DE19840263C1 - Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen - Google Patents
Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten ErkrankungenInfo
- Publication number
- DE19840263C1 DE19840263C1 DE19840263A DE19840263A DE19840263C1 DE 19840263 C1 DE19840263 C1 DE 19840263C1 DE 19840263 A DE19840263 A DE 19840263A DE 19840263 A DE19840263 A DE 19840263A DE 19840263 C1 DE19840263 C1 DE 19840263C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- dna
- protein
- virus
- papilloma virus
- genome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 title claims abstract description 58
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 6
- 208000034179 Neoplasms, Glandular and Epithelial Diseases 0.000 claims description 5
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 claims description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 4
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 claims description 3
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 78
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710112324 Glutathione S-transferase L1 Proteins 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000010106 skin squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft eine DNA, die für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins bzw. ein Papillomvirus-Genom codiert. Des Weiteren betrifft die Erfindung durch das Papillomvirus-Genom codierte Proteine und gegen sie gerichtete Antikörper sowie deren Verwendung in Diagnose, Therapie und Vakzinierung.
Description
Die Erfindung betrifft eine DNA, die für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcap
sid-Proteins bzw. ein Papillomvirus-Genom codiert. Desweiteren betrifft die
Erfindung durch das Papillomvirus-Genom codierte Proteine und gegen sie
gerichtete Antikörper sowie deren Verwendung in Diagnose, Therapie und
Vakzinierung.
Es ist bekannt, daß Papillomviren das Epithelgewebe von Mensch und Tier
infizieren. Human-Papillomviren (nachstehend mit HP-Viren bezeichnet) finden
sich in benignen, z. B. Warzen, Kondylome im Genitalbereich, und malignen, z. B.
Karzinome der Haut und der Gebärmutter, epithelialen Neoplasmen (vgl. zur
Hausen, H., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1288, (1996), Seiten 55-78).
Auch werden HP-Viren für die Entwicklung maligner Tumoren im Oropharyn
gealbereich in Betracht gezogen (vgl. zur Hausen, H., Curr. Top. Microbiol.
Immunol. 78, (1977), Seiten 1-30).
Papillomviren weisen ein ikosaedrisches Capsid ohne Hülle auf, in dem ein
zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Molekül von etwa 7900 bp vorliegt. Das
Capsid umfaßt ein Hauptcapsid-Protein (L1) und ein Nebencapsid-Protein (L2).
Beide Proteine, coexprimiert oder L1 alleine exprimiert, führen in vitro zur Aus
bildung von Virusähnlichen Partikeln (vgl. Kirnbauer, R. et al., Journal of Virolo
gy, (1993), Seiten 6929-6936).
Papillomviren lassen sich nicht in Monolayer-Zellkultur vermehren. Ihre Charak
terisierung ist daher äußerst schwierig, wobei bereits der Nachweis von Papil
lomviren erhebliche Probleme schafft. Dies trifft insbesondere für Papillomviren
in Karzinomen der Haut zu.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem Papillomviren, insbesondere in Karzinomen der Haut, nach
gewiesen werden können. Ferner sollte ein Mittel bereitgestellt werden, um
gegen diese Papillomviren therapeutisch vorgehen zu können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den
Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine für ein Peptid eines Papillomvirus-
Hauptcapsid-Proteins (L1) codierende DNA, wobei das Peptid die Aminosäu
resequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6 oder eine davon
durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz
umfaßt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein Peptid eines Papillomvirus-
Hauptcapsid-Proteins codierende DNA, wobei die DNA die Basensequenz von
Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6 oder eine davon durch ein oder
mehrere Basenpaare unterschiedliche Basensequenz umfaßt.
Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz
einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA
wurde als Plasmid DL416 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorga
nismen und Zellkulturen) unter DSM 12309 am 14. Juli 1998 hinterlegt.
Fig. 2 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz
einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA
wurde als Plasmid DL428 bei der DSM unter DSM 12310 am 14. Juli 1998
hinterlegt.
Fig. 3 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz
einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA
wurde als Plasmid DL436 bei der DSM unter DSM 12311 am 14. Juli 1998
hinterlegt.
Fig. 4 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz
einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA
wurde als Plasmid DL473 bei der DSM unter DSM 12312 am 14. Juli 1998
hinterlegt.
