폴리싱

순차적인 용출은, 오염물질로서 IgG를 함유하는 농축된 단량체성 IgA 분획(F4)을 생성하였다. 폴리싱 단계는 친화성 크로마토그래피(IgSelect)에 의한 IgG의 선택적 제거에 의해 수행하였다.

분획 F4를 2개의 소분획 F4A 및 F4B(도 3) 중에서 수집하였다. 그러나, 수득된 F4A 분획은 한외여과/정용여과(diafiltration)에 적용시켜 단백질을 농축시키고, 이를 중성 pH를 지닌 일반적인 완충액 시스템, 바람직하게는 PBS(포스페이트 완충된 염수)로 이전시켰다. 당해 단백질 용액을 친화성 크로마토그래피에 대한 공급 원료로서 사용하였다. IgA는 친화성 수지에 결합하지 않으며, 통과액 분획 중에 수집되었다. 결합된 IgG를 0.1M 글리신 완충액, pH 3.0으로 용출하였다. 최종적으로, IgA 생성물을 안정한, 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 도 5는 IgG(및 IgM)의 부재 하에 폴리싱된 IgA 분획을 나타낸다.

Claims (24)

1. IgA-포함 조성물로부터 IgA를 농축시키는 방법으로서, 상기 방법은,
   (a) IgA가 결합하도록 하는 조건 하에서 음이온 교환체(anion exchanger)에 IgA-포함 조성물을 부하(loading)하는 단계;
   (b) 2개 이상의 산 그룹을 지닌 물질을 포함하는 알칼리성 용출 용액을 적용시키는 단계;
   (c) 음이온 교환체에 대한 강력한 경쟁인자를 포함하는 산성 용출 용액을 임의로 적용시키는 단계를 포함하고,
   여기서, 상기 단계 (b) 동안에 용출된 단백질에는 단량체성 IgA가 농축되는, IgA-포함 조성물로부터 IgA를 농축시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 (a)와 단계 (b) 사이에, 저 전도도 용액을 상기 음이온 교환체에 적용시킴으로써 예비-용출 단계 (a1)이 수행되는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 단계 (a1)이 약산성/중성 pH에서 수행되는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 물질이, 2개 이상의 카복실 그룹을 지닌 다가의 하이드록시-카복실산 또는 이의 염, 및/또는 포스페이트로부터 선택되는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 물질이, 타르타르산/타르트레이트, 옥살산/옥살레이트, 말론산/말로네이트, 및 말레산/말레에이트와 같은 디하이드록시-디카복실산 및/또는 디카복실산 또는 이들의 염, 시트르산/시트레이트와 같은 하이드록시-트리카복실산 또는 이의 염, 및/또는 포스페이트로부터 선택되는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 디하이드록시-디카복실산 또는 이의 염이, 타르타르산/타르트레이트, 옥살산/옥살레이트, 말론산/말로네이트, 및 말레산/말레에이트로부터 선택되는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 디하이드록시-디카복실산 또는 이의 염이 타르타르산/타르트레이트 또는 옥살산/옥살레이트인, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안에 수집된 용출물에 필수적으로 IgM이 부재하는, 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 용출된 단백질에는 이량체성 IgA가 농축되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 음이온 교환체에 대한 강력한 경쟁인자가, 시트레이트, 벤젠설폰산, 벤조산, 및 황산수소의 염 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 음이온 교환체에 대한 강력한 경쟁인자가 시트레이트인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환체가 강력한 음이온 교환체 또는 약한 음이온 교환체인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 음이온 교환체가, 4급 암모늄, 4급 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸, 또는 디메틸아미노에틸과 같은 음이온 교환 리간드를 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 음이온 교환체가, MPHQ, DEAE 세파로즈 FF, Q 세파로즈(HP 및 FF), ANX 세파로즈 FF(저 치환 및 고 치환됨), 캡토(Capto) Q, 캡토 Q XP, 캡토 DEAE, 캡토 ANX, 마크로 캡(Macro Cap) Q, 소오스(Source) 30 Q 및 15 Q, Q 하이퍼 셀(Hyper Cel), 기가 캡(Giga Cap) Q 650M, QAE 550 C, DEAE 바이오겔(Biogel) A, 프럭토겔(Fractogel) DEAE, 프럭토겔 TMAE 및 프럭토겔 DMAE로부터 선택되는, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgA-포함 조성물이, 혈액, 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유액이거나 이들로부터 유도되는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 IgA-포함 조성물이, 혈장 분획화의 중간체 침전물의 용액 또는 혈장 유래의 IgG의 정제 동안에 수득된 부수적 분획인, 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 IgA-포함 조성물이 IgG 정제 공정에서의 중간체이며, 여기서, 제1항의 방법의 상기 단계 (a) 및 상기 단계 (b)가 IgG 생산 공정의 일부인 음이온 교환체에 대해 수행되는, 방법.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 IgG-포함 조성물이, 침전물을 가용화시킴으로써 수득되는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 침전물이, IgG 정제 동안 수득된 옥탄산 침전물인, 방법.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 가용화 단계가 IgA 및 IgG를 선택적으로 용액화시키는, 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 가용화가, 전도도가 1 내지 15mS/cm이고, pH가 3.5 내지 6 또는 7 내지 9.5인 용액을 사용하여 수행되는, 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 가용화가, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 트리스 완충액, 및/또는 이들 완충액 중 2개 이상의 조합물로 수행되는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 완충액이, 0.22M 아세테이트 완충액 또는 0.15M 포스페이트 완충액, pH 4.8로부터 선택되는, 방법.
24. 순차적 용출에 의해 단량체성 및 이량체성 IgA를 분리하기 위한, 음이온 교환 크로마토그래피의 용도.

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