HU228490B1 - Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein - Google Patents

Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein Download PDF

Info

Publication number
HU228490B1
HU228490B1 HU9801608A HUP9801608A HU228490B1 HU 228490 B1 HU228490 B1 HU 228490B1 HU 9801608 A HU9801608 A HU 9801608A HU P9801608 A HUP9801608 A HU P9801608A HU 228490 B1 HU228490 B1 HU 228490B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
gene
dna
yeast
proteins
Prior art date
Application number
HU9801608A
Other languages
English (en)
Inventor
Hugh A George
Kathryn J Hofmann
Kathrin U Jansen
Joseph G Joyce
Ernest Dale Lehman
Michael P Neeper
Original Assignee
Merck Sharp & Dohme
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27022236&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU228490(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merck Sharp & Dohme filed Critical Merck Sharp & Dohme
Publication of HUP9801608A2 publication Critical patent/HUP9801608A2/hu
Publication of HUP9801608A3 publication Critical patent/HUP9801608A3/hu
Publication of HU228490B1 publication Critical patent/HU228490B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A 11. típusú humán papillomavirusból .származó- Ll~ fehérjét kódoló szintetikus HPVS/li-Ll-hifcrid-DNS
A találmány tárgyát szintetikus ONS-moiekulák képezik, melyek a tisztított 11. típusú humán papiliomavírusből származó Ll-fedérjét kódolják. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-moiekulákat tartalmazó vektorok, a találmány szerinti molekulákat tartalmazó készítmények, valamint a találmány szerinti molekulák alkalmazása papullomavírus által okozott fertőzések kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható papiliomavírusos fertőzések megelőzésére és kezelésére.
Az 1. ábra a HPV6/Il~hlbríd~Ll~gén szintetikus oligonnkleotidők alkalmazásával felépített sematikus vázlaA kt a s z ámun k: 3 δ 4 2 7-2ö37/PÁ * * * 9 + ~
A 2. ábrán látható a HPVé/ll-hibrid-, valamint a publikált HPVőa- és a publikált KP711-LI-gének nukeofcidszekvanciája.
A 3. ábrán látható a pGAL-10-jelű kétirányú élesztőeredetű expressziós vektor, amelyet papi!lomavirus-Ll·kapszidfehérjók kifejezésére alkalmaztunk.
A 4. ábra az élesztőből származó HPVll-Ll-mKNS
Northern-analízisét mutatja be.
Az 5. ábra mutatja be a HPV1 i-Li-fehérje expresszlóját élesztőben Western-blot-analizíssel (immnnobiot; .
A 6. ábra mutatja be a vad típusú (wtíüPVll által kifejezett HPVll-Ll-VLP-k ELTSA-reaktivitását a HP'VS/Ilhíbrid-SNS által kifejezetthez hason!itva,
A 7, ábra látható az élesztőben kifejezett HPV11-L1VLP-k eiektronmikrográfja.
A 8. ábrán látható a HPYú/il-hibridgén nukieotidszekvénei áj a.
Papáilomavlrus (PVj által okozott fertőzések sokféle állati és emberi szervezetben előfordulnak, például emberekben, disznókban, kutyákban, macskákban, nyulakban, majmokban, kígyókban, és szarvasmarhákban. A papillomavírus az epitél sejteket fertőzi meg, általában jóindulatú epitél vagy fibroepítél tujsoro-kat indukálva a fertőzés helyén. A PV-k fajspecáfikus fertőző ágensek; a humán papillomavítus nem képes megfertőzni állati szervezetet.
A papillomevirusokat jói megkülönböztethető csoportokra oszthatjuk a megfertőzött gazdaszervezet alapján. A humán papillomavítusok (HPV) tovább csoportosíthatók több, * Λ ♦<
mint 70 típusra a DNS.-szekvencia homolőgiája alapján. A PV~ típusok tlpusspeci.fikus ímmunogének, amely szerint az egyik típusú fertőzést semlegesítő immunitás nem biztosit védelmet egy másik típusú papíllomavírus fertőzése ellen.
Emberekben a különböző HPV-tipusok különféle megbetegedést váltanak ki. Az 1., 2., 3., 4., 7., 10. és 26-29. típusú HPV jóindulatú szemölcsöket okoz mind normál, mind legyengült immunitással rendelkező egyénekben. Az 5., 8., 9,, 12,, 14., 15., 1'7., 19-2.5., 36. és 46-50. típusú HPV sekély felületi sebet vált ki legyengült immunitással redeikező egyénekben. A 6., 11., 34., 39., 41-44. és :51-55.. típusú HPV a genitális mukőza epítél di.szpl.azi áj át váltja ki és a méhnyak, hüvely, külső szeméremtest és végbőlcsatorna ráterjedő iinvasíve) és in sizx karcinómáinak többségével asszociált.
A papillomavirus kisméretű (50-60 nm), burkolatlan, ikozaéder alakú DNS-virus, amely maximum nyolc korai és két késői gént kódol. A víruseredetö genomok nyitott leolvasási fázisait <ÖRF) Sl~től E8~i.g és L1-, L2-vel jelöljük, ahol az £ felel meg a korai és az wLíf a késői géneknek. Az Elés az 1,2-gén a vírus kapszídfehérjéit kódolja. A korai <E) gének asszociáltak a funkciókkal, például a virusreplikáciővai, transzkripciós szabályzással és a celluláris transzformációval.
Az Ll-fehérje a fő kapszídfehérje, molekulatömege 5560 kDa, Az L2~fehérje a kisebb mennyiségben előforduló kapszidfehérje, előre látható molekulatömege 55-60 kDa, poilakrílamíd-gélelektroforézissei meghatározott látszata*χ : ** * * ♦ «* * * * * « «.
* »**!,» φ Κ ♦ ♦ ·»« , gos molekulatömege 75-100 kba. Immunológiai adatok azt támasztják alá, hogy az L2-fehérje nagyobb része as L2fehérjén belül helyezkedik el a víruskapszomerben. Az LlGRF-ek (nyitott leolvasási fázisok) nagymértékben konzervatívak a különböző papillomavírusokban.
AZ. LI- és L2-gér,ek jő célpontoknak bizonyultak az immunoprof 1 laxí s számára, A korai gének közül néhányról, szintén kimutatták, hogy az oltőanyagfejlesztés potenciális célpontjai lehetnek. Amerikai üreglnyűifcól származó (CRFVj és marhaeredetü papíllomavírus (BFV)-rendszerekkel végzett kísérletek azt mutatták,· hogy rekombináns L.1- és/vagy L2fehérjével (baktériumban termelt vagy tehénhimlőből származó vektorokat alkalmazva) törtéiit. immunizálás védettséget biztosított az állatok számára a vírusfertőzéssel szemben.
A papiIdomavírusból származó Ll-gének expressziőja bacubo vírusból származó expressziős rendszerekben vagy tehénhimlőből származó vektorok alkalmazása olyan vírussszerö partikuiumok (VLP) képződését eredményezi, amelyek magas titerű, vírust semlegesítő ellenanyagválasz indukálására alkalmazhatók, amely összhangban van a vírusfertőzéssel szembeni védettséggel. Továbbá az Ll- és Lz-géneket használták oltóanyagok előállítására papíllomavírus fertőzéseinek megelőzésére és kezelésére állatokban.
Az Ll-fehérjét, L1+L2-fehérjéket vagy módosított Livagy LHL2-fehérjéket tartalmazó, a PV fertőzések és megbetegedések ellen alkalmazható profilaktikus és terápiás hatású oltóanyagok kifejlesztésének és forgalomba hozatalának az volt az akadálya, hogy nem állt rendelkezésre nagy meny* ♦>
** nyiségű tisztított vírus és tisztított fehérje. Mivel a PV körülményesen tenyészthető in vitro, nehéz előállítani a kívánt mennyiségű Ll- és L2-fehérjét a PV in vitro tenyésztésével . Az ebből származó beszerzési problémák nehézzé teszik a PV és a PV~fehérjék jellemzését. Eszerint hasznos lenne kifejleszteni nyers PV-fehérjék könnyen megújítható forrását, különösen a PV-eredetű Ll- és L2 fehérjékre vagy módosított Ll- es L2~ fehérjékre.. Ugyancsak hasznos lenne kifejleszteni nagy mennyiségű, papiIlonavírusból származó nyers fehérjék tisztítására alkalmazható módszereket, amelyekkel immunológiai kísérletekhez és ol tőanyagfej vesztéshez megfelelő tisztaságú fehérjét lehetne előállítani, Hasznos lenne még terhelni nagy mennyiségben papiliomavírusból származó fehérjéket, amelyek rendelkeznek a natív fehérjék immunogén tulajdonságaival, úgymint a natív fehérjék konformációjával. Ezenkívül hasznos lenne kifejieszteni PV-ereöetu fehérjéket analizáló eljárásokat, és a fehérjék, valamint a fehérjéket tartalmazó készítmények relatív tisztaságát meghatározó eljárásokat. Ilyen nagytiszéaságü fehérjék alkalmasak lennének a PV-fertőzés vizsgálatánál alkalmazott különböző reagensek előállításához is; ilyen reagensek lehetnek például poliklonális ellenanyagok, monoklonális ellenanyagok és analitikai standarőek,
A 6. és .1.1, típusú HPV a. kiváltó ágense a nemi szerveken fellépő jóindulatú szemölcsök 90%-ának, és ezek csak ritkán asszociáltak malignításokkal [Gissmann és mtsal., PNAS 30, 560-563 (1983)). A HFVGa tekinthető a leggyakoribb HPVu-sltípusnak a hegyes függöly {conoyloms acamánntamz fc kakastaréiyszerü hámburjánzás: nemi szerveken)· esetén ÍBrown, D. B. é-S mtsai., a. Clín. Microbiol. 31, 166716731 . A nemi szerveken jelentkező szemölcsök (condy.lo/sa acoumínatcs: vagy plánom) esetszáma megnövekedett az utóbbi időben.. Becslések szerint a 15-49 év közötti népesség kb. 10%~ának van nemi szerveken jelentkező HPV- fertőzése [Koutsky és mtsai., Epideméoi. Rév. 10, 122-163 (1083)1. dig a condyiomaéa többsége a BPVő-vírussai asszociált, a gége papiliomafertözése (la.fyngead papiilomatosis) esetén a HPVÍl-típusű vírus a domináns. Az légzőtraktus epitéé sejtjeiben történő BPVil-repiikáciő stimulálja ezen sejtek prolíferációját, amely klin.ika.ilag kevéssé fontos izolált sérülésekhez vagy többszörösen kiterjedt sérülésekhez és ismétlődő megbetegedéshez vezethet. A légzőtraktus ismétlődő papiiéom.af ertőzése (respiratory papiiiomatosis), amely többnyire a fiatal populációt sújtó betegség, életveszélyes lehet a légzőtraktus elzáródása miatt. Az utóbbi időben kifejlesztett, állati szervezetet alkalmazó modellben lehetővé vált a fertőző HPVIX-vírus repiíRációja [Kreider és mtsai., Matere 31.7, 639-640 (1985); Kreider és mtsai., J.
Virol . 61, .590-.5-93 (1087) ]. A modell lehetővé tette konformációs neutralizáió epltépok azonosítását a natív virionon és baculovirus által expresszált VLP-ken monokionáiis ellenanyagok alkalmazásával [Christensen és mtsai., 0é Vírol. 64, 5678-5681 (1990); Christensen és Kreider, Virus Pes. 21, 169-179 (1391); Christensen és Kreider, Vírus Rés. 29, 195-202 (1993); Christensen és mtsai,, 75, 2271-2276 (1994) ) .
» <
ΗΣΨΙΙ-ΕΙ“fehérjét tartalmazó vírusszerű partikulamókát expresszált-ak mind rovar, mind emlős sej trends zerekben. VLF-k expressziója élesztősedtekben gazdaságossága és fermentorokban végezhető nagyméretű növesztéshez való könynyü adaptálhatósága miatt előnyös. Azonban a HPV1I-L1fehérje csak kismértékben expresszálható élesztősejtekhen. Ezt a HPV1l-Ll-mRNS megrövidülése eredményezte. Ezzel szemben a HPV6-Li-gén teljes hosszúságú mhNS-ként íródik át és expressziója nagymértékű. Ha a HPV'S-hl-DNS-t úgy módosítjuk, hogy HP711---L1-fehérjét kódoljon, lehetségessé válik a teljes hosszúságú mRMS transzkripciójának elősegítése, melynek eredménye a HPVll-kl-fehérje megnövekedett mértékű expressziója, A találmány tárgya HPV6/ll-típusű hibrid-Llgén szekvenciája, valamint eljárás a HPVő/lI-tí.pusű hibridLl-gén előállítására szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával. A. hibridgént HRV6a-Ll-szekvenoia -ÍHoffmann, K. ú. és mtsai., Virology (1995), közlésre elfogadták] felhasználásával terveztük, de minimális számú változtatást tartalmaz a bázisokban, amelyre a HPVll-Ll-fehérje kódolásához volt szükség. A vad. típusú HPVll-Ll-génnel ellentétben, a HPVő/ll-hihrídgén nem tartalmaz élesztő által felismerhető internálás transzkripciós termináciős szignált; így teljes hosszúságú HPV6/il-mRNS keletkezik és a HPV11-L1-fehérje expressziója megnövekszik.
A találmány tágyát nagytisztaságű PV-Ll-féhérje képezi, A találmány eljárásokra is vonatkozik, amelyek segítségévei a natív papillomavírusból származó fehérjék immunegén tulajdonságaival rendelkező rekoíobináns, papillomavírushól származó fehérjék termelhetek és tisztíthatok. A találmány tárgyát képezi papillomavírus fertőzése esetén alkalmazható profílaktíkus és terápiás hatású oltóanyagok előállítása. Elektronmikroszkópiával és konformációs ellenanyagokhoz történő kötődési kísérletekkel igazoltuk, hogy a találmány szerinti rekombináns fehérjék képesek vírusszerű partikulumókát kialakítani.
