JP2008200038A - 新規タンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの利用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、SDS−PAGE法で分子量が約15kDaの成分の存在を示す、抗菌タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用法が提供される。
【選択図】 なし
Description
本発明は、抗菌活性を有する新規なタンパク質とその製造法、それをコードする遺伝子、及び上記タンパク質及び遺伝子の利用法に関するものである。詳細には、本発明は、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有するタモギタケ由来タンパク質、上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに上記タンパク質及び上記遺伝子の利用法に関する。
従来、植物病原菌に対して抗菌活性のある植物のタンパク質として、キチナーゼ、β−1,3−グルカナーゼなどの溶菌酵素が知られている。In vitro実験では、これらの酵素は単独でも効果があるが(Schlumbaum et al.(1986)Nature 324:p.365−367)、一般に2種類以上の酵素を組み合わせることにより、より高い効果が出ることが知られている(Mauch et al.(1988)Plant Physiol. 88:p.936−942)。これら溶菌酵素が糸状菌の生育を抑制する濃度は一般的には、単独の場合数十〜数百μg/ml程度、組み合わせの場合でも各々数μg/ml程度を必要とすることが知られている。しかしながら、これらの溶菌酵素の中で、イネの重要病害であるいもち病菌(Magnaporthe grisea)に対して抗菌的に働くことが証明されたものは未だ報告されていない。
本発明の目的の1つは、比較的低濃度でイネの重要病害であるいもち病菌をはじめとする様々な植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗菌タンパク質を検索、同定することである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の遺伝子を宿主生物(微生物、動物または植物など)に導入して形質転換体を作出し、本発明の遺伝子の利用を図ることである。
上記課題を解決することを目的として、本発明者らは、先ず、いもち病菌に対するin vitroでの抗菌活性を検定するためのアッセイ系を確立した。
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけNaCl濃度50mMから600mMの濃度で溶出する画分を回収する工程;
を含む、本発明の抗菌タンパク質の製造方法が提供される。
本発明の遺伝子は、典型的には、配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列(以下、本明細書中、単に「配列番号1又は3の塩基配列」という場合もある)、上記塩基配列中に1〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する。
配列表の配列番号1又は3に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように2つの領域を選択し:
1)各領域の長さが15−30塩基であること;
2)各領域中のG+Cの割合が40−60%であること;
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAを製造し、または、上記一本鎖DNAによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖DNAの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖DNAを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
本発明の第6の側面によれば、上記オリゴヌクレオチドの2種の組をプライマーとして用いて、タモギタケ子実体cDNAライブラリーを鋳型にして増幅反応を行い本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記cDNAライブラリーをスクリーニングして完全長cDNAクローンを単離することを含む、本発明の遺伝子の単離方法が提供される。
本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
本発明の第8の側面によれば、宿主生物に本発明の組換えベクターを導入して得られる形質転換体が提供される。
発明の実施の形態
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
本発明の第一の側面によれば、植物病原菌に対して抗菌効果のあるタモギタケ由来のタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の抗菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えDNAから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
本発明はまた、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のDNA、組換えDNA、化学合成DNAの何れでもよく、またゲノムDNAクローン、cDNAクローンの何れでもよい。
本発明によればまた、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号1または3に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように2つの領域を選択し:
1)各領域の長さが15−30塩基であること;
2)各領域中のG+Cの割合が40−60%であること;
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAを製造し、または、上記一本鎖DNAによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖DNAの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖DNAを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な2種をプライマー対として用いたPCR等の増幅反応に用いることが可能である。
本発明のタンパク質は極めて強力な抗菌活性をもつ。例えばイネのいもち病菌に対しては50ng/mlという非常に低い濃度で胞子の発芽を完全に抑制する(後述の実施例4を参照)。この濃度においては長時間のインキュベーションの後にも胞子の発芽はみられないことから、本発明のタンパク質のいもち病菌に対する効果は、生長の部分的阻害というよりはむしろ、殺菌効果であると考えられる。このような低い濃度(ナノグラムオーダー)で、病原菌の生育を完全に抑止できる抗菌タンパク質は本発明者の知る範囲では現在までに報告されていない。後述の実施例においては、抗菌タンパク質の精製のための抗菌アッセイのための植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌を使用したが、同定したタモギタケ抗菌タンパク質が、これ以外の紋枯病菌等の植物病害にも大差ないレベルで抗菌効果を有している可能性は極めて高い。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
例えば、細菌(E.coil, Bacillus subtilis等)の場合は、例えばCohenらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、プロトプラスト法[Mol.Gen.Genet.,168,111(1979)]やコンピテント法[J.Mol.Biol.,56,209(1971)]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1927(1978)]やリチウム法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法[Science,227,129(1985)]、エレクトロポレ−ション法[Nature,319,791(1986)]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology,52,456(1973)]、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法[Mol.Cell.Biol.,3,2156−2165(1983)]によってそれぞれ形質転換することができる。
本発明のタンパクは強い抗菌活性をもつ。例えば我々の用いた抗菌アッセイではイネのいもち病菌に対して50ng/mlという低い濃度で菌糸の成長を抑制する。後述の実施例においては、抗菌アッセイ用の植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌と紋枯病菌を使用し、本発明で同定したタモギタケ抗菌タンパクはこれらに対して抗菌作用を示した。本発明のタンパク質がいもち病菌以外の他の植物病原菌に対しても抗菌効果を有している可能性が高い。
散布量は、植物の種類、生育段階、症状、散布方法、処理時間、散布するタンパク質の種類(全長のタンパク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入及び/又は付加したクンパク質など)、生育している場所の気候、生育している場所の土壌などにより異なるが、一日一回から複数回毎日ないし数日おきに散布することができる。散布量は種々の条件により変動する。本発明の抗菌剤の散布に際しては、必要に応じて、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して散布することも可能である。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば蒸留水、食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
これらは、必要に応じてバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた、例えば凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物の形態で製造し、使用前に無菌の蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
1. Schlumbaum et al.(1986)Nature 324:p.365−367
2. Mauch et al.(1988)Plant Physiol. 88:p.936−942
3. 特表平8−505048
4. Oita et al.(1996)Biosci. Biotech. Biochem. 60:p.481−483
5. Terras et al.(1992)J. Biol. Chem. 267:p.15301−15309
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7. Broglie et al.(1991)Science 254:p.1194−1197
8. Terras et al.(1995)The Plant Cell 7:p.573−588
9. Nishizawa et al.(1999)Theor Appl Genet 99:383−390
