KR20180034425A - 친화성 담체 및 이뮤노글로불린을 단리하는 방법 - Google Patents

친화성 담체 및 이뮤노글로불린을 단리하는 방법 Download PDF

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KR20180034425A
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사토시 나카무라
준-이치 야스오카
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Abstract

리간드의 목적 물질과의 결합성이 향상된 친화성 담체의 제공. 고상 담체와 단백질 리간드를 포함하고, 해당 단백질 리간드는, 식 (1): R-R1(식 (1) 중 R은 해당 고상 담체와 화학 결합하는 링커이며, 폴리프롤린을 포함하는 링커를 나타내고, R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고, 해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있다)로 표시되는, 친화성 담체.

Description

친화성 담체 및 이뮤노글로불린을 단리하는 방법
본 발명은 친화성 담체 및 이뮤노글로불린을 단리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 친화성 담체의 이뮤노글로불린 정제 효율을 높일 수 있는, 담체에 대한 리간드 고정화 방법에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는, 분리 또는 정제를 목적으로 하는 물질과 특이적으로 결합하는 물질(리간드)을 불용성 담체에 고정화한 리간드 고정화 담체를 충전한 칼럼을 사용하는 크로마토그래피이다. 친화성 크로마토그래피는, 예를 들어 단백질, 핵산 등의 생체 관련 물질의 분리·정제에 사용되고 있다(특허문헌 1). 친화성 크로마토그래피용 담체로서는, 예를 들어 아가로오스 겔로 대표되는 당쇄의 가교 입자나, 합성 중합체를 주성분으로 하는 입자가 사용되고 있다.
친화성 크로마토그래피에 있어서는, 목적 물질과 특이적으로 작용하는 물질인 리간드를 담체에 고정화할 필요가 있다. 담체에 대한 리간드의 고정화에는, 담체 표면에 존재하는 다양한 관능기에 대하여, 리간드측의 관능기를 통하여 리간드를 담체에 화학 결합시키는 방법이 자주 사용되고 있다. 그러나, 친화성 크로마토그래피에 사용되는 리간드 중에는, 일반적으로는 복수의 관능기가 있고, 이 복수의 관능기가 담체 표면 상의 관능기에 무질서하게 결합한다. 그로 인해, 종래의 친화성 크로마토그래피에는, 고정화된 리간드를 충분히 유효하게 이용할 수 없다는 문제가 있었다.
일본 특허 공개 (평)6-281638호 공보
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 친화성 담체의 표면에 단백질 리간드를 효율적으로 고정화하며, 또한 고정화된 해당 리간드의 목적 물질에 대한 결합능을 높은 비율로 유지시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은
친화성 담체이며,
고상 담체와 단백질 리간드를 포함하고,
해당 단백질 리간드는, 하기 식 (1):
Figure pct00001
(식 (1) 중
R은 해당 고상 담체와 결합하는 링커이며, 폴리프롤린을 포함하는 링커를 나타내고,
R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있다)
로 표시되는,
친화성 담체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 폴리프롤린에 있어서의 프롤린의 수는 3 내지 300이다.
바람직하게는, 상기 링커의 길이는 0.9㎚ 내지 91㎚이다.
별도의 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 친화성 담체이며,
고상 담체와 단백질 리간드를 포함하고,
해당 단백질 리간드는, 하기 식 (1):
Figure pct00002
(식 (1) 중 R은 해당 고상 담체와 결합하는 링커이며, 길이 0.9㎚ 내지 91㎚인 링커를 나타내고,
R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있다)
로 표시되는,
친화성 담체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 링커는 폴리프롤린을 포함한다.
바람직하게는, 상기 폴리프롤린에 있어서의 프롤린의 수는 3 내지 300이다.
본 발명의 친화성 담체의 일 실시 형태에 있어서, 상기 링커는, 상기 고상 담체와 결합하는 말단에, 아미노기 또는 티올기를 갖는 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 친화성 담체의 일 실시 형태에 있어서, 상기 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질은, Fc 결합성 단백질, 또는 단백질 A에서 유래하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 친화성 담체의 일 실시 형태에 있어서, 상기 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질은, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 및 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함한다.
본 발명의 친화성 담체의 일 실시 형태에 있어서, 상기 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질은, 상기 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2개 이상 포함한다.
본 발명의 친화성 담체의 일 실시 형태에 있어서, 상기 고상 담체는 티올기 또는 아미노기와 결합하는 반응성기를 갖는다.
본 발명의 친화성 담체의 일 실시 형태에 있어서, 상기 반응성기는 에폭시기이다.
추가의 실시 형태에 있어서, 본 발명은 상기 친화성 담체를 사용하는, 이뮤노글로불린의 단리 방법을 제공한다.
추가의 실시 형태에 있어서, 본 발명은 상기 친화성 담체를 사용하는, 항체 의약의 제조 방법을 제공한다.
추가의 실시 형태에 있어서, 본 발명은
링커 R과 단백질 리간드 R1을 포함하고,
해당 링커 R은 폴리프롤린을 포함하고,
해당 R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있는,
친화성 리간드를 제공한다.
본 발명의 친화성 담체에 있어서는, 특정한 링커를 통하여 리간드 단백질을 담체에 결합시킴으로써, 리간드 단백질을 일정한 배향성을 갖고 담체에 고정화시킬 수 있다. 그 결과, 본 발명의 친화성 담체에 있어서는, 리간드와 담체의 무질서한 결합에 기인하는 리간드의 변성이나 부적절한 배향성을 방지하고, 리간드의 목적 물질에 대한 결합성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 친화성 리간드를 효율적으로 담체 표면에 고정화할 수 있으며, 또한 고정화된 리간드가 목적 물질의 정제에 효율적으로 이용된다. 본 발명의 친화성 담체는, 이뮤노글로불린의 결합 용량이 높고, 이뮤노글로불린 정제의 프로세스를 저비용으로 실시하는 것을 가능하게 한다.
