SK147696A3 - Isolated and purified protein of papillomavirus, a capside, a viral particle, pharmaceutical composition comprising its, a method of making them and their use - Google Patents
Isolated and purified protein of papillomavirus, a capside, a viral particle, pharmaceutical composition comprising its, a method of making them and their use Download PDFInfo
- Publication number
- SK147696A3 SK147696A3 SK1476-96A SK147696A SK147696A3 SK 147696 A3 SK147696 A3 SK 147696A3 SK 147696 A SK147696 A SK 147696A SK 147696 A3 SK147696 A3 SK 147696A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- protein
- papillomavirus
- recombinant
- crpv
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 171
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 155
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 title claims abstract description 38
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 81
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 51
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 claims description 15
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 14
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 101710132637 Protein C2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710132697 Protein L2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710195626 Transcriptional activator protein Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 claims description 3
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 claims 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 claims 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 32
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 109
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 87
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 85
- 101100114742 Homo sapiens CPVL gene Proteins 0.000 description 54
- 101100484716 Homo sapiens VHLL gene Proteins 0.000 description 54
- 239000000463 material Substances 0.000 description 48
- 101900163635 Cottontail rabbit papillomavirus Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 47
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 37
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 30
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 29
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 29
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 29
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 26
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 25
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 24
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 24
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 22
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 101900043895 Cottontail rabbit papillomavirus Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 19
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 18
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 18
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 14
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 description 14
- 101150029183 PEP4 gene Proteins 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 13
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 13
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 13
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 12
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 12
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 11
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 11
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 11
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 10
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 10
- 101150101314 PRB1 gene Proteins 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 10
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 9
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- 101150027802 L2 gene Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 9
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000641175 Human papillomavirus type 18 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 7
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 6
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 5
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 101100243377 Mus musculus Pepd gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 102100029516 Basic salivary proline-rich protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 4
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 4
- 101001125486 Homo sapiens Basic salivary proline-rich protein 1 Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 101000742340 Human papillomavirus type 16 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 101000803413 Human papillomavirus type 18 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 2
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 201000000089 larynx squamous papilloma Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBTMNFYXJYCQHQ-UHFFFAOYSA-N (2,3,4,5,6-pentasulfooxycyclohexyl) hydrogen sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC1C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C(OS(O)(=O)=O)C1OS(O)(=O)=O NBTMNFYXJYCQHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N (e)-3-(1-benzyl-3-pyridin-3-ylpyrazol-4-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound N1=C(C=2C=NC=CC=2)C(/C=C/C(=O)O)=CN1CC1=CC=CC=C1 OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNUYRSUEKBRISA-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-[4-(2-hydroxyethyl)piperidin-1-yl]-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1CC(CCO)CCN1C1=NC(O)=NC(O)=C1Br PNUYRSUEKBRISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWWZYORFHGIOOC-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-6-[4-(2-hydroxyethyl)piperidin-1-yl]-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1CC(CCO)CCN1C1=NC(O)=NC(O)=C1Cl RWWZYORFHGIOOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700031454 Bovine papillomavirus L1 Proteins 0.000 description 1
- 108700031455 Bovine papillomavirus L2 Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 102000036364 Cullin Ring E3 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 1
- 108700025391 Human papillomavirus type 6 L1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- UIZOCMIOWRJUEG-OYIAIMIOSA-M azanium sodium (2S)-2-aminopentanedioate (2S)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound [NH4+].N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O.N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-].[Na+] UIZOCMIOWRJUEG-OYIAIMIOSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108010000306 endodeoxyribonuclease PaeI Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096405 magnesium cation Drugs 0.000 description 1
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940114241 recombivax Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález sa týka izolovaných a čistených bielkovín papilomavírusu a vektorov na expresiu rekombinantných bielkovín L1 a L2 tohto vírusu.
Doterajší stav techniky
K infekcii uvedeným vírusom dochádza u celého radu živočíchov, vrátane človeka, ovce, psa, mačky, králika, opice, kravy a tiež u hadov. Vírus infikuje epiteliálne bunky a zvyčajne vyvoláva tvorbu benígnych epiteliálnych nádorov v mieste infekcie. Vírusy sú špecifické pre určité čeľade, napríklad ľudský papilomavírus nemôže infikovať iné živočíchy .
Papilomavírusy je možné klasifikovať do rôznych skupín v závislosti na hostiteľovi, ktorých je vírus schopný infikovať. Ľudské papilomavírusy, HPV je ďalej možné zaradiť do viacerých než 60 typov na báze homológie sekvencie DNA, ako bolo opísané v súhrnej publikácii Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press, Inc., 1990. Papilomavírusy sú tiež špecifické, pokiaľ ide o tento typ, takže neutralizačná imunita k infekcii určitým typom tohto vírusu neznamená súčasne imunitu proti inému typu vírusu.
U človeka spôsobujú rôzne typy HPV odlišné ochorenia. HPV typu 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 spôsobujú tvorbu benígnych bradavíc u zdravých jedincov aj u jedincov s narušeným imunitným systémom. HPV typu 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 spôsobujú ploché poškodenia u ľudí s narušeným imunitným systémom. HPV typu 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 spôsobujú tvorbu nemalígnych kondylomov na sliznici genitá’lneho alebo respiračného systému. HPV typu 16 a 18 vyvolávajú epiteliálnu dysplaziu sliznice pohlavných orgánov a sú spojené prevažne s tvorbou invazívnych karcinómov, vznikajúcich in situ v pošve, kŕčku maternice, rodidlách a v análnom kanáli. HPV6 a HPV11 spôsobuje viac než 90 % všetkých kondylomov v genitálnej oblasti a papilomov hrtana. Najčastejšie sa vyskytujúcim podtypom HPV typu 6 je HPV6a.
Imunologické štúdie u živočíchov dokázali, že tvorba neutralizačných protilátok proti antigénom papilomavirusu môže zabrániť infekcii homológnym vírusom. Vývoj účinnej vakcíny proti tomuto vírusu bol spomalený v dôsledku ťažkostí, ktoré sú spojené s pestovaním týchto vírusov in vitro. Ďalej potom bol vývoj účinnej vakcíny proti HPV spomalený skutočnosťou, že neexistuje vhodný živočíšny model.
Neutralizácia papilomavirusu protilátkami je zrejme typovo špecifická a závislá na základných epitópoch na povrchu určitého typu vírusu.
Papilomavírusy sú malé vírusy veľkosti 50 až 60 nm, neopuzdrené DNA vírusmi v tvare dvadsaťstenu, s kódovými sekvenciami pre až 8 včasných a 2 neskoré gény. Otvorené čítacie rámce ORF genómu vírusu sú označené E1 až E7 a L1 a L2, kde E znamená včasný a L znamená neskorý. L1 a L2 sú kódové sekvencie pre bielkoviny kapsidu vírusu. Včasné gény sú spojené s určitou funkciou, napríklad replikáciou vírusov a jeho transformáciou vo vnútri buniek.
Bielkovina L1 je hlavná bielkovina kapsidu s molekulovou hmotnosťou 55 000 až 60 000. Bielkovina L1 je bielkovina kapsidu, vyskytujúca sa v menšom množstve, s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 55 000 až 60 000 a zjavnou melekulovou hmotnosťou 75 000 až 100 000 pri stanovení elektroforézou na polyakrylamidovom géli. Podľa imunologických údajov je možné predpokladať, že väčšina bielkoviny L2 je uložená vo vnútri vzhľadom na bielkovinu L1. Bielkoviny L2 sú u rôznych vírusov vysoko konzervované, zvlášť ide o 10 bázických aminokyselín na C-zakončení. L1 ORF je vysoko koncentrovaný u rôznych papilomavírusov.
Gény L1 a L2 boli použité na tvorbu vakcín na prevenciu a liečenie infekcií týmito vírusmi u živočíchov. Zhou a dal3 ší, 1991, 1992 klonovali HPV, gény typu 16, L1 a L2 vo vakcínia víruse ako vektora a potom infikovali rekombinantným vektorom cicavčí bunkový materiál CV-1 za vzniku častíc, podobných vírusu a označovaných VLP.
Boli izolované rekombinantné Ll a L2 papilomavírusu hovädzieho dobytka, odvodené od baktérií. Nautralizačné séra proti rekombinantným bakteriálnym bielkovinám reagovali s natívnym vírusom, pravdepodobne vzhľadom k rozdielu medzi natívnymi a z baktérií odvodenými bielkovinami však bola reaktivita veľmi nízka.
Rekombinantné baculovírusy, u ktorých dochádzalo k expresii HPV6 Ll , HPV11 L1, HPV16 L1, HPV18 L1, HPV31 Ll alebo HPV16 L2 ORF boli použité na infekciu buniek hmyzu SF9 a na produkciu bielkovín Ll a L2. Analýza Vestern Blot dokázala, že bielkoviny Ll a L2, odvodené od baculovírusu, reagujú s protilátkou proti HPV16. Ll, po odvodení od baculovírusu vytvárajú častice, podobné vírusu, VLP.
Carter a ďalší, 1991 dokázali produkciu bielkovín HPV16 Ll a HPV16 L2 rekombinantným kmeňom Saccharomyces cerevisiae. Títo autori tiež dokázali produkciu bielkovín HPV6b Ll a L2. Bielkovina HPV6b Ll nemala plnú dĺžku bielkoviny Ll. Rekombinantné bielkoviny boli produkované vo vnútri buniek, avšak boli tiež z buniek vylučované. Molekulová hmotnosť rekombinantných bielkovín Ll a L2 bola podobná ako u prírodných bielkovín. V prípade, že k expresii bielkovín došlo vo vnútri buniek, bola väčšina týchto bielkovín nerozpustná po rozrušení buniek v neprítomnosti denaturačných reakčných činidiel. Aj napriek tomu, že táto nerozpustnosť môže uľahčiť čistenie bielkoviny, môže tiež zabrániť analýze natívnych epitópov týchto bielkovín.
Bolo dokázané, že rekombinantné bielkoviny, vylučované kvasinkami, obsahujú uhľohydráty, odvodené od týchto kvasiniek. Prítomnosť takýchto N-viazaných oligosacharidov môže maskovať prítomnosť natívnych epitópov. Okrem toho môžu vylučované rekombinantné bielkoviny obsahovať ďalšie modifikácie, napríklad retenciu sekrečnej vedúcej sekvencie.
Je zrejmé, že by bolo potrebné vyvinúť spôsoby, ktorými by bolo možné získať veľké množstvo bielkoviny papilomavirusu akéhokoľvek typu pestovaním rekombinantných kvasiniek. Bolo by tiež žiadúce získať veľké množstvo týchto bielkovín s rovnakými vlastnosťami ako natívne bielkoviny, pokiaľ ide o vyvolanie imunity.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoria izolované a čistené bielkoviny papilomavírusu zo skupiny L1, L2, L1 + L2 a ich funkčné deriváty s čistotou najmenej 60 %.
Vynález sa tiež týka spôsobu výroby rekombinantných bielkovín papilomavírusu so schopnosťou prenášať imunitu, zodpovedajúcu natívnym bielkovinám. Vynález sa tiež týka spôsobu výroby vakcíny na preventívne a liečebné použitie proti infekcii uvedeným vírusom. Rekombinantné bielkoviny podľa vynálezu majú schopnosť tvoriť častice, podobné vírusu, VPL. Tieto častice sú imunogénne a na živočíšnom modeli zabránia tvorbe bradavíc. Podľa vynálezu sa používa králičí papilomavírus CRPV a HPV typu 6 (podtyp 6a) ako modelové systémy.
Vynález sa týka postupov a prostriedkov na charakterizáciu, detekciu, prevenciu a liečenie infekcií papilomavírusom PV. Postupy sú založené na produkcii rekombinantných bielkovín L1, L2 alebo L1 + L2 v kvasinkách. Tieto rekombinantné bielkoviny môžu napodobniť neutralizačné epitópy natívneho PV. Rekombinantné bielkoviny L1 alebo L1 + L2 môžu tiež vytvárať častice, podobné vírusom, VLP. Prostriedok podľa vynálezu obsahuje kódové rekombinantné molekuly DNA pre bielkoviny L1 alebo L2 alebo L1 + L2, rekombinantné bielkoviny ako také alebo v kombinácii s ďalšími rekombinantnými bielkovinami, VLP s obsahom najmenej jednej rekombinantnej bielkoviny, fragmenty týchto rekombinantných bielkovín. Prostriedky zahrňujú aj farmaceutické prostriedky s obsahom rekombinantných bielkovín, vakcíny s obsahom rekombinantných bielkovín, protilátky proti rekombinantným bielkovinám alebo VLP, imunogénne prostriedky s obsahom najmenej
- 5 jednej rekombinantnej bielkoviny a diagnostické balíčky s obsahom rekombinantných molekúl DNA alebo rekombinantných bielkovín. Spôsoby podľa vynálezu sa týkajú produkcie rekombinantnej bielkoviny transformáciou príslušných kvasiniek rekombinantnou molekulou DNA a pestovaním transformovaných kvasiniek za podmienok, pri ktorých môže dôjsť k expresii tejto DNA za produkcie rekombinantnej bielkoviny s následným čistením tejto bielkoviny. Takto získané rekombinantné bielkoviny je možné podávať živočíchom, vrátane človeka, podávať je možné tiež prostriedky s obsahom týchto bielkovín alebo VLP. Hostiteľské bunky zahrnujú kmene kvasiniek z rodov Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces a Hansenula.
K infekcii papilomavírusom môže dôjsť u celého radu živočíchov, vrátane ľudí, oviec, psov, mačiek, králikov, opíc, hadov a kráv. Papilomavírusy infikujú epiteliálne bunky a zvyčajne spôsobujú v mieste infekcie tvorbu benígnych epiteliálnych alebo fibroepiteliálnych nádorov.
Papilomavírusy je možné klasifikovať do rôznych skupín v závislosti na hostiteľovi, ktorých je vírus schopný infikovať. Ľudské papilomavírusy, HPV je ďalej možné zaradiť do viacerých než do 60 typov na báze homológie sekvencie DNA, ako bolo opísané v súhrnej publikácii Papilomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press, Inc., 1990. Papilomavírusy sú tiež špecifické, pokiaľ ide o tento typ, takže neutralizačná imunita k infekcii určitým typom tohto vírusu neznamená súčasne imunitu proti inému typu vírusu.
U človeka spôsobujú rôzne typy HPV odlišné ochorenia. HPV typu 1,2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 spôsobujú tvorbu benígnych bradavíc u zdravých jedincov s narušeným imunitným systémom. HPV typu 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 spôsobujú ploché poškodenia u ľudí s narušeným imunitným systémom. HPV typu 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 spôsobujú tvorbu nemalígnych kondylomov na sliznici genitálneho alebo respiračného systému. HPV typu 16 a 18 vyvolávajú epiteliálnu dysplaziu sliznice pohlavných orgánov a sú spojené prevažne s tvorbou invazívnych karcinómov, vznikajú- 6 cich in situ v pošve, kŕčku maternice, rodidlách a v análnom kanáli. HPV6 a HPV11 spôsobuje viac než 90 % všetkých kondylomov v genitálnej oblasti a papilomov hrtana.
Imunologické štúdie u živočíchov dokázali, že tvorba neutralizačných protilátok proti antigénom papilomavírusu môže zabrániť infekcii homológnym vírusom. Vývoj účinnej vakcíny proti tomuto vírusu bol spomalený v dôsledku ťažkostí, ktoré sú spojené s pestovaním týchto vírusov in vitro. Ďalej potom bol vývoj účinnej vakcíny proti HPV spomalený skutočnosťou, že neexistuje vhodný živočíšny model.
Neutralizácia papilomavírusu protilátkami je zrejme typovo špecifická a závislá na základných epitópoch na povrchu určitého typu vírusu.
Papilomavírusy sú malé vírusy veľkosti 50 až 60 nm, neopuzdrené DNA vírusmi v tvare dvadsaťstenu, s kódovými sekvenciami pre 8 včasných a 2 neskoré gény. Otvorené čítacie rámce ORF genómu vírusu sú označené E1 až E7 a L1 a L2, kde E znamená včasný a L znamená neskorý. L1 a L2 sú kódové sekvencie pre bielkoviny kapsidu vírusu. Včasné gény sú spojené s určitou funkciou, napríklad replikáciou vírusov a ich transformáciou vo vnútri buniek.
Bielkovina L1 je hlavná bielkovina kapsidu a má molekulovú hmotnosť 55 000 až 60 000. Bielkovina 12 sa v kapside vyskytuje v menšom množstve, jej predpokladaná molekulová hmotnosť je 55 000 až 60 000 a zjavná molekulová hmotnosť 75 000 až 100 000 pri stanovení elektroforézou na polyakrylamidovom géli.
Boli už podané správy o produkcii bielkovín HPV16 L1, HPV16 L2 a HPV6 L1 rekombinantnými kmeňmi Saccharomyces cerevisiae. Bolo by vhodné vyvinúť spôsoby na výrobu veľkého množstva bielkovín papilomavírusu akéhokoľvek typu pestovaním rekombinantných kvasiniek. Bolo by tiež vhodné získať veľké množstvo bielkovín papilomavírusu s imunitnými vlastnosťami natívnych bielkovín, napríklad so schopnosťou vyvolať imunitu proti infekcii vírusom.
Vynález sa týka spôsobu výroby takýchto bielkovín a ich použitia. Vynález sa zvlášť týka výroby profylaktickej vak7 cíny proti infekcii uvedeným vírusom. Na tento účel boli využité kmene vírusov CRPV králičieho pôvodu a kmene HPV6 ľudského pôvodu ako modelové systémy. Je zrejmé, že všeobecný postup podľa vynálezu je platný aj pre ďalšie typy a podtypy papilomavírusu PV vrátane HPV typu 11, HPV typu .16 a HPV typu 18, rovnako ako HPV podtyp 6a a HPV podtyp 6b.
Farmaceutické prostriedky s obsahom bielkovín alebo VLP je možné pripraviť známymi postupmi, napríklad pridaním prijateľného nosiča. Príklady takýchto postupov a nosičov je možné nájsť v publikácii Remington’s Pharmaceutical Sciences. Farmaceutický prostriedok na toto použitie bude obsahovať účinné množstvo bielkoviny alebo VLP, tieto látky môžu byť odvodené od jediného typu alebo od väčšieho počtu typov HPV.
Prostriedky na diagnostické alebo liečebné účely podľa vynálezu sa podávajú v množstve, dostatočnom na liečenie alebo diagnostiku infekcie PV. Účinné množstvo môže závisieť na rade faktorov, ako sú celkový stav chorého, hmotnosť, pohlavie a vek alebo aj spôsob podania. Zvyčajne sa budú dávky pohybovať v rozmedzí 1 až 250 mikrogramov.
Farmaceutické prostriedky je možné podávať podkožné, miestne, perorálne, na sliznici alebo vnútrosvalovo.
Vakcíny podľa vynálezu obsahujú rekombinantné bielkoviny alebo VLP s obsahom antigénnych determinantov, potrebných na vyvolanie tvorby neutralizačných protilátok u hostiteľa. Vakcíny sú dostatočne bezpečné na podávanie bez nebezpečia klinickej infekcie, nemajú toxické vedľajšie účinky, sú stále, kompatibilné s bežnými nosičmi a je možné ich podávať účinným spôsobom.
Vakcíny je možné podávať rôznymi cestami, napríklad perorálne, parenterálne, podkožné, na sliznici alebo vnútrosvalovo. Podávaná dávka sa môže meniť v závislosti na celkovom stave, pohlaví, hmotnosti a veku chorého,’ na spôsobe podania a na type PV vo vakcíne. Vakcína môže mať formu kapsúl, suspenzie, elixíru alebo roztoku. Môže byť spracovaná spolu s imunologický prijateľným nosičom.
