ES2258869T3 - Particulas similares a virus para la induccion de autoanticuerpos. - Google Patents

Abstract

Una composición para romper la tolerancia que comprende: (a) una estructura capsomérica que tiene un ensamblaje simétrico de proteínas de cápsida; y (b) al menos un epítopo de células B de un tolerógeno unido a la estructura capsomérica para formar una estructura capsomérica presentadora de tolerógeno, en la que la estructura capsomérica presentadora de tolerógeno exhibe el tolerógeno sobre la superficie de la misma en una disposición ordenada repetitiva que tiene un espaciado de aproximadamente 100 angstroms.

Description

Partículas similares a virus para la inducción de autoanticuerpos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y a métodos para estimular una respuesta inmune de células B in vivo. Se proporcionan nuevas herramientas biológicas, productos terapéuticos y profilácticos que comprenden partículas similares a virus quiméricas o conjugadas y métodos de uso de los anteriores para el estudio, el tratamiento y la prevención de enfermedades humanas.

Antecedentes de la invención

Está bien establecido que las defensas inmunes del huésped entran en juego en diversas etapas de la enfermedad humana. Por ejemplo, durante la infección vírica, los anticuerpos estimulados en respuesta a inmunización previa pueden neutralizar los virus entrantes antes de la unión a y penetración en células diana sensibles. En el caso de que las células se infecten y exhiban antígenos asociados a virus sobre sus superficies, pueden activarse también las respuestas inmunes celulares. En este último caso, las células T citotóxicas pueden matar las células infectadas, limitando así la progresión de la infección. Estas respuestas inmunes humoral y celular se arman habitualmente contra la infección por una amplia variedad de virus, incluyendo virus que tienen genomas de ADN o ARN y cubiertas externas compuestas por cápsidas de proteína o envolturas de membrana.

El hecho de que los animales puedan armar respuestas inmunes vigorosas contra la mayoría de los antígenos extraños sin responder similarmente a los componentes de sus propios tejidos sugirió a Burnet y Fenner ("The Production of Antibodies", Macmillan Co., Melbourne (1949)) que el sistema inmune debe haber desarrollado algún mecanismo para distinguir lo propio de lo no propio. Existe indudablemente un estado de autotolerancia para los antígenos centrales a los que el sistema inmune está expuesto normalmente. (Véase Siskind, G., "Fundamental Immunology", ed. W.E. Paul, Raven Press, Nueva York, cap. 20 (1984)). Un "antígeno central" es un autoantígeno que está habitualmente expuesto a células del sistema inmune, mientras que un "antígeno periférico" es un autoantígeno que está habitualmente escudado del contacto con células del sistema inmune, por ejemplo mediante separación física. La incapacidad del sistema inmune de armar respuestas contra ciertos componentes de ojo, cerebro y testículos, por ejemplo, resulta de la segregación de estos tejidos del sistema inmune del huésped en lugar de autotolerancia. Es más, pueden aparecer respuestas autoinmunes cuando se comprometen las "barreras" físicas que mantienen estos antígenos de tejido periférico separados de la vigilancia inmune. Notablemente, el genoma vertebrado posee toda la información necesaria para producir anticuerpos dirigidos contra un autoantígeno; y pueden detectarse rutinariamente anticuerpos generados espontáneamente contra muchos autoantígenos. Sin embargo, estos anticuerpos son de bajo título, baja avidez y de clase IgM.

Varios investigadores creen que la autotolerancia implica el "aprendizaje" del sistema inmune para distinguir los componentes propios de los no propios, un fenómeno que aparece antes de la maduración aproximadamente en el momento del nacimiento. Se ha especulado que la exposición del sistema linfoide a autoantígenos durante el desarrollo fetal, por ejemplo, es una fase crítica para desarrollar tolerancia a los autoantígenos. Según otros modelos, los linfocitos que expresan receptores de superficie celular específicos del autoantígeno son eliminados se vuelven incapaces de activación o se "tolerizan" frente al antígeno.

El término "tolerancia de células B" se utiliza a menudo para describir un estado en el que el sistema inmune responde ineficazmente a la presencia de un antígeno (por ejemplo, un autoantígeno) o, más particularmente, cuando las células B del sistema inmune no consiguen armar una respuesta contra un antígeno. En consecuencia, un antígeno que está normalmente expuesto a células B pero no consigue inducir una respuesta de anticuerpo de alto título o que está asociado a una falta de respuesta normal por células B (por ejemplo, un autoantígeno), se designa como un "tolerógeno" porque el sistema inmune "tolera" su presencia. Claramente, los autoantígenos son tolerógenos, pero los antígenos extraños pueden volverse también tolerógenos cuando las células B no consiguen responder suficientemente frente al antígeno. Algunos investigadores creen, por ejemplo, que las infecciones víricas crónicas aparecen (por ejemplo persistencia vírica en bebés nacidos de madres portadoras del virus de la hepatitis B (HBV)) porque el sistema inmune se ha tolerizado contra los antígenos víricos. (Takashima et al., Immunology, 75: 398 (1992)). Los tolerógenos no son necesariamente moléculas enteras, sino que pueden ser porciones de moléculas (por ejemplo fragmentos peptídicos de proteínas) en regiones potencialmente inmunodominantes de una molécula. Aunque los investigadores han tenido éxito en la inducción de tolerancia en animales mediante diversas técnicas, nuestra comprensión de los modos de generar anticuerpos contra tolerógenos está en su infancia.

Sumario de la invención

Los inventores han descubierto composiciones y métodos de aumento de los títulos de anticuerpos contra tolerógenos (por ejemplo, autoantígenos y antígenos extraños) por encima de los títulos generados rutinariamente de forma espontánea o después de métodos convencionales de vacunación. En varias realizaciones, la ruptura de la tolerancia en células B se consigue utilizando un soporte o estructura capsomérica que tiene un ensamblaje ordenado de subunidades o proteínas de cápsida unidas al menos a un epítopo de célula B de un tolerógeno, en el que el tolerógeno se presenta en una disposición regular repetitiva. En algunos aspectos de la invención, el tolerógeno y la proteína de cápsida vírica derivan de diferentes organismos, virus o agentes infecciosos. El soporte puede ser una perla, una membrana lipídica o un polímero proteico. La estructura capsomérica puede tener simetría icosaédrica o helicoidal. Sin embargo, en composiciones deseables la estructura capsomérica consiste en proteínas de cápsida vírica que se autoensamblan formando una estructura organizada designada como "partícula similar a virus" o VLP.

En algunas realizaciones, las proteínas de cápsida vírica son moléculas híbridas o están modificadas de otro modo. Por tanto, algunas realizaciones son "partículas similares a virus (VLP) quiméricas" y otras son "partículas similares a virus (VLP) conjugadas", en las que las "VLP quiméricas" tienen un tolerógeno unido a la proteína de cápsida vírica (o su homólogo) mediante ingeniería genética (por ejemplo, creación de una fusión tolerógeno/proteína de cápsida) y las "VLP conjugadas" tienen un tolerógeno unido a la proteína de cápsida vírica (o su homólogo) mediante modificación química, física u otra de la proteína de cápsida o tolerógeno o ambos (por ejemplo, biotina/estreptavidina, biotina/avidina, otras secuencias de ligando/receptor). Por tanto, aspectos de la invención incluyen una composición que comprende un soporte que tiene un ensamblaje ordenado de subunidades y al menos un epítopo de células B de un tolerógeno unido al soporte para formar un inmunógeno presentador de tolerógeno, en la que el inmunógeno presentador de tolerógeno exhibe el tolerógeno en una disposición regular repetitiva. Otras composiciones de la invención comprenden una estructura capsomérica que tiene un ensamblaje simétrico de proteínas de cápsida y al menos un epítopo de células B de un tolerógeno unido a la estructura capsomérica para formar una partícula similar a virus (VLP) presentadora de tolerógeno, en la que la VLP presentadora de tolerógeno exhibe el tolerógeno en una disposición ordenada repetitiva. Otra realización de la invención se refiere a un complejo aislado que comprende una de estas composiciones unida a una célula del sistema inmune. Además, los productos farmacéuticos que comprenden estas composiciones son realizaciones de la invención.

Los métodos para generar anticuerpos contra un tolerógeno son también parte de la invención. Mediante un método, se generan anticuerpos contra un tolerógeno identificando un sujeto necesitado de anticuerpos contra un tolerógeno y proporcionando al sujeto una cantidad suficiente de una de las composiciones descritas anteriormente para generar anticuerpos contra el tolerógeno. Otro enfoque implica la identificación de agentes que generan autoanticuerpos. En consecuencia, se proporciona a un sujeto una de las composiciones anteriores, se aíslan anticuerpos del sujeto, se determina el título de los anticuerpos aislados en la etapa (b) que se unen al tolerógeno y se identifica el agente mediante la capacidad de generar anticuerpos de alto título. Adicionalmente, está dentro del alcance de la invención un método de generación de anticuerpos monoclonales contra un tolerógeno. Mediante este enfoque, se proporciona una de las composiciones descritas anteriormente a un sujeto y se prepara un hibridoma con una célula B del sujeto. Otros métodos incluyen un método de potenciación de la producción de anticuerpos contra un compuesto normalmente inmunogénico que comprende las etapas de seleccionar un antígeno que genera una respuesta de anticuerpo de bajo título en un sujeto, unir este antígeno a una VLP modificada para formar una VLP conjugada, en el que la VLP conjugada exhibe el antígeno en una disposición regular repetitiva, y proporcionar la VLP conjugada a un sujeto y generar así anticuerpos de alto título.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son gráficas lineales que muestran la reactividad de anticuerpo sérico en un ensayo ELISA. La Figura 1A muestra la reactividad de anticuerpo IgG frente a péptido CCR5 acoplado a BSA. La Figura 1B muestra la reactividad de anticuerpo IgG frente a VLP de BPV-1. Los símbolos representan los resultados utilizando sueros de ratones inoculados con partículas L1-CCR5 (\Box), partículas L1-CCR5 desnaturalizadas (\medcirc), o VLP de BPV-1 (\Delta) en presencia de coadyuvante de Freund, o partículas L1-CCR5 en ausencia de coadyuvante (\lozenge).

Las Figuras 2A-2G son histogramas ilustrativos del análisis citométrico de flujo de la unión a anticuerpo de células HeLa-MAGI transfectadas transitoriamente. Se transfectaron en las células constructos que codifican ADN de CCR5 (líneas sólidas gruesas) o, como control para la tinción de fondo, vector solo (histograma sombreado), 2 días antes de la tinción. (2A-2D) Células transfectadas con CCR5 de ratón o ADN de vector. (2E-2G) Células transfectadas con una quimera CCR5 humano/de ratón (HMHH) o ADN de vector. Las células se incubaron con IgG purificada de ratones inmunizados con L1-CCR5 (2A y 2E), IgG purificada de ratones inmunizados con VLP de BPV-1 (2B y 2F), o IgG purificada de ratones inmunizados con péptido CCR5 acoplado a KLH (2D). Como control, se tiñeron también células con un anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceína contra el 2º bucle EC de CCR5 humano (2C y 2F).

La Figura 3 es una gráfica de barras que representa el desplazamiento de RANTES humano iodado por sueros. Se transfectaron transitoriamente células HeLa-MAGI con mCCR5. Tres días después de la transfección, se incubaron las células con RANTES iodado 0,5 nM en ausencia o presencia de diluciones de sueros de ratón. Se determinó el RANTES iodado unido máximo ensayando la unión en ausencia de sueros, y corresponde aproximadamente a 2.550 cpm (indicado por la línea de puntos). Se determinó la unión no específica de RANTES iodado (aproximadamente 1.300 cpm) ensayando la unión en un exceso de 1.000 veces (500 nM) de RANTES humano frío (no iodado). Los datos representan la media de pocillos por duplicado de un experimento. Este ensayo se repitió en dos ocasiones para asegurar la reproducibilidad.

La Figura 4 es una gráfica lineal que muestra la inhibición de la infección por BaL de VIH-1 utilizando diluciones de sueros de L1-CCR5, sueros de VLP de BPV-1 o un anticuerpo monoclonal contra el segundo bucle EC de CCR5 humano (mAb182). Los sueros se reunieron a partir de tres animales. Se transfectaron transitoriamente células HeLa-MAGI, una estirpe celular indicadora de VIH-1 en la que los núcleos de las células infectadas se tiñen de azul, con una quimera CCR5 humano-de ratón (HMHH), que contiene el primer bucle EC de CCR5 de ratón en un fondo de gen CCR5 humano. Tres días después de la transfección, se incubaron las células con diluciones de sueros de ratón reunidos o anticuerpo durante 30 minutos a 4ºC. Se infectaron después las células con el aislamiento M-trópico de BaL de VIH-1. Tres días después de la infección, se calificaron las células infectadas contando el número de células azules en cada pocillo. Se determinó la inhibición de la infección por BaL de VIH-1 comparando el número de núcleos azules (infectados) en presencia de sueros frente al número de núcleos azules en ausencia de sueros. Los datos representan el promedio de pocillos por duplicado de un experimento. Para asegurar la reproducibilidad, se repitió este ensayo en al menos otras dos ocasiones, con resultados similares. Sueros de ratones inoculados con L1-CCR5 (\medcirc), ratones inoculados con VLP de BPV-1 (\Delta) o mAb182 (\Box).

La Figura 5 es una gráfica lineal que muestra la reactividad de anticuerpo sérico de primate en un ensayo ELISA. Los símbolos representan los resultados utilizando sueros de macacos inoculados con partículas L1-CCR5 con coaduyvante (\Box) o VLP de BPV-1 de tipo silvestre en ausencia de coadyuvante (\lozenge).

La Figura 6 es una gráfica lineal que muestra la unión de estreptavidina a VLP biotiniladas y no biotiniladas. Los símbolos representan (\Box) VLP biotiniladas conjugadas con estreptavidina (EA) de tipo silvestre, (\medcirc) VLP biotiniladas conjugadas con EA-TNF\alpha, (\blacksquare) VLP no biotiniladas conjugadas con EA de tipo silvestre y (\bullet) VLP no biotiniladas conjugadas con EA-TNF\alpha.

La Figura 7 es una gráfica de barras que muestra los resultados de un ensayo de toxicidad por TNF\alpha. Se incubaron sueros de ratones inoculados con una proteína de fusión estreptavidina-TNF\alpha (EA-TNF\alpha) unida a una VLP biotinilada con una estirpe celular sensible a TNF\alpha (L929) en presencia de TNF\alpha. Se utilizaron los sueros de ratones inoculados con estreptavidina unida a VLP biotinilada como control. La capacidad de las células. El suero de ratones inoculados con EA-TNF\alpha (por ejemplo, a 5% de concentración) demostró un aumento de tres veces del número de células supervivientes cuando se comparó con los niveles de fondo.

Descripción detallada de la invención

La invención descrita en la presente memoria se refiere a composiciones para aumentar los títulos de anticuerpos contra "tolerógenos", incluyendo autoantígenos y antígenos extraños, por encima de los títulos generados rutinariamente de forma espontánea o después de métodos de vacunación convencionales. Por "bajo título de respuesta de anticuerpo" se quiere indicar una respuesta de células B que da como resultado una cantidad insuficiente de anticuerpos para armar una respuesta inmune in vivo fisiológicamente eficaz, mientras que un "alto título de respuesta de anticuerpo" designa una cantidad suficiente de anticuerpos para armar una respuesta inmune in vivo fisiológicamente eficaz. Los términos "respuesta de anticuerpo de bajo título" y "respuesta de anticuerpo de alto título" se definen también según la concentración y avidez del anticuerpo producido. Es decir, que un antígeno produzca una "respuesta de anticuerpo de bajo título" o una "respuesta de anticuerpo de alto título" depende de la dilución de los sueros que contienen anticuerpo a la que el antígeno no es ya detectable en un ensayo ELISA en el que se utilizan típicamente 200 ng de antígeno diana con una dilución 1:1.000 de anticuerpo secundario. Por tanto, una "respuesta de anticuerpo de bajo título" es típicamente menor de aproximadamente una dilución 1:10.000 en las condiciones para ELISA descritas anteriormente, y una "respuesta de anticuerpo de alto título" es típicamente mayor o igual a una dilución 1:10.000. Debe entenderse que el término "tolerógeno" se utiliza a lo largo de esta descripción para designar un autoantígeno o antígeno extraño (péptido, ácido nucleico, carbohidrato o lípido) que está asociado a una falta de sensibilidad completa de células B o a una sensibilidad limitada de células B en la que el antígeno desencadena sólo una respuesta de anticuerpo de bajo título que no afecta sustancialmente a la actividad normal in vivo del antígeno.

En varias realizaciones, la ruptura de la tolerancia de células B se consigue utilizando un soporte o estructura capsomérica que tiene un ensamblaje ordenado de subunidades o proteínas de cápsida unido al menos a un epítopo de célula B de un tolerógeno, en el que el tolerógeno se presenta en una disposición regular repetitiva. En algunos aspectos de la invención, el tolerógeno y la proteína de cápsida vírica derivan de diferentes organismos, virus o agentes infecciosos. El soporte puede ser una perla, una membrana lipídica o un polímero proteico. La estructura capsomérica puede tener simetría icosaédrica o helicoidal. Sin embargo, en composiciones deseables, la estructura capsomérica consiste en proteínas de cápsida vírica que se autoensamblan formando una estructura organizada. Dichos ensamblajes de cápsida vírica se designan como "partículas similares a virus" o VLP.

