PL183299B1

PL183299B1 - Izolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11, wektor ekspresyjny obejmujący tę cząsteczkę i kompozycja

Info

Publication number: PL183299B1
Application number: PL96322588A
Authority: PL
Inventors: Kathryn J. Hofmann; Kathrin U. Jansen; Michael P. Neeper; Joseph G. Joyce; Hugh A. George; Dale E. Lehman
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2002-06-28
Also published as: PL322588A1; CN1154732C; DE69629556D1; EP0817852A2; NO320086B1; AU708111B2; EP0817852B1; ES2203691T3; CZ291375B6; ZA962526B; CZ309197A3; KR100441477B1; HU228490B1; JPH11503313A; US6159729A; SK283998B6; WO1996030520A2; PT817852E; EA199700281A1; IL117591A0

Abstract

1. Izolowana i oczyszczona czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko L1 ludz- kiego wirusa brodawczaków typu 1 1 o sekwencji pokazanej na figurze 8 albo jej funkcjonalna pochodna, wolna, od wewnetrznych sygnalów przerywajacych transkrypcje rozpoznawanych przez drozdze. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana i oczyszczona cząsteczek kwasu nukleinowego kodująca białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę izolowaną i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja obejmująca cząsteczkę izolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11.

Różne wykonania wynalazku obejmują, choć nie są ograniczone do rekombinowanych cząsteczek DNA HPV, RNA komplementarnego do rekombinowanych cząsteczek DNA HPV, białek kodowanych przez rekombinowane cząsteczki DNA, przeciwciał przeciwko rekombinowanym cząsteczkowym DNA i pokrewnym białkom, kompozycji obejmujących DNA, RNA, białka albo przeciwciała, sposobów zastosowania DNA, RNA, białek albo przeciwciał, jak również ich pochodnych. Pochodne takie obejmują, choć nie sąograniczone do peptydów i białek kodowanych przez DNA, przeciwciał przeciwko DNA albo przeciwciał wobec białek kodowanych przez DNA, szczepionek obejmujących DNA albo szczepionek obejmujących białka kodowane

183 299 przez DNA, kompozycji immunologicznych obejmujących DNA albo białka kodowane przez DNA, zestawów zawierających DNA albo RNA pochodzące z DNA albo białka kodowane przez DNA.

HPV6 i HPV11 są przyczyną~90% łagodnych brodawek genitalnych i tylko wyjątkowo wiążą się ze zmianami złośliwymi (Gissmann i in., PNAS 80,560-563). Liczba przyjęć z powodu brodawek genitalnych (kłykcin kończystych albo płaskich) rośnie w ostatnich czasach. Ocenia się, że ~ 10%o populacji ogólnej (w wieku 15-49 lat) cierpi na zakażenia układu płciowego HPV (Koutsky i in., 1988, Epidemiol. Rev. 10,122-163). Podczas gdy większość kłykcin związanych jest z HPV6, w przypadku brodowczakowatości krtani dominującym typem jest HPV 11. Replikacja HPV 11 w komórkach nabłonkowych układu oddechowego stymuluje te komórki do proliferacji, co może prowadzić do ograniczonych zmian o małym znaczeniu klinicznym albo do licznych rozsianych zmian i choroby nawrotowej. Nawracająca brodawczakowatość układu oddechowego, choroba częściej dotykająca populację młodszą, może być chorobą zagrażającą życiu powodując zamknięcie dróg oddechowych. Ostatnio, opracowano model zwierzęcy umożliwiający replikację zakaźnego HPV11 (Kreider i in., 1985, Nature 317,639-640; Kreider i in., 1987, J. Virol. 61,590-593). Model umożliwił identyfikację konformacyjnych epitopów neutralizująych natywnych wirionów i VLP ekspresjonowanych w bakulowirusie przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (Christiansen i in., 1990, j. Viro. 64, 5678-5681; Christiansen i Kreider 1991, Virus Res. 21169-179; Christiansen i Kreider 1993, Virus Res. 28,195-202; Christiansen i in., 1994, 75, 2271-2276).

Opracowanie i komercjalizacja szczepionek profilaktycznych i terapeutycznych przeciwko zakażeniom i chorobom wywołanym przez PV, zawierających białko L1, białko L1+L2 albo zmodyfikowane białka L1 albo L1+L2 uniemożliwiane było przez brak dużych ilości oczyszczonego wirusa i oczyszczonego białka. Ponieważ PV jest trudny do hodowania in vitro, trudne jest wytworzenie potrzebnych ilości białka L1i L2 przez namnożenie PV in vitro. Powstałe problemy ze źródłem utrudniają charakterystykę PV i białek PV. Przydatne byłoby zatem opracowanie łatwo odnawialnego źródła surowych białek PV, zwłaszcza białek L1i L2 PV albo zmodyfikowanych białek LI i L2. Powinno być również przydatne opracowanie sposobów oczyszczania dużych ilości surowych białek wirusa brodawczaków, o poziomie czystości odpowiednim do badań immunologicznych i opracowania szczepionki. Powinno być również przydatne wytworzenie znanych ilości białek wirusa brodawczaków wykazujących właściwości zapewniające odporność białek natywnych, takie jak konformacja białka natywnego. Oprócz tego, powinno być przydatne opracowanie sposobów analizowania białek PV i sposobów określania względnej czystości białek, jak również kompozycji zawierających białka. Takie wysoko oczyszczone białka powinny być również przydatne do wytwarzania różnych reagentów przydatnych w badaniu zakażeń PV; reagenty takie obejmują, choć nie sąograniczone do przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał monoklonalnych i wzorców analitycznych.

Cząsteczki wiroidalne zawierające białko L1 HPV 11 ekspresjonowano w układach komórek owadzich jak i komórek ssaków. Ekspresja VLP w komórkach drożdży posiada takie zalety jak efektywność nakładów i łatwą adaptację do hodowli na wielkąskalę w fermentorach. Jednakże, białko L1 HPV11 ulega słabej ekspresji w komórkach drożdży. Jest to jak zaobserwowano, wynikiem okrawania mRNA L1 HPV11. W przeciwieństwie, gen L1 HPV6 ulega transkrypcji jako mRNA pełnej długości i jest ekspresjonowany w znacznych ilościach. Przez modyfikowanie DNA L1 HPV6 w taki sposób, że koduje on białko L1 HPV 11, możliwe jest ułatwienie transkrypcji mRNA pełnej długości powodujące zwiększenie ekspresji białka L1 HPV11. Niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji genu hybrydowego L1 HPV 6/11, jak również sposobu konstruowania hybrydowego genu L1 HPV6/11 przy użyciu oligonukleotydów syntetycznych. Gen hybrydowy został zaprojektowany przy użyciu sekwencji L1 HPB6a (Hofman i in., 1995, Virology, przyjęte do publikacji), ale zawierał minimalną liczbę zmienionych zasad, niezbędną do kodowania białka L1 HPV11. W przeciwieństwie do genu L1 HPV11 typu dzikiego, gen hybrydowy HPV 6/11 nie zawierał rozpoznawanych przez drożdże wewnętrznych sygnałów przerywających

183 299 transkrypcję; w wyniku tego tworzony był mRNA HPV6/11 pełnej długości i zwiększona była ekspresja białka L1 HPV 11.

Kompozycje przydatne farmaceutycznie, obejmujące DNA albo białka kodowane przez DNA mogą być wytwarzane według znanych metod, takich jak mieszanie z nośnikami dopuszczalnymi farmaceutycznie. Przykłady takich nośników oraz sposobów wytwarzania można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences. Kompozycja dopuszczalna farmaceutycznie, odpowiednia do skutecznego podawania powinna zawierać skuteczną ilość białka albo VLP. Kompozycja taka może zawierać białko albo VLP pochodzące z więcej niżjednego typu HPV.

Kompozycje terapeutyczne albo diagnostyczne według wynalazku są podawane osobnikowi w ilościach odpowiednich do leczenia albo diagnozowania zakażeń PV. Skuteczna ilość może być różna w zależności od różnych czynników takich jak stan ogólny osobnika, ciężar ciała, płeć i wiek. Inne czynniki obejmująsposób podawania. Ogólnie, kompozycje można podawać w dawkach zawierających się od około 1 pg do około 1 mg.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczone osobnikowi różnymi drogami takimi jak podskórna, miejscowa, doustna, śluzówkowa, dożylna i domięśniowa.

Szczepionki według wynalazku obejmują DNA, RNA albo białka kodowane przez DNA, które zawierają determinanty antygenowe konieczne do wywołania tworzenia się przeciwciał neutralizujących w organizmie gospodarza. Szczepionki takie są również wystarczająco bezpieczne by je podawać bez zagrożenia zakażenia klinicznego; nie wykazują ubocznych efektów toksycznych; mogą być podawane skuteczną drogą; są stabilne i kompatybilne z nośnikami szczepionek.

Szczepionki mogąbyć podawane różnymi drogami, takimi jak doustna, pozajelitowa, podskórna, śluzówkowa, dożylna albo domięśniowa. Dawkowanie może zmieniać się w zależności od stanu, płci, ciężaru i wieku osobnika; drogi podania i rodzaju PV. Szczepionki mogąbyć stosowane w postaciach użytkowych takich jak kapsułki, zawiesiny, eliksiry albo roztwory wodne. Szczepionki mogą być łączone z immunologicznie dopuszczalnym nośnikiem.

Szczepionki są podawane w ilościach efektywnych terapeutycznie, tzn. w ilościach odpowiednich do wywołania ochronnej odpowiedzi odpornościowej. Efektywna terapeutycznie ilość może być zmienna w zależności rodzaj u PV. Szczepionka może być podawana w dawce poj edynczej albo wielokrotnej.

Oczyszczone białka według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane w wytwarzaniu kompozycji immunogennych. Kompozycje takie, po wprowadzeniu do organizmu odpowiedniego gospodarza, są zdolne do wywołania odpowiedzi odpornościowej u gospodarza.

Oczyszczone białka według wynalazku lub ich pochodne mogą być zastosowane do wywoływania przeciwciał. Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza zarówno przeciwciało poliklonalnejak i monoklonalne,jak również ich fragmenty takiejak Fv, Fab i F(ab)2, które są zdolne do wiązania antygenu bądź haptenu.

Białka i pochodne białek według wynalazku mogą być zastosowane do serotypowania zakażenia HPV i badań przesiewowych na HPV. Oczyszczone białka, VLP i przeciwciała nadają się same do wytworzenia zestawów odpowiednich do wykrywania i serotypowania HPV. Zestaw taki powinien obejmować podzielone opakowanie odpowiednie do przechowywania w bezpośrednim sąsiedztwie przynajmniej jednego pojemnika. Opakowanie powinno dalej zawierać odczynniki takie jak białka L1 lub L2 lub VLP pochodzące od zrekombinowanego HPV6/11 lub inne zrekombinowane cząsteczki DNA typu HPV albo przeciwciała przeciwko tym białkom. Opakowanie może również zawierać środki do wykrywania takie jak znakowane antygeny albo substraty enzymów itp.

Oczyszczone białka sąrównież przydatnejako wzorce immunologiczne, znaczniki ciężaru cząsteczkowego oraz wielkości cząsteczkowej.

Wiadomo, że istnieje znaczna nadmiarowość różnych kodonów kodujących konkretny aminokwas. Stąd, niniejszy wynalazek dotyczy również takich sekwencji DNA, które zawierają alternatywne kodony, kodujące ewentualnątranslację identycznych aminokwasów. Dla tego opisu, sekwencja zawierającajeden albo wiele zastąpionych kodonów będzie określanajako odmia183 299 nazdegenerowana. Zakresem niniejszego wynalazku objęte sąrównież mutacje sekwencje DNA albo translowanego białka, które nie zmieniają istotnie zasadniczych właściwości ekspresjonowanego białka. Przykładowo, zastąpienie leucyny waliną, lizyny argininąalbo glutaminy asparaginą może nie spowodować zmiany czynności polipeptydu.

Wiadomo, że sekwencje DNA kodujące peptyd mogą być zmienione w taki sposób, że kodująpeptyd wykazujący właściwości różne od peptydu występującego naturalnie. Metody zmieniania sekwencji DNA obejmują, choć nie są ograniczone do ukierunkowanej mutagenezy.

W znaczeniu tu użytym „pochodna funkcjonalna” genu hybrydowego HPV6/11 oznacza związek wykazujący właściwość biologiczną (funkcjonalną albo strukturalną), która jest zasadniczo podobna do aktywności biologicznej HPV6/11. W znaczeniu tu użytym termin „pochodna funkcjonalna” obejmuje „fragmenty”, „odmiany”, „zdegenerowane odmiany”, „analogi” i „homologi” albo „chemiczne pochodne” HPV6/11.

Określenie „analog” dotyczy cząsteczki zasadniczo podobnej w funkcji do całej cząsteczki HPV6/11 albo do jej fragmentu.