본 명세서 중에서 인용된 모든 특허문헌, 비특허문헌 및 그 밖의 간행물은, 그 전체가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열의 서열 동일성은, 립맨-피어슨법(Lipman-Pearson법; Science, 227, 1435-41, 1985)에 의해 계산된다. 구체적으로는, 유전 정보 처리 소프트웨어 Genetyx-Win(Ver.5.1.1; 소프트웨어개발)의 호몰로지 해석(Search ho㏖ogy) 프로그램을 사용하여, Unit size to compare(ktup)를 2로 하여 해석을 행함으로써 산출된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 관한 「적어도 70％의 동일성」이란, 70％ 이상의 동일성, 바람직하게는 80％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 85％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 동일성, 보다 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 동일성, 한층 바람직하게는 98％ 이상의 동일성, 한층 더 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 상의 「상당하는 위치」는, 목적 서열과 참조 서열(예를 들어, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열)을, 각 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 중에 존재하는 보존 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 최대의 상동성을 부여하도록 정렬(얼라인먼트)시킴으로써 결정할 수 있다. 얼라인먼트는, 공지된 알고리즘을 사용하여 실행할 수 있고, 그 수순은 당업자에게 공지이다. 예를 들어, 얼라인먼트는, 상술한 립맨-피어슨법 등에 기초하여 수작업으로 행할 수도 있지만, Clustal W 멀티플 얼라인먼트 프로그램(Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680)을 디폴트 설정으로 사용함으로써 행할 수 있다. 혹은, Clustal W의 개정판인 Clustal W2나 Clustal omega를 사용할 수도 있다. Clustal W, Clustal W2 및 Clustal omega는, 예를 들어 유럽 바이오 인포매틱스 연구소(European Bioinformatics Institute: EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])나, 일본 국립 유전학 연구소가 운영하는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])의 웹 사이트 상에서 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「단백질」이란, 펩티드 구조 단위를 갖는 모든 분자를 의미하고, 예를 들어 천연형 단백질의 부분적 단편이나 천연형 단백질의 아미노산 서열을 인위적으로 개변한 변이체를 포함하는 개념이다. 단백질은, 당쇄, 지질과 같은 생체 유래 물질이나, 폴리에틸렌글리콜 등의 중합체 등으로 수식되어 있어도 된다.
본 명세서에 있어서, 단백질 A란, 황색 포도상구균(Staphyloco㏄us aureus)의 세포벽 성분인 단백질 A를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「이뮤노글로불린 결합 도메인」이란, 단독으로 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능 단위를 의미한다. 본 명세서에 있어서의 「이뮤노글로불린 결합」이란, 이뮤노글로불린 분자의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역, 특히 적어도 Fc 프래그먼트에 결합함을 의미한다. 바람직하게는, 본 명세서에 있어서의 「이뮤노글로불린 결합 도메인」의 예로서는, Fc 결합성 단백, 및 단백질 A에서 유래하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 들 수 있다. 해당 단백질 A에서 유래하는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 예로서는, 단백질 A의 A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인, E 도메인, 및 B 도메인의 개변형 도메인인 Z 도메인, 및 이들에서 유래하는 변이체를 들 수 있다. 해당 변이체의 예로서는, 상기 A 내지 E 및 Z 도메인 중 어느 것과 아미노산 서열에 있어서 적어도 70％ 이상의 동일성을 가지며, 또한 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질」 또는 「이뮤노글로불린 결합 단백질」이란, 이뮤노글로불린에 특이적인 친화성을 갖고, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 「이뮤노글로불린 결합 도메인」을 적어도 1개, 보다 바람직하게는 2개 이상 포함하는 단백질을 의미한다.
1. 친화성 담체
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체는, 고상 담체와 단백질 리간드를 포함하고, 해당 단백질 리간드는, 하기 식 (1):
Figure pct00003
(식 (1) 중
R은 해당 고상 담체와 화학 결합하는 링커를 나타내고,
R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있다)
로 표시된다.
1.1. 담체
1.1.1. 구성
본 발명의 친화성 담체에 포함되는 상기 고상 담체는, 바람직하게는 물에 대하여 불용성인 기재이다. 해당 고상 담체의 형상으로서는, 입자의 형태일 수 있으며, 이러한 입자는 다공성이어도 비다공성이어도 된다. 입자상의 담체는 충전층으로서 사용할 수도 있고, 현탁 형태로 사용할 수도 있다. 현탁 형태에는 유동층(expanded bed) 및 순수한 현탁물로서 알려진 것이 포함되며, 해당 형태 중에서는 입자가 자유롭게 운동할 수 있다. 모놀리스, 충전층 및 유동층의 경우, 분리 수순은 일반적으로 농도 구배에 의한 종래의 크로마토그래피법에 따른다. 순수한 현탁물의 경우에는 회분법이 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 담체는 충전제이다. 혹은, 해당 담체는 칩, 캐필러리 또는 필터와 같은 형태여도 된다. 또한, 고상 담체로서 자성 입자를 사용해도 된다. 자성 입자로서는, 자기 유도에 의해 용이하게 자화될 수 있는 것이면 특별히 제한은 되지 않고, 예를 들어 사산화삼철(Fe3O4), 삼산화이철(γ-Fe2O3), 각종 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬 등의 금속이나, 코발트, 니켈, 망간 등의 합금을 포함하는 자성체 미립자, 또는 이들 자성체를 내부에 포함한 소수성 중합체, 친수성 중합체 등을 들 수 있다. 적합한 예로서는, 일본 특허 공개 제2008-32411호 공보에 기재된, 초상자성 미립자를 포함하는 모입자의 표면에, 소수성의 제1 중합체층이 형성되고, 당해 제1 중합체층 위에, 적어도 표면에 글리시딜기를 갖는 제2 중합체층이 형성되고, 당해 글리시딜기를 화학 수식함으로써, 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 원자를 1개 이상 포함하는 극성기가 도입된 자성 입자를 들 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 친화성 담체는 친화성 크로마토그래피용 담체이다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 고상 담체는, 바람직하게는 20 내지 200㎛, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 20 내지 100㎛, 더욱 바람직하게는 30 내지 80㎛, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 50 내지 200㎛, 더욱 바람직하게는 60 내지 150㎛의 입경을 갖는다. 입경이 20㎛ 미만이면 고유속 하에서 칼럼 압력이 높아져, 실용에 견디지 못한다. 입경이 200㎛를 초과하면, 이뮤노글로불린이 친화성 담체에 결합하는 양(결합 용량)이 떨어지는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「입경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치에 의해 얻어지는 부피 평균 입경이다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 고상 담체는, 바람직하게는 다공질이며, 50 내지 150㎡/g, 보다 바람직하게는 80 내지 130㎡/g의 비표면적을 갖는다. 여기서, 비표면적이 50㎡/g 미만이면 결합 용량이 떨어지는 경우가 있고, 한편, 150㎡/g을 초과하면, 담체의 강도가 떨어지기 때문에 고유속 하에서 담체가 파괴되어, 칼럼 압력이 상승하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「비표면적」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000㎚의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 중량으로 나눈 값이다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 고상 담체는, 바람직하게는 100 내지 1400㎚, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 100 내지 400㎚, 더욱 바람직하게는 200 내지 300㎚, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 500 내지 1400㎚, 더욱 바람직하게는 800 내지 1200㎚의 부피 평균 세공 직경을 갖는다. 여기서, 부피 평균 세공 직경이 100㎚ 미만이면 고유속 하의 결합 용량 저하가 현저해지는 경우가 있고, 한편, 1400㎚를 초과하면, 유속에 관계없이 결합 용량이 저하되는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「부피 평균 세공 직경」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000㎚의 세공의 부피 평균 세공 직경이다.
