DE69924262T2

DE69924262T2 - Verfahren zur herstellung von durch hefe exprimierte hpv typs 6 und 16 kapsid-proteinen

Info

Publication number: DE69924262T2
Application number: DE69924262T
Authority: DE
Inventors: Tornese Daniela BUONAMASSA; E. Catherine GREER; L. Cesira GALEOTTI; Giuliano Bensi; Roberto Petracca
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2019-08-14
Also published as: CA2340422A1; EP1105495B1; ATE291089T1; WO2000009699A9; DE69924262T3; CA2340422C; WO2000009699A2; WO2000009699A3; DE69924262D1; EP1105495B2; EP1105495A2

Description

Die vorliegende Anmeldung beansprucht nach 35 U.S.C. § 119(e) die Priorität der vorläufigen Anmeldung Serial No. 60/096 625, Anmeldetag 14. August 1998, wobei diese Anmeldung hier vollinhaltlich in Bezug genommen wird.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Mosaik-Virus-ähnlichen Partikeln, die Kapsidproteine des humanen Papillom-Virus (HPV), Typen 6 und 16, enthalten und befähigt sind, eine Immunantwort gegen beide HPV-Typen zu induzieren.
Hintergrund der Erfindung
Eine erfolgversprechende Strategie zur Induzierung einer Immunantwort, durch die Infektionen durch das Papillom-Virus (PV) neutralisiert werden können, ist die Verwendung von Viruskapsidproteinen als Antigene. Im Fall der genitalen menschlichen Papillom-Viren (HPVs) wurde dieser Ansatz durch das Fehlen jeglicher In-vivooder In-vitro-Quelle für ausreichende Mengen des nativen Virus verhindert. Zur Lösung dieses Problems wurden heterologe Expressionssysteme in großem Umfang verwendet, um große Mengen an Kapsidproteinen zu gewinnen und die Analyse ihrer strukturellen und immunologischen Eigenschaften zu ermöglichen. Die Expression des späten Haupt-Kapsidproteins 1 (L1) aus verschiedenen PV-Typen unter Verwendung von prokaryotischen Expressionssystemen (25), Baculovirus-Expressionssystemen (21, 23, 37, 41, 42, 46), Hefe-Expressionssystemen (14, 18, 19, 20, 29) und Säuger-Expressionssystemen (15, 16, 51) ergaben, dass dieses Protein zur Selbstmontage zu Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) in der Lage ist. Die Coexpression des späten Neben-Kapsidproteins 2 (L2) ist nicht zwingend erforderlich, um VLPs zu erzeugen, obwohl sein Vorliegen die Effizienz der Partikelbildung erhöht (15, 22, 51) und neutralisierende Anti-L2-Antikörper induziert (32). Die L1- und L2-VLPs sehen in der Elektronenmikroskopie (EM) ähnlich wie native Virionen aus. Die Verwendung verschiedener Tiermodelle zeigte, dass VLPs bei der Induzierung einer schützenden Immunantwort sehr wirksam sein können.
VLPs erfüllen viele der Kriterien, die sie zu idealen Surrogaten von nativen Virionen machen. Sie gleichen in der Ultrastrukturanalyse (16) infektiösen Partikeln, rufen Virus-neutralisierende Antikörper hervor und binden am mutmaßlichen Rezeptor auf der Oberfläche von Säugerzellen (28, 31, 33, 44, 47). In besonders bemerkenswerter Weise ergaben die mit Tiermodellen gewonnenen Ergebnisse, dass eine prophylaktische Immunisierung mit VLPs in vivo sehr wirksam sein kann. Wildkaninchen, Kälber und Hunde, die mit L1-VLPs immunisiert waren, waren gegen eine anschließende Testinfektion mit dem homologen PV geschützt (20, 23, 41), und die passive Übertragung von Immunseren rief Schutz bei naiven Tieren hervor (20, 41), was darauf hinweist, dass eine über Antikörper erfolgende Antwort eine Hauptrolle bei der Verhinderung einer Virusinfektion spielt.
Untersuchungen mit infektiösen HPV-Virionen sowie mit VLPs unterschiedlicher HPV-Typen ergaben jedoch den starken Hinweis, dass die Immunantwort überwiegend typspezifisch ist. Die Wirksamkeit von Anti-HPV-Vakzin-Kandidaten auf VLP-Basis kann ferner nicht bei Tieren ermittelt werden, da diese Viren einen hohen Grad an Speciesspezifität zeigen. Daher wurde die über Antikörper verlaufende Virusneutralisation unter Verwendung entweder von In vitro-Assays oder von Xenotransplantat-Systemen untersucht, die eine Vermehrung infektiöser Viren spezifischer HPV-Typen erlauben (1, 2, 5, 6, 24). Die erste Schlussfolgerung, die aus diesen Versuchen gezogen werden konnte, war, dass die Immunisierung mit HPV-VLPs eine neutralisierende Immunantwort hervorruft, die überwiegend typspezifisch ist (6, 7, 34, 35, 36, 48).
Eine Kreuzneutralisation zwischen HPV-6 und HPV-11 (92% Identität der Aminosäuresequenz) (8) und zwischen HPV-16 und HPV-33 (80% Identität der Aminosäuresequenz) (48) wurde berichtet. Dies kann auf das Vorliegen einer gewissen Korrelation zwischen Proteinsequenzen und strukturelle Ähnlichkeiten hinweisen, die möglicherweise für den Mechanismus der Kapsidmontage relevant sein könnten. Auf der Basis dieser Überlegungen ist allerdings das Konzept, dass HPV-6L1- und HPV-16L1-Proteine eine Comontage zeigen können, nicht naheliegend, da diese beiden Viren zu phylogenetisch weiter auseinander liegenden Gruppen gehören (3, 45) und eine geringere Identität (67%) der L1-Aminosäuresequenz zeigen.
Darüber hinaus scheint, während Hüllproteine von zu sehr unterschiedlichen Familien gehörenden Viren in die gleiche Hülle eingebracht werden können (50), die Kombination von Nucleocapsidproteinen erheblich stärker beschränkt zu sein. Gemischte Corepartikel von Moloney-Murine-Leukämie-Virus (MuLV) und humanem Immundefizienz-Virus (HIV) wurden erhalten, jedoch nur, wenn künstliche chimäre Gag-Vorläufer, die sowohl HIV- als auch MuLV-Determinanten enthalten, mit Wildtyp-MuLV-Gag-Proteinen coexprimiert werden (10). Durch Verwendung eines Hefe-Zweihybrid-Systems auf der Basis von GAL4-Gag-Fusionsprotein-Expressionsplasmiden konnten Franke et al. zeigen, dass die Fähigkeit von zwei heterologen Gag-Proteinen zur Multimerisierung mit dem genetischen Verwandtschaftsgrad zwischen ihnen korreliert war (13).
Eine gemischte Kapsidbildung zwischen Wildtyp-Gag-Proteinen wurde bisher nicht berichtet. Im Fall des Core (C)-Proteins des Hepadnavirus zeigten Chang et al. (4), dass sich ein Epitop-markiertes trunkiertes Hepatitis B-Virus (HBV)-C-Polypeptid in Xenopus-Oocyten mit C-Proteinen von Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus (Woodchuck Hepatitis Virus, WHV) und Erdhörnchen-Hepatitis-Virus (Ground Squirrel Hepatitis Virus, GSHV) vereinigen konnte, jedoch nicht mit dem C-Protein von Enten-Hepatitis B-Virus (DHBV). Dieses Ergebnis war nicht unerwartet, da die beiden Coreproteinsequenzen signifikant verschieden waren und keine immunologische Kreuzreaktivität zeigen. Wenn eine Vereinigung von C-Polypeptiden von HBV, WHV und GSHV eintrat, resultierte die Bildung gemischter Kapside aus der Aggregation unterschiedlicher Species von Homodimeren (4).
Es wurden synthetische HPV 16-VLPs beschrieben, bei denen in bestimmten Bereichen Mutationen eingeführt worden waren, so dass HPV 11-spezifische Antikörper binden (53). Ferner wurden auch Flock House-Virus-Partikel beschrieben, bei denen heterologe Aminosäuresequenzen, die zum Beispiel Epitope aufweisen, in das Kapsidprotein eingeführt worden waren (54).
