EA000969B1 - Выделенная последовательность днк, вектор для экспрессии последовательности днк и способ получения вирусоподобных частиц - Google Patents

Description

Эта заявка является продолжением заявки US № 08/413572, поданной 30 марта 1995 г., в настоящее время ожидающей рассмотрения, и продолжением заявки US № 08/413571, поданной 30 марта 1995 г., в настоящее время ожидающей рассмотрения.

Область изобретения

Данное изобретение относится к выделенной последовательности ДНК, кодирующей белок L1 папилломавируса человека типа 11, и ее производным. Далее, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, предназначенным для экспрессии указанной последовательности в клетках-хозяевах. Настоящее изобретение также относится к способу получения вирусоподобных частиц папилломавируса типа 11 .

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - схематическое представление конструирования гибридного гена L1 HPV6/11 с использованием синтетических олигонуклеотидов;

фиг. 2 - нуклеотидная последовательность гибридного гена HPV6/11, опубликованные последовательности генов L1 HPV6a и HPV11;

фиг. 3 - двунаправленный экспрессирующий вектор дрожжей pGAL1 -1 0, используемый для экспрессии капсидных белков L1 папилломавируса;

фиг. 4 - Нозерн-анализ мРНК L1 HPV11 из дрожжей;

фиг. 5 показывает экспрессию белка L1 HPV11 в дрожжах при помощи Вестерн-анализа (иммуноблот);

фиг. 6 показывает реактивность в ELISA VLPL1 HPV11, экспрессируемых в HPV11 дикого типа (wt), по сравнению с гибридной ДНК HPV6/11;

фиг. 7 - электронная микрофотография VLP L1 HPV11, экспрессируемых в дрожжах;

фиг. 8 показывает нуклеотидную последовательность гибридного гена HPV6/11.

Предпосылки изобретения

Инфекции папилломавируса (PV) имеют место у множества животных, в том числе у людей, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Вирусы папилломы инфицируют эпителиальные клетки, индуцируя обычно доброкачественные эпителиальные или фиброэпителиальные опухоли в месте инфекции. PV являются видоспецифическими инфекционными агентами; папилломавирус человека не может инфицировать другое животное.

Папилломавирусы могут быть классифицированы на группы в зависимости от хозяина, которого они инфицируют. Папилломавирусы человека (HPV) подразделяются более чем на 70 типов на основе гомологии последовательности ДНК. Типы PV являются, по-видимому, типоспецифическими иммуногенами в том смысле, что нейтрализующий иммунитет к инфекции одним типом папилломавируса не создает иммунитета против другого типа папилломавируса.

Различные типы HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10 и 2629 вызывают образование доброкачественных бородавок как у здоровых людей, так и у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы HPV 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 46-50 вызывают образование плоских поражений у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы HPV 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают образование незлокачественных кондилом слизистой оболочки половых органов или дыхательных путей. Типы HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 и 58 вызывают эпителиальную дисплазию слизистой оболочки половых органов и ассоциированы in situ с большинством и инвазивных карцином шейки матки, вагины, вульвы и анального канала.

Папилломавирусы являются небольшими (50-60 нм), не имеющими оболочки, икосаэдральными ДНК-вирусами, которые кодируют до восьми ранних и двух поздних белков. Открытые рамки считывания (ORF) геномов этих вирусов обозначаются как Е1-Е8 и L1 и L2, где Е обозначает early (ранние) и L обозначает late (поздние). L1 и L2 кодируют вирусные капсидные белки. Ранние (Е) гены ассоциированы с такими функциями, как репликация вирусов и трансформация клеток.

Белок L1 является основным капсидным белком и имеет мол. массу 55-60 кДа. Белок L2 является минорным капсидным белком, который имеет предсказанную мол. массу 55-60 кДа и среднюю (кажущуюся) мол. массу 75-100 кДа, как определено при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Иммунологические данные предполагают, что большая часть белка L2 является внутренней по отношению к белку L1 ORF L1 является высококонсервативной среди различных папилломавирусов. Белки L2 являются менее консервативными среди различных папилломавирусов.

Было обнаружено, что гены L1 и L2 являются хорошими мишенями для иммунопрофилактики. Было также показано, что некоторые из ранних генов являются потенциальными мишенями разработки вакцин. Исследования в системах папилломавируса американского кролика (CRPV) и бычьего папилломавируса (BPV) показали, что иммунизации рекомбинантными белками L1 и/или L2 (продуцируемыми в бактериях или с использованием векторов на основе вируса коровьей оспы) защищали животных от вирусной инфекции. Экспрессия генов L1 вируса папилломы в бакуловирусных системах экспрессии или с использованием векторов на основе вируса коровьей оспы приводили к сборке вирусоподобных частиц (VLP), которые были использованы для индуцирования ответов в виде высокого титра вирус-нейтрализующих антител, которые коррелируют с защитой от вирусного заражения. Кроме того, гены L1 и L2 ис3 пользовали для создания вакцин для предотвращения и лечения папилломавирусных инфекций у животных.

Разработка и коммерциализация профилактических и терапевтических вакцин для инфекций и заболеваний, вызываемых PV, содержащих белок L1, белки L1+L2 или модифицированные белки L1 или L1+L2, тормозились отсутствием больших количеств очищенного вируса и очищенного белка. Поскольку PV не легко культивировать in vitro, трудно получить белки L1 и L2 размножением PV in vitro, и, соответственно, охарактеризовать PV и белки РУ. Поэтому, важно создать легко восполняемый источник неочищенных белков PV, в частности, белков L1 и L2 PV или модифицированных белков L1 и L2. Была бы также ценной разработка способов очистки больших количеств неочищенных белков папилломавируса до уровня чистоты, пригодной для иммунологических исследований и создания вакцин. Важным было бы также получение больших количеств белков папилломавируса, имеющих генерирующие иммунитет свойства нативных белков, в частности, конформацию нативного белка. Кроме того, ценной была бы разработка способов анализа белков PV и способов определения относительной чистоты этих белков, а также композиций, содержащих эти белки. Такие высокоочищенные белки были бы также важны в приготовлении множества реагентов, применимых в исследовании инфекций PV; к таким реагентам относятся (без ограничений указанными) поликлональные антитела, моноклональные антитела и аналитические стандарты.

HPV6 и 11 являются причинными агентами для ~90% доброкачественных остроконечных кондилом и они редко связаны со злокачественностью (Gissmann et al., 1983, PNAS 80, 560-563). Считается, что НРV6а является наиболее часто встречающимся подтипом HPV6 в случае остроконечных кондилом (Brown D.B., et al., J. Clin. Microbiol. 31:1667-1673). Посещение врача в связи с бородавками половых органов (остроконечными или плоскими кондиломами) в последние годы усилилось. Существуют данные, что ~10% всего населения (в возрасте от 15 до 49 лет) имеют инфекции HPV половых путей (Koutsky et al. 1988, Epidemiol. Rev., 10, 122163). В то время как большинство кондилом связано с HPV6, в случае папилломатоза гортани преобладающим типом является HPV11. Репликация HPV11 в эпителиальных клетках дыхательных путей стимулирует пролиферацию этих клеток, которая может приводить к изолированным повреждениям малого клинического значения или к многочисленным распространяющимся повреждениям и рецидивирующему заболеванию. Рецидивирующий респираторный папилломатоз, заболевание, которое чаще поражает ювенильную популяцию, может быть угрожающим для жизни заболеванием, вызывающим обструкцию дыхательных путей. Недавно была разработана модель на животных, которая обеспечивает репликацию инфекционного HPV11 (Kreider et al 1985, Nature 317, 639-640; Kreider et al. 1987, J.Virol. 61, 590-593). Модель позволяет идентифицировать конформационные нейтрализующие эпитопы на нативных вирионах и экспрессируемых бакуловирусом VLP при помощи моноклональных антител (Christensen et al. 1990, J.Virol. 64, 5678-5681; Christensen and Kreider 1991, Virus Res. 28, 195-202; Christensen et al. 1994, 75, 2271-2276).

Вирусоподобные частицы, содержащие белок L1 HPV11, были экспрессированы в системах клеток как насекомых, так и млекопитающих. Экспрессия VLP в клетках дрожжей предоставляет преимущества вследствие низкой стоимости и легкой приспособляемости для широкомасштабного выращивания в ферментерах. Однако белок L1 HPV11 экспрессируется в клетках дрожжей на низких уровнях. Было обнаружено, что это является результатом усечения мРНК L1 HPV11. В противоположность указанному ген L1 HPV6 транскрибируется в виде полноразмерной мРНК и экспрессируется до высоких уровней. Путем модификации ДНК L1 HPV6 для кодирования белка L1 HPV11 можно облегчить транскрипцию полноразмерной мРНК с получением увеличенной экспрессии белка L1 HPV11. Данное изобретение обеспечивает HPV6/11-гибридную последовательность гена L1, а также способ конструирования гибридного гена L1 HPV6/11 с использованием синтетических олигонуклеотидов. Гибридный ген был сконструирован с использованием последовательности L1 HPV6a (Hofmann K.J., et al., 1995, Virology, статья принята к опубликованию), но он содержит минимальное число замен оснований, необходимое для кодирования белка L1 HPV11. В противоположность гену L1 HPV11 дикого типа, гибридный ген HPV6/11 не содержит узнаваемых дрожжами внутренних сигналов терминации транскрипции, в результате чего продуцируется полноразмерная мРНК HPV6/11 и увеличивается экспрессия белка L1 HPV11.

Данное изобретение относится к высокоочищенному белку L1 PV. Изобретение также включает в себя способы, при помощи которых получают и очищают рекомбинантные белки, имеющие придающие иммунитет свойства нативных белков папилломавируса. Данное изобретение относится к получению профилактических и терапевтических вакцин для папилломавирусных инфекций. Электронная микроскопия и связывание с конформационными антителами (антителами против конформационнозависимой антигенной детерминанты) демонстрируют, что рекомбинантные белки данного изобретения способны образовывать вирусоподобные частицы.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к синтетической молекуле ДНК, кодирующей очищенный белок L1 папилломавируса человека типа 11, и ее производным.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к синтетической молекуле ДНК, кодирующей очищенный белок L1 папилломавируса человека типа 11, и ее производным. Различные варианты изобретения включают (но не ограничены указанными) рекомбинантные молекулы ДНК HPV, РНК, комплементарные рекомбинантным молекулам ДНК HPV, белки, кодируемые рекомбинантными молекулами ДНК, антитела к рекомбинантным молекулам ДНК и соответствующим белкам, композиции, содержащие эти ДНК, РНК, белки или антитела, способы использования этих ДНК, РНК, белков или антител, а также их производных. Такие производные включают в себя (но не ограничиваются указанными) пептиды и белки, кодируемые этой ДНК, антитела к этой ДНК или антитела к белкам, кодируемым этой ДНК, вакцины, содержащие эту ДНК, или вакцины, содержащие белки, кодируемые этой ДНК, иммунологические композиции, содержащие эту ДНК или белки, кодируемые этой ДНК, наборы, содержащие эту ДНК или РНК, произведенную из этой ДНК, или белки, кодируемые этой ДНК.