Fig. 5 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz
einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA
wurde als Plasmid KG80 bei der DSM unter DSM 12313 am 14. Juli 1998
hinterlegt.
Fig. 6 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz
einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA
wurde als Plasmid TN111 bei der DSM unter DSM 12314 am 14. Juli 1998
hinterlegt.
Vorstehende DNA wurde mit der DNA bekannter Papillomviren verglichen. Es
wurden Sequenzhomologie-Studien durchgeführt. Eine Homologie, die weniger
als 90% beträgt, weist eine erfindungsgemäße DNA als neues HP-Virus aus.
Die erfindungsgemäßen DNAs weisen zu bekannten Papillomviren folgende
Sequenzhomologien auf:
DNA von Fig. 1: 78% zu HP-Virus 61
DNA von Fig. 2: 91% zu HP-Virus 9 (DL 428)
DNA von Fig. 3: 77% zu HP-Virus 17
DNA von Fig. 4: 80% zu HP-Virus 15
DNA von Fig. 5: 77% zu HP-Virus 12
DNA von Fig. 6: 81% zu HP-Virus 12
DNA von Fig. 2: 91% zu HP-Virus 9 (DL 428)
DNA von Fig. 3: 77% zu HP-Virus 17
DNA von Fig. 4: 80% zu HP-Virus 15
DNA von Fig. 5: 77% zu HP-Virus 12
DNA von Fig. 6: 81% zu HP-Virus 12
Bezüglich der DNA von Fig. 2 muß angemerkt werden, daß hier nur ein Teil des
offenen Leserasters betrachtet wurde und dieser sich in einer höchstkonservier
ten Region befindet. Legt man die obige Definition, die sich auf das gesamte L1-
Leseraster bezieht, zugrunde, ist auch hier eine Gesamthomologie von weniger
als 90% zu erwarten.
Erfindungsgemäß kann vorstehende DNA in einem Vektor bzw. Expressions
vektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines
Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEM-T
und pGEX-2T. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nen
nen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEF-BOS, cDM8
und pCEV4, anzugeben sind.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um vorstehende, in einem Expressions
vektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die
E. coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109 und XL1-Blue, den Hefe-
Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NH-3T3, FM3A,
CHO, COS, Vero, und Hela.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise vorstehende DNA in einen Expressions
vektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß vorstehende DNA in
Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA
inseriert werden kann, so daß vorstehende DNA in Form eines Fusionsproteins
exprimiert werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Papillomvirus-Genom, das vor
stehende DNA umfaßt. Der Ausdruck "Papillomvirus-Genom" umfaßt auch ein
unvollständiges Genom, d. h. Fragmente eines Papillomvirus-Genoms, die vor
stehende DNA umfassen. Dies kann z. B. eine für L1 codierende DNA oder ein
Teil davon sein.
Zur Bereitstellung vorstehenden Papillomvirus-Genoms kann ein übliches Ver
fahren verwendet werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Verfahrens
schritte umfaßt:
- a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplasmas,
- b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit vorstehender DNA, wodurch ein in der Gesamt-DNA von (a) enthaltenes Papillomvirus-Genom nach gewiesen wird, und
- c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von in einem Vektor, und gegebenenfalls Subklonierung des erhaltenen Klons, wobei sämtliche Verfahrensschritte üblicher DNA-Rekombination stechnik entstammen.
Hinsichtlich der Isolierung, Hybridisierung und Klonierung von Zell-DNA wird
ergänzend auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite
Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) verwiesen.
Der Ausdruck "epitheliales Neoplasma" umfaßt jegliche Neoplasmen des Epithel
gewebes bei Mensch und Tier. Beispiele solcher Neoplasmen sind Warzen,
Kondylome im Genitalbereich und Karzinome der (Schleim)haut. Letztere werden
vorliegend bevorzugt verwendet, um vorstehendes Papillomvirus-Genom zu
isolieren.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jegliche zur Klonierung von chromosomaler bzw.
extrachromosomaler DNA geeignete Vektoren. Beispiele solcher Vektoren sind
Cosmide, wie pWE15 und Super Cos1, und Phagen, wie λ-Phagen, z. B. λZAP
Expressvector, λZAPII Vector und λgt10 Vektor. Vorliegend werden λ-Phagen
bevorzugt verwendet. Vorstehende Vektoren sind bekannt und bei der Firma
Stratagene erhältlich.