In einigen Berichten wurde die Bedeutung von Disulfidbindungen für die Integrität von nativen Rinder-Papillomvirus Typ 1 (Bovine Papillomavirus, BPV-1)-Virionen (26) und VLP-Strukturen (25, 38, 39) beschrieben. Von Li et al. (26) wurde ferner gezeigt, dass die Cystein 424-Mutante (C424) von HPV-11L1 in der carboxyterminalen Domäne, die als für die Kapsidbildung kritisch identifiziert worden war (25), noch befähigt ist, Kapsomere zu bilden, nicht jedoch VLPs, was darauf hindeutet, dass dieser Rest an einer Interpentamer-Bindung beteiligt sein kann. Die essentielle Rolle von Disulfidbindungen wurde durch eine Single-Point-Mutation von C 176 oder C427 in HPV-33L1 (C428 in HPV-18L1) bestätigt, die sämtliche VLP-Trimeren in Monomere umwandelt und so die Kapsomerbildung ermöglicht, nicht jedoch die Vereinigung zum VLP (39).
Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass unter Verwendung eines In-vitro-Infektionssystems und eines empfindlichen Assays auf der Basis einer Reverse-Transcriptase-PCR (RT-PCR) Antiseren gegen HPV-6-VLPs nicht befähigt sind, authentische HPV-16-Virionen zu neutralisieren (48). Da Cysteinreste, die den oben als bei der Disulfidbindung beteiligt beschriebenen Disulfidresten entsprechen, in den HPV-6L1- und HPV-16L1-Proteinen konserviert sind, wurde von uns die Hypothese aufgestellt, dass Mosaik-VLPs entweder aus einer intrakapsomeren oder interkapsomeren Assoziierung der beiden Proteine und/oder aus der Wechselwirkung zwischen typspezifischen Subsets von Kapsomeren resultieren könnten.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von mosaikartigen Virus-ähnlichen Partikeln, welche die Kapsidproteine der HPV-Typen 6 und 16 enthalten. Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt sind die Kapsidproteine die Proteine L1 und L2 der HPV-Typen 6 und 16.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen zur Expression der Kapsidproteine von mindestens zwei HPV-Typen. Gemäß einem bevorzugten Aspekt stammen die Kapsidproteine von den HPV-Typen 6 und 16. Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt sind die Kapsidproteine die Proteine L1 und L2 von HPV-Typ 6 und HPV-Typ 16. Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen diploiden Hefestamm, der die Kapsidproteine L1 und L2 von HPV-6 und HPV-16 als Mosaik-VLPs coexprimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von VLPs, welche die Kapsidproteine der HPV-Typen 6 und 16 enthalten, zur Induzierung einer Immunantwort. Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt enthalten die Mosaik-VLPs die Kapsidproteine L1 und L2 der HPV-Typen 6 und 16.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein immunogenes Virus-ähnliches Partikel, das Kapsidproteine von unterschiedlichen HPV-Typen enthält, am meisten bevorzugt der HPV-Typen 6 und 16. Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt enthalten die Mosaik-VLPs die Kapsidproteine L1 und L2 von HPV Typ 6 und HPV Typ 16.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus des pBS-6L1-Plasmids.
2 zeigt die rekombinante PCR, die beim Aufbau des pBS-6L1-Plasmids durchgeführt wurde.
3 zeigt eine Western Blot-Analyse von Zellextrakten von Hefestämmen, die HPV-6- und HPV-16-Kapsidproteine exprimieren. Äquivalente Mengen der Gesamtzellextrakte aus dem parentalen Stamm JSC310 (Bahnen 1) und verschiedenen rekombinanten Stämmen (Bahnen 2 und 3) wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, durch Elektrotransfer auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit den typspezifischen H6.C6 (a)- oder H16.H5 (c)-Anti-L1-Mabs und mit HPV-6L2 (b)- oder HPV-16L2 (d)-Antiseren inkubiert.
Bahnen 2a und 2c: JSC310-6L1epi; Bahnen 3a und 3c: JSC310-16L1epi; Bahnen 2b und 2d: JSC310-6L2epi; Bahnen 3b und 3d: JSC310-16L2epi. Die Molekülmassenstandards (in kDa) sind angegeben. Diese aus mehreren Feldern bestehende Figur sowie die folgenden Figuren wurden unter Verwendung der Programme Photoshop 4.0 und FreeHand 7.0 für Macintosh zusammengestellt.
4 ist eine schematische Darstellung der in Hefe vorkommenden integrativen Plasmide und Vektoren YIpAde (a) und YIpLys-L2 (b). Die durchgezogenen Linien stellen die pUC-Vektorsequenzen dar. Der mit ade2 markierte Kasten in (a) stellt die Adenin-2-Gensequenz dar. Die mit lys2 markierten Kästen in (b) stellen Lysin-2-Genfragmente dar; der mit L2 markierte Kasten bedeutet das L2-Gen, die übrigen Kästen bedeuten den ADH2/GAP-Hybridpromotor und die MFα-Terminationssequenz der Gentranscription. Der Pfeil in dem Kasten L2 zeigt die 5'-3'-Orientierung der kodierenden Sequenz an. Die relevanten Restriktionsstellen sind angegeben.
5 stellt eine Western Blot-Analyse von Zellextrakten von rekombinanten haploiden und diploiden Hefestämmen dar. Die Gesamtzellextrakte wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, durch Elektrotransfer auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit Anti-HPV-6L1(a)- und Anti-HPV-16L1 (c)-Mabs sowie mit HPV-6L2(b)und HPV-16L2 (d)-Antiseren inkubiert. Bahnen 1: AB 110-6L1/16L2; Bahnen 2: JSC310-16L1/6L2; Bahnen 3: AB/JS-4L; Bahnen 4: JSC310-6L2epi; Bahnen 5: JSC310-16L2epi. Die Pfeile in (b) und (d) bezeichnen die Banden, die den L2-Proteinen entsprechen. Die Molekülmassenstandards (in kDa) sind angegeben.
6 zeigt eine Analyse der Fraktionen aus der CsCl-Gradientensedimentation eines AB/JS-4L-Zellextrakts. (A) Aliquote der Fraktionen 1 bis 9 wurden auf Nitrocellulosefilter geblottet, wobei entweder (a und c) denaturierende und reduzierende (D) oder (b und d) nichtdenaturierende und nichtreduzierende (N) Bedingungen angewandt wurden. Die Filter wurden mit den typspezifischen Anti-L1-H6.C6 (a)- und Anti-L1-H16.H5 (c)-Mabs sowie mit den konformationsabhängigen typspezifischen Anti-L1-H6.B10.5 (b)- und Anti-L1-H16.V5 (d)-Mabs inkubiert. Als Kontrolle wurden die konformationellen Anti-HPV-6-L1- und Anti-HPV-16-L1-Mabs mit CsCl-gereinigten VLPs (e), die unter denaturierenden oder unter nichtdenaturierenden Bedingungen geblottet worden waren, inkubiert. Die Pfeile in A bezeichnen die Fraktion No. 5. (B) Aliquote der Fraktion No. 5 wurden der SDS-PAGE unterzogen, auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet und mit HPV-6L2-Antiserum (Bahn 3a) oder HPV-16L2-Antiserum (Bahn 3b) inkubiert. Als Kontrolle wurden Gesamtzellextrakte der Stämme JSC310-6L2epi (Bahnen 1) und JSC310-16L2epi (Bahnen 2) verwendet. Die Molekülmassenstandards (in kDa) sind angegeben. Die Pfeile bezeichnen Banden, die den L2-Proteinen entsprechen.
7 zeigt eine elektronenmikroskopische (EM) Analyse von CsCl-gereinigten VLPs. Die VLPs HPV-6 (a), HPV-16 (b) und HPV- 6/ 16 wurden auf Formvar-Kohlenstoff-beschichteten Netzchen adsorbiert, mit 4% Uranylacetat gefärbt und mit einem Elektronenmikroskop Zeiss EM10C bei einer Vergrößerung von 100 000 untersucht (Strich = 100 nm).