상기 고상 담체가 상기 범위의 입경, 비표면적 및 세공 직경 분포를 만족시키는 경우, 정제 대상 용액의 유로가 되는 입자 사이의 간극 및 입자 내의 비교적 큰 세공 직경과, 정제 대상 분자의 결합 표면적의 밸런스가 최적화되어, 고유속 하의 결합 용량이 높은 레벨로 유지된다.
상기 고상 담체의 재질로서는, 예를 들어 친수성 표면을 갖는 중합체이며, 예를 들어 외표면에(그리고 존재하는 경우에는 내표면에도) 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH), 아미노카르보닐기(-CONH2 또는 N 치환형), 아미노기(-NH2 또는 치환형) 또는 올리고 혹은 폴리에틸렌옥시기를 갖는 중합체이다. 일 실시 형태에 있어서, 해당 중합체는, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐알코올계 등의 합성 중합체일 수 있는데, 바람직하게는 다관능 (메트)아크릴레이트, 디비닐벤젠 등의 다관능 단량체로 가교된 공중합체와 같은 합성 중합체이다. 이러한 합성 중합체는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어, J. MATER. CHEM 1991, 1(3), 371-374에 기재된 방법을 참조하라). 혹은, 토요펄(도소사)과 같은 시판품도 사용된다. 다른 실시 형태에 있어서의 중합체는 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류이다. 이러한 다당류는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어 일본 특허 제4081143호에 기재된 방법을 참조하라). 혹은, 세파로스(GE 헬스케어 바이오사이언스사)와 같은 시판품도 사용된다. 그 밖의 실시 형태에서는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 담체여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 고상 담체로서 사용되는 다공성 입자의 일 구체예로서는, 예를 들어 20 내지 50질량％의 가교성 비닐 단량체와 3 내지 80질량％의 에폭시기 함유 비닐 단량체, 20 내지 80질량％의 디올기 함유 비닐 단량체의 공중합체를 함유하고, 입경이 20 내지 80㎛이며, 비표면적이 50 내지 150㎡/g이며, 부피 평균 세공 직경이 100 내지 400㎚인 다공성 유기 중합체 입자를 들 수 있다.
또한, 상기 고상 담체를 수은 포로시미터로 측정한 경우의 세공 직경 10 내지 5000㎚의 세공의 침입 부피(세공 부피)는, 바람직하게는 1.3 내지 7.0mL/g, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 1.3 내지 2.5mL/g, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 3.0 내지 6.0mL/g이다.
1.1.2. 리간드와의 결합
상기 고상 담체에 대한 리간드의 결합 방법으로서는, 단백질을 담체에 고정화하는 일반적 방법을 사용하여 행할 수 있다. 고정화 수단으로서는, 예를 들어 담체에 대한 리간드의 물리적 흡착, 담체와 리간드의 화학적 결합 등을 들 수 있다. 담체와 리간드의 화학적 결합을 위한 방법으로서는, 공유 결합을 들 수 있다. 예를 들어, 리간드의 링커는, 그 카르복시기, 아미노기, 수산기 또는 티올기를 통하여 담체와 공유 결합한다. 또한, 공유 결합을 위한 반응성기를 담체에 도입해도 된다. 해당 반응성기로서는, 카르복시기, 아미노기, 수산기, 말레이미드기 또는 에폭시기가 바람직하고, 이들 중에서도, 온화한 조건에서 리간드와의 반응이 진행되는 점에서, 에폭시기가 보다 바람직하다. 담체에 대한 리간드의 결합 방법의 구체예로서는, 카르복시기를 갖는 담체를 사용하여, 이 카르복시기를 N-히드록시 숙신산이미드에 의해 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 아미노기 또는 카르복시기를 갖는 담체를 사용하여, 수용성 카르보디이미드 등의 탈수 축합제 존재 하에서 리간드의 카르복시기 또는 아미노기와 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 방법, 수산기를 갖는 담체를 사용하여, 브롬화시안 등의 할로겐화시안으로 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 담체의 수산기를 토실화 혹은 트레실화하여 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 말레이미드기를 갖는 담체를 사용하여, 리간드의 티올기와 반응시켜 티오에테르 결합을 형성하는 방법, 비스에폭시드, 에피클로로히드린 등에 의해 에폭시기를 담체에 도입하고, 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법, 및 에폭시기를 갖는 담체를 사용하여, 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다. 상기 중 반응을 실시하는 수용액 중에서의 안정성의 관점에서는, 에폭시기를 통하여 리간드를 도입하는 결합 방법이 바람직하다.