A találmány tárgyát szintetikus DNS-molekula képezi, amely tisztított humán, 11. típusú papillomavírusból származó L1 -fehérjét és annak, származékait kódolja,.
A találmány tárgyát szintetikus DNS-molekula képezi, amely tisztított humán, 11. típusú papillomavírusból származó Ll-fehé.rjét kódol. A találmány különféle megvalősitási módjai például rekombináns HRV-BNS-molekulák, a rekombináns HPV-DNS-molekulával komplementer RNS, a DNS-t, RNS-t tartalmazó készítmények, a DNS-t és RNS-t alkalmazó eljárások.
Λ 6. és 11. típusú HFV s2 okozó ágense a nemi szerveken fellépő jóindulatú szemölcsök 9öj-ának és csak ritkán asszociáltak malígnitásokkai {Glssmsnn és mtsai.f PRAS 80, 560-563 <19S3) 1 . A nemi szerveken jelentkező szemölcsök (condyioma aeeumínatum vagy plánom) esetszáma megnövekedett az utóbbi időben és becslések szerint a középkorú (15-49 év közötti) népesség kb. 10%-ának vau nemi szerveken jelentkező HPV-fertőzése [Routsky és mtsai,, Epidémiái. Rév. 10, 132-163 (1983)). Mig a condylomata többsége a HFV6-vírussal asszociált, a gége papillomaf ertőzése (laryngeal papíílomazosisj esetén a HPV1I-típusú vírus a domináns. Az légzötraktus ep.itél sejtjeiben történő HFV11 -repii káciő stimulálja ezen sejtek proliferációját, amely kiinlkaliag kevéssé fontos izolált sebekhez vagy többszörösen áttevődött sebekhez és ismétlődő megbetegedéshez vezethet. A légzötraktus ismétlődő pspillomafertőzése (respiratory pa.pillomatos.is) , amely többnyire a fiatal populációt sújtó betegség, életveszélyes lehet a légzötraktus elzáródása miatt. Az utóbbi, időben kifejlesztett, állati szervezetet alkalmazó modellben lehetővé vált a fertőző HPV11-vírus replzkácíőja (Rreider és mtsai., Natúré 317, 639-640 (1985); Rreider és mtsai., J. Vírol. 61, 590-593 (1937)]. A. modell lehetővé tette konformációs neutrálisaié epitőpok azonosítását a natív virionon és baculovírus által expresszált VAP-ken monokionáiis ellenanyagok alkalmazásával {Christensen és mtsai., J. Viroi. 64, 5678-5661 (1.990); Chrístensen és Rreider, Vírus Rés. 21, 169-179 (1991);
Christensen és Krelder, Vírus Rés, 29, 195-202 ; 1982;; Christensen és mtsai.., (ő! 7'S, 2271-2276 (1994)),
Az Fi-fehérjét, IJ+Lz-fehérjéket vagy módosított 11vagy L1+L2-fehérjéket tartalmazó, a FV fertőzések és megbetegedések ellen alkalmazható profílaktikus és terápiás hatású oltóanyagok kifejlesztésének és forgalomba hozatalának az veit az akadálya, hogy nem állt rendelkezésre nagy menynyíségű tisztított vírus és tisztított fehérje.· Mivel a PV körülményesen tenyészthető in vitro, nehéz előállítani a kívánt mennyiségű Ll- és l,2~f ehér jót a PV in vitro tenyésztésével. A. PV in vitro tenyésztésével összefüggő nehézségek a PV és a FV-fehérjék kémiai, immunológiai és biológiai jellemzésében okoznak nehézségeket. Eszerint hasznos lenne kifejleszteni nyers PV-fehérjék könnyen megújítható forrását, különösen a PV-e.redetű Ll- és I>2 fehérjékre vagy módosított Ll- és L2-fehérjéfcre. Ugyancsak hasznos lenne kifejleszteni nagy mennyiségű, papiiiomavirüsból származó nyers fehérjék tisztítására alkalmazható· módszereket, amelyekkel immunológiai kísérletekhez és oltóanyagfejlesztéshez megfelelő tisztaságú fehérjét lehetne előállítani. Hasznos lenne még termelni nagy mennyiségben papiiiomavirüsból származó fehérjéket, amelyek rendelkeznek a natív fehérjék ímmunogén tulajdonságaival, úgymint a natív fehérjék konformációjával, Ezenkívül hasznos lenne kifejleszteni PV-eredetű fehérjéket analizáló eljárásokat, és a fehérjék, valamint a fehérjéket tartalmazó készítmények relatív tisztaságát meghatározó eljárásokat. Ilyen nagytisztaságú fehérjék hasznosak lennének a PV-fertőzés vizsgálatánál alkalmazott külön* ·· böző reagensek előállításához is; ilyen reagensek lehetnek políklónális ellenanyagok# monoklonálís ellenanyagok és analitikai standardek.
HPV11-L1-fehérjét tartalmazó vírosszéra, parti kaiamokát expresszáitak mind rovar, mind emlős sej trendszerekben. VLP-k expressziója élesztősejtekben előnyös gazdaságossága és fermentorokban végezhető nagyméretű növesztéshez való könnyű adaptálhatósága miatt. Azonban a HrVii-LI-fehérje csak kismértékben expresszálható élesztősejbekben. Ezt a HPV11 -Ll~mP.NS' megrövidülése eredményezte. Ezzel szemben a HPV'6-hl-gén teljes hosszúságú mRNS-ként íródik át és expressziója nagymértékű. Ha a HPVC-Ll-öNS-t ügy módosítják, hogy HPVll-Ll-fehérjét kódoljon, lehetségessé válik a teljes hosszúságú mRN.S transzkripciójának elősegítése, melynek eredménye a HPVIi-Ll-fehérje megnövekedett mértékű expressziója.. A találmány tárgya a HPV6/11-típusú hibridLl.~gén. szekvenciája, valamint eljárás a HPV6/1 l-típusó hibrid-Ll-gén előállítására szintetikus oligonukleotidok alkalmazásával, A híbridgént HPVűa-Ll-szekvencia (Hoffmann, K. óh és mtsai,# Virology (1995)# közlésre elfogadták} felhasználásával terveztük# de minimális számú változtatást tartalmas a bázisokban# amelyre a HPVll-Ll-fehérje kódolásához volt szükség. A vad típusú HPVll-Ll-génnel ellentétben# a HPV6/II“hibridgén nem tartalmaz élesztő által felismerhető internálás transzkripciós terminációs szignált; Így teljes hosszúságú HPVű/ll-mRES keletkezik és ennek következtében a HPVli-hifehérje expressziója megnövekszik, » ♦ * > ♦
A DN.S~t vagy a DNS által kódolt fehérjéket tartalmazó gyógyászatilag alkalmazható készítmények ismert eljárások szerint szerelhetők ki, például gyógyászatilag elfogadható hordozó hozzáadásával. Példák az ilyen hordozókra és eljárások a kiszerelésre találhatók a Remington~féle Pharmaoentimái Sciences,#-ben. Hatékony beadásra alkalmas gyógyászatilag elfogadható készítmény előállítása esetén a készítmény hatásos mennyiségben tartalmazza a fehérjét vagy a VLP-t. ilyen készítmények többféle Hpy-típusból származó fehérjéket vagy VLP-ket tartaixsazhatnak.
A találmány szerinti terápiás vagy diagnosztikai készítményeket a páciensnek akkora mennyiségben adjuk be, amennyi elegendő a PV-fertözések kezelésére vagy diagnózisára. A hatásos mennyiség különféle faktorok szerint változhat, például az egyén egészségi állapota, súlya, neme és kora szerint. Más faktorok játszanak szerepet a beadás módjában. Általában a készítményeket körülbelül 1 meg-tói 1 mg~ig terjedő dózistartományban adjuk be.
A gyógyászati készítmények az egyénnek sokféle módon beadhatók, például szubkután, topákéilsen, orálisan, nyálkahártyán keresztül, intravénásán és intarmuszkulárisan.
A találmány szerinti oltóanyagok olyan DNS-t, .RNS~i vagy a DNS által kódolt fehérjéket tartalmaznak, amelyek a gazdaszervezetben termelődő, semlegesítő ellenanyagok képződésének indukciójához szükséges antigéndeterminánsokat tartalmazzák. Az ilyen oltóanyagok megfelelően biztonságosak is ahhoz, hogy klinikai fertőzés veszélye nélkül beadjuk azokat; nincsenek toxikus mellékhatásaik; hatásosan be**** ί
).9 adhatók.; stabilak; és kompatíbilisek az oltóanyaghordozókkal.
Az oltóanyagok sokféle módon adhatok be, például szubkután, topikáiisan, orálisan, nyálkahártyán keresztéi, intravénásán és intarmuszkulárisan. A beadott dózis változhat az egyén egészségi állapota, súlya, neme és kora szerint; a beadás módja szerint; és a PV típusa szerint, ami ellen az oltóanyagok alkalmazzuk. Az oltóanyagot alkalmazhatjuk adagolt formában, például kapszulákban, szuszpenziókban, elixírekben vagy oldatokban. Az oltóanyagot immu.nológiailag eiofogadhatő hordozóval is kiszerelhetjük.
As oltóanyagokat terápiás szempontból hatásos mennyiségben adjuk be, akkora mennyiségben, amely elegendő az immunológiai védettséget biztosító válasz kiváltására. A terápiás szempontból hatásos mennyiség változhat a PV típusa szerint. Az oltóanyag beadható egyszeri vagy többszöri dózis formájában.
A találmány szerinti tisztított fehérjék vagy ezek származékai, alkalmazhatok ellenanyagok termeltetésére. Az ellenanyag kifejezésen polikionális és monoklonális ellenanyagot egyaránt értünk, valamint ezek fragmenseít, például Fv-, Fab- és F(abj2-íragmenseket, amelyek képesek antigént vagy haptént kötni,
A találmány szerinti fehérjék és fehérjeszármazékok alkalmazhatók HFV-fertozés szerotipizálására és HPVszkrinelésre, A tisztított fehérjék, VLP-k és ellenanyagok felhasználhatók HPV detektálására és szerotipizálására alkalmazható reagenskészletekbe való kiszerelésre, Egy ilyen * *χ reagens-készlet tartalmazna egy ko-mpartmentalizált dobozt, amelyben legalább egy edény elfér jói zárható állapotban. A doboz, tartalmazna továbbá reagenseket,, például Ll- vagy L2f ehér j ét vagy VLP-ket, amelyek rekombináns- HPV6/11-ból vagy más rekombináns HPV-típusból .származó DNS-molekulákból vagy esek ellen a fehérjék -ellen termeltetett ellenanyagokból származnak. A doboz tartalmazna detekciós eszközöket is, például jelölt antigét vagy enzim-ssubsztrátok-at vagy hasonlókat .
A tisztított fehérjék alkalmazhatók immunológiai standardként, m-oíekulasűly-markerként és moleku.lamére-tmarkérként is.
Ismert, hogy számottevő mértékben van redundancia a különböző kőbánokban, amelyek az egyes konkrét amínosavakat kódolják. Ennélfogva a találmány tárgyát képezik olyan DNSszekvenciák is, amelyek olyan alternatív kődonokat tartalmaznak, amelyek ugyanolyan amlnosav transzlációját kódolják. Az ilyen specifikáció céljából az egy vagy több helyettesített ködont tartalmazó szekvenciát -degenerált variációnak definiálunk. A igényelt oltalmi körbe tartoznak a DNS-szekvenciában vagy a transzlálódott fehérjében található olyan mutációk is, amelyek lényegében nem változtatják meg az expresszáit fehérje végsó fizikai tulajdonságait. Például vaiin szubsztituálása leucinra, argininé leucínra, vagy aszparagíné glutamin-ra nem okozhat változást a poíipeptid funkció iában.
Ismert, hogy egy pepiidet kódoló DNS-szekvenciák megváltozhatnak ügy is, hogy olyan pepiidet kódolnak, amelynek ' »*.· » tulajdonságai 'különböznek a természetesen előforduló pepiidétől. A DNS-szekvenciák megváltoztatására használt módszerek között van a helyspecifikus mutagenezis.
A leírásban használt HPVó/11-hibr.iágérs. funkcionális .származéka olyan vegyület, amely olyan biológiai aktivitással rendelkezik (vagy funkcionális- vagy szerkezeti) , amely lényegében hasonló a hPV6/ll biológiai aktivitásához-. A funkcionális származék kifejezésen értjük a HPV6/11 fragmens-ei t, variánsait, degenerált variánsait, analógjait és homológjait. vagy kémiai származékait.
Az analóg kifejezésen olyan molekulát értünk, amely funkciójában lényegében hasonló vagy az egész HPV6/11--molekúrához, vagy annak egy fragmensáhez.
A klónozott HPV6/11-DNS-t vagy annak fragmenseit az itt leírt eljárások szerint állítottuk elő, amelyek lehetnek rekcmbinánsan kifejezettek megfelelő promótert és más transzkripciós szabályzó-elemet tartalmazó expressziós vektorba történő molekuláris klónozást alkalmazva, prokarió-ta vagy eu'karióta. gazdase j te-kbe juttatva rekombináns HPVli termelhető. Az ilyen műveletekhez szükséges- módszerek teljes egészükben le vannak Írva Sambrook, -J, és munkatársai könyvében (lásd mint fent), amely szakember számára hozzáférhető .
