CN116745309A

CN116745309A - 用于纯化抗-4-1bb/抗-her2双特异性抗体的方法

Info

Publication number: CN116745309A
Application number: CN202280011462.6A
Authority: CN
Inventors: 朴珠英; 崔诚玹; 崔允姬; 金元泰
Original assignee: Liu Hanyangxing
Current assignee: Liu Hanyangxing
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2023-09-12
Also published as: US20240084025A1; KR20220107968A; JP2024504388A; WO2022158889A1; EP4281467A1

Abstract

本发明提供了一种用于纯化抗‑4‑1BB/抗‑HER2双特异性抗体的方法，该方法包括用含有特定无机盐的乙酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液进行亲和层析。本发明的纯化方法提高了呈完整形式的抗体的洗脱，从而能够以高纯度和高产率提供呈完整形式的抗‑4‑1BB/抗‑HER2双特异性抗体。

Description

用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法

技术领域

本发明涉及一种用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法。更具体地，本发明涉及一种用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法，该方法包括用含有特定无机盐的乙酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液进行亲和层析。

背景技术

4-1BB蛋白是TNF-受体超家族(TNF-receptor superfamily，TNFRSF)的成员，是一种共刺激分子，在免疫细胞(先天免疫细胞和适应性免疫细胞二者)激活后表达。4-1BB在调节各种免疫细胞的活性中起重要作用。4-1BB激动剂增强免疫细胞的增殖和存活、细胞因子的分泌和CD8 T细胞的溶细胞活性(cytolytic activity)。因此，4-1BB可能是一个有希望的肿瘤免疫学靶分子。尽管抗-4-1BB抗体具有抗肿瘤作用，但它们在临床应用中可能会引起严重的肝毒性。

HER2是一种存在于细胞表面的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)，诱导癌细胞的增殖和渗透(penetration)、血管生成等。

与单克隆抗体相比，靶向两种或多种抗原的多特异性抗体有望成为具有优异治疗效果的新药。能够识别两种不同抗原(其中一种存在于癌细胞上，另一种存在于免疫细胞上)的多特异性抗体可以诱导更强(potent)的癌症特异性免疫反应。本申请人已经开发了多种特异性结合4-1BB和HER2二者的抗体，即抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体(国际专利申请号PCT/KR2020/009871)。只有在表达HER2的细胞存在时，该抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体才能激活4-1BB信号传导并增强免疫细胞。因此，由于所述特异性HER2-介导的免疫反应，预期使用双特异性抗体的肝毒性与4-1BB单克隆抗体相比大大降低。本文援引加入了申请号为PCT/KR2020/009871的国际专利申请。

发明内容

技术问题

本发明人认识到一个问题，即当根据申请号为PCT/KR2020/009871的国际专利申请的公开内容培养产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞并从中分离抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体时，产生的抗体大量以聚集体(aggregate)的形式存在。本发明人进行了各种研究以开发能够提高呈完整形式的抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的纯度的纯化方法。作为其结果，已经发现，当使用含有特定无机盐的乙酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液进行亲和层析时，可以以高纯度和高产率(high yield)获得呈完整形式的抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法，该方法包括用含有特定无机盐的乙酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液进行亲和层析。

解决技术问题的技术方案

根据本发明的一个方面，提供了一种用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法，该方法包括(a)将产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系的培养上清液过滤，以获得含粗抗体的滤液(crude antibody-containing filtrate)；(b)将滤液装载到蛋白A亲和层析柱上；和(c)用含有CaCl₂的乙酸钠缓冲液从步骤(b)的柱中洗脱抗体。

在本发明的纯化方法中，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链包含(i)由SEQID NO:9的氨基酸组成的抗-HER2抗体的重链和(ii)包含含有SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸的抗-4-1BB抗体的轻链可变区；和含有SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸的抗-4-1BB抗体的重链可变区的抗-4-1BB抗体的scFv，并且抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的轻链包含由SEQ IDNO:11的氨基酸组成的抗-HER2抗体的轻链。