HPV6 и 11 являются причинными агентами для ~90% доброкачественных остроконечных кондилом, и они редко связаны со злокачественностью (Gissmann et al., 1983, PNAS 80, 560-563). Считается, что НРV6а является наиболее часто встречающимся подтипом HPV6 в случае остроконечных кондилом (Brown D.B., et al., J. Clin, Microbiol. 31:1667-1673). Посещение врача в связи с бородавками половых органов (остроконечными или плоскими кондиломами) в последние годы усилилось. Существуют данные, что ~10% всего населения (в возрасте от 15 до 49 лет) имеют инфекции HPV половых путей (Koutsky et al. 1988, Epidemiol. Rev., 10, 122163). В то время как большинство кондилом связано с HPV6, в случае папилломатоза гортани преобладающим типом является HPV11. Репликация HPV11 в эпителиальных клетках дыхательных путей стимулирует пролиферацию этих клеток, которая может приводить к изолированным повреждениям малого клинического значения или к многочисленным распространяющимся повреждениям и рецидивирующему заболеванию. Рецидивирующий респираторный папилломатоз, заболевание, которое чаще поражает ювенильную популяцию, может быть угрожающим для жизни заболеванием, вызывающим обструкцию дыхательных путей. Недавно была разработана модель на животных, которая обеспечивает репликацию инфекционного HPV11 (Kreider et al 1985, Nature 317, 639-640; Kreider et al. 1987, J. Virol. 61, 590-593). Модель позволяет идентифицировать конформационные нейтрализующие эпитопы на нативных вирионах и экспрессируемых бакуловирусом VLP при помощи моноклональных антител (Christensen et al. 1990, J. Virol. 64, 5678-5681; Christensen and Kreider 1991, Virus Res. 28, 195-202; Christensen et al. 1994, 75, 2271-2276).

Разработка и коммерциализация профилактических и терапевтических вакцин для инфекции и заболевания PV, содержащих белок L1, белки L1+L2 или модифицированные белки L1 или L1+L2, тормозились отсутствием больших количеств очищенного вируса и очищенного белка. Поскольку PV не легко культивировать in vitro, трудно получить белки L1 и L2 размножением PV in vitro, и, сответственно, охарактеризовать PV и белки PV. Поэтому, важно создать легко восполняемый источник неочищенных белков PV, в частности, белков L1 и L2 PV или модифицированных белков L1 и L2. Была бы также ценной разработка способов очистки больших количеств неочищенных белков папилломавируса до уровня чистоты, пригодной для иммунологических исследований и создания вакцин. Важным было бы также получение больших количеств белков папилломавируса, имеющих генерирующие иммунитет свойства нативных белков, в частности, конформацию нативного белка. Кроме того, ценной была бы разработка способов анализа белков PV и способов определения относительной чистоты этих белков, а также композиций, содержащих эти белки. Такие высокоочищенные белки были бы также важны в приготовлении множества реагентов, применимых в исследовании, инфекции PV; к таким реагентам относятся (без ограничений указанными) поликлональные антитела, моноклональные антитела и аналитические стандарты.

Вирусоподобные частицы, содержащие белок L1 HPV11, были экспрессированы в системах клеток как насекомых, так и млекопитающих. Экспрессия VLP в клетках дрожжей предоставляет преимущества вследствие низкой стоимости и легкой приспособляемости для широкомасштабного выращивания в ферментерах.

Однако белок L1 HPV11 экспрессируется в клетках дрожжей на низких уровнях. Было обнаружено, что это является результатом усечения мРНК L1 HPV11. В противоположность указанному, ген L1 HPV6 транскрибируется в виде полноразмерной мРНК и экспрессируется до высоких уровней. Путем модификации ДНК L1 HPV6 для кодирования белка L1 HPV11 можно облегчить транскрипцию полноразмерной мРНК с получением увеличенной экспрессии белка L1 HPV11. Данное изобретение обеспечивает HPV6/11-гибридную последовательность гена L1, а также способ конструирования гибридного гена L1 HPV6/11 с использованием синтетических олигонуклеотидов. Гибридный ген был сконструирован с использованием по7 следовательности L1 HPV6a, но он содержит минимальное число замен оснований, необходимое для кодирования белка L1 HPV11. В противоположность гену L1 HPV11 дикого типа, гибридный ген HPV6/11 не содержит узнаваемых дрожжами внутренних сигналов терминации транскрипции, в результате чего продуцируется полноразмерная мРНК HPV6/11 и вследствие этого увеличивается экспрессия белка L1 HPV11.

Фармацевтические композиции, содержащие ДНК или кодируемые этой ДНК белки, могут быть приготовлены в соответствии с известными способами, такими как смешивание с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и способы приготовления могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences. Для получения фармацевтически приемлемой композиции, пригодной для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество белка или VLP. Такие композиции могут содержать белки или VLP, происходящие более чем из одного типа HPV.

Терапевтические или диагностические композиции данного изобретения вводят индивидууму в количествах, достаточных для лечения или диагностики инфекций PV. Эффективное количество может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как состояние, вес, пол и возраст индивидуума. Другие факторы включают способ введения. Как правило, композиции следует вводить в дозах от ~1 мкг до ~1 мг.

Фармацевтические композиции могут предоставляться индивидууму различными способами, такими как подкожный, местный, пероральный, через слизистую оболочку, внутривенный и внутримышечный.

Вакцины данного изобретения содержат ДНК, РНК или белки, кодируемые этими ДНК, которые содержат антигенные детерминанты, необходимые для индуцирования образования нейтрализующих антител в организме хозяина. Такие вакцины являются также достаточно безопасными для введения без риска клинической инфекции, не имеют токсических побочных действий, являются стабильными и совместимы с носителями вакцин.

Вакцины можно вводить различными способами, такими как пероральный, парентеральный, подкожный, через слизистую оболочку, внутривенный или внутримышечный. Вводимая доза может меняться в зависимости от состояния, пола, веса и возраста индивидуума, способа введения и типа PV вакцины. Вакцину можно использовать в дозированных лекарственных формах, таких как капсулы, суспензии, эликсиры или жидкие растворы. Вакцина может быть приготовлена с иммунологически приемлемым носителем.

Вакцины вводят в терапевтически эффективных количествах, т.е. в количествах, достаточных для генерирования иммунологически защитной ответной реакции. Терапевтически эффективное количество может меняться в зависимости от типа PV. Вакцину можно вводить в виде одной дозы или в виде множественных доз.

Очищенные белки данного изобретения могут быть использованы для приготовления иммуногенных композиций. Такие композиции при введении в подходящего хозяина способны индуцировать иммунную ответную реакцию в организме хозяина.

Очищенные белки данного изобретения могут быть использованы для генерирования антител. Термин антитела в применении здесь включает как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также их фрагменты, такие как Fv, Fab и F(ab)2, которые способны связывать антиген или гаптен.

Белки и белковые производные данного изобретения могут быть использованы для серотипирования инфекции HPV и скрининга HPV. Очищенные белки, VLP и антитела могут быть использованы для приготовления наборов (китов), пригодных для обнаружения и серотипирования HPV. Подобный набор мог бы включать различные компартменты или компартмент, содержащий, по меньшей мере, один контейнер. Кроме того, набор может включать в себя реагенты, такие как белки L1 или L2 или VLP, полученные на основе молекул ДНК рекомбинантного HPV6/11 или молекул ДНК других рекомбинантных типов HPV, или антитела против этих белков. Набор может также содержать средства для детектирования, такие как меченый антиген или субстраты фермента или т. п.

Указанные очищенные белки применимы также в качестве иммунологических стандартов, маркеров молекулярной массы и молекулярного размера.

Известно, что имеется значительное количество избыточности в различных кодонах, кодирующих специфические аминокислоты. Таким образом, данное изобретение касается также тех последовательностей ДНК, которые содержат альтернативные кодоны, обеспечивающие возможную при некоторых обстоятельствах трансляцию идентичной аминокислоты. В отношении заявленного изобретения последовательность, имеющая один или несколько замененных кодонов, будет называться вырожденной вариацией. В объем данного изобретения включена возможность получения мутаций либо в ДНК-последовательности, либо в транслированном белке, которые по существу не изменяют конечные физические свойства экспрессируемого белка. Например, замена лейцина валином, лизина аргинином или глутамина аспара9 гином может не вызывать изменения в функциональности данного полипептида.

Известно, что последовательности ДНК, кодирующие пептид, могут быть изменены таким образом, что они будут кодировать пептид, имеющий свойства, отличающиеся от свойств природного пептида. Способы изменения последовательностей ДНК включают в себя сайтспецифический мутагенез (но не ограничиваются им).

В отношении заявленного изобретения функциональным производным гибридного гена HPV6/11 является соединение, которое обладает биологической активностью (функциональной или структурной), в основном сходной с биологической активностью HPV6/11.

Термин функциональные производные предназначен для фрагментов, вариантов, вырожденных вариантов, аналогов и гомологов или химических производных HPV6/11.

Термин аналог относится к молекуле, по существу сходной по функции либо со всей молекулой HPV6/11, либо с ее фрагментом.

Клонированная ДНК HPV6/11 или ее фрагменты, полученные описанными здесь способами, могут рекомбинантно экспрессироваться в результате молекулярного клонирования в экспрессирующем векторе, содержащим подходящий промотор и другие подходящие регуляторные элементы транскрипции, и переноситься в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева для получения рекомбинантного HPV11. Способы таких манипуляций подробно описаны Sambrook J., et al. (supra) и известны в данной области.