에폭시기가 개환되어 생성되는 개환 에폭시기인 알코올성 수산기는, 담체 표면을 친수화하여, 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 함께, 수중에서 담체의 인성을 향상시켜, 고유속 하의 담체 파괴를 방지하는 역할을 한다. 따라서, 리간드를 고정화시킨 후의 담체 중에 리간드와 결합되어 있지 않은 잔여의 에폭시기가 존재하고 있는 경우, 당해 잔여의 에폭시기를 개환시키는 것이 바람직하다. 담체 중의 에폭시기의 개환 방법으로서는, 예를 들어 수용매 중에서, 산 또는 알칼리에 의해, 가열 또는 실온 하에서 해당 담체를 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 머캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 머캅토기를 갖는 블로킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블로킹제로, 에폭시기를 개환시켜도 된다. 가장 바람직한 개환 에폭시기는, 담체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은, 원료로서 머캅토에탄올 등보다도 독성이 낮고, 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는, 아미노기를 갖는 블로킹제에 의한 개환기보다도 비특이 흡착이 낮은 데다가 담체의 동적 결합량이 높아진다는 이점을 갖는다.
1.2. 리간드
1.2.1. 링커
본 발명의 친화성 담체에 포함되는 단백질 리간드는, 링커 R과 단백질 리간드 R1을 포함하고, 하기 일반식 (1)로 표시된다.
Figure pct00004
이 단백질 리간드를, 상술한 바와 같이, 예를 들어 담체 상의 에폭시기 등과 반응시킴으로써, 담체에 리간드를 고정화시킬 수 있다.
상기 식 (1) 중의 링커 R은, 그의 일단에 고상 담체의 반응성 관능기와 반응하는 관능기를 포함하는 링커이다. 해당 링커는, 후술하는 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질 R1을 담체에 연결하여 고정화하기 위하여 사용될 수 있다. 또한 해당 링커는, 해당 R1을 담체 상에 효율적으로 고정화하기 위하여 사용되는 한편, 해당 R1의 이뮤노글로불린 친화성을 실질적으로 유지하는 데 적합하다. 즉, 해당 링커를 사용한 경우, 링커를 사용하지 않는 경우에 비하여, 담체 상에 효율적으로, 예를 들어 25％ 이상 효율적으로, 단백질 R1을 도입할 수 있다. 또한, 해당 링커를 사용하여 효율적으로 도입된 단백질 R1은, 담체 상에서, 그 활성, 예를 들어 이뮤노글로불린 결합성을 유지할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 상기 링커 R은, 바람직하게는 0.9㎚ 내지 91㎚, 보다 바람직하게는 1.8㎚ 내지 15.4㎚, 더욱 바람직하게는 3.6㎚ 내지 7.3㎚의 길이를 갖는다. 여기서, 링커의 길이란, 해당 링커의 삼차원적인 입체 구조에 있어서, 상기 R1에 결합하는 부위부터 상기 고상 담체에 결합하는 부위까지의 거리를 의미한다. 일 실시 형태에 있어서, 해당 링커는 나선 구조를 갖고, 해당 나선의 전체 길이가 상기 길이를 갖는다.
바람직하게는, 상기 링커 R은, 적어도 2개의 프롤린을 포함하는 펩티드 링커이다. 보다 바람직하게는, 해당 링커 R은, 적어도 2개의 프롤린을 포함하며, 또한 측쇄에 아미노기 또는 티올기를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다. 더욱 바람직하게는, 해당 링커 R은, 적어도 2개의 프롤린을 포함하며, 또한 상기 고상 담체에 결합하는 말단에, 적어도 1개, 보다 바람직하게는 1개 이상의 시스테인 (C) 또는 리신 잔기 (K)를 갖는 폴리펩티드이다. 링커 R이 시스테인 잔기를 복수 포함하는 경우, 시스테인 사이에서 디술피드 결합이 형성되지 않도록 고려할 필요가 있고, 당해 시스테인 사이의 디술피드 결합의 형성을 회피하기 위하여, 예를 들어 환원제를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 환원제는, 디술피드 결합을 환원하는 것이면 특별히 제한은 되지 않고, 예를 들어 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨, 1-티오글리세롤, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 등을 들 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 링커 R은, 적어도 3개의 연속하는 프롤린 잔기를 갖는 폴리프롤린을 포함한다. 해당 폴리프롤린에 포함되는 프롤린 잔기의 수는, 바람직하게는 3 내지 300개, 보다 바람직하게는 6 내지 51개, 더욱 바람직하게는 12 내지 24개이다. 폴리프롤린은, 3개의 프롤린을 1단위로 하는 폴리프롤린 헬릭스를 구성할 수 있으므로, 상기 링커 R은, 바람직하게는 3 내지 300개, 보다 바람직하게는 6 내지 51개, 더욱 바람직하게는 12 내지 24개의 프롤린을 포함하는 폴리프롤린 헬릭스를 포함할 수 있다. 바꾸어 말하면, 3개의 프롤린에 의해 폴리프롤린 헬릭스 약 1회전(본 명세서에 있어서, 1피치라고도 한다)이 형성되므로, 상기 링커 R은, 바람직하게는 1 내지 100의 피치수, 보다 바람직하게는 2 내지 17의 피치수, 더욱 바람직하게는 4 내지 8의 피치수를 갖는 폴리프롤린 헬릭스를 포함할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서, 해당 링커 R의 폴리프롤린 헬릭스의 피치수는 정수에 한정되지 않는다. 폴리프롤린 헬릭스 1피치당 길이는 약 0.9㎚이다(J. AM. CHEM. SOC., 2007, 129(4): 873-880).
