CN1558774B - 血管紧张肽-载体偶联物及其用途 - Google Patents

血管紧张肽-载体偶联物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1558774B
CN1558774B CN028189248A CN02818924A CN1558774B CN 1558774 B CN1558774 B CN 1558774B CN 028189248 A CN028189248 A CN 028189248A CN 02818924 A CN02818924 A CN 02818924A CN 1558774 B CN1558774 B CN 1558774B
Authority
CN
China
Prior art keywords
angiotensin
conjugate
virus
present
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN028189248A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1558774A (zh
Inventor
马丁·巴克曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cytos Biotechnology AG
Original Assignee
Cytos Biotechnology AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US10/050,902 external-priority patent/US7264810B2/en
Application filed by Cytos Biotechnology AG filed Critical Cytos Biotechnology AG
Publication of CN1558774A publication Critical patent/CN1558774A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1558774B publication Critical patent/CN1558774B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5437—IL-13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

本发明提供哺乳动物肽激素血管紧张肽原、血管紧张肽I和血管紧张肽II的肽衍生物的偶联物，通过肽衍生物与一种载体特别是病毒样颗粒(VLP)偶联，它们被呈递在重复支架中。本发明还提供生产这些偶联物的方法，以及获得的免疫原偶联物在治疗和预防与肾素激活血管紧张肽系统有关的疾病中的免疫治疗用途。