Экспрессирующие векторы определяются здесь как ДНК-последовательности, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы можно использовать для экспрессии эукариотических генов в многочисленных хозяевах, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, клетки растений, клетки насекомых, клетки грибов и клетки животных. Специально сконструированные векторы позволяют переносить ДНК между такими хозяевами, как бактерии-дрожжи или бактерииклетки животных, или бактерии-клетки грибов, или бактерии-клетки позвоночных животных. Правильно сконструированный экспрессирующий вектор должен содержать: начало репликации для автономной репликации в клеткаххозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное число применимых сайтов рестриктаз, потенциал для высокой копийности и активные промоторы. Промотор определяется как ДНКпоследовательность, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразы с ДНК и инициирует синтез РНК. Сильным промотором является такой промотор, который обусловливает высокую частоту инициации синтеза РНК. Экспрессирующие векторы могут быть (без ограничений указанными) клонирующими векторами, модифицированными клонирующими векторами, специально сконструированными плазмидами или вирусами.

Разнообразные экспрессирующие векторы млекопитающих можно использовать для экспрессии ДНК HPV6/11 или ее фрагментов в клетках млекопитающих. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы млекопитающих, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6/11, включают (но не ограничиваются указанными) pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPVMMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и XZD35 (ATCC 37565).

Множество бактериальных экспрессирующих векторов можно использовать для экспрессии ДНК HPV6/11 и ее фрагментов в бактериальных клетках. Коммерчески доступные бактериальные экспрессирующие векторы, которые могут быть пригодными для экспрессии ДНК рекомбинантного HPV6/11, включают (но не ограничиваются указанными) pETlla (Novagen), Xgtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Различные экспрессирующие векторы можно использовать для экспрессии HPV6/11 или его фрагментов в клетках грибов. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы грибных клеток, которые могут быть пригодными для экспрессии ДНК рекомбинантного HPV6/11, включают (но не ограничиваются указанными) pYES2 (Invitrogen), экспрессирующий вектор Pichia (Invitrogen) и экспрессирующий вектор Hansenula (Rhein Biotech, Dusseldorf, Germany).

Различные экспрессирующие векторы можно использовать для экспрессии ДНК HPV6/11 или ее фрагментов в клетках насекомых. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы для клеток насекомых, которые могут быть пригодными для экспрессии ДНК рекомбинантного HPV6/11, включают (но не огра-ничиваются указанными) pBlueBacIII (Invitrogen).

Экспрессирующий вектор, содержащий ДНК HPV6/11 или ее фрагменты, может быть использован для экспрессии белков HPV6/11 или фрагментов белков HPV6/11 в клетке, ткани, органе или организме животного (в том числе человека). Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, в том числе (но не только) бактериями, такими как E.coli, клетками грибов, такими как дрожжи, клетками млекопитающих, в том числе (но не только) клеточными линиями человека, быка, свиньи, обезьяны и грызунов, и клетками насекомых, в том числе (но не только), клеточными линиями, полученными из Drosophila и тутового шелкопряда. Пригодными клеточными линиями млекопитающих, которые являются коммерчески доступными, являются (но не ограничиваются указанными) L-клетки L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L-клетки L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) и MRC-5 (ATCC CCL 171).

Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева посредством одного из способов, таких как (но не только) трансформация, трансфекция, липофекция, слияние протопластов и электропорация. Содержащие экспрессирующий вектор клетки клонально размножают и индивидуально анализируют для определения, продуцируют ли они белок HPV11. Идентификацию экспрессирующих HPV11 клонов клеток-хозяев можно осуществлять несколькими способами, в том числе (но не только) по иммунологической реактивности с антителами против HPV11.

Экспрессия ДНК-фрагментов HPV может также осуществляться с использованием продуцируемой in vitro синтетической мРНК или нативной мРНК. Синтетическая мРНК или мРНК, выделенная из экспрессирующих гибридную ДНК HPV6/11 клеток, может эффективно транслироваться в различных бесклеточных системах, таких как (но не только) экстракты зародышей пшеницы и экстракты ретикулоцитов, а также может эффективно транслироваться в системах на основе клеток, в том числе (но не только), посредством микроинъекции в ооциты лягушки, причем этот способ является предпочтительным.

После экспрессии белка HPV11 в клеткехозяине белок HPV11 может быть извлечен для получения НР V11 в очищенном виде.

Доступны и пригодны несколько способов очистки HPV11. Как описано здесь, рекомбинантный белок HPV11 может быть очищен из клеточных лизатов и экстрактов солевым фракционированием, ионообменной хроматографией, гель-фильтрацией, адсорбционной хроматографией на гидроксилапатите и хроматографией гидрофобного взаимодействия, а также при использовании комбинаций указанных методов.

Кроме того, рекомбинантный HPV11 может быть отделен от других клеточных белков на иммуноаффинной колонке, приготовленной с моноклональными или поликлональными антителами, специфическими для полноразмерного HPV11 или полипептидных фрагментов HPV11. Моноклональные и поликлональные антитела могут быть получены в соответствии со множеством способов, известных в данной области.

Моноклональные или моноспецифические антитела определяются здесь как антитела с однородными характеристиками связывания в отношении HPV11. Однородным связыванием здесь называют способность молекул антитела связываться со специфическим антигеном или эпитопом.

Специалистам в данной области понятно, что способы получения моноспецифических антител могут быть использованы для получения антител, специфических для полипептидных фрагментов HPV или полноразмерных полипептидов HPV. В частности, специалистам в данной области понятно, что могут быть получены моноспецифические антитела, которые являются специфическими для полноразмерных функциональных белков HPV или их фрагментов.

Данное изобретение касается также способов скрининга соединений, которые модулируют экспрессию ДНК или РНК, кодирующих HPV, а также функцию (функции) белка (белков) HPV11 in vivo. Соединениями, которые модулируют эти активности, могут быть ДНК, РНК, пептиды, белки или небелковые органические молекулы. Соединения могут модулировать эти активности увеличением или аттенуированием экспрессии ДНК или РНК, кодирующих HPV11, или функции белка HPV11. Соединения, способные модулировать экспрессию ДНК или РНК, кодирующих HPV11, или функцию белка HPV11, могут быть обнаружены различными тестами. Такой тест может быть простым тестом нет/да для определения, имеется ли изменение в экспрессии или функции. Тест может быть количественным и основанным на сравнении экспрессии или функции испытуемой пробы с уровнями экспрессии или функции в стандартной пробе.

Могут быть приготовлены наборы, содержащие гибридную ДНК HPV6/11, фрагменты гибридной ДНК HPV6/11, антитела к ДНК HPV6/11 или к белку HPV11, гибридную РНК HPV6/11 или белок HPV11. Такие наборы используют для обнаружения ДНК, которая гибридизуется с ДНК HPV6/11, или для обнаружения присутствия белка или пептидных фрагментов HPV11 в пробе. Такая характеристика является ценной для многочисленных целей, в том числе (но не только), для судебных анализов и эпидемиологических исследований.

Нуклеотидные последовательности, комплементарные последовательности ДНК HPV6/11 могут быть синтезированы для терапии при помощи антисмысловых последовательностей. Такими антисмысловыми молекулами могут быть ДНК, стабильные производные ДНК, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, РНК, стабильные производные РНК, такие как 2'-О-алкилРНК, или другие антисмы13 еловые олигонуклеотидные миметики HPV6/11. Антисмысловые молекулы HPV6/11 могут быть введены в клетки микроинъекцией, инкапсулированием в липосомы или экспрессией при использовании векторов, несущих эту антисмысловую последовательность. Терапия при помощи антисмысловых молекул HPV6/11 может быть, в частности, применима для лечения заболеваний, при которых выгодно уменьшение активности HPV11.

Термин химическое производное относится к молекуле, которая содержит дополнительные химические группы, которые в норме не являются частью основной молекулы. Такие группы могут улучшать растворимость, продолжительность жизни, абсорбцию и т. д. основной молекулы. Альтернативно, эти группы могут ослаблять нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Примеры таких групп описаны во многих руководствах, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences.

Соединения, идентифицированные согласно описанным здесь способам, можно использовать отдельно в подходящих дозах, определяемых рутинным тестированием, для получения оптимального ингибирования HPV11 или его активности при минимизации любой потенциальной токсичности. Кроме того, может быть желательным совместное введение или последовательное введение других агентов.

Предпочтительно, соединения по данному изобретению могут быть введены в виде одной суточной дозы или общая суточная доза может вводиться в виде нескольких разделенных доз. Кроме того, соединения по данному изобретению могут вводиться посредством таких способов, как (без ограничений указанными) интраназальный, трансдермальный способы, при помощи суппозитория, пероральный и т. п.

Для комбинированного лечения более чем одним активным агентом, когда активные агенты находятся в раздельных дозированных готовых формах, активные агенты могут вводиться совместно или каждый может быть введен отдельно.

Схему введения соединений по данному изобретению выбирают в соответствии с различными факторами, такими как тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть состояния, которое должно быть подвергнуто лечению; способ введения; функционирование почек и печени пациента и конкретное применяемое соединение. Врач с обычной квалификацией может легко определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования данного состояния. Оптимальная точность в достижении концентраций лекарственного средства в пределах, которые дают эффективность без токсичности, требует схемы, основанной на кинетике доступности данного лекарственного средства для сайтов-мишеней. Это включает в себя рассмотрение распределения, равновесия и элиминации лекарственного средства.

Для использования в способах описанные здесь подробно соединения могут составлять активный ингредиент и их обычно вводят в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, наполнителями или носителями (называемыми здесь в общем виде материаламиносителями), выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т. е. введения в виде пероральных таблеток, капсул, эликсиров, сиропа, суппозиториев, гелей и т.п., и соответствующими обычной фармацевтической практике.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный лекарственный компонент может комбинироваться с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т. п. Кроме того, при желании или при необходимости, в эту смесь могут быть включены подходящие связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и красители. К подходящим связующим веществам (без ограничения указанными) относятся крахмал, желатина, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, сахаристые вещества из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воски и т. п. К смачивающим веществам, используемым в таких лекарственных формах, относятся (без ограничения указанными) олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т. п. Дезинтеграторы включают в себя (без ограничения указанными) крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.