Az expressziós vektorokat a leírásban- DNSszekvencia-ként definiáljuk, amelyek gének klónozott kópiáinak transzkripciójához és- azoknak megfelelő mRNS-k transzlációjához szükségesek megfelelő gazdaszervezetben. Ilyen vektorokat alkalmazhatunk eukerióta gének expressz lőj áh-oz ♦ Φ különféle gazdaszervezLekben, például baktériumokban, kékeszöld algákban, növényi sej tökben, rovarsejtekben és állata sejtekben. Speciálisan tervezett vektorok lehetővé teszik bdS átjuttatását gazdaszervezetek között, például baktérium-éles ztősejtek, vagy baktérium-állati sejtek, vagy baktérlnm-gorebasejtek, vagy baktérium-gerinctelen szervezetből származó sejtek között. Egy megfelelően szerkesztett expressziös vektornak a következőket kell tartalmaznia: repiikáciös origót gazdaszervezetekben történő autonóm replikádé céljából, szelektálható markereket, korlátozott számban hasznosan alkalmazható restrikciós enzimek hasítöhelyeít, lehetőséget nagy kópiaszám eléréséhez és aktív p romét ereket.. A oroméiért olyan DhS-szekvencíaként definiáljuk, amely az KdS-polimerá2t irányítja a DNS-hez való kötődéshez és iniciáija az KdS-szintézist. Egy erős promóter nagy gyakorisággal, iniciáija a mENS szintézisét. Expressziös vektorok lehetnek, anélkül, hogy csak ezekre korlátoznánk azokat, klónozó vektrok, módosított klónozó vektorok, speciálisan tervezett plazmídok és vírusok.
Különféle emlős expressziös vektorok alkalmazhatók a HPVS/lI-DdS vagy frsgmensei kifejezésére emlős sejtekben. Kereskedelemben kapható emlős expressziös vektorok, amelyek alkalmasak lehetnek rekombináns HPV6/11-DNS kifejezésére, például: pcDNAÜ íInvitrogenj, pMClneo {Sfratagens}, pXTi (Stratagene), pSGS (Stratagene), ESO-pSV'2-neo (ATCC 37593; , pBPV~l(&~2) (ATCC 37U.G) , pöSPV-MMTneo(342-12) (ATCC 372245, pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV217 **»* » β» φφ φ X φ Φ * X φ Φ * * *·. * *
Α » Φ * X Φ * X · ' φ
ΦΦ β ΦΦ « dhfr ÍATCC 37146?, pUCiag ÍATCC 37460) és AZD3S íATCC 37 565) ,
Különféle bakteriális expressziős vektorok alkalmazhatok a HPVő/ll-DNS vagy fragmensei kifejezésére emlős sejtekben. Kereskedelemben kapható bakteriális expressziős vektorok, amelyek alkalmasak lehetnek rekombináns KPV6/11DNS kifejezésére például: pETila (Kovagen), lambtía gtll (Invitrogen) , poDKAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia),
Különféle gombaeredetü expressziős vektorok alkalmazhatók a HPV6/1I-DKS vagy fragmensei kifejezésére emlős sejtekben. Kereskedelemben kapható gombaeredetű expressziős vektorok,.amelyek alkalmasak lehetnek rekombináns KFV6/1IDNS kifejezésére például: pYES2 (Invitrogen), Fích.ía expressziős vektor (Invitrogen) és Kansenula expressziős vektor (Rhein Bíotech,· Düsseldorf, Germanyj ,
Különféle rovarsejtböX származó expressziős vektorok alkalmazhatok a HFV6/I1-DMS vagy fragmensei kifejezésére emlős sejtekben. Kereskedelemben kapható rovarsejtből származó expressziős vektorok, amelyek alkalmasak lehetnek rekombináns HFVá/li-BNS kifejezésére, például a pBlue Bao III ílnvirrogen).
A HFv6/lI“DRS~t vagy fragmenseit tartalmazó expressziős vektor alkalmazható a HPV11-fehérjék vagy a HFVll-fehérje fragmenseinek kifejezésére sejtben, szövetben, szervben vagy állati szervezetben- Az állati szervezet kifejezésen a leírásban az emberi szervezeteket is beleértjük. A gazdasejtek lehetnek prokariőták vagy enkariőták, például; baktériumokból származóak, például E< coli eredetű » * * » « * * sejtek, goxabaeredetű sejtek, például· élesztőből származók, emlős sejtek, például; humán, marha, sertés, majom és rágcsálóeredetű sejtvonalak, és rovareredetű sejtek, például Lrcsopaila és selyemhernyóból származó sejtvonalak, Emlős fajokból származó sejtvonalak, amelyek alkalmasak lehetnek és kereskedelemben rendelkezésre állnak például; L~seibek L-M(TK) (ATCC CCL 1.3), L-sejtek L-M (ATCC CCL 1.2b, 293 (ATCC CRL 157 31, Raji (ATCC CCL 86) , CV-1 (ATCC CCL 7 Cd ,
C03-1 (ATCC CRL 1650), CCS-7 (ATCC CRL 1651), CKO-K). (ATCC
CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), R1H/3T3 (ATCC CRL 1653), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) és MRC-S (ATCC CCL 171).
Az expressziós vektort a gazdasejtbe juttathatjuk a számos eljárás bármelyikével, amely például lehet transzformáció, transzfekciö, lipofekció, pretoplasztfüzió és elekfroporáció. Az expressziős vektort tartalmazó sejteket klóronként tenyésztjük és egyenként analizáljuk, hogy termelnek-e HRVll-fehérjét. A üBVll-et expresszáló gazdasejtklánok azonosítása sokféleképpen történhet, például antiHPVli-eilenanyagokkal való immunológiai reakcióval.
HRV-DhS-fragmensek expresszáiása in vitze termelt szintetikus mRNS vagy nafiv mRMS alkalmazásával ís végrehajtható. Szintetikus raRNS vagy BFV6/II-hibrid-DNS-t expresszáló sejtekből izolált mRNS hatékonyan transzlálható különféle sejtmentes rendszerekben, például búzacsíra extraktumban és retiknlocita-extraktumban, valamint hatékonyan transzlálható sej talapé, rendszerekben, például békaeredetű
X * ΦΦ φ oocítákba történő mikroínjektálással·, a fo-ékaeredetű occitákba történő mikroinjektálást részesítjük előnyben.
A HPVll-fehérje gazdasejtben való expresssáiását követően a HPVll-fehérje kinyerhető tisztított HPVll-fehérje formájában. Számos HPVll-et tisztító eljárás áll rendelkezésre és megfelelő erre a célra. A leírásban ismertetettek szerint# a rekombináns HPVll-fehérje sejtlizátumböl és extrák tűmből tisztítható a következő eljárások egyedi vagy különféle kombinált alkalmazásával: frakciónál© kisózás, ioncserélő kromatográfia, méret -szerinti kromatográfia, h-idroxilapatit adssorbcíős kromatográfia és hídrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia alkalmazásával.
Ezenkívül a rekombináns HPVll-fehérje szeparálható a többi ceiiuláris fehérjétől immunoaffinitás-oszlop alkalmazásával, amely a teljes hosszúságú# naszcens HPVll-re vagy a HPVll-poiipeptid-fragmenseire specifikus monokionális vagy poiikionális ellenanyagok felhasználásával készült. Monokionális és poiikionális ellenanyagok sokféle# -szakember által ismert eljárás szerint állíthatók elő. Monokionális vagy mcnospecífikus ellenanyagon a leírásban egyetlen ellenanyagfajtát vagy olyan több ellenanyagfaj tát értünk, amelyek HPVll-et kötő karakterisztikája homogén. Homogén kötésen az ellenanyagfajta azt a képességét értjük# amellyel egy specifikus antigént vagy apitópot köt.
Szakmember számára nyilvánvaló, hogy monospecifikus ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások alkalmazhatók üpy-polipeptid-fmegmentekre specifikus vagy a teljes hoszszűságü, naszcens HPV~polipeptidekre specifikus ellenanyag« » * X ok előállítására. Közelebbről meghatározva, szakember számára nyilvánvaló, hogy olyan monospecifikus ellenanyagok .állíthatok elő, amelyek specifikusak a teljes funkcionális HPV-fehérjékre vagy azok fragmen.se 1 re.
A találmány tárgyát képezik olyan eljárások is, amelyek a HPV-t kódoló DNS vagy RNS expresszióját, valamint a KPVil-fehérje funkcióját (funkcióit) in vivő raoduláló ve-nyeleteket szkrlnelik. A vegyületek, amelyek ezeket az aktivitásokat modulálják, lehetnek DNS, RNS, peptidek, fehérjék vagy nem-proteinszerö szerves iaole-kulák. A vegyületek modulálhatnak a HPVll-et kódoló DNS vagy RNS expressziós szintjének megnövelésével vagy csökkentésével, vagy a HPV'il-fehérje- funkciójának erősítésével vagy gyengítésével. .A HFVll-fehérjét kódoló DNS vagy RNS expresszióját vagy a HPVll-fehér je funkcióját moduláló vegyületeket számos mérési eljárás detektálhatja. A mérési eljárás lehet lehet egyszerű ígen/nem mérési eljárás, amely azt határozza xaeg, hogy van-e változás az expresszi-óban vagy a funkcióban. A mérési eljárás kvantitatívvá tehető egy tesztminta expressziós szintjének vagy funkciójának egy standard mintához való hasonlításával.
A HPV6/11-hibríd-DNS-t, HPWll-hibrid-DNS fragmenseit, RPV6/11-DNS vagy HPVli-fehérje ellen termeltetett ellenanyagokat, HPV6/11-hibrid-RNS-t vagy HFVll-fehérjót tartalmazó reagens'készlet-ek állíthatók elő. Az ilyen r e a genskés z1et e k a1ka imazha ték ΗΡV6/11-DNS-he z híbridizálődni képes DNS detektálására, vagy HPVll-fehérje vagy peptidfragmensek jelenlétének detektálására. Az ilyen karakterizáiás sokféle célból hasznos, például törvény-széki vizsgálathoz és járványtan! tanulmányokhoz.
A HPV6/11-DNS-szekveneiával komplementer nukleotidszekvenciák szintetizálhatok antiszensz terápia céljára. Ezek az antiszensz molekulák lehetnek DMS-k, a DNS-k stabil származékai, úgymint foszforotloátok vagy merilfoszfonátok, RNS-ek, az RNS~ek stabil származékai, úgymint 2'~ö-alkilRNS, vagy más HPV6/11 antiszensz oligonukleotidmimetíkumok. A HPVS/il antiszensz molekulák sejtekbe juttathatók mikroinjektálássai, liposzóma-kapszuiázással vagy az antiszensz szekvenciát hordozó vektorból való kifejezésével. A. HPV6/11 antiszensz terápia különösen olyan betegségek kezelésére lehet alkalmas, amelyek esetén a HPVílaktivitás csökkentésének van jótékony hatása.
A kémiai származék kifejezésen egy olyan molekulát értünk, amely utólag hozzáadott olyan kémiai oldalláncokat tartalmaz, amelyek normálisan nem részei az alapmolekuiának. Ilyen oldalláncok javíthatják az aiapmolekula oldhatóságát, fél-életidejét, abszorpcióját stb. Ezzel párhuzamosan az oldaliáncok gyengíthetik az alapmolekula mellékhatásait, vagy csökkenthetik az alapmolekula toxicitását. Ilyen oldalláncokra különféle leírásokban találhatunk példákat, például a Remingtons's Pharmaceutical Sciences-ben.
A találmányi leírásban ismertetett eljárások szerint azonosított vegyűletek alkalmazhatók egymagukban, rutin teszteléssel meghatározott, megfelelő dózisban a HPVíl vagy aktivitásának optimális gátlása céljából, miközben minimalizálható bármilyen potenciális toxicitás. Ezenkívül kivá-
natos lehet más ágensekkel való együttes beadás· vagy egymást követő beadás.·
A találmány szerinti vegyületek előnyösen egyszeri dózisban adhatók be, vagy a teljes dózis néhány kisebb dózisra elosztva adható be. Továbbá a találmány szerinti vegyületek sokféle módon adhatok be., amely lehet a teljesség igénye nélkül, intranasáiis, transsdermális, kúp formájában, orális, vagy hasonló módokon.
Több, mint egy aktív ágenst kombináló kezelésnél, amelynél az aktív ágensek külön-külön dózisban vannak kiszerelve, az aktív ágenseket beadhatjuk egyidejűleg, vagy külön-küiön adhatók be egyenként, egymást követő lépésekben .
A találmány szerinti vegyületeket alkalmazó kezelési előirat kiválasztása többféle faktor figyelembe vételével történik, például a páciens típusa, faja, kora,· súlya, neme és egészségi állapota; a kezelendő állapot súlyossága; a beadás módja; a páciens vese- és májfunkciója; és a konkrétan alkalmazott vegyület alapján. Szokásos ismeretekkel rendelkező orvos könnyedén meghatározhatja és felírhatja a gyógyszerből a megelőzéshez, a kóros állapot továbbfejlődése elleni vagy megfékezéséhez szükséges mennyiséget. A gyógyszer optimális pontosságú koncentrációjának beállításához abban a tartományban, amelyben toxicitás nélkül is hatásos, szükség van egy gyógyszerklnetikára épülő kezelési sióiratra, amely kinetika a gyógyszer hatóhelyén értendő. Ez magában foglalja a gyógyszer megoszlásának, egyensúlyi körülményeinek és eliminálódásának figyelembe vételét,
** φ
Ά találmány szerinti eljárásokban, a leírásban részletesen ismertetett vegyületek alkotják az aktív alkotórészt, és megfelelő gyógyászati, hígitószerekkel, kötőanyagokkal vagy hordozókkal (ezeket együttvéve a leírásban ho-rdozők~n.ak hívjuk) összekeverve adhatók be, amelyet a szándékozott beadási formára való tekintettel alkalmas módon szelektálunk, amely beadási forma lehet tabletták, kapszulák, elixírek, szirup, kúpok, gélek és ehhez hasonlók formájában, és a szokásos gyógyszerészeti gyakorlattal
Össsaharában van.