Erfindungsgemäße Papillomvirus-Genome können integriert in chromosomaler
DNA oder extrachromosomal vorliegen. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt,
dies abzuklären. Auch weiß er um Verfahren, die zur Klonierung der Papillomvi
rus-Genome optimalen Restriktionsenzyme herauszufinden. Er wird sich an
Genomen bekannter Papillomviren orientieren. Insbesondere wird der Fachmann
die vorstehend genannten HP-Viren entsprechend beachten.
Beispielhaft wird die Bereitstellung eines mit DL473-G bezeichneten Papillomvi
rus-Genoms beschrieben. Hierzu wird die Gesamt-DNA aus einer Biopsie eines
plattenepithelialen Karzinoms isoliert, mit BamHI gespalten und in einem Agaro
segel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Agarosegel wird danach einem Blotting-
Verfahren unterzogen, wodurch die DNA auf eine Nitrozellulosemembran über
tragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt, in dem die
DNA von Fig. 4, ggfs. in Kombination mit einer DNA von HP-Virus 15 als mar
kierte Probe verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit der in der Gesamt-
DNA vorliegenden Papillomvirus-DNA erhalten.
Im weiteren wird vorstehende mit BamHI gespaltene Gesamt-DNA in einem, λ-
Phagen kloniert. Die entsprechenden Klone, d. h. die die Papillomvirus-DNA
enthaltenden Klone, werden durch Hybridisierung mit der DNA von Fig. 4, ggfs.
in Kombination mit einer DNA des HP-Virus 15 identifiziert. Das Insert dieser
Klone wird dann einer weiteren Klonierung in einem Plasmid-Vektor unterzogen,
wodurch ein Klon erhalten wird, der das Papillomvirus-Genom DL473-G enthält.
Das Genom wird durch Sequenzierung bestätigt.
In analoger Weise werden weitere Papillomvirus-Genome bereitgestellt. Sie
werden entsprechend der zu ihrer Bereitstellung verwendeten DNAs bezeichnet,
mit: DL416-G, DL428-G, DL436-G, KG80-G bzw. TN111-G.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, das durch vorstehendes
Papillomvirus-Genom codiert wird. Ein solches Protein ist z. B. ein Hauptcapsid-
Protein (L1) oder ein Nebencapsidprotein (L2). Die Herstellung eines vorstehen
den Proteins erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird die Herstellung von L1
bzw. L2 des Papillomvirus-Genoms DL473-G beschrieben. Hierzu wird das zu
der DNA von Fig. 4 verwandte HP-Virus 15 herangezogen. Von diesem ist die
vollständige Sequenz und die Lage einzelner für Proteine codierender DNA-
Bereiche bekannt. Durch parallele Restriktionsspaltungen beider Genome und
anschließender Hybridisierung mit verschiedenen, die L1 bzw. L2 codierende
DNA betreffenden Fragmenten werden diese DNAs auf dem Papillomvirus-
Genom DL473-G identifiziert. Sie werden durch Sequenzierung bestätigt. Die für
L1 codierende DNA wird mit DL473-G-L1-DNA und die für L2 codierende DNA
mit DL473-G-L2-DNA bezeichnet.
Im weiteren wird die für L1 bzw. L2 codierende DNA in einen Expressionsvektor
inseriert. Beispiele eines solchen für E. coli, Hefe und tierische Zellen sind
vorstehend genannt. Insbesondere wird für die Expression in E. coli auf den
Vektor pGEX-2T verwiesen (vgl. Kirnbauer, R, et al., supra). Nach Insertion der
DL473-G-L1- bzw. DL473-G-L2-DNA wird pGEX-2T-DL473-G-L1 bzw. pGEX-2T-
DL473-G-L2 erhalten. Diese Expressionsvektoren exprimieren nach Transforma
tion von E. coli ein Glutathion S-Transferase-L1- bzw. Glutathion S-Transferase-
L2-Fusionsprotein. Die Reinigung dieser Proteine erfolgt in üblicher Weise.
Für eine weitere Expression vorstehender L1 bzw. L2 codierender DNA wird das
Bacculovirus- bzw. Vacciniavirus-System genannt. Hierfür verwendbare Ex
pressionsvektoren sind z. B. pEV mod. und pSynwtVI- für das Bacculovirus-
System (vgl. Kirnbauer, R. et al., supra). Für das Vacciniavirus-System sind
insbesondere Vektoren mit dem Vacciniavirus "early" (p7.5k)- bzw.