Vakcíny sa podávajú v množstve, dostatočnom na vyvolá8 nie ochrannej odpovede. Toto množstvo sa môže meniť v závislosti na použitom type PV, vakcínu je možné podať vo forme jednotlivej alebo opakovanej dávky.
Spôsoby podľa vynálezu umožňujú tvorbu vakcíny pri použití menších prvkov než vírusov na prevenciu infekcie PV. Použitím týchto postupov je možné pripraviť monovalentné alebo viacvalentné vakcíny. Napríklad monovalentnú vakcínu HPV typ 16 je možné pripraviť použitím rekombinantnej bielkoviny HPV 16 L1 alebo L2 alebo L1 + L2. Viacvalentnú vakcínu je možné pripraviť zmiešaním L1 alebo L2 alebo L1 + L2 alebo VLP rôznych typov HPV.
Rekombinantné bielkoviny a VLP podľa vynálezu je možné využiť na vytvorenie imunogénnych prostriedkov. Tieto prostriedky sú po podaní príslušnému hostiteľovi schopné vyvolať odpoveď imunitného systému.
Rekombinantné bielkoviny a VLP je možné využiť na tvorbu protilátok. Môže ísť o polyklonálne a monoklonálne protilátky a tiež a ich fragmenty, napríklad o fragmenty Fv, Fab a F(ab)2, schopné sa viazať na antigén alebo na haptén.
Rekombinantné bielkoviny, VLP a protilátky podľa vynálezu je tiež možné použiť na seriózne vyšetrenie serotypov HPV a infekcií týmito serotypmi. Rekombinantné bielkoviny, VLP a protilátky môžu tvoriť súčasť skúšobného balíčka, použiteľného na detekciu a určenie serotypov HPV. Takýto skúšobný balíček bude obsahovať nosič, uložený v zásobníku spolu s reakčnými činidlami, ako rekombinantnou bielkovinou HPV alebo VLP alebo protilátkou proti HPV, vhodnou na detekciu rôznych typov HPV. Nosič môže tiež obsahovať prostriedky na detekciu, napríklad značený antigén, substráty pre enzýmy a podobne.
Rekombinantné bielkoviny a VLP podľa vynálezu je možné využiť aj ako značiace látky na určenie molekulovej hmotnosti .
Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. v kvasinkách
Na obr. 1 je znázornený obojsmerný vektor na expresiu v kvasinkách, použitý na expresiu bielkovín kapsidu papilomavírusu L1 a/alebo L2.
Na obr. 2 je znázornená expresia bielkoviny L1 HPV6a v kvasinkách (imunoblot).
je znázornená expresia bielkoviny L2 HPV6a (imunoblot). Dráha 1: molekulová hmotnosť
- značenie. Dráha 2: zložená bielkovina trpE-L2 po expresii v E. coli ako pozitívna kontrola. Dráha 4: HPVóa L1 po expresii v kvasinkách ako negatívna kontrola. Dráha 5: HPVóa L2 po expresii v kvasinkách (podrobnejšie údaje budú ďalej uvedené).
Na obr. 4 je znázornená mikrofotografia HPVóa L1 VLP po expresii v kvasinkách v elektrónovom mikroskope.
Na obr. 5 je znázornená mikrofotografia HPVóa L1/L2 VLP po expresii v kvasinkách v elektrónovom mikroskope.
Na obr. 6 je znázornený imunoblot CRPV L1, L2 a L1 + L2 po expresii týchto bielkovín v kvasinkách.
Časť A: expresia CRPV L1, meranie podľa reaktivity s antisérom proti CRPV L1.
Časť B: expresia CRPV L2, meranie podľa reaktivity s antisérom proti CRPV L2.
Dráha 1: značenie molekulovej hmotnosti po hodnotách 1000 (Amersham Rainbow^^ Markers, 14 300 až 200 000).
Dráha 2: BL5462 s obsahom vektora na expresiu CRPV L1.
Dráha 3: kmeň 1569 s obsahom vektora na expresiu CRPV L2. Dráhy 4 a 5: dva izoláty kmeňa 1569, súčasne transformovaného dvoma plazmidmi na expresiu CRPV L1 a CRPV L2.
Dráhy 6 až 8: tri izoláty kmeňa 1569, obsahujúci jediný vektor na súčasnú expresiu bielkovín CRPV L1 a L2.
Dráhy 9 a 10; dva izoláty BJ5462, obsahujúce jediný vektor na súčasnú expresiu bielkovín CRPV L1 a L2.
Poloha migrácie L1 a L2 je značená na pravej osi príslušnej časti obr. 6.
Na obr. 7 je schematicky znázornená konštrukcia kmeňa
S. cerevisiae 1558, obsahujúca mnn9 a prbl mutanty.
Na obr. 8 je schematický znázornená konštrukcia kmeňa S. cerevisiae 1569, obsahujúca prbl a pep4 mutanty.
Na obr. 9 sú uvedené hlavné stupne čistiaceho postupu.
Na obr. 10 je uvedený zoznam rekombinantných kmeňov kvasiniek, u ktorých dochádza k expresii bielkovín Ll a/alebo L2.
Na obr. 11 sú znázornené analýzy čistených bielkovín HPV16 Ll + L2 z kvasiniek za použitia SDS-PAGE. Okrem konečnej čistenej frakcie VLP sú uvedené aj frakcie z medzistupňa. V každej dráhe je identifikovaná vzorka. Je uvedený gél, farbený farbivom Coomassie a tiež Vestern blot za použitia antisér proti bielkovinám Ll a L2.
Na obr. 12 je schematický znázornený ďalší možný spôsob čistenia Ll z CRPV VLP.
Na obr. 13 a 14 sú znázornené analýzy čistených častíc VLP za použitia SDS/PAGE.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava kmeňa kvasiniek U9
Kmeň kvasiniek Saccharomyces cerevisiae 3150-2-3 (MATa, leu-2-04, adel, οϊτθ) bol získaný od Dr. Lelanda Hartwella (University of Vashington, Seattle, Va). Bunky kmeňa 2150-2-3 boli pestované cez noc pri teplote 30 °C v 5 ml prostredia YEHD podlá publikácie Carty a ďalší, J. Ind. Micro, 2, 1987, 117 až 121. Bunkový materiál sa trikrát premyje sterilnou destilovanou vodou, znova sa uvedie do suspenzie v 2 ml sterilnej destilovanej vody a 0,1 ml bunkovej suspenzie sa nenesie na každú zo šiestich platní, obsahujúcich kyselinu 5-fluórorotovú, FOA na selekciu mutánt ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual of Yest Genetics). Platne boli inkubované pri teplote 30 °C. Prostredie obsahovalo v 250 ml destilovanej vody 3,5 g základných dusíkatých
YEHD, zatiaľ Bol oddelený látok (Difco) bez aminokyselín a síranu amónneho, 0,5 g kyseliny 5-flórorotovej, 25 mg uracilu a 10,0 g dextrózy.
Prostredie sa sterilizuje filtráciou cez membránu s otvormi 0,2 mikrometra a potom sa zmieša s 250 ml 4% Bactoagaru (Difco), udržovaného na teplote 50 C, 10 ml roztoku adenínu s obsahom 1,2 mg/ml tejto látky a 5 ml roztoku L-leucínu s obsahom 180 mg/50 ml. Výsledné prostredie sa potom rozdelí do Petriho misiek po 20 ml.
Po 5 dňoch inkubácie sa vytvoril rad kolónií. Jednotlivé kolónie boli izolované odohraním kolónií z počiatočných platní FOA a ich rozotrením na čerstvé platne FOA, ktoré potom boli inkubované pri teplote 30 °C. Kolónie z druhej skupiny platní FOA boli potom podrobené skúškam na prítomnosť mutácie ura3 opakovaným nanesením na platne YEHD a na platne uracil-mínus. Bolo možné pozorovať dobrý rast na platniach čo v prostredí bez uracilu kvasinky nerástli, izolát U9 s uvedenými vlastnosťami a uložený v zmrazenom stave v glycerole pri teplote -70 °C na ďalšie použitie (kmeň 325).
Príklad 2
Príprava vektora na rozrušenie génu kvasiniek MNN9
Aby bolo možné pripraviť vektor na rozrušenie génu MNN9, bolo najskôr potrebné klonovať gén MNN9 z DNA genómu S, cerevisiae. Tento postup bol uskutočnený za použitia PCR-technológie. 5’-negatívny primér a 3’-pozitívny primér pre PCR v plnej dĺžke kódovej sekvencie MNN9 boli skonštruované podľa zverejnenej sekvencie génu MNN9 z kvasiniek v EP patentovej prihláške č. 88117834.7, zverejnenie pod číslom 314 096 (Zymogenetics). Boli použité nasledujúce oligodeoxynukleotidové priméry s okrajovými časťami HindlII (podčiarknuté).
Negatívny primér:
5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3'(reťazec č.l)
Pozitívny primér:
5’-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’ (reťazec č. 2)
Počiatočný kodón pre metionín génu pre MNN9 je uložený tesne za miestom pôsobenia HindlII, ktoré je v negatívnom priméri podčiarknuté. PCR sa uskutočňuje za použitia DNA genómu kmeňa S. cerevisiae JRY188 ako matrice. Použije sa Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer) a 25 cyklov amplifikácie (94 °C 1 minúta, 37 °C 2 minúty a 72 °C 3 minúty). Výsledný fragment PCR s veľkosťou 1,2 kb sa rozštiepi enzýmom HindlII, čistí sa na géli a naviaže sa na plazmid pUC13 (Pharmacia), vopred rozštiepený enzýmom HindlII a spracovaný alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid bol označený pll83.
Aby bolo možné rozrušiť gén MNN9 jeho prerušením génom URA3 z kvasiniek, bol plazmid pBR322-URA3 (obsahujúci kódový fragment génu S. cerevisiae URA3 po štiepení enzýmom HindlII s veľkosťou 1,1 párov kb, subklonovaný v mieste pôsobenia HindlII plazmidu pBR322) rozštiepený enzýmom HindlII a fragment DNA s velkosťou 1,1 párov kb, obsahujúci funkčný gén URA3 bol čistený na géli, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a potom bol fragment naviazaný na plazmid pll83 po jeho rozštiepení enzýmom PmlI (PmlI štiepi v kódovej sekvencii MN9. Výsledný plazmid pll99 obsahuje prerušenie génu MNN9 funkčným génom URA3.
Príklad 3
Konštrukcia derivátu U9 kmeňa s obsahom prerušeného génu MNN9
Na prerušenie génu MNN9 u kmeňa U9(325), sa 30 mikrogramov plazmidu pll99 štiepi enzýmom HindlII za vzniku lineárnej kazety mnn9:URA3 s prerušením. Bunkový materiál kmeňa 325 sa transformuje uložením DNA plazmidu pll99 po rozštiepení HindlII za využitia sferoplastov podľa publikácie Hinnen a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 5:1929 až 1933 a transformanty boli podrobené selekcii na syntetickom agarovom prostredí bez uracilu s obsahom 1,0 M sorbitolu. Syntetické prostredie obsahovalo na 1 liter destilovanej vody 20 g agaru, 6,7 g dusíkatých báz a aminokyselín z kvasiniek, 0,04 g adenínu, 0,05 g L-tyrozínu, 182 g sorbitolu, 20 g glukózy a 10 ml roztoku 2 s nedostatkom Íeucínu. Tento roztok obsahuje na 1 liter destilovanej vody 2 g L-arginínu, 1 g L-histidínu, 6 g L-leucínu, 6 g L-izoleucínu, 4 g L-lyzínu, 1 g L-metionínu, 6 g L-fenylalanínu, 6 g L-teronínu, 4 g L-tryptofánu.
Platne boli inkubované 5 dní pri teplote 30 C, v priebehu tejto doby sa vytvorili mnohé kolónie. Z desiatich kolónií boli pripravené preparáty chromozomálnej DNA a tie boli potom rozštiepené enzýmami EcoRI a HindlII. Rozštiepený materiál bol potom vyhodnotený metódou Southern blots podľa J. Sambrock a ďalší, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, za použitia fragmentu po štiepení HindlII s veľkosťou 1,2 párov kb s obsahom génu MNN9 , izolovaného z plazmidu pll99 ako sondy. Jeden z izolátov, kmeň 1372, ktorý bol týmto spôsobom identifikovaný, mal očakávaný posun pásov pre DNA pri uskutočňovaní metódy Southern blot a tiež vytváral zhluky, ktoré sú typické pre mutanty s obsahom MNN9 .
Príklad 4
Konštrukcia vektora na prerušenie génu HIS3 u kvasiniek
Aby bolo možné vytvoriť kazetu na prerušenie, v ktorej je gén HIS3 kvasiniek S. cerevisiae prerušený génom URA3, bol plazmid YEp6 podľa publikácie K. Struhl a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:1035 rozštiepený enzýmom BamHI. Fragment po tomto štiepení s veľkosťou 1,7 párov kb a obsahujúci gén HIS3, bol čistený na géli, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a fragmenty boli naviazané na plazmid pUC18, vopred taktiež rozštiepený pôsobením BamHI a spracovaný T4 DNA polymerázou. Výsledný plazmid, označovaný pl501 alebo pUC18-HIS3 bol rozštiepený enzýmom NheI, kto14 rý štiepi kódovú sekvenciu HIS3 a fragment vektora bol čistený na géli, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a potom bol materiál spracovaný alkalickou fosfatázou z teľacích čriev. Gén URA3 bol izolovaný z plazmidu pBR322 rozštiepením HindlII a fragment s 1,1 pármi kb, obsahujúci gén URA3 bol čistený na géli, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a materiál bol naviazaný na vyššie uvedený fragment pUC18-HIS3 NheI. Výsledný plazmid, označený pUCl8-his3::URA3 alebo pl515 obsahuje kazetu, v ktorej je gén HIS3 kvasiniek prerušený funkčným génom URA3.
Príklad 5
Konštrukcia vektora na prerušenie génu PRB1 kvasiniek génom HIS3
Plazmid FP8deltaH s obsahom génu PRB1 kvasiniek S. cerevisiae, bol dodaný z Dr. E. Jones of Carnegie-Mellon Univ., C. M. Moehle a ďalší, 1987, Genetics, 115:255 až 263. Plazmid bol rozštiepený enzýmami HindlII a Xhol a fragment DNA s obsahom 3,2 párov kb, nesúci gén PRB1 bol čistený na géli a zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou. Plazmid pUCl8 bol rozštiepený BamHI, čistený na géli a zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou. Výsledný fragment vektora bol naviazaný na vyššie získaný fragment s génom PRB1 za vzniku plazmidu pUC18-PRBl. Plazmid YEp6, obsahujúci gén HIS3, bol rozštiepený enzýmom BamHI. Výsledný fragment BamHI, obsahujúci 1,7 párov kb a funkčný gén HIS3 bol čistený na géli a zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou. Plazmid pUC18-PRBl bol rozštiepený enzýmami EcoRV a Ncol, štiepiacimi vo vnútri kódovej sekvencie PRB1 a odstraňujúcimi miesto pre proteázu B a susedný reťazec. Fragment EcoRV-Ncol s 5,7 pármi kb, obsahujúci zvyšné 5’- a 3’-časti kódovej sekvencie PRB1 v pUC18 bol čistený na géli, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a po defosforylácii alkalickou fosfatázou z teľacích čriev bol materiál naviazaný na vyššie opísaný fragment HIS3 s vyplnenými koncami. Vý15 sledný plazmid, označovaný pUC18-prbl::HIS3, kmeň 1243, obsahuje funkčný gén HIS3 namiesto časti génu PRBl, ktorý bol týmto postupom rozrušený.
Príklad 6
Konštrukcia U9-kmeňa kvasiniek s obsahom rozrušených génov MNN9 a PRBl
U9-kmeň 1372, obsahujúci prerušený gén MNN9 bol opísaný v príklade 3. Izoláty klonov tohto kmeňa boli nanesené na platne FOA na selekciu mutánt ura3. Bol získaný rad izolátov ura3 kmeňa 1372 a jeden z nich (kmeň 12930-190-Sl-1) bol zvolený pre nasledujúce rozrušenie génu HIS3. Vektor pUC18-his3::URA3, pl501 bol rozštiepený enzýmami Xbal a EcoRI za vzniku lineárnej kazety his3::URA3 a bol použitý na transformáciu kmeňa 12930-190-S1-1 za použitia octanu lítneho podľa publikácie Methods in Enzymology, 194:290, 1991. Transforraanty Ura+ boli podrobené selekcii na syntetickom agarovom prostredí bez uracilu, potom nanesené na to isté prostredie na získanie jednotlivých izolátov, tie boli potom nanášané na prostredie bez uracilu alebo bez histidínu, aby bolo možné zistiť izoláty, súčasne Ura+ a His-. Jeden z týchto izolátov, kmeň 12930-230-1 bol zvolený pre nasledujúce rozrušenie génu PRBl. Vektor na rozrušenie tohto génu, pUC18-prbl::HIS3, kmeň 1245, bol rozštiepený enzýmami Sací a Xbal za vzniku lineárnej kazety prbl::HIS3 a tá bola potom použitá na transformáciu kmeňa 12930-230-1 postupom za použitia octanu lítneho. His+ transformanty boli podrobené selekcii na agarovom prostredí bez histidínu a potom prenesené jednotlivo na to isté prostredie na získanie izolátov jednotlivých klonov. Z radu výsledných izolátov His+ bola pripravená DNA genómu, ktorá bola rozštiepená enzýmom EcoRI a podrobená elektroforéze na 0,8% agarózovom géli. Potom bola uskutočnená analýza Southern blot za použitia rádioaktívne značenej sondy so 617 bp pre gén PRBl, pripravený pomocou PCR za použitia nasledujúcich oligodeoxynukleotidových pri16 mérov:
5’-TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3’ (reťazec č. 3)
5’ CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3’ (reťazec č. 4).
Bolo získaných jedenásť izolátov s očakávanou hybridizáciou sondy s fragmentom DNA prbl::HIS3 s veľkosťou 2,44 párov kb. Táto skutočnosť kontrastuje s hybridizáciou rovnakej sondy s fragmentom divokého typu génu PRB1 s veľkosťou 1,59 párov kb. Jeden z izolátov, obsahujúci požadované prerušenie prbl::HIS3 bol vybratý na ďalšie použitie a označený ako kmeň 1558.
Príklad 7
Konštrukcia vektora na rozrušenie génu PEP4 kvasiniek
Gén PEP4 kvasiniek S. cerevisiae bol klonovaný z banky genómu kvasiniek nasledujúcim spôsobom. Bunky E. coli, obsahujúce banku genómu kvasiniek pLSIOl podľa publikácie Schultz a Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155:8 až 14, boli pestované cez noc v 5 ml prostredia LB s obsahom 100 mikrogramov/ml ampicilínu. Z tejto kultúry boli nanesené riedenia ÍO-^ a 10”^ na platne prostredia LB s ampicilínom. Kolónie boli odobraté nitrocelulózovými filtrami. Sonda so 600 bp pre gén PEP4 kvasiniek bola pripravená pomocou PCR a Taq DNA polymerázy za použitia celkovej DNA plazmidu z pLSIOl a nasledujúcich oligodeoxynukleotidových primérov, konštruovaných na báze zverejnenej sekvencie DNA pre PEP4 podľa C.A. Voolford a ďalší, Moc. Celí. Biol., 6:2500, 1986.
Natívny primér:
5’-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3’ (reťazec č. 5)
Pozitívny primér:
5’-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3’ (reťazec č. 6).