Például az orális beadásra kerülő tablettában vagy kapszulában, az aktív gyógyszer komponens kombinálható orális, nemtoxikus, gyógyszerészetileg elfogadható inért hordozóval, például etanolial, glicerinnel, vízzel és ehhez hasonlóval. Sót, ha kívánatos vagy szükséges, alkalmas kötőanyagokat, kenőcsöket, dezintegráió ágenseket és színezőágenséket tehetünk a keverékbe. Alkalmas kötőanyagok például a keményítő, zselatin, természetes cukrok, úgymint glükóz vagy béta-iaktóz, kukorioaédesítök, természetes és szintetikus gumik, úgymint a guaiarábíkurn, tragantmézga, nátri. nm - a 1g in á t, k a r b ox Íme t i 1 - c e 11 u 1 ό ζ, ρ ο 1 i e 111 é n - g I í ko 1, viaszok és ehhez hasonlók, Ebben az adagolt formában alkalmazott kenőcsök tartalmaznak például nátríum-oleátot, nátr i um- s z t e a r á t o t, magnézi um- sztearátot, nátri um - b en ζ o a t o t, rátrium-acetátot, nátrium-kloridot és ehhez hasonlókat. Dszintegrátor lehet keményítő, metil-cellulóz, agar, bsntonit, xantángu.m.i és ehhez hasonló.
Eölysáé'kformákban az aktív győgyszerkomponens kombinálható alkalmasan ízesített szuszpenzlós és diszperziós ágensekkel,· például szintetikus és természetes gumikkal, például tragantmézgával, gumiáráéikummal, metíl-celluló2zal és ehhez hasonlókkal. Más alkalmazható diszperziós ágens a glicerin és ehhez hasonló anyagok. Parenterális beadáshoz strei.1 szuszpenziók és oldatok kívánatosak. Tzotónikus készítményeket, amelyek általában megfelelő- tartósítószereket tartalmaznak, akkor alkalmazunk, ha intravénás beadásra van szükség.
Tónikái is (helyi) beadásra szánt készítményekben az aktív gyógyszert keverhetjük szakember által jól ismert, különféle hordozóanyaggal, például alkoholokkal, aloe várából származó géllel, ailnatoinnai, glicerinnel, A- és £vitamintartalmú olajokkal, ásványolajjal, PFG2-roirisztiipropionáttal és ehhez hasonlókkal, amelyekkel alkoholos oldatokat, topikáiis tisztítókat, lemosó krémeket, bőrgéleket, bőrvizeket és krém- vagy gélformájú samponokat készítünk.
A találmány szerinti vegyületek beadhatók 1iposzórnaalapú hordozórendszerek alkalmazásával is, amelyek lehetnek kicsi egylamellás: vezikuiumok, nagy egylamellás vezikul.umok és multilamellás vezikuiumok. Sokféle foszfolipidből lehet liposzőmákat kialakítani, például koleszterinből, sztsari.1aminból vagy foszfatidil-kolinokbói.
A találmány szerinti vegyületeket olyan monoklonális ellenanyagokkal mint egyedi hordozókkal ís célba juttathatjuk, amely ellenanyagokhoz a vegyület molekulái kapcsolva * V « « * * #
Λ «»«» « « « vannak... A találmány szerinti vegyületeket oldható polimerekkel is kapcsolhatjuk mint célbajuttató gyógyszerhordosókkal. ilyen polimerek lehetnek polivini 1-pirrolíd.in, pirán-kopolimer, polihidrcxi-propi imetakr ί 1 amid-fenol, polihidroxi-efc ilaszpartamid- fenol vagy polietiléncxidpolilizin palmi toll—csoportokkal szubszt!.fcuáiva. Továbbá a találmány szerinti vegyületek biológiailag degradálódó polimerek egy osztályához is kapcsolhatók, amelyekkel egy gyógyszer kontrollált felszabadulása érhető el, példán! po 1 í t e j s a v, ρ ο 1 i ep s z i 1 οn - k ap r ο 1 a k t ο η, ρ ο 1 i h i d r ο χ i - v a j s a v, poliortoészterek, poliacetálok, polídihidro-piránok, poli·ciano-akrilátok és keresztkötött vagy bidrogéiek amfip.ati.kus blokk-kopoiimerjei,
A következő példák a. találmány szerinti megoldást kívánják illusztrálni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Szintetikus hl-gén előállítása
A HFV11-L1 1,5 kbp méretű nyitott leolvasási tézisét szintetikus DNS-olígomerékből állítottuk elő, melyeket a Midland Reagent Company cégtől rendeltünk meg. Ezeket az oligomereket 5*-végi foszfátokkal látták el. A megrendelt 2.4 oligomer a következő volt:
#241* X X ♦ A * *
A « A A«
TTTTATCATGCCA
3’ (SEQID
GAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCC TAACAAATTTGCATrGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATGCCACAA CACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT 3' (SEQ ID NO:2) #241-3
GATAACAGG 3’ {SEQ ID NO:3) #241-4
#241-5
#241-6
GGTGATAGáTTáTTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGC CAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC 3’<SEQ ID NO:6)
CTATATGT
TCACACCCCAAGCGGCTOTIGGTGTCCTCTGAGGCACA V (SEQIDNÖ:?)
AAAIGGTACACTCGAGCGG 3XSBG ID NO:10)
24M1
ATAAGGACATGAGTrnTGGGAGGrrAATrFAAAAGAAAAGTr
TTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT 3S (SEQ ID NO: II) #24142
ATCTTC 3’ (SBQ ID NO: 12) *♦ ί * «' * ν ·? *·'·.*
5ΌΑΑ0ΑΤσΤΤΑσΐΤΓΤΓΑ0ΤΤΓ
3’(SEQ Π> ΝΟ:13) #24144
5ACTAGAÁAACrTlTCTm^ A A ACTCATí
TCCrT.ATAGGGATCTrGCmTCCTrrrCAGGAGTGGGCTTn'G
AOCGG 3' (SEQ ID .NO: 14)
GGTTCCCCC AO3GTACCCC 3' (SEQ H> NO; 18)
TATGTCAA 3' (SEQ © NO:
CACCrTAAATACTCrGTATTCATATCCrGACACCTrTGGCACA.A
CAGTTTTOTTAACCTTTTTTÁTGO AATAATAAGGATG ACCC 3’ (SEQ©NO:23) #241 »24
CATTTTOTFTTGTGAGATCTTC 3’ (SEQ © NO:24>
•·*ί:
Φ X Φ « «XX « φ *« V
Az komplementer párokat képező oligomerekefc (11241-1 és #241-24, #241-2 és #241-23, #241-3' és #241-22, #241-4 és #241-21, #341-5 és #341-20, #341-6 és #341-19, #241-7 és #241-1«, #241-8 és #241-17, #241-9 és #241-16, #241-10 és #241-15, #241.-11 és #241-14, #241-12 és #241-13, 1, ábra;
2,5 mM TRIS~t és 0,25 mM EEd’A-t tartalmazó pH 7,5 puffért külön csövekben hibrid!zártuk össze. A csöveket 9S°C-ra melegítettük 4 percig, és azután 250 ml-es főzőpohárban lévő, 200 ml 98°C~os vízbe helyeztük szokat, hogy lassan lehűljenek. Amikor a víz lehűlt szobahőmérsékletre, az összehlbrldizált párokat a következőképpen jelölt csövekhez adtuk: Attagmens (#241-1 & 24, és -2 & 33 öli gomer párok); Bfragmens (#241-3 #22, -4 & 21, -5 & 20 és ~6 & 19); Cfr-agmens (#241-7 & 18, -8 & 17, -9 & 16 és -10 & 15) és Dfargmens (#241-11 & 14 és -12 & 13). Ezeket az oligomerpárkeverékeket 62°C-ra melegítettük fel 2 percig, és azután az előbbiek szerint lassan lekötöttük. Az egyes csövek tartalmát egy éjszakán át ligáltuk 23°C-on 14-DNS-ligát (Boehringer Mannheim, Inc. cégtől szereztük be) és a gyártó cég által kiszerelt reagensek alkalmazásával,
A. ligálás után a B-fragmenst PCR-rel kellett amplifikálni, hogy megnöveljük a teljes hosszúságú termék mennyiségét. A következő tíz ciklusra volt szükség: 94°C, 1 perc; 4 8°C, 1 perc; ?2Ö€, l perc, amit 72hB~on. .10 perces inkubálás követett Applied Biosystems cégtől vásárolt elklízáió termosztátban, Boehringer Mannheim cégtől vásárolt Taq-poiimeráz és a következő láncinditő oligonukleotidok alkalmazásával:
*«*♦ * ·,Φ « Φ 4 » * « « « φ « «« * * *« «Φ st » Φ φ »Φ * ΧΦ * ··· 31 ~
5'GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG3f fszék.azonos!tőszáma; 25J
5<GGAATICGGGGTAeCAGCCÜ?GTTAA3í (szék. azon-ositó-száma: 26.)
A .ligáit termékeket és a 5- f ragmens PCR-termékét restrikciós -enzimekkel emésztettük (Boehringer Mannheim, Inc., cégtől szereztük be) a következőképpen: az A-fragmens-t. BglII/Sphl-el; a B-fragmenst Sph VKpnX-el; a C-fragmenst Kpui/XhoI-el; és a D~fragmenst XhoI/BglXI-vel emésztettük. Az emésztett fragmenseket alacsony olvadáspontú ag-arőz gélben (FMC BioProducts. cégtől -szereztük be) választottuk el, és megfelelő méretű fragmense-k izolálásához kivágtuk a csikókat és az agarózt Agaró ζΛ-el (Boehringer Mannheim, Inc. cégtől szereztük be) emésztettük a gyártő ajánlása .szerint. Az Α-, B- és D~fragmenseket etanolos kicsapással nyertük vissza- és azután külön-külön ligáitok azokat pSP'72~vekto.rba (Promega, Inc. cégtől szereztük be), amit az előzőekhez hasonlóan emésztettünk restrikciós enzimekkel úgy, hogy megfeleljen az egyes li-gálandó fragmens-eknek.
A Kpnl/XhoI-el emésztett C-fragmenst először a következő hib-ridizált oligomerekhez lígáltuk:
5' TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC3f í sz ok.
azonos!tőszáma: 27.); és
Sf GCGAGTGTAGCATITGGGGGAGGGGATAACCG.AAAGTTCCAGTCT3f ( szek.
azonos)tószárna: 28.')..
A C-íragmenst azután újra hasítottuk Xhoi-enzimmel, és a 4 50 bp méretű KpnI/Xh-ol - fragmenst ligái tűk a XpnI/Xhoi-enzimekkel emésztett pSP72-vektorrai. A ligációs keveréket 'használtuk Bscherichia coli törzs DH5-kompetens sejtjeinek íGibco BRL, Gaithershurg, MD) transzformálására.
'••ι« * * φ * ♦ « « Φ « χ χ >Χ Φ >. X <
A trnas2form.ánsokat az inszerbet tartalmazó kiónokra szkrineltük kolónia-hibridizációval [<J. Samforook és mtsai,, Molecuiar Cloning: A Lahoratory Kannal, 2':: edition, told Soring Harbor La.bora.tory Press (1989) j . Plazmid-DFo-t. izoláltunk a pozitív kIónokból dizard miniprep kit ipromega Corp. cégtől szereztük bei alkalmazásával, és azután szekvenáltuk azokat Applied Biosystems 373A DBA Sequencer alkalmazásával. Azokat a kiőnokat, amelyek a korrekt DNSszekvenciát tartalmazták mind a négy fragmensből, emésztettük az előzőek szerint, hogy szabaddá tegyük a fragmenseket a p-SF72-vektorból. A Xpnl/XhoI-enzímekkei emésztett Cfragmenst ilgáltuk az Xhol/SglII-enzimekkel emésztett Dfargmenssei, és a Kpni/Bgill-enzímekkei hasított pSP72~ vektorral, háromkomponensű. ligáiással. A ligációs termékeket használtuk azután A. coli eredetű sejtek transzformálására, Az így kapott transzfortén sokat azután szekvenáltuk, és eljutottunk a helyes szekvenciát tartalmazó kiónhoz (CDvel jelöltük} . A CD-szek.v©ncia 750 kp méretű Bgill/Kpnlinszertjét azután újra kihasítottuk a pSBC2-vektorból, és Ilgáltuk a BglU/Sphl-enzimekkel emésztett A-fragmennssei és az Sphl/Kpnl-enzimekkel emésztett B-fragmenssel háromkomponensü ligálással az előbbiek szerint, kivéve azt, hogy BglXI-enzimet adtunk hozzá a nem kívánt ligációs termékek csökkentése céljából. A ligációs termékeket agaröz géleken választottuk el, az 1,5 kbp méretű fragmenst izoláltuk, és
D36X~i~el jelöltük.
