ES2321491T3 - Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos. - Google Patents

Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos. Download PDF

Info

Publication number
ES2321491T3
ES2321491T3 ES02800605T ES02800605T ES2321491T3 ES 2321491 T3 ES2321491 T3 ES 2321491T3 ES 02800605 T ES02800605 T ES 02800605T ES 02800605 T ES02800605 T ES 02800605T ES 2321491 T3 ES2321491 T3 ES 2321491T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
angiotensin
bacteriophage
conjugate
seq
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02800605T
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Bachmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytos Biotechnology AG
Original Assignee
Cytos Biotechnology AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/050,902 external-priority patent/US7264810B2/en
Application filed by Cytos Biotechnology AG filed Critical Cytos Biotechnology AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2321491T3 publication Critical patent/ES2321491T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Un conjugado de resto de péptido angiotensina-transportador que comprende: (a) un transportador con al menos un primer sitio de unión, y (b) al menos un resto de péptido angiotensina con al menos un segundo sitio de unión; en donde dicho transportador comprende una partícula de núcleo que es una partícula similar a virus, donde dicha partícula similar a virus es una partícula similar a virus de un bacteriófago de ARN y; en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de la asociación a través de al menos un enlace covalente no peptídico con dicho primer sitio de unión para de esta manera formar un conjugado de resto de péptido angiotensinatransportador ordenado y repetitivo.

Description

Conjugados que llevan péptido angiotensina y usos de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención está en los campos de la medicina, salud pública, inmunología, biología molecular y virología.
Técnica relacionada
La presión sanguínea arterial de mamíferos se controla principalmente por una cascada bioquímica conocida como el sistema renina-angiotensina (RAS). Se inicia por la liberación de renina de las células epiteloides del aparato yuxtaglomerular del riñón después de una caída en la presión sanguínea arterial. La renina escinde enzimáticamente el péptido angiotensinógeno (secuencia de aminoácidos: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Asn), que se secreta en el suero por el hígado. Esta escisión lleva a la formación del decapéptido angiotensina I (secuencia de aminoácidos Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu). La enzima convertidora de angiotensina (ACE) que está presente en el endotelio de los pulmones escinde en cuestión de segundos los dos aminoácidos C-terminales de la ATI para dar lugar a angiotensina II (secuencia de aminoácidos: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Mientras que la angiotensina I tiene una vida media muy corta dentro del cuerpo y no tiene o tiene una leve actividad vasoconstrictora, la angiotensina II tiene un efecto profundo sobre el sistema circulatorio, así como sobre el sistema endocrino. Los niveles elevados de angiotensina II activada por RAS causan vasoconstricción, retención renal de sal y agua, contribuyendo ambas a incrementar la presión arterial (hipertensión), que puede llevar a un daño cardiovascular. Las posibles manifestaciones clínicas de la hipertensión son apoplejía, infarto, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia renal o hemorragia retinal.
De acuerdo con los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC), la insuficiencia cardíaca congestiva es una enfermedad crónica importante para adultos de edad avanzada, suponiendo aproximadamente 260.000 muertes al año en los Estados Unidos. En 1995, se pagaron 3400 millones de dólares por programas de salud Medicare para la insuficiencia cardíaca. Aunque están disponibles fármacos para el tratamiento de la hipertensión, solo se obtiene un control de la hipertensión en aproximadamente la mitad de los pacientes hipertensos tratados. Esto se debe parcialmente a la no conformidad del paciente o a la ineficacia de los fármacos usados.
El tratamiento actual de la hipertensión incluye la intervención del sistema RAS usando moléculas orgánicas pequeñas. Las dianas principales son la renina, la ACE y los receptores para angiotensina II. Los inhibidores de ACE incluyen lisinopril®, captopril® y enalapril®, sin embargo, estos fármacos no han sido completamente exitosos. En primer lugar, no parece que bloqueen completamente la actividad de ACE y, en segundo lugar, también se afecta la generación por ACE de otros péptidos biológicamente activos, incluyendo la bradiquinina, lo que es indeseable. Estos fármacos pueden inducir efectos secundarios tales como tos seca y un efecto hipotensor de la primera dosis con mareo y posible desmayo. Los antagonistas del receptor de angiotensina II incluyen losartan®, valsartan® e isbesaftan®, que actúan específicamente sobre el receptor de angiotensina AT1; por lo tanto, bloquean los efectos vasoconstrictores dominantes de la angiotensina II, y son mejor tolerados pero no afectan a otras acciones de las hormonas angiotensina. Sin embargo, los antagonistas del receptor de angiotensina II, así como los inhibidores de ACE necesitan tomarse con regularidad, frecuentemente durante periodos prolongados, tal como durante la mayor parte de la vida adulta, lo que explica al menos parcialmente la escasa conformidad del paciente. Por lo tanto, hay una clara necesidad de terapias de hipertensión que sean eficaces, bien toleradas y asociadas a una alta conformidad del paciente.
Un enfoque potencial en el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos asociados con la actividad de una hormona consiste en neutralizar los efectos de la hormona dentro del paciente por inmunoterapia, es decir, por inmunización del paciente contra la hormona o enzimas que están involucradas en la generación de la hormona, de tal manera que se neutraliza la actividad de la hormona o sus niveles se reducen por anticuerpos específicos antihormona o antienzima. Tales anticuerpos pueden administrarse exógenamente en inmunización pasiva, o pueden generarse in situ por inmunización activa usando un inmunógeno basado en la hormona o la enzima relacionada.
Se ha demostrado la viabilidad de la vacunación contra componentes del RAS para modular la hipertensión en modelos animales (para una revisión, véase Michel, Am. Heart J. 117: 756 (1989)). La vacunación contra renina era eficaz en la reducción de la presión sanguínea, sin embargo, los animales padecían una nefritis autoinmune. (Michel et al., Circulation 81: 1899 (1990); Lo et al., Hypertension 16: 80(1990)). Los datos sobre la inmunización activa contra ACE homóloga son muy limitados. Un informe describe la vacunación de conejos, pero sólo 1 de 50 animales generaron anticuerpos anti-ACE detectables (Soffer, Fed. Proc. 42: 2735 (1983)). La transferencia pasiva de suero inmune contra ACE puede disminuir la presión sanguínea en conejos, pero conduce a una respuesta inmunoalérgica con edema pulmonar, posiblemente debido a que la ACE se expresa en una forma unida a membrana en el pulmón (Cadwell, FEBS Lett. 63: 82 (1976)). No hay informes disponibles sobre la inmunización activa contra angiotensinógeno, sin embargo, varios estudios exploraron la viabilidad de la vacunación contra angiotensina I y angiotensina II. Dos estudios informaron de un efecto de presión sanguínea (Christlieb, J. Clin. Invest. 48: 1506 (1996); Gardiner, Br. J. Pharmacol. 129: 1178 (2000)) en animales vacunados y no se observó autoinmunidad. Sin embargo, la mayoría de los estudios de vacunación con péptidos angiotensina fueron negativos, posiblemente debido a que los títulos inducidos contra péptidos angiotensina eran demasiado bajos, o debido a que la especificidad de los anticuerpos inducidos no era óptima. Es probable que una vacuna que sólo se dirige contra la angiotensina II no tenga el mismo efecto sobre el RAS que una vacuna que induzca anticuerpos contra la angiotensina II, así como contra la angiotensina I, y posiblemente también contra el precursor angiotensinógeno.
El documento WO 98/58952 describe el tratamiento con un conjugado que contiene una angiotensina I conjugada con toxoide tetánico, que conduce a la inducción de anticuerpos específicos de angiotensina en ratas si se aplica junto con un adyuvante tal como hidróxido de aluminio. Los adyuvantes frecuentemente son tóxicos o al menos irritantes. Los únicos adyuvantes permitidos para uso humano hasta la fecha son sales minerales (hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio) y virosomas. El adyuvante usado más frecuentemente en seres humanos es el hidróxido de aluminio (Alum). Aunque se considera seguro, permanece en el cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado formando un depósito. Todavía no se entienden bien las consecuencias de dicha formación de depósitos, por lo tanto, deben realizarse intentos para evitar el Alum en futuras vacunas sin perder su inmunogenicidad.
Por lo tanto, continúa existiendo la necesidad en la técnica de proporcionar conjugados que lleven a la inducción de altos títulos de anticuerpos incluso en ausencia de adyuvantes.
Breve resumen de la invención
Se han desarrollado ahora inmunógenos potentes, como se definen en las reivindicaciones, para la inducción de anticuerpos específicos para angiotensinógeno, angiotensina I, angiotensina II (denominados en este documento en conjunto "péptidos angiotensina"), que son eficaces incluso sin el uso de adyuvantes y que permiten el desarrollo de anticuerpos in vivo que se dirigen específicamente a uno o más péptidos angiotensina, tales como angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Los inmunógenos consisten en restos de péptidos angiotensina que están unidos a partículas similares a virus (VLP). Esto da como resultado una serie repetitiva de antígenos altamente inmunogénica que es capaz de estimular la formación de anticuerpos incluso sin el uso de adyuvantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de los restos de péptidos angiotensina usados, se inducen altos títulos de anticuerpo y, además, pueden inducirse específicamente contra los extremos N- o C-terminales de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Esto permite el direccionamiento específico de una sola especie de péptidos angiotensina o una combinación de los mismos. Los inmunógenos de la presente invención pueden usarse por lo tanto en un enfoque inmunoterapéutico para combatir afecciones asociadas con niveles elevados de angiotensina II producida por el RAS.
Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular de funcionamiento o mecanismo, los conjugados y conjugados de la invención pueden inducir anticuerpos que se unan a más de una especie de péptido angiotensina, bloquean de este modo todas las especies relevantes de angiotensina al mismo tiempo. Como alternativa, los anticuerpos inducidos podrían unirse específicamente al extremo C-terminal de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. En estas condiciones, los anticuerpos inducidos bloquearán la activación de angiotensinógeno o angiotensina I por renina o ACE, respectivamente. No obstante, proteasas distintas de ACE o renina, tales como endopeptidasas y aminopeptidasas, pueden degradar angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II a partir del extremo N-terminal, evitando de esta manera la acumulación de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II intactos unidos a anticuerpo.
Por lo tanto, se proporcionan por la invención inmunógenos que comprenden uno o más péptidos angiotensina o restos de péptidos, o derivados de los mismos, unidos a una o más partículas de núcleo, preferiblemente una o más partículas similares a virus (VLP), para formar conjugados que tienen la estructura de series ordenadas y repetitivas. Las partículas de núcleo que contienen un primer sitio de unión y los péptidos angiotensina o derivados de los mismos que contienen un segundo sitio de unión, se asocian mediante un enlace covalente no peptídico a través de dichos primer y segundo sitios de unión para formar dichas series ordenadas y repetitivas. La interacción entre el primer y segundo sitios puede ser directa o puede involucrar a al menos otra molécula, por ejemplo, un enlazador.
En una realización, el primer sitio de unión es de origen natural en la partícula de núcleo. Como alternativa, el primer sitio de unión se añade por acoplamiento químico o por técnicas recombinantes. Los primeros sitios de unión preferidos comprenden grupos amino, grupos carboxilo o grupos sulfhidrilo. Los aminoácidos preferidos que comprenden un primer sitio de unión se seleccionan de lisina, arginina, cisteína, aspartato, glutamato, tirosina e histidina. Se prefieren particularmente restos de lisina.
Son segundos sitos de unión apropiados en los péptidos angiotensina o derivados de los mismos grupos amina, amida, carboxilo y sulfhidrilo. Hay un amplio rango de compuestos que se han desarrollado para permitir el entrecruzamiento de péptidos/proteínas o la conjugación de proteínas con moléculas derivatizadas, por formación de un enlace covalente con un grupo reactivo de una molécula proteica de la partícula de núcleo.
Las partículas de núcleo con un primer sitio de unión de la invención son partículas similares a virus de un bacteriófago de ARN apropiadas para la formación de series repetitivas ordenadas. En general, las partículas de núcleo incluyen partículas similares a virus (VLP), bacteriófagos, partículas similares a virus de bacteriófagos, pili y similares, incluyendo HbcAg VLP, VLP de bacteriófagos y pili de tipo I. La invención también proporciona formas variantes de las partículas de núcleo que continúan siendo capaces de formar una estructura repetitiva ordenada. Las formas variantes incluyen formas recombinantes y naturales, y formas mutantes de partículas de núcleo. En ciertas realizaciones, las formas mutantes de las partículas de núcleo incluyen aquellas en las que el tipo de primer sitio de unión, o el número de dichos sitios, difiere de la precursora. Se prefiere particularmente la alteración del número de restos de lisina en la partícula de núcleo.
Los conjugados de la invención comprenden restos de péptidos angiotensina que están químicamente acoplados a partículas similares a virus (VLP) por asociación a través de al menos un enlace covalente no peptídico. Esto da como resultado una serie repetitiva de antígenos altamente inmunogénica que es capaz de estimular la formación de anticuerpos incluso sin el uso de adyuvantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de los restos de péptidos angiotensina usados, se inducen altos títulos de anticuerpos y, además, pueden inducirse específicamente contra los extremos N- o C-terminales de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Esto permite dirigirse específicamente a una sola especie de péptidos angiotensina o una combinación de los mismos. Los inmunógenos de la invención pueden usarse en un enfoque inmunoterapéutico para combatir afecciones asociadas con niveles elevados de angiotensina II producidos por el RAS.
La presente invención proporciona por lo tanto conjugados de la invención que comprenden una partícula de núcleo y uno o más péptidos angiotensina o restos de péptidos angiotensina, apropiados para usarse en la inducción de respuestas inmunes. La invención también proporciona conjugados que comprenden dichos conjugados de la invención y uno o más componentes adicionales, tales como uno o más excipientes o vehículos, convenientemente uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Los conjugados de la invención incluyen conjugados de vacunas o conjugados, con o sin excipientes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables adicionales. Por ejemplo, la presente invención también proporciona conjugados de vacunas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o más de los conjugados de la presente invención junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, la vacuna comprende además al menos un adyuvante, tal como Alum o adyuvante incompleto de Freund.
Los conjugados de la invención pueden usarse en métodos de inmunización y/o tratamiento de un animal, preferiblemente un mamífero tal como un ser humano, que comprenden administrar al animal una cantidad inmunológicamente eficaz de conjugados o vacunas de la invención, induciendo de este modo una respuesta inmune contra los conjugados. Pueden inmunizarse convenientemente animales con los conjugados o conjugados de la invención por cualquier vía de administración conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, por vía subcutánea, intramuscular, intranasal, intradérmica, intravenosa, transdérmica, transmucosa, oral o directamente en un ganglio linfático. La inmunización intranasal es una vía particularmente apropiada; este tipo de administración conduce, no sólo a altos títulos de anticuerpos que incluyen IgA como se indica en los ejemplos, sino que también, por evitar procedimientos de inmunización dolorosos (por ejemplo, intramuscular) es más aceptada por el paciente y conduce a una mayor conformidad.
Los conjugados de la invención inducen respuestas inmunes, incluyendo la producción de anticuerpos. Por lo tanto, se describen métodos para producir anticuerpos contra uno o más péptidos angiotensina o restos de péptidos angiotensina. Tales anticuerpos son útiles en el tratamiento o la prevención de trastornos físicos asociados con el RAS, y para la detección de péptidos angiotensina o restos de péptidos angiotensina, por ejemplo, en los métodos de diagnóstico de trastornos físicos asociados con la presencia de uno o más componentes del RAS en los tejidos o la circulación de un animal.
En una realización relacionada, la invención es útil para la prevención o el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con el RAS, incluyendo, pero sin limitación, apoplejía, infarto, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia renal, hemorragia retinal y similares. La inmunización con los conjugados de la invención da como resultado una respuesta inmune contra uno o más péptidos angiotensina o restos de péptidos angiotensina, de tal manera que las moléculas inmunes, particularmente anticuerpos, se unen a los péptidos angiotensina o restos de péptidos angiotensina. La transferencia pasiva de anticuerpos también es útil para el tratamiento y la prevención de trastornos asociados con el RAS.
Se ha descubierto que los conjugados de péptidos angiotensina o restos de péptidos angiotensina unidos a partículas similares a virus (VLP) inducen anticuerpos IgG altamente específicos de angiotensina. La presente invención proporciona por lo tanto un agente terapéutico para trastornos físicos asociados con el RAS, que se basa, en una realización muy preferida, en un conjugado repetitivo y ordenado de VLP-péptido/resto de angiotensina. Este agente terapéutico es capaz de inducir altos títulos de anticuerpos antiangiotensina en un animal vacunado. Los altos títulos de anticuerpos se inducen incluso en ausencia de adyuvantes e incluyen, no sólo IgG, sino también subtipos de IgA. Además, sorprendentemente este agente terapéutico no está asociado con la inducción de respuestas inmunes potencialmente patológicas tales como inflamación. Los conjugados terapéuticos de la invención comprenden al menos un péptido angiotensina o resto de péptido angiotensina y una VLP de un fago de ARN. Se describen conjugados de al menos un péptido angiotensina o resto de péptido angiotensina y una partícula de núcleo alternativa tal como HbcAg o pili.
Serán evidentes otras realizaciones de la presente invención para un especialista a la luz de lo que se conoce en la técnica, los siguientes dibujos y descripción de la invención, y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 1 y la angiotensina II en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio I, Angio 2, Angio 3 o Angio 4 acoplados a la proteína de la cápsida Q\beta.
La Figura 2 es un análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 2 y la angiotensina I en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio I, Angio 2, Angio 3 o Angio 4 acoplados a la proteína de la cápsida Q\beta.
La Figura 3 es un análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 1 y la angiotensina II en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio 5, Angio 6, Angio 7, Angio 8 o Angio 9 acoplados a la proteína de la cápsida Q\beta.
La Figura 4 es un análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 2 y la angiotensina I en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio 5, Angio 6, Angio 7, Angio 8 o Angio 9 acoplados a la proteína de la cápsida Q\beta.
Descripción detallada de la invención Definiciones
En la descripción que sigue, se utilizan ampliamente varios términos usados en el campo de la biología molecular, inmunología y medicina. Para proporcionar un entendimiento más claro y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se debe dar a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones no limitantes.
Inmunización activa: Como se usa en este documento, la expresión "inmunización activa" se refiere a la inducción de una respuesta inmune en un individuo, típicamente un animal, suscitada por la administración de un inmunógeno, vacuna, antígeno o conjugado que lleva un péptido angiotensina. Por el contrario, la inmunización pasiva se refiere a conferir inmunidad en un individuo mediante la transferencia de moléculas o células inmunes en dicho individuo.
Alfavirus: Como se usa en este documento, el término "alfavirus" se refiere a cualquiera de los virus de ARN incluidos dentro del género Alfavirus. Las descripciones de los miembros de este género están contenidas en Strauss y Strauss, Microbiol. Rev., 58: 491-562 (1994). Los ejemplos de alfavirus incluyen virus Aura, virus Bebaru, virus Cabassou, virus Chikungunya, virus de la encefalomielitis equina del Este, virus Fort morgan, virus Getah, virus Kyzylagach, virus Mayoaro, virus Middleburg, virus Mucambo, virus Ndumu, virus Pixuna, virus Tonate, virus Triniti, virus Una, virus de la encefalomielitis equina del Oeste, virus Whataroa, virus Sindbis (SIN), virus del bosque Semliki (SFV), virus de encefalomielitis equina venezolana (VEE) y virus del río Ross.
Enlazador de aminoácidos: Un "enlazador de aminoácidos", o también denominado únicamente "enlazador" en esta memoria descriptiva, como se usa en este documento, asocia el antígeno o determinante antigénico con el segundo sitio de unión o, más preferiblemente, ya comprende o contiene el segundo sitio de unión, típicamente -pero no necesariamente- como un resto aminoacídico, preferiblemente como un resto de cisteína. Sin embargo, la expresión "enlazador de aminoácidos", como se usa en este documento, no pretende implicar que dicho enlazador de aminoácidos consiste exclusivamente en restos aminoacídicos, incluso si una realización preferida de la presente invención es un enlazador de aminoácidos que consiste en restos aminoacídicos. Preferiblemente, los restos aminoacídicos del enlazador de aminoácidos están compuestos por aminoácidos de origen natural o aminoácidos no naturales conocidos en la técnica, todos L o todos D o mezclas de los mismos. Sin embargo, también se incluye dentro de la invención un enlazador de aminoácidos que comprende una molécula con un grupo sulfhidrilo o resto de cisteína. Dicha molécula comprende preferiblemente un resto alquilo C1-C6, cicloalquilo (C5,C6), arilo o heteroarilo. Sin embargo, además de una enlazador de aminoácidos, también debe incluirse dentro del alcance de la invención un enlazador que comprende preferiblemente un resto alquilo C1-C6, cicloalquilo (C5,C6), arilo o heteroarilo y está desprovisto de cualquier aminoácido o aminoácidos. La asociación entre el antígeno o determinante antigénico u opcionalmente el segundo sitio de unión y el enlazador de aminoácidos, preferiblemente es por medio de al menos un enlace covalente, más preferiblemente por medio de al menos un enlace peptídico.
Resto de péptido angiotensina: Como se usa en este documento, la expresión "resto de péptido angiotensina" se refiere a cualquier resto, ya tenga el resto o no la actividad biológica de una angiotensina nativa in vivo (por ejemplo, actividad de hormona nativa en los receptores, incluyendo tanto angiotensina I como II), que es capaz de actuar como un inmunomimético de péptidos angiotensina nativos (es decir, que mimetiza inmunológicamente la angiotensina para de esta manera generar anticuerpos que se unan a péptidos angiotensina nativos). Por lo tanto, dicho resto puede comprender convenientemente un péptido angiotensina, preferiblemente angiotensinógeno, angiotensina I (un decapéptido de fórmula Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu) o angiotensina II (un octapéptido de fórmula Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) o una variante funcionalmente equivalente de la misma. Por lo tanto, la expresión "resto de péptido angiotensina" incluye la expresión "péptido angiotensina" como se define dicho término en este documento. Dichas variantes funcionalmente equivalentes pueden incluir modificaciones de la secuencia de angiotensina I o II por sustitución, adición o deleción de un solo o de múltiples aminoácidos, y también secuencias en las que los restos aminoacídicos están modificados químicamente, pero que no obstante conservan la actividad inmunogénica de la angiotensina. Dichas variantes funcionalmente (o inmunológicamente) equivalentes pueden presentarse como variaciones biológicas naturales, o pueden prepararse usando técnicas conocidas y convencionales, por ejemplo, por síntesis o modificación química, mutagénesis, por ejemplo, mutagénesis dirigida o aleatoria, etc. Para los fines de esta definición, una característica clave con respecto a la modificación es que el péptido angiotensina conserva la capacidad de actuar como inmunomimético de la angiotensina nativa. De esta manera por ejemplo, un aminoácido puede reemplazarse por otro que conserve el carácter fisicoquímico del péptido angiotensina o su epítopo o epítopos, por ejemplo, en términos de densidad de carga, hidrofilicidad/hidrofobicidad, tamaño y configuración y, por lo tanto, conserve la estructura inmunológica. Las variantes de "adición" pueden incluir fusiones N- o C-terminales, así como la inserción intrasecuencia de un solo o de múltiples aminoácidos. Las deleciones pueden ser intrasecuencia o pueden ser truncamientos de los extremos N- o C-terminales. Los mutantes de deleción preferidos son los que permiten la inducción de anticuerpos N- o preferiblemente C-terminales. Tales anticuerpos pueden impedir la generación de angiotensina II activa, pero todavía permiten la degradación de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II unidos a
anticuerpo.
Péptido angiotensina: Como se usa en este documento, la expresión "péptido angiotensina" incluye todos los péptidos angiotensina, preferiblemente nativos y sus variantes funcionalmente equivalentes. Por lo tanto, la expresión "péptido angiotensina" puede considerarse un subconjunto de un "resto de péptido angiotensina" como se define en este documento. Como una cuestión práctica, puede determinarse si una variante dada de un péptido angiotensina (o resto de péptido angiotensina) es "funcionalmente equivalente" a un péptido angiotensina, preferiblemente nativo, mediante una diversidad de métodos de ensayo para determinar la actividad biológica de un péptido angiotensina. Ciertos de estos métodos de ensayo se describen en este documento, y otros serán rápidamente familiares para un especialista en la técnica.
Anticuerpo: Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas que son capaces de unirse a un epítopo o determinante antigénico. El término pretende incluir anticuerpos completos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla. Tales anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno humano e incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio V_{L} o V_{H}. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son de mamífero, por ejemplo, de ser humano, murinos, de conejo, cabra, cobaya, camello, caballo y similares u otros animales apropiados, por ejemplo, pollos. Como se usan en este documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de las bibliotecas de inmunoglobulinas humanas, o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 5.939.598, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.
Antígeno: Como se usa en este documento, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz de estar unida por un anticuerpo o un receptor de célula T (TCR) si se presenta por moléculas del MHC. El término "antígeno", como se usa en este documento, también incluye epítopos de células T. Un epítopo de célula T es reconocido por un receptor de célula T en el contexto de un MHC de clase I, presente en todas las células del cuerpo excepto los eritorcitos, o de clase II, presente en células inmunes y, en particular, en células presentadoras de antígenos. Este suceso de reconocimiento lleva a la activación de células T y a los posteriores mecanismos efectores tales como la proliferación de las células T, secreción de citoquinas, secreción de perforina, etc. Un antígeno es además capaz de ser reconocido por el sistema inmune y/o de ser capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T. Sin embargo esto puede requerir que, al menos en ciertos casos, el antígeno contiene o está unido a un epítopo de célula T_{H} y se proporcina en un adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopos (epítopos B y T). La reacción específica a la que se ha hecho referencia anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará preferiblemente, típicamente de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo o TCR y no con la multitud de otros anticuerpos o TCR que pueden suscitarse por otros antígenos. Los antígenos, como se usan en este documento, también pueden ser mezclas de varios antígenos individuales.
Determinante antigénico: Como se usa en este documento, la expresión "determinante antígenico" pretende referirse a esa porción de un antígeno que es reconocida específicamente por linfocitos B o T. Los linfocitos B responden a determinantes antigénicos extraños mediante la producción de anticuerpos, mientras que los linfocitos T son los mediadores de la inmunidad celular. De esta manera, los determinantes o epítopos antigénicos son las partes de un antígeno que son reconocidas por anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por receptores de células T. Un determinante antigénico contiene uno o más epítopos. Los alergenos también sirven como antígenos en animales vertebrados.
Asociación: Como se usa en este documento, el término "asociación", como se aplica al primer y segundo sitios de unión, se refiere a la unión del primer y segundo sitios de unión, que preferiblemente es por medio de al menos un enlace no peptídico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente la naturaleza de la asociación es covalente.
Primer sitio de unión: Como se usa en este documento, la expresión "primer sitio de unión" se refiere a un elemento de la partícula de núcleo que es de origen natural o no natural, con el que se puede asociar el segundo sitio de unión localizado en el antigénico o determinante antigénico. El primer sitio de unión puede ser una proteína, un polipéptido, un aminoácido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfluoruro), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. El primer sitio de unión se localiza, típicamente y preferiblemente, en la superficie de la partícula de núcleo, tal como, preferiblemente, la partícula similar a virus. Están presentes múltiples primeros sitios de unión en la superficie de la partícula de núcleo y similar a virus, respectivamente, típicamente en una configuración repetitiva.
Segundo sitio de unión: Como se usa en este documento, la expresión "segundo sitio de unión" se refiere a un elemento asociado con el antígeno o determinante antigénico con el que puede asociarse el primer sitio de unión localizado en la superficie de la partícula de núcleo y de la partícula similar a virus, respectivamente. El segundo sitio de unión del antígeno o determinante antigénico puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfluoruro), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. Está presente al menos un segundo sitio de unión en el antígeno o determinante antigénico. La expresión "antígeno o determinante antigénico con al menos un segundo sitio de unión" se refiere, por lo tanto, a un antígeno o construcción antigénica que comprende al menos el antígeno o determinante antigénico y el segundo sitio de unión. Sin embargo, en particular para un segundo sitio de unión, que es de origen no natural, es decir, que no es de origen natural dentro del antígeno o determinante antigénico, este antígeno o construcciones antigénicas comprenden un "enlazador de aminoácidos".
Unido: Como se usa en este documento, el término "unido" se refiere a una unión o enlace que puede ser covalente, por ejemplo, por acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, enlaces éster, éter, fosfoéster, amida, peptídicos, imida, enlaces de carbono-azufre, enlaces de carbono-fósforo y similares. El término "unido" es más amplio que e incluye términos tales como "acoplado", "fusionado" y "enlazado".
Proteína o proteínas de recubrimiento: Como se usa en este documento, la expresión "proteína o proteínas de recubrimiento" se refiere a la proteína o proteínas de un bacteriófago o fago de ARN capaces de incorporarse dentro del ensamblaje de la cápsida del bacteriófago o del fago de ARN. Sin embargo, cuando se hace referencia al producto génico específico del gen de una proteína de recubrimiento de fagos de ARN, se usa el término "CP". Por ejemplo, el producto génico específico del gen de proteína de cubierta del fago de ARN Q\beta se denomina "Q\beta CP", mientras que las "proteínas de cubierta" del bacteriófago Q\beta comprenden el "Q\beta CP" así como la proteína A1. La cápsida del bacteriófago Q\beta se compone principalmente del Q\beta Cp, con un contenido minoritario de la proteína A1. Asimismo, la proteína de cubierta VLP Q\beta contiene principalmente Q\beta CP, con un contenido minoritario de proteína A1.
Partícula de núcleo: Como se usa en este documento, la expresión "partícula de núcleo" se refiere a una estructura rígida con una organización repetitiva inherente. Una partícula de núcleo, como se usa en este documento, puede ser el producto de un proceso sintético o el producto de un proceso biológico.
Cantidad eficaz: Como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Una cantidad eficaz de la composición sería la cantidad que consigue este resultado seleccionado, y tal cantidad podría determinarse como una cuestión de rutina por un especialista en la técnica. Por ejemplo, una cantidad eficaz para tratar una deficiencia del sistema inmune podría ser esa cantidad necesaria para causar la activación del sistema inmune, dando como resultado el desarrollo de una respuesta inmune especifica de antígeno tras la exposición al antígeno. La expresión también es sinónima a la de "cantidad suficiente".
La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se trate, la composición particular que se administre, el tamaño del sujeto y/o la gravedad de la enfermedad o afección. Un especialista en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de una composición particular de la presente invención sin necesitar una experimentación excesiva.
Epítopo: Como se usa en este documento, el término "epítopo" se refiere a un elemento básico o unidad más pequeña de reconocimiento por un anticuerpo individual o receptor de células T y, por lo tanto, al dominio particular, región o estructura molecular a la que se une dicho anticuerpo o receptor de célula T. Un antígeno puede consistir en numerosos epítopos mientras que un hapteno, típicamente, puede poseer pocos epítopos.
Fusión: Como se usa en este documento, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de origen diferente en una cadena polipeptídica por combinación en fase de lectura de sus secuencias de nucleótidos codificantes. El término "fusión" abarca explícitamente fusiones internas, es decir, inserciones de secuencia de origen diferente dentro de una cadena polipeptídica, además de fusión con uno de sus extremos terminales.
Secuencia heteróloga: Como se usa en este documento, el término "secuencia heteróloga" se refiere a una segunda secuencia de ácido nucleico o proteína que normalmente no se encuentra con dicho ácido nucleico o proteína y, habitualmente, se añade artificialmente a la secuencia para conferir propiedades particulares. En un ejemplo, pueden añadirse aminoácidos heterólogos a proteínas de la cápsida recombinantes con el fin de la purificación de la proteína, o para servir como un primer sitio de unión.
Respuesta inmune: Como se usa en este documento, la expresión "respuesta inmune" se refiere a cualquier acción por el sistema inmune de un individuo que se dirige contra una molécula o compuesto, tal como un antígeno. En mamíferos, la respuesta inmune incluye tanto las actividades de las células como la producción de moléculas solubles tales como citoquinas y anticuerpos. El término incluye por lo tanto una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que lleva a la activación o proliferación de linfocitos B y/o T. En algunos casos, sin embargo, la respuesta inmune puede ser de baja intensidad y volverse detectable sólo cuando se usa al menos una sustancia de acuerdo con la invención. El término "inmunogénico" se refiere a un agente usado para estimular el sistema inmune de un organismo vivo, de manera que una o más funciones del sistema inmune se aumentan y se dirigen hacia el agente inmunogénico. Un "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido que provoca una respuesta inmune celular y/o humoral, en solitario o unido a un vehículo en presencia o ausencia de un adyuvante.
Desviación inmune: Como se usa en este documento, la expresión desviación inmune se refiere a la estimulación de una respuesta inmune que es de una naturaleza diferente a una respuesta inmune preexistente. Por ejemplo, un individuo que posee una respuesta inmune de T_{H}2 contra un alérgeno de modo que se producen anticuerpos IgE tras la exposición al alérgeno puede inducirse, mediante realizaciones de la presente invención, para producir una respuesta inmune de T_{H}1 contra el alérgeno. Dicha respuesta de T_{H}1 contrarrestará la alergia induciendo una respuesta de T_{H}2 y de esta manera aliviará la enfermedad alérgica.
Inmunoterápico: Como se usa en este documento, el término "inmunoterápico" se refiere a un conjugado para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones. Más específicamente, el término se usa para referirse a un método de tratamiento en el que se genera una respuesta inmune beneficiosa por vacunación.
Cantidad inmunológicamente eficaz: Como se usa en este documento, la expresión "cantidad inmunológicamente eficaz" se refiere a una cantidad de un conjugado suficiente para inducir una respuesta inmune en un individuo cuando se introduce en ese individuo. La cantidad de un conjugado necesaria para ser inmunológicamente eficaz varía de acuerdo con muchos factores incluyendo el conjugado, la presencia de otros componente en el conjugado (por ejemplo, adyuvantes), el antígeno, la vía de inmunización, el individuo, el estado fisiológico o inmune previo, etc.
Individuo: Como se usa en este documento, el término "individuo" se refiere a organismos multicelulares e incluye tanto plantas como animales. Los organismos multicelulares preferidos son animales, más preferiblemente son vertebrados, aun más preferiblemente son mamíferos y todavía más preferiblemente son humanos.
Aislado: Como se usa en este documento, cuando el término "aislado" se usa en referencia a una molécula, el término significa que esa molécula se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Además, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Las moléculas de ARN aisladas incluyen productos de replicación de ARNm in vivo o in vitro de moléculas de ADN y ARN. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen además moléculas producidas sintéticamente. Adicionalmente, también están aisladas las moléculas de vector contenidas en células hospedadoras recombinantes. Por lo tanto, no todas las moléculas "aisladas" tienen que estar purificadas.
Inmunoterápico: Como se usa en este documento, el término "inmunoterápico" es un conjugado que comprende moléculas inmunes y/o provoca una respuesta inmune para el tratamiento de enfermedades o trastornos.
Individuo: Como se usa en este documento, el término "individuo" se refiere a un organismo multicelular e incluye tanto plantas como animales. Los organismos multicelulares preferidos son animales, más preferiblemente son vertebrados, aun más preferiblemente son mamíferos y todavía más preferiblemente son humanos.
Bajo o indetectable: Como se usa en este documento, la expresión "bajo o indetectable", cuando se usa con referencia al nivel de expresión génica, se refiere a un nivel de expresión que es significativamente menor que el que se observa cuando el gen se induce de máximamente (por ejemplo, al menos cinco veces inferior) o que no es fácilmente detectable por los métodos usados en la siguiente sección de ejemplos.
Lectina: Como se usa en este documento, las proteínas obtenidas particularmente de las semillas de plantas leguminosas, pero también de muchas otras fuentes vegetales y animales, que tienen sitios de unión para mono- u oligosacáridos específicos. Los ejemplos incluyen concanavalina A y aglutinina de germen de trigo, que se usan ampliamente como agentes analíticos y preparativos en el estudio de glicoproteínas.
Mimotopo: Como se usa en este documento, el término "mimotopo" se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmune contra un antígeno o determinante antigénico. Generalmente, el término mimotopo se usará con referencia a un antígeno en particular. Por ejemplo, un péptido que suscita la producción de anticuerpos contra una fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) es un mimotopo del determinante antigénico al que se unen los anticuerpos. Un mimotopo puede tener o no una similitud estructural sustancial con o compartir propiedades estructurales con un antígeno o determinante antigénico contra el que induce una respuesta inmune. Se conocen en la técnica métodos para generar e identificar mimotopos que inducen respuestas inmunes contra antígenos o determinantes antigénicos particulares y se describen en otra parte en este documento.
Muteína: Como se usa en este documento, el término "muteína" se refiere a una proteína o polipéptido que difiere en uno o más aminoácidos de un polipéptido de referencia dado (por ejemplo, natural, de tipo silvestre, etc.).
Origen natural: Como se usa en este documento, la expresión "origen natural" significa que la totalidad o partes del mismo no son sintéticas y se presentan o se producen en la naturaleza. Preferiblemente, como se usa en este documento, la expresión "origen natural" significa que la totalidad no es sintética y se presenta o se produce en la naturaleza.
No natural: Como se usa en este documento, el término significa generalmente que no es de origen natural, más específicamente, el término significa que está hecho por el hombre.
Armazón molecular no natural: Como se usa en este documento, la expresión "andamiaje molecular no natural" se refiere a cualquier producto hecho por el hombre que sirve para proporcionar una serie rígida y repetitiva de primeros sitios de unión. Idealmente, pero no necesariamente, estos primeros sitios de unión están en un orden geométrico. El armazón molecular no natural puede ser orgánico o no orgánico y puede sintetizarse químicamente o a través de un proceso biológico, en parte o en su totalidad. El armazón molecular no natural está compuesto por: (a) una partícula de núcleo, ya sea de origen natural o no natural; y (b) al menos un primer sitio de unión. Origen no natural: Como se usa en este documento, la expresión "origen no natural" significa generalmente sintético o no de origen natural; más específicamente, la expresión significa hecho por el hombre.
Serie ordenada y repetitiva de antígenos o determinantes antigénicos: Como se usa en este documento, la expresión "serie ordenada y repetitiva de antígenos o determinantes antigénicos" se refiere generalmente a un patrón que se repite de antígenos o determinantes antigénicos, caracterizado por una disposición espacial típicamente y preferiblemente uniforme de los antígenos o determinantes antigénicos con respecto a la partícula de núcleo y a la partícula similar a virus, respectivamente. En una realización de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Los ejemplos típicos y preferidos de series ordenadas y repetitivas apropiadas de antígenos o determinantes antigénicos son los que poseen estrictamente órdenes paracristalinos repetitivos de antígenos o determinantes antigénicos, preferiblemente con espaciados de 0,5 a 30 nanómetros, preferiblemente de 5 a 15 nanómetros.
Inmunización pasiva: Como se usa en este documento, la expresión "inmunización pasiva" se refiere a la administración, por cualquier vía, de moléculas inmunes producidas exógenamente (por ejemplo, anticuerpos) o células (por ejemplo, células T) en un animal. La inmunización pasiva difiere de la inmunización "activa", en la que la inmunidad se obtiene por introducción de un inmunógeno, vacuna, antígeno o conjugado que lleva un hapteno en un individuo para suscitar una respuesta inmune.
Pili: Como se usa en este documento, el término "pili" (siendo el singular "pilus") se refiere a estructuras extracelulares de células bacterianas compuestas por monómeros de proteínas (por ejemplo, monómeros de pilina) que se organizan en patrones ordenados y repetitivos. Además, los pili son estructuras que están involucradas en procesos tales como la unión de células bacterianas a receptores de superficie de células hospedadoras, intercambios genéticos intercelulares y reconocimiento célula-célula. Los ejemplos de pili incluyen pili de tipo 1, pili P, pili F1C, pili S y pili 987P. Se exponen ejemplos adicionales de pili en otra parte en este documento.
Estructura tipo pilus: Como se usa en este documento, la expresión "estructura tipo pilus" se refiere a estructuras que tienen características similares a la de los pili y que están compuestas por monómeros de proteínas. Un ejemplo de una "estructura tipo pilus" es una estructura formada por una célula bacteriana que expresa proteínas de pilina modificadas que no forman series ordenadas y repetitivas que son esencialmente idénticas a las de pili naturales.
Polipéptido: Como se usa en este documento, el término "polipéptido" se refiere a un polímero compuesto por restos aminoacídicos, generalmente restos aminoacídicos naturales, unidos entre sí por enlaces peptídicos. Un polipéptido puede no estar necesariamente limitado en tamaño, e incluye tanto proteínas como péptidos. Un péptido es un polipéptido de un tamaño típico de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, o cualquier número de aminoácidos dentro de este intervalo general. No obstante, un péptido también puede ser de una longitud mayor, por ejemplo de hasta 120-150 aminoácidos.
Proteína: Como se usa en este documento, el término "proteína" se refiere a un polipéptido generalmente de un tamaño de aproximadamente 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, 2000 o más aminoácidos. Generalmente las proteínas tienen una estructura tridimensional definida aunque no tienen que tenerla necesariamente, y con frecuencia se las denomina plegadas, en oposición a péptidos y polipéptidos que frecuentemente no poseen una estructura tridimensional definida, pero en su lugar pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, y se denominan no plegados. No obstante, los péptidos también pueden tener una estructura tridimensional definida.
Purificado: Como se usa en este documento, cuando el término "purificado" se usa con referencia a una molécula, significa que la concentración de la molécula que se está purificando ha aumentado con relación a las moléculas asociadas con la misma en su entorno natural, o entorno en el que se producía, se encontraba o se sintetizaba. Las moléculas asociadas de forma natural incluyen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y azúcares, pero generalmente no incluyen agua, tampones y reactivos añadidos para mantener la integridad o facilitar la purificación de la molécula que se está purificando. Por ejemplo, incluso si se diluye ARNm con un disolvente acuoso durante una cromatografía en columna de oligo dT, las moléculas de ARNm se purifican mediante esta cromatografía si los ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas asociadas de forma natural no se unen a la columna y se separan de las presentes moléculas de ARNm. De acuerdo con esta invención, una sustancia puede ser un 5% o más, 10% o más, 20% o más, 30% o más, 40% o más, 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 8% o más, 95% o más, 98% o más, 99% o más o 100% pura cuando se considera en relación con sus contaminantes.
Receptor: Como se usa en este documento, el término "receptor" se refiere a proteínas o glicoproteínas o fragmentos de los mismos capaces de interaccionar con otra molécula, denominada ligando. El ligando puede pertenecer a cualquier clase de compuesto bioquímico o químico. El receptor no tiene que ser necesariamente una proteína unida a membrana. También son receptores proteínas solubles como, por ejemplo, proteína de unión a maltosa o proteína de unión a retinol.
Resto: Como se usa en este documento, el término "resto" pretende significar un aminoácido específico en una estructura o cadena lateral de un polipéptido.
Célula hospedadora recombinante: Como se usa en este documento, la expresión "célula hospedadora recombinante" se refiere a una célula hospedadora en la que se han introducido una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. Las células hospedadoras incluyen eucariotas incluyendo, por ejemplo, mamíferos, insectos, plantas, aves, levaduras; y procariotas, por ejemplo, E. coli, B. subtilis, etc.
Virus recombinante: Como se usa en este documento, la expresión "virus recombinante" se refiere a un virus que se modifica genéticamente por el hombre. La expresión abarca cualquier virus conocido en la técnica. Más específicamente, la expresión se refiere a un alfavirus modificado genéticamente por el hombre, y más específicamente, la expresión se refiere a un virus Sinbis modificado genéticamente por el hombre.
Fago de ARN: Como se usa en este documento, la expresión "fago de ARN" se refiere a virus de ARN que infectan bacterias, más específicamente a virus de ARN de sentido positivo de cadena sencilla que infectan bacterias.
Vector: Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a un agente (por ejemplo, un plásmido o virus) usado para transmitir material genético a una célula hospedadora. Un vector puede estar compuesto por ADN o ARN.
Partícula similar a virus (VLP): Como se usa en este documento, la expresión "partícula similar a virus" se refiere a una estructura que se asemeja a una partícula de virus. Además, una partícula similar a virus de acuerdo con la invención no se replica y no es infecciosa, ya que carece de todo o parte del genoma viral, en particular los componentes infecciosos y de replicación del genoma viral. Una partícula similar a virus de acuerdo con la invención puede contener un ácido nucleico distinto de su genoma. Una realización típica y preferida de una partícula similar a virus de acuerdo con la presente invención es una cápsida viral tal como la cápsida viral del virus, bacteriófago o fago de ARN correspondiente. Las expresiones "cápsida viral" o "cápsida", como se usan de forma intercambiable en este documento, se refieren a un ensamblaje macromolecular compuesto por subunidades de proteína viral. Típicamente y preferiblemente, las subunidades de proteína viral se ensamblan en una cápsida viral y cápsida, respectivamente, que tienen una estructura con una organización repetitiva inherente, en las que dicha estructura es, típicamente, esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsidas de fagos de ARN o HBcAg tienen una forma esférica de simetría icosaédrica. La expresión "estructura tipo cápsida", como se usa en este documento, se refiere a un ensamblaje macromolecular compuesto por subunidades de proteína viral que se asemejan a la morfología de la cápsida en el sentido definido anteriormente, pero que se desvía del ensamblaje simétrico típico al tiempo que se mantiene un grado suficiente de orden y repetitividad.
Partícula similar a virus de un bacteriófago: Como se usa en este documento, la expresión "partícula similar a virus de un bacteriófago" se refiere a una partícula similar a virus que recuerda la estructura de un bacteriófago, sin replicarse y sin ser infecciosa, y que carece al menos del gen o genes que codifican la maquinaria de replicación del bacteriófago, careciendo también típicamente del gen o genes que codifican la proteína o proteínas responsables de la unión viral para o de la entrada en el hospedador. No obstante, esta definición también debería incluir partículas similares a virus de bacteriófagos en las que el gen o genes mencionados anteriormente estén todavía presentes pero inactivos, y por lo tanto, también conducen a partículas similares a virus que no pueden replicarse y que no son infecciosas de un bacteriófago.
VLP de proteína de cubierta de fago de ARN: La estructura de la cápsida formada a partir del autoensamblaje de 180 unidades de proteína de cubierta de fago de ARN y que contiene, opcionalmente, ARN hospedador se denomina "VLP de proteína de cubierta de fago de ARN". Un ejemplo específico es la VLP de la proteína de cubierta Q\beta. En este caso particular, la VLP de la proteína de cubierta Q\beta puede ensamblarse exclusivamente a partir de subunidades Q\beta CP (generadas por expresión de un gen de Q\beta CP que contiene, por ejemplo, un codón de terminación TAA que impide cualquier expresión de la proteína A1 de mayor tamaño por supresión, véase Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)), o adicionalmente contiene subunidades de proteína A1 en el ensamblaje de la cápsida.
Partícula de virus: La expresión "partícula de virus", como se usa en este documento, se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus comprende un genoma rodeado por una cápsida proteica; otras tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envolturas, colas, etc.).
Uno, un o una: Cuando los términos "uno", "un" o "una" se usan en esta descripción, significan "al menos uno" o "uno o más", salvo que se indique de otra manera.
Como se usa en este documento cuando se hace referencia a cualquier valor numérico, el término "aproximadamente" significa un valor de \pm10% del valor indicado (por ejemplo, "aproximadamente 50ºC" abarca un intervalo de temperaturas desde 45ºC hasta 55ºC, ambas inclusive; de forma similar, "aproximadamente 100 mM" abarca un intervalo de concentraciones desde 90 mM hasta 110 mM, ambas inclusive).
Visión de conjunto
Se han desarrollado ahora potentes inmunógenos para la inducción de anticuerpos específicos para péptidos de angiotensina que son eficaces aun sin el uso de adyuvantes, y que pueden permitir un direccionamiento específico hacia angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Los inmunógenos consisten en restos de péptidos angiotensina que están unidos a partículas similares a virus (VLP) u otras partículas de núcleo tales como pili bacterianos o partículas tipo pilus. Esto da como resultado una serie de antígenos repetitiva altamente inmunogénica que es capaz de estimular la formación de anticuerpos aun sin el uso de adyuvantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de los restos de péptidos angiotensina usados, se inducen altos títulos de anticuerpos, y además, pueden inducirse específicamente contra los extremos N- o C-terminales de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Esto permite el direccionamiento específico de sólo una especie de péptidos angiotensina o una combinación de los mismos. Por lo tanto, los inmunógenos de la presente invención pueden usarse en un enfoque inmunoterápico para combatir afecciones asociadas con niveles elevados de restos de péptidos angiotensina, particularmente angiotensina II y derivados de la misma, producidos por el RAS.
La formación de conjugados de la invención, es decir, que unen uno o más restos de péptidos angiotensina a la partícula de núcleo (por ejemplo, la VLP), se consigue mediante enlaces covalentes no peptídicos. En una realización, la VLP contiene un primer sitio de unión, la molécula orgánica contiene un segundo sitio de unión. La asociación entre la molécula orgánica se produce por unión del primer y segundo sitios de unión directamente, o por medio de una tercera molécula. Los sitios de unión pueden ser de origen natural o pueden introducirse.
La inmunización de animales con conjugados de restos de péptidos angiotensina y partículas de núcleo, como se proporcionan por la invención, induce una fuerte respuesta inmune contra los restos de péptidos angiotensina presentados. Por lo tanto, los conjugados de la invención son útiles para la estimulación de una respuesta inmune contra una diversidad de restos de péptidos angiotensina o derivados de los mismos y, por lo tanto, para el uso en animales. La presente invención también se refiere a una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o más de los conjugados de la presente invención junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los conjugados de la invención pueden usarse para vacunar a un animal contra uno o más restos de péptidos angiotensina o derivados de los mismos. La vacunación puede ser para fines profilácticos o terapéuticos, o ambos. En general, pueden usarse moléculas inmunes, tales como anticuerpos, generadas contra tales conjugados o conjugados para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de una enfermedad, afección o trastorno. Tales anticuerpos, conjugados y conjugados de la invención también son útiles como kits de componentes.
Por lo tanto, en un aspecto la invención proporciona conjugados de uno o más restos de péptidos angiotensina con un vehículo en un conjugado que lleva un resto de péptido angiotensina ordenado o repetitivo, como se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona conjugados que comprenden al menos uno de tales conjugados de la invención y al menos otro componente, convenientemente al menos un excipiente o vehículo y, particularmente, al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los conjugados y conjugados de la invención son útiles para inducir respuestas inmunes contra restos de péptidos angiotensina. Una respuesta inmune de este tipo puede utilizarse para generar anticuerpos útiles para fines terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico.
Los conjugados de la presente invención comprenden series altamente ordenadas y repetitivas de uno o más restos de péptidos angiotensina. Las series de conjugado de acuerdo con la invención comprenden (a) una partícula de núcleo que comprende un primer sitio de unión y (b) un resto de péptido angiotensina que comprende un segundo sitio de unión, donde los elementos (a) y (b) se asocian mediante el primer y segundo sitios de unión asociados por al menos un enlace covalente no peptídico para formar dichas series ordenadas y repetitivas de conjugados que llevan restos de péptidos angiotensina.
Las partículas de núcleo usadas convenientemente en los conjugados de la invención pueden ser naturales o no naturales. Las partículas de núcleo naturales usadas en los conjugados de la presente invención incluyen partículas similares a virus de un fago de ARN. Las proteínas de estas partículas de núcleo naturales pueden ser naturales o recombinantes. Los primeros sitios de unión en la partícula de núcleo pueden ser de origen natural o pueden introducirse mediante medios químicos o recombinantes. Los restos de péptidos angiotensina usados en los conjugados y conjugados de la presente invención son los apropiados para inducir una respuesta inmune contra una diversidad de componentes del RAS (es decir, una diversidad de restos de péptidos angiotensina o derivados de los mismos), que incluyen, pero sin limitación, un péptido angiotensina, preferiblemente los que comprenden, o como alternativa que consisten en la secuencia, o fragmentos de la misma, de angiotensinógeno, angiotensina I (un decapéptido de fórmula Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu) o angiotensina II (un octapéptido de fórmula Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), o variantes funcionalmente equivalentes de los mismos incluyendo los restos de péptidos angiotensina descritas en otra parte en este documento. El segundo sitio de unión sobre el resto de péptido angiotensina puede ser de origen natural o puede introducirse. La interacción entre el primer y segundo sitios puede ser directa, o puede involucrar al menos a otra molécula, por ejemplo un enlazador. Adicionalmente pueden usarse moléculas entrecruzantes de acuerdo con la presente invención para la asociación del primer y segundo sitios de unión. Típicamente se usan moléculas entrecruzantes además del enlazador.
Los conjugados y conjugados de la invención son sorprendentemente eficaces para inducir respuestas inmunes, particularmente anticuerpos, contra una diversidad de restos de péptidos angiotensina. Por lo tanto, son útiles en conjugados apropiados para la inmunización de animales para terapéutica o profilaxis contra enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con el RAS, incluyendo, pero sin limitación, hipertensión, apoplejía, infarto, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia renal o hemorragia retinal. Los anticuerpos producidos por inmunización con los conjugados y conjugados de la invención también son útiles para fines terapéuticos y profilácticos.
En otras realizaciones, la invención proporciona conjugados de la invención para el uso en métodos de tratamiento y prevención de una enfermedad. También se describen kits apropiados para el diagnóstico y la exploración.
Conjugados de series ordenadas y repetitivas
La presente invención proporciona conjugados, como se definen en las reivindicaciones, que comprenden una serie ordenada y repetitiva de uno o más restos de péptidos angiotensina. Además, la invención permite convenientemente al usuario construir series ordenadas y repetitivas para diversos propósitos, y preferiblemente la inducción de una respuesta inmune contra uno o más restos de péptidos angiotensina o derivados de los mismos.
Los conjugados comprenden esencialmente, o como alternativa consisten en dos elementos: (1) un armazón molecular no natural; y (2) al menos un resto de péptido angiotensina con al menos un segundo sitio de unión capaz de la asociación a través de al menos un enlace con dicho primer sitio de unión.
El armazón molecular no natural comprende, o como alternativa consiste en: (a) una partícula de núcleo seleccionada del grupo que consiste en (1) una partícula de núcleo de origen no natural y (2) una partícula de núcleo natural; y (b) al menos un primer sito de unión conectado con dicha partícula de núcleo por al menos un enlace covalente. Las partículas de núcleo usadas en los conjugados, conjugados y métodos de la invención incluyen moléculas inorgánicas, partículas de virus, partículas similares a virus,y pili bacterianos. Los restos de péptidos angiotensina usados en los conjugados, conjugados y métodos de la invención tienen al menos un segundo sitio de unión que se selecciona del grupo que consiste en (a) un sito de unión que no es de origen natural dentro del resto de péptido angiotensina; y (b) un sitio de unión de origen natural dentro del resto de péptido angiotensina.
Se proporciona una serie ordenada y repetitiva a través de una asociación del segundo sitio de unión con el primer sitio de unión por medio de al menos un enlace. De esta manera, el resto de péptido angiotensina y el armazón molecular no natural se aproximan a través de esta asociación del primer y del segundo sitios de unión para formar una serie de antígenos ordenada y repetitiva:
El usuario puede diseñar específicamente el resto de péptido angiotensina y el segundo sitio de unión de tal manera que la disposición de todos los restos unidos al armazón molecular no natural, o en ciertas realizaciones a la partícula de núcleo, será uniforme. Por ejemplo, se puede colocar un solo segundo sitio de unión del resto de péptido angiotensina, asegurándose de este modo mediante el diseño de que todos los restos de péptidos angiotensina que se unen al armazón molecular no natural se colocan de una manera uniforme. En un aspecto de este tipo de la invención, se añaden uno o más aminoácidos adicionales (que llevan a un segundo sitio de unión de origen no natural) en el extremo C- o en el N-terminal de las secuencias de restos de péptidos angiotensina para asegurar, en particular, una asociación orientada y ordenada con la partícula de núcleo de acuerdo con la presente invención. De esta manera, la descripción proporciona un medio conveniente de colocación de cualquier resto de péptido angiotensina en un armazón molecular no natural en un orden definido y de una manera que forma un patrón repetitivo.
Como será evidente para los especialistas en la técnica, ciertas realizaciones de la invención implican el uso de tecnologías de ácido nucleico recombinante tales como clonación, reacción en cadena de la polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de proteínas recombinantes en células procariotas y eucariotas, etc. Tales metodologías son bien conocidas para los especialistas en la técnica y pueden encontrarse convenientemente en manuales de métodos de laboratorio publicados (por ejemplo, Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H Wiley & Sons, Inc. (1997)). También se describen adecuadamente en la bibliografía técnicas de laboratorio fundamentales para trabajar con líneas celulares de cultivo de tejidos (Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2ª edición, (1998)) y tecnologías basadas en anticuerpos (Harlow, E. y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, N. Y. (1988); Deutscher, M. P., "Guide to Protein Purification", Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R. K., "Protein Purification Principles and Practice", 3ª ed., Springer-Verlag, Nueva York (1994)) incorporándose todas ellas en este documento como referencia.
Además, son bien conocidas para los especialistas en la técnica tecnologías para acoplar moléculas orgánicas a aminoácidos y medios para generar derivados de restos de péptidos angiotensina que contienen segundos sitios de unión apropiados como son necesarias para la práctica de la invención. Tales metodologías pueden encontrarse en libros de texto químicos y publicaciones, incluyéndose a continuación ejemplos de las mismas e incorporándose como referencia; patente de Estados Unidos Nº 5.876.727; documento WO 99/61054; Isomura, S et al. J. Org. Chem. 66: 4115-4121 (2001); Matsushita, H. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 57: 1006-1010. (1974); Langone, J. L. y Van Vunakis, H., Methodos Enzymol. 84: 628-640 (1982); Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., Boca Ratón, Fla (1991).
Partículas de núcleo y armazones moleculares no naturales
La presente invención proporciona métodos para la formación de una serie ordenada y repetitiva de uno o más restos de péptidos angiotensina. Mediante la invención, esto se produce por asociación de una partícula de núcleo a la que se unen uno o más restos de péptidos angiotensina mediante un primer y segundo sitios de unión.
De esta manera, un elemento en ciertos conjugados es un armazón molecular no natural que comprende, o como alternativa que consiste en, una partícula de núcleo y un primer sitio de unión. Más específicamente, el armazón molecular no natural comprende, o como alternativa consiste en (a) una partícula de núcleo de origen natural o no natural y (b) al menos un primer sitio de unión conectado a la partícula de núcleo por al menos un enlace covalente.
Partículas de núcleo. En general, una partícula de núcleo puede ser un polímero sintético, una micela lipídica o un metal. Tales partículas de núcleo se conocen en la técnica, proporcionando una base a partir de la que construir el armazón molecular no natural.
A modo de ejemplo, se describe un polímero sintético o partículas de núcleo metálicas en la patente de Estados Unidos Nº 5.770.380 y patente de Estados Unidos Nº 5.334.394.
Los metales adecuados incluyen, pero sin limitación, cromo, rubidio, hierro, zinc, selenio, níquel, oro, plata, platino. Los materiales cerámicos apropiados incluyen, pero sin limitación, dióxido de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de rutenio y óxido de estaño. Las partículas de núcleo de esta realización pueden estar hechas de materiales orgánicos incluyendo, pero sin limitación, carbono y polímeros apropiados, incluyendo poliestireno, nylon y nitrocelulosa. Para partículas nanocristalinas, son útiles partículas hechas de óxido de estaño, dióxido de titanio o carbono (diamantes). Las micelas lipídicas para usar se preparan por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, Baiselle y Millar (Biophys. Chem. 4: 355-361 (1975)) o Corti et al. (Chem. Phys. Lipids 38: 197-214 (1981) o López et al. (FEBS Lett. 426: 314-318 (1998)) o Topchieva y Karezin (J. Colloid Interface Sci. 213: 29-35 (1999)) o Morein et al., (Nature 308: 457-460 (1984)).
La partícula de núcleo puede producirse mediante un proceso biológico, que puede ser natural o no natural. Por ejemplo, se forman virus y pili bacterianos o estructuras tipo pilus a partir de proteínas que se organizan en estructuras ordenadas y repetitivas. Por lo tanto, las partículas de núcleo pueden incluir un virus, partícula similar a virus, un pilus bacteriano, un fago, una partícula de cápsida viral o fragmentos de la misma. Las proteínas pueden ser recombinantes.
La partícula de núcleo del armazón molecular no natural puede comprender un virus, un pilus bacteriano, una estructura formada a partir de una pilina bacteriana, un bacteriófago, una partícula similar a virus, una partícula de cápsida viral o una forma recombinante de la misma. Cualquier virus conocido en la técnica que tenga una estructura de cubierta y/o de proteína de núcleo ordenada y repetitiva puede seleccionarse para usarse como un armazón molecular no natural. Los ejemplos de virus apropiados incluyen, pero sin limitación, sindbis y otros alfavirus, rabdovirus (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular), picornavirus (por ejemplo, rinovirus humano, virus Aichi), togavirus (por ejemplo, virus de la rubeola), ortomixovirus (por ejemplo, virus Thogoto, virus Batken, virus de la plaga de aves), poliomavirus (por ejemplo, poliomavirus BK, poliomavirus JC, poliomavirus aviar BFDV), parvovirus, rotavirus, virus Norwalk, virus de la glosopeda, un retrovirus, virus de la hepatitis B, virus del mosaico del tabaco, virus Flock House y papilomavirus humano (por ejemplo, véase la Tabla 1 en Bachman, M. F. y Zinkernagel, R. M., Immunol. Today 17: 553-558 (1996)).
En la presente invención, puede usarse bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago M11, bacteriófago MX1, bacteriófago NL95, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP, bacteriófago MS2, bacteriófago f2, bacteriófago PP7, bacteriófago AP205.
La partícula de núcleo puede comprender, o como alternativa consistir en proteínas recombinantes de rotavirus, proteínas recombinantes de virus Norwalk, proteínas recombinantes de alfavirus, proteínas recombinantes que forman pili bacterianos o estructuras tipo pilus, proteínas recombinantes del virus de la glosopeda, proteínas recombinantes de retrovirus, proteínas recombinantes del virus de la hepatitis B (por ejemplo, un HbcAg), proteínas recombinantes del virus del mosaico del tabaco, proteínas recombinantes del virus Flock House, y proteínas recombinantes de papilomavirus humano. En la presente invención puede usarse bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago M11, bacteriófago MX1, bacteriófago NL95, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP, bacteriófago MS2, bacteriófago f2, bacteriófago PP7, bacteriófago AP205.
La partícula de núcleo puede comprender además, o como alternativa consistir en uno o más fragmentos de dichas proteínas, así como variantes de dichas proteínas que conservan la capacidad de asociarse entre sí para formar series ordenadas y repetitivas de antígenos o determinantes antigénicos. Por ejemplo, como se explica en el documento US 2003/0175 290 A1, pueden formarse partículas de núcleo a partir de formas variantes del HBcAg humano que difieren notablemente de la partícula de tipo silvestre en la identidad y similitud de la secuencia de aminoácidos, y en la longitud de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del HBcAg de virus de la hepatitis B infectan a gansos nivales y patos difiere lo bastante del HBcAg de mamíferos infectados con virus que el alineamiento de proteínas es difícil. Sin embargo, ambos virus conservan la capacidad de formar estructuras de núcleo apropiadas para la formación de series de antígenos repetitivas ordenadas. De forma similar, el HBcAg puede conservar la capacidad para formar partículas multiméricas, típicamente de un virus, después de la eliminación de secuencias líder N-terminales, deleciones, sustituciones o adiciones adicionales a la secuencia. Los métodos que pueden usarse para determinar si las proteínas forman tales estructuras comprenden filtración en gel, electroforesis en gel de agarosa, centrifugación en gradiente de sacarosa y microscopía electrónica (por ejemplo Koschel, M. et al., J. Virol 73: 2153-2160 (1999)).
Primeros sitios de unión. Ya sea natural o no natural, la partícula de núcleo usada en los conjugados y métodos de la presente invención poseerá un componente que comprende un primer sitio de unión que está unido a la partícula de núcleo natural o no natural por al menos un enlace covalente. El elemento que comprende el primer sitio de unión está unido a una partícula de núcleo de un modo no aleatorio que proporciona un sitio de nucleación para crear una serie ordenada y repetitiva. Idealmente, pero no necesariamente, este elemento se asocia con la partícula de núcleo en un orden geométrico. El primer sitio de unión puede ser una parte natural de la partícula de núcleo, tal como un resto aminoacídico expuesto en la superficie apropiado para el acoplamiento con el segundo sitio de unión. Por ejemplo, la lisina y la cisteína pueden formar enlaces no peptídicos por medio de grupos reactivos en el aminoácido. Como alternativa, un elemento que contiene el primer sitio de unión puede introducirse en la partícula de núcleo mediante acoplamiento químico o a través del diseño de moléculas recombinantes. El primer sitio de unión puede ser, o puede encontrarse en, cualquier elemento que comprenda unido a una partícula de núcleo por al menos un enlace covalente.
El primer sitio de unión puede comprender, o como alternativa puede consistir en una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (es decir, un resto de una proteína, un polipéptido o péptido), un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fenilmetilsulfonilfluoruro), o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo de los mismos. En una realización más específica, comprendiendo el primer sitio de unión un antígeno, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estreptavidina, un receptor, un ligando de receptor, un ligando, una proteína de unión a ligando, un polipéptido con cremallera de leucina interactivo, un grupo amino, un grupo químico reactivo con un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo con un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo con un grupo sulfhidrilo o una combinación de los mismos.
En una realización, la invención utiliza la modificación por ingeniería genética de un virus para crear una fusión entre una proteína de la envoltura viral repetitiva y ordenada y el elemento que comprende el primer sitio de unión que comprende una proteína heteróloga, péptido, determinante antigénico o un resto aminoacídico reactivo de elección. Pueden incluirse otras manipulaciones genéticas conocidas para los especialistas en la técnica en la construcción del armazón molecular no natural; por ejemplo, puede ser deseable limitar la capacidad de replicación del virus recombinante mediante mutación genética. La proteína viral seleccionada para fusión con la proteína que contiene la proteína del primer sitio de unión debería tener una estructura organizada y repetitiva. Dicha estructura organizada y repetitiva incluye organizaciones paracristalinas con un espaciado de 0,5-30 nm, preferiblemente de 5-15 nm en la superficie del virus. La creación de este tipo de proteína de fusión dará como resultado múltiples primeros sitios de unión ordenados y repetitivos en la superficie del virus. De esta manera, la organización ordenada y repetitiva de los primeros sitios de unión que se obtiene como resultado reflejará la organización normal de la proteína viral nativa.
Como entenderán los especialistas en la técnica, el primer sitio de unión puede ser o puede ser una parte de cualquier proteína, polipéptido, azúcar, polinucleótido, péptido (aminoácido), polímero natural o sintético, un metabolito secundario o una combinación de los mismos adecuado que puede servir para unir específicamente el antígeno o determinante antigénico de elección al armazón molecular no natural. En una realización, el sitio de unión es una proteína o péptido que puede seleccionarse de los conocidos en la técnica. Por ejemplo, el primer sitio de unión puede ser un ligando, un receptor, una lectina, avidina, estreptavidina, biotina, un epítopo tal como un marcador HA o T7, Myc, Max, dominios de inmunoglobulina y cualquier otra secuencia de aminoácidos conocida en la técnica que sería útil como un primer sitio de unión.
Los especialistas en la técnica entenderán además que en otra realización de la invención, el primer sitio de unión puede crearse de forma secundaria a la creación de un elemento que lleve el primer sitio de unión (por ejemplo, una proteína o polipéptido) utilizado en la construcción de la fusión en fase de lectura con la proteína de la cápsida. Por ejemplo, puede utilizarse una proteína para la fusión con la proteína de la envoltura con una secuencia de aminoácidos que se sabe que está glicosilada de un modo específico y después, el resto de azúcar añadido como resultado puede servir en el primer sitio de unión del armazón viral a modo de unión con una lectina que sirve como el sitio de unión secundario de un antígeno. Como alternativa, una secuencia puede biotinilarse in vivo y el resto de biotina puede servir como el primer sitio de unión de la invención, o la secuencia puede someterse a una modificación química de restos aminoacídicos diferentes in vitro, sirviendo la modificación como el primer sitio de unión.
En una realización específica de la invención, el primer sitio de unión es el dominio de proteína con cremallera de leucina JUN-FOS que se fusiona en fase de lectura con la proteína de la cápsida (núcleo) de la hepatitis B (HBcAg). Sin embargo, será evidente para los especialistas en la técnica que pueden utilizarse otras proteínas de cápsida viral en la construcción de proteína de fusión para localizar el primer sitio de unión en el armazón molecular no natural de la invención. Por ejemplo, en otras realizaciones de la invención, el primer sitio de unión se selecciona para que sea un resto de lisina o cisteína que esté fusionado en fase de lectura con el HBcAg. También será evidente para todos los especialistas en la técnica que pueden utilizarse otra partículas de la cápsida viral o similares a virus en la construcción de proteína de fusión para localizar la primera unión en el armazón molecular no natural de la invención.
Partículas virales. A continuación se describen partículas virales. El armazón molecular no natural puede ser un alfavirus recombinante, y más específicamente, un virus Sindbis recombinante. Varios miembros de la familia alfavirus, Sindbis (Xiong, C. et al., Science 243: 1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11: 18-22 (1993)), virus del bosque Semliki (SFV) (Liljeström, P. y Garoff, H., Bio/Technology 9: 1356-1361 (1991)) y otros (Davis, N. L. et al., Virology 171: 189-204 (1989)), han recibido una atención considerable para usarse como vectores de expresión basados en virus para una diversidad de proteínas diferentes (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578-582 (1997); Liljeström, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5: 495-500 (1994)) y como candidatos para el desarrollo de vacunas. Se ha descrito el uso de alfavirus para la expresión de proteínas heterólogas y el desarrollo de vacunas (véanse las patentes de Estados Unidos Nº 5.766.602; 5.792.462; 5.739.026, 5.789.245; y 5.814.482). La construcción de un armazón alfaviral puede realizarse por medios conocidos en general en la técnica de la tecnología de ADN recombinante, como se describe mediante los artículos mencionados anteriormente.
Pueden utilizarse una variedad de células hospedadoras recombinantes para producir una partícula de núcleo basada en virus para la unión de uno o más restos de péptidos angiotensina.
También pueden usarse secuencias de ARN empaquetadas para infectar células hospedadoras. Estas secuencias de ARN empaquetadas pueden introducirse en células hospedadoras por adición de las mismas al medio de cultivo. Por ejemplo, la preparación de partículas alfavirales no infecciosas se describe en varias fuentes, incluyendo "Sindbis Expression System", Versión C (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA; Nº de catálogo K750-1).
Cuando se usan células de mamífero como células hospedadoras recombinantes para la producción de partículas de núcleo basadas en virus, generalmente estas células se desarrollarán en cultivo de tejidos. Se conocen bien en la técnica métodos para el desarrollo de células en cultivo (véase, por ejemplo, Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2ª edición, (1998); Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R., CULTURE OF
ANIMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983)).
Las partículas de núcleo basadas en virus pueden comprender, o como alternativa consistir en, un virus, partícula similar a virus, un fago, una partícula de cápsida viral o una forma recombinante de la misma. Los especialistas tienen los conocimientos para producir dichas partículas de núcleo y unir primeros sitios de unión a las mismas. La producción de partículas similares a virus de hepatitis B, en particular las ensambladas o autoensambladas a partir de HBcAg y partículas de la cápsida viral del sarampión como partículas de núcleo se describen en los Ejemplos 17 a 22 del documento WO 00/32227, que se incorpora explícitamente en este documento como referencia. En tales realizaciones, el dominio de proteína con cremallera de leucina JUN o el dominio de proteína con cremallera de leucina FOS puede usarse como un primer sitio de unión para el armazón molecular no natural de la invención. Un especialista en la técnica será consciente de los métodos para construir partículas de núcleo de hepatitis B que lleven un péptido fusionado en fase de lectura con un resto de lisina reactivo y restos de péptidos angiotensina que llevan un resto de cisteína genéticamente fusionado, como primer y segundo sitios de unión, respectivamente.
En otros casos, las partículas del núcleo pueden estar compuestas por una proteína de la cápsida (núcleo) de la hepatitis B (HBcAg), un fragmento de un HBcAg, u otra proteína o péptido que puede formar partículas similares a virus, que son series ordenadas, que se han modificado para eliminar o reducir el número de restos de cisteína libres. Zhou et al., (J. Virol. 66: 5393-5398 (1992)) demostraban que los HBcAgs que se habían modificado para eliminar los restos de cisteína naturalmente presentes, conservan la capacidad para asociarse y formar estructuras multiméricas. De esta manera, las partículas de núcleo apropiadas para usar incluyen las que comprenden HBcAg modificados o fragmentos de los mismos, en los que uno o más de los restos de cisteína naturalmente presentes se han delecionado o sustituido con otro resto aminoacídico (por ejemplo, un resto de resina).
Un HBcAg modificado que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1, o una subporción de la misma, puede usarse para para preparar armazones moleculares no naturales. En particular, los HBcAg modificados incluyen proteínas en las que uno o más de los restos de cisteína en las posiciones correspondientes a las posiciones 48, 61, 107 y 185 de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 se han delecionado o sustituido con otros restos aminoacídicos (por ejemplo, un resto de serina). Como reconocerá un especialista en la técnica, también podrían delecionarse o sustituirse con otros restos aminoacídicos restos de cisteína en localizaciones similares en variantes de HBcAg que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de la que se muestra en la SEC ID Nº: 1. Las variantes de HBcAg modificadas pueden usarse entonces para preparar conjugados de vacunas de la invención.
En determinadas circunstancias (por ejemplo, cuando se usa un reactivo entrecruzante heterobifuncional para unir uno o más restos de péptidos angiotensina al armazón molecular no natural), se piensa que la presencia de restos de cisteína libres en el HBcAg conduce al acoplamiento covalente de componentes tóxicos con partículas de núcleo, así como al entrecruzamiento de monómeros para formar especies indefinidas. Además, en muchos casos, estos componentes tóxicos pueden no ser detectables con ensayos realizados sobre conjugados de la invención. Esto es así porque el acoplamiento covalente de componentes tóxicos al armazón molecular no natural daría como resultado la formación de una población de especies diversas en la que los componentes tóxicos están unidos a diferentes restos de cisteína, o en algunos casos a ningún resto de cisteína, de los HBcAg. En otras palabras, cada resto de cisteína libre de cada HBcAg no estará unido covalentemente a componentes tóxicos. Además, en muchos casos, ninguno de los restos de cisteína de HBcAg particulares estará unido a componente tóxicos. Por lo tanto, la presencia de estos componentes tóxicos puede ser difícil de detectar porque estarían presentes en una población mixta de moléculas. La administración a un individuo de especies de HBcAg que contienen componentes tóxicos, sin embargo, podría conducir a una reacción adversa potencialmente grave.
Es bien conocido en la técnica que los restos de cisteína libres pueden estar involucrados en varias reacciones químicas secundarias. Estas reacciones secundarias incluyen intercambios de disulfuro, reacción con sustancias químicas o metabolitos que, por ejemplo, se inyectan o se forman en una terapia de combinación con otras sustancias, u oxidación directa y reacción con nucleótidos tras la exposición a luz UV. Por lo tanto, podrían generarse aductos tóxicos, especialmente considerando el hecho de que los HBcAg tienen una fuerte tendencia a unirse a ácidos nucleicos. La detección de dichos productos tóxicos en conjugados de antígeno-cápsida será difícil usando cápsidas preparadas que usan HBcAg que contienen cisteínas libres y entrecruzantes heterobifuncionales, ya que podría generarse una distribución de productos con un amplio intervalo de peso molecular. Por lo tanto, los aductos tóxicos se distribuirían entre una multiplicidad de especies, pudiendo cada uno estar presente individualmente a una baja concentración, pero alcanzan niveles tóxicos en conjunto.
En vista de lo anterior, una ventaja para el uso de HBcAg en conjugados de vacunas que se han modificado para eliminar restos de cisteína naturalmente presentes es que los sitios a los que pueden unirse especies tóxicas cuando los restos de péptidos angiotensina están unidos al armazón molecular no natural, se reducirían en número o se eliminarían por completo. Además, puede usarse una alta concentración de entrecruzante para producir partículas altamente decoradas sin la desventaja de generar una pluralidad de especies entrecruzadas indefinidas de monómeros de HBcAg (es decir, una mezcla diversa de HBcAg monoméricos entrecruzados).
Se han identificado varias variantes de HBcAg de origen natural. Yuan et al., (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)), por ejemplo, describen variantes en las que el resto de isoleucina en la posición correspondiente a la posición 97 en la SEC ID Nº: 1 se reemplaza con un resto de leucina o un resto de fenilalanina. Las secuencias de aminoácidos de varias variantes de HBcAg, así como de varias variantes del precursor del antígeno del núcleo de la hepatitis B, se describen en los informes del GenBank AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X8529, X85307, X65257, X85311, X85301, X85314, X85287, X85272, X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520, P03153, AF110999 y M95589, incorporándose la descripción de cada uno de los mismos en este documento como referencia. Estas variantes de HBcAg difieren en la secuencia de aminoácidos en varias posiciones, incluyendo los restos aminoacídicos que se corresponden con los restos aminoacídicos localizados en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121,,126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 y 183 en la SEC ID Nº: 1.
Se describen variantes de HBcAg adicionales que pueden modificarse adicionalmente de acuerdo con la descripción de esta memoria descriptiva en los documentos WO 00/198333, WO 00/177158 y WO 00/214478, incluidos en este documento como referencia en su totalidad.
Los HBcAg pueden proceder de cualquier organismo siempre que sean capaces de asociarse para formar una serie de antígenos ordenada y repetitiva. Pueden usarse HBcAg procesados en general (es decir, los que carecen de secuencias líder). Se describen conjugados de vacunas, así como métodos para usar estos conjugados, que emplean los HBcAg variantes descritos anteriormente para la preparación de armazones moleculares no naturales. Se describen adicionalmente variantes de HBcAg adicionales que son capaces de asociarse para formar estructuras diméricas o multiméricas. De esta manera, la invención incluye además conjugados de vacunas que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden, o como alternativa consisten en, secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 97% o aproximadamente el 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran en las secuencias anteriores, incluyendo la SEC ID Nº: 1, y formas de estas proteínas que se han procesado, cuando sea apropiado, para eliminar la secuencia líder N-terminal.
Si la secuencia de aminoácidos de un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 97% o aproximadamente el 99% con una de las secuencias de aminoácidos mostradas anteriormente, o una subporción de la misma, puede determinarse convencionalmente usando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit. Cuando se usa el Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular, por ejemplo, tiene una identidad de aproximadamente el 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se ajustan de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta el 5% del número total de restos aminoacídico en la secuencia de referencia. De tal manera, pueden hacerse comparaciones entre la secuencia de aminoácidos de HBcAg de la SEC ID Nº: 1 y otro HBcAg. Cuando se comparan proteínas que son relativamente similares, la referencia a un resto aminoacídico de una variante de HBcAg localizado en una posición que corresponde a una posición en particular en la SEC ID Nº: 1, se refiere al resto aminoacídico que está presente en esa posición en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1. La homología entre estas variantes de HBcAg es en su mayor parte lo suficientemente alta entre virus de la hepatitis B que infectan mamíferos de manera que un especialista en la técnica tendrá escasas dificultades para revisar tanto la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 1 como la de una variante de HBcAg particular e identificar restos aminoacídicos "correspondientes". Por ejemplo, en comparaciones entre la SEC ID Nº: 1 y la secuencia de aminoácidos de un HBcAg derivado de un virus que infecta marmotas de Norteamérica, es fácilmente evidente que existe un inserto de tres restos aminoácidos en esa secuencia entre los restos aminoacídicos 155 y 156 de la SEC ID Nº: 1.
Sin embargo, cuando el alineamiento es difícil, un especialista en la técnica reconocería la importancia de aminoácidos o motivos particulares en una secuencia. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de HBcAg de virus humanos difiere de la de virus de pato de tal manera que el alineamiento es difícil, aunque un especialista en la técnica reconocería restos de cisteína conservados que podrían sustituirse con otro resto aminoacídico o eliminarse antes de su inclusión en conjugados de vacunas de la invención.
En una realización, los restos de cisteína en las posiciones 48 y 107 de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 se eliminan o substituyen con otro resto aminoacídico pero la cisteína en la posición 61 se deja en su lugar. Además, el polipéptido modificado se usa entonces para preparar conjugados de vacunas de la invención.
La preparación de partículas similares a virus de hepatitis B ejemplares se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/32227, y por este medio en particular en los Ejemplos 17 a 19 y 21 a 24, así como en el documento WO 01/85208, y por este medio en particular en los Ejemplos 17 a 19, 21 a 24, 31 y 41, y en la solicitud de Estados Unidos en trámite Nº 10/050.902, presentada por el presente cesionario el 18 de enero del 2002. Para la última solicitud, se hace referencia en particular a los Ejemplos 23, 24, 31 y 51. Los tres documentos se incorporan explícitamente en este documento como referencia.
Como se establece en el Ejemplo 31 de la solicitud de Estados Unidos Nº 10/050,902 presentada por el presente cesionario el 18 de enero de 2002, los restos de cisteína en las posiciones 48 y 107, que son accesibles para el solvente, pueden eliminarse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida. En un ejemplo de este tipo, se ha descubierto que el mutante doble Cys-48-Ser, Cys-107-Ser HBcAg construido como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 10/050.902, presentada el 18 enero de 2002 (que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad) puede expresarse en E. coli.
Como se ha analizado anteriormente, la eliminación de los restos de cisteína libres reduce el número de sitios donde pueden unirse componentes tóxicos al HBcAg, y también elimina sitios en los que puede producirse el entrecruzamiento de restos de lisina y cisteína del mismo o de moléculas HBcAg vecinas. La cisteína en la posición 61, que está involucrada en la formación de dímeros y forma un puente disulfuro con la cisteína en la posición 61 de otro HBcAg, quedará normalmente intacta para la estabilización de dímeros y multímeros HBcAg de la invención. Los experimentos entrecruzantes realizados con (1) HBcAg que contienen restos de cisteína libres y (2) HBcAg cuyos restos de cisteína libres se han convertido en no reactivos con yodoacetamida, indican que los restos de cisteína libres del HBcAg son responsables del entrecruzamiento entre HBcAg a través de reacciones entre cadenas laterales de lisina derivatizada entrecruzantes heterobifuncionales y restos de cisteína libres. También se descubrió que el entrecruzamiento de subunidades de HBcAg conduce a la formación de especies de alto peso molecular de tamaño no definido que no pueden resolverse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Cuando un resto de péptido angiotensina está unido al armazón molecular no natural a través de un resto de lisina, puede ser ventajoso sustituir o delecionar uno o ambos de los restos de lisina naturalmente presentes localizados en las posiciones correspondientes a las posiciones 7 y 96 en la SEC ID Nº: 1, así como otros restos de lisina presentes en variantes de HBcAg. La eliminación de estos restos de lisina da como resultado la eliminación de sitios de unión para restos de péptidos angiotensina que podría alterar la serie ordenada y debería mejorar la calidad y uniformidad del conjugado de vacuna final.
En muchos casos, cuando se eliminan ambos restos de lisina naturalmente presentes en las posiciones correspondientes a las posiciones 7 y 96 en la SEC ID Nº: 1, se introducirá otra lisina en el HBcAg como un sitio de unión para un resto de péptido angiotensina. Se exponen métodos para insertar dicho resto de lisina, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 10/050.902, presenta el 18 de enero de 2002, y por este medio en particular en el Ejemplo 23 de la solicitud de Estados Unidos Nº 10/050.902 (que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad). Frecuentemente será ventajoso introducir un resto de lisina en el HBcAg, por ejemplo, cuando se altera ambos restos de lisina naturalmente presentes en posiciones correspondientes a las posiciones 7 y 96 en la SEC ID Nº: 1 y se busca unir el resto de péptido angiotensina al armazón molecular no natural usando un agente entrecruzante heterobifuncional.
Se ha demostrado que el extremo C-terminal del HBcAg dirige la localización nuclear de esta proteína (Eckhardt et al., J. Virol. 65: 575-582 (1991)). Además, también se piensa que esta región de la proteína confiere al HBcAg la capacidad para unir ácidos nucleicos.
En algunas realizaciones, los conjugados de vacunas pueden contener HBcAg que tienen actividad de unión a ácido nucleico (por ejemplo, que contienen un dominio de unión a ácido nucleico de HBcAg presente de forma natural). Los HBcAg que contienen uno o más dominios de unión a ácido nucleico son útiles para preparar conjugados de vacunas que presenten una actividad estimulante de células T aumentada. De esta manera, los conjugados de vacunas incluyen conjugados que contienen HBcAg que tienen actividad de unión a ácidos nucleicos. Además, se incluyen conjugados de vacunas, así como el uso de dichos conjugados en protocolos de vacunación, donde los HBcAg se unen a ácidos nucleicos. Estos HBcAg pueden unirse a los ácidos nucleicos antes de la administración a un individuo o pueden unirse a los ácidos nucleicos después de la administración.
Los HBcAg adicionales incluyen mutantes de truncamiento N- y C-terminales, y muteínas cuyas secuencias de aminoácidos comprenden, o como alternativa consisten en, secuencias de aminoácidos que tienen una identidad de al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 97%, o aproximadamente el 99% con los mutantes de truncamiento descritos anteriormente.
Como se ha analizado anteriormente, se introduce un resto de lisina como un primer sitio de unión en un polipéptido que forma el armazón molecular no natural. Pueden prepararse conjugados de vacunas usando un HBcAg que comprende, o como alternativa consiste en los aminoácidos 1-144 o aminoácidos 1-149 o aminoácidos 1-185 de la SEC ID Nº: 1, que se modifica de tal manera que los aminoácidos correspondientes a las posiciones 79 y 80 se reemplazan con un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly y los restos de cisteína en las posiciones 48 y 107 se delecionan o sustituyen con otro resto aminoacídico, mientras que la cisteína en la posición 61 se deja en su lugar.
Conjugados de vacunas adicionales comprenden fragmentos de un HBcAg que comprende, o como alternativa consiste en una secuencia de aminoácidos diferente de la que se muestra en la SEC ID Nº: 1, de la que se ha delecionado un resto de cisteína no presente en la localización correspondiente en la SEC ID Nº: 1.
Los conjugados de vacunas pueden comprender mezclas de diferentes HBcAg. De esta manera, estos conjugados de vacunas pueden estar compuestos por HBcAg que difieren en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, podrían prepararse conjugados de vacunas que comprenden un HBcAg de "tipo silvestre" y un HBcAg modificado en el que se han alterado uno o más restos aminoacídicos (por ejemplo, delecionado, insertado o sustituido).
Son conjugados de vacunas adicionales aquellos en los que el armazón molecular no natural se prepara usando un HBcAg fusionado a otra proteína. Como se ha analizado anteriormente, un ejemplo de dicha proteína de fusión es una fusión de HBcAg/FOS. Otros ejemplos de proteínas de fusión de HBcAg apropiadas para usarse en conjugados de vacunas incluyen proteínas de fusión en las que se ha añadido una secuencia de aminoácidos, contribuyendo a la formación y/o estabilización de dímeros y multímeros de HBcAg. Esta secuencia de aminoácidos adicional puede fusionarse con el extremo C-terminal del HBcAg. Un ejemplo, de una proteína de fusión de este tipo es una fusión de un HBcAg con la región de hélice GCN4 de Saccharomyces cerevisiae, que forma homodímeros por medio de interacciones no covalentes que pueden usarse para preparar y estabilizar dímeros y multímeros de HBcAg.
Pueden prepararse conjugados de vacunas usando proteínas de fusión de HBcAg que comprenden un HBcAg, o un fragmento del mismo, con un polipéptido GCN4 (PAALKRARNEAARRSRARKLQ-RMKQLEDKVEELLSKNYH
LENEVARLKK) fusionado en el extremo C-terminal. Este polipéptido GCN4 también puede fusionarse en el extremo N-terminal del HBcAg.
También podrían usarse proteínas de fusión de HBcAg/dominio de homología con src tipo 3 (SH3) para preparar conjugados de vacunas. Los dominios SH3, son dominios relativamente pequeños que se encuentran en varias proteínas que confieren la capacidad para interaccionar con secuencias específicas ricas en prolina en compañeros de unión a proteínas (véase McPherson, Cell Signal 11: 229-238 (1999). Podrían usarse proteínas de fusión de HBcAg/SH3 de varias maneras. En primer lugar, el dominio SH3 podría formar un primer sitio de unión que interacciona con un segundo sitio de unión del resto de péptido angiotensina. De forma similar, una secuencia de aminoácidos rica en prolina podría añadirse al HBcAg y usarse como un primer sitio de unión para un segundo sitio de unión de dominio SH3 de un resto de péptido angiotensina. En segundo lugar, el dominio SH3 podría asociarse con regiones ricas en prolina introducidas en HBcAg. De esta manera, podrían insertarse dominios SH3 y sitios de interacción con SH3 ricos en prolina en el mismo y/o HBcAg diferentes y usarse para formar y estabilizar dímeros y multímeros.
Como se demuestra por el ejemplo mencionado anteriormente, un especialista en la técnica sabrá cómo formar un armazón molecular que comprende partículas de núcleo y un primer sitio de unión a partir de HBcAg y muteínas derivadas de HBcAg. Por aplicación de procedimientos conocidos en la técnica y una experimentación de rutina, un especialista en la técnica entenderá cómo podrían usarse otros virus de forma similar para construir un armazón molecular.
Como se presenta en otro lugar en este documento, pueden usarse cápsidas virales para (1) la presentación de uno o más restos de péptidos angiotensina y (2) La preparación de conjugados de vacunas. Particularmente, son útiles proteínas de la cápsida viral, también denominadas en este documento como "proteínas de cubierta", que tras la expresión forman cápsidas o estructuras tipo cápsida. De esta manera, estas proteínas de la cápsida pueden formar partículas de núcleo y armazones moleculares no naturales. Generalmente, estas cápsidas o estructuras tipo cápsida forman series ordenadas y repetitivas que pueden usarse para la presentación de determinantes antigénicos y la preparación de conjugados de vacunas.
Pueden unirse uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) restos de péptidos angiotensina por gran cantidad de medios a una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) proteínas que forman cápsidas virales o estructuras tipo cápsida (por ejemplo, proteínas de cubierta de bacteriófagos), así como otras proteínas. Por ejemplo, puede unirse restos de péptidos angiotensina a partículas de núcleo usando un primer y segundo sitios de unión. Además, pueden usarse uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, etc.) entrecruzantes heterobifuncionales para unir uno o más restos de péptidos angiotensina a una o más proteínas que forman cápsidas virales o estructuras tipo cápsida.
Las proteínas de cápsida viral o fragmentos de las mismas pueden usarse, por ejemplo, para preparar partículas de núcleo y conjugados de vacunas. Las proteínas de cubierta de bacteriófago Q\beta, por ejemplo, pueden expresarse de forma recombinante en E. coli. Además, tras dicha expresión estas proteínas forman espontáneamente cápsidas, que son partículas similares a virus. Adicionalmente, estas cápsidas forman series de antígenos ordenadas y repetitivas que pueden usarse en la presentación de restos de péptidos angiotensina y la preparación de conjugados de vacunas.
La partícula similar a virus comprende, consiste esencialmente en o como alternativa consiste en proteínas recombinantes de un fago ARN. Preferiblemente, el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en: a) bacteriófago Q\beta; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; l) bacteriófago PP7 y m) bacteriófago AP205.
En otra realización preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes del bacteriófago de ARN Q\beta o del bacteriófago de ARN fr o del bacteriófago de ARN AP205.
Los ejemplos específicos de proteínas de cubierta de bacteriófagos que pueden usarse parar preparar conjugados de la invención incluyen las proteínas de cubierta de bacteriófagos de ARN, tales como bacteriófago Q\beta (SEC ID Nº: 3; base de datos PIR; Nº de acceso VCBPQ\beta con referencia a Q\beta CP y SEC ID Nº: 4, Nº de acceso AAA16663 con referencia a la proteína Q\beta A1), bacteriófago R17 (PIR Nº de acceso VCBPR7), bacteriófago fr (PIR Nº de acceso VCBPFR), bacteriófago GA (GenBank Nº de acceso NP-040754), bacteriófago SP (GenBank Nº de acceso CAA30374 con referencia a la SP CP y Nº de acceso con referencia a la proteína SP A1), bacteriófago MS2 (PIR Nº de acceso VCBPM2), bacteriófago M11 (GenBank Nº de acceso AAC06250), bacteriófago MX1 (GenBank Nº de acceso AAC14699), bacteriófago NL95 (GenBank Nº de acceso AAC14704), bacteriófago f2 (GenBank Nº de acceso P03611), bacteriófago PP7, bacteriófago AP205 (SEC ID Nº: 11). Como reconocerá un especialista en la técnica, cualquier proteína que forma cápsidas o estructuras tipo cápsida puede usarse para la preparación de conjugados de vacunas de la invención. Adicionalmente, la proteína A1 del bacteriófago Q\beta (GenBank Nº de acceso AAA16663 (SEC ID Nº: 4)) o formas truncadas C-terminales con ausencia de tantos como aproximadamente 100, aproximadamente 150 o aproximadamente 180 aminoácidos en su extremo C-terminal pueden incorporarse en un ensamblaje de cápsida de proteínas de cubierta de Q\beta. La proteína A1 también puede fusionarse con un elemento que contiene un primer sitio de unión, para la unión de restos de péptidos angiotensina que contienen un segundo sitio de unión. Generalmente, el porcentaje de proteína A1 con relación a Q\beta CP en el ensamblaje de cápsida se limitará, para asegurar la formación de la cápsida.
También se ha descubierto que la proteína de cubierta Q\beta se autoensambla en cápsidas cuando se expresa en E. coli (Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 (1993)). Las cápsidas o partículas similares a virus obtenidas mostraban una estructura de cápsida tipo fago icosaédrico con un diámetro de 25 nm y cuasi-simetría T = 3. Adicionalmente, se ha resuelto la estructura cristalina del fago Q\beta. La cápsida contiene 180 copias de la proteína de cubierta, que se unen en pentámeros y hexámeros covalentes por puentes disulfuro (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)). También se ha demostrado que otras proteínas de cubierta de fagos de ARN se autoensamblan tras la expresión en hospedadores bacterianos (Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170: 238-242 (1989), Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). La cápsida del fago Q\beta contiene, además de la proteína de cubierta, la llamada proteína de ultralectura A1 y la proteína de maduración A2. La A1 se genera por supresión en el codón de terminación UGA y tiene una longitud de 329 aa. La cápsida de la proteína de cubierta recombinante del fago Q\beta usada en la invención está desprovista de la proteína de lisis A2, y contiene ARN del hospedador. La proteína de cubierta de los fagos de ARN es una proteína de unión a ARN, e interacciona con el tallo-bucle del sitio de unión al ribosoma del gen de la replicasa, actuando como un represor de la traducción durante el ciclo de vida del virus. Se conocen los elementos de secuencia y estructurales de la interacción (Witherell, GW. y Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F. et al., J. Biol.. Chem. 271: 31839-31845 (1996)). En general se sabe que el tallo-bucle y el ARN están involucrados en el ensamblaje del virus (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554
(1996).
Tras la expresión en E. coli, la metionina N-terminal de la proteína de cubierta de Q\beta se elimina habitualmente, como se observa por secuenciación N-terminal de Edman como se describe en Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252: 990-993 (1997). Las VLP compuestas a partir de proteínas de cubierta de Q\beta en las que no se han eliminado la metionina N-terminal, o las VLP que comprende una mezcla de proteínas de cubierta de Q\beta en las que la metionina N-terminal se escinde o está presente, también están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización adicional preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas recombinantes, o fragmentos de las mismas, del fago de ARN AP205.
El genoma de AP205 consiste en una proteína de maduración, una proteína de cubierta, una replicasa y dos fases de lectura abierta que no están presentes en fagos relacionados; un gen de lisis y una fase de lectura abierta que juega un papel en la traducción del gen de maduración (Klovins,J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). La proteína de cubierta AP205 se puede expresar a partir del plásmido pAP283-58 (SEC ID Nº: 11), que es un derivado de pQb10 (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)), y que contiene un sitio de unión al ribosoma AP205. Como alternativa, la proteína de cubierta de AP205 se puede clonar en pQb185, cadena abajo del sitio de unión al ribosoma presente en el vector. Ambos enfoques conducen a la expresión de la proteína y la formación de cápsidas como se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 60/396.126, con el título "Molecular Antigen Arrays", y habiéndose presentado por el presente cesionario el 17 Julio 2002, que se incorpora como referencia en su totalidad, y en particular como se describe en el Ejemplo 2 de dicha solicitud de patente. Los vectores pQb10 y pQb185 son vectores derivados del vector pGEM y la expresión de los genes clonados en estos vectores se controla por el promotor trp (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)). El plásmido pAP283-58 (SEC ID Nº: 11) comprende un supuesto sitio de unión al ribosoma de AP205 en la siguiente secuencia, que está cadena abajo del sitio XbaI, e inmediatamente cadena arriba del codón de inicio ATG de la proteína de cubierta de AP205: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg. El vector pQb185 comprende una secuencia de Shine Delagarno cadena abajo del sitio XbaI y cadena arriba del codón de inicio (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg. La secuencia de Shine Delagarno está subrayada).
En una realización adicional preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteínas de cubierta recombinantes o fragmentos de las mismas del fago de ARN AP205.
Esta realización preferida de la presente invención, por lo tanto, comprende proteínas de cubierta de AP205 que forman cápsidas. Tales proteínas se expresan de manera recombinante o se preparan a partir de fuentes naturales. Las proteínas de cubierta de AP205 producidas en bacterias forman espontáneamente cápsidas, como se demuestra por microscopía electrónica (EM) e inmunodifusión. Las propiedades estructurales de la cápsida formada por la proteína de cubierta de AP205 (SEC ID Nº: 12) y las formadas por la proteína de cubierta del fago de ARN AP205 casi no se distinguen cuando se observan con EM. Las VLP de AP205 son altamente inmunogénicas y pueden unirse a antígenos y/o determinantes antigénicos para generar construcciones de vacunas que presentan los antígenos y/o determinantes antigénicos orientados de una forma repetitiva. Se obtienen altos títulos contra los antígenos presentados de este modo demostrando que los antígenos y/o determinantes antigénicos unidos son accesibles para interaccionar con moléculas de anticuerpos y son inmunogénicos.
En una realización adicional preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende o como alternativa consisten esencialmente en, o como alternativa consisten en proteínas de cubierta mutantes recombinantes o fragmentos de las mismas del fago de ARN AP205.
Las formas mutantes de ensamblaje competente de las VLP de AP205, incluyendo la proteína de cubierta de AP205 con la sustitución de prolina en el aminoácido 5 por treonina (SEC ID Nº: 13), también se puede usar en la práctica de la invención y conduce a una realización adicional preferida de la invención. Estas VLP, las VLP de AP205 derivadas de fuentes naturales o partículas virales de AP205, se pueden unir a antígenos para producir series repetitivas ordenadas de los antígenos de acuerdo con la presente invención.
La proteína de cubierta mutante AP205 P5-T se puede expresar a partir del plásmido pAP281-32 (SEC ID Nº: 14), que se obtiene directamente de pQb185, y que contiene el gen de la proteína de cubierta mutante de AP205 en lugar del gen de la proteína de cubierta de Q\beta. Los vectores para la expresión de la proteína de cubierta de AP205 se transfectan en E. coli para la expresión de la proteína de cubierta de AP205.
Se describen métodos para la expresión de la proteína de cubierta y la proteína de cubierta mutante, respectivamente, que conducen a un autoensamblaje en VLP en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 60/396.126 con el título "Molecular Antigen Arrays", y habiéndose presentado por el presente cesionario el 17 de julio de 2002, que se incorpora como referencia en su totalidad. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen, pero sin limitación, E. coli K802, JM 109, RR1. Los vectores y cepas adecuados y combinaciones de los mismos se pueden identificar por ensayo de la expresión de la proteína de cubierta y la proteína de cubierta mutante, respectivamente, por SDS-PAGE y la formación y ensamblaje de cápsidas purificando primero opcionalmente las cápsidas por filtración en gel y posteriormente ensayándolas en un ensayo de inmunodifusión (prueba de Ouchterlony) o microscopía electrónica (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)).
Las proteínas de cubierta de AP205 expresadas a partir de los vectores pAP283-58 y pAP281-32 pueden estar desprovistas del aminoácido de metionina inicial debido al procesamiento en el citoplasma de E. coli. Las formas escindidas y sin escindir de VLP de AP205, o mezclas de las mismas son realizaciones preferidas adicionales de la invención.
En una realización adicional preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en una mezcla de proteínas de cubierta recombinantes o fragmentos de las mismas del fago de ARN AP205 y de proteínas de cubierta mutantes recombinantes o fragmentos de las mismas del fago de ARN AP205.
En una realización adicional preferida de la presente invención, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en fragmentos de proteínas de cubierta recombinantes o proteínas de cubierta mutantes recombinantes del fago de ARN AP205.
Los fragmentos de proteína de cubierta de AP205 recombinante capaces de ensamblarse en una VLP y una cápsida, respectivamente, también son útiles en la práctica de la invención. Estos fragmentos se pueden generar por deleción, internamente o en los extremos terminales de la proteína de cubierta y la proteína de cubierta mutante, respectivamente. Las inserciones en la secuencia de la proteína de cubierta y de la proteína de cubierta mutante o fusiones de secuencias de antígenos con la secuencia de la proteína de cubierta y de la proteína de cubierta mutante, y compatibles con un ensamblaje en VLP, son realizaciones adicionales de la invención y conducen a proteínas de cubierta de AP205 quiméricas, y partículas, respectivamente. El resultado de las inserciones, eliminaciones y fusiones con la secuencia de la proteína de cubierta y si es compatible con el ensamblaje en una VLP puede determinarse por microscopía electrónica.
Las partículas formadas por la proteína de cubierta de AP205, fragmentos de proteínas de cubierta y proteínas de cubierta quiméricas antes descritas, se pueden aislar en forma pura por una combinación de etapas de fraccionamiento por precipitación y de etapas de purificación por filtración en gel usando, por ejemplo, columnas de Sefarosa CL-4B, Sefarosa CL-2B, Sefarosa CL-6B y combinaciones de las mismas como se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente con el título "Molecular Antigen Arrays", y habiéndose presentado por el presente cesionario el 17 de julio de 2002, que se incorpora por referencia en su totalidad. Se conocen en la técnica otros métodos de aislamiento de partículas similares a virus y se pueden usar para aislar las partículas similares a virus (VLP) del bacteriófago AP205. Por ejemplo, el uso de ultracentrifugación para aislar VLP del retrotransposón de levadura Ty se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.918.166, que se incorpora como referencia en este documento en su totalidad.
De acuerdo con la presente invención, uno o más restos de péptidos angiotensina pueden unirse a una subunidad de la cápsida de proteínas de cubierta de fagos de ARN. La capacidad para acoplar varios restos de péptidos angiotensina por subunidad de la cápsida de la proteína de cubierta de fagos de ARN y, en particular, de la cápsida de Q\beta, permite la generación de una serie de restos de péptidos angiotensina densa. Se describen otras cápsidas virales que pueden usarse para la unión covalente de restos de péptidos angiotensina por medio de un entrecruzado químico, tal como por ejemplo un HBcAg modificado con un resto de lisina en su región inmunodominante principal (MIR; documento WO 00/32227). La distancia entre los picos (correspondientes al MIR) de HBcAg es de 50 Angströms (Wynne, SA. et al., Mol. Cell 3: 771-780 (1999)), y por lo tanto no se puede generar una serie de restos de péptidos angiotensina con distancias más cortas que 50 A.
Las cápsidas de la proteína de cubierta de Q\beta presentan un número definido de restos de lisina en su superficie, con una topología definida con tres restos de lisina dirigidos hacia el interior de la cápsida que interaccionan con el ARN, y otros cuatro restos de lisina expuestos al exterior de la cápsida. Estas propiedades definidas favorecen la unión de restos de péptidos angiotensina al exterior de la partícula, y no al interior donde los restos de lisina interaccionan con el ARN. Las cápsidas de otras proteínas de cubierta de fagos de ARN también tienen un número definido de restos de lisina en su superficie y una topología definida de estos restos de lisina. Otra ventaja de las cápsidas derivadas de fagos de ARN es su alto rendimiento de expresión en bacterias, que permite la producción de grandes cantidades de material a un coste razonable.
Otra característica de la cápsida de la proteína de cubierta de Q\beta es su estabilidad. Las subunidades de Q\beta se unen entres sí mediante puentes disulfuro, uniendo covalentemente las subunidades. La proteína de la cápsida de Q\beta también muestra una resistencia poco habitual a disolventes orgánicos y agentes desnaturalizantes. Sorprendentemente, se ha observado que concentraciones de DMSO y acetonitrilo tan altas como de aproximadamente el 30% y concentraciones de guanidinio tan altas como de aproximadamente 1 M, se pueden usar sin afectar la estabilidad o a la capacidad de formar series de restos de péptidos angiotensina de la cápsida. Por lo tanto, se pueden usar estos disolventes orgánicos para acoplar moléculas hidrófobas, tales como ciertos restos de péptidos angiotensina. La alta estabilidad de la cápsida de la proteína de cubierta de Q\beta es una característica importante que se refiere a su uso para la inmunización y vacunación de mamíferos y seres humanos en particular. La resistencia de la cápsida a disolventes orgánicos permite el acoplamiento de restos de péptidos angiotensina o derivados de los mismos que no son solubles en tampones acuosos.
La inserción del resto de cisteína dentro de la horquilla \beta N-terminal de la proteína de cubierta del fago de ARN MS-2 se ha descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.698.424, observándose no obstante que la presencia de un resto de cisteína libre expuesto en la cápsida puede conducir a la oligomerización de cápsidas por medio de la formación de puentes disulfuro. Otras uniones contempladas en la patente de Estados Unidos anterior implica la formación de puentes disulfuro entre los restos de péptidos angiotensina y la partícula Q\beta. Dichas uniones son lábiles con moléculas que contienen restos sulfhidrilo.
La reacción entre un puente disulfuro inicial formado con un resto de cisteína sobre Q\beta y el antígeno que contiene un resto sulfhidrilo libre, libera especies que contienen sulfhidrilo distintas del resto de péptido angiotensina. Estas especies que contienen sulfhidrilo recién formadas pueden reaccionar de nuevo con otros puentes disulfuro presentes en la partícula, estableciendo así un equilibrio. Al reaccionar con el puente disulfuro formado en la partícula, el resto de péptido angiotensina puede formar un puente disulfuro con el resto de cisteína de la partícula o con el resto de cisteína de la molécula de grupo saliente que estaba formando el puente disulfuro inicial en la partícula. Además, el otro método de unión descrito, usando un agente de entrecruzamiento heterobifuncional que reacciona con una cisteína en la partícula Q\beta por un lado, y con un resto de lisina en el resto de péptido angiotensina por otro lado, puede conducir a una orientación aleatoria de los restos de péptidos angiotensina en la partícula.
Se observa además que, al contrario que la cápsida de las proteínas de cubierta de Q\beta y Fr, el MS-2 recombinante descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.698.424 está esencialmente libre de ácidos nucleicos, mientras que el ARN se empaqueta dentro de las dos cápsidas antes mencionadas.
Se describen aquí conjugados nuevos y de la invención y conjugados que permiten la formación de series robustas de restos de péptidos angiotensina, con una densidad variable de epítopos de angiotensina en los conjugados. Se demuestra que se puede lograr una densidad de epítopos muy elevada uniendo restos de péptidos angiotensina a VLP. Además, la densidad y el espaciamiento de restos de péptidos angiotensina se puede modificar por alteraciones en el número y tipo de restos con primeros sitios de unión adecuados. Por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 10/050.902 presentada el 18 de enero de 2002, describe una proteína de cubierta mutante de Q\beta con restos de lisina adicionales, adecuada para la obtención de series de densidad superior que las observadas con la proteína de cubierta de Q\beta de tipo silvestre. Además, la solicitud antes mencionada también describe conjugados adecuados para la presentación simultánea de varios antígenos con un espaciamiento adecuado, y conjugados en los que la adición de moléculas accesorias mejora la solubilidad o modifica la cápsida de una forma adecuada y deseada. Otros mutantes de proteínas de cubierta de Q\beta que forman cápsidas, que son partículas similares a virus, se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 10/050.902, y son adecuados para generar composiciones de la invención. En particular, en sucesos en los que la solubilidad del resto de péptido angiotensina y de la serie de antígenos de péptidos angiotensina-Q\beta impone un limite en el número de restos de péptidos angiotensina que pueden unirse a la partícula similar a virus Q\beta, pueden usarse mutantes en los que los restos de lisina se han substituido por argininas, que no tienen la misma reactividad que los restos de lisina. Cuando se preparan estas composiciones, puede usarse una alta concentración de resto de péptido angiotensina, o de resto de péptido angiotensina modificado para comprender un segundo sitio de unión, para lograr una reacción completa en los restos de lisina en las partículas similares a virus Q\beta mutantes sin generar partículas potencialmente insolubles con un número superior de restos de péptidos angiotensina unidos, como sería el caso cuando se usa la partícula similar a virus Q\beta de tipo silvestre (wt).
Se ha determinado la estructura del cristal de varios bacteriófagos de ARN (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-554 (1996)). Al usar tal información, un especialista en la técnica puede identificar fácilmente los restos expuestos en la superficie y modificar las proteínas de cubierta de bacteriófagos de tal manera que se puedan insertar uno o más restos aminoacídicos reactivos. Así, un especialista en la técnica podría generar e identificar fácilmente formas modificadas de proteínas de cubierta de bacteriófagos, que se pueden usar en la práctica de la invención. Así, también pueden usarse variantes de proteínas que forman cápsidas o estructuras tipo cápsidas (por ejemplo, proteínas de cubierta de bacteriófago Q\beta, bacteriófago R17, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP y bacteriófago MS2) para preparar conjugados de vacunas de la invención.
Aunque la secuencia de las proteínas variantes antes discutidas será diferente de sus homólogas de tipo silvestre, estas proteínas variantes conservarán generalmente la capacidad para formar cápsidas o estructuras de tipo cápsida. Así, la invención incluye además conjugados de vacunas que contienen variantes de proteínas que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsida, así como métodos para la preparación de tales conjugados de vacunas, subunidades de proteínas individuales usadas para preparar tales conjugados de vacunas. Así, se incluye dentro del alcance de la invención las formas variantes de proteínas de tipo silvestre que forman series ordenadas y repetitivas (por ejemplo, variantes de proteínas que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsida) y conservan la capacidad para asociarse y formar cápsidas o estructuras de tipo cápsida. Normalmente, las variantes de truncamiento C- y N-terminal conservan la capacidad de formar partículas similares a virus. Como resultado, las formas variantes que incluyen deleción, adición o sustitución, formas quiméricas, y variantes de origen natural son componentes adecuados de la invención.
Proteínas bacterianas de pili y pilina. A continuación se describen proteínas bacterianas de pili y pilina. Una pilina bacteriana, una subporción de pilina bacteriana o una proteína de fusión que contiene una pilina bacteriana o una subporción de la misma, pueden usarse para preparar conjugados de vacunas. Los ejemplos de proteínas de pilina incluyen pilinas producidas por Escherischia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Caulobacter cescentus, Pseudomonas stutzeri y Pseudomonas aeruginosa. Las secuencias de aminoácidos de proteínas de pilina adecuadas para su uso con la presente invención, incluyen aquellas expuestas en los informes del GenBank AJ000636, AJ132364, AF229646, AF051814, AF051815, y X00981, cuyas descripciones completas se incorporan en este documento como referencia.
Las proteínas de pilina bacterianas se procesan generalmente para eliminar las secuencias líder N-terminales antes de la exportación de las proteínas hacia el periplasma bacteriano. Además, como reconocería un especialista en la técnica, las proteínas bacterianas de pilina usadas para preparar conjugados de vacunas generalmente no tendrán la secuencia líder naturalmente presente.
Un ejemplo específico de una proteína de pilina es la P-pilina de E. coli (informe de GenBank AF237482). Un ejemplo de una pilina de E. coli de tipo 1 es una pilina que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en el informe del GenBank P04128 (SEC ID Nº: 2), que está codificada por un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en el informe de GenBank M27603. Las descripciones completas de estos informes del GenBank se incorporan en este documento como referencia. De nuevo, la forma madura de la proteína a la que se ha hecho referencia anteriormente se usaría generalmente para preparar conjugados de vacunas.
Las pilinas bacterianas o subporciones de pilina pueden ser capaces de asociarse para formar armazones moleculares no naturales. Se conocen bien en la técnica métodos para preparar pili y estructuras de tipo pilus in vitro. Bullita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12890-12895 (1996), por ejemplo, describe la reconstitución in vitro de subunidades de P-pili de E. coli. Además, Eshdat et al (J. Bacteriol. 148: 308-314 (1981)) describen métodos adecuados para disociar pili de tipo 1 de E. coli y para la reconstitución de pili. En resumen, estos métodos son los siguientes: los pili se disocian por incubación a 37ºC en clorhidrato de guanidina saturado. Las proteínas de pilina se purifican después por cromatografía, después de lo cual se forman dímeros de pilina por diálisis contra clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano 5 mM (pH 8,0). Eshdat et al. también descubrieron que los dímeros de pilina se vuelven a ensamblar para formar pili tras la diálisis contra tris(hidroximetil)aminometano 5 mM (pH 8,0) que contiene MgCl_{2} 5 mM.
Además, al usar por ejemplo ingeniería genética convencional y métodos de modificación de proteínas, se pueden modificar las proteínas de pilina para que contengan un primer sitio de unión al que se une un resto de péptido angiotensina a través de un segundo sitio de unión. Alternativamente, se pueden unir directamente restos de péptidos angiotensina a través de un segundo sitio de unión a restos aminoacídicos que están naturalmente presentes en estas proteínas. Esta proteína de pilina modificadas se pueden usar después en conjugados inmunizantes.
Las proteínas de pilina bacterianas usadas para preparar conjugados se puede modificar de una forma similar a la descrita en este documento para HBcAg. Por ejemplo, los restos de cisteína y de lisina pueden delecionarse o sustituirse con otros restos aminoacídicos, y se pueden añadir primeros sitios de unión a estas proteínas. Además, las proteínas de pilina se pueden expresar en forma modificada o se pueden modificar químicamente después de la expresión. De forma similar, se pueden recoger pili intactos de bacterias y luego modificarse químicamente.
En otro ejemplo, se recogen pili o estructuras de tipo pilus de bacterias (por ejemplo, E. coli) y se usan para formar conjugados de vacunas. Un ejemplo de pili adecuados para preparar conjugados de vacunas son el pilus de tipo 1 de E. coli, que se forma a partir de monómeros de pilina que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2.
Se conocen en la técnica varios métodos para recoger pili bacterianos. Bullitt y Makowski (Biophys. J. 74: 623-632 (1998)), por ejemplo, describen un método de purificación de pilus para recoger P-pili a partir de E. coli. De acuerdo con este método, los pili se fragmentan a partir de E. coli hiperpilada que contiene un plásmido de P-pilus y se purifican por ciclos de solubilización y precipitación con MgCl_{2} (1,0 M). El documento US 2003/0175290 A1 describe la recogida y purificación de pili de tipo I a partir de bacterias que producen pili de forma natural o en las que se ha introducido un vector que codifica el operón fim responsable de la producción de pilus.
Una vez recogidos, los pili o estructuras tipo pilus se pueden modificar de diversas formas. Por ejemplo, se puede añadir un primer sitio de unión a los pili con el que puede unirse uno o más restos de péptidos angiotensina a través de un segundo sitio de unión. En otras palabras los pili o estructuras de tipo pilus bacterianos pueden recogerse y modificarse para formar armazones moleculares no naturales.
Los pili o estructuras de tipo pilus también se pueden modificar mediante la unión de restos de péptidos angiotensina en ausencia de un primer sitio de unión no natural. Por ejemplo, podrían unirse antígenos o determinantes antigénicos a restos de cisteína o restos de lisina de origen natural. En tales casos, el alto orden y la repetibilidad de un resto aminoacídico de origen natural guiaría el acoplamiento de los restos de péptidos angiotensina con los pili o estructuras de tipo pilus. Por ejemplo, los pili o estructuras de tipo pilus podrían unirse a los segundos sitios de unión de los restos de péptidos angiotensina usando un agente de entrecruzado heterobifuncional.
Cuando las estructuras que se sintetizan de forma natural por organismos (por ejemplo, pili) se usan para preparar conjugados de vacunas, con frecuencia será ventajoso modificar por ingeniería genética estos organismos de manera que produzcan estructuras que tengan características deseables. Por ejemplo, cuando se usan pili de tipo 1 de E. coli, la E. coli a partir de la que se recogen estos pili se puede modificar para producir estructuras con características especificas. Los ejemplos de modificaciones posibles de proteínas de pilina incluyen la inserción de uno o más restos de lisina, la deleción o sustitución de uno o más de los restos de lisina naturalmente presentes y la deleción o sustitución de uno o más restos de cisteína naturalmente presentes (por ejemplo, los restos de cisteína en las posiciones 44 y 84 en la SEC ID Nº: 2).
Además, pueden realizarse modificaciones adicionales en genes de pilina que dan como resultado productos de expresión que contienen un primer sitio de unión distinto de un resto de lisina (por ejemplo, un dominio FOS o JUN). Por supuesto, generalmente los primeros sitios de unión adecuados estarán limitados a los que no impidan que las proteínas de pilina formen pili o estructuras de tipo pilus adecuadas para su uso en conjugados de vacunas. La capacidad de las proteína de pilina recombinantes para formar pili se puede determinar por varios métodos incluyendo microscopía electrónica.
Los genes de pilina que están presentes naturalmente en células bacterianas se pueden modificar in vivo (por ejemplo, por recombinación homóloga) o pueden insertarse genes de pilina con características particulares en estas células. Por ejemplo, podrían introducirse genes de pilina en células bacterianas como un componente de un vector de clonación replicable o un vector que se inserta en el cromosoma bacteriano. Los genes de pilina insertados también pueden unirse a secuencias de control reguladoras de la expresión (por ejemplo, el operador lac).
En la mayoría de los casos, los pili o estructuras de tipo pilus usadas en conjugados de vacunas estarán compuestos por un solo tipo de subunidad de pilina. Sin embargo, los conjugados también pueden incluir vacunas que comprenden pili o estructuras tipo pilus formadas a partir de subunidades de pilina heterogéneas. Se usarán generalmente pili o estructuras de tipo pilus compuestas por subunidades idénticas ya que se espera que formen estructuras que presenten series de antígenos altamente ordenadas y repetitivas.
Segundo sitio de unión. La preparación de armazones moleculares con series ordenadas y repetitivas se proporciona por la presente, incluyendo conjugados de cápsidas de proteínas de cubierta de fagos de ARN con una alta densidad de epítopos. La naturaleza del resto de péptido angiotensina, y la naturaleza y localización del segundo sitio de unión sobre el resto, son factores importantes que pueden tener influencia en los medios disponibles para construir conjugados de la invención, y en la eficacia de esos conjugados para inducir una respuesta inmune, como se entiende por los especialistas en la técnica.
Un requisito previo para diseñar un segundo sitio de unión es la elección de la posición en la que debería fusionarse, insertarse o en general modificarse por ingeniería o unirse. Un especialista sabrá cómo encontrar consejos para seleccionar la posición del segundo sitio de unión, y se pueden considerar muchos factores relevantes para esta decisión. La estructura química y/o cristalina del resto de péptido angiotensina puede proporcionar información sobre la disponibilidad de dominios en la molécula adecuados para el acoplamiento. La accesibilidad de un dominio reactivo a un disolvente puede ser un factor limitante en la cinética del acoplamiento químico con un primer sitio de unión. Deben estar disponibles grupos adecuados para el acoplamiento, tales como restos sulfhidrilo. En general, en el caso en el que se tiene como objetivo la inmunización con un resto de péptido angiotensina en la inhibición de la interacción del resto de péptido de la angiotensina, que también puede ser un autoantígeno con sus ligandos naturales, tales como un sustrato receptor, el segundo sitio de unión se añadirá de tal modo que permita la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción con los ligandos naturales. Así, la localización del segundo sitio de unión se seleccionará de modo que se evita el impedimento estérico del segundo sitio de unión o de cualquier enlazador aminoacídico que lo contenga. En realizaciones adicionales, se desea una respuesta de anticuerpos dirigida a un sitio diferente del sitio de interacción del antígeno con su ligando natural. En tales realizaciones, se puede seleccionar el segundo sitio de unión de manera que evite la generación de anticuerpos contra el sitio de interacción del antígeno con sus ligandos naturales. Otros factores de consideración incluyen la naturaleza del resto de péptido angiotensina, sus propiedades bioquímicas tales como pI, distribución de cargas, modificaciones adicional. En general, se favorecen los enlazadores flexibles.
Otros criterios para seleccionar la posición del segundo sitio de unión incluyen el estado de oligomerización del resto de péptido angiotensina, el sitio de oligomerización, la presencia de un cofactor y la disponibilidad de pruebas experimentales que describen sitios en la estructura y la secuencia del resto, en los que la modificación del resto es compatible con la función del resto, o con la generación de anticuerpos que reconocen el resto y, preferiblemente, bloquean la función del resto de péptido angiotensina. En ciertas realizaciones, se añaden uno o más aminoácidos adicionales (que conducen a un segundo sitio de unión de origen no natural) en los extremos C- o N-terminales de las secuencias de restos de péptidos angiotensina para asegurar, en particular, una asociación orientada y ordenada del resto de péptido angiotensina con la partícula similar a virus de acuerdo con la presente invención.
Un método particularmente favorecido de unión de antígenos polipeptídicos a cápsidas de las proteínas de cubierta de fagos de ARN, es la unión de un resto de lisina en la superficie de la cápsida de proteínas de cubierta de fagos de ARN con un resto de grupo sulfhidrilo en el antígeno, tal como se encuentra en restos de cisteína. De forma similar, los grupos sulfhidrilo libres en restos de péptidos angiotensina también pueden ser sitios de unión eficaces. Cuando los grupos sulfhidrilo oxidados deben estar en un estado reducido para funcionar como un segundo sitio de unión, la reducción puede conseguirse con, por ejemplo, DTT, TCEP o \beta-mercaptoetanol.
De acuerdo con la presente invención, la densidad de epítopos en la cápsida de proteínas de cubierta de fagos de ARN se puede modular mediante la selección de un entrecruzante y otras condiciones de reacción. Por ejemplo, los entrecruzantes Sulfo-GMBS y SMPH permiten alcanzar una alta densidad de epítopos. La derivatización se ve positivamente influenciada por una alta concentración de reactivos, y se puede usar la manipulación de las condiciones de reacción para controlar el número de antígenos acoplados a proteínas de la cápsida de fagos de ARN y, en particular, a la proteína de la cápsida de Q\beta. Además, el número de primeros sitios de unión en la partícula de núcleo es otro factor que afecta a la densidad de la serie de restos de péptidos angiotensina. En una realización de la presente invención, se proporciona una proteína de cubierta mutante de Q\beta con restos de lisina adicionales adecuados para obtener series de densidad superior.
En las realizaciones más preferidas, el resto de péptido angiotensina comprende un solo segundo sitio de unión o un solo sitio de unión reactivo capaz de la asociación con los primeros sitios de unión en la partícula de núcleo y las VLP o subunidades de VLP, respectivamente. Esto asegura una unión y una asociación definida y uniforme respectivamente, del al menos 1, pero típicamente más de uno, preferiblemente más de 10, 20, 40, 80, 120 antígenos a la partícula de núcleo y a la VLP, respectivamente. El suministro de un solo segundo sitio de unión o un solo sitio de unión reactivo en el antígeno, asegura así un tipo único y uniforme de unión y asociación, que conducen respectivamente a una serie muy altamente ordenada y repetitiva. Por ejemplo, si la unión y la asociación, respectivamente, se efectúan por medio de una interacción con lisina (como el primer sitio de unión) y cisteína (como segundo sitio de unión) se asegura de acuerdo con esta realización preferida de la invención, que solamente un resto de cisteína por antígeno, independientemente de si este resto de cisteína está o no presente naturalmente en el antígeno, es capaz de unirse y asociarse, respectivamente, con la VLP y el primer sitio de unión de la partícula de núcleo, respectivamente.
En la invención el covalente es un enlace no peptídico.
En algunas realizaciones, la modificación por ingeniería genética de un segundo sitio de unión en el antígeno requiere la fusión de un enlazador aminoacídico que contiene un aminoácido apropiado como segundo sitio de unión de acuerdo con las descripciones de la invención. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, un enlazador de aminoácidos se une al antígeno o al determinante antigénico por medio de al menos un enlace covalente. Preferiblemente, el enlazador aminoacídico comprende, o como alternativa consiste en, el segundo sitio de unión. En una realización preferida adicional, el enlazador aminoacídico comprende un grupo sulfhidrilo o un resto de cisteína. En otra realización preferida, el enlazador aminoacídico es cisteína. Algunos criterios de selección del enlazador aminoacídico, así como realizaciones preferidas adicionales del enlazador aminoacídico de acuerdo con la invención, ya se han mencionado anteriormente.
También se describen fusiones en las que el al menos un antígeno o determinante antigénico se fusiona con la partícula de núcleo y la partícula similar a virus, respectivamente. Como se ha resumido anteriormente, una VLP se compone típicamente de al menos una subunidad que se ensambla en una VLP. De esta manera, los antígenos o determinantes antigénicos, tales como el al menos un resto de péptido angiotensina, se fusionan con al menos una subunidad de la partícula similar a virus o de una proteína capaz de incorporarse en una VLP que genera una fusión quimérica de subunidad-VLP-resto de péptido angiotensina.
La fusión de los restos de péptidos angiotensina puede efectuarse por inserción en la secuencia de una subunidad de VLP, o por fusión con el extremo N- o C-terminal de la subunidad de VLP o la proteína capaz de incorporarse en una VLP. Posteriormente, cuando se hace referencia a proteínas de fusión de un péptido con una subunidad de VLP, se incluye la fusión en cualquiera de los extremos de la secuencia de la subunidad o la inserción interna del péptido dentro de la secuencia de la subunidad.
La fusión también puede efectuarse por inserción de las secuencias de restos de péptidos angiotensina en una variante de una subunidad de VLP en la que se ha delecionado parte de la secuencia de la subunidad, que se denominan adicionalmente mutantes de truncamiento. Los mutantes de truncamiento pueden tener deleciones N- o C-terminales o internas de parte de la secuencia de la subunidad de VLP. Por ejemplo, la VLP HBcAg específica con, por ejemplo, la deleción de los restos aminoacídicos 79 a 81 es un mutante de truncamiento con una deleción interna. La fusión de restos de péptidos angiotensina en cualquiera de los extremos N- o C-terminales de las subunidades de VLP mutantes de truncamiento, también conduce a conjugados. Así mismo, la fusión de un epítopo en la secuencia de la subunidad de VLP también puede efectuarse por sustitución, en la que por ejemplo, para la VLP HBcAg específica, los aminoácidos 79-81 se reemplazan con un epítopo extraño. De esta manera, la fusión, como se hace referencia posteriormente, puede efectuarse por inserción de la secuencia de un resto de péptido angiotensina en la secuencia de una subunidad de VLP, por sustitución de parte de la secuencia de la subunidad de VLP con la secuencia del resto de péptido angiotensina, o por una combinación de deleción, sustitución o inserciones.
La subunidad de VLP-resto de péptido angiotensina quimérica será en general capaz de autoensamblarse en una VLP. Los epítopos que presentan VLP fusionados con sus subunidades también se denominan en este documento VLP quiméricas. Como se indica, la partícula similar a virus comprende, o como alternativa se compone de, al menos una subunidad de VLP. En un ejemplo adicional, la partícula similar a virus comprende o como alternativa está compuesta por una mezcla de subunidades de VLP quiméricas y subunidades de VLP no quiméricas, es decir, subunidades de VLP que no tiene un antígeno fusionado con las mismas, conduciendo a las denominadas partículas mosaico. Esto puede ser ventajoso para asegurar la formación de, y el ensamblaje en una VLP. En esas realizaciones, la proporción de subunidades de VLP quiméricas puede ser del 1, 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 90, 95% o mayor.
Pueden añadirse restos aminoacídicos flanqueantes a cualquier extremo de la secuencia del péptido o epítopo que se va a fusionar con cualquier extremo de la secuencia de la subunidad de una VLP, o para la inserción interna de tal secuencia peptídica en la secuencia de la subunidad de una VLP. Los restos de glicina y serina son aminoácidos particularmente favorecidos para usarse en las secuencias flanqueantes añadidas al resto de péptido angiotensina que se va a fusionar. Los restos de glicina confieren una flexibilidad adicional, que puede disminuir el efecto potencialmente desestabilizante de fusionar una secuencia extraña en el interior de la secuencia de una subunidad VLP.
La VLP puede ser una VLP de antígeno de núcleo de Hepatitis B. Se han descrito proteínas de fusión con el extremo N-terminal de un HBcAg (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)) o inserciones en denominada región inmunodominante principal (MIR) (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), documento WO 01/98333). También se han descrito variantes de origen natural de HBcAg con delecines en la MIR, (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)), y se describen adicionalmente fusiones con el extremo N- o C-terminal, así como inserciones en la posición de la MIR correspondiente al sitio de deleción en comparación con un HBcAg wt. También se han descrito fusiones con el extremo C-terminal (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Un especialista en la técnica encontrará fácilmente consejos sobre cómo construir proteínas de fusión usando técnicas de biología molecular clásicas (Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ho et al., gene 77:51 (1989). Se han descrito vectores y plásmidos que codifican HBcAg y proteínas de fusión de HBcAg y que son útiles para la expresión de un HBcAg y proteínas de fusión de HBcAg (Pumpens, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)). También se describe a modo de ejemplo (Ejemplo 6) la inserción de un epítopo en la MIR de HBcAg, dando como resultado un HBcAg quimérico autoensamblable. Un factor importante para la optimización de la eficacia de autoensamblaje y de la presentación del epítopo que se va a insertar en la MIR de un HBcAg es la elección del sitio de inserción, así como el número de aminoácidos a delecionar de la secuencia de HBcAg dentro de la MIR (Pumpes, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); documentos EP 421 635; US 6.231.864) tras la inserción, o en otras palabras, qué aminoácidos del HBcAg se van a sustituir con el nuevo epítopo. Por ejemplo, se ha descrito la sustitución de los aminoácidos 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 u 80-81 con epítopos extraños (Pumpes, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); documentos EP 421 635; US 6.231.864). El HBcAg contiene una cola larga de arginina (Pumpes, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)) que es prescindible para el ensamblaje de cápsidas y capaz de unirse a ácidos nucleicos (Pumpes, P. y Grens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Son ejemplos descritos tanto HBcAg que comprende o carece de esta cola de arginina.
En una realización preferida adicional de la invención, la VLP es una VLP de un fago de ARN. Las proteínas de cubierta principales de fagos de ARN se ensamblan espontáneamente en VLP tras la expresión en bacterias y, en particular, en E. coli. Los ejemplos específicos de proteínas de cubierta de bacteriófagos que se pueden usar para preparar composiciones de la invención incluyen las proteínas de cubierta de bacteriófagos de ARN tales como el bacteriófago Q\beta (SEC ID Nº: 3; base de datos PIR Nº de acceso VCNPQ\beta que se refiere a Q\betaCP y SEC ID Nº: 4; Nº de acceso AAA16663 que se refiere a la proteína Q\beta A1) y el bacteriófago fr (Nº de acceso PIR VCBPFR).
El al menos un resto de péptido angiotensina puede fusionarse con una proteína de cubierta de Q\beta. Se han descrito construcciones de proteínas de fusión en las que se han fusionado epítopos en el extremo C-terminal de una forma truncada de la proteína A1 de Q\beta, o se han insertado dentro de la proteína A1 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39: 9-15(1996)). La proteína A1 se genera por supresión del codón de terminación UGA y tiene una longitud de 329 aa o 328 aa si se tienen en cuenta la escisión de la metionina N-terminal. La escisión de la metionina N-terminal antes de una alanina (el segundo aminoácido codificado por el gen de Q\beta CP) tiene lugar habitualmente en E. coli, y tal es el caso para extremos N-terminales de las proteínas de cubierta de Q\beta CP. La parte del gen de A1, 3' del codón ámbar UGA codifica la extensión de CP, que tiene una longitud de 195 aminoácidos. La inserción del al menos un resto de péptido angiotensina entre la posición 72 y 73 de la extensión de CP conduce a conjugados adicionales (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39: 9-15(1996)). La fusión de un resto de péptido angiotensina en el extremo C-terminal de una proteína Q\beta A1 truncada C-terminalmente conduce a ejemplos adicionales. Por ejemplo, Kozlovska, T. M., et al., (Intervirology, 39: 9-15(1996)) describe las fusiones de proteína Q\beta A1 en las que el epítopo se fusiona en el extremo C-terminal de la extensión de Q\beta CP truncada en la posición 19.
Como se describe por Kozlovska, et al., (Intervirology, 39: 9-15(1996)), el ensamblaje de las partículas que presentan los epítopos fusionados, requiere típicamente de la presencia tanto de la fusión de proteína A1-resto de péptido angiotensina como la CP wt para formar una partícula mosaico. Sin embargo también se describen realizaciones que comprenden partículas similares a virus y con ello en particular las VLP de la proteína de cubierta del fago de ARN Q\beta, que están compuestas exclusivamente por subunidades de VLP que tienen al menos un resto de péptido angiotensina fusionado con las mismas.
La producción de partículas mosaico se puede efectuar de diversas maneras. Kozlovska, et al., Intervirology, 39: 9-15(1996) describe dos métodos, pudiendo usarse ambos. En el primer enfoque, la presentación eficaz del epítopo fusionado en las VLP está mediada por la expresión del plásmido que codifica la fusión de proteína Q\beta A1 que tiene un codón de terminación UGA entre CP y la extensión de CP en una cepa de E. coli que alberga un plásmido que codifica un ARNt supresor de UGA clonado que conduce a la traducción del codón UGA dentro en Trp (plásmido pISM3001 (Smiley B. K et al., Gene 134: 33-40 (1993))). En otro enfoque el codón de terminación del gen de CP se modifica en UAA, y un segundo plásmido que expresa la fusión de proteína A1-resto de péptido angiotensina se cotransforma. El segundo plásmido codifica una resistencia a antibiótico diferente y el origen de replicación es compatible con el primer plásmido (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39: 9-15(1996)). En un tercer enfoque, la CP y la fusión de proteína A1-resto de péptido angiotensina están codificados de forma bicistrónica, unidos operativamente a un promotor tal como el promotor Trp, como se describe en la Figura 1 de Kozlovska, et al., Intervirology, 39: 9-15
(1996).
El resto de péptido angiotensina puede insertarse entre el aminoácido 2 y 3 (numeración de la CP escindida, es decir en la que se escinde la metionina N-terminal) de la fr CP, conduciendo así a una proteína de fusión de resto de péptido angiotensina-fr CP. Se han descrito vectores y sistemas de expresión para la construcción y expresión de proteínas de fusión de fr CP que se autoensamblan en VLP (Pushko P. et al.,Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)). La secuencia del resto de péptido angiotensina puede insertarse en una variante de deleción de la fr CP después del aminoácido 2, en la que se han delecionado los restos 3 y 4 de la fr CP (Pushko P. et al., Prot. Eng, 6: 883-891 (1993)).
También se ha descrito la fusión de epítopos en la horquilla \beta protuberante N-terminal de la proteína de cubierta del fago de ARN MS-2 y la presentación posterior del epítopo fusionado en la VLP autoensamblada del fago de ARN MS-2 (documento WO 92/13081), y también se describe la fusión de un resto de péptido angiotensina por inserción y sustitución en la proteína de cubierta del fago de ARN MS-2 también caen dentro del alcance de la invención.
Los restos de péptidos angiotensina pueden fusionarse con una proteína de cápsida de papilomavirus. En un ejemplo más específico, los restos de péptidos angiotensina se fusionan con la proteína principal de la cápsida L1 de papilomavirus bovino de tipo 1 (BPV-1). Se han descrito vectores y sistemas de expresión para la construcción y expresión de proteínas de fusión de BPV-1 en sistemas de baculovirus/células de insectos (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), documento WO 00/239556). La sustitución de los aminoácidos 130-136 de BPV-1 L1 con un resto de péptido angiotensina conduce a una proteína de fusión de BPV-1 L1-resto de péptido angiotensina.
La clonación en un vector de baculovirus y la expresión en células Sf9 infectadas con baculovirus se ha descrito (Chackerian, B et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), documento WO 00/23955). La purificación de las partículas ensambladas que presentan los restos de péptidos angiotensina fusionados se puede efectuar de varias maneras, tal como por ejemplo filtración en gel o ultracentrifugación en gradiente de sacarosa (Chackerian, B et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378, documento WO 00/23955).
En un ejemplo adicional, los restos de péptidos angiotensina se fusionan con una proteína Ty capaz de incorporarse en una Ty VLP. Más específicamente, los restos de péptidos angiotensina se fusionan con la p1 o proteína de la cápsida codificada por el gen TYA (Roth, J. F., Yeast 16: 785-795 (2000)). Los retrotransposones de levadura Ty1, 2, 3 y 4 se han aislado de Saccharonmyces cerevisiae, mientras que el retrotransposón Tf1 se ha aislado de Schizosaccharomyces pombae (Boeke, J. D. y Sandmeyer, S. B., "Yeast Transposable elemets", en The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics., p. 193, Cold Spring Habor Laboratory Press (1991)). Los retrotransposones Ty1 y 2 se relacionan con la clase copia de elementos vegetales y animales, mientras que Ty3 pertenece a la familia gypsy de retrotransposones, que se relaciona con retrovirus de plantas y animales. En el retrotransposón Ty1, la proteína p1 también denominada proteína Gag o de cápsida, tiene una longitud de 440 aminoácidos. La p1 se escinde durante la maduración de la VLP en la posición 408, lo que conduce a la proteína p2, el componente esencial de la VLP.
Se han descrito proteínas de fusión para p1 y vectores para la expresión de dichas proteínas de fusión en levaduras (Adams, S. E., et al., Nature 329: 68-70(1987)). Así, por ejemplo, un resto de péptido angiotensina se puede fusionar con p1 por inserción de una secuencia que codifica el resto de péptido angiotensina en el sitio BamH1 del plásmido pMA5620 (Adams, S. E., et al., Nature 329: 68-70(1987)). La clonación de secuencias que codifican epítopos extraños en el vector pMA5620 conduce a la expresión de proteínas de fusión que comprenden los aminoácidos 1-38 de p1 de Ty1-15 fusionados C-terminalmente en el extremo N-terminal del epítopo extraño. Así mismo, también se describe la fusión N-terminal de restos de péptidos angiotensina, o la inserción interna dentro de la secuencia de p1 o la sustitución de parte de la secuencia de p1. En particular, la inserción de restos de péptidos angiotensina en la secuencia Ty entre los aminoácidos 30-31, 67-68, 113-114 y 132-133 de la proteína Ty p1 (documento EP0677111) conduce a ejemplos específicos.
Son VLP adecuadas adicionales para la fusión de restos de péptidos angiotensina por ejemplo, partículas similares a retrovirus (documento WO9630523), HIV2 Gag (Kang, Y. C., et al., Biol. Chem 380: 353-364 (1999)), virus del mosaico del frijol (Taylor, K. M. et al., Biol. Chem. 380: 387-392 (1999)), parvovirus VP2 VLP (Rueda, P. et al., Virology 263: 89-99 (1999)), HBsAg (documentos US 4.722.840, EP0201416B1).
También se describen ejemplos de VLP quiméricas en Intervirology 39: 1 (1996). También se han realizado ejemplos adicionales de VLP_{ }son HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, virus del mosaico del tabaco, partículas similares a virus de SV-40, Poliomavirus, Adenovirus, Virus del Herpes Simple, Rotavirus y virus Norwalk y también se describen VLP quiméricos de esos VLP.
Entrecruzamiento. Los métodos para unir el resto de péptido angiotensina a la partícula de núcleo están bien dentro del conocimiento de trabajo del especialista en la técnica, y existen numerosas referencias para ayudar a dicho especialista (por ejemplo Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, N. Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Celis, J., ed., CELL BIOLGY, Academic Press, 2ª edición, (1998); Harlow, E. y Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Habor Laboratory, 
\hbox{Cold Spring Habor, N. Y. (1988),
incorporándose todas ellas en este documento como referencia en su
totalidad.}
Métodos diferentes de lograr una asociación entre la partícula de núcleo y el resto de péptido angiotensina se describen en este documento y se describen además en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 10/050.902, presentada el 18 de enero de 2002, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Los métodos incluyen los dominios de la proteína de cremallera de leucina JUN y FOS que se utilizan para el primer y segundo sitios de unión de la invención, respectivamente.
Las realizaciones preferidas de la invención comprenden el acoplamiento del armazón molecular no natural con el resto de péptido angiotensina por entrecruzamiento químico. Hay un amplio intervalo de compuestos que se han desarrollado para facilitar el entrecruzamiento de proteínas/péptidos o la conjugación de proteínas con moléculas derivatizadas, por ejemplo, restos de péptidos angiotensina. Estos incluyen, pero sin limitación, ésteres activos derivados del ácido carboxílico (compuestos activados), anhídridos mixtos, haluros de acilo, azidas de acilo, haluros de alquilo, N-maleimidas, ésteres imino, isocianatos e isotiocianatos, que se conocen por los especialistas en la técnica. Estos son capaces de formar un enlace covalente con un grupo reactivo de una molécula proteica. Dependiendo del grupo activador, el grupo reactivo es el grupo amino de un resto de lisina en una molécula proteica o el grupo tiol en una proteína transportadora o una molécula proteica transportadora modificada que, cuando se hace reaccionar, da como resultado la formación de un enlace amida, amina, tioéter, amidina urea o tiourea. Un especialista en la técnica puede identificar grupos activadores apropiados adicionales, por ejemplo, en los textos de referencia generales tales como Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (Wong (1991) CRC Press, Inc., Boca Raton, Flo.). La mayoría de los reactivos reaccionan preferencialmente con grupos de cadena lateral de lisina.
En algunas realizaciones, el resto de péptido angiotensina se une a la partícula de núcleo por medio de un entrecruzamiento químico, usando un entrecruzante heterobifuncional. Se conocen en la técnica varios entrecruzantes heterobifuncionales. En una realización, el entrecruzante heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con el grupo amino de cadena lateral de los restos de lisina de la partícula de núcleo, y un grupo funcional que puede reaccionar con un resto de cisteína o grupo sulfhidrilo presente, hecho disponible para la reacción por reducción, o producido por ingeniería genética en el resto de péptido angiotensina y opcionalmente también hecho disponible para la reacción por reducción. La primera etapa del procedimiento, llamada la derivatización, es la reacción de la partícula de núcleo con el entrecruzante. El producto de esta reacción es una partícula de núcleo activada, también llamada transportador activado. En la segunda etapa, se elimina el entrecruzante sin reaccionar usando métodos habituales tales como filtración en gel o diálisis. En la tercera etapa, el antígeno (por ejemplo, el resto de péptido angiotensina) se hace reaccionar con la partícula de núcleo activada, y esta etapa se llama etapa de acoplamiento. El antígeno sin reaccionar puede eliminarse opcionalmente en una cuarta etapa.
En una realización alternativa, el resto de péptido angiotensina se derivatiza con un resto activo apropiado para entrecruzamiento con el primer sitio de unión, generando un resto de péptido angiotensina activado. Tal derivatización puede presentarse en un resto de péptido angiotensina aislado o por medio de una síntesis química. El resto de péptido angiotensina activado se hace reaccionar después con la partícula de núcleo de modo que se produzca el acoplamiento.
Se conocen en la técnica varios entrecruzantes heterobifuncionales. Estos incluyen los entrecruzantes SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros entrecruzantes disponibles, por ejemplo, en la Pierce Chemical Company (Rockford, IL, Estados Unidos), y que tienen un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional reactivo hacia restos SH. Todos los entrecruzantes mencionados anteriormente conducen a la formación de un enlace tioéter. Otra clase de entrecruzantes apropiados en la práctica de la invención se caracteriza por la introducción de un enlace disulfuro entre el resto de péptido angiotensina y la partícula de núcleo tras el acoplamiento. Los entrecruzantes que pertenecen a esta clase incluyen, por ejemplo, SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce). El grado de derivatización de la partícula de núcleo con entrecruzante puede estar influenciado por condiciones experimentales variables tales como la concentración de cada uno de los compañeros de reacción, el exceso de un reactivo sobre el otro, el pH, la temperatura y la fuerza iónica, como es bien conocido de la teoría de reacción en el campo de la química orgánica. El grado de acoplamiento, es decir, la cantidad de resto de péptido angiotensina por transportador puede ajustarse al variar las condiciones experimentales descritas anteriormente para ajustarse a los requerimientos de la vacuna. La solubilidad del resto de péptido angiotensina puede imponer una limitación en la cantidad de antígeno que puede acoplarse en cada subunidad, y en los casos en los que la vacuna obtenida es insoluble, reducir la cantidad de antígenos por subunidad es beneficioso.
En una realización específica, el agente químico es el agente entrecruzante heterobifuncional, éster de N-hidroxisuccimida del ácido \varepsilon-maleimidocaproico (Tanimori et al., J. Pharm. Dyn. 4: 812 (1981); Fujiwara et al., J. Immunol. Meth. 45: 195 (1981)), que contiene (1) un grupo succinimida reactivo con grupos amino y (2) un grupo maleimida reactivo con grupos SH. Una proteína o polipéptido heterólogo del primer sitio de unión puede modificarse por ingeniería genética para contener uno o más restos de lisina que servirán como un resto reactivo para el resto de succimida del agente entrecruzante heterobifuncional. Una vez acoplado químicamente a los restos de lisina de la proteína heteróloga, el grupo maleimida del agente entrecruzante heterobifuncional estará disponible para reaccionar con el grupo SH de un resto de cisteína en el antígeno o determinante antigénico. La preparación de antígeno o determinante antigénico en este caso puede requerir la modificación por ingeniería genética de un resto sulfhidrilo como el segundo sitio de unión, de manera que puede reaccionar con la función maleimida libre en el agente entrecruzante unido al primer sitio de unión del armazón molecular no natural. De esta manera, en tal caso, el agente entrecruzante heterobifuncional se une a un primer sitio de unión del armazón molecular no natural y conecta el armazón con un segundo sitio de unión del resto de péptido angiotensina.
Otros métodos de acoplamiento del resto de péptido angiotensina con la partícula de núcleo incluyen métodos en los que el resto de péptido angiotensina se entrecruza con la partícula de núcleo usando enlaces carbodiimida. Estos incluyen carbodiimida EDC (clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida) y NHS. En un método, el EDC se mezcla con un resto de péptido angiotensina que contiene un resto ácido carboxílico amino o amido libre, después se añade al transportador de proteína. En otros métodos, el resto se une a la partícula de núcleo usando un entrecruzante homobifuncional tal como glutaraldehído, DSG, BM[EPO]_{4}, BS^{3}, (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, Estados Unidos) u otros entrecruzantes homobifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos hacia grupos amina o grupos carboxilo de la partícula de núcleo.
Pueden encontrarse métodos de entrecruzamiento adicionales y entrecruzantes, apropiados para unir un hapteno a una partícula de núcleo y una partícula similar a virus, respectivamente, así como consejos sobre la realización de reacciones de acoplamiento y sobre el uso de entrecruzantes químicos y procedimientos de entrecruzamiento químicos en Hermanson, G. T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc., San Diego, CA, Estados Unidos.
Los métodos descritos adicionalmente de unión de la partícula de núcleo a un resto de péptido angiotensina incluyen métodos en los que la partícula de núcleo está biotinilada, y el resto fusionado a estreptavidina, o métodos en los que tanto el resto como la partícula de núcleo están biotinilados. En este caso, el resto de péptido angiotensina puede unirse primero a estreptavidina o avidina para ajustar la proporción de resto con respecto a estreptavidina de tal manera que los sitios de unión libres estén todavía disponibles para la unión de la partícula de núcleo, que se añade en la siguiente etapa. Como alternativa, todos los componentes pueden mezclarse en una reacción de "un recipiente". Otras parejas de ligando-receptor, en las que está disponible una forma soluble del receptor y del ligando, y son capaces de entrecruzarse con la partícula de núcleo o el resto de péptido angiotensina, pueden usarse como agentes de unión para unir el resto de péptido angiotensina a la partícula de núcleo.
Restos de péptidos angiotensina
De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona series ordenadas, repetitivas de restos de péptidos angiotensina apropiadas para la inmunización contra tales restos. Los restos de péptidos angiotensina preferidas son los que comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia, o fragmentos de la misma, de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Como se ha indicado anteriormente, uno o más aminoácidos adicionales pueden añadirse convenientemente en los extremos C- o N-terminales de las secuencias de restos de péptidos angiotensina para asegurar, en particular, una asociación orientada 
\hbox{y ordenada del resto de péptido
angiotensina con la  partícula de núcleo.}
Los restos de péptidos angiotensina preferidas para usar en los conjugados y conjugados de la invención son los que comprenden, o como alternativa consisten en la secuencia de longitud completa de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Preferiblemente, los restos de péptidos angiotensina comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia de longitud completa de la angiotensina II, tal como CGGDRVYIHPF (denominada en este documento "Angio 1"; los aminoácidos adicionales a la secuencia peptídica de la angiotensina se indican por cursivas), o la secuencia de longitud completa de la angiotensina I, tal como CGGDRVYIHPFHL ("Angio 2"), DRVYIHPFHLGGC ("Angio 3") y CDRVYIHPFHL ("Angio 4"). Las realizaciones preferidas adicionales son aquellos restos de péptidos angiotensina que comprenden, o como alternativa consisten en, sólo un fragmento de las secuencias de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. Ciertas de tales realizaciones incluyen restos de péptidos angiotensina que comprenden, o como alternativa consisten en, al menos tres aminoácidos del extremo C-terminal de los péptidos angiotensina y, en una realización alternativa, de los que se han delecionado al menos cuatro aminoácidos del extremo N-terminal. Otras realizaciones relacionadas son las derivadas de la angiotensina I, tales como CHPFHL ("Angio 5") y CGPFHL ("Angio 6") o las derivadas de la angiotensina II, tales como CYIHPF ("Angio 7"), CGIHPF ("Angio 8") y CGGHPF ("Angio 9").
Las realizaciones adicionales de la presente invención usan restos de péptidos angiotensina que comprenden, o como alternativa consisten en, al menos tres aminoácidos del extremo N-terminal de los péptidos angiotensina y, para los que, en una realización preferida adicional, se han delecionado al menos cuatro, preferiblemente cinco, aminoácidos del extremo N-terminal. Otras realizaciones relacionadas son DRVYIGGC ("Angio 13"), DRVYGGC ("Angio 14") y DRVGGC ("Angio 15"). Se entenderá por los especialistas en la técnica, sin embargo, que los ejemplos anteriores de restos de péptidos angiotensina son ejemplos no limitantes, y que el número y la naturaleza de los aminoácidos añadidos para el acoplamiento, ya sea C- o N-terminal, puede variar.
En la presente invención, no es necesario que el resto de péptido angiotensina inmunizante comprenda una molécula intacta completa de cualquier resto de péptido angiotensina particular. Pueden generarse respuestas inmunes apropiadas contra los restos de péptidos angiotensina de interés mediante el uso de fragmentos del resto de péptido angiotensina, o derivados, mutantes o muteínas del mismo.
La invención abarca diferentes sitios de enlace y medios de enlace del resto de péptido angiotensina con la partícula de núcleo, describiéndose ejemplos no limitantes de los mismos en otra parte en este documento. También pueden determinarse sitios y medios preferidos de enlace por el especialista en la técnica basándose en la experiencia y teoría anterior y mediante experimentación de rutina.
Conjugados, vacunas y métodos de uso
La invención proporciona por lo tanto conjugados que pueden usarse para prevenir y/o aliviar enfermedades o condiciones asociadas con uno o más componentes del RAS, particularmente uno o más restos de péptidos angiotensina. La invención proporciona además métodos de vacunación para prevenir y/o aliviar enfermedades o afecciones en individuos, particularmente en animales tales como mamíferos, y particularmente seres humanos. En una realización preferida, los conjugados y conjugados de la invención estimulan una respuesta inmune que lleva a la producción de moléculas inmunes, incluyendo anticuerpos, que se unen a uno o más restos de péptidos angiotensina. La invención proporciona además métodos de vacunación para prevenir y/o aliviar enfermedades o afecciones asociadas con el RAS en individuos.
La naturaleza o tipo de respuesta inmune no es un factor limitante de esta descripción. El resultado deseado de una respuesta inmune terapéutica o profiláctica puede variar de acuerdo con la enfermedad, de acuerdo con principios bien conocidos en la técnica. Sin la intención de limitar la presente invención por la siguiente explicación mecánica, los conjugados de la invención pueden inducir anticuerpos que se unen a más de una especie de péptido angiotensina, por lo que bloquean todas las especies relevantes de angiotensina al mismo tiempo. Como alternativa, los anticuerpos inducidos pueden unirse específicamente al extremo C-terminal de angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II. En estas condiciones, los anticuerpos inducidos bloquearán la activación de angiotensinógeno o angiotensina I por la renina o la ACE, respectivamente. No obstante, proteasas diferentes de ACE o renina tales como endopeptidasas y aminopeptidasas pueden degradar el angiotensinógeno, angiotensina I o angiotensina II desde el extremo N-terminal impidiendo de esta manera la 
\hbox{acumulación de
angiotensinógeno,  angiotensina I o angiotensina II intactos unidos
a anticuerpos.}
Adicionalmente, puede desearse estimular diferentes tipos de respuestas inmunes dependiendo de la enfermedad, y de acuerdo con principios conocidos en la técnica. Es bien conocido, por ejemplo, que algunas respuestas inmunes son más apropiadas para un antígeno particular que otras respuestas inmunes. Algunas respuestas inmunes son, de hecho, inapropiadas y pueden causar patología, tal como inflamación patológica.
La naturaleza de la respuesta inmune puede verse afectada por la naturaleza del antígeno, la vía de introducción en el cuerpo, dosis, régimen de dosificación, naturaleza repetitiva del antígeno, fondo del hospedador y factores de señalización del sistema inmune. Tal conocimiento es bien conocido en la técnica. Como tal, puede confeccionarse una respuesta inmune por aplicación de tanto la teoría conocida en la técnica como de la experimentación de rutina.
Adicionalmente, la invención abarca el uso de diferentes partículas de núcleo durante el curso de la vacunación contra restos de péptidos angiotensina. Los individuos que desarrollan respuestas inmunes fuertes contra partículas de núcleo tales como, por ejemplo, pili, pueden inmunizarse con conjugados que comprenden el mismo resto de péptido angiotensina pero se diferencian en la partícula de núcleo.
Aunque sin desear quedar ligado a una teoría, los conjugados actuales de la presente invención proporcionan ventajas novedosas y sorprendentes particulares como componentes de conjugados farmacéuticos para generar una respuesta inmune, y particularmente como vacunas, contra uno o más restos de péptidos angiotensina. Otros vehículo conocidos en la técnica incluyendo BSA, hemocianina de lapa californiana, toxoide tetánico, proteínas de membrana externa bacteriana, toxina del cólera y Exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa pueden ser inapropiados para usarse en un individuo, y en particular un ser humano. Los vehículos mencionados anteriormente pueden inducir reacciones alérgicas, o estimular respuestas inmunes patológicas (por ejemplo, toxina del cólera, KLH, BSA). Los vehículos mencionados anteriormente pueden requerir la presencia de adyuvantes tales como adyuvante completo de Freund, ahora considerado inapropiado para uso en humanos. Varios vehículos pueden ser componentes de vacunas actuales (por ejemplo, toxoide tetánico, toxina del cólera, Exotoxina A). Como tal, un individuo puede poseer un alto nivel de inmunidad preexistente contra estos vehículos, de tal manera que la inmunización con un conjugado antígeno-vehículo inducirá una respuesta inmune relativamente grande contra el vehículo en vez de contra el nuevo antígeno. Por estas razones, individualmente o en conjunto, los conjugados y conjugados de la presente invención representan una mejora útil sobre las proteínas transportadoras mencionadas anteriormente.
En el uso de las realizaciones de la invención, uno o más restos de péptidos angiotensina conjugados con partículas de núcleo pueden captarse por células presentadoras de antígeno y de este modo estimular células T auxiliares para inducir respuestas inmunes. Las respuestas de células T auxiliares pueden dividirse en respuestas de células T auxiliares tipo 1 (T_{H}1) y tipo 2 (T_{H}2) (Romagnani, Immunol. Today 18: 263-266 (1997)). Las células T_{H}1 secretan interferón gamma y otras citoquinas que desencadenan que las células B produzcan anticuerpos IgG1-3. Por el contrario, una citoquina crítica producida por células T_{H}2 es IL-4, que lleva a las células B a producir IgG4 e IgE. En muchos sistemas experimentales, el desarrollo de respuestas T_{H}1 y T_{H}2 es mutuamente excluyente ya que las células T_{H}1 suprimen la inducción de las células T_{H}2 y viceversa. De esta manera, los antígenos que desencadenan una fuerte respuesta T_{H}1 suprimen simultáneamente el desarrollo de respuestas T_{H}2 y, por lo tanto, la producción de anticuerpos IgE. De manera interesante, prácticamente todos los virus inducen una respuesta T_{H}1 en el hospedador y no consiguen desencadenar la producción de anticuerpos IgE (Coutelier et al., J. Exp. Med. 165: 64-69 (1987)). Los anticuerpos del isotipo IgE son componentes importantes en las reacciones alérgicas. Los mastocitos unen anticuerpos IgE en sus superficies y liberan histaminas y otros mediadores de la respuesta alérgica tras la unión de un antígeno específico a las moléculas de IgE unidas a la superficie del mastocito. El patrón de isotipo típico de las respuestas T_{H}1 no se limita a virus vivos, sino que también se ha observado para partículas virales inactivadas o recombinantes (Lo-Man et al., Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407 (1998)). De esta manera, al usar los procesos de la invención (por ejemplo, tecnología de vacunas alfa), las partículas virales pueden decorarse con diversos restos de péptidos angiotensina y usarse para la inmunización. Debido a la "estructura viral" resultante de la serie, se desencadenará una respuesta T_{H}1, se producirán anticuerpos IgG1-3 "protectores", y se evitará la producción de anticuerpos IgE que causan reacciones alérgicas. De esta manera, la invención abarca conjugados capaces de inducir respuestas inmunes preferidas, notablemente respuestas del tipo T_{H}1. Además, la descripción describe el uso de conjugados de la invención para contrarrestar reacciones alérgicas inducidas por vacunas alternativas contra antígenos de interés.
Una característica ventajosa adicional de la invención es que pueden presentarse restos de péptidos angiotensina en las partículas en series uniformes, repetitivas, que son capaces de inducir respuestas inmunes eficaces tanto con como sin células T auxiliares. Esta característica de la invención es particularmente ventajosa.
A diferencia de proteínas aisladas, los virus inducen respuestas inmunes rápidas y eficaces en ausencia de cualquier adyuvante tanto con como sin células T auxiliares (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15: 235-270 (1997). Aunque los virus frecuentemente consisten en pocas proteínas, estas son capaces de desencadenar respuestas inmunes mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para respuestas de célula B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de los virus es la repetibilidad y orden de los epítopos de superficie. Muchos virus exhiben una superficie cuasi-cristalina que presenta una serie uniforme de epítopos que se entrecruzan eficazmente con inmunoglobulinas específicas de epítopo en células B (Bachmann y Zinkernagel, Immunol, Today 17: 553-558 (1996)). Este entrecruzamiento de inmunoglobulinas de superficie en células B es una fuerte señal de activación que induce directamente la evolución del ciclo celular y la producción de anticuerpos IgM. Además, tales células B desencadenadas son capaces de activar células T auxiliares, que a su vez inducen un cambio de producción de anticuerpos IgM a IgG en células B y la generación de una memoria de células B de larga duración -el objetivo de cualquier vacunación (Bachmann y Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). La presente invención proporciona un modo de mejorar la eficacia de la vacunación por aumento del grado de repetibilidad del resto de péptido angiotensina a usar en la inmunización, a través de la unión del resto de péptido angiotensina a las partículas de núcleo. Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona conjugados que comprenden una partícula de núcleo modificada para alterar el número y/o la disposición del organizador.
Como entendería un especialista en la técnica, cuando los conjugados de la invención se administran a un individuo, pueden estar en un conjugado que contiene sales, tampones, adyuvantes, u otras sustancias que son deseables para mejorar la eficacia del conjugado. Se proporcionan ejemplos de materiales apropiados para usar en la preparación de conjugados farmacéuticos en numerosas fuentes que incluyen REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990)).
Se dice que los conjugados de la invención son "farmacológicamente aceptables" si su administración puede tolerarse por un individuo receptor. Además, los conjugados de la invención se administrarán en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (es decir, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado).
Para inducir una respuesta inmune, los conjugados de la presente invención pueden administrarse a un animal, convenientemente un mamífero tal como un ser humano, por diversos métodos conocidos en la técnica, pero normalmente se administrarán por inyección, infusión, inhalación, administración oral, y otros métodos físicos apropiados. Los conjugados pueden administrarse alternativamente por vía intramuscular, intravenosa, transmucosa, transdérmica o subcutánea. Los componentes de conjugados para la administración incluyen soluciones y suspensiones acuosas (por ejemplo, solución salina fisiológica) o no acuosas estériles. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Pueden usarse vehículos o vendajes oclusivos para aumentar la permeabilidad cutánea y aumentar la absorción del antígeno.
Además, se describen moléculas inmunes producidas por inmunización con conjugados de la invención. Las moléculas inmunes incluyen anticuerpos y receptores de células T. Tales moléculas inmunes pueden ser útiles en un individuo vacunado para unirse para dirigirse a uno o más restos de péptidos angiotensina. Las moléculas inmunes también pueden ser útiles cuando se transfieren a otro individuo no inmunizado contra conjugados de la invención, para transferir de este modo la inmunidad "pasivamente". La molécula inmune puede ser un anticuerpo. Un anticuerpo monoclonal apropiado para unirse a uno o más restos de péptido angiotensina puede transferirse a un individuo para lograr una terapia o profilaxis.
Se describen los usos de anticuerpos producidos por inmunización con los conjugados de la invención en kits para la detección de uno o más restos de péptidos angiotensina en inmunoensayos (por ejemplo, ELISA). Pueden ser útiles series ordenadas repetitivas de restos de péptidos angiotensina para la detección de anticuerpos contra tales restos en ensayos de unión. Se describen procesos para la producción de los conjugados de la invención y métodos de tratamiento médico usando tales conjugados, particularmente para tratar uno o más trastornos físicos asociados con el RAS tales como hipertensión, apoplejía, 
\hbox{infarto,
insuficiencia cardíaca congestiva,  insuficiencia renal o hemorragia
retinal.}
Un especialista en la técnica pertinente entenderá que son fácilmente evidentes otras modificaciones y adaptaciones apropiadas de los métodos y aplicaciones descritas en este documento y que pueden realizarse sin alejarse del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Teniendo ahora descrita la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen en la misma para propósitos de ilustración solamente y no pretenden ser limitantes de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
Ejemplo 1
Acoplamiento de péptidos derivados de angiotensina I y angiotensina II con Q\beta y la inmunización de ratones con los conjugados resultantes A. Producción de conjugados
Las siguientes restos de péptidos angiotensina se sintetizaron químicamente: CGGDRVYIHPF ("Angio 1"), CGGDRVYIHPFHL ("Angio 2"), DRVYIHPFHLGGC ("Angio 3"), CDRVYIHPFHL ("Angio 4"), CHPFHL ("Angio 5"), CGPFHL ("Angio 6"), CYIHPF ("Angio 7"), CGIHPF ("Angio 8"), CGGHPF ("Angio 9"), DRVYIGGC ("Angio 13"), DRVYGGC ("Angio 14") y DRVGGC ("Angio 15"). Se usaron para acoplamiento químico con Q\beta como se describe a continuación.
Para péptidos Angio 1 a Angio 4: Una solución de 5 ml de 2 mg/ml de proteína de cápsida Q\beta en Hepes 20 mM. NaCl 150 mM pH 7,4 se hace reaccionar durante 30 minutos con 507 \mul de una solución de 13 mg/ml de Sulfo-MBS (Pierce) en H_{2}O a 25ºC en un agitador de balanceo. La solución de reacción se dializa posteriormente dos veces durante 2 horas contra 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC. Se hicieron reaccionar entonces 665 \mul de la mezcla de reacción dializada con 2,8 \mul de cada una de las soluciones de reserva de péptido 100 mM correspondiente (en DMSO) durante dos horas a 25ºC en un agitador de balanceo. La mezcla de reacción se dializó posteriormente 2x 2 horas contra 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a 4ºC.
Para péptidos Angio 5-9 y Angio 13-15: Una solución de 3 ml de 2 mg/ml de proteína de cápsida Q\beta en Hepes 20 mM. Se hizo reaccionar NaCl 150 mM pH 7,2 durante 50 minutos con 86 \mul de una solución de SMPH 100 mM (hexanoato de succinimidil-6-(\beta-maleimidopropionamido), Pierce) en DMSO a 25ºC en un agitador de balanceo. La solución de reacción se dializó posteriormente dos veces durante 2 horas contra 2 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC. Se hicieron reaccionar entonces 514 \mul de la mezcla de reacción dializada con 3,6 \mul de cada una de las soluciones de reserva de péptido 100 mM correspondiente (en DMSO) durante 4 horas a 25ºC en un agitador de balanceo. La mezcla de reacción se dializó posteriormente 2x 2 horas contra 2 litros de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4ºC.
B. Inmunización
Se vacunaron ratones Balb/c hembra con uno de nueve derivados de péptidos angiotensina acoplados con proteína de la cápsida de Q\beta sin adición de adyuvantes. Se diluyen 50 \mug (vacuna Q\beta-Angio 1-4) o 20 \mug (vacuna Q\beta-Angio 5-9) de proteína total de cada muestra en PBS hasta 200 \mul y se inyectó subcutáneamente (100 \mul en dos lados ventrales) en el día 0 y el día 14. Se extrajo sangre de los ratones retroorbitalmente el día 21 y su suero se analizó usando un ELISA específico de angiotensina.
Debe señalarse que las secuencias humana y murina de los péptidos angiotensina se corresponden idénticamente entre sí. Por lo tanto, la inmunización de un ser humano o un ratón con vacunas o conjugados, respectivamente, que comprenden restos de péptidos angiotensina como determinante antigénico de acuerdo con la invención, es una vacunación contra un autoantígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Análisis de ELISA de sueros de ratones vacunados con péptidos derivados de angiotensina I y angiotensina II acoplados a Q\beta
Los derivados de péptidos Angio 1 a Angio 9 y Angio 13-15 preparados como se describe en el Ejemplo 1 se acoplaron individualmente a la ARNsa A bovina (Sigma) usando el entrecruzante químico sulfo-SPDP. Se recubrieron placas ELISA durante la noche a 4ºC con preparaciones de ARNsa acopladas a una concentración de 10 \mug/ml en tampón de recubrimiento (NaH_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 9,6). Como alternativa, la angiotensina I o angiotensina II (SIGMA) se diluyen en el mismo tampón de recubrimiento a una concentración de 200 \mug/ml. Las placas se bloquearon con tampón de bloqueo (albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en PBS (pH 7,4)/Tween 20 al 0,05%) durante 2 horas a 37ºC, se lavaron con PBS (pH7,4)/Tween 20 al 0,05% y luego se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con sueros de ratón diluidos en serie en tampón de bloqueo. Las placas se lavaron con PBS (pH 7,4)/Tween 20 al 0,05%, y luego se incubaron con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano rusticano a 1 \mug/ml (Jackson ImmunoResearch) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS (pH 7,4)/Tween 20 al 0,05% y se añadió la solución de sustrato (Na_{2}HPO_{4} 0,066 M, ácido cítrico 0,035 M (pH 5,0) + 0,4 mg OPD (diclorhidrato de 1,2-fenilendiamina) + H_{2}O_{2} al 0,01%). Después de 10 minutos, la reacción de color se detiene con H_{2}SO_{4} al 5% y se lee la absorbancia a 450 nm.
Como un control, también se ensayaron los sueros preinmunes de los mismos ratones. Los experimentos de ELISA de control usando sueros de ratones inmunizados con péptidos no relacionados entrecruzados con Qf3 u otros portadores, demostraban que los anticuerpos detectados eran específicos para el péptido respectivo. Los títulos de ELISA se calculan como la dilución de suero recíproca que da una señal semimáxima en el ELISA (50% de la densidad óptica máxima).
Resultados
La Figura 2 muestra análisis ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 2 y angiotensina I en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio 1-4 acoplados a la proteína de la cápsida de Q\beta. Q\beta-Angio 1, Q\beta-Angio 1, Q\beta-Angio 3 y Q\beta-Angio 4, como se usan en las Figuras, representan la vacuna inyectada en los ratones, de los que se obtienen los sueros de acuerdo con la definición anterior de los péptidos angiotensina. Se vacunaron ratones Balb/c hembra por vía subcutánea con 50 \mug de vacuna en PBS el día 0 y el día 14. Los anticuerpos IgG en sueros de ratones vacunados con Q\beta-Angio 1, Q\beta-Angio 2, Q\beta-Angio 3 y Q\beta-Angio 4 se miden el día 21 contra el péptido Angio 2 acoplado a ARNsa A y contra angiotensina I. Como control, los sueros preinmunes también se analizan. Los resultados para diluciones de suero indicadas se muestran como densidad óptica a 450 nm. El promedio de tres ratones de cada (incluyendo desviaciones típicas) se muestra para Angio 2. El promedio de dos ratones de cada se muestra para angiotensina II. Todos los ratones vacunados generan anticuerpos IgG específicos contra el péptido Angio 2 así como contra angiotensina I, aunque los ratones inmunizados con el péptido Angio 2, Angio 3 ó Angio 4 presentaban títulos mayores que los vacunados con el péptido Angio 1, correlacionándose con la similitud próxima de los péptidos Angio 2, Angio 3 y Angio 4 y la angiotensina I.
La Figura 1 muestra análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 1 y la angiotensina II en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio 1-4 acoplados a la proteína de la cápsida de Q\beta. Q\beta-Angio 1, Q\beta-Angio 1, Q\beta-Angio 3 y Q\beta-Angio 4, como se usan en las Figuras, representan la vacuna inyectada en los ratones, de los que se obtuvieron los sueros de acuerdo con la definición anterior de los péptidos angiotensina. Se vacunaron ratones Balb/c hembra por vía subcutánea con 50 \mug de vacuna en PBS el día 0 y el día 14. Los anticuerpos IgG en los sueros de ratones vacunados con Q\beta-Angio 1, Q\beta-Angio 2, Q\beta-Angio 3 y Q\beta-Angio 4 se miden el día 21 contra el péptido Angio 1 acoplado a ARNsa A y contra angiotensina II. Como control, también se analizan sueros preinmunes. Los resultados para diluciones de suero indicadas se muestran como densidad óptica a 450 nm. El promedio de tres ratones de cada (incluyendo desviaciones típicas) se muestra para Angio 1. El promedio de dos ratones de cada se muestra para angiotensina II. Todos los ratones vacunados generan anticuerpos IgG específicos contra el péptido Angio 1 así como contra angiotensina II, aunque los ratones inmunizados con el péptido Angio 1 presentan los títulos más altos que se correlacionan con la similitud próxima del péptido Angio 1 y la angiotensina II.
La Figura 4 muestra análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 2 y angiotensina I en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio 5-9 acoplados a la proteína de la cápsida de Q\beta. Q\beta-Angio 5, Q\beta-Angio 6, Q\beta-Angio 7, Q\beta-Angio 8 y Q\beta-Angio 9, como se usan en las Figuras, representan las vacunas inyectadas en los ratones, de los que se obtienen los sueros de acuerdo con la definición anterior de los péptidos angiotensina. Se vacunaron ratones Balb/c hembra por vía subcutánea con 20 \mug de vacuna en PBS en el día 0 y día 14. Los anticuerpos IgG en sueros de ratones vacunados con Q\beta-Angio 4, Q\beta-Angio 5, Q\beta-Angio 6, Q\beta-Angio 7, Q\beta-Angio 8 y Q\beta-Angio 9 se miden en el día 21 contra el péptido Angio 2 acoplado a ARNsa A y contra angiotensina I. Los resultados para diluciones de suero indicadas se muestran como densidad óptica a 450 nm. El promedio de dos ratones de cada se muestra. Los dos ratones vacunados con Angio 8 y Q\beta-Angio 9 presentan títulos muy bajos o inespecíficos contra el péptido Angio 2, así como contra angiotensina I, lo que indica que estos dos tipos de vacuna inducen anticuerpos que son en su mayoría específicos para el extremo C-terminal de la angiotensina II, pero no para la angiotensina I (véase también la Figura 3).
La Figura 3 muestra análisis de ELISA de anticuerpos IgG específicos para el péptido Angio 1 y angiotensina II en sueros de ratones inmunizados con péptidos Angio 5-9 acoplados a la proteína de la cápsida de Q\beta. Q\beta-Angio 5, Q\beta-Angio 6, Q\beta-Angio 7, Q\beta-Angio 8 y Q\beta-Angio 9, como se usan en las Figuras, representan las vacunas inyectadas en los ratones, de los que se obtienen los sueros de acuerdo con la definición anterior de los péptidos angiotensina. Se vacunaron ratones Balb/c hembra por vía subcutánea con 20 \mug de vacuna en PBS en el día 0 y día 14. Los anticuerpos IgG en sueros de ratones vacunados con Q\beta-Angio 4, Q\beta-Angio 5, Q\beta-Angio 6, Q\beta-Angio 7, Q\beta-Angio 8 y Q\beta-Angio 9 se miden en el día 21 contra el péptido Angio 1 acoplado a ARNsa A y contra angiotensina II. Los resultados para diluciones de suero indicadas se muestran como densidad óptica a 450 nm. El promedio de dos ratones de cada se muestra. Los dos ratones vacunados con Q\beta-Angio 5 y Q\beta-Angio 6 presentaban títulos muy bajos o inespecíficos contra el péptido Angio 1 así como contra angiotensina II, lo que indica que estos dos tipos de vacuna inducen anticuerpos que son en su mayoría específicos para el extremo C-terminal de angiotensina I, pero no para la angiotensina II (véase también la Figura 4).
La siguiente tabla resume el análisis de ELISA de sueros de ratones vacunados con los péptidos Angio 1 a 9 acoplados con Q\beta. Los títulos de ELISA promedio del día 21 se calculan como se describe en el Ejemplo 2.
TABLA 1 Péptidos derivados de angiotensina usados para la vacunación de ratones y respuestas de anticuerpos resultantes contra los péptidos usados, así como contra angiotensina I y angiotensina II
1
2
Los resultados con Angio 5 y Angio 6 muestran que pueden inducirse péptidos que reconozcan selectivamente la Angiotensina I. Adicionalmente, los resultados con Angio 7-9 muestran que pueden inducirse anticuerpos que reconozcan selectivamente la Angiotensina II pero no la Angiotensina I. Ya que la Angiotensina I y II se diferencian solamente en 2 aminoácidos en el extremo C-terminal, mientras que los 8 aminoácidos restantes son idénticos, estos resultados demuestran que todos los anticuerpos inducidos por Angio 5 o Angio 6 reconocen selectivamente en el extremo C-terminal de la Angiotensina I y que los anticuerpos inducidos por Angio 7-9, y en particular Angio 8-9, reconocen selectivamente en el extremo C-terminal de la Angiotensina II. De esta manera, los 8 aminoácidos compartidos no son reconocidos, y en particular el extremo N-terminal compartido no es reconocido. Esto indica que el extremo N-terminal no se encuentra enterrado en el interior de los anticuerpos cuando se unen y, por lo tanto, está accesible a proteasas.
Habiendo descrito ahora completamente la presente invención en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de entendimiento, será obvio para un especialista en la técnica que la misma puede realizarse modificando o cambiando la invención dentro de un intervalo amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar al alcance de la invención o cualquier realización específica de la misma, y que tales modificaciones o cambios pretenden incluirse en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
SEC ID Nº: 1
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\newpage
SEC ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(Se deja en blanco intencionadamente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\newpage
SEC ID Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
13
14 
\newpage
SEC ID Nº: 12
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 13
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 14
17
18

Claims (25)

1. Un conjugado de resto de péptido angiotensina-transportador que comprende:
(a) un transportador con al menos un primer sitio de unión, y
(b) al menos un resto de péptido angiotensina con al menos un segundo sitio de unión;
en donde dicho transportador comprende una partícula de núcleo que es una partícula similar a virus, donde dicha partícula similar a virus es una partícula similar a virus de un bacteriófago de ARN y;
en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de la asociación a través de al menos un enlace covalente no peptídico con dicho primer sitio de unión para de esta manera formar un conjugado de resto de péptido angiotensina-transportador ordenado y repetitivo.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha partícula similar a virus comprende proteínas de un bacteriófago de ARN.
3. El conjugado de la reivindicación 2, en el que dicho bacteriófago de ARN se selecciona del grupo que consiste en:
a) bacteriófago Q\beta;
b) bacteriófago R17;
c) bacteriófago fr;
d) bacteriófago GA;
e) bacteriófago SP;
f) bacteriófago MS2;
g) bacteriófago M11;
h) bacteriófago MX1;
i) bacteriófago NL95;
j) bacteriófago f2;
k) bacteriófago AP205; y
l) bacteriófago PP7.
4. El conjugado de la reivindicación 1, en el que la partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes de bacteriófagos de ARN.
5. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes del bacteriófago de ARN Q\beta.
6. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha partícula similar a virus comprende proteínas recombinantes del bacteriófago de ARN fr o del bacteriófago de ARN AP205.
7. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dichas proteínas recombinantes de dicho bacteriófago de ARN comprenden proteínas de cubierta mutantes, en el que preferiblemente dichas proteínas de cubierta mutantes se han modificado por eliminación de al menos un resto de lisina por medio de sustitución, o por adición de al menos un resto de lisina por medio de sustitución, o
en el que preferiblemente dichas proteínas de cubierta mutantes se han modificado por deleción de al menos un resto de lisina, o por adición de al menos un resto de lisina por medio de inserción.
8. El conjugado de la reivindicación 5, en el que dichas proteínas recombinantes comprenden una o más proteínas de cubierta que tienen una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3.
\newpage
9. El conjugado de la reivindicación 5, en el que dichas proteínas recombinantes comprenden una mezcla de proteínas de cubierta que tienen las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 o mutantes de la misma, y la SEC ID Nº: 3.
10. El conjugado de la reivindicación 7, en el que dichas proteínas recombinantes comprenden proteínas de cubierta de Q\beta mutantes y en el que preferiblemente dichas proteínas de cubierta de Q\beta mutantes comprenden proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6;
b) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7;
c) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8;
d) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9; y
e) la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10.
11. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho primer sitio de unión comprende un grupo amino o un grupo carboxilo.
12. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un primer sitio de unión es un resto de lisina.
13. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho primer sitio de unión aparece de forma natural en dicha partícula de núcleo.
14. El conjugado de la reivindicación 1, que comprende además un entrecruzante heterobifuncional y en el que dicho primer sitio de unión es un resto de lisina y dicho segundo resto de unión es un resto de cisteína.
15. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho segundo sitio de unión es un grupo sulfhidrilo.
16. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho resto de péptido angiotensina es un péptido angiotensina, en donde dicho péptido angiotensina se selecciona del grupo que consiste en angiotensinógeno, angiotensina I, angiotensina II y fragmentos o derivados de los mismos.
17. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho resto de péptido angiotensina es angiotensina II.
18. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho resto de péptido angiotensina con dicho segundo sitio de unión tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
a) CGGDRVYIHPF (SEC ID Nº: 19);
b) CGGDRVYIHPFHL (SEC ID Nº: 20)
c) DRVYIHPFHLGGC (SEC ID Nº: 21);
d) CDRVYIHPFHL (SEC ID Nº: 22);
e) CHPFHL (SEC ID Nº: 23);
f) CGPFHL (SEC ID Nº: 24);
g) CYIHPF (SEC ID Nº: 25);
h) CGIHPF (SEC ID Nº: 26);
i) CGGHPF (SEQ ID NO: 27);
j) DRVYIGGC (SEC ID Nº: 28);
k) DRVYGGC (SEC ID Nº: 29); y
l) DRVGGC (SEQ ID NO: 30).
19. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicho resto de péptido angiotensina con dicho segundo sitio de unión consiste en la secuencia de aminoácidos de CGGDRVYIHPF (SEC ID Nº: 19).
\newpage
20. Una composición farmacéutica, que comprende uno o más de los conjugados de la reivindicación 1 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
21. Una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del conjugado de la reivindicación 1, y un vehículo o excipiente inmunológicamente aceptable.
22. La composición de vacuna de la reivindicación 21, en la que dicha composición de vacuna comprende además al menos un adyuvante.
23. Un conjugado de la reivindicación 1 o la composición de vacuna de la reivindicación 21 para uso en un método de inmunización de un animal contra un resto de péptido angiotensina, que comprende administrar el conjugado o composición a un animal en condiciones tales que dicho animal desarrolle una respuesta inmune contra dicho resto de péptido angiotensina, y
en el que preferiblemente dicho conjugado o dicha composición de vacuna se administra a dicho animal por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en administración intranasal, administración oral, administración subcutánea, administración transdérmica, administración intramuscular y administración intravenosa.
24. Una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los conjugados de la reivindicación 1, una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 20 o una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de vacuna de la reivindicación 21 para uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno físico asociado con el sistema de angiotensina activado por renina, que comprende la administración a un animal que lo necesite.
25. La cantidad de la reivindicación 24, en donde dicho trastorno físico asociado con el sistema de angiotensina activado por renina se selecciona del grupo que consiste en hipertensión, apoplejía, infarto, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia renal y hemorragia retinal.
ES02800605T 2001-10-05 2002-10-07 Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos. Expired - Lifetime ES2321491T3 (es)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32699801P 2001-10-05 2001-10-05
US326998P 2001-10-05
US33104501P 2001-11-07 2001-11-07
US331045P 2001-11-07
US50902 2002-01-18
US10/050,902 US7264810B2 (en) 2001-01-19 2002-01-18 Molecular antigen array
PCT/IB2002/000166 WO2002056905A2 (en) 2001-01-19 2002-01-21 Molecular antigen array
WOIB02/00166 2002-01-21
US39663702P 2002-07-19 2002-07-19
US396637P 2002-07-19
PCT/EP2002/011219 WO2003031466A2 (en) 2001-10-05 2002-10-07 Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2321491T3 true ES2321491T3 (es) 2009-06-08

Family

ID=27517536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02800605T Expired - Lifetime ES2321491T3 (es) 2001-10-05 2002-10-07 Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos.

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1432443B1 (es)
JP (1) JP4671389B2 (es)
CN (1) CN1558774B (es)
AU (1) AU2002362696B2 (es)
CA (1) CA2462857C (es)
ES (1) ES2321491T3 (es)
NZ (1) NZ531534A (es)
WO (1) WO2003031466A2 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
AU2002339224B2 (en) 2001-09-14 2008-10-09 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use
CN1665565A (zh) * 2002-07-19 2005-09-07 赛托斯生物技术公司 Ghrelin－载体偶联物
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
KR20050115913A (ko) 2003-03-26 2005-12-08 사이토스 바이오테크놀로지 아게 Ｍｅｌａｎ―ａ 펩티드 유사체-바이러스-양-입자컨쥬게이트
KR20060128924A (ko) * 2004-01-20 2006-12-14 사이토스 바이오테크놀로지 아게 그레린-담체 접합체
EP1791870A1 (en) * 2004-09-21 2007-06-06 Cytos Biotechnology AG Virus-like particles comprising a fusion protein of the coat protein of ap205 and an antigenic polypeptide
KR20070059207A (ko) 2004-10-05 2007-06-11 사이토스 바이오테크놀로지 아게 Ｖｌｐ-항원 컨쥬게이트 및 백신으로서 그의 용도
US20070160628A1 (en) * 2005-08-31 2007-07-12 Birkett Ashley J Stabilized virus-like particles and epitope display systems
ZA200802225B (en) * 2005-09-28 2009-10-28 Cytos Biotechnology Ag Interleukin-1 conjugates and uses thereof
WO2007052491A1 (ja) * 2005-10-31 2007-05-10 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. セキュア処理装置、セキュア処理方法、難読化秘密情報埋め込み方法、プログラム、記憶媒体および集積回路
US20070184068A1 (en) 2005-12-14 2007-08-09 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
CA2655108C (en) 2006-06-12 2019-05-07 Cytos Biotechnology Ag Processes for packaging oligonucleotides into virus-like particles of rna bacteriophages
JP2008007482A (ja) * 2006-06-30 2008-01-17 Univ Of Miyazaki 昇圧作用を有する新規ポリペプチド
WO2009056651A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin-carrier formulation
JP2009137859A (ja) * 2007-12-05 2009-06-25 Univ Nihon マウス多量体免疫グロブリンレセプターに反応するモノクローナル抗体
EP2865752A1 (en) 2009-09-03 2015-04-29 Pfizer Vaccines LLC PCSK9 vaccine
US9446120B2 (en) 2011-04-15 2016-09-20 Osaka University DNA vaccine
MX2014007262A (es) 2011-12-22 2014-08-01 Hoffmann La Roche Sistema de exhibicion de anticuerpos de longitud completa para celulas eucarioticas y su uso.
JP6422022B2 (ja) 2012-08-31 2018-11-14 国立大学法人大阪大学 Ｖｅｇｆ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むｄｎａワクチン
JP6001974B2 (ja) 2012-09-21 2016-10-05 アンジェスＭｇ株式会社 アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むＤＮＡワクチン
ES2854726T3 (es) 2015-10-30 2021-09-22 The Univ Of Copenhagen Partícula similar a virus con presentación eficiente de epítopos
WO2024047090A2 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Saiba Animal Health Ag Modified virus-like particles of cmv

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA934199B (en) * 1992-06-18 1994-01-10 Akzo Nv Carrier system against gnrh
NZ501832A (en) * 1997-06-24 2002-12-20 Proteus Molecular Design Angiotensin-peptide carrier conjugates for treating diseases associated with the renin-angiotensin system
CA2347411C (en) * 1998-10-21 2012-04-03 The Government Of The United States Of America Virus-like particles for the induction of autoantibodies
NZ512456A (en) * 1998-11-30 2003-10-31 Cytos Biotechnology Ag Ordered molecular presentation of antigens
CA2407897A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
CN1558774A (zh) 2004-12-29
NZ531534A (en) 2005-10-28
AU2002362696B2 (en) 2008-05-29
JP4671389B2 (ja) 2011-04-13
EP1432443A2 (en) 2004-06-30
CN1558774B (zh) 2012-03-14
WO2003031466A2 (en) 2003-04-17
WO2003031466A3 (en) 2003-10-23
EP1432443B1 (en) 2009-01-21
AU2002362696A2 (en) 2003-04-22
CA2462857A1 (en) 2003-04-17
CA2462857C (en) 2012-01-24
JP2005514333A (ja) 2005-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2321491T3 (es) Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos.
US7666408B2 (en) Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
JP5084103B2 (ja) ハプテン担体抱合体およびその用法
US20080292652A1 (en) Virus-Like Particles Comprising a Fusion Protein of the Coat Protein of Ap205 and an Antigenic Polypeptide
US20070248617A1 (en) Medical Uses of Carrier Conjugates of Non-Human Tnf -Peptides
US20090123414A1 (en) Il-15 Antigen Arrays And Uses Thereof
AU2002362696A1 (en) Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US20050191317A1 (en) Ghrelin-carrier conjugates
NZ538083A (en) Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein
US20080019991A1 (en) Carrier Conjugates Of Tnf-Peptides
JP4533626B2 (ja) アレルギー性好酸球性疾患を治療するための抗原アレイ
JP2010189406A (ja) アンジオテンシンペプチド−担体複合体およびその使用
RU2350622C2 (ru) Конъюгат ангиотензиновой пептидной составляющей с носителем, композиция вакцины, способ иммунизации животного и способ лечения или профилактики физического нарушения, ассоциированного с активируемой ренином ангиотензиновой системой
JP2005514347A5 (es)
MXPA06008170A (es) Respuesta inmune a la grelina inducida por particulas