8 zeigt eine Western Blot-Analyse von immunpräzipitierten VLPs. CsCl-gereinigte VLPs des diploiden Stamms AB/JS-4L wurden mit dem konformationsabhängigen Anti-HPV-6L1-H6.B10.5-Mab immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Proteine wurden unter Verwendung eines 15 Zentimeter (cm) langen 10% Polyacrylamid-SDS-Gels getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran elektrogeblottet und mit dem spezifischen Anti-HPV-6L1-H6.C6-Mab (a) oder mit dem spezifischen Anti-HPV-16L1-H16.H5-Mab (b) inkubiert. Kontrollreaktionen unter Verwendung von entweder lediglich den VLPs oder lediglich des konformationellen Mabs wurden angesetzt und unter identischen Versuchsbedingungen durchgeführt. Bahn 1: VLPs, die über Nacht ohne den Mab inkubiert wurden; Bahn 2: über Nacht inkubierter Mab; Bahn 3: VLPs, die über Nacht mit dem konformationellen H6.B10.5-Mab inkubiert wurden; Bahn 4: Gesamtzellextrakt aus dem Stamm JSC310-6L1epi; Bahn 5: Gesamtzellextrakt des Stamms JSC310-16L1epi. Die Pfeile bezeichnen eine konformationelle, Mab-bezogene Bande (A), die L1-Banden (B) und eine Bande von Protein A-Sepharose (C).
9 zeigt eine Charakterisierung von Seren, die von Mäusen stammten, die mit HPV-6, HPV-16. und Mosaik-VLPs immunisiert worden waren. (A) Vergleichbare Mengen von HPV-6-VLPs (Bahnen 1), HPV-I6-VLPs (Bahnen 2) und von Mosaik-VLPs (Bahnen 3) wurden an SDS-PAGE getrennt und mit Antiseren von Mäusen immungeblottet, die mit HPV-6-VLPs (a), HPV-16-VLPs (b) und Mosaik-VLPs (c) immunisiert worden waren. (B) Vergleichbare Mengen von HPV-6-und HPV- I6-VLPs wurden unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen (D) und unter nichtdenaturierenden und nichtreduzierenden Bedingungen (N) Dot-geblottet und mit dem S16-Antiserum einer Maus inkubiert, die mit Mosaik-VLPs immunisiert worden war.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zum Testen der Möglichkeit der Induzierung von Antikörpern gegen multiple HPV-Typen wurde ein rekombinanter diploider Hefestamm erzeugt, der die Gene L1 und L2 von HPV-6 und HPV-16 coexprimiert. Die HPV-6/ 16-Mosaik-VLPs wurden aus dem Zelllysat gereinigt und als Antigene zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Die nachstehend angeführten Daten bestätigen die Bildung von Mosaik-VLPs, die alle vier Proteine enthalten. Der Immunpräzipitationsversuch ist ein starker Hinweis darauf, dass die CsCl-gereinigten VLPs das Ergebnis einer reziproken Wechselwirkung der beiden L1-Proteine darstellen und nicht einfach unterschiedliche VLP-Typen koexistieren. Die Tatsache, dass die L2-Proteine in den gleichen CsCl-Fraktionen vorliegen, stützt die Hypothese, dass sie ebenfalls in die VLPs eingeführt wurden, da das L2-Protein allein in einem CsCl-Gradienten bei der gleichen Dichte wie der der L1-VLPs keine Bande bildet (22). Ferner wurden Antiseren erhalten, die befähigt sind, Konformationsepitope der beiden L1-Proteine zu erkennen. Obgleich noch zu bestätigen ist, dass die Immunantwort, die durch HPV-6/16-VLPs hervorgerufen wird, die beiden Viren zu neutralisieren vermag, stützen die vorliegenden Daten die Verwendung von Mosaik-VLPs zur Immunisierung gegen ein breiteres Spektrum von Virustypen.
Ein Hefe-Expressionssystem, wie es hier angegeben wurde, ist bevorzugt. Verschiedene Labors hatten festgestellt, dass ein Expressionssystem von Saccharomyces cerevisiae erfolgreich zur leichten Reinigung von PV-VLPs verwendet werden kann (14, 18), die zur Induzierung einer schützenden Immunantwort in Tiermodellen hochwirksam sind (20).Hefe-exprimierte VLPs sind befähigt, eine spezifische Immunantwort nicht nur auf systemischem Niveau, sondern auch auf Schleimhautniveau hervorzurufen. Lowe et al. berichteten die Erzeugung von neutralisierenden IgG-Antikörpern in den Seren und Genitalsekreten von afrikanischen Meerkatzen, die intramuskulär mit HPV-1 1-VLPs, die auf Aluminium-Adjuvans adsorbiert worden waren, immunisiert worden waren (27). Greer et al. stellten die Induzierung von spezifischen Anti-L1-IgG- und Anti-L1-IgA-Antikörpern in den Seren und Genitalsekreten von Mäusen fest, die intranasal mit HPV-6-VLPs immunisiert worden waren, die entweder mit hitzelabilem E.coli-Enterotoxin (LT) oder mit einer von LT abgeleiteten nichttoxischen Mutante als Adjuvans versehen worden waren (14). Die Hefe-Expression ergibt ferner das Potential zur Gewinnung von Tausenden von Litern unter relativ niedrigen Kosten; außerdem sind zahlreiche von Hefen abgeleitete Produkte zur menschlichen Verwendung aufgrund ihrer Sicherheit bereits auf dem Markt zugelassen.
Zur Expression des L1-Gens und des L2-Gens von HPV-6 und HPV-16 in der gleichen Hefezelle erzeugten wir einen diploiden Stamm von S. cerevisiae durch Paarung zweier haploider Stämme, die jeweils zwei der vier Kapsidproteine exprimieren. Zur Erzielung einer Expression der heterologen Gene unter identischen Kulturbedingungen wurde jedes in die gleiche Expressionskassette auf der Basis des Glucose-repressiven Hybridpromotors ADH2/GAP und der T_MFα-Transcriptionsterminationssequenz kloniert. Die L1-Proteine von HPV-6 und HPV-16 wurden mit Hilfe des episomalen Expressionsvektors pBS24.1 exprimiert. Andererseits wurde die Expression der L2-Proteine von HPV-6 und HPV-16 durch Klonieren der Expressionskassette in ein integratives Plasmid erzielt, das sich zur Insertion in den lys2-Locus des Genoms des haploiden Stamms eignet (4b). Als Konsequenz dieser Klonierungsstrategie waren die Kopienzahlen des L1-Gens und des L2-Gens in den haploiden Stämmen verschieden, was zu höheren Expressionsniveaus der L1-Proteine führte. Dies sollte dem Verhältnis von L1 zu L2 entsprechen, das bei nativen HPV-Virionen beobachtet wird und das als im Bereich von 5:1 bis 30:1 liegend geschätzt worden war (25). In Tabelle 1 sind die verwendeten parentalen Hefestämme, die beiden erhaltenen rekombinanten haploiden Stämme und der aus der Paarung resultierende diploide Stamm aufgeführt.
TABELLE 1. Liste der parentalen und rekombinanten Hefestämme mit Genotypen und exprimierten HPV-Genen
Der hier verwendete Ausdruck "Mosaik-VLP" bezieht sich auf ein VLP, das Kapsidproteine von mehr als einem Virustyp enthält. VLPs, die aus einer intrakapsomeren und/oder interkapsomeren Assoziierung der Proteine resultieren, sind darin eingeschlossen.
Der hier in Bezug auf Viren verwendete Ausdruck "Typ" schließt Viren (tierische und pflanzliche) innerhalb der gleichen Familie, der gleichen Gruppe oder des gleichen Genus sowie Viren in unterschiedlichen Familien, Gruppen oder Genera ein.
Der hier in Bezug auf Vektoren verwendete Ausdruck "nichtintegrativ" bringt zum Ausdruck, dass der Vektor nicht in die Wirts-DNA integriert wird.
Hefestämme. Die verwendeten haploiden Stämme von Saccharomyces cerevisiae waren JSC310 (MATa, leu2-3, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, prc1-407, adr1::DM15, cir°) (17) und AB110 (MATα, leu2-3-112, ura3-52, pep4-3, his4-580, cir° (43), geliefert von Vicky Hines (Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA).