Description

血管紧张肽-载体偶联物及其用途
发明背景 
发明领域 
本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。 
相关技术 
哺乳动物的动脉血压主要由被称为肾素-血管紧张肽-系统(RAS)的生物化学级联控制。在动脉血压下降后，肾脏肾小球旁器的上皮样细胞释放肾素，启动该系统。肾素酶切由肝脏分泌到血清中的血管紧张肽原(氨基酸序列：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Asn，SEQ ID NO：15)。这种酶切导致形成十肽血管紧张肽I(ATI，氨基酸序列：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu，SEQ ID NO：16)。存在于肺内皮中的血管紧张肽转化酶(ACE)在数秒钟内酶切ATI的两个C端氨基酸，产生血管紧张肽II(氨基酸序列：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，SEQ ID NO：17)。血管紧张肽I在体内存在时间极短，没有或仅有轻微的血管收缩活性，而血管紧张肽II对循环系统及内分泌系统具有强烈的影响。RAS激活的血管紧张肽II水平升高引起血管收缩、盐和水的肾潴留，二者均可升高动脉压(高血压)，可导致心血管损伤。高血压的可能的临床表现有中风、梗塞、充血性心力衰竭、肾衰竭或视网膜出血。 
根据美国疾病控制预防中心(CDC)报告，充血性心力衰竭是老年人中的一种主要慢性病，在美国每年大约致260,000人死亡。1995年，医疗保险为心力衰竭支付了34亿美元。尽管已经有治疗高血压的药物，但是在治疗的高血压患者中只有约半数得到控制。这部分是由于患者不配合或者所用药物无效。 
当前对高血压的治疗包括利用有机小分子干预RAS系统。主要 靶标是肾素、ACE和血管紧张肽II受体。ACE抑制剂包括赖诺普利 
Figure S02818924819960327D000021
、卡托普利和依那普利，然而，这些药物尚未完全成功。首先，它们似乎不能完全阻断ACE的活性，其次，ACE产生其它生物活性肽(包括缓激肽)也受到影响，这是不希望的。这些药物能引起副作用，如干咳和初次给药低血压作用，伴有眩晕并可能昏厥。血管紧张肽II受体拮抗剂包括洛沙坦
Figure S02818924819960327D000024
缬沙坦
Figure S02818924819960327D000025
和依贝沙坦
Figure S02818924819960327D000026
，它们特异作用于AT1血管紧张肽受体，因此阻断血管紧张肽II的主要血管收缩效果，并能较好地被耐受但不影响血管紧张肽激素的其它作用。然而，血管紧张肽II受体拮抗剂以及ACE抑制剂需要定期服用，通常是长期的，例如占成人寿命的大半部分，这至少部分解释了较差的患者顺应性。因此，确实需要有效、良好耐受并且具有高患者顺应性的高血压治疗方法。 
治疗或预防与激素活性有关的疾病的一种可能的方法是通过免疫治疗中和患者体内激素的作用，即免疫患者抗激素或与激素产生有关的酶，使得该激素的活性被特异性抗激素或抗酶抗体中和，或者使其水平降低。这类抗体可以在被动免疫中外源性施用，或者可以使用基于激素或相关酶的免疫原通过主动免疫在原位产生。 
为了控制高血压而对RAS成分接种的可行性已经在动物模型中得到证实(综述见Michel，Am.Heart J.117：756(1989))。抗肾素的接种可有效降低血压，然而，动物罹患自身免疫性肾炎(Michel等人，Circulation81：1899(1990)；Lo等人，Hypertension16：80(1990))。对同源ACE主动免疫的资料非常有限。一篇报告描述了兔的接种，但是50只动物中只有1只产生可检测的抗-ACE抗体(Soffer，Fed.Proc.42：2735(1983))。抗ACE免疫血清的被动转移能够降低兔的血压，但是导致伴肺水肿的免疫过敏反应，这可能是因为ACE在肺中以膜结合形式表达(Cadwell，FEBS Lett.63：82(1976))。还没有关于对血管紧张肽原的主动免疫的报告，但是有几项研究探索了对血管紧张肽I和血管紧张肽II接种的可行性。有两项研究报告了接种动物的血压 效应，未发现自身免疫(Christlieb，J.Clin.Invest.48：1506(1969)；Gardiner，Br.J.Pharmacol.129：1178(2000))。然而，大多数用血管紧张肽进行接种的研究结果是阴性的，这可能是因为诱导的抗血管紧张肽滴度太低，或者产生的抗体的特异性并非最佳。只针对血管紧张肽II的疫苗对RAS的作用可能不同于诱导抗血管紧张肽II、抗血管紧张肽I和(也可能)抗前体血管紧张肽原抗体的疫苗。 
WO98/58952描述了利用一种偶联物进行的治疗，该偶联物含有与破伤风类毒素偶联的血管紧张肽I，如果与佐剂(如氢氧化铝)一起使用，在大鼠中可诱导产生血管紧张肽特异性抗体。佐剂通常是有毒的，或者至少是刺激性的。允许用于人的佐剂迄今为止只有无机盐(氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙)和病毒颗粒。最常用于人的佐剂是氢氧化铝(明矾)。尽管认为它是安全的，但是它在体内长期存留，形成积淀。这种积淀形成的后果还不清楚，因此在未来的疫苗中，应当在不丧失其免疫原性的条件下尽量避免使用明矾。 
因此，本领域仍然需要研制甚至在不使用佐剂时仍能诱导高抗体滴度的偶联物。 
发明简述
如今，我们已经研制了用于诱导血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II(此处通称为“血管紧张肽”)特异性抗体的强免疫原，它们甚至在不使用佐剂的情况下也是有效的，使得在体内产生特异性针对一种或多种血管紧张肽(如血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II)的抗体。这些免疫原由与病毒样颗粒(VLP)结合的血管紧张肽部分组成。产生高免疫原性的重复抗原阵列，甚至在不使用佐剂的情况下也能够刺激抗体形成。根据所使用的血管紧张肽部分的氨基酸序列，能够诱导产生高抗体滴度，而且能够针对血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的N端或C端特异性诱导。这使得能够特异性靶向于仅仅一种血管紧张肽或其组合。因此本发明的免疫原能够在免疫治疗方法中使用，用来治疗与RAS产生的血管紧张肽II 水平升高有关的疾病。 
不局限于任何特定的运行或机制理论，本发明的偶联物和制剂(conjugate)能够诱导可与一种以上的血管紧张肽形式结合，从而同时阻断所有相关种类血管紧张肽的抗体。此外，诱导产生的抗体可能是血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的C端特异性的。在这些条件下，诱导产生的抗体将阻断肾素或ACE分别对血管紧张肽原或血管紧张肽I的激活。不过，与ACE或肾素不同的蛋白酶，如内肽酶和氨肽酶，能够从N端降解血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II，从而阻止与抗体结合的完整血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的积累。 
因此，本发明提供如下免疫原：其包含一种或多种血管紧张肽或肽部分或其衍生物，它们与一种或多种核心颗粒、优选地与一种或多种病毒样颗粒(VLP)结合，形成具有有序、重复阵列结构的偶联物。包含第一附着位点的核心颗粒和包含第二附着位点的血管紧张肽或其衍生物通过该第一和第二附着位点连接，形成有序、重复的阵列。第一与第二位点之间的相互作用可能是直接的，或者可能涉及至少一种其它分子，例如接头。 
在一个实施方案中，第一附着位点在核心颗粒中天然存在。此外，也可通过化学偶联或重组技术添加第一附着位点。优选的第一附着位点包括氨基、羧基或巯基。包含第一附着位点的优选氨基酸选自：赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸和组氨酸。特别优选的是赖氨酸残基。 
血管紧张肽或其衍生物上适宜的第二附着位点有胺、酰胺、羧基和巯基。已经研制了多种化合物，它们通过与核心颗粒蛋白质分子的反应性基团形成共价键，使得肽/蛋白质能够交联或者蛋白质与衍生化分子能够偶联。 
本发明的包含第一附着位点的核心颗粒包括适于形成有序、重复阵列的任何颗粒。在一些实施方案中，这类核心颗粒包括病毒样颗粒(VLP)、噬菌体、噬菌体病毒样颗粒、菌毛等。在某些实施方案中， 包括HBcAg VLP、噬菌体VLP和I型菌毛。本发明也提供仍然能够形成有序、重复结构的核心颗粒的变体形式。变体形式包括核心颗粒的重组及天然形式和突变形式。在某些实施方案中，核心颗粒的突变形式包括第一附着位点的类型或所述位点的数量与亲本不同的形式。核心颗粒上赖氨酸残基数量的改变是特别优选的。 
在某些实施方案中，本发明的偶联物包含与病毒样颗粒(VLP)化学偶联的血管紧张肽部分。这样产生高免疫原性的重复抗原阵列，它甚至在不使用佐剂的情况下也能够刺激抗体形成。根据所使用的血管紧张肽部分的氨基酸序列，能够诱导产生高抗体滴度，而且能够针对血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的N端或C端特异性诱导。这使得能够特异性靶向于仅仅一种血管紧张肽或其组合。因此本发明的免疫原能够在免疫治疗方法中使用，用来治疗与RAS产生的血管紧张肽II水平升高有关的疾病。 
本发明提供包含一种核心颗粒和一种或多种血管紧张肽或血管紧张肽部分的偶联物，它适合用来诱发免疫应答。本发明还提供包含本发明这类偶联物和一种或多种其它成分(如一种或多种赋形剂或载体，适当地一种或多种药物可接受的赋形剂或载体)的制剂。本发明的偶联物和制剂包括疫苗偶联物或制剂，它们含有或不含其它药物可接受赋形剂或佐剂。例如，本发明还提供包含免疫有效量的一种或多种本发明偶联物以及药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂的疫苗制剂。在另一个实施方案中，疫苗还包含至少一种佐剂，如明矾或弗氏不完全佐剂。本发明还提供免疫和/或治疗动物(优选的是哺乳动物，如人)的方法，包括对动物施用免疫有效量的本发明的偶联物或疫苗，从而诱发针对该偶联物的免疫应答。动物可以用本发明的偶联物或制剂通过本领域周知的任何给药途径适当免疫，包括但不限于：皮下、肌肉内、鼻内、皮内、静脉内、经皮肤、经粘膜、口服或直接进入淋巴结。鼻内免疫是一种特别合适的途径；这种给药途经不仅能够产生包括IgA的高抗体滴度(如实施例所述)，而且由于避免了引起疼痛的免疫过程(例如肌肉内免疫)，更易于被患者接受，从而改善顺应 性。 
本发明的偶联物和制剂诱发免疫应答，包括抗体的产生。因此，在另一个实施方案中，本发明提供生产抗一种或多种血管紧张肽或血管紧张肽部分的抗体的方法。本发明的这些抗体可用于RAS相关疾病的治疗或预防，以及血管紧张肽或血管紧张肽部分的检测，例如与动物组织或循环中存在的一种或多种RAS成分有关的疾病的诊断方法。 
在一个相关实施方案中，本发明可用于RAS相关疾病的预防或治疗，包括但不限于：中风、梗塞、充血性心力衰竭、肾衰竭、视网膜出血等。用本发明的偶联物或制剂免疫产生针对一种或多种血管紧张肽或血管紧张肽部分的免疫应答，致使免疫分子，特别是抗体，与血管紧张肽或血管紧张肽部分结合。抗体的被动转移也可用于RAS相关疾病的治疗和预防。 
我们发现，血管紧张肽偶联物或与病毒样颗粒(VLP)附着的血管紧张肽部分的偶联物诱导高水平的血管紧张肽特异性的IgG抗体。因此本发明提供RAS相关疾病的一种治疗剂，在一个特别优选的实施方案中，它以一种有序、重复的VLP-血管紧张肽/部分偶联物为基础。这种治疗剂在接种的动物中能够诱导高滴度的抗血管紧张肽抗体。甚至在不使用佐剂时也能诱导高滴度抗体，不仅包含IgG亚型，而且包含IgA亚型。而且，令人吃惊的是，这种治疗剂与可能的病理性免疫应答(如炎症)的诱发无关。本发明的治疗偶联物包含至少一种血管紧张肽或血管紧张肽部分和一种VLP，优选RNA噬菌体的VLP，或者至少一种血管紧张肽或血管紧张肽部分和另一种核心颗粒，如HBcAg或菌毛。 
根据本领域的知识、下列本发明的附图、描述以及权利要求书，普通技术人员应当理解本发明的其它实施方案。 
附图简述
图1是使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio1、Angio2、Angio3或 Angio4肽免疫的小鼠血清中，Angio1肽和血管紧张肽II特异性IgG抗体的ELISA分析。 
图2是使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio1、Angio2、Angio3或Angio4肽免疫的小鼠血清中，Angio2肽和血管紧张肽I特异性IgG抗体的ELISA分析。 
图3是使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio5、Angio6、Angio7、Angio8或Angio9肽免疫的小鼠血清中，Angio1肽和血管紧张肽II特异性IgG抗体的ELISA分析。 
图4是使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio5、Angio6、Angio7、Angio8或Angio9肽免疫的小鼠血清中，Angio2肽和血管紧张肽I特异性IgG抗体的ELISA分析。 
发明详述
定义 
在下列描述中广泛使用了大量分子生物学、免疫学和医学领域的术语。为了更清楚、一致地理解本说明书和权利要求书，包括这些术语定义的范围，给出了下列非限制性定义。 
主动免疫：在此使用时，术语“主动免疫”是指通过施用免疫原、疫苗、抗原或血管紧张肽-载体偶联物引起的，个体(一般是动物)中免疫应答的诱发。相反，被动免疫是指通过向所述个体内转移免疫分子或细胞使该个体具有免疫力。 
甲病毒：在此使用时，术语“甲病毒”是指甲病毒属包括的任何RNA病毒。Strauss和Strauss，Microbiol.Rev.，58：491-562(1994)中有关于该属成员的描述。甲病毒的例子包括奥拉病毒、毕巴鲁病毒、卡巴苏病毒、屈曲病毒、东部马脑炎病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、克孜勒阿加什病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆茨布病毒、恩杜姆病毒、皮克孙纳病毒、托纳特病毒、特里尼蒂病毒、乌纳病毒、西部马脑炎病毒、沃达罗河病毒、辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)和罗斯河病毒。
氨基酸接头：本说明书中的“氨基酸接头”，也被称为“接头”，在此使用时，使抗原或抗原决定簇与第二附着位点结合，或者更优选地，已经包含或含有第二附着位点，该位点一般—但不是必需—是一种氨基酸残基，优选的是半胱氨酸残基。然而，术语“氨基酸接头”在此使用时并非意味着这种氨基酸接头只是由氨基酸残基组成，尽管由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨基酸接头的氨基酸残基优选地包含本领域公知的自然存在的氨基酸或非天然氨基酸，所有L-或所有D-氨基酸或其混合物。然而，本发明也包括一种氨基酸接头，其含有一种含巯基或半胱氨酸残基的分子。该分子优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。然而，除了氨基酸接头外，优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分且不含任何氨基酸的接头也包括在本发明范围内。抗原或抗原决定簇或任选地第二附着位点与氨基酸接头之间的结合优选地是通过至少一种共价键，更优选地是通过至少一种肽键。 
血管紧张肽部分：在此使用时，术语“血管紧张肽部分”是指能够作为天然血管紧张肽的免疫模拟物(即，免疫学模拟的血管紧张肽，从而产生可与天然血管紧张肽结合的抗体)的任何部分，而无论该部分是否具有体内天然血管紧张肽的生物活性(例如受体处的天然激素活性，包括血管紧张肽I和II)。因此，该部分可适当包含血管紧张肽，优选地血管紧张肽原、血管紧张肽I(一种十肽：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu，SEQ ID NO：16)或血管紧张肽II(一种八肽：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，SEQ ID NO：17)，或其功能相当的变体。因此，“血管紧张肽部分”包括如此处术语定义的“血管紧张肽”。功能相当的变体可包含通过单氨基酸或多氨基酸置换、添加或删除对血管紧张肽I或II序列的修饰，以及氨基酸残基被化学修饰、但仍保留血管紧张肽免疫原活性的序列。这些功能(或免疫学)相当的变体可以是天然生物学变异，或者可利用周知的标准技术制备，如化学合成或修饰、诱变，例如定点或随机诱变等。对于该定义而言，关于修饰的一个主要特征是血管紧张肽保留作为天然血管紧张肽的免疫模拟物的能力。因此，例如，一种氨基酸可以用另一种保留了血管紧张肽或其表位的物理化学特征(例如，在电荷密度、亲水性/疏水性、大小和构型方面)、因而保留了免疫结构的氨基酸代替。“添加”变体可包括N端或C端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。缺失可以是序列内的，或者可以是N端或C端的截短。优选的缺失突变体是那些可以诱导N端、优选地诱导C端抗体的突变体。这些抗体可防止活性血管紧张肽II的产生，但仍允许抗体结合的血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的降解。 
血管紧张肽：在此使用时，术语“血管紧张肽”包括所有的、优选天然的血管紧张肽及其功能相当的变体。因此，“血管紧张肽”可以被认为是如此处定义的“血管紧张肽部分”的一部分(subset)。实际上，血管紧张肽(或血管紧张肽部分)的特定变体与一种(优选天然)血管紧张肽是否“功能相当”，可以用测定血管紧张肽生物活性的多种测定方法来确定。此处描述了一些这样的测定方法，本领域技术人员也熟悉其它方法。 
抗体：在此使用时，术语“抗体”是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语应该包括完整的抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。这些抗体包括人抗原结合性抗体片段，包括但不限于：Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。抗体可来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是哺乳动物抗体，例如人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马等，或者其它合适的动物，如鸡。在此使用时，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体，或者来自表达一种或多种人免疫球蛋白但不表达内源性免疫球蛋白的转基因动物的抗体，如美国专利号5,939,598所述，其公开内容在此完整引用作为参考。 
抗原：在此使用时，术语“抗原”是指如果由MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。术语“抗原”在此使用时也包括T细胞表位。在MHC I类(存在于除红细胞之外的所有体 细胞上)或II类(存在于免疫细胞上和特定抗原呈递细胞内)分子存在下，T细胞表位可被T细胞受体识别。这种识别事件导致T细胞的活化，及随后的效应机制，如T细胞增殖、细胞因子分泌、穿孔素分泌等。另外，抗原能够被免疫系统识别，并且/或者能够诱发体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或连接于TH细胞表位，并且包含于佐剂中。抗原可能包含一种或多种表位(B和T表位)。上述特异性反应是指抗原通常以高选择性方式优选地与其相应抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的许多其它抗体或TCR反应。此处使用的抗原也可能是几种不同抗原的混合物。 
抗原决定簇：在此使用时，术语“抗原决定簇”是指可被B或T淋巴细胞特异识别的抗原部分。B淋巴细胞通过产生抗体与外源性抗原决定簇反应，而T淋巴细胞则是细胞免疫的介质。因此，抗原决定簇或表位是可被抗体识别或者(在MHC存在下)可被T细胞受体识别的抗原部分。抗原决定簇包含一个或多个表位。在脊椎动物中，变应原也可作为抗原。 
连接(association)：在此使用时，术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，是指第一与第二附着位点优选地通过至少一个非肽键结合。连接的性质可能是共价、离子、疏水、极性的或其任意组合，优选地，连接的性质是共价结合。 
第一附着位点：在此使用时，短语“第一附着位点”是指非天然或天然来源的核心颗粒的一种元件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。第一附着位点通常且优选地位于核心颗粒(优选地如病毒样颗粒)的表面。核心和病毒样颗粒的表面上分别存在多个第一附着位点，一般是重复构型。 
第二附着位点：在此使用时，短语“第二附着位点”是指与抗原或 抗原决定簇结合的一种元件，位于核心颗粒和病毒样颗粒表面的第一附着位点分别可与之连接。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上存在至少一个第二附着位点。因此，术语“包含至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”是指至少含有抗原或抗原决定簇和第二附着位点的抗原或抗原构建体。然而，特别是对于非天然来源的第二附着位点(即在抗原或抗原决定簇内非天然存在)，这些抗原或抗原构建体含有一种“氨基酸接头”。 
结合(bound)：在此使用时，术语“结合”是指结合或附着，它们可能是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是例如：酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语如“偶联”、“融合”和“附着”范围更广，并且包括后者。 
外壳蛋白：在此使用时，术语“外壳蛋白”是指噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质，它们能够掺入噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配体中。然而，当指RNA噬菌体的外壳蛋白基因的特定基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物被称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“QβCP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由QβCP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLPQβ外壳蛋白主要含有QβCP，以及少量A1蛋白。 
核心颗粒：在此使用时，术语“核心颗粒”是指具有固有重复组织的刚性结构。此处使用的核心颗粒可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。 
有效量：在此使用时，术语“有效量”是指达到希望的生物学效应的量或必需的量。组合物的有效量是获得这种选择结果的量，此量可由本领域技术人员常规确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、在暴露于抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的 量。该术语也与“足量”同义。 
用于任何具体用途的有效量根据如下因素而不同，如所治疗的疾病或病症、施用的具体组合物、患者体重和/或疾病或病症的严重程度。本领域技术人员能够根据经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要过多的实验。 
表位：在此使用时，术语“表位”是指可被单个抗体或T细胞受体识别的基本组件或最小单位，因而是指所述抗体或T细胞受体结合的特定结构域、区或分子结构。一个抗原可由大量表位组成，而半抗原一般很少含表位。 
融合：在此使用时，术语“融合”是指通过编码性核苷酸序列的框内组合，将不同来源的氨基酸序列组合于一条多肽链中。除了与多肽链的末端之一融合外，术语“融合”还包括内部融合，即将不同来源的序列插入一条多肽链内。 
异源序列：在此使用时，术语“异源序列”是指核酸或蛋白质的第二种序列，它不是该核酸或蛋白质正常所见，通常是为了赋予特殊的性质而人工添加到该序列中。在一个实例中，为了蛋白质的纯化或作为第一附着位点，可以向重组衣壳蛋白中添加异源氨基酸。 
免疫应答：在此使用时，术语“免疫应答”是指个体免疫系统针对一种分子或化合物(如抗原)的任何作用。在哺乳动物中，免疫应答包括细胞活性和可溶性分子(如细胞因子和抗体)的产生。因此该术语包括导致B和/或T淋巴细胞的激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种根据本发明的物质时才能检测到。“免疫原性剂”是指一种试剂，其用来刺激活生物的免疫系统，使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且针对该免疫原性剂。“免疫原性肽”是一种引发细胞和/或体液免疫应答的多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用或不使用佐剂。 
免疫偏离：在此使用时，术语“免疫偏离”是指与预先存在的免疫应答性质不同的免疫应答的刺激。例如，一个个体，其对一种变应原具有TH2免疫应答，因而在接触该变应原后产生IgE抗体，可以通过本发明的实施方案诱导该个体产生针对该变应原的TH1免疫应答。这种TH1应答将消除诱发TH2应答的变态反应，从而缓解变应性疾病。
免疫治疗：在此使用时，术语“免疫治疗”是指用于治疗疾病、不适或病症的偶联物。更具体的讲，该术语用来指一种治疗方法，其中通过接种产生有益的免疫应答。 
免疫有效量：在此使用时，术语“免疫有效量”是指当导入个体时足以在该个体中诱发免疫应答的偶联物的量。达到免疫有效所需的偶联物的量根据多种因素而不同，包括偶联物、偶联物中其它成分(例如佐剂)的存在、抗原、免疫途径、个体、预先免疫或生理状态等。 
分离的：在此使用时，当术语“分离的”用于一种分子时，该术语的含义是，该分子已经从其天然环境中分离。例如，活动物中自然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是与天然状态的共存物质分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。此外，对于本发明的目的而言，载体中所含的重组DNA分子被认为是分离的。分离的RNA分子包括DNA和RNA分子的体内或体外RNA复制产物。分离的核酸分子还包括通过合成生产的分子。另外，重组宿主细胞中所含的载体分子也是分离的。因此，不是所有“分离的”分子都需要“纯化”。 
免疫治疗剂：在此使用时，术语“免疫治疗剂”是一种偶联物，其包含免疫分子和/或引发免疫应答，用于疾病或不适的治疗。 
个体：在此使用时，术语“个体”是指多细胞生物，包括植物和动物。优选的多细胞生物是动物，更优选的是脊椎动物，更加优选的是哺乳动物，最优选的是人。 
低或不可检测的：在此使用时，当短语“低或不可检测的”用于基因表达水平时，是指表达水平显著低于基因最大诱导时所见的水平(例如至少低5倍)，或者用下文实施例部分所述方法不易检测到。
凝集素：在此使用时，是指特别是从豆科植物种子获得的，以及来自其它多种植物和动物来源的蛋白质，它们具有特定单糖或寡糖的结合位点。实例包括伴刀豆球蛋白A和麦胚凝集素，它们在糖蛋白研究中广泛用作分析和制备性试剂。 
模拟位：在此使用时，术语“模拟位”是指可诱发对一种抗原或抗原决定簇的免疫应答的物质。术语模拟位通常用于特定抗原。例如，引起产生抗磷脂酶A2(PLA2)抗体的一种肽是与该抗体结合的抗原决定簇的一种模拟位。一种模拟位与一种抗原或抗原决定簇(诱发对它的免疫应答)可能有基本的结构相似性或有共同的结构特征，或者可能没有。可诱发对特定抗原或抗原决定簇的免疫应答的模拟位，其生产和鉴定方法在本领域公知，并在本文其它部分描述。 
突变蛋白：在此使用时，术语“突变蛋白”是指与给定参照(例如天然、野生型等)多肽相比有一个或多个氨基酸不同的蛋白质或多肽。 
天然来源：在此使用时，术语“天然来源”是指其全部或部分不是合成的，而是自然存在或产生的。优选地，在此使用时，术语“天然来源”是指全部不是合成的，而是自然存在或产生的。 
非天然的：在此使用时，该术语通常是指并非来源于自然，更具体而言，该术语是指来自人工的。 
非天然分子支架：在此使用时，短语“非天然分子支架”是指用来提供第一附着位点的刚性、重复阵列的人工制成的任何产物。理想地但不是必须地，这些第一附着位点为几何顺序。非天然分子支架的部分或全部可以是有机或无机的，可以是化学合成或通过生物学方法合成的。非天然分子支架包括：(a)天然或非天然来源的核心颗粒；和(b)至少一个第一附着位点。非天然来源：在此使用时，术语“非天然来源”通常是指合成的或并非来源于自然的；更具体而言，该术语是指来自人工的。 
有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列：在此使用时，术语“有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒 的典型且优选地均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可能是一种几何模式。合适的有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选实例具有抗原或抗原决定簇的严格重复的类结晶排列，优选地具有0.5-30纳米的间隔，该间隔优选为5-15纳米。 
被动免疫：在此使用时，术语“被动免疫”是指通过任何途径向动物体内施以外源产生的免疫分子(例如抗体)或细胞(例如T细胞)。被动免疫不同于“主动”免疫，后者是通过向个体内导入免疫原、疫苗、抗原或半抗原-载体偶联物，引发免疫应答而获得免疫。 
菌毛：在此使用时，术语“菌毛”是指细菌细胞的胞外结构，它由蛋白质单体(例如菌毛单体)组成，这些单体组成有序、重复的模式。此外，菌毛也是与多种过程有关的结构，如细菌细胞与宿主细胞表面受体的附着、细胞间基因交换和细胞-细胞识别。菌毛的例子包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。菌毛的其它实例在本文其它部分描述。 
菌毛样结构：在此使用时，短语“菌毛样结构”是指具有类似于菌毛结构的特征、由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个实例是表达修饰的菌毛蛋白的一种细菌细胞形成的一种结构，这种修饰的菌毛蛋白不形成与天然菌毛基本相同的有序、重复阵列。 
多肽：在此使用时，术语“多肽”是指由氨基酸残基(通常是天然氨基酸残基)通过肽键连接在一起组成的聚合体。多肽不一定有大小限制，包括蛋白质和肽。肽是一般大小约5-约50个氨基酸的、或该范围内任何数量氨基酸的多肽。然而，肽也可具有更长的长度，例如可达120-150个氨基酸。 
蛋白质：在此使用时，术语蛋白质是指大小通常超过约5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多、2000个或更多氨基酸的多肽。尽管不是必需，蛋白质通常具有确定的三维结构，通常被称为折叠的，不同于通常不具有确定三维结构的肽和多肽，后者能采取大量不同的构象，被称为非折叠的。然而，肽也 可能具有确定的三维结构。 
纯化的：在此使用时，当术语“纯化的”用于分子时，是指相对于在其自然环境或其产生、发现或合成的环境中与之结合的分子，纯化分子的浓度提高。自然结合的分子包括蛋白质、核酸、脂类和糖，但通常不包括水、缓冲液和为了保持纯化分子的完整性或便于纯化而添加的试剂。例如，即使在oligo dT柱层析过程中用水溶剂稀释mRNA，如果自然结合的核酸和其它生物分子不与该柱结合，并且与所述mRNA分子分开，则该mRNA分子通过这种层析被纯化。根据此定义，相对于污染物，一种物质的纯度可能是5％或以上、10％或以上、20％或以上、30％或以上、40％或以上、50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上、95％或以上、99％或以上或100％。 
受体：在此使用时，术语“受体”是指能够与被称为配体的另外一种分子相互作用的蛋白质或糖蛋白或其片段。配体可以属于任何类别的生物化学或化学化合物。受体不一定必须是膜结合蛋白。可溶性蛋白质，例如麦芽糖结合蛋白或视黄醇结合蛋白，也是受体。 
残基：在此使用时，术语“残基”是指多肽骨架或侧链内的具体氨基酸。 
重组宿主细胞：在此使用时，术语“重组宿主细胞”是指已经导入一种或多种本发明的核酸分子的宿主细胞。宿主细胞包括：真核细胞，包括哺乳动物、昆虫、植物、鸟类、酵母的细胞；原核细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。 
重组病毒：在此使用时，短语“重组病毒”是指人工基因修饰的病毒。该短语覆盖本领域所知的任何病毒。更具体而言，该短语是指一种人工基因修饰的甲病毒，最具体来说，该短语是指人工基因修饰的辛德毕斯病毒。 
RNA-噬菌体：在此使用时，术语“RNA-噬菌体”是指感染细菌的RNA病毒，更具体而言，是指感染细菌的单链正义RNA病毒。 
载体：在此使用时，术语“载体”是指用来向宿主细胞传递遗传物质的物质(例如质粒或病毒)。载体可以由DNA或RNA组成。
病毒样颗粒(VLP)：在此使用时，术语“病毒样颗粒”是指一种类似于病毒颗粒的结构。而且，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的，因为它缺乏全部或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位被分别装配为病毒衣壳和衣壳，它们具有固有重复组织的结构，其中所述结构一般是球形或管状。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。在此使用时，术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它在上述方面类似于衣壳的形态，但是不同于典型的对称装配体，而保持了足够程度的顺序和重复性。 
噬菌体的病毒样颗粒：在此使用时，术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，它是非复制性和非传染性的，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括上述基因仍然存在但是无活性的噬菌体病毒样颗粒，于是也产生非复制性和非传染性的噬菌体病毒样颗粒。 
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP：由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成、任选地含有宿主RNA的衣壳结构，被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体实例是Qβ外壳蛋白的VLP。在此特定情况中，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由QβCP亚单位装配而成(通过一种QβCP基因的表达产生，该基因含有例如一个TAA终止密码子，通过抑制阻止更长A1蛋白的表达，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology39：9-15(1996))，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位。 
病毒颗粒：术语“病毒颗粒”在此使用时是指病毒的形态学形式。一些病毒类型含有一个由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的具有附加 结构(例如包膜、尾等)。 
一种(个)：术语“一种(个)”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。 
在此使用时，当涉及任何数值时，术语“大约”是指所述数值±10％(例如，“约50℃”包括45℃-55℃的温度范围；同样，“约100mM”包括90mM-110mM的浓度范围)。 
概述 
如今，我们已经研制了用来诱导血管紧张肽特异性抗体的强免疫原，它们甚至在不使用佐剂时仍然有效，并且能够特异性地靶向于血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II。这些免疫原由与病毒样颗粒(VLP)或其它核心颗粒(如细菌菌毛或菌毛样颗粒)结合的血管紧张肽部分组成。这样产生高免疫原性的重复抗原阵列，它甚至不使用佐剂即能刺激抗体形成。根据所使用的血管紧张肽部分的氨基酸序列，高抗体滴度能够被诱导，而且能够针对血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的N端或C端特异性诱导。这使得能够特异性地靶向于仅仅一种血管紧张肽或其组合。因此本发明的免疫原能够在免疫治疗方法中使用，用来治疗与血管紧张肽部分、特别是RAS产生的血管紧张肽II及其衍生物水平升高有关的病症。 
本发明的偶联物的形成，即通过附着、连接、融合或其它结合(包括共价键和非共价键)实现将一种或多种血管紧张肽部分与核心颗粒(例如VLP)结合。在一个实施方案中，VLP含有第一附着位点，有机分子含有第二附着位点。有机分子的结合通过第一与第二附着位点直接连接或经第三种分子连接而实现。附着位点可能天然存在，或者可能是导入的。 
使用血管紧张肽部分与核心颗粒的偶联物，或者使用包含本发明提供的这些偶联物的制剂免疫动物，诱发针对所展示的血管紧张肽部分的强免疫应答。因此，本发明的偶联物和制剂可用于刺激针对多种血管紧张肽部分或其衍生物的免疫应答，因而可用于动物。本发明也 涉及一种疫苗，其包含免疫有效量的一种或多种本发明的偶联物和制剂，以及药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。本发明的偶联物和制剂能够用来接种动物对抗一种或多种血管紧张肽部分或其衍生物。这种接种能够用于预防或治疗目的，或者用于这两种目的。在一个相关方面，产生的针对这些偶联物或制剂的免疫分子，如抗体，可用于疾病、病症或不适的治疗、预防或诊断。这些抗体、偶联物和本发明的偶联物也可用作试剂盒的成分。 
因此，一方面，本发明提供一种或多种血管紧张肽部分与一种载体以有序、重复的血管紧张肽部分-载体偶联物形式的偶联物，以及制备这种偶联物的方法。本发明也提供包含至少一种本发明的偶联物和至少一种其它成分(适当地，至少一种赋形剂或载体，特别是至少一种药物可接受的赋形剂或载体)的制剂。本发明的偶联物和制剂可用于诱发针对血管紧张肽部分的免疫应答。这种免疫应答能够用来产生可用于治疗、预防和诊断目的的抗体。 
本发明的偶联物包含一种或多种血管紧张肽部分的高度有序、重复的阵列。根据本发明该方面的偶联物阵列包含(a)核心颗粒，其包含第一附着位点，(b)血管紧张肽部分，其包含第二附着位点，其中成分(a)和(b)通过第一和第二附着位点连接，形成所述有序、重复的血管紧张肽部分阵列。 
适于在本发明的偶联物和制剂中使用的核心颗粒可以是天然的或是非天然的。在本发明的偶联物和制剂中使用的天然核心颗粒包括病毒颗粒、病毒样颗粒和菌毛。这些天然核心颗粒的蛋白质可以是天然的或是重组的。核心颗粒上的第一附着位点可以是自然存在的，或者可以通过化学或重组方法导入的。在本发明的偶联物和制剂中使用的血管紧张肽部分适于诱发针对RAS多种成分(即多种血管紧张肽部分或其衍生物)的免疫应答，包括但不限于血管紧张肽，优选地包含或者由下列序列或其片段组成：血管紧张肽原、血管紧张肽I(式Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu的十肽，SEQ ID NO：16)或血管紧张肽II(式Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe的八肽，SEQ ID NO：17)，或其功能相当的变体，包括本文其它部分所述的血管紧张肽部分。血管紧张肽部分上的第二附着位点可以自然存在或被导入。第一与第二附着位点之间的相互作用可能是直接的，或者可能涉及至少一种其它分子，例如接头。此外，第一和第二附着位点的连接也可以根据本发明使用交联分子。除了接头之外一般还使用交联分子。 
本发明的偶联物和制剂在诱发针对多种血管紧张肽部分的免疫应答、特别是抗体方面惊人地有效。因此，可以在适于免疫动物的偶联物中使用，用于治疗或预防RAS相关疾病、不适或病症，包括但不限于高血压、中风、梗塞、充血性心力衰竭、肾衰竭或视网膜出血。本发明的偶联物和制剂免疫产生的抗体也可用于治疗或预防目的。 
在其它实施方案中，本发明提供使用本发明的偶联物和制剂治疗和预防一种疾病的方法。在另一个实施方案中，本发明提供适于诊断和筛选的试剂盒。 
具有有序、重复阵列的偶联物 
本发明提供偶联物和偶联物的制剂，其中包含一种或多种血管紧张肽部分的有序、重复阵列。此外，本发明使技术人员能够方便地构建用于不同目的的有序、重复阵列，优选地诱发针对一种或多种血管紧张肽部分或其衍生物的免疫应答。 
本发明的偶联物基本包含或由下列两种成分组成：(1)非天然分子支架；和(2)至少一种血管紧张肽部分，其含有至少一个第二附着位点，该位点能够通过至少一个键与所述第一附着位点结合。 
非天然分子支架包含或者由下列成分组成：(a)核心颗粒，其选自(1)非天然来源的核心颗粒，和(2)天然来源的核心颗粒；(b)至少一个第一附着位点，它通过至少一个共价键与所述核心颗粒连接。在本发明的偶联物、制剂和方法中使用的核心颗粒包括无机分子、病毒颗粒、病毒样颗粒和细菌菌毛。在本发明的偶联物、制剂和方法中使用的血管紧张肽部分含有至少一个第二附着位点，其选自：(a)血管紧张肽部分内非自然存在的附着位点；和(b)血管紧张肽部分 内自然存在的附着位点。 
本发明提供一种有序、重复的阵列，它是由第二附着位点与第一附着位点通过至少一个键连接而形成的。因此，通过第一和第二附着位点的这种连接，血管紧张肽部分和非天然分子支架结合在一起，形成一种有序、重复的抗原阵列。 
技术人员可以特异地设计血管紧张肽部分和第二附着位点，使得与非天然分子支架(或者在某些实施方案中，与核心颗粒)结合的所有血管紧张肽部分均一排列。例如，可以将单一的第二附着位点置于血管紧张肽部分上，从而通过设计确保与非天然分子支架附着的所有血管紧张肽部分均一排列。在本发明的一个方面，在血管紧张肽部分序列的C端或N端添加一个或多个其它氨基酸(形成非自然存在的第二附着位点)，以确保尤其与根据本发明的核心颗粒定向、有序的结合。因此，本发明提供一种便利的方法，用来将任何血管紧张肽部分以确定的顺序和形成重复模式的方式置于非天然分子支架上。 
本领域普通技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及使用重组核酸技术，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白在原核和真核细胞中的表达等。这些方法为本领域技术人员所熟知，在发表的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997))。使用组织培养细胞系工作的基本实验室技术(Celis，J.编著，《细胞生物学》，AcademicPress，第二版，(1988))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，《抗体：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白质纯化原理与实践》，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有大量描述，全部在此引用作为参考。 
此外，本领域技术人员也熟知将有机分子与氨基酸偶联的技术， 和制备含有适当第二附着位点(如实施本发明所必需)的血管紧张肽部分衍生物的方法。这些方法在化学教科书和公开文献中可见，其实例包括如下文献，在此引用作为参考：美国专利号5,876,727；WO99/61054；Isomura，S.等人，J.Org.Chem.66：4115-4121(2001)；Matsushita，H.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.57：1006-1010(1974)；Langone，J.L.和Van Vunakis，H.，Methods Enzymol.84：628-640(1982)；Wong，《蛋白质偶联和交联的化学》.CRC Press，Inc.，BocaRaton，Fla(1991)。 
核心颗粒与非天然分子支架 
在一个实施方案中，本发明提供构成一种或多种血管紧张肽部分的有序、重复阵列的方法。根据本发明，通过核心颗粒与一种或多种血管紧张肽部分通过第一和第二附着位点结合产生。 
因此，某些情况下，本发明的偶联物和制剂中的一种组分是非天然分子支架，其包含或由核心颗粒和一个第一附着位点组成。更具体而言，非天然分子支架包含或由下列成分组成：(a)天然或非天然来源的核心颗粒，(b)通过至少一个共价键与核心颗粒连接的至少一个第一附着位点。 
核心颗粒。在本发明的一个实施方案中，核心颗粒是一种合成聚合物、脂质微团或金属。这类核心颗粒在本领域周知，为建立本发明的新型非天然分子支架提供基础。例如，美国专利号5,770,380和美国专利号5,334,394公开了合成聚合物或金属核心颗粒，在此完整引用作为参考。合适的金属包括但不限于：铬、铷、铁、锌、硒、镍、金、银、铂。合适的陶瓷材料包括但不限于：二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化钌和氧化锡。该实施方案的核心颗粒可以由有机材料制成，包括但不限于碳和适当的聚合物，包括聚苯乙烯、尼龙和硝酸纤维素。对于纳米晶体颗粒，可以使用由氧化锡、二氧化钛或碳(钻石)制成的颗粒。用于本发明的脂质微团通过本领域周知的任何方法制备，例如，Baiselle和Millar(Biophys.Chem.4：355-361(1975))或Corti 等人(Chem.Phys.Lipids38：197-214(1981))或Lopez等人(FEBS Lett.426：314-318(1998))或Topchieva和Karezin(J.Colloid Interface Sci.213：29-35(1999))或Morein等人(Nature308：457-460(1984))，在此完整引用作为参考。 
在本发明的一个实施方案中，核心颗粒通过生物学方法生产，可以是天然的或非天然的。例如，病毒和细菌菌毛或菌毛样结构由可组织为有序、重复结构的蛋白质构成。因此，本发明包括包含有用的核心颗粒的偶联物、制剂和方法，这些核心颗粒包括但不限于：病毒、病毒样颗粒、细菌菌毛、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其片段。在某些这样的实施方案中，蛋白质可以是重组的。 
在某些实施方案中，非天然分子支架的核心颗粒包括病毒、细菌菌毛、由细菌菌毛蛋白构成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式。可以选择本领域周知的具有有序、重复外壳和/或核心蛋白质结构的任何病毒，在本发明的方法、偶联物和制剂中作为非天然分子支架使用。合适的病毒的实例包括但不限于：辛德毕斯病毒和其它甲病毒，棒状病毒(例如水泡性口膜炎病毒)，微小RNA病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)，披膜病毒(例如风疹病毒)，正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、家禽瘟疫病毒)，多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)，细小病毒，轮状病毒，噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体M11，噬菌体MX1，噬菌体NL95，噬菌体fr，噬菌体GA，噬菌体SP，噬菌体MS2，噬菌体f2，噬菌体PP7，噬菌体AP205，诺瓦克病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，烟草花叶病毒，兽棚病毒，和人乳头瘤病毒(例如，参见Bachman，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today17：553-558(1996)中的表1)。在本发明的一个更具体的代表性实施方案中，核心颗粒可包含或由下列成分组成：重组轮状病毒蛋白，重组诺瓦克病毒蛋白，重组甲病毒蛋白，可形成细菌菌毛或菌毛样结构的重组蛋白，重组口蹄疫病毒蛋白，重组逆转录病毒蛋白，重组乙型肝炎病毒蛋白(例如HBcAg)，重组烟草花叶病毒蛋白，重组兽棚病 毒蛋白，和重组人乳头瘤病毒蛋白。 
在本发明的偶联物、制剂和方法中使用的核心颗粒还可包含或由下列成分组成：这些蛋白质的一种或多种片段，以及这些蛋白质的变体，它们仍保留彼此结合形成有序、重复抗原或抗原决定簇阵列的能力。例如，如共同所有的共同未决的美国专利申请号10/050.902(2002年1月18日提交，其公开内容在此完整引用作为参考)所述，核心颗粒可以由人HBcAg的变体形式构成，这种变体在氨基酸序列同一性和相似性和序列长度上与野生型颗粒显著不同。例如，感染雪鹅和鸭的乙型肝炎病毒HBcAg的氨基酸序列与感染哺乳动物的病毒的HBcAg十分不同，以致难以进行蛋白质比对。然而，这两种病毒都保留了适于形成有序、重复的抗原阵列的核心结构的能力。类似地，在除去N端前导序列，进一步对序列进行缺失、置换或添加之后，HBcAg可以保留形成多聚颗粒(通常是病毒颗粒)的能力。能够确定蛋白质是否形成这种结构的方法包括凝胶过滤、琼脂糖凝胶电泳、蔗糖梯度离心和电子显微镜检查(例如，Koschel，M.等人，J.Virol.73：2153-2160(1999))。 
第一附着位点。无论是天然的还是非天然的，在本发明的偶联物、制剂和方法中使用的核心颗粒通常含有一种成分，该成分包含一个第一附着位点，该位点通过至少一个共价键与天然或非天然核心颗粒附着。包含第一附着位点的组分以非随机方式与核心颗粒结合，为产生有序、重复的阵列提供了一个核化位点。理想地但不是必须地，该组分与核心颗粒以几何顺序结合。第一附着位点可以是核心颗粒的天然部分，如适合与第二附着位点偶联的表面暴露的氨基酸残基。例如，赖氨酸和半胱氨酸可通过氨基酸上的反应性基团形成非肽键。此外，也可以通过化学偶联或通过设计重组分子，将含有第一附着位点的组分导入核心颗粒内。第一附着位点可以是通过至少一个共价键与核心颗粒结合的任何组分，或者存在于该组分上。 
第一附着位点可包含或由下列成分组成：蛋白质、多肽、肽、氨基酸(即蛋白质、多肽或肽的残基)、糖、多核苷酸、天然或合成的 聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。在一个更具体的实施方案中，第一附着位点包括抗原、抗体或抗体片段、生物素、亲和素、链霉亲和素、受体、受体配体、配体、配体结合蛋白、相互作用亮氨酸拉链多肽、氨基、氨基反应性的化学基团；羧基，羧基反应性的化学基团，巯基，巯基反应性的化学基团，或其组合。 
在一个实施方案中，本发明通过基因工程改造一种病毒产生有序、重复病毒包膜蛋白与包含第一附着位点的组分的融合，该组分包括异源蛋白质、肽、抗原决定簇或选择的反应性氨基酸残基。在非天然分子支架的构建中可以使用本领域公知的其它遗传操作；例如，希望通过基因突变限制重组病毒的复制能力。为了与含有第一附着位点的蛋白质融合而选择的病毒蛋白应当具有有序、重复的结构。这种有序、重复结构包括在病毒表面上间距为0.5-30nm、优选5-15nm的类晶体结构。这类融合蛋白的产生将在病毒表面产生多个有序、重复的第一附着位点。因此，由此产生的第一附着位点的有序、重复的结构反映了天然病毒蛋白的正常组织结构。 
本领域普通技术人员应当理解，第一附着位点可以是任何合适的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合，或是它们的一部分，它们可用来使选择的抗原或抗原决定簇与非天然分子支架特异附着。在一个实施方案中，附着位点是一种可选自本领域所知的蛋白质或肽。例如，第一附着位点可以是配体、受体、凝集素、亲和素、链霉亲和素、生物素、表位如HA或T7标签、Myc、Max、免疫球蛋白域和本领域公知可以用作第一附着位点的其它任何氨基酸序列。 
本领域技术人员应当能够进一步理解，在本发明的另一个实施方案中，可以在产生携带第一附着位点(例如蛋白质或多肽)的组分后产生第一附着位点，该组分用于构建与衣壳蛋白的框内融合。例如，一种蛋白质可以用来与包膜蛋白融合，其含有已知以特定方式糖基化 的氨基酸序列，添加的糖部分然后可以作为病毒支架的第一附着位点，与作为抗原的第二附着位点的凝集素结合。此外，一种序列也可以在体内被生物素标记，生物素部分可以作为本发明的第一附着位点，或者序列可以在体外进行氨基酸残基的不同化学修饰，该修饰作为第一附着位点。 
在本发明的一个具体实施方案中，第一附着位点是与乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)框内融合的JUN-FOS亮氨酸拉链蛋白结构域。然而，本领域普通技术人员应当理解，也可以在融合蛋白构建体中使用其它病毒衣壳蛋白以定位本发明的非天然分子支架中的第一附着位点。例如，在本发明的其它实施方案中，选择第一附着位点为与HBcAg框内融合的赖氨酸或半胱氨酸残基。本领域技术人员也应当理解，在融合蛋白构建体中也可以使用其它病毒衣壳或病毒样颗粒以定位本发明的非天然分子支架中的第一附着位点。 
病毒颗粒。在本发明的一个实施方案中，非天然分子支架是一种重组甲病毒，更具体而言，是一种重组辛德毕斯病毒。甲病毒科的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong，C.等人，Science 243：1188—1191(1989)；Schlesinger，S.，Trends Biotechnol．11：18-22(1993))、塞姆利基森林病毒(SFV)(
Figure S02818924819960327D000261
P.&Garoff，H.，Bio/Technology 9：1356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology 171：189-204(1989))，在作为多种不同蛋白质的基于病毒的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin．Biotechnol．8：578-582(1997)；P.，Curr.Opin.Biotechnol.5：495-500(1994))以及作为疫苗研制的候选物方面已经受到极大关注。甲病毒在异源蛋白质表达和疫苗研制中的用途已经公开(参见美国专利号5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245；5,814,482；其公开内容在此完整引用作为参考)。根据本发明该方面的甲病毒支架的构建可以用本领域周知的重组DNA技术进行，如上述文章所述，在此引用作为参考。能够使用多种重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒，用于一种或多种血管紧张肽部分的附着。 
包装的RNA序列也能够用来感染宿主细胞。这些包装的RNA序 列能够通过添加到培养基中而导入宿主细胞内。例如，在大量资料中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备，包括“辛德毕斯表达系统”，C版(Invitrogen Corporation，Carlsbad CA；目录号K750-1)。 
当使用哺乳动物细胞作为重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒时，这些细胞通常在组织培养基中培养。在培养基中培养细胞的方法在本领域中众所周知(参见，例如：Celis，J.编著，《细胞生物学》，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《动物细胞培养》，Alan R.Liss，Inc.(1993))。 
本发明包括基于病毒的核心颗粒，其包含或由下列成分组成：病毒、病毒样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其重组形式。通常，熟练技术人员知道如何生产这些核心颗粒以及与第一附着位点附着。WO00/32227的实施例17-22公开了生产乙型肝炎病毒样颗粒(特别是由HBcAg装配或自装配的)和麻疹病毒衣壳颗粒作为核心颗粒，在此引用作为参考。在这些实施方案中，可以用JUN亮氨酸拉链蛋白结构域或FOS亮氨酸拉链蛋白结构域作为本发明的非天然分子支架的第一附着位点。本领域普通技术人员应当知道如何构建携带含反应性赖氨酸残基之框内融合肽的乙型肝炎核心颗粒，和携带基因融合的半胱氨酸残基的血管紧张肽部分，分别作为第一和第二附着位点。 
在其它实施方案中，在本发明的偶联物中使用的核心颗粒由乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)、HBcAg的片段或能够形成病毒样颗粒的其它蛋白质或肽组成，它们是有序的阵列，已经被修饰除去了游离半胱氨酸残基或减少了其数量。Zhou等人(J.Virol.66：5393-5398(1992))证实，经修饰除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留结合并形成多聚体结构的能力。因此，适于在本发明的偶联物中使用的核心颗粒包括包含修饰的HBcAg或其片段的核心颗粒，其中一个或多个自然存在的半胱氨酸残基已经被删除或被置换为另 一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。在本发明的一个实施方案中，用包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的修饰的HBcAg或其亚部分制备非天然分子支架。具体而言，适用于本发明的修饰的HBcAg包含如下蛋白质：其中在对应于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的位点48、61、107、185的位点处，一个或多个半胱氨酸残基已经被删除或被置换为其它氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。本领域技术人员应当知道，在含有不同于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的HBcAg变体中，位于相似位点的半胱氨酸残基也可能被删除或被置换为其它氨基酸残基。然后可以用修饰的HBcAg变体制备本发明的疫苗偶联物。 
在某些情况下(例如，当使用异双功能交联剂附着一个或多个血管紧张肽部分和非天然分子支架时)，认为HBcAg中存在游离半胱氨酸残基使得毒性成分与核心颗粒共价偶联，以及单体交联形成不确定的形式。另外，在许多情况中，对本发明偶联物进行的测定可能无法检测到这些毒性成分。这是因为毒性成分与非天然分子支架的共价偶联将导致形成一群不同的形式，其中毒性成分与HBcAg的不同半胱氨酸残基连接，或者在某些情况下与HBcAg的非半胱氨酸残基连接。换句话说，不是每个HBcAg的每个游离半胱氨酸残基将与毒性成分共价连接。此外，在许多情况下，特定HBcAg的半胱氨酸残基均不与毒性成分连接。因此，这些毒性成分的存在可能难以检测，因为它们会混合在分子群中。然而，对个体施用包含毒性成分的HBcAg形式可能导致严重的副作用。 
本领域众所周知，游离半胱氨酸残基能够参与大量化学副反应。这些副反应包括二硫键交换，与例如在与其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸反应。因而能够产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向这一事实。使用以含有游离半胱氨酸的HBcAg和异双功能交联剂制备的衣壳，难以检测抗原-衣壳偶联物中的这些毒性产物，因为将产生大范围分子量产物的分布。毒性加合物分布于 多个形式之间，它们单个均以低浓度存在，但在一起存在时达到毒性水平。 
根据如上所述，在疫苗偶联物中使用经修饰除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当血管紧张肽部分与非天然分子支架附着时毒性形式能够结合的位点在数量上减少或者完全消失。进而，能够用高浓度的交联剂生产高度修饰的颗粒，而没有产生大量不确定的HBcAg单体交联形式(即交联的单体HBcAg的不同混合物)的缺点。 
适用于本发明的大量自然存在的HBcAg变体已经被鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol.73：10122-10128(1999))描述了在对应于SEQ IDNO：1的97位点处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。大量HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于GenBank报告AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X8529、X85307、X65257、X85311、X85301、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520、P03153、AF110999和M95589中，每个公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg变体在多个位点处的氨基酸序列不同，包括对应于位于SEQID NO：1中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基酸残基。 
WO00/198333、WO00/177158和WO00/214478中描述了适于在本发明的组合物中使用，并可根据本申请书公开内容进一步修饰的其它HBcAg变体，在此完整引用作为参考。
适用于本发明的HBcAg能够来源于任何生物，只要它们能够结合形成有序、重复的抗原阵列。在本发明的疫苗偶联物中一般使用加工的HBcAg(即缺乏前导序列的)。本发明包括疫苗偶联物，以及应用这些偶联物的方法，它们使用上述变异HBcAg制备非天然分子支架。本发明的范围内还包括能够结合形成二聚体或多聚体结构的其它HBcAg变体。因此，本发明还包括包含HBcAg多肽的疫苗偶联物，该多肽包含或由如下氨基酸序列组成：它们与包括SEQ ID No：1在内的上述序列所示任何一种氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％相同，以及必要时加工除去N端前导序列的这些蛋白质的形式。 
一种多肽的氨基酸序列是否具有与上述氨基酸序列之一或其亚部分至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％相同的氨基酸序列，能够利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，设置参数，使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且使同源性缺口可达参照序列中氨基酸残基总数的5％。这样，可以在SEQ ID NO：1的HBcAg与其它HBcAg的氨基酸序列之间进行比较。当比较相对相似的蛋白质时，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO：1中特定位点的位置处的氨基酸残基，是指SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性在很大程度上足够高，因此本领域技术人员不难检查SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列及特定HBcAg变体的氨基酸序列，并鉴定“相应的”氨基酸残基。例如，在比较SEQ ID NO：1与来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列时，显然在该序列中在SEQ ID NO：1的氨基酸残基155与156之间插入了3个氨基酸残基。 
然而，当难以比对时，本领域技术人员应当认识到序列中特定氨基酸残基或基序的重要性。例如，来自人病毒的HBcAg的氨基酸序列不同于鸭病毒，因此难以比对，而本领域技术人员应当知道，在包 含于本发明的疫苗偶联物之前，保守半胱氨酸残基能够被置换为另一种氨基酸残基或删除。 
在一个实施方案中，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的位点48和107处的半胱氨酸残基缺失或被置换为另一种氨基酸残基，而位点61处的半胱氨酸仍在原处。然后用修饰的多肽制备本发明的疫苗偶联物。 
能够用于本发明的优选乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中公开，例如：WO00/32227，具体见实施例17-19和21-24，以及WO01/85208，具体见实施例17-19、21-24、31-41，和本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902。最后一个申请具体参照实施例23、24、31和51。全部三篇文献在此均引用作为参考。 
如本申请人于2002年1月18日提交的美国申请号10/050,902的实施例31所述，例如通过定点诱变可以除去溶剂可及的位点48和107处的半胱氨酸残基。在一个这样的实施例中，发现如2002年1月18日提交的共同未决的美国申请号10/050,902(在此完整引用作为参考)所述构建的Cys-48-Ser、Cys-107-Ser HBcAg双突变体能够在大肠杆菌中表达。 
如上所述，除去游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够结合HBcAg的位点数量，也除去了同一或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基能够发生交联的位点。位点61处的半胱氨酸，其参与二聚体的形成并且与另一个HBcAg位点61处的半胱氨酸形成二硫桥键，为了本发明的HBcAg二聚体和多聚体的稳定，通常保持其完整。用(1)含有游离半胱氨酸残基的HBcAg和(2)其游离半胱氨酸残基与碘乙酰胺不反应的HBcAg进行的交联实验表明，HBcAg的游离半胱氨酸残基通过异双功能交联剂衍化的赖氨酸侧链与游离半胱氨酸残基之间的反应，引起HBcAg之间的交联。也发现，HBcAg亚单位的交联导致大小不确定的高分子量形式的形成，它们不能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。 
当血管紧张肽部分与非天然分子支架通过一个赖氨酸残基连接 时，置换或删除位于相对于SEQ ID NO：1位点7和96的位点处的自然存在的赖氨酸残基之一或全部以及HBcAg变体中存在的其它赖氨酸残基是有利的。除去这些赖氨酸残基导致除去了可能破坏有序阵列的血管紧张肽部分的结合位点，应能提高终疫苗偶联物的质量和均一性。 
在许多情况下，当对应于SEQ ID NO：1位点7和96的位点处自然存在的两个赖氨酸残基均被去除时，向HBcAg中引入另一个赖氨酸作为血管紧张肽部分的附着位点。插入这种赖氨酸残基的方法在例如2002年1月18日提交的共同未决的美国申请号10/050,902中描述，具体参照美国申请号10/050,902的实施例23(在此完整引用作为参考)。例如，当对应于SEQ ID NO：1位点7和96的位点处自然存在的两个赖氨酸残基均被改变，并且试图利用异双功能交联剂将血管紧张肽部分与非天然分子支架附着时，向HBcAg内引入一个赖氨酸残基通常是有利的。 
已经证明HBcAg的C端引导该蛋白质的核定位(Eckhardt等人，J.Virol.65：575-582(1991))。而且也认为该蛋白质的这一区域使HBcAg具有结合核酸的能力。 
在一些实施方案中，本发明的疫苗偶联物含有具有核酸结合活性的HBcAg(例如含有自然存在的HBcAg核酸结合域)。含有一个或多个核酸结合域的HBcAg可用于制备显示出增强的T细胞刺激活性的疫苗偶联物。因此，本发明的疫苗偶联物包括含有具有核酸结合活性的HBcAg的偶联物。另外还包括疫苗偶联物，以及这些偶联物在接种方案中的用途，其中HBcAg与核酸结合。这些HBcAg在对个体施用之前可以与核酸结合，或者可以在施用后与核酸结合。 
适用于本发明的其它HBcAg包括N端和C端截短突变体，以及突变型蛋白，其氨基酸序列包含或由这样的氨基酸序列组成：它们与上述截短突变体至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％相同。 
如上所述，在本发明的某些实施方案中，向构成非天然分子支架的一种多肽内引入一个赖氨酸残基作为第一附着位点。在优选实施方案中，使用一种HBcAg制备本发明的疫苗偶联物，该HBcAg包含或由下列氨基酸组成：SEQ ID NO：1的氨基酸1-144或氨基酸1-149或氨基酸1-185，其经过修饰，使得对应于位点79和80的氨基酸被替换为具有氨基酸序列Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(SEQ ID NO：31)的肽，位点48和107处的半胱氨酸残基缺失或被置换为另一种氨基酸残基，而位点61处的半胱氨酸仍在原处。 
本发明还包括包含HBcAg片段的疫苗偶联物，该片段包含或由不同于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，该序列中不在SEQ ID NO：1相应位点处存在的半胱氨酸残基已经被删除。 
本发明的疫苗偶联物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗偶联物可由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和修饰的HBcAg的疫苗偶联物，在修饰的HBcAg中一个或多个氨基酸残基已经被改变(例如缺失、插入或置换)。 
本发明还包括使用与另一种蛋白质融合的HBcAg制备非天然分子支架的疫苗偶联物。如上所述，这种融合蛋白的一个例子是HBcAg/FOS融合蛋白。适于在本发明的疫苗偶联物中使用的HBcAg融合蛋白的其它实例包括已经添加了一种有助于形成和/或稳定HBcAg二聚体和多聚体的氨基酸序列的融合蛋白。这种添加的氨基酸序列可与HBcAg的C端融合。这种融合蛋白的一个实例是HBcAg与酿酒酵母GCN4螺旋区的融合蛋白，它通过非共价相互作用形成同型二聚体，可以用来制备并稳定HBcAg二聚体和多聚体。 
在一个实施方案中，本发明提供使用HBcAg融合蛋白制备的疫苗偶联物，该融合蛋白包含HBcAg或其片段，以及与C端融合的GCN4多肽(SEQ ID NO：5，PAALKRARNEAARRSRARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKK)。该GCN4多肽也可与HBcAg的N端融合。 
HBcAg/src同源3(SH3)域融合蛋白也可以用来制备本发明的疫苗偶联物。SH3域是在大量蛋白质中发现的相对较小的域，它提供与蛋白质结合性配偶体中特定富含脯氨酸序列相互作用的能力(参见 McPherson，Cell Signal11：229-238(1999))。HBcAg/SH3融合蛋白可以以几种方式使用。首先，SH3域能够构成第一附着位点，该位点可与血管紧张肽部分的第二附着位点相互作用。同样，可以向HBcAg中添加富含脯氨酸的氨基酸序列，并作为对于血管紧张肽部分的SH3域第二附着位点的第一附着位点。其次，SH3域能够与引入HBcAg内的富含脯氨酸区结合。因此，SH3域和富含脯氨酸的SH3相互作用位点可以被插入相同或不同的HBcAg内，用来构成并稳定本发明的二聚体和多聚体。 
上述实例证实，本领域技术人员应当知道如何由HBcAg和HBcAg衍生的突变型蛋白构成包含核心颗粒和第一附着位点的分子支架。应用本领域周知的技术和常规实验，本领域普通技术人员应当理解如何类似地使用其它病毒构建分子支架。 
如本说明书其它部分所述，病毒衣壳可用于(1)一种或多种血管紧张肽部分的呈递，和(2)本发明的疫苗偶联物的制备。特别是，在本发明的实施中有用的是病毒衣壳蛋白，在此也称为“外壳蛋白”，它在表达后形成衣壳或衣壳样结构。因此，这些衣壳蛋白能够形成核心颗粒和非天然分子支架。这些衣壳或衣壳样结构通常形成有序、重复的阵列，后者可用于抗原决定簇的呈递和本发明的疫苗偶联物的制备。 
一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)血管紧张肽部分可以通过任何方法与一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)形成病毒衣壳或衣壳样结构(例如噬菌体外壳蛋白)的蛋白质以及其它蛋白质附着。例如，血管紧张肽部分可以利用第一和第二附着位点附着于核心颗粒。此外，也可以用一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)异双功能交联剂使一种或多种血管紧张肽部分附着于一种或多种形成病毒衣壳或衣壳样结构的蛋白质。 
例如，可以使用病毒衣壳蛋白或其片段制备核心颗粒和本发明的疫苗偶联物。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。进而，这些蛋白质在表达后自发形成衣壳，它们是病毒样颗粒。另外， 这些颗粒形成有序、重复的抗原阵列，能够在血管紧张肽部分的呈递和疫苗偶联物的制备中使用。 
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA-噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7；m)噬菌体AP205。 
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr或RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。 
可以用来制备本发明偶联物的噬菌体外壳蛋白的具体实例包括RNA噬菌体的外壳蛋白，如：噬菌体Qβ(SEQ ID NO：3；PIR数据库，登录号VCBPQβ指QβCP，和SEQ ID NO：4；登录号AAA16663指QβA1蛋白)，噬菌体R17(PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(GenBank登录号CAA30374指SP CP，和涉及SP A1蛋白的登录号)，噬菌体MS2(PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7，噬菌体AP205(SEQ ID NO：12)。本领域技术人员应当知道，能够用形成衣壳或衣壳样结构的任何蛋白质制备本发明的疫苗偶联物。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白(Genbank登录号AAA16663(SEQ ID NO：4))或从C端丢失多达约100、约150或约180个氨基酸的C端截短形式也可参与Qβ外壳蛋白的衣壳装配。A1蛋白也可融合含有第一附着位点的一种组分，以与含有第二附着位点的血管紧张肽部分附着。为了确保衣壳形成，衣壳装配中A1蛋白相对于QβCP的百分比通常受到限制。 
也发现Qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE137：133-137(1993))。获得的衣壳或病 毒样颗粒显示二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3半对称。噬菌体Qβ的晶体结构已经解析。该衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，它们通过二硫桥键连接为共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure4：543-5554(1996))。也发现其它RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein，RA.等人，Gene23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology170：238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白外还含有所谓的连读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通过在UGA终止密码子处抑制而产生，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，在病毒的生命周期中作为一种翻译阻遏物。这种相互作用的序列和结构组件已知(Witherell，GW.&Uhlenbeck，OC.Biochemistry28：71-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.271：31839-31845(1996))。已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure4：543-5554(1996))。 
我们通过N端Edman测序发现，在大肠杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端蛋氨酸通常被除去，该方法如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252：990-993(1977)中所述。本发明的范围内也包括由其中N端蛋氨酸尚未去除的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有其中N端蛋氨酸被切除和仍然存在的Qβ外壳蛋白混合物的VLP。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。 
AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成；一种裂解基因和开放阅读框在成熟基因的翻译中起作用(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol.83：1523-33(2002))。AP205外壳蛋白能够由质粒pAP283-58(SEQ ID NO：11)表达，该质 粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))，含有一个AP205核糖体结合位点。此外，AP205外壳蛋白也可以被克隆到pQb185内，位于载体中核糖体结合位点的下游。这两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成，如2002年7月17日本申请人提交的题目为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请号60/396,126中所述，在此完整引用作为参考，具体如所述专利申请的实施例2所述。载体pQb10和pQb185是由pGEM载体衍生的载体，克隆到这些载体中的基因的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQ ID NO：11)包含推断的具有下列序列的AP205核糖体结合位点，位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子直接上游：tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT GAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO：33)。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg，SD序列以下划线标出，SEQ ID NO：18)。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。 
本发明的这一优选实施方案包含可形成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质重组表达或从天然来源制备。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中观察时，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：12)形成的衣壳与AP205RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法辨别。AP205VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生展示以重复方式定向的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。产生针对这样展示的抗原的高滴度，这表明结合的抗原和/或抗原决定簇容易与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。 
AP205VLP的可装配突变形式，包括氨基酸5处的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：13)，也可以在本发明中使用，形成本发明的一个更优选的实施方案。这些VLP、来自天然来源的AP205VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，产生根据本发明的有序、重复的抗原阵列。 
AP205P5-T突变外壳蛋白能够由质粒pAP281-32(SEQ ID NO：14)表达，该质粒由pQb185直接衍生，含有突变的AP205外壳蛋白基因而不是Qβ外壳蛋白基因。为了表达AP205外壳蛋白，用表达AP205外壳蛋白的载体转染大肠杆菌。 
分别表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法，在2002年7月17日本申请人提交的题目为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请号60/396,126中描述，在此完整引用作为参考。合适的大肠杆菌株包括但不限于：大肠杆菌K802、JM 109、RR1。合适的载体和菌株及其组合能够通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达而鉴定，衣壳的形成和装配如下鉴定：首先任选通过凝胶过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137：133-37(1993))检测。 
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏最初的蛋氨酸。AP205VLP的切割形式、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变型外壳蛋白的片段组成。 
在本发明中也可使用能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。可以通过内部删除或分别在外壳蛋白和突变型外壳蛋 白的末端删除产生这些片段。只要与VLP装配相容，向外壳蛋白和突变型外壳蛋白序列中插入，或抗原序列与外壳蛋白和突变型外壳蛋白序列融合是本发明的进一步的实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是否与VLP装配相容，能够通过电子显微镜检查确定。 
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒能够被分离为纯化形式，分离方法是组合使用通过沉淀的分级分离步骤和通过凝胶过滤的纯化步骤，例如使用Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合，如2002年7月16日本申请人提交的题目为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请中所述，在此完整引用作为参考。分离病毒样颗粒的其它方法在本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此完整引用作为参考。 
根据本发明，一种或多种血管紧张肽部分可附着于RNA噬菌体外壳蛋白衣壳的一个亚单位上。RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳、特别是Qβ衣壳的每个亚单位偶联几个血管紧张肽部分的能力使得能够产生密集的血管紧张肽部分阵列。其它病毒衣壳通过化学交联可与血管紧张肽部分共价附着，例如在主要免疫显性区中含有一个赖氨酸残基的修饰的HBcAg(MIR；WO00/32227)。HBcAg刺突之间的距离(对应于MIR)是50埃(Wynne，SA.等人，Mol.Cell 3：771-780(1999))，因此不能产生间距小于50A的血管紧张肽部分阵列。 
Qβ外壳蛋白的衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的布局，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，其它4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特征有利于血管紧张肽部分附着于颗粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基有确定的布局。来源于RNA噬菌体的衣壳的另一个优点是它们在细菌中的高表达量，这允许以可负担的成 本大量生产材料。 
Qβ外壳蛋白的衣壳的另一个特征是其稳定性。Qβ亚单位通过二硫桥键彼此结合，共价连接亚单位。Qβ衣壳蛋白也显示对有机溶剂和变性剂不同寻常的抗性。我们惊奇地发现，能够使用高至约30％的DMSO和乙腈浓度和高至约1M的胍盐浓度，而不影响衣壳的稳定性或形成血管紧张肽部分阵列的能力。因此，可以使用这些有机溶剂偶联疏水分子，如某些血管紧张肽部分。特别是对于在哺乳动物和人的免疫和接种中的用途而言，Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性是一个重要特征。衣壳对有机溶剂的抗性使得在水性缓冲液中不可溶的血管紧张肽部分或其衍生物能够偶联。 
美国专利号5,698,424描述了向RNA噬菌体MS-2的外壳蛋白的N端β发夹中插入一个半胱氨酸残基，该专利在此完整引用作为参考。然而我们注意到，衣壳中存在暴露的游离半胱氨酸残基可通过形成二硫桥键导致衣壳寡聚化。上述美国专利中所述的其它附着涉及血管紧张肽部分与Qβ颗粒之间二硫桥键的形成。这些附着对含有巯基部分的分子不稳定。 
最初Qβ上的半胱氨酸残基形成的二硫桥键与含有游离巯基残基的抗原之间的反应释放含巯基的形式，而不是血管紧张肽部分。这些新形成的含巯基形式能够与颗粒上存在的其它二硫桥键再次反应，从而建立平衡。一旦与颗粒上形成的二硫桥键反应，血管紧张肽部分即可与来自颗粒的半胱氨酸残基，或者与在颗粒上形成最初二硫桥键的离去基团分子的半胱氨酸残基形成二硫桥键。而且，使用一侧与Qβ颗粒上的半胱氨酸反应、另一侧与血管紧张肽部分上的赖氨酸残基反应的异双功能交联剂，所述的其它附着方法可导致血管紧张肽部分在颗粒上的随机定向。 
我们进一步注意到，与Qβ和Fr外壳蛋白的衣壳不同，美国专利号5,698,424所述的重组MS-2基本不含核酸，而在上述两种衣壳内包装有RNA。 
我们在此描述了本发明的允许形成坚固的血管紧张肽部分阵列 的新的偶联物，这些偶联物中含有不同密度的血管紧张肽表位。我们证实，通过将血管紧张肽部分附着于VLP能够获得极高的表位密度。此外，通过改变含有适当第一附着位点的残基的数量和类型也能够修饰血管紧张肽部分的密度和间距。例如，2002年1月18日提交的共同未决的美国专利申请号10/050,902公开了一种含有额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它比野生型Qβ外壳蛋白更适于获得高密度的阵列。此外，上述申请也公开了适于以适当间距同时展示几种抗原的偶联物，和以适当和希望的方式添加辅助分子提高溶解度或修饰衣壳的偶联物。其它Qβ外壳蛋白突变体、形成的衣壳(是病毒样颗粒)，在共同未决的美国专利申请号10/050,902中公开，适于生产本发明的组合物。特别是，当血管紧张肽部分和Qβ-血管紧张肽抗原阵列的可溶性限制了能够与Qβ病毒样颗粒附着的血管紧张肽部分的数量时，可以使用赖氨酸残基已经被置换为精氨酸(它没有与赖氨酸残基相同的反应性)的突变体。在制备这些组合物时，可以用高浓度的血管紧张肽部分或经修饰含有第二附着位点的血管紧张肽部分阵列在突变型Qβ病毒样颗粒上的赖氨酸残基处获得完全反应，而不会象使用野生型Qβ病毒样颗粒时那样，产生可能不溶的含有较多附着的血管紧张肽部分的颗粒。 
几种RNA噬菌体的晶体结构已经被测定(Golmohammadi，R.等人，Structure4：543-554(1996))。利用这些信息，本领域技术人员能够容易地鉴定表面暴露的残基并修饰噬菌体外壳蛋白，以便能够插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，本领域技术人员能够容易地生产和鉴定可用于本发明中的噬菌体外壳蛋白的修饰形式。因此，也可以用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的疫苗偶联物。 
尽管上述变异蛋白质的序列不同于其野生型，但是这些变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括：包含可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的疫苗偶联物，以及制备这 些疫苗偶联物的方法，用来制备这些疫苗偶联物的各种蛋白质亚单位。因此，本发明的范围内包括野生型蛋白质的变体形式，它们可形成有序、重复的阵列(例如可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体)，并保留结合并形成衣壳或衣壳样结构的能力。C端和N端截短变体通常保留形成病毒样颗粒的能力。因此，包括缺失、添加或置换在内的变体形式、嵌合形式和自然存在的变体是本发明的适当的成分。 
细菌菌毛和菌毛蛋白。在其它实施方案中，细菌菌毛、细菌菌毛的亚部分，或含有细菌菌毛或其亚部分的融合蛋白，可以用来制备本发明的疫苗偶联物。菌毛蛋白的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产生的菌毛蛋白。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank报告所述的AJ000636、AJ132364、AF229646、AF051814、AF051815和X00981，其完整内容在此引用作为参考。 
细菌菌毛蛋白在输入细菌周质之前，通常被加工除去N端前导序列。此外，本领域技术人员应当认识到，用来制备本发明的疫苗偶联物的细菌菌毛蛋白通常不含自然存在的前导序列。 
适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体实例是大肠杆菌的P-菌毛蛋白(GenBank报告AF237482)。适用于本发明的大肠杆菌1型菌毛蛋白的一个实例是含有GenBank报告P04128所述氨基酸序列(SEQID NO：2)的菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603所示核苷酸序列的核酸编码。这些GenBank报告的完整公开内容在此引用作为参考。另外也常用上述蛋白质的成熟形式制备本发明的疫苗偶联物。 
适用于本发明的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亚部分通常能够结合形成非天然分子支架。在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法为本领域周知。例如，Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：12890-12895(1996)描述了大肠杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。此外，Eshdat等人 (J.Bacteriol.148：308-314(1981))描述了适于分离大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。简言之，这些方法如下：通过在饱和盐酸胍中37℃下孵育裂解菌毛。然后通过层析纯化菌毛蛋白，之后用5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等人也发现，在用含有5mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后，菌毛蛋白二聚体重装配形成菌毛蛋白。 
另外，例如使用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋白，使之含有第一附着位点，血管紧张肽部分通过第二附着位点与之连接。此外，血管紧张肽部分也可以通过第二附着位点与这些蛋白质中自然存在的氨基酸残基直接连接。这些修饰的菌毛蛋白然后可用于本发明的免疫性偶联物。 
用来制备本发明偶联物的细菌菌毛蛋白可以用类似于此处所述对HBcAg修饰的方式进行修饰。例如，可以将半胱氨酸和赖氨酸残基删除或置换为其它氨基酸残基，并且可以向这些蛋白质中添加第一附着位点。此外，菌毛蛋白也可以以修饰形式表达，或者可以在表达后进行化学修饰。类似地，也可以从细菌中收获完整的菌毛，然后进行化学修饰。 
在另一个实施方案中，从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛样结构，用来形成本发明的疫苗偶联物。适于制备疫苗偶联物的一个实例是大肠杆菌1型菌毛，它由具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的菌毛蛋白单体构成。 
本领域周知多种收获细菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74：623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P-菌毛质粒的多菌毛大肠杆菌上剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的多个循环纯化。2002年1月18日提交的共同未决的美国专利申请号10/050,902公开了从自然产生菌毛或者已经导入编码负责菌毛产生的fim操纵子的载体的细菌中收获和纯化I型菌毛。 
一旦收获后，即可用多种方式修饰菌毛或菌毛样结构。例如，可 以向菌毛中添加第一附着位点，一种或多种血管紧张肽部分可通过第二附着位点与之连接。换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构，形成非天然分子支架。 
也可以在没有非天然第一附着位点的情况下通过血管紧张肽部分的附着修饰菌毛或菌毛样结构。例如，抗原或抗原决定簇可以被连接到自然存在的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上。在这些情况下，自然存在的氨基酸残基的高度有序和重复性将引导血管紧张肽部分与菌毛或菌毛样结构偶联。例如，使用异双功能交联剂，菌毛或菌毛样结构可以与血管紧张肽部分的第二附着位点连接。 
当使用生物自然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的疫苗偶联物时，遗传改造这些生物使它们产生具有所希望的特征的结构通常是有利的。例如，当使用大肠杆菌1型菌毛时，可以修饰收获菌毛的大肠杆菌，使之产生具有特定特征的结构。可能的菌毛蛋白修饰的实例包括一个或多个赖氨酸残基的插入、一个或多个自然存在的赖氨酸残基的缺失或置换、一个或多个自然存在的半胱氨酸残基的缺失或置换(例如SEQ ID NO：2位点44和84处的半胱氨酸残基)。 
另外也可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，产生含有并非赖氨酸残基的第一附着位点(例如FOS或JUN域)的表达产物。当然，合适的第一附着位点通常仅限于不妨碍菌毛蛋白形成适于在本发明的疫苗偶联物中使用的菌毛或菌毛样结构的位点。重组菌毛蛋白形成菌毛的能力可以用包括电子显微镜检查在内的多种方法测定。 
细菌细胞中自然存在的菌毛蛋白基因可以在体内修饰(例如通过同源重组)，或者可以将具有特定特征的菌毛蛋白基因插入这些细胞内。例如，可以将菌毛蛋白基因导入细菌细胞中，作为复制型克隆载体或插入细菌染色体内的载体的一种成分。插入的菌毛蛋白基因也可以与表达调节控制序列(例如lac操纵子)连接。 
在大多数情况下，在本发明的疫苗偶联物中使用的菌毛或菌毛样结构由一种类型的菌毛亚单位构成。然而，本发明的偶联物也包括包含由异源菌毛蛋白亚单位构成的菌毛或菌毛样结构的疫苗。通常使用 由相同亚单位组成的菌毛或菌毛样结构，因为预期它们能够形成表现为高度有序、重复抗原阵列的结构。 
第二附着位点。本发明提供了有序、重复阵列的分子支架的制备，包括高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白衣壳的偶联物。如本领域普通技术人员应当理解的，血管紧张肽部分的性质和该部分上第二附着位点的性质和位置，是可能影响构建本发明的偶联物的方法和这些偶联物诱发免疫应答的效果的重要因素。 
设计第二附着位点的一个前提条件是融合、插入或基因改造或附着位点的选择。熟练技术人员应当知道如何找到选择第二附着位点的位置的指示，可以考虑与这种决定有关的多种因素。血管紧张肽部分的化学和/或晶体结构可以提供关于适于偶联的分子结构域的可用性的信息。一种反应性结构域的溶剂可及性可能是与第一附着位点化学偶联的动力学的限制因素。适于偶联的基团必须是可以利用的，如巯基残基。如果用血管紧张肽部分免疫旨在抑制血管紧张肽部分(也可能是一种自身抗原)与其天然配体(如底物或受体)的相互作用，通常添加第二附着位点，以便产生针对与天然配体相互作用的位点的抗体。因此选择第二附着位点的位置，避免第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它实施方案中，希望有针对一种位点的抗体应答，该位点不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点。在这些实施方案中，选择第二附着位点，防止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。考虑的其它因素包括血管紧张肽部分的性质、其生物化学性质如pI、电荷分布、进一步的修饰。通常优选柔性接头。 
选择第二附着位点位置的其它标准包括：血管紧张肽部分的寡聚状态、寡聚位点、辅因子的存在以及现有的揭示该部分结构和序列中存在如下位点的实验证据：该位点的修饰与功能部分相容，或者适于产生可识别该部分、优选地可阻断该血管紧张肽部分的功能的抗体。在某些实施方案中，向血管紧张肽部分序列的C端或N端添加一个或多个其它氨基酸(产生非自然存在的第二附着位点)，以确保特别 是血管紧张肽部分与根据本发明的病毒样颗粒定向、有序地结合。 
多肽抗原与VLP、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳附着的一个特别优选的方法是RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳表面的赖氨酸残基与抗原上的巯基残基(如半胱氨酸残基中所见)连接。类似地，血管紧张肽部分上的游离巯基也可能是有效的附着位点。为了作为第二附着位点，氧化的巯基必须是还原状态，可以用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇进行还原。 
根据本发明，通过选择交联剂和其它反应条件能够调节RNA噬菌体外壳蛋白衣壳上的表位密度。例如，用交联剂Sulfo-GMBS和SMPH能够获得高表位密度。高浓度反应物正向影响衍化，可以用操作反应条件来控制与RNA噬菌体衣壳蛋白偶联的、特别是与Qβ衣壳蛋白偶联的抗原数量。另外，核心颗粒上第一附着位点的数量是影响血管紧张肽部分阵列的密度的另一个因素。在本发明的一个实施方案中，我们提供了一种含有额外赖氨酸残基的Qβ突变型外壳蛋白，它适于获得更高密度的阵列。 
在最优选的实施方案中，血管紧张肽部分包含单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点，它们分别能够与核心颗粒和VLP或VLP亚单位上的第一附着位点结合。这确保了至少1个、一般1个以上、优选地超过10、20、40、80、120个抗原分别与核心颗粒和VLP固定、均匀地结合、连接。因此，抗原上单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点确保了一种单一、均匀类型的结合和连接，分别产生极其高度有序、重复的阵列。例如，如果通过赖氨酸(作为第一附着位点)和半胱氨酸(作为第二附着位点)的相互作用分别实现结合和连接，根据本发明该优选实施方案，确保每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接，而无论该半胱氨酸残基在抗原上是自然存在还是非自然存在。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，共价键是一种非肽键。 
在一些实施方案中，在抗原上构建第二附着位点需要融合氨基酸接头，根据本发明的公开内容，该接头含有适于作为第二附着位点的 氨基酸。因此，在本发明的一个优选实施方案中，一个氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合。优选地，该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成。在一个更优选的实施方案中，氨基酸接头包含一个巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。氨基酸接头的一些选择标准以及根据本发明的氨基酸接头的优选实施方案在上文中已经提及。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，至少一种抗原或抗原决定簇，即血管紧张肽部分，分别与核心颗粒和病毒样颗粒融合。如上所述，VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明的一个更优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇，优选地至少一种血管紧张肽部分，与病毒样颗粒或一种能够掺入VLP内的蛋白质的至少一种亚单位融合，产生嵌合VLP-亚单位-血管紧张肽部分融合蛋白。 
血管紧张肽部分的融合可以按如下实现：插入VLP亚单位序列内，或与VLP亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中，当提到一种肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内的内部插入。 
也可以通过向VLP亚单位变体内插入血管紧张肽部分的序列来实现融合，其中亚单位序列的一部分缺失，被称为截短突变体。截短突变体可能有VLP亚单位序列N端或C端缺失或内部的一部分缺失。例如，氨基酸残基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体。血管紧张肽部分与截短突变体VLP-亚单位的N端或C端的融合也是本发明的实施方案。同样，一种表位向VLP亚单位序列内的融合也可以通过置换实现，例如对于特定VLP HBcAg，用一种外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所述，实现融合的方法包括：向VLP亚单位的序列中插入血管紧张肽部分序列，用血管紧张肽部分序列置换VLP亚单位序列的一部分，或者缺失、置换或插入的组合。 
嵌合血管紧张肽部分-VLP亚单位通常能够自装配为VLP。展示 与其亚单位融合的表位的VLP在此也称为嵌合VLP。如所说明的，病毒样颗粒包含或由至少一种VLP亚单位组成。在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不含融合抗原的VLP亚单位)的混合物组成，产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配。在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可能是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。 
可以将侧翼氨基酸残基添加到与VLP亚单位序列任一端融合的肽或表位序列的任一端，或者向VLP亚单位序列内部插入这种肽序列。甘氨酸和丝氨酸残基是特别优选的氨基酸，可以在添加到待融合的血管紧张肽部分的侧翼序列中使用。甘氨酸残基提供额外的柔韧性，这可降低外源序列与VLP亚单位序列融合时可能的去稳定作用。 
在本发明的一个具体实施方案中，VLP是一种乙型肝炎核心抗原VLP。与HBcAg N端(Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))或与所谓的主要免疫显性区(MIR)中的插入融合的融合蛋白已经被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001)，WO01/98333)，并且是本发明的优选实施方案。MIR中含有缺失的HBcAg的自然存在的变体也已经被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001)，在此完整引用作为参考)，与N端或C端的融合，以及与野生型HBcAg相比在对应于缺失位点的MIR位点处的插入，也是本发明的实施方案。与C端的融合也已经被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))。本领域技术人员能够容易地找到如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指示(Sambroo k，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho等人，Gene77：51(1989))。编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表达HBcAg和HBcAg融合蛋白的载体和质粒已经被描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.5：1157-1163(1999))，可以在本发明的实施中使用。 通过实施例(实施例6)，我们也描述了向HBcAg的MIR内插入一种表位，产生自装配的嵌合HBcAg。优化自装配效率和展示插入HBcAg MIR内的表位的一个重要因素是插入位点的选择，以及插入时从MIR内HBcAg序列上删除的氨基酸数量(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001)；EP421635；美国专利号6,231,864)，换句话说，HBcAg的哪些氨基酸将被置换为新的表位。例如，已经有用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81的描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001)；EP0421635；US6,231,864)。HBcAg含有一个长的精氨酸尾(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))，它不是衣壳装配所必需的，并能够结合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology44：98-114(2001))。包含或缺乏这一精氨酸尾的HBcAg是本发明的两个实施方案。 
在本发明的一个更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。RNA噬菌体的主要外壳蛋白在细菌、特别是在大肠杆菌中表达后自发装配为VLP。能够用来制备本发明的组合物的噬菌体外壳蛋白的具体实例包括RNA噬菌体如噬菌体Qβ(SEQ ID NO：3；PIR数据库，登录号VCBPQβ指QβCP，和SEQ ID NO：4；登录号AAA16663指QβA1蛋白)和噬菌体fr(SEQ ID NO：32；PIR登录号VCBPFR)的外壳蛋白。 
在一个更优选的实施方案中，至少一种血管紧张肽部分与一种Qβ外壳蛋白融合。已经描述了融合蛋白构建体，其中表位与QβA1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，39：9-15(1996))。A1蛋白是通过UGA终止密码子的抑制产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考虑N端蛋氨酸的切除，为328个氨基酸。丙氨酸(QβCP基因编码的第二个氨基酸)之前的N端蛋氨酸的切除通常在大肠杆菌中发生，Qβ外壳蛋白CP的N端也是如此。位于UGA琥珀密码子3’的A1基因的一部分编码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入至少一个血管紧张肽部分产生本发明的另外的实施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology39：9-15(1996))。血管紧张肽部分在C端截短的QβA1蛋白C端的融合产生本发明的更优选的实施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology39：9-15(1996))描述了QβA1融合蛋白，其中该表位在位点19处平截的QβCP延伸的C端融合。 
如Kozlovska等人(Intervirology39：9-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配一般需要存在A1蛋白-血管紧张肽部分融合和野生型CP，才能形成镶嵌颗粒。然而，本发明的范围内也包括包含病毒样颗粒、特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP(其仅仅由融合至少一个血管紧张肽部分的VLP亚单位组成)的实施方案。 
镶嵌颗粒的产生可以用许多方法实现。Kozlovska等人，Intervirology39：9-15(1996)描述了两种方法，它们均能在本发明的实施中使用。第一种方法，通过在大肠杆菌株中表达在CP与CP延伸之间含有一个UGA终止密码子的编码QβA1融合蛋白的质粒，介导VLP上融合表位的有效展示，该大肠杆菌株携带编码克隆的UGA抑制性tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp(pISM3001质粒(SmileyB.K.等人，Gene134：33-40(1993))。另一种方法，将CP基因终止密码子修饰为UAA，与表达A1蛋白-血管紧张肽部分融合蛋白的第二种质粒共转化。该第二种质粒编码一种不同的抗生素耐药性，其复制起点与第一种质粒相一致(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology39：9-15(1996))。第三种方法，CP和A1蛋白-血管紧张肽部分融合蛋白以双顺反子的形式编码，与一种启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska等人，Intervirology39：9-15(1996)的图1所示。 
在另外一个实施方案中，血管紧张肽部分被插入fr CP的氨基酸2与3之间(切割的CP的编号，即其中N端蛋氨酸被切除)，从而产生血管紧张肽部分-fr CP融合蛋白。用于构建和表达可自装配为VLP的fr CP融合蛋白并且在本发明中有用的载体和表达系统已经被描述(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。在一个具体实施方案中，血管紧张肽部分序列被插入fr CP缺失变体内氨基酸2之后， 其中fr CP的残基3和4已缺失(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。 
表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白N端突起的β-发夹中的融合，以及随后融合表位在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递，也已经被描述(WO92/13081)，血管紧张肽部分通过插入或置换融合到MS-2RNA噬菌体的外壳蛋白内也属于本发明的范围。 
在本发明的另一个实施方案中，血管紧张肽部分与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，血管紧张肽部分与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合。用于构建及在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达BPV-1融合蛋白的载体和表达系统已经被描述(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。用一种血管紧张肽部分置换BLV-1L1的氨基酸130-136产生BPV-1L1-血管紧张肽部分融合蛋白，是本发明的一个优选实施方案。在杆状病毒载体中的克隆以及在杆状病毒感染的Sf9细胞中的表达已经被描述，并能够在本发明的实施中应用(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。展示融合血管紧张肽部分的装配颗粒可以用多种方法进行纯化，如凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：2373-2378(1999)，WO00/23955)。 
在本发明的另一个实施方案中，血管紧张肽部分与能够掺入TyVLP内的Ty蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，血管紧张肽部分与p1或TYA基因编码的衣壳蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast16：785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母中分离，而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母中分离(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“酵母转座因子”，《酵母的分子和细胞生物学：基因组动力学、蛋白质合成和能量学》，p.193，Cold Spring HarborLaboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物组分的copia类别有关，而Ty3属于逆转录转座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白，也被 称为Gag或衣壳蛋白，长度为440个氨基酸。在VLP的成熟过程中p1在位点408处被切割，产生p2蛋白，后者是VLP的基本成分。 
与p1的融合蛋白和在酵母中表达所述融合蛋白的载体已经被描述(Adams，S.E.等人，Nature329：68-70(1987))。例如，通过向pMA5620质粒的BamHI位点内插入编码血管紧张肽部分的序列，该血管紧张肽部分可以与p1融合(Adams，S.E.等人，Nature329：68-70(1987))。将编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合。同样，血管紧张肽部分的N端融合，或向p1序列内的内部插入，或p1序列一部分的置换，也属于本发明的范围。具体而言，血管紧张肽部分被插入Ty序列内Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间(EP0677111)，产生本发明的优选实施方案。 
适于融合血管紧张肽部分的其它VLP有，例如：逆转录病毒样颗粒(WO9630523)、HIV2Gag(Kang，Y.C.等人，Biol.Chem.380：353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380：387-392(1999))、细小病毒VP2VLP(Rueda，P.等人，Virology263：89-99(1999))、HBsAg(US4,722,840，EP0020416B1)。 
适于本发明的嵌合VLP的实例还包括Intervirology39：1(1996)所述。可在本发明中使用的VLP的其它例子有：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒。也已经制备了SV40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，这些VLP的嵌合VLP也属于本发明的范围。 
交联。本领域普通技术人员应当知道连接血管紧张肽部分与核心颗粒的方法，有大量参考文献可帮助技术人员(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆：实验室手册》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley&Sons，Inc.(1997)；Celis， J.编著，《细胞生物学》，Academic Press，第二版，(1998)；Harlow，E.和Lane，D.，《(抗体：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)，全部在此完整引用作为参考。 
本文描述了核心颗粒与血管紧张肽部分结合的不同方法，并在2002年1月18日提交的共同未决的美国专利申请号10/050,902中进一步描述，在此完整引用作为参考。方法包括，JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白域分别用作本发明的第一和第二附着位点。 
本发明的优选实施方案包括非天然分子支架与血管紧张肽部分通过化学交联偶联。已经研制了大量化合物来促进蛋白质/肽的交联或蛋白质与衍化分子(例如血管紧张肽部分)的偶联。包括但不限于本领域技术人员周知的羧酸衍化的活性酯(活化的化合物)、混合酸酐、酰卤、酰基叠氮、烷基卤、N-马来酰亚胺、亚氨基酯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。它们能够与蛋白质分子的反应性基团形成共价键。根据活性基团的不同，反应性基团是一种蛋白质分子上的赖氨酸残基的氨基，或一种载体蛋白质或修饰载体蛋白质分子中的硫醇基，它们在反应时导致酰胺、胺、硫醚、脒、脲或硫脲键的形成。本领域技术人员可以确定其它合适的活性基团，例如，见普通参考文献，如《蛋白质偶联和交联的化学》(Wong(1991)CRC Press，Inc.，Boca Raton，Fla.)。大多数试剂优先与赖氨酸侧链基团反应。 
在一些实施方案中，使用异双功能交联剂，使血管紧张肽部分通过化学交联附着于核心颗粒。有几种异双功能交联剂在本领域公知。在一个实施方案中，异双功能交联剂含有一个能够与核心颗粒的赖氨酸残基的侧链氨基反应的功能基团，以及另一个能够与血管紧张肽部分上存在(可通过还原使之能够参与反应)或构建(任选地也可通过还原使之能够参与反应)的半胱氨酸残基或巯基反应的功能基团。该方法的第一步，称为衍化，是核心颗粒与交联剂反应。反应产物是活化的核心颗粒，也称为活化载体。第二步，用常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。第三步，抗原(例如血管紧张肽部分)与活化的核心颗粒反应，该步骤被称为偶联步骤。未反应的抗原任选地 可在第四步除去。 
在一个替代实施方案中，用适于交联第一附着位点的活性部分衍化血管紧张肽部分，产生活化的血管紧张肽部分。这种衍化可以在分离的血管紧张肽部分上发生或者通过化学合成发生。活化的血管紧张肽部分然后与核心颗粒反应，从而发生偶联。 
有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它可利用的交联剂，例如可从Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)获得，含有一个氨基反应性的功能基团和一个SH残基反应性的功能基团。上述交联剂均能导致硫醚键的形成。适用于本发明的另一类交联剂，其特征在于偶联后在血管紧张肽部分与核心颗粒之间引入一个二硫键。属于这一类的交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。根据有机化学领域的反应理论，众所周知，交联剂衍化核心颗粒的程度可能受不同实验条件影响，如每个反应物的浓度，一种试剂相对于另一种试剂的过量程度，pH，温度和离子强度。偶联程度，即每个载体上血管紧张肽部分的数量，可通过改变上述实验条件来调节，以满足疫苗的要求。血管紧张肽部分的溶解度可能限制能够在每个亚单位上偶联的抗原的数量，当获得的疫苗不可溶时，减少每个亚单位上抗原的数量是有利的。 
在一个具体实施方案中，化学试剂是异双功能交联剂ε-马来酰亚氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Tanimori等人，J.Pharm.Dyn.4：812(1981)；Fujiwara等人，J.Immunol.Meth.45：195(1981))，其含有(1)氨基反应性的琥珀酰亚胺基，和(2)SH基反应性的马来酰亚胺基。可以改造第一附着位点的异源蛋白质或多肽，使之含有一个或多个赖氨酸残基，作为异双功能交联剂的琥珀酰亚胺部分的反应部分。一旦与异源蛋白质的赖氨酸残基化学偶联，异双功能交联剂的马来酰亚胺基即可与抗原或抗原决定簇上半胱氨酸残基的SH基反应。在此情况下，抗原或抗原决定簇的制备可能需要构建一个巯基作为第二附着位 点，使其可与交联剂上的游离马来酰亚胺功能基团反应，而该交联剂与非天然分子支架第一附着位点结合。因此，在这种情况下，异双功能交联剂与非天然分子支架的第一附着位点结合，并且将该支架与血管紧张肽部分的第二结合位点连接。 
血管紧张肽部分与核心颗粒偶联的其它方法包括血管紧张肽部分与核心颗粒利用碳二亚胺键交联的方法。这包括碳二亚胺EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS。一种方法，EDC与含有游离羧酸、氨基或氨基部分的血管紧张肽部分混合，然后添加到蛋白质载体上。其它方法中，使用同双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或其它已知的均一双功能交联剂(其含有对核心颗粒的胺基或羧基具有反应性的功能基团)，使该部分附着于核心颗粒。 
适于将半抗原分别附着于核心颗粒和病毒样颗粒的其它交联方法和交联剂，以及进行偶联反应和使用化学交联剂的指示和化学交联方法，可见Hermanson，G.T.《生物偶联技术》，Academic Press Inc.，SanDiego，CA，USA。 
将核心颗粒与血管紧张肽部分结合的其它方法包括核心颗粒被生物素标记、该部分与链霉亲和素融合的方法，或该部分和核心颗粒均被生物素标记的方法。在这种情况下，通过调节血管紧张肽部分与链霉亲和素的比例，首先使该部分与链霉亲和素或亲和素结合，使得仍有游离结合位点可与下一步添加的核心颗粒结合。此外，也可以在“一锅”反应中混合所有成分。其它配体-受体对也可以作为结合血管紧张肽部分与核心颗粒的结合剂，其中有能够与核心颗粒或血管紧张肽部分交联的受体和配体的可溶形式。 
血管紧张肽部分 
因此，本发明的一个方面是提供适用于针对血管紧张肽部分免疫的这些部分的有序、重复阵列。优选的血管紧张肽部分是包含或由血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的序列或其片段组成的。 如上所述，可以向血管紧张肽部分序列的C端或N端适当添加一个或多个额外氨基酸，以确保特别是血管紧张肽部分与核心颗粒定向、有序的结合。 
在本发明的偶联物和制剂中使用的优选的血管紧张肽部分是包含或由血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的全长序列组成的。优选地，血管紧张肽部分包含或由下列序列组成：血管紧张肽II的全长序列，如 DRVYIHPF(SEQ ID NO：19，在此称为“Angio 1”；血管紧张肽序列之外的氨基酸用斜体表示)，或血管紧张肽I的全长序列，如 DRVYIHPFHL(SEQ ID NO：20，“Angio 2”)，DRVYIHPFHL 
Figure 360805DEST_PATH_GWB00000007620400083
(SEQ ID NO：21，“Angio 3”)和 DRVYIHPFHL(SEQ ID NO：22，“Angio 4”)。其它优选的实施方案是包含或由血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II序列的片段组成的血管紧张肽部分。一些这样的实施方案包括包含或由血管紧张肽C端的至少3个氨基酸组成的血管紧张肽部分，在一个替代实施方案中，其N端的至少4个氨基酸被删除。其它有关实施方案包括来源于血管紧张肽I的血管紧张肽部分，如 HPFHL(SEQ ID NO：23，“Angio 5”)和 
Figure 351392DEST_PATH_GWB00000007620400086
PFHL(SEQ ID NO：24，“Angio 6”)，或来源于血管紧张肽II的血管紧张肽部分，如 YIHPF(SEQ ID NO：25，“Angio 7”)、 
Figure 209944DEST_PATH_GWB00000007620400088
IHPF(SEQ ID NO：26，“Angio 8”)和 
Figure 682513DEST_PATH_GWB00000007620400089
HPF(SEQ ID NO：27，“Angio 9”)。 
本发明的其它实施方案使用包含或由血管紧张肽N端至少3个氨基酸组成的血管紧张肽部分，在一个更优选的实施方案中，C端至少4个、优选地5个氨基酸被删除。其它相关实施方案有DRVYI (SEQ ID NO：28，“Angio 13”)、DRVY 
Figure 517931DEST_PATH_GWB000000076204000811
(SEQ ID NO：29，“Angio 14”)和DRV 
Figure 742239DEST_PATH_GWB000000076204000812
(SEQ ID NO：30，“Angio 15”)。 
然而，本领域普通技术人员应当理解，血管紧张肽部分的上述例子是非限制性实例，为了偶联在C端或N端添加的氨基酸的数量和性质可能不同。 
在本发明中，用于免疫的血管紧张肽部分不是必须含有任何特定血管紧张肽部分的全部完整分子。可以使用血管紧张肽部分的片段或其衍生物、突变体或突变型蛋白产生对目的血管紧张肽部分的适当免疫应答。 
本发明包括不同的连接位点和血管紧张肽部分与核心颗粒的连接方法，本文的其它部分描述了其非限制性实例。优选的连接位点和连接方法也可由普通熟练技术人员根据已有经验、理论和常规实验确定。 
偶联物、疫苗和使用方法 
本发明提供可用于预防和/或缓解与RAS的一种或多种成分(特别是一种或多种血管紧张肽部分)有关的疾病的偶联物。本发明还提供用来预防和/或缓解个体、特别是动物(如哺乳动物，特别是人)疾病或病症的接种方法。在一个优选实施方案中，本发明的偶联物和制剂刺激免疫应答，导致可与一种或多种血管紧张肽部分结合的免疫分子(包括抗体)的产生。本发明还提供用来预防和/或缓解个体的RAS相关疾病或病症的接种方法。 
免疫应答的性质或类型不是本公开内容的限制性因素。根据本领域众所周知的原则，根据疾病的不同，治疗或预防性免疫应答所希望的结果可能不同。下面的技术性说明并非意在限制本发明，本发明的偶联物可诱导与一种以上血管紧张肽部分结合的抗体，从而同时阻断所有相关的血管紧张肽种类。或者，诱导的抗体可特异性结合血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的C端。在这些条件下，诱导的抗体将阻断肾素或ACE分别对血管紧张肽原或血管紧张肽I的激活。然而，不同于ACE或肾素的蛋白酶，如内肽酶和氨肽酶，能够从N端降解血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II，从而阻止与抗体结合的完整的血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的积累。 
此外，根据本领域公知的原则，根据不同疾病，可能希望刺激不同类型的免疫应答。例如，众所周知，某些免疫应答比其它免疫应答更适于特定抗原。某些免疫应答实际上是不适当的，能够引起病状，如病理性炎症。 
抗原性质、导入体内的途径、剂量、给药方案、抗原的重复性质、 宿主背景和免疫系统的信号传导因子可能够影响免疫应答的性质。这些知识在本领域众所周知。同样，利用本领域公知的理论和常规实验可以调整免疫应答。 
此外，本发明还包括在对血管紧张肽部分接种过程中使用不同的核心颗粒。对核心颗粒如菌毛产生强烈免疫应答的个体，可以用包含相同血管紧张肽部分但核心颗粒不同的偶联物免疫。 
不希望局限于理论，作为产生免疫应答的药物制剂，特别是作为针对一种或多种血管紧张肽部分的疫苗，本发明的现有偶联物具有新的出人意料的优点。本领域周知的其它载体，包括BSA、匙孔血蓝素、破伤风类毒素、细菌外膜蛋白、霍乱毒素和铜绿假单胞菌外毒素A，对个体可能不适用，特别是对于人。上述载体可诱发变态反应，或刺激病理性免疫应答(例如霍乱毒素、KLH、BSA)。上述载体可能需要使用佐剂，如现在认为不适于人用的弗氏完全佐剂。有大量载体可能是现有疫苗的成分(例如，破伤风类毒素、霍乱毒素、外毒素A)。因此，一个个体可能已经具有对这些载体的高水平免疫，因此用抗原-载体偶联物免疫将比新型抗原诱发针对载体的相对更强的免疫应答。由于其中一个或全部这些原因，本发明的偶联物和制剂与上述载体蛋白相比是有益的改进。 
在本发明实施方案的应用中，与核心颗粒偶联的一种或多种血管紧张肽部分能够被抗原呈递细胞摄取，从而刺激T细胞辅助诱发免疫应答。T辅助细胞应答可被分为1型(TH1)和2型(TH2)T辅助细胞应答(Romagnani，Immunol.Today18：263-266(1997))。TH1细胞分泌干扰素-γ和其它细胞因子，引发B细胞产生IgG1-3抗体。相反，TH2细胞产生的一种重要细胞因子是IL-4，它使B细胞产生IgG4和IgE。在许多实验系统中，TH1和TH2应答的发展互相排斥，因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然。因此，引发强烈TH1应答的抗原同时抑制TH2应答的发展，因此抑制IgE抗体的产生。有趣的是，实际上所有病毒都在宿主中诱发TH1应答，但不能引发IgE抗体的产生(Coutelier等人，J.Exp.Med.165：64-69(1987))。IgE同型抗体是 变态反应的重要成分。肥大细胞在其表面结合IgE抗体，并且在特异抗原与结合在肥大细胞表面的IgE分子结合后，释放组胺和变态反应的其它介质。TH1应答典型的同型模式不限于活病毒，用灭活或重组病毒颗粒也可观察到(Lo-Man等人，Eur.J.Immunol.28：1401-1407(1998))。因此，利用本发明的方法(例如AlphaVaccine技术)，病毒颗粒能够装载不同的血管紧张肽部分，用于免疫。由于产生这种阵列的“病毒结构”，将引发TH1应答，产生“保护性”IgG1-3抗体，并且阻止产生引起变态反应的IgE抗体。因此，本发明包括能够诱发优选的免疫应答(特别是TH1型应答)的偶联物。此外，本发明还包括本发明的偶联物对抗由针对目的抗原的其他疫苗诱发的变态反应的用途。 
本发明的另一个有利特征是，血管紧张肽部分可以在颗粒上以有序、重复的阵列存在，无论是否有T细胞辅助，均能够诱发有效的免疫应答。本发明的这一特征特别有用。 
与分离的蛋白质不同，在不使用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒均诱发快速、有效的免疫应答(Bachmann&Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。尽管病毒通常仅含极少的蛋白质，但它们比其分离成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示有序的表位阵列，可有效交联B细胞上表位特异性免疫球蛋白(Bachmann&Zinkernagel，Immunol.Today17：553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，T辅助细胞随后诱导B细胞由产生IgM抗体向产生IgG抗体的转换，以及长期B细胞记忆的产生—这是所有接种的目标(Bachmann&Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。本发明提供一种提高接种效果的方法，是通过血管紧张肽部分与核心颗粒结合，提高用于免疫的血管紧张肽部分的重复程度。如前所述，本发明提供所 含的核心颗粒经修饰改变了形成体(orgnizer)数量和/或排列的偶联物。 
本领域普通技术人员应当理解，当对个体施用本发明的偶联物时，该偶联物可存在于含有盐、缓冲液、佐剂或希望用来提高偶联物效能的其它物质的制剂(conjugate)中。大量资料，包括Remington’sPharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))中提供了适于制备药物制剂的材料的例子。 
如果接受个体能够耐受本发明偶联物的施用，则认为该偶联物是“药物学可接受的”。进而，本发明的偶联物将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用。 
为了诱发免疫应答，可以用本领域周知的多种方法对动物(适当地为哺乳动物，如人)施用本发明的偶联物，但是通常通过注射、输液、吸入、口服或其它适当的物理方法给药。该偶联物也可肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮肤或皮下施用。给药制剂的成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水性溶液和悬液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。 
本发明的其它实施方案包括用本发明的偶联物免疫产生的免疫分子。免疫分子包括抗体和T细胞受体。这些免疫分子可用于接种的个体，结合一种或多种靶性血管紧张肽部分。当转移给未对本发明的偶联物或制剂免疫的另外的个体时，免疫分子也可能是有用的，从而“被动”转移了免疫。在一个实施方案中，免疫分子是一种抗体。可以将适于结合一种或多种血管紧张肽部分的一种单克隆抗体转移到个体内，实现治疗或预防。 
本发明也包括用本发明的偶联物免疫产生的抗体在试剂盒中的使用，用于通过免疫测定(例如ELISA)检测一种或多种血管紧张肽部分。在一个相关实施方案中，血管紧张肽部分的重复、有序阵列能够用于通过结合试验检测这些部分的抗体。本发明的其它实施方案包括生产本发明的偶联物的方法，和使用这些偶联物进行医学治疗的方 法，特别是治疗一种或多种RAS相关疾病，如高血压、中风、梗塞、充血性心力衰竭、肾衰竭或视网膜出血。 
本领域普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下，可以对此处所述的方法和用途进行适当的调整和修改。现在已经详细描述了本发明，通过下列实施例将能更清楚地理解本发明，这些实施例只是用于说明，并非意在限制本发明。 
实施例
实施例1：来源于血管紧张肽I和血管紧张肽II的肽与Qβ的偶联，以及用获得的偶联物对小鼠的免疫 
A.偶联物的产生 
化学合成下列血管紧张肽部分：CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO：19，“Angio 1”)，CGGDRVYIHPFHL(SEQ ID NO：20，“Angio 2”)，DRVYIHPFHLGGC(SEQ ID NO：21，“Angio 3”)，CDRVYIHPFHL(SEQ ID NO：22，“Angio 4”)，CHPFHL(SEQ ID NO：23，“Angio 5”)，CGPFHL(SEQ ID NO：24，“Angio 6”)，CYIHPF(SEQ ID NO：25，“Angio7”)，CGIHPF(SEQ ID NO：26，“Angio 8”)，CGGHPF(SEQ ID NO：27，“Angio 9”)，DRVYIGGC(SEQ ID NO：28，“Angio 13”)，DRVYGGC(SEQ ID NO：29，“Angio 14”)，DRVGGC(SEQ ID NO：30，“Angio15”)。如下所述用它们与Qβ化学偶联。 
对于肽Angio 1-Angio 4：5ml 2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mMHepes，150mM NaCl pH 7.4中的溶液与507μl 13mg/ml Sulfo-MBS(Pierce)水溶液在摇床上25℃反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4透析两次各2小时。665μl透析的反应混合液然后与2.8μl每种相应100mM肽贮存溶液(DMSO溶液)在25℃摇床上反应2小时。反应混合液随后在4℃下用2L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4透析2次各2小时。 
对于肽Angio5-9和Angio13-15：3ml2mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与86μl100mM SMPH (琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚氨基丙酰氨基己酸酯，Pierce)DMSO溶液在25℃摇床上反应50分钟。反应溶液随后在4℃下用2L20mMHepes，150mM NaCl，pH7.2透析两次各2小时。514μl透析的反应混合液然后与3.6μl每种相应100mM肽贮存溶液(DMSO溶液)在25℃摇床上反应4小时。反应混合液随后在4℃下用2L20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.2透析2次各2小时。 
B.免疫 
对雌性Balb/C小鼠接种与Qβ衣壳蛋白偶联的9种血管紧张肽衍生物之一，其中不添加佐剂。每种样品的50μg(Qβ-Angio1-4疫苗)或20μg(Qβ-Angio5-9疫苗)总蛋白用PBS稀释为200μl，于第0天和第14天皮下注射(100μl，腹部两侧)。对小鼠在第21天眼眶后放血，用血管紧张肽特异的ELISA分析其血清。 
应当注意到，人和鼠的血管紧张肽序列彼此相同。因此，分别用本发明的包含血管紧张肽部分作为抗原决定簇的疫苗或偶联物免疫人或小鼠，是针对自身抗原的接种。 
实施例2：接种与Qβ偶联的来源于血管紧张肽I和血管紧张肽II的肽的小鼠血清的ELISA分析 
使用化学交联剂sulfo-SPDP，将如实施例1所述制备的Angio1-Angio9和Angio13-15肽衍生物分别与牛RNAse A(Sigma)偶联。ELISA板用溶于包被缓冲液(0.1M NaH2CO3，pH9.6)的浓度为10μg/ml的偶联的RNAse制品4℃包被过夜。此外，血管紧张肽I或血管紧张肽II(SIGMA)也用相同的包被缓冲液稀释为200μg/ml的浓度。在37℃下用封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白(BSA)，PBS(pH7.4)/0.05％Tween20)封闭板2小时，用PBS(pH7.4)/0.05％Tween20洗涤，然后在室温下与封闭缓冲液无菌稀释的小鼠血清孵育2小时。用PBS(pH7.4)/0.05％Tween20洗板，然后在室温下与1μg/ml辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)孵育1小时。用PBS(pH7.4)/0.05％Tween20洗板，添加底物溶液 (0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸(pH5.0)+0.4mg OPD(1，2-苯二胺二盐酸盐)+0.01％H2O2)。10分钟后，用5％H2SO4终止显色反应，在450nm处读取吸光度。 
检测同一小鼠的免疫前血清作为对照。用与Qβ或其它载体交联的无关肽免疫小鼠，用其血清进行对照ELISA实验，表明检测到的抗体是对各自肽特异的抗体。ELISA滴度计算为在ELISA中产生半数最大信号(最大光密度的50％)的血清稀释度倒数。 
结果： 
图2显示在使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio 1-4肽免疫的小鼠血清中，Angio 2肽和血管紧张肽I特异性IgG抗体的ELISA分析。在图中，Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio 4代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，见上述对血管紧张肽的定义。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接种溶于PBS的50μg疫苗。于第21天测定接种Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 2、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio4的小鼠血清中针对与RNAseA偶联的Angio 2肽和针对血管紧张肽I的IgG抗体。分析免疫前血清作为对照。指定血清稀释度的结果显示为450nm处的光密度。对于Angio 2，显示了每组3只小鼠的平均值(包括标准差)。对于血管紧张肽I，显示了每组两只小鼠的平均值。接种的所有小鼠均产生抗Angio 2肽及血管紧张肽1的特异性IgG抗体，但是用Angio 2、Angio 3或Angio 4肽免疫的小鼠比接种Angio1肽的小鼠显示更高的滴度，这与Angio 2、Angio 3和Angio 4肽与血管紧张肽I的密切相似性有关。 
图1显示在使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio 1-4肽免疫的小鼠血清中，Angio 1肽和血管紧张肽II特异性IgG抗体的ELISA分析。在图中，Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio 4代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，见上述血管紧张肽的定义。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接种溶于PBS的50μg疫苗。于第21天测定接种Qβ-Angio 1、Qβ-Angio 2、Qβ-Angio 3和Qβ-Angio 4的小鼠血清中针对与RNAseA偶联的Angio 1肽和针对血管紧张肽II的 IgG抗体。分析免疫前血清作为对照。指定血清稀释度的结果显示为450nm处的光密度。对于Angio1，显示了每组3只小鼠的平均值(包括标准差)。对于血管紧张肽II，显示了每组两只小鼠的平均值。接种的所有小鼠均产生抗Angio1肽及血管紧张肽II的特异性IgG抗体，但是用Angio1肽免疫的小鼠显示最高的滴度，这与Angio1肽与血管紧张肽II的密切相似性有关。 
图4显示在使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio5-9肽免疫的小鼠血清中，Angio2肽和血管紧张肽I特异性IgG抗体的ELISA分析。在图中，Qβ-Angio5、Qβ-Angio6、Qβ-Angio7、Qβ-Angio8和Qβ-Angio9代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，见上述血管紧张肽的定义。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接种溶于PBS的20μg疫苗。于第21天测定接种Qβ-Angio4、Qβ-Angio5、Qβ-Angio6、Qβ-Angio7、Qβ-Angio8和Qβ-Angio9的小鼠血清中针对与RNAseA偶联的Angio2肽和针对血管紧张肽I的IgG抗体。指定血清稀释度的结果显示为450nm处的光密度。显示了每组2只小鼠的平均值。接种Qβ-Angio8和Qβ-Angio9的2只小鼠显示极低的或者没有抗Angio2肽及血管紧张肽I的特异性滴度，表明这两种类型的疫苗诱导主要对血管紧张肽II的C端特异但不是血管紧张肽I特异的抗体(参见图3)。 
图3显示在使用与Qβ衣壳蛋白偶联的Angio5-9肽免疫的小鼠血清中，Angio1肽和血管紧张肽II特异性IgG抗体的ELISA分析。在图中，Qβ-Angio5、Qβ-Angio6、Qβ-Angio7、Qβ-Angio8和Qβ-Angio9代表向采集血清的小鼠中注射的疫苗，见上述血管紧张肽的定义。雌性Balb/c小鼠在第0天和第14天皮下接种溶于PBS的20μg疫苗。于第21天测定接种Qβ-Angio4、Qβ-Angio5、Qβ-Angio6、Qβ-Angio7、Qβ-Angio8和Qβ-Angio9的小鼠血清中针对与RNAseA偶联的Angio1肽和针对血管紧张肽II的IgG抗体。指定血清稀释度的结果显示为450nm处的光密度。显示了每组2只小鼠的平均值。接种Qβ-Angio5和Qβ-Angio6的2只小鼠显示极低的或者没有抗Angio1肽及血管紧张肽II的特异滴度，表明这两种类型的疫苗诱导主要对血 管紧张肽I的C端特异但不是血管紧张肽II特异的抗体(参见图4)。 
下表概括了接种与Qβ偶联的Angio肽1-9的小鼠血清的ELISA分析。第21天的平均ELISA滴度如实施例2所述计算。 
表1：用于接种小鼠的血管紧张肽衍生的肽，以及产生的针对所使用的肽及血管紧张肽I和血管紧张肽II的抗体应答 
*n.t.＝未检测 
注意：对于检测的所有抗原，免疫前血清的滴度低于50。 
Angio 5和Angio 6的结果表明，能够诱导选择性识别血管紧张肽I的肽。此外，Angio 7-9的结果表明，能够诱导选择性识别血管紧张肽II而非血管紧张肽I的抗体。血管紧张肽I和II仅在C端有两个氨基酸不同，而仍有8个氨基酸相同，这些结果证实，Angio 5或Angio6诱导的所有抗体均选择性识别血管紧张肽I的C端，而Angio 7-9、特别是Angio 8-9诱导的抗体选择性识别血管紧张肽II的C端。因此，共有的8个氨基酸不被识别，特别是共有的N端不被识别。这表明，当结合时N端不会被埋藏于抗体内部，因此蛋白酶可及。 
为了清楚地理解，已经通过说明和实施例全面、详细地描述了本发明，本领域普通技术人员应当理解，在广泛和相当范围的条件、组成和其它参数内修改或改变本发明，也能够进行本发明，而不影响本发明或其任何具体实施方案的范围，这些修改或改变将包括在附加权利要求的范围之内。 
本说明书中提到的所有公开文本、专利和专利申请均代表本发明所属领域技术人员的技术水平，在此引用作为参考，如同每个公开文本、专利或专利申请特别地、单独地被指出作为参考引用。 

Claims (8)

1.一种血管紧张肽部分-载体偶联物，其包含：
(a)一种载体，其含有至少一个第一附着位点，和
(b)至少一种血管紧张肽部分，其含有至少一个第二附着位点；
其中所述载体包含一个核心颗粒，其为RNA-噬菌体的病毒样颗粒，该RNA-噬菌体的病毒样颗粒包含RNA-噬菌体Qβ的重组蛋白，其中所述重组蛋白包含氨基酸序列为SEQ ID NO：3的外壳蛋白；和
其中所述第二附着位点通过至少一个非肽共价键与所述第一附着位点结合，以形成有序、重复的血管紧张肽部分-载体偶联物；和
其中含有所述第二附着位点的所述血管紧张肽部分由选自下组的氨基酸序列组成：
a)CGGDRVYIHPF；
b)CGGDRVYIHPFHL；
c)DRVYIHPFHLGGC；
d)CDRVYIHPFHL；
e)CHPFHL；
f)CGPFHL；
g)CYIHPF；
h)CGIHPF；
i)CGGHPF；
j)DRVYIGGC；
k)DRVYGGC；和
l)DRVGGC。
2.权利要求1的偶联物，其中所述重组蛋白包含其氨基酸序列为SEQ ID NO：4的外壳蛋白或其突变体和其氨基酸序列为SEQ IDNO：3的外壳蛋白的混合物。
3.权利要求1的偶联物，其中所述至少一个第一附着位点是赖氨酸残基。
4.权利要求1的偶联物，其中含有所述第二附着位点的所述血管紧张肽部分由氨基酸序列CGGDRVYIHPF组成。
5.一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求1的偶联物以及一种药物可接受的载体或赋形剂。
6.一种疫苗组合物，其包含免疫有效量的权利要求1的偶联物以及一种免疫学可接受的载体或赋形剂。
7.权利要求6的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物还包含至少一种佐剂。
8.权利要求1的偶联物或权利要求6的疫苗组合物在制备用于免疫动物抗一种血管紧张肽部分的药物中的应用。
CN028189248A 2001-10-05 2002-10-07 血管紧张肽-载体偶联物及其用途 Expired - Fee Related CN1558774B (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32699801P 2001-10-05 2001-10-05
US60/326,998 2001-10-05
US33104501P 2001-11-07 2001-11-07
US60/331,045 2001-11-07
US10/050,902 2002-01-18
US10/050,902 US7264810B2 (en) 2001-01-19 2002-01-18 Molecular antigen array
PCT/IB2002/000166 WO2002056905A2 (en) 2001-01-19 2002-01-21 Molecular antigen array
IBPCT/IB02/00166 2002-01-21
US39663702P 2002-07-19 2002-07-19
US60/396,637 2002-07-19
PCT/EP2002/011219 WO2003031466A2 (en) 2001-10-05 2002-10-07 Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1558774A CN1558774A (zh) 2004-12-29
CN1558774B true CN1558774B (zh) 2012-03-14

Family

ID=27517536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN028189248A Expired - Fee Related CN1558774B (zh) 2001-10-05 2002-10-07 血管紧张肽-载体偶联物及其用途

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1432443B1 (zh)
JP (1) JP4671389B2 (zh)
CN (1) CN1558774B (zh)
AU (1) AU2002362696B2 (zh)
CA (1) CA2462857C (zh)
ES (1) ES2321491T3 (zh)
NZ (1) NZ531534A (zh)
WO (1) WO2003031466A2 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
DE60234375D1 (de) 2001-09-14 2009-12-24 Cytos Biotechnology Ag VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG
CN1665565A (zh) * 2002-07-19 2005-09-07 赛托斯生物技术公司 Ghrelin－载体偶联物
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
ZA200507063B (en) 2003-03-26 2007-03-28 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: Method of preparation and use
BRPI0507002A (pt) * 2004-01-20 2007-06-05 Cytos Biotechnology Ag conjugados veìculos de grelina
MX2007003171A (es) * 2004-09-21 2007-05-23 Cytos Biotechnology Ag Particulas tipo virus que comprenden una proteina de fusion de la proteina de cubierta de ap205 y un polipeptido antigenico.
CA2588274A1 (en) 2004-10-05 2006-04-13 Cytos Biotechnology Ag Vlp-antigen conjugates and their uses as vaccines
US20070160628A1 (en) * 2005-08-31 2007-07-12 Birkett Ashley J Stabilized virus-like particles and epitope display systems
KR20080047564A (ko) * 2005-09-28 2008-05-29 사이토스 바이오테크놀로지 아게 인터루킨-1 컨쥬게이트 및 그의 용도
WO2007052491A1 (ja) * 2005-10-31 2007-05-10 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. セキュア処理装置、セキュア処理方法、難読化秘密情報埋め込み方法、プログラム、記憶媒体および集積回路
US20070184068A1 (en) 2005-12-14 2007-08-09 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
ES2427994T3 (es) 2006-06-12 2013-11-05 Cytos Biotechnology Ag Procesos para empaquetar oligonucleótidos en partículas de tipo viral de bacteriófagos de ARN
JP2008007482A (ja) * 2006-06-30 2008-01-17 Univ Of Miyazaki 昇圧作用を有する新規ポリペプチド
WO2009056651A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin-carrier formulation
JP2009137859A (ja) * 2007-12-05 2009-06-25 Univ Nihon マウス多量体免疫グロブリンレセプターに反応するモノクローナル抗体
NZ620441A (en) 2009-09-03 2015-08-28 Pfizer Vaccines Llc Pcsk9 vaccine
WO2012141280A1 (ja) * 2011-04-15 2012-10-18 国立大学法人 大阪大学 Ｄｎａワクチン
SG11201403445YA (en) 2011-12-22 2014-07-30 Hoffmann La Roche Full length antibody display system for eukaryotic cells and its use
CN104768575B (zh) 2012-08-31 2017-09-08 国立大学法人大阪大学 含有vegf特异性表位和/或血管生成素‑2特异性表位的dna疫苗
JP6001974B2 (ja) 2012-09-21 2016-10-05 アンジェスＭｇ株式会社 アポリポプロテイン（ａ）の特異的エピトープを含むＤＮＡワクチン
ES2854726T3 (es) 2015-10-30 2021-09-22 The Univ Of Copenhagen Partícula similar a virus con presentación eficiente de epítopos
WO2024047090A2 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Saiba Animal Health Ag Modified virus-like particles of cmv

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998058952A1 (en) * 1997-06-24 1998-12-30 Proteus Molecular Design Limited Angiotensin derivatives
WO2000023955A1 (en) * 1998-10-21 2000-04-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles for the induction of autoantibodies

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA934199B (en) * 1992-06-18 1994-01-10 Akzo Nv Carrier system against gnrh
BR9915771A (pt) * 1998-11-30 2001-12-26 Cytos Biotechnology Ag Apresentação molecular ordenada de antìgenos,processo de preparação e utilização
WO2001085208A2 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998058952A1 (en) * 1997-06-24 1998-12-30 Proteus Molecular Design Limited Angiotensin derivatives
WO2000023955A1 (en) * 1998-10-21 2000-04-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles for the induction of autoantibodies

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHACKERIAN B 等.induction of autoantibodies to mouse CCR5 with recombinantpapillomavirus particles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA96 5.1999,2373-2378.
CHACKERIAN B 等.induction of autoantibodies to mouse CCR5 with recombinantpapillomavirus particles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA96 5.1999,2373-2378. *
KOLETZKI D 等.mosaic hepatitis B virus core particle allow Insertionofextended foreign protein segements.Journal of General Virology78.1997,782049-2053. *
KOZLOVSKA T M等.RNA Phage Qβ coat protein as a carrier for foreign epitopes.Intervirology39 1/2.1996,39(1/2),9-15.
KOZLOVSKA T M等.RNA Phage Qβ coat protein as a carrier for foreign epitopes.Intervirology39 1/2.1996,39(1/2),9-15. *
S. M. Gardiner等.Active immunization with angiotensin I peptide analoguevaccines slectively reduces the pressor effects of exogenousangiotensin i in conscious rats.British Journal of Pharmacology129 6.2000,1178-1182.
S. M. Gardiner等.Active immunization with angiotensin I peptide analoguevaccines slectively reduces the pressor effects of exogenousangiotensin i in conscious rats.British Journal of Pharmacology129 6.2000,1178-1182. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002362696B2 (en) 2008-05-29
EP1432443B1 (en) 2009-01-21
CA2462857C (en) 2012-01-24
CA2462857A1 (en) 2003-04-17
AU2002362696A2 (en) 2003-04-22
WO2003031466A2 (en) 2003-04-17
JP2005514333A (ja) 2005-05-19
ES2321491T3 (es) 2009-06-08
EP1432443A2 (en) 2004-06-30
CN1558774A (zh) 2004-12-29
WO2003031466A3 (en) 2003-10-23
NZ531534A (en) 2005-10-28
JP4671389B2 (ja) 2011-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1558774B (zh) 血管紧张肽-载体偶联物及其用途
US7666408B2 (en) Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US7138252B2 (en) Molecular antigen arrays
CN100518823C (zh) 半抗原-载体偶联物及其用途
US7264810B2 (en) Molecular antigen array
US20090155302A1 (en) Antigen Arrays for Treatment of Allergic Eosinophilic Diseases
US20070248617A1 (en) Medical Uses of Carrier Conjugates of Non-Human Tnf -Peptides
US20080019991A1 (en) Carrier Conjugates Of Tnf-Peptides
AU2002362696A1 (en) Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
JP4533626B2 (ja) アレルギー性好酸球性疾患を治療するための抗原アレイ
JP2010189406A (ja) アンジオテンシンペプチド−担体複合体およびその使用
RU2350622C2 (ru) Конъюгат ангиотензиновой пептидной составляющей с носителем, композиция вакцины, способ иммунизации животного и способ лечения или профилактики физического нарушения, ассоциированного с активируемой ренином ангиотензиновой системой
JP2005514347A5 (zh)
CN101049502B (zh) 用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的展示il-5、il-13或嗜酸细胞活化趋化因子的抗原阵列

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CI01 Correction of invention patent gazette

Correction item: Priority

Correct: 60/326,998 2001.10.05 US|60/331,045 2001.11.07 US|10/050,902 2002.01.18 US|PCT/IB02/00166 2002.01.21 WO|60/396,637 2002.07.19 US

Number: 11

Volume: 28

CI03 Correction of invention patent

Correction item: Priority

Correct: 60/326,998 2001.10.05 US|60/331,045 2001.11.07 US|10/050,902 2002.01.18 US|PCT/IB02/00166 2002.01.21 WO|60/396,637 2002.07.19 US

Number: 11

Page: The title page

Volume: 28

ERR Gazette correction

Free format text: CORRECT: PRIORITY; FROM: NONE TO: 60/326,998 2001.10.05 US;60/331,045 2001.11.07 US;10/050,902 2002.01.18 US;PCT/IB02/00166 2002.01.21 WO;60/396,637 2002.07.19 US

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120314

Termination date: 20141007

EXPY Termination of patent right or utility model