WO2009123347A1 - ウイルス定量法 - Google Patents

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WO2009123347A1
WO2009123347A1 PCT/JP2009/057039 JP2009057039W WO2009123347A1 WO 2009123347 A1 WO2009123347 A1 WO 2009123347A1 JP 2009057039 W JP2009057039 W JP 2009057039W WO 2009123347 A1 WO2009123347 A1 WO 2009123347A1
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virus
carrier
lectin
hhv
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PCT/JP2009/057039
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高倉由光
市川雅子
近藤一博
清水昭宏
Original Assignee
日本たばこ産業株式会社
株式会社 ウイルス医科学研究所
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Priority to EP09727611A priority patent/EP2267151A4/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/36—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying the number of human herpesvirus (HHV) collected from a body fluid, and a kit for performing the method.
  • HHV human herpesvirus
  • the main cause of the delay in research and prevention / treatment of “fatigue” is that there is no method for objectively measuring “fatigue”.
  • saliva is preferably used as a sample, but it has been known that salivary gland has a high endogenous piotin content in the salivary glands (Green, M., et a., J. Cl in Pathol., (1992) 45 (9): 788-790).
  • a method for quantifying viruses a method for quantifying viral DNA by PCR (Kido, S., et al., J. Med. Vi rol., (1990) 32: 139-142), double-nested PCR The method (Kondo, K ⁇ , et al., J. Infect. Dis., (1993) 167: 1197-1200) etc. which measure by the method (Double-Nested PCR) are known.
  • a method for the quantification of retroviruses a method is also disclosed in which a retrovirus containing a viral nucleic acid containing a labeled sequence is used as an internal standard when the amount of viral DNA is measured by quantitative PCR (W095 / 034684).
  • an immunoassay method (Immunoassay method) using an antibody against the viral protein.
  • the sandwich EL ISA method can be mentioned (Gerna, G., et al., J. Clin. Microbiol., (1983) 17: 942—944).
  • the method of increasing the virus concentration in the solution and concentrating the virus is, for example, the m heart method, but this method requires expensive equipment and a long separation time, and requires a lot of labor for the work. It becomes.
  • there is a method of precipitating the virus with ammonium glycol sulfate and concentrating it but in these methods, the reagents used inhibit the PCR for subsequent virus detection, so the sample is purified after virus precipitation. There was a problem that it was necessary.
  • a method using magnetic particles bound with mannose-binding lectin has been disclosed (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-165591).
  • Patent Document 1 International Publication No. W02006 / 006634 Pamphlet
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. W095 / 034684
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-165591
  • Patent Document 4 International Publication No. W02001 / 079456 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Green, M., et al., J. Clin. Pathol., (1992) 45 (9): 788-790
  • Non-Patent Document 2 Kido, S., et al., J. Med. Virol. , (1990) 32: 139-142
  • Non-patent literature 3 Kondo, K., et al., J. Infect. Dis., (1993) 167: 1197-1200
  • Non-patent literature 4 Gerna, G., et al., J. Clin. Microbiol., (1983 17: 942-944 Summary of the Invention
  • HHV human herpesvirus
  • the present inventors have mixed a carrier combined with a substance capable of binding to HHV in a body fluid to bind to the target virus, and recovered the carrier by a magnet or centrifugation.
  • concentration could be easily quantified by PCR, LAMP, ELISA, and the like.
  • the present inventors succeeded in performing accurate quantification by performing a series of steps by adding a certain amount of reference virus to, during the quantification process.
  • this method it was possible to perform simpler and more accurate quantification by using mutant HHV as a reference virus.
  • the present invention provides a novel quantification method that enables simpler and more accurate measurement of HHV in sputum, and a kit for performing the method of the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a method for quantifying the number of human herpesviruses collected from a body fluid comprising the following steps:
  • the solution of (1) is brought into contact with a virus-binding substance, where (i) the virus-binding substance is linked to a molecule that can bind to the carrier, and is further bound to the carrier via the molecule.
  • the virus bound to the virus-binding substance indirectly binds to the carrier, or (ii) the virus-binding substance is directly bound to the carrier, so that the virus bound to the virus-binding substance is bound to the carrier.
  • the recovery rate was evaluated by comparing the number of recovered reference viruses with the number of reference viruses added in (1). From the number of human herpesviruses quantified in (4) and the recovery rate, Determine the number of chick herpesviruses collected; Including the method.
  • a method for quantifying the number of human herpesviruses collected from a body fluid comprising the following steps:
  • the recovery rate was evaluated by comparing the number of recovered reference viruses with the number of reference viruses added in (1). From the number of human herpesviruses quantified in (4) and the recovery rate, Determine the number of human herpesviruses collected;
  • a method for quantifying the number of human herpesviruses collected from saliva comprising the following steps:
  • the recovery rate was evaluated by comparing the number of recovered reference viruses with the number of reference viruses added in (1). From the number of human herpesviruses quantified in (4) and the recovery rate, Determine the number of chick herpesviruses collected;
  • Aspect 4 The person according to any one of aspects 1 to 3, wherein the human herpesvirus is human herpesvirus 6 (HHV-6) or human herpesvirus 7 (HHV-7) Law.
  • Aspect 5 The method according to any one of aspects 1 to 3, wherein the reference virus is a recombinant virus derived from HHV-6 or HHV-7.
  • the lectin contains at least one of N-acetyl galactosamine (GalNAc), ⁇ 2-6 linked sialic acid (Siaa2-6), and N-acetyl darcosamine (G l cNAc).
  • Aspect 7 The method according to Aspect 6, wherein the lectin is selected from the group consisting of SBA (derived from soybean), SSA (derived from two-spotted licorice), DSA (derived from datura), and WGA (derived from wheat germ).
  • SBA derived from soybean
  • SSA derived from two-spotted licorice
  • DSA derived from datura
  • WGA derived from wheat germ
  • Embodiment 8 The method according to any one of embodiments 1 to 3, wherein step (4) comprises quantifying the number of viruses by a method selected from the group consisting of PCR, LAMP, and ELISA.
  • a method for quantifying the number of human herpesvirus 6 (HHV-6) or human herpesvirus 7 (HHV-7) collected from saliva comprising the following steps:
  • the pictinated lectin with the solution in (1), bring the virus into contact with the piotinated lectin, add beads that bind to the piotin-binding protein, and then add the virus that binds to piotin-lectin to the beads.
  • the lectin is selected from the group consisting of SB A (from soybean), SSA (from Nihontoko), DSA (from Datura), and WGA (from wheat germ) force;
  • the number of viruses recovered from the separated beads is quantified by a method selected from the group consisting of PCR, LAMP, and ELISA:
  • the recovery rate was evaluated by comparing the number of recovered reference viruses with the number of reference viruses added in (1). From the number of human herpesviruses quantified in (4) and the recovery rate, Determine the number of flu herpesviruses collected; Including the method.
  • Aspect 10 A method for quantifying the number of human herpesviruses collected from, comprising the following steps:
  • the recovery rate was evaluated by comparing the number of recovered reference viruses with the number of reference viruses added in (1). From the number of human herpesviruses quantified in (4) and the recovery rate, Determine the number of human herpesviruses collected;
  • a kit for quantifying the number of human herpesviruses collected from a body fluid comprising:
  • a kit for quantifying the number of leopard herpesvirus collected from a body fluid comprising:
  • the lectin contains at least one of N-acetyl galactosamine (GalNAc), ⁇ 2-6 conjugated sialic acid (S ia ⁇ 2-6), and ⁇ -acetyl darcosamine (GlcNAc).
  • the lectin is selected from the group consisting of SBA (derived from soybean), SSA (derived from two-spotted toco), DS A (derived from datura), and WGA (derived from wheat germ).
  • the reference virus is a recombinant virus derived from HHV-6 or HHV-7;
  • a method for quantifying the number of human herpesviruses collected from ⁇ liquid comprising the following steps:
  • the collected sickle is brought into contact with a virus-binding substance, where (i) the virus-binding substance is linked to a molecule that can bind to the carrier, and is further bound to the carrier via the ⁇ .
  • the virus bound to the virus-binding substance indirectly binds to the carrier, or (ii) the virus-binding substance is directly bound to the carrier, so that the virus bound to the virus-binding substance binds to the carrier.
  • Aspect 16 Method for quantifying the number of human herpesviruses collected from saliva, comprising the following steps:
  • the concentration in the body fluid is very low, and the quantification is not easy if it is as it is.
  • the quantification of HHV that requires skill can be performed easily and more accurately.
  • Figure 1 is a fluorescence micrograph showing the results of testing for nonspecific adsorption of HHV-6 to tamavidin beads.
  • the green light points indicate that EGFP recombinant HH V-6 is infected with MT-4 cells, one of the Indike overnight cells, and one dot represents one infectious virus particle ( The difference in brightness at each point is due to the difference in viral gene expression after infection. is there).
  • the photo on the left shows the case where HHV-6 virus solution (stock solution) was allowed to act on MT-4 cells.
  • the photo on the right shows the case where HHV-6 virus solution (stock solution) was contacted with evening mavidin beads in the absence of lectin, and the virus adsorbed on tamavidin beads was allowed to act on MT-4 cells.
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph showing the results of testing the effect of HHV-6 on the lectins ABA, DSA, Lotus, MAM, and PHA-E4.
  • the dots that glow in green indicate that EGFP recombinant HHV-6 is infected with MT-4 cells, which are indigenous overnight cells, and one dot represents one infectious virus particle (each The difference in brightness of the spots is due to the difference in viral gene expression after infection).
  • Figure 3 shows HH with PHA—L4, UEA—I, SBA, and S S A lectins.
  • the present invention is a method for quantifying the number of human herpesviruses collected from a body fluid, comprising the following steps:
  • the collected body fluid is brought into contact with a virus-binding substance, where (i) the virus-binding substance is linked to a molecule that can bind to the carrier, and is further bound to the carrier via the molecule.
  • the virus bound to the virus-binding substance indirectly binds to the carrier, or (ii) the virus-binding substance is directly bound to the carrier, so that the virus bound to the virus-binding substance binds to the carrier.
  • the method is provided.
  • the present invention is a method for quantifying the number of human herpesviruses collected from a body fluid, The following steps:
  • the solution of (1) is brought into contact with a virus-binding substance, wherein (i) the virus-binding substance is linked to the carrier so that it can bind to the carrier, and further, by binding to the carrier via the molecule.
  • the virus bound to the virus-binding substance indirectly binds to the carrier, or (ii) the virus-binding substance is bound directly to the carrier, so that the virus bound to the virus-binding substance binds to the carrier.
  • the recovery rate was evaluated by comparing the number of recovered reference viruses with the number of reference viruses added in (1). From the number of human herpesviruses in the body fluid determined in (4) and the recovery rate, Determine the number of human herpesviruses collected from body fluid force;
  • the method is provided.
  • the virus to be quantified in the method of the present invention is a virus capable of quantifying baboon fatigue, and specifically, a virus belonging to the Herpesviridae that infects humans, that is, human herpes.
  • Pesvirus (hereinafter also referred to as HHV).
  • human herpesvirus 6 variant A and B of human herpesvirus 6: hereinafter also referred to as HHV-6
  • human herpesvirus 7 hereinafter also referred to as HHV-7
  • Human herpesvirus is a double-stranded DNA virus that infects humans.
  • HHV-6 is a virus with a diameter of about 200 nm.
  • Body fluids to be analyzed by the method of the present invention are blood, saliva, serum, semen, breast milk, and pharyngeal wipes. It can be any fiber collected from the human body, such as cervical fluid, brain fluid, ascites, sweat, tears, urine, etc. Saliva is preferred. In the present specification, the body fluid to be analyzed by the method of the present invention may be simply referred to as “sample”.
  • Examples of the method for collecting saliva include a method of wiping the viscous fluid of the pharynx with a cotton swab, a method of directly discharging saliva to the collection tube, a method of using a saliva collection device such as salivette (Sarusutsu 3 ⁇ 4) and the like.
  • a method using a salivet is preferred.
  • saliva is collected by putting cotton in the mouth and letting saliva soak into the cotton, and then transferring the cotton soaked in saliva to a centrifuge tube and centrifuging it.
  • oral treatment before collecting saliva includes, for example, a method of resting without eating for a long time or a method of rinsing the oral cavity with water immediately before collecting saliva.
  • the rinse method is preferred.
  • body fluids other than saliva can be collected by methods known to those skilled in the art. As long as the collected body fluid does not affect the quantification of virus particles and virus DNA, it may be subjected to appropriate treatments such as dilution, filtration, and centrifugation before measurement. Alternatively, if virus quantification is not performed immediately, it may be refrigerated or cryopreserved by methods known to those skilled in the art as needed until measurement.
  • the virus-binding substance refers to a substance that can bind to HHV.
  • Substances that can bind to HHV include lectins and antibodies to HHV.
  • lectin refers to a sugar-binding protein that recognizes and binds to a sugar chain.
  • the sugar chain to which the lectin binds has specificity for each lectin.
  • the lectin used in the present invention is not particularly limited as long as it can bind to HHV, but preferably has a high affinity with the virus to be quantified and a high recovery rate of the virus. More preferably, N-acetyl galactosamine (G al NA c;), sialic acid with 2-6 linkage (S ia ⁇ 2-6)> less ⁇ -acetyl darcosamine (G 1 c NA c) More preferably, it is a lectin that binds to a sugar chain containing one, and more preferably SBA (soybean-derived lectin.
  • SBA sibean-derived lectin.
  • Linked sugar chain sugar chain containing N-acetylylgalactosamine (G al NA c)), SSA (derived from Nihon Nikko) Lectin Binding sugar chain: ⁇ 2 _ 6-linked sialic acid (S ia ⁇ 2— 6) sugar chain containing), DSA (Datura-derived lectin. Binding sugar chain: N-acetylyl darcosamine (G lc NA c) containing sugar chain), and WGA (wheat germ-derived lectin. Binding sugar chain: N—A A lectin selected from the group consisting of cetyldarcosamine (G lcNAc) or a sugar chain containing sialic acid). In particular, SBA and WG A are more preferred when the virus to be quantified is HHV-6.
  • the antibody against HHV used in the present invention is not particularly limited as long as it can bind to HHV, and may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the virus-binding substance may be used by directly binding to a carrier.
  • the virus-binding substance may be used indirectly bound to a carrier.
  • An example of indirect binding is the binding of a virus binding substance and a carrier through the binding of piotin and a pyotin binding protein. More specifically, the virus-binding substance and the carrier are indirectly bound by piotinizing the virus-binding substance and binding the protein to the surface of the carrier and binding the protein to the protein. Bonding can be achieved.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is a solid or insoluble material (for example, a material that can be separated from the reaction mixture by filtration, application, magnetic separation, etc.).
  • Materials that make up the solid support are cellulose, Teflon (registered trademark), nitrocellulose, agarose, highly cross-linked spherical agarose, dextran, chitosan, polystyrene, polyacrylamide, polyester, polycarbonate, polyamide, polypropylene, naycan, polydivinylidene Fluoride, Latex, Silica, Glass, Glass, Gold, Platinum, Silver, Copper, Iron, Stainless steel, Ferrite, Silicon wafer, Polyethylene, Polyethyleneimine, Polylactic acid, Resin, Polysaccharide, Protein (albumin etc.), Including but not limited to carbon or combinations thereof.
  • Solid carrier shapes include but are not limited to beads, magnetic beads, thin films, tubules, filters, plates, microplates, carbon nanotubes, sensor chips, etc. As is known in the art, G, groove, filter bottom, etc. may be provided.
  • the magnetic 14 beads may have a sphere diameter ranging from about 10 nm to about 1 mm. In preferred embodiments, the magnetic beads have a diameter in the range of about 25 nm to about 1 mm, about 50 nm to about 100 Hm. The size of the magnetic beads can be selected depending on the particular application. In one embodiment of the invention, beads composed of highly cross-linked spherical agarose, such as Sepharose, can have a diameter in the range of about 24 / m to about 1665 m. In a preferred embodiment, the highly crosslinked spherical agarose beads have a diameter in the range of about 24 / m to about 44 m. The size of the highly crosslinked spherical agarose beads can be selected depending on the particular application.
  • solid supports having a hydrophobic surface examples include polystyrene latex beads such as those commercially available from Polysciences or Spherotech.