Для жидких форм активный лекарственный компонент может комбинироваться с подходящими суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические и природные камеди, например, трагакант, аравийская камедь, метилцеллюлоза и т.п. Другими диспергирующими агентами, которые могут применяться, являются глицерин и т.п. Для парентерального введения желательны стерильные суспензии и растворы. В случае внутривенного введения желательно использование изотонических препаратов, которые обычно содержат подходящие консерванты.

Препараты для местного нанесения, содержащие активный лекарственный компонент, могут быть смешаны с различными материалами-носителями, хорошо известными в данной области, такими как, например, спирты, гель Aloe vera, аллантоин, глицерин, масла с витаминами А и Е, минеральное масло, PPG2 миристилпропионат и т.п., для образования, например, спиртовых растворов, очищающих средств для местного применения, очищающих кремов, кожных гелей, кожных лосьонов и шампуней в виде крема или геля.

Соединения по данному изобретению могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стериламин или фосфатидилхолины.

Соединения по данному изобретению могут также доставляться с использованием моноклональных антител в качестве индивидуальных носителей, с которыми соединены молекулы конкретного соединения. Соединения по данному изобретению могут быть также связаны с растворимыми полимерами в качестве нацеливаемых носителей лекарственного средства. К таким полимерам относятся поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксиметакриламидфенол, полигидроксиэтиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный остатками пальмитоила. Кроме того, соединения по данному изобретению могут быть соединены с классом биодеградируемых полимеров, применяемых для обеспечения контролируемого высвобождения лекарственного средства, например, с полимолочной кислотой, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полигидропиранами, полицианоакрилатами и сшитыми или амфипатическими блок-сополимерами гидрогелей.

Приведенные далее примеры иллюстрируют данное изобретение без его ограничения только этими примерами.

Пример 1. Конструирование синтетического гена L1.

Открытую рамку считывания 1,5 т.п.н. L1 HPV11 конструировали с использованием синтетических олигомеров ДНК, полученных от Midland Reagent Company. Эти олигомеры содержали 5'-концевые фосфаты. Всего потребовалось 24 олигомера, которые приведены ниже:

#241-1

5’GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCA CAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCC ACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCA GCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT 3' (SEQ ID N0:1) #2412

5’ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGT CAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCC TAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAA CACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT 3’ (SEQ ID N0:2) #241-3

5'ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCAT TAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGA TGATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAG GATAACAGG 3' (SEQ ID N0:3) #241-4

5'GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATG GTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTA CACAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC 3' (SEQ ID N0:4) #241-5

5'CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGG TTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACC AATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA 3’ (SEQ ID N0:5) #241-6

5’TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATAT GGTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGC CAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC 3'(SEQ ID N0:6) #241-7

5’GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTA AGGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGT TCACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA 3' (SEQ ID N0:7) #241-8

5'ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACA TAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGG TAGATACCACACGCAGTACCAACATGA 3’(SEQ ED N0:8) #241-9

5'CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTC TGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTA CAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT 3'(SEQ ID N0:9) #241-10

5'ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAAT CCCTCTGTTCTCGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCC AAATGGTACACTCGAGCGG 3’(SEQ ED N0:10) #241-11

5'CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATT ACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCT ATAAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTT TTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT 3' (SEQ ID N0:11) #241-12

5'GGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGAC CTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCT CTACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAG ATCTTC3' (SEQ ID N0:12) #241-13

5’GAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGC AGTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACG AGCAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTG CGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC 3' (SEQ ID N0:13) #241-14

5’ACTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATG TCCTTATAGGGATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTG ACAGGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCG AGCGG 3' (SEQ ID N0:14) #241-15

5’CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTT CCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCC ATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTGAAAAA 3’ (SEQ ID N0:15) #241-16

5'TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTT ATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCA CATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG 3’ (SEQ ID N0:16) #241-17

5'GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATA CCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATT AAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA 3’ (SEQ ID N0:17) #241-18

5’AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGA CGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACA GGTTCCCCCACGGTACCCC 3’ (SEQ ID N0:18) #241-19

5'GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGT TCCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTG CAGCCATTTGTAAATAATCTGGATATTTACATACAGTGCCACA TATGTCAA 3’ (SEQ ID NO: 19) #241-20

5’GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCA TAGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAAC ACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT 3' (SEQ ID N0:20) #241-21

5’ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGC CCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTT ATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT 3' (SEQ ID N0:21) #241-22

5’TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATT TAGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCC CGGCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT 3'(SEQ ID N0:22) #241-23

5’ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAA GAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACAC CACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAA CAGTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAAGGATGACCC 3' (SEQ ID N0:23) #241-24

5'ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTG GTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAG GGTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCA CATTTTGTTTTGTGAGATCTTC 3' (SEQ ID N0:24)

Олигомеры, образующие комплементарные пары (№ 241-1 и № 241-24, № 241-2 и № 241-23, № 241-3 и № 241-22, № 241-4 и № 24121, № 241-5 и № 241-20, № 241-6 и № 241-19, № 241-7 и № 241-18, № 241-8 и № 241-17, № 241-9 и № 241-16, № 241-10 и № 241-15, № 241-11 и № 241-14, № 241-12 и № 241-13 - фиг. 1), отжигали в отдельных пробирках, содержащих 2,5 мМ Трис, рН 7,5, 0,25 мМ ЭДТК. Пробирки нагревали до 98°С в течение 4 мин и затем помещали в 200 мл воды с температурой 98°С в стакан на 250 мл для медленного охлаждения. Когда вода охладилась до комнатной температуры, отожженные пары добавляли в пробирки, как обозначено: фрагмент А (пары олигомеров № 241-1 и 24 и -2 и 23); фрагмент В (№ 241-3- и 22, -4 и 21, -5 и 20, -6 и 19); фрагмент С (№ 241-7 и 18, -8 и 17, -9 и 16, -10 и 15) и фрагмент D (№ 241 -11 и 1 4, -1 2 и 1 3). Эти смеси пар олигомеров нагревали до 62°С в течение 2 мин и затем медленно охлаждали, как описано выше. Содержимое каждой пробирки лигировали в течение ночи при 23°С с использованием ДНКлигазы Т7 (Boehringer Mannheim, Inc.) и реагентов, поставляемых изготовителем.

После лигирования фрагмент В требовал ПЦР-амплификации для увеличения количества полноразмерного продукта. Это требовало 1 0 циклов из 94°С, 1 мин; 48°С 1 мин; 72°С 1 мин; с последующими 10 мин при 72°С в термосайклере Applied Biosystems с использованием Taq полимеразы Boehringer Mannheim и олигомерных праймеров:

5’GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG 3’ (SEQ ID N0:25) И 5' GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA 3’ (SEQ ID N0:26). Лигированные продукты и фрагмент В после ПЦР расщепляли рестриктазами (Boehringer Mannheim, Inc.) следующим образом: фрагмент А расщепляли Bgl II b Sph I; фрагмент В, Sph I и Kpn I; фрагмент С, Kpn I и Xho I; и фрагмент D, Xho I и Bgl II. Расщепленные фрагменты разделяли на агарозных гелях с низкой точкой плавления (FMS BioProducts) и фрагменты с правильным размером выделяли вырезанием полосы и расщеплением агарозы при помощи Agarase™ (Boehringer Mannheim, Inc.), как рекомендовано поставщиком. Фрагменты А, В и D извлекали осаждением этанолом и затем раздельно лигировали в вектор pSP72 (Promega, Inc.), который был подобным образом расщеплен рестриктазами для совместимости с каждым лигируемым фрагментом.

Расщепленный Kpn I и Xho I фрагмент С сначала лигировали с отожженными олигомерами

5'TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTA САС 3’; (SEQ ID N0:27) и

5'TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAG ТСТЗ' (SEQ ID N0:28).

Затем фрагмент С повторно расщепляли Xho I и фрагмент 450 п.н. Kpn I, Xho I лигировали с расщепленным Kpn I, Xho I вектором pSP72. Смеси для лигирования использовали для трансформации компетентных клеток штамма DH5 Escherichia coli (Gibco BRL, Gaithesburg, MD). Трансформанты подвергали скринингу на содержащие вставку клоны гибридизацией колоний (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Плазмидную ДНК выделяли из положительных клонов с применением набора Wizard miniprep (Promega Corp.) и затем секвенировали при помощи секвенатора ДНК Applied Biosystems 373A. Клоны, содержащие правильную последовательность ДНК для каждого из четырех фрагментов, расщепляли, как описано выше, для высвобождения этих фрагментов из вектора pSP72. Расщепленный Kpn I, Xho I фрагмент С лигировали с расщепленным Xho I, Bgl II фрагментом D и разрезанной Kpn I, Bgl II pSP72 трехстадийным лигированием. Затем продукты лигирования использовали для трансформации E.coli. Полученные трансформанты секвениро19 вали и получали клон с правильной последовательностью (обозначенный CD). Инсерт 750 п.н. Bgl II, Kpn I CD повторно расщепляли из вектора pSP72 и лигировали с расщепленным Bgl II, Sph I фрагментом А и расщепленным Sph I, Kpn I фрагментом В в трехстадийном лигировании, как описано ранее, за исключением того, что добавляли Bgl II для уменьшения нежелательных продуктов лигирования . Продукты лигирования разделяли на агарозных гелях, выделяли фрагмент 1,5 т.п.н., который был обозначен D361-1.

Пример 2. Сравнение последовательностей.

Сравнение нуклеотидных ДНКпоследовательностей L1 гибрида HPV6/11, HPV6a и HPV11 показано на фиг. 2. Имеется всего 55 нуклеотидных замен для каркасной последовательности HPV6 для превращения ее в HPV11-кодирующую рамку трансляции. Кроме того, три вставки пар оснований добавлены в № 411-413 п.н. для кодирования дополнительной аминокислоты (тирозина¹³²), обнаруживаемой в HPV11, но не в HPV6. Вместе эти изменения позволяют специфическому для типа 11 , зависимому от конформации, нейтрализующему моноклональному антителу (Chemicon 8740 Mab) связывать белок L1, экспрессируемый ДНК HPV6/11 в дрожжах. Это предполагает, что белок из гибридного гена HPV6/11 , повидимому, неотличим иммунологически от нативного L1 HPV11 .

Сравнение гибридной последовательности ДНК HPV6/11 с опубликованной последовательностью L1 HPV11, обнаруживает 194 замены пар оснований. Имеется значительное число замен относительно последовательности ДНК L1 дикого типа, любая комбинация которых или все эти изменения в целом могут быть ответственными за увеличенную экспрессию белка L1 типа 11 в дрожжах.