En algunas realizaciones, las proteínas de cápsida vírica son moléculas híbridas o modificadas de otro modo. El término "partícula similar a virus" o "estructura capsomérica" se utiliza a menudo para designar una estructura organizada que comprende el autoensamblaje de disposiciones ordenadas de proteínas de cápsida que no incluyen un genoma vírico. A este respecto, algunas realizaciones son "partículas similares a virus (VLP) quiméricas" y otras son "partículas similares a virus (VLP) conjugadas". El término "VLP quimérica" designa una VLP en la que el tolerógeno está unido a la proteína de cápsida vírica (o su homólogo) mediante ingeniería genética (por ejemplo, creación de una fusión tolerógeno/proteína de cápsida). Por tanto, la fusión tolerógeno/proteína de cápsida se designa a menudo como una "proteína de cubierta híbrida" debido a que la proteína de cubierta vírica está quimerizada con una secuencia aminoacídica del epítopo de célula B de un tolerógeno. Según la nomenclatura utilizada en la presente memoria, se identifica una proteína de cubierta híbrida mediante el nombre de la proteína de cubierta vírica y la fuente del tolerógeno que se exhibe con relación a la proteína de cubierta vírica. El término "VLP conjugada" se utiliza para designar una VLP en la que el tolerógeno se une a la proteína de cápsida vírica (o su homólogo) mediante modificación química, física u otra de la proteína de cápsida o tolerógeno o ambos (por ejemplo, biotina/estreptavidina, biotina/avidina, otras secuencias de ligando/receptor).

La proteína de cubierta híbrida puede incorporar la secuencia aminoacídica del tolerógeno a su estructura primaria, como insertando la secuencia aminoacídica del tolerógeno en la secuencia aminoacídica de la proteína de cubierta vírica, o reemplazando la secuencia aminoacídica de la proteína de cubierta vírica por la secuencia aminoacídica del tolerógeno. El sitio de quimerización depende a menudo de la superficie externa de la VLP y de las regiones de la proteína de cubierta vírica que estén implicadas en el autoensamblaje. Este sitio puede corresponder al sitio de un epítopo neutralizante de virus, por ejemplo. Ha de entenderse que la proteína de cubierta híbrida puede tomar la forma de una proteína de cubierta única en ciertas realizaciones de la invención, un capsómero (5 proteínas de cubierta dispuestas en un pentámero) en otras realizaciones, o una VLP compuesta por múltiples proteínas de cápsida dispuestas en forma de una estructura particulada en realizaciones preferidas.

La proteína de cápsida vírica que comprende la estructura capsomérica de una VLP puede ser de muchos tipos diferentes de virus, pero las realizaciones deseables tienen proteínas que se encuentran en un virus que tiene estructura icosaédrica (por ejemplo, T= 7) y virus cuyo huésped reservorio natural es un mamífero y virus seleccionados de las familias de papilomavirus, poliomavirus o parvovirus. Las composiciones preferidas tienen un ensamblaje de cápsida que comprende una pluralidad de proteínas L1 de papilomavirus híbridas o modificadas.

Empleando la tecnología de VLP quimérica y conjugada dada a conocer en la presente memoria, pueden utilizarse varios enfoques para unir un tolerógeno a un soporte para crear muchas nuevas composiciones. En la mayoría de las realizaciones, la composición es un soporte "multimérico" en el que se unen más de una molécula de tolerógeno al soporte. En algunas realizaciones, sin embargo, se proporciona un soporte "multimerizado" en el que la porción de tolerógeno de la composición comprende una pluralidad del mismo dominio de tolerógeno fusionado en tándem. Además, son también realizaciones de la invención composiciones multiméricas que tienen tolerógenos multimerizados. En otras realizaciones, la composición es un soporte "compuesto" en el que se presentan más de un tipo de tolerógeno. Un experto en la técnica apreciará también que los soportes compuestos pueden ser multiméricos y pueden incluir tolerógenos multimerizados. Preferiblemente, las composiciones multiméricas, composiciones multimerizadas y composiciones compuestas y combinaciones de las mismas unen tolerógenos al soporte de una manera que optimiza la presentación a células del sistema inmune. Por ejemplo, las realizaciones presentan los tolerógenos en una disposición ordenada, estrechamente espaciada y repetitiva. Adicionalmente, algunas realizaciones incluyen engarces introducidos por ingeniería genética entre el soporte y la proteína de cápsida vírica (o su homólogo) o entre el tolerógeno y la proteína de cápsida vírica (o su homólogo) o ambos para reducir el impedimento estérico y potenciar la respuesta inmune óptima. Por tanto, algunas composiciones tienen una proteína de cápsida vírica (o su homólogo) o un tolerógeno o ambos que están unidos al soporte a través de un engarce.

Pueden unirse muchos tolerógenos diferentes al soporte incluyendo péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos. En algunas realizaciones, el tolerógeno es un autoantígeno. Por ejemplo, el tolerógeno puede ser un ligando tal como una proteína sobre la superficie de una célula neoplásica, o un factor de crecimiento tal como una proteína asociada a la angiogénesis, o un receptor vírico tal como el receptor quimiocina CCR5, y citocinas tales como TNF\alpha. Los fragmentos de estos tolerógenos "completos" son también deseables para algunas realizaciones. Es decir, en algunas realizaciones el tolerógeno puede ser una molécula entera (por ejemplo completa), pero lo más a menudo el tolerógeno comprende sólo una porción o fragmento de la molécula completa (por ejemplo parcial). Los tolerógenos deseables comprenden al menos 5 a 500 aminoácidos consecutivos de la molécula completa, ventajosamente 5 a 200, y preferiblemente 5 a 50. Preferiblemente, el tolerógeno y la proteína de cápsida vírica derivan de diferentes organismos, virus o agentes infecciosos. Otras realizaciones incluyen un complejo aislado que comprende una de las composiciones descritas anteriormente unida a una célula del sistema inmune (por ejemplo, una célula B, una célula T o una célula dendrítica) y un producto farmacéutico que comprende una de las composiciones descritas anteriormente.

Las composiciones, complejos aislados y productos farmacéuticos de la invención se utilizan como herramientas biológicas, productos terapéuticos y profilácticos para el estudio de la tolerancia de células B, la identificación de agentes que generan autoanticuerpos y el tratamiento y la prevención de enfermedades humanas tales como infección vírica, inflamación crónica y cáncer. En una realización, por ejemplo, se proporciona un método para identificar agentes que generan autoanticuerpos. Mediante este enfoque, se proporciona una composición de la invención a un sujeto, se aíslan después anticuerpos del sujeto, y se hace una determinación de si los anticuerpos aislados interaccionan con el tolerógeno presentado por la composición. Posteriormente, se identifica el inmunógeno como uno que rompe la tolerancia de células B por la capacidad de los anticuerpos aislados de interaccionar con el tolerógeno. En otra realización, se proporciona un método de generación de anticuerpos contra un tolerógeno en el que se identifica un sujeto necesitado de anticuerpos contra un tolerógeno y después se le proporciona una cantidad terapéuticamente beneficiosa de una composición de la invención. Adicionalmente, se proporcionan métodos de tratamiento y prevención de infección por VIH, infección vírica crónica, cáncer e inflamación que implican la etapa de proporcionar un producto farmacéutico que comprende una composición de la invención. Por ejemplo, el cáncer de mama y la artritis reumatoide pueden tratarse induciendo la producción de anticuerpos dirigidos contra ErbB-2 y TNF, respectivamente (Maini, R.N. et al., Imm. Reviews, 144: 195-223 (1995); Baselga, J. et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). Además, son realizaciones anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos a epítopos sobre las VLP quiméricas y conjugadas de la invención.

Se proporcionan evidencias de este descubrimiento en dos grupos de experimentos proporcionados a continuación. En una primera demostración ejemplar, se anuló la tolerancia de células B a antígeno central de receptor quimiocina de ratón (mCCR5) inmunizando ratones con VLP quiméricas que tienen el tolerógeno mCCR5. En estos experimentos, se incorporó un péptido que representa un bucle extracelular del receptor quimiocina de ratón CCR5 a un epítopo neutralizante de la proteína de cubierta L1 del papilomavirus bovino (BPV-1) mediante técnicas de clonación convencionales. L1 tiene la capacidad intrínseca de autoensamblarse en partículas similares a virus (VLP) que inducen altos niveles de anticuerpos neutralizantes incluso sin coadyuvante. (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 12180-12184 (1992); Greenstone, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 95, 1800-1805 (1998)). El receptor CCR5 se expresa en numerosos tipos celulares y tejidos, incluyendo células T de memoria y macrófagos. (Zhang et al., J. Virol., 72: 5035-5045 (1998)). Las proteínas quiméricas producidas recombinantemente denominadas "L1-CCR5" se autoensamblaron en estructuras particuladas que tenían una disposición ordenada de capsómeros (designadas en adelante en la presente memoria como partículas similares a virus o VLP) que se utilizaron como inmunógenos. Los expertos en la técnica apreciarán que CCR5 es conocido por ser el correceptor para cepas M-trópicas de VIH, y que los anticuerpos monoclonales contra CCR5 humano bloquean la infección por VIH de células humanas in vitro.

Como se detalla a continuación, los ratones administrados con el inmunógeno L1-CCR5 produjeron autoanticuerpos que se unían a CCR5 de ratón nativo, inhibían la unión del ligando RANTES y bloqueaban la infección por VIH-1 de una estirpe celular indicadora que expresaba una quimera CRR5 humano-de ratón. También se muestra que los efectos a largo plazo del protocolo de tratamiento sobre los ratones fueron mínimos. Además, se demuestra que pueden producirse autoanticuerpos contra CCR5 en primates. Estos experimentos proporcionan evidencias de que puede romperse la tolerancia de células B a un autoantígeno de superficie celular que ha coevolucionado con un sistema inmune. Estas nuevas composiciones pueden incorporarse a productos farmacéuticos y pueden utilizarse para tratar y/o prevenir infección por VIH.

En un segundo grupo de experimentos, se proporcionan evidencias de que la producción de autoanticuerpos contra factor de necrosis tumoral (TNF\alpha) puede inducirse inoculando un sujeto con VLP conjugadas que comprenden un fragmento de TNF\alpha. El inmunógeno se creó uniendo una proteína de fusión estreptavidina/TNF\alpha (EA-TNF\alpha) a VLP de L1 biotiniladas. Los ratones inoculados con VLP conjugadas de EA-TNF\alpha produjeron autoanticuerpos que neutralizaron los efectos del TNF-\alpha en una estirpe celular sensible a TNF\alpha (células L929). Estas nuevas composiciones pueden incorporarse a productos farmacéuticos y pueden utilizarse para tratar y/o prevenir enfermedades inflamatorias crónicas y otras enfermedades asociadas a una liberación excesiva de TNF\alpha incluyendo, pero sin limitación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cáncer, esclerosis diseminada, diabetes, psoriasis, osteoporosis y asma. En la descripción a continuación y los ejemplos siguientes, se discuten estos dos grupos de experimentos con mayor detalle.

Una VLP quimérica que rompe la tolerancia inmune e inhibe la infección por VIH

Mientras se investigaba si pueden inducirse autoanticuerpos contra un autoantígeno, se descubrió que la tolerancia de células B puede anularse disponiendo el antígeno en un contexto que imite la superficie ordenada de una partícula vírica. En los experimentos iniciales, se insertó el receptor quimiocina de ratón mCCR5 en un sitio inmunodominante de la proteína de cubierta L1 de papilomavirus bovino. La proteína recombinante se denominó "L1-CCR5", que es una proteína L1 quimérica autoensamblante que incluye una pluralidad de aminoácidos que codifican un epítopo de CCR5. Se seleccionaron papilomavirus porque son inmunógenos altamente específicos. Cada especie vertebrada es infectada por un grupo distinto de papilomavirus, comprendiendo cada grupo varios tipos de papilomavirus. Los anticuerpos neutralizantes contra los viriones de un tipo de papilomavirus habitualmente no confieren inmunidad contra otro
tipo.

Los papilomavirus son ejemplos de virus sin envoltura que replican en los epitelios de una amplia variedad de especies animales dando como resultado la formación de tumores o verrugas epiteliales y fibroepiteliales benignos. Las partículas de papilomavirus son de aproximadamente 55 nm de diámetro y encapsulan un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 8 kb contenido en un núcleo de nucleohistona (Baker et al., Biophys. J., 60: 1445 (1991)). Las cápsidas están compuestas por dos proteínas codificadas víricamente, L1 y L2, que migran en geles PAGE-SDS aproximadamente a 55 kDa y 75 kDa, respectivamente (Mose Larson et al., J. Virol., 61: 3596 (1987)). La proteína de cápsida principal L1 está dispuesta en 72 pentámeros que se asocian con simetría icosaédrica T=v7. Hay aproximadamente 12 proteínas de cápsida L2 por virión (Baker et al., Biophys. J., 60: 1445 (1991)).

La proteína L1 tiene la capacidad de autoensamblarse, de modo que pueden generarse grandes cantidades de partículas similares a virus (VLP) mediante la expresión de la proteína L1 a partir de un papilomavirus dado en una variedad de sistemas de expresión recombinante (Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 12180 (1992) (BPV-1, sistema de expresión de baculovirus); Hagensee et al., J. Virol., 67: 315 (1993) (HPV-1, sistema de expresión de virus vaccinia); Kirnbauer et al., J. Virol., 67: 6929 (1993) (HPV-16, sistema de expresión de baculovirus); Rose et al., J. Virol., 67: 1936 (1993) (HPV-11, sistema de expresión de baculovirus); Sasagawa et al., J. Virol., 206: 126 (1995) (HPV-16, sistema de expresión de levadura); Nardinelli-Haefliger et al., Infection and Immunity, 65: 3328 (1997) (HPV-16, sistema de expresión bacteriano)). Aunque no es necesaria para el ensamblaje, L2 se incorpora a las VLP cuando se coexpresa con L1 (VLP de L1/L2) en células.

La inmunización de conejos con viriones nativos de VLP de L1, pero no con proteínas L1 desnaturalizadas, induce altos títulos de anticuerpos séricos neutralizantes (Christensen et al., J. Viriol., 64: 3151 (1990); Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180 (1992); Pilacinski et al., Bio/Technology, 2: 356 (1984); Segre et al., Am. J. Vet. Res., 16: 517 (1955)). Los anticuerpos neutralizantes policlonales y monoclonales generados contra partículas nativas reconocen epítopos conformacionalmente dependientes (Christensen et al., Virus Res., 28: 195 (1993); Christensen et al., Virology, 181: 572 (1991)). Aunque la naturaleza de la respuesta inmune humoral contra antígenos de papilomavirus está bien establecida, nadie apreciaba o esperaba que la geometría ordenada de las VLP de L1 pudiera explotarse para presentar un tolerógeno al sistema inmune de manera que se promueva una respuesta inmune potente y, por tanto, se rompa la tolerancia de células B.

La generación de partículas L1-CCR5 quiméricas requería la inserción del péptido CCR5 en una región de L1 que no desestabilizara la capacidad de L1 de formar partículas. (Véase el ejemplo 1). Aunque la localización estructural y función precisa de la mayoría de los aminoácidos de L1 no son conocidas, se han cartografiado los cambios aminoacídicos que desestabilizan los epítopos neutralizantes de diversos papilomavirus humanos sin afectar al ensamblaje de cápsida en tres regiones no contiguas de L1. (Ludmerer, S.W., Benincasa, D. y Mark III, G.E., J. Virol., 70: 4791-4794 (1996); Ludmerer, S.W., et al., J. Virol., 71: 3834-3839 (1997); Roden, R.B. et al., J. Virol., 71: 6247-6252 (1997)). Como era probable que los aminoácidos en estos sitios estuvieran sobre la superficie de la cápsida, los sitios análogos en L1 de BPV-1 se hicieron dianas para inserción de péptido. Por lo tanto, se construyeron tres quimeras L1-CCR5 en las que la secuencia L1 en los aminoácidos 130-136, 275-285 o 344-350 de L1 de BPV-1 se reemplazó por una secuencia que se predecía que codificaba un péptido de 16 aminoácidos correspondiente al primer bucle EC de CCR5 de ratón (mCCR5) a partir de ratones C57BI/6 (B6). Estas quimeras se designaron quimeras L1-CCR5 1, 2 y 3, respectivamente.