<- X
2. példa
A szekvenciák ö s s z e h a s ο η 111 á s a
A RPVS/íi~hibrid~, HPV6a-bői származó nukieotidszekvenciákat és HPVll-El-DHS-szekvencia összehasonlítását a 2. ábrán mutatjuk be. összesen 55 nukleotidszubsztitűciót végeztünk a üPVö-gerincszekvencián, hogy átalakítsuk azt HPVll-et kódoló transzlációs fázisra. Ezenkívül három bázispárt inszertáltunk a #431-413. bp-boz egy plusz aminosavat {tirozln;':í) kódolva, axsít megtaláltunk a HPVll-foen, de a HPVö-ban nem. Együttesen, ezek a változtatások lehetővé tették a 11. típusra specifikus, konformáció- függő, semlegesítő monokionális ellenanyag (Chemicon 8-740 MAb; kötődését az élesztőben kifejezett HPV6/11-L1uNS-nek megfelelő Ll-fehérjéhez. Ez alátámasztja azt, hogy a EPVő/Il-hibrldgénnek megfelelő fehérje immunológiaiisg megkülönböztethetetlennek látszik a natív HPV'll-től.
A HFVő/11-hibrid DNS-szekvenciáját a közölt HPvil-hiszekvenciához hasonlítva 194 bázispár szubsztitúciót találunk. -Jelentős számban van szubsztitúció a vad típusú IILl-szekvenciához viszonyítva, bármelyik kombináció vagy akár az összes változtatás együttesen lehet felelős a 11Ll~típusú fehérje msgnövekedett mértékű expressziójáért élesztőben.
3. példa
Az hl -gén DÚS-székvenálása
A HFVc/Xl-Ll-gent ''Applied Biosystems DNA Seguencer #373A készülékkel szekvenáituk, festéktermináciős szekvenálő reakciókat alkalmazva (PR.T.ZM:M Sequencing Kit), a gyártó (ABT, Inc. cégtől szerestök fos, Foster City, CA) specifikációja szerint.
7, pád da
HPV6/1.1-U-, HPVii-Ll- és HPV€Ll-jelű élesztőben alkalmazható expressziós vektorok előállítása
A pGALl-lO-jelű élesztőben alkalmazható expresszlös vektort állítottunk elő a pCül«/kétirányú GAL-promóterplazmádból származó 1,4 kbp méretű SphI-fragmens izolálásával, amely plazmid a pBM272-plazmádból (Mark Johnstontől kaptak, Washington Universíty, St. Louis, MO) származó, Saccharojsyees cerevűsiae eredetű, divergens GAL1-GAL10promötereket tartalmaz, A divergens promőiereket miden egyes oldalról egy kópia élesztőeredetű ADB1-transzkripciós terminátor (Bennetzen, <J. L. és Hall, B< D., J. Bioi. Chem, 257, 3018-3025 (1982)] szegélyezi, egy BamHI-klónozóhely található a GÁLI-promoter és az ADHl-jelű transzkripciós terminátor első kópiája között, és egy Sraal-klőnosőhely található a GÁLI0-promőtér és az ADHl-jelű transzkripciós terminátor második kópiája között. Egy p3.R322-pIazmidot tartalmazó élesztőeredetű ingázó vektort, élesztőből származó LEUzd-gént [Erbart, E. és Bollenberg, C.P., J, Bacteriol. 156, 625-635 (1983)3 és· élesztőeredetű 2u~ plazmidot (Benjámin Hall ajándéka, Universíty of Washington, Seat t le,· WA) [Broaon, J. R, és Völkert, F, C., U-Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor (1391), New York) ♦ »
Γ, emésztettünk SpbX-enzimmel, és iigáltunk 1,4 ktop mérető Sphl-divergens-GAn-promöter-fragmenssel# amely a pGALl-10plazmídot eredményezte (3. ábra),
A HPV11-L1-fehérjét (a D361~l. sz. minta az. 1. példában) kódoló HPV6/ll-hÍbrid-Ll-DNS tartalmaz egy élesztő által felismerhető' nem-transzláiódő vezstöszekvencíát iránnyal szemben línearizáltuk# (Kniskern# P. J. és mtsai,# Gene 4 6# 135-141 (1936) ) rögtön a HPV€/ll~L.l“t kezdő metionin-kódon mellett, szintézisA pGALÍ-10-pIazmidot BahHI-el amely a GÁLI-promóter és az ADH1transzkripciős terminátor között hasit, és ligáitok a HPVS/l 1-1-1 -gén 1,5 kbp méretű fragmensével {'D3€2~l. sz. minta). Az S, coli eredetű DHS-transzformánsokat (Gibco BRL, Inc.) .szkríneltük, és egy HPVö/ll~Ll~gént tartalmazó pGALl-1δ-plazmidot izoláltunk, és D362-1. számmal jelöltük.
Vad típusú HPV11 (wt-HPVll;-EbíS-t klónoztunk egy oondyioma acumi.nstum sebből (Dr. Darron Brown nagylelkű adománya). A teljes humán genomí eredetű DNS-t extraháltük és restrikciós endonukleázokkai emésztettük, A wt-HPVllDNS-t tartalmazó frakciókat, egy PCR-templátként használható E. coli eredetű klónozó vektorba Iigáltuk, A wt-HPVH~Llgént PCR-re1 amplifikáituk Vent-polimeráz alkalmazásával (New Engiand Biolabs# Inc. cégtől szereztük he)# lőamplifikácíós ciklussal (94°C 1 perc# 43°C 1 perc# ?2°C 1 perc 45 másodperc)# a következő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával# amelyek szegélyező Sglll-hasitőhelyeket (aláhúzva) tartalmaztak:
szensz láncindító oligonukleotid;
5? ~CTC3bATCTCACAAAACAAAATGfGGCGGCGTAGCGACAGCAGAG~3! issek, azonosítószáma: 29.) axitiszenss láncindító oligonukleotid:
5f-GAGA3ATCTT&CTTT T T GGT T TTG GT ACGTTTTCG-3' (szék. azonositőszáxua: 30.)
A szánsz láncindító oligonukleotid egy élesztő által felismerhető nem-transzlálődó vezetőszekvenciát [Knis'k-srn, p. J. és mtsai,, Gene 46, 135-141 (1986)] juttat be rögtön a wt-BFVll-Ll-t kezdő metionln kódon (vastagfoetűvel szedve) mellé szintézisíránnyai szembe. A wt~HFVll~.Ll 1,5 kfop mérető PCR-termékét Bgll I-enzimmel. emésztettük, gélen tisztítottuk, és Bambi-enzimmel emésztett pGALl-lu-plazmiddai ligáltuk, így kaptuk a p329-l~plazmidot.
A ΗΡνβδ-ροζίtiv contíyloma acumínatam sebből (Dr. Barron Broun nagylelkű, ajándéka) extraháltak a teljes genomi eredetű DNS-t. A HFV6-a~Ll~gént PCR-reí ampiífifcáltuk, templátként biopsziáből származó DNS-t és Vnet-polimerázt [New England Bíolabs, Inc. cégtől szereztük be) alkalmazva, 35 axupii.fi kációs ciklussal (94°C 1 perc, 46°C 1 perc, ?2CG 1. perc 45 másodperc), a szentz iáncindítő oligonukleotid azonos volt a fenti wt-BPVll-Ll-RCR-nél alkalmzottai, és az -antiszensz láncindító- oligonukleotid a következő volt:
5f -GAGAGATCTTACCTTTT.AGTTTTGGCGCGCTTAG-G*' (szék. azonosítószáma: 31.)
A HPVua-Li 1,5 kbp méretű PCR-termékét Sgill-enzímmel emésztettük, gélen tisztítottuk és 8amHI-enzimmel emésztett pGALI-iO-plazmiddal ligáltuk, így kaptuk a Dl23-plazmidot.
5. pél de
1558 . sz,-ű törzs előállítása
a) 1épés; U9-é1esztőtörzs előállítása
2150-2-3·-jelű Saccharomyces cerevisiae törzset (MATalpha, leu2~04, adel, cir'd Dr. Lei and Hartweiltöl kaptuk (üniversity of Washington, Seattle, WA) . A 2150-2-3jeiű törzs sejtjeit egy éjszakán át tenyésztettük 30’C-on 5 ml YEHD-tápközegben [Carty és mtsai., >J. ind, Micro. 2, 117-121 (1937)] . A sejteket háromszor mostuk steril desztillált vízben, 2 ml steril desztillált vízben szuszpendáltűk azokat fel, és 0,1 ml sejtszuszpenziot szélesztettunfc hat 5-fiuoro-orotsavat tartalmazó tenyésztőtálcára, hogy uras-mutánsokra szelektáljunk P'Cold Spring Harbor Laboratory Manna1 fór Yeast Genetics) . A tenyésztőtálcákat 30°C-on inkubáltűk. A táptalaj 250 ml desztillált vízben a következőket tartalmazta: 3,5 g Dífco cégtől vásárolt élesztő-nitrogáubázis pTeast Nitrogén Sasé) aminosavak és ammónium-szulfát nélkül; 0,5 g 5-fiuoro-orotsav; 25 mg uracil; és lö,0 g dextrőz.
A táptalajt 0,2 pm-es membránon való átszűréssei sterilizáltuk és 250 ml 4%-os Sacto-Agarral (Dífco cégtől szereztük be) 50°c-on tartva, 10 ml 1,2 mg/ml adenin-oldattal és 5 ml 1-leucín oldattal (180 mg/50 ml) kevertük össze. Az *'* .3 &
így kapott táptalajt 20 ml-es adagokra osztottak szét
Pstrí-csészékbe.
Öt nap inkubáció után számos kolónia jelent meg. Az egyedülálló kolóniákat átszélesztettük az eredeti tenyésztotálcáröl egy friss FOA-tenyésztőtáicára, amelyeket Siódon in.kufoáltunk. Számos kolóniát teszteltünk a második sorozatból arai-mutációra, párhuzamos széiesztéssel YEKDtenyésztőtáicákra és uracii nélküli tálcákra. A kívánt eredmény; jó növekedés YEHD-táptalajon és semmi az uracii nélküli táptalajon. Egy izoiátum (U9) mutatta ezeket a tulajdonságokat. Mélyhűtött glicerines törzsoidatban tároltuk (törzsszám #325) -7Cóü~or további használatig.
bí lépés; Vektor előállítása éiesztőeredetü MNNu-gén. elrontására
Az MNNS-gén elrontására szolgáié vektor előállításához először az MNN9-gént kellett kiónozni S. cerevásiae genomi eredetű DNS-bői. Ezt a standard polimeráz-láncreakcíö (PCR)· alkalmazásával hajtottuk végre. A teljes hosszúságú MNN9gérfc kódoló szekvencia PCR-jéhez S'-szensz és 3f-antíszensz láncindító oiigonukleotídot terveztünk élesztőeredetű MNN9gén közölt szekvenciája íSymogenetíes: EPO Patent
Application No. 88117834,7, Publícation No. 0-314-036-A2} alapján. Az alábbi, szegélyező HindiΣΣ-hasitóhelyet (aláhúzva) tartalmazó láncínditő oiígodezoxinukieotidokat alkalmaztuk:
szensz láncindító oligonukleotid:
5'-CTTAAAGCTTATGTCAÜTTTCTCTTGTATCG-S' (szék.az.sz. : 32} .antiszensz 1 áncindító oiigonukleotid:
5-TeATAAGCTTGCTCAATGGTToTCTTCC2C-3f (esek.sz.sz,: 33)
Az MPiN9-gén kezdő metíonín kódon ját vastag betűvel, szedtük. A PCR végrehajtásához JKY188-js.lű S, cerevzsiae törzsből származó genomi eredetű DNS~t használtunk tempiátként, ?aq-pol.imerázt {Perkin Elmer cégtől szereztük be) alkalmaztunk 25 ampiifikációs ciklussal (94% 1 perc, 37%' 2 perc, 72% 3 perc). Az Így kapott 1,2 kbp méretű PCR-fragmenst Hindi11-enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk, és ligáltuk Rindlll-enzimmel emésztett, aikaiíknsfoszfatázzal kezelt pUCl3-plazmiddaI {Pharmacia cégtől szereztük be). így kaptuk a pllöS-piazmídot.
Az MNNS-gén élesztőeredetű üRA3-génnel való megszakítása céljából a pBR322~üRA3~piazmidot {amely a S, oerevísíae UP.A3~génf. kódoló 1,1 köp méretű Hindii!fragmenst tartalmazza a pBR322-plazmid Hindlllhasítóhelyébe szubkiőnozva? HindiiI-enzimmel emésztettük, és a funkcionális üRA3-gént hordozó 1,1 kbp méretű DNSfragmenst gélen tisztítottuk.,· ?4~DRS~poíimerázzal ragadő>s végűvé alakítottuk, és azután ligáltuk Pmil-enzimmel emésztett pi183-piazmiddal {a Pmll-enzim az DNNa-kódoid szekvenciában hasít). Az így kapott pliSP-plazmid tartalmazta a funkcionális üRAd-génnel. megszakított Ml®9-gént
c) Az NNR9~gén megszakítását tartalmazó, 1372♦ számú U9származéktörzs előállítása
Az ΜΝΝ'9-gén megszakítását az U9(#325)-törzsben a következőképpen végeztük: 30 μρ pll99-píazmidot emésztettünk
Hindlíl-al, hogy lineáris mnnő::URAs-megszakítókazettát állltsunk elő. A 325.
sz.-ú törzs sejtjeit a szíeropiasztos eljárást alkalmazva, HíndlXI-enzimmel emésztett p!199-D^Sel transzformáltuk (Hinnen és mtsai., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978)], és a transzformánsoka t olyan szintetikus agar-táptalajon szelektáltuk, amely uraoilmentes volt és 1,0 M szorbitot tartalmazott. A szintetikus táptalaj összetétele 1 liter desztillált vízre vonatkoztatva a következő volt: 20 g agar; 6,7 g élesztőül trogénbázis (Yeast nitrogén base) amínosavak nélkül; 0,04 g adsnin; 0,05 g L-tirozin; 182 g szerbitől; 20 g glukóz; és 10 ml leucin mínusz #2-old.«t. A leucin mínusz #2-oldat összetétele 1 liter desztillált vízre vonatkoztatva a következő volt: 2 g L-arginin; 1 g L-hisztidin; 6 g Lleucin; 6 g L-izoleucin; 4 g L-iizín; 1 g L-metionin; 6 g L-fenílalanín; 6 g L-treonin; 4 g L-tríptofán.