10. Alexander et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:p.7327−7331
11. Wu et al.(1995)Plant Cell 7:p.1357−1368
12. Hain et al.(1993) Nature 361:p.153−156
13. Bayer et al. (1995) Biochim Biophys Acta 1263:p.60−66
14. Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Res 14:p.1871−1882
15. Freitag et al.(1997) Protein Sci.6:p.1157−1166
16. Gope et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:p.3595−3606
17. Keinanen et al. (1994) Eur J Biochem 220:p.615−621
18. Gitlin et al.(1988)Biochem.J 256:p.279−282
19. Gitlin et al(1990)Biochem J 269:p.527−530
20. Hofmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:p.4666−4668(1980)
21. Garwin et al.WO/8602077
22. Liang.WO/9707244
23. Skerra et al. EP835934
24. Kopetzki. WO/9711186
25. Howard and Albertsen.WO/9640949
26. Czapla et al.WO/9400992
27. Baszczynski et al. US Pat. No.5767379
本発明の配列番号2または4のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはその一部の配列からなりかつビオチンまたはその誘導体と結合する能力を有するポリペプチドを含むことを特徴とするタンパク質成分を有効成分として含む製剤を作出すれば、抗菌剤としての利用が期待できる。
実施例
実施例1 アッセイ系の構築
1)検定系の確立
病原菌の培養:イネいもち病菌(菌株TUS−1、レース337;農林水産省東北農業試験場より分譲)はオートミル培地(Difco社製,1%ショ糖添加)上で培養して分生胞子を得て、接種源とした。胞子液は必要に応じて10%グリセロールを加えて、−80℃で保存した。
市販のタモギタケ(Pleurotus cornucopiae)子実体100gをあらかじめハサミで細かく切断後、液体窒素を用いて凍結して乳鉢で細粉となるまで磨砕し、300mlの100mM HEPES−KOH緩衝液pH7.5を加えて緩やかに撹拌しながら4℃で30分間抽出を行った。抽出液はミラクロスでろ過後、10,000´g、20分間の遠心を行った。上清に硫安を75%飽和になるように加えて、一晩4℃で静置した。次に15,000´g、20分間の遠心で沈殿させて、沈殿物を3mlの10mM HEPES−KOH緩衝液、pH7.5に溶解し、透析チューブ(Spectra/Por1 MWCO 6−8000,Spectrum Medical Industries社製)を用いて20mM HEPES−KOH緩衝液、pH7.5に対して透析を行った。不溶物を遠心によって除去しタモギタケタンパク質試料とした。タモギタケタンパク質試料のタンパク質濃度は牛血清アルブミン(BSA)を標準タンパク質としてBradford法で測定した。
1)タモギタケ粗タンパク試料の抗菌活性
上記のいもち病菌、紋枯病菌の培養系に培養開始直後にタモギタケタンパク質試料を一定量加えて、培養2日後(46−48時間後)の吸光度を測定して抗菌性の有無について判定した。その結果、タモギタケの抽出物の中にはいもち病菌、紋枯病菌両菌に対して高い抗菌活性をもつ物質が含まれていることが明らかとなった。阻害の様式は、いもち病菌の場合、発芽の完全抑制や菌糸の生長阻害が観察され、紋枯病菌の場合は菌糸の生長阻害が観察された。いもち病菌の細胞の場合、その細胞質が細胞壁から離れ原形質分離様の様相を呈していた。
次に抗菌タンパクの精製を行った。粗タンパク試料150mg/20mlをまず、イオン交換単体Q Sepharose FF(Pharmacia社製)を充填した自製カラム(内径1.5cmX長さ10cm、単体容量10ml)にかけ、抗菌タンパクを部分精製した。流速は2ml/分とし、基本緩衝液は50mM Tris pH8.0, 50mM NaCl、溶出緩衝液は50mM Tris pH8.0,600mM NaClを、グラジェント(NaClで50mMから600mM)は、100分間かけた。各画分(12.5ml)の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、SDS−PAGE電気泳動に供試した。各画分のタンパク質溶液に等量の2´SDS泳動用緩衝液(Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning 2nd edition、Cold Spring Harbor)を加え、95℃で5分間処理した後、Laemmli(Laemmli(1970)Nature 227:p.680−685.)の方法に従い、SDS−PAGE電気泳動を行った。ゲルは15%のPAGEL(ATTO社製)を用い、銀染色IIキットワコー(和光純薬社製)によりタンパク質を検出した。タンパクのおよその分子量と量を見積もるため、分子量マーカー(LMW マーカーキット:Pharmacia LKB社製、分子量の大きい順に94kDa、67kDa、43kDa、30kDa、20.1kDa、14.4kDa)を泳動した。タンパク質の銀染色による電気泳動像と抗菌性の強さとの関係を図2に示した。