Se generaron baculovirus recombinantes que contenían quimeras L1-CCR5, y se purificaron las partículas L1-CCR5 resultantes mediante centrifugación en gradiente (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 12180-12184 (1992)). Para determinar si las moléculas L1-CCR5 quiméricas se ensamblaban en VLP, capsómeros u otras formas particuladas, se realizó una cromatografía de filtración en gel Superose 6 en preparaciones de las tres quimeras L1-CCR5. (Véase el ejemplo 2). Sólo las preparaciones de quimera L1-CCR5 1 eluyeron en una fracción indicativa de una estructura particulada ensamblada. Por lo tanto, el análisis adicional se limitó a esta quimera. El examen de partículas de quimera 1 mediante microscopía electrónica reveló muchas partículas que eran menores que las VLP de L1 de tipo silvestre, aproximadamente 28 nm frente a 55 nm. Morfológicamente, las partículas quiméricas L1-CCR5 se parecían a las cápsulas de poliomavirus 12 ICOSA (partículas T= 1), que están compuestas por una disposición regular de 12 capsómeros pentaméricos de la proteína de cubierta principal de poliomavirus VP1, y pueden generarse tras el reensamblaje in vitro de capsómeros VP1 a alta fuerza iónica (Salunke, D., Caspar, D.L.D. y Garcea, R.L., Biophysical Journal, 56: 887-900 (1989)). Se encuentran a menudo partículas pequeñas de tamaño similar a las partículas L1-CCR5 como componente minoritario de preparaciones de VLP de L1 de BPV-1 de tipo silvestre.

Para examinar si las partículas quiméricas CCR5 podrían inducir anticuerpos anti-CCR5, se vacunaron ratones C57B1/6 (una cepa que codifica la secuencia CCR5 idéntica a la secuencia de inserto) con partículas L1-CCR5, proteína L1-CCR5 desnaturalizada o VLP de tipo silvestre. (Véase el ejemplo 3). Se ensayó en sueros de estos ratones la reactividad frente a péptido CCR5 y VLP de tipo silvestre mediante ELISA (FIG. 1A). Los sueros de ratones control inoculados con VLP de tipo silvestre no tenían reactividad ELISA anti-CCR5, pero la inoculación con partículas L1-CCR5 indujo sueros con altos títulos ELISA anti-CCR5. Estos títulos estaban en el intervalo de 3 x 10^{3} a 3 x 10^{4} en los tres animales inoculados en combinación con coadyuvante de Freund, y medían 3 x 10^{3} en los dos animales inoculados sin coadyuvante. En contraposición, no se detectaron anticuerpos específicos del péptido CCR5 en ratones inoculados con partículas L1-CCR5 desnaturalizadas en combinación con coadyuvante. La falta de reactividad de las partículas L1-CCR5 desnaturalizadas estaba limitada al péptido CCR5, puesto que el material desnaturalizado desencadenó altos títulos de anticuerpos anti-L1 (Fig. 1B).

Aunque estos resultados proporcionaron evidencias de que las partículas L1-CCR5 desencadenan anticuerpos contra el péptido CCR5, existía la posibilidad de que estos anticuerpos no pudieran reconocer al péptido en su conformación nativa como parte de mCCR5 asociado a membrana. Para eliminar esta posibilidad, se realizó un experimento en el que se ensayaba la capacidad de anticuerpos anti-CCR5 de unirse a mCCR5 sobre células mediante análisis citométrico de flujo (FACS). (Véase el ejemplo 4). No pudo evaluarse la unión de sueros de partículas L1-CCR5 a mCRR5 expresado sobre células T primarias y macrófagos de ratón debido a los altos niveles de unión de IgG de ratón no específica a estas células. Como alternativa, se expresó transitoriamente mCCR5 clonado de ratones B6 en células HeLa-MAGI mediante transfección, y se midió la unión de IgG de ratón purificada respecto a células transfectadas con vector (Fig. 2A-2G). Mediante este ensayo, la IgG de ratones inmunizados con L1-CCR5 se unía específicamente a las células transfectadas con mCCR5 (Fig. 2A), mientras que no había unión significativa con IgG purificada de sueros de VLP de BPV de tipo silvestre (Fig. 2B) o con un anticuerpo monoclonal (mAb182) que se une al segundo bucle EC de CCR5 humano (h). (Fig. 2C). Como control para la especificidad de anticuerpo, se inocularon ratones con péptido mCCR5 acoplado a hemocianina de lapa bocallave (KLH). Aunque estos ratones generaron una respuesta de anticuerpo anti-péptido CCR5, con títulos ELISA de 10^{5} contra el péptido CCR5 acoplado a albúmina de suero bovino (BSA), la IgG purificada de los sueros de estos ratones no consiguió unirse a células que expresan mCCR5 (Fig. 2D). Por tanto, los anticuerpos inducidos por L1-CCR5, en contraposición con los inducidos por el péptido acoplado a KLH, funcionan como autoanticuerpos verdaderos en que se unen a mCCR5 nativo.

Como otro enfoque para examinar la capacidad de los anticuerpos de unirse a mCCR5 nativo, se examinó si los sueros L1-CCR5 podían competir con un ligando quimiocina de mCCR5 en la unión a células HeLa-MAGI transfectadas transitoriamente con mCCR5 (Fig. 3). (Véase el ejemplo 5). Las quimiocinas de ratón MIP-1, MIP-1\beta y RANTES son ligandos de mCCR5. Además, los homólogos humanos de MIP-1\beta y RANTES son capaces de unirse a mCCR5 (Meyer, A., et al., J. Biol. Chem., 271: 14445-14451 (1996); Nibbs, R.J.B., et al., J. Biol. Chem., 272: 12495-12504 (1997)). En el ensayo de competición, se utilizó RANTES humano yodado disponible comercialmente. Una dilución 1:30 de sueros L1-CCR5 desplazó aproximadamente un 66% del RANTES humano yodado (similar al desplazamiento observado utilizando un exceso de 100 veces de RANTES frío), comparado con un 37% de desplazamiento con una dilución 1:30 de sueros VLP de L1 de tipo silvestre. Las diluciones 1:75 y 1:150 de L1-CCR5 desplazaron un 25% y un 17% del RANTES yodado, respectivamente, mientras que no se observó un desplazamiento significativo utilizando sueros control a estas diluciones. Los estudios previos han mostrado que MIP-1, MIP-1\beta y RANTES se unen al segundo bucle EC de hCCR5, puesto que su unión fue bloqueada por anticuerpo monoclonal contra este bucle, pero no por anticuerpo contra la terminación amino de hCCR5. (Wu, L., et al., J. Exp. Med., 186: 1373-1381 (1997)). Los resultados de estos experimentos proporcionan evidencias de que los anticuerpos que se unen al primer bucle EC de mCCR5, que está localizado entre estos dos sitios, pueden bloquear parcialmente la unión de RANTES, quizás debido a la proximidad de este bucle al segundo bucle EC.

Se ensayó también la capacidad de anticuerpos inducidos por L1-CCR5 de bloquear la infección por VIH-1 M-trópico. (Véase el ejemplo 6). La interacción entre la envoltura de VIH-1 y hCCR5 es compleja, probablemente dependiente de la cepa, y probablemente implica varias regiones EC de CCR5. Específicamente, estudios de anticuerpo monoclonal han implicado al segundo bucle EC y a la región terminal NH_{2} de hCCR5, y estudios de receptores quiméricos han indicado que el primer y tercer bucles EC de hCCR5 contribuyen también a su interacción con VIH-1 (Wu, L., et al., J. Exp. Med., 186: 1373-1381 (1997); Rucker, J. et al., Cell, 87: 437-446 (1996); Atchison, R.E. et al., Science, 274: 1924-1926 (1996); Alkhatib, G. et al., J. Biol. Chem. 272: 19771-19776 (1997); Picard, L. et al., J. Virol., 71: 5003-5011 (1997); Ross, T.M., Bieniasz, P.D. y Cullen, B.R., J. Virol., 72: 1918-1924 (1998)). Aunque mCCR5 no funciona como un correceptor de VIH-1, un receptor quimérico humano-de ratón (HMHH) que contiene el primer bucle EC de mCRR5 (la secuencia B6 de ratón) en un fondo de hCCR5, tiene actividad correceptora (aunque con baja eficacia) cuando se expresa en estirpes celulares humanas. (Kuhmann, S.E. et al., J. Virol., 71: 8642-8656 (1997)). Se utilizó este receptor quimérico para ensayar si sueros L1-CCR5 podrían bloquear la infección por VIH-1 M-trópico. Para confirmar que la IgG purificada de sueros L1-CCR5 se unía a HMHH, se realizó un análisis FACS en células HeLa-MAGI transfectadas transitoriamente con HMHH. Se obtuvo unión positiva con IgG de ratones L1-CCR5 y con un anticuerpo monoclonal control positivo que se une al segundo bucle EC de CCR5 humano, mientras que IgG de ratones VLP de L1 de tipo silvestre no se unía a HMHH (Fig. 2E-2G).

Basándose en estos resultados, se ensayó en sueros de ratones L1-CCR5 su capacidad de inhibir la infección de la cepa BaL M-trópica de VIH-1, en un ensayo de un solo ciclo de replicación, utilizando la estirpe celular indicadora MAGI. (Kimpton, J. y Emerman, M., J. Virol., 66: 2232-2239 (1992)). Cuando se infectaron con BaL de VIH-1 células indicadoras transfectadas transitoriamente con HMHH en presencia de sueros L1-CCR5, las diluciones de 1:15, 1:30 y 1:75 exhibieron un 65%, un 50% y un 45% de neutralización, respectivamente, de la infectividad (Fig. 4). A las mismas diluciones, los sueros control de ratones VLP de L1 de tipo silvestre exhibieron cierta neutralización no específica, pero fue sólo de un 25% a dilución 1:15 y un 15% a 1:30 y 1:75. En comparación, las células indicadoras infectadas con BaL de VIH-1 en presencia de diluciones de anticuerpo monoclonal de unión a hCRR5 (mAb182) (a una concentración inicial de 1 \mug/\mul) utilizado como control positivo, exhibieron una curva de neutralización similar (Fig. 5). Se ensayó también en los sueros L1-CCR5 la actividad de neutralización frente al aislamiento LAI de VIH-1 trópico de células T y, como se esperaba, no consiguió mostrar neutralización por encima de los niveles de fondo frente a este aislamiento.

Es una preocupación de la inducción de autoanticuerpos que dichos procedimientos pueden tener consecuencias nocivas a largo plazo para el animal inmunizado, incluyendo posiblemente estimulación antigénica incontrolada de la proteína CCR5 nativa. Sin embargo, en tres ratones que se monitorizaron durante un periodo de seis meses después de la inoculación de partículas L1-CCR5, se observó un descenso de dos a ocho veces del título de anticuerpos específicos de CCR5 durante este periodo; este descenso era aproximadamente equivalente al descenso paralelo en el título de anticuerpos específicos de L1. Dos de los animales exhibieron descensos de dos veces en los títulos de anticuerpo anti-CCR5 y un descenso de tres veces de los títulos de anticuerpo anti-L1. El tercer animal exhibió un descenso de ocho veces de su título anti-CCR5 y un descenso de diez veces de su título de anticuerpo anti-L1. Estos resultados proporcionan evidencias de que la exposición continuada a CCR5 nativo no conduce a la inducción continua de células B, presuntamente debido a que la proteína celular permanece en un contexto que es ignorado por el sistema inmune y, además, debido a que la respuesta anti-CCR5 depende exclusivamente de la exposición al péptido CCR5 sobre partículas L1-CCR5. Los ratones inmunizados mantuvieron el mismo peso que los ratones control, y las autopsias realizadas en dos de los ratones seis meses después del recuerdo final no revelaron ningún cambio patológico grande.

En seres humanos, CCR5 se expresa predominantemente en células T de memoria (CD3+, CD4+, CD26^{hi}). Adicionalmente, de 1 a 10% de los macrófagos del timo, bazo y nódulos linfáticos expresan CCR5. (Zhang, L. et al., J. Virol., 72: 5035-5045 (1998)). El análisis FACS de células mononucleares de ratón de bazo, timo y sangre periférica indicó que no había descenso de los subconjuntos de macrófagos y células T de bazo o sangre periférica que expresan CCR5 comparado con los ratones control. Por tanto, según los análisis, los ratones inmunizados con partículas L1-CCR5 no sufrían cambios patológicos grandes durante el periodo de observación.

Se obtuvieron más evidencias que apoyan los beneficios de utilizar VLP quiméricas para romper la tolerancia de células B en seres humanos, y específicamente para el tratamiento y la prevención de infección por VIH, a partir de estudios de primates en los que se produjeron autoanticuerpos contra un polipéptido CCR5 de macaco. (Véase el ejemplo 7). En estos experimentos, se preparó un constructo de expresión recombinante que codificaba una proteína de fusión L1-CCR5 de macaco. Se clonó el correspondiente péptido CCR5 humano/de macaco (son iguales) en el sitio idéntico en la proteína de cápsida principal L1 utilizada en los experimentos de ratón. A continuación, se evaluó el autoensamblaje de partícula de cápsida. Cuando se comparó con los experimentos previos con L1-CCR5 de ratón, la formación de partícula fue ineficaz con el L1-CCR5 quimérico de macaco. Sin embargo, se pudieron purificar suficientes partículas para inmunizar macacos cola de cerdo. Cuatro de los cinco animales que se vacunaron tres veces con la preparación, en presencia de coadyuvante Titer Max, produjeron claramente anticuerpos específicos de CCR5 medidos en un ensayo ELISA (Fig. 5). Se cree que puede generarse un mejor inmunógeno basado en VLP para generar autoanticuerpos contra CCR5 humano/de macaco encontrando otro sitio para la inserción del péptido CCR5 que exhiba el péptido extraño sobre la superficie de VLP y sea más compatible con el autoensamblaje. Adicionalmente, como se describe a continuación, se cree que las VLP conjugadas que tienen el tolerógeno CCR5 humano/de macaco inducirán una mejor respuesta inmune.

Los resultados del primer grupo de experimentos demuestran que la incorporación de un péptido de la porción EC de un antígeno central, mCCR5, a la disposición regular de una partícula de papilomavirus, seguido por inmunización de estas partículas, puede inducir autoanticuerpos que se unen al receptor y bloquean la unión de ligando y VIH-1. Los autoanticuerpos contra mCCR5 descendieron con el tiempo a una velocidad que era similar al descenso de los anticuerpos específicos de L1, sugiriendo que no se inducía la estimulación de células B por CCR5 endógeno de superficie celular.

Los antianticuerpos inducidos por partículas L1-CCR5 se unieron eficazmente a mCCR5 expresado sobre la superficie celular, indicando que funcionan como verdaderos autoanticuerpos. En contraposición, los anticuerpos inducidos por péptido CCR5 acoplado a KLH no consiguieron unirse a mCCR5 nativo. Es probable que la unión de autoanticuerpos no reconozca sólo esta secuencia aminoacídica particular, sino la secuencia de tolerógeno en su conformación nativa. Además, la IgG de ratones inmunizados con L1-CCR5 bloquea la unión de un ligando de CCR5 e inhibe la infección por VIH-1 a través de una proteína CCR5 quimérica que contiene el péptido CCR5 de ratón, demostrando adicionalmente la especificidad de estos autoanticuerpos y la utilidad terapéutica de aspectos de la invención. La inhibición observada en estas disposiciones era consistente, reproducible, específica y similar a un anticuerpo monoclonal control contra el segundo bucle EC de CCR5 humano.

El primer bucle EC de mCCR5 se eligió para las investigaciones iniciales porque permitía ensayar simultáneamente el enfoque de ruptura de la tolerancia de células B y proporcionar un nuevo método para inducir al cuerpo de un sujeto a inhibir la infección por VIH-1. Debido a que los individuos infectados por VIH-1 que son heterocigóticos de un alelo CCR5 inactivo tienen una progresión retardada del SIDA, incluso una reducción parcial de la expresión de CCR5 puede tener efectos clínicamente significativos. (Liu, R. et al., Cell, 86: 367-377 (1996); Samson, M. et al., Nature (Londres) 382: 722-725 (1996); Winkler, C. et al., Science, 279: 389-393 (1998)). Los resultados demuestran también que los primates tienen la capacidad de producir anticuerpos específicos de CCR5 a condición que el antígeno se presente en un inmunógeno apropiado.

No se observaron efectos adversos de inducción de autoanticuerpos en ratones seguidos durante seis meses desde la inoculación inicial. Aunque no se ensayaron las células T autorreactivas, no se esperaba romper la tolerancia de células B a CCR5. Las células T que reconocen autoantígenos centrales se seleccionan negativamente en gran medida durante el desarrollo del sistema inmune. Presuntamente, la ayuda de células T necesaria para el cambio de clase de inmunoglobulina para producir IgG anti-CCR5 está dirigida contra la proteína vírica ligada. A la inversa, en animales adultos hay una generación continua de anticuerpos con nuevas especificidades como resultado de la reactivación de RAG y la edición periférica de genes receptores de células B (Han, S. et al., Science, 278: 301-305 (1998); Papavasiliou, F. et al., Science, 278: 298-301 (1988); Hertz, M. et al., Nature, 394: 292-295 (1998)).