Пример 3. ДНК-секвенирование гена L1.

Ген L1 HPV6/11 секвенировали при помощи секвенатора ДНК № 373А Applied Biosystems на основе реакций секвенирования с красителем-терминатором (PRIZM™ Sequencing Kit), согласно рекомендациям изготовителя (ABI, Inc., Foster City, CA).

Пример 4. Конструирование дрожжевых экспрессирующих векторов L1 HPV6/11, L1 HPV11 и L1 HPV6.

Дрожжевой экспрессирующий вектор pGAL1 -1 0 конструировали выделением фрагмента 1,4 т.п.н. Sph I из плазмиды pUC18 с двунаправленным GAL-промотором, которая содержит дивергентные промоторы GAL1 -GAL1 0 Saccharomyces cerevisiae из плазмиды рВМ272 (Mark Johnston, Washington University, St. Louis, МО). Дивергентные промоторы фланкированы на каждой стороне копией терминатора транскрипции дрожжей ADI (Bennetzen J.L. and Hall B.D., 1982, J. Biol. Chem. 257:3018-3025), клонирующим сайтом BamHI, расположенным между промотором GAL1 и первой копией терминатора транскрипции ADI, и клонирующим сайтом Sma I, расположенным между промотором GAL 1 0 и второй копией терминатора транскрипции ADI. Дрожжевой челночный вектор, состоящий из pBR322, гена LEU2d дрожжей (Erhart E. and Hollehberg CP., 1983, J. Bacteriol. 156:625-635) и 2ц-плазмиды дрожжей (подарок Бенджамина Холла, University of Washington, Seattle, WA) (Broach J.R. and Volkert F.C., 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), расщепляли SphI и лигировали с фрагментом 1,4 т.п.н. SphI дивергентного промотора GAL с получением pGAL1 -1 0 (фиг. 3).

Гибридная ДНК L1 HPV6/11, кодирующая белок L1 HPV11 (проба D361-1 из примера 1), содержит нетранслируемую лидерную последовательность дрожжей (Kniskern P.J., et al., 1986, Gene 46:1 35-1 41 ) непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина L1 HPV6/11. Плазмиду pGAL1 -1 0 линеаризовали BamHI, которая разрезает ДНК между промотором GAL1 и терминатором транскрипции AD1 , и лигировали с фрагментом гена L1 HPV6/11 1,5 т.п.н. (проба D361-1). Трансформанты E.coli DH5 (Gibco BRL, Inc.) подвергали скринингу и выделяли плазмиду pGAL1-10, содержащую ген L1 HPV6/11, которая была обозначена D362-1 .

ДНК HPV11 дикого типа (wt-HPV11 ) клонировали из остроконечной кондиломы (безвозмездно представлена д-ром Darron Brown). Общую геномную ДНК человека экстрагировали и расщепляли рестриктазами. Фракцию, содержащуюДНК wt-HPV11 , лигировали в клонирующий вектор E.coli для использования в качестве матрицы для ПЦР. Ген L1 wt-HPV11 амплифицировали при помощи ПЦР с использованием полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc.), 1 0 циклов амплификации (94°С 1 мин, 48°С 1 мин, 72°С 1 мин 45 с) и следующих олигонуклеотидных праймеров, которые содержат фланкирующие сайты BGL II (подчеркнуты):

смысловой праймер:

5'-СТС AGATCT САС ААА АСА AAA TGT GGC GGC СТА GCG АСА GCA CAG-3' (SEQ ID N0:29) антисмысловой праймер:

5'-GAG AGATCTТАСТТТTTG GTTTTG GTA CGT ТТТ CG-3’ (SEQ ГО N0:30)

Смысловой праймер вводит нетранслируемую лидерную последовательность дрожжей (Kniskern P.J. et al., 1986, Gene 46:135-141) непосредственно против хода транскрипции относительно инициирующего кодона метионина L1 wt-HPV11 (выделенного жирным шрифтом).

Продукт ПЦР L1 wt-HPV11 1 ,5 т.п.н. расщепляли Bgl II, очищали на геле и лигировали с расщепленной BamHI плазмидой pGAL1 -1 0 с получением плазмиды р329-1 . Общую геномную ДНК экстрагировали из положительной по

HPV6a остроконечной кондиломы (безвозмездно представлена доктором Darron Brown). Ген L1 HPV6a амплифицировали в ПЦР с использованием ДНК-пробы биопсийного материала в качестве матрицы, полимеразы Vent (New England Biolabs, Inc.), 35 циклов амплификации (94°С 1 мин, 48°С 1 мин, 72°С 1 мин 45 с), смыслового праймера, указанного выше для ПЦР L1 wt-HPV 11, и антисмыслового праймера с последовательностью

5'-GAG AGATCT TAC СТТ ТТА GTT TTG GCG CGC ТТА С-3' (SEQ ID N0:31).

Продукт ПЦР L1 HPV6a 1,5 т.п.н. расщепляли Bgl II, очищали в геле и лигировали с расщепленной BamHI плазмидой pGAL1-10 с получением плазмиды D128.

Пример 5. Получение штамма 1558.

Стадия а: получение штамма U9 дрожжей

Штамм 2150-2-3 (М A Talpha, leu2-04, adel, cir°) Saccharomyces cerevisiae был получен от доктора Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Клетки штамма 2150-2-3 размножали в течение ночи при 30°С в 5 мл среды YEHD (Carty et al., J. Ind Micro 2(1987) 117-121). Клетки промывали 3 раза в стерильной дистиллированной воде, ресуспендировали в 2 мл стерильной дистиллированной воды и 0,1 мл клеточной суспензии высевали на каждую из шести чашек с 5-фтороротовой кислотой (FOA) для отбора на мутанты ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Чашки инкубировали при 30°С. Среда содержала на 250 мл дистиллированной воды: 3,5 г азотистого основания дрожжей Difco без аминокислот и сульфата аммония; 0,5 г 5-фтороротовой кислоты; 25 мг урацила и 1 0,0 декстрозы.

Среду стерилизовали фильтрованием через мембраны 0,2 мкм и затем смешивали с 250 мл 4% бактоагара (Difco), поддерживаемого при 50°С, 1 0 мл раствора аденина 1 ,2 мг/мл и 5 мл раствора L-лейцина (180 мг/50 мл). Полученную среду распределяли по 20 мл на чашки Петри.

После 5 дней инкубирования появились многочисленные колонии. Отдельные колонии выделяли путем повторного посева штрихом из исходных чашек с FOA на свежие чашки с FOA, которые затем инкубировали при 30°С. Ряд колоний из второй серии чашек с FOA тестировали на присутствие мутации ura3 при помощи посева методом реплик (отпечатков) как на чашки со средой YEHD, так и на урацилминус-чашки. Желательным результатом был хороший рост на YEHD и отсутствие роста на урацил-минус-среде. Был получен один изолят (U9), который обнаружил эти свойства. Его хранили в виде замороженного раствора в глицерине (штамм № 325) при -70°С для последующего использования.

Стадия b: получение вектора для разрыва гена MNN9 дрожжей

Для получения вектора для разрыва гена MNN9 необходимо было сначала клонировать ген MNN9 из геномной ДНК S. сегеvisiae. Это достигалось при помощи стандартной технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). 5'смысловой праймер и 3'-антисмысловой праймер для ПЦР полноразмерной кодирующей последовательности MNN9 конструировали на основе опубликованной последовательности для гена дрожжей MNN9 (Zymogenetics: заявка на Европейский патент № 88117834.7, публикация № 0314096-A2). Использовали следующие олигодезоксинуклеотидные праймеры, содержащие фланкирующие сайты HindIII (подчеркнуты):

смысловой праймер:

5'-СТТ AAAGCTTAT GTC ACT ТТС ТСТ TGT АТС G-3' (SEQ ID N0:32) антисмысловой праймер:

5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT СТС ТТС СТС-3'. (SEQ ID NO:33)

Инициирующий кодон метионина для гена MNN9 выделен жирными буквами. ПЦР проводили с использованием геномной ДНК из штамма JRY1 88 S. cerevisiae в качестве матрицы, ДНК-полимеразы Taq (Perkin Elmer) и 25 циклов амплификации (94°С 1 мин, 37°С 2 мин, 72°С 3 мин). Полученный ПЦР фрагмент 1 ,2 т.п.н. расщепляли HindIII, очищали в геле и лигировали с расщепленной HindIII обработанной щелочной фосфатазой плазмидой pUC1 3 (Pharmacia). Полученная плазмида была обозначена р1183.

Для разрыва гена MNN9 геном дрожжей URA3 плазмиду pBR322-URA3 (которая содержит фрагмент HindIII 1,1 т.п.н., кодирующий ген URA3 S. cerevisiae, субклонированный в сайт HindIII pBR322) расщепляли HindIII и фрагмент ДНК 1,1 т.п.н. очищали в геле, концы затупляли ДНК-полимеразой Т4 и затем лигировали этот фрагмент с расщепленной PmlI плазмидой р1183 (PmlI разрезает внутри кодирующей последовательности MNN9). Полученная плазмида р11 99 содержит разрыв гена MNN9 функциональным геном URA3.

Стадия с: конструирование U9производного штамма 1 372, содержащего разрыв гена MNN9

Для разрыва гена MNN9 в штамме U9 (№ 325) 30 мкг плазмиды р1199 расщепляли HindIII для создания линейной кассеты с разрывом mnn9::URA3. Клетки штамма 325 трансформировали расщепленной HindIII ДНК р11 99 при помощи сферопластного метода (Hinnen et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933) и трансформанты отбирали на синтетической среде с агаром без урацила, содержащей 1 ,0М сорбит. Синтетическая среда содержала на литр дистиллированной воды: агар 20 г; азотистое основание дрожжей без аминокислот 6,7 г; аденин 0,04 г; L-тирозин 0,05 г; сорбит 182 г; Глюкозу 20 г; Лейцин-минус-раствор № 2 10 мл. Лейцин-минус-раствор № 2 содержит на литр дистиллированной воды: L-аргинин 2 г; Lгистидин 1 г; L-лейцин 6 г; L-изолейцин 6 г; L23 лизин 4 г; L-метионин 1 г; L-фенилаланин 6 г; L-треонин 6 г; L-триптофан 4г.