タモギタケ抗菌タンパクの精製、そしてnativeな状態での分子量を推定するため、上記のMonoQ画分の#41−46をウルトラフリーMC 10,000 NMWL フィルターユニット(ミリポア社製)で濃縮し、ゲル濾過カラムSuperose6 HR 10/30(Pharmacia社製)に供試した。流速は0.5ml/分とし、緩衝液は50mM MES−NaOH pH6.0、50mM NaClを用いた。まずGel filtration standard(BIO−RAD社製)によりタンパクの分子量とおよその溶出時間を把握した後、抗菌活性のあるMonoQ画分を打ち込んだ。
1)タモギタケ抗菌タンパクのアミノ酸配列の解読
上記のSuperose6画分をウルトラフリーMC 10,000 NMWL(ミリポア社製)で濃縮し、SDS−PAGE電気泳動した。トリスを除去し、グリシンを含まない緩衝液系でPVDF膜(ミリポア社製)へ転写し、クマシーブリリアントブルーR−250で軽く染色した後、脱色した。その後、抗菌性に関与すると考えられた15kDaのタンパクバンドを切り出した。また15kDaのタンパク質をリシルエンドペプチダーゼ(和光純薬工業社製)若しくはV8プロテアーゼ(和光純薬工業社製)で部分消化した。
N末端−Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr−C末端 (配列番号5)
が決定された(上記アミノ酸配列において、Xaaは未定、以下同様)。また、14kDaタンパクのリシルエンドペプチダーゼ消化物からは次のような50アミノ酸:
N末端−Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val−C末端 (配列番号6)
また、14kDaタンパクのV8プロテアーゼ消化物からは次のような21アミノ酸:
N末端−Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly−C末端 (配列番号7)
また、12kDaタンパクからは次のような23アミノ酸
N末端−Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu−C末端 (配列番号8)
が決定された。
N末端−Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val−C末端 (配列番号9)
2)縮重プライマーの設計
1)で決定されたアミノ酸配列を基に、考えられる全ての塩基がミックスされた4つのプライマーを合成した。括弧内の数字は縮重度を示す。
TMR1: 5'-acnggnacntggtayaayg-3’(256)
(配列番号9の2番目のアミノ酸残基Thrないし8番目のGluに対応) (配列番号10)
TMR2: 5'-garytiggiwsnacnatgaa-3’(256)
(配列番号9の8番目のアミノ酸残基Gluないし14番目のAsnに対応) (配列番号11)
TMF1: 5'-gtrttytcraaiswiacn-3’(128)
(配列番号9の59番目のアミノ酸残基Alaないし65番目のThrに対応) (配列番号12)
TMF2: 5'-cciarigtnacnccytgncc-3’(256)
(配列番号9の51番目のアミノ酸残基Glyないし57番目のGlyに対応) (配列番号13)
但し、上記において「i」は「イノシン」を、「r」は「g又はa」を、「y」は「c又はt」を、「w」は「a又はt」を、「s」は「g又はc」を、そして「n」は「a又はg又はc又はt」をそれぞれ表す。
タモギタケ子実体からSDSフェノール法で全核酸を抽出し、塩化リチウム沈殿により全RNAを回収した。ここからmRNA purification kit(Pharmacia社製)によりタモギタケmRNAを調製した。子実体約5gから10μgのmRNAが得られた。このうち5μgをZAP cDNA synthesis kit (Stratagene社製)に供試し、cDNAを合成した。。ゲル濾過カラムによりおよそ0.5〜5kbのcDNAを分画し、Uni−ZAP XR ベクター(Stratagene社製)にライゲーションし、GigapackIII(Stratagene社製)によりパッケージングを行った。全ての手順はキット添付の説明書に従った。構築したタモギタケ子実体cDNAライブラリーのタイターは、およそ300万pfuと算出された。
2)で合成したプライマーを用いて3)で合成したcDNAを鋳型にPCRを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなるタモギタケ抗菌タンパクの部分長cDNAの増幅を試みた。反応条件は以下のように行った。50μlの反応液中に、cDNA 10ng,10´Ex taq buffer 5μl,2.5mM 各dNTPs 4μl,プライマー 5ピコモル/各配列,Ex taq(Takara社製)+Taq START 抗体(Clontech社製) 1μlをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムPC−700(ASTEK社)を用いて、94℃ 3分を1回、94℃ 1分、50℃ 1分、72℃ 1分を35 回、72℃ 6分を1回行った。その結果、TMR1−TMRF1、TMR1−TMRF2、TMR2−TMRF1、TMR2−TMRF2の全てのプライマー組み合わせにおいて、各々およそ150〜190bpの産物が増幅された。