在一个实施方案中，抗-4-1BB抗体的轻链可变区可以由SEQ ID NO:4的氨基酸组成；并且抗-4-1BB抗体的重链可变区可以由SEQ ID NO:8的氨基酸组成。在另一个实施方案中，抗-4-1BB抗体的scFv可以还包含由SEQ ID NO:13的氨基酸组成的接头。在另一个实施方案中，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链可以还包含(iii)由SEQ ID NO:12的氨基酸组成的接头。在另一个实施方案中，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链可以由SEQID NO:10的氨基酸组成。

在本发明的纯化方法中，CaCl₂在乙酸钠缓冲液中可以以30-500mM，优选75-125mM的浓度范围存在。并且，乙酸钠在乙酸钠缓冲液中可以以20-100mM的浓度范围存在。此外，乙酸钠缓冲液的pH值可以在3.5至4.0的范围内。

本发明的有益效果

当用含有特定无机盐即CaCl₂的乙酸钠缓冲液作为根据本发明的洗脱缓冲液进行亲和层析时，可显著提高完整形式的抗体的洗脱，从而能够以高纯度和高产率提供呈完整形式的抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体。因此，本发明的纯化方法可以以高纯度和高产率提供抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体。

具体实施方式

本发明提供了一种用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法，该方法包括(a)将产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系的培养上清液过滤，以获得含粗抗体的滤液；(b)将滤液装载到蛋白A亲和层析柱上；和(c)用含有CaCl₂的乙酸钠缓冲液从步骤(b)的柱中洗脱出抗体。

在本发明的纯化方法中，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体由重链和轻链组成，该抗体可以如申请号为PCT/KR2020/009871的国际专利申请中公开的方法制备。具体地，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链包含(i)由SEQ ID NO:9的氨基酸组成的抗-HER2抗体的重链和(ii)抗-4-1BB抗体的scFv(单链Fv)，其包含含有SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸的抗-4-1BB抗体的轻链可变区；和含有SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸的抗-4-1BB抗体的重链可变区，并且抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的轻链包含由SEQ ID NO:11的氨基酸组成的抗-HER2抗体的轻链。

在一个实施方案中，抗-4-1BB抗体的轻链可变区可由SEQ ID NO:4的氨基酸组成，并且抗-4-1BB抗体的重链可变区可由SEQ ID NO:8的氨基酸组成。在另一个实施方案中，抗-4-1BB抗体的scFv可以还包含由SEQ ID NO:13的氨基酸组成的接头。例如，抗-4-1BB抗体的scFv可以是一种多肽，其中SEQ ID NO:4的氨基酸、SEQ ID NO:13的氨基酸和SEQ IDNO:8的氨基酸按顺序连接(即N'→C')。

在一个实施方案中，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链可以还包含(iii)由SEQ ID NO:12的氨基酸组成的接头。例如，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链可以是其中SEQ ID NO:9的氨基酸、SEQ ID NO:12的氨基酸、SEQ ID NO:4的氨基酸、SEQ ID NO:13的氨基酸和SEQ ID NO:8的氨基酸按顺序连接的多肽(即N'→C')，即由SEQ ID NO:10的氨基酸组成的多肽。

本发明的纯化方法包括将产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系的培养上清液过滤，以获得含有粗抗体的滤液[步骤(a)]。产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系可以是用质粒转染的细胞(例如CHO细胞)，其中分别插入了编码抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链和轻链的多核苷酸。所述转染的细胞可以如申请号为PCT/KR2020/009871的国际专利申请中所公开的方法获得。可以根据常规方法在生物技术领域中常规使用的培养基中培养转染的细胞。培养上清液可以例如通过将产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系的培养物离心来获得。过滤可以按照常规的无菌过滤(asepticfiltration)，例如通过0.2μm膜滤器进行的无菌过滤进行。如上所述获得的含粗抗体的滤液包含约40-45％的抗体聚集体。