Una VLP conjugada que rompe la tolerancia inmune e inhibe la actividad TNF\alpha

El segundo enfoque para romper la tolerancia de células B implica el uso de VLP conjugadas construidas mediante la adición de tolerógenos a la superficie externa de VLP preformadas. Una vez ensambladas, las VLP y estructuras capsoméricas son bastante estables y la adición de tolerógenos grandes o pequeños puede conseguirse fácilmente. En contraposición con el enfoque de VLP quimérica, en el que el tamaño del tolerógeno es habitualmente pequeño debido a la perturbación del autoensamblaje, el enfoque de VLP conjugada permite el ensamblaje de tolerógenos mayores en la VLP, que proporcionarían más epítopos de anticuerpo y por tanto un conjunto más diverso de autoanticuerpos. Esta estrategia podría ser también aplicable a polipéptidos de secuencia y tamaño más variados que la inserción genética de las secuencias en la proteína de cápsida principal.

En los primeros experimentos utilizando el enfoque de VLP conjugada, se unió el tolerógeno TNF\alpha a VLP mediante una interacción biotina-estreptavidina. Se mostró que las VLP de L1 estaban fuertemente biotiniladas utilizando sulfo-NHS-biotina (Pierce), que biotinila los residuos de lisina expuestos. En condiciones saturantes, las VLP biotiniladas se unieron a estreptavidina a una relación de aproximadamente tres tetrámeros de estreptavidina por una molécula de L1. Este resultado proporcionó evidencias de que una proteína de fusión estreptavidina/tolerógeno podría presentarse al sistema inmune en forma de una disposición densa, ordenada y estrechamente empaquetada de epítopos.

En consecuencia, se generó en E. coli una proteína de fusión que comprendía el núcleo de estreptavidina ligado a un fragmento de veinte aminoácidos de longitud de TNF\alpha de ratón, designado como as-EA-TNF\alpha. La proteína de fusión se purificó en forma de cuerpos de inclusión insolubles, se solubilizó en HCl de guanidina y se replegó mediante diálisis en tampón fisiológico. Se unió después la proteína de fusión replegada a VLP de L1 biotiniladas, preparadas como se describe anteriormente, para crear el inmunógeno EA-TNF\alpha/VLP. La proteína de fusión EA-TNF\alpha se unió a VLP biotiniladas con alta ocupación (Fig. 6). A continuación, se inyectó el inmunógeno EA-TNF\alpha/VLP en ratones para desencadenar una respuesta de autoanticuerpo. Dos inyecciones de las VLP conjugadas en ratones (3 x 5 g) indujeron altos títulos de anticuerpos que se unieron a TNF de ratón nativo en un ELISA. (Véase la Tabla 1). En contraposición, la inmunización con EA-TNF\alpha solo o VLP sola no consiguió desencadenar una respuesta de anticuerpo consistente ni alta. (Véanse las Tablas 2 y 3). Después de una tercera inyección de EA-TNF\alpha/VLP, los títulos de anticuerpos contra TNF\alpha alcanzaron 10^{5} en todos los ratones.

TABLA 1 Títulos de ratón después de dos inmunizaciones con proteína AE-TNF\alpha acoplada a VLP biotinilada

EA-TNF\alpha/VLP
+ Coadyuvante	- Coadyuvante
10^{4}	10^{4}	10^{4}	40	160	160

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Títulos de ratón después de dos inmunizaciones con proteína AE-TNF\alpha sola

EA-TNF\alpha
+ Coadyuvante	- Coadyuvante
10^{2}	<10	<10	10	<10	<10

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Títulos de ratón después de dos inmunizaciones con VLP solas

VLP
+ Coadyuvante	- Coadyuvante
<10	<10	<10

Estos resultados establecieron que el inmunógeno EA-TNF\alpha/VLP rompía eficazmente la tolerancia de células B. Se obtuvieron más evidencias de que la VLP conjugada rompía eficazmente la tolerancia de células B a partir de ensayos de citotoxicidad de TNF\alpha. En estos experimentos, se determinó la capacidad del inmunógeno EA-TNF\alpha/VLP de prevenir la apoptosis mediada por TNF de una estirpe celular indicadora (células L929). Se incubaron con TNF\alpha sueros obtenidos a partir de ratones inoculados con VLP unidas a estreptavidina (controles) o EA-TNF\alpha/VLP, y se añadieron las muestras de TNF\alpha tratadas con sueros o no tratadas con sueros a células en cultivo. Se midió la capacidad de los sueros de neutralizar la actividad TNF\alpha mediante un aumento del porcentaje de células supervivientes. Los sueros de ratones inoculados con EA-TNF\alpha/VLP (a una solución al 5%) conducen a un aumento de tres veces de la supervivencia celular por encima de los valores de fondo (Fig. 7). Dados los resultados alentadores con las proteínas de fusión de TNF de ratón, se prepararon proteínas de fusión de estreptavidina similares para cada uno de los cuatro dominios extracelulares de CCR5 de macaco. Se han generado y purificado las cuatro proteínas de fusión a partir de cuerpos de inclusión
de E. coli. Se han podido replegar tres de las cuatro de tal modo que se unen fuertemente a VLP biotiniladas.

Como se muestra en la discusión anterior y en los ejemplos siguientes, una secuencia peptídica correspondiente a un tolerógeno puede anular la tolerancia de células B a la proteína nativa, cuando se presenta en un contexto de una disposición altamente organizada de capsómeros víricos quiméricos o conjugados ensamblados. La capacidad de anular la tolerancia de células B utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria tiene numerosas aplicaciones. Por ejemplo, esta técnica puede utilizarse para generar antiautoanticuerpos monoclonales de ratón. Adicionalmente, este enfoque es eficaz como medio para modular la actividad de una proteína soluble para examinar su función en procesos normales o patológicos en modelos animales experimentales. Además, la inducción de autoanticuerpos proporciona una alternativa eficaz a la terapia de anticuerpos monoclonales para enfermedades humanas, tal como en el tratamiento de cáncer de mama y artritis reumatoide, con anticuerpos dirigidos contra ErbB-2 y TNF, respectivamente (Maini et al., Immunol. Rev., 144: 195 (1995); Baselga, et al., J. Clin. Oncol., 14: 737 (1996)). La discusión siguiente describe más aspectos que se refieren a realizaciones de la invención.

Soportes y estructuras capsoméricas

Aunque las partículas similares a virus o estructuras capsoméricas representan un sistema preferido para suministrar autopéptidos al sistema inmune para estimular la producción de autoanticuerpos, se pretende que la invención abarque también otros ensamblajes estructurados que pueden presentar un tolerógeno en una disposición ordenada, estrechamente espaciada y repetitiva. Estos soportes tienen un ensamblaje ordenado de subunidades y permiten que al menos un epítopo de célula B de un tolerógeno se una al soporte en una disposición regular repetitiva. Preferiblemente, los soportes y estructuras capsoméricas son capaces de presentar antígeno con un espaciado de aproximadamente 10-500 angstroms, ventajosamente aproximadamente 50-300 angstroms, y preferiblemente aproximadamente 100 angstroms. Los antígenos independientes de T de tipo 2 modificados (TI-2) pueden comportarse como VLP a este respecto. Estos incluyen polisacáridos neumocócicos, flagelina polimerizada de Salmonella, dextrano y ficol conjugado con hapteno (polisacarosa).

Aunque se han empleado partículas similares a virus de papilomavirus en la demostración ejemplar presentada en la presente memoria, se contemplan también partículas similares a virus de otros papilomavirus y no papilomavirus para uso en la estimulación de la producción de autoanticuerpos. Se prevén también virus infecciosos. Los virus atenuados o inherentemente no patogénicos pueden modificarse de forma similar y utilizarse para generar autoanticuerpos. Los ejemplos de VLP quiméricas contemplados particularmente para uso con relación a la invención son aquellos descritos en Intervirology, 39: 1 (1996), incorporado a la presente memoria como referencia. Entre las VLP quiméricas contempladas para uso en la estimulación de la producción de autoanticuerpos están: BPV-1, HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV y COPV. Se contemplan también: parvovirus B19, partículas nucleares del virus de la hepatitis B, partículas de antígeno de superficie de hepatitis B, partículas gag de VIH, virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico del fríjol caupí, partículas T\gamma de levadura y fagos de ARN. Se han preparado partículas similares a virus, y pueden prepararse VLP quiméricas, para SV40, poliomavirus, adenovirus, herpes simplex, rotavirus y virus de Norwalk. Notablemente, los expertos en la técnica han determinado ya la secuencia nucleotídica completa de los genomas completos de muchos papilomavirus incluyendo: BPV-1, BPV-2, BPV-4, CRPV, DPV, EPV, HPV-1, HPV-5, HPV-6, HPV-8, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 y RhPV. Sin embargo, las proteínas de cápsida preferidas que se utilizan para construir las estructuras capsoméricas de realizaciones de la invención incluyen proteínas de virus icosaédricos o virus que tienen un huésped reservorio natural mamífero. Por tanto, son ya conocidas las secuencias polinucleotídicas que codifican muchas proteínas de cubierta principales y minoritarias que pueden utilizarse con relación a los métodos descritos en la presente memoria.

Ha de entenderse que las VLP que incluyen proteínas de cubierta principales y/o minoritarias pueden utilizarse para preparar composiciones inmunogénicas según los métodos dados a conocer en la presente memoria. En el caso particular de la proteína de cubierta minoritaria L2 de papilomavirus, ha de entenderse que las quimeras L2 pueden exponer el antígeno insertado sobre la superficie. Los antígenos diana son externos. Una fusión L2/E7 que se ha utilizado para generar anticuerpos de E7 de papilomavirus, cuando se incorpora a VLP, tiene los primeros 110 aminoácidos de L2 de BPV fusionados con la secuencia polipeptídica de E7 de HPV16 completa (Lowy et al., patente de EE.UU. nº 5.618.536, incorporada a la presente memoria como referencia). En este caso, la secuencia E7 se fusionó con un sitio de L2 que se había mostrado anteriormente que correspondía a un epítopo neutralizante de virus (Roden, et al., J. Virol., 68: 7570 (1994)). En la descripción siguiente, se proporcionan varios enfoques para unir tolerógenos a los ensamblajes ordenados de la invención.

Enfoques para preparar soportes o estructuras capsoméricas que presentan tolerógenos

Como se discute anteriormente, pueden emplearse en general dos enfoques diferentes para incorporar tolerógenos a las estructuras de partículas similares a virus. Mediante un enfoque, se crea primero un constructo genético que codifica una secuencia aminoacídica que incluye tanto secuencias de proteína de cubierta vírica como la secuencia de autopéptido de interés. El constructo resultante codifica un polipéptido quimérico único que exhibe el autopéptido sobre una superficie externa de una partícula después del autoensamblaje de la proteína de cubierta híbrida, formando estructuras capsoméricas o VLP. Según el segundo enfoque, el autopéptido exhibido sobre la superficie externa de la VLP está unido directa o indirectamente a una pluralidad de proteínas de subunidades que comprenden una VLP preformada. Por ejemplo, la proteína L1 de papilomavirus de tipo silvestre puede ser una proteína de cubierta recombinante acoplada a un primer agente de unión que tiene una constante de asociación por un segundo agente de unión en el intervalo de 10^{7}-10^{10}, de 10^{4}-10^{8}, de 10^{10}-10^{12}, o de 10^{12}-10^{16}. El segundo agente de unión puede adaptarse para acoplamiento al autopéptido. En una realización particularmente preferida de la invención, se producen primero VLP de tipo silvestre biotiniladas. Esto puede conseguirse biotinilando VLP preformadas. A continuación, se combinan las VLP biotiniladas con un autopolipéptido ligado a avidina o estreptavidina, formando complejos que tienen superficies sobre las que se exhibe el autopéptido. De este modo, se acoplan indirectamente múltiples copias del autopéptido con la VLP de tal modo que el autopéptido no se integra en el esqueleto peptídico de la proteína de cubierta. Por tanto, las composiciones que incluyen una proteína de cubierta híbrida ligada a un autopéptido como parte integral de la secuencia polipeptídica de proteína de cubierta híbrida, o indirectamente tal como mediante un enlace de biotina, se pretende que entren dentro del alcance de la invención.

Las realizaciones de la invención proporcionan deseablemente tolerógenos de tal forma o de tal modo que se consiga una afinidad, anulación de la tolerancia de células B o inhibición de un estado patológico (por ejemplo, infección vírica, neoplasia o inflamación) suficiente. Aunque un tolerógeno monomérico natural (es decir, un tolerógeno que presenta una molécula discreta, portando así sólo un número pequeño de epítopos), puede ser suficiente para conseguir una respuesta deseada, un tolerógeno sintético o un inmunógeno multimérico (por ejemplo, una VLP que presenta múltiples moléculas de tolerógeno, teniendo así un mayor número de los mismos epítopos) puede desencadenar a menudo una respuesta inmune mayor. Debe observarse que el término "multimérico" designa la presencia de más de una molécula idéntica sobre un soporte o estructura capsomérica. Por ejemplo, varias moléculas idénticas de CCR5 o fragmentos del mismo exhibidos sobre una VLP. El término multimérico debe distinguirse del término "multimerizado", que designa un soporte o estructura capsomérica unido a moléculas híbridas, en el que cada molécula híbrida comprende múltiples copias del tolerógeno o epítopos individuales del mismo unidos en tándem. Por ejemplo, cada tolerógeno multimerizado individual puede comprender un fragmento de 20 aminoácidos de longitud de CCR5 que se repite aleatoriamente con o sin engarces intercalados (por ejemplo, engarces de fago \lambda), y pueden unirse una pluralidad de tolerógenos multiméricos a un soporte o estructura capsomérica para formar un inmunógeno multimerizado/multimérico.

Puede obtenerse un inmunógeno multimérico (sintético o natural) que rompe eficazmente la tolerancia de células B uniendo tolerógenos a un soporte o una estructura capsomérica. Los soportes adecuados con este fin incluyen, pero sin limitación, perlas de poliacrilamida, perlas de agarosa, perlas de poliestireno, perlas magnéticas, partículas de látex, ensamblajes de carbohidrato (por ejemplo, perlas o ensamblajes basados en oligosacárido), ensamblajes lipídicos (por ejemplo, membranas lipídicas), ensamblajes o polímeros proteicos (por ejemplo, poli-L-lisina o poli-D,L-alanina) y otros soportes conocidos en la técnica por tener un ensamblaje organizado simétrico de subunidades. Pueden utilizarse también con algunas realizaciones vehículos inorgánicos tales como material de óxido de silicio (por ejemplo, gel de sílice, zeolita, tierra de diatomeas o vidrio aminado) a los que se une covalentemente el tolerógeno a través de un grupo hidroxi, carboxi o amino y un grupo reactivo sobre el portador.

En varias realizaciones, el tolerógeno se une al soporte o estructura capsomérica mediante un engarce, que puede ser un enlace entre dos especies químicamente reactivas, una interacción ligando/receptor o un péptido que se ha unido al tolerógeno para permitir la unión al soporte o estructura capsomérica o para proporcionar una mayor libertad de asociación del tolerógeno con una célula del sistema inmune. En algunas realizaciones, por ejemplo, el soporte o estructura capsomérica tiene una superficie hidrofóbica que interacciona con una porción del tolerógeno mediante una interacción hidrofóbica no covalente. En algunos casos, la superficie hidrofóbica del soporte es un polímero tal como plástico
o cualquier otro polímero en el que los grupos hidrofóbicos se han ligado tal como poliestireno, polietileno o polivinilo.

Adicionalmente, el tolerógeno puede unirse covalentemente a un soporte o estructura capsomérica incluyendo proteínas y oligopolisacáridos (por ejemplo, celulosa, almidón, glicógeno, quitosano o sefarosa aminada). En estas últimas realizaciones, se utiliza un grupo reactivo sobre un tolerógeno, tal como un grupo hidroxi o amino, para unirse a un grupo reactivo sobre el soporte o estructura capsomérica para crear el enlace covalente. Las realizaciones pueden comprender también un soporte con una superficie cargada que interacciona con el tolerógeno. Realizaciones adicionales comprenden un soporte que tiene otros grupos reactivos que se activan químicamente para unirse a un tolerógeno. Por ejemplo, se utilizan matrices activadas con bromuro de cianógeno, matrices activadas con epoxi, geles tio y tiopropilo, enlaces de cloroformiato de nitrofenilo y cloroformiato de N-hidroxisuccinimida o soportes acrílicos de oxirano (Sigma).

En otras realizaciones, se explota la interacción de biotina con moléculas similares a avidina (por ejemplo, estreptavidina y neutraavidina). Como se presentó anteriormente, las VLP pueden biotinilarse y pueden unirse fácilmente a proteínas de fusión tolerógeno/estreptavidina. Al insertar más moléculas de lisina o cisteína en las proteínas de cápsida, puede conseguirse una mayor biotinilación y, por tanto, puede añadirse más tolerógeno a la superficie de una VLP. Además, al utilizar técnicas de mutagénesis específica de sitio, pueden insertarse estratégicamente moléculas de lisina o cisteína para establecer una VLP que tenga una disposición densa y altamente organizada y repetitiva de tolerógenos. Como un experto apreciará inmediatamente, también puede realizarse lo contrario, es decir, el uso de fusiones de estreptavidina/proteína de cápsida y tolerógenos biotinilados. En otra realización, se insertan engarces \lambda de una longitud apropiada entre el tolerógeno y el soporte o estructura capsomérica para potenciar una mayor flexibilidad y superar cualquier impedimento estérico que pueda estar presente. La determinación de la longitud de engarce apropiada que permita una respuesta inmune óptima puede realizarse examinando el tolerógeno con engarces variables en los diversos ensayos descritos en la presente memoria.