Klonowany DNA HPV6/11 albo jego fragmenty uzyskane opisanymi tu metodami, mogą być ekspresjonowane rekombinacyjnie przez klonowanie molekularne do wektora ekspresyjnego zawierającego odpowiedni promotor i inne odpowiednie elementy regulujące transkrypcje, i przenoszone do komórek gospodarzy prokariotycznych albo eukariotycznych w celu wytwarzania rekombinowanego HPV 11. Techniki takich manipulacji sąw pełni opisane w Sambrook i in., wyżej, i znane w stanie techniki. Wektory ekspresyjne są określone tu jako sekwencje DNA konieczne do transkrypcji klonowanych kopii genów i translacji ich mRNA w odpowiednim gospodarzu. Wektory takie mogą być stosowane do ekspresji genów eukariotycznych w różnych organizmach gospodarza takich jak bakterie, algi zielononiebieskie, komórki roślinne, komórki owadzie, komórki grzybów i komórki zwierzęce. Szczególnie zaprojektowane wektory umożliwiają przemieszczanie DNA pomiędzy gospodarzami takimi jak bakterie-drożdże albo bakterie-komórki zwierzęce albo bakterie-komórki grzybów albo bakterie-komórki bezkręgowców. Odpowiednio skonstruowane wektory ekspresyjne powinny zawierać: początek replikacji dla autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, znaczniki umożliwiające selekcję, ograniczoną liczbą przydatnych miejsc enzymów restrykacyjnych, potencjał tworzenia licznych kopii i aktywny promotor. Promotor określony jest jako sekwencja DNA, która kieruje polimerazę RNA w kierunku wiązania z DNA i zapoczątkowuje syntezę RNA. Silnym promotorem jest taki, który powduje inicjację mRNA z dużą częstotliwością. Wektory ekspresyjne mogą obejmować, choć nie są ograniczone do wektorów klonowania, zmodyfikowanych wektorów klonowania, specjalnie zaprojektowanych plazmidów albo wirusów.

Różne ssacze wektory ekspresyjne mogąbyć zastosowane w celu ekspresji DNA HPV6/11 albo jego fragmentów w komórkach ssaczych. Dostępne w handlu ssacze wektory ekspresyjne, które mogąbyć odpowiednie do rekombinacyjnej ekspresji DNA HPV6/11 obejmują, choć nie są ograniczone do pCDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110),pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), ppSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (37460) i ZZD35 (ATCC 37565).

Różne bakteryjne wektory ekspresyjne mogąbyć zastosowane do ekspresjonowania DNA HPV6/11 albo ich fragmentów w komórkach baktyryjnych. Dostępne w handlu bakteryjne wektory ekspresyjne które mogą być przydatne do ekspresji rekombinowanego DNA HPV6/11 obejmują, choć nie są ograniczone do pETl 1a (Ncwagen), km^ld^a gt 11 (l^rwitr^c^ggt^n), pcDNATI (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Różne wektory ekspresyjne komórek grzybów mogąbyć zastosowane w celu ekspresj onowania HPV6/11 albo jego fragmentów w komórkach grzybów. Dostępne w handlu wektory ekspresyjne komórek grzybów, które mogą być przydatne obejmują, choć nie wyłącznie, pYES2 (lnvitrogen), wektory ekspresyjne Pichia (Invitrogen) i wektory Hansenula (Rhein Biotech, Dusseldorf, Niemcy).

183 299

Różne wektory ekspresyjne komórek owadów mogą być zastosowane w celu ekspresjonowania HPV6/11 albo jego fragmentów w komórkach owadów. Dostępne w handlu wektory ekspresyjne komórek owadów, które mogą być przydatne do rekombinacyjnej ekspresji DNA HPV6/11 obejmują, choć nie są ograniczone do pBlue Bac III (Invitrogen).

Wektor ekspresyjny zawierający DNA kodujący HPV6/11 albo jego fragmenty może być zastosowany do ekspresji białek HPV11 albo fragmentów białek HPV11 w komórkach, tkankach, narządach albo zwierzętach. Zwierzę, w znaczeniu tu użytym obejmuje człowieka. Komórki gospodarza mogąbyć prokariotyczne albo eukariotyczne, obejmując, choć nie wyłącznie bakterie takie jak E. coli, komórki grzybów takiejak drożdże, komórki ssakówtakiejak linie komórkowe ludzkie, bydlęce, świńskie, małpie i gryzoni oraz komórki owadów obejmujące, choć nie ograniczone do linii komórkowych pochodzących od Drosophila i jedwabników. Linie komórkowe pochodzące od gatunków ssaków, które mogąbyć przydatne i które są dostępne w handlu obejmują choć nie są ograniczone do komórek L L-M(TK') (ATCC CCL 1.3), komórek L L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CR1650), COS-7 (ATCC CRL 1651),CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) i MRC-5 (ATCC CCL 171).

Wektor ekspresyjny może być wprowadzony do komórek gospodarza dowolną spośród licznych technik, obejmujących choć nie ograniczonych do transformacji, transfekcji, lipofekcji, fuzji protoplastu i elektroporacji. Komórki zawierające wektor ekspresyjny sąnamnażane klonalnie i analizowane indywidualnie w celu określenia czy wytwarzająbiałko HPV 11. Identyfikacja klonów komórek gospodarza ekspresjonujących HPV11 może być dokonana kilkoma sposobami, obejmującymi choć nie ograniczonymi do reakcji z przeciwciałami przeciwko HPV11.

Ekspresja fragmentów DNA HPV może być również przeprowadzona przy użyciu wytworzonego in vitro syntetycznego mRNA albo natywnego mRNA. Syntetyczny mRNA albo mRNA izolowany z komórek ekspresjonujących hybrydowy DNA HPV6/11 może być wydajnie poddawany translacji w różnych układach bezkomórkowych, obejmujących choć nie ograniczonych do ekstraktów zarodków pszenicy i ekstraktów retikulocytów,jak również mogąulegać efektywnej translacji w układach komórkowych, obejmujących choć nie ograniczonych do mikroiniekcji do oocytów żaby, która to metoda jest korzystna.

Po ekspresji białka HPV 11 w komórce gospodarza, białko HPV 11 może być odzyskiwane dostarczając białka HPV11 w postaci czystej. Kilka procedur oczyszczania HPV18 jest dostępnych i odpowiednich do zastosowania. Jak to tu opisano, rekombinowane białko HPV18 może być oczyszczone z lizatów komórkowych i ekstraktów przez różne kombinacje albo pojedyncze zastosowanie frakcjonowania solą, chromatografii anionowymiennej, chromatografii żelowej, chromatografii adsorpcyjnej na hydroksyapatycie i chromatografii oddziaływań hydrofobowych.

Oprócz tego, rekombinowane białko HPV11 może być oddzielane od innych białek komórkowych przez zastosowanie kolumny powinowactwa immunologicznego, wytworzonej z przeciwciał monoklonalnych albo poliklonalnych swoistych wobec powstających HPV11 pełnej długości albo fragmentów polipeptydów HPV 11. Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogąbyć wytwarzane według różnych znanych sposobów. Przeciwciało monoklonalne albo posiadające poj edynczą swoistość w znaczeniu tu użytym oznacza pojedynczy gatunek przeciwciała albo liczne gatunki przeciwciała o homogennej charakterystyce wiązania z HPV 11. Wiązanie homogenne w znaczeniu tu użytym dotyczy zdolności gatunku przeciwciała do wiązania swoistego antygenu albo epitopu.

Jest oczywiste, że sposoby wytwarzania przeciwciał o pojedynczej swoistości mogą być wykorzystane do wytwarzania przeciwciał swoistych wobec fragmentów polipeptydowych HPV, albo powstającego polipeptydu HPV pełnej długości. W szczególności, oczywiste jest, że mogą być wytwarzane przeciwciała o pojedynczej swoistości, swoiste wobec w pełni funkcjonalnego HPV albo jego fragmentów.

183 299

Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobów badania przesiewowego związków modulujących ekspresję DNA albo RNA kodującego HPV, jak również funkcję (funkcje) białka HPV11 in vivo. Związki, które modulują te aktywności mogą być DNA, rNa, pedptydami, białkami albo organicznymi cząsteczkami nie białkowymi. Związki mogą modulować przez zwiększenie albo osłabienie ekspresji DNA albo RNA kodującego HPV11, albo funkcji białka HPV11. Związki, które modulują ekspresję DNA albo RNA kodującego HPV11 albo funkcję białka HPV11 mogąbyć wykryte różnymi testami. Test może być prostym testem typu „tak/nie”, określającym czy występuje zmiana ekspresji albo funkcji. Test może się stać ilościowy przez porównanie ekspresji albo funkcji próbki testowej z poziomami ekspresji albo funkcji w próbce odniesienia.

Mogą być wytworzone zestawy zawierające hybrydowy DNA HPV6/11, fragmenty hybrydowego DNA HpV6/1 1, przeciwciała przeciwko DnA HPV6/1 1 albo białku HPV 11, hybrydowy RNA HPV6/11 albo białko HPV11. Zestawy takie są stosowane do wykrywania DnA, który hybrydyzuje z DNA HPV6/11 albo w celu wykrywania obecności białka albo fragmentów peptydowych w próbce. Charakterystyka taka jest przydatna dla wielu zastosowań obejmujących, ale nie wyłącznie, badania kryminalistyczne i epidemiologiczne.

Sekwencje nukleotydowe komplementarne do sekwencji DNA kodujące HPV6/11 mogą być zsyntetyzowane do terapii antysensownej. Takie cząsteczki antysensowne mogąbyć DNA, stabilnymi pochodnymi DNA takimi jak tiofosforany albo metylofosfoniany, RNA, stabilnymi pochodnymi RNA takimi jak 2'-0-alkilo RNA, albo innymi mimetykami oligonukleotydów antysensownych HPV6/11. Cząsteczki antysensowne HPV6/11 mogąbyć wprowadzane do komórek przez mikroiniekcję, kapsułkowanie w liposomach albo przez ekspresję z wektorów niosących sekwencję antysensowną. Terapia antysensowna HPV6/11 może być szczególnie przydatna do leczenia chorób, gdzie korzystne jest zmniejszenie aktywności HPV11.

Określenie „pochodna chemiczna” opisuje cząsteczkę, która zawiera dodatkowe reszty chemiczne, które nie są normalnie częścią cząsteczki podstawowej. Reszty takie mogą poprawiać rozpuszczalność, półokres trawienia, wchłaniania itp. cząsteczki podstawowej. Alternatywnie, reszty mogą osłabiać niepożądane efekty uboczne cząsteczki podstawowej albo zmniejszać toksyczność cząsteczki podstawowej. Przykłady takich reszt opisane są w różnych tekstach takich jak Remington's Pharmaceutical Sciences.

Związki zidentyfikowane w oparciu o ujawnione tu sposoby mogąbyć stosowane same w odpowiednich dawkach określonych w rutynowych badaniach, w celu uzyskania optymalnego zahamowania HPV11 albo jego aktywności, przy minimalizaji jakiejkolwiek potencjalnej toksyczności. Oprócz tego, może być pożądane równoczesne albo kolejne podawanie innych czynników.

Korzystnie, związki według niniejszego wynalazku mogąbyć podawane w pojedynczej dawce dziennej, albo całkowita dawka dzienna może być podawana w kilku dawkach podzielonych. Ponadto, związki według niniejszego wynalazku mogąbyć podawane różnymi obejmującymi choć nie ograniczonymi do podawania donosowego, doustnego, przezskómego albo w czopkach itp.

Do leczenia skojarzonego z więcej niż jednym składnikiem czynnym, gdzie składniki czynne sąw osobnych postaciach dawkowania, składniki czynne mogąbyć podawane równocześnie albo każdy z nich może być podawany osobno.

Schemat dawkowania wykorzystujący związki według niniejszego wynalazku może być wybrany w zależności od różnych czynników takichjak rodzaj, gatunek, wiek, ciężar, płeć i stan kliniczny pacjenta; ciężkość leczonego stanu; drogę podania; czynność nerek i wątroby pacjenta oraz konkretny zastosowany związek. Lekarz o przeciętnych umiejętnościach może łatwo określić i przepisać skuteczną ilość leku niezbędną do zapobiegania, przeciwdziałania albo zahamowania postępu choroby. Optymalna precyzja w osiąganiu stężenia leku w zakresie zapewniającym skuteczność bez toksyczności wymaga schematu opartego na kinetyce dostępności leku w miejscach docelowych. Obejmuje to wzięcie pod uwagę rozmieszczenia, równowagi i eliminacji leku.

W sposobach według wynalazku, opisane tu związki mogą tworzyć składnik czynny i są zwykle podawane w mieszaninie z dopuszczalnymi farmaceutycznie rozcieńczalnikami, zarób10

183 299 kami albo nośnikami (określanymi tu łącznie jako substancje „nośnikowej”) wybranymi odpowiednio w zależności od zamierzonej postaci do podawania, tj. doustnych tabletek, kapsułek, eliksirów, syropów, czopków, żeli itp., oraz zgodnie z konwencjonakiąpraktykąfarmaceutyczną.

Przykładowo, do podawania doustnego w postaci tabletki albo kapsułki, składnik czynny może być połączony z doustnym, nie toksycznym dopuszczalnym farmaceutycznie obojętnym nośnikiem takim jak etanol, gliceryna, woda itp. Ponadto, jeżeli to pożądane albo konieczne, do mieszaniny mogąbyć włączone odpowiednie środki wiążące, smarujące, ułatwiające rozpadanie i barwiące. Odpowiednie substancje wiążące obejmują, bez ograniczania, skrobię, żelatynę, naturalne cukiy takie jak glukoza albo beta-laktoza, słodziki kukurydziane, naturalne i syntetyczne gumy takie jak guma arabska, tragakanta albo alginian sodu, karboksymetyloceluloza, poliglikol etylenowy, woski itp. Środki smarujące zastosowane w tych postaciach dawkowania obejmują, bez ograniczania oleinian sodu, stearynian sodu, stearynian magnezu, benzoesan sodu, octan sodu, chlorek sodu itp. Środki ułatwiające rozpadanie obejmująbez ograniczania skrobię, metylocelulozę, agar, bentonit, gumę ksantanową itp.

Do postaci płynnych składnik czynny może być łączony w odpowiednio aromatyzowanych środkach zawieszających albo rozpraszających takichjak gumy naturalne albo syntetyczne, przykładowo tragakanta, guma arabska, metyloceluloza itp. Inne środki rozpraszające, które mogą być zastosowane obejmują glicerynę itp. Do podawania pozajelitowego, pożądane są sterylne zawiesiny i roztwory. Gdy pożądane jest podawanie dożylne, stosuje się ogólnie preparaty izotoniczne, które zawierają odpowiednie środki konserwujące.