Чашки инкубировали при 30°С в течение 5 дней, когда появились многочисленные колонии. Препараты хромосомной ДНК получали из 10 колоний и затем расщепляли EcoRI плюс HindIII. Затем расщепленный ДНК-продукт оценивали при помощи Саузерн-блоттинга (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) с использованием фрагмента HindIII 1,2 т.п.н., несущего ген MNN9 (выделенный из плазмиды р1199), в качестве зонда. Идентифицировали изолят (штамм № 1372), который обнаруживал ожидаемые смещения полос ДНК на блоте, а также усиленную агрегацию, обычно обнаруживаемую мутантами mnn9.

Стадия d: конструирование вектора для разрыва гена HIS3 дрожжей

Для конструирования кассеты с разрывом, в которой ген HIS3 S. cerevisiae разорван геном URA3, плазмиду YЕр6 (К. Struhl et al., 1979, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 76:1035) расщепляли BamHI и фрагмент BamHI 1,7 т.п.н., несущий ген HIS3, очищали в геле, концы его затупляли ДНК-полимеразой Т4 и лигировали этот фрагмент с pUC18, которую предварительно расщепляли BamHI и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4. Полученную плазмиду (обозначенную p1501 или pUC18-HIS3) расщепляли NheI (которая разрезает в кодирующей последовательности HIS3) и фрагмент вектора очищали в геле, концы затупляли ДНК-полимеразой Т4 и затем фрагмент обрабатывали щелочной фосфатазой кишечника теленка. Ген URA3 выделяли из плазмиды pBR322-URA3 расщеплением HindIII и фрагмент 1,1 т.п.н., содержащий ген URA3, очищали в геле, концы затупляли ДНКполимеразой Т4 и лигировали фрагмент с описанным выше фрагментом NheI pUC18-HIS3. Полученная плазмида (обозначенная pUC18::His3::URA3 или р1505) содержит кассету с разрывом, в которой ген дрожжей HIS3 разорван функциональным геном URA3.

Стадия е: конструирование вектора для разрыва гена PRB1 дрожжей геном HIS3

Плазмиду ГР8АН. несущую ген PRB1 S. cerevisiae, получали от доктора Е. Jones из Carnegie-Mellon Univ. (C.M. Moehle et al., 1987, Genetics, 115:255-263). Ее расщепляли HindIII плюс XhoI и фрагмент ДНК 3,2 т.п.н., содержащий ген PRB1 , очищали в геле, концы затупляли обработкой ДНК-полимеразой Т4. Плазмиду pUC1 8 расщепляли BamHI, очищали в геле и затупляли концы обработкой ДНКполимеразой Т4. Полученный векторный фрагмент лигировали с указанным выше фрагментом гена PRB1 с получением плазмиды pUC18PRB1 . Плазмиду YEp6, которая содержит ген HIS3, расщепляли BAMHI. Полученный фрагмент BamHI 1,7 т.п.н., несущий функциональный ген HIS3, очищали в геле и затем затупляли его концы при помощи ДНК-полимеразы Т4. Плазмиду pUC18-PRB1 расщепляли EcoRV плюс NcoI, которые разрезают в кодирующей последовательности PRB1 и удаляют активный сайт протеазы В и фланкирующую последовательность. Фрагмент EcoRV-NcoI5,7 т.п.н., несущий оставшиеся 5'- и 3'-части кодирующей последовательности PRB1 и pUC18, очищали в геле, концы затупляли обработкой ДНКполимеразой Т4, дефосфорилировали фрагмент щелочной фосфатазой кишечника теленка и лигировали с имеющим тупые концы фрагментом HIS3, описанным выше. Полученная плазмида (обозначенная pUO8: :HIS3, группа (штамм) № 1245)) содержит функциональный ген HIS3 вместо части гена PRB1, которая была делегирована, как описано выше.

Стадия f: конструирование родственного U9 штамма дрожжей, содержащего разрывы генов MNN9 и PRB1

Родственный U9 штамм 1372, который содержит разрыв гена MNN9, был описан в примере 5с. Клональные изоляты штамма 1372 пассировали на чашках с FOA (как описано в примере 5а) для отбора мутантов ura3. Получали ряд изолятов ura3 штамма 1372 и один конкретный изолят (штамм 12930-190-S1-1) был отобран для последующего разрыва гена HIS3. Вектор с разрывом гена pUC18::URA3 (p1505) расщепляли XbaI плюс EcoRI с образованием линейной кассеты с разрывом his3::URA3 и использовали ее для трансформации штамма 12930-190-S1-1 по методу с ацетатом лития (Methods in Enzymology, 194:290 (1991). URA+трансформанты отбирали на синтетической среде с агаром, не содержащей урацила, пересевали методом штриха для получения клональных изолятов на той же самой среде и затем высевали методом реплик на среду, не содержащую ни урацила, ни гистидина, для скрининга тех изолятов, которые были как Ura+, так и His^-. Один изолят (штамм 12930-230-1) был отобран для последующего разрыва гена PRB1. Вектор с разрывом гена PRB1 (pUC18-prbl::HIS3, группа (штамм) № 1245)) расщепляли Sad плюс XbaI для образования линейной кассеты с разрывом prbl::HIS3 и использовали ее для трансформации штамма 12930-230-1 по методу с ацетатом лития. His⁺-тpaнcфopмaнты отбирали на среде с агаром, не содержащей гистидина и пересевали штрихом на ту же самую среду для получения клональных изолятов. Геномную ДНК получали из ряда полученных His⁺-изолятов, расщепляли ее EcoRI и затем подвергали электрофорезу в 0,8% агарозных гелях. Затем проводили блоттинг по Саузерну с использованием радиоактивно меченного зонда 617 п.н. для гена PRB1, который был получен с применением следующих олигодезоксинуклеотидных праймеров:

5' TGG ТСА ТСС САА АТС TTG ААА 3' (SEQ ID N0:34); и

САС CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (SEQ ID NO:35).

Получали 11 изолятов, которые обнаруживали ожидаемую гибридизацию зонда с фрагментом ДНК 2,44 т.п.н. prbl::HIS3.

В противоположность этому, не было гибридизации указанного зонда с фрагментом 1,59 т.п.н. для гена PRB1 дикого типа. Один из этих изолятов, содержащий желаемый разрыв prbl::HIS3, был отобран для дальнейшего использования и обозначен как штамм № 1558.

Пример 6. Экспрессия L1 HPV11 и L1 HPV6 в дрожжах.

Плазмиды D362-1 (pGAL1-10+HPV6/11 L1), p329-l (pGAL1-10+wt-HPV11 L1), D128 (pGAL1 -1 0+HPV6 L1 ) и pGAL1 -1 0 использовали для трансформации штамма № 1558 S. cerevisiae (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adeI, cir°) при помощи сферопластного метода (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933). Штамм дрожжей № 1558, трансформированный плазмидой D362-1, был обозначен как штамм № 1782. Для исследований РНК клональные изоляты дрожжей выращивали при 30°С в комплексной среде YEH (Carty et al., 1978, J. Ind. Micro. 2, 117-121), содержащей 0,1М сорбит и 2% глюкозу или галактозу, в течение 26 ч. После сбора клеток РНК дрожжей экстрагировали при помощи метода с кислым фенолом, как описано ранее (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols, 1993). Для анализа белка идентичные изоляты выращивали при 30°С в комплексной среде YEH, содержащей 0,1М сорбит, 2% глюкозу и 2% галактозу, в течение 70 ч. После сбора клеток клеточные осадки разбивали стеклянными гранулами и клеточные лизаты анализировали на экспрессиию белка L1 HPV11 или L1 HPV6 иммуноблоттингом.

Пример 7. Нозерн-блоттинг РНК L1 HPV, экспрессируемых дрожжами.

Пробы, содержащие 1 0 мкг общей РНК, денатурировали обработкой глиоксалем и ДМСО (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Current Protocols, 1993) и подвергали электрофорезу в забуференном фосфатом 1,2% агарозном геле. РНК переносили на найлоновую мембрану и детектировали с ³²р-меченным олигонуклеотидом, комплементарным последовательностям ДНК L1 как HPV11, так и HPV6.

Нозерн-блот показан на фиг. 4. В пробах, росших на среде с глюкозой, не обнаружили полос, соответствующих ожидаемому размеру полноразмерной РНК L1 HPV (дорожки 1, 3 и 5). Это и ожидалось, поскольку глюкоза подавляет транскрипцию с дрожжевого промотора GAL 1 . В противоположность этому, пробы, росшие в среде с галактозой, которая индуцирует транскрипцию с промотора GAL 1 , обнаруживают сильные сигналы РНК L1 HPV. L1 HPV6 транскрибировался в виде полноразмерных РНК (дорожка 2), тогда как большая часть

L1 HPV11 дикого типа (wt) транскрибировалась в виде укороченной формы (дорожка 4). Этот результат предполагает, что сигнал терминации транскрипции дрожжей расположен в ORF L1 wt-HPV11, но не присутствует в последовательности L1 HPV6. РНК, транскрибируемая из гибридного гена HPV6/11, по-видимому, является полноразмерной (дорожка 6). В контрольной pGAL1-10-пробе дрожжей (дорожка 7) не была обнаружена HPV-специфическая РНК.

Пример 8. Вестерн-анализ экспрессируемых дрожжами белков L1 HPV.

Пробы, содержащие 20 мкг общего клеточного белка, подвергали электрофорезу в 1 0% трис-глициновых гелях (Novex, Inc.) при денатурирующих условиях и переносили электроблоттингом на нитроцеллюлозные фильтры. Белок L1 иммунодетектировали с применением кроличьей антисыворотки, полученной к слитому белку treE-HPV11 L1 в качестве первого антитела (Brown D.R. et al., 1994, Virology 201:46-54), и связанного с пероксидазой хрена (HRP) ослиного антикроличьего IgG (Amersham, Inc.) в качестве второго антитела. Фильтры обрабатывали с использованием хемилюминесцентного набора для детектирования ECL™ (Amersham, Inc.). Полосу белка L1 50-55 кДа обнаружили во всех пробах, кроме отрицательного контроля pGAL1-10 (дорожка 4) (фиг. 5). Кроме того, количество белка L1 HPV11, экспрессируемого гибридным геном HPV6/11 (дорожка 3), по-видимому, в ~10 раз выше, чем количество белка L1, экспрессируемого как геном wt-HPV11 (дорожка 2), так и геном L1 HPV6 (дорожка 1).