4)で得られたcDNAクローンTM100、TM75をベクターから切り出し、これをプローブに用いてタモギタケ子実体cDNAライブラリーをスクリーニングした。14×10cmの角形シャーレにZAP cDNA synthesis kit(Stratagene社製)の説明書きに従って、約20,000pfuのファージを宿主菌XL1−blue MRF’とともにプレーティングした。プラークをHybond−N+ナイロンメンブレンフィルター(Amersham社製)に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いDNAを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブはrediprime IITM DNA labelling system(Amersham社製)を用いて32Pラベルした。ハイブリダイゼーションは0.5M NaHPO4(pH7.2)、7%SDS、1mM EDTA中で65℃で一晩、洗浄の条件は40mM NaHPO4(pH7.2)、1%SDS、1mM EDTA中で65°C、20分を2回行った。1次スクリーニングで約160,000pfuのファージからTM100プローブで600個、TM75プローブで30個のポジティブクローンが得られた。うちTM100プローブで24個、TM75プローブで12個のクローンに関して、2次スクリーニング、プラークの精製を兼ねた3次スクリーニングを行い、選抜されたクローン全てについてZAP cDNA synthesis kit(Stratagene社製)の説明書きに従って、in vivo excisionを行った。その結果、TM100プローブで18個、TM75プローブで12個のクローンが、ファージミドベクターpBluescript SKに組み込まれたcDNAとして回収された。これらのクローンに関して制限酵素分析によりインサート長を同定した。
上記の各cDNAクローンについて、最長のクローンの全塩基配列を両鎖とも決定した。まず、M13プライマー(takara)を用いて、ABI PRISM蛍光シークエンサー(Model 310 Genetic Analyzer,Perkin Elmer社製)でクローンの5’、3’両部分の塩基配列を決定した。
TM100inRV: gTC AAg gCg TTA CTC Tgg
(配列番号14)
を、同3’部分の塩基配列情報を基にプライマー
TM100inFW: CTg ggT gAg gAT CAC CTC
(配列番号15)
を、さらにTM75由来の最長クローンの5’部分の塩基配列情報を基に、プライマー
TM75inRV: gAT gTC TAC gTg CCC TAC
(配列番号16)
を、同3’部分の塩基配列情報を基にプライマー
TM75inFW: ACg ACT CAg AgA AgA ACT g
(配列番号17)
をそれぞれ合成し、配列決定に利用した。以上のようにしてTM100及びTM75由来の最長クローンについてDNAの両鎖の配列を解読し、全塩基配列を決定した。
本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種であるD−ビオチン(ビタミンH、片山化学工業社製)と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビオチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアッセイ培地に存在する遊離ビオチンと結合し、これが培地中のビオチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えれると予測される。
1)発現ベクターの構築
tam2遺伝子は本発明のtam1遺伝子のホモログとして単離された遺伝子であるが、このtam2遺伝子によってコードされるtamavidin2が、実際にビオチン結合活性を示すか否かを調べた。具体的にはtam2遺伝子を大腸菌に組み込み、組換えtamavidin2を発現させ、このタンパク質がイミノビオチンカラムで精製されるか否かを調べた。
TM75Bsp5: 5’−ACCAACATgTCAgACgTTCAA−3’
(配列番号18)
TM75Hin3: 5’−ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCgg−3’
(配列番号19)
を合成した。TM75Bsp5には制限酵素BspLU 11Iの認識部位(下線で示した)が、TM75Hin3には制限酵素HindIIIの認識部位(下線で示した)がそれぞれ組み込まれている。これらのプライマーを使ってtam2遺伝子が組み込まれたプラスミド(pBluescript、実施例3(6))を鋳型にPCRを行なった。50μlの反応液中に、鋳型プラスミドDNA 500ng,10´Pyrobest buffer 5μl,2.5mM 各dNTPs 4μl,各プライマー 10pmoles,Pyrobest DNA polymerase(Takara社製) 0.5μl、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムPC−700(ASTEK社製)を用いて、94℃、3分を1回、94℃、1分、50℃、1分、72℃、1分を15回、72℃、6分を1回行った。
tam2が組み込まれた発現ベクターpTrc99Aをもつ大腸菌TB1の単一コロニーを、抗生物質アンピシリンを含むLB培地に接種し、OD600=0.5程度になるまで菌を前培養した。次いで、IPTGを最終濃度で1mM加え、タンパク質発現を誘導し、37℃でさらに4.5時間振盪培養した。培養スケールは50mLとし、IPTG(Isopropyl−b−D(−)−thiogalactopyranoside、和光純薬社製)を加えないものを対照とした。菌体を遠心分離によって集め、タンパク質精製まで−80℃で保存した。
Claims (26)
- タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、SDS−PAGE法で分子量が約15kDaの成分の存在を示す、抗菌タンパク質。
- N末端が、配列表の配列番号9記載のN末端アミノ酸配列:
Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val
(ここにおいてXaaは不明である)