Preparaty miejscowe zawierające składnik czynny mogąbyć podawane z różnymi substancjami nośnikowymi znanymi w technice, takimi jak alkohole, żel aloe vera, alantoina, gliceryna, oleje z witaminąA i E, oleje mineralne, propionian mirystylowy PPG2 itp., w postaci np. roztworów alkoholowych, miejscowych zmywaczy, kremów czyszczących, żeli na skórę, toników na skórę i szamponów w postaci kremu albo żelu.

Związki według niniejszego wynalazku mogąbyć również podawane w postaci układów liposomów, takichjak małe pęcherzyki jednobłonowe, wielkie pęcherzyki jednobłonowe i pęcherzyki wielobłonowe. Liposomy mogą być wytwarzane z różnych fosfolipidów, takich jak cholesterol, stearyloaminy albo fosfatydylocholiny.

Związki według niniejszego wynalazku mogąbyć również dostarczane przez zastosowanie przeciwciał monoklonalnych jako pojedynczych nośników, z którymi sprzęgane są cząsteczki związku. Związki według niniejszego wynalazku mogąbyć również sprzęgane z rozpuszczalnymi polimerami jako nośnikami leku z możliwością kierowania. Polimery takie mogą obejmować poliwinylopirolidon, kopolimer piranu, polihydroksypropylometakrylo-amidofenol, polihydroksyetyloaspartamidofenol albo polietoksylowana polilizyna podstawiona resztami palmitoilowymi. Ponadto, związki według niniejszego wynalazku mogąbyć sprzęgnięte z klasąpolimerów ulegających biodegradacji, przydatnych do uzyskiwania kontrolowanego uwalniania leku, przykładowo, polikwasem mlekowym, poll-c-kaprolaktonem, poikwasem hydroksymasłowym, poliortoestrami, poliacetalami, polidihydropiranami, policyjanoakrylanami.

Poniższe przykłady ilustrują niniejszy wynalazek bez ograniczania go.

Przykład 1. Konstruowanie syntetycznego genu L1

Skonstruowano otwartą ramkę odczytu L1 HPV11 wielkości 1,5 kb stosując syntetyczne oligomery DNA zakupione w Midland Reagent Company. Oligomery te zawierały fosforan na końcu 5'. Zakupiono 24 oligomery o sekwencjach podanych poniżej.

#241-1

5OAAGATCTOACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAC_ICA

CAGTATATGTGCCTCC^rCCTAACCCTGTATCCAAA^GITGdT'GCC

ACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCA

GCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT 3' (SEQ ID

NO:1)

183 299 #2412

5'ATIT:CATAAAAAAGGTIAAC4AAACTCTTGnGCCAAAGGTGT CAGGATATCAATACAGAGTATnAAGGTGGTGTTACCAGATCr TAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAA CACAACGTTTCGTATCCGCATGCATGT 3' (SEQ ID NO:2) #241-3

5'ACATCCATCCACACCCCTACACGTCGGCCCCCCACAGCCAT TACGTCTGGGTGTAAGTCGACATCCTTTACTAAATAAATATCA TGATCTTGAAAATTCAGCGGGTTACCCTCCTAACCCTGGACAC GATAACAGG 3' (SEQ ID NO:3) #241-4 .

5GTTAATCTACCTATCGATTATAAACAAACACAATTATCCATC CTTCCATGTGCCCCCCCTTTCCCCCAGCATTCCCGTAAACGTA CACACTCTAGTAATACATCTCTACAGAATGCTCACTCCCCGC 3' (SEQ ID N0:4) #241-5

5’CCTTAGAACTTATTACCACTGTTATACAGCATGGCCATATGC TTCACACAGCCTTTGCTGCTATCAATTTTCCTGATTTCCAGACC AATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGCCACTCTA 3' (SEQ ID NO:5) #241-6

5’TGTAAATATCCAGATTATTTACAA ATGCCTGCACACCCATAT CGTGATACATTΑTIΤmΤATCTACCGAACCAACAAATCTTTCC CAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC 3'(SEQ ID NO:6) #241-7

5’GCCGTACCGTCGGCCAACCTCTCCCTGATCATCTTTTACTTA AGCC^rΓCCTAACAATCGCTC.CTCTCTACCGACTACTATATATCT TCACACCCCAACIC:GGCT'CTT^^,GCTCTCC^^CT(CAGCCACA 3' (SEQ ID N0:7)

183 299 #241-8

5'ATTGTTTAATAAGCCATATTGG CTACAAAA AGCCCAGGG ACA TAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGG TAGATACCACACGCAGTACCAACATGA 3’(SEQ ID NO:8) #241-9

5'CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTC TGAT^rATAAAGA^CT^^^^CA^TGiCGTCiA^TGnrjGAACjACrn^rCjATTT.A CAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT 3'(SEQ ID NO:9) #241-10

5^,ACATTCTCTCCTCAACTAATGCCCTATATTCACACAATGAAT CCCTCTGTTCTCGACCACTCCAACTTTGCCTTATCCCCTCCCCC AAATCCTACACTCGACCCC 3’(SEQ ID NO: 10) #241-11

5'CCCCTCGACGATACCTATACCTATGTGCAGTCACACGCCATT ACCTCTCAAAACCCCACTCCTGAAAAGCAAAACCAAGATCCCT ATAACCACATCACTTTTTGCCAGGTTAATTTAAA.AGAAAACTT TTCTAGTGAATTCCATCAGTTTCCTTT 3' (SEQ ID NO:l 1) #241-12

5’CCCACCCAAGTTTTTCTTACAAAGTCCATATACCCCACGGAC CTCTCCTCCTACCCCTATTAAGCCCCCTCCTGTTTCCAAACCCT CTACTCCCCCTAAACGTAACCGCACCAAAACTAAAAACTAAC ATCTTC 3' (SEQ ID NO: 12) #241-13

5’GAAGATCTTACTTTTTAGTTTTCGTGCCCTTACGTTTACCGC C AGTAGACCCTTTCGAAACACCACCGCCCTTAATACCGCTACC AGCAGACGTCCCTCCCCTATATCCACTTTCTAACAAAAACTTC CGT^’^<^i^,AAG^AAACTGATCCAATTC 3' (SEQ ID NO: 13) #241-14 'ACTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATC TCCTTATACCGATCTTCCTTTTCCTTTTCAGGAGTCCGCTTTTC ACACGTAATCGICCTGTGACTCCACATACCTATAGGTATCCTCC AGCGG 3' (SEQ ID NO: 14)

183 299 #241-15

5^,CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGA'TAACCCAAAGTT CCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCC ATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTG AAAAA 3 ' (SEQ ID NO:15) #241-16

5TAAATrCnAAATCAAA(TCTTCCACATGACGCATGTACTCTTT ATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCA CATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG 3' (SEO ID NO: 16) #241-17

5'GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATA CCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATT AAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA 3' (SEQ ID NO: 17) #241-18

5'AGAGCCGCTTGGGGTCTGAACATATATACTACTCGCTACACA CGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACA GGTTCCCCCACGGTACCCC 3’ (SEQ ID NO: 18) #241-19 ^,GGGGTACCAGCCCTCTTAAAAAAATCTCTGCCAAACATTTCT TCCTTCCGTAG ATAAAAAAATAATCTATCA CCATATCGCTCTC CAGCCATTTGTAAATAATCTGCATATTTACATACACTGCCACA TATGTCAA 3' (SEQ ID NO: 19) #241-20

5'(CAGGAACAT'CTGATTTA^TGCTCTCCAAATCΛCCAAAATTCA TAGCACCAAAGCCTCTGTCAACCATATCGCCATCCT'CiTATΆAC ACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT 3’ (SEQ ID NO:20)

1183 299 #241-21

5'ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGC CCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATrGTGTTrCGTr ATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT 3' (SEQ ID NO:21) #241-22

5'TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATT TACTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATCGCTCTCCC CGCCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT 3'(SEQ ID NO:22) #241-23

5’ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTCTGGCATCAAAAA CAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTACCATCTGCTAACAC CACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTCCCACAA CACTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAAT.AAGGATGACCC 3' (SEQ ID NO:23) #241-24

5'ACTGCAAGAAGTCTACAACTGCTGGCATCATAAAATATCTTC CTGCGTTTAACATAAGCATCCCTGGCAACAACTTTGG ATACAC GCTTAGGACGAGCCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCA CATTTTCTTTTGTGAGATCTTC 3' (SEQ ID NO:24)

Oligomery tworzące pary komplementarne (#241 -1 i #241 -24, #241 -2 i #241 -23, #241 -3 i #241 -22, #241 -4 i #241 -21, #241 -5 i #241 -20, #241 -6 i #241 -19, #241 -7 i #241 -18, #241 -8 i #241-17, #241-9 i #241-16, #241-10 i #241-15, #241-11 i #241-14 oraz #241-12 i #241-13, Figura 1) połączono w osobnych probówkach zawierających 2,5 mM Tris, pH 7,5,0,25 mM EDTA. Probówki ogrzano do 98°C przez 4 minuty i umieszczono w 200 ml wody w temperaturze 98°C w 250-ml naczyniu i pozostawiono do powolnego schłodzenia. Gdy woda ostygła do temperatury pokojowej, połączone pary dodano do probówek w następujący sposób: fragment A (para oligomerów #241-1 i -24 oraz #241-2 i -23), fragment B (#241-3 i -22, #241-4 i -21, #241-5- i -20, #241-6 i -19), fragment C (#241-7 i -18, #241-8 i -17, #241-9 i -16, #241-10 i -15), fragment D (#241 -11i -14, #241 -12 i -13). Te mieszaniny par oligomerów podgrzano do 62°C przez 2 minuty i ostudzono pomałujak uprzednio. Zawartość każdej z probówek poddano ligacji przez noc w 23°C przy użyciu ligazy DNA T4 (Boehringer Mannheim, Inc.) i odczynników dostarczonych przez producenta.

Po ligacji, fragment B wymagał amplifikacji PCR w celu wydłużenia do pełnej długości. Wymagało to dziesięciu cykli po 1 min. w 94°C; 1 min w 48°C i 1 min w 72°C a następnie 10 minut w 72°C, w urządzeniu Applied Biosystems thermocycler przy użyciu polimerazy Taq Boehringer Mannheim i starterów oligomerowych:

5'GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG3' (Identyfikator Sekw. Nr 25) i

5'GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA3' (Identyfikator Sekw. Nr 26).

183 299

Ligowane produkty i produkt PCR fragmentu B trawiono enzymami restrykcyjnymi (Boehringer Mannheim, Inc.) w następujący sposób: fragment A trawiono BglII i SphI; fragment B - SphI i KpnI; fragment C - KpnI i Xhol i fragment D - Xhol i BglII. Trawione fragmenty rozdzielono na agarozie o niskiej temperaturze topnienia (FMC BioProducts) i izolowano fragmenty o prawidłowej długości przez wycięcie prążka i trawienie agarozy przy użyciu Agaraze™ (Boehringer Mannheim, Inc.) jak to zaleca dostawca. Fragmenty A, B i D odzyskano przez precypitację etanolem a następnie osobno poddano ligacji z wektorem pSP72 (Promega, Inc.), który trawiono podobnie enzymami restrykcyjnymi zgodnymi z poddanym ligacji fragmentem.

Trawiony KpnI/XhoI fragment C najpierw poddano ligacji z połączonymi oligomerami:

5TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC3' (Identyfikator Sekw. Nr 27) i

5'TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT3' (Identyfikator Sekw. Nr 28).

Fragment C trawiono ponownie Xhol, po czym fragment KpnI/XhoI o długości 450 bp poddano ligacji z trawionym KpnI/XhoI wektorem pSP72. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformacji kompetentnych komórek Escherichia coli szczepu DH5 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Transformanty przesiewano w kierunku klonów zawierających wstawkę przez hybrydyzację kolonii (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratry Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Plazmidowy DNA izolowano z klonów pozytywnych stosując zestaw Wizard miniprep kit (Promega Corp.), a następnie sekwencjonowano sekwenatorem DNA Applied Biosystems 373A. Klony zawierające prawidłowąsekwencję DNA dla każdego z czterech fragmentów trawiono jak uprzednio w celu uwolnienia fragmentów z wektora pSP72. Fragment C trawiony KpnI/XhoI poddano ligacji z fragmentem D trawionym XhoI/BglII i pSP72 trawionym BgUl/KpnI w trzy-etapowej ligacji. Produkty ligacji zastosowano następnie do transformacji E. coli. Powstałe transformanty sekwencjonowano uzyskując klon o prawidłowej sekwencji (oznaczony CD). Wstawkę Bglll/KpnI wielkości 750 bp ponownie wycięto z pSP72 i poddano ligacji z fragmentem A trawionym Bglll/SphI i fragmentem B trawionym SphI/KpnI w trzy-etapowej ligacji, jak poprzednio, z takim wyjątkiem tego, że dodano Bglll w celu uniknięcia niepożądanych produktów ligacji. Produkty ligacji rozdzielono na żelach agarozowych i wyizolowano fragment wielkości 1,5 kb, oznaczając go D361-1.

Przykład 2. Porównanie sekwencji

Porównanie sekwencji nukleotydowych dla L1 hybrydowego HPV6/11, HPV6a i HPV11 pokazano na figurze 2. W szkielecie HPV6 występuje 55 zastąpień nukleotydowych, w celu przekształcenia go w ramkę translacji kodującą HPV 11. Oprócz tego, w pozycji 411 -413 bp dodano trzy pary zasad kodujące dodatkowy aminokwas (tyrozynę 132) spotykaną w HPV11, ale nie w HPV6. Podsumowując, zmiany te umożliwiły wiązanie swoistych wobec typu 11, zależnych od konformacji, neutralizujących przeciwciał monoklonalnych (Chemicon 8740 Mab) z białkiem L1 DNA HPV6/11 L1 ekspresjonowanym w drożdżach. Wskazuje to, że białko genu hybrydowego HPV6/11 nieodróżnialne immunologicznie od natywnego HPV11.