Monoklonale und polyklonale Antikörper. Die monoklonalen Antikörper (Mabs) H6.C6 und H16.H5, die an den L1-Proteinen von HPV-6 bzw. HPV-16 binden, sowie die Mabs H6.B10.5 und H16.V5, die für intakte HPV-6- und HPV-16-VLPs spezifisch sind, wurden von Christensen et al. angegeben (8, 9). Zur Western Blot-Analyse wurden diese Mabs in einer Verdünnung von 1:3000 und unter Inkubation über Nacht bei 4 °C eingesetzt. Kaninchen-HPV-16L2-Antiserum war ein Geschenk von Lutz Gissmann (DKFZ, Heidelberg, Deutschland); die Kaninchen-HPV-6L2-Antiseren wurden freundlicherweise von Denise Galloway (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington) und Robert C. Rose (University of Rochester, NY) zur Verfügung gestellt. Alle Antiseren wurden in einer Verdünnung von 1:3000-5000 unter Inkubation über Nacht bei 4 °C verwendet. Peroxidase-konjugierte Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper stammten von Biosource International (Camarillo, CA) und wurden in einer Verdünnung von 1:5000 1,5 h bei Raumtemperatur eingesetzt.
Beispiel 1
HPV-typspezifischer Nachweis von in Hefe exprimierten Kapsidproteinen.
Es wurde ein einziger Hefestamm hergestellt, der die vier Kapsidproteine L1 und L2 von HPV-6 und von HPV-16 exprimieren konnte. Ein notwendiges Werkzeug zur Erreichung dieses Ziels war die Verfügbarkeit von Antikörpern, die spezifisch oder bevorzugt mit dem L1-Protein oder dem L2-Protein lediglich eines HPV-Typs reagierten. Das L1-Gen und das L2-Gen von HPV-6 und von HPV-16 wurden in dem episomalen Vektor pBS24.1 kloniert (vergleiche das untenstehende Beispiel 2) und in dem S. cerevisiae-Stamm JSC310 exprimiert, um die Typspezifizität der erhältlichen Antikörper zu testen. 3 zeigt die Ergebnisse einer Western Blot-Analyse von Gesamtzellextrakten, die von den rekombinanten Stämmen hergestellt worden waren, mit spezifischen Anti-HPV-6-L1-Mabs (a) oder Anti-HPV-16-L1-Mabs (c) und mit HPV-6-L2-Antiseren (b) oder HPV-16-L2-Antiseren (d) inkubiert worden waren. In allen Fällen wurden HPV-typspezifische Banden ermittelt, obgleich eine schwache Kreuzreaktivität bei beiden L2-Antiseren erkennbar war. Während die Anti-HPV-6-L1-Mabs und die Anti-HPV-16-L1-Mabs Proteine mit dem erwarteten Molekulargewicht von etwa 55 Kilodalton (kDa) identifizierten, zeigten die L2-Proteine, wie früher berichtet worden war (11, 12), eine elektrophoretische Mobilität, die etwa 72 bis 75 kDa entspricht, anstelle des Molekulargewichts von 55 kDa, das auf der Basis ihrer Aminosäuresequenzen vorausgesagt worden waren.
Beispiel 2
Konstruktion von rekombinanten Plasmiden
DNA-Fragmente, welche die HPV-Proteine kodieren, wurden aus verfügbaren rekombinanten Plasmiden entweder durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder durch PCR-Amplifizierung (Expand High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim) hergestellt; sie wurden unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers von Applied Biosystem (Norvalk, CELLTECH, USA), Model 373, sequenziert.
Der episomale Hefe-Expressionsfaktor pBS24.1, ein Hefe-"Shuttle"-Vektor (17 und Philip J. Barr, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA), der die selektierbaren Gene Leucin 2 (Leu2) und Uracil 3 (Ura3) enthielt, wurde verwendet. In diesem Fall wurde er durch Verdau eines verfügbaren Plasmids pBS24.1αt6E7 mit Bam HI und Sal I hergestellt. Das Plasmid pBS24.1αt6E7 wurde zur Hefe-Expression des Antigens HPV-6E7 in einer sezernierten Form hergestellt.
Das pBS-6L1-Plasmid, welches das HPV-6-L1-Protein unter der Kontrolle des Glucose-repressiven Alkoholdehydrogenase-2-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (ADH2/GAP)-Promotors (J. Shuster, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA) und der Transcriptionsterminationssequenz des Gens des Alpha-Faktors vom Paarungstyp (T_MFα) exprimiert, wurde aus dem pBS24.1-Plasmid wie folgt abgeleitet.
Das Plasmid pBS-6L1 ist ein Hefe-Expressionsvektor, der das HPV-6L1-Gen enthält, das unter der Kontrolle des ADH2/GAP-Promotors in die Bam HI- und Sal I-Stellen des Vektors pBS24.1 kloniert wurde. Der Vektor pBS24.1 enthält den Alpha-Faktor-Terminator; daher wird eine "Expressionskassette" für HPV-6L1 erhalten. Die "Expressionskassette" für HPV-6L1 besteht aus den folgenden fusionierten Sequenzen (von 5' zu 3'): ADH2/GAP-Hybridpromotor, HPV-6L1-Gen und Alpha-Faktor-Terminator. Am Ende der Klonierungsprozeduren wurde die obige "Expressionskassette" im pBS24.1 (17) erhalten. Der Vektor pBS24.1 kann sowohl in Escherichia coli als auch in Saccharomyces cerevisiae repliziert werden, da er pBR322-Sequenzen ( einschließlich des Replikationsursprungs und des Ampicillinresistenz-Gens) und die kompletten 2μ-Sequenzen (einschließlich des Replikationsursprungs) enthält. Es enthält ferner das Hefe-URA3-Gen und das Hefe-LEU2-Gen.
Eine Zusammenfassung der Konstruktion des Plasmids pBS24.1-A/G-6L1 ist in 1 schematisch dargestellt. Aufgrund des Fehlens geeigneter Restriktionsstellen wurde die Fusionierung zwischen dem Glucose-repressiven ADH2/GAP-Promotor und dem L1-ORF durch rekombinante PCR erzielt. Das 1-563 bp-Segment des Hybridpromotors (Länge 1113 bp) ist von dem Plasmid GAGαt6E7 abgeleitet, während das 564-1113 bp-Segment aus der PCR-Amplifizierung des Gga-Plasmids abgeleitet ist (siehe unten). Das 1-115 bp-Segment der L1-Sequenz (Länge 1503 bp) ist von der PCR-Amplifizierung des Plasmids pAcC13-6L1 abgeleitet (Greer et al., J. Clin. Microbiology, (1995), 2058-2063, und Munemitsu et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 5977-5982), während das 116-1503 bp-Segment direkt vom Plasmid pAcC13-6L1 abgeleitet ist. Die DNA-Sequenz von HPV-6 ist in Schwarz et al., EMBO J., 2 (1983), 2341-2348, angegeben.
Das Plasmid GAGαt6E7 ist ein Derivat des Vektors pGEM-3z (Promega), in dem die folgende Sequenz konstruiert wurde (von 5' nach 3'): ADH2 / GAP-Promotor, eine vom Alpha-Faktor abgeleitete Leader-Sequenz und die HPV-6E7 kodierende Sequenz. Das Plasmid GAGαt6E7 wurde mit Bc1 I und Xba I gespalten. Die von DH5α abgeleitete Plasmid-DNA konnte mit Bcl I nicht geschnitten werden, da die DH5α-Zellen dam+ sind; das Enzym Bcl I wird durch überlappende dam-Methylierung inhibiert; zur Herstellung einer durch Bcl I spaltbaren DNA wurde das Plasmid in die dam-JM110-Zellen von E. coli transformiert (Stratagene). Das von JM110 abgeleitete Plasmid wurde mit Bcl I und Xba I gespalten; das Fragment, das den Vektor und die 5'-Hälfte des ADH2 / GAP-Promotors enthielt, wurde einer Geleinigung unterzogen und zur weiteren Ligasierung beiseitegestellt.
Das Plasmid pAcCl3-6L1 wurde mit Xba I gespalten; das Insert wurde der Gelreinigung unterzogen und zur Ligasierung beiseitegestellt. Das Xba I-Insert bestand in der L1-Sequenz von by 115 bis zum Ende der Sequenz, einschließlich des Stoppcodons.
Die rekombinante PCR ist schematisch in 2 dargestellt. Die Sequenzen der Primer sind nachstehend aufgeführt.
RP5 5'-ACTGATAGTTTGATCAAAGGGGCAAAACGTAGGGGC-3' SEQ ID NO:1
RP6 5'-GTCGCTAGGCCGCCACATGGTGTTTGTTTATGTGTG-3' SEQ ID NO:2
RP7 5'-AAACACACATAAACAAACACCATGTGGCGGCCTAGC-3' SEQ ID NO:3
RP8 5'-GCAGTCACCACCCTGTACAGGTGTATTAGTACACTG-3' SEQ ID NO:4
Eine erste PCR wurde unter Verwendung der Primer RP5 und RP6 und der Gga-Plasmid-DNA als Matrize durchgeführt. Das Plasmid Gga ist ein Derivat des Plasmids pGEM-3z, das im Kontext der vorstehenden Prozeduren für die HPV-6E7-Klonierung in Hefe erhalten wurde und den ADH2 / GAP-Promotor enthält. Zielsetzung dieser ersten PCR war es, den 563-1113 bp-Abschnitt (3'-Hälfte) des ADH2 / GAP-Promotors zu erzeugen. Der Primer RP5 überlappte eine Bcl I-Stelle. Eine zweite PCR wurde unter Verwendung der Primer RP7 und RP8 und des Plasmids pAcC6L1 (Greer et al., 1995) als Matrize durchgeführt. Zielsetzung dieser zweiten PCR war es, das 5'-Ende der L1-Sequenz vom Initiierungscodon bis zu by 543 zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment enthielt eine Xba I-Stelle in Position 115. Die Primer RP6 und RP7 waren so ausgelegt, dass das 3'-Ende des Produkts der ersten PCR mit dem 5'-Ende des Produkts der zweiten PCR verbunden wurde. Durch Mischen des ersten und des zweitens Amplimers und der externen Primer RP5 und RP8 wurde eine dritte PCR durchgeführt. Während dieser PCR trat eine Verbindung zwischen dem ersten und dem zweiten Amplimer ein und ferner eine Amplifizierung des verbundenen Produkts.
Es war vorauszusagen, dass das erwartete Produkt der dritten PCR mit 1126 by aus der Sequenz 563-1113 (3'-Hälfte) des ADH2/GAP-Promotors, der mit der Sequenz 1-530 (5'-Ende) des HPV-6LI-ORF verbunden ist, besteht. Das abschließende PCR-Produkt sollte eine Bcl I-Stelle am 5'-Ende und eine Xba I-Stelle im L1-Bereich der Sequenz in Position 115 aufweisen. Das dritte PCR-Produkt wurde einem Verdau mit Bcl I und Xba I unterzogen und an einem Gel gereinigt. Das Fragment, das den Vektor pGEM-3z und the 5'-Hälfte des Promotors enthält und aus dem Verdau durch Bcl I-Xba I des Plasmids GAGαt6E7 stammte, wurde mit dem mit Bcl I-Xba I gespaltenen Produkt der rekombinanten PCR und dem aus dem Xba I-Verdau des Plasmids pAcC13-6L1 stammenden L1-Insert ligasiert.
Nach der Transformierung in DH5α-Zellen wurden mehrere Transformanten erhalten. Die Miniprep-DNAs von 14 Transformanten wurden unter Verwendung von Eco RI gespalten. Das Enzym Eco RI wurde gewählt, da es durch Verwendung dieses Enzyms möglich war, sowohl die erwarteten Molekülgrößen als auch die korrekte Orientierung des 6L1-Fragments zu verifizieren. Das 6L1-Fragment hatte identische Enden (wie etwa Xba I), so dass die Wahrscheinlichkeit dafür, dass das Fragment eine entgegengesetzte Orientierung annimmt, 50% beträgt. Durch Verwendung von Eco RI sollte die Plasmid-DNA der richtigen Klone zwei Fragmente liefern, die 2600 und 2700 by lang sind. Die Miniprep-DNA des Klons No. 8 ergab auf einem ersten Gel eine einzige Bande; durch stärkeres Laufenlassen des Gels war es möglich, die Fragmente 2600 und 2700 by aufzulösen. Auch unter Verwendung von Sph I war es möglich, einen weiteren Hinweis darauf zu gewinnen, dass der Klon No. 8 gut war. Somit wurde angenommen, dass der Klon No. 8 das korrekte Plasmid pGAG-6L1 enthielt, das in dem Vektor pGEM-3z besteht, der die HPV-6L1-Sequenz unter der Kontrolle des ADH2/GAP-Promotors enthält.
Das ADH2/GAP-HPV-6L1-Insert wurde durch Verdau mit Bam HI und Sal I aus dem aus dem Plasmid pGAG-6L1 herausgeschnitten; das Insert wurde an einem Gel gereinigt und zur weiteren Ligasierung beiseitegestellt. Das Promotor-L1-Fragment und der Vektor pBS24.1 wurden ligasiert, und das Reaktionsprodukt wurde in DH5α-Zellen transformiert. Die Miniprep-DNAs von 5 Transformanten wurden durch Spaltung mit Bam HI und Sal I analysiert; die Klone A, B, C und E wurden als gute Klone selektioniert, die das richtige Molekulargewichtsmuster zeigten.
Ein Klon wurde durch Elektroporation in den Stamm JSC310 von Saccharomyces cerevisiae transformiert; die Zellen wurden auf URA-Platten plattiert. Ausgewählte Transformanten wurden aus den URA-Platten entnommen und auf LEU-Platten aufgestrichen. Einzelne Kolonien von den LEU-Platten wurden in LEU-Medium inokuliert. Vier in dem LEU-Medium gewachsene Klone wurden in YEPD-Medium reinokuliert. Zellpellets von den vier JSC310-6L1-Klonen A, B, C und D wurden nach 24 und 48 Stunden Wachstum in YEPD-Medium zur Überprüfung der Expression des Proteins L1 auf -20 °C gefroren. Glycerinansätze der vier Klone wurden bei -80 °C gelagert.
Die Pellets der 6L1-Hefezellen wurden über Glaskügelchen extrahiert; lösliche und unlösliche Extrakte wurden durch Zentrifugieren getrennt und für die SDS-PAGE-Analyse vorbereitet.
Als Negativkontrolle wurden ferner Extrakte von einem Stamm hergestellt, der das Plasmid pBS-6L1 nicht enthielt (mit dem Vektor pAB24 transformierte JSC310-Zellen). In mit Coomassie-Blau gefärbtem Gel sowie im Western-Immunoblot war eine induzierte Bande sichtbar, die das erwartete Molekulargewicht aufwies. Ein Vergleich des in dem Hefestamm JSC310 exprimierten HPV-6L1 mit dem in Insektenzellen exprimierten gleichen Antigen zeigte, dass die beiden Antigene gleiches Molekulargewicht besitzen.
Der DNA-Abschnitt des aus der rekombinanten PCR abgeleiteten L1-Gens (bp 1-115) wurde unter Verwendung des folgenden Primers sequenziert:
5'TAGTTTTAAAACACCAA 3' SEQ ID NO:12.
Der Primer erzeugte die Verbindung am 3'-Ende des Promotors ADH2/GAP in Position -37 vom L1-Startcodon. Das Plasmid pGAG-6L1 (pGEM-3z, das den mit der L1-Sequenz verschmolzenen Promotor ADH2/GAP enthält) wurde als Matrize verwendet. Durch Sequenzierung wurde sichergestellt, dass weder bei den Manipulationen der rekombinanten PCR noch in den Klonierungsschritten Fehler eintraten.
Zur Konstruktion des integrativen Plasmids YIpAde wurde ein genomisches DNA-Fragment XbaI mit 1059 by des Adenin2-Gens von S. cerevisiae (Ade2) unter Verwendung des PCR-Oligonucleotidprimers 5'AdeE (5'-GCGGCGAATTCTAGAACAGTTGGTATATTAG-3' SEQ ID NO:5, der eine EcoRI-Stelle einfügt) und des PCR-Oligonucleotidprimers 3'AdeP (5'GCGGCCTGCAGGGTCTAGACTCTTTTCCATATA-3' SEQ ID NO:6, der eine PstI-Stelle einfügt) amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in das Plasmid pUC8 kloniert, das mit EcoRI und PstI gespalten wurde; die XbaI-Stellen, die im amplifizierten DNA-Fragment enthalten waren, wurden dazu verwendet, das Insert zur Hefetransformation herauszuschneiden. Zur Herstellung des integrativen Expressionsplasmids YIpLys-L2 wurde ein genomisches DNA-Fragment von 1318 by des Lysin2-Gens (Lys2) von S. cerevisiae amplifiziert, wobei die PCR-Oligonucleotidprimer 5'LysE (5'-GCGGAATTCCACTAGTAATTACA-3' SEQ ID NO:7, der eine EcoRI-Stelle einfügt) und 3'LysH (5'-GATGTAAGCTTCTACTAGTTGA-3' SEQ ID NO:8, der eine HindIII-Stelle einfügt) verwendet wurden. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde dann in pUC8 eingefügt (Derivate leicht im Handel erhältlich, z.B. von Promega), das mit EcoRI und HindIII gespalten wurde, wodurch ein Plasmid erhalten wurde, das als YIpLys bezeichnet wurde. Ein BamHI-DNA-Fragment des Vektors pSI3 (Isabel Zaror, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA, Grundsequenz pBR322, Promotor ADH2/GAP, Protein SOD und T_MFα), das den Promotor ADH2/GAP, das Gen der humanen Superoxiddismutase (SOD) und die Transcriptionsterminationssequenz T_MFα enthielt, wurde in die einzige BglII-Restriktionsstelle in der Sequenz des Lys2-Gens von YIpLys kloniert, wodurch ein als YIpLys-SOD bezeichnetes Plasmid erhalten wurde. Das Plasmid YIpLys-6L2 wurde von YIpLys-SOD abgeleitet, indem das NcoI-SalI-DNA-Fragment, welches das SOD-Gen kodiert, durch das DNA-Fragment NcoI-SalI von pGEM3z-6L2 (Kent Thudium, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA), das den offenen Leserahmen (ORF) von HPV-6bL2 kodiert, ersetzt wurde. Zur Konstruktion des Plasmids YIpLys-16L2 wurde das Gen L2 aus der klonierten genomischen HPV-16-DNA (in diesem Fall von Dennis J. McCance, University of Rochester, NY, freundlicherweise zur Verfügung gestellt) unter Verwendung des PCR-Oligonucleotidprimers
DT-5'L2 (5'-CGACACAAACGTTCTGCAA-3' SEQ ID NO:9) und des PCR-Oligonucleotidprimers
DT-3'L2 (5'-ATTAGTCGACCTAGGCAGCCAAGAGACATC-3' SEQ ID NO:10), der das Translationsterminationscodon und eine SalI-Stelle enthält, amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit SalI gespalten und in YIpLys-SOD kloniert, aus dem die SOD kodierende Sequenz durch Verdau mit NcoI, Verfüllen mit Klenow-Enzym und Verdau mit SalI entfernt worden war.
Die episomalen Expressionsplasmide pBS-6L2 und pBS-16L2 wurden durch Ersatz eines SacI-SalI-DNA-Fragments von pBS-6L1, das einen Teil des ADH2/GAP-Promotors und den ganzen HPV-6bL1-ORF enthält, durch SacI-SalI-DNA-Fragmente, die entweder von YIpLys-6L2 oder YIpLys-16L2 abgeleitet waren und den entsprechenden Promotorabschnitt und den L2-ORF enthielten, hergestellt.
Zur Konstruktion des episomalen Expressionsplasmids pBS-16L1 wurde das L1-Gen aus klonierter genomischer HPV-16-DNA unter Verwendung des PCR-Oligonucleotidprimers
DT-5'L1 (5'-TCTCTTGGCTGCCTAGTGAGGCCA-3' SEQ ID NO:11) und des PCR-Oligonucleotidprimers
DT-3'L1 (5'-CTAGTAATGTCGACTTACAGCTTACGTTTTTTGCG-3' SEQ ID NO:12), der das Translationsterminationscodon und eine SalI-Stelle enthält, amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit Agarosegel gereinigt und in pSI3-Vektor mit glatten Enden kloniert, aus dem zuvor das SOD-Gen durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NcoI und SalI entfernt und danach mit Klenow-Enzym aufgefüllt worden war. Aus diesem intermediären Konstrukt wurde ein SacI-SalI-DNA-Fragment, das einen Teil des Promotors ADH2/GAP und den HPV-16L1-ORF enthielt, gereinigt und zum Ersatz des entsprechenden SacI-SalI-DNA-Fragments in pBS-6L1 verwendet.
Beispiel 3
Erzeugung von rekombinanten Hefestämmen
Die Stämme JSC310-6L1epi (14), JSC310-16L1epi, JSC310-6L2epi und JSC310-16L2epi, welche die vier Kapsidproteine über episomale Vektoren exprimieren, wurden durch Transformation des parentalen Stamms JSC310 mit den Expressionsplasmiden pBS-6L1 (14), pBS-16L1, pBS-6L2 und pBS-16L2 hergestellt.
Die Stämme JSC310-6L2int und AB 110-16L2int wurden unter Anwendung des folgenden Versuchsansatzes hergestellt. Kompetente Hefezellen wurden mit 5 μg des integrativen Plasmids YIpLys-6L2 oder YIpLys-16L2, die mit EcoRI-HindIII gespalten worden waren, und 1 μg episomalem Vektor pBS24.1 co-transformiert, um eine Selektion von Transformanten zu ermöglichen. Die verschiedenen Klone wurden auf Platten mit Minimalmedium (MM), das mit α-Adipat ergänzt war, auf Wachstum getestet, um Mutanten mit einem inaktivierten Lys2-Gen zu selektieren (49). Eine korrekte Integration in den Lys2-Locus wurde durch PCR-Analyse verifiziert, wobei Paare von Oligonucleotidprimern verwendet wurden, die komplementär zu den Sequenzen innerhalb der Expressionskassette und dem Genomabschnitt des Lys2-Gens waren. Von den Kolonien, die das Protein L2 exprimierten, wurde eine ausgewählt, mit dem Plasmid pBS24.1 behandelt und auf seine Unfähigkeit getestet, in Abwesenheit von Uracil und Leucin zu wachsen. Die Einführung des episomalen, L1 exprimierenden Vektors in diese Stämme wurde nach zwei unterschiedlichen Strategien vorgenommen. AB110-16L2int wurde mit dem Expressionsplasmid pBS-6L1 transformiert; die Selektion von Transformanten auf MM-Platten ohne Leucin und Uracil erlaubten die Isolierung des haploiden Stamms AB 110-6L1/16L2. Auf der anderen Seite wurde der Stamm JSC310-6L2int mit dem Expressionsvektor pBS-16L1 und mit dem integrativen Plasmid YIpAde, das mit XbaI gespalten worden war, co-transformiert. Die auf selektiven Platten gewachsenen Transformanten wurden auf vollständiges Hefeextrakt-Pepton-Medium (YEP) plattiert und 3-4 Tage bei 30 °C wachsen gelassen, bis Kolonien (1-2%) aufgrund der Disruption des ade2-Locus eine rote Färbung entwickelten (52). Einer der Klone, die aufgrund der PCR und der Expression von L1 und L2 nach Western Blot-Analyse eine korrekte Integration in den ade2-Locus zeigte, wurde als JSC310-16L1/6L2 bezeichnet.
Die Erzeugung des diploiden Stamms AB/JSC-4L wurde durch gemischte Kultivierung der beiden haploiden Stämme AB110-6L1/16L2 und JSC310-16L1/6L2 in YEP-Medium mit Gehalt von 5% Glucose erhalten. Die Selektion des diploiden Stamms AB/JSC-4L erforderte einen zusätzlichen genetischen Marker in dem haploiden Stamm JSC310-6L2int. Dies wurde durch Inaktivierung des endogenen Gens Ade2 mit dem in 4a dargestellten Integrationsplasmid erzielt. Diploide Zellen wurden auf MM-Platten selektiert, die kein Histidin und kein Adenin enthielten.
Die Expression der vier Proteine in den haploiden Stämmen und in dem aus ihrer Paarung resultierenden Stamm wurde durch Western Blot-Analyse ermittelt. 5 zeigt die Ergebnisse solcher Versuche, die zeigen, dass sowohl die haploiden Stämme AB 110-6L1/16L2 (a und d, Bahnen 1) als auch JSC310-16L1/6L2 (b und c, Bahnen 2) die heterologen Gene exprimierten, sowie, dass die Expression sämtlicher vier Proteine bei dem resultierenden diploiden Stamm AB/JS-4L (a, b, c und d, Bahnen 3) stabil aufrechterhalten blieb.
Beispiel 4
Herstellung von VLPs
Parentale Hefestämme wurden in vollständigem YEP-Medium wachsen gelassen. Mit episomalen Vektoren transformierte Stämme wurden zuerst in MM-Medium ohne Leucin mit 4% Glucose kultiviert, bis sie die Midlog-Phase erreichten. Die Expression der Gene unter der Kontrolle des Glucose-repressiven Promotors ADH2/GAP wurde durch 1:50-Verdünnung in vollständigem YEP-Medium und Kultivieren der Zellen während 2-3 Tagen bei 30 °C induziert. Gesamtzellextrakte wurden von den Hefezellkulturen, die bis zu einer optischen Dichte (OD) von etwa OD₆₀₀=20 kultiviert worden waren, bei einer optischen Dichte von 3,5 erzeugt. Die Zellen wurden durch 10 min Inkubieren auf Eis in 0,24 N NaOH und 0,96% β-Mercaptoethanol lysiert und anschließend mit Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt und mit eiskaltem Aceton gewaschen, worauf das Proteinpellet schließlich in 100 μl Proteinloading-Puffer suspendiert wurde. Zur Durchführung von Dot Blot-Experimenten, bei denen die Beibehaltung der L1-Konformation erforderlich war, wurden die Hefezellen gesammelt, gewaschen, in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,5) suspendiert und durch fünfmalige Behandlung in einem Vortex-Gerät für 1 min in Gegenwart von Glaskügelchen (425-600 μm Sigma) aufgebrochen.
Gefrorene Hefezellpellets wurden in einem Puffer aufgetaut, der 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 2 mM MgCl₂ und 1 mM EGTA (#E3889, Sigma Chemical Co.) und Complete^TMProtease Inhibitors (#1-697-498, Boehringer Mannheim) enthielt. Die Zellen wurden durch zweimal 10 min Behandlung in einem Vortex-Gerät, mit einem 5 min-Intervall auf Eis, in Gegenwart von Glaskügelchen (0, 5 ml Kügelchen pro ml der Zellsuspension) unter Verwendung eines VWR-Multi-Tube-Vortexers (VWR Scientific Product) aufgebrochen. Die Zellbruchstücke wurden durch 20 min Zentrifugieren bei 2000 g abgetrennt. Die Überstände wurden dann durch ein 40%-iges (G/G) Sucrosekissen zentrifugiert (2 Stunden Zentrifugieren bei 100 000 g). Die resultierenden Pellets wurden in PBS suspendiert, auf einen vorgebildeten CsCl-Gradienten (1,17-1,57 g/ml) aufgegeben und 24 Stunden bei 285 000 g zentrifugiert. Die Gradienten wurden fraktioniert; Aliquote jeder Fraktion wurden der Western Blot-Analyse mit typspezifischen Anti-L1- und Anti-L2-Antikörpern unterzogen. Die Peakfraktionen wurden gepoolt und gegen PBS dialysiert. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit dem BCATM Protein Assay Reagent (#23225, Pierce Chemicals) bestimmt.
Beispiel 5
Charakterisierung von VLPs
Die Proteine wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE, 10% Polyacrylamid) und Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran (Porengröße 0,45 μm, MSI, Westborough, MA, USA) nach Standardprotokollen analysiert. Die Dot Blot-Analyse von denaturierten und reduzierten VLPs wurde durch 5 min Kochen der Proteinproben in Gegenwart von Dithiothreitol (DTT) vor ihrem Aufbringen auf Nitrocellulosefilter unter Verwendung eines Bio-Dot-Geräts (Biorad) durchgeführt. Wenn die native VLP-Struktur aufrechterhalten werden sollte, wurden die VLPs in PBS ohne Kochen und in Abwesenheit von DTT auf die Membran aufgebracht. Die Umsetzung mit HPV-spezifischen Antikörpern wurde unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting-Reagens (Amersham) und von Hyperfilm ECL (Amersham) erfasst.
Im Einzelnen wurde der Zellextrakt des diploiden Stamms der CsCl-Gradientensedimentation unterzogen, und Aliquote der gesammelten Fraktionen wurden in Gegenwart von DTT gekocht und doppelt auf Nitrocellulosefilter aufgeblottet. Die Filter wurden mit spezifischen Anti-HPV-6-Mabs und Anti-HPV-16-Mabs inkubiert, die mit denaturiertem L1 reagieren (8, 9), was zeigt, dass die beiden L1-Proteine in den gleichen Fraktionen angereichert waren (6A, a und c). Der Dot Blot-Versuch wurde ohne Denaturierung und ohne Reduzierung der Proteinproben unter Verwendung der spezifischen Anti-HPV-6L1- und Anti-HPV-16L1-Mabs wiederholt, von denen früher angegeben worden war, dass sie ausschließlich mit intakten VLPs in enzymmarkierten Immunosorbent-Assays (ELISA) reagieren (8, 9). Das erhaltene Ergebnis bestätigte, dass die beiden konformationsabhängigen Mabs befähigt waren, die in den CsCl-Fraktionen co-gereinigten L1-Proteine zu erkennen (6A, b und d). Wie erwartet, reagierten die beiden Mabs spezifisch mit HPV-6- und HPV-16-Kontroll-VLPs lediglich unter nichtdenaturierenden und nichtreduzierenden Bedingungen (6A, e). Die Western Blot-Analyse von Fraktion 5 bestätigte, dass sowohl das HPV-6L2-Protein als auch das HPV-16L2-Protein vorlagen (6B, a und b). Die Abschätzung des Brechungsindex des identifizierten Proteinpeaks ergab einen Wert von 1,29-1,3 mg/ml. Die EM-Analyse der angereicherten Fraktion ergab das Vorliegen von VLPs, die gleich aussahen wie Kontroll-VLPs, die mit HPV-6L1 oder HPV-16L1 hergestellt worden waren (7).
Zur Ermittlung, ob die Proteine HPV-6L1 und HPV-16L1 miteinander wechselwirken und sich zu Mosaik-VLPs vereinigen können, wurden Immunpräzipitationsversuche unter Verwendung der CsCl-aufgereinigten VLPs und des spezifischen, konformationsabhängigen Anti-HPV-6L1-Mabs H6.B10.5 (9) durchgeführt. Etwa 1 μg der CsCl-aufgereinigten VLPs wurden mit PBS verdünnt und mit dem konformationsabhängigen Anti-HPV-6L1-Mab H6.B10.5 (Verdünnung 1:1000) über Nacht bei 4 °C unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Die Immunkomplexe wurden mit Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech) gesammelt, viermal mit 1 ml PBS gewaschen, im gleichen Puffer suspendiert, 5 min gekocht, der SDS-PAGE unterzogen und durch Western Blot unter Verwendung von Anti-HPV-6L1- und Anti-HPV-16L1-Mabs analysiert. Durch Western Blot der Immunpräzipitate unter Verwendung typspezifischer Anti-L1-Mabs (8) wurden drei Hauptbanden identifiziert: (A) war eine Mab-abhängige Bande, da sie auch beobachtet werden konnte, wenn der konformationelle Mab mit dem Anti-Maus-Antikörper immungeblottet wurde; (B) war eine Bande, die nur dann auftrat, wenn die VLPs mit dem konformationellen Anti-HPV-6L1-Mab inkubiert wurden (Bahnen 3), der spezifisch immunpräzipitierte Proteine mit einer elektrophoretischen Mobilität identifiziert, die der von HPV-6L1 (a, Bahn 4) und HPV-16L1 (b, Bahn 5) entspricht; (C) war eine Harz-abhängige Bande, die auch erfasst wurde, wenn ein Aliquot von Protein A-Sepharose in PBS suspendiert und mit dem Anti-Maus-Antikörper immungeblottet wurde. Die Banden (B) waren nicht erkennbar, wenn die Immunpräzipitation unter Verwendung eines nichtzugehörigen Mabs durchgeführt wurde. In ähnlicher Weise konnte HPV-16L1 nicht erfasst werden, wenn HPV-6- und HPV-16-VLPs gemischt und immunpräzipitiert wurden.
Beispiel 6
Immunisierung von Mäusen mit VLPs.
Zur Untersuchung, ob HPV-6/ 16-Mosaik-VLPs befähigt sind, eine gegen beide HPV-Typen gerichtete Immunantwort zu induzieren, wurden Gruppen von Mäusen mit HPV-6-VLPs, HPV- 16-VLPs und Mosaik-VLPs subcutan immunisiert, und die Seren wurden nach der dritten Immunisierung getestet. Sechs Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse erhielten durch subcutane Injektion 20 μg der folgenden gereinigten Antigene: (i) HPV-6-VLPs, (ii) HPV-16-VLPs, (iii) HPV-6/ 16-VLPs. Sämtliche Antigene wurden mit dem gleichen Volumen MF59-Adjuvans (30) verabreicht. Eine Gruppe von Kontrollmäusen erhielt lediglich Injektionen mit MF59. Die Mäuse wurden mit 15 μg des entsprechenden Antigens bei Woche 3 und mit 10 μg bei Woche 5 geboostet. Die Serumproben wurden am Tag 12 nach dem letzten Boosten gesammelt und auf Kapsidproteinspezifische Antikörper geprüft.
9A zeigt das Ergebnis des Western Blots, der mit den drei Typen von denaturierten VLPs durchgeführt wurde, die mit drei Seren inkubiert worden waren, die jeweils für die verschiedenen Gruppen der immunisierten Mäuse repräsentativ waren. Während die Reaktivität der Seren von den entweder mit HPV-6-VLPs oder HPV-16-VLPs immunisierten Mäuse überwiegend typspezifisch war (9A, a und b), reagierte das Serum von Maus 16 (S 16), die mit HPV-6/16-VLPs immunisiert worden war, sowohl mit HPV-6L1 als auch mit HPV-16L1 (9A, c). Zur Analyse, ob die Immunantwort auch gegen konformationelle Epitope der L1-Proteine gerichtet war, wurden gleiche Mengen von HPV-6-VLPs oder HPV-16-VLPs unter denaturierenden und nichtdenaturierenden Bedingungen geblottet und mit dem S16-Antiserum inkubiert. 9B zeigt, dass das Signal signifikant niedriger war, wenn die Proben denaturiert und reduziert waren, was nahelegt, dass konformationelle Antikörper induziert worden waren.
Die vorstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind nicht so aufzufassen, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken. Fachleute sind in der Lage, Modifizierungen zu erkennen, die innerhalb des Konzepts und des Umfangs der Erfindung liegen. Sämtliche hier zitierten Referenzen werden in ihrer Gesamtheit hiermit in Bezug genommen.
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Claims

Virus-ähnliches Partikel (VLP), das Kapsidproteine des humanen Papillom-Virus (HPV) Typ 6 und HPV Typ 16 enthält.
VLP von Anspruch 1, wobei die Kapsidproteine das späte Haupt-Kapsidprotein 1 (L1) umfassen.
VLP von Anspruch 1, wobei die Kapsidproteine das späte Neben-Kapsidprotein 2 (L2) umfassen.
VLP von Anspruch 1, wobei die Kapsidproteine L1 von einem Virus-Typ und L2 von einem zweiten Virus-Typ umfassen.
VLP von Anspruch 2, das ferner das L2-Kapsidprotein enthält.
Zusammensetzung, die das VLP von Anspruch 1 enthält.
Zusammensetzung von Anspruch 6, wobei das VLP zu einer Form gereinigt ist, die sich zur Verwendung bei der Immunisierung eignet.
Zusammensetzung von Anspruch 7, wobei das VLP das VLP von Anspruch 5 enthält.
Zusammensetzung von Anspruch 8, die ferner ein Adjuvans enthält.
Zusammensetzung von Anspruch 9, wobei das Adjuvans MF59 ist.
Verfahren zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs), die Kapsidproteine von mindestens zwei Typen des humanen Papillom-Virus (HPV) enthalten, wobei das Verfahren umfasst: a) Einklonieren der Kapsidproteine in Expressionskassetten, welche die gleichen Promotoren und die gleichen Terminationssequenzen aufweisen, und b) Exprimieren der Kassetten in der gleichen Wirtszelle.
Verfahren von Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
Verfahren von Anspruch 12, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die HPV-Typen die Typen 6 und 16 sind.
Verfahren von Anspruch 11 oder 14, wobei die Kapsidproteine das späte Haupt-Kapsidprotein 1 (L1) umfassen.
Verfahren von Anspruch 11 oder 14, wobei die Kapsidproteine das späte Neben-Kapsidprotein 2 (L2) umfassen.
Verfahren von Anspruch 11 oder 14, wobei die Kapsidproteine L1 von einem Virus-Typ und L2 von einem zweiten Virus-Typ umfassen.
Verfahren von Anspruch 15, wobei ferner L2-Kapsidproteine umfasst sind.
Verfahren von Anspruch 13, wobei die L1-Protein-Expressionskassetten in nicht-integrative Vektoren und die L2-Protein-Expressionskassetten in integrative Vektoren einkloniert werden.
Verfahren von Anspruch 19, wobei der nicht-integrative Vektor pBS24.1 ist.
Verfahren von Anspruch 19, wobei der integrative Vektor pUC8 ist.
Wirtszelle, die Vektoren zur Expression von Kapsidproteinen von mindestens zwei Typen des humanen Papillom-Virus (HPV) enthält.
Wirtszelle von Anspruch 22, wobei die HPV-Typen die Typen 6 und 16 sind.
Wirtszelle von Anspruch 23, wobei die Kapsidproteine das späte Haupt-Kapsidprotein 1 (L1) umfassen.
Wirtszelle von Anspruch 23, wobei die Kapsidproteine das späte Neben-Kapsidprotein 2 (L2) umfassen.
Wirtszelle von Anspruch 22 oder 23, wobei die Kapsid-Proteine L1 von einem Virus-Typ und L2 von einem zweiten Virus-Typ umfassen.
Wirtszelle von Anspruch 24, wobei ferner die L2-Kapsid-Proteine umfasst sind.
Wirtszelle von Anspruch 27, wobei die Wirtszelle eine diploide Zelle ist.
Wirtszelle von Anspruch 22 oder 28, wobei die Wirtszelle eine Hefe ist.
Wirtszelle von Anspruch 29, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
Verwendung des VLP von einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Induzierung einer Immunantwort.
Verfahren zur Expression von Kapsid-Proteinen von mindestens 2 Typen des humanen Papillom-Virus (HPV), wobei das Verfahren umfasst: a) Einklonieren der Kapsidproteine in Expressions-Kassetten, welche die gleichen Promotoren und die gleichen Terminationssequenzen aufweisen, und b) Exprimieren der Kassetten in der gleichen Wirtszelle.
Verfahren von Anspruch 32, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
Verfahren von Anspruch 33, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
Verfahren von Anspruch 32, wobei die HPV-Typen Typ 6 und Typ 16 sind.
Verfahren von Anspruch 32 oder 35, wobei die Kapsidproteine das späte Haupt-Kapsidprotein 1 (L1) umfassen.
Verfahren von Anspruch 32 oder 35, wobei die Kapsid-Proteine das späte Neben-Kapsidprotein 2 (L2) umfassen.
Verfahren von Anspruch 32 oder 35, wobei die Kapsidproteine L1 von einem Virus-Typ und L2 von einem zweiten Virus-Typ umfassen.
Verfahren von Anspruch 36, wobei ferner die L2-Kapsidproteine umfasst sind.
Virus-ähnliches Partikel (VLP) von Anspruch 1, wobei das VLP eine Immunantwort gegen beide HPV-Typen induziert.
Zusammensetzung, die das VLP von Anspruch 40 enthält.