PCR bola uskutočňovaná za použitia 25 cyklov amplifikácie, vždy 94 °C 1 minúta, 37 °C 2 minúty a 72 °C 3 minúty. PCR-sonda bola čistená na géli, rádioaktívne značená a hybridizovaná s vyššie uvedenými filtrami s odobratými kolóniami . Niekoľko kolónií bolo pozitívnych na hybridizáciu so sondou PEP4. Tieto kolónie boli znova nanesené jednotlivo na platne s prostredím LB s ampicilínom. DNA-plazmidu bola pripravená rozrušovaním pomocou alkalického prostredia a SDS podľa vyššie uvedenej publikácie Sambrooka a ďalších, z materiálu z niekoľkých izolátov a rozštiepená enzýmom BamHI. Bolo možné pozorovať očakávaný pás pre vektor so 14 pármi kb a pás na uloženie PEP4 so 6,9 kbp. Po dvojitom rozštiepení enzýmami EcoRI a Xhol bolo možné pozorovať očakávaný pás pre PEP4 s 1,5 kbp. Jeden z izolátov, kmeň 860 s očakávanými výsledkami bol vybratý na ďalšie použitie. DNA tohto kmeňa bola rozštiepená enzýmom BamHI a vzniknutý fragment DNA so 6,9 kbp s obsahom chroraozomálneho génu PEP4 bol subklonovaný v plazmide pUC13 v mieste jeho štiepenia enzýmom BamHI za vzniku plazmidu p890. Tento plazmid bol potom rozštiepený Ncol, štiepiacim v kódovej sekvencii PEP4, materiál bol čistený na géli, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a materiál bol naviazaný na fragment s 1,1 kbp s vyplnenými koncami, obsahujúci funkčný gén URA3 a pripravený podľa príkladu 2. Výsledný plazmid, obsahujúci gén PEP4, prerušený génom URA3 bol potom označený pUC13-pep4::URA3, kmeň 906.
Príklad 8
Konštrukcia kmeňa 1569 kvasiniek, ktorý je derivátom kmeňa U9, obsahujúceho mutácie prbl a pep4
Aby bolo možné rozrušiť gén HIS3 u kmeňa U9, bol rozštiepený vektor pUC18-his3::URA3 enzýmami EcoRI a Xbal a potom použitý na transformáciu kmeňa U9 za použitia octanu lítneho. Transformanty Ura+ boli podrobené selekcii na agarovom prostredí bez uracilu a potom znova nanesené na to isté prostredie na izoláciu klonov. Rad výsledných izolátov
Ura+ bol potom znova nanesený na agarové prostredie bez uracilu alebo bez histidínu a boli vyhľadávané izoláty, súčasne Ura+ a His”. Jeden z izolátov, kmeň 1524 bol vybratý na rozrušenie génu PRB1. Vektor pUC18-prbl::HIS3 bol rozštiepený enzýmami Sací a Xbal a potom bol použitý na transformáciu kmeňa 1524 za použitia octanu lítneho. Transformanty His+ boli podrobené selekcii na agarovom prostredí bez histidínu a izoláty jednotlivých klonov boli prenesené na to isté prostredie. DNA genómu bola potom pripravená z radu izolátov His+ a vyhodnotená hybridizáciou metódou Southern blot za použitia rádioaktívne značenej sondy PRB1. Jeden z izolátov, kmeň 1537 s požadovaným prerušením génu PRB1 génom HIS3 (to znamená prbl::HIS3) bol vybraný na nasledujúce rozrušenie génu PEP4. Kmeň 1537 bol pasažovaný na platniach FOA na získanie izolátov ura3 a jeden z týchto izolátov, kmeň 1541 bol vybraný na ďalšie použitie.
Na rozrušenie génu PEP4 u kmeňa 1541 bol rozštiepený vektor pUC13-pep4::URA3 enzýmom Xhol za vzniku lineárnej kazety pep4::URA3 a použitý na transformáciu kmeňa 1541 za využitia octanu lítneho. Transformanty Ura+ boli podrobené selekcii na agarovom prostredí bez uracilu a jednotlivé izoláty boli prenesené na to isté prostredie. DNA genómu bola pripravená z radu transformantov Ura+ a vyhodnotená metódou Southern blot za použitia rádioaktívne značenej sondy pre gén PEP4. Jeden z izolátov, kmeň 1569 s požadovaným prerušením génu PEP4 génom URA3 bol vybraný na ďalšie použitie.
Príklad 9
Konštrukcia vektora na expresiu CRPV L1
Gén CRPV L1 bol amplifikovaný metódou PCR z plazmidu pLAII, obsahujúceho úplný vírusový genóm CRPV (Dr. Peter Howley, MCI) za použitia polymerázy Vent (New England Biolabs, Inc.). Bolo použitých 35 cyklov amplifikácie, vždy 94 ’C 1 minúta, 50 °C 1 minúta a 72 ’C 2 minúty a nasledujúce oligonukleotidové priméry s miestami pôsobenia BglII v okra19 jových častiach (podčiarknuté).
Negatívny primér:
’ -GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC-3’ (reťazec č. 7)
Pozitívny primér:
’ -GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG-3’ (reťazec č. 8) .
Negatívny primér zavádza neprenášanú vedúcu sekvenciu z kvasiniek bezprostredne proti smeru expresie CRPV LI s počiatočným metionínovým kodónom, označeným silnejšími písmenami . PCR produkt LI s 1,6 kb bol rozštiepený enzýmom BglII, čistený na géli a subklonovaný v mieste BglII vektora pSP72 (Promega) za vzniku plazmidu pSP72-CRPV-LI (pl2930-314-4-1).
U jedného zo subklonov bol úplne analyzovaný reťazec a bolo dokázané, že sa štyrmi nukleotidmi líši od zverejnenej sekvencie CRPV LI . Zmeny však nevedú k zmenám v reťazci aminokyselín. Gén LI bol vyštiepený z plazmidu pS72-CRPV-Ll ako fragment BglII a subklonovaný v jedinom mieste BamHI, uloženom medzi promótorom GAL10 z kvasiniek a terminátorom transkripcie ADH1 vo vektore na expresiu v kvasinkách, pCl/1-GALlOp-ADHlt, ktorý obsahuje promótor GAL10 z plazmidu YEp52 podľa Broach a ďalší, Exp. Manipulation of Gene Expresion, 1983, 83:81 až 116 a terminátor transkripcie ADH1 v kostre vektora pCl/1. Výsledný plazmid bol potom označený pl2930-323-6-l.
Príklad 10
Konštrukcia vektora na expresiu CRPV L2
Gén CRPV L2 bol amplifikovaný pomocou PCR za použitia polymerázy Vent (New England Biolabs, Inc) z plazmidu pLAII po jeho rozštiepení enzýmom Sali, fragment so 7,9 kb sa čis20 tí na géli a potom sa fragmenty na seba naviažu. Uskutočňuje sa 35 cyklov PCR, vždy 90 °C 1 minúta, 50 °C 1 minúta a 72 °C 2 minúty za použitia oligonukleotidových primérov s miestami EcoRI v okrajových častiach (podčiarknuté):
Negatívny primér:
5’-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT CAC GAA AAC-3’ (reťazec č. 9)
Pozitívny primér:
5’-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG-3’ (reťazec č. 10).
Negatívny primér zavádza neprenášaný vedúci reťazec z kvasiniek bezprostredne proti smeru expresie CRPV L1 s inicializačným kodónom pre metionín, znázorneným silnejšími písmenami. Produkt PCR s 1,5 kb bol rozštiepený EcoRI, fragmenty boli čistené na géli a subklonované v mieste EcoRI dvojsmerného promotórového vektora pUC18-GALlp-GALlOp s obsahom promótora GAL1/GAL10 z kvasiniek. Tento vektor obsahuje jediné miesto BamHI medzi promótorom GALI a prvou kópiou terminátora transkripcie ADH1 a jediné miesto pôsobenia EcoRI a Smal medzi promótorom GAL10 a druhou kópiou terminátora transkripcie ADH1. Výsledná kazeta na expresiu je nesená fragmentom Sphl s 1,5 kb. Jeden z klonov, pl2930-295 - 2-2, obsahujúci požadovanú uloženú časť L2 v bezprostrednej blízkosti promótora GAL10 sa celkom analyzuje a bolo dokázané, že jeho sekvencia obsahuje šesť zmien v nukleotidoch v porovnaní so známou sekvenciou, pričom štyri z týchto zmien majú za následok zmenu aminokyseliny. Analýza sekvencie pôvodnej matrice DNA potvrdila, že zmeny sú prítomné v pLAII a nevznikajú v priebehu PCR. Vektor pUC18-GALlp-GALlOp s obsahom génu L2 bol rozštiepený Sphl a fragment s 2,9 kb s kazetou na expresiu ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt bol naviazaný na velký fragment Sphl vektora pCl/1 kvasiniek. Výsledný plazmid bol označený P12930-323-2-3, pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2.
Príklad 11
Expresia bielkovín kapsidu CRPV L1 a CRPV L2 v kvasinkách
Plazmid pl2930-323-6-l a pl2930-323-2-3 (pCl/1-GALlOp-CRPV/L1 a pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV/L2) boli použité na transformáciu kmeňov S. cerevisiae 1569, BJ5462 podľa E. V. Jones, Methods in Enzymology, 194, 1991, 428 až 453 a BJ1995 (tiež tam). Izoláty klonov boli pestované pri 30 C na prostredí YEHD s obsahom 2 % galaktózy celkom 48 až 72 hodín. Po izolácii buniek bola usadenina buniek rozrušená sklenenými guľôčkami, bol pridaný Triton X-100 do konečnej koncentrácie 0,5 % a výsledné rozrušené bunky boli vyhodnotené na expresiu CRPV L1 a L2 imunoblotovou analýzou. Vzorky 40 mg celkovej bielkoviny buniek boli podrobené elektroforéze na 12% géli s tris-glycínom (Novex) za redukčných a denaturačných podmienok a potom bol uskutočnený elektroblot na membránach PVDF (Novex). Bielkoviny CRPV L1 a L2 boli dokazované za použitia polyklonálnych králičích antisér proti L1 alebo L2 (dar od Dr. Johna Kreidera, Hershey Medical Center) ako primárnych protilátok a bielkoviny A, viazanej na peroxidázu z chrenu (Amersham, Inc.) ako sekundárnej protilátky. Membrány boli spracované za použitia chemiluminiscenčného balíčka na detekciu ECL^^ (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách s obsahom plazmidu na expresiu L1 bol dokázaný pás pre bielkovinu L1 s molekulovou hmotnosťou 55 000 až 61 000 a pás pre bielkovinu L2 s molekulovou hmotnosťou približne 90 000 bol dokázaný vo všetkých vzorkách klonu kvasiniek s obsahom plazmidu na expresiu L2.
Žiadny signál nebol dokázaný vo vzorkách s plazmidom na expresiu L1 s antisérom proti L2 a obrátene.
Príklad 12
A. Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV L1
Všetky postupy boli uskutočňované pri 4 ’C, ak nie je uvedené inak. Bunkový materiál, skladovaný pri teplote -70 °C bol po roztopení uvedený do suspenzie.v rovnakom objeme pufra pre Ll s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 so 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Do suspenzie boli pridané inhibítory PMSF a Pepstatin A do koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Potom bol bunkový materiál rozrušený 10 prechodmi mikrofluidizačným prístrojom. Lyzát bol vyčerený odstredením 10 minút pri 5000xg. Supernatant bol navrstvený na vrchol vrstvy 45% sacharózy v pufri Ll s výškou 5 cm a potom bol materiál odstredený 4 hodiny pri 100 OOOxg na získanie Ll. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 1/10 objemu pufra Ll a opäť odstredená 10 minút pri 5000xg. K supernatantu bol pridaný Tween-80 do konečnej koncentrácie 0,01 % objemových a supernatant bol podrobený pri teplote miestnosti f.rakcionácii chromatografiou na stĺpci s obsahom 1700 ml (5 cm vnútorný priemer) živice Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Ako elučné činidlo bol použitý 10 mM fosfát sodný s pH 7,2 so 150 mM NaCl a 0,01 % objemovými Tween-80. Frakcie, ktoré podľa metódy imuno-dot blot obsahovali imunoreaktívny materiál, boli spojené a zahustené na 1/6 objemu ultrafiltráciou za použitia komory Amicon a plochej membrány YM-100 s priemerom 76 mm (100 000 MVCO). Produkt bol sterilizovaný filtráciou cez membránu Millex-GV s priemerom otvorov 0,22 mikrometrov (Millipore). Čistená bielkovina kapsidu CRPV Ll bola adsorbovaná na hydroxid hlinitý v koncentrácii 100 mikrogramov/ml.
B. Charakterizácia rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV Ll
Produkt bol identifikovaný metódou Vestern blot a analýzou N-terminálnej sekvencie. Čistota bola overená pomocou SDS/PAGE pri farbení Coomassie a striebrom a za použitia kapilárnej elektroforézy SSCE s optickou detekciou pri 215 nm. Čistota Ll bola 75 % podľa SSCE.
Príklad 13
Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV L2
Všetky postupy boli uskutočňované pri 4 °C, ak nie je uvedené inak. Bunkový materiál, skladovaný pri teplote -70 °C bol po roztopení uvedený do suspenzie v rovnakom objeme pufra pre Ll s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 so 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Do suspenzie boli pridané inhibítory PMSF a Pepstatín A do koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Potom bol bunkový materiál rozrušený 10 prechodmi mikrofluidizačným prístrojom. Lyzát bol vyčerený odstredením 10 minút pri 5000xg. Supernatant bol navrstvený na vrchol vrstvy 45% sacharózy v pufri Ll s výškou 5 cm a potom bol materiál odstredený 4 hodiny pri 100 OOOxg na získanie Ll. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 1/10 objemu pufra Ll a opäť odstredená 10 minút pri 5000xg. K supernatantu bol pridaný Tween-80 do konečnej koncentrácie 0,01 % objemových a supernatant bol podrobený pri teplote miestnosti frakcionácii chromatografiou na stĺpci s obsahom 1700 ml (5 cm vnútorný priemer) živice Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Ako elučné činidlo bol použitý 10 mM fosfát sodný s pH 7,2 so 150 mM NaCl a 0,01 % objemovými Tween-80. Frakcie, ktoré podľa metódy imuno-dot blot obsahovali imunoreaktívny materiál, boli spojené. Spojené frakcie boli potom analyzované pomocou SDS/PAGE pri detekcii striebrom a metódou Vestern blot.
Príklad 14
A. Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV Ll
Bunkový materiál, skladovaný pri teplote -70 “C bol po· roztopení uvedený do suspenzie v rovnakom objeme pufra pre Ll s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 so 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Do suspenzie boli pridané inhibítory PMSF a Pepstatín A do koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Potom bol bunkový materiál rozrušený 10 prechodmi mikrofluidizačným prístrojom. Lyzát bol vycerený odstredením 10 minút pri 5000xg. Supernatant bol navrstvený na vrchol vrstvy 45% sacharózy v pufri Ll s výškou 5 cm a potom bol materiál odstredený 4 hodiny pri 100 OOOxg na získanie Ll. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 1/10 objemu pufra Ll a opäť odstredená 10 minút pri 5000xg. K supernatantu bol pridaný Tween-80 do konečnej koncentrácie 0,01 % objemových a supernatant bol podrobený pri teplote miestnosti frakcionácii chromatografiou na stĺpci s obsahom 1700 ml (5 cm vnútorný priemer) živice Sephacryl-S-1000 (Pharmacia). Ako elučné činidlo bol použitý 10 mM fosfát sodný s pH 7,2 so 150 mM NaCl a 0,01 % objemovými Tween-80. Frakcie, ktoré podľa metódy imuno-dot blot obsahovali imunoreaktívny materiál, boli spojené a zahustené na 1/6 objemu ultrafiltráciou za použitia komory Amicon a plochej membrány YM-100 s priemerom 76 mm (100 000 MVCO). Produkt bol sterilizovaný filtráciou cez membránu Millex-GV s priemerom otvorov 0,22 mikrometrov (Millipore).
B. Charakterizácia rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV Ll
Totožnosť výsledného produktu bola overená metódou Vestern blot a analýzou N-terminálnej sekvencie. Čistota produktu bola overená pomocou SDS/PAGE pri zafarbení Coomassie a striebrom a kapilárnou elektroforézou SSCE s optickou detekciou pri 215 nm. Podľa tejto skúšky bola čistota Ll 75 %. V elektrónovom mikroskope bolo možné pozorovať prípádnosť VLP s priemerom 50 až 55 nm.
C. Analytická HPLC s oddelením látok podľa molekulovej hmotnosti
Pri skúške na VLP boli vzorky podrobené frakcionácii chromatografiou za použitia Perkin-Elmer Šerieš 410 Biopump so vstrekovacím zariadením ISS 100, vybaveným vstrekovacou slučkou s objemom 200 mikrolitrov. Bol použitý stĺpec
TSK-gél G5000PV s rozmerom 7,5 x 600 mm (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA). Na sledovanie elúcie bielkoviny zo stĺpca bola uskutočňovaná optická detekcia pri 280 nm za použitia diódového detektora Perkin-Elmer LC-235. Mobilnou fázou bol roztok 0,5 M NaCl v 10 mM fosfáte sodnom s pH 7,2. Rýchlosť prietoku bola 0,5 ml/min, odoberané frakcie mali objem 1 ml. Kalibrácia stĺpca bola uskutočnená bielkovinovým štandardnom (Sigma) s reklombinantným povrchovým antigénom hepatitídy B (Recombivax, Merck and Co., Vest Point, PA). Detekcia antigénov vo frakciách, získaných elúciou, bola uskutočnená skúškou imunodot blot.
D. Skúška imunodot blot
Vzorka každej frakcie s objemom 10 mikrolitrov bola nanesená na prúžok membrány PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA), ktorý bol vopred zvlhčený a uložený na papier. Vzorka vsiakla do membrány a memuložená do 5 % blokovacieho roztoku v odmlieku, rozpustenom v 0,15 M NaCl s 0,02 0,01 M fosfátu s pH 2 a inkubovaná pri tepza opatreného miešania po dobu najmenej 3 hodiny. Potom bol blokovací roztok odstránený a nahradený roztokom primárnej protilátky.
Primárna protilátka sa menila v závislosti na antigéne, ktorý mal byť preukázaný.
Prítomnosť CRPV Ll bola dokazovaná pomocou králičieho antiséra proti CRPV pre neskorú odpoveď (Biodesign International, Kennebunk, ME). CRPV L2 bola dokazovaná pomocou králičieho antiséra proti CRPV L2. Bielkovina HPV6a Ll bola dokazovaná za použitia monoklonálnej protilátky MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). Bielkovina HPV6a L2 bola dokazovaná za použitia myšacieho séra proti HPV6a L2-trpE.
Vytvorený komplex bol vizualizovaný bežne používanými postupmi za použitia druhej protilátky, konjugovanej s alkalickou fosfatázou a chromogénneho substrátu NBT/BCIP.
zvlhčený blotový brána bola potom tučnenom sušenom % azidu sodíka a lote miestnosti
E. Kapilárna elektroforéza SSCE
Vzorky CRPV VLP, približne 0,2 mg/ml, boli zahrievané 15 minút na 100 °C v 1% 2-merkaptoetanole a 1% SDS. Vzorka bola nanášaná elektrokineticky spolu s referenčným značením, kyselinou melitovou na kapiláru oxidu kremičitého s rozmerom 42 cm (22 cm k detektoru) a vnútorným priestorom 0,05 mm, vopred v rovnovážnom stave s desiatimi objemami vnútorného priestoru 0,1 N NaOH vo vode a sitom ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA). Potom bolo aplikované deliace napätie 300 V/cm za použitia zariadenia Applied Biosystems Model 270A-HT CE. Vymývaná vzorka bola sledovaná absorbanciou pri 215 nm a údaje boli zaznamenávané za použitia softwaru Nelson Turbochrom 3.