Porównanie sekwencji hybrydowego DNA HPV6/11 z opublikow£rnąsekwencjąL1 HPV 11 wykazało zastąpienie 194 par zasad. Istniała istotna liczba zastąpień w porównaniu z sekwenqąL1 11 typu dzikiego, które to wszystkie albo ich dowolna kombinacja może być odpowiedzialna za zwiększenie ekspresji białka L1 typu 11 w drożdżach.

Przykład 3. Sekwencjonowanie DNA genu L1

Gen L1 HPV6/11 sekwencjonowano stosując urządzenie Applied Biosystems DNA Sequencer #373A w reakcji zakańczania łańcucha didezoksynukleotydami (zestaw PRIZM™ Sequencing Kit) według instrukcji producenta (ABI, Inc., Foster City, CA).

Przykład 4. Konstruowane drożdżowy ch wektorów ekspresj onuj ących L1 HPV 6/11, L1 HPV11 i L1 HPV6

Wektor ekspresyjny pGAL 1-10 skonstruowano przez izolowanie fragmentu SphI wielkości 1,4 kbp, z plazmidu pUC18 o dwukierunkowym promotorze GAL, który zawierał rozbieżne promotory Saccharomyces cerevisiae GAL1-GAL 10 z plazmidu pBM272 (dostarczony przez

183 299

Marka Johnstonat WashivgtotUstversity, St. Louis,MO).Promotory rozbieaie są flankowane z każdej strony przez kopie drożdżowego terminatora transkrypcji ADH1, miejsca klonowania BamHI położone pomiędzy promotorem GAL1 i pierwsząkopiątermmatora transkrypcji ADH1 i miejsce klonowania Smal położone pomiędzy promotorem GAL10 i druga kopiątermmatora transkrypcji ADH1. Drożdżowy wektor wahadłowy zbudowany z pBR322, drożdżowego genu LEU2d (Erhart i Hollghbgrg, 1983, J. Bacteriol. 156:625-635)) i drożdżowego plazmidu 2u (dar Benjamina Halla, Umversity ofWayhingtoh, Seattle, WA) trawiono SphI i poddano ligacji z fragmentem SphI rozbieżnych promotorów GAL wielkości 1,4 kbp powodując powstanie pGALl-10 (figura 3).

DNA hybrydowego L1HPV 6/11 kodujący białko L1 HPV 11 (próbka D3 61 -1 z przykładu 1) zawierał nie ulegającą translacji sekwencję liderową drożdży (Kniskem i in., 1986, Gene 46:135-141) bezpośrednio powyżej kodonu początkowej metioniny L1 HPV6/11. pGAL1-10 lihearyzowαho BamHI, który ciął pomiędzy promotorem GAL1 i terminatorem transkrypcji ADH1, po czym poddano ligacji z fragmentem genu L1HPV6/11 wielkości około 1,5 kb (próbka D361-1). Transformanty E. coli. DH5 (Gibco BRL, Inc.) przeniesiono i izolowano plazmid pGALl-10, który zawierał gen L1 HPv6/11, i oznaczono go D362-1.

DNA HPV 11 typu dzikiego (wt-HPV 11) klonowano ze zmian kłykcin kończystych (dar od dr Darrona Browna). Całkowity ludzki genomowy DNA ekstrahowano i trawiono endonukleazami restrykcyjnymi. Frakcję zawierającą DNA wt-HPV11 poddano ligacji do wektora klonowania E. coli. jako matrycę do PCR. Gen L1 wt-HPV11 amplifikowano przez PCR stosując polimerazę Veht (New England Biolabs, Inc.), 10 cykli amplifikacji (94°C, 1 min, 48°C, 1 min, 72°C, 1 min 45 sek) i poniższe startery oligohukleotydowg, które zawierały flankujące miejsca Bglll (podkreślone):

starter sensowny

5'-CTCAGATCTCACAAAACAAAATGTGGGGCCTAGCGACAGCACAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 29).

starter antysensowny

5'-GAGTCTAGATACTTTTTGGTTTTGGTACGTTTTCG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 30).

Starter sensowny wprowadzał nie ulegającą translacji drożdżową sekwencję liderową (Kniskem i in., 1986, wyżej) bezpośrednio powyżej kodonu start L1 wt-HPV11 (wytłuszczona czcionka). Fragment PCR wielkości 1,5 kb L1 wt-HPV 11 trawiono Bglll, oczyszczono na żelu i poddano ligacji z plazmidem pGALl-10 trawionym Bglll otrzymując plazmid p329-1.

Całkowity genomowy DNA ekstrahowano z HUV6a-pozytywhych, zmian o typie kłykcin kończystych (dar od dr Darrona Browna). Gen L1 HPV6a amplifikowano stosując próbkę DNA z biopsji jako matrycę, polimerazę Vent (New England Biolabs, Inc.), 35 cykli amplifikacji (94°C, 1 min, 48°C, 1 min, 72°C, 1 min 45 sek), starter sensowny podany wyżej dla PCR genu L1 wt-HPV11 i starter antysensowny o sekwencji.

5'-GAGAGATCTTACCTTTTAGTTTTGGCGCGCTTAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 31).

Produkt PCR wielkości 1,5 kb HPV6a trawiono Bglll, oczyszczano na żelu i poddano ligacji z trawionym BamHI plazmidem pGALl-10 otrzymując plazmid D128.

Przykład 5. Wytwarzanie szczepu 1558 etap a: Wytwarzanie szczepu drożdży U9

Szczep Saccharomyces cerevisiae 2150-2-3 (MATalpha, Leu2-04, adel, cir°) otrzymano od dr Leland Hartwell (Unwersity of Washington, Seattle, WA). Komórki szczepu 2150-2-3 namhażaho przez noc w 30°C w 5 ml pożywki YEHD (Carty i in., J. Ind. Micro. 2 (1987) 117-121). Komórki płukano trzykrotnie w sterylnej, destylowanej wodzie, zawieszono w 2 ml sterylnej wody destylowanej po czym 0,1 ml zawiesiny komórek wysiano na sześć płytek z kwasem 5-fluoro-orotowym (FOA) w celu wyselekcjonowania mutantów ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Płytki ihkubownho w 30°C. Pożywka zawierała 3,5 g Difco Yeast

183 299

Nitrogen Base, bez aminokwasów i siarczanu amonu; 0,5 g kwasu 5-fluoro-orotowego; 25 g uracylu i 10 g dekstrozy na 250 ml wody destylowanej.

Pożywkę sterylizowano przez przefiltrowanie przez membranę 0,2 pm a następnie zmieszano z 250 ml 4% Bacto-Agar (Difco) utrzymywanego w 50°C, 10 ml roztworu 1,2 mg/ml adeniny i 5 ml roztworu 180 mg/50 ml L-leucyny. Powstałe podłoże rozporcjowano na 20 ml szlaki Petri'ego.

Po 5 dniach inkubacji, pojawiły się liczne kolonie. Wyizolowano pojedyncze kolonie przez rozmazanie kolonii z początkowych płytek FOA na świeże płytki, które inkubowano w 30°C. Liczne kolonie z drugiego zestawu płytek FOA badano na obecność mutacji ura3 przez odbitki posiewów na płytkach YEHD i płytkach bez uracylu. Pożądanym rezultatem był wzrost na płytkach YEHD i brak wzrostu na podłożu bez uracylu. Uzyskano jeden izolat (U9) wykazujący te właściwości. Przechowywano go jako zamrożony roztwór glicerynowy (szczep #325) w -70°C do późniejszego użycia.

etap b: Wytwarzanie wektora do zniszczenia genu MNN9 drożdży

W celu wytworzenia wektora do zniszczenia genu MNN9, konieczne było sklonowanie genu MNN9 z genomowego DNA Saccharomyces cerevisiae. Uzyskano to przez standardową technologię reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Starter sensowny 5' i antysensowny 3' do PCR sekwencji kodującej MNN9 pełnej długości zaprojektowano w oparciu o opublikowaną sekwencję dla tego genu (Zymogenetics: patent EPO zgłoszenia nr 88117834.7, publikacja nr 0-314-096-A2). Zastosowano poniższe startery oligodezoksynukleotydowe, zawierające flankujące miejsca Hindlll (podkreślone):

starter sensowny

5'-CTTAAAGCTTATGTCACTTTCTCTTGTATCG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 32). starter antysensowny

5'-TGATAAGCTTGCTCAATGGTTCTCTTCCTC-3' (Identyfikator Sekw. Nr33).

Początkowy kodon metioniny dla genu MNN9 zaznaczono wytłuszczoną czcionką. PCR przeprowadzono stosując genomowy DNA ze szczepu JRY188 S. cerevisiae jako matrycę, polimerazę DNA Taq (Perkin Elmer) i 25 cykli amplifikacji (94°C 1 min; 37°C 2 min; 72°C 3 min). Powstały fragment PCR wielkości 1,2 kbp trawiono Hindlll, oczyszczano na żelu i poddano ligacji z trawionym Hindlll i traktowanym fosfataząalkalicziąpUC13 (Pharmacia). Powstały plazmid oznaczono jako p1183.

W celu zniszczenia genu MNN9 genem drożdży URA3, plazmid pBR322-URA3 (zawierający 1,1 kbp fragment Hindlll kodujący gen drożdży URA3 wklonowany w miejsce Hindlll pBR322) trawiono Hindlll i oczyszczano na żelu fragment DNA zawierający funkcjonalny gen URA3 wielkości 1,1 kbp, tępiono na końcach polimeraząDNA T4 i poddawano ligacji z plazmidem p 1183 trawionym Pm 11 (Pm 11 ciął w sekwencji kodujący MNN9). Powstały plazmid p 1199 zawierał gen MNN9 zniszczony funkcjonalnym genem URA3.

etap c: Konstruowanie szczepu 1372 - pochodnej U9. zawierającej zniszczony genMNN9

W celu zniszczenia genu MNN9 szczepu U9 (#325), 30 pg plazmidu pl 199 trawiono Hindlll tworząc liniową kasetę mnn9::URA3. Komórki szczepu 325 transformowano DNA pl 199 trawionym Hindlll metodą sferoplastu (Hinnen i in., 1987, PNAS USA 75:1929-1933), zaś transformanty selekcjonowano na syntetycznym podłożu agarowym pozbawionym uracylu i zawierającym 1,0 M sorbitol. Syntetyczne podłoże zawierało agar, 20 g; Yeast nitrogen Base bez aminokwasów, 6,7 g; adeninę, 0,04 g; L-tyrozynę, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukozę, 20 g i roztwór bez leucyny #2,10 ml, na litr wody destylowanej. Roztwór bez leucyny #2 zawierał: L-argininę, 2g; L-histydynę, 1 g; L-leucynę, 6 g; L-izoleucynę, 6 g; L-lizynę, 4 g; L-metioninę, 1 g; L-fenyloalaninę, 6 g; L-treoninę, 6 g; L-tryptofan, 4 g, na litr wody destylowanej.

Płytki inkubowano w 30°C przez pięć dni po którym to czasie pojawiły się liczne kolonie. Z 10 kolonii wykonano preparaty DNA chromosomalnego, a następnie trawiono EcoRI i Hindlll. Produkty trawienia badano metodą Southern blot (J. Sambrook i in., Molecular Cloning: ALaboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), stosując jako sondę fragment Hindlll wielkości 1,2 kbp, zawierający gen MNN9 (wyizolowany z plazmidu pl!99).

183 299

Zidentyfikowano izolat (szczep #1372) wykazujący oczekiwane przesunięcie prążka DNA w badaniu Southern blot, jak również niezwykłą zdolność tworzenia skupisk, charakterystyczną dla mutantów mnn9.

etap d: Konstruowanie wektora do zniszczenia genu drożdży HIS3

W celu skonstruowania kasety niszczącej, w której gen HIS3 S. ceravisiae jest zniszczony genem URA3 plazmid YEp6 (K. Struhl i in., 1979, PNAS USA 76:1035) trawiono BamHI po czym oczyszczono na żelu fragment wielkości 1,7 kg niosący gen HIS3, stępiono na końcach polimeraząDNA T4 i poddano ligacji z pUCl 8, który trawiono uprzednio BamHI i traktowano polimerazą DNA T4. Powstały plazmid (oznaczony jako p 1501 albo pUC 18-HIS3) trawiono Nhel (który ciął w sekwencji kodującej genu HIS3), po czym wektor oczyszczono na żelu, stępiono na końcach polimerazą DNA T4 i traktowano fosfatazą alkaliczną. Gen URA3 wyizolowano z plazmidu pBR322-URA3 przez trawienie Hindlll po czym fragment wielkości 1,1 kb niosący gen URA3 oczyszczono na żelu, stępiono na końcach polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z powyższym fragmentem Nhel pUC18-HIS3. Powstały plazmid (oznaczony pUC18-his3::URA3 albo 1505) zawierał kasetę niszczącą, w której drożdżowy gen HIS3 przerwano funkcjonalnym genem uRa3.

etap e: Konstruowanie wektora do zniszczenia drożdżowego genu PRB1 przez gen His 3