A tenyésztő-tálcákat 30°C--on ínkubáltuk öt napig, amely alatt számos kolónia jelent meg. Kromoszómáiis DNSmintákat állítottunk elő 10 kolóniából, és azután
Eco.RIZHindlII~enzimek.kel emésztettük azokat. A. DNSemésztmenyeket azután Southern-blot eljárással értékeltük ki [J< Sambrook és mtasi., Moleculsr Cioning; A Laboratory Manual 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press <1989)1 próbaként MMN9~gént tartalmazó, 1,2 kbp méretű HindlII-fragmenst alkalmazva (a pl19-9-plazmidból Izoláltuk). ügy olyan izolátumot (#1372; azonosítottunk, amely a DNS-csíkok várt eltolódásait a Soutbern-bloton, valamint az mnn9-mutánsok általi tipikus extrém összecsapzödását mutatta.
φ *
- 41 d) lépés: Élesztőéredetű HlS-3-gén megszakítására___szolgáló vektor előá_l 1 í t á s a
Egy olyan megszakitókazetta előállítása céljából, amelyben az URAS-gén megszakítja a S. cerevds.íae eredetű HIS3~gént, Yepő-pl azmi dót (K. Struhi és mtsí.? Proc. Natl, Acad, Sci, USA 76, 1035 (1973)) emésztettünk BamHlenzimmel, és a HIS3~génfc hordozó, 1,7 kbp méretű BamHIfragmenst gélen tiszítottuk, lé-DNS-pcIimerázzal tompa végűvé alakítottuk, és ligáitok pü'Cl 8-piazmiddai, amelyet előzőleg BamHl-enzimmei emésztettünk és T4-DNS~poiimerázzal kezeltünk. Az így kapott plazmidot (amelyet pl501-el vagy püCI8-BlS3~al jelöltünk) Nhel-enzímmel (amely a HlSo-kódolö szekvenciában hasít) emésztettük, és a vektortragmenst gélen tisztítottuk, T4-DNS~poiimerázzal tompa végűvé alakítottuk, és borjűbélből származó alkaiikus főszfátazzal kezeltük. Az URA3-gént izoláltuk a pSR322~URA3~plazmidból Hindiíl-enzimes emésztéssel., és az URAS-gént hordozó 1,1 kbp méretű fragmenst gélen tisztítottuk, és Ügáituk a fenti pDCIS-HISB-plazmidből származó Nhel-fragmenssel. Az igy kapott plazmid (pUC18~his3: :URA3~al vagy pl505-el jelöltük) tartalmazta azt a megszakitókazettát, amelyben az élesztőből származó HIS3~gént funkcionális URAS-gén. szakítja meg.
e) __ lépés: Élesztőből származó PRBl-gént, HIS3~gén által megszakító vektor előállítása
A S. cerevísiae eredetű PRBl-gént hordozó ΕΡ3ΔΗplazmidot Dr. E. Jonestől kaptuk, a Carnegie-Nellon Egyetemről [C. M, Moehle és mtsai., Genetios 11_5, 255-263 (198?)), A plazmidot HindlIX/XhoI-enzimskfcel emésztettük,
és a PRBl-gént hordozó 3,2 kbp méretű DNS-fragmenst gélen tisztítottuk és T4DNS~pol.ím.erá2os kezeléssel tompa végűvé, alakítottuk.. A püClS-prazmido-t BamHI-enzimmel emésztettük, gélen tisztítottuk és Té-DMS-polimsrásos kezeléssel tompa végűvé alakítottuk. Az igy kapott vektort'ragmenst ligáitok a fenti PRBl-génfragmenssel, így kaptuk a pUClS-PRBlplazmídot. A Yep6-piazmidot, amely a HIS3-gént tartalmazta, BamHI-enzimmel emésztettük. Az igy kapott 1,7 kbp méretű, funkcionál is HI.S3-gént hordozó BamHI-f ragmenst gélen tisztítottuk, és azután Té-DNS-polimerázo-s kezeléssel tompa, végűvé. alakítottuk. A pUCIB-PRB.l-piazmidot Eco-RV/NcoIenzímekkei emésztettük, amelyek a PRBl-kódoló szekvenciában hasítanak és eltávolítják a proteáz-B aktív centrumát és szegélyező szekvenciáját. A püCIB-plazmidban lévő, PRBlkódoló szekvencia maradék 5* - és 3'-darabját hordozó, 5,7 kbp méretű ScoRV/KcoI-fragmenst gélen tisztítottuk, T4-DNSpolimerázos kezeléssel tompa végűvé alakítottuk, borjúbélbői származó aikalikus foszfatázzal defoszforiláltuk, és ligáitok a fenti tompavégű HlSS-fragmenssel. Az így kapott plazmád {pUClS-prbl::fí!S3~al jelöltük, törzsszáma #1245} tartalmazta a funkcionális HlSó-gént a PRBl-gén egy darabja helyett, amelyet a fentiek szerint deletáltunk.
f} _ lépés: .Az üS-tőrzzsel rokon élesztőtörzs előállítása, amelyben mind az MNN9-, mind a PRB-l-gén meg van szakítva
Az MNNP-gén általi megszakítást tartalmazó, UStörzzsel rokon 1372. sz.-ú törzs előállítását az S.c példában ismertettük. Az 1372, sz.-ű törzs monoklonáiís izolátumait FOA-tenyésztőtálcákra {az 5.a példában leírtak
«·.* szerint) szélesítettük uraH-mztánsokra való szelektálás céljából. Az 1372. sz,~ú törzs számos uraH-izoIátumát állítottuk elő# és egyik izoiátumot kiválasztottuk az azt követő HIS3~gé-n. megszakításához , A püCl S-his3: : URA3génmegszakító vektort (pl505) Xbal/EcoRI-enzimekkel emésztettük, igy lineáris his3: :URáő-megszakitökazettát állítottunk elő, és a 12930-190-S1-1. sz.~ű törzs lítium-acetátos eljárással [Metbods in Snzymciogy# 194, 290 (1991) ) végzett transzformációjához használtuk fel. Ura*-transzformánsokat szelektáltunk uracilment.es, szintetikus agar-táptalajon, üjra szélesítettük kiének izolálására ugyanerre a táptalajra# és azután párhuzamos sséiesztést végeztünk vagy uracilmentes# vagy hlsztídinmentes táptalajra olyan izoiátumok szkrinelése céljából, amelyek mind ürap mind H.i-s‘ voltak, Agy izolátumot (12930-230-1. sz.-ü) szelektáltunk ki az azt követő PEBI-gén megszakítására, A PEBl-gént megszakító vektort (püClS-prfcl::HIS3, #1245) Saof/Xbalenzímekksl emésztettük# így lineáris prbl::ElS3megszakítókazettát állítottunk elő és a 12930-230-1. sz.-ű törzs lítium-acetátos eljárással végzett transzformációjához használtuk fel, His'-transzformánsokat szelektáltunk bisztidinmentes agar-táptalajon, újra szélesítettük kiónok izolálására ugyanerre a táptalajra. Genomi DNS-t állítottunk elő a számos Így kapott Hís'-izolátumböi, S.coRI~ enzimmel emésztettük# és azután eiektroforetízáituk azokat 0,81-os agaröz gélben. Azután Southern-blot analíziseket végeztünk 617 bp méretű, radioaktívan jelölt próbát alkalmazva a PRBI-génre# amelyet PCR segítségével állítottunk elő· a következő lánc indító oligo-desoxinukelotidok alkalmazásával ;
5' TGC TCA ICC CAA ATC TTG AAA 3* (34. szék.az.sz.); és
5' CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (35. szék.az.az.; .
Tizenegy olyan i zol atomot, kaptunk, amely mutatta a próba kívánt hibridizá-lódását a 2,44 kbp méretű prbl: : HI.S3DRS~frsgmens.sel. Sz ellentétben, volt azzal·, 'hogy a próba hibrídizálódott a vad típusú PRRI-gén 1,59 kbp méretű fragmensével. Ezek közül az izolátumok közül az egyik tartalmazta a kívánt prbl; :Hl.S3~megszakltást, amelyet kiválasztottunk további felhasználásra, törzsszáma #1558.
6. példa
HWI I-Ll- és HőVő-Ll-fehérje ki felezése élesztőben
A D362-1- (pGALl-10 >· HPVO/li-Ll;, p329-l- (pGALl-10 a wt-RkVil-Ll) f D128- (pGALi-10 é RPVO-Ll} és pGAU-10plazmrdokat .alkalmaztuk a #1558. S. cerevisiae törzs (MATa, leu2~04, prbl;;HT.S3, mnn9: :URA3, adel, cirö, transzformálására. A D3€2-1-plazmaddal transzformált #1558. élesztő-törzset #1782-el jelöltük. RNS-vizsgálatok céljából élesztőkión-izolátumokat 30°C-on növesztettük. YER-komplex tápközegben [Carty és mtsai., J. Ind. Micro. 2, 117-121 (1937)} 26 óráig, amely 0,1 M szorbltot valamint 2% glükózt vagy galaktózt tartalmazott. A sejtek elkülönítése után az éiesztő-RNS-t extraháltuk, forró savas fenolos eljárást alkalmazva [Current Rrotocols ín Molecular Biology, vol. 2., -Current Protocols (199-3) ] . Fehérji ©analízis céljából, az azonos izoláfcumokat 30eC-o.n növesztettük YE.H-komplex fápko’ί:
zegben 7δ óráig, amely 0,1 M szorbltot, 2% glükózt és 2% galaktózt tartalmazott. A sejtek elkülönítése után a sejtüledéket üveggömfcökkel tártuk fel, és a sejtlizátumot HPY11-L1- vagy HPV6-L1-fehérje expresszárására vizsgáltuk immunoblottoiással.
7. példa
Élesztőben expressziéit BBV-L1-RNS-ek Northern-blot anallzise lö pg totál RNS-t tartalmazó mintákat denaturáltunk glioxált és BMSO-t alkalmazó kezeléssel [Current Protocols in Nbiecular Biology, voi. 1., Current Rrotocols {1993}], és elekfcroforetísáltuk foszfát-pu.f férés, 1,2%-os agarózgélen. Az RNS-t nylon membránra vittük át, és '^P-vel jelölt oligonukleotiddal detektáltuk, amely komplementer volt mind a HRVli- , mind a RPVu-Ll-DNS-el.
A Northern-blot analízist a 4. ábrán mutatjuk be. Nincs olyan csík, amely megfelelne a várt, teljes hosszúságú HPV-Ll-RNS-nek, amelyet a glükózt tartalmazó tápközegben növesztett -mintákban detektáltunk {1,,3, és 5. sáv). Ez várható volt, mivel a glükóz represszálja az élesztőből származó GÁLI-promótérből való transzkripciót. Ezzel ellentétben, a galaktózt tartalmazó tápközegben növesztett minták, mivel a gaiaktőz Indukálja a GÁLI-promótérből való transzkripciót, erős HPV-L1-RNS-jeleket mutattak, A HBVS-Ll teljes hosszúságú PMS-fajtaként íródik át (2. sáv), míg a vad típusú (wt)-HPV1l-Ll többsége rövidített formában íródik át (4. sáv). Ezek az eredmények azt támasztják alá, ΐ ί κ hogy egy élesztőeredetü transzkripciós termináciős szignál tri 1 álható· a wt-HPVll-Ll-ORF-ben, da nincsen meg a HPV6-L1szekvenciában. A HRV6/1l-hibridgánből átíródott RNS teljes .hosszúságúnak tűnik (6. sáv).. HPV-re specifikus RNS-t nem detektáltunk az élesztőeredetű pGAL-10-kontrolmintában (7.
sáv; .
E. példa
Élesztóben expresszált BFV- L1 -f ehérjék Kestern-analízise pg totál celluláris fehérjét tartalmazó mintákat elektroforstizáltünk 10%-os Vris-giicint tartalmazó gélben (Novex, Inc. cégtől szereztük be) denaturáló körülmények között, és elektroblotoituk nítrocellulóz szűrőkre. Az LIfehérjét immunológiai eljárással detektáltuk, trpE-B?VllLl-fúziós fehérje ellen termeltetett, nyűl-antiszérumot alkalmazva első ellenanyagként (Brown, D. R. és mtsai., Virology 201, 46-54 (1994)} és tormaeredetü peroxidázzal (BRR) jelölt, szamárban termeltetett anti-nyűl-IgG-t (Amers.feam, Inc. cégtől szereztük be) alkalmaztunk második ellenanyagként. A szűrőket kemilumineszcenciás ECL™ Detecticn Kit íAmersham., Inc. cégtől szereztük be) alkalmazásával kezeltük.. Egy 50-55 kDa méretű Ll~fehérjecsikot detektáltunk mindegyik mintában, kivéve a pGALl-lö-jelű negatív kontrolt (4. sáv, B. ábra). Továbbá, a HPV6/X1hibridgén által expresszált HPVll-Ll-fehérje (3. sáv) menynyisége kb. IQ-sser nagyobbnak látszik, mint akár a wtHRVll-gén által (2. sáv), akár a HPVű-Ll-gén (1. sáv) által expresszált Ll-fehérje mennyisége.