  • silica (S i 0 2 ) -treated or silica (S i O 2 ) based solid supports examples include superparamagnetic silica beads available from Polysciences. Alternatively, M_280, etc. commercially available from Dynal Biotech can also be used.
  • magnétique beads having a hydrophilic surface examples include beads commercially available from Polysciences under the name B i om ag® Rupoxyl or Peas from Bangs Laboratory (MC O 2 N / 2 9 2 8) Etc. Alternatively, M-270 or the like commercially available from Dynal Biotech can be used.
  • the virus-binding substance and the carrier can be used by directly binding to each other.
  • the carrier is a nanobead having a size capable of Brownian motion.
  • the preferred sphere diameter range of the nanobeads is 10 nm to: sphere diameter of L 00 nm, more preferably sphere diameter of 30 nm to 70 nm.
  • magnetic nanobeads such as MACS MicroBeads (diameter 50 nm) of Miltenyi Biotech. Is mentioned.
  • the virus-binding protein and carrier can be linked using a protein-carrier coupling method known to those skilled in the art.
  • the carrier surface is modified so that the carboxyl group is exposed, and
  • the protein and carrier can be linked by coupling the amino group of the protein in the presence of the crosslinking agent 11-ethyl-3_ (3-dimethylaminopropyl) carpositimide (EDC).
  • EDC crosslinking agent 11-ethyl-3_ (3-dimethylaminopropyl) carpositimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the cross-linking reagent BS 3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate) or DS S (disuccinimidyl suberate) can be used to replace the carrier surface and amino protein groups, or the cross-linking reagent.
  • SPDP N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate
  • GMBS N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide
  • the virus-binding substance may be used indirectly bound to a carrier.
  • indirect binding of a virus-binding substance and a carrier is achieved by piotating a virus-binding substance, binding a protein that binds to the surface of the carrier, and binding the protein to the protein. it can.
  • beads can be preferably used as the carrier, but the preferred sphere diameter range of the beads is 0.1 zm to: L 00 zm sphere diameter, more preferably 0.5 ⁇ m to 10 m.
  • Piotin is the general name for D — [(+) — cis-hexahydro-2-year-old xo-1H-thieno- (3,4) -imidazole 4-valeric acid]. .
  • Piotin is a type of water-soluble vitamin classified into the vitamin B group, sometimes called vitamin B 7 , or sometimes called vitamin H or coenzyme R. Piotin binds very strongly to avidin, a glycoprotein contained in egg white.
  • “piotin” means iminobiotin (Hofmann, et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4666- 4668), desthiobiotin ( desthiobiotin) (Hirsch, et al., (2002) Anal. Biochem., 308: 343-357), or other biotins such as biocytin and biotin sulfoxide.
  • PI ERCE manufactured by PI ERCE (linker length, reactive group in Katsuko)
  • EZ-Link registered trademark Sulfo- HS-Biotin (13.5 A, primary amine
  • EZ-Link (Registered trademark) Sulfo- HS-LC-Biotin (22.
  • piotinizing reagent it is possible to bind piotin to a virus-binding substance such as lectin using a known method.
  • a piotination reagent containing NHS ester dissolve it in an organic solvent such as DMSO (dimethyl sulfoxide) or a pH 7_9 phosphate buffer, and add it to a virus-binding substance such as lectin.
  • a virus-binding substance such as lectin.
  • Piotin can be bound.
  • a piotation reagent containing an amino group use a calpositimide such as EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide / hydride chloride).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide / hydride chloride
  • a piotination reagent dissolved in a buffer solution having a pH of about 5 may be added to bind the piotine.
  • a virus-binding substance such as lectin to which piotin is bound may be purchased from J-0il Mills as a piotin-labeled lectin.
  • a biotin labeling kit such as, but not limited to, EZ-Unk (registered trademark) NHS-Lc-Biotin manufactured by Pierce or Biotin Labeling Kit-NH2 manufactured by Dojindo Molecular Technologies
  • EZ-Unk registered trademark
  • NHS-Lc-Biotin manufactured by Pierce or Biotin Labeling Kit-NH2 manufactured by Dojindo Molecular Technologies
  • a gene for a virus-binding substance such as a lectin is fused with a DNA encoding a peptide containing a piotinization sequence, and a vector that expresses this fusion gene is constructed.
  • a pyotinylated lectin may be prepared by expression as a fusion protein of (Schwarz et al., (1988). J. Biol. Chem. 263: 9640-9645).
  • Examples of such vectors include, but are not limited to, vectors containing Invitrogen's BioE ase TM tag.
  • examples of the piotine-binding protein include avidin, streptavidin, neutravidin, AVR protein (Biochem. L, (2002), 363: 609-617), bradavidin (J. Biol. Chem., (2005), 280: 13250-13255), Rhizavidin (Biochem. J., (2007), 405: 397-405), tamavidin and their mutants, such as a protein that binds piotin and piotin Z avidin. Any of these can be suitably used. In particular, evening mavidin and its mutants can be preferably used.
  • evening mavidin is a piotin-binding protein discovered from the edible mushroom Pleurotus conucopiae (W002 / 072817; Takakura et al., (2009) FEBS J., 276: 1383-1397 ).
  • tamavidin mutants include high binding ability and low non-specific binding tamavidin (Japanese Patent Application No. 2008-208766 unpublished).
  • evening mavidin refers to evening mavidin 1 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 11, nucleic acid sequence encoding it: SEQ ID NO: 10), evening mavidin 2 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 13, nucleic acid sequence encoding the same: SEQ ID NO: 12) or a variant thereof.
  • the evening mavidin of the present invention typically comprises a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12. The encoded protein.
  • the evening mavidin of the present invention is encoded by a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13, or a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • evening mavidin 1, evening mavidin 2, and variants thereof may be collectively referred to simply as evening mavidin.
  • a variant of Mavidin 1 or 2 is a protein comprising an amino acid sequence containing one or more amino acid deletions, substitutions, insertions, and additions or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 1 or 13 It may be a protein having a piotin binding activity similar to that of Mavidin 1 or 2.
  • the substitution may be a conservative substitution, which is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics.
  • Non-limiting examples of conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues, such as I 1 e, V a 1, 61 or 8 1a mutual substitution, L ys and Substitutions between polar residues such as mutual substitution of A rg, G 1 u and A sp, G 1 n and A sn are included.
  • Mutations due to amino acid deletions, substitutions, insertions and additions can be performed on the DNA encoding the wild-type protein, for example, by site-directed mutagenesis (eg, ucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20). , p. 6487-6500, 1982, the entire contents of which are incorporated herein by reference).
  • site-directed mutagenesis eg, ucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20. , p. 6487-6500, 1982, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
  • “one or more amino acids” means amino acids that can be deleted, substituted, inserted and Z or added by site-directed mutagenesis. In the present specification, “one or more amino acids” may mean one or several amino acids depending on circumstances.
  • the tamavidin 1 or 2 variant further comprises at least 60%, preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 1 or 13 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, more preferably 99.3% or more of amino acid H4 It may be a protein having an amino acid sequence having a piotin-binding activity similar to that of tamavidin 1 or 2, or a protein having a high binding ability / low non-specific binding activity .
  • the percent identity between two amino acid sequences may be determined by visual inspection and mathematical calculations. Alternatively, the percent identity between two protein sequences may be determined by Needleman, SB and Wunsch, CD (J. Mol. Biol , 8: 443-453, 1970) and It may be determined by comparing sequence information using the GAP computer program available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Preferred default parameters for the GAP program include: (1) Henikoff, S. and Henikoff, JG (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992), Scoring matrix, blos um62; (2) 12 gap weights; (3) 4 gap length weights; and (4) No penalty for end gaps.
  • the 14th percentile can be determined by comparing the sequence information with the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997). Is possible.
  • the program can be used on the Internet from the website of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) or DM Data Bank of Japan (DDBJ).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • DDBJ DM Data Bank of Japan
  • Various conditions (identity of parameters) for identity search using the BLAST program are described in detail on the site, and some settings can be changed as appropriate, but the search is usually performed using default values. Do.
  • the same H4% of the two amino acid sequences may be determined by using a program such as genetic information processing software GENETYX Ver. 7 (manufactured by Genetics) or the FASTA algorithm. In this case, the default value may be used for the search.
  • the percent identity between two nucleic acid sequences can be determined by visual aversion and mathematical calculation, or more preferably, this comparison is made by comparing the sequence information using a computer program.
  • a typical, preferred computer's program is the GAP, a Wisconsin package from the Genetics Combining Group (GCG; Madison, Wis.), Version 10.0 program (Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387).
  • GAP Genetics Combining Group
  • preferred tamavidins include the following evening mavidin variants. (Japanese Patent Application No. 2008-208766 not published). Including the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence having 1 to several amino acid variations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence, In the proteins shown, the following groups
  • a modified piotin-binding protein wherein one or more residues selected from are substituted with acidic amino acid residues or neutral amino acid residues.
  • the 104th arginine residue is substituted with a glutamic acid residue
  • the 14th 1st lysine residue is substituted with a glutamic acid residue.
  • Piotin binding protein (R 1 0 4 E— K 1 4 1 E);
  • SEQ ID NO: 1 a modified piotin-binding protein in which the 40th aspartic acid residue is substituted with an asparagine residue, and 1 4 1st lysine residue is substituted with a glutamic acid residue D 4 0 N_K 1 4 1 E);
  • the 40th aspartic acid residue is substituted with an asparagine residue
  • the 10th 4th arginine residue is substituted with a glutamic acid residue
  • a modified piotin-binding protein selected from the group consisting of
  • the linking of the piotin-binding protein and the carrier can be performed using a protein-carrier coupling method known to those skilled in the art.
  • the carrier surface is modified so that the carboxyl group is exposed, and the carboxyl group and the amino group of the protein are combined in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide (EDC), which is a cross-linking reagent.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide
  • a protein and a carrier can be linked by a coupling reaction.
  • carrier By mixing the carrier whose surface carboxyl group is activated with N-hydroxysuccinimide (NHS) and protein in a buffer solution of pH 6.5 to 9 containing no primary amino group, the carboxyl group on the carrier surface is mixed. And the amino group of the protein can be linked.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • cross-linking reagent B S3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate
  • DSS disuccinimidyl suberate
  • the carrier surface amino group and protein amino group or cross-linking reagent SPDP
  • N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate or GMBS (N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide
  • the amino group on the carrier surface can be linked to the thiol group of the protein.
  • the microplate on which the functional group is arranged on the surface is, for example, a maleic anhydride plate such as React i-Bind (trademark) Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96- Well Plates (PI ERCE For example, Immobilizer TM -Amino Modules / Plates (Nunc) as an active amino plate, or as an ISA plate MS-8796 F (96 uel ⁇ C type ⁇ flat bottom ⁇ carbo) Sumitomo Beichikrite).
  • a maleic anhydride plate such as React i-Bind (trademark) Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96- Well Plates (PI ERCE
  • Immobilizer TM -Amino Modules / Plates (Nunc) as an active amino plate, or as an ISA plate MS-8796 F (96 uel ⁇ C type ⁇ flat bottom ⁇ carbo) Sumitomo Beichikrite).
  • microbeads having functional groups arranged on the surface include, for example, Sepharose (trademark) (GE Healthcare Bioscience 3 ⁇ 4) as a highly cross-linked agarose bead, and Dynabeads (trademark) (Dynal) as a magnetic bead.
  • Sepharose trademark
  • Dynabeads trademark
  • the connection between the piotin-binding protein and the solid carrier may be performed according to the instructions attached to the carrier.
  • microplates such as Reacti-Bind TM Streptavidin Coated Plates (PI ERCE), unc Streptavidin Coated 96 Micro Well TM Plates (Nalge Nunc), Alternatively, commercially available products such as magnetic beads such as Dynabeads M-280 Streptavidin (Dyna 1 3 ⁇ 4:, MagnaBind Tk Streptavidin Beads (PI ERCE)) may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • PI ERCE Reacti-Bind TM Streptavidin Coated Plates
  • PI ERCE unc Streptavidin Coated 96 Micro Well TM Plates
  • magnetic beads such as Dynabeads M-280 Streptavidin (Dyna 1 3 ⁇ 4:, MagnaBind Tk Streptavidin Beads (PI ERCE)
  • PI ERCE MagnaBind Tk Streptavidin Beads
  • piotin and piotin-binding protein are not used, for example, histidine tag, FL AG TM tag, or glutathione S-transferase (GST) is bound to the virus binder, and N It is also possible to indirectly bind the virus-binding substance and the carrier by binding i-NTA (nitrite triacetate), anti-FLAG antibody, or dalbutthione, and binding each.
  • i-NTA nitrite triacetate
  • anti-FLAG antibody anti-FLAG antibody
  • dalbutthione dalbutthione
  • the recovery rate of the virus to be quantified is not necessarily 100%, and varies slightly depending on the sample and conditions, so the recovery rate is not strictly constant. This is sufficient for the purpose of obtaining an approximate number of viruses.
  • virus quantification that can withstand mid- to long-term fatigue assessment, it is necessary to measure the amount of body fluid collected over a period of time and compare the amount continuously. If it fluctuates, it becomes difficult to compare the amount of virus collected and quantified at the time of passage.
  • the inventors have the same recovery rate as the fixed virus and can determine and measure the number of viruses even if they are mixed with the virus to be quantified.
  • a virus hereinafter referred to as “reference virus”
  • the initial sample for example, saliva
  • the amount of the reference virus added to the initial sample is recovered.
  • the recovery rate is evaluated based on the amount of the reference virus. Then, by multiplying the measured value of the target virus by this recovery rate and correcting the measured value of the amount of virus, it was possible to always quantitate the constant comfort model virus accurately.
  • the recovery rate is evaluated, and the measured value of the constant comfort virus is corrected, it is preferable to do this in one measurement system.
  • the recovery rate may be evaluated by adding the reference virus to only one of them, and the virus to be quantified may be measured with the other, and the measured value of the virus to be quantified may be corrected from the results of both.
  • the standard virus when quantifying the virus of a large number of specimens, it is preferable to introduce the standard virus into all specimens for quantification, but it is always necessary if the virus recovery rate is stable. It is not necessary to introduce the reference virus for all specimens, and the introduction of the reference virus may be omitted as appropriate. In other words, by introducing a reference virus into some specimens, While confirming that the yield is stable, other samples may be subjected to virus quantification without introducing a reference virus, and such an embodiment is also included in the method of the present invention.
  • the reference virus should have the same characteristics as the virus to be quantified and be easily distinguishable from the virus to be quantified. That is, in the quantification method of the present invention, it binds to a virus-binding substance in the same manner as the virus to be quantified, and is recovered in the same manner, and quantified so that it can be easily distinguished from the target virus by PCR, LAMP, ELISA, etc. It must be possible.
  • the inventors prefer to use a variant HHV-6 when the target virus is HHV-6 and a variant HHV-7 when the target virus is HHV-7. I found out.
  • Mutant HHV-6 is a recombinant virus derived from HHV-6, which is wild in the region corresponding to the U 2 to U 8 region of HHV-6 or the region corresponding to the U 2 4 and U 2 5 regions. Those having an exogenous nucleotide sequence not present in the type H HV-6 genome are preferred.
  • the mutant HHV-7 is a recombinant virus derived from HHV-7, and a wild-type HHV— is present at a site corresponding to the U 2 to U 8 region or U 2 4 to 25 region of HHV-7. Those having an exogenous nucleotide sequence not present in the genome are preferred.
  • the exogenous nucleotide sequence is a sequence that does not exist in the human genome of the wild-type HHV that is a consolation. If it is, there will be no restriction
  • the length of the exogenous nucleotide sequence is not particularly limited, but is preferably 10 bases or more and 20 or 0 bases or less, more preferably 2 bases or more and 10 or 0 bases. It is as follows.
  • HHV-6 sugar chain-lectin binding when a structural gene is inserted as an exogenous nucleotide sequence in such a system, it does not affect the recovery rate of HHV to be quantified (for example, it affects HHV-6 sugar chain-lectin binding).