本发明的纯化方法包括将步骤(a)中获得的滤液装载到蛋白A亲和层析柱上[步骤(b)]。蛋白A亲和层析包括各种基于琼脂糖的树脂的使用。作为树脂，可以使用已知的基于琼脂糖的树脂，例如亲和层析树脂，如MabSelect SuRe^TMLX(思拓凡生物科技公司(Cytiva))、MabSelect^TMPrismA(思拓凡生物科技公司)、Praesto^TMjetted A50(Purolite生命科学公司(Purolite Life Sciences))等，优选是MabSelect^TMPrismA(思拓凡生物科技公司)。将步骤(a)中获得的滤液装载到填充有例如MabSelect^TMPrismA(思拓凡生物科技公司)树脂的蛋白A亲和层析柱上可以按照常规方法进行。例如，滤液可以以每毫升树脂20-40mg的比例装载，但不限于此。

本发明的纯化方法包括用含有CaCl₂的乙酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液从步骤(b)的柱中洗脱抗体(即，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体)[步骤(c)]。在乙酸钠缓冲液中，CaCl₂可以优选以30-500mM的浓度范围存在，更优选以50-500mM的浓度范围存在，还更优选以75-125mM的浓度范围存在，特别优选以约100mM的浓度存在。在乙酸钠缓冲液中，乙酸钠可以优选以20-100mM的浓度范围存在。在本发明的实施方案中，CaCl₂在乙酸钠缓冲液中可以以75-125mM的浓度范围存在，并且乙酸钠在乙酸钠缓冲液中可以以20-100mM的浓度范围存在。

乙酸钠缓冲液的pH范围可以优选为pH 3.5至pH 4.0，更优选pH为约pH 3.7。在本发明的实施方案中，CaCl₂在乙酸钠缓冲液中可以以75-125mM的浓度范围存在；乙酸钠在乙酸钠缓冲液中可以以20-100mM的浓度范围存在；并且乙酸钠缓冲液的pH范围可以为3.5至4.0。

在根据本发明的纯化方法的一个实施方案中，乙酸钠缓冲液可以是含有约100mMCaCl₂并且pH为约pH 3.7的100mM乙酸钠缓冲液。

在根据本发明的纯化方法的另一个实施方案中，乙酸钠缓冲液可以是含有约100mM CaCl₂且pH为约pH3.7的20mM乙酸钠缓冲液。

根据本发明的纯化方法获得的抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体可以通过按照常规方法进行病毒灭活和中和处理，以含抗体溶液的形式从步骤(c)的洗脱溶液中分离出来。病毒灭活可例如通过将pH调节至3.4至3.6来进行，并且中和可例如通过使用1M氨丁三醇(tromethamine)溶液来进行，但不限于此。如必要，在进行步骤(c)的工序之后，可以另外进行一种或多种色谱法，这些色谱法选自阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、混合模式色谱法和疏水作用色谱法。

将参照以下制备例和实施例更详细地描述本发明。这些制备例和实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。

制备例：抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的制备

根据申请号为PCT/KR2020/009871的国际专利申请中公开的方法，制备抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体，如下所示。

(1)抗-4-1BB scFv抗体

通过针对4-1BB的噬菌体文库免疫管淘选(phage library immunotube panning)进行筛选。为了针对靶分子淘选噬菌体文库(获自KBio Health公司和CUREBIO株式会社)，对使用人4-1BB(NCBI登录号NP_001552.2)包被的免疫管总共进行四轮淘选。

将来自3轮淘选输出的细菌菌落在96深孔板中的SB-Carbenicillin(Biomatik公司，目录号#A2311-5g)中生长直至混浊(turbid)，此时向每个孔中加入10¹¹pfu的VCSM13辅助噬菌体(K-Bio Health公司)。在37℃下轻轻摇动(80rpm)感染1小时后，加入70μg/mL卡那霉素，并将细胞在30℃下以200rpm摇动培养过夜。