"late"(Psynth, p11K)-Promotor zu nennen (vgl. Hagensee, M., E. et al., Journal
of Virology (1993), Seiten 315-322). Vorliegend wird das Bacculovirus-System
bevorzugt. Nach Insertion vorstehender L1 bzw. L2 codierender DNA in pEV
mod. wird pEVmod.-DL473-G-L1 bzw. pEVmod.-DL473-G-L2 erhalten.
Der erstere Expressionsvektor alleine bzw. beide Expressionsvektoren zusammen
führen nach Infektion von SF-9 Insektenzellen zur Ausbildung von Virusähn
lichen Partikeln. Im ersteren Fall umfaßt ein solches Partikel ein L1-Protein,
während es im letzteren Fall neben einem L1- auch ein L2-Protein enthält.
Ein Virus-ähnliches Partikel letzteren Falls wird auch erhalten, indem die vor
stehenden DL473-G-L1- und DL473-G-L2-DNAs gemeinsam in den Expressions
vektor pSynwtVI- inseriert werden und das erhaltene pSynwtVI-DL473-G-L1/L2
zur Infektion von SF-9 Insektenzellen verwendet wird. Die Reinigung vorstehen
der Virus-ähnlicher Partikel erfolgt in üblicher Weise. Sie stellen auch einen
Gegenstand der Erfindung dar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein
bzw. Virus-ähnliches Partikel gerichteter Antikörper. Die Herstellung eines
solchen erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird es für die Herstellung eines
Antikörpers beschrieben, der gegen ein L1 von DL473-G umfassendes Virus
ähnliches Partikel gerichtet ist. Hierzu wird das Virus-ähnliche Partikel BALB/c-
Mäusen subcutan injiziert. Diese Injektion wird im Abstand von jeweils 3 Wo
chen wiederholt. Etwa 2 Wochen nach der letzten Injektion wird das den Anti
körper enthaltende Serum isoliert und in üblicher Weise getestet.
In bevorzugter Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
Zu seiner Herstellung werden nach vorstehender vierten Injektion den Mäusen
Milzzellen entnommen und diese in üblicher Weise mit Myelomzellen fusioniert.
Die weitere Klonierung erfolgt ebenso nach bekannten Verfahren.
Mit der vorliegenden Erfindung wird es ermöglicht, Papillomviren, insbesondere
in Karzinomen der Haut, nachzuweisen. Hierzu kann die erfindungsgemäße DNA
als solche oder von einer weiteren DNA umfaßt eingesetzt werden. Letztere
kann auch ein Papillomvirus-Gom oder ein Teil davon sein.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Bereitstellung von bisher nicht
gekannten Papillomviren. Diese finden sich insbesondere in Karzinomen der
Haut. Desweiteren liefert die Erfindung Proteine und Virus-ähnliche Partikel, die
auf diese Papillomviren zurückgehen. Darüberhinaus werden Antikörper bereitge
stellt, die gegen diese Proteine bzw. Partikel gerichtet sind.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es also, diagnostische und therapeutische
Maßnahmen bei Papillomvirus-Erkrankungen zu ergreifen. Darüberhinaus liefert
sie die Möglichkeit, eine Vakzine gegen Papillomvirus-Infektionen aufzubauen.
Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Durchbruch auf dem Gebiet der
Papillomvirus-Forschung dar.
Die Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.
Aus einer Biopsie eines Plattenepithelkarzinoms der Haut wird die
Gesamt-DNA isoliert. 10 µg dieser DNA werden mit dem Restrik
tionsenzym BamHI gespalten und in einem 0,5% Agarosegel
elektrophoretisch aufgetrennt. Gleichzeitig werden auch 10 µg
vorstehender DNA aufgetrennt, die nicht gespalten worden ist. Das
Agarosegel wird einem Blotting-Verfahren unterzogen, wodurch die
DNA aus dem Agarosegel auf eine Nitrozellulosemembran über
tragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt,
in dem die vorstehende DNA von Fig. 4 in Kombination mit HP-
Virus-15 DNA als p32-markierte Probe verwendet wird. Es wird eine
Hybridisierung mit der geblotteten DNA erhalten.