F. Príprava vakcíny z rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV L1.
Čistená bielkovina kapsidu CRPV L1 bola absorbovaná na hydroxid hlinitý v koncentrácii 100 mikrogramov/ml.
Príklad 15
Ochrana proti vzniku papilómu, vyvolaného CRPV očkovaním za použitia CLP CRPV L1, odvodených od kvasiniek
Päť bielych králikov (New Zealand Vhite) bolo imunizovaných vnútrosvalovo za použitia buď 135 mg L1 VLP s čistotou 75 % z príkladu 17 po adsorpcii na hydroxid hlinitý (alum) alebo 100 mg rekombinantného povrchového antigénu hepatitídy B s čistotou 99 % po absorpcii na hydroxid hlinitý ako negatívnej kontroly. Kontrolné zvieratá boli preočkované ešte dvakrát v priebehu 8 týždňov a 10 dní po poslednom preočkovaní bola uskutočnená aplikácia CRPV: Sérum bolo odobraté pred imunizáciou, pri každom preočkovaní a pred podaním antigénu a bolo analyzované metódou ELISA, špecifickou pre Ll-VLP. Nepriama skúška ELISA bola použitá na stanovenie
- 27 protilátok v séri ako odpoveď na CRPV L1 VLP po expresii v kvasinkách. Použitými antigénmi pri skúške ELISA boli CRPV L1 VLP po expresii v bunkách hmyzu s rekombinantným baculovírusom v podstate podľa publikácie Christensen a ďalší, J. Virol., 64:3151 až 3156, 1990 a J, Gen. Virol., 75:2271 až 2276, 1994. Ako druhá protilátka bola použitá kozia protilátka proti králičej IgG-alkalickej fosfatáze a ako substrát bol použitý p-nitrofenylfosfát (Kirkegaard a Perry Labs., Inc.). Absorbancia bola meraná pri 405 nm. Titer bol stanovený riedením (vždy trojnásobné riedenie séra, vychádza sa z hodnoty 1:100) a považuje sa za pozitívny v prípade, že absorbancia, špecifická pre L1 prevýši priemernú absorbanciu pre králičie sérum pred imunizáciou plus dvojnásobok štandardnej odchýlky. Z týchto údajov boli vypočítané presné titre za použitia programu SOFTmax verzia 2.3 (Molecular Devices Inc., Menlo Park, CA).
Titre protilátok proti L1 VLP bolo možné dokázať 4 týždne po prvej imunizácii a zvyšovali sa pri každom ďalšom preočkovaní. Kontrolné zvieratá nevytvorili žiadne protilátky. Šesť týždňov po aplikácii CRPV boli očkované zvieratá zbavené bradavíc v 15 z 15 miest, vystavených pôsobeniu vírusu (riedený zásobný vírus 1:2 alebo 1:12), zatiaľ čo kontrolné zvieratá mali bradavice na dvanástich z pätnástich miest pri riedení vírusu 1:2 alebo na deviatich z pätnástich pri riedení vírusu 1:12. Po 15 týždňoch sa u očkovaných zvierat stále ešte nevytvorili žiadne bradavice.
Skúšky na neutralizáciu vírusu boli uskutočnené v podstate podľa publikácie Christensen ďalší, 1991, Virology, 181, 572 až 579, zmiešaním králičieho séra s CRPV a takto spracovaný CRPV bol potom aplikovaný králikom. Štandardom na stanovenie neutralizačných protilátok bol úplná neutralizácia vírusu, to znamená, že na troch miestach z troch miest aplikácie sa nevytvorili bradavice. Okrem toho boli analyzované séra piatich očkovaných zvierat a piatich kontrolných zvierat. Séra, odobraté po jednej dávke CRPV L1 VLP obsahovali protilátky, ktoré úplne neutralizovali neriedený vírus u 80 % králikov, to znamená u 4 z 5 zvierat. Po dvoch alebo
- 28 troch dávkach už vytvorilo 100 % zvierat, päť králikov z piatich, protilátky, neutralizujúce vírus. U kontrolných sér nebolo možné pozorovať žiadny neutralizačný účinok na vírus. V závislosti na konečnom titre sér očkovaných zvierat bolo možné tieto séra zriediť 10 až lOOOx pri zachovaní schopnosti neutralizovať vírus na 100 %.
Aby bolo možné zistiť, či neutralizačné protilátky boli špecifické pre natívny CRPV L1 VLP, bolo zvolené jedno imúnne sérum a toto sérum bolo inkubované so štvorcovými úsekmi nitrocelulózy, vybavenej povlakom natívneho alebo denaturovaného CRPV L1 VLP, odvodeného od kvasiniek. Nitrocelulózové štvorce s plochou 1 cm boli poťahované natívnym alebo denaturovaným (redukcia a alkylácia kyselinou jódoctovou v 8 M močovine) CRPV L1 VLP po expresii v kvasinkách. Ako kontroly boli použité natívne alebo denaturované extrakty z kvasníc. Imunné králičie sérum bolo sériovo inkubované štyrikrát s nitrocelulózovými štvorcami po dobu 8 až 14 hodín pri teplote 4 °C a potom bola uskutočnená skúška na neutralizáciu vírusu vyššie uvedeným spôsobom. Len natívny CRPV L1 VLP je schopný absorbovať protilátky, zodpovedné za neutralizáciu CRPV, zatiaľ čo denaturované alebo kontrolné bielkoviny z kvasiniek tieto protilátky neadsorbujú. Okrem toho natívny CRPV L1 VLP tiež ruší reaktivitu skúšky ELISA na CRPV L1 VLP po jeho expresii v bunkách hmyzu (údaje nie sú uvedené).
Príklad 16
Konštrukcie vektora pre súčasnú expresiu CRPV L1/L2 za použitia jediného plazmidu
Plazmid pSP72-CRPV-L1, pl2930-314-4-l bol rozštiepený enzýmom BglII a fragment s 1,5 kbp, nesúci CRPV L1 ORF s 5’-neprenášaným vedúcim reťazcom z kvasiniek bol čistený na géli. Plazmid pl2930-323-2-3, pCl/l-GALlp-GAL10p-CRPV-L2, bol rozštiepený enzýmom BamHI, ktorý štiepi medzi promótorom GALI a terminátorom transkripcie ADH1. Lineárny fragment vektora bol čistený na géli a potom naviazaný na vyššie uvedený fragment CRPV-L1 BglII za vzniku plazmidu pl2930-366-l-2, pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2. Tento výsledný plazmid obsahuje CRPV-L1 ORF pod riadením promótora GALI a CRPV-L2 ORF pod riadením promótora GAL10.
Príklad 17
Konštrukcia vektora na súčasnú expresiu CRPV L1/L2 z dvoch plazmidov
Vektor pUSl8-GALlp-GALlOp s obsahom génu L2 bol rozštiepený pomocou Sphl a fragment s 2,9 kb s obsahom ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt vo forme kazety na expresiu bol čistený na géli a zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou. Vektor z kvasiniek YEp24 podľa Borstein a ďalší, Gene, 8:17, 1979, bol rozštiepený enzýmom BamHI, zakončenia boli vyplnené T4 DNA polymerázou a po defosforylácii alkalickou fosfatázou z teľacieho čreva bol fragment naviazaný na vyššie uvedenú kazetu na expresiu L2 s vyplnenými koncami za vzniku plazmidu pl594.
Príklad 18
Súčasná expresia L1 a L2 v kvasinkách
Plazmid pl2930-366-l-2, pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2, bol použitý na transformáciu kmeňov S. cerevisiae 1569 a BJ5462 za použitia systému s jedným plazmidom a výsledné transformanty boli podrobené selekcii na syntetickom agarovom prostredí s nedostatkom leucínu. V paralelnom pokuse bol kmeň 1569 transformovaný súčasne vektorom na expresiu pCl/1-GALlOp-CRPV-L1, pl2930-323-6-l a okrem toho vektorom na expresiu YEp24-GAL10p-L2, pl594 v systéme za použitia dvoch plazmidov a výsledné transformanty s obsahom oboch vektorov boli podrobené selekcii na syntetickom agarovom prostredí bez leucínu a bez uracilu. Izoláty klonov v oboch uvedených systémoch boli pestované pri teplote 30 °C na komplexnom prostredí YEHD s obsahom 2 % galaktózy po dobu 48 až 72 hodín. Po izolácii buniek boli usadeniny buniek rozrušené sklenenými guľôčkami. Potom bol pridaný Triton X-100 do konečnej koncentrácie 0,5 % a materiál bol analyzovaný po expresii CRPV Ll a L2 imunoblotovou analýzou. Vzorky s obsahom 50 mikrogramov celkovej bunkovej bielkoviny boli podrobené elektroforéze na géli s gradientom tris-glycínu 8 až 16 % (Novex) za redukčných a denaturačných podmienok a potom bol uskutočnený elektroblot na membránach PVDF (Novex). Bielkoviny CRPV Ll a L2 boli dokazované za použitia polyklonálnych králičích antisér proti Ll a L2 (dar Dr. Johna Kreidera, Hershey Medical Center) ako primárnymi protilátkami a bielkovinou A, viazanou na peroxidázu z chrenu (Amersham, Inc.), ako sekundárnou protilátkou. Membrány boli spracované za použitia chemiluminiscenčného detekčného balíčka ECL (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorcoch s obsahom plazmidu na expresiu Ll + L2 bolo možné dokázať pás bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 55 000 až 61 000 a pás bielkoviny L2 s molekulovou hmotnosťou približne 90 000. Žiadny signál pre L2 nebolo možné pozorovať vo vzorkách, odvodených od klonov kvasiniek, obsahujúcich plazmid na expresiu Ll. Žiadny signál pre Ll tiež nebolo možné pozorovať vo vzorkách z buniek, ktoré obsahovali len vektor na expresiu L2.
Príklad 19
Čistenie CRPV Ll á CRPV Ll + L2 VLP analýzou EM
Bielkoviny CRPV Ll a CRPV Ll + L2 po expresii z kvasiniek boli čiastočne čistené a koncentrované na analýzu v elektrónovom mikroskope, EM. Jeden liter až 1,5 litrov prostredia YEHD s obsahom 2 % galaktózy bolo naočkovaných vektorom na expresiu Ll + L2, pl2930-366-l-2, pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll a L2 a kvasinky boli pestované pri teplote 30 °C po dobu 48 až 72 hodín. V paralelnom pokuse boli podobným spôsobom pestované bunky kmeňa 1569, súčasne transformované vektorom na expresiu GALlOp-CRPV-L1, pl2930-323-6-l a okrem toho vektorom YEp24-GAL10p-L2, plazmidom pl594. Bunky boli izolované a usadeniny buniek boli zmrazené na -70 °C. Všetky nasledujúce stupne boli uskutočňované pri teplote 4 ’C. Usadeniny buniek boli po roztopení uvedené do suspenzie v rovnakom objeme pufra L1, ktorý obsahoval 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 so 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzii boli pridané inhibítory bielkovín PMSF a Pepstatín A v konečnej koncentrácii 2 mM a 1,7 mikroM. Bunky boli rozrušené 3 až 5 prechodmi mikrofluidizačným prístrojom. Materiál bol odstredený 10 minút pri 5000xg. Supernatant bol navrstvený na vrstvu 45% sacharózy v pufri L1 a výškou 5 cm a bielkovina L1, L2 alebo L1 + L2 boli usadené odstredením 4 hodiny pri 100 OOOxg. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 1/10 objemu pufra L1. Suspenzia bola potom znova odstredená celkom 10 minút pri 5000xg.
Pre analýzu EM (Structure Próbe, Vest Chester, PA), bol podiel každej vzorky uložený na medenú mriežku s uhlíkovým povlakom s priemerom otvorov 200 mesh. Na mriežku bola na 20 sekúnd uložená kvapka 2% roztoku kyseliny fosfowolfrámovej , PTA, s pH 7,0. Potom boli mriežky vysušené na vzduchu pred skúškou TEM. Všetky mikroskopické pozorovania boli uskutočňované za použitia elektrónového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) pri urýchľovacom napätí 100 kV. Získané mikrofotografie mali konečné zväčšenie 100 OOOx.
Vo všetkých vzorkách kvasiniek s uloženým plazmidom na expresiu CRPV L1 alebo plazmidmi na súčasnú expresiu CRPV L1 a L2, bolo možné pozorovať VLP s priemerom 50 až 55 nm. U kontrolných vzoriek kvasiniek alebo u kvasiniek s obsahom plazmidu na expresiu L2 nebolo možné VLP pozorovať, ako je zrejmé z obr. 7, 8 a 9.
Príklad 20
Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu CRPV L1, schéma 2
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 ’C, ak nie je uvedené inak.
Bunkový materiál, uložený pri -70 “C sa po roztopení suspenduje v rovnakom objeme pufra pre narušenie buniek, ktorý obsahuje 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzii sa pridajú inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Potom sa bunkový materiál rozruší za použitia systému BioNeb Call Disruptor (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lyzát sa vyčerí odstredením 10 minút pri 5000xg.
Supernatant sa navrství na vrstvu 45% sacharózy v pufri Ll s výškou 5 cm a bielkovina Ll sa usadí odstredením 4 hodiny pri 100 OOOxg. Usadenina sa uvedie znova do suspenzie v 1/10 objemov pufra Ll. Suspenzia sa opäť vyčerí odstredením 10 minút pri 5000xg.
Supernatant sa zriedi PBS v pomere 1:5 a zmes sa znova odstredí za použitia rotora Sorvall SA-600 pri 6500 otáčkach/minútu 10 minút pri teplote 4 ’C. Supernatant sa prefiltruje cez filter s priemerom otvorov 0,22 mikrometrov a frakcionuje sa chromatografiou na anionomeniči.
Chromatografia na anionomeniči sa uskutočňuje za použitia vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie na zariadení Perkin-Elmer Šerieš 410 Biopump so vstrekovacou slučkou s objemom 5 ml. Ako prostredie pre chromatografiu sa využije živica Fractogel EMF TMAE-650 (S) s priemerom častíc 25 až 40 mikrometrov (EM Separations, Gibbstown, NJ), použije sa sklenený stĺpec s výškou 150 mm a vnútorným priemerom 10 mm. Vymývanie bielkoviny zo stĺpca sa sleduje optickou detekciou pri 280 nm a zariadením Perkin-Elmer LC-235 s diódovým detektorom. Stĺpec sa vopred uvedie do rovnovážneho stavu s 0,15 M NaCl v 0,01 M pufri s fosfátom sodným s pH 7,2 (pufer A). Rýchlosť prietoku je 0,75 ml/min. Vzorka sa nanesie na stĺpec a stĺpec sa premýva pufrom A na odstránenie nenaviazaného materiálu. Viazaný materiál sa potom vymýva za použitia lineárneho koncentračného gradientu chloridu sodného v rozmedzí 0,15 až 0,65 M celkom 5 minút a potom v rozmedzí 0,65 až 1,15 M po dobu 30 minút. Antigén v odobratých frakciách sa dokazuje skúškou imunodot blot. Frakcie, ktoré obsahujú imunoreaktívny materiál a vymývajú sa v rozmedzí 0,81 a 1,05 M NaCl sa spoja.
Spojené frakcie sa zahustia za použitia zariadenia Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) až na 1/5 pôvodného objemu.
Koncentrát sa podrobí frakcionácii chromatografiou za použitia živice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na stĺpci s výškou 87 cm a vnútorným priemerom 27 mm. Rýchlosť prietoku je 2,5 ml/min. Elúcia bielkoviny sa sleduje pri 280 nm, prítomnosť antigénu sa dokazuje imunoblotovou skúškou.
Frakcie s obsahom imunoreaktívneho materiálu sa spoja a zahustia ultrafiltráciou za miešania v komore (Amicon, Inc., Beverly, MA) s membránou s priemerom 43 mm, YM-100 (Amicon, Inc. , Beverly, MA) pod dusíkom pri tlaku 0,07 MPa.
Výsledný produkt sa charakterizuje pomocou SDS/PAGE pri farbení Coomassie a kapilárnou elektroforézou SSCE. Výsledný produkt, získaný podľa schémy 2 mal čistotu 88 % podľa výsledku SSCE.
Príklad 21
Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu CRPV L1 - schéma 3
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 °C, ak nie je uvedené inak.
Bunkový materiál, uložený pri -70 °C sa po roztopení suspenduje v rovnakom objeme pufra pre narušenie buniek, ktorý obsahuje 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. K suspenzii sa pridajú inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Potom sa bunkový materiál rozruší za použitia systému BioNeb Call Disruptor (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lyzát sa vycerí odstredením 10 minút pri 5000xg.
Supernatant sa navrství na vrstvu 45% sacharózy v pufri
- 34 L1 s výškou 5 cm a bielkovina L1 sa usadí odstredením 4 hodiny pri 100 OOOxg. Usadenina sa uvedie znova do suspenzie v 1/10 objemov pufra L1. Suspenzia sa opäť vycerí odstredením 10 minút pri 5000xg.
Supernatant sa extrahuje jednou polovicou svojho objemu chloroformu. Vodná vrstva sa oddelí a vycerí odstredením pri 12 000 otáčkach/minútu na mikroodstredivke Beckman celkom 5 minút pri teplote miestnosti.
Supernatant sa zriedi v PBS v pomere 1:5 a zmes sa znova odstredí za použitia rotora Sorvall SA-600 pri 6500 otáčkach/minútu 10 minút pri teplote 4 ’C. Supernatant sa prefiltruje cez filter s priemerom otvorov 0,22 mikrometrov a frakcionuje sa chromatografiou na anionomeniči.
Chromatografia na anionomeniči sa uskutočňuje za použitia vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie na zariadení Perkin-Elmer Šerieš 410 Biopump so vstrekovacou slučkou s objemom 5 ml. Ako prostredie pre chromatografiu sa využije živica Fractogel EMF TMAE-650 (S) s priemerom častíc 25 až 40 mikrometrov (EM Separations, Gibbstown, NJ), použije sa sklenený stĺpec s výškou 150 mm a vnútorným priemerom 10 mm. Vymývanie bielkoviny zo stĺpca sa sleduje optickou detekciou pri 280 nm a zariadením Perkin-Elmer LC-235 s diódovým detektorom. Stĺpec sa vopred uvedie do rovnovážneho stavu s 0,15 M NaCl v 0,01 M pufri s fosfátom sodným s pH 7,2 (pufer A). Rýchlosť prietoku je 0,75 ml/min. Vzorka sa nanesie na stĺpec a stĺpec sa premýva pufrom A na odstránenie nenaviazaného materiálu. Viazaný materiál sa potom vymýva za použitia lineárneho koncentračného gradientu chloridu sodného v rozmedzí 0,15 až 0,65 M celkom 5 minút a potom v rozmedzí 0,65 až 1,15 M po dobu 30 minút. Antigén v odobratých frakciách sa dokazuje skúškou imunodot blot. Frakcie, ktoré obsahujú imunoreaktívny materiál a vymývajú sa v rozmedzí 0,81 a 1,05 M NaC'l sa spoja.
Spojené frakcie sa zahustia za použitia zariadenia Macrosep (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) až na 1/5 pôvodného objemu.
Koncentrát sa podrobí frakcionácii chromatografiou za použitia živice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na stĺpci s výškou 87 cm a vnútorným priemerom 27 mm. Rýchlosť prietoku je 2,5 ml/min. Elúcia bielkoviny sa sleduje pri 280 nm, prítomnosť antigénu sa dokazuje imunoblotovou skúškou.