Пример 9. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) экспрессируемых дрожжами VLP L1 HPV11.

Для определения относительных количеств VLP, продуцируемых дрожжевыми клонами, экспрессирующими либо wt-HPV11, либо гибрид HPV6/11, использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). ELISA использовали также для демонстрации, что конформационный эпитоп, вызывающий сильные ответные реакции в виде нейтрализующих антител, сохранялся на вирусоподобных частицах (VLP), происходящих из гибридной ДНК HPV6/11. Этот конформационный эпитоп был определен с помощью моноклонального антитела Н11. В2 (Christensen et al 1990, J. Virol. 64, 5678-5681), которое доступно из Chemicon International (Temecula, CA) в виде Chemicon Mab8740. Вкратце, лунки планшетов ELISA (Maxisorb, Nunc Inc., Naperville, IL) покрывали уменьшающимися количествами общего белка дрожжей, содержащего VLP HPV6/11 (гибрида) или wt-HPV11 в 100 мкл PBS. Очищенные при помощи CsCl вирионы wt-HPV11 (подарок доктора D. Brown ) и белок дрожжей использовали в качестве контролей. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С перед отсасыванием и блокированием планшетов 250 мкл 10% сухого молока (Carnation) в TTBS (50 мМ Трис, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин 20) в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали один раз смесью PBS/0,1% Твин 20 перед инкубированием лунок с 100 мкл разведения 1:1000 моноклонального антитела Chemicon MAB 8740 против вириона HPV11 в 1% сухом молоке в TTBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза смесью PBS/Твин 20 и затем инкубировали с 1 00 мкл антимышиного IgG, связанного со щелочной фосфатазой (Kierkegard and Perry, Gaithersburg, MD) при разведении 1:1000 в 1% молоке+TTBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты опять промывали 3 раза смесью PBS/Твин 20 перед добавлением 1 00 мкл субстрата фосфатазы (п-нитрофенилфосфата в буфере с диэтаноламином). Планшеты инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 3н NaOH. Планшеты считывали при 405 нм в планшет-ридере ELISA.

Средние величины показателей OD405 из двух лунок с поправкой на показатели фона, полученные от контрольных белков дрожжей, наносили на график в зависимости от общего белка дрожжей в лунках, и эти данные показаны на фиг. 6. Клон дрожжей с гибридом HPV6/11 производил количество нативных VLP, которое было более чем в 1 0 раз выше количества нативных VLP wt-клона. Кроме того, на этих VLP был обнаружен эффективный нейтрализующий эпитоп, узнаваемый Chemicon Mab 8740.

Пример 1 0. Электронно-микроскопические исследования.

Для ЭМ-анализа (Structure Probe, West Chester, PA) аликвоту каждой пробы помещали на медные сетки с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты (РТА), рН 7,0, помещали на сетку на 20 с. Сеткам давали высохнуть на воздухе перед исследованием при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. Всю микроскопию выполняли с применением трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100CX (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 1 00 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 100000Х. Как показано на фиг. 7, VLP в диапазоне диаметров 45-55 нм наблюдали во всех пробах HPV11, но не в контрольных пробах дрожжей.

Пример 11. Ферментация L1 HPV6/11 (штамма № 1782).

Поверхностную культуру на чашках штамма 1782 асептически переносили на не содержащую лейцина среду, содержащую (на л): 8,5 г дрожжевого азотистого основания Difco без аминокислот и сульфата аммония; 0,2 г аденина, 0,2 г урацила; 10 г янтарной кислоты; 5 г сульфата аммония и 0,25 г L-тирозина; эту среду доводили до рН 5,0-5,3 NaOH перед стерилизацией. После роста в течение 25 ч при 28°С, при 250 об./мин на ротационном шейкере готовили флаконы с замороженной культурой путем добавления стерильного глицерина до конечной концентрации 17% (м/об.) перед хранением при -70°С (1 мл на криофлакон). Инокулят для ферментации штамма 1782 получали в той же самой среде (750 мл на 2-литровую колбу) и заквашивали перенесением оттаянного содержимого двух замороженных культуральных флаконов в 2-литровые колбы и инкубированием при 28°С и 250 об./мин на ротационном шейкере в течение 25 ч. Для ферментации штамма 1782 использовали ферментер Chemap 23 L с рабочим объемом 18 л после инокуляции. Используемая продукционная среда содержала (на л): 20 г дрожжевого экстракта Difco; 10 г пептона (Sheffield HySoy); 20 г глюкозы; 20 г галактозы; среду доводили до рН 5,3 перед стерилизацией. Все содержимое (500 мл) 2-литровой колбы с инокулятом переносили в ферментер, который инкубировали при 28°С, 9 л воздуха в минуту, 500 об./мин, давление 3,5 psi (24131,6 Па). Перемешивание увеличивали по необходимости для поддержания уровней растворенного кислорода более 40% от насыщения. Развитие ферментации подвергали мониторингу посредством автономных измерений глюкозы (Beckman Glucose 2 Analyzer) и неавтономной масс-спектрометрии (Perkin-Elmer 1 200). После 66 ч инкубации клеточная плотность достигала 9,32 г сухого веса клеток на л. Содержимое двух таких ферментаций (всего 17,5 л бульона) объединяли перед извлечением клеток. Эту культуру концентрировали при помощи фильтрования через полые волокна (Amicon H5MP01-43 kartridge в системе фильтрования Amicon DC-1 0) до приблизительно 2 л, диафильтровали с 2 л забуференного фосфатом солевого раствора и концентрировали далее (приблизительно до 1 л) перед разливом в 500-миллилитровые центрифужные склянки. Осадки клеток собирали центрифугированием при 8000 об./мин, (ротор Sorval GS3) в течение 20 мин при 4°С. После декантации супернатанта осадки (всего 358 г сырых клеток) хранили при -70°С до использования.

Пример 1 2. Очистка рекомбинантных капсидных белков L1 HPV типа 11.

Все стадии проводили при 4°С, если нет других указаний. Клетки хранили замороженными при -70°С. Замороженные клетки (сырой вес = 180 г) оттаивали при 20-23°С и ресуспендировали в 900 мл разрушающего буфера (50 мМ MOPS, pH 7,2, 500 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2). Ингибиторы протеаз AEBSF и Пепстатин А добавляли до конечных концентраций 1 мМ и 1,7 мкМ, соответственно. Клеточную суспензию разрушали при давлении приблизительно 1 6000 psi (110316012 Па) четырьмя циклами в микрофлюидизаторе M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, МА). К разрушенной клеточной суспензии добавляли достаточный объем 1 0% детергента Тритон Х-100¹'· (Pierce, Rockford, IL) для получения концентрации Тритона Х-100 0,5%. Суспензию перемешивали в течение 20 ч. Обработанный Тритоном X-1 00 лизат центрифугировали при 12000 х g в течение 40 мин для удаления остатков клеток. Извлекали супернатант, содержащий белок L1 .

Супернатант диафильтровали против пяти объемов 20 мМ фосфата натрия, pH 7,2, 0,5М NaCl с применением мембранной кассеты тангенциального тока 300 К (Filtron, Northborough, МА). При помощи радиоиммуноанализа и Вестерн-блоттинга было показано, что материал, удерживаемый мембраной, содержит белок L1 .

Ретентат наносили на аффинную колонку высокого разрешения (11,0 см (внут. диам.) х 5,3 см) со смолой SP Spherodex (М)^к (IBP, Villeneuve-la-Garenne, France), уравновешенную в 20 мМ фосфате натрия, pH 7,2, 0,5М NaCl. После промывания буфером для уравновешивания и стадии промывания 20 мМ фосфатом натрия, pH 7,2, 1,0М NaCl, белок L1 элюировали со ступенчатой промывкой 20 мМ фосфатом натрия, pH 7,2, 2,5М NaCl. Фракции собирали во время промываний и элюции. Фракции колонки анализировали на общий белок по методу Бредфорда. Затем фракции анализировали Вестернблоттингом и электрофорезом в ПААГ-ДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Фракции также анализировали при помощи радиоиммуноанализа.

Фракции SP Spherodex, обнаружившие сравнимые чистоту и обогащение L1 белка, объединяли.

Конечный продукт анализировали при помощи Вестерн-блоттинга и электрофореза в ПААГ-ДСН с окрашиванием коллоидным Кумасси. Было показано, что гомогенность белка L1 была >90%. Идентичность белка L1 была подтверждена Вестерн-блоттингом. Конечный продукт асептически фильтровали через мембрану 0,22 мкм и хранили при 4°С. Этот способ давал в целом 1 00 мг белка.

ЭМ-анализ выполняли при помощи Structure Probe (West Chester, PA). Аликвоту пробы помещали на медную сетку с угольной пленкой 200 меш. Каплю 2% фосфовольфрамовой кислоты, рН 7,0, помещали на эту сетку на 20 с. Сетке давали высохнуть на воздухе перед ТЭМисследованием. Всю микроскопию выполняли с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 100 СХ (JEOL USA, Inc.) при ускоряющем напряжении 1 00 кВ. Полученные микрофотографии имеют конечное увеличение 1 00000Х.

Метод Бредфорда для определения общего белка

Общий белок определяли при помощи коммерчески доступного набора Coumassie Plus^R (Pierce, Rockford, IL). Пробы разводили до подходящих уровней в Milli-Q-H2O. Для стандартных протоколов и для микротестов требовались объемы 0,1 мл и 1,0 мл, соответственно.

Для обоих протоколов для построения стандартной кривой использовали БСА (Pierce, Rockford, IL). Анализ выполняли в соответствии с рекомендациями изготовителя. Стандартные кривые строили с применением программного обеспечения CricketGraph^R на компьютере Macintosh IIci.