* V * * * *
9. pél da
Élesztő által expresszált H?V1l-Ll-VLF-k ELlSA-mérése
Enzimkapcsolt imnnszorbens vizsgálati eljárást (ELISA-ként is rövidíthetjük) alkalmaztunk az élesztőkiötlőkből termeit, vagy wt-HPVll-f ehérj ét vagy HPVt/l.lhibridfehérjet expresszálö VLP-k relatív mennyiségének meghatározására. ELISA~t alkalmaztunk annak bemutatására is, hogy erősen semlegesé tő eilenanyagválaszokat kiváltó konformációs epifcőp maradt épen a HPVS/Il-hlbrid-DNS-hől származó VLB-ken. Ezt a konformációs epitópot a. H11.B2monoklonális ellenanyaggal határoztuk meg (C'hristensen. és mtsai., J. Viroi. 64, 5678-5681 (1990)), amelyet a Chemican International (Temecuia, CA) cégtől szereztünk be, mint Chemichon Mab874 0- Röviden, ismertetve, az ELISA~fálcákon (Maxisorb, Mono Inc., Faperville, IL) lévő lyukakat csökkenő mennyiségű, HPV6/11(hibrid;- vagy wt-HPVll-VLP-ket tartalmazó, totál éiesztőfehérjével burkoltuk 100 pl PBS-ben, CsCi-on tisztított wt-KFVÍl-vlrionokat (Dr. ű, Brown nagylelkű adománya) és kontrol élesztőfehérjét használtunk kontrollként. A tálcákat egy éjszakán keresztül inkubáltuk 4°C~on a folyadék kiszívása és blokkolás előtt, a blokkolást 250 μί 10%-os szárított tejjel (Carnation) végeztük TTHS-puff erben (50 mM Tris, pH 7,6, 150 mM MaCi, 0,1%
TweenBöj 2 óráig szobahőmérsékleten, A tálcákat egyszer mostuk FBS/0,1% Tween20~puíferrel, mielőtt inkubáltuk 100 μί 1:1000 hígítású, Chemicon MAB 8740 anti-.HPVil-vírion monoklonális ellenanyaggal 1% szárított tejben T?BS~ben 1 óráig szobahőmérsékleten. A tálcákat háromszor mostuk
PBS/Tween 20-puf ferrs.1, majd inkubáltuk 100 gl alkalikus £'oszfatá2zai jelölt snti-egér-lgö-vei (Kierkeg&rd&Perry, Gaithersburg, MD} 1:1000 hígításban, IS tej t TTBSpufferben I óráig szobahőmérsékleten. A tálcákat újra mostuk FBS/Tween '20-puf ferrel, mielőtt 100 μΐ foszfa.táz szabsztrafót (p~nitrofen.il~foszfát) adtunk hozzá. A tálcákat 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. A reakciót 50 gi 3 N NsOH hozzáadásával állítottuk le. A tálcákat 405 nmen olvastuk le EE1SA tálcás spektrofotométerben ípiate readeri.
lyukban leolvasott Oty<;5. .S(, érték átlagát korrigáltuk a kontrol -élest tő fehérjékből kapott háttérértékekkel, és ezt ábrázoltuk a lyukakban lévő totál élesztőfehér j -ével szemben, és a 6. ábrán mutatjuk be. A HPV6/11-hibrid élesztőkiónja több, mint 10-szer annyi natív VLP-t termeit, mint a wt-klón. Ráadásul a Chemicon Mab $740-jelű ellenanyag által felismert erősen centralizáló epítóp is megjelent ezeken a VLP-ken.
10, példa
E1 ektronmikroszkó-pos (EM> vizsgálatok
EM-vizsgálathoz (Strucfcurs Probe, Kést Óbester, PA) mindegyik mintából (a nyers tiszta lizátumfoól vagy tisztított VLP-kből)· ali.kvotok.at helyeztünk egy 200 mesh~es szénnel burkolt rézrácsra. Egy csepp 2%-os foszfo-woiframsavat, pH-ja 7,0, ejtettünk a- rácsra 20 másodpercre, A rácsokat levegőn száradni hagytuk a transzmissziós EM vizsgálat előtt. Az összes mikroszkópos vizsgálatot JSOL 100CX-típusú
♦ Φ φ ΦΦΦ« « 9 * Φ
Φ * * « » * transzmissziós elektronmikroszkópon (JEOL USA, Inc.) végeztük, ISO kV gyorsítófeszültségnél. A. nrikrográfokát 100.000 x-es végső nagyításnál vettük fel. Ahogyan azt a 7. ábrán láthatjuk, a megfigyelt VLP-k átmérője 45-55 nm-es tartományban voltak minden HPV11-mintában, de az élesztőből származó kontrolmintákban.
11. példa
Hbkn/11 ϊX-fehérje fermentácíója {terasszám. #1782)
Az 1782. sz.-ü törzs felületi tenyészetét oltottuk sterilen a következő összetételű leucinmentes folyékony tápközegbe, amelynek összetétele a következő volt (literenként) : 3,5 g Difco cégtől vásárolt élesztő-nítrogénbázis aminosavak és ammónium-szulfát nélkül; 0,2 g adenin; 0,2 g uracii; 10 g szukciniisav; 5 g ammönium-szulfát; és 0,25 g L-tirozin; ennek a tápközegnel a ph-ját 5,0—5,3-ra állítottuk NaOü-ai sterilizálás előtt. Rázógépen növesztettük 25 óráig, 28cC~on, 250 rpm-el,· majd ezután a tenyészetet lefagyasztottuk csövekbe, steril glicerint adagoltunk hozzájuk 17% (w/v) végkoncentrációban, mielőtt ~70öC~ra helyeztük azokat (1 ml fagyasztó-edényenként) tárolás céljából. Az 1782. sz.-ú törzs inokulumfermentáciöját ugyanebben a tápközegben végeztük (750 ml 2 I-es edényenként) , és két fagyasztóedény megolvasztott tartalmával oltottuk a 2 1-e-s edénybe, majd 23öC-on, 25 óráig rázsttuk inkubátorrázógépen 250 rpm-el·. Az 1732. sz,--ü törzs fermentációját egy Chemap típusú 23 1-es fermentorban végeztük, 18 1-es tenyésztési térfogatban az inokuláiás után. A termeléshez alkalmazott φ »» « * Φ * « * « ♦ * ♦ ♦ *·♦ φ » φφφ» φ φ < Φ „9 « ♦'« * ί ι tápközeg összetétele a következő volt (literenként; : 2 0 g Difco élesztökivonat; 10 g Sheffield HySoy pepton; 20 g glükóz; 20 g galaktóz? a táptalajt pH 5,3-ra állítottuk sterilizálás előtt. A 2 1-es ínokulnmedény teljes tartalmát (500 ml; a fermentorba öntöttük, amelyet 28'=C-on inkubáltunk, 9 1/perc sebességgel levegőztettünk, 500 rpmel keverhettünk, 3,5 psl nyomás alatt, A kevertetésfc szükség szerint növeltük, hogy az oldott oxigénszintet a telítettség 40%-a fölött tartsuk, A fermentáció előrehaladását cfflins glükózmérésekkel (Beckman Glucose 2 Analyzer; és online tömegspektrométerrel (Rerkin-Elmer 1200; követtük. 65 óra inkubáció után az elért sejtsűrüség 9,32 g száraz sejttömeg/liter volt. Két ilyen fermentáció tartalmát (eszszesen 17,5 liter fermentíé) összeöntöttük a sejtek kinyerése előtt. A tenyészetet hol.low fiber szűrőn (Amioon
H5dPöl~43 betét az Amicon DC-10 szűrőrendszerben) koncentráltuk kb. 2 1-re, diaszűrtük 2 liter foszfát-pútterelt sóoldattal, és tovább koncentráltuk (kb. 1 1-re;, mielőtt széttör főttük azokat 500 ml-es centrifugacsövekbe. A sejteket 4“C~on, 8000 rpm-an, 20 perces (Sorval GS3 rotor) centrifugáiéssal ülepítettük. A felülűszö dékántálása után a sejtüledéket (358 g nedves sejt összesen) -7G°t-or. tároltuk a felhasználásig.
12. pél da
Rekombináns II. típusú HFV-Ll-kapszidfehérjék tisztítása
Az összes lépést 4°C-on hajtottuk végre, hacsak ezt külön nem jelezzük.
« « * X φ i ♦ * *
Α φφ «φ χ
A sejteket ~?0°C~on tartottuk fagyasztva. A fagyasztott sejteket (nedves tbmeg~I30 g) felolvasztottuk 20~23*C~ on és felszuszpendál tok 900 ml feltáró pufferben ;50 mM MóPS, pH g2, 500 ró) NaCl, 1 mM CaCl£) . AEBSF és pepsztatin-A proteázinhlbí.torokat adtunk hozzá 1 mM és 1,7 uM végkoncentrációban, sorrendben. A sejtuszpenzlót körülbelül 16,000 psi nyomáson tártuk fel Mllö-Y Mlcofluídízelben (Ml crof luidlcs Corp., Newton, MA), 4-szer átnvomva. Elegendő mennyiségű 10%-os Triton XlöG^-detergenst (Pierce, Rookford, IX,} adtunk a feltárt sejtszuszpenzröhoz, hogy a 1X100 koncentrációja 0,5% legyen. A szuszpenziót 20 óráig kevertettük. A Triton XlOO-ai kezelt lízátumot 12.000xg-n, 40 percig centrifugáltuk a sejttormelékek eltávolítása céljából. Az Ll-fehérjét tartalmazó feiulúszőt tartottuk meg.
A felüiűszót tíias-zűrtük öt térfogat 20 mM nátriumfoszfát, pH 7,2, 0,5 M MaCl-ot tartalmazó pufferrel szemben, 300 K tangenciális membránkazettát (FÍItron, borthberough, MA) alkalmazva. A membrán által visszatartott anyagban radioaktív immunológiai vizsgálati eljárással és western-blotolással mutattuk ki az Ll-fehérjét.
A retentátumot nagy felbontású aff initásoszlopra vittük fel (11,0 cm ID x 5,3 cm), amely S? Spherodex (M) ®gyantát (1BF, VíIleneuve-Ia-Garenne, Francé) tartalmazott, amelyet 20 mM nátrium-foszfát, pH 7,2, 0,5 M NaCi-ot tartalmazó pufferrel ekvilitorálfcunk.. Az ekvllíbrálő pufferrel és az azt követő 20 mM nátrium-foszfát, pH 7,2, 1,0 M MaClot tartalmazó pufferrel való (lépcsős gradiens) mosás után az Ll-fehérjét 20 mM nátrium-foszfát, pH 7,2, 2,5 M NaCl-ot 'taimazé- pufférés mosással eluáltuk. Az oszlopról lejött
kban levő totál
tűk meg. A f rak
st ékeié· kői loidá)
k. A frakc lókat
frakciókat radioaktív immunológiai vizsgálati eljárással is analizáltuk.
Azokat az SP .Sph.erode.x~frakodókat, amelyek hasonló tisztaságúnk és Ll-fe'hérjére tömények voltak, összetdltöttük.
A végterméket weste.rn~.blot és SDS-PAGE (detekcíó koiloidálís Coomassie-val} eljárásokkal analizáltuk. Az LI~ fehérje homogenitását >sö%~os tisztaságúnak becsültök. Az hl- fehérje azonosságát westem-biottolással igazoltuk. A végterméket sterilen szűrtük 0,22 pm-es membránon, és Gálon tároltuk. Ez az eljárás végül 100 mg fehérjét eredményezett.
Az elektronmikroszkópos vizsgálatot a Structure Probe (West Chester, PA) végezte el. Egy alikvot mintát helyeztünk egy 200 mesh-es szénnel, burkolt résrácsra. Egy csepp 2%-os foszfo-wolframsavat, pH-ja 7,0, ejtettünk a rácsra 20 másodpercre. A rácsokat levegőn száradni hagytuk a transzmissziós EM vizsgálat előtt. Az összes mikroszkópos: vizsgálatot JEOL 10 OCX-típusú, transzmissziós elektronmikroszkópon (JEOL USA, Inc.) végeztük, 100 kV gyorsítóiészültségnéi. A mikrográfokat 100,000 x~es végső nagyításnál vettük fei.
3radf'ord·· fé 1 e eljárás totál fehérje meghatározására
A totál fehérjét egy kereskedelemben kapható, Coomassie Fiús ® reagenskésziet (Piarcé, Rockford, 1L) alkalmazásával határoztuk meg. A mintákat MilIí-Q-rbO-val hígítottuk a megfelelő szintre. A szükséges térfogat sorrendben 0,1 ml és 1,0 ml volt a mikro- és a standard eljárások esetén. Mindkét eljáráshoz ESA-t (Piarcé, Rockford, 1L) alkalmaztunk a standard görbe felvételére. Az eljárást a gyártó ajánlásai alapján hajtottuk végre. A standard görbét ''CricketGrapK* szoftver alkalmazásával vettük fel egy Macin t o s h Π c i számítógép e n.
SDE-PAGEjny western-blot vizsgálati eljárások
A géleket, puffereket, és az eiektroforetifcus berendezést a Rovex cégtől szereztük be (San Diego, CA) , és a gyártó ajánlásai alapján használtuk azokat. Röviden, a mintákat azonos fehérjekoncentrációra hígítottuk Flilii-Q-.Hj.Oval és 1:1 arányban kevertük azokat össze a mintaínkubációs pufferrel, amely 200 sM DTT-t tartalmazott. A mintákat 15 percig inkubáltuk lOO^C-on, és az előre kiöntött 12%-os Tris-glioint tartalmazó gélekre vittük fel azokat. A minták elektroforézlsét 125 V-on, 1 óra. 45 percig végeztük. A géleket kolloidális Coomassie festéssel hívtuk elő, kereskedelemben kapható reagenskészlet (Intergrated Separatíon Systems, Ivat lek, FIA) alkalmazásával.