Plazmid FP8AH niosący gen PRB1S. cerevisiae dostarczył dr E. Jones z Camegie-Mellon Univ. (C.M. Moehle i in., 1987, Genetics 115:255-263). Trawiono go Hindlll + XhoI, po czym oczyszczono na żelu fragment DNA wielkości 3,2 kb, zawierający i stępiono na końcach polimerazą DNA T4. Następnie plazmid pUC 18 trawiono BamHI, oczyszczano na żelu i stępiono na końcach przez działanie polimerazą DNA T4. Powstały fragment wektora poddano ligacji z powyższym fragmentem genu PRB1 dając plazmid pUC 18-pRB 1. Plazmid YEp6, zawierający gen HIS3 trawiono BamHI. Powstały fragment BamHI wielkości 1,7 kb zawierający funkcjonalny gen HIS3 oczyszczono na żelu i stępiono na końcach przez działanie polimeraząDNA T4. Plazmid pUCl 8-PRb 1 trawiono EcoRV + Ncol które cięły w sekwencji kodujące PRB1 i usuwały miejsce aktywne proteazy B i sekwencje flankujące. Fragment EcoRI-Ncol wielkości 5,7 kb niosący reszty 5' i 3' sekwencji kodującej PRB1 w pUC18, oczyszczono na żelu, stępiono działając polimerazą DNA T4, defosforylowano fosfatazą alkaliczną i poddawano ligacji z fragmentem HIS3 o tępych końcach, opisanym powyżej. Powstały plazmid (oznaczony pUC18-prbl::HIS3, roztwór #1245) zawierał funkcjonalny gen HIS3 w miejscu części genu PRB1, który usunięto.

etap f: Konstrukcja szczepu drożdży spokrewnionego z U9. zawierającego uszkodzenia genów MNN9 i PRB1

W przykładzie 5c opisano szczep 1372 spokrewniony z U9, który zawiera uszkodzenie genu MNN9. Izolaty klonalne szczepu 1372 pasażowano na płytkach FOA (jak to pisano w przykładzie 5a) w celu selekcji mutantów ura3. Uzyskano wiele izolatów ura3 szczepu 1372, zaś jeden konkretny (szczep 12930-190-S1-1) wybrano do dalszego uszkodzenia genu HIS3. Wektor uszkadzający pUC 18-his3: :URA3 (p 1505) trawiono Xbal i EcoRI w celu wytworzenia liniowej kasety uszkadzającej his3::URA3, i zastosowano do transformacji szczepu 12930-190-S1-1 metodąz octanem litu (Meth. Enzymol., 194:290 (1991)). Transformanty ura+ wyselekcjonowano na syntetycznym agarze bez uracylu, rozsiano w celu uzyskania izolatów klonalnych na tym samym podłożu a następnie wysiano w postaci odbitek na podłoże pozbawione uracylu albo histydyny, w celu poszukiwania izolatów, które byłyby Ura+ jak i His-, Jedne z izolatów (szczep 12930-230-1) wyselekcjonowano do dalszego uszkodzenia genu PRBl. Wektor uszkadzający gen PRBl (pUC18-prbl ::HIS3, roztwór #1245) trawiono SacI i Xbal w celu wytworzenia liniowej kasety uszkadzającej prbl ::HIS3 i zastosowano do transformacji szczepu 12930-230-1 metodą z octanem litu. Transformanty His+ wyselekcjonowano na podłożu agarowym pozbawionym histydyny i rozsiano na tym samym podłożu w celu izolacji klonów. Z licznych powstałych izolatów His+ wytworzono genomowy DNA, trawiono EcoRI i poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym. Analizy met. Southern biot wykonano stosując znakowanąra183 299 dioaktywnie sondę długości 617 bp wytworzoną przez PCR z użyciem poniższych starterów oligonukleotydowych:

5'-TGGTCATCCCAAATCTTGAAA3' (Identyfikator Sekw. Nr 34) i

5' -CACCGTAGTGTTTGGAAGCGA3' (Identyfikator Sekw. Nr 35).

Uzyskano jedenaście izolatów wykazujących oczekiwaną hybrydyzację sondy fragmentu DNAprbl::HIS3 długości 2,44 bp. Stało to wjaskrawej sprzeczności z hybrydyzacją saondy z fragmentem 1,59 kb dla genu PRB1 typu dzikiego. Jeden z izolatów zawierających pożądane uszkodzenie prb 1: .HIS3 wyselekcjonowano do dalszego zastosowania i oznaczono gojako #1558.

Przykład 6. Ekspresja L1 i L2 HPV 18 w drożdżach

Plazmidy D362-1 (pGAL1-10 + LI HPV6/11), p329-1 (pGAL1-10 + L1 wt-HPVll), D128 (pGAL 1-10 + L1 HPV 6) i pGAL 1-10 zastosowano do transformowania szczepu #1558 Ś. cerevisiae (MATa, leu2-04,prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°), metodąsferoplastu (Hinnen i in., 1929-1933). Szczep drożdży tanasformowany plazmidem D362-1 oznaczono jako szczep #1782. Do badań RNA izolaty klonalne hodowano w 30°C w pożywce YEHD zawierającej 0,1M sorbitan i 2% galaktozę albo glukozę przez 26 godzin. Po zebraniu komórek, ekstrahowano drożdżowy RNA stosując metodę z kwaśnym fenolem na gorąco jak to opisano (Current Protocols in Molecular Biology, tom 2, Current Protocols, 1993). Do analizy białka identyczne izolaty hodowano w 30°C w złożonej pożywce YEH zawierającej 0,1 M sorbitan i 2% galaktozę albo glukozę przez 70 godzin. Po zebraniu komórek osad komórkowy zniszczono szklanymi perełkami i analizowano lizaty komórkowe w kierunku ekspresji L1HPV 11 lub L1 HPV6 analizą immunologiczną.

Przykład 7. Analiza met. Northern biot drożdży ekspresjonujących RNA L1 HPV

Próbki zawierające 10 (g całkowitego RNA denaturowano przez traktowanie glioksalem i DMSO (Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, Current Protocols, 1993) i poddano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym buforowanym fosforanem. RNA przeniesiono na membranę nylonową, i wykrywano znakowanym ³²P oligonukleotydem, komplementarnym do sekwencji DNA L 1 HPV11 i HPV6.

Badanie Northern biot pokazano na figurze 4. Nie wykryto prążków o oczekiwanej długości dla RNA L1HPV pełnej długości w próbkach hodowanych na pożywce z glukozą(ścieżki 1,3 i 5). Oczekiwano tego ponieważ glukoza hamuje przez represję transkrypcję z promotora drożdżowego GAL1. W przeciwieństwie, próbki hodowane na pożywce z galaktozą, która indukuje ekspresje z promotora GAL1, wykazywały silne sygnały RNA L1 HPV. L1 HPV6 ulegał transkrypcji jako RNA pełnej długości (ścieżka 2), podczas gdy większość L1 wt-HPVll ulegała transkrypcji w postaci okrojonej (ścieżka 4). Wynik ten wskazuje, że drożdżowy sygnał przerwania transkrypcji położony jest w ORF L1 wt-HPVl 1, ale nie jest obecny w sekwencji L1 HPV6. RNA transkiynowany z genu hybrydowego HPV6/11 wydaje się być pełnej długości (ścieżka 6). Nie wykrywano. RNA swoistego dla HPV w próbce kontrolnej drożdży pGAL 1-10 (ścieżka 7).

Przykład 8. Analiza met. Western blot drożdży ekspresjonujących białka L1 HPV

Próbki zawierające 20 fig całkowitego białka komórkowego poddano elektroforezie na 10% żelach Tris-Glicine (Novex, Inc.) w warunkach denaturujących i przeniesiono elektrycznie na filtry nitrocelulozowe. Białko L1 badano immunologicznie stosując surowicę króliczą wywołanąprzeciwko białku fiizyjnemu trpE-L 1 HPV 11 jako przeciwciało pierwotne (Brown i in., 1994, Virology 201:46-54) i koniugat oślego przeciwciała przeciwko króliczym IgG sprzęgnięty z peroksydaząchrzanową(Amersham Inc.) jako przeciwciało wtórne. Filtry obrabiano stosując zestaw do wykrywania chemiluminescencją ECL™ Detection Kit (Amersham Inc.). Wykryto 50-55 kDa prążki białka L1 we wszystkich próbkach z wyjątkiem kontroli negatywnej (ścieżka

4) (figura 5). Ponadto, ilość białka L1 HPV11 ekspresjonowanego przez hybrydowy gen HPV6/11 (ścieżka 3) wydawała się być około 10x większe niż ilość białka L1 ekspresjonowanego przez gen wt-HPV11 (ścieżka 2) albo gen L1 HPV6 (ścieżka 1).

Przykład 9. Elisa VLP L1 HPV11 ekspresjonowanego przez drożdże

W celu określenia względnej ilości VLP wytworzonych przez klony drożdży ekspresjonujące wt-HPV 11 albo hybrydę HPV6/11. ELISA zastosowano również do wykazania, że epitop

183 299 konformacyjny dający bodziec dla silnej odpowiedzi przeciwciał neutralizujących został zachowany na VLP otrzymanych z hybrydowego DNA HPV6/11. Ten epitop konformacyjny określono przeciwciałem monoklonalnym H11.B2 (Christiansen i in., 1990, J. Virol. 64, 5678-5681), którejest dostępne z Chemicon International (Temecula, CA) jako Chemicon Mab 8740. Pokrótce, studzienki płytek ELISA (Maxisorb, Nunc Inc., Napperville, IL) opłaszczono zmniejszającymi się ilościami całkowitego białka drożdży zawierającego VLP hybrydy HPV6/11 albo wt-HPV 11 w 100 pl PBS. Oczyszczone na CsCl wiriony wt-HPV 11 (szczodry dar Dr D. Browna) i kontrolne białko drożdży zastosowano jako kontrolne. Płytki inkubowano przez noc w 4°C, po czym aspirowano zawartość i blokowano płytki 250 pl 10% odtłuszczonego mleka (Carnation) w TTBS (50 mM Tris, pH 7,6,150 mM NaCl, 0,1 % Yween 20) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Płytki przepłukano PBS/0,1% Tween 20, po czym inkubowano studzienki z 100 pl rozcieńczenia 1:1000 przeciwciała monoklonalnego przeciwko wirionom Chemicon MAB 8740 w 1% odtłuszczonym mleku w TTBS przez godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki płukano trzy razy PBS/Tween 20, a następnie inkubowano ze 100 fil przeciwciała przeciwko mysim IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (Kirkegard i Peny Laboratories, Gaithersburg, MD) w rozcieńczeniu 1:1000 w 1%mleku+TT'BS przez godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie płukano trzykrotnie PBS/Tween 20 po czym dodano 100 pl substratu fosfatazy (fosforan p-nitrofenylu w buforze dietyloaminy). Płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję przerwano przez dodanie 50 pl 3N NaOH. Płytki odczytywano przy 405 nm w czytniku płytek ELISA.

Średniąodczytu OD4_05nm z dwóch studzienek skorygowaną wobec odczytu tła uzyskanego z kontrolnych białek drożdży wykreślano wobec całkowitej zawartości białek drożdży w studzience i pokazano na figurze 6. Klon drożdży hybrydowy HPV6/11 wytwarzał ponad 10x większą ilość natywnych VLP w porównaniu z klonem wt. Oprócz tego, na tych VLP obserwowano silnie neutralizujący epitop, rozpoznawany przez przeciwciało Chemicom MAB 8740.

Przykład 10. Badania w mikroskopie elektronowym

Do analizy EM (Structure Probe, West Chester, PA) porcję każdej z próbek umieszczono na siateczkach miedzianych mesh 200 pokrytych węglem. Na siateczce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Siateczki pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu przed badaniem transmisyjnąEM. Wszystkie nadania wykonywano stosując transmisyjny mikroskop elektronowy JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrofotografie miały powiększenie końcowe równe 100000x. Jak pokazano na figurze 7, obserwowano VLP w zakresie 45-55 nm średnicy we wszystkich próbkach HPV 11 z wyjątkiem próbek kontrolnych.

Przykład 11. Fermentacja HPV6/11 (szczep #1782)

Kulturę szczepu 1782 rosnącą na powierzchni płytki przeniesiono aseptycznie do płynnej pożywki bez leucyny zawierającej (na litr): 8,5 g Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokwasów i siarczanu amonu; 0,2 g adeniny; 0,2 g uracylu; 10 g kwasu sukcynylowego; 5 g siarczanu amonu; 0,25 g L-tyrozyny; pożywkę tę doprowadzono do pH 5,0-5,3 przy użyciu NaOH po czym sterylizowano. Po hodowli przez 25 godzin w 28°C, przy 250 obr./min. na wytrząsarce, przygotowano zamrożeniowe probówki przez dodanie sterylnej gliceryny do stężenia końcowego 17% (wag/obj), po czym przechowywano w -70°C (1 ml na probówkę). Inokulum przygotowywano w tej samej pożywce (750 ml na butelkę 2 1) i rozpoczęto je przez przeniesienie rozmrożonej zawartości probówki mrożeniowej i inkubację w 28°C, przy 250 obr./min na wytrząsarce przez 25 godzin. W fermentacji szczepu 1782 wykorzystywano fermentator Chemap 23L, o pojemności roboczej 181 po inokulacji. Pożywka produkcyjna zawierała (na litr): 20 g ekstraktu drożdżowego Difco; 10 g peptony HySoy Sheffield; 20 g glukozy; 20 g galaktozy; pH pożywki ustalano przed sterylizacjąna 5,3. Całą zawartość (500 ml) 2-litrowej butelki przenoszono do fermentatora, który inkubowano w 28°C, przy przepływie 9 1 powietrza na minutę, 500 obr./min, ciśnienie 3,5 psi. Wytrząsanie zwiększano jeżeli było konieczne utrzymanie wysycenia tlenu rozpuszczonego na poziomie powyżej 40%. Postęp fermentacji śledzono przez pomiar glukozy w trybie off-line (analizator Beckman Glucose 2 Analyzer) i spektrometrię masową w trybie on-line

183 299 (Perkin Elmer 1200). Po inkubacji przez 66 godzin, osiągnięto gęstości komórek 9,32 g suchej masy na litr. Zawartość dwóch takich fermentacji (17,51 brzeczki) połączono przed odzyskaniem komórek. Hodowle zatężono przez filtrację przez puste włókna (wkładka Amicon H5MP01-43 w układzie filtracyjnym Amicon DC-10) do około 2 litrów, diafiltrowano wobec 2 1 roztworu soli buforowanego fosforanem i dalej zatężono (do około 1 litra) po czym rozporcjonowano do 500-ml butelek wirowniczych. Zebrano osad komórkowy przez odwirowanie przy 8000 obr./min (rotor Sorval GS-3) przez 20 minut w 4°C. Po dekantacji nadsączu, osad (358 g komórek) przechowywano w -70°C do momentu zużycia.