Frakcie s obsahom imunoreaktívneho materiálu sa spoja a zahustia ultrafiltráciou za miešania v komore (Amicon, Inc., Beverly, MA) s membránou s priemerom 43 mm, YM-100 (Amicon, Inc., Beverly, MA) pod dusíkom pri tlaku 0,07 MPa.
Výsledný produkt sa charakterizuje pomocou SDS/PAGE pri farbení Coomassie a kapilárnou elektroforézou SSCE. Výsledný produkt, získaný podľa schémy 3 mal čistotu 95 % podľa výsledku SSCE.
Príklad 22
Expresia CRPV L1 a HPV typ 6 a L1 (kmeň 1644) v komplexnom obohatenom chemicky definovanom prostredí
Očkovací materiál týchto kmeňov bol vypestovaný na syntetickom prostredí bez leucínu, tak ako bolo opísané vyššie. Trepacie fľaše boli vybavené lopatkami pre väčšie prevzdušnenie (70 ml kvapaliny na fľašu s objemom 300 ml, Tunair Labware) a prostredie bolo doplnené približne 0,5 ml/1 protipenivého prostriedku UCON LB-625, Union Carbide). Obohatené komplexné prostredie obsahovalo v 1 litri: 40 g extraktu z kvasníc Difco, 20 g peptónu HySoy, Sheffield, 30 g glukózy a 50 g galaktózy, pred sterilizáciou sa pH prostredia upraví na hodnotu 5,3. Chemicky definované prostredie bolo podobné prostredie, ako bolo opísané v publikácii Oura, Biotechnol. Bioengineer., 16, 1197 až 1212, 1974, bolo však doplnené na 1 liter nasledujúcimi zložkami: 0,1 g cholínchloridu, 0,4 g adenínu, 30 g glutamátu sodného ako zdroja dusíka, 0,2 g uracilu, 20 g glukózy, 40 g galaktózy, Fľaše boli naočkované 3 ml očkovacieho materiálu a inkubované 66 hodín pri 28 °C a pri 250 otáčkach/minútu na rotačnej trepačke. Z fliaš boli v určitých časových intervaloch odobraté vzorky
- 36 na overenie expresie metódou imunoblot za použitia antísér proti CRPV Ll a proti HPV 6a L1.
Príklad 23
Klonovanie genómu GPV-6a
Tkanivo chorého so závažným výskytom condylomata accuminata (Dr. Darron Brown, Indiana University Shool of Medicíne), boli analyzované reštrikčnými enzýmami a pomocou PCR a bolo dokázané, že obsahuje HPV typu 6a. Zo vzorky tkaniva bola extrahovaná DNA a rozštiepená enzýmom HindlII. Potom bol materiál frakcionovaný na 0,8% agarózovom géli s nízkou teplotou topenia, z preparatívneho gélu bola vyrezaná oblasť, zodpovedajúca 8 kb a agaróza bola spracovaná enzýmom Gelase^ (Epicentre Technologies, Inc.). Vzorka bola naviazaná na plazmid pUC18, vopred rozštiepený HindlII a defosforylovaný (Pharmacia, Inc.). Po transformácii príslušných buniek E. coli DH5 (BRL), bola plazmidová banka vyšetrená na prítomnosť HPV-6a-pozitívnych klonov za použitia p-značeného oligodeoxynukleotidu, komplementárneho ku génu HPV-6a Ll. Plazmid pUCl8 s obsahom genómu HPV-6a s 8 kb bol izolovaný a charakterizovaný pôsobením reštrikčných enzýmov a analýzou Southern blot. Vzniknutý plazmid bol označený pUCl8-HPV-6a. Bola uskutočnená analýza sekvencie úplného genómu HPV-6a s 8 kb za použitia automatického analyzátora ABI (373A) podľa pokynov výrobcu.
Veľký exemplár condyloma accuminatum bol získaný od 25 ročnej ženy po pôrode. Fragment tohto exemplára bol zmrazený v kvapalnom dusíku a potom spracovaný pri zväčšení pomocou prístroja Braun Mikrodismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, SRN). Výsledný materiál bol solubilizovaný pôsobením 0,6% dodecylsu'lf átu sodného SDS, spracovaný proteinázou K 50 mikrogramov/ml a extrahovaný zmesou fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu. DNA bola vyzrážaná etanolom a jej množstvo bolo stanovené spektrofotometricky v UV-žiarení. Prítomnosť DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou bola dokáza37 ná elektroforézou na agarózovom géli s následným farbením etidiumbromidom.
DNA typu HPV bola určená za požitia tvorby hybridu za použitia skúšobného balíčka Vira Type Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD) . Použité sondy HPV boli rozdelené do dvoch skupín v závislosti na vzťahu určitého typu k zhubným afekciám pohlavných orgánov. Skupina A obsahovala typy s nízkym rizikom, HPV6, 11, 42, 43 a 44, zatiaľ čo skupina B obsahovala typy s vysokým rizikom 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 a 56. Celková DNA bola rozštiepená enzýmami PstI, BamHI a HindlII a metóda Southern blot bola uskutočňovaná za veľmi obmedzujúcich podmienok (T -15 °C), aby bolo možné stanoviť podtyp HPV.
Aby bolo možné určiť úplnú sekvenciu HPV 6a, boli syntetizované priméry na analýzu na báze zverejnenej sekvencie HPV6b. Oba reťazce úplného genómu HPV6a s 8,1 kbp boli analyzované dideoxyterminačným postupom za použitia skúšobného balíčka PRISM a automatického analyzátora (373A) podľa pokynov výrobcu (Applied Biosystems, ABI, Inc., Foster City, CA). V prípade, že negatívne a pozitívne sekvencie si nezodpovedali, boli syntetizované ďalšie špecifické priméry pre HPV6a tak, aby bolo možné uskutočniť opakovanú analýzu uvedenej oblasti v oboch smeroch a dosiahnuť úspech.
Sekvencie DNA pre HPV6a a HPV6b sú totožné z 97 %, u celkom 8010 bp bolo možné dokázať celkom 229 zmien v pároch báz: Najvýznamnejšie rozdiely v porovnaní so sekvenciou HPV6b bolo možné dokázať v dlhej riadiacej oblasti (LRC, nt 7205 až nt 106). Okrem niekoľkých zmien, týkajúcich sa jednotlivých nukleotidov (nt) v oblasti HPV6a LCR, bolo možné dokázať uloženie úsekov s 94 bp pri nt 7350 a ďalšieho úseku s veľkosťou 19 bp pri nt 7804. Pri nt 7615 je v genóme HPV6a vypustených šesť párov báz.
Príklad 24
Konštrukcia vektora na expresiu HPVóa LI v kvasinkách
DNA HPV typu 6a bola uložená ako matrica pre PCR. Gén HPB6a L1 bol amplifikovaný pomocou PCR za použitia polymerázy Vent (New England Biolabs., Inc.), bolo uskutočnených 35 cyklov amplifikácie, vždy 94 °C 1 minúta, 48 °C 1 minúta a 72 °C 1 minúta 45 sekúnd, použité boli nasledujúce oligodeoxynukleotidové priméry, obsahujúce miesta BglII na zakončení (podčiarknuté):
Negatívny primér:
’-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3’ (reťazec č. 11)
Pozitívny primér:
5’-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3’ (reťazec č. 12) strane kópiou terminátora (Bennetzen J. L. a Halí
Negatívny primér zavádza neprenášanú vedúcu sekvenciu z kvasiniek bezprostredne proti smeru expresie iniciačného kodónu pre metionín v sekvencii' HPV6a L1 (tučné písmo). Produkt PCR L1 s 1,5 kbp sa rozštiepi BglII a čistí na géli. Vektor na expresiu pCl/l-GAL sa skonštruuje tak, že sa izoluje fragment Sphl s 1,4 kbp z dvojsmerného promotórového vektora pUC18-GALlp-GAL10p, obsahujúceho divergentný promótor GAL1/GAL10 z plazmidu pBM272 (Dr. Mark Johnston, Vashington University, St. Louis), ohraničený na každej transkripcie ADH1 z kvasiniek B. D., 1982, J. Biol. Chem.,
257:3018 až 3025. V každej výslednej kazete na expresiu je miesto BamHI uložené medzi promótorom GALI a prvou kópiou terminátora transkripcie ADH1 a miesto Smal na klonovanie je uložené medzi divergentným promótorom GAL10 a druhou kópiou terminátora transkripcie ADH1. Vektor pCl/1 z kvasiniek (Rosenberg a ďalší, Náture 312, 1984, 77 až 80) sa rozštiepi Sphl a naviaže na fragment promótora Sphl GAL s 1,4 kbp. Výsledný vektor pCl/l-GAL sa linearizuje pôsobením BamHI, ktorý štiepi medzi promótorom GALI a terminátorom transkripcie ADH1. Vektor pCl/l-GAL, rozštiepený BamHI a fragment PCR
HPV6a Ll, rozštiepený BglII sa navzájom naviaže a materiál sa použije na transformáciu buniek E. coli DH5 (BRL). Plazmid pCl/l-GAL sa izoluje. Tento plazmid obsahuje gén HPV-6a Ll a bol označený pl3173-357-6. Bola uskutočnená analýza génu pre Ll v tomto plazmide pomocou zariadenia ABI Sequencer (373A) a bolo dokázané, že táto sekvencia je totožná so sekvenciou génu pre Ll v plazmide pUC18-HPV6a príslušného klonu.
Príklad 25
Konštrukcia vektora na expresiu HPV6a Ll a L2 v kvasinkách
Plazmid pl3173-357-6, pCl/l-GAL+HPV6a Ll sa rozštiepi enzýmom Smal, ktorý štiepi medzi promótorom GAL10 a terminátorom transkripcie ADH1. Gén HPV6a L2 s 1,4 kbp sa amplifikuje pomocou PCR za použitia DNA plazmidu pUC18-HPV6a ako matrice. Ďalej sa použije polymeráza Vent (New England Biolabs, Inc.) a uskutočňuje sa desať cyklov PCR-amplifikácie vždy 94 ’C 1 minúta, 48 “C 1 minúta a 72 ’C 1 minúta 45 sekúnd, súčasne sa použijú nasledujúce oligodeoxynukleotidové priméry, ktoré obsahujú miesta pôsobenia Smal (podčiarknuté) :
Negatívny primér:
5’-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC-3’ (reťazec č. 13)
Pozitívny primér:
’-TCC CCC GGG GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG-3’ (reťazec č. 14).
Negatívny primér zavádza neprenášanú vedúcu sekvenciu z kvasiniek bezprostredne proti smeru expresie od inicializačného kodónu pre metionín HPV6a L2, ako je naznačené silnými písmenami. PCR-fragment sa rozštiepi Smal, čistí na géli a naviaže na plazmid pl3173-357-6, taktiež rozštiepený
Smal. Plazmid pCl/l-GAL, ktorý obsahuje oba gény pre HPV6a L1 a L2 sa izoluje a bol označený pl4049-7-2. Gén L2 bol analyzovaný automatickým zariadením (ABI Sequencer 373A) a bolo dokázané, že je totožný s génom pre L2 v klone plazmidu pUC18-HPV6a.
Príklad 26
Expresia HPV6a L1 a súčasná expresia HPV6a L1 a L2 v kvasiniek
Plazmidy pl3173-357-6 (pCl/1-GAL+HPV6a Ll) a p-14049-7-2, pCl/l-GAL+HPV6a Ll a L2 sa použijú na transformáciu kmeňov S. cerevisiae 1569 (MATa, leu2-04, prbl, adel, pep4, cir°) a 1558 (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, cir°). Výsledná rekombinantné kmene, získané za použitia hostiteľského kmeňa 1558 boli kmene 1644 (HPV6a Ll) a 1670 (HPV6a Ll + L2), ako je uvedené v tabuľke I (Obr. 10). Izoláty klonov boli pestované pri 30 °C na prostredí YEHD s obsahom 2 % galaktózy celkom 68 až 78 hodín. Po izolácii buniek boli usadeniny buniek rozrušené sklenenými guľôčkami a materiál bol analyzovaný metódou imunoblot na expresiu bielkoviny HPV6a Ll alebo HPV6a L2. Vzorky, obsahujúce 40 mikrogramov celkovej bunkovej bielkoviny boli podrobené elektroforéze na 10% tris-glycínovom géli za redukčných a denaturačných podmienok a potom bol uskutočnený elektroblot na nitrocelulózové filtre. Bielkovina Ll bola dokazovaná za použitia králičieho antiséra proti zloženej bielkovine trpE-HPVll podľa Brown D. R. a ďalší, Virology, 301:46 až 54, ako primárne protilátky a úplné protilátky osla proti králičiemu IgG, viazanému na peroxidázu z chrenu, HRP (Amersham, Inc.) ako sekundárne protilátky. Filtre boli spracované chemiluminiscenciou pri použití detekčného balíčka ECL (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách bol dokázaný pás pre bielkovinu Ll s molekulovou hmotnosťou 50 000 až 55 000 s výnimkou negatívnej kontroly, ktorou bol plazmid pCl/1 bez génu Ll alebo L2.
Bielkovina L2 bola dokázaná ako pás pre bielkovinu
4ί s molekulovou hmotnosťou 70 000 pri analýze Vestern blot za použitia 1:250 riedení myšacieho séra, získaného trojitou imunizáciou zloženou bielkovinou trpE-HPV6a L2, získanou podľa Carter a ďalších, ako primárnej protilátky s ovčej protilátky proti myšaciemu IgG, viazanému na HRP (Amersham, Inc.) ako sekundárnej protilátky pri riedení 1:1000.
Pre analýzu EM (Structure Próbe, Vest Chester, PA) bol uložený podiel každej' vzorky na medenú mriežku s priemerom otvorov 20 mesh, vybavenú uhlíkovým povlakom. Na mriežku bola na 20 sekúnd uložená kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej PTA s pH 7,0. Potom bola mriežka usušená na vzduchu pred analýzou TEM. Všetky mikroskopické pozorovania boli uskutočnené za použitia elektrónového mikroskopu JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) pri urýchľujúcom napätí 100 kV. Výsledné mikrofotografie mali zväčšenie 100 OOOx.
Bolo možné pozorovať VLP s priemerom 50 až 55 nm vo všetkých vzorkách z kvasiniek, v ktorých bol uložený plazmid pre HPV6a Ll alebo pre súčasnú expresiu HPV6a Ll a L2. V kontrolných vzorkách kvasiniek nebolo možné VLP pozorovať.
Príklad 27
Pestovanie kmeňa 1670 pre HPV6a Ll + L2
Povrchová kultúra kmeňa 1670 prenesie do kvapalného prostredia, zbaveného leucínu, ktoré obsahuje na 1 liter: 8,5 g dusíkatých báz z kvasiniek Difco bez aminokyselín a síranu amónneho, 0,2 g adenínu, 0,2 h uracilu, 10 g kyseliny jantárovej, 5 g síranu amónneho a 0,25 g L-tyrozínu. Toto prostredie sa pred sterilizáciou upraví hydroxidom sodným na pH 5,0 až 5,3. Organizmus sa nechá rásť 25 hodín pri 28 °C za pretrepávania 250 otáčok/minútu na rotačnej trepačke, potom sa pridá sterilný glycerol do konečnej koncentrácie 17 g na 100 ml a potom sa kultúra skladuje pri teplote -70 °C po podieloch 1 ml. Očkovací materiál na fermentáciu kmeňa 1670 sa vytvorí v tom istom prostredí, ktorého sa použije 500 ml vo fľaši s objemom 2 litre, postupuje sa tak, že
- 42 sa do fľaše pridajú obsahy dvoch zmrazených podielov kultúry a fľaša sa inkubuje 25 hodín na rotačnej trepačke pri 250 otáčkach/minútu pri teplote 28 °C. K fermentácii väčšieho množstva kmeňa 1670 sa použije fermentor New Brunswick SF-116 s pracovným objemom 10 litrov po naočkovaní. Produkčné prostredie obsahuje na 1 liter: 20 g extraktu z kvasiniek Difco, 10 g peptónu HySoy Sheffield, 20 g glukózy a 20 g galaktózy, prostredie sa pred sterilizáciou upraví na pH 5,3. Potom sa do fermentora prenesie celý obsah 500 ml vyššie uvedenej kultúry vo fľaši s objemom 2 litre a produkčná kultúra sa inkubuje pri teplote 28 °C pri prevzdušnení 5 litrov vzduchu za minútu, pri 400 otáčkach/minútu a pri tlaku 0,025 MPa. Miešanie je možné zintenzívniť tak, aby úroveň rozpusteného kyslíka bola udržovaná na hodnote vyššej než 40 % nasýtenia. Postup fermentácie je možné sledovať meraním obsahu glukózy (Beckman Glucose 2 Analyser) a hmotnostnou spektrometriou (Perkin-Elmer 1200). Po 69 hodinách inkubácie bolo dosiahnutých 9,9 g sušiny buniek na 1 liter. Kultúra bola zahustená filtráciou za použitia dutých vláken (náplň Amicon H5MPO1-43 vo filtračnom systéme Amicon DC-10) na objem približne 2 litre a potom bola uskutočnená diafiltrácia proti fyziologickému roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom (2 litre) a potom bol materiál zahustený na približne 1 liter a potom rozdelený do fliaš pre odstredivky s objemom 500 ml. Usadenina buniek sa získa odstredením pri 8000 otáčkach/minútu (rotor Sorval GS3) 20 minút pri teplote 4 °C. Po zliatí supernatantu sa získa celkom 225 g vlhkých buniek a tento materiál sa uloží až do použitia pri teplote -70 °C.
Príklad 28
Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu HPV6a Ll + L2
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 C, ak nie je uvedené inak.
Bunky kmeňa 1670 boli uložené v zmrazenom stave pri
-70 °C. 38,0 g zmrazených buniek bolo po roztopení pri 20 až 23 “C uvedených do suspenzie v 50 ml pufra L1 s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Potom boli pridané inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Bunková suspenzia bola rozrušená pri tlaku 56 MPa pri trojnásobnom prechode mikrofluidizačným zariadením M110 (Microfluidícs Corp., Newton, MA). Suspenzia rozrušených buniek bola odstredená 10 minút pri 5000xg na odstránenie bunkovej drviny. Potom bol oddelený supernatant, obsahujúci antigén L1 + L2.
Supernatant bol zriedený v pomere 1:5 pridaním pufra A (20 mM MOPS s pH 7,0) a nanesený na stĺpec aniomomeniča s výškou 4 cm a vnútorným priemerom 5 cm s náplňou živice Fractogel^ EMD ZMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnovážnom stave v pufri A. Po premytí pufrom A bol antigén vymývaný gradientom 0 až 1,0 NaCl v pufri A. V jednotlivých frakciách bola sledovaná prítomnosť bielkoviny L1 skúškou imunodot blot.
Frakcie, u ktorých bola touto metódou bielkovina L1 identifikovaná, boli analyzované na celkové množstvo bielkoviny podľa Bradforda a potom bola uskutočnená analýza na SDS-PAGE pri farbení striebrom a metóda Vestern blot.
Frakcie zo živice TMAE s porovnateľnou čistotou a obsahom bielkoviny L1 boli spojené. Antigén bol koncentrovaný frakcionáciou síranom amónnym na 63 % pridaním tuhého reakčného činidla a opatrným miešaním celkom 30 minút. Vzorka bola uložená do ľadu, zrážanie prebiehalo 30 minút. Potom bola vzorka odstredená pri 12 OOOxg. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 20 ml PBS (6,25 mM fosfátu sodného s pH 7,2 a 150 mM NaCl).