Es también una realización un soporte compuesto que tiene más de un tipo de tolerógeno. Un "soporte compuesto" puede ser una estructura macromolecular utilizada para unir o inmovilizar dos o más tolerógenos diferentes. Los soportes compuestos están también construidos utilizando interacciones hidrofóbicas y enlaces covalentes formados a través de grupos reactivos, como se detalla anteriormente. Adicionalmente, se insertan engarces tales como engarces \lambda de una longitud apropiada entre los tolerógenos y el soporte en algunas realizaciones, para potenciar una mayor flexibilidad en la molécula y superar el impedimento estérico. La determinación de la longitud apropiada del engarce que permite una respuesta inmune óptima puede realizarse examinando los tolerógenos con engarces variables en los ensayos detallados en la presente descripción.

En otras realizaciones de la presente invención, los soportes multiméricos y compuestos discutidos anteriormente tienen unidos tolerógenos multimerizados para crear un "soporte multimérico multimerizado" y un "soporte compuesto multimerizado", respectivamente. Se obtiene una realización de un tolerógeno multimerizado, por ejemplo, creando un constructo de expresión que tiene dos o más secuencias nucleotídicas que codifican un tolerógeno unidas conjuntamente utilizando técnicas convencionales en biología molecular. La proteína de fusión expresada es una realización de un agente multimerizado, y se une después a un soporte. Un soporte que tiene muchos de dichos agentes multimerizados se denomina un soporte multimérico multimerizado. La forma multimerizada de un tolerógeno puede ser ventajosa para muchas aplicaciones debido a la capacidad para obtener un agente con una mejor capacidad de inducir una respuesta inmune, y por tanto, romper la tolerancia de células B. La incorporación de engarces o espaciadores tales como engarces \lambda flexibles entre los dominios proteicos de unión que constituyen el agente multimerizado puede ser también ventajosa para algunas realizaciones. La inserción de engarces \lambda de una longitud apropiada entre dominios de unión de proteína, por ejemplo, potencia una mayor flexibilidad en la molécula y supera el impedimento estérico entre los dominios. De forma similar, la inserción de engarces entre los tolerógenos multimerizados y el soporte potencia una mayor flexibilidad y reduce el impedimento estérico presentado por el soporte o estructura capsomérica. La determinación de una longitud apropiada del engarce que permita una respuesta inmune óptima puede conseguirse examinando los tolerógenos con engarces variables en los ensayos detallados en esta descripción. De forma similar, los soportes multiméricos multimerizados compuestos con y sin engarces pueden construirse uniendo más de un tolerógeno multimerizado diferente a un soporte.

Los sitios particularmente preferidos sobre las partículas similares a virus para insertar autoantígenos contra los que se desea una respuesta autoinmune son epítopos neutralizantes de virus. Esto es debido a que los epítopos neutralizantes de virus se disponen típicamente sobre la superficie del virus y están disponibles para la unión a anticuerpo. Estos rasgos son deseables para presentar autoantígenos al sistema inmune en el contexto estructural de una partícula similar a virus quimérica. Se han descrito métodos para identificar epítopos neutralizantes de papilomavirus por Ludmerer et al., en J. Virol., 70: 4791 (1997); Ludmerer et al., en J. Virol., 71: 3834 (1997) y por Roden et al., en J. Virol., 71: 6247 (1997). Generalmente, los métodos para identificar epítopos neutralizantes de virus pueden emplear un anticuerpo monoclonal que se une preferiblemente a una de las dos proteínas L1 estrechamente relacionadas y después preparan sistemáticamente recombinantes que reagrupan las diferencias aminoacídicas específicas entre ellos. Como alternativa, las secuencias polipeptídicas que codifican las proteínas L1 de virus relacionados, por ejemplo papilomavirus, pueden alinearse para identificar segmentos que son de longitud muy variable. Estas posiciones altamente variables estarán probablemente en bucles externos o internos de la proteína de cápsida. Los bucles externos serán candidatos para sustitución por secuencias polipeptídicas de autoantígenos para los que se busca una respuesta autoinmune. Por tanto, los epítopos neutralizantes de virus, como pueden identificarse fácilmente utilizando procedimientos rutinarios de laboratorio, son sitios preferidos para la disposición de autopéptidos en las VLP o estructuras capsoméricas de la invención. Por ejemplo, el sitio de un epítopo neutralizante de virus en BPV-1 sería un sitio preferido en una VLP correspondiente para la disposición de un autopéptido. En la sección a continuación, se proporciona una discusión del tamaño de los tolerógenos que pueden utilizarse con aspectos de la invención.

Tamaño de tolerógeno sobre el soporte o estructura capsomérica

Generalmente, el número de aminoácidos que representan el antígeno que se incorpora a la estructura de la proteína de cubierta vírica o que se une al soporte o estructura capsomérica debe ser suficientemente grande para corresponder a un epítopo que sea característico del antígeno, y que pueda ajustarse en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Puesto que se acepta generalmente que una disposición lineal de 5 a 6 aminoácidos es suficiente para unirse a un sitio de unión a antígeno, se prefiere que al menos 5 aminoácidos del autoantígeno se incorporen a la estructura del inmunógeno. Sin embargo, ha de entenderse que puede utilizarse también un número mayor de aminoácidos con buenos resultados. En el ejemplo presentado en la presente memoria, se introdujeron 16 aminoácidos de la proteína CCR5 de ratón en la estructura de una proteína de cubierta principal L1 con buenos resultados. Se contemplan también secuencias polipeptídicas más largas que representan tolerógenos para la integración en la estructura de la cubierta vírica para uso como inmunógenos para inducir reacciones antiautoinmunes. Por tanto, se prefiere que la partícula similar a virus inmunogénica incorpore secuencias de autopolipéptido de al menos 5 aminoácidos de longitud, pero la longitud del tolerógeno puede ser mayor de 200 aminoácidos y puede incluir una proteína completa. Es un intervalo deseable de 5 a 200 aminoácidos.

Se contempla que las VLP biotiniladas serán capaces de complejar con, y presentar al sistema inmune, péptidos que sean sustancialmente mayores de 16 aminoácidos de longitud. También es posible incorporar a la estructura de una proteína de cubierta minoritaria híbrida una secuencia polipeptídica que represente una proteína completa. Se describen a continuación la amplia variedad de tolerógenos que pueden presentarse como una realización de la invención.

Muchos tipos de tolerógenos pueden presentarse sobre un soporte o estructura capsomérica

La invención puede practicarse utilizando una amplia variedad de tolerógenos. En realizaciones preferidas, los tolerógenos son autoantígenos. Los autoantígenos preferidos incluyen aquellos para los que se ha mostrado que los anticuerpos diana contra el autoantígeno son un agente terapéutico eficaz. En general, el autoantígeno corresponderá a un autoantígeno del organismo que se inmuniza con la composición que incluye el autoantígeno ligado a la VLP. Por tanto, la secuencia de un autopéptido humano, tal como el receptor quimiocina CCR5 humano, puede introducirse en la estructura de una VLP para uso en la inmunización de seres humanos. De este modo, puede hacerse que seres humanos produzcan autoanticuerpos. Los ejemplos particulares de autoantígenos que pueden utilizarse son autoantígenos centrales tales como TNF y CLTA-4.

El TNF se ha implicado en una serie de enfermedades humanas, lo más notablemente como el efector soluble principal en artritis reumatoide (AR). (Maini et al., Imm. Reviews, 144: 195 (1995)). La artritis reumatoide es una enfermedad crónica y dolorosa de múltiples articulaciones que se cree que afecta aproximadamente a un 1% de la población del mundo. Los síntomas de la AR se tratan ineficazmente con terapia de fármacos. Esto ha impulsado el deseo de desarrollar estrategias terapéuticas alternativas que se dirijan a los efectores de la enfermedad en lugar de a los síntomas. La terapia de anticuerpo monoclonal anti-TNF ha producido una mejora dramática tanto en las medidas objetivas como subjetivas de la AR en ensayos clínicos humanos (Feldman et al., Annu. Rev. Immunol., 14: 397 (1996)). Desgraciadamente, los beneficios han probado ser transitorios, y esta pérdida de eficacia se ha correlacionado con el desarrollo de anticuerpos contra el anticuerpo monoclonal. Unido al hecho de que el TNF es una molécula soluble pequeña que es biológicamente activa a concentraciones séricas relativamente bajas, estas observaciones hacen al TNF una diana atractiva para una vacuna inductora de autoanticuerpo. Además, existe un buen modelo de ratón para AR mediada por TNF en el que ensayar el concepto (Thorbecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7375 (1992)).

El CTLA-4 es un receptor unido a membrana de células T que parece ser un regulador importante de la coestimulación mediada por B7 de células T (Thompson et al., Immunity, 7: 445 (1997)). La coestimulación es crítica para generar una respuesta eficaz de linfocitos T citotóxicos (CTL) mediada por células T CD8+. Si CTLA-4 actúa normalmente transmitiendo señales positivas o negativas después del enlace de B7, está actualmente sin resolver (Zheng, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6284 (1998)). Sin embargo, los anticuerpos contra CTLA-4 potencian claramente la generación de CTL en respuesta a antígenos tumorales en modelos de tumor de ratón. Por tanto, podría utilizarse una vacuna para inducir autoanticuerpos contra CLTA-4 para aumentar la respuesta inmune a tumores solos o en combinación con vacunas específicas de antígenos tumorales (Leach et al., Science, 271: 1734 (1996)). Notablemente, los síntomas de enfermedad autoinmune transitoria pueden ser efectos secundarios aceptables en pacientes que tienen cánceres ampliamente diseminados o inoperables que son insensibles a terapias convencionales.

Otros tolerógenos contemplados incluyen antígenos víricos de virus que infectan crónicamente a seres humanos incluyendo, pero sin limitación, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis B (HBV) y VIH, quimiocinas y moléculas asociadas a neoplasia y angiogénesis. Al utilizar las enseñanzas descritas en la presente memoria, un experto en la técnica puede presentar una variedad de diferentes tolerógenos, incluyendo ácidos nucleicos, péptidos, lípidos y carbohidratos, sobre VLP biotiniladas. Por ejemplo, puede emplearse un enfoque de sándwich en el que el ácido nucleico biotinilado se une primero a estreptavidina y después se une el complejo ácido nucleico/estreptavidina a una VLP biotinilada. De forma similar, utilizando química convencional, los lípidos pueden unirse a biotina, unirse a estreptavidina y unirse a VLP biotiniladas.

Se estableció la capacidad de romper la tolerancia de células B a compuestos orgánicos pequeños realizando experimentos sobre VLP biotiniladas. La biotina es una vitamina y un autotolerógeno en ratones. Se prepararon VLP biotiniladas, como se describen anteriormente, y se inyectaron estos inmunógenos en ratones como anteriormente. Se determinó la presencia de anticuerpos anti-biotina mediante un ensayo ELISA en el que se utilizó BSA biotinilada como antígeno diana. Como control negativo, se determinó la reactividad de sueros frente a BSA no biotinilada. Los anticuerpos anti-biotina en los sueros de tres ratones estuvieron a títulos de 100, 100 y 10, y no se detectó reactividad frente a la BSA no biotinilada.

Las composiciones descritas anteriormente pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas, por ejemplo, la unión a una célula aislada del sistema inmune, que puede proporcionar un sistema modelo para el estudio de la tolerancia de células B, pero se incorporan preferiblemente a productos farmacéuticos terapéuticos y profilácticos para el tratamiento y la prevención de enfermedades humanas. La descripción siguiente discute varias de las realizaciones terapéuticas y profilácticas de la invención.

Aplicaciones terapéuticas y profilácticas

Las composiciones de la invención son adecuadas para uso en el tratamiento de sujetos como medida preventiva para evitar enfermedades tales como cáncer, infección vírica o afecciones inflamatorias, o como producto terapéutico para tratar sujetos ya aquejados de estas enfermedades. Aunque cualquiera podría tratarse con los agentes de la invención como producto profiláctico, los sujetos más adecuados son gente con riesgo de enfermedades con mediadores accesibles a la unión a Ab.

Los compuestos farmacológicamente activos de esta invención pueden procesarse según métodos convencionales de farmacia galénica para producir agentes medicinales para administración a pacientes, por ejemplo mamíferos, incluyendo seres humanos. Pueden incorporarse a un producto farmacéutico con y sin modificación. Además, son aspectos de la invención la fabricación de agentes farmacéuticos o terapéuticos que suministran los inmunógenos de la invención por varias vías.

Los compuestos de esta invención pueden emplearse mezclados con excipientes convencionales, concretamente, sustancias vehículo orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para administración parenteral, entérica (por ejemplo oral) o tópica que no reaccionen perjudicialmente con las composiciones de la invención. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones salinas, alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácido graso de pentaeritritol, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse, y si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, sustancias colorantes, aromatizantes y/o aromáticas y similares que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos.

La dosis y el método de administración eficaces de una formulación particular pueden variar basándose en el paciente individual y en la etapa de la enfermedad, así como otros factores conocidos por los expertos en la técnica. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y DL50 (la dosis letal en el 50% de la población). La relación de dosis de efectos tóxico a terapéutico es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación DE50/DL50. Se prefieren composiciones farmacéuticas que exhiben altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios animales se utilizan en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

La dosificación exacta se elige por el médico individual a la vista del paciente que se va a tratar. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de resto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad de la enfermedad, la edad y el peso del paciente; la dieta, momento y frecuencia de administración, combinación(es) de fármaco, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia.

Las vías de administración incluyen, pero sin limitación, transdérmica, parenteral, gastrointestinal, transbronquial y transalveolar. Las vías parenterales de administración incluyen, pero sin limitación, inyección eléctrica o directa tal como inyección directa en una línea venosa central, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Las vías gastrointestinales de administración incluyen, pero sin limitación, ingestión y rectal. Las vías de administración transbronquial y transalveolar incluyen, pero sin limitación, inhalación por la boca o intranasal.

Las composiciones adecuadas para administración transdérmica incluyen, pero sin limitación, suspensiones, aceites, cremas y ungüentos farmacéuticamente aceptables aplicados directamente a la piel o incorporados a un vehículo protector tal como un dispositivo transdérmico ("parche transdérmico"). Los ejemplos de cremas, ungüentos, etc. adecuados pueden encontrarse, por ejemplo, en el "Physician's Desk Reference". Se describen ejemplos de dispositivos transdérmicos adecuados, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.818.540, expedida el 4 de abril de 1989 a Chinen et al., incorporada a la presente memoria como referencia.

Las composiciones adecuadas para administración parenteral incluyen, pero sin limitación, soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables. Dichas soluciones incluyen, pero sin limitación, solución salina y solución salina tamponada con fosfato para inyección en una línea venosa central, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.

Las composiciones adecuadas para administración transbronquial y transalveolar incluyen, pero sin limitación, diversos tipos de aerosoles para inhalación. Son también realizaciones dispositivos adecuados para administración transbronquial y transalveolar. Dichos dispositivos incluyen, pero sin limitación, atomizadores y vaporizadores. Muchas formas de atomizadores y vaporizadores actualmente disponibles pueden adaptarse fácilmente para suministrar las composiciones de la invención.

Las composiciones adecuadas para administración gastrointestinal incluyen, pero sin limitación, polvos, píldoras o líquidos farmacéuticamente aceptables para ingestión y supositorios para administración rectal. Debido a la facilidad de uso, la administración gastrointestinal, particularmente oral, es la realización preferida de la presente invención.

Se proporcionan varios agentes para uso en el tratamiento y la prevención de enfermedades humanas. En estos aspectos, las composiciones de la invención se incorporan a productos farmacéuticos y pueden administrarse a pacientes necesitados. Mediante un enfoque, un sujeto con riesgo de contraer infección por VIH u otra infección vírica crónica, o un sujeto ya infectado con VIH u otra infección vírica crónica, se identifica mediante ensayos de diagnóstico convencionales, y después se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente beneficiosa de un producto farmacéutico de la invención al sujeto. Puede emplearse un enfoque similar para tratar y/o prevenir enfermedades inflamatorias crónicas. Es decir, identificar un sujeto necesitado y administrar después un producto farmacéutico que comprende una composición de la invención. Otros métodos de la invención incluyen un enfoque para crear altos títulos de anticuerpos neutralizantes. En consecuencia, se identifican agentes (por ejemplo, una composición de la invención) por su capacidad de romper la tolerancia de células B y se administran posteriormente a un sujeto necesitado. Las realizaciones adicionales incluyen un método para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales en una composición de la invención. Estos nuevos anticuerpos pueden incorporarse también a productos farmacéuticos y administrarse a pacientes necesitados de tratamiento y prevención de enfermedades humanas. La descripción a continuación proporciona más discusión de estos enfoques.