Электрофорез в ПААГ-ДСН и Вестерн-блоттинг

Все гели, буферы и прибор для электрофореза были получены из Novex (San Diego, CA) и электрофорез проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя. Вкратце, пробы разводили до равных концентраций белка в MilliQ-ЩО и смешивали 1:1 с буфером для инкубирования пробы, содержащим 200 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 1 5 мин при 1 00°С и наносили на предварительно залитые 1 2% трисглициновые гели. Пробы подвергали электрофорезу при 1 25 В в течение 1 ч 45 мин. Гели проявляли окрашиванием коллоидным Кумасси с применением коммерчески полученного набора (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Для Вестерн-блотов белки переносили на мембраны ПВДФ при 25 В в течение 40 мин. Мембраны промывали Milli-Q-H₂O и сушили на воздухе. Первым антителом была поликлональная кроличья антисыворотка, индуцированная слитым белком trpE-HPV11 L1 (подарок др. D. Brown). Раствор антител готовили разведением антисыворотки в буфере для блоттинга (5% обезжиренное молоко в 6,25 мМ фосфате натрия, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN₃). Инкубирование проводили, по меньшей мере, 1 ч при 20-23°С. Блот промывали в течение 1 мин в каждой из трех смен PBS (6,25 мМ фосфат натрия, рН 7,2, 150 мМ NaCl). Раствор второго антитела готовили разведением козьего антикроличьего IgG, конъюгированного со щелочной фосфатазой (Pierce, Rockford, IL) в буфере для блоттинга. Инкубирование проводили при тех же самых условиях, по меньшей мере, в течение 1 ч. Блоты промывали, как описано выше, и детектирование выполняли при помощи 1 -стадийного NBT/BCIP субстрата (Pierce, Rockford, IL).

Пример 1 3. Приготовление иммуногенных композиций.

Очищенные VLP готовили согласно известным способам, таким как смешивание с фармацевтически приемлемыми носителями, стабилизаторами или вакцинным адъювантом. Иммуногенные VLP данного изобретения могут быть приготовлены для использования в вакцине путем комбинирования с физиологически приемлемой композицией, такой как, например, PBS, солевой раствор или дистиллированная вода. Иммуногенные VLP вводят в диапазоне доз приблизительно 0,1-100 мкг, предпочтительно приблизительно 1 -20 мкг, для получения желаемого иммуногенного действия.

Количество VLP на готовую форму варьируют в зависимости от множества факторов, в том числе, но не только, в зависимости от со31 стояния, веса, возраста и пола индивидуума. Введение готовой формы VLP можно осуществлять различными способами, в том числе, но не только, пероральным, подкожным, местным, трансмукозным и внутримышечным способами введения. Такие готовые формы VLP могут состоять из одного типа VLP (т.е., VLP из HPV11) или смеси VLP (т.е. VLP из HPV6, HPV11, HPV16 и HPV18).

Необязательно может присутствовать антимикробный консервант, например тимеросал. Иммуногенные антигены по данному изобретению можно применять, если желательно, в сочетании со стабилизаторами вакцин и адъювантами вакцин. Типичные стабилизаторы представляют собой специфические соединения, например полианионы, такие как гепарин, инозитгексасульфат, сульфатированный бетациклодекстрин, менее специфические наполнители, например аминокислоты, сорбит, маннит, ксилит, глицерин, сахароза, декстроза, трегалоза, и вариации в условиях, относящихся к раствору, например нейтральный рН, высокая ионная сила (приблизительно 0,5-2,0М соли), двухвалентные катионы (Са²⁺, М^²⁺). Примерами адъювантов являются А1(ОН)₃ и А1(РО₄). Вакцину по данному изобретению можно хранить в холодильнике или в лиофилизированном виде.

Пример 1 4. Получение антител к VLP.

Для образования антител использовали очищенные вирусоподобные частицы (VLP). Термин антитела в применении здесь относится как к поликлональным, так и к моноклональным антителам, а также их фрагментам, таким как фрагменты Fv, Fab и F(ab)2, которые способны связывать антиген или гаптен. Эти антитела используют различным образом, в том числе (но не только), для очистки рекомбинантных VLP, очистки нативных белков L1 и L2 и для наборов. Наборы могут содержать компартментализованный носитель, пригодный для размещения, по меньшей мере, одного контейнера. Носитель может, кроме того, содержать реагенты, такие как антитела против VLP или VLP, пригодные для обнаружения HPV или фрагментов HPV или антител к HPV. Носитель может также содержать детектирующие средства, такие как меченый антиген или субстраты для ферментов или т.п. Эти антитела или VLP или наборы применимы для различных целей, в том числе (не ограничиваясь указанным), для анализов в судебной медицине и для эпидемиологических исследований.

Claims (4)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенная последовательность ДНК, представляющая собой гибридный ген L1 HPV6/11, кодирующий капсидный белок L1 папилломавируса человека типа 11 и не содержащий внутренних сигналов терминации транскрипции, которые распознаются в клетках дрожжей, имеющая следующую структуру:

   10 20 30 ' 40 50 60

   ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAGTATAT GTGCCTCCTC CTAACCCTGT ATCCAAAGTT 70 80 90 100 110 120

   GTTGCCACGG ATGOTATGT TAAACGCACC ААСАТАТГГТ ATCATGCCAG CAGTTCTAGA 130 140 150 160 170 180

   OTOTGCAG TGGGTCATCC ГГАГГАТТСС ATAAAAAAGG TTAACAAAAC TGTTGTGCCA 190 200 210 220 230 240

   AAGGTGTCAG GATATCAATA CAGAGTATTT AAGGTGGTGT TACCAGATCC ТААСАААТП 250 260 270 280 290 300

   GCAHGCCTG ACTCGTCTCT TTTTGATCCC ACAACACAAC GTTTGGTATG GGCATGCACA 310 320 330 340 350 360

   GGCCTAGAGG TGGGCCGGGG ACAGCCAHA GGTGTGGGTG TAAGTGGACA ТССПТАСТА 370 380 390 400 410 420

   AATAAATATG ATGATGHGA AAATTCAGGG GGTTACGGTG GTAACCCTGG ACAGGATAAC 430 440 450 460 470 480

   AGGGHAATG TAGGTATGGA TTATAAACAA ACACAATTAT GCATGGHGG ATGTGCCCCC 490 500 510 520 530 540

   CCTTTGGGCG AGCAHGGGG TAAAGGTACA CAGTGTAGTA ATACATCTGT ACAGAATGGT 550 560 570 580 590 600

   GACTGCCCGC COTAGAACT TAHACCAGT GHATACAGG ATGGCGATAT GGHGACACA 610 620 630 640 650 660

   GGCTTTGGTG CTATGAATTT TGCTGATTTG CAGACCAATA AATCAGATGT TCCTOTGAC 670 680 690 700 710 720

   ATATGTGGCA CTGTATGTAA ATATCCAGAT ТАПТАСААА TGGCTGCAGA CCCATATGGT 730 740 750 760 770 780

   GATAGATTAT ТТТТПАТСТ ACGGAAGGAA CAAATGTTTG CCAGACATTT TTTTAACAGG

   790 800 810 820 830 840

   GCTGGTACCG TGGGGGAACC TGTGCCTGAT GATCTTTTAG HAAGGGTGG TAACAATCGC

   850 860 870 880 890 900

   TCGTCTGTAG CGAGTAGTAT ATATGTTCAC ACCCCAAGCG GCTCTTTGGT GTCCTCTGAG

   910 920 930 940 950 960

   GCACAAHGT TTAATAAGCC ATAKGGCTA CAAAAAGCCC AGGGACATAA CAATGGTAH

   970 980 990 1000 1010 1020

   TGVTGGGGTA ATCATOTOT TGnACTGTG GTAGATACCA CACGCAGTAC CAACATGACA

   1030 1040 1050 1060 1070 1080

   KATGTGCAT CCGTATCTAA ATCTGCCACA ТАСАССААП CTGATTATAA AGAGTACATG

   1090 1100 1110 1120 1130 1140

   CGTCATGTGG AAGAGHTGA ТПАСААПТ ATTTTTCAAT TATGTAGCAT TACATTGTCT

   1150 1160 1170 1180 1190 1200

   GCTGAAGTAA TGGCCTATAT TCACACAATG AATCCCTCTG TTCTCGAAGA CTGGAAOTT

   1210 1220 1230 1240 1250 1260

   GGGHATCGC CTCCCCCAAA TGGTACACTC GAGGATACCT ATAGGTATGT GCAGTCACAG

   1270 1280 1290 1300 1310 1320

   GCCAHACCT GTCAAAAGCC CACTCCTGAA AAGGAAAAGC AAGATCCCTA TAAGGACATG

   1330 1340 1350 1360 1370 1380

   AGTTHTGGG AGGHAAITT AAAAGAAAAG THTCTAGTG AAHGGATCA GTHCCTHG

   1390 1400 1410 1420 1430 1440

   GGACGCAAGT THTGTTACA AAGTGGATAT AGGGGACGGA CCTCTGCTCG TACCGGTAH

   1450 1460 1470 1480 1490 1500

   AAGCGCCCTG CTGTTTCCAA ACCCTCTACT GCCCCTAAAC GTAAGCGCAC CAAAACTAAA

   1510 1520 1530 1540 1550 1560

   AAGTAA.......................................................

   или ее функциональное производное или аналог.
2. 2. Вектор для экспрессии последовательности ДНК по п.1 формулы в клетках-хозяевах, сконструированный на основе челночного дрожжевого вектора, включающего pBR322, ген дрожжей LEU2d и 2-μ плазмиду дрожжей, и содержащий SpHI-фрагмент размером 1,4 т.п.о. из плазмиды pUC1 8, в состав которого входят следующие конструктивные элементы:

   дивергентные промоторы Saccaromyces cerevisiae GAL1-GAL10 из плазмиды рВМ272, которые фланкированы с каждой стороны копией терминатора транскрипции ADHI;

   BamHI-клонирующий сайт, расположенный между промотором GAL1 и первой копией терминатора транскрипции ADHI, в который встроена указанная последовательность ДНК, и SmaI-клонирующий сайт, расположенный между промотором GAL1 0 и второй копией терминатора транскрипции ADHI.
3. 3. Вектор экспрессии по п.2, отличающийся тем, что он представляет собой вектор D3621, содержащий последовательность ДНК по п.1 формулы, встроенную в BamHI-клонирующий сайт.
4. 4. Способ получения вирусоподобных частиц папилломавируса человека типа 11, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии:

   а) трансформируют клетки дрожжей вектором экспрессии по любому из пп.2-3 формулы;

   б) культивируют трансформированные клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию последовательности ДНК, представляющей собой гибридный ген L1 HPV 6/11, кодирующий белок L1 папилломавируса человека типа 11 , и

   в) очищают и выделяют вирусоподобные частицы, которые спонтанно формируются в трансформированных клетках после экспрессии в них указанного белка.