を有する、請求項1に記載の抗菌タンパク質。 - 配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に1から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と52%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質。
- 配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項3に記載の抗菌タンパク質。
- 配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項3に記載の抗菌タンパク質。
- 配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項3に記載の抗菌タンパク質。
- 配列番号2または4に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項3に記載の抗菌タンパク質。
- 配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項3に記載の抗菌タンパク質。
- 配列番号2の部分アミノ酸配列8−143又は配列番号4の部分アミノ酸配列8−141からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に1〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと52%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質。
- タモギタケの水性抽出液から硫安75%飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程;および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけNaCl濃度50mMから600Mの濃度で溶出する画分を回収する工程;
を含む、請求項1ないし9のいずれか1項に記載の抗菌タンパク質の製造方法。 - 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列、上記塩基配列中に1〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する請求項11に記載の遺伝子。
- 配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列と60%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項11又は12に記載の遺伝子。
- 配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列と70%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項11又は12に記載の遺伝子。
- 配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項11又は12に記載の遺伝子。
- 配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項11又は12に記載の遺伝子。
- 配列番号1の塩基71−502の塩基配列又は配列番号3の塩基226−651の塩基配列と95%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項11又は12に記載の遺伝子。
- タモギタケ由来の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列番号1又は3に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように2つの領域を選択し:
1)各領域の長さが15−30塩基であること;
2)各領域中のG+Cの割合が40−60%であること;
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAを製造し、または、上記一本鎖DNAによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖DNAの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖DNAを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチド。 - 配列番号10ないし19の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する請求項18に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項18又は19に記載のオリゴヌクレオチドの2種をプライマー対として用いて、タモギタケ子実体cDNAライブラリーを鋳型にして核酸増幅反応を行い請求項1ないし9のいずれか1項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記cDNAライブラリーをスクリーニングして完全長cDNAクローンを単離することを含む、請求項11ないし17のいずれか1項に記載の遺伝子の単離方法。
- 請求項11ないし17のいずれか1項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- ベクターが発現ベクターである請求項21に記載の組換えベクター。
- 宿主生物に請求項21または22に記載の組換えベクターを導入して得られる形質転換体。
- 病害抵抗性植物である、請求項23の形質転換体。
- 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤。
- 請求項23の形質転換体によって発現される、組換えタンパク質。
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