Przykład 12. Oczyszczanie rekombinowanych białek kapsydu L1 HPV11

O ile nie zaznaczono inaczej wszystkie etapy prowadzono w 4°C.

Komórki przechowywano w zamrożeniu -70°C. Zamrożone komórki (wilgotna masa = 180 g) odmrożono w 20-23°C i zawieszono w 900 ml buforu (50 mM MOPS, pH 7,2,500 mM NaCl, 1 mM CaCł₂). Dodano inhibitorów proteaz AEBSF i pepstatynę A w stężeniu końcowym, odpowiednio, 1 mM i 1,7 pM. Zawiesinę komórek zniszczono przez czterokrotne przepuszczenie przez urządzenie M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) pod ciśnieniem 16000 psi. Do zniszczonej zawiesiny komórek dodano odpowiednią ilość 10% detergentu Triton X-100 (Pierce, Rockford, IL) doprowadzając stężenie TX100 do 0,5%. Zawiesinę mieszano przez 20 godzin. Lizat traktowany TX100 odwirowano przy 12000 x g przez 40 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Zebrano nadsącz zawierający antygen L1.

Nadsącz diafiltrowano wobec pięciu objętości 20 mM fosforanu sodu, pH 7,2,0,5 M NaCl stosując kasetę z membraną, o skośnym przepływie (Filtron, Northborough, MA). Materiał zatrzymany na membranie zawierał białko L1jak wykazano testem radioimmunologicznym i badaniem met. western blot.

Nadsącz wprowadzono do kolumny powinowactwa (11 x 5,3 cm) żywicy SP Spherodex (M)® (IBF, Villaneuve-la-Grenne, Francja) zrównoważonej 20 mM fosforanem sodu, pH 7,2,0,5 M NaCl. Po płukaniu buforem równoważącym i płukaniu 20 mM fosforanem sodu, pH 7,2,1,0 M NaCl, białko L1 eluowano płukaniem w 20 mM fosforanie sodu, pH 7,2, 2,5 M NaCl. Frakcje zbierano podczas płukania i elucji. Frakcje z kolumny badano na białko całkowite metodąBradforda. Frakcje analizowano met. western biot i SDS-PAGE z wykrywaniem koloidem Coomassie. Frakcje badano również testem radioimmunologicznym.

Frakcje z SP Spherodex wykazujące podobną czystość i zawartość białka L1 łączono.

Produkt końcowy analizowano metodą western blot i SDS-PAGE z wykrywaniem koloidem Coomassie. Białko L1 było w>90% czyste. Tożsamość białka L1 potwierdzono badaniem western blot. Produkt końcowy filtrowano aseptycznie przez membranę 0,22 pm i przechowywano w 4C. Proces dał 100 mg białka.

Analizę EM wykonała firma Structure Probe, West Chester, PA. Porcję każdej z próbek umieszczono na siateczkach miedzianych mesh 200 pokrytych węglem. Na siateczce umieszczano na 20 sekund kroplę 2% kwasu fosforowolframowego (PTA), pH 7,0. Siateczki pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu przed badaniem transmisyjną EM. Wszystkie badania wykonano stosując' transmisyjny mikroskop elektronowy JEOL 100CX (JEOL YSA, Inc.) przy napięciu przyspieszającym równym 100 kV. Powstałe mikrofotografie miały powiększenie końcowe równe 100000x.

Badanie metoda Bradforda na białko całkowite

Białko całkowite badano stosując dostępny w handlu zestaw Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL). Próbki rozcieńczano do odpowiedniego poziomu stosując wodę Milli-Q. Objętości wymagane do testu standardowego i mikrotestu wynosiły odpowiednio 0,1 ml i 1,0 ml. Dla obu protokołów zastosowano BSA (Pierce, Rockford, IL) w celu wykreślenia krzywych standardowych. Testy wykonywano stosując się do zaleceń producenta. Krzywe standardowe wykreślono stosując oprogramowanie CricketGraph® na komputerze Mackintosh lici.

Analiza SDS-PAGE i western biot

Wszystkie żele, bufory i aparat do elektroforezy pochodziły zNovex (San Diego, CA) i stosowane były według zaleceń producenta. Pokrótce, próbki rozcieńczano do równych stężeń

183 299 białka w wodzie Milli-Q mieszano 1:1 z buforem inkubacyjnym zawierającym 200 mM DTT. Próbki inkubowano 15 minut w 100°C i nakładano na odlany uprzednio 12% żel Tris-glicyna. Próbki rozdzielano elektroforetycznie przy 125V przez godzinę i 45 minut. Żele wywoływano stosując barwienia koloidem Coomassie stosując dostępny w handlu zestaw (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Do badania metodą western blot, białka przenoszono na membrany PVDF przy 25V przez 40 min. Membrany płukano wodą. Milli-Q i suszono na powietrzu. Przeciwciałem pierwotnym była królicza surowica poliklonalna wywołana przeciwko białku fuzyjnemu trpE-L1 HPV11 (dar od dr D. Brown). Roztwór przeciwciał wykonano przez surowicy odpornościowej w buforze do western blot (5% odtłuszczone mleko w 6,25 mM fosforanie sodu, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Inkubację prowadzono przez godzinę w 20-23°C. Membrany płukano przez minutę w trzech zmianach PBS (6,25 mM fosforan sodu, pH 7,2,150 mM NaCl). Roztwór przeciwciała wtórnego wytworzono przez rozcieńczenie koziej surowicy odpornościowej przeciwkróliczej skoniugowanej z fosfatazą alkaliczną (Pierce, Rockford, IL). Inkubacja przebiegała w tych samych warunkach przez przynajmniej 1 godzinę. Membrany płukanojak wcześniej i wywoływano stosując jednoetapowy proces z substratem NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Przykład 13. Wytwarzanie kompozycji immunogennych

Oczyszczane VLP mogą być formułowane znanymi sposobami, takimi jak mieszanie z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, stabilizatorem albo adiuwantem szczepionki. Immunogenne VLP według wynalazku mogąbyć preparowane jako szczepionka przez połączenie z fizjologicznie dopuszczalnymi kompozycjami, takimi jak np. PBS, roztwór soli albo woda destylowana. Immunogenne VLP według wynalazku sąpodawane w dawkach zawierających się od około 0,1 do 100 pg, korzystnie od około 1 pg do około 20 pg, w celu uzyskania efektu immunogennego. Skuteczna ilość VLP może być różna w zależności od różnych czynników takich jak stan ogólny osobnika, ciężar ciała, płeć i wiek. Kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczone osobnikowi różnymi drogami takimijak podskórna, miejscowa, doustna, śluzówkowa, dożylna i domięśniowa. Kompozycje VLP mogą obejmować jeden rodzaj VLP (tj. VLP z HPV11), albo mieszaninę VLP (tj. VLP z HPV6, HPV11, HPV16 i HPV18).

Ewentualnie może występować przeciwbakteryjny środek konserwujący, np. tiomersal. Antygeny immunogenne według niniejszego wynalazku mogą być użyte, jeżeli to konieczne, w kombinacji ze stabilizatorami szczepionek i adiuwantami. Typowe stabilizatory są konkretnymi związkami np. polianionami takimi jak heparyna, heksasiarczan inozytolu, siarczanowane β-cyklodekstryny, mniej swoiste zaróbki np. aminokwasy, sorbitan, mannitol, ksylitol, gliceryna, sacharoza, dekstroza, trehaloza i odmiany roztworów np. obojętne pH, wysoka siła jonowa (około 0,5 do 2,0 M sól), kationy dwuwartościowe (Ca²⁺, Mg²⁺). Przykładami adiuwantów są Al(OH)₃ i Al(PO4). Szczepionka według wynalazku może być przechowywana w postaci zamrożonej albo liofilizowanej.

Przykład 14. Wytwarzanie przeciwciał przeciwko VLP

Oczyszczone VLP mogą być zastosowane do wywoływania przeciwciał. Określenie „przeciwciało” w znaczeniu to zastosowanym oznacza zarówno przeciwciało poliklonalne jak i monoklonalne, jak również ich fragmenty jak Fv, Fab i F(ab)2, które sązdolne do wiązania antygenu bądź haptenu. Przeciwciała mogą być stosowane różnymi sposobami obejmującymi, choć nie ograniczonymi do oczyszczania rekombinowanych VLP, oczyszczania natywnych białek L1 i L2 i zestawów. Zestaw taki powinien obejmować podzielone opakowanie odpowiednie do przechowywania w bezpośrednim sąsiedztwie przynajmniej jednego pojemnika. Opakowanie powinno dalej zawierać odczynniki takie jak przeciwciała przeciwko VLP albo VLP odpowiednie do wykrywania HPV albo fragmentów HPV albo przeciwciał przeciwko HPV. Opakowanie może również zawierać środki do wykrywania takie jak znakowane antygeny albo substraty enzymów itp. Przeciwciała albo VLP albo zestawy są przydatne do różnych celów obejmujących, choć nie ograniczonych do analiz kryminalistycznych i badań epidemiologicznych.

183 299

OPIS OLIGOMERU: (# 241-1)

Bglll \

SphI

Kpnl

23 22 21 20 19 18 17 16

Xhol

I 11

14

ŁĄCZENIE FRAGMENTÓW:

ANILING OLIGOMERÓW LIGAĆJA

KLONOWANIE OSOBNO A, B, C D do pSP72 '

SEKWENCJONOWANIE

PONOWNE CIĘCIE W CELU UWOLNIENIA WSTAWKI

LIGACJA C i D do pSP72

CD

UWOLNIENIE CD z pSP72

TRAWIENIEM Kpnl, Bglll

LIGACJA z A trawionym Bglll, SphI i B TRAWIONYM SphI, Kpnl IZOLOWANIE FRAGMENTU Bglll wielkości 1,5 kb

FIG.1

183 299

20 30 40 50

Łowy—16L1 1 ATGTCTCTTT GGCTGCCTAG TGAGGCCACT GTCTACTTGC CTCCTGTCCC 50 hpv16!1.gb 1 ATGTCTCTTT GGCTGCCTAG TGAGGCCACT GTCTACTTGC CTCCTGTCCC 50 hpv16l1.mrl 1 ATGTCTCTTT GGCTGCCTAG TGAGGCCACT GTCTACTTGC CTCCTGTCCC 50

70 80 90 100

Lowy-16L1 51 AGTATCTAAG GTTGTAAGCA CGGATGAATA TGTTGCACGC ACAAACATAT 100 hpv1611 .gb 51 AGTATCTAAG GTTGTAAGCA CGGATGAATA TGTTGCACGC ACAAACATAT 100 hpv16l1.mrl 51 AGTATCTAAG GTTGTAAGCA CGGATGAATA TGTTGCACGC ACAAACATAT 100

110 120 130 140 150

Lowy-16L1 101 ATTATCATGC AGGAACATCC AGACTACTTG CAGTTGGACA TCCCTATTTT 150 hpv1611 .gb 101 ATTATCATGC AGGAACATCC AGACTACTTG CAGTTGGACA TCCCTATTTT 150 hpv1611 .mrI 101 ATTATCATGC AGGAACATCC AGACTACTTG CAGTTGGACA TCCCTATTTT 150

160 170 180 190 200 lowy-1611 151 CCTATTAAAA AACCTAACAA TAACAAAATA TTAGTTCCTA AAGTATCAGG 200 hpv16l1.gb 151 CCTATTAAAA AACCTAACAA TAACAAAATA TTAGTTCCTA AAGTATCAGG 200 hpv16l1.mrl 151 CCTATTAAAA AACCTAACAA TAACAAAATA TTAGTTCCTA AAGTATCAGG 200

210 220 230 240 250

Lowy-1611 201 ATTACAATAC AGGGTATTTA GAATACATTT ACCTGACCCC AATAAGTTTG 250 hpv16l1.gb 201 ATTACAATAC AGGGTATTTA GAATACATTT ACCTGACCCC AATAAGTTTG 250 hpv 1611 .mr I 201 ATTACAATAC AGGGTATTTA GAATACATTT ACCTGACCCC AATAAGTTTG 250

260 270 280 290 300

Lowy-1611 251 GTTTTCCTGA CACCTCATTT TATAATCCAG ATACACAGCG GCTGGTTTGG 300 hpv16l1.gb 251 GTTTTCCTGA CACCTCATTT TATAATCCAG ATACACAGCG GCTGGTTTGG 300 hpv16l 1 .mr I 251 GTTTTCCTGA CACCTCATTT TATAATCCAG ATACACAGCG GCTGGTTTGG 300

310 320 330 340 350

Lowy-16L1 301 GCCTGTGTAG GTGTTGAGGT AGGTCGTGGT CAGCCATTAG GTGTGGGCAT 350 hpv1611 .gb 301 GCCTGTGTAG GTGTTGAGGT AGGTCGTGGT CAGCCATTAG GTGTGGGCAT 350 hpv1611 .mr I 301 GCCTGTGTAG GTGTTGAGGT AGGTCGTGGT CAGCCATTAG GTGTGGGCAT 350