Resuspendovaná usadenina bola chromatografovaná na stĺpci s výškou 89 cm a vnútorným priemerom 2,6 cm s náplňou živice Sephacryl 500 HJ (Pharmacia, Piscataway, NJ). Na elúcii bol použitý PBS. Chromatografia bola uskutočňovaná pri teplote 20 až 23 C. Frakcie boli analyzované pomocou SDS-PAGE pri farbení striebrom a detekciou metódou Vestern blot. Najčistejšie frakcie boli spojené a skoncentrované.
- 44 Výsledný produkt bol analyzovaný na SDS-PAGE pri farbení farbivom Coomassie. Bolo dokázané, že bielkoviny Ll a L2 sú z 85 % homogénne. Ich totožnosť bola potvrdená metódou Vestern blot za použitia príslušného antiséra. Produkt bol rozdelený na podiely a uložený pri teplote -70 C. Bolo získaných celkom 3,0 mg bielkoviny.
Elektrónová mikroskopia bola uskutočnená pomocou Structure Próbe (Vest Chester, PA). Podiel vzorky bol uložený na medenú mriežku s priemerom otvorov 200 mesh, vybavenou uhlíkovým povlakom. Na túto mriežku bola na 20 sekúnd uložená kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej s pH 7,0. Pred mikroskópiou bola mriežka vysušená na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie bolo uskutočnené na elektrónovom mikroskope JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) pri urýchľujúcom napätí 100 kV. Mikrofotografie mali konečné zväčšenie 100 OOOx. Bolo možné dokázať prítomnosť častíc, podobných vírusu s priemerom v rozmedzí 50 až 55 nm.
Príklad 29
Čistenie VLP HPV-6a Ll a L1/L2 na sledovanie EM
Bielkoviny HPV-6a Ll a HPV-6a Ll + L2 boli po expresii v kvasinkách čiastočne čistené a koncentrované na sledovanie elektrónovým mikroskopom (EM). 1 liter až 1,5 litrov prostredia YEHD s obsahom 2 % galaktózy a 0,1 M sorbitolu bolo naočkovaných kmeňom S. cerevisiae 1558, obsahujúcim plazmid pl3173-357-6 (vektor na expresiu . Ll) alebo plazmid pl4049-7-2 (vektor na súčasnú expresiu Ll a L2) a materiál bol pestovaný pri teplote 30 °C celkom 68 až 78 hodín. Bunkový materiál bol odstredený 10 minút pri 4000xg a usadenina buniek bola uložená pri -70 °C. Všetky nasledujúce stupne boli uskutočňované pri teplote 4 °C. Po roztopení bol bunkový materiál uvedený do suspenzie v rovnakom objeme pufra Ll, obsahujúceho 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl s 1,7 mM EDTA. K suspenzii boli pridané inhibítory proteázy PMŠF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mik45 roM. Bunky boli rozrušené 3 až 5 prechodmi mikrofluidizačným prístrojom. Lyzát bol vycerený odstredením 10 minút pri 5000xg. Supernatant bol navrstvený na vrchol vrstvy 45% sacharózy v pufri L1 s výškou 5 cm a bielkovina L1 alebo L1 + L2 boli usadené odstredením 4 hodiny pri 100 OOOxg. Potom bola usadenina znova uvedená do suspenzie v 1/10 objemu pufra L1 a suspenzia bola vyčerená odstredením 10 minút pri 5000xg. Vzorky boli sledované pomocou EM a bolo dokázané, že obsahujú častice, podobné vírusu.
Príklad 30
Klonovanie génov HPV16 L1 a L2
Celková DNA genómu bola extrahovaná z buniek Caski, ATCC CRL 1550, štandardnými postupmi podľa vyššie uvedenej publikácie Sambrooka a ďalších. DNA bola potom rozštiepená endonukleázami Bstl 1071 a Sphl a podrobená elektroforéze na preparatívnom 0,8% agarózovom géli s nízkou teplotou topenia. Z gélu bola vyrezaná oblasť, zodpovedajúca DNA s veľkosťou približne 3,5 kbp a agaróza bola spracovaná pôsobením enzýmu Gelase^ (Epicentre Technologies, Inc.). DNA, čistená na géli bola spracovaná vyplnením koncov T4 DNA polymerázou a naviazaná na fosforylované oligodeoxynukleotidové spoj niky s vyplnenými zakončeniami, obsahujúcimi miesto HindlII. Väzbová zmes bola úplne rozštiepená enzýmom HindlII a DNA bola frakcionovaná na agarózovom géli rovnako ako vyššie. Čistená DNA s približne 3,5 kbp bola potom naviazaná na DNA plazmidu pUC18, ktorý bol tiež rozštiepený HindlII a defosforylovaný. Po transformácii buniek E. coli DH5 (BRL), bola plazmidová banka vyšetrená na prítomnosť HPV 16-pozitívnych klonov hybridizáciou klonov za použitia pozitívneho 32
P-značeného oligodeoxynukleotidu, komplementárneho k 3’-zakončeniu génu HPV-16 L1 (5’-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3’). Plazmid pUC18, obsahujúci fragment genómu HPV16 s 3,3 kbp bol izolovaný a charakterizovaný reštrikčnými enzýmami a analýzou Southern blot. Tento plaz46 mid bol označený pUC18-HPV 16 L1/L2 a obsahuje celú kódovú sekvenciu DNA pre L1 a L2. DNA plazmidu bola pripravená za použitia balíčka Qiagen^ Plasmid Maxi kit (Qiagen, Inc.).
Príklad 31
Konštrukcia vektora na expresiu HPV16 L1 v kvasinkách
Kloň pUC18-HPV16 L1/L2 bol použitý ako matrica pre PCR. Gén HPV16 L1 bol amplifikovaný pomocou PCR za použitia polymerázy Vent (New England Biolabs., Inc.), Bolo použitých 10 cyklov amplifikácie, vždy 94 °C 1 minúta, 48 ”C 1 minúta a 72 °C 1 minúta 45 sekúnd s miestami BglII (podčiarknuté):
Negatívny primér:
5’-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC-3’ (reťazec č. 15)
Pozitívny primér:
5’-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3’ (reťazec č. 16).
Negatívny primér zavádza neprenášanú vedúcu sekvenciu z kvasiniek bezprostredne proti smeru expresie iniciačného metionínového kodónu HPV16 L1, ktorý je vyznačený silnými písmenami. PCR produkt L1 s 1,5 kbp bol rozštiepený BglII, čistený na géli a naviazaný na vektor pCl/l-GAL, rozštiepený BamHI. Plazmid pCl/l-GAL bol izolovaný vo forme, obsahujúcej gén HPV16 L1 a táto forma bola označená pl4049-37-l. Bola uskutočnená analýza sekvencie génu L1 v tomto plazmide za použitia balíčka PRISM^ (ABI, Inc.) a analyzátora ABI Sequencer Model 373A podlá návodu výrobcu. Bolo dokázané, že gén L1 v tomto izoláte obsahuje tri zmeny v nukleotidoch v porovnaní so zverejnenou sekvenciou prototypu podlá Kirnbauer R. a ďalší, 1993, J. Virol., 67:6929 až 6936, čo má za následok dve zmeny aminokyselín, His-202 na Asp a Ťhr-266 na Ala. Analýza sekvencie pôvodnej matrice DNA potvrdila, že tieto zmeny sú prítomné aj v géne klonu pUC18-HPV16 L1/L2 a neboli spôsobené pri uskutočňovaní PCR.
Príklad 32
Konštrukcia vektora na expresiu HPV6a Ll a L2 v kvasinkách
Plazmid pl4049-37-l, pCl/l-GAL+HPV16 Ll sa rozštiepi enzýmom Smal, ktorý štiepi medzi promótorom GAL10 a terminátorom transkripcie ADH1. Gén HPV16 s 1,4 kbp sa amplifikuje pomocou PCR za použitia DNA plazmidu pUC18-HPV16 ako matrice. Ďalej sa použije polymeráza Vent (New England Biolabs, Inc.) a uskutočňuje sa desať cyklov PCR-amplifikácie vždy 94 °C 1 minúta, 48 °C 1 minúta a 72 °C 1 minúta 45 sekúnd, súčasne sa použijú nasledujúce oligodeoxynukleotidové priméry, ktoré obsahujú miesta pôsobenia Smal (podčiarknuté):
Negatívny primér:
5’-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC-3’ (reťazec č. 17)
Pozitívny primér:
5’-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA-3’ (reťazec č. 18).
Negatívny primér zavádza neprenášanú vedúcu sekvenciu z kvasiniek bezprostredne proti smeru expresie iniciačného metionínového kodónu HPV16 L2, ktorý je vyznačený silnými písmenami. PCR produkt L2 s 1,4 kbp bol rozštiepený Smal, materiál sa čistí na géli a potom je naviazaný na vektor pl4049-37-l, tiež rozštiepený Smal. Plazmid pCl/l-GAL bol izolovaný vo forme, obsahujúcej gén HPV16 Ll a L2 a táto forma bola označená pl4049-42-2. Gén L2 v tomto plazmide bol analyzovaný za použitia balíčka PRISM (ABI, Inc.) a analyzátora ABI Sequencer Model 373A podlá návodu výrobcu. Bolo dokázané, že gén L2 v tomto izoláte obsahuje päť zmien v nukleotidoch v porovnaní so zverejnenou sekvenciou,
Kirnbauer R. a ďalší, 1993, vyššie. Tieto zmeny majú za následok zmenu jednej aminokyseliny, Ser-269 na Pro. Analýza sekvencie klonu genómu pUC18-HPV16 L1/L2 potvrdila, že táto zmena už bola prítomná v pôvodnej matrici DNA a nebola spôsobená PCR.
Príklad 33
A. Expresia HPV16 L1 a súčasná expresia HPV16 L1 a L2 v kvasinkách
Plazmidy pl4049-37-l, pCl/l-GAL+HPV16 Ll a pl4049-42-2, pCl/1-GAL+HPV16 L1 a L2 sa použijú na transformáciu kmeňov S. cerevisiae 1558. Výsledné rekombinantné kmene boli označené 1678 (HPV16 Ll) a 1679 (HPV16 L1 + L2), ako je uvedené v tabuľke I (Obr. 10). Izoláty klonov boli pestované pri 30 °C na prostredí YEHD s obsahom 2 % galaktózy celkom 68 až 78 hodín. Po izolácii buniek boli usadeniny buniek rozrušené sklenenými guľôčkami a lyzáty buniek boli analyzované na expresiu bielkoviny HPV16 Ll alebo HPV16 L2 metódou imunoblot. Vzorky, obsahujúce 40 mikrogramov celkovej bunkovej bielkoviny boli podrobené elektroforéze na 10% tris-glycínovom géli za redukčných a denaturačných podmienok a potom bol uskutočnený elektroblot na nitrocelulózové filtre. Bielkovina HPV16 Ll bola dokazovaná imunologický za použitia králičieho antiséra proti zloženej bielkovine trpE-HPVll Ll podľa Brown D. R. a ďalší, Virology, 201:46 až 54, ako primárne protilátky a úplné protilátky osla proti králičiemu IgG, viazanému na peroxidázu z chrenu, HRP (Amersham, Inc.) ako sekundárne protilátky. Filtre boli spracované chemiluminiscenciou pri použití detekčného balíčka (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách bol dokázaný pás pre bielkovinu Ll s molekulovou hmotnosťou 50 000 až 55 000 s výnimkou negatívnej kontroly, ktorou bol plazmid pCl/1 bez génu Ll alebo L2. Bielkovina L2 bola dokázaná ako pás pre bielkovinu s molekulovou hmotnosťou 70 000 metódou imunoblot za- použitia myšacej protilátky proti zloženej bielkovine trpE-L2 po jej expresii E. coli ako primárnej protilátky. Ako sekundárna protilátka bola použitá kozia protilátka proti myšaciemu IgG, viazaná na HRP (Amersham, Inc.) a filtre boli spracované vyššie uvedeným spôsobom.
B. Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu HPV16 L1 + L2
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 °C, ak nie je uvedené inak.
Bunky kmeňa 1670 boli uložené v zmrazenom stave pri -70 °C. 38,0 g zmrazených buniek bolo po roztopení pri 20 až 23 °C uvedených do suspenzie v 50 ml pufra Ll s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Potom boli pridané inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Bunková suspenzia bola rozrušená pri tlaku 56 MPa pri trojnásobnom prechode mikrofluidizačným zariadením M110 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Suspenzia rozrušených buniek bola odstredená 10 minút pri 5000xg na odstránenie bunkovej drviny. Potom bol oddelený supernatant, obsahujúci antigén Ll + L2.
Supernatant bol zriedený v pomere 1:5 pridaním pufra A (20 mM MOPS s pH 7,0) a nanesený na stĺpec aniomomeniča s výškou 4 cm a vnútorným priemerom 5 cm s náplňou živice Fractogel^ EMD ZMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnovážnom stave v pufri A. Po premytí pufrom A bol antigén vymývaný gradientom 0 až 1,0 NaCl v pufri A. V jednotlivých frakciách bola sledovaná prítomnosť bielkoviny Ll skúškou imunodot blot.
Frakcie, u ktorých bola touto metódou bielkovina Ll identifikovaná, boli analyzované na celkové množstvo bielkoviny podľa Bradforda a potom bola uskutočnená analýza na SDS-PAGE pri farbení striebrom a metóda Vestern blot.
Frakcie TMAE s porovnateľnou čistotou a obsahom bielkoviny Ll boli spojené. Antigén bol koncentrovaný frakcionáciou síranom amónnym. Vzorky boli upravené síranom amónnym do nasýtenia 48 % pridaním tuhého reakčného činidla za opatrného miešania v priebehu 30 minút. Vzorky boli uložené do ľadu, zrážanie prebiehalo cez noc. Potom boli vzorky odstredené pri 12 OOOxg. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 20 ml PBS (6,25 mM fosfátu sodného s pH 7, 2 a 150 mM NaCl).
Resuspendované usadeniny boli chromatografované na stĺpci s výškou 89 cm a vnútorným priemerom 2,6 cm s náplňou živice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Na elúciu bol použitý PBS. Frakcie boli analyzované pomocou SDS-PAGE pri farbení striebrom a detekciou metódou Vestern blot. Najčistejšie frakcie boli spojené. Potom bol materiál koncentrovaný v komore s objemom 50 ml za miešania za použitia membrány YM-100 s priemerom 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pri tlaku dusíka 0,03 až 0,06 MPa.
Výsledný produkt bol analyzovaný na SDS-PAGE pri farbení farbivom Coomassie. Bolo dokázané, že bielkoviny L1 a L2 sú na 70 % homogénne. Ich totožnosť bola potvrdená metódou Vestern blot za použitia príslušného antiséra. Produkt bol rozdelený na podiely a uložený pri teplote -70 ‘C. Bolo získaných celkom 0,53 mg bielkoviny.
Elektrónová mikroskopia bola uskutočnená pomocou Structure Próbe (Vest Chester, PA). Podiel vzorky bol uložený na medenú mriežku s priemerom otvorov 200 mesh, vybavenou uhlíkovým povlakom. Na túto mriežku bola na 20 sekúnd uložená kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej s pH 7,0. Pred mikroskópiou bola mriežka vysušená na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie bolo uskutočnené na elektrónovom mikroskope JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) pri urýchľujúcom napätí 100 kV. Mikrofotografie mali konečné zväčšenie 100 OOOx. Bolo možné dokázať prítomnosť častíc, podobných vírusu s priemerom v rozmedzí 50 až 55 nm.
C. Čistenie rekombinantných bielkovín kapsidu HPV16 L1 + L2
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 °C, ak nie je uvedené inak.
Bunkový materiál bol uložený v zmrazenom stave pri -70 “C: 92,8 g zmrazených buniek bolo po roztopení pri 20 až 23 °C uvedených do suspenzie v 105 ml pufra Ll s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl a 1,7 mM EDTA. Potom boli pridané inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do koBunková suspenzia botrojnásobnom prechode (Microfluidics Corp., nečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. la rozrušená pri tlaku 100 MPa pri mikrofluidizačným zariadením M110-Y
Newton, MA). Suspenzia rozrušených buniek bola odstredená 15 minút pri 6100xg na odstránenie bunkovej drviny. Potom bol oddelený supernatant, obsahujúci antigén Ll + L2.
Supernatant bol zriedený v pomere 1:5 pridaním pufra A (20 mM MOPS s pH 7,0) a nanesený na stĺpec aniomomeniča s výškou 4,2 cm a vnútorným priemerom 5 cm s náplňou živice Fractogel^ EMD ZMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnovážnom stave v pufri A. Po premytí pufrom A bol antigén vymývaný gradientom 0 až 1,0 NaCl v pufri A. V jednotlivých frakciách bola sledovaná prítomnosť bielkoviny Ll skúškou imunodot blot.
Frakcie s obsahom bielkoviny Ll boli analyzované na celkové množstvo bielkoviny podľa Bradforda a potom bola uskutočnená analýza na SDS-PAGE pri farbení striebrom a metóda Vestern blot.
Frakcie TMAE s porovnateľnou čistotou a obsahom bielkoviny Ll boli spojené. Antigén bol koncentrovaný frakcionáciou síranom amónnym. Vzorky boli upravené síranom amónnym do nasýtenia 35 % pridaním tuhého reakčného činidla za opatrného miešania v priebehu 10 minút. Vzorky boli uložené do ľadu, zrážanie prebiehalo 4 hodiny. Potom boli vzorky odstredené pri 12 OOOxg. Usadeniny boli znova uvedené do suspenzie v 20 ml PBS (6,25 mM fosfátu sodného s pH 7, 2a 150 mM NaCl) s obsahom 1 mM EDTA.
Resuspendované usadeniny boli chromatografované na stĺpci s výškou 89 cm a vnútorným priemerom 2,6 cm s náplňou živice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Na elúciu bol použitý PBS + 1 mM EDTA. Frakcie boli analyzované pomocou SDS-PAGE pri farbení striebrom a metódou Vestern blot. Najčistejšie frakcie boli spojené a koncentrované v komore s obsahom 50 ml pri použití membrány YM-100 s prie52 merom 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pri tlaku dusíka 0, 02 až 0,04 MPa.
Výsledný produkt bol analyzovaný na SDS-PAGE pri farbení farbivom Coomassie. Bolo dokázané, že bielkoviny L1 a L2 sú na 70 % homogénne. Ich totožnosť bola potvrdená metódou Vestern blot za použitia príslušných antisér. Produkt bol rozdelený na podiely a uložený pri teplote -70 °C. Bolo získaných celkom 3,8 mg bielkoviny.
Príklad 34
A. Fermentácia kmeňa 1679, HPV16 L1 a L2
Príprava zmrazenej zásobnej kultúry, očkovacieho materiálu, fermentácia a izolované kmene 1679 boli uskutočňované rovnakým spôsobom ako vyššie. Po 67 hodinách inkubácie bolo získaných 4,2 g sušiny buniek na 1 liter prostredia, celkom bolo získaných 93 g vlhkej usadeniny buniek.
B. Fermentácia kmeňa 1678 HPV16 Ll
Postupy na prípravu zmrazenej zásobnej kultúry, očkovacieho materiálu, fermentácie a izolácie buniek kmeňa 1678 boli uskutočnené rovnako ako vyššie. Po 70,5 hodinách inkubácie boli spojené obsahy dvoch fermentorov po 10 litroch, bolo získaných 8,7 g sušiny buniek na 1 liter živného prostredia a celkom 258 g vlhkej usadeniny buniek.
C. Čistenie rekombinantných bielkovín kapsidu HPV16 Ll
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 ’C, ak nie je uvedené inak.
Bunky kmeňa 1678 boli uložené v zmrazenom stave pri -70 °C. 128 g zmrazených buniek bolo po roztopení pri 20 až 23 °C uvedených do suspenzie v 140 ml modifikovaného pufra Ll s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 a 100 mM NaCl. Potom boli pridané inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do
FractogelR EMD ZMAE-650 (S) v rovnovážnom stave pufra A, konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Bunková suspenzia bola rozrušená pri tlaku 100 MPa pri trojnásobnom prechode mikrofluidizačným zariadením M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Suspenzia rozrušených buniek bola odstredená 40 minút pri 11 OOOxg na odstránenie bunkovej drviny. Potom bol oddelený supernatant, obsahujúci antigén L1.
Supernatant bol zriedený v pomere 1:5 pridaním pufra A (20 mM MOPS s pH 7,0) a nanesený na stĺpec aniomomeniča s výškou 6,4 cm a vnútorným priemerom 5 cm s náplňou živice (EM Separations, Gibbstown, NJ) Po premytí pufrom A bol antigén vymývaný gradientom 0 až 1,0 NaCl v pufri A. Na stanovenie obsahu L1 vo frakciách bol použitý imunodot blot.
Frakcie, u ktorých bola touto metódou bielkovina L1 identifikovaná, boli analyzované na celkové množstvo bielkoviny podľa Bradforda a potom bola uskutočnená analýza na SDS-PAGE pri farbení striebrom a metóda Vestern blot.
Frakcie TMAE s porovnateľnou čistotou a obsahom bielkoviny L1 boli spojené. Antigén bol koncentrovaný frakcionáciou síranom amónnym. Vzorky boli upravené síranom amónnym do nasýtenia 35 % pridaním tuhého reakčného činidla za opatrného miešania v priebehu 10 minút. Vzorky boli uložené do ľadu, zrážanie prebiehalo 5 hodín. Potom boli vzorky odstredené pri 12 OOOxg. Usadenina bola znova uvedená do suspenzie v 20 ml PBS (6,25 mM fosfátu sodného s pH 7, 2 a 150 mM NaCl).
Resuspendované usadeniny boli chromatografované na stĺpci s výškou 89 cm a vnútorným priemerom 2,6 cm s náplňou živice Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Na elúciu bol použitý PBS. Frakcie boli analyzované pomocou SDS-PAGE pri farbení striebrom a detekciou metódou Vestern blot. Najčistejšie frakcie boli spojené a koncentrované v komore s objemom 50 ml za miešania za použitia membrány YM-100 s priemerom 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pri tlaku dusíka 0,03 až 0,04 MPa.
Výsledný produkt bol analyzovaný na SDS-PAGE pri farbení koloidnou Coomassie. Bielkovina L1 bola na 70 % homogén54 na. Jej totožnosť bola potvrdená metódou Vestern blot za použitia príslušných antisér. Produkt bol rozdelený na podiely a uložený pri teplote -70 °C. Bolo získaných celkom 7,4 mg bielkoviny.
D. Analytické postupy
Metóda Imunodot blot
V prípade potreby boli vzorky zriedené 1:10 v Milli-Ql^O a potom bolo vždy 10 mikrolitrov vzorky nanesených na membrány PolyScreen^ PVDF (NEN Research Products, Boston, MA). Po vysušení škvŕn boli membrány premyté vodou a vysušené. Primárny roztok protilátky bol pripravený riedením príslušného antiséra v pufri pre blot (5 % odtučneného mlieka v 6,25 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN-j) . Inkubácia bola uskutočňovaná najmenej 1 hodinu pri teplote 20 až 23 °C. Blot bol premývaný 1 minútu, trikrát vždy v čerstvom PBS (6,25 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundárnej protilátky bol pripravený zrieantiséra a alkalickej fosfatázy prebiehala najmenej 1 hodinu za rovnakých podmienok, potom boli vzorky premyté rovnako ako vyššie. Detekcia bola uskutočnená za použitia substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).
Na detekciu boli použité nasledujúce protilátky: Bielkovina HPV6a Ll bola dokazovaná za použitia MAB 837 (Chemicon Internacionál, Inc., Temecula, CA). HPV6a L2 bola dokazovaná za použitia myšacieho séra proti zloženej bielkovine HPV6a L2-trpE, šarža 641 a 647. HPV16 Ll bola dokazovaná pomocou MAB 885 (Chemicon International. Inc., Temecula, CA), HPV16 L2 bola dokazovaná za použitia myšacieho antiséra proti zloženej bielkovine HPV16 L2-trpE, šarža 611.
dením príslušného konjugátu v pufri pre blot. Inkubácia
Bradfordova skúška na celkové množstvo bielkoviny
Celkové množstvo bielkoviny bolo stanovené za použitia
D bežné dodávaného balíčka Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL). Vzorky boli zriedené na príslušné riedenie pomocou Milli-Q-P^O. Objemy vzoriek boli 0,1 ml a 1,0 ml pre mikroskúšky a bežné skúšky. V oboch prípadoch bol na vytvorenie štandardnej krivky použitý BSA (Pierce, Rockford, IL) . Skúška bola uskutočnená podlá doporučenia výrobcu. Sledovanie bolo uskutočňované porovnaním so štandardnou krivkou za pouD žitia softwaru CricketGraph na počítači Macintosh líci.
Príklad 35
Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu HPV 11 Ll
Bunkový materiál bol uložený v zmrazenom stave pri -70 ’C. 180 g zmrazených buniek bolo po roztopení pri 20 až 23 °C uvedených do suspenzie v 900 ml pufra na rozrušenie s obsahom 50 mM MOPS s pH 7,2, 500 mM NaCl a 1 mM CaC^· Potom boli pridané inhibitory proteázy AEBSF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 1 mM a 1,7 mikroM. Bunková suspenzia bola rozrušená pri tlaku 100 MPa pri štvornásobnom prechode mikrofluidizačným zariadením M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Potom bol pridaný dostatočný objem zmáčadla 10 % Triton X100^ (Pierce, Rockford, IL) na úpravu koncentrácie uvedenej látky na 0,5 %. Suspenzia bola miešaná 20 hodín a potom odstredená 40 minút pri 12 OOOxg na odstránenie bunkovej drviny. Kvapalný supernatant s obsahom bielkovín Ll bol oddelený.
Supernatant sa podrobí diafiltrácii proti piatim objemom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 s 0,5 M NaCl za použitia kazety 300K s membránou s tangenciálnym prietokom (Filtron, Northborought, MA). Bolo dokázané rádioimunologicky a metódou Vestern Blot, že materiál, zadržaný na membráne obsahuje bielkovinu Ll.
Zadržaný podiel sa nanesie na afinitný stĺpec s výškou 5,3 cm a vnútorným priemerom 11,0 cm s náplňou živice SP Spherodex (M)^ (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Francie) v rovnovážnom stave v 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2 s 0,5
M NaCl. Po premytí ekvilibračným pufrom a postupným premytím 20 mM fosfátom sodným s pH 7,2, s 1,0 M NaCl sa bielkovina L1 vymýva 20 mM fosfátom sodným s pH 7,2 s 2,5 M NaCl. Odoberajú sa jednotlivé frakcie, v ktorých sa stanoví celkový obsah bielkoviny podľa Bradforda. Frakcie sa potom analyzujú metódou Vestern blot a SDS-PAGE pri zafarbení koloidnou Coomassie. Okrem toho sa tiež frakcie analyzujú rádioimunologicky.
Frakcie zo živice SP Spherodex majú porovnateľnú čistotu, frakcie s väčším obsahom L1 boli spojené.
Produkt bol analyzovaný metódou Vestern blot a na SDS-PAGE pri detekcii koloidnou Coomassie. Bolo dokázané, že bielkovina L1 je homogénna z viac než 90 %. Identita bielkoviny L1 bola potvrdená metódou Vestern blot. Produkt bol aseptický odfiltrovaný cez membránu s priemerom ôk 0,22 mikrometrov a uložený pri teplote 4 °C. Týmto spôsobom bolo získaných celkom 202 mg bielkoviny.
Analýza v elektrónovom mikroskope bola uskutočnená za použitia balíčka Structure Próbe (Vest Chester, PA). Podiel vzorky sa uloží na medenú mriežku z priemerom otvorov 20 mesh, vybavenú povlakom uhlíka. Na mriežku sa na 20 sekúnd nanesie kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej s pH 7,0. Potom sa mriežka vysuší na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočňuje za použitia elektrónového mikroskopu JEOL 100 CX (JEOL US, Inc.) pri urýchľovacom napätí 100 kV. Mikrofotografie mali zväčšenie 100 OOOx.
SDS-PAGE a Vestern blot
Všetky gély, pufre a elektroforetické zariadenia boli získané od Novex (San Diego, CA) a skúšky boli uskutočňované podľa doporučenia výrobcu. Vzorky boli zriedené na rovnakú koncentráciu bielkoviny za použitia MÍIIÍ-Q-H2O a zmiešané 1:1 s inkubačným pufrom, obsahujúcim 200 mM DTT. Vzorky boli inkubované 15 minút pri 100 °C a potom nanesené na vopred odliate 12% tris-glycínové gély. Elektroforéza bola uskutočnená 1 hodinu 45 minút pri 125 V. Gély boli vyvíjané farbe57 ním koloidnou Coomassie za použitia bežne dodávaného balíčka (Integrated Separation Systems, Natick, MA).
Pri uskutočňovaní metódy Vestern blot boli bielkoviny prenesené na 40 minút na membrány PVDF pri 25 V. Membrány boli premyté Milli-Q-I^O a vysušené na vzduchu. Primárnou protilátkou bolo polyklonálne králičie sérum proti zloženej bielkovine TrpE-HPVll Ll (dar Dr. D. Browna). Roztok protilátky bol pripravený zriedením antiséra v pufri pre blot (5% odtučnené mlieko v 6,25 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN3). Vzorka sa inkubuje najmenej 1 hodinu pri teplote 20 až 23 C. Potom sa blot premýva vždy 1 minútu trikrát vždy čerstvým PBS (6,25 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 150 mM NaCl). Sekundárna protilátka bola pripravená zriedením kozieho antiséra proti králičiemu IgG, konjugovanému s alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v pufri pre blot. Inkubácia bola uskutočňovaná najmenej 1 hodinu za tých istých podmienok. Bloty boli premyté ako je uvedené vyššie, detekcia bola uskutočňovaná v jednom stupni za použitia substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).
Príklad 36
Expresia HPV18 Ll a L2 v kvasinkách
Plazmidy pl91-6, pGaLl-10+HPV18 Ll a pl95-ll, pGALl-10+ +HPV18 Ll + L2 sa použijú na transformáciu kmeňov S. cerevisiae 1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°). Izoláty klonov boli pestované pri 30 °C na prostredí YEHD s obsahom 2 % galaktózy celkom 88 hodín. Po izolácii buniek boli usadeniny buniek rozrušené sklenenými guľôčkami a materiál bol analyzovaný metódou imunoblot na expresiu bielkoviny HPV18 Ll a/alebo HPV18 L2. Vzorky, obsahujúce 25 mikrogramov celkovej bunkovej bielkoviny boli podrobené elektroforéze na 10% tris-glycínovom géli (Novex, Inc.) za redukčných a denaturačných podmienok a potom bol uskutočnený elektroblot na nitrocelulózových filtroch. Bielkovina Ll bola dokazovaná za použitia králičieho antiséra proti zloženej
- 58 bielkovine trpE-HPVll Ll podľa Brown D. R. a ďalší, 1994, Virology, 20:46 až 54, ako primárnej protilátky a ako sekundárna protilátka bola použitá protilátka osla proti králičiemu IgG, viazanému na peroxidázu z chrenu, HRP (Amersham, Inc.). Filtre boli spracované chemiluminiscenciou pri použití detekčného balíčka ECL™ (Amersham, Inc.). V oboch klónoch kvasiniek, to znamená kmeňoch 1725 a 1727 bol dokázaný pás pre bielkovinu Ll s molekulovou hmotnosťou 50 000 až 55 000, tento pás nebol dokázaný len u negatívnej kontroly pGALl-10 bez génov Ll alebo L2.
Bielkovina HPV18 L2 bola dokázaná analýzou Vestern blot za použitia kozieho polyklonálneho antiséra proti zloženej bielkovine trpE-HPV18 L2 ako primárnej protilátke, sekundárnou protilátkou bola králičia protilátka proti koziemu IgG, konjugovaná s HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) . Filtre boli spracované vyššie uvedeným spôsobom. Bielkovina L2 bola dokázaná ako pás bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 75 000 v klone kvasiniek pre súčasnú expresiu Ll a L2, kmeň 1727, avšak nie u negatívnej kontroly alebo u klonu na expresiu Ll.
Príklad 37
Pestovanie kmeňa HPV18 Ll, kmeň 1725 a 18 Ll + deltaL2, kmeň 1727
Povrchovo rastúca kultúra kmeňov 1725 a 1727 bola z platne aseptický prenesená do kvapalného prostredia, zbaveného leucínu a obsahujúceho v 1 litri: 8,5 g dusíkatých báz z kvasiniek Difco bez aminokyselín a síranu amónneho, 0,2 g adenínu, 0,2 g uracilu, 10 g kyseliny jantárovej, 5 g síranu amónneho, 40 g glukózy, 0,25 g L-tyrozínu, 0,1 g L-arginínu, 0,3 g L-izoleucínu, 0,05 g L-metionínu, 0,2 g L-triptofánu, 0,05 g L-histidínu, 0,2 g L-lyzínu a 0,3 g L-fenylalanínu, toto prostredie bolo pridaním NaOH upravené na pH 5,0 až 5,3 pred sterilizáciou. Po raste pri 28 °C za pretrepávania pri 250 otáčkach/minútu na rotačnej trepač59 ke boli pripravené zmrazené podiely kultúry vo fľaštičkách pridaním sterilného glycerolu do konečného obsahu 17 g/100 ml s následným uložením pri teplote -70 °C, obsah kultúry v každej fľaštičke bol 1 ml. Očkovací materiál bol pripravený v tom istom prostredí, bolo použitých vždy 500 ml prostredia vo fľaši s obsahom 2 litrov, kultúra bola založená prenesením roztopeného obsahuj zmrazenej fľaštičky s následnou inkubáciou 29 hodín pri teplote 28 °C a pri 250 otáčkach/minútu na rotačnej trepačke. Fermentácia každého kmeňa bola uskutočnená po naočkovaní vo fermentore New Brunswick SF-116 s pracovným objemom 10 litrov. Produkčné prostredie obsahovalo v 1 litri: 20 g extraktu z kvasníc Difco, 10 g peptónu HySoy Sheffield, 20 g glukózy, 20 g galaktózy a 0,3 ml protipenivého činidla Union Carbide UCON LB-625, pred sterilizáciou bolo prostredie upravené na pH 5,3. Celý objem 500 ml z fľaše s objemom 2 litre bol prenesený do fermentora s následnou inkubáciou pri teplote 28 C, prevzdušnenie 5 litrov vzduchu za minútu, 400 otáčok/minútu, plak 0,25 MPa. Miešanie bolo zintenzívnené v prípade, že bolo potrebné zvýšiť obsah rozpusteného kyslíka na hodnotu vyššiu než 40 % nasýtenia. Postup fermentácie sa sleduje meraním glukózy (Beckman Glukose 2 Analyzer) a hmotnostnou spektrometriou (Perkin-Elmer 1200). Po inkubácii 66 hodín bolo získaných 9,5 až 9,7 g sušiny buniek na 1 liter živného prostredia. Kultúra bola zahustená filtráciou za použitia dutých vláken (náplň Amicon H5MPO1-43 vo filtračnom systéme Amicon DC-10) až na objem približne 2 litre a potom bola podrobená diafiltrácii za použitia 2 litrov fyziologického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom a ďalej zahustená až na približne 1 liter pred rozdelením do fliaš pre odstredivku s objemom 500 ml. Usadenina buniek bola získaná odstredením 20 minút pri 8000 otáčkach/minútu a teplote 4 °C (rotor Sorval GS-3). Po zliatí supernatantu sa usadenina buniek, celkom 191 až 208 g vlhkej usadeniny uloží pri teplote -70 °C až do použitia.
- 60 Príklad 38
Čistenie rekombinantnej bielkoviny kapsidu HPV18 Ll
Všetky stupne boli uskutočňované pri teplote 4 °C ak nie je uvedené inak.
Bunkový materiál bol uložený v zmrazenom stave pri -70 °C. 126 g zmrazených buniek bolo po roztopení pri 20 až 23 °C uvedených do suspenzie v 70 ml pufra na rozrušenie buniek s obsahom 20 mM fosfátu sodného s pH 7,2, 100 mM NaCl. Potom boli pridané inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A do konečnej koncentrácie 2 mM a 1,7 mikroM. Bunková suspenzia bola rozrušená pri tlaku 100 MPa pri štvornásobnom prechode mikrofluidizačným zariadením M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Suspenzia rozrušených buniek bola odstredená 40 minút pri 12 OOOxg na odstránenie bunkovej drviny. Potom bol oddelený kvapalný supernatant, obsahujúci antigén Ll.
Kvapalný supernatant bol zriedený v pomere 1:5 pridaním pufra A (20 mM MOPS s pH 7,0) a nanesený na stĺpec aniomomeniča s výškou 3,9 cm a vnútorným priemerom 9,0 cm s náplňou živice Fractogel^ EMD ZMAE-650 (S) (EM Separations, Gibbstown, NJ) v rovnovážnom stave v pufri A. Po premytí pufrom A bol antigén vymývaný gradientom 0 až 1, 0 NaCl v pufri A. Frakcie s rovnakým obsahom bielkoviny potom boli analyzované metódou Vestern blot a SDS-PAGE pri zafarbení striebrom.
Frakcie TMAE s porovnateľnou čistotou a s obsahom bielkoviny Ll boli spojené. Antigén bol koncentrovaný frakcionáciou síranom amónnym. Roztok bol upravený na 35% nasýtený síranom amónnym pridávaním tuhého reakčného činidla za opatrného miešania v priebehu 10 minút. Potom bola vzorka uložená na ľad a zrážanie prebiehalo ešte 4 hodiny. Potom bol materiál odstredený 45 minút pri 16 OOOxg. Usadenina bola uvedená do suspenzie v 20,0 ml PBS s obsahom 6,25 mM fosfátu sodného s pH 7,2 a 150 mM NaCl.
Resuspendovaná peleta bola chromatografovaná na stĺpci s výškou 89 cm a vnútorným priemerom 2,6 cm s náplňou živice
- 61 Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Na elúciu bol použitý PBS. Frakcie boli analyzované pomocou SDS-PAGE pri farbení striebrom. Najčistejšie frakcie boli spojené a koncentrované v komore s obsahom 50 ml pri použití membrány YM-100 s priemerom 43 mm (Amicon, Beverly, MA) pri tlaku dusíka 0, 03 až 0,04 MPa.