  • fluorescent proteins eg, green fluorescent protein: GFP and enhanced green fluorescent protein: EGFP
  • antibiotic resistance proteins eg, tetracycline, ampicillin, kanamycin
  • Preferred nucleotide sequences are:
  • an exogenous protein not present in the wild-type HHV in the mutant HHV for example, in the immunoassay such as ELISA.
  • a protein is encoded by an exogenous nucleotide sequence, and the nucleotide sequence is not particularly limited as long as it is a sequence that does not exist in the conservative wild-type HHV genome, but it does not exist in the human genome. Preferably it is a sequence.
  • the exogenous protein a fluorescent protein, an antibiotic resistance protein, or the like as described above, which does not affect the recovery rate of HHV to be quantified, is preferable.
  • an enzyme or the like that can be easily used can also be preferably used.
  • a recombinant virus for example, see Patent No. 3923505 in which a gene encoding a protein for measurement separately from wild-type HHV-6 is used preferably it can.
  • a recombinant virus for example, see JP 2007-159586 in which a gene encoding a protein for measurement separately from wild type HHV-7 is preferably used. it can.
  • the amount of the reference virus added to the sample is not particularly limited as long as the amount of the reference virus can be quantified.
  • the mutant HH V-6 from 1 to 1 copy per 1 m 1.
  • Quantification using the reference virus is not only used as a reference for recovery and concentration of the target virus using a carrier, but also for subsequent quantification using PCR or LAMP, because the reference virus has the characteristics described above. It can be preferably used as it is as a standard for quantification using the internal standard or ELISA method.
  • the method of the present invention includes the step of contacting a body fluid with a virus binding substance.
  • the condition for contacting the body fluid with the virus-binding substance is not particularly limited as long as the virus and the virus-binding substance in the sample bind to each other to such an extent that the virus can be quantified. Elements of contact conditions include incubation temperature and incubation time.
  • the body fluid may be contacted with the virus-binding substance as it is or after a desired buffer solution is added to the body fluid. When a desired buffer solution is added, the amount of the added buffer solution must be taken into account when calculating the virus amount.
  • the lower limit of the incubation temperature may be 4 or 10; the upper limit is 50, 45, 4 O t :, 37, selected from the group consisting of 30, 25, and 20 As a preferable incubation temperature, 10 to 37 t :, 10: to 25, 10 to 20 or 15 can be mentioned.
  • the lower limit of the incubation time may be selected from the group consisting of 1 minute, 3 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 30 minutes
  • the upper limit is overnight, 10 hours, 8 hours , 5 hours, 3 hours, 2 hours, 1.5 hours, and 1 hour.
  • Preferable incubation times include 5 minutes to 2 hours, 10 minutes to 1.5 hours, and 30 minutes to 1 hour.
  • the virus-binding substance is bound via a molecule capable of binding to the carrier before, simultaneously with, or after contacting the virus-binding substance and the body fluid.
  • the substance and the carrier are bonded together.
  • the conditions for bringing the virus-binding substance into contact with the carrier are not particularly limited as long as the virus-binding substance can sufficiently bind to the carrier via a molecule that can bind to the carrier. Elements of contact conditions include incubation temperature and incubation time.
  • the conditions similar to the above-mentioned conditions for bringing the virus into contact with the virus-binding substance can be appropriately selected, but particularly preferred incubation times are 1 minute to 2 hours, 3 minutes to 1 hour, 5 minutes. Up to 30 minutes.
  • the carrier that captures the constant-conformity virus via the virus-binding substance is separated from the sample body fluid by a method known to those skilled in the art according to the nature of the carrier.
  • separation of the carrier from the sample may be accomplished by centrifugation followed by removal of the supernatant.
  • the carrier may be separated from the sample by collecting the carrier using a magnet and removing the supernatant.
  • the carrier may be separated from the sample by pulling up the carrier from the sample or passing the sample through the carrier.
  • the carrier is a microplate However, if it is designed to capture viruses inside the well structure, the carrier may be separated from the sample by simply removing the sample from the well.
  • a step of washing the separated carrier may be added in order to remove substances non-specifically bound to the carrier separated from the sample.
  • the conditions of the washing solution and temperature used in the washing step are not particularly limited as long as the conditions for maintaining the binding between the virus and the virus-binding substance and / or the binding between the virus-binding substance and the carrier are maintained.
  • the wash solution is buffered and may be a buffer solution with a pH of 7-8, eg, a buffer based on Tris EDTA (TE), PBS, HEPES, TBS, etc.
  • the pH of the cleaning solution may be 6-9, preferably 7-8.
  • the cleaning temperature is not particularly limited, but the lower limit of the cleaning temperature may be 4 or 10, and the upper limit may be selected from the group consisting of 50, 45, 40, 37, 30, 25, and 20. Good. Preferred washing temperatures include 10 to 37, 10 to 25, 1 Ot to 20, 151 :.
  • the amount smaller than the initial volume of the body fluid is not particularly limited, but may be 1/2, 1/10, 1Z20, 1/40, 1/60, 1/80, 1/100 of the initial volume.
  • the buffer solution added to the carrier that captures the virus to be quantified is selected appropriately according to the virus quantification method to be applied thereafter.
  • the virus number is quantified.
  • quantifying the number of viruses means quantifying the amount of virus present in a sample.
  • quantifying the number of viruses includes, for example, directly or indirectly quantifying as an absolute virus number, as a virus concentration, or as a virus titer.
  • Methods for measuring the number of viruses include a method for quantifying the amount of viral DNA and a method for quantifying the number of antigens derived from virus particles, and known quantification methods can be used as appropriate.
  • the former includes real-time PCR Examples include methods based on PCR (Science, (1985), 230: 1350-1354), and quantification of DNA using the LAMP method (Nucleic Acids Res., (2000), 28: E63). Examples of the latter include antigen protein quantification methods such as sandwich ELISA. There is also a method of quantifying the virus titer by infecting a desired cell for infection with a virus. When measuring the amount of viral DNA, it is necessary to destroy the viral coat protein. Therefore, although not limited thereto, heat treatment, addition of a surfactant, proteinase K treatment, or a combination thereof can be preferably used in an appropriate buffer solution.
  • the buffer is not particularly limited, but the reaction pH may be 5.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0, and more preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer solution having a pH of 7 to 8 may be a buffer solution based on, for example, Tris / EDTA (TE), PBS, HEPES, TBS, or the like.
  • the temperature of the heat treatment is not particularly limited, but a preferable heat treatment temperature may be 60 to 100 ⁇ 0, more preferably 70 to 95 t: more preferably 80 to 95, and a treatment time of 5 Min to 1 hour, preferably 10 to 30 minutes.
  • the type of the surfactant is not particularly limited as long as it does not affect the subsequent quantitative measurement of the virus.
  • Non idet P-40, Tween 20, Triton X-100, and the like examples thereof include Non idet P-40, Tween 20, Triton X-100, and the like.
  • concentration may be from 0.01% to 1%, preferably from 0.05% to 0.5%, more preferably from 0.05% to 0.25%.
  • a chemical and a surfactant they can be combined as appropriate within the above range.
  • the present invention also provides a kit for quantifying the number of human herpesviruses collected from body fluids based on the method of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises at least a pyotinylated virus binding substance and a carrier bound with a biotin binding protein.
  • the kit of the present invention comprises at least a piotini virus binding substance, a carrier conjugated with a piotin-binding protein, and a reference virus having a predetermined concentration.
  • the virus-binding substance, piotin-binding protein, carrier, and reference virus are as defined above.
  • the kit of the present invention comprises at least a nanobin to which a virus-binding substance is bound.
  • the kit of the present invention comprises at least nanobeads to which a virus-binding substance is bound and a reference virus having a predetermined concentration. Viral binding substances, nanobeads and reference viruses are as defined above.
  • the kit of the present invention further comprises a buffer for binding the virus and the virus-binding substance, a buffer for washing the separated virus-binding carrier, and / or for subsequent addition to the carrier.
  • the buffer solution may be contained.
  • the kit of the present invention may further contain a reagent for quantifying the virus and Z or a buffer.
  • a reagent for quantifying the virus examples include DNA polymerase, primers, appropriate probes as necessary, and appropriate buffers.
  • the virus quantification method is based on the quantification of the number of antigens, an antibody that recognizes an antigen, an appropriate secondary antibody for detection, an appropriate buffer, and the like can be mentioned.
  • each reagent may be enclosed in a suitable container. Further, the kit of the present invention may also include a package for appropriately packing the reagents contained therein.
  • the kit of the present invention may contain appropriate instructional materials. Instructions for use include, but are not limited to, instructions on how to use the package, or printed materials, electronic storage media (eg, air discs, tapes, cartridges, tips), and optical media (eg, CDR OM), And the like, and a medium that can convey to the user how to use the kit of the present invention. In addition, the description of the address on the Internet site that provides the instructional material is also included in the instructional material.
  • V-6 concentration of V-6 could be achieved by reacting the pectinated lectin with cultured HHV-6 solution and binding it to magnetic beads bound with mavidin.
  • HHV-6 solution Preparation of HHV-6 solution from cultured sputum cells Human umbilical cord blood-derived cultured T cells were infected with recombinant HHV-6 expressing EGFP (Patent No. 39235 05) to prepare an EGFP type HHV-6 solution.
  • the magnetic beads were washed with cold ultrapure water 300 ⁇ 1, followed by 5 OmM ME S buffer (pH 5.0) 300 1, and replaced with 50 mM MES buffer (pH 5.0) 0.6 mg / m 1 evening Mavidin was mixed with 300 1 (180 g). By shaking at room temperature for 30 minutes, the mavidin and magnetic beads were bound by covalent bond. The magnetic beads were collected with a magnet and the supernatant was removed. Next, after removing unreacted carboxyl groups in the beads with 5 OmM Tris buffer (pH 7.0) 300 1, magnetic beads in PBS buffer 300 u containing 0.5% BSA and 0.1% Tween 20 Blocked. Magnetic beads were suspended in PBS buffer 30 O 1 to complete the magnetic beads. The evening mavidin magnetic beads had a piotine binding activity of 15 nmo 1 per lm 1 of bead suspension.
  • virus concentration was attempted using the infectious titer of recombinant HHV-6 as an index.
  • Piotinylated lectins are manufactured by J—Oil Mills, Inc. 15 types (Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA- L4, SBA, SSA) were used.
  • EGFP recombinant HHV-6 solution 100 1 (concentration 10 4 m 1 TE) and PBS 500 1 were mixed and incubated at 15 for 1 hour (inverted mixing).
  • evening mavidin magnetic beads prepared in item 2 above were added to the reaction solution, and further incubated at 15 for 1 hour (mixed by inversion).
  • Eppendorf Fuchu containing the reaction solution The plate was placed on a dynabead magnetic stand and then washed twice with PBS 2 mM EDTA 0.5% BSA 200 1. This was then suspended in a culture medium (RPMI 1640 + 10% urine fetal serum) 500 1 and then suspended in 0.5 ml of Indike overnight cells (MT 4 cells).
  • a culture medium RPMI 1640 + 10% urine fetal serum
  • EGFP-type HHV-6 If EGFP-type HHV-6 is present, EGFP-type HHV-6 infects cells in the indica every day, and DNA of HHV-6 enters the cell, and the EGFP gene incorporated into the virus in it. Is expressed and emits GFP fluorescence. As a result of the above experiment, as shown in Fig. 1, it was confirmed that there was almost no non-specific adsorption of HHV-6 to evening mavidin beads.
  • the concentration of HHV-6 in the saliva was quantified using a pyotinylated lectin and evening mavidin magnetic beads without using a reference virus.
  • Saliva from the subject was collected using salivets (salivet cotton, manufactured by Zalus Yutt). The subject squeezed the oral cavity twice with distilled water just before collecting saliva, and then included saliva in the oral cavity for 2 minutes and collected saliva.
  • the HHV-6 concentration in saliva was quantified using the method.
  • the obtained DNA was subjected to quantitative PCR.
  • quantitative PCR the HHV-6 U65 / 6 6 region was quantified by the real-time PCR method.
  • the sequence used for PCR was
  • TaqMan probe FAM 5 '-AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3' TAMRA (SEQ ID NO: 3); FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche), reaction temperature 9 5 10 minutes, 95 seconds for 5 seconds + Real-time PCR was performed in 60 seconds for 31 seconds and 45 cycles.
  • the amount of HHV-6 in the eluate 51 was 2934 copies. Therefore, it is calculated that 5868 copies of HHV-6 existed in TEl O x l. Since this is the amount of HHV-6 originally present in saliva 400 1, it is calculated to be 14 670 copies Zm 1 per ml. This value was in good agreement with the value measured by the conventional method in 2 above (14616 copies Zml). In this case, the virus recovery rate can be considered to be almost 100%.
  • HHV-6 can be quantified using piotinylated SBA.
  • the concentration of HHV-6 in saliva was quantified using a pyotinylated lectin, evening mavidin magnetic beads, and reference virus.
  • Saliva from the subject was collected using salivets (salivet cotton, manufactured by Sarstatt). The subject squeezed the oral cavity twice with distilled water just before collecting saliva, and then included saliva in the oral cavity for 2 minutes and collected saliva.
  • the amount of HHV-6 in saliva was determined in the same manner as in item 2 of Example 2.
  • the EGFP type HHV-6 solution containing 1000 copies of EGFP type HHV-6 was added to the saliva 400 1 collected in item 1 above. Subsequently, PBS 10 times the concentration of 44 1 and piotinated WGA 1 nmo 1 were mixed and incubated at 15 for 30 minutes (mixed by inversion). Next, evening mavidin magnetic beads 101 prepared in Example 1 were added to the reaction solution, and further incubated for 30 minutes at 15 (mixed by inversion). Then reaction The Eppendorf tube containing the solution was placed on a magnetic stand for Dynabeads and then washed 3 times with PBS 500/1.
  • TaqMan probe FAM 5'-CTGAGCACCCAGTCCGCCCTG-3 'TAMRA (SEQ ID NO: 6);
  • TaqMan probe FAM 5′-AGGCACCCGTTCCGCCCCAGC-3 ′ TAMRA (SEQ ID NO: 9);
  • the real-time PCR method was performed using FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche) at a reaction temperature of 95 for 10 minutes once and 95: 5 seconds +60 31 seconds for 45 cycles.
  • Table 1 HHV—6 quantification and quantification using vivid chinification WG moth and tamavidin magnetic beads
  • the concentration of HHV-7 in the saliva was quantified using a pyotinylated lectin and evening mavidin magnetic 14 beads without using a reference virus.
  • Saliva from the subject was collected using salivets (salivet cotton, manufactured by Zalus Yutt). The subject squeezed the oral cavity twice with distilled water just before collecting saliva, and then included saliva in the oral cavity for 2 minutes and collected saliva.
  • the HHV-7 concentration in saliva was quantified using a conventional method.
  • the obtained DNA was subjected to quantitative PCR.
  • quantitative PCR the HHV-7 U37 region was quantified by real-time PCR.
  • sequence used for PCR was
  • HHV-7 DNA in 1 ml of saliva was 22 1774 copies Zm 1.
  • 250/1 saliva collected in item 1 above was mixed with PBS / piotinated WGA (J-Oil Mills 201) at a double concentration of 250/1 and incubated at 15 for 1 hour (mixed by inversion)
  • PBS / piotinated WGA J-Oil Mills 201
  • evening mavidin magnetic beads prepared in the same manner as in item 2 of Example 1 (however, use Dynabeads MyOne for magnetic beads) 50 1 was added to the reaction solution, and further incubated at 15 for 1 hour.
  • the Ebendorf tube containing the reaction solution was placed on the magnetic stand for Dynabeads and then washed 3 times with PBS 500 1.
  • the amount of HHV-7 in 1 ml of saliva was determined to be 223934 copies. This value was in good agreement with the value measured by the conventional method in 2 above (221774 copies Zml). In this case, the virus recovery rate can be considered to be 99%.
  • HHV-7 can be quantified using piotinylated WG A.