第二天，将板离心，并将含有噬菌体的上清液加入到用PBST(含吐温20的磷酸盐缓冲盐水)中的3％(v/v)BSA(牛血清白蛋白)封闭的4-1BB抗原包被的ELISA平板中。在室温下孵育1小时后，用PBST将板洗涤三次，并加入抗-M13抗体(义翘神州生物技术有限公司(SinoBiological)目录号#11973-MM05)。将板孵育1小时，用PBST洗涤三次，并使用四甲基联苯胺(TMB)测量结合活性。

扩增4-1BB特异性结合物以用于质粒DNA测序。分析轻链可变区和重链可变区(VL和VH)序列以鉴定独特的序列并确定序列多样性。使用表示为BMUR的抗-4-1BB抗体(BMS公司的乌瑞芦单抗(Urelumab)，美国专利号7,288,638)比较激动活性(agonisticactivity)。作为其结果，抗-4-1BB的完整人单克隆抗体的序列如下。

表1

使用SEQ ID NO:13的(GGGGS)₄作为接头，制备具有如下表2所示的(N’)-VL-接头-VH-(C’)结构的抗-4-1BB scFv抗体，其中轻链可变区103位处的氨基酸残基“G”被“C”取代(SEQ ID NO:4)，并且重链可变区44位处的氨基酸残基“G”被“C”取代(SEQ ID NO:8)，以便通过产生二硫桥稳定scFv。具体地，将编码SEQ ID NO:4的轻链可变区的DNA、编码SEQ IDNO:13的接头的DNA和编码SEQ ID NO:8的重链可变区的DNA连接的多核苷酸插入到pcDNA3.4(英杰公司(Invitrogen)，A14697)中。使用ExpiFectamine^TMCHO试剂盒(吉布科公司(Gibco)，A29133)在37℃下将所得载体转染到ExpiCHO细胞(吉布科公司，A29127)中，然后将细胞培养8天。用0.2μm过滤器过滤培养上清液以制备具有(N’)-VL-接头-VH-(C’)结构的抗-4-1BB scFv抗体。

表2

(2)抗-HER2抗体

作为抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的HER2靶向部分，使用曲妥珠单抗的重链和轻链(基因泰克公司(Genentech)，以下简称为“HER2(野生型)”，DrugBank登录号DB00072；人IgG1κ单克隆抗体)。HER2(野生型)重链和轻链的氨基酸序列如下表3所示。

表3

(3)产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系

使用上述(1)和(2)中获得的抗-4-1BB scFv抗体和HER2(野生型)的重链和轻链，我们制备了处于IgG-scFv融合形式的抗体(scFv抗体片段融合到IgG的c-末端)，即具有由SEQ ID NO:10组成的重组分(heavy component)和由SEQ ID NO:11组成的轻组分(lightcomponent)的抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体，如下表4中所示。

具体地，将编码SEQ ID NO:12的GS接头的DNA区段(segment)2融合到编码抗-HER2抗体重链(SEQ ID NO:9)的DNA区段1的末端；然后将编码抗-4-1BB抗体的scFv的DNA区段3与其融合，以制备编码抗-HER2/抗-4-1BB双特异性抗体重链(SEQ ID NO:10)的DNA区段，然后将其插入质粒1(英杰公司，A14697)中。此外，将编码抗-HER2/抗-4-1BB双特异性抗体轻链(SEQ ID NO:11)的DNA区段4插入质粒2(英杰公司，A14697)中。

使用ExpiCHO^TM表达系统(吉布科公司，A29133)将所得质粒1和2转染到ExpiCHO细胞(吉布科公司，A29127)中。具体地，将获得的质粒1(250μg)和2(250μg)与OptiPRO^TMSFM(12309-050)和ExpiFectaimin CHO试剂(A29129)(800μL)(最终体积：20mL)混合，随后放置3分钟。为了进行转染，将所得混合溶液和6×10⁶个ExpiCHO细胞置于ExpiCHO表达培养基(A29100-01)中，于37℃下在8％ CO₂加湿振荡培养箱中培养。培养18小时后，向其中加入1.5mL ExpiFectamin^TMCHO转染强化剂(Transfection Enhancer)1和ExpiFectamin^TMCHO补料(Feed)，然后在37℃下继续培养4天。将温度调至32℃后，向其中加入ExpiFectamin^TMCHO补料(Feed)，然后继续培养8天。

表4

(4)用于抗体表达的补料分批培养(Fed-batch culture)

在不含谷氨酰胺的Actipro培养基(Hyclone公司，SH31037.02)中培养(3)中获得的产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系3天后，进行补料分批培养(工作容积:700ml/2000ml烧瓶，37℃，5％ CO₂，130rpm)14天，同时每隔1天添加Cell Boost^TM7a(Hyclone公司，SH31026.01)/7b补充物(Hyclone公司，SH31027.01KR)。用0.2μm膜滤器过滤通过以约3000rpm离心培养物获得的培养物上清液，以获得含粗抗体的滤液。

实施例1：通过蛋白A亲和层析纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体

将MabSelect PrismA亲和层析树脂(思拓凡公司)填充到直径为1.6cm、床高为20cm的柱中，以制备蛋白A亲和层析柱，然后用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)使其平衡。将制备例(4)中获得的含粗抗体的滤液以每毫升树脂30毫克的比例装载到蛋白A亲和层析柱上。将柱用1×PBS(pH 7.4)洗涤后，用含有辅料(excipient)(CaCl₂)的乙酸钠缓冲液或不含辅料的乙酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液洗脱抗体。洗脱缓冲液中辅料和乙酸钠的浓度以及洗脱缓冲液的pH如下表5中所示。

对于使用相应洗脱缓冲液得到的抗体池，通过在280nm处测量UV来分析抗体(即，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体)的产率；并且通过使用尺寸排阻色谱法(size exclusionchromatography，SEC-HPLC)测量高分子量聚集体的含量(％)来分析抗体(即，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体)的纯度。使用SEC-HPLC的分析使用TOSOH model TSK-GEL G3000SW_XL柱进行。通过使1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)以1ml/分钟的流速流过该色谱柱来平衡该色谱柱后，向其中注入各洗脱级分(eluted fraction)(100ug)以进行纯度分析。纯度是指完整形式的纯度(％)，通过以下等式来计算。

纯度(％)＝100-高分子量聚集体的含量(％)

通过使用如上所述的蛋白A亲和层析进行纯化获得的结果示于在下表5中。

表5

从上表5的结果可以看出，当使用含有作为辅料的CaCl₂的乙酸钠缓冲液时，抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的纯度可以显著提高，产率相对较高。而且，从表5中的结果可以看出，乙酸钠缓冲液中CaCl₂的浓度优选在30-500mM的范围内，更优选在50-500mM的范围内，还更优选在75-125mM的范围内，并且特别优选约100mM。此外，可以看出乙酸钠缓冲液中乙酸钠的浓度优选在20-100mM的范围内。

比较例1：使用NaCl作为辅料纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体

按照与实施例1中相同的方式进行蛋白A亲和层析的纯化，使用含有浓度为1000mM的NaCl作为辅料的100mM乙酸钠缓冲液(pH3.7)。对于洗脱池，按照与实施例1中相同的方式分析纯度和产率。作为其结果，与使用不含辅料的100mM乙酸钠(pH 3.7)进行纯化相比，纯度相对提高，但是产率明显降低至29.3％。

根据上述结果，通过降低乙酸钠和辅料(NaCl)的浓度来评估纯度和产率。即，以与实施例1中相同的方式用蛋白A亲和层析进行纯化，使用含有浓度为100mM的NaCl作为辅料的20mM乙酸钠缓冲液(pH3.7)。对于洗脱池，以与实施例1中相同的方式分析纯度和产率。作为其结果，纯度明显降低至74.2％。

因此，就纯度和产率而言，使用含NaCl的乙酸钠缓冲液并没有显示出提高的纯化效果。

比较例2：使用MgCl₂作为辅料纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体

以与实施例1相同的方式进行蛋白A亲和层析的纯化，使用含有浓度为1000mM的MgCl₂作为辅料的100mM乙酸钠缓冲液(pH3.7)。对于洗脱池，以与实施例1中相同的方式分析纯度和产率。作为其结果，与使用不含辅料的100mM乙酸钠(pH 3.7)的纯化相比，纯度相对提高，但是产率明显降低至43.9％。

根据上述结果，通过降低乙酸钠和辅料(MgCl₂)的浓度来评估纯度和产率。即，以与实施例1中相同的方式用蛋白A亲和层析进行纯化，使用含有浓度为100mM的MgCl₂作为辅料的20mM乙酸钠缓冲液(pH3.7)。对于洗脱池，以与实施例1中相同的方式分析纯度和产率。其结果是，与在纯化中使用高浓度乙酸钠/辅料的纯化相比，纯度相对提高，但产率仅为66.7％。

因此，就产率而言，使用含MgCl₂的乙酸钠缓冲液并未显示出提高的纯化效果。

<110> 柳韩洋行(YUHAN CORPORATION)

<120> 用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法

<130> KHP232111118.0

<150> KR 10-2021-0010077

<151> 2021-01-25

<160> 17

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成 L-CDR1

<400> 1

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成 L-CDR2

<400> 2

Ala Asp Ser His Arg Pro Ser

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成 L-CDR3

<400> 3

Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成轻链可变区

<400> 4

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 抗-4-1BB抗体的合成 H-CDR1

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Ser Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成 H-CDR2

<400> 6

Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成 H-CDR3

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Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成重链可变区

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-HER2抗体的合成重链

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 10

<211> 719

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的合成重链组分

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly

465 470 475 480

Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn

485 490 495

Ile Gly Asn Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

530 535 540

Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr

565 570 575

Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

595 600 605

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

610 615 620

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

625 630 635 640

Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile

645 650 655

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

660 665 670

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

675 680 685

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg

690 695 700

Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710 715

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-HER2抗体的合成轻链

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽接头

<400> 12

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽接头

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 14

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成重链

<400> 14

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 15

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成重链可变区

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gln Arg Asn Ser Met Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成轻链

<400> 16

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 17

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-4-1BB抗体的合成轻链可变区

<400> 17

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Claims

1.一种用于纯化抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的方法，所述方法包括(a)将产生抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的细胞系的培养上清液过滤，以获得含粗抗体的滤液；(b)将所述滤液装载到蛋白A亲和层析柱上；和(c)用含有CaCl₂的乙酸钠缓冲液从步骤(b)的所述柱中洗脱所述抗体，其中

所述抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链包含(ⅰ)由SEQ ID NO:9的氨基酸组成的抗-HER2抗体的重链和(ii)抗-4-1BB抗体的scFv，其包含含有SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸的抗-4-1BB抗体的轻链可变区；和含有SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸的抗-4-1BB抗体的重链可变区，并且

所述抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的轻链包含由SEQ ID NO:11的氨基酸组成的抗-HER2抗体的轻链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-4-1BB抗体的轻链可变区由SEQ ID NO:4的氨基酸组成。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-4-1BB抗体的重链可变区由SEQ ID NO:8的氨基酸组成。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-4-1BB抗体的scFv还包含由SEQ ID NO:13的氨基酸组成的接头。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链还包含(iii)由SEQ ID NO:12的氨基酸组成的接头。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-4-1BB/抗-HER2双特异性抗体的重链由SEQID NO:10的氨基酸组成。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中CaCl₂在所述乙酸钠缓冲液中以30-500mM的浓度范围存在。

8.根据权利要求7所述的方法，其中CaCl₂在所述乙酸钠缓冲液中以75-125mM的浓度范围存在。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中乙酸钠在所述乙酸钠缓冲液中以20-100mM的浓度范围存在。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述乙酸钠缓冲液的pH范围为pH3.5至pH 4.0。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中CaCl₂在所述乙酸钠缓冲液中以75-125mM的浓度范围存在，并且乙酸钠在所述乙酸钠缓冲液中以20-100mM的浓度范围存在。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述乙酸钠缓冲液的pH范围为pH 3.5至pH 4.0。