Preparación de anticuerpos contra VLP quiméricas y conjugadas

Después de la construcción de una VLP quimérica o conjugada, estas composiciones pueden utilizarse para generar anticuerpos. (Véase el ejemplo 10). Los anticuerpos que reconocen una VLP quimérica o conjugada tienen muchos usos incluyendo, pero sin limitación, aplicaciones biotecnológicas, aplicaciones terapéuticas/profilácticas y aplicaciones de diagnóstico. Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos neutralizantes, concretamente aquellos que inhiben la adhesión mediada por CCR5, son especialmente preferidos para productos terapéuticos.

Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos huéspedes, incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, etc., mediante inyección con una VLP quimérica o conjugada. Dependiendo de la especie huésped, pueden utilizarse diversos coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos coadyuvantes incluyen, pero sin limitación, de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa bocallave y dinitrofenol. BCG (Bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvuum son coadyuvantes potencialmente útiles. Sin embargo, los inmunógenos basados en VLP pueden aumentar también el título de anticuerpos contra tolerógenos sin la adición de coadyuvantes.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra una VLP quimérica o conjugada utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante estirpes celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma descrita originalmente por Koehler y Milstein (Nature, 256: 495-497 (1975), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., Immunol. Today, 4: 72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026-2030 (1983) y la técnica de hibridoma EBV, Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss Inc., Nueva York, NY, pág. 77-96 (1985), todos los artículos incorporados a la presente memoria como referencia. Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayuste de genes de anticuerpo de ratón a genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad antigénica y actividad biológica apropiadas. (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); y Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985), todos los artículos incorporados a la presente memoria como referencia. Como alternativa, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE.UU. nº 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios dirigidos a una VLP quimérica o conjugada, incorporado a la presente memoria como referencia. Pueden producirse también anticuerpos induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o examinando las bibliotecas de inmunoglobulina recombinante o paneles de reactivos de unión altamente específica, como se da a conocer en Orlandii et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 3833-3837 (1989) y Winter G. y Milstein C., Nature, 349: 293-299 (1991), todos los artículos incorporados a la presente memoria como referencia.

Pueden generarse también fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específica para una VLP quimérica o conjugada. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero sin limitación, los fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2.} Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una identificación rápida y sencilla de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. (Huse W.D. et al., Science, 256: 1275-1281 (1989), incorporado a la presente memoria como referencia.

Mediante un enfoque, se preparan anticuerpos monoclonales contra una VLP quimérica o conjugada del modo siguiente. Brevemente, se inocula repetidamente un ratón con unos pocos microgramos de la proteína seleccionada o péptidos derivados de la misma durante un periodo de unas pocas semanas. Se sacrifica después el ratón, y se aíslan las células productoras de anticuerpo del bazo. Se fusionan las células de bazo en presencia de polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y se destruye el exceso de células no fusionadas mediante crecimiento del sistema en medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Se diluyen las células exitosamente fusionadas y se disponen alícuotas de la dilución en pocillos de una placa de microvaloración donde se continúa el crecimiento del cultivo. Se identifican los clones productores de anticuerpo mediante la detección de anticuerpo en el fluido sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de inmunoensayo tales como ELISA, como se describe originalmente por Engvall, E., Meth. Enzymol., 70: 419 (1980), incorporado a la presente memoria como referencia, y métodos derivados del mismo. Los clones positivos seleccionados pueden expandirse y recogerse su producto anticuerpo monoclonal para uso. Se describen procedimientos detallados para la producción de anticuerpo monoclonal en Davis, L. et al., "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevier, Nueva York, sección 21-2.

El antisuero policlonal que contiene anticuerpos contra epítopos heterogéneos de una proteína única puede prepararse inmunizando animales adecuados con la proteína expresada, o péptidos derivados de la misma, descrita anteriormente, que puede estar no modificada o modificada para potenciar la inmunogenicidad. La producción de anticuerpos policlonales eficaces está afectada por muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la especie de huésped. Además, los animales huéspedes varían en la respuesta al sitio de inoculaciones y dosis, dando como resultado dosis inadecuadas o excesivas de antígeno antisueros de bajo título. Las dosis bajas (nivel de ng) de antígeno administrado en múltiples sitios intradérmicos parece ser lo más fiable. Puede encontrarse un protocolo de inmunización eficaz para conejos en Vaitukaitis J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33: 988-991 (1971).

Pueden administrarse inyecciones de recuerdo a intervalos regulares, y recogerse el antisuero cuando el título de anticuerpo del mismo como se determina semicuantitativamente, por ejemplo, mediante doble inmunodifusión en agar frente a concentraciones conocidas del antígeno, empiece a bajar. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, O. et al., cap. 19 en "Handbook of Experimental Immunology", D. Wier (ed) Blackwell (1973). La concentración meseta del anticuerpo está habitualmente en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12 M). La afinidad de los antisueros por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva como se describe, por ejemplo, por Fisher, D., cap. 42 en "Manual of Clinical Immunology", 2ª ed. (Rose and Friedman, eds.), Amer. Soc. For Microbiol., Washington D.C. (1980). Las preparaciones de anticuerpo preparadas según cualquier protocolo son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias portadoras de antígeno en muestras biológicas; se utilizan también semicuantitativa o cualitativamente. Adicionalmente, puede utilizarse una VLP quimérica o conjugada para inducir la producción de anticuerpo en seres humanos, como se discute a lo largo de esta descripción. En consecuencia, puede unirse una VLP quimérica o conjugada a, o administrarse con, otra proteína, vehículo, soporte o coadyuvante para generar un producto farmacéutico o vacuna que inducirá una respuesta inmune potente.

El siguiente ejemplo describe los procedimientos que se utilizaron para preparar y expresar un polinucleótido que codifica una proteína L1-CCR5 quimérica que se autoensambla en estructuras capsoméricas. El procedimiento descrito a continuación implicaba modificar un polinucleótido que codifica L1 para incorporar una secuencia aminoacídica que codifica un fragmento de péptido CCR5. En esta demostración ejemplar, se insertaron separadamente dieciséis codones del primer bucle extracelular de CCR5 de ratón C57BI/6 (B6) (mCCR5) en una de las tres regiones de la secuencia L1 de BPV-1 correspondiente a los sitios de epítopos neutralizantes de virus. Las posiciones de estos epítopos se habían deducido anteriormente mediante alineamiento de secuencias polipeptídicas de diversos papilomavirus humanos. Las tres regiones no contiguas de L1 que recibieron la secuencia CCR5 se han descrito por Ludmerer et al., J. Virol., 70: 4791 (1996); por Ludmerer et al., J. Virol., 71: 3834 (1997) y por Roden et al., J. Virol., 71: 6247 (1997). Puesto que era probable que los aminoácidos en estos sitios se expresaran sobre la superficie de cápsida, se hicieron dianas sitios análogos en L1 de BPV-1 para la inserción de péptido. Esto aseguraba que la porción de la proteína L1 quimérica que incluía la secuencia peptídica de CCR5 sería expresada en superficie y estaría disponible para una presentación eficaz al sistema inmune humoral.

El ejemplo 1 describe el método utilizado para crear una proteína L1-CCR5 quimérica que se autoensambla en partículas antigénicas.

Ejemplo 1 Construcción de una proteína quimérica capaz de autoensamblaje en partículas antigénicas

Se prepararon polinucleótidos que codifican tres quimeras L1-CCR5 diferentes (designadas "quimera L1-CCR5 1", "quimera L1-CCR5 2" y "quimera L1-CCR5 3") mediante mutagénesis por PCR de extensión por superposición esencialmente según la técnica descrita por Ho et al., en Gene, 77: 51 (1989). Se clonó un polinucleótido que codificaba L1 de BPV-1 (Chen et al., Nature 299: 557 (1982)) en forma de un fragmento EcoRI/KpnI en sitios complementarios del sitio de clonación múltiple del vector de expresión de baculovirus pFastBac1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Se reemplazaron porciones de la secuencia L1 de BPV-1 en cada una de las tres quimeras por una secuencia que codificaba el primer bucle extracelular de mCCR5 de C57B1/6. La secuencia polipeptídica de la proteína mCCR5 tenía la secuencia: His-Tyr-Ala-Ala-Asn-Glu-Trp-Val-Phe-Gly-Asn-Ile-Met-Cys-Lys-Val (SEC ID Nº 1) (Boring et al., J. Biol. Chem., 271: 7551 (1996)). En la quimera L1-CCR5 1, la secuencia que codifica los aminoácidos 130-136 de L1 se reemplazó por la secuencia de mCCR5. En la quimera L1-CCR5 2, la secuencia que codifica los aminoácidos 275-285 de L1 se reemplazó por la secuencia de mCCR5. En la quimera L1-CCR5 3, la secuencia que codifica los aminoácidos 344-350 de L1 se reemplazó por la secuencia de mCCR5. Los clones finales se verificaron mediante análisis de digestión por restricción y mediante análisis de secuencia nucleotídica de la región amplificada por PCR.

Se generaron soluciones madre de baculovirus recombinantes que contenían los genes que codifican las proteínas L1-CCR5 quiméricas o L1 de BPV-1 de tipo silvestre utilizando el sistema baculovirus de GIBCO BRL, como se describe por el fabricante. Se purificaron partículas similares a papilomavirus a partir de células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante como se describe anteriormente (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 12180-12184 (1992); Greenstone, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1800-1805 (1998)). La morfología general de las preparaciones de partículas se analizó mediante un ensayo de movilidad utilizando una columna de filtración de FPLC de gel Superose 6 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Se recogió el eluído en fracciones de 1 ml. El volumen vacío de esta columna es de 8 ml. Previamente, se determinó que las VLP de L1 de tipo silvestre eluyen predominantemente en la fracción 9 de la columna, los capsómeros de L1 eluyen en la fracción 15 y los monómeros de L1 eluyen en las fracciones 19-21 (Okun, M.M., et al., enviado a publicación). Se ensayó en las fracciones de columna la presencia de L1 mediante transferencia Western.

El ejemplo 2 describe los métodos utilizados para confirmar que una proteína L1-CCR5 quimérica se autoensamblaba en estructuras capsoméricas. De forma interesante, se mostró mediante microscopía electrónica que las partículas L1-CCR5 descritas a continuación son algo menores que las VLP formadas por proteína L1 de tipo silvestre.

Ejemplo 2 Preparación de estructuras capsoméricas quiméricas

Se aislaron las tres quimeras de L1-CCR5 anteriormente descritas mediante cromatografía FPLC en columna de filtración de gel SUPEROSE 6 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Se ensayó en fracciones de columna de 1 ml cada una la presencia de L1 mediante transferencia Western utilizando un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes. Los procedimientos de control indicaron que las VLP de L1 de tipo silvestre eluían en la fracción de columna 9, que los capsómeros de L1 eluían en la fracción 15 y que los monómeros de L1 eluían en las fracciones 19-21. La proteína L1-CCR5 de las preparaciones de las quimeras 2 y 3 se detectó predominantemente en la fracción 15. Estos resultados sugerían que las proteínas quimera de L1-CCR5 2 y quimera de L1-CCR5 3 no conseguían ensamblarse en estructuras de orden superior. Basándose en estos resultados, se seleccionó la quimera L1-CCR5 1 para procedimientos posteriores. Se examinaron partículas purificadas utilizando microscopía electrónica adsorbiendo en primer lugar las partículas en rejillas recubiertas con carbono, tiñendo con acetato de uranilo al 1% y examinando después la rejilla utilizando un microscopio electrónico Philips modelo EM 400RT a 36.000 aumentos.

Los resultados de estos procedimientos indicaron que la proteína quimera L1-CCR5 1 eluía en una fracción de columna conocida por contener estructuras particuladas ensambladas. El examen de partículas de quimera 1 mediante microscopía electrónica reveló que las partículas tienen diámetros de aproximadamente 28 nm, mientras que las VLP de L1 de tipo silvestre tenían diámetros de aproximadamente 55 nm. El diámetro de 28 nm sugiere que las partículas estaban compuestas por 12 capsómeros, mientras que las estructuras de mayor diámetro formadas por proteínas L1 de tipo silvestre estaban compuestas por 72 capsómeros. Morfológicamente, las partículas de quimera L1-CCR5 1 se parecían a cápsulas de poliomavius 12 ICOSA (partículas T= 1) que están compuestas por una disposición regular de 12 capsómeros pentaméricos de la proteína de cubierta principal de poliomavirus VP1 y pueden generarse tras reensamblaje in vitro de capsómeros de VP1 a alta fuerza iónica (Salunke, et al., Biophys. J., 56: 887 (1989)). Se encontraron partículas pequeñas de tamaño similar a las partículas L1-CCR5 como componentes minoritarios de preparaciones de VLP de L1 de BPV-1 de tipo silvestre. Aunque las partículas L1-CCR5 eran menores que las VLP de tipo silvestre, poseían al menos algunas características de las VLP de tipo silvestre de las que carecen los capsómeros de tipo silvestre. En particular, las partículas L1-CCR5 hemaglutinaban glóbulos rojos de ratón y exhibían reactividad ELISA frente a un anticuerpo monoclonal neutralizante de BPV-1 (nº 9) que se une específicamente a partículas pero no a capsómeros (Roden, et al., J. Virol., 68: 7570 (1994)).

El siguiente ejemplo ilustra cómo las secuencias peptídicas exhibidas como disposiciones ordenadas sobre estructuras capsoméricas pueden estimular respuestas inmunes humorales, incluso contra antígenos centrales. Como se indica a continuación, los ratones administrados con partículas L1-CCR5 respondieron produciendo anticuerpos específicos de mCCR5. Significativamente, los resultados indicaron que la inmunización superó la tolerancia de células B al péptido sin afectar a la tolerancia a CCR5 celular endógeno. Los autoanticuerpos inducidos mediante las partículas inmunogénicas se unieron a mCCR5 nativo, bloquearon la unión de un ligando de CCR5 e inhibieron la infección por VIH-1 mediante una proteína CCR5 quimérica que contenía el péptido mCCR5.

El ejemplo 3 describe los métodos utilizados para demostrar que las partículas L1-CCR5 quiméricas podrían utilizarse como inmunógenos para inducir anticuerpos anti-CCR5.

Ejemplo 3 Estimulación de una respuesta inmune que rompe la tolerancia

Para preparar antisueros, se administraron a ratones C57BI/6 en un protocolo de inmunización: partículas L1-CCR5, VLP de L1 de BPV-1 de tipo silvestre o un péptido CCR5 sintético que representa el primer bucle extracelular de mCCR5 que se acopló con hemocianina de lapa bocallave (KLH) utilizando un kit de conjugación de inmunógeno activado IMJECT (Pierce, Rockford, IL). En algunos casos, se administraron a ratones partículas L1-CCR5 que se habían desnaturalizado mediante cocción durante 2 minutos en presencia de SDS al 1%. Se inocularon por vía dérmica a los ratones 10 \mug de antígeno tres veces en intervalos de dos semanas. En la mayoría de los casos, se recogieron muestras de suero dos semanas después del recuerdo final. Cuando se utilizó coadyuvante, se preparó el antígeno en coadyuvante completo de Freund para la inyección inicial, y en coadyuvante incompleto de Freund para las inyecciones posteriores. Se ensayó en las muestras de suero la reactividad frente al péptido CCR5 y frente a VLP de tipo silvestre utilizando un protocolo ELISA cuantitativo para detectar anticuerpo IgG contra VLP de BPV-1. Se realizó el ELISA utilizando el procedimiento descrito por Kirnbauer et al. en J. Natl. Cancer Inst., 86: 494 (1994). Se preparó un péptido sintético que representa el primer bucle extracelular de mCCR5 y se acopló con albúmina de suero bovino (BSA) como proteína vehículo. Se detectó IgG específica anti-CCR5 uniendo 300 ng de péptido CCR5 acoplado a BSA en 50 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos IMMULON II (Dynatech, Chantilly, VA) durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar tres veces con PBS, se bloquearon los pocillos durante 2 horas con 50 \mul de PBS que contenía 0,5% de leche desecada desnatada más 1% de suero de ternero recién nacido a temperatura ambiente. Después de bloquear, se lavaron de nuevo los pocillos tres veces con PBS después de ello. Se diluyó en serie el suero de ratón en PBS más 0,5% de leche desecada desnatada. Se aplicaron las muestras de suero diluido (50 \mul) a los pocillos después de retirar el lavado de PBS final. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2,5 horas con agitación suave. Después de cinco lavados, se añadieron 50 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada a peroxidasa de rábano picante (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) diluida 1:10.000 en PBS con 0,5% de leche a los pocillos. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave y después se lavaron tres veces. Se añadió el sustrato de peroxidasa ABTS (50 \mul) (Boehringer Mannheim) a la placa, se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente, y se leyeron las densidades ópticas (DO) a 405 nm utilizando un lector de microplacas THERMO MAX. Los valores de DO_{405} mayores de dos veces el fondo (habitualmente mayores de 0,1) se consideraron positivos.

Los resultados presentados en la Figura 1A indicaban que las muestras de suero de ratones administrados con partículas L1-CCR5 tenían altos títulos ELISA anti-CCR5. En contraposición, los ratones control administrados con VLP de tipo silvestre no tenían reactividad ELISA, como se esperaba. Los títulos ELISA anti-CCR5 estaban en el intervalo de 3 x 10^{3} a 3 x 10^{4} en los tres animales que se habían administrado con el inmunógeno en combinación con coadyuvante de Freund, y medían 3 x 10^{3} en los dos animales que habían recibido el inmunógeno sin coadyuvante. Los ratones administrados con partículas L1-CCR5 desnaturalizadas en combinación con coadyuvante no mostraron evidencias de anticuerpos específicos de péptido mCCR5. La falta de reactividad de las partículas L1-CCR5 desnaturalizadas estaba limitada al péptido CCR5 ya que, como se indica por los resultados presentados en la Figura 1B, el material desnaturalizado desencadenó altos títulos de anticuerpos anti-L1. Estos descubrimientos demostraban claramente que los mamíferos adultos retenían la capacidad de producir anticuerpos específicos contra autoantígenos centrales.

Aunque los resultados anteriores indicaban que las partículas L1-CCR5 desencadenaban anticuerpos específicos del péptido CCR5, se realizaron ensayos adicionales para verificar que los anticuerpos reconocían también proteína mCCR5 asociada a célula cuando se exhibía en su conformación nativa. Esto se consiguió utilizando análisis citométrico de flujo (FACS) para mostrar que los anticuerpos anti-CCR5 se unían a mCCR5 expresado sobre la superficie celular.

El ejemplo 4 describe los métodos utilizados para demostrar que los anticuerpos creados contra las partículas L1-CCR5 se unían a proteína receptor mCCR5 auténtico expresada sobre superficies celulares.

Ejemplo 4 Unión de antígeno nativo mediante autoanticuerpos estimulados en respuesta a un autoantígeno incorporado en una estructura capsomérica

Se purificó por afinidad la IgG total de sueros de ratones reunidos a través de una columna de proteína G (Pierce) utilizando procedimientos que serán familiares para los expertos en la técnica. Se reunieron las fracciones de columna que contenían IgG y después se concentraron utilizando una columna de centrifugación CENTRICON-30 (Amicon, Beverly, MA). Se realizaron ensayos de unión a anticuerpo utilizando células humanas transfectadas que expresaban un receptor CCR5 de ratón recombinante. La unión de anticuerpos creados contra partículas L1-CCR5 no pudo ensayarse fácilmente utilizando cultivos primarios de células de ratón debido a que estas células expresaban altos niveles de receptores Fc\gamma y proporcionaban altos niveles de fondo de unión debido a interacciones con IgG de ratón no específica. En consecuencia, para el análisis de citometría de flujo, se expresó transitoriamente un vector de expresión de CCR5 de ratón en células HeLa-MAGI mediante transfección utilizando un kit de transfección LIPOFECTAMINE PLUS (Gibco BRL, Gaithersburg, MO). Se prepararon plásmidos derivados de pcDNA3 que contenían mCCR5 clonado de ratones B6 y una quimera CCR5 humano-de ratón que contenía el primer bucle extracelular de mCCR5 en un fondo de CCR5 humano como se describe por Kuhmann et al., en J. Virol., 71: 8642 (1997). Se separaron las monocapas mediante rascado suave en presencia de EDTA 5 mM a las 48 horas después de la transfección. Se lavaron las células tres veces con un tampón de tinción (PBS más 0,5% de BSA). Se resuspendieron aproximadamente 10^{5} células en 25 \mul de tampón de tinción más 1 \mug de IgG de ratón y después se incubaron 45 minutos a 4ºC. Se lavaron las células tres veces con tampón de tinción, se resuspendieron en 25 \mul de tampón de tinción más 250 ng de IgG de cabra anti-ratón marcada con fluoresceína (FITC) (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), y se incubó durante 30 minutos a 4ºC. Se lavaron las células tres veces con tampón de tinción y finalmente se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de tinción en la preparación para análisis FACS. Como control, se tiñeron las células con 500 ng de anticuerpo monoclonal de ratón anti-CCR5 humano marcado con FITC (mAb182) (R&D Systems; Minneapolis, MN) según las especificaciones del fabricante. Se realizó el análisis FACS utilizando el software FACSCALIBUR y CELLQUEST (Becton-Dickinson, San José, CA). Se midió la unión específica respecto a la tinción de células control transfectadas con el vector pcDNA3.

Los resultados de estos procedimientos indicaban que los autoanticuerpos estimulados en respuesta a la administración de partículas capsoméricas L1-CCR5 se unían específicamente a receptores mCCR5 recombinantes expresados sobre la superficie de células HeLa-MAGI transfectadas. La Figura 2A muestra que la IgG de ratones inmunizados con L1-CCR5 se unía específicamente con alta afinidad a células transfectadas que expresaban el receptor mCCR5 pero no a células transfectadas con vector solo. Las células que expresaban mCCR5 no se unían sustancialmente a los anticuerpos que se estimularon en respuesta a la inmunización con partículas similares a virus formadas por L1 de tipo silvestre (Figura 2B) o un anticuerpo monoclonal (mAb182) específico del segundo bucle extracelular de CCR5 humano (Figura 2C), como se esperaba. Como control para la especificidad de anticuerpo, se administraron a ratones péptido mCCR5 que se había acoplado a hemocianina de lapa bocallave (KLH). Aunque estos ratones respondieron produciendo anticuerpos anti-péptido CCR5 que tenían títulos ELISA de 10^{5} contra una IgG purificada acoplada a BSA, no consiguieron unirse a células que expresaban mCCR5 (Figura 2D). En conjunto, estos resultados indicaban que los anticuerpos creados en respuesta a la inmunización con partículas capsoméricas de L1-CCR5 funcionaban como verdaderos autoanticuerpos porque se unían específicamente a mCCR5 nativo expresado en superficie celular, en contraposición con los anticuerpos creados contra el péptido KLH-CCR5.

Se examinó adicionalmente la capacidad de los anticuerpos creados contra partículas L1-CCR5 de unirse a mCCR5 nativo ensayando la competición del ligando quimiocina RANTES humano marcado con ^{125}I por la unión a células HeLa-MAGI transfectadas que expresaban mCCR5. Las quimiocinas de ratón MIP-1, MIP-1\beta y RANTES son ligandos de mCCR5. Además, los homólogos humanos de MIP-1\beta y RANTES son capaces de unirse a mCCR5 (Meyer et al., J. Biol. Chem., 271: 14445 (1996); Nibbs et al., J. Biol. Chem., 272: 12495 (1997)). Como se describe en el siguiente ejemplo, se incubaron células con RANTES iodado 0,5 nM en ausencia o presencia de diluciones de sueros de ratón tres días después de transfección con un constructo de expresión de mCCR5.

El ejemplo 5 describe los métodos utilizados para demostrar que los autoanticuerpos creados contra el receptor CCR5 inhibían la unión de ligando al receptor.

Ejemplo 5 Autoanticuerpos específicos de un receptor inhiben la unión a ligando

Se transfectaron transitoriamente células HeLa-MAGI con el plásmido de expresión de mCCR5 utilizando un kit de transfección con CaPO_{4} que se adquirió en Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA). A los dos días después de la transfección, se transfirieron 10^{5} células a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Se lavaron al día siguiente las células dos veces con PBS frío y después se resuspendieron en 150 \mul de tampón de unión frío (HEPES 25 mM (pH 7,2), MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, 0,5% de BSA (p/v)). Se incubaron las células durante 4 horas a 4ºC con RANTES humano marcado con ^{125}I 0,5 nM (Amersham, Arlington Heights, IL) en ausencia o presencia de diversas diluciones de sueros de ratón. Para retirar las moléculas pequeñas, se intercambió el tampón de los sueros de ratón por tampón de unión utilizando columnas MICRO BIO-SPIN CHROMATOGRAPHY-6 (Bio-Rad, Hercules, CA) antes de realizar los ensayos de unión. Como control, se realizaron varios ensayos de unión en presencia de RANTES humano no iodado 50 mM o 500 mM (R&D Systems). Se detuvieron las reacciones lavando los pocillos cuatro veces con tampón de unión frío más NaCl 0,5 M. Se lisaron las células añadiendo 0,5 ml de SDS al 0,1% y se transfirieron los lisados a viales de recuento. La radiactividad unida se contó durante 1 minuto en un contador Beckman Gamma 5500B.

Los resultados de estos procedimientos confirmaron que los autoanticuerpos creados contra las partículas L1-CCR5 se unían específicamente a CCR5 expresado en superficie celular e inhibían la unión de ligando al receptor. Más particularmente, los resultados gráficos mostrados en la Figura 4 indicaron que una dilución 1:30 de sueros L1-CCR5 desplazaba aproximadamente un 66% del RANTES humano yodado (similar al desplazamiento observado utilizando un exceso de 100 veces de RANTES frío), comparado con un 37% de desplazamiento con una dilución 1:30 de sueros VLP de L1 de tipo silvestre. Las diluciones 1:75 y 1:150 de sueros L1-CCR5 desplazaron un 25% y un 17% del RANTES yodado, respectivamente, mientras que no se observó un desplazamiento significativo utilizando sueros control a estas diluciones. Se determinó el RANTES yodado unido máximo ensayando la unión en ausencia de sueros, y correspondía a aproximadamente 2.550 cpm, indicado por la línea horizontal de puntos en la Figura 3. Se determinó la unión no específica de RANTES yodado (aproximadamente 1.300 cpm) ensayando la unión en un exceso de 1.000 veces (500 nm) de RANTES humano frío (no yodado). Los datos mostrados en la Figura 4 representan la media de pocillos por duplicado de un experimento. Los estudios previos han sugerido que MIP-1, MIP-1\beta y RANTES se unen al segundo bucle extracelular de CCR5 humano (h), ya que su unión se bloqueaba mediante anticuerpo monoclonal contra esta porción de la molécula, pero no mediante un anticuerpo específico de la terminación amino de hCCR5 (Wu et al., J. Exp. Med., 186: 1373 (1997)). Los descubrimientos presentados en la presente memoria indicaban que los anticuerpos que tenían especificidad de unión por el primer bucle extracelular de mCCR5, que está localizado entre estos dos sitios, inhibían ventajosamente la unión de RANTES y proporcionaban adicionalmente un modo de estimular la formación de estos autoanticuerpos in vivo.

Para investigar adicionalmente la utilidad de los autoanticuerpos anteriormente descritos, se investigó si la inhibición de unión de ligando observada en el ejemplo anterior se correlacionaba con la inhibición de la infección vírica de células diana. Los estudios de anticuerpo monoclonal han implicado al segundo bucle extracelular y a la región amino-terminal de hCCR5, y los estudios de receptores quiméricos han indicado que el primer y tercer bucles extracelulares de CCR5 contribuyen también a la interacción de receptor con VIH-1 (Wu et al., J. Exp. Med., 186: 1373 (1997); Rucker et al., Cell, 87: 437 (1996); Atchison et al., Science, 274: 1924 (1996); Alkhatib et al., J. Biol. Chem., 272: 19771 (1997); Picard et al., J. Virol., 71: 5003 (1997); Ross et al., J. Virol., 72: 1918 (1998)). Aunque mCCR5 no funciona como correceptor de VIH-1, un receptor quimérico humano-de ratón (HMHH), que contiene el primer bucle extracelular de mCCR5 (la secuencia de ratón B6) en un fondo de hCCR5, tiene actividad correceptora cuando se expresa en estirpes celulares humanas (Kuhmann et al., J. Virol., 71: 8642 (1997)). En consecuencia, se utilizó este receptor quimérico
en el siguiente ejemplo para ensayar si los sueros anti-L1-CCR5 podían bloquear la infección por VIH-1 M-trópico.

Los resultados presentados en el siguiente ejemplo tienen una gran relevancia en la inhibición de la inhibición por VIH porque incluso una reducción parcial de la expresión de CCR5 puede tener efectos clínicamente significativos. Esto es cierto porque los individuos infectados por VIH-1 que son heterocigóticos por un alelo CCR5 inactivo exhiben una progresión retardada del SIDA (Liu et al., Cell, 86: 367 (1996); Samson et al., Nature, 382: 722 (1996); Winkler et al., Science, 279: 389 (1998)).

El ejemplo 6 describe los métodos utilizados para demostrar que los autoanticuerpos creados en respuesta a partículas L1-CCR5 inhibían la infección de células diana por VIH-1 M-trópico. Puesto que se utilizó un receptor CCR5 quimérico de ratón-humano en estos procedimientos, la etapa inicial implicaba confirmar que los autoanticuerpos anti-CCR5 anteriormente descritos reconocían el receptor quimérico.

Ejemplo 6 Los autoanticuerpos antirreceptor inhiben la infección por VIH de células diana

Para confirmar que la IgG purificada a partir de sueros L1-CCR5 se unía a receptor quimérico humano-de ratón, se realizó un análisis FACS en células HeLa-MAGI transfectadas transitoriamente con el constructo de expresión HMHH descrito por Kuhmann et al. en J. Virol., 71: 8642 (1997). Se transfectó el constructo de expresión en células receptoras 2 días antes de teñir con IgG de L1-CCR5, IgG de VLP de L1 de tipo silvestre o un anticuerpo monoclonal anti-CCR5 humano control positivo. Los resultados presentados en las Figuras 2E-2G indicaban que se obtenía una unión positiva utilizando IgG de suero de ratones administrados con partículas L1-CCR5 así como con un anticuerpo monoclonal control positivo específico del segundo bucle extracelular de CCR5 humano. Sin embargo, la IgG de ratones administrados con VLP de L1 de tipo silvestre no se unía a HMHH, como se esperaba.

Basándose en los resultados anteriores, se ensayó en los sueros de ratones L1-CCR5 la capacidad de inhibir la infección de la cepa Bal M-trópica de VIH-1 utilizando un ensayo de un solo ciclo de replicación y la estirpe celular indicadora HeLa-MAGI. Las células HeLa-MAGI, descritas por Kimpton et al., en J. Virol., 66: 2232 (1992), se transfectaron transitoriamente con el vector de expresión CCR5 quimérico humano-de ratón utilizando un kit de transfección con CaPO_{4} comercialmente obtenido (Stratagene Cloning Systems). Dos días después de la transfección, y el día antes de la infección, se sembraron células indicadoras en placas de 24 pocillos a 6,5 x 10^{4} células por pocillo en DMEM completo. Se realizaron algunas infecciones en presencia de los sueros de ratón reunidos en los que se había intercambiado el tampón por PBS utilizando columnas MICRO BIO-SPIN CHROMATOGRAPHY-6 (BioRad). Antes de la infección, se incubaron las células en un volumen total de 140 \mul en DMEM completo con DEAE-dextrano 10 \mug/ml más diluciones de sueros durante 30 minutos a 4ºC. Después de la incubación, se añadió el virus a cada pocillo, proporcionando un volumen total de 150 \mul. Se incubaron las células durante 2 horas a 37ºC, después se añadió 1 ml de DMEM completo a cada pocillo. A los 3 días después de la infección, se tiñeron las células con X-gal y se determinó la dosis infecciosa contando el número de núcleos azules en los pocillos infectados. Se evaluó la inhibición de la entrada vírica comparando el número medio de núcleos azules en presencia de sueros con el número medio de centros infecciosos en ausencia de sueros. Típicamente, se utilizaron suficientes viriones infecciosos para conducir a 50-75 centros azules infecciosos en los pocillos control (sin sueros) en cada infección. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Con las pasadas, la eficacia de la infección de células HeLa-MAGI transfectadas se redujo notablemente, presuntamente debido a una expresión reducida de CD4. Por lo tanto, todas las infecciones se realizaron en células HeLa-MAGI recién descongeladas.

Los resultados de estos procedimientos, presentados gráficamente en la Figura 4, mostraron que se creaban anticuerpos séricos contra el autoantígeno de CCR5, y se mostraba que reconocían antígeno nativo y que inhibían interacciones ligando-receptor, y también inhibían la infección vírica de células diana. Las células indicadoras que se transfectaron transitoriamente con el constructo de expresión HMHH y se pusieron en contacto con BaL de VIH-1 en presencia de diluciones de sueros L1-CCR5 de 1:15, 1:30 y 1:75, exhibieron un 65%, un 50% y un 45% de neutralización de la infectividad. A las mismas diluciones, los sueros control de ratones VLP de L1 de tipo silvestre exhibían cierta neutralización no específica, pero sólo a un nivel de un 25% a la dilución 1:15 y de un 15% a 1:30 y 1:75. Las células indicadoras infectadas con Bal de VIH-1 en presencia de 50 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal específico de CCR5 humano (mAb182), que se utilizó como control positivo, exhibieron aproximadamente un 50% de neutralización. Por tanto, los autoanticuerpos anti-CCCR5 producidos según el procedimiento dado a conocer anteriormente, inhibían eficazmente la infección de células sensibles a VIH-1.