  • the present invention provides a novel quantification method and a kit for performing the method that enable more simple, accurate and efficient measurement of the number of HHV in a body fluid. Since the method of the present invention can withstand continuous evaluation of the number of HHV in body fluids, It is also applicable to quantitative evaluation of

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Abstract

　本発明は体液から採取したヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）数を定量する方法、および当該方法を行うためのキットに関する。体液からのＨＨＶ数を正確に定量することは、従来、熟練した技術が必要であった。本発明の方法は、体液中のＨＨＶ数について、より簡便で正確かつ効率的な計測を可能にする新規な定量方法を提供する。本発明の方法は、体液中のＨＨＶ数についての継続的な評価に耐えうる方法であることから、疲労の蓄積についての定量的な評価にも適用可能である。

Description

明細書
ウィルス定量法
技術分野
本発明は体液から採取したヒトヘルぺスウィルス （HHV) 数を定量する方法、 および 当該方法を行うためのキットに関する。
背景技術
「疲労」の蓄積は過労死、自殺、生活習慣病など多くの重篤な問題を引き起こす。 しかし、 「疲労」に関する科学的、医学的な研究は他の分野に比べて著しく遅れており、「疲労」が個人 の健康や社会生活に与える問題は解決の糸口すらない状況である。
「疲労」に対する研究や予防法 ·治療法の開発が遅れている主な原因としては，「疲労」を客 観的に測定する方法がないことが挙げられる。 特に、生活や健康に最も大きな影響を持つ 「疲労の蓄積」や「中長期的に持続する疲労」に関する測定法は確立されているものが無ぐ この様な測定法に対するニーズは非常に大きい。
本出願の発明者の一人は、唾液中に再活性化してくるヒトヘルぺスウイルスの量を測定 することによって疲労の蓄積を測定する方法を開発した （W02006/006634) 。これまでの研 究から、この方法を利用することで、 1週間からそれ以上の期間の様々な種類のストレスに よって蓄積した疲労を定量的に測定できることが判つている。なお、 この方法において は、 試料として唾液が好ましく用いられるが、 唾液については、 唾液腺に内生ピオチン含 量が高いということが知られていた (Green, M. , et aし, J. Cl in. Pathol. , (1992) 45 (9) : 788-790)。
従来、 ウィルスを定量する方法として、 ウィルス DN A量を P C Rにより定量する方法 (Kido, S. , et al.， J. Med. Vi rol . , (1990) 32 : 139-142)、 ダブルネステッド P C R法 (Double-Nested PCR) により測定する方法 (Kondo, K攀， et al.， J. Infect. Dis. , (1993) 167： 1197-1200) などが知られている。 また、 レトロウイルスの定量について は、 ウィルス DNA量を定量的 P C Rにより測定する際、 標識配列を含むウィルス核酸を 含むレトロウイルスを内部標準として用いる方法も開示されている （W095/034684)。 また、 ウィルスタンパク質の量を測定する方法としては、 例えば、 ウィルスタンパク質 に対する抗体を用いた免疫測定法 （ィムノアッセィ法） がある。 代表的な免疫測定法とし て、 例えばサンドイッチ EL I S A法などが挙げられる （Gerna, G. , et al., J. Clin. Microbiol., (1983) 17:942—944)。
一方、 溶液中のウィルスの濃度を上げ、 ウィルスを濃縮する方法として、 例えば、 m 心法が挙げられるが、 この方法は高価な機器と長い分離時間を要し、 作業には多大な労力 が必要となる。 また、 硫酸アンモニゥムゃポリエチレングリコールによりウィルスを沈殿 させて濃縮する方法があるが、 これらの方法には、 使用する試薬がその後のウィルス検出 のための P CRを阻害するため、 ウィルス沈殿後に試料の精製が必要となるという問題点 があった。 その他のウィルス濃縮法として、 例えばマンノース結合型レクチンが結合した 磁性粒子を用いる方法が開示されている （特開 2002-165591)。 また、 レトロウイルスの 力価を高める、 あるいは、 検体サンプルからレトロウイルスを単離する方法として、 スト レプトアビジンとピオチン化レクチンを利用した方法も開示されている (W02001/079456)。
先行技術文献
特許文献 1 国際公開第 W02006/006634号パンフレツト
特許文献 2 国際公開第 W095/034684号パンフレット
特許文献 3 特開 2002— 165591号公報
特許文献 4 国際公開第 W02001/079456号パンフレツト
非特許文献 1 Green, M., et al., J. Clin. Pathol., (1992) 45(9): 788-790 非特許文献 2 Kido, S.， et al., J. Med. Virol., (1990) 32: 139-142
非特許文献 3 Kondo, K.， et al., J. Infect. Dis.， (1993) 167： 1197-1200 非特許文献 4 Gerna, G.， et al., J. Clin. Microbiol., (1983) 17:942-944 発明の概要
発明が解決しょうとする課題
発明者らが、 日常生活の疲労に対する疲労度を定量的に評価するにあたり、 体液中のヒ トヘルぺスウィルス （以下、 HHVと表記する） の量を ¾έ¾の方法で測定したところ、 試 料中の HHV数が、 場合によってはヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV-6) で 100コピ 一/ ml未満、 ヒトヘルぺスウィルス 7 (HHV-7) でも 100コピー m 1未満と非 常に少なく、 測定の途中でウィルス DNAを損失してしまう場合がかなりあり、 正確かつ 効率的な定量には技術の賽嫌が必要となることが判明した。 そしてこのままでは、 HHV 定量方法をキット化して簡便に大量の試料を定量するのは困難であった。 本発明は、 従来 のウィルス定量法における上記問題を解決することを目的とする。
課題を解決するための手段】
本発明者らは、 鋭意研究に努めた結果、 HHVと結合可能な物質を結合した担体を、 体 液に混和して対象ウィルスと結合させ、 当該担体を磁石や遠心処理などにより回収するこ とにより、 P C R、 L AMP, E L I S Aなどの方法で容易に定量できる濃度に調製でき ることを見出した。
さらに本発明者らは定量の過程で、 に一定量の基準となるウィルスを加え一連のス テツプを行うことにより、 正確な定量を行うことができることに成功した。 この方法にお いては、 基準ウィルスとして変異型 HHVを利用することにより、 簡易で一層正確な定量 を行うことができた。
本発明は以上の知見に基づき、 碰中の HHVについて、 より簡便で正確な計測を可能 にする新規な定量方法、 および本発明の方法を行うためのキットを提供するものである。 すなわち、 本発明は以下のとおりである。
態様 1 ： 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の 工程：
( 1 ) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
( 2 ) ( 1 ) の液をウィルス結合物質と接触させる、 ここで、 ( i ) 当該ウィルス結合物質 は担体に結合可能な分子に連結しており、 さらに当該分子を介して担体に結合させること により、 ウィルス結合物質に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i ) 当該ウィルス結合物質は担体に直接的に結合しており、 それによりウィルス結合物質に結 合したウィルスは担体に結合し；
( 3 ) 当該担体を （1 ) の液から分離し、；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
( 5 ) 回収された基準ウィルス数と （1 ) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中から採取 したヒ卜へルぺスウィルス数を決定する； を含む、 前記方法。
態様 2 ： 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の 工程：
(1) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
(2) (1) の液をレクチンと接触させる、 ここで、 （i) 当該レクチンは担体に結合可能 な^に連結しており、 さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、 レクチン に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i) 当該レクチンは担体に直接 的に結合しており、 それによりレクチンに結合したウィルスは担体に結合し；
(3) 当該担体を （1) の液から分離し、 ；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
態様 3 ： 唾液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の 工程：
(1) 採取した唾液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
(2) (1) の液にピオチン化レクチンを混和して、 ウィルスとピオチン化レクチンを接触 させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、 ピオチン化レクチ ンと結合したウィルスをビーズに結合させ；
(3) 当該ビーズを （1) の液から分離し、 ；
(4) 分離したビーズから回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 唾液中から採取 したヒ卜へルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
態様 4： ヒトヘルぺスウィルスが、 ヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV-6) またはヒ トヘルぺスウィルス 7 (HHV-7) である、 態様 1ないし 3いずれか 1項に記載の方 法。
態様 5 ： 基準ウィルスが、 HHV—6または HHV— 7由来の組換えウィルスであ る、 態様 1ないし 3いずれか 1項に記載の方法。
態様 6 ： レクチンが、 N—ァセチルガラクトサミン （Ga lNAc)、 α 2— 6結合 のシアル酸 (S i aa2— 6)、 N—ァセチルダルコサミン （G l cNAc) の少なくと も一つを含む糖鎖に結合するレクチンである、 態様 2または 3に記載の方法。
態様 7 ： レクチンが、 SBA (ダイズ由来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DSA (チョウセンアサガオ由来)、 および WGA (コムギ胚芽由来） からなる群より選択され る、 態様 6に記載の方法。
態様 8： 工程 (4) が、 PCR、 LAMP, および EL I SAからなる群より選択さ れる方法によりウィルス数を定量することを含む、 態様 1ないし 3いずれか 1項に記載の 方法。
態様 9 ： 唾液から採取したヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV— 6) またはヒトヘルべ スウィルス 7 (HHV-7) の数を定量する方法であって、 以下の工程：
(1) 採取した唾液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加して、 基準ウィル ス濃度が 10〜： L 00, 000ゲノムコピ一 Zm 1になるようにし、 ここで当該基準ウイ ルスは HHV— 6または HHV— 7由来の組換えウィルスである；
(2) (1) の液にピオチン化レクチンを混和して、 ウィルスとピオチン化レクチンを接触 させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、 ピオチンィ匕レクチ ンと結合したウィルスをビーズに結合させ、 ここで当該レクチンは SB A (ダイズ由 来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DSA (チョウセンアサガオ由来)、 および WGA (コムギ胚芽由来） 力^なる群より選択され；
(3) 当該ビーズを （1) の液から分離し、 ；
(4) 分離したビーズから回収されたウィルス数を、 PCR、 LAMP, および EL I S Aからなる群より選択される方法で定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 唾液中から採取 したヒ卜ヘルぺスウィルス数を決定する； を含む、 前記方法。
態様 10 ： から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下 の工程：
(1) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
(2) (1) の液を、 直径 10 nm〜l 00 nmのナノピーズに直接結合しているウィルス 結合物質と接触させて、 ウィルスをナノビーズに結合させ；
(3) 当該ナノビーズを （1) の液から分離し、 ；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
態様 11 ： 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量するためのキットであつ て、 以下：
ピオチン化レクチン；
ピオチン結合タンパク質が結合したピーズ；
を含む、 前記キット。
態様 12 ： 体液から採取したヒ卜へルぺスウィルス数を定量するためのキットであつ て、 以下：
ピオチン化レクチン；
ピオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
予め濃度が決定されている基準ウィルス；
を含む、 前記キット。
態様 13 : レクチンが、 N—ァセチルガラクトサミン （Ga lNAc)、 α2— 6結 合のシアル酸 (S i a α 2 - 6), Ν—ァセチルダルコサミン （G l cNAc) の少なく とも一つを含む糖鎖に結合するレクチンである、 態様 11または 12に記載のキット。 態様 14 : レクチンが、 SBA (ダイズ由来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DS A (チョウセンアサガオ由来)、 および WGA (コムギ胚芽由来） 力、らなる群より選択さ れ；そして基準ウィルスが、 HHV— 6または HHV 7一由来の組換えウィルスである； 態様 1 3に記載のキット。
態様 1 5 ： τ液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下 の工程：
( 1 ) 採取した鎌をウィルス結合物質と接触させる、 ここで、 ( i ) 当該ウィルス結合物 質は担体に結合可能な分子に連結しており、 さらに当該^を介して担体に結合させるこ とにより、 ウィルス結合物質に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i ) 当該ウィルス結合物質は担体に直接的に結合しており、 それによりウィルス結合物質 に結合したウィルスは担体に結合し；
( 2 ) 当該担体を （1 ) の液から分離し、；
( 3) 分離した担体から回収されたウィルス量を定量する；
を含む、 前記方法。
態様 1 6 ： 唾液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下 の工程：
( 1 ) 採取した唾液にピオチン化レクチンを混和して、 ウィルスとピオチン化レクチンを 接触させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、 ピオチン化レ クチンと結合したウィルスをビーズに結合させ；
( 2 ) 当該ビーズを （1 ) の液から分離し、 ；
( 3 ) 分離したビーズから回収されたウィルス数を定量する；
を含む、 前記方法。
発明の効果
本発明により、 体液中での濃度が非常に低ぐ そのままでは定量が容易ではなぐ 熟練 を必要とする H H Vの定量にっレ、て、 簡易で一層正確な定量が可能となつた。
図面の簡単な説明
図 1は、 タマビジンビーズへの HHV— 6の非特異的吸着について試験した結果を示 す蛍光顕微鏡写真である。 緑色に光る点は、 E G F P組換え HH V— 6がィンディケ一夕 一細胞である MT— 4細胞に感染していることを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス 粒子 1個を表す （各点の明るさの違いは、 感染後のウィルス遺伝子発現の差によるもので ある）。 左の写真は HHV— 6ウィルス液 （原液） を MT— 4細胞に作用させた場合を示 す。 右の写真は、 レクチンの非存在下で HHV— 6ウィルス液 （原液） を夕マビジンビ一 ズと接触させ、 タマビジンビーズに吸着したウィルスを MT— 4細胞に作用させた場合を 示す。
図 2は、 ABA、 DSA、 Lo t u s, MAM、 および PHA— E4の各レクチン による HHV— 6の應効果について試験した結果を示す蛍蕭微鏡写真である。 緑色に 光る点は、 E G F P組換え HHV— 6がィンディケ一夕一細胞である MT— 4細胞に感染 していることを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス粒子 1個を表す （各点の明るさの 違いは、 感染後のウィルス遺伝子発現の差によるものである）。
図 3は、 PHA— L4、 UEA— I、 SBA、 および S S Aの各レクチンによる HH
V-6の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 緑色に光る点は、 EGF P組換え HHV— 6がィンディケ一夕一細胞である MT— 4細胞に感染しているこ とを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス粒子 1個を表す （各点の明るさの違いは、 感 染後のウィルス遺伝 現の差によるものである)。
発明を実施するための形態
以下、 本発明についてさらに詳細に説明する。
1. 中の HHVの定量方法
本発明は、 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の 工程：
(1) 採取した体液をウィルス結合物質と接触させる、 ここで、 ( i) 当該ウィルス結合物 質は担体に結合可能な分子に連結しており、 さらに当該分子を介して担体に結合させるこ とにより、 ウィルス結合物質に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i) 当該ウィルス結合物質は担体に直接的に結合しており、 それによりウィルス結合物質 に結合したウィルスは担体に結合し；
(2) 当該担体を (1) の液から分離し、；
(3) 分離した担体から回収されたウィルス量を定量する；
を含む、 前記方法を提供する。
また、 本発明は、 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の工程：
( 1 ) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
( 2 ) ( 1 ) の液をウィルス結合物質と接触させる、 ここで、 ( i ) 当該ウィルス結合物質 は担体に結合可能な に連結しており、 さらに当該分子を介して担体に結合させること により、 ウィルス結合物質に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i ) 当該ウィルス結合物質は担体に直接的に結合しており、 それによりウィルス結合物質に結 合したウィルスは担体に結合し；
( 3 ) 当該担体を （1 ) の液から分離し、 ；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
( 5 ) 回収された基準ウィルス数と （1 ) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量した体液中のヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中 力ら採取したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法を提供する。
以下、 本発明の方法の各構成について詳細に説明する。
ウィルス
本発明の方法において定量の対象となるウィルスは、 ヒ卜の疲労を定量できるウィルス であり、 具体的にはヒトに感染するへルぺスウィルス科 （Herpesvi ridae) に属するウイ ルス、 すなわち、 ヒトヘルぺスウィルス （以下、 HHVとも表記する） である。 好ましく は、 ヒトヘルぺスウィルス 6 (ヒトヘルぺスウィルス 6のバリアント Aおよび B：以下、 合わせて HHV— 6とも表記する）、 ヒトヘルぺスウィルス 7 (以下、 HHV— 7とも表 記する）、 サイトメガロウィルス （別名ヒトヘルぺスウィルス 5 ) 及び工プシユタイン' バーウィルス （以下、 E B Vとも表記する） からなる群より選択される 1以上のウィルス である。 より好ましくは HHV— 6及び HHV— 7、 さらに好ましくは HHV— 6であ る。
ヒトヘルぺスウィルスは、 ヒトに感染する二本鎖 DNAウィルスとされている。 HHV —6は直径 2 0 0 nm程度のウィルスである。
体液
本発明の方法による分析の対象となる体液は、 血液、 唾液、 血清、 精液、 母乳、 咽頭拭 い液、 脳擁液、 腹水、 汗、 涙、 尿等、 人体から採取される繊であればよいが、 唾液が 好適である。 本明細書において、 本発明の方法による分析の対象となる体液は、 単に 「試 料」 と記載することもある。
唾液の採取方法としては、 咽頭部の粘性液を綿棒で拭い取る方法、 唾液を採取管に直接 吐き出す方法、 唾液採取器具、 例えばサリベット （ザルス夕ット ¾) 等を用いる方法など が挙げられるが、 サリベットを用いた方法が好ましい。 この場合、 綿を口に含み、 唾液を 綿にしみ込ませることで唾液を採取し、 その後唾液のしみこんだ綿を遠心管に移し、 遠心 することで、 唾液を回収すればよい。
また、 唾液を採取する前の口腔処理は、 例えば、 長時間食事をせずに安静にする方法や 唾液採取直前に水で口腔内をゆすぐ方法が挙げられるが、 唾液採取直前に水で口腔内をゆ すぐ方法が好ましい。
また、 唾液以外の体液についても、 当業者に公知の方法で採取することができる。 なお、 採取した体液については、 ウィルス粒 ウィルス DNAの定量に影響を及ぼさ なければ、 測定前に希釈やろ過、 遠心など適宜必要に応じた処理を行なっても構わない。 あるいは直ちにウィルス定量を行わない場合は、 測定までの間必要に応じ、 当業者に公知 の方法で、 冷蔵保存や凍結保存をしてもよい。
ウィルス結合物質
本発明においてウィルス結合物質とは、 HHVに結合可能な物質をいう。 HHVに結合 可能な物質には、 レクチンや、 HHVに対する抗体などが含まれる。
本明細書において、 「レクチン」 とは、 糖鎖を認識して結合する糖結合性タンパク質を レ う。 レクチンが結合する糖鎖は、 それぞれのレクチンについて特異性がある。
本発明において使用するレクチンは、 HHVと結合可能なものであれば特に限定されな いが、 定量の対象となるウィルスとの親和性が高く当該ウィルスの回収率が高いものが好 ましい。 さらに好ましくは、 N—ァセチルガラクトサミン （G a l NA c；)、 ひ 2— 6結 合のシアル酸 (S i a α 2 - 6 ) > Ν—ァセチルダルコサミン （G 1 c NA c ) の少なく とも一つを含む糖鎖に結合するレクチンであり、 さらに好ましくは、 S B A (ダイズ由来 レクチン。 結合糖鎖： N—ァセチルガラクトサミン （G a l NA c ) を含む糖鎖)、 S S A (二ホンニヮトコ由来レクチン。 結合糖鎖： α 2 _ 6結合のシアル酸 （S i a α 2— 6 ) を含む糖鎖)、 D S A (チョウセンアサガオ由来レクチン。 結合糖鎖： N—ァセチル ダルコサミン （G l c NA c ) を含む糖鎖)、 および WGA (コムギ胚芽由来レクチン。 結合糖鎖： N—ァセチルダルコサミン （G l c NA c ) またはシアル酸を含む糖鎖)、 か らなる群より選択されるレクチンである。 特に、 定量の対象となるウィルスが HHV— 6 の場合は S B Aと WG Aがより好ましい。
本発明において使用する HHVに対する抗体は、 HHVと結合可能なものであれば特に 限定されず、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明の一態様においてウィルス結合物質は、 担体と直接結合させて使用してもよい。 別の態様において、 ウィルス結合物質は間接的に担体と結合させて使用してもよい。 間 接的な結合の例としては、 ピオチンとピオチン結合性タンパク質との結合を介したウィル ス結合物質と担体の結合である。 より具体的には、 ウィルス結合物質をピオチン化すると ともに、 担体の表面にピオチン結合性タンパク質を結合させ、 ピオチンとピオチン結合性 夕ンパク質を結合させることにより、 ウィルス結合物質と担体の間接的な結合が達成でき る。
雄
本発明において、 担体は、 固体または不溶性材料 （例えば、 濾過、 請、 磁性分離など により反応混合物から分離することができる材料） である担体であれば特に限定されな レ >
固体担体を構成する材料は、 セルロース、 テフロン （登録商標)、 ニトロセルロース、 ァガロース、 高架橋球形ァガロース、 デキストラン、 キトサン、 ポリスチレン、 ポリアク リルアミド、 ポリエステル、 ポリカーボネート、 ポリアミド、 ポリプロピレン、 ナイ口 ン、 ポリジピニリデンジフルオライド、 ラテックス、 シリカ、 ガラス、 ガラス,、 金、 白金、 銀、 銅、 鉄、 ステンレススチール、 フェライト、 シリコンウェハ、 ポリエチレン、 ポリエチレンィミン、 ポリ乳酸、 樹脂、 多糖類、 タンパク （アルブミン等)、 炭素または それらの組合せ、 などを含むがこれらに限定されない。
固体担体の形状は、 ビーズ、 磁性ビーズ、 薄膜、 删管、 フィルター、 プレート、 マイ クロプレート、 カーボンナノチューブ、 センサーチップなどを含むがこれらに限定されな レ 薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、 当該技術分野で知られているように、 ピッ ト、 溝、 フィルター底部などを設けてもよい。
本発明の一態様において、 磁 14ビーズは、 約 1 0 nm〜約 l mmの範囲の球体直径を有 しうる。 好ましい態様では、 磁性ビーズは約 2 5 nm〜約 l mm、 約 5 0 nm〜約 1 0 0 H mの範囲の直径を有する。 磁性ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。 本発明の一態様において、 セファロースなどの高架橋球形ァガロースからなるビーズ は、 約 2 4 / m〜約 1 6 5 mの範囲の直径を有しうる。 好ましい態様では、 高架橋球形 ァガロースビーズは約 2 4 / m〜約 4 4 mの範囲の直径を有する。 高架橋球形ァガロー スビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
疎水性表面を有する固体担体の例には、 Polysciences社または Spherotech社から市販 されているものなどのポリスチレンラテックスビーズが挙げられる。
シリカ （S i 02) —処理またはシリカ （S i O 2) ベースの固体担体の例には、 Polysciences 社から入手可能な、 超常磁性シリカビーズ等が挙げられる。 あるいは、 Dynal Biotech社から市販されている M_ 2 8 0等も使用されうる。
親水性表面を有する磁性ビーズの例としては、 B i om a g (登録商標） 力ルポキシル の名称で Polysciences社から市販されているビーズまたは Bangs Laboratory社のピーズ (MC O 2 N/ 2 9 2 8 ) などが挙げられる。 あるいは、 Dynal Biotech 社から市販され ている M— 2 7 0等が使用されうる。
ウイルス結合物質と担体の直接的結合
本発明の一態様において、 ウィルス結合物質と担体は直接結合させて使用することがで きる。 この場合、 ウィルスとレクチン結合担体の会合可能性を向上させる観点から、 担体 はブラウン運動できる程度の大きさのナノビーズである。 ナノビーズの好ましい球体直径 の範囲は、 1 0 nm〜： L 0 0 nmの球体直径、 より好ましくは 3 0 nm〜 7 0 nmの球体 直径である。 また、 この場合、 磁石で簡便に回収できる磁性体を含むことが好ましく、 例 えば、 これに限定されるわけではないが、 Mi l tenyi Biotech社の MACS MicroBeads (直径 5 0 nm) などの磁性ナノビーズが挙げられる。
ウィルス結合物質の多くはタンパク質であるため、 このウィルス結合タンパク質と担体 の連結は、 当業者に公知のタンパク質と担体のカツプリング法を用いて行うことができ る。 例えば、 担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、 当該カルボキシル基と夕 ンパク質のアミノ基を、 架橋試薬である 1一ェチル _ 3 _ (3—ジメチルァミノプロピ ル） カルポジイミド （EDC) の存在下でカップリング反応させることにより、 タンパク 質と担体を連結することができる。 または、 例えば、 担体表面のカルボキシル基が N—ヒ ドロキシスクシンイミド （NHS) により活性エステルイ匕された担体とタンパク質とを一 級アミノ基を含まない pH 6. 5〜9の緩衝液中で混和することにより、 担体表面のカル ボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。
あるいは、 架橋試薬 B S 3 (ビス [スルホスクシンィミジル] スべレート） や DS S (ジスクシンイミジルスべレート） を用いて、 担体表面のァミノ基とタンパク質のァミノ 基を、 あるいは架橋試薬 SPDP (N—スクシンィミジル 3— [2—ピリジルジチォ] プロピオネート） や GMBS (N- (4—マレイミドブチリルォキシ） スクシンイミド） を用いて、 担体表面のァミノ基とタンパク質のチォ一ル基を結びつけることができる。
ウィルス結合物質と担体の間接的結合
本発明の別の態様において、 ウィルス結合物質は間接的に担体と結合させて使用しても よい。
例えば、 ウィルス結合物質をピオチン化するとともに、 担体の表面にピオチン結合性夕 ンパク質を結合させ、 ピオチンとピオチン結合性タンパク質を結合させることにより、 ゥ ィルス結合物質と担体の間接的な結合が達成できる。
この場合に担体として、 ビーズを好ましく用いることができるが、 ビーズの好ましい 球体直径の範囲は、 0. 1 zm〜： L 00 zmの球体直径、 より好ましくは、 0. 5 ^m〜 10 mの球体直径、 さらに好ましくは、 1 〜 5 β mの球体直径である。
本明細書において、 「ピオチン」 とは、 D— [(+) — c i s—へキサヒドロ— 2—才 キソ— 1H—チエノ— （3, 4) —イミダゾール一 4—吉草酸] の一般名称である。 ピオ チンは、 ビタミン B群に分類される水溶性ビタミンの一種で、 ビタミン B7と呼ばれるこ ともあり、 あるいは、 ビタミン H、 補酵素 Rと呼ばれることもある。 ピオチンは卵白中に 含まれる糖タンパク質の一種、 アビジンと非常に強く結合する。
本明細書中において 「ピオチン」 とは、 上記ピオチンの他、 イミノビォチン (iminobiotin) (Hofmann, et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4666- 4668) や、 デスチオビォチン （desthiobiotin) (Hirsch, et al., (2002) Anal. Biochem., 308: 343-357)、 あるいはビオシチン （biocytin) やピオチンスルホキシド (biotin sulfoxide) 等のピオチン類縁体も含む。
レクチン等のウィルス結合物質をピオチン化する際には、 ピオチン化試薬を用いる方法 が挙げられる。 ピオチン化試薬として例えば、 P I ERCE社製の （カツコ内は順にリン カー長、 反応基） EZ- Link (登録商標） Sulfo- HS-Biotin (13. 5 A, 1級ァミン）、 EZ- Link (登録商標） Sulfo- HS-LC-Biotin (22. 4人、 1級ァミン）、 EZ-Link (登録 商標） Sulfo- HS-LCLC- Biotin (30. 5A、 1級ァミン）、 EZ- Link (登録商標） PFP- Biotin (9. 6A、 ァミン）、 EZ-Link (登録商標) Maleimide-PE02-Biotin (29. 1 人、 チオール基）、 EZ-Link (登録商標） Biotin-PE02 Amine (20. 4A、 カルボキシ ル基）、 EZ-Link (登録商標） Biotin- PE03-LC Amine (22. 9A、 カルボキシル基）、 EZ-Link (¾ ^商標） Biotin- Hydrazide (15. 7入、 アルデヒド基)、 EZ-Link (登録商 標） Biotin-LC-Hydrazide (24. 7A、 アルデヒド基）、 EZ-Link (登録商標） HS- Iminobiotin (13. 5A、 1級ァミン） などを利用できるが、 これらに限定されるもの ではない。
このようなピオチン化試薬を用いて、 レクチン等のウィルス結合物質に、 公知の方法を 使用してピオチンを結合させることができる。
例えば、 NHSエステルを含むピオチン化試薬を用いる場合は、 DM SO (ジメチルス ルホキシド） のような有機溶媒か、 pH7_ 9のリン酸緩衝液で溶解し、 レクチン等のゥ ィルス結合物質に添加することによってピオチンを結合させることができる。 また、 例え ばアミノ基を含むピオチン化試薬を用いる場合は、 EDC (1—ェチル— 3- (3—ジメ チルァミノプロピル） カルポジイミド ·ハイド口クロライド） のようなカルポジイミドを 用いて、 レクチン等のウィルス結合物質のカルボキシル基を活性ィ匕エステルに変換させた 後、 pH 5付近の緩衝液で溶解したピオチン化試薬を添加して、 ピオチンを結合させても よい。
また、 ピオチンを結合させたレクチン等のウィルス結合物質は、 例えば J-0il Mills社 からピオチン標識レクチンとして購入してもよい。 あるいはまた、 ピオチン標識キット (例えばこれらに限定するものではないが、 Pierce社製の EZ-Unk (登録商標） NHS-Lc- Biotinや、 Dojindo Molecular Technologies社製の Biotin Labeling Ki t-NH2など) を 用いて所望のウィルス結合物質にピオチンを結合させて作製してもよい。
あるいはまた、 レクチン等のウィルス結合物質の遺伝子を、 ピオチン化配列を含むぺプ チドをコードする DNAと融合し、 この融合遺伝子を発現するべクタ一を構築、 任意の宿 主においてピオチン化配列との融合タンパク質として発現させることにより （Schwarz et al.， (1988). J. Biol. Chem. 263 : 9640-9645)、 例えばピオチン化レクチンを作製して もよい。 このようなベクタ一としてこれに限定されるわけではないが、 例えば Invitrogen社の B i oE a s e (商標） タグが含まれるベクターが挙げられる。 このう ち哺乳類細胞発現用には、 pcDNA (商標） 6ベクターが、 大腸菌発現用には pETl 04ベクターが、 あるいは Drosophila発現用には pMT/B i oE a s eベクタ一があ る。
本発明において、 ピオチン結合性タンパク質としては、 アビジン、 ストレブトァビジ ン、 ニュートラアビジン、 AVRタンパク質 （Biochem. L， (2002), 363: 609-617)、 ブ ラダビジン （Bradavidin) (J. Biol. Chem. , (2005), 280: 13250-13255), リザビジン (Rhizavidin) (Biochem. J., (2007), 405: 397-405)、 タマビジンやこれらの変異体等、 ピオチンとピオチン Zアビジン結合するタンパク質であれば、 いずれも好適に使用するこ とができる。 特に、 夕マビジンとその変異体を好ましく用いることができる。 なお、 夕マ ビジンは、 食用キノコである担子菌タモギタケ （Pleurotus conucopiae) から発見された ピオチン結合性タンパク質である (W002/072817； Takakura et al.， (2009) FEBS J.， 276: 1383-1397)。 タマビジンの変異体としては、 例えば、 高結合能'低非特異結合タマ ビジン （特願 2008-208766 未公開） 等が挙げられる。
本発明における 「夕マビジン」 は、 夕マビジン 1 (アミノ酸配列：配列番号 11、 それ をコードする核酸配列：配列番号 10)、 夕マビジン 2 (アミノ酸配列：配列番号 13、 それをコードする核酸配列：配列番号 12)、 またはそれらの変異体を意味する。 具体的 には、 本発明の夕マビジンは典型的には、 配列番号 11もしくは配列番号 13のアミノ酸 配列を含んでなるタンパク質、 または、 配列番号 10もしくは配列番号 12の塩基配列を 含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、 であってよい。 あるいは、 本発明の夕 マビジンは、 配列番号 1 1もしくは配列番号 13のアミノ酸配列を含んでなるタンパク 質、 または、 配列番号 10もしくは配列番号 12の塩基配列を含んでなる核酸によってコ —ドされるタンパク質、 の変異体であって、 夕マビジン 1または 2と同様のピオチン結合 活性を有するタンパク質、 あるいは、 高結合能 ·低非特異結合の活性を有するタンパク質 であってよい。 本明細書において、 夕マビジン 1、 夕マビジン 2、 およびそれらの変異体 を総称して、 単に夕マビジンと呼ぶことがある。
夕マビジン 1または 2の変異体は、 配列番号 1 1または 1 3のアミノ酸配列において、 1または複数のアミノ酸の欠失、 置換、 挿入およびンまたは付加を含むアミノ酸配列を含 んでなるタンパク質であって、 夕マビジン 1または 2と同様のピオチン結合活性を有する タンパク質であってもよい。 置換は、 保存的置換であってもよく、 これは、 特定のァミノ 酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。 保存的置換の非限 定的な例には、 I 1 e、 V a 1、 6 1または八1 a相互の置換のような脂肪族基含有ァ ミノ酸残基の間の置換、 L y sおよび A r g、 G 1 uおよび A s p、 G 1 nおよび A s n 相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、 置換、 挿入およびンまたは付加による変異体は、 野生型タンパク質を コードする DNAに、 例えば周知技術である部位特異的変異誘発 （例えば、 ucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982参照、 引用によりその全体を本明細書に 援用する） を施すことにより作成することができる。 本明細書において、 「1または複数 のアミノ酸」 とは、 部位特異的変異誘発法により欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加で きる程度のアミノ酸を意味する。 また、 本明細書において 「1または複数のアミノ酸」 と は、 場合により、 1または数個のアミノ酸を意味してもよい。
タマビジン 1または 2の変異体はさらに、 配列番号 1 1または 1 3のァミノ酸配列と少 なくとも 6 0 %以上、 好ましくは 6 5 %以上、 7 0 %以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上または 9 9 % 以上、 より好ましくは 9 9. 3 %以上のアミノ酸同 H4を有するアミノ酸配列を含んでな るタンパク質であって、 タマビジン 1または 2と同様のピオチン結合活性を有するタンパ ク質、 あるいは、 高結合能 ·低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
2つのアミノ酸配列の同一性％は、 視覚的検査および数学的計算によって決定してもよ レ^ あるいは、 2つのタンパク質配列の同一性パーセントは、 Needleman, S. B. 及び Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. , 8: 443-453, 1970) のアルゴリズムに基づき、 そして ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ （UWGCG) より入手可能な GAP コンピュータープログラムを用い配列情報を比 することにより、 決定してもよい。 GA Pプログラムの好ましいデフォルトパラメ一夕一には： （1) Henikoff, S. 及び Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992) に記載され るような、 スコアリング ·マトリックス、 b l o s um62 ; (2) 12のギャップ加 重； （3) 4のギャップ長加重；及び （4) 末端ギャップに対するペナルティなし、 が含 まれる。
当業者に用いられる、 配列比較の他のプログラムもまた、 用いてもよい。 同」 14のパー セン卜は、 例えば Altschul ら (Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997) に記載さ れている B L A S Tプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。 当 該プログラムは、 インターネッ卜上で ational Center for Biotechnology Information (NCBI)、 あるいは DM Data Bank of Japan (DDBJ) のウェブサイ卜から利用することが 可能である。 BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件 （パラメ一夕一） は同サ イトに詳しく記載されており、 一部の設定を適宜変更することが可能であるが、 検索は通 常デフォルト値を用いて行う。 または、 2つのアミノ酸配列の同 H4%は、 遺伝情報処理 ソフトウェア GENETYX Ve r. 7 (ゼネティックス製） などのプログラム、 また は、 FASTAアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。 その際、 検索はデフォルト値 を用いてよい。
2つの核酸配列の同一性％は、 視覚的嫌と数学的計算により決定可能であるか、 また はより好ましくは、 この比較はコンピュータ ·プログラムを使用して配列情報を比較する ことによってなされる。 代表的な、 好ましいコンピュータ 'プログラムは、 遺伝学コンビ ユー夕 ·グループ （GCG；ウィスコンシン州マディソン） のウィスコンシン ·パッケ一 ジ、 バージョン 10. 0プログラム 「GAP」 である （Devereux, et al.， 1984， Nucl. Acids Res., 12: 387)。 この 「GAP」 プログラムの使用により、 2つの核酸配列の比較 の他に、 2つのアミノ酸配列の比較、 核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができ る。
本発明において、 好ましいタマビジンには、 以下の夕マビジン改変体が含まれる。 （特 願 2008— 208766 未公開)。 配列番号 1 3に記載のアミノ酸配列、 あるいはこの配列中に 1から数個のアミノ酸変異 を有するアミノ酸配列、 又はこの配列と 8 0 %以上の同一性を有するアミノ酸配列を含 み、 ピオチン結合活性を示すタンパク質において、 以下のグループ
1 ) 配列番号 1 3の 1 0 4番目のアルギニン残基；
2 ) 配列番号 1 3の 1 4 1番目のリジン残基；
3 ) 配列番号 1 3の 2 6番目のリジン残基；及び
4) 配列番号 1 3の 7 3番目のリジン残基
から選択される 1または複数の残基が、 酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換さ れていることを特徴とする、 改変型ピオチン結合夕ンパク質である。
より好ましくは、 配列番号 1 3において、 1 0 4番目のアルギニン残基がグルタミン酸 残基に置換されており、 そして、 1 4 1番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換され ている、 改変型ピオチン結合タンパク質 （R 1 0 4 E— K 1 4 1 E)；
配列番号 1 3において、 4 0番目のァスパラギン酸残基がァスパラギン残基に置換され ており、 そして、 1 0 4番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、 改 変型ピオチン結合タンパク質 （D 4 0 N— R 1 0 4 E) ；
配列番号 1 3において、 4 0番目のァスパラギン酸残基がァスパラギン残基に置換され ており、 そして、 1 4 1番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、 改変型 ピオチン結合タンパク質 （D 4 0 N_K 1 4 1 E) ；並びに、
配列番号 1 3において、 4 0番目のァスパラギン酸残基がァスパラギン残基に置換され ており、 1 0 4番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、 そして、 1
4 1番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、 改変型ピオチン結合タンパ ク質 （D 4 O N— R 1 0 4 E— K 1 4 1 E)、
カ^なるグループから選択される、 改変型ピオチン結合タンパク質である。
ピオチン結合性タンパク質と担体の連結は、 当業者に公知のタンパク質と担体のカップ リング法を用いて行うことができる。 例えば、 担体表面をカルボキシル基が露出するよう 修飾し、 当該カルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、 架橋試薬である 1—ェチル—3 - ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミド （E D C) の存在下でカップリング反 応させることにより、 タンパク質と担体を連結することができる。 または、 例えば、 担体 表面のカルボキシル基が N—ヒドロキシスクシンイミド （NHS) により活性エステルイ匕 された担体とタンパク質とを一級ァミノ基を含まない pH6. 5〜9の緩衝液中で混和す ることにより、 担体表面のカルボキシル基と夕ンパク質のアミノ基を結びつけることがで さる。
あるいは、 架橋試薬 B S3 (ビス [スルホスクシンィミジル] スべレート） や DSS (ジスクシンイミジルスべレート） を用いて、 担体表面のァミノ基とタンパク質のァミノ 基を、 あるいは架橋試薬 SPDP (N—スクシンィミジル 3— [2—ピリジルジチォ] プロピオネート） や GMBS (N- (4一マレイミドブチリルォキシ） スクシンイミド） を用いて、 担体表面のァミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。 上記のような結合を用いて、 ピオチン結合性タンパク質を担体に固定化する場合、 様々 な官能基が表面に配置された各種担体が市販されているので、 それらを好ましく用いるこ とができる。 例えばこれらに P腕されるわけではないが、 官能基が表面に配置されたマイ クロプレートとしては、 無水マレイン酸プレートとして例えば React i-Bind (商標） Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96- Well Plates (P I ERCE社） が、 活性 型ァミノ基プレートとして例えば Immobilizer™- Amino Modules/Plates (Nunc社） が、 あるいはカルボキシル基プレートとして例えば EL I S A用プレート MS— 8796 F (96ゥエル · Cタイプ ·平底 ·カルボ） （住友べ一クライト社） が挙げられる。 ま た、 官能基が表面に配置されたマイクロビーズとしては、 高架橋ァガロースビーズとして 例えば Sepharose (商標） (GE ヘルスケアバイオサイエンス ¾) が、 磁性ビーズとして 例えば Dynabeads (商標） （Dyna l社） 等が挙げられるが、 これらに限定されるわけ ではない。 ピオチン結合性タンパク質と固体担体の連結は、 担体に添付された説明書に従 えばよい。
あるいはまた、 ピオチン結合性タンパク質を固定化した担体としては、 例えば、 Reacti-Bind™ Streptavidin Coated Plates (P I ERCE社) 、 unc Streptavidin Coated 96 Micro Well™ Plates (Nalge Nunc社） 等のマイクロプレー卜類、 あるいは Dynabeads M-280 Streptavidin (D y n a 1 ¾: 、 MagnaBindTk Streptavidin Beads (P I ERCE社） 等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、 これらに限定される わけではない。 ピオチンとピオチン結合性タンパク質を使用しない場合には、 例えば、 ウィルス結合物 質にヒスチジンタグ、 F L AGTMタグ、 またはグル夕チオン一 S—トランスフェラーゼ (G S T) を結合させるとともに、 担体にはそれぞれ、 N i - NTA (二トリ口トリ酢 酸)、 抗 F L AG抗体、 またはダル夕チオンを結合させ、 それぞれを結合させることによ り、 ウィルス結合物質と担体を間接的に結合させることもできる。
基準ウィルス
本発明の方法において、 定量の対象となるウィルスの回収率は、 必ずしも 1 0 0 %では なく、 また試料や条件によっても微妙に変動するため、 回収率は厳密に一定とはならな レ 一回的にウィルスの概数を得る目的であればこれでも十分である。 しかし、 中長期の 疲労の評価に耐えうるウィルス定量を行うには、 一定期間をおいて採取した体液のウィル ス量を計測し、 継続的にその量を比較していく必要があり、 回収率が変動してしまうと、 継時に採取 ·定量したウィルス量の比較が困難となることが問題となる。
これに対して、 発明者らは検討の結果、 定影ォ象となるウィルスと回収率が同程度で、 かつ、 定量対象ウィルスと混在していてもそれぞれのウィルス数を判別して計測できるよ うなウィルス （以下、 「基準ウィルス」 という） を系に導入することにより、 この問題を 解決することに成功した。 具体的には、 定量しておいた基準ウィルスを当初試料 （例え ば、 唾液） に一定量加えておき、 本発明の方法を行った後、 当初試料に加えた基準ウィル スの量と回収された基準ウィルスの量に基づいて回収率を評価する。 そしてこの回収率を 定»象ウィルスの測定値に乗じて、 ウィルス量の測定値を補正することにより、 定慰寸 象ウイルスを常に正確に定量することができた。
また、 基準ウィルスを試料に加えて測定、 回収率を評価し、 定慰ォ象ウィルスの測定値 を補正する場合、 これを一つの測定系の中で行うことが好ましいが、 例えば、 試料を 2つ に分け、 片方にだけ基準ウィルスを加えて回収率を評価、 もう片方で定量対象ウィルスの 測定を行い、 両者の結果から定量対象ウィルスの測定値を補正しても良い。
なお、 本発明の方法において、 多数の検体のウィルス定量を行う場合、 全ての検体に基 準ウィルスを導入して定量することが好ましいが、 ウィルス回収率が安定していれば、 必 ずしもすベての検体について基準ウイルスを導入する必要はなく、 適宜基準ウイルス導入 を省略してもよい。 すなわち、 一部の検体に基準ウィルスを導入することにより、 系の回 収率が安定していることを確認しつつ、 その他の検体については基準ウィルスの導入なし にウィルス定量を行ってもよく、 このような態様も本発明の方法に含まれる。
基準ウィルスは、 定量するウィルスと同様の特徴を有し、 かつ、 定量するウィルスと容 易に区別できなければならない。 すなわち、 本発明の定量方法において、 定量対象となる ウィルスと同様にウィルス結合物質と結合し、 同様にピーズで回収され、 P C R、 LAM P、 E L I S Aなどで容易にかつ対象ウィルスと区別できるように定量できなければなら ない。
発明者らは、 この条件を満たす基準ウィルスとして、 定 象ウィルスが HHV— 6の 場合は変異型 HHV— 6、 定 象ウィルスが HH V— 7の場合は変異型 HH V— 7が好 適であることを見出した。
変異型 HHV—6としては、 HHV— 6由来の組換えウィルスであって、 HHV— 6の U 2〜U 8領域に相当する部位または U 2 4及び U 2 5領域に相当する部位に、 野生型 H HV— 6ゲノム中に存在しない外因性ヌクレオチド配列を有するものが好ましい。 また、 変異型 HHV—7としては、 HHV— 7由来の組換えウィルスであって、 HHV— 7の U 2〜U 8領域または U 2 4〜 2 5領域に相当する部位に、 野生型 HHV— 7ゲノム中に存 在しない外因'性ヌクレオチド配列を有するものが好ましい。
ウィルスを、 P C Rや L AM Pなどヌクレオチド自体を高感度に検出する系で定量する 場合には、 外因性ヌクレオチド配列は、 定慰ォ象となる野生型 HHVのゲノムゃヒトゲノ ム中に存在しない配列であれば制限はなく、 特に構造遺伝子でなくても構わない。 この場 合外因性ヌクレオチド配列の長さは、 特に限定されないが、 好ましくは 1 0 0塩基以上 2 0， 0 0 0塩基以下であり、 さらに好ましくは 2 0 0塩基以上 1 0， 0 0 0塩基以下であ る。 また、 このような系において、 外因性ヌクレオチド配列として構造遺伝子を挿入す る場合には、 定量対象となる HHVの回収率に影響を与えない （例えば、 HHV— 6糖鎖 —レクチン結合に影響を与えない） ようなタンパク質、 例えば、 蛍光タンパク質 （例えば green f luorescent protein： G F Pや enhanced green f luorescent protein： E G F P 等が挙げられるがこれらに限定されない） や抗生物質耐性タンパク質 （例えばテトラサイ クリン、 アンピシリン、 カナマイシン、 ネオマイシン、 ハイグロマイシン、 またはスぺク チノマイシン等に対する耐性タンパク質が挙げられるがこれに限定されない） 等、 をコー ドするヌクレオチド配列が好ましい。
また、 ウィルスを、 ウィルスに対する抗体を用いて定量する場合、 例えば E L I S A法 等のィムノアッセィによる定量においては、 変異型 HHVに、 野生型 HHVには存在しな い外因性タンパク質を発現させる必要があり、 このようなタンパク質は、 外因性ヌクレオ チド配列によってコードされ、 当該ヌクレオチド配列は、 定慰ォ象となる野生型 HHVゲ ノム中に存在しない配列であれば特に制限はないが、 ヒトゲノム中に存在しない配列であ ることが好ましい。 また、 外因性タンパク質としては、 定量対象となる HHVの回収率に 影響を与えない、 例えば上述のような、 蛍光タンパク質や抗生物質耐性タンパク質等が好 ましい。 あるいはまたアツセィが容易な酵素等も好ましく使用することができる。
このような変異型 HHV— 6の例として、 野生型 HHV— 6と区別して計測するための 夕ンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた組換えウィルス （例えば特許第 3923505号 を参照） を好ましく利用できる。 また、 このような HHV— 7の例として、 野生型 HHV ― 7と区別して計測するためのタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた組換えウイ ルス （例えば特開 2007-159586を参照） を好ましく利用できる。
このような基準ウィルスの試料への添加量は、 基準ウィルスの定量ができる量であれば 特に制限はないが、 例えば変異型 HH V— 6の場合、 1 m 1あたり 1 0コピ一〜 1， 0 0 0， 0 0 0コピー程度、 好ましくは l m 1当たり 1 0コピー〜 1 0 0 , 0 0 0コピー程 度、 より好ましくは l m lあたり 5 0コピ一〜 5 0 , 0 0 0コピー程度、 さらに好ましく は 1 m 1あたり 1 0 0コピ一〜 1 0， 0 0 0コピー程度で定量することができる。
基準ウィルスを用いた定量は、 基準ウィルスが上記のような特性を有するため、 担体を 利用した対象ウィルスの回収や濃縮の基準とするだけではなく、 その後の P C Rや L AM Pを用いた定量に於ける内部標準、 E L I S A法を用いた定量の基準として、 そのまま好 ましく用いることができる。
体液とウィルス結合物質の接触
本発明の方法は、 体液とウィルス結合物質とを接触させる工程を含む。 体液とウィルス 結合物質とを接触させる条件は、 ウィルスの定量が可能な程度に試料中のウィルスとウイ ルス結合物質とが結合する条件であれば特に制限されない。 接触条件の要素としては、 ィ ンキュベーション温度およびィンキュベーション時間を含む。 また、 体液はそのまま、 あるいは当該体液に所望の緩衝液等を加えてから、 ウィルス結 合物質と接触させてもよい。 なお、 所望の緩衝液等を加えた場合には、 加えた緩衝液の量 をウィルス量の算出時に考慮する必要がある。
インキュベーション温度の下限は 4 または 1 0でであってよく、 上限は 5 0で、 4 5で、 4 O t:, 3 7で、 3 0 、 2 5 、 および 2 0 からなる群より選択されてもよ レ 好ましいインキュベーション温度として、 1 0 〜 3 7 t：、 1 0 ：〜 2 5 、 1 0 〜2 0 、 1 5でが挙げられる。
インキュベーション時間の下限は 1分、 3分、 5分、 1 0分、 1 5分、 2 0分、 3 0分 からなる群より選択されてもよぐ 上限は一晩、 1 0時間、 8時間、 5時間、 3時間、 2 時間、 1 . 5時間、 および 1時間からなる群より選択されてもよい。 好ましいインキュべ —ション時間として、 5分〜 2時間、 1 0分〜 1 . 5時間、 3 0分〜 1時間が挙げられ る。
本発明の方法におけるウィルス結合物質と担体とが間接的に結合する態様においては、 ウィルス結合物質と体液を接触させる前に、 それと同時に、 またはその後に、 担体に結合 可能な分子を介してウィルス結合物質と担体とを させて結合させる。 ウィルス結合物 質と担体を接触させる条件は、 ウィルス結合物質が、 担体に結合可能な分子を介して担体 に十分に結合できる条件であれば特に制限されない。 接触条件の要素としては、 インキュ ベーシヨン温度およびィンキュベーション時間を含む。 上述したウィルスとウィルス結合 物質を接触させる条件と同様の条件を適 1択することができるが、 特に好ましいインキ ュべ一シヨン時間としては、 1分〜 2時間、 3分〜 1時間、 5分〜 3 0分が挙げられる。
担体の分離
ウィルス結合物質を介して定慰ォ象のウィルスを捕捉した担体は、 その担体の性質に応 じた当業者に公知の手法により、 試料である体液から分離する。
例えば、 ビーズなど粒子状の担体については遠心分離とそれに続く上清の除去により、 担体の試料からの分離を達成してもよい。 担体が 性ビーズの場合は、 磁石を用いて担体 を集め、 上清を除去することにより、 担体を試料から分離してもよい。 担体が、 薄膜ゃフ ィルターなどの形状である場合は、 担体を試料から引き上げることにより、 あるいは担体 に試料を通過させた後、 担体を試料から分離してもよい。 担体が、 マイクロプレートな ど、 ゥェル構造の内部でウィルスを補足するように設計されている場合は、 単に試料をゥ エルから除くことにより担体を試料から分離してもよい。
また、 必要に応じて試料から分離した担体に非特異的に結合した物質を除去するため に、 分離した担体を洗浄する工程を加えてもよい。 洗浄工程に用いる洗浄液や温度の条件 は、 ウィルスおよびウィルス結合物質の間の結合、 ならびに または、 ウィルス結合物質 と担体の間の結合を維持するという条件が維持される限り、 特に限定されない。
好ましくは、 洗浄液は緩衝されており、 p H 7〜 8の緩衝液、 例えば T r i s E D T A (TE)、 PBS、 HEPES、 TBS, 等を基本とする緩衝液であってよい。 また、 洗浄液の pHは 6〜9、 好ましくは 7〜8、 であってもよい。
洗浄温度は、 特に限定されないが、 洗浄温度の下限は 4でまたは 10 であってよく、 上限は 50 、 45で、 40 、 37 、 30で、 25で、 および 20 からなる群より 選択されてもよい。 好ましい洗浄温度として、 10で〜37で、 10で〜25で、 1 Ot 〜20で、 151:が挙げられる。
濃縮ウィルス溶液の定量
定慰寸象のウィルスを捕捉した担体を、 試料である体液から分離および Zまたは洗浄し た後、 当該担体に当該体液の初期體よりも少ない量の緩衝液を加える。 それにより、 回 収した試料中の HH V濃度を体液の HH V濃度よりも上昇させる。 体液の初期体積よりも 少ない量は、 特に限定されないが、 初期体積の 1ノ 2、 1/10、 1Z20、 1/40, 1/60, 1/80, 1/100であってよい。
定量対象のウィルスを捕捉した担体に加える緩衝液は、 その後適用するウィルスの定量 方法に応じて適龍択される。
上述のように回収した試料中の HHV濃度を体液のそれと比較して上昇させた後は、 ゥ ィルス数の定量を行う。 本明細書において、 「ウィルス数を定量する」 とは、 試料中に存 在するウィルスの量を定量することを意味する。 したがって、 「ウィルス数を定量する」 とは、 例えば、 絶対的なウィルス数として、 ウィルス濃度として、 またはウィルス力価と して、 直接的または間接的に定量することを包含する。 ウィルス数の計測方法としては、 ウィルス D N A量を定量する方法、 ウィルス粒子に由来する抗原の数を定量する方法があ り、 公知の定量方法を適宜用いることができる。 前者としてはリアルタイム PCR法など PCR (Science, (1985)， 230: 1350-1354) に基づく方法や、 LAMP法 （Nucleic Acids Res., (2000), 28: E63) などを用いた DN Aの定量法が挙げられる。 後者として はサンドイッチ EL I S A法などを用いた抗原タンパク質の定量法が挙げられる。 また、 所望の感染用細胞にウィルスを感染させ、 ウィルス力価として定量する方法もある。 なお、 ウィルス DNA量を測定する場合には、 ウィルス外皮タンパク質を破壊する必要 がある。 そのために、 限定するものではないが、 適当な緩衝液中において、 熱処理や界面 活性剤の添加、 プロテネース K処理、 またはそれらの組み合わせなどを好ましく用いるこ とがでさる。
緩衝液については特に限定されないが、 反応させる pHが 5. 0〜9. 0、 好ましくは 6. 0〜8. 0、 より好ましくは、 7. 0〜8. 0であってよい。 pH7〜8の緩衝液 は、 例えば Tr i s/EDTA (TE)、 PBS、 HEPES、 TBS、 等を基本とする 緩衝液であってよい。 熱処理の温度は、 特に限定されないが、 好ましい熱処理温度とし て、 60で〜100<0、 より好ましくは 70で〜 95t：、 さらに好ましくは 80で〜 9 5でであってよく、 処理時間は 5分〜 1時間、 好ましくは 10分から 30分である。 界面 活性剤の種類は、 後のウィルス定量測定に影響を及ぼさないものであれば特に限定されな いが、 例えば、 Non i d e t P— 40や Twe e n 20、 T r i t o n X- 100 等が挙げられ、 濃度はそれぞれ、 0. 01 %から 1 %、 好ましくは、 0. 05 %から 0. 5%、 より好ましくは 0. 05%から 0. 25%であってよい。 理と界面活性剤を組 み合わせる場合は、 上記条件の範囲で適宜組み合わせることができる。
2. キッ卜
本発明はまた、 本発明の方法に基づいて体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定 量するためのキッ卜を提供する。
一態様において、 本発明のキットは、 少なくともピオチン化ウィルス結合物質、 ビォチ ン結合タンパク質を結合した担体、 を含む。 好ましくは、 本発明のキットは、 少なくとも ピオチンィ匕ウィルス結合物質、 ピオチン結合タンパク質を結合した担体、 および予め濃度 が決定されている基準ウィルスを含む。 ウィルス結合物質、 ピオチン結合タンパク質、 担 体、 および基準ウィルスについては上記に定義したとおりである。
別の態様において、 本発明のキットは、 少なくともウィルス結合物質が結合したナノビ —ズ、 を含む。 好ましくは、 本発明のキットは、 少なくともウィルス結合物質が結合した ナノビーズおよび予め濃度が決定されている基準ウィルスを含む。 ウィルス結合物質、 ナ ノビーズおよび基準ウィルスについては、 上記に定義したとおりである。
本発明のキットは、 さらに本発明の方法において、 ウィルスとウィルス結合物質を結合 させるための緩衝液、 分離したウィルス結合担体を洗浄するための緩衝液、 および/また は、 その後当該担体に加えるための緩衝液を含んでいてもよい。
本発明のキットはまた、 ウィルスの定量を行うための試薬および Zまたは緩衝液をさら に含んでいてもよい。 例えば、 ウィルスの定量方法が D N A量の定量に基づく方法である 場合は、 D N Aポリメラ一ゼ、 プライマー、 必要に応じて適切なプローブ、 適切な緩衝液 等が挙げられる。 ウィルスの定量方法が抗原の数の定量に基づく方法である場合は、 抗原 を認識する抗体、 検出のための適切な二次抗体、 適切な緩衝液等が挙げられる。
本発明のキットは、 各々の試薬が適切な容器に封入されていていてもよい。 また、 本発 明のキットは、 それに含まれる試薬等を適切に梱包するためのパッケージをも含んでいて もよい。
また、 本発明のキットには適切な使用説明資料が含まれていてもよい。 使用説明資料に は、 非限定的に、 パッケージへの使用方法の記載、 あるいは、 印刷物、 電子記憶媒体 （例 えば逾気ディスク、 テープ、 カートリッジ、 チッフ °)、 および光学媒体 （例えば C D R OM)、 等、 本発明のキットの使用方法を利用者に伝達可能な媒体が含まれる。 また、 使 用説明資料を提供するインタ一ネットサイ卜へのァドレスの記載もまた、 使用説明資料に 含まれる。
実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の 術的範囲を 限定するものではない。 当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾 ·変更を 加えることができ、 それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例 1 HHVを検出することのできるレクチンの探索
ピオチン化されたレクチンを培養した HHV— 6溶液と反応させ、 夕マビジンを結合し た磁性ビーズに結合させることにより ΗΗ V— 6の濃縮が出来るかどうかを検討した。
1 . 培養 Τ細胞からの HHV— 6溶液の作製 ヒト臍帯血由来培養 T細胞に EGFPを発現する組換え HHV—6 (特許第 39235 05号） を感染させ、 EGFP型 HHV— 6溶液を作製した。
2. 夕マビジン磁性ビーズの作製
カルボキシル基で表面をコートされた磁性ビーズ （Dynabeads M-270 Car boxy lie Acid, Dynal 社） 300 1を 0. 0 1N 水酸化ナトリウム 300 z 1で 10分間洗浄後、 さらに,水 300 1で 10分間 3回洗浄した。 洗浄済みの磁性ビーズに、 冷超»で 溶解した 1—ェチル一3— (3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミド 'ハイドロク 口ライド （EDC) (P I ERCE社） を最終濃度 0. 2Mになるように添加し、 30分 間室温で振とうした。 その後、 冷超純水 300 μ 1、 続いて 5 OmM ME S緩衝液 （p H5. 0) 300 1で磁性ビーズを洗浄し、 50mM MES緩衝液 （pH5. 0) に 置換した 0. 6mg/m 1 夕マビジンを 300 1 ( 180 g) 混和した。 室温で 3 0分間振とうさせることにより、 共有結合にて夕マビジンと磁性ビーズを結合させた。 磁 石で磁性ビーズを回収し、 上清を除去した。 次に 5 OmM トリス緩衝液 （pH 7. 0) 300 1でビーズの未反応カルボキシル基を消去後、 0. 5% BSA、 0. 1% Twe e n 20を含む P B S緩衝液 300 u \で磁性ビーズをブロッキングした。 PBS 緩衝液 30 O 1で磁性ビーズを懸濁し、 磁性ビーズを完成させた。 夕マビジン磁性ビー ズのピオチン結合活性は、 ビーズ懸濁液 lm 1当たり 1 5 nmo 1であった。
3. 組換え HHV - 6溶液の濃縮
上記項目 1で作製した EGFP型 HHV— 6溶液を利用して、 組換え HHV—6の感染 力価を指標にウィルス濃縮を試みた。ピオチン化レクチンは、 J—オイルミルズ社製 ピオ チン化レクチン 1 5種類 （Con A， DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA， ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA) を使用した。
まず、 レクチンの探索を行なう前に、 バックグランドとなる夕マビジンの非特異的吸着 の確認を行なった。
最初に、 EGFP組換え HHV—6液 100 1 (濃度 104個 m 1 TE)、 PBS 500 1を混和し、 1 5 で 1時間、 インキュベーションを行なった (転倒混和）。 次 に、 上記項目 2で作製した夕マビジン磁性ビーズを反応液に添加し、 さらに 1 5でで 1時 間、 インキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の入ったエツペンドルフチュー ブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 PBS 2mM EDTA 0. 5% BSA 200 1で 2回洗浄した。 次いでこれを培養液 (RPMI 1640 + 10%ゥ シ胎児血清） 500 1にて懸濁した後、 全量を 0. 5 m 1のィンディケ一夕一細胞 (M T 4細胞）と懸濁した。 なお、 EGFP型 HHV— 6が存在すれば、 EGFP型 HHV— 6はインディケ一夕一細胞に感染し、 HHV—6の DNAが細胞中に入って、 その中でゥ ィルスに組み込まれた E G F P遺伝子が発現して G F P蛍光を発するものと考えられる。 上記実験の結果、 図 1にみられる様に、夕マビジンビーズへの HHV— 6の非特異的吸 着はほとんどないことが確認された。
次に、 各種レクチンを用いたウィルス濃縮が可能かどうかを調べた。
最初に、 EGFP組換え HHV— 6液 10 O 1 (濃度 104個 Zm 1 TE)、 PBS 500 1、ピオチンィ匕レクチン l O igを混和し、 15でで 1時間、 インキュべ一ショ ンを行なった (転倒混和)。 次に、 上記項目 2で作製したタマビジン磁性ビーズを 1 1 反応液に添加し、 さらに 15でで 1時間、 インキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の入った試験管をダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 PBS 2mM EDTA 0. 5% BSA 200 1で 2回洗浄した。 次いでこれを培養液 （R PM I 1640 + 10 %ゥシ胎児血清） 500 ^ 1にて懸濁した後、 全量を 0. 5m 1のイン ディケ一夕一細胞 (MT4細 と懸濁し、 EGFPの発現を観察した。 EGFP型 HHV ― 6を濃縮できていれば、 レクチン -ピオチン-夕マビジンを介して磁性ビーズと結合して いる E GF P型 HHV— 6はィンディケ一夕一細胞に感染し、 HHV— 6の DNAが細胞 中に入り、 その中でウィルスに組み込まれた EGFP遺伝子が発現して GFP蛍光を発す るものと考えられる。
実験の結果、 例えば図 2、 図 3に見られるように > SBA、 SSA、 DSAが、 あるい は WG Aを使用した場合にウィルス原液よりも多くの EG F Pの発現が観察された。 この ことから、 これらのレクチンを使用して効率的に HHV— 6を濃縮できることが示され た。
実施例 2 基準ウィルスを用いない唾液中 HHV— 6の定量
唾液中の HHV— 6濃度を、 基準ウィルスは用いずに、 ピオチン化レクチン、 夕マビジ ン磁性ビーズを利用して定量した。 1. 唾液の採取
被験者からの唾液をサリベット （サリベットコットン、 ザルス夕ット社製） を用いて採 取した。 被験者は、 唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を 2度漱いだ後、 2分間サリベット の中綿を口腔内に含み、 唾液を採取した。
2. 従来法を利用した HHV— 6の定量
まず、 法を利用して唾液中の HHV— 6濃度を定量した。
上記項目 1. で採取した唾液 400 lについて、 BioRobot EZl (QIAGE 社） と EZl Virus Mini Kit v2.0 (QIAGEN ¾) を用いて、 EZl Virus Mini Handbook (QIAGEN ¾) の プロトコールに従い、 唾液中の HHV— 6 DNAを精製した。
得られた DNAを、 定量 PCRに供試した。 定量 PCRでは、 HHV— 6 U65/6 6領域を、 リアルタイム PC R法で定量した。 PCRに使用した配列は、
プライマー： 5' -GACAATCACATGCCTGGATAATG-3' (配列番号 1 )；および
プライマ一： 5' -TGTAAGCGTGTGGTAATGGACTAA-3' (配列番号 2 )；ならびに
TaqManプローブ： FAM 5' -AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3' TAMRA (配列番号 3)； であり、 FastStart Universal Probe Master (Rox) (ロシュ社） を用いて、 反応温度 9 5 10分間 1回、 95で 5秒 +60で 31秒、 を 45サイクルでリアルタイム P CRを行った。
なお、 本試験は、 ウィルス実験に極めて熟練した実験者によって行なわれた。
以上の結果、 唾液 lm 1中の HHV—6DNAは、 14616コピー/ m 1であった。 3. ピオチン化レクチン、 夕マビジン磁性ビーズを利用した HHV— 6の定量
上記項目 1で採取した唾液 400 z lに、 の 10倍濃度の P B S,ピオチン化 SBA l nmo lを混和し、 15 で 1時間インキュベーションを行なった （転倒混 和） 。 次に、 実施例 1の項目 2で作製した夕マビジン磁性ビーズ 100 1を反応液に添 加し、 さらに 15でで 1時間ィンキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の入つ たエツペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 PBS 5 00 z 1で 3回洗浄した。 ここに TEを 10/i 1加え、 98 10分間処理した後、 マグ ネットスタンドにおいて、 上清を回収し、 うち 5 Ad を定量 PCRに供試した。 定量 PC Rでは、 上記項目 2と同様に、 HHV— 6 U 65/66領域を、 リアルタイム PC 法 C'Al量した。
その結果、 溶出液 5 1中の HHV— 6量は、 2934コピーと測定された。 従って、 TEl O x lには、 HHV— 6が 5868コピー存在していたと算出される。 これは、 も ともと唾液 400 1中に存在した HHV— 6量なので、 1ml当りに換算すると、 14 670コピー Zm 1と計算される。 この値は、 上記 2で従来法で測定した値 （14616 コピー Zml) とよく一致していた。 この場合、 ウィルスの回収率はほぼ 100%と考え ることができる。
以上により、 ピオチン化 SB Aを利用して、 HHV— 6の定量を行なうことができるこ とが示された。
実施例 3 基準ウィルスを用いた唾液中 HHV— 6の定量
唾液中の HHV— 6濃度を、 ピオチン化レクチン、 夕マビジン磁性ビーズ、 基準ウィル スを利用して定量した。
1. 唾液採取方法
被験者からの唾液をサリベット （サリベットコットン、 ザルスタツト社製） を用いて採 取した。 被験者は、 唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を 2度漱いだ後、 2分間サリベット の中綿を口腔内に含み、 唾液を採取した。
2. 従来法を利用した HHV— 6の定量
実施例 2の項目 2. と同じ方法で、 唾液中の HHV- 6の定量を行なった。
なお、 本試験は、 ウィルス実験に極めて熟練した実験者によって行なわれた。 結果を表 1に示した。
3. ピオチン化レクチン、 夕マビジン磁性ビーズ、 基準ウィルスを利用した HHV— 6 の定量
(1) ピオチン化 WGAを用いた HHV—6の定量
上記項目 1. で採取した唾液 400 1に、 1000コピーの EGFP型 HHV— 6が 含まれる EGFP型 HHV— 6溶液を添加した。 次いで、 44 1の 10倍濃度の P B S、ピオチン化 WGA 1 nmo 1を混和し、 15でで 30分間インキュベーションを行 なった （転倒混和） 。 次に、 実施例 1で作製した夕マビジン磁性ビーズ 10 1を反応 液に添加し、 さらに 15でで 30分間インキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応 液の入ったエツペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 P BS 500 / 1で 3回洗浄した。 次いでプロテネース Kバッファー （TE中に、 lmg m 1のプロテネース K、 0. 45% ΝΡ— 40、 0. 45 % Twe e η 20を加えた もの） を 40 l 加えて、 56でで 1時間インキュベーションし、 ウィルス粒子を破壊 し、 ゲノム DNAを させた。 さらにマグネットスタンドにおいて、 上清を回収した。 上清を 98でで 10分間処理しプロテネース Kを失活させた後、 うち 5 1を使って定量 PCRを行なった。 定量 PC Rでは、 EGFP組換えウィルスのみがもつ EGFP遺伝子 と、 野生型 HHV— 6には存在するが組換えウィルスでは欠損させてある HHV— 6 U 5遺伝子を、 リアルタイム PC R法で定量した。
EGF P遺伝子を定量するためのプライマ一および Taqmanプローブとして、
プライマ一： 5' - CTGCTGCCCGACAACCA- 3' (配列番号 4)；および
プライマー： 5' -TGTGATCGCGCTTCTCGTT-3' (配列番号 5)；ならびに
TaqManプローブ： FAM 5' -CTGAGCACCCAGTCCGCCCTG-3' TAMRA (配列番号 6)；
HHV-6 U 5遺伝子を定量するためのプライマーとして、
プライマ一： 5' -CGMGAMAGTAGCACAGGTCTCC- 3' (配列番号 7)；および
プライマ一： 5' -ACCGTGTCATAAATGCTGAGTTGG-3' (配列番号 8)；ならびに'
TaqManプローブ： FAM 5' -AGGCACCCGTTCCGCCCCAGC-3' TAMRA (配列番号 9)； を用いた。 リアルタイム PCR法は、 FastStart Universal Probe Master (Rox) (ロシュ 社） を用いて、 反応温度 95 10分間 1回、 95 : 5秒 +60 31秒を 45サ ィクル、 で行った。
EGFP遺伝子の上記リア Jレタイム P C R法の結果から定量された EGFP型 HHV— 6数と、 当初添加した EGFP型 HHV— 6 1000コピーの比から、 各実験における EGFP型 HHV— 6の回収率を計算した。 この回収率に、 上記 HHV— 6 U5遺伝子 の上記リアルタイム PC R法の結果から測定された野生型 HHV— 6数を乗じて補正し、 本方法により定量された値とした。
以上の実験を、 異なる 3種類の唾液検体を用いて行なった。 その結果を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000033_0001
表 1：ビ才チン化 WG Αとタマビジン磁性ビーズを用いた HHV— 6数の定量および
¾ ^去による定量結果との Jt^
(回収 TO外の数値の単位は、 唾液 1 m l中の HHV— 6ゲノム DNAコピー数) いずれの唾液検体においても、 本発明の方法により得られた野生型 HHV— 6の値と従 来法による野生型 HHV— 6の値はよく一致した。 これにより唾液について、 本発明の方 法により HH V— 6数の定量を簡便に行なうことができることが示された。
実施例 4 基準ウィルスを用いない唾液中 HHV— 7の定量
唾液中の HHV— 7濃度を、 基準ウィルスは用いずに、 ピオチン化レクチン、 夕マビジ ン磁 14ビーズを利用して定量した。
1. 唾液の採取
被験者からの唾液をサリベット （サリベットコットン、 ザルス夕ット社製） を用いて採 取した。 被験者は、 唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を 2度漱いだ後、 2分間サリベット の中綿を口腔内に含み、 唾液を採取した。
2. 従来法を利用した HHV— 7の定量
まず、 従来法を利用して唾液中の HHV— 7濃度を定量した。
上記項目 1. で採取した唾液 400 について、 BioRobot EZl (QIAGEN ¾) と EZl Virus Mini Kit v2.0 (QIAGEN社） を用いて、 EZl Virus Mini Handbook (QIAGEN社） のプ ロトコールに従い、 唾液中の HHV— 7 DNAを精製した。
得られた DNAを、 定量 PCRに供試した。 定量 PCRでは、 HHV—7 U37領域 を、 リアルタイム PC R法で定量した。 PCRに使用した配列は、
プライマ一： 5' - CGGMGTCACTGGAGTMTGAC- 3' (配列番号 14) ;および プライマー： 5'- CCAATCCTTCCGAAACCGAT-3' (配列番号 15)；ならびに TaqManプローブ： FAM 5'- CCTCGCAGATTGCTTGTTGGCCATG-3 ' TAMRA (配列番号 16)； であり、 FastStart Universal Probe Master (Rox) (ロシュ社） を用いて、 反応温度 9 5 10分間 1回、 95 5秒 +60 31秒、 を 45サイクルでリアルタイム P CRを行った。
なお、 本試験は、 ウィルス実験に極めて謹した実験者によって行なわれた。
以上の結果、 唾液 lml中の HHV—7DNAは、 22 1774コピー Zm 1であつ た。
3. ピオチン化 WGA、 夕マビジン磁 1¾ビーズを利用した HHV_ 7の定量
上記項目 1で採取した唾液 250 / 1に、 250/ 1の 2倍濃度の P B S,ピオチン化 WGA (J—オイルミルズ社 20 1を混和し、 15でで 1時間インキュベーション を行なった （転倒混和） 。 次に、 実施例 1の項目 2と同様な方法で作製した夕マビジン磁 性ビーズ （ただし磁性ビーズは Dynabeads MyOneを使用） 50 1を反応液に添加し、 さ らに 15でで 1時間インキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の入ったエツべ ンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 PBS 500 1 で 3回洗浄した。 ここに 0. 09%の Twe e n 20を含む TEを 40 1加え、 9 5で 15分間処理した後、 マグネットスタンドにおいて、 上清を回収し、 うち 5 l を定 量 PCRに供試した。 定量 PCRでは、 上記項目 2と同様に、 HHV— 7 U37領域 を、 リアルタイム PC R法で定量した。
その結果、 唾液 1 m 1中の HHV— 7量は、 223934コピーと測定された。 この値 は、 上記 2で従来法で測定した値 （221774コピー Zml) とよく一致していた。 こ の場合、 ウィルスの回収率は 99%と考えることができる。
以上により、 ピオチン化 WG Aを利用して、 HHV— 7の定量を行なうことができるこ とが示された。
産業上の利用可能性
本発明は、 体液中の HHV数について、 より簡便で正確かつ効率的な計測を可能にする 新規な定量方法および当該方法を行うためのキットを提供する。 本発明の方法は、 体液中 の HHV数についての継続的な評価に耐えうる方法であることから、 疲労の蓄積について の定量的な評価にも適用可能である

Claims

請求の範囲
1. 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の工程：
(1) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
(2) (1) の液をウィルス結合物質と接触させる、 ここで、 (i) 当該ウィルス結合物質 は担体に結合可能な分子に連結しており、.さらに当該分子を介して担体に結合させること により、 ウィルス結合物質に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i) 当該ウィルス結合物質は担体に直接的に結合しており、 それによりウィルス結合物質に結 合したウィルスは担体に結合し；
(3) 当該担体を （1) の液から分離し、；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
2. 鎌から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の工程：
(1) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
(2) (1) の液をレクチンと接触させる、 ここで、 (i) 当該レクチンは担体に結合可能 な分子に連結しており、 さらに当該分子を介して担体に結合させることにより、 レクチン に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i) 当該レクチンは担体に直接 的に結合しており、 それによりレクチンに結合したウィルスは担体に結合し；
(3) 当該担体を （1) の液から分離し、；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
3. 唾液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下の工程： (1) 採取した唾液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し； (2) (1) の液にピオチン化レクチンを混和して、 ウィルスとピオチン化レクチンを接触 させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、 ピオチン化レクチ ンと結合したウィルスをビーズに結合させ；
(3) 当該ビーズを （1) の液から分離し、 ；
(4) 分離したビーズから回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 唾液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
4. ヒトヘルぺスウィルスが、 ヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV-6) またはヒトヘル ぺスウィルス 7 (HHV-7) である、 請求項 1ないし 3いずれか 1項に記載の方法。
5. 基準ウィルスが、 HHV— 6または HHV— 7由来の組換えウィルスである、 請求 項 1ないし 3いずれか 1項に記載の方法。
6. レクチンが、 N—ァセチルガラクトサミン （Ga 1 NAc)、 α2— 6結合のシァ ル酸 （S i aa2— 6)、 N—ァセチルダルコサミン （G l cNAc) の少なくとも一つ を含む糖鎖に結合するレクチンである、 請求項 2または 3に記載の方法。
7. レクチンが、 SBA (ダイズ由来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DSA (チヨ ゥセンアサガオ由来)、 および^ WGA (コムギ胚芽由来） カ^なる群より選択される、 請 求項 6に記載の方法。
8. 工程 （4) が、 PCR、 LAMP、 および EL I S Aからなる群より選択される方 法によりウィルス数を定量することを含む、 請求項 1ないし 3いずれか 1項に記载の方 法。
9. 唾液から採取したヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV-6) またはヒトヘルぺスウイ ルス 7 (HHV-7) の数を定量する方法であって、 以下の工程：
(1) 採取した唾液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加して、 基準ウィル ス濃度が 10〜100, 000ゲノムコピー Zmlになるようにし、 ここで当該基準ウイ ルスは HHV— 6または HHV— 7由来の組換えウィルスである；
(2) (1) の液にピオチン化レクチンを混和して、 ウィルスとピオチン化レクチンを接触 させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、 ピオチン化レクチ ンと結合したウィルスをビーズに結合させ、 ここで当該レクチンは SB A (ダイズ由 来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DSA (チョウセンアサガオ由来)、 および WGA (コムギ胚芽由来） からなる群より選択され；
(3) 当該ビーズを （1) の液から分離し、；
(4) 分離したビーズから回収されたウィルス数を、 PCR、 LAMP, および EL I S Aからなる群より選択される方法で定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 唾液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
10. 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下のェ 程：
(1) 採取した体液に、 予め濃度が決定されている基準ウィルスを添加し；
(2) (1) の液を、 直径 10 nm〜l 00 nmのナノビーズに直接結合しているウィルス 結合物質と接触させて、 ウィルスをナノビーズに結合させ；
(3) 当該ナノビーズを （1) の液から分離し、；
(4) 分離した担体から回収されたウィルス数を定量し：そして
(5) 回収された基準ウィルス数と （1) で添加した基準ウィルス数とを比較して回収率 を評価し、 （4) で定量したヒトヘルぺスウィルス数と当該回収率から、 体液中から採取 したヒトヘルぺスウィルス数を決定する；
を含む、 前記方法。
11. 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量するためのキットであって、 以 下：
ピオチン化レクチン；
ピオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
を含む、 前記キット。
12. 体液から採取したヒ卜へルぺスウィルス数を定量するためのキッ卜であって、 以 下：
ピオチン化レクチン；
ピオチン結合タンパク質が結合したビーズ；
予め濃度が決定されている基準ウィルス；
を含む、 前記キット。
13. レクチンが、 N—ァセチルガラクトサミン （Ga 1 NAc)、 α2— 6結合のシ アル酸 (S i aa2-6), N—ァセチルダルコサミン （G l cNAc) の少なくとも一 つを含む糖鎖に結合するレクチンである、 請求項 11または 12に記載のキット。
14. レクチンが、 SBA (ダイズ由来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DSA (チ ヨウセンアサガオ由来)、 および WGA (コムギ胚芽由来） からなる群より選択され；そ して基準ウィルスが、 HHV— 6または HHV 7—由来の組換えウィルスである；請求項 13に記載のキット。
15. 体液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下のェ 程：
(1) 採取した纖をウィルス結合物質と接触させる、 ここで、 (i) 当該ウィルス結合物 質は担体に結合可能な分子に連結しており、 さらに当該 ^^を介して担体に結合させるこ とにより、 ウィルス結合物質に結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または （i i) 当該ウィルス結合物質は担体に直接的に結合しており、 それによりウィルス結合物質 に結合したウィルスは担体に結合し；
(2) 当該担体を (1) の液から分離し、 ；
(3) 分離した担体から回収されたウィルス量を定量する；
を含む、 前記方法。
16. 唾液から採取したヒトヘルぺスウィルス数を定量する方法であって、 以下のェ 程：
(1) 採取した唾液にピオチン化レクチンを混和して、 ウィルスとピオチン化レクチンを 接触させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、 ピオチン化レ クチンと結合したウィルスをビーズに結合させ；
(2) 当該ビーズを （1) の液から分離し、 ； (3) 分離したビーズから回収されたウィルス数を定量する； を含む、 前記方法。
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