더욱 바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 링커 R은, 폴리프롤린에 더해, 프롤린 이외의 아미노산 잔기를 1개 또는 2개 이상 갖고 있어도 된다. 바람직하게는, 해당 링커 R은, 폴리프롤린과, 상기 고상 담체와 결합하는 링커 말단 사이에, 프롤린 이외의 아미노산 잔기를 1개 또는 2개 이상 갖고 있으며, 보다 바람직하게는, 폴리프롤린과, 상기 고상 담체와 결합하는 링커 말단 사이에, 아미노기 또는 티올기를 갖는 아미노산 잔기를 1개 또는 2개 이상 포함하고 있다. 이러한 프롤린 이외의 아미노산 잔기로서는, 1 내지 3개의 시스테인 (C) 또는 리신 잔기 (K)가 바람직하다. 바람직하게는, 링커 R은 해당 고상 담체와 결합하는 말단에 적어도 1개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 시스테인 (C) 또는 리신 잔기 (K)를 포함하며, 또한 3 내지 300개, 보다 바람직하게는 6 내지 51개, 더욱 바람직하게는 12 내지 24개의 프롤린을 포함하는 폴리프롤린을 포함하는 링커이다.
1.2.2. 이뮤노글로불린 결합 단백질
상기 식 (1) 중의 R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질(또는 이뮤노글로불린 결합 단백질)이다. R1의 예로서는, 이뮤노글로불린 Fc 영역에 결합하는 Fc 결합성 단백질, 및 단백질 A에서 유래하는 이뮤노글로불린 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 적어도 1개 포함하는 단백질을 들 수 있다. R1은, 공업적으로 문제가 되지 않는 한, 이뮤노글로불린 결합 도메인을 몇개 포함하고 있어도 된다.
바람직하게는, R1은, 단백질 A에서 유래하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 적어도 1개 포함한다. 보다 바람직하게는, R1은 단백질 A의 A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인, E 도메인, Z 도메인, 및 그들의 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함한다.
상기 A 내지 E 및 Z 도메인의 변이체는, 단백질 A의 A 내지 E 및 Z 도메인에 대하여, 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환 또는 결실이나, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등의 개변을 실시함으로써 제작할 수 있다. 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환 또는 결실의 수단으로서는, 상기 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 부위 특이적 돌연변이(Site-specific mutaion) 등의 공지된 수단을 들 수 있다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, R1은, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 및 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함한다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, R1은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함한다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, R1은, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 및 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함한다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, R1은, 상기에 예시한 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2개 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개 포함한다. 해당 이뮤노글로불린 결합 도메인의 각각은, 동일한 것이어도 상이한 것이어도 된다. 바람직하게는, 해당 이뮤노글로불린 결합 도메인의 각각은, 그의 N 말단이, 인접하는 도메인의 C 말단에 연결되어 있다. 각 도메인은, 인접하는 도메인과 직접 연결해도 되고, 또는 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 통하여 연결해도 된다.
다른 일 실시 형태에 있어서, R1은, 상기 이뮤노글로불린 결합 도메인을 1개 이상 포함하고 있으면 되지만, 이뮤노글로불린 결합 용량이나 이뮤노글로불린 결합 단백질의 생산성의 관점에서는, R1의 이뮤노글로불린 결합 도메인수는, 바람직하게는 10 이하이고, 보다 바람직하게는 2 이상 8 이하이고, 더욱 바람직하게는 4 이상 6 이하이다.
바람직하게는, R1에 포함되는 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것으로 표시되는 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 Val 잔기를 갖고/갖거나 서열 번호 1 내지 3 중 어느 것으로 표시되는 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 Ala 잔기를 갖는다.
R1의 바람직한 예로서는, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 1위치 Ala를 Val로, 29위치 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 4개 포함하는 폴리펩티드이다.
R1의 다른 바람직한 예로서는, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 가지며, 또한 서열 번호 3의 1위치에 상당하는 위치에 Val을, 29위치에 상당하는 위치에 Ala를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을, 3 내지 8개 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
일반적인 단백질 리간드에 있어서는, 링커는, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 기능이 실질적으로 유지되도록, 그 말단에 결합 혹은 융합될 수 있다. 따라서, 상기 링커 R은, 바람직하게는 상기 이뮤노글로불린 결합 단백질 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합된다. 혹은, 2개의 링커 R이, R1의 아미노산 서열의 양 말단에 각각 결합되어도 되고, 또는 링커 R은, R1의 아미노산 서열의 말단 잔기가 아닌 아미노산 잔기에 결합되어도 된다.
1.2.3. 리간드의 제조
본 발명의 친화성 담체에 포함되는, 상기 식 (1)로 표시되는 단백질 리간드 R-R1은, 상기 링커 R과 상기 이뮤노글로불린 결합 단백질 R1을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 또한 상술한 바와 같이, 해당 단백질 리간드에 포함되는 R1은, 이뮤노글로불린 결합 도메인을 1개 이상, 바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 3 내지 8개 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 이들 융합 폴리펩티드는, 당해 분야에서 공지된 재조합법에 의해 생성될 수 있다.
상기 단백질 리간드를 제조하기 위한 표준 기술로서는, 예를 들어 Frederick M. Ausbel 등에 의한 Current Protocols In Molecular Biology나 Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 공지된 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있다. 즉, 상기 단백질 리간드를 코딩하는 핵산 서열을 함유시킨 발현 벡터를 대장균 등의 숙주로 형질전환하여, 얻어진 재조합체를 적절한 액체 배지에서 배양함으로써, 배양 후의 세포로부터, 목적의 단백질 리간드를 대량으로 또한 경제적으로 취득할 수 있다. 바람직한 발현 벡터로서는, 숙주 세포 내에서 복제 가능한 기지의 벡터를 모두 사용할 수 있는데, 예를 들어 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 플라스미드나, Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 형질전환을 위한 숙주로서는, 특별히 한정되지 않지만, 대장균 등의 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 포유류 세포 등의 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 사용되는 공지된 숙주를 사용할 수 있다. 숙주 중에 핵산을 도입함으로써 숙주를 형질전환시키기 위해서는, 각 숙주에 따라 당해 기술 분야에 있어서 알려진 어느 방법을 사용해도 되는데, 예를 들어 Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 재조합체(세균 등)를 배양하여 발현된 단백질을 회수하는 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 실시예에도 예시되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 식 (1)로 표시되는 단백질 리간드 R-R1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA 등), 그것을 포함하는 벡터, 및 이들을 포함하는 재조합체를 제공한다.