Vorstehende Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der
DNA-Rekombinationstechnik bekannt. Ergänzend wird auf Sam
brook et al., supra verwiesen.
Die aus Beispiel 1 erhaltene Biopsie-DNA wird mit dem Restrik
tionsenzym BamHI gespalten. Die erhaltenen Fragmente werden in
eine Ligasereaktion eingesetzt, in der ebenfalls der mit BamHI
gespaltene und dephosphorylierte Vektor λZAP Express vorliegt.
Die hierbei erhaltenen rekombinanten DNA-Moleküle werden in
Bakteriophagen verpackt und diese zur Infektion von Bakterien
verwendet. Für diese Verfahrensschritte wird der von der Firma
Stratagene angebotene ZAP Express Vektor Kit verwendet. Die
erhaltenen Phagenplaques werden dann einem Hybridisierungsver
fahren unterzogen, in dem die in Beispiel 1 verwendete p32-markier
te DNA von Fig. 4 in Kombination mit p32-markierter HP-Virus-15-
DNA verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit entsprechen
den Phagenplaques erhalten. Aus diesen werden die BamHI-Frag
mente von DL473-G isoliert und zusammen mit einem BamHI-ge
spaltenen, dephosphorylierten Plasmid-Vektor, pBluescript, in eine
weitere Ligasereaktion eingesetzt. Die erhaltenen rekombinanten
DNA-Moleküle werden zur Transformation von Bakterien, E. coli
XL1-Blue, verwendet. Durch Restriktionsspaltungen bzw. Hybri
disierung mit vorstehenden DNA-Proben wird ein das Papillomvirus-
Genom DL473-G enthaltender Bakterienklon identifiziert. Das Plas
mid dieses Bakterienklons wird mit pBlue-DL473-G bezeichnet.
Claims (12)
1. DNA, codierend für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins,
wobei das Peptid die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig.
4, Fig. 5 oder Fig. 6, wobei die Fig. 1-6 Bestandteil dieses An
spruchs sind, oder eine davon durch ein oder mehrere Aminosäuren unter
schiedliche Aminosäuresequenz umfaßt, und wobei die DNA durch folgen
de Verfahrensschritte erhältlich ist:
- a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplas mas,
- b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit einer DNA von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wodurch ein in der Ge samt-DNA von (a) enthaltenes Papillomvirus-Genom nachgewiesen wird, und
- c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor sowie Sequenzierung des Klons, und
2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptid
des Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins codierende DNA die Basensequenz
von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wobei die Fig. 1-
6 Bestandteil dieses Anspruchs sind, oder eine davon durch ein oder
mehrere Basenpaare unterschiedliche Basensequenz umfaßt, und wobei
die DNA durch folgende Verfahrensschritte erhältlich ist:
- a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplas mas,
- b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit einer DNA von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wodurch ein in der Ge samt-DNA von (a) enthaltendes Papillomvirus-Genom nachgewie sen wird, und
- c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor sowie Sequenzierung des Klons, und
3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA ein
Papillomvirus-Genom umfaßt.
4. Protein, codiert durch das Papillomvirus-Genom nach Anspruch 3.
5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomvirus-
Hauptcapsid-Protein als Virus-ähnliches Partikel vorliegt.
6. Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus-ähnliche
Partikel auch ein Papillomvirus-Nebencapsid-Protein enthält.
7. Expressionsvektor, umfassend eine für das Protein nach Anspruch 4
codierende DNA.
8. Transformante, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 7.
9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 4, umfassend die
Kultivierung der Transformante nach Anspruch 8 unter geeigneten Bedin
gungen.
10. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach einem der Ansprüche 4-6.
11. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-3 als Reagens zur
Diagnose von Papillomvirus-Infektionen bzw. -Erkrankungen.
12. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 4-6 als Reagens zur
Diagnose, Therapie und/oder Vakzinierung von bzw. bei Papillomvirus-
Infektionen bzw. -Erkrankungen.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19840263A DE19840263C1 (de) | 1998-09-03 | 1998-09-03 | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
| US09/786,454 US6589532B1 (en) | 1998-09-03 | 1999-09-01 | Papilloma viruses, means for the detection thereof and therapy for diseases caused thereby |
| EP99968672A EP1109893A2 (de) | 1998-09-03 | 1999-09-01 | Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen |
| PCT/DE1999/002824 WO2000014112A2 (de) | 1998-09-03 | 1999-09-01 | Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19840263A DE19840263C1 (de) | 1998-09-03 | 1998-09-03 | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19840263C1 true DE19840263C1 (de) | 2000-05-25 |
Family
ID=7879737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19840263A Expired - Fee Related DE19840263C1 (de) | 1998-09-03 | 1998-09-03 | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6589532B1 (de) |
| EP (1) | EP1109893A2 (de) |
| DE (1) | DE19840263C1 (de) |
| WO (1) | WO2000014112A2 (de) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5057823B2 (ja) * | 2007-03-31 | 2012-10-24 | テイ・エス テック株式会社 | ヘッドレスト及び該ヘッドレストを備えた車両用シート |
| JP6153866B2 (ja) | 2010-05-25 | 2017-06-28 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． | 迅速なハイブリッド捕捉アッセイ、及び関連する戦略的に切断されたプローブ |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4415743C2 (de) * | 1994-05-04 | 1996-10-10 | Deutsches Krebsforsch | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
| IL117591A0 (en) | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
| DE19735118C1 (de) * | 1997-08-13 | 1998-08-13 | Deutsches Krebsforsch | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen |
-
1998
- 1998-09-03 DE DE19840263A patent/DE19840263C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-09-01 US US09/786,454 patent/US6589532B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-01 WO PCT/DE1999/002824 patent/WO2000014112A2/de not_active Application Discontinuation
- 1999-09-01 EP EP99968672A patent/EP1109893A2/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Virology S.6929-6936, 1993 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1109893A2 (de) | 2001-06-27 |
| US6589532B1 (en) | 2003-07-08 |
| WO2000014112A2 (de) | 2000-03-16 |
| WO2000014112A3 (de) | 2000-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0809700B1 (de) | Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung | |
| DE69532532T2 (de) | Chimerische papillomavirus-ahnliche partikel | |
| DE69434383T2 (de) | Herstellung von menschlichem papillomavirus hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen | |
| DE68922336T2 (de) | Sonden für Papilloma-Virus (HPV49, HPV50, HPV54, HPV55), zu diesem Papilloma-Virus genetisch und immunologisch verwandte Produkte und in vitro Methoden zur Diagnose von Papilloma-Virusinfektionen und Herstellung von Antikörpern gegen diese Papilloma-Viren. | |
| DE69104380T2 (de) | Vom genom des papillomavirus-hpv-39 abgeleitete dns-sequenzen, deren anwendung in der in vitro-diagnose und zur herstellung einer immunogenenzusammensetzung. | |
| DE69531308T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von gereinigten papillomavirus Proteinen | |
| DE4415743C2 (de) | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen | |
| DE19526386C1 (de) | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen | |
| DE19648962C1 (de) | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen | |
| DE69933875T2 (de) | Protein-verabreichungssystem, das dem menschlichen papillomavirus ähnliche partikel benützt. | |
| DE19735118C1 (de) | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen | |
| DE19712541C1 (de) | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen | |
| DE19840263C1 (de) | Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen | |
| DE69130562T2 (de) | Verbesserung in zusammenhang mit dem nachweis von viren | |
| DE4447664C2 (de) | Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung | |
| DE69528578T2 (de) | Verändertes l2-protein des papillomavirus und damit gestellte viroide | |
| DE10059631A1 (de) | T-Zellepitope des Papillomavirus L1-und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie | |
| DE19526752C2 (de) | Hocheffiziente Bildung von Papillomavirusähnlichen Partikeln | |
| DE19649606C1 (de) | Systeme zur Bestimmung von Wirksubstanzen gegen HPV-assoziierte Karzinome | |
| WO2002055542A2 (de) | Hpv-spezifische peptide, die die bindung von hpv an die wirtszelle blockieren | |
| DE19905883C2 (de) | Chimäre Virus-ähnliche Partikel bzw. chimäre Capsomere von BPV | |
| FR2656627A1 (fr) | Sonde a papillomavirus (hvpv63), notamment pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus, pouvant s'accompagner de neoplasies genitales, et produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus. | |
| DE29824556U1 (de) | Formulierung mit Papillomavirus-spezifischem Protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of patent without earlier publication of application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |