JPH08512045A

JPH08512045A - ヒトパピローマウイルスの合成ペプチド

Info

Publication number: JPH08512045A
Application number: JP7503350A
Authority: JP
Inventors: シェパード，フィリップ・スティーブン
Original assignee: ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 1996-12-17
Also published as: GB9313556D0; WO1995001374A1; NZ267682A; AU7040594A; CA2166333A1; EP0706533A1

Abstract

(57)【要約】ＨＰＶ１６またはヒロパピローマウイルス類似物を原因とする、又はそのようなＨＰＶが関与する感染症、特に子宮頸部形成異常、の患者の治療に共同して用いるペプチドであって、その様なペプチドは長さ１５から２４のアミノ酸であり、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｌ１タンパク質の内の以下のアミノ酸配列：（１）配列番号：１＝アミノ酸残基３１１−３２５、またはその保存的修飾変異体；（２）配列番号：２＝アミノ酸残基３２１−３３５、またはその保存的修飾変異体；（３）配列番号：３＝アミノ酸残基３３１−３４５、またはその保存的修飾変異体：からなる、またはこれらの３種のペプチドそれ自体の組成物、またはその様な治療への利用は、本発明に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトパピローマウイルスの合成ペプチド発明の背景（１）発明の分野本発明は、性器いぼ、子宮頸部形成異常、および子宮頸部癌の予防および治療に有効なヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質内で同定された合成ペプチドを提供する。（２）関連する技術ヒトパピローマウイルスは、動物のパピローマウイルスと共通の遺伝的生物体に分けられ、かつ、皮膚および粘膜の落屑性上皮病変を引起こすウイルスの一群である。６５種以上の異なるＨＰＶの型が同定されている。異なる型のＨＰＶは異なる病気の原因となり、体の異なる部位に表れる。数種の型、特に６、１１、１６、１８、３１、３３、３５および５２型は、性器領域に感染する。ＨＰＶの６および１１型は、主に、尖形（ａｃｕｍｉｎａｔａ）コンジロームとして知られている性器いぼの原因となる。その他のＨＰＶの型、１６、１８、３１、３３、３５、３９、５１および５５は、主に、組織学的に頸部上皮内癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａ）（ＣＩＮ）と定義されている子宮頸部上皮の扁平いぼおよび形成異常病変の原因となる。これらのＣＩＮ−病変は、さらに非侵襲性癌（その部位の癌）または侵襲性落屑性細胞癌に進行する可能性がある。全子宮頸部癌の９０％以上は、宿主ゲノム中にある型のＨＰＶを組み込んでいると言う遺伝学的証拠を持ち、そのうち、ＨＰＶ１６のみが最も共通に認められ（全子宮頸部腫瘍の６０％）、かつ、これは、本出願で最も興味あるＨＰＶの型である。ＨＰＶ感染とＣＩＮおよび子宮頸部癌への進行との関係は、明らかではないが、ＨＰＶは子宮頸部発癌のイニシエーターとして働き、かつ、悪性への形質転換は他の要素との相互作用に依存する（ＺｕｒＨａｕｓｅｎ，Ｈ．ら、Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：１３７０，１９８２）と予想されている。特別にはＨＰＶ１６、および一般的にはパピローマウイルスの形態は、よく研究されてきた。ＨＰＶ１６は、７９０４ｂｐの二本鎖ＤＮＡゲノムを含んでいる（Ｓｉｅｄｏｒｆ，Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４５，１８１−１８５，１９８５）。キャプシドは５０ｎｍであり、７２のキャプソメアを含む（Ｋｌｕｇ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，４０３−４２３，１９６５）。ＨＰＶ１６の亜種の多くは、５０％より大きい相同性を示す分離菌である（Ｃｏｇｇｉｎ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，３９，５４５−５４６，１９７９）が、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いてサザンブロッティングを行うと制限フラグメントの長さの多型性パターンに違いを示すことが報告されてきた。すべてのＨＰＶゲノムは、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）（ＯＲＦ）から転写される多数のタンパク質をコードする少なくとも８つの領域を持つ。これらの領域は、機能的には、複製および形質転換のために必要なタンパク質（Ｅ１からＥ７）をコードすると仮定される初期領域、並びに、２つの主なウイルスキャプシドタンパク質（Ｌ１およびＬ２）をコードする終期領域に分けられる。終期領域は、すべてのＨＰＶの型に相同的領域を示す。ＨＰＶ１６およびパピローマウイルス一般による感染に対する免疫応答についてはほとんど知られていない。ＨＰＶの検出は、例えば、子宮頸部サンプル内では、ポリメラーゼ鎖反応（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）およびサザンブロッティング（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）のような感度の高いＤＮＡタイピング技術を用いて行うことができるが、ウイルスは、分離できず、研究室では免疫試験に適した抗原性物質が適当量に達するまで増殖させることもできない（Ｔｉｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．，８３：２５−６５，１９８４）。ＨＰＶの血清反応性エピトープが同定され、それに対する抗体が作製された。これらの抗体はＨＰＶ感染の診断に用いられることが認められ、このことは、例えばＷＯ９１／１８２９４（ＤｉｌｌｎｅｒおよびＤｉｌｌｎｅｒ）に記載されており、この文献中ではＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２タンパク質に相当する合成ペプチドが合成され、ヒト血清で試験された。また、これらの抗体が反応する合成ペプチドは、ＨＰＶ感染の診断に有用であると考えられた。しかしながら、これらの抗体またはペプチドを治療に用いることについては示唆されていない。生物学的に重要なＢおよびＴ細胞のエピトープについてスクリーニングを行うのに適した生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）バイオアッセイシステムが欠如しているので、酵素結合イムノアッセイ（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）（ＥＬＩＳＡｓ）においてＨＰＶ結合活性を持つこれらおよびその他の報告されている抗体がＨＰＶを中和する能力を持つか否かについて明らかにすることはできない。さらに、診断に用いうる可能性を持つ抗体を上昇させるであろう血清反応性エピトープ（Ｂ細胞エピトープ）は、それ自身、防御免疫応答を引き出す能力を持つエピトープである。ＨＰＶのような外来抗原に感染することによって、免疫システムは、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｓ）（ＡＰＣｓ）を通して宿主に提示される異なるＨＰＶ抗原上に認められる多数の抗原決定基に対して応答する特異的なＴ細胞およびＢ細胞を装備すると予想される。欧州特許出願２５７７５４（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ）、４１２７６２（Ｏｌｉｆｆ）、４５１５５０（Ｍｕｌｌｅｒ）およびＭｕｌｌｅｒら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７１．２７０９−２７１７，１９９０）は、彼らが言うところのＨＰＶ１６型が治療に有効であると言うことも含めて、ＨＰＶのエピトープについて述べている。当該技術分野において記載されているこれらの全エピトープ中、大多数は初期領域のタンパク質に関係する。また、Ｍｕｌｌｅｒは、ワクチンに有効なＨＰＶ１６Ｌ１の８８のアミノ酸の配列を開示している。しかしながら、すべての場合において、証拠は血清学的試験に基づいており、それらがＢ細胞エピトープについて考察していることを示唆しており、これらのペプチドがＢ細胞応答を作り出すに十分な免疫原性を持つこと、および、その結果得られたＢ細胞抗体がＨＰＶを中和する抗体であるか、そしてＨＰＶ感染を防御するか否か、を示す証拠は提供されていない。Ｔ細胞エピトープもまた、侵入した抗原に対する個体の免疫応答に重要である。Ｔ細胞は、マクロファージおよび多形核白血球と共に、体の免疫防御の最も重要で主要な系である。Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ（本発明者）および共同研究者らは、子宮頸部形成異常の患者から得られたＴ細胞を特異的に刺激し増殖させるこれらペプチドの能力を測定するようにデザインしたＴ細胞増殖アッセイで、ＨＰＶ１６Ｌ１から誘導されたあるペプチドに対する免疫応答を試験した。様々な発表会が、１９９２年および１９９３年に行われ、それによって、患者の細胞は、ペプチドの２つのプール、その内の一つのプールはアミノ酸残基３０５−３２９からの２つのペプチドを含み、他のプールはアミノ酸残基３２１−３４５からの３つのペプチドを含む、の内の一方または両方のどちらかのペプチドによって最も良く刺激されることが示された。エピトープを提示するペプチドを正確に定義することが難しいのは周知の事実であるが、関連する臨床的症状、この場合は子宮頸部形成異常、を持つ患者に、高い割合でＴ細胞刺激応答を共に提供するであろう比較的短いペプチドのセットを定義することは、より難しい。長いペプチドは、合成経費の観点、および患者の抗原提示細胞によるその様なペプチドの的確な提示、の両方から避けるべきである。本発明は、試験グループのほとんどの患者によって認識されるペプチドのセットを定義することによって、この問題の解決を提供する。発明の概要本発明は、ＨＰＶ１６あるいは同様のヒトパピローマウイルスを原因とする、またはその様なＨＰＶが関与する感染症、特に具体的にはヒトパピローマウイルス詳しくは子宮頸部形成異常、の患者の治療に共同して使用する３種のペプチドを提供し、そのペプチドは長さ１５から２４のアミノ酸からなり、以下の配列：（１）配列番号：１＝アミノ酸残基３１１−３２５：またはその保存的修飾変異体；（２）配列番号：２＝アミノ酸残基３２１−３３５：またはその保存的修飾変異体；（３）配列番号：３＝アミノ酸残基３３１−３４５：またはその保存的修飾変異体；からなる、または含んでいる。また、本発明は上記の３種のペプチドからなる治療用組成物自体、または上記の治療における使用を含む。上記の定義のいずれもが、その他のペプチド組成物、あるいはその他の適合する活性原理、あるいはその他の成分を治療に用いること、または共存させることを排するわけではない。さらに、ペプチドは、それぞれの場合において、遊離形であることも、または、上記治療目的を促進する、改良する、あるいは少なくとも適合するであろう、任意のキャリヤーまたは補助分子との（一つあるいはそれ以上の共有化学結合による結合を含む）結合形であることもできる。本発明は、上記ペプチドの２つ、あるいは３つの全てが、２つあるいは３つのペプチドの組み合わせによって示される配列を網羅するに必要な同じ長さのまたはそれより長い単一ペプチドによって置換される可能性を含む。しかしながら、より短いペプチドを用いることによる利益は、この方針を魅力ないものにする。その場合には、しかしながら、ペプチドは３１１−３４５の範囲の外側のＨＰＶ１６Ｌ１配列、すなわち、３１１のＮ末端側または３４５のＣ末端側をカバーすべきではない。望ましい実施態様の説明本発明で用いるペプチドは、Ｔ細胞応答を引き出す能力を持つそのようなペプチドである。最適なＴ細胞応答に必要な正確に作り上げられた配列は、個体ごとに変化しても良い。望ましくは、アミノ酸の長さが１５から２２、最も望ましくは１５から２０、よりさらに望ましくは１５から１８である、本発明のペプチドを併用することによって、ヒト母集団でのＴ細胞エピトープ認識の多様性を許容することができる。上記の必須の１５の長さを越える、任意のさらなるアミノ酸には、ＨＰＶ１６Ｌ１の隣接するアミノ酸、特に、ペプチド（１）の３０５−３１１が望ましい。本発明で用いるペプチドはヘルパーＴ細胞の産生を刺激し、次にヘルパーＴ細胞はヘルパー機能および特異的Ｂ細胞への細胞間のシグナルを提供して、抗原／ペプチドおよびサイトカインの放出、ＨＰＶに特異的な抗体応答を惹起し、および／またはウイルスあるいはウイルス感染細胞を殺すまたは非活性化する細胞障害性Ｔ細胞の補助を行うと思われる。この様に、ヘルパーＴ細胞は、体の２つの主要免疫防御機構を調整するのに重要な中枢の役割を演ずる。それ故、Ｂ細胞エピトープまたは細胞障害性Ｔ細胞エピトープのような抗原提示に用いられるシステムにヘルパーＴ細胞エピトープを包含させると、ヘルパーＴ細胞の産生をさらに刺激することによって、提示されているＢ細胞エピトープまたは細胞障害性Ｔ細胞エピトープとの応答を改善に導くであろう。このように、本発明の望ましい特徴に従って、上記のペプチドは、Ｂ細胞または細胞障害性Ｔ細胞のエプトープと連結している。本発明で用いられるペプチドと連結しているＢ細胞エピトープは、望ましくは、ＨＰＶ、具体的には、１６、１１、および６型、より望ましくは、ＨＰＶ１６からのものであるが、免疫応答を生ずることが所望される任意のその他の望ましい抗原／ペプチドでもよい。Ｂ細胞エピトープは、ＨＰＶの初期領域（Ｅ１からＥ７）か、より望ましくは、後期領域（Ｌ１およびＬ２）のどちらかからであって良い。本発明の一つ以上のペプチドと共に、提示されるＢ細胞または細胞障害性Ｔ細胞のエピトープは一つ以上あっても良い。本明細書で用いられる「ペプチド」という言葉は、中性（負電荷）および塩の形を含み、かつグリコシル化、側鎖の酸化、あるいはリン酸化のような修飾を受けていない、またはこれらの修飾を含んでいるかのいずれかである。アミノ酸配列が酸性基および塩基性基を含むこと、並びに、ペプチドが溶液である場合、ペプチドが示す個々のイオン化状態は周辺媒質のｐＨに依存すること、またはペプチドが固体型である場合は、ペプチドの得られた媒質のそれであること、はこの技術分野で良く理解されている。また、ペプチドの定義には、グルコシル単位、脂質、またはリン酸塩のような無機イオン、のようなアミノ酸側鎖に結合するさらなる置換基、並びに、スルフヒドリル基の酸化のような鎖の化学転化に関連する修飾、によって修飾されたものを含む。このように、「ペプチド」という用語は、その免疫原性特性を壊さないそのような上記の修飾を受けやすい、上記の適当なアミノ酸配列の分子を含む。本発明に用いるペプチドは、ペプチド合成の技術分野で標準的な技術を用いて化学合成によって調製されて良い。一つのアミノ酸を同様の性質を持ったもう一つのアミノ酸によって置き換える、例えば、アスパラギン酸残基をグルタミン酸残基によって置き換えても、その様な置換が起こったペプチドの性質には影響を及ぼさないであろうことは、この技術分野では良く認識されている。それ故、本発明は、ペプチドの性質に影響を及ぼさない、その様な置換が起こったペプチドの保存的修飾変異体に及ぶ。特に、配列番号：１−３のアミノ酸の１、２または３を、非極性、非電荷極性、正電荷、または負電荷のカテゴリーが同じ他のアミノ酸によって置き換えることに及ぶ。Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＭｅｔは非極性であり；Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎは非電荷極性であり；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓは正電荷であり、ＡｓｐおよびＧｌｕは負電荷である。上記のペプチドは、他の様々な化学修飾を行ってもよく、それらはなお、本発明の範囲の内にある。特に、ペプチドはＣ末端にアミノ基を持つ、または持たないように調製してもよい。Ｃ末端にアミノ基を持つように調製した場合、ペプチドは、上記のアミノ酸残基のカルボニル部分に共有結合したカルボキシ末端のアミド基を持つ。また、ペプチドはＮ末端のアミノ酸に共有結合したアセチル基を持つ場合もある。他の化学修飾、特に環化および二量体化の形状、も可能である。本発明に用いられるペプチドは単独で用いてもよいが、低分子量の場合は、それらの抗原性をより強めるための免疫原性のキャリヤー物質に付けてもよい。本発明のもう一つの特徴に従って、上記の結合ペプチドは、上記のようなＢ細胞または細胞毒性Ｔ細胞に、または免疫原性キャリヤー物質と共に、結合してもよく、本発明に用いられる。本明細書中で用いられる「免疫原性キャリヤー物質」という言葉は、宿主動物中に独立的に免疫原性応答を引き出す性質を持つそれらの物質、およびポリペプチド中の遊離カルボキシル、アミノあるいはヒドロキシル基と免疫原性キャリヤー物質上の関連する基との間のペプチド結合あるいはエステル結合の形成を通して直接的に、あるいは従来の二価性の連結基による結合によってペプチドに共有結合することができるそれらの物質、を含む。そのようなキャリヤーの例には、動物血清のアルブミン、動物血清のグロブリン、動物のチログロブリン、動物のヘモグロビン、動物のヘモシアニン、特にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫｅｙｈｏｌｅＬｉｍｐｅｔＨａｅｍｏｃｙａｎｉｎａ）（ＫＬＨ）、回虫属から抽出したタンパク質（日本特許出願公開第１６，４１４／８１号、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１１，２６０−２６８，１９７３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２，３０２−３０８，１９７９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９８，８９３−９００，１９６７およびＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９，５７５−５７８，１９６０に記載されたような回虫抽出物、またはそれ精製生成物）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミン酸の共重合体、リジンまたはオルニチンなどを含む共重合体が含まれる。最近では、ワクチンは免疫原性キャリヤー物質としてジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドを用いて生産されており（Ｌｅｐｏｗ．Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，１５０，４０２−４０６，１９８４；およびＣｏｅｎＢｅｕｖｅｒｙ，Ｅ．ら、ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，４０，３９−４５，１９８３）、これらのトキソイド物質はここでもまた用いることができる。その他の適当なキャリヤーは、例えば、米国特許第４，５７５，４９５号、に開示されており、ワクチン、有機ポリマー等が含まれる。ツベルクリン（ＰＰＤ）のタンパク質誘導体は、（１）それ自身がＴ細胞応答を誘発せず（即ち、それは事実上「Ｔ細胞ハプテン」である）、さらに完全にプロセシングされた抗原としてふるまい、それ自身Ｔ細胞によって認識される；（２）連鎖認識モードで最も強力なハプテン「キャリヤー」の一つであることが知られている；および（３）最も重要なことには、さらに試験することなしにヒトに用いることができる：ために、「活性な」免疫化スキーム中での利用に特に望ましい。ペプチドキャリヤー結合試薬として、従来から抗原の調製に用いられているそれらは広く用いることができる。免疫原性キャリアー物質とペプチドの共有結合は、この技術分野で良く知られている方法で行うことができる。このように、例えば、直接共有結合を行うために、カップリング試薬として、カルボジイミド、最も適切にはジクロロヘキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いることが可能である。グルタルアルデヒドもまた、免疫原性キャリヤー物質へのペプチドの共有結合の手段として用いてもよい。上記において、ペプチド、ペプチドキャリヤー結合試薬および免疫原性キャリヤー物質の割合は、適当に決定することができるが、キャリヤーは、ペプチド重量の約１−６倍、望ましくは１−５倍の量で用い、ペプチド−キャリヤー結合試薬はペプチド量の約５から約１０モル倍の量で用いることが望ましい。上記の反応によって、キャリヤーは、ペプチド−キャリヤー結合試薬を介してペプチドに結合し、ペプチド−キャリヤー複合体で構成される所望の抗原がえられる。反応が完了した後、この様にして得られた接合体は、透析法、ゲル濾過法、分画沈殿法等の手段によって、容易に分離、精製することができる。本発明で用いるペプチドは、性器いぼ、子宮頸部癌、特に形成異常、またはＨＰＶを原因とする男性の他の症状、によって現れるそれらの初期徴候の予防または治療への効用が認められている。ＨＰＶの全タイプのＬ１領域のアミノ酸配列は、高い保存性を持つ。本発明の定義では、「ヒトパピローマウイルス様」という用語は、ＨＰＶ１６Ｌ１のアミノ酸３１１−３４５に関して言えば、アミノ酸配列の５０％またはそれより大きい同一性、特に、６５％またはそれより大きい同一性をもつそれらを含む。本発明で用いるペプチドは、多くのＨＰＶ関連疾病、特に、ＨＰＶ６および１１、最も具体的にはＨＰＶ１６を原因とする疾病、の予防および治療に有効であると認められるであろう。主な使用は子宮頸部形成異常の患者に対してであるが、それは、この病気がしばしばＨＰＶ１６感染に関連しているからである。本発明で用いられるペプチドの宿主への直接投与は、宿主にＨＰＶに対する防御免疫を与えることができ、または素因者がすでに感染しており従って免疫学的に準備されている場合は、素因者自身の特異的なＨＰＶの免疫応答への追加免疫として機能し、ＨＰＶまたはＨＰＶ関連疾患の進行に対してより効果的に防御を強めることができる。本発明のペプチドは、ＨＰＶを含む疾病の治療または予防のための薬剤組成物に含まれてよい。薬剤組成物中には治療上有効量のペプチド、Ｂ細胞あるいは細胞毒性Ｔ細胞エピトープに結合したペプチド若しくは上記のようなペプチド結合体、またはその薬剤として許容しうる塩を薬剤として許容しうる希釈剤あるいは担体と共に含む。薬剤組成物中にはその他の治療成分もまた含まれてよい。「薬剤として許容しうる塩」という用語は、薬剤として許容しうる無毒の有機および無機の塩基から調製された塩を指す。組成物は、経口、局所（腟を含む）または非経口（皮下、粘液下、筋肉内、静脈内、および動脈内を含む）投与に適当な組成物を含むが、任意に与えられる場合に最も適当な経路は、治療される側の性質及び状態の重症度並びに活性成分の種類に依存する。それらは単位投与量の形で与えられるのが都合がよく、薬剤の技術分野で良く知られた任意の方法によって調製することができる。実際的に用いる場合には、本発明で用いられるペプチドは、従来の薬剤化合物の技術による薬剤キャリヤーと共に、混合物中に活性成分として一緒にすることができる。キャリヤーは、投与に適した調製物の形によって、いろいろな形を取ってよい。経口投薬形の組成物の調製では、例えば、水グリコール、油脂、アルコール、香味剤、防腐剤、カップリング剤等のような任意の通常の薬剤媒質は、例えば、懸濁液、エリキシル、溶液のような経口液体調製物に；または、デンプン、砂糖、ミクロクリスタリンセルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、分解剤等のキャリヤーは、例えば、パウダー、カプセルおよび錠剤のような経口固体調製物に、用いられてよい。それらの投与の容易さのために、錠剤及びカプセルは、最も好都合な経口投薬単位の形を代表しており、その場合、明らかに固体の薬剤キャリヤーが用いられる。所望するならば、錠剤は砂糖コーティングまたは標準的技術による腸コーティングであってよい。経口投与に適した本発明の薬剤組成物は、予想量の活性成分を粉末あるいは粒剤としてそれぞれ含む、カプセル、薬用オブラートあるいは錠剤といったような分離単位として、または水性液体、非水性液体、水中油脂エマルジョンあるいは油脂中水液体エマルジョン中の溶液あるいは懸濁液として、存在してもよい。適切な局所調合物は、経皮用装置、エアロゾル、クリーム、軟膏、ローション剤、散粉末等を含む。しかしながら、望ましくは、ペプチドは、非経口で、より望ましくはワクチンとして投与されるべきである。所望するならば、ワクチンは抗原物質への応答を強めるためのある形のアジュバンド含む。アジュバンド物質の例には、水酸化アルミニウムおよびサポニンが含まれる。活性成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製物は、この技術分野で良く知られている。望ましくは、ワクチンは、注入可能な形で調製され、望ましくは、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、表皮内、または皮内、望ましくは筋肉内に投与される。組成物は、単位投薬形、または単位投薬の倍数あるいは約数に調合されてよい。さらに、ワクチンは、時間にともなってペプチドの遊離を遅滞させるペプチドを提供する形であってよい。ワクチンは、投薬調合物と適合する方式で、治療上効果的で免疫原性をもつであろう量を投与する。治療するための量、素因者が抗体を合成する免疫システムの能力、および所望する防御の程度等、適格な量は様々な要因に依存する。得られた活性化合物の投薬は、様々な要因に依存するであろうが、指標として、投薬量は、体重１ｋｇ当り通常０．１ｍｇから２０ｍｇであろう。国内特許法が許可する様に、本発明はまた、ヒトの体のＨＰＶの感染の予防または治療法を含み、本発明で用いるペプチドをヒトの患者に治療上有効な投薬量を投与することからなり、例えば、体重１ｋｇ当り０．１−２０ｍＭ、望ましくは１−２ｍＭ／ｋｇの範囲を、治療過程の間、毎日または日に二回投与する。あるいは、本発明は、該治療に用いるために本発明の化合物、およびそのような目的の薬剤製造にそれらを用いること、を含む。上記の一般の投薬形に加えて、ペプチドはまた、放出制御手段および／または放出装置によって投与されてよい。以下の実施例は本発明を具体的に説明するものである。実施例ＨＰＶ１６Ｌ１の合成ペプチドの合成合成ペプチドは、ペプチド合成の標準的方法なＦ−ｍｏｃ法によって合成した。それらは、ＨＰＶ１６Ｌ１からの以下のアミノ酸配列：（４）３０１−３１５；（５）３０５−３１９；（６）３１１−３１９；（７）３１１−３２５；（８）３１４−３２９；（９）３２１−３３５；（１０）３２５−３３５；（１１）３３１−３４５；および（１２）３３５ −３４５：をもつ。ＰＨＶ１６Ｌ１融合蛋白質の合成／調製ＨＰＶ１６Ｌ１融合タンパク質はＰａｔｅｌら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．，７０，６９−７７，１９８９に記載の方法によって調製した。子宮頸部形成異常の患者からの短期系の誘導（ａ）材料及び方法試薬：ＨａｎｋｓＢＳＳ（ＨＢＳＳ）（０４２−０４０６０Ｈ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）ジメチルスルホキシド（１０３２３；ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）組織培養培地；１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウム（１６−８２０−４９；ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、２ｍＭＬ−グルタミン（０４３−０５０３０Ｈ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（４４２８５；ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（１６−７６２−４５；ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｍ−６２５０；Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、および０．２５μｇ／ｍｌ“ Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ”（登録商標）（１６−７２３−４６；ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を追加したＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（０４１ − ０１８７５Ｍ：ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）。熱で不活性化しプールしたヒトの血清（ｎ＝２０）患者のリンパ球の調製５０ｍｌの静脈血液を個々の患者から採取し、１５のガラスボール（３３２１２４Ｇ；ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を含む５０ｍｌの遠心管（Ｃｅｌ−Ｃｕｌｔ；）中、室温で５分間回転させることによって、脱繊維素した。血液は、新たな５０ｍｌ遠心管中にデカントし、１６４２ｇで１０分間、室温で遠心分離した。血清を集め、パックした血液細胞を１００ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した。リンパ球沈殿物の１５ｍｌのアリコートを、４ｘ５０ｍｌの遠心管内に置き、それぞれの上に２５ｍｌの希釈した血液を注意深く積層させた。９４２ｇで３０分間、室温で遠心分離したのち、界面の細胞を集め、同容量のＨＢＳＳで洗浄し、３５０ｇで１０分間、室温で遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁し、患者当りの収量４．５ｘ１０⁷から６ｘ１０⁷の細胞を数えた。これらの細胞は、３５０ｇで１０分間、室温で遠心分離し、次いで、１０％のジメチルスルホキシドを含む４．５ｍｌの自己血清に再懸濁した。この混合物の１．５ｍｌのアリコートを液体窒素保管庫に移した。短期系これらは、貯蔵した患者の細胞の３つのバイアル中の一つを用いて行った。細胞は、３７℃の水浴中に迅速に投げ入れ、次いで、培養液２５ｍｌで希釈し、さらに、３５０ｇで１０分間、室温で遠心分離した。次いで、ペレット状の細胞を、１０％の自己血清を含む２ｍｌの培養液に再懸濁し、計数し、細胞数を２ｘ１０⁶／ｍｌに調整した。ＨＰＶ１６Ｌ１の融合タンパク質（アミノ酸残基１９９ −４０９）を１０％の自己血清を含む培養液で希釈し、１００μｌ（１μｇ／ｍｌ）を９６穴の丸底のミクロタイタープレートの３０穴に分配した。１００μｌの細胞懸濁液（２ｘ１０⁵細胞）を各々の穴に加え、プレートは、加湿した５％ＣＯ₂大気中で１４日間３７℃にインキュベーションした。細胞培養液は、３日目および７日目に１００μｌの上澄液を除去し、それを５％自己血清および組換え型ＩＬ４（２５単位／ｍｌ，Ｓａｎｄｏｚ）および組換え型ＩＬ−４（４単位／ｍｌ，Ｇｌａｘｏ）を含む培地に、１１日目に５％の血清のみを含む培地に、取換えることによって栄養補給した。短期系での特異性アッセイ抗原特異性アッセイは、１４日目に行った。２５の短期系を調製し、一人の患者当り２０を試験した。２０の短期系のそれぞれを、上に示した、ＨＰＶ１６Ｌ１融合タンパク質（１μｇ／ｍｌ）；β−ガラクトシダーゼ（Ｇ−６００８，Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）１０μｇ／ｍｌ；（４）から（１２）の９種のＨＰＶ１６Ｌ１合成ペプチドのそれぞれ及び培養液に対して、試験した。ペプチドは、全アッセイにおいて１０μＭを用いた。細胞の計数は５つのプールした細胞系で行い、計数の平均を用いて、系当たりの細胞数（±２ｘ１０⁵細胞）を概算した。各々の細胞系は、自己由来の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｓ）（ＡＰＣ）存在下、９６穴の丸底ミクロタイタープレートに、上記の１１の抗原およびひとつの培地対照を重複させて準備した。後者は、液体窒素中に貯蔵した患者の細胞の残り２バイアルを溶解し、洗浄し、放射線照射（４０００ラド）した、溶解から２時間以内のものである。ＡＰＣ数は患者によって（± ２ｘ１０⁷細胞）異なり、アッセイでは２．５ｘ１５⁵ｍｌを用いた。ペプチドを培養液（１００μｌ／穴）に分配し、１００μｌの培養液中にＡＰＣｓ（２．５ｘ１０⁵ｍｌ）および細胞系（２−５ｘ１０ｍｌ）を加えた。プレートは５％のＣＯ₂存在下、３７℃で３日間インキュベーションし、次いで、２０μｌの［メチル−³Ｈ］チミジン（ＴＲＡ１２０、Ａｍｅｒｓｈａｍ；９．２５ＫＢｑ／穴）を加え、さらに１８時間インキュベーションした。標識したチミジンの取り込みは、収集した細胞を液体シンチレーションβ−スペクトロメーター（ＬＫＢ）で計数することによって測定した。データはそれぞれの細胞系における全抗原および対照培地での一分間当たりの壊変（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ）（ｄｐｍ）でプロットし、正の応答は、それぞれの系の対照培地の刺激指標（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｓ）（ＳＩ）が＞２．５であり、Δｄｐｍ（ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｄｐｍｏｖｅｒｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）（ｄｐｍのバックグラウンドとの差）が＞５００であることとした。正の応答は、短期系の１０％またはそれより多い、即ち２０の系の内２またはそれより多く、が抗原に対して正に応答する場合に、有意であると考えられた。 β−ｇａｌＨＰＶ１６Ｌ１融合タンパク質（アミノ酸１９９−４０９）および合成ペプチド（４）から（１２）に対する２４人の患者からの短期系のＴ細胞増殖応答を試験し、８人の未疾患の素質者の対照と比較した。結果を以下の表１に示した。表の結果は、１６／２４の患者のそれが、ペプチド３１１−３２５、３２１−３３５および３３１−３４５の一つあるいはそれより多くで増殖する事を示している。これらの３種のペプチドは、アミノ酸３２１−３２５および３３１−３３５で重複しているが、明らかに、これらは、それぞれ、それより前の配列及びそれに続く配列との前後関係において存在しなければならない。一人の患者のみが、単独のペプチド３２１−３３５に応答した。３１１−３２５と３３１−３４５との組み合わせは適当ではない：５人の患者のみが３１１−３２５単独、３３１− ３４５単独またはその組み合わせに応答した。明らかに、何人かの患者は３２１ −３２５付近のエピトープとの前後関係、即ち同じペプチドでは、３３１−３３５付近のエピトープと応答した。ペプチド３２１−３３５は２４人の患者のうち１１人に増殖を誘導した。他の患者（１２／２４）は、ペプチド３３１−３４５を通して、続く配列との前後関係において同じ３３１−３３５エピトープに応答した。ペプチド３２１−３３５および３３１−３４５の単純な組み合わせでは、８／２４のみに応答が誘導された。他の８人の正に応答する患者は、３１１−３２５ペプチドの提示を必要とした。これらの結果は、適度に短いペプチドを用いる場合、３種のペプチドの組み合わせが必要であるという本発明の発見の基礎を説明している。さらに、子宮頸部に疾患のある４１人の患者を試験し、１１人の疾病に罹っていない対照と比較した。結果を次の表２に示す。全患者は、１０またはそれより多いそれらの細胞系でＨＰＶ１６Ｌ１に応答し、全ペプチドへの応答が検出された。患者一人当たり応答する細胞系の最も大きい数は、ペプチド（１１）次いでペプチド（９）で検出された。子宮頸部生体組織検査用組織は、上記のアッセイに用いる血液サンプルを集めたように、同じコルプスコピー診療所での４１人の患者から、医療診断の目的で得た。これらの生体組織検査は、独立に、そして前に得られた上記のＴ細胞データの知識を伴わずに組織学的に等級付けされた。さらなる生体組織検査断片を、疾病活性の証拠を持つ選択された塊から後程切り出し、存在する任意のＨＰＶＤＮＡをＰＣＲによって検出およびタイプ分けした。結果を以下の表３に示す。４１人の生体組織検査のＨＰＶＤＮＡタイピングの結果、１３人（３１．７％）患者はＨＰＶＤＮＡが検出されず、１２人（２９．３％）は同定できない（タイプＸの）ＨＰＶＤＮＡ（即ち、ＨＰＶＤＮＡ陽性であるがＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１または３３型でない）であり、さらに、１２人（２９．３％）はＨＰＶ１６陽性（一人は、ＨＰＶ１６及び１８に混合感染していた）であった。残りの４人の患者のうち、３人（７．３％）はＨＰＶ１８陽性であり、一人（２．４％）はＨＰＶ３３陽性であった。また、患者の生体組織検査は、三種の組織学的カテゴリー、即ち不定型，ＣＩＮＩ及びＩＩまたはＣＩＮＩＩＩと名付けられたカテゴリーのうちの一つに分類された。不定型群（ｎ＝１０）のうち、同定された最も有力なＨＰＶの型はタイプＸ（６０％）であったが、これに対して生体組織検査の３３％がＨＰＶ陰性であることが分かった。同様のパターンはＣＩＮＩ／ＩＩ級の生体組織検査でも認められ、その内の４２％はＨＰＶ陰性であり、３５％はＨＰＶ−Ｘ型であった。高いグレードのＣＩＮＩＩＩ群（ｎ＝１７）のうち、患者の大多数はＨＰＶ１６（６４％）を保持していた。それ故、ＨＰＶ１６ＤＮＡ陽性患者とＣＩＮＩＩＩ級の病変の間には強い関連性（Ｐ＝０．０００１）がある。しかしながら、このグループのうちにもＨＰＶＤＮＡを全く認めることの出来ない患者が（２３％）いる。（ＨＰＶの型に関係なく）ＨＰＶＤＮＡ陽性のそれらの患者と組織学的級分けとの間には、明らかな相関関係は認められなかった。ＨＰＶ１８が認められる患者には、３つの組織学的クレードのすべてが認められ、ＨＰＶ３３を持つ只一人の患者はＣＩＮＩＩグレードの病変が認められるが、患者数は少ない（ｎ＝４）。また、表３では、ＨＰＶ１６Ｌ１ペプチドへの患者のＴ細胞増殖応答、それらの子宮頸部の生体組織検査の組織学およびＨＰＶのＤＮＡタイピングの結果について示している。患者のＨＰＶＤＮＡ陰性グループでは子宮頸部病変の３種の全カテゴリーに応答者（ｎ＝８）が認められ、そのうち７／８が不定形で低いグレードのＣＩＮＩ／ＩＩ病変に関連した。ＨＰＶＤＮＡ陽性の応答者は、４種のＨＰＶ型のカテゴリーのうち３種；ＨＰＶＸ（ｎ＝５）、ＨＰＶ１６（ｎ＝１２）およびＨＰＶ３３（ｎ＝１）；に認められた。Ｔ細胞増殖応答は、ＨＰＶ１８陽性グループの内には検出されなかった。最も著しい発見は、ＨＰＶ１６陽性の患者のすべては、一つまたはそれより多いペプチドに応答し、それらの９２％はＣＩＮＩＩＩ病変をもっている事である。残りの応答者は、ＣＩＮＩ／ＩＩ病変を持ち、患者は不定型のグループにはまったく認められなかった。カイ自乗試験による統計学的分析では、応答者とＨＰＶ１６ＤＮＡの存在との間の関連性に高い有意性（ｐ＝０．０００４）を示した。ＨＰＶ１６ＤＮＡ陽性の個人のＴ細胞応答とそれらの組織学的グレードとの間の関係は、非応答者が不在のために、示すことはできなかった。しかしながら、ＨＰＶＤＮＡ陽性の個々のＴ細胞応答とそれらの病変の組織学的グレードとの間には関連があった（ｐ＝０．００４）。

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＰＶ１６あるいはヒトパピローマウイルス類似物を原因とする、またはその様なＨＰＶが関係している、感染症の患者の治療に共同して用いるペプチドであって、長さ１５から２４のアミノ酸からなり、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の以下のアミノ酸配列：（１）配列番号：１＝アミノ酸残基３１１−３２５：またはその保存的修飾変異体；（２）配列番号：２＝アミノ酸残基３２１−３３５：またはその保存的修飾変異体；および（３）配列番号：３＝アミノ酸残基３３１−３４５：またはその保存的修飾変異体：からなる、あるいは含むペプチド。２．請求項１記載のペプチドであって、その内の任意の一つまたはそれより多くが、長さ１５から２２のアミノ酸である、該ペプチド。３．請求項２記載のペプチドであって、その内の任意の一つまたはそれより多くが、長さ１５から１８のアミノ酸である該ペプチド。４．請求項１記載した以外のさらなる任意の配列がＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質に隣接する配列である、請求項１、２または３記載のペプチド。５．キャリヤーまたは補助分子に結合させた形の、請求項１−４のいずれか１項に記載のペプチド。６．子宮頸部形成異常のヒトの患者の治療に共同して用いるための、請求項１ −５のいずれか１項に記載のペプチド。７．請求項１−５のいずれか１項に定義したペプチドのそれぞれからなる治療組成物。８．さらに治療に適当なキャリヤーまたは補助剤を含む、請求項７記載の組成物。９．請求項１に定義したような治療に用いるための、請求項７または８記載の組成物。１０．子宮頸部形成異常のヒトの患者の治療に用いるための、請求項７または８に記載の組成物。１１．子宮頸部形成異常の患者の治療に単独でまたは共同で用いるための１つから３つのペプチドであって、それのまたはそれぞれのペプチドは個々に長さ１５から３５のアミノ酸であり、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｌ１タンパク質、ペプチド、あるいは共同して用いうると考えられるペプチド類のアミノ酸配列からなる、または含む、（ＨＰＶ１６Ｌ１の３１１あるいは３４５から、それぞれ隣接するＮ末端側あるいはＣ末端側配列をのぞく）アミノ酸３１１−３４５の全配列からなるＨＰＶ１６Ｌ１配列を提供するペプチド。