A western blothoz a fehérjéket FVDP-membránokra transzferáltuk 25 V-on 40 percig. A membránokat Mi iii-QH?0-vai mostuk és levegőn szárítottuk. Az első ellenanyag poiiklonális nyúl-antíszérum volt, amelyet a TrpS-HFVil-LI-
•A fúziós fehérje ellen termeltettek (Dr. D. B-rown ajándéka). As ellenanyagcldatot as antíszérum biottolópufferben (5% zsírmentes tej, 6,25 mM Na-foszfát, pü ~T,2t 150 mM MaCl,
0,02% Naih) való hígításával készítettük. Legalább egy óráig inkubáltuk 2ö-23°C-on. A folobot 1 percig mostuk, háromszori cserével PBS-ben {6,-25 mM Ma-foszfát, pH ?,2, 150 mM MaCl;. A második ellenanyag oldatát kecskében termeltetett, alkalikus fősz:f áfással konjugált antí-nyúl-Ige antlszérum (Pierce, Rockford, J.L) biottolópufferre! való hígításával állítottuk elő, As inkubációt azonos körülmények között hajtottuk végre legalább egy óráig. A biotokat az előzőekhez hasonlóan mostuk, és egylépéses MBT/SCIű-szubsztrát (Pierce, Rockford, IL} alkalmazásával detektáltuk.
13. példa
Immunogén készítmények előállítása
Tisztított VIP-ket ismert eljárások szerint szereltünk ki, gyógyszerészetíieg elfogadható hordozók, stabiltsátorok vagy oltóanyag-adjuváns hozzáadásával. A találmány szerinti immunogén VLP~ket oltóanyag céljára fiziológiailag elfogadható készítménnyel, például PB3-el, sóval vagy desztillált vízzel való összekeveréssel állíthatjuk elő. Az immunogén V.LP-ket 0,1 - löö meg dóző.s tar töményben adhatjuk be, a kívánt immunogén hatás elérése érdekében, A kiszerelt készítménybe kerülő VLB mennyisége számos faktor szerint változhat, például az egyén egészségi állapotának, súlyának, korának és nemének megfelelően. A 7LP-készítmények beadása sokféleképpen történhet, például orálisan, sznhkufeán, φφφ topikálisan, mukozáiisan és intramuszkalárisan. Az ilyen VlP-kiszerelé-sek tartalmazhatnak, egytípusú V'LP-t {azaz VLPt HPV11-ből), vagy VI<P:~k. keverékét (azaz VLP-ket HPVS-, HPV11-, HPV1-6- és HPViS-bőI) .
Adott esetben mikroorganizmusok szaporodását gátié tartósítószer, például timerozái lehet jelen. A találmány szerinti immun-egén antigéneket, igény szerint, -oltóanyagstabilizálökkal és olt-óanyag-adjuvánsokkal kombinációban is alkalmazhatjuk. A tipikus stabilizálok speciális vegyületek, például poliani-onok, úgymint heparin, inozitolhexaszulfát, szulfátéit béha-cikloóextrin, kevésbé specifikus kötőanyagok, például aminosavak, szerbit, mannóz, xiiéz, glicerin, szacharóz, dextrőz, tr-ehalóz, és az oldószer körülményeinek variációi, például semleges pH, nagy ionerősség (kb. 0,5 2,0 M só), di val e-ns kationok íCa‘‘, Mg2*). Adjuvánsok például Al (ΟΗΉ és Al (PO<) . Az találmány szerinti oltóanyagokat hűtve vagy lio.fizilálva tárolhatjuk.
14. pél ds
VLP elleni ellenanyagok termeltetése
Tisztított VLP-t használtunk ellenanyagok termeltetésére. Az 'ellenanyag kifejezésen poiikionális és monokionális ellenanyagokat egyaránt értünk, valamint ezek fragmenseit, amelyek képesek antigént vagy haptént kötni. Az ellenanyagok alkalmazásának sokféle lehetősége van, például rekombináns VLP tisztítására, natív 1.1- vagy L2~ fehérjék tisztítására, és reagenskészletekben alkalmazhatjuk azokat, A reagenskészlatek kompartmentaíizált dobozt tartalmazhatnak, amelyben legalább egy edényt jói zárható aootban e.
tartani. A doboz tartalmazhat továbbá ame I y sokét, például anti-VLP el alkalmas HPV vagy HPV-fragmer ett ellenanyagok detektálását detekcíös eszközöket, például jelölt szubsztrátot vagy ehhez hasonlót. Az VIP vagy a reagenskészletek sokféle például törvényszéki vizsgálatokra és enanyagot vagy VLP-t, sek vagy HPV ellen téri. A doboz tartalmazhat antigént vagy enzimellenanyagok vagy a célnak megfelelnek, j á r v á n y t a n i v i z s g á 1 a tokra . <e ♦ χ. .. Λ

Claims (7)

1. Izolált és tisztított nukleinssv-uolekuia, amely II, típusú humán, papillomaví.rusból származó Ll-fehérjét kódol, és élesztő által felismerhető belső transzkripciós terminációs s z-íghá1októl mentes.
'
2, As I. igénypont szerinti nukle.insav-moleku.la, amely
DNS-molekula.
3. Az 2. igénypont szerinti DNS-molekula, melynek szekvenciája a 8, ábrán látható szekvenciával megegyezik.
4. Expressziős vektoramely 2. igénypont szerinti DNSmolekulát tartalmaz.
5. Expressziós vektor, amely 3. igénypont szerinti DNSmolekulát tartalmaz,
S, Az 5. igénypont szerinti expressziős vektor, amely a 2. ábrán bemutatott pGALl-10 jelzésé vektor.
7. Készítmény, amely 2, igénypont szerinti DNS-molekulát vagy 2. igénypont szerinti DNS-molekulával komplementer RNS~t tartalmaz.
8. Az 1. igénypont szerinti nukleínsav-mólokula alkalmazása humán papíllomavírus által okozott fertőzés vagy megbetegedés kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
HU9801608A 1995-03-30 1996-03-26 Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein HU228490B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41357195A 1995-03-30 1995-03-30
US41357295A 1995-03-30 1995-03-30
PCT/US1996/004117 WO1996030520A2 (en) 1995-03-30 1996-03-26 Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9801608A2 HUP9801608A2 (hu) 1998-10-28
HUP9801608A3 HUP9801608A3 (en) 1999-04-28
HU228490B1 true HU228490B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=27022236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9801608A HU228490B1 (en) 1995-03-30 1996-03-26 Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6159729A (hu)
EP (1) EP0817852B1 (hu)
JP (1) JP3918877B2 (hu)
KR (1) KR100441477B1 (hu)
CN (1) CN1154732C (hu)
AT (1) ATE247712T1 (hu)
AU (1) AU708111B2 (hu)
CZ (1) CZ291375B6 (hu)
DE (1) DE69629556T2 (hu)
DK (1) DK0817852T3 (hu)
EA (1) EA000969B1 (hu)
ES (1) ES2203691T3 (hu)
HU (1) HU228490B1 (hu)
IL (1) IL117591A0 (hu)
NO (1) NO320086B1 (hu)
NZ (1) NZ306663A (hu)
PL (1) PL183299B1 (hu)
PT (1) PT817852E (hu)
SK (1) SK283998B6 (hu)
WO (1) WO1996030520A2 (hu)
ZA (1) ZA962526B (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL319294A1 (en) * 1994-09-22 1997-08-04 Merck & Co Inc Dna encoding the human papilloma virus of 6 a type
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
ES2216280T3 (es) * 1997-04-08 2004-10-16 MERCK &amp; CO., INC. Formulaciones estabilizadas de papilomavirus humano.
SI1105466T1 (sl) * 1998-08-14 2006-08-31 Merck & Co Inc Postopek za ciscenje virusu podobnih delcev humanega papilomskega virusa
DE19840263C1 (de) 1998-09-03 2000-05-25 Deutsches Krebsforsch Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
US6380364B1 (en) 1998-11-23 2002-04-30 Loyola University Of Chicago Chimeric biotin-binding papillomavirus protein
AUPP765398A0 (en) * 1998-12-11 1999-01-14 University Of Queensland, The Treatment of papillomavirus infections
SI1150712T1 (sl) 1999-02-05 2009-02-28 Merck & Co Inc Pripravek cepiva proti humanem papiloma virusu
US7001995B1 (en) * 1999-08-25 2006-02-21 Merck & Co., Inc. Synthetic human papillomavirus genes
SI1421200T1 (sl) * 2001-08-23 2007-04-30 Merck & Co Inc Poskusi PCR fluorescentnih multipleks HPV-jev z uporabo vec fluoroforov
EP1302550A1 (en) * 2001-10-10 2003-04-16 King Car Food Industrial Co., Ltd. Method and detector for identifying subtypes of human papilloma viruses
RU2005131016A (ru) * 2003-03-07 2006-06-10 Мерк энд Ко., Инк. (US) Вакцина вируса гриппа
AU2004224335B2 (en) 2003-03-24 2010-01-28 Merck Sharp & Dohme Llc Optimized expression of HPV 31 L1 in yeast
IL156670A0 (en) * 2003-06-26 2004-01-04 Zvi Zolotariov Aloe suppositories
US7527948B2 (en) * 2003-09-25 2009-05-05 Third Wave Technologies, Inc. Detection of HPV
MY140664A (en) * 2003-09-29 2010-01-15 Merck Sharp & Dohme Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast
MY139500A (en) * 2003-11-12 2009-10-30 Merck Sharp & Dohme Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast
TWI349036B (en) * 2004-03-24 2011-09-21 Merck Sharp & Dohme Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast
EP1819835B1 (en) 2004-12-08 2010-08-04 Gen-Probe Incorporated Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
ES2524050T3 (es) * 2004-12-10 2014-12-03 Genera Biosystems Limited Detección del virus del papiloma humano (VPH) usando sondas de ácidos nucleicos, microperlas y clasificadores celulares activados por fluorescencia (FACS)
WO2007057669A2 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Genoid Kft. Method of detecting pathogens
US8080643B2 (en) * 2006-09-05 2011-12-20 Third Wave Technologies, Inc. HPV primers
CN101200696B (zh) * 2007-11-14 2011-07-20 山东大学 人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用
KR20090073987A (ko) * 2007-12-31 2009-07-03 정운원 인간유두종바이러스 유전자형 검사를 위한 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 ｄｎａ칩, 이의 검사 방법 및 검사 키트
WO2011149897A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
WO2012065034A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Enolase peptide conjugate vaccines against staphylococcus aureus
CN103717741B (zh) * 2011-06-15 2016-04-13 中央大学校产学协力团 用于提高人乳头瘤病毒l1蛋白产量的方法
BR112018011331A2 (pt) 2015-12-04 2019-04-30 Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. mutante de proteìna l1 de papillomavirus humano tipo 11
JP7290258B2 (ja) 2018-09-26 2023-06-13 厦▲門▼大学 ヒトパピローマウイルス５１型のｌ１タンパク質の変異型

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7476389B1 (en) * 1991-07-19 2009-01-13 The University Of Queensland Papillomavirus vaccines
DE122007000014I1 (de) * 1993-03-09 2007-05-24 Univ Rochester Herstellung von menschlichem Papillomavirus Hüllprotein und virus-ähnlichen Teilchen

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996030520A2 (en) 1996-10-03
SK129397A3 (en) 1998-05-06
KR19980703391A (ko) 1998-10-15
ES2203691T3 (es) 2004-04-16
EP0817852B1 (en) 2003-08-20
IL117591A0 (en) 1996-07-23
JP3918877B2 (ja) 2007-05-23
HUP9801608A3 (en) 1999-04-28
CN1154732C (zh) 2004-06-23
EA000969B1 (ru) 2000-08-28
HUP9801608A2 (hu) 1998-10-28
AU708111B2 (en) 1999-07-29
DE69629556D1 (de) 2003-09-25
PT817852E (pt) 2003-12-31
EP0817852A2 (en) 1998-01-14
NO974514L (no) 1997-11-27
US6159729A (en) 2000-12-12
ATE247712T1 (de) 2003-09-15
ZA962526B (en) 1996-09-04
DE69629556T2 (de) 2004-06-17
PL183299B1 (pl) 2002-06-28
CZ309197A3 (cs) 1998-02-18
JPH11503313A (ja) 1999-03-26
CZ291375B6 (cs) 2003-02-12
WO1996030520A3 (en) 1996-11-07
NO974514D0 (no) 1997-09-29
EA199700281A1 (ru) 1998-04-30
SK283998B6 (sk) 2004-07-07
CN1185810A (zh) 1998-06-24
NO320086B1 (no) 2005-10-24
DK0817852T3 (da) 2003-11-24
PL322588A1 (en) 1998-02-02
AU5527796A (en) 1996-10-16
NZ306663A (en) 1999-10-28
KR100441477B1 (ko) 2004-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228490B1 (en) Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein
US5840306A (en) DNA encoding human papillomavirus type 18
US5821087A (en) Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA
US5820870A (en) Recombinant human papillomavirus type 18 vaccine
AU708737B2 (en) Purified papillomavirus proteins
CA2215834C (en) Dna encoding human papillomavirus type 18
WO1996015247A9 (en) Purified papillomavirus proteins
US6908615B1 (en) DNA encoding human papilloma virus type 18
CA2216827C (en) Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein
CA2204266C (en) Purified papillomavirus proteins

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., US

Free format text: FORMER OWNER(S): MERCK & CO., INC., US; MERCK SHARP & DOHME CORP., US; SCHERING CORPORATION, US

HC9A Change of name, address

Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., US

Free format text: FORMER OWNER(S): MERCK & CO., INC., US; MERCK SHARP & DOHME CORP., US; SCHERING CORPORATION, US