360 370 380 390 400

Lowy-16L1 351 TAGTGGCCAT CCTTTATTAA ATAAATTGGA TGACACAGAA AATGCTAGTG 400 hpv1611 .gb 351 TAGTGGCCAT CCTTTATTAA ATAAATTGGA TGACACAGAA AATGCTAGTG 400 hpv16M.mrl 351 TAGTGGCCAT CCTTTATTAA ATAAATTGGA TGACACAGAA AATGCTAGTG 400

410 420 430 440 450

Lowy-1611 401 CTTATGCAGC AAATGCAGGT GTGGATAATA GAGAATGTAT ATCTATGGAT 450 hpv1611 .gb 401 CTTATGCAGC AAATGCAGGT GTGGATAATA GAGAATGTAT ATCTATGGAT 450 hpv16l1.mrl 401 CTTATGCAGC AAATGCAGGT GTGGATAATA GAGAATGTAT ATCTATGGAT 450

FIG.2A

183 299

460 470 480 490 500

Lowy-16L1 451 TACAAACAAA CACAATTGTG TTTAATTGGT TGCAAACCAC CTATAGGGGA 500 hpv16ll.gb 451 TACAAACAAA CACAATTGTG TTTAATTGGT TGCAAACCAC CTATAGGGGA 500 hpv!6l 1 .mr I 451 TACAAACAAA CACAATTGTG TTTAATTGGT TGCAAACCAC CTATAGGGGA 500

510 520 530 540 550

Lowy-16L1 501 ACACTGGGGC AAAGGATCCC CATGTACCAA TGTTGCAGTA AATCCAGGTG 550 hpv1611 .gb 501 ACACTGGGGC AAAGGATCCC CATGTACCAA TGTTGCAGTA AATCCAGGTG 550 hpv16l1.mrl 501 ACACTGGGGC AAAGGATCCC CATGTACCAA TGTTGCAGTA AATCCAGGTG 550

560 570 580 590 600

Lowy-16L1 551 ATTGTCCACC ATTAGAGTTA ATAAACACAG TTATTCAGGA TGGTGATATG 600 hpv16l1.gb 551 ATTGTCCACC ATTAGAGTTA ATAAACACAG TTATTCAGGA TKJTGATATG 600 hpv!6l 1 .mr I 551 ATTGTCCACC ATTAGAGTTA ATAAACACAG TTATTCAGGA TGGTGATATG 600

610 620 630 640 650

Lowy-16L1 601 GTTGATACTG GCTTTGGTGC TATGGACTTT ACTACATTAC AGGCTAACAA 650 hpv16l 1 .gb 601 GT10ATACTG GCTTTGGTGC TATGGACTTT ACTACATTAC AGGCTAACAA 650 hpv16l 1 .mr I 601 GTTGATACTG GCTTTGGTGC TATGGACTTT ACTACATTAC AGGCTAACAA 650

660 670 680 690 700

Lowy-16L1 651 AAGTGAAGTT CCACTGGATA TTTGTACATC TATTTGCAAA TATCCAGATT 700 hpv!6ll.gb 651 AAGTGAAGTT CCACTGGATA TTTGTACATC TATTTGCAAA TATCCAGATT 700 hpvl6H.mrl 651 AAGTGAAGTT CCACTGGATA TTTGTACATC TATTTGCAAA TATCCAGATT 700

710 720 730 740 750

Lowy-16L1 701 ATATTAAAAT GGTGTCAGAA CCATATGGCG ACAGCTTATT TTTTTATTTA 750 hpv16l1.gb 701 ATATTAAAAT GGTGTCAGAA CCATATGGCG ACAGCTTATT TTTTTATTTA 750 hpv16l 1 .mrl 701 ATATTAAAAT GGTGTCAGAA CCATATGGCG ACAGCTTATT TTTTTATTTA 750

760 770 780 790 800

Lowy-16L1 751 CGAAGGGAAC AAATGTTTGT TAGACATTTA TTTAATAGGG CTGGTACTGT 800 hpv16l1.gb 751 CGAAGGGAAC AAATGTTTGT TAGACATTTA TTTAATAGGG CTGGTACTGT 800 hpv16l1 .mr I 751 CGAAGGGAAC AAATGTTTGT TAGACATTTA TTTAATAGGG CTGG1&TGT 800

810 820 830 840 850

Lowy-1611 801 TGGTGAAAAT GTACCAGACG ATTTATACAT TAAAGGCTCT GGGTCTACTG 850 hpv16l1.gb 801 TGGTGAAAAT GTACCAGACG ATTTATACAT TAAAGGCTCT GGGTCTACTG 850 hpv16l 1 .mrl 801 TGGTGAAAAT GTACCAGACG ATTTATACAT TAAAGGCTCT GGGTCTACTG 850

860 870 880 890 900

Lowy-16L1 851 CAAATTTAGC CAGTTCAAAT TATTTTCCTA ęACCTAGTGG TTCTATGGTT 900 hpv16l1.gb 851 CAAATTTAGC CAGTTCAAAT TATTTTCCTA CACCTAGTGG TTCTATGGTT 900 hpv1611 .mr I 851 CAAATTTAGC CAGTTCAAAT TATTTTCCTA CACCTAGTGG TTCTATGGTT 900

FIG.2B

183 299

910 920 930 940 950

Łowy—16L1 901 ACCTCTGATG CCCAAATATT CAATAAACCT TATTGGTTAC AACGAGCACA 950 hpv16l1.gb 901 ACCTCTGATG CCCAAATATT CAATAAACCT TATTGGTTAC AACGAGCACA 950 hpv16l 1 .mr I 901 ACCTCTGATG CCCAAATATT CAATAAACCT TATTGGTTAC AACGAGCACA 950

960 970 980 990 1000

Lowy-1611 951 GGGCCACAAT AATGGCATTT GTTGGGGTAA CCAACTATTT GTTACTGTTG 1000 hpv16l1.gb 951 GGGCCACAAT AATGGCATTT GTTGGGGTAA CCAACTATTT GTTACTGTTG 1000 hpv!6l1.mrl 951 GGGCCACAAT AATGGCATTT GTTGGGGTAA CCAACTATTT GTTACTGTTG 1000

1010 1020 1030 1040 1050

Lowy-16L1 1001 TTGATACTAC ACGCAGTACA AATATGTCAT TATGTGCTGC CATATCTACT 1050 hpv16M.gb 1001 TTGATACTAC ACGCAGTACA AATATGTCAT TATGTGCTGC CATATCTACT 1050 hpv16l 1 .mr I 1001 TTGATACTAC ACGCAGTACA AATATGTCAT TATGTGCTGC CATATCTACT 1050

1060 1070 1080 1090 1100

Łowy—16L1 1051 TCAGAAACTA CATATAAAAA TACTAACTTT AAGGAGTACC TACGACATGG 1100 hpv16l1.gb 1051 TCAGAAACTA CATATAAAAA TACTAACTTT AAGGAGTACC TACGACATGG 1100 hpv16H.mrl 1051 TCAGAAACTA CATATAAAAA TACTAACTTT AAGGAGTACC TACGACATGG 1100

1110 1120 1130 1140 1150

Łowy—16L1 1101 GGAGGAATAT GATTTACAGT TTATTTTTCA ACTGTGCAAA ATAACCTTAA 1150 hpv16l1.gb 1101 GGAGGAATAT GATTTACAGT TTATTTTTCA ACTGTGCAAA ATAACCTTAA 1150 hpv16l 1 .mrI 1101 GGAGGAATAT GATTTACAGT TTATTTTTCA ACTGTGCAAA ATAACCTTAA 1150

1160 1170 1180 1190 1200

Łowy—16L1 1151 CTGCAGACGT TATGACATAC ATACATTCTA TGAATTCCAC TATTTTGGAG 1200 hpv16l1.gb 1151 CTGCAGACGT TATGACATAC ATACATTCTA TGAATTCCAC TATTTTGGAG 1200 hpv16l 1 .mr I 1151 CTGCAGACGT TATGACATAC ATACATTCTA TGAATTCCAC TATTTTGGAG 1200

Łowy—16L1 hpv16I1.gb hpv1611.mrI

1210 1220 1230 1240 1250 1201 GACTGGAATT TTGGTCTACA ACCTCCCCCA GGAGGCACAC TAGAAGATAC 1201 GACTGGAATT TTGGTCTACA ACCTCCCCCA GGAGGCACAC TAGAAGATAC 1201 GACTGGAATT TTGGTCTACA ACficCCCA GGAGGCACAC TAGAAGATAC

1250

1260 1270 1280 1290 1300

Lowy-16L1 1251 TTATAGGTTT GTAACRtC AGGCAATTGC TTGTCAAAAA CATACACCTC 1300 hpv16l1.gb 1251 TTATAGGTTT GTAACbJC AGGCAATTGC TTGTCAAAAA CATACACCTC 1300 hpv16l 1 .mr I 1251 TTATAGGTTT GTAACATCCC AGGCAATTGC TTGTCAAAAA CATACACCTC 1300

1310 1320 1330 1340 1350

Lowy-16L1 1301 CAGCACCTAA AGAAGATGAT CCCCTTAAAA AATACACTTT TTGGGAAGTA 1350 hpv16l1.gb 1301 CAGCACCTAA AGAAGATGAT CCCCTTAAAA AATACACTTT TTGGGAAGTA 1350 hpv16l1.mrl 1301 CAGCACCTAA AGAAGAlB CCCCTTAAAA AATACACTTT TTGGGAAGTA 1350

FIG.2C

183 299

1360 1370 1380 1390 1400

Łowy—16L1 1351 AATTTAAAGG AAAAGTTTTC TGCAGACCTA GATCAGTTTC CTTTAGGACG 1400 hpv16l 1 .gb 1351 AATTTAAAGG AAAAGTTTTC TGCAGACCTA GATCAGTTTC CTTTAGGACG 1400 hpv16l 1 .ror I 1351 AATTTAAAGG AAAAGTTTTC TGCAGACCTA GATCAGTTTC CTTTAGGACG 1400

1410 1420 1430 1440 1450

Lowy-16L1 1401 CAAATTTTTA CTACAAGCAG GATTGAAGGC CAAACCAAAA TTTACATTAG 1450 hpv16l1.gb 1401 CAAATTTTTA CTACAAGCAG GATTGAAGGC CAAACCAAAA TTTACATTAG 1450 hpv16H.mrł 1401 CAAATTTTTA CTACAAGCAG GATTGAAGGC CAAACCAAAA TTTACATTAG 1450

1460 1470 1480 1490 1500

Lowy-16L1 1451 GAAAACGAAA AGCTACACCC ACCACCTCAT CTACCTCTAC AACTGCTAAA 1500 hpv16l1.gb 1451 GAAAACGAAA AGCTACACCC ACCACCTCAT CTACCTCTAC AACTGCTAAA 1500 hpv16l1.mrl 1451 GAAAACGAAA AGCTACACCC ACCACCTCAT CTACCTCTAC AACTGCTAAA 1500

1510 1520 1530 1540 1550

Lowy-16L1 1501 CGCAAAAAAC GTAAGCTGTA L................... ..........

hpv 1611. gb 1501 CGCAAAAAAC GTAAGCTGTA A.............................

hpv16l1.rarl 1501 CGCAAAAAAC GTAAGCTGTA A.............................

1550

FIG.2D

183 299

FIG.3

183 299

FIG.4

183 299 kDa

200

fuMi-’»·’

FIG.5

183 299

0.001 0.01 0.1 1

CAłKOWITE BIAŁKO, gg

FIG.6

183 299

FIG.7

183 299

20 30

ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAGTATAT

80 90

GHGCCACGG ATGCTTATGT TAAACGCACC 130 140 150

CTTCTTGCAG TGGGTCATCC TTATTATTCC 190 200 210

AAGGTGTCAG GATATCAATA CAGAGTATTT 250 260 270

GCAHGCCTG ACTCGTCTCT TTTTGATCCC 310 320 330

GGCCTAGAGG TGGGCCGGGG ACAGCCATTA 370 380 390

AATAAATATG ATGATGTTGA AAATTCAGGG 430 440 450

AGGGTTAATG TAGGTATGGA TTATAAACAA 490 500 510

CCTTTGGGCG AGCATTGGGG TAAAGGTACA 550 560 570

GACTGCCCGC CCTTAGAACT TATTACCAGT 610 620 630

GGCTTTGGTG CTATGAATTT TGCTGATTTG 670 680 690

ATATGTGGCA CTGTATGTAA ATATCCAGAT 730 740 750

GATAGATTAT TTTTTTATCT ACGGAAGGAA 790 800 810

GCTGGTACCG TGGGGGAACC TGTGCCTGAT 850 860 870

TCGTCTGTAG CGAGTAGTAT ATATGTTCAC 910 920 930

GCACAATTGT TTAATAAGCC ATATTGGCTA 970 980 990

TGTTGGGGTA ATCATCTGTT TGTTACTGTG 1030 1040 1050

TTATGTGCAT CCGTATCTAA ATCTGCCACA 1090 1100 1110

CGTCATGTGG AAGAGTTTGA TTTACAATTT 1150 1160 1170

GCTGAAGTAA TGGCCTATAT TCACACAATG 1210 1220 1230

GGGTTATCGC CTCCCCCAAA TGGTACACTC

50 60

GTGCCTCCTC CTAACCCTGT ATCCAAAGn 100 110 120

AACATATTTT ATCATGCCAG CAGTTCTAGA

160 170 180

ATAAAAAAGG TTAACAAAAC TGTTGTGCCA

220 230 240

AAGGTGGTGT TACCAGATCC TAACAAATTT

280 290 300

ACAACACAAC GTTTGGTATG GGCATGCAĆA

340 350 360

GGTGTGGGTG TAAGTGGACA TCCTTTACTA

400 410 420

GGTTACGGTG GTAACCCTGG ACAGGATAAC

460 470 480

ACACAATTAT GCATGGTTGG ATGTGCCCCC

520 530 540

CAGTGTAGTA ATACATCTGT ACAGAATGGT

580 590 600

GTTATACAGG ATGGCGATAT GGTTGACACA

640 650 660

CAGACCAATA AATCAGATGT TCCTCTTGAC

700 710 720

TATTTACAAA TGGCTGCAGA CCCATATGGT

760 770 780

CAAATGTTTG CCAGACATTT TTTTAACAGG

820 830 840

GATCTTTTAG TTAAGGGTGG TAACAATCGC

880 890 900

ACCCCAAGCG GCTCTTTGGT GTCCTCTGAG

940 950 960

CAAAAAGCCC AGGGACATAA CAATGGTATT 1000 1010 1020

GTAGATACCA CACGCAGTAC CAACATGACA 1060 1070 1080

TACACCAATT CTGATTATAA AGAGTACATG 1120 1130 1140

ATTTTTCAAT TATGTAGCAT TACATTGTCT 1180 1190 1200

AATCCCTCTG TTCTCGAAGA CTGGAACTTT 1240 1250 1260

GAGGATACCT ATAGGTATGT GCAGTCACAG

FIG. 8A

183 299

1270 1280 1290 1300 1310 1320

GCCATTACCT GTCAAAAGCC CACTCCTGAA AAGGAAAAGC AAGATCCCTA TAAGGACATG

1330 1340 1350 1360 1370 1380

AGTTTTTGGG AGGTTAATTT AAAAGAAAAG TTTTCTAGTG AATTGGATCA GTTTCCTTTG

1390 1400 1410 1420 1430 1440

GGACGCAAGT TTTTGTTACA AAGTGGATAT AGGGGACGGA CCTCTGCTCG TACCGGTATT

1450 1460 1470 1480 1490 1500

AAGCGCCCTG CTGTTTCCAA ACCCTCTACT GCCCCTAAAC GTAAGCGCAC CAAAACTAAA

1510 1520 1530 1540 1550 1560

AAGTAA......................................................