상기 링커 R과 상기 이뮤노글로불린 결합 단백질 R1을 결합 또는 융합한 융합 폴리펩티드 R-R1을 얻은 후, 그것을 상기 고상 담체에 고정화함으로써, 본 발명의 친화성 담체를 제조할 수 있다. 혹은, 상기 링커 R을, 상기 이뮤노글로불린 결합 단백질 R1과의 결합보다 전에, 화학적 수단에 의해, 재조합법에 의해 또는 효소를 사용하여, 상기 고상 담체에 결합하고, 이어서 해당 링커 R에 R1을 결합해도 된다. 해당 링커 R의 결합에 적절한 고상 담체는, 상기 1.1에서 설명한 대로이다.
1.3. 작용 효과
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체는, 담체에 고정화된 리간드양이 많으며，또한 초기의 IgG 정적 결합 용량(SBC)이 높은 점에서, 하기 식에 따라 산출되는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 유효 이용도 E[％]가 높다. E[％]=[(SBC/항체의 분자량)/(이뮤노글로불린 결합 단백질 도입량/이뮤노글로불린 결합 단백질의 분자량)]×100
2. 이뮤노글로불린을 단리하는 방법
본 발명의 일 실시 형태에 관한 이뮤노글로불린을 단리하는 방법을 설명한다. 본 실시 형태에 관한 이뮤노글로불린을 단리하는 방법은, 상기 식 (1)로 표시되는 단백질 리간드 R-R1을 고정화한 친화성 담체에, 이뮤노글로불린을 함유하는 시료를 접촉시켜, 해당 담체에 이뮤노글로불린을 흡착시키는 공정(제1 공정) 및 해당 담체로부터 해당 이뮤노글로불린을 용출시키는 공정(제2 공정)을 포함하고, 바람직하게는 해당 제2 공정 후에, 해당 담체를 알칼리성 액으로 세정하는 공정(제3 공정)을 더 포함한다. 본 발명의 이뮤노글로불린 단리 방법에 사용되는 본 발명의 친화성 담체는, 현탁 형태여도 되고, 칼럼에 충전된 상태여도 되고, 혹은 칩, 캐필러리 또는 필터와 같은 형태여도 된다.
상기 제1 공정에서는, 상기 친화성 담체를 충전한 칼럼 등에 이뮤노글로불린을 함유하는 시료를, 리간드에 이뮤노글로불린이 흡착되는 조건에서 접촉시킨다. 이 제1 공정에서는, 시료 중의 이뮤노글로불린 이외의 물질의 대부분은 리간드에 흡착되지 않고 담체 상에 잔류하지 않는다. 이 후, 필요에 따라, 리간드에 약하게 유지된 일부의 물질을 제거하기 위하여, 담체를 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액으로 세정해도 된다.
상기 제2 공정에서는, pH2 내지 5의 적절한 완충액을 흘려, 리간드에 흡착된 이뮤노글로불린을 용출시킨다. 이 용출액을 회수함으로써, 시료로부터 이뮤노글로불린을 단리할 수 있다.
본 실시 형태에 관한 이뮤노글로불린을 단리하는 방법에 있어서는, 바람직하게는 상기 제2 공정에 이어 제3 공정이 행하여진다. 제3 공정에서는, 알칼리성 액으로 담체를 세정(CIP 세정)한다. 제3 공정에 사용되는 알칼리성 액으로서는, 예를 들어 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄 등을 들 수 있다.
본 발명의 친화성 담체는, 상기 제3 공정에서의 세정 후에도 이뮤노글로불린 결합능을 안정적으로 유지할 수 있으므로, 본 발명의 이뮤노글로불린 단리 방법에 반복하여 사용할 수 있다.
본 발명의 이뮤노글로불린 단리 방법의 일 실시 형태에 있어서, 단리해야 할 이뮤노글로불린은, 항체 또는 그것을 포함하는 의약일 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 친화성 담체를 사용하는 항체 의약의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법의 수순은, 목적으로 하는 항체 의약을 함유하는 시료를 사용하는 것 이외에는, 기본적으로 상술한 이뮤노글로불린 단리 방법의 수순과 마찬가지이다.
실시예
이하, 본 발명을, 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 기재는 본 발명의 형태를 개괄적으로 나타내는 것이며, 특별히 이유 없이, 이러한 기재에 의해 본 발명은 한정되는 것은 아니다.
참고예 1 다공질 입자의 합성
글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 8.2g, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(사토머사제) 65.9g 및 글리세린모노메타크릴레이트(니치유사제) 90.6g을 2-옥타논(도요 고세이 고교사제) 245.8g 및 아세토페논(와코 쥰야쿠 고교사제) 62g에 용해시켜, 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야쿠 고교사제) 2g을 첨가하여, 유기 단량체 용액을 제조했다.
이어서, 4240g의 순수에 폴리비닐알코올(쿠라레사제 PVA-217) 8.5g, 도데실황산나트륨(가오사제 에말 10G) 0.43g 및 황산나트륨(와코 쥰야쿠 고교사제) 21.3g을 첨가하고, 밤새 교반하여 수용액을 제조했다.
이어서, 얻어진 수용액을 7L 세퍼러블 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여, 온수 배스에 세트하고, 질소 분위기 하에서, 600rpm으로 교반을 개시했다. 계속하여, 세퍼러블 플라스크를 온수 배스에 의해 가온하여, 수용액의 온도가 85℃가 되었을 때, 이 수용액에 적하 깔때기를 사용하여 상기 유기 단량체 용액을 첨가하고, 5시간 교반을 행했다.
이어서, 반응액을 냉각한 뒤, 이러한 반응액을 5L의 폴리프로필렌제 병에 옮기고, 입자가 부유할 때까지 정치하고, 하방으로부터 여분의 물을 분출하여 폐기했다. 또한, 이 반응액에 아세톤을 첨가하여 입자를 침강시켰다. 이어서, 반응액을 3분간 정치하고, 데칸테이션에 의해 아세톤을 제거했다. 이 조작을 2회 반복한 뒤 물을 첨가하고, 입자를 침강시켰다. 재차, 3분간 정치하여 데칸테이션을 행했다. 이 조작을 2회 반복하여 입자를 세정했다. 또한, 입자의 분산액을 아세톤으로 다시 치환하고, 밤새 풍건한 뒤, 진공 건조기로 건조를 행하여, 다공질 입자(이하, PB1이라고 기재한다) 90g을 얻었다. PB1의 광 산란 방식에 의한 부피 평균 입경은 53㎛, 수은 포로시미터 측정에 의하면 비표면적은 95㎡/g였다.
비교예 1
(1) 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조
링커가 없는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 코딩하는 플라스미드를 화학 합성에 의해 제조하고, 대장균 BL21(STRATAGENE제)에 도입하여 형질전환했다. 형질전환된 대장균을, 흡광도(OD600)가 약 10에 도달할 때까지 37℃에서 인큐베이트하고, 이어서 최종 농도로 1mM이 되도록 IPTG(Sigma-Aldrich제)를 첨가하고, 4시간 37℃에서 더 인큐베이트하여, 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 발현시켰다. 단백질 발현 후, 세포를 회수하고, pH9.5의 트리스 완충액 중에서 리소자임을 사용하여 파쇄했다. 얻어진 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 포함하는 대장균 파쇄액으로부터, 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제) 및 양이온 교환 크로마토그래피(SP-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사제)에 의해 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 정제했다. 정제된 이뮤노글로불린 결합 단백질을, 10mM 시트르산 완충액 pH6.6에 대하여 16시간 투석했다. SDS-PAGE에 의해 확인된 이뮤노글로불린 결합 단백질의 순도는 95％ 이상이었다. 해당 이뮤노글로불린 결합 단백질의 이론 분자량[kDa]을, ExPACy([www.expasy.org/compute_pi/])를 사용하여 구했다.
(2) 담체에 대한 이뮤노글로불린 결합 단백질의 고정화
150μL의 순수에 참고예 1에서 제조한 PB1을 8㎎ 현탁시켜, 필터 튜브(Millipore사)에 옮기고, 원심하여 순수를 제거했다. 여기에 (1)에서 제조한 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 1㎎을 용해한, 0.85M 황산나트륨을 포함하는 0.1M 탄산 완충액(pH9.8) 450μL를 첨가하고, 25℃에서 5시간 진탕시켜, 이뮤노글로불린 결합 단백질을 PB1에 결합시켰다. 생성된 입자를 여과한 후, 1M 티오글리세롤 450μL과 혼합하고, 25℃에서 16시간 반응시켜 잔여 에폭시기를 블로킹하고, 0.5M NaOH로 세정 후, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH3.2)로 세정하고, 마지막으로 인산 완충 생리적 식염수(BupHTM 개변 둘베코 PBS(BupHTM Modified Dulbe㏄o's PBS), PIERCE사)를 400μL 첨가하고, 이뮤노글로불린 결합 단백질이 고정화된 다공질 입자를 분산시켜, 해당 입자의 현탁액 400μL를 얻었다.
비교예 2
표 1에 나타내는 시스테인 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 5)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
비교예 3
표 1에 나타내는 폴리리진 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 6)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
실시예 1
표 1에 나타내는 폴리프롤린 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 7)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
실시예 2
표 1에 나타내는 폴리프롤린 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 8)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
실시예 3
표 1에 나타내는 폴리프롤린 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 9)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
실시예 4
표 1에 나타내는 폴리프롤린 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 10)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로, 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
실시예 5
표 1에 나타내는 폴리프롤린 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 11)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환한 것 이외는, 비교예 1과 마찬가지의 수순으로, 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하고, 이어서 그것을 다공질 입자 PB1에 고정화했다.
비교예 4
참고예 1에서 제조한 입자 PB1에 대하여, 과잉량의 티오글리세롤을 작용시켜 에폭시기를 개환시킨 뒤, 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄(BDDGE)(탄소수 10)을 표면 수산기와 등몰량 작용시켜, 탄소쇄의 링커를 도입했다. 이 입자를 PB2로 했다. 8㎎의 PB2에 대하여, 비교예 1과 실질적으로 마찬가지로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질(서열 번호 4)을 고정화하여, 해당 입자의 현탁액 400μL를 얻었다.
비교예 5
참고예 1에서 제조한 입자 PB1에 대하여, 과잉량의 티오글리세롤을 작용시켜 에폭시기를 개환시킨 뒤, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에탄(EGDG)(탄소수 8)을 표면 수산기와 등몰량 작용시켜, 탄소쇄의 링커를 도입했다. 이 입자를 PB3으로 했다. 8㎎의 PB3에 대하여, 비교예 1과 실질적으로 마찬가지로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질(서열 번호 4)을 고정화하여, 해당 입자의 현탁액 400μL를 얻었다.
Figure pct00005
시험예 1(리간드 결합량의 측정)
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 5의 입자 현탁액 400μL로부터 50μL를 분취하고, BCA Assy 키트(PIERCE사)를 사용하여, 해당 입자에 결합한 이뮤노글로불린 결합 단백질의 양을 각각 측정하여, 비교예 1의 결합량을 100으로 한 상대값을 구했다.
시험예 2(이뮤노글로불린 G(IgG) 정적 결합 용량의 측정)
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 5의 입자 현탁액 400μL로부터 150μL를 분취하고, 각각 필터 튜브(Millpore사)에 투입하고, 여기에 5㎎의 IgG를 포함하는 0.1M 인산 완충액 pH7.5를 300μL 투입하고, 1시간 25도에서 진탕시켜 IgG를 해당 입자에 흡착시켰다. 원심 후, pH7.5의 0.1M 인산 완충액 450μL를 사용하여 해당 입자를 세정하고, 0.1M 시트르산 완충액 pH3.2를 사용하여 해당 입자에 흡착된 IgG를 용출시키고, 용출액의 280㎚에 있어서의 흡광도로부터 해당 입자의 IgG의 정적 결합 용량(SBC)을 측정했다.
시험예 3 이뮤노글로불린 결합 단백질의 이용 효율
시험예 1 및 시험예 2에서 측정한 리간드 결합량과 SBC의 값으로부터, 하기 식에 따라, 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 5의 다공질 입자에 있어서의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 유효 이용도 E[％]를, 하기 식에 따라 산출했다.
E[％]=[(SBC/항체의 분자량)/(이뮤노글로불린 결합 단백질 도입량/이뮤노글로불린 결합 단백질의 분자량)]×100
시험예 1 내지 3의 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00006
실시예 1 내지 5에서 제조한 폴리프롤린 링커를 포함하는 이뮤노글로불린 단백질이 고정화된 입자는, 리간드 결합량 및 SBC가 비교예 1 내지 3에 비하여 향상되었다. 또한, 폴리프롤린의 길이가 보다 길어지면, SBC가 보다 향상되고, 이용 효율 E[％]도 보다 높아지는 경향이 있었다. 또한, 실시예 4 내지 5에 기재한 바와 같이, 링커와 담체의 결합에 사용되는 관능기가 리신 유래의 아미노기에서도 시스테인 유래의 티올기에서도, 실질적으로 동일 정도의 도입량이 얻어졌다. 한편, 비교예 5 내지 6에 기재한 바와 같이, 탄소쇄 링커는, 리간드 결합량 및 SBC 향상에는 전혀 공헌하지 않았다.
본 발명의 실시 형태에 관한 설명은 이상이다. 그러나, 본 발명은 상술한 실시 형태에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 더욱 다양한 변형이 가능하다. 또한 본 발명은 상기에서 설명한 실시 형태의 구성과 실질적으로 동일한 구성(예를 들어, 기능, 방법 및 결과가 동일한 구성, 혹은 목적 및 결과가 동일한 구성)을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기에서 설명한 실시 형태의 구성의 본질적이지 않은 부분을 치환한 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기에서 설명한 실시 형태의 구성과 동일한 작용 효과를 발휘하는 구성 또는 동일한 목적을 달성할 수 있는 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기에서 설명한 실시 형태의 구성에 공지 기술을 부가한 구성을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> JSR Corporation;JSR Life Sciences Corporation <120> Affinity Support and Method for Isolating Immunoglobrins <130> JSR0075 <150> JP 2015-148670 <151> 2015-07-28 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, B domain <400> 1 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, Z domain <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, C domain <400> 3 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 242 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 4 Ala Gln Gly Thr Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe 50 55 60 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 65 70 75 80 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 85 90 95 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys 115 120 125 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 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Thr Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe 50 55 60 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 65 70 75 80 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 85 90 95 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys 115 120 125 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 130 135 140 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 145 150 155 160 Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 165 170 175 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 180 185 190 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 195 200 205 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 210 215 220 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 225 230 235 240 Pro Lys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys 245 <210> 8 <211> 252 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8 Ala Gln Gly Thr Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe 50 55 60 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 65 70 75 80 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 85 90 95 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys 115 120 125 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 130 135 140 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 145 150 155 160 Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 165 170 175 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 180 185 190 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 195 200 205 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 210 215 220 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 225 230 235 240 Pro Lys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys 245 250 <210> 9 <211> 255 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 9 Ala Gln Gly Thr Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe 50 55 60 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 65 70 75 80 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 85 90 95 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 100 105 110 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys 115 120 125 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 130 135 140 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 145 150 155 160 Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 165 170 175 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 180 185 190 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 195 200 205 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 210 215 220 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 225 230 235 240 Pro Lys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys 245 250 255 <210> 10 <211> 257 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 10 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys 50 55 60 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 65 70 75 80 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 85 90 95 Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 100 105 110 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Glu Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 180 185 190 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 195 200 205 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 210 215 220 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Pro Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 245 250 255 Cys <210> 11 <211> 259 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 11 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys 50 55 60 Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 65 70 75 80 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 85 90 95 Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 100 105 110 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Glu Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 180 185 190 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 195 200 205 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 210 215 220 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Pro Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 245 250 255 Lys Lys Lys

Claims (15)

  1. 친화성 담체이며,
    고상 담체와 단백질 리간드를 포함하고,
    해당 단백질 리간드는, 하기 식 (1):
    Figure pct00007

    (식 (1) 중
    R은 해당 고상 담체와 결합하는 링커이며, 폴리프롤린을 포함하는 링커를 나타내고,
    R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
    해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있다)
    로 표시되는,
    친화성 담체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리프롤린에 있어서의 프롤린의 수가 3 내지 300인, 친화성 담체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 링커의 길이가 0.9㎚ 내지 91㎚인, 친화성 담체.
  4. 친화성 담체이며,
    고상 담체와 단백질 리간드를 포함하고,
    해당 단백질 리간드는, 하기 식 (1):
    Figure pct00008

    (식 (1) 중
    R은 해당 고상 담체와 결합하는 링커이며, 길이 0.9㎚ 내지 91㎚인 링커를 나타내고,
    R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
    해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있다)
    로 표시되는,
    친화성 담체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 링커가 폴리프롤린을 포함하는, 친화성 담체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리프롤린에 있어서의 프롤린의 수가 3 내지 300인, 친화성 담체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가, 상기 고상 담체와 결합하는 말단에, 아미노기 또는 티올기를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는, 친화성 담체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질이, Fc 결합성 단백질, 또는 단백질 A에서 유래하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는, 친화성 담체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질이, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인, 및 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하는, 친화성 담체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질이, 상기 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2개 이상 포함하는, 친화성 담체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고상 담체가 티올기 또는 아미노기와 결합하는 반응성기를 갖는, 친화성 담체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 반응성기가 에폭시기인, 친화성 담체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 담체를 사용하는, 이뮤노글로불린의 단리 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 담체를 사용하는, 항체 의약의 제조 방법.
  15. 링커 R과 단백질 리간드 R1을 포함하고,
    링커 R은 폴리프롤린을 포함하고,
    R1은 이뮤노글로불린에 친화성을 나타내는 단백질을 나타내고,
    해당 R은, 해당 R1의 아미노산 서열의 C 말단 또는 N 말단에 결합되어 있는,
    친화성 리간드.
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