Se ha mostrado cómo romper la tolerancia de células B a autoantígeno presentándolo en un contexto que imita los antígenos de superficie ordenada de un virus infeccioso. Para hacer esto, se sustituyó un epítopo neutralizante de virus dominante sobre la superficie de VLP de L1 de papilomavirus por una secuencia peptídica de una autoproteína. Más específicamente, se introdujo por ingeniería genética en un supuesto epítopo neutralizante en L1 de papilomavirus bovino de tipo 1 (BPV-1) (Ludmerer et al., J. Virol., 70: 4791 (1996)), una secuencia peptídica de 16 aminoácidos de longitud que correspondía al primer bucle externo del receptor quimiocina de ratón CCR5. Esta L1 quimérica se ensamblaba en partículas que tenían disposiciones ordenadas de capsómeros que podrían utilizarse como inmunógenos para estimular respuestas inmunes humorales contra la proteína quimérica L1-CCR5.

Se mantuvieron ratones inmunizados con VLP compuestas por subunidades proteicas quiméricas de L1-CCR5 para determinar los efectos a largo plazo de la inmunización, incluyendo cualquier consecuencia patológica de la producción de autoanticuerpos. A los seis meses después de inmunización, los ratones inmunizados pesaban lo mismo que los animales control y parecían externamente sanos. Una autopsia del ratón con los títulos anti-CCR5 más altos no reveló ninguna indicación de enfermedad autoinmune. Los títulos de anticuerpo CCR5 en los ratones vacunados fueron inicialmente estables, pero después descendieron lentamente, paralelamente a las respuestas frente a L1. Estos resultados sugieren que el CCR5 celular ni activa ni toleriza la respuesta de células B inducida por VLP quimérica frente a péptido CCR5.

El siguiente ejemplo describe cómo pueden estimularse autoanticuerpos dirigidos a un autoantígeno central en un mamífero distinto de un ratón. En el caso ejemplar ilustrado a continuación, se describe una composición y un método para inducir la producción de anticuerpos anti-CCR5 de macaco.

Ejemplo 7 Estimulación de una respuesta autoinmune en macacos

Se preparó en primer lugar un constructo de expresión recombinante que codificaba una proteína quimérica L1-CCR5 que incluye una porción de la secuencia polipeptídica CCR5 de macaco esencialmente según el procedimiento dado a conocer en el ejemplo 1. Se introdujo el constructo de expresión resultante en células Sf9 receptoras en las que se produjo la proteína codificada por el vector recombinante. Se purificaron las estructuras capsoméricas que representaban agregados autoensamblados de la proteína quimérica L1-CCR5 producida en células receptoras mediante gradiente de sacarosa y centrifugación en gradiente de CsCl. En un procedimiento paralelo, se prepararon también VLP compuestas por proteína L1 de tipo silvestre y se purificaron para uso como inmunógeno control. El inmunógeno control no contiene la secuencia polipeptídica de CCR5 de macaco que está presente en la quimera L1-CCR5. Las VLP de tipo silvestre o L1-CCR5 quimérica purificadas, combinadas con estructuras capsoméricas coadyuvantes, proporcionan composiciones inmunogénicas control y de ensayo, respectivamente. Estas composiciones se inyectan separadamente por vía intradérmica en macacos según un protocolo de inmunización estándar tal como el descrito en el ejemplo 3. En un caso, se administran los animales con las composiciones inmunogénicas tres veces en intervalos de dos semanas. Las muestras de suero tomadas periódicamente de los dos animales desde un momento anterior a la inmunización inicial no indicaron evidencias de anticuerpos de unión a CCR5 antes de la inmunización. Las muestras de suero del animal control no muestran evidencias de anticuerpos de unión a CCR5 siquiera varias semanas después de la administración final de la composición inmunogénica de VLP de L1 de tipo silvestre. En contraposición, las muestras de suero del animal administrado con estructuras capsoméricas que incluían la quimera L1-CCR5 contienen niveles significativos de anticuerpos anti-CCR5 (Fig. 5). Estos resultados confirmaron que las estructuras capsoméricas L1-CCR5 tienen la inmunogenicidad deseada y que el efecto es específico de antígeno.

Se ha mostrado previamente que la adición de otros polipéptidos de papilomavirus a las VLP en forma de fusiones de la proteína de cápsida minoritaria L2 puede inducir una fuerte respuesta inmune mediada por célula contra estos péptidos víricos, y la producción de anticuerpos específicos contra el péptido insertado (Greenstone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1800 (1998); H.L. Greenstone, tesis de doctorado (1998), The John Hopkins University, Baltimore, MD). Tanto la inducción de respuestas de anticuerpo de alto título como de respuestas CTL restringidas a MHC I, pueden inducirse mediante la inoculación de dosis baja de VLP en ausencia de coadyuvante. A la vista de los descubrimientos presentados anteriormente, la capacidad de las VLP de inducir una respuesta inmune potente contra epítopos víricos está probablemente relacionada con su capacidad de interaccionar con las superficies celulares y de presentar epítopos en forma de una disposición ordenada de estructura repetitiva.

Se ha tenido éxito en la generación de quimeras L2 de proteínas víricas. Significativamente, todas las fusiones fueron compatibles con el coensamblaje en VLP de L1, completas que pudieron recuperarse eficazmente en forma de partículas (Greenstone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1800 (1998)). Fueron compatibles insertos grandes en la proteína L2, incluso que representaban proteínas completas de 42 kDa, con el ensamblaje en VLP. La capacidad de L2 de aceptar insertos de este tamaño es atribuida al hecho de que L2 no contribuye a la integridad estructural de la VLP, y así puede tolerar una modificación sustancial sin comprometer el autoensamblaje de partícula. Aunque es probable que L2 tenga una estructura ordenada en las VLP, su espaciado probablemente no es tan estrecho como el espaciado de L1. Aunque la localización de L2 en la cápsida de papilomavirus no se ha determinado definitivamente, se tienen evidencias experimentales que muestran que L2 está localizada en los doce vértices de la cápsida icosaédrica. Esto situaría a L2 y a cualquier péptido insertado en la misma a una distancia repetida de aproximadamente 300 angstroms.

Puesto que la proteína L2 de papilomavirus puede acomodar grandes insertos de secuencias polipeptídicas extrañas y seguir incorporándose a partículas similares a virus, pueden prepararse quimeras L1/L2 que tengan autoproteínas completas insertadas en el sitio de L2, y utilizarse como inmunógenos. En una realización preferida, se fusiona el polipéptido diana con los primeros 110 aminoácidos de la proteína L2 de BPV. Esto presenta la secuencia insertada sobre la cápsida exterior cuando se ensambla en VLP de L1. Es más, este enfoque puede utilizarse para preparar VLP quiméricas que pueden utilizarse como inmunógenos para estimular la producción de autoanticuerpos contra TNF.

Los siguientes dos ejemplos describen cómo preparar VLP de TNF de ratón tanto en forma de quimeras de L2 como de fusiones de estreptavidina. Basándose en la estructura atómica conocida de la proteína (Eck et al., J. Biol. Chem., 264: 17595, (1989)), pueden prepararse también quimeras L1 insertando péptidos de TNF que incluyen epítopos a los que se unen funcionalmente anticuerpos neutralizantes. En el suero de ratones vacunados con VLP de TNF puede ensayarse la reactividad contra TNF de ratón en un ensayo ELISA, y la inhibición de la citólisis inducida por TNF de células L929 in vitro. (Takasaki et al., Nature Biotech., 15: 1266 (1997)). Las VLP que presentan la secuencia polipeptídica de TNF pueden utilizarse también para vacunar ratones DBA/1 que tienen AR colagenosa de tipo II. El efecto de este tratamiento sobre el transcurso de la enfermedad puede monitorizarse utilizando análisis de hinchamiento de pata e histológico estándar (Thorbecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7375 (1992)).

El ejemplo 8 describe un método que puede utilizarse para preparar partículas L1/L2 quiméricas para uso como inmunógenos.

Ejemplo 8 Partículas L1/L2 quiméricas para estimular la producción de autoanticuerpos

Utilizando técnicas estándar que serán familiares para los expertos en la técnica de la clonación molecular, se preparan constructos genéticos que codifican quimeras polipeptídicas de TNF de ratón-L2 y se expresan en células transfectadas en forma de proteínas quiméricas. Las proteínas quiméricas se coensamblan después en partículas similares a virus de L1, dando como resultado VLP quiméricas de L1/L2. Las VLP de L1/L2 se purifican, se combinan con un coadyuvante y se administran a animales de ensayo en un protocolo de inmunización. Como controles, se inyectan la proteína quimérica L2-TNF y TNF soluble solos. Las muestras de suero de ratones administrados con la preparación de VLP quimérica de L1/L2 contienen anticuerpos anti-TNF que son detectables en un ensayo ELISA. En contraposición, las muestras de suero de animales control no contienen anticuerpos anti-TNF. Este resultado indica que las partículas quiméricas L1/L2 que incluyen proteínas L2 quiméricas son útiles para estimular la producción de autoanticuerpos.

El ejemplo 9 describe un método para preparar y utilizar partículas similares a virus inmunogénicas, en el que se une una secuencia de autopolipéptido a las proteínas que constituyen la partícula a través de un enlace de biotina. En este caso, las VLP preformadas se biotinilan y después se ponen en contacto con un autopéptido ligado a estreptavidina. Esta manipulación es posible porque las VLP de L1 de tipo silvestre son bastante estables una vez se forman.

Ejemplo 9 Partículas similares a virus que incorporan autopolipéptidos a través de un enlace de biotina

Se biotinilaron VLP de L1 de tipo silvestre purificadas utilizando reactivos sulfo-NHS-Biotin según las instrucciones del fabricante (Pierce). Se purificaron las VLP biotiniladas a partir de biotina libre mediante separación en un gradiente lineal de sacarosa de 24-54%. Los experimentos preliminares demostraron que las VLP de L1 estaban fuertemente biotiniladas. Esta observación indicaba que había al menos una lisina expuesta para unión a biotina en cada L1. Se conjugó un polipéptido TNF\alpha de ratón con las VLP en forma de una proteína de fusión de estreptavidina. La estreptavidina era generalmente útil para unir eficazmente cualquier polipéptido de elección a las VLP biotiniladas. La secuencia polipeptídica de la proteína TNF\alpha de ratón tenía la secuencia: Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-His-Gln-Val-Glu (SEC ID Nº 2). Esta secuencia se clonó en forma de una fusión C-terminal en el vector de expresión de estreptavidina pTSA-18F (Sano, T. y Cantor, C.R., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 571-577 (1991)). La expresión se realizó en bacterias BL21 (DE3)(pLysS) incubadas durante 3-6 horas después de inducción con IPTG 0,4 mM. La purificación de la proteína a partir de los cuerpos de inclusión se realizó como se describe por Sano y Cantor (Sano, T. y Cantor, C.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 142-146 (1990)). La proteína de fusión de estreptavidina se hizo reaccionar con VLP biotiniladas a una relación en peso de 3:1 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se purificaron las partículas conjugadas con la fusión de estreptavidina mediante centrifugación en un gradiente lineal de sacarosa de 24%-54%. Se inyectaron preparaciones de 5 \mug de VLP con o sin autopolipéptido ligado a estreptavidina unido en ratones de ensayo y control, respectivamente, tres veces en intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la inyección final, las muestras de suero tomadas del animal administrado con la composición que incluía el autopolipéptido mostraron evidencias de anticuerpos antiautopolipéptido. En contraposición, no se detectaron los correspondientes anticuerpos en muestras de suero de los animales control.

Está bien establecido que los anticuerpos monoclonales de ratón son útiles como agentes terapéuticos y como reactivos para una variedad de estudios básicos y aplicados. Sin embargo, puesto que la mayoría de los anticuerpos monoclonales son de origen de ratón o rata, el conjunto disponible actualmente de anticuerpos es deficiente en aquellos que reconocen específicamente epítopos de ratón o rata exhibidos sobre la superficie de antígenos centrales en su conformación nativa. Esta deficiencia es limitante para estudios humanos porque los roedores son modelos para estudiar la biología de mamíferos, y las secuencias aminoacídicas de proteína altamente conservadas tienen típicamente funciones importantes que están conservadas a lo largo de la evolución. En consecuencia, utilizando los métodos dados a conocer en la presente memoria, será posible estimular respuestas de células B contra autoantígenos en su conformación nativa. Después de ello, será posible preparar y examinar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales que tengan la especificidad de unión deseada. Específicamente, se utilizará la VLP de TNF que sea más eficaz en la generación de anticuerpos policlonales contra TNF en un intento de generar anticuerpos monoclonales que reconozcan específicamente e inactiven funcionalmente el TNF de ratón. Se utilizará el método de fusión estándar de células de bazo/mieloma para generar células productoras del anticuerpo monoclonal (Galfre et al., Nature, 266: 550 (1977)).

El ejemplo 10 describe brevemente un método que puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales de ratón contra TNF.

Ejemplo 10 Producción de anticuerpos monoclonales

Se inmunizan en primer lugar ratones con partículas similares a virus que exhiben sobre su superficie un TNF-polipéptido de ratón preparado según los métodos descritos anteriormente. Se establece utilizando un ensayo ELISA que el suero de ratones contiene anticuerpos específicos de TNF nativo. Se sacrifican los ratones y se fusionan las células de bazo recogidas con células de mieloma no secretoras para producir una colección de hibridomas. Los hibridomas se examinan mediante métodos que serán familiares para los expertos en la técnica de identificar aquellos anticuerpos secretados que tienen especificidad de unión por el TNF nativo. Se purifican después cantidades útiles de los anticuerpos anti-TNF.

Ejemplo 11 Aumento de la respuesta de anticuerpos frente a epítopos neutralizantes de virus subdominante

La vacunación con VLP de L1 y L1/L2 de papilomavirus puede generar antisueros neutralizantes específicos de alto título (mayor de 100.000) pero sólo un tipo (Kirnbauer, R. et al., PNAS, 89: 12180-12184 (1992); Roden, R., et al., J. Virol., 70: 5875-5873 (1996)). En contraposición, L2 sola o fragmentos de la misma desencadenan sólo bajos títulos de antisueros neutralizantes (1.000 o menos), pero pueden ser neutralizantes cruzados entre tipos de papilomavirus (Roden, R., et al., J. Virol., 68: 7570-7574 (1994); Kawana, K., et al., J. Virol., 73: 6188-6190 (1999); Roden, R. et al., "Abstract Book, 17th International Papillomavirus Conference", pág. 61 (1999)). Para aumentar los títulos de anticuerpos L2 neutralizantes cruzados, se exhiben péptidos L2 en una disposición estrechamente espaciada sobre la superficie de VLP. Por ejemplo, se fusiona genéticamente un péptido que incluye los aminoácidos 108-120 de L2 de HPV16 con la terminación C de estreptavidina, y se produce la proteína de fusión como se describe en el ejemplo 9. La proteína de fusión estreptavidina-L2 se hace reaccionar con VLP biotiniladas y las VLP conjugadas se purifican como se esquematiza en el ejemplo 9. Se ensayan en antisueros de mamíferos vacunados con VLP conjugadas de estreptavidina-L2 los anticuerpos que neutralizan de forma cruzada los pseudoviriones de papilomavirus, utilizando los ensayos neutralizantes in vitro anteriormente descritos (Roden, R. et al., J. Virol., 68: 7570-7574 (1994); Roden, R. et al., "Abstract Book, 17th International Papillomavirus Conference", pág, 61 (1999). Se detectan altos títulos de anticuerpos neutralizantes cruzados.

<110> El Gobierno de los Estados Unidos de América, representado por el Secretario del Departamento de Servicios Sanitarios y Humanos, Oficina de Transferencia de Tecnología

\hskip1cm Schiller, John

\hskip1cm Chackerian, Bryce

\hskip1cm Lowy, Douglas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> PARTÍCULAS SIMILARES A VIRUS PARA LA INDUCCIÓN DE AUTOANTICUERPOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> NIH152.001VPC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/105.132

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 21-10-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Tyr Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ile Met Cys Lys}

\sac{Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala}

\sac{Asn His Gln Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (12)

1. Una composición para romper la tolerancia que comprende:

(a) una estructura capsomérica que tiene un ensamblaje simétrico de proteínas de cápsida; y

(b) al menos un epítopo de células B de un tolerógeno unido a la estructura capsomérica para formar una estructura capsomérica presentadora de tolerógeno,

en la que la estructura capsomérica presentadora de tolerógeno exhibe el tolerógeno sobre la superficie de la misma en una disposición ordenada repetitiva que tiene un espaciado de aproximadamente 100 angstroms.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la proteína de cápsida es una proteína de cápsida de un virus seleccionado del grupo constituido por papilomavirus, poliomavirus y parvovirus.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que la proteína de cápsida es una proteína L1 de papilomavirus.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que la estructura capsomérica es icosaédrica.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el tolerógeno se une a la estructura capsomérica mediante un engarce.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que el engarce comprende biotina.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el tolerógeno se selecciona del grupo constituido por péptido, carbohidrato y lípido.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el tolerógeno es un autoantígeno.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el tolerógeno es CCR5.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el tolerógeno es factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha).

11. Un producto farmacéutico que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la preparación de un medicamento para generar anticuerpos contra el tolerógeno.