FIG. 8B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowana i oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11 o sekwencji pokazanej na figurze 8 albo jej funkcjonalną pochodną, wolną, od wewnętrznych sygnałów przerywających transkrypcję rozpoznawanych przez drożdże.
2. Wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11 o sekwencji pokazanej na figurze 8 albo jej funkcjonalną pochodną, wolną od wewnętrznych sygnałów przerywających transkrypcję rozpoznawanych przez drożdże.
3. Wektor ekspresyjny według zastrz. 2, będący D362-1.
4. Kompozycja obejmująca kwas nukleinowy, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11 o sekwencji pokazanej na figurze 8 albo jej funkcjonalnąpochodną, wolną od wewnętrznych sygnałów przerywających transkrypcję rozpoznawanych przez drożdże albo komplementarny do niej RNA.

Wynalazek dotyczy izolowanej i oczyszczonej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko L1 ludzkiego wirusa brodawczaków typu 11, wektora ekspresyjnego obejmującego tę cząsteczkę oraz kompozycji obejmującej tę cząsteczkę.

Figura 1 pokazuje schemat konstruowania hybrydowego genu L1 HPV6/11 przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów.

Figura 2 pokazuje sekwencję nukleotydowąhybrydy L1HPV6/11, opublikowanąsekwencję genów L1 HPV6a i HPV11.

Figura 3 pokazuje dwukierunkowy drożdżowy wektor ekspresyjny pGAL 1-10 zastosowany do ekspresji białek L1 kapsydu wirusa brodawczaków.

Figura 4 pokazuje analizę metodąNorthern mRNA L1 HPV11 ekspresjonowanego w drożdżach.

Figura 5 pokazuje ekspresję białka L1 HPV11 w drożdżach badaną metodą Western biot (badanie immunologiczne).

Figura 6 pokazuje aktywność VLP L1 HPV6/11 ekspresjonowanego przez HPV11 typu dzikiego (wt) w porównaniu z hybrydowym DNA HPV6/11, określoną techniką ELISA.

Figura 7 pokazuje fotografię z mikroskopu elektronowego VLP L1 HPV6/11 ekspresjonowanego w drożdżach.

Figura 8 pokazuje sekwencję nukleotydową genu hybrydowego HPV6/11.

Zakażenia wirusem brodawczaków (PV) następują u różnych zwierząt, w tym u ludzi, owiec, psów, kotów, królików, małp, węży i bydła. Wirusy brodawczaków zakażają komórki nabłonka, ogólnie, wywołując łagodne guzy nabłonkowe albo włóknistonabłonkowe w miejscu zakażenia. PV stanowią gatunkowo swoisty czynnik zakaźny: ludzkie wirusy brodawczaków nie zakażają zwierząt nie będących ludźmi.

Wirusy brodawczaków mogą być podzielone na osobne grupy, w oparciu o gospodarza, którego zakażają. Ludzkie wirusy brodawczaków (HPV) sądalej dzielone na ponad 70 rodzajów, w oparciu o homologię sekwencji DNA. Rodzaje PV wydają się być immunogenami swoistymi dla rodzaju, i odporność neutralizująca jeden rodzaj wirusa brodawczaków nie zapewnia odporności w stosunku do innego rodzaju wirusa brodawczaków.

183 299

U ludzi, różne rodzaje HPV powodują różne choroby. HPV typów 12, 3,4, 7, 10 i 26-29 powodują łagodne brodawki u osobników zarówno normalnych jak i poddanych immunosupresji. HPV typów 5,8,9, 12,15,17,19-25,36 i 46-50 powoduj ąpłytkie owrzodzenia u osobników poddanych immunosupresji. HPV typów 6,11,34,39,41 -44 i 51 -55 powodująniezłośliwe kłyciny na śluzówce narządów płciowych i układu oddechowego. HPV typów 16 i 18 powodują dysplazję nabłonkową na śluzówce narządów płciowych i są związane z większością raków in situ i inwazyjnych szyjki macicy, pochwy, sromu i kanału odbytu.

Wirusy brodawczaków są małymi (50-60 nm) bezotoczkowymi, ejkozaedralnymi wirusami DNA, kodującymi ponad osiem genów wczesnych i dwa późne. Otwarte ramki odczytu (ORF) genomów wirusa oznaczone zostały od El do E7 i L1 oraz L2, gdzie „E” oznacza wczesny, zaś „L” oznacza późny. L1i L2 koduuąbiałka kapsydu wirusa. Geny wczesne (E) związane są z takimi funkcjami wirusa jak replikacja i transformacja komórkowa.

Białko L1 stanowi główne białko kapsydu o ciężarze cząsteczkowym równym 55-60 kDa. Białko L2jest pobocznym białkiem kapsydu o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym 55-60 kDa i prawdopodobnym ciężarze cząsteczkowym 75-100 kDa, co stwierdzono przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym. Dane immunologiczne wskazują, że większość białka L2 jest stanowi wnętrze białka L1 w kapsomerze wirusa. ORF L1jest silnie zakonserwowana wśród różnych wirusów brodawczaków. Białka L2 są mniej zakonserwowane wśród różnych wirusów brodawczaków.

Stwierdzono, że geny L1 i L2 sądobrymi celami immunoprofilaktycznymi. Badania na wirusie brodawczaków królików amerykańskich (CRPV) i bydlęcych (BPV) pokazały, że immunizacja białkami L 1i L2 ekspresjonowanymi w bakteriach albo przy użyciu wektorów krowianki chroni zwierzęta przed zakażeniem wirusowym. Ekspresja genów L1 wirusa brodawczaków w układach ekspresyjnych bakulowirusa albo przy użyciu wektorów krowianki powodowała łączenie się cząstek wiroidalnych (VLP), które zastosowano do wywołania wysokich zmian przeciwciał neutralizujących wirusa, co korelowało z ochroną podczas ekspozycji na wirusa. Ponadto, geny L1 i L2 zastosowano do wytwarzania szczepionek do zapobiegania i leczenia zakażeń wirusami brodawczaków u zwierząt.

Opracowanie i komercjalizacja szczepionek profilaktycznych i terapeutycznych przeciwko zakażeniom i chorobom wywołanym przez PV, zawierających białko L1, białka L1+L2 albo zmodyfikowane białka L1 albo L1+L2 uniemożliwiane było przez brak dużych ilości oczyszczonego wirusa i oczyszczonego białka. Ponieważ PV jest trudny do hodowania in vitro, trudne jest wytworzenie potrzebnych ilości białka L1i L2 przez namnożenie PV in vitro. Powstałe problemy ze źródłem utrudniają charakteryzację PV i białek PV. Przydatne byłoby zatem opracowanie łatwo odnawialnego źródła surowych białek PV, zwłaszcza białek L1i L2 PV albo zmodyfikowanych białek L1 i L2. Powinno być również przydatne opracowanie sposobów oczyszczania dużych ilości surowych białek wirusa brodawczaków, o poziomie czystości odpowiednim do badań immunologicznych i opracowania szczepionki. Powinno być również przydatne wytworzenie znacznych ilości białek wirusa brodawczaków wykazujących właściwości zapewniające odporność białek natywnych, takie jak konformacja białka natywnego. Oprócz tego, powinno być przydatne opracowanie sposobów analizowania białek PV i sposobów określania względnej czystości białek, jak również kompozycji zawierających białka. Takie wysoce oczyszczone białka powinny być również przydatne do wytwarzania różnych reagentów przydatnych w badaniu zakażeń PV; reagenty takie obejmują, choć nie sąograniczone do przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał monoklonalnych i wzorców analitycznych.

HPV6 i HPV11 są przyczy ną~90% łagodnych brodawek genitalnych i tylko wyjątkowo wiążą się ze zmianami złośliwymi (Gissmann i in., PNAS 80, 560-563). HPV6a uważany jest za najczęstszy podtyp HPV6 w kłycinach kończystych (Brown i in., J. Clin. Microbiol. 31:1667-1673). Liczba przyjęć z powodu brodawek genitalnych (kłykcin kończystych albo płaskich) rośnie w ostatnich czasach. Ocenia się, że ~ 10% populacji ogólnej (w wieku 15-49 lat) cierpi na zakażenia układu płciowego HPV (Koutsky i in., 1988, Epidemiol. Rev. 10,122-163). Podczas gdy większość kłykcin związanych jest- z HPV6, w przypadku brodawczakowatości

183 299 krtani dominującym typemjest HPV 11. Replikacja HPV 11 w komórkach nabłonkowych układu oddechowego stymuluje te komórki do proliferacji, co może prowadzić do ograniczonych zmian o małym znaczeniu klinicznym albo do licznych rozsianych zmian i choroby nawrotowej. Nawracająca brodawczakowatość układu oddechowego, choroba częściej dotykająca populację młodszą, może być chorobązagrażającążyciu powodując zaniknięcie dróg oddechowych. Ostatnio, opracowano model zwierzęcy umożliwiający replikację zakaźnego HPV11 (Kreider i in., 1985, Nature 317,639-640; Kreider i in., 1987, J. Virol. 61,590-593). Model umożliwił identyfikację konformacyjnych epitopów neutralizujących natywnych wirionów i VLP ekspresjonowanych w bakulowirusie przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (Christiansen i in., 1990, J. Virol. 64, 5678-5681; Christiansen i Kreider 1991, Virus Res. 21,169-179; Christansen i Kreider 1993, Virus Res. 28,195-202; Christiansen i in., 1994, 75,2271-2276).

Cząsteczki wiroidalne zawierające białko L1 HPV 11 ekspresjonowano w układach komórek owadzich jak i komórek ssaków. Ekspresja VLP w komórkach drożdży posiada takie zalety jak efektywność nakładów i łatwą adaptację do hodowli na wielką skalę w fermentorach. Jednakże, białko L1 HPV 11 ulega słabej ekspresji w komórkach drożdży. Jest to jak zaobserwowano, wynikiem okrawania mRNA L1 HPV11. W przeciwieństwie, gen L1 HPV6 ulega transkrypcji jako mRNA pełnej długości i jest ekspresjonowany w znacznych ilościach. Przez modyfikowanie DNA L1 HPV6 w taki sposób, że koduje on białko L1HPV11, możliwe jest ułatwienie transkrypcji mRNA pełnej długości powodujące zwiększenie ekspresji białka L1 HPV11. Niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji genu hybrydowego L1 HPV6/11, jak również sposobu konstruowania hybrydowego genu L1 HPV6/11 przy użyciu oligonukleotydów syntetycznych. Gen hybrydowy został zaprojektowany przy użyciu sekwencji L1 HPV6a (Hofman i in., 1995, Virology, przyjęte do publikacji), ale zawierał minimalną liczbę zmienionych zasad, niezbędną do kodowania białka L1 HPV 11. W przeciwieństwie do genu L1 HPV11 typu dzikiego, gen hybrydowy HPV6/11 nie zawierał rozpoznawanych przez drożdże wewnętrznych sygnałów przerywających transkrypcję; w wyniku tego tworzony był mRNA HPV6/11 pełnej długości i zwiększona była ekspresja białka L1 HPV 11.

Niniejszy wynalazek dotyczy wysoko oczyszczonego białka L1 PV. Wynalazek dotyczy również sposobów wytwarzania i oczyszczania rekombinowanych białek wirusa brodawczaków wykazujących właściwości zapewniające odporność natywnych białek wirusa brodawczaków-'. Niniejszy wynalazek dotyczy również wytwarzania szczepionek profilaktycznych i terapeutycznych przeciwko zakażeniom wirusem brodawczaków. Mikroskopia elektronowa i wiązanie z przeciwciałami konformacyjnymi wykazuje, że rekombinowane białka według niniejszego wynalazku są zdolne do tworzenia cząstek wiroidalnych.

Niniejszy wynalazek dotyczy syntetycznej cząsteczki DNA kodującej oczyszczone białko L1 wirusa brodawczaków typu 11 i jej pochodnych.