Produkt bol analyzovaný metódou Vestern pri detekcii koloidnou Coomassie. Bielkovina génna z 50 až 60 %, jej identita bola potvrdená metódou
Vestern blot. Výsledný produkt bol rozdelený na podiely a uložený pri teplote -70 °C. Postupom bolo získaných 12,5 g bielkoviny.
blot SDS-PAGE LI bola homoPríklad 39
Príprava prostriedkov na vyvolanie imunity
Čistená frakcia VLP sa spracováva známym spôsobom, napríklad pridaním farmaceutický prijateľných nosičov, stabilizátorov alebo pomocných prostriedkov pre vakcíny. Imunogénny VLP podľa vynálezu je možné pripraviť na použitie ako vakcínu zmiešaním -s fyziologicky prijateľným nosným prostredím, ako je PBS, fyziologicky roztok chloridu sodného alebo destilovaná voda. VLP sa podáva v dávke 0,1 až 100, s výhodou 1 až 20 mikrogramov na dosiahnutie imunogénneho účinku. Množstvo VLP v prostriedku sa môže meniť v závislosti na rôznych faktoroch, ako sú zdravotný stav, vek, hmotnosť a pohlavie. Prostriedok s obsahom VLP je možné podávať rôznym spôsobom, napríklad perorálne, podkožné, miestne, na sliznici a vnútrosvalovo. Prostriedky môžu obsahovať VLP jediného typu, napríklad VLP z HPB6a alebo zmes VLP, napríklad VLP z HPVóa, HPB11, HPV16 a HPV18.
Prostriedok môže obsahovať antimikrobiálny konzervačný prostriedok, napríklad thimerosal. Použité antigény antigény je možné kombinovať so známymi stabilizátormi a pomocnými látkami pre vakcíny. Typickými stabilizátormi sú niektoré špecifické zlúčeniny, napríklad polyanióny, ako heparín, inozitolhexasulfát, beta-cyklodextrín sulfát a niektoré menej špecifické pomocné látky, ako aminokyseliny, sorbitol, manitol, xylitol, glycerol, sacharóza, dextróza, trehalóza, alebo je možné meniť hodnotu pH, použiť vysokú iónovú silu približne 0,5 až 2,0 M solí, dvojväzbové katióny, ako vápenatý alebo horečnatý katión. Ako príklady pomocných prostriedkov je možné uviesť hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý. Vakcínu podľa vynálezu je možné skladovať za chladenia alebo tiež v lyofilizovanej forme.
Príklad 40
Príprava protilátok proti VLP
Čistené VLP je tiež možné použiť na tvorbu protilátok. Pojem protilátka v tomto prípade zahrnuje polyklonálne aj monoklonálne protilátky a ich fragmenty, ako Fv, Fab a F(ab)2> ktoré sú schopné viazať antigén alebo haptén. Protilátky je možné využiť v rôznom smere, napríklad pri čistení rekombinantných VLP, na čistenie natívnych bielkovín L1 alebo L2 a ako súčasť skúšobných balíčkov. Tieto balíčky budú obsahovať reakčné činidlá, napríklad protilátku proti VLP alebo VLP na detekciu HPV alebo fragmentov HPV alebo protilátok proti HPV. Nosič môže tiež obsahovať prostriedky na detekciu, ako značený antigén alebo substrát pre enzým a podobne. Protilátky alebo VLP alebo balíčky uvedeného typu je možné použiť na rad účelov, napríklad na súdne účely alebo na epidemiologické štúdie.
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaná a čistená bielkovina papilomavírusu zo skupiny bielkovina Ll, bielkovina L2, bielkovina Ll + L2 a ich funkčné deriváty pri čistote bielkoviny najmenej 60 %.
- 2. Bielkovina podľa nároku 1, z ľudského papilomavírusu alebo papilomavírusu králika.
- 3. Bielkovina podľa nároku 2, z ľudského papilomavírusu zo skupiny HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV41, HPV45 a HPV58.
- 4. Bielkovina podlá nároku 1, produkovaná v syntetickom systéme, vrátane rekombinantného hostiteľa.
- 5. Kapsid s obsahom bielkoviny podľa nároku 1.
- 6. Vírusovité partikuly, obsahujúce bielkovinu podľa nároku 1.
- 7. Spôsob výroby čistenej bielkoviny podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že saa) transformuje hostiteľ rekombinantnou molekulou DNA, ktorá je kódom pre bielkovinu zo skupiny bielkovina Ll papilomavírusu, bielkovina L2 papilomavírusu, bielkoviny Ll + L2 papilomavírusu a ich funkčné deriváty,b) transformovaný hostiteľ sa pestuje za podmienok, dovoľujúcich expresiu rekombinantnej molekuly DNA za vzniku surovej rekombinantnej bielkoviny papilomavírusu, potom sac) surová rekombinantná bielkovina papilomavírusu čistí za vzniku čistenej bielkoviny.
- 8. Rekombinantná bielkovina papilomavírusu, ziskatelná spôsobom podľa nároku 7.- Š4
- 9. Kapsidy, obsahujúce bielkovinu podlá nároku 7.
- 10. Vírusovité partikuly, obsahujúce bielkovinu podľa nároku 7.
- 11. Vakcína, vyznačujúca satým, že obsahuje bielkovinu podľa nároku 1.
- 12. Farmaceutický prostriedok, vyznačuj úci sa tým, že obsahuje bielkovinu podľa nároku 1.
- 13. Spôsob liečenia alebo prevencie infekcie papilomavírusom, vyznačujúci sa tým, že sa podáva vakcína podľa nároku 11.
- 14. Skúšobný balíček na detekciu papilomavirusu alebo protilátok proti papilomavirusu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje reakčné činidlo zo skupiny kódová molekula DNA pre bielkovinu papilomavirusu podľa nároku 1, bielkovina podľa nároku 1, častica, podobná vírusu s obsahom bielkoviny podľa nároku 1, protilátka proti bielkovine podľa nároku 1 a protilátka proti časticiam, podobným vírusu s obsahom bielkoviny podľa nároku 1.
- 15. Spôsob výroby rekombinantnej bielkoviny kapsidu papilomavírusu, začlenenej do kapsidu alebo do častice, podobnej vírusu, vyznačujúci sa tým, že saa) klonuje gén papilomavirusu, ktorý je kódom pre najmenej jednu bielkovinu kapsidu papilomavirusu, vo vhodnom vektore,b) vektor sa prenesie do hostiteľskej bunky za vzniku rekombinantnej hostiteľskej bunky,c) rekombinantná hostiteľská bunka sa pestuje za podmienok, pri ktorých môže dôjsť k produkcii bielkoviny kapsidu papilomavirusu ad) vytvorená bielkovina kapsidu papilomavirusu sa čistí.- <55 16. Kapsidy, podobné vírusu, získatelné spôsobom podľa nároku 15.
- 18. Spôsob vyvolania odpovede imunitného systému u stavovcov, vyznačuj úci sa t ý m, že sa podáva čistená bielkovina podľa nároku 15 alebo kapsid podlá nároku 15 alebo častica, podobná vírusu a získaná spôsobom podľa nároku 15.
- 19. Spôsob vyvolania odpovede imunitného systému u živočícha, vyznačujúci sa tým, že sa živočíchom podáva bielkovina podľa nároku 1.
- 20. Syntetický systém na výrobu bielkoviny podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa tento systém volí zo skupiny transformovaných buniek hmyzu, transformovaných buniek kvasiniek, transformovaných bakteriálnych buniek, transformovaných hubových buniek, transformovaných rastlinných buniek a transformovaných živočíšnych buniek.
- 21. Syntetický systém podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sa transformované bunky kvasiniek volia zo skupiny Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis a Schizosaccharomyces pombe.
- 22. Syntetický systém podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že sa transformované bunky kvasiniek Saccharomyces cerevisiae volia zo skupiny, tvorenej kmeňmi 2150-2-3, U9, 1372, 1372-ura3, 1372-his3, 1558, 1524, 1537, 1541, 1582 a 1569.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24279494A | 1994-05-16 | 1994-05-16 | |
| PCT/US1995/006006 WO1995031532A1 (en) | 1994-05-16 | 1995-05-15 | Papillomavirus vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK147696A3 true SK147696A3 (en) | 1997-08-06 |
Family
ID=22916213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1476-96A SK147696A3 (en) | 1994-05-16 | 1995-05-15 | Isolated and purified protein of papillomavirus, a capside, a viral particle, pharmaceutical composition comprising its, a method of making them and their use |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0757717B1 (sk) |
| JP (1) | JP3863559B2 (sk) |
| CN (1) | CN1152935A (sk) |
| AT (1) | ATE328068T1 (sk) |
| AU (1) | AU693203B2 (sk) |
| BG (1) | BG100974A (sk) |
| BR (1) | BR9507657A (sk) |
| CA (1) | CA2189882C (sk) |
| CZ (1) | CZ336696A3 (sk) |
| DE (1) | DE69535018T2 (sk) |
| DK (1) | DK0757717T3 (sk) |
| ES (1) | ES2264126T3 (sk) |
| FI (1) | FI119815B (sk) |
| HU (1) | HUT76354A (sk) |
| MX (1) | MXPA96005662A (sk) |
| NO (1) | NO322133B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ285941A (sk) |
| PL (1) | PL183781B1 (sk) |
| PT (1) | PT757717E (sk) |
| RO (1) | RO117541B1 (sk) |
| RU (1) | RU2206608C2 (sk) |
| SI (1) | SI0757717T1 (sk) |
| SK (1) | SK147696A3 (sk) |
| WO (1) | WO1995031532A1 (sk) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6153201A (en) * | 1993-03-09 | 2000-11-28 | University Of Rochester | Oral immunization with papillomavirus virus-like particles |
| BR9509076A (pt) * | 1994-09-22 | 1998-07-14 | Merck & Co Inc | Molécula de dna isolada e purificada vetor de expressão proteína anticorpo monoespecífico composto composição farmacêutica vacina e processos para expressar preteina de papilomavírus humano tipo 6a para identificar compostos e para induzir respostas imunes contra infecção ou doença provocada por papilomavírus humano |
| AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
| GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| PT1105466E (pt) | 1998-08-14 | 2006-07-31 | Merck & Co Inc | Processo para a purificacao de particulas tipo virus do papilomavirus humano |
| DE69935606T9 (de) | 1998-10-16 | 2021-03-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Adjuvanzsysteme und impfstoffe |
| AUPP765398A0 (en) * | 1998-12-11 | 1999-01-14 | University Of Queensland, The | Treatment of papillomavirus infections |
| AU764138B2 (en) * | 1999-02-05 | 2003-08-14 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Human papilloma virus vaccine formulations |
| DE10137102A1 (de) | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| JP2005523722A (ja) | 2002-04-30 | 2005-08-11 | オンコリティクス バイオテック， インコーポレイティッド | 改善されたウイルス精製方法 |
| US7858098B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-28 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccine |
| MY140664A (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
| NZ588616A (en) | 2004-09-30 | 2012-05-25 | Bayer Healthcare Llc | An apparatus for separating a protein of interest comprising a purification system integrated with a particle removal system |
| US7901921B2 (en) | 2004-10-22 | 2011-03-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Viral purification methods |
| HUE032422T2 (en) | 2006-09-29 | 2017-09-28 | Takeda Vaccines Inc | Norovirus vaccine preparations |
| PE20081723A1 (es) * | 2007-01-30 | 2008-12-14 | Transgene Sa | Vacuna contra el papilomavirus |
| AU2008224877B2 (en) * | 2007-03-14 | 2013-07-11 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Virus like particle purification |
| MX2009014246A (es) | 2007-06-26 | 2010-03-31 | Japan Health Science Found | Antigeno de vacuna con la capacidad de inducir anticuerpo de neutralizacion y reaccion cruzada contra virus de papiloma humano del tipo de alto riesgo. |
| US20100266636A1 (en) | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| CA2698397C (en) | 2007-09-18 | 2018-03-27 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| MY162658A (en) * | 2007-11-23 | 2017-06-30 | Shanghai Zerun Biotechnology Co Ltd | Genes encoding major capsid protein l1 of human papilloma virus and use of the same |
| CN104911154A (zh) | 2008-08-08 | 2015-09-16 | 武田疫苗股份有限公司 | 交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒 |
| CN102215861B (zh) * | 2009-06-19 | 2014-10-08 | 艾金株式会社 | 宫颈癌疫苗 |
| CN102234661A (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-09 | 北京生物制品研究所 | 人乳头瘤病毒类病毒颗粒的制备方法和外源蛋白表达盒、表达系统 |
| AU2011336410B2 (en) | 2010-12-02 | 2015-01-22 | Oncolytics Biotech Inc. | Lyophilized viral formulations |
| SG190418A1 (en) | 2010-12-02 | 2013-07-31 | Oncolytics Biotech Inc | Liquid viral formulations |
| RU2445358C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18 |
| RU2445357C1 (ru) * | 2011-02-15 | 2012-03-20 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16 |
| KR102151890B1 (ko) * | 2011-04-29 | 2020-09-03 | 온콜리틱스 바이오테크 인코포레이티드 | 겔 침투 크로마토그래피를 이용한 바이러스의 정제방법 |
| JP6208659B2 (ja) | 2011-07-11 | 2017-10-04 | タケダ ワクチン，インコーポレイテッド | 非経口ノロウイルスワクチン製剤 |
| BR112014012491A2 (pt) * | 2011-12-01 | 2017-06-06 | Univ Cape Town | partícula tipo vírus, método para produzir uma partícula tipo vírus, método para impedir ou tratar a infecção pelo hpv ou câncer cervical em um indivíduo, uso de uma partícula tipo vírus, e, composição farmacêutica |
| CN103215302B (zh) * | 2012-01-21 | 2019-01-15 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv18 l1蛋白的方法 |
| CN103361377B (zh) * | 2012-03-28 | 2017-12-05 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv6 l1蛋白的方法 |
| JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
| CN110484554B (zh) * | 2013-04-26 | 2024-04-16 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv52 l1蛋白的方法 |
| CN110423774A (zh) * | 2013-04-26 | 2019-11-08 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv58 l1蛋白的方法 |
| CN104164374B (zh) * | 2013-05-17 | 2019-10-22 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法 |
| CN104673760B (zh) * | 2013-11-29 | 2018-01-02 | 南京赛威信生物医药有限公司 | 一种原核细胞表达类病毒颗粒的纯化方法 |
| RU2546241C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 |
| RU2546242C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 18 |
| RU2546243C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения |
| RU2546240C1 (ru) * | 2014-02-13 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56 |
| KR101825996B1 (ko) * | 2014-12-26 | 2018-02-09 | 아이진 주식회사 | 인유두종 바이러스의 바이러스 유사 입자 제조방법 |
| US10758606B2 (en) * | 2015-09-04 | 2020-09-01 | Inventprise, Llc | VLP stabilized vaccine compositions |
| RU2676160C1 (ru) * | 2018-02-14 | 2018-12-26 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11 |
| RU2681174C1 (ru) * | 2018-07-12 | 2019-03-04 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Способ получения рекомбинантной вакцины для профилактики папилломавирусной инфекции человека, рекомбинантная вакцина |
| CN116426396B (zh) * | 2023-06-09 | 2023-09-01 | 内蒙古工业大学 | 一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2586428B1 (fr) * | 1985-08-26 | 1988-11-25 | Pasteur Institut | Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus |
| DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
| DK0595935T3 (da) * | 1991-07-19 | 2003-07-21 | Csl Ltd | Papillomavirusvaccine |
| EP1835029A1 (en) * | 1992-06-25 | 2007-09-19 | Georgetown University | Papillomavirus vaccines |
| US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| DE4332596A1 (de) * | 1993-09-24 | 1995-03-30 | Martin Josef Dr Sapp | Monoklonale Antikörper |
| AUPM566794A0 (en) * | 1994-05-17 | 1994-06-09 | University Of Queensland, The | Process and product |
-
1995
- 1995-05-15 JP JP52980895A patent/JP3863559B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 AT AT95919820T patent/ATE328068T1/de active
- 1995-05-15 SI SI9530726T patent/SI0757717T1/sl unknown
- 1995-05-15 HU HU9603155A patent/HUT76354A/hu unknown
- 1995-05-15 EP EP95919820A patent/EP0757717B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 AU AU25495/95A patent/AU693203B2/en not_active Expired
- 1995-05-15 PL PL95317234A patent/PL183781B1/pl unknown
- 1995-05-15 CZ CZ963366A patent/CZ336696A3/cs unknown
- 1995-05-15 BR BR9507657A patent/BR9507657A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-05-15 SK SK1476-96A patent/SK147696A3/sk unknown
- 1995-05-15 PT PT95919820T patent/PT757717E/pt unknown
- 1995-05-15 CA CA002189882A patent/CA2189882C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 WO PCT/US1995/006006 patent/WO1995031532A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-15 CN CN95194158A patent/CN1152935A/zh active Pending
- 1995-05-15 RO RO96-02165A patent/RO117541B1/ro unknown
- 1995-05-15 ES ES95919820T patent/ES2264126T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-15 RU RU96123707/13A patent/RU2206608C2/ru active
- 1995-05-15 DK DK95919820T patent/DK0757717T3/da active
- 1995-05-15 MX MXPA96005662A patent/MXPA96005662A/es active IP Right Grant
- 1995-05-15 DE DE69535018T patent/DE69535018T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 NZ NZ285941A patent/NZ285941A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-11-12 BG BG100974A patent/BG100974A/xx unknown
- 1996-11-15 NO NO19964862A patent/NO322133B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-11-15 FI FI964592A patent/FI119815B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0757717T3 (da) | 2006-09-25 |
| DE69535018T2 (de) | 2007-02-15 |
| AU693203B2 (en) | 1998-06-25 |
| EP0757717B1 (en) | 2006-05-31 |
| PL183781B1 (pl) | 2002-07-31 |
| NO322133B1 (no) | 2006-08-21 |
| CA2189882C (en) | 2005-09-20 |
| CN1152935A (zh) | 1997-06-25 |
| BR9507657A (pt) | 1997-09-09 |
| NO964862D0 (no) | 1996-11-15 |
| NZ285941A (en) | 1998-05-27 |
| NO964862L (no) | 1997-01-16 |
| AU2549595A (en) | 1995-12-05 |
| ES2264126T3 (es) | 2006-12-16 |
| HUT76354A (en) | 1997-08-28 |
| WO1995031532A1 (en) | 1995-11-23 |
| ATE328068T1 (de) | 2006-06-15 |
| EP0757717A4 (en) | 1998-04-15 |
| HU9603155D0 (en) | 1997-01-28 |
| EP0757717A1 (en) | 1997-02-12 |
| JPH10500847A (ja) | 1998-01-27 |
| FI119815B (fi) | 2009-03-31 |
| PT757717E (pt) | 2006-09-29 |
| SI0757717T1 (sl) | 2006-08-31 |
| CA2189882A1 (en) | 1995-11-23 |
| DE69535018D1 (de) | 2006-07-06 |
| CZ336696A3 (en) | 1997-07-16 |
| BG100974A (en) | 1998-04-30 |
| FI964592A0 (fi) | 1996-11-15 |
| JP3863559B2 (ja) | 2006-12-27 |
| PL317234A1 (en) | 1997-03-17 |
| FI964592A (fi) | 1996-11-15 |
| RU2206608C2 (ru) | 2003-06-20 |
| MXPA96005662A (es) | 2004-08-19 |
| RO117541B1 (ro) | 2002-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK147696A3 (en) | Isolated and purified protein of papillomavirus, a capside, a viral particle, pharmaceutical composition comprising its, a method of making them and their use | |
| US6159729A (en) | Synthetic HPV6/11 hybrid L1 DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein | |
| US5821087A (en) | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA | |
| EP0789767B1 (en) | A method for producing purified papillomavirus proteins | |
| US5888516A (en) | Recombinant papillomavirus vaccines | |
| WO1996015247A9 (en) | Purified papillomavirus proteins | |
| CZ293697A3 (cs) | Izolovaná a čištěná molekula DNA, vektor pro expresi a vakcína | |
| RU2494106C2 (ru) | Гены, кодирующие главный капсидный белок l1 вируса папилломы человека, и их применение | |
| CA2204266C (en) | Purified papillomavirus proteins |