JPH11502813A - インターロイキン−12を利用するパピロマウィルス関連損傷の処置 - Google Patents

インターロイキン−12を利用するパピロマウィルス関連損傷の処置

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JPH11502813A JP8528209A JP52820996A JPH11502813A JP H11502813 A JPH11502813 A JP H11502813A JP 8528209 A JP8528209 A JP 8528209A JP 52820996 A JP52820996 A JP 52820996A JP H11502813 A JPH11502813 A JP H11502813A
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Abstract

(57)【要約】 インターロイキン−12(IL−12)もしくはその機能性類似体、又はIL−12をコードするもしくはその機能性類似体をコードするポリヌクレオチドはパピロマウィルス関連損傷、例えば HPV6及び/又は11に基づくいぼ、例えば尖圭コンジロームの治療の治療剤又はアジュバントとして利用される。IL−12又は内生産生のためのそれをコードするベクターをワクチン、例えばパピロマウィルス抗原、又はパピロマウィルス抗原をコードするベクターと共に利用してよい。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン-12 を利用するパピロマウィルス関連損傷の処置 発明の分野 本発明はパピロマウィルス関連損傷、例えば性器いぼと称される腫瘍の如きHP V 関連損傷の処置のための剤及び方法に関する。本発明は更に、ワクチン及びア ジュバントの如き免疫治療剤を含むかかる剤の製造及び利用方法に関する。 発明の背景及び従来技術 数多くの増殖性症状、特に様々ないぼ、例えば尖圭コンジローマ(肛門性器い ぼ)及び頸部上皮内形成異常症及び新形成であって頸部癌へと進行しうるものが パピロマウィルスに関連することが知られている。 尖圭コンジローマは通常6及び11型のヒトパピロマウィルスによる感染により 生じ、そして英国における最もよく診断される性的感染型ウィルス障害である。 著しい罹病率は損傷に関連し、そして有効な処置療法は満足たるものでなく、数 多くの患者が再発性障害を示す。その他の型のHPV、特に16及び18は上皮内形成 異常及び新形成の進行を伴い、それらは頸部、そして(稀に)外陰、膣又は陰茎 の侵襲性癌腫へと進行しうる。更に、目に見える性器いぼを有する患者の50%に おいて頸部上皮内新形成が示される研究がされた(PG Walker ら(1983)Br J Ve n DiS 59:120-123)。 コンジロームを有する患者の一部(約20%)はその腫瘍が自発的退行し、明ら かに宿主による効果的な免疫反応を反映する。S Aibaら(1986)Cancer 58:1246 -1251)は、腫瘍退行がCD4+Tリンパ球 及びマクロファージが主要となっている活性T細胞媒介型免疫反応を特徴とする ことを報告しており、外来抗原に対する遅延型過敏反応と一致する。 ワクチンは従来からパピロマウィルス関連症状の予防及び治療のために提案さ れていた。即ち、例えばWO 93/00436(Cancer Research Campaign Technology:WF H Jarrett ら)は、パピロマウィルス関連症状の予防及び治療のためのパピロマ ウィルスタンパク質L2、並びに関連のフラグメント及び融合タンパク質の利用 に関する;WO 93/20844(Cancer Research Campaign Technology:MS Campoら)は パピロマウィルスE7タンパク質のワクチン用途に関する;そしてWO 93/02184( University of Queensland and CLS Ltd:I Frazer ら:Papilloma Virus Vaccin e)はL1タンパク質又はL1及びL2タンパク質を含んで成るパピロマウィルス 様粒子並びにワクチンとしてのその利用に関する。 更に、WO 96/00583(Merck:JJ Donnelly ら:Polynucleotide Vaccine for Pap ilomavirus)には、パピロマウィルスによる感染症に対する免疫防御を供しうる 予防薬としての、動物組織への直接導入により発現できるパピロマウィルス遺伝 子生成物をコードするDNA 構築体が記載されている。 免疫分野において、数多くのサイトカイン及びアクセサー物質が知られ、その うちの一の公知のサイトカインが現在IL−12と称されている。WO 92/05256(Gene tics Institute and Wistar Institute:G Trinchieri ら:Natural killer Stim ulatory Factor)にはナチュラルキラー刺激因子の名称で、ヒトサイトカインと してのIL−12が記載されている。WO 92/05256 は一般に、「ガンマーインターフ ェロンの高揚した存在又はGM-CSF産生に応答性の癌、ウィルス感染症、例えばAI DS、細菌感染症及びその他の疾患状態の処置のための 方法」における適当な薬理担体中のNKSF又はそのサブユニットの一方もしくは両 方又はそのペプチドフラグメントの利用の推奨を含む。 EP 0,433,827(Hoffman-la Roche:RA Chizzonite ら:Cytotoxic lymphocyte m aturation fuctor and monolclonal antibodies directed thereto)には、細胞 障害性リンパ球成熟因子(CLMF)の名のIL−12が記載されている。IL−12は他にナ チュラルキラー細胞刺激因子と呼ばれている。 IL−12に関する言及はM Kobayashi ら J Exp Med(Sep1989)170(3)827-845「Id entification and purification of natural killer cell stimulatory factor( NKSF),a cytokine with multiple biologic effects on human lymphocytes」 ;A S Stern ら Proc Nat Acad Sci USA(Sep 1990)87:6808-6812,「Purificati on to homogeneity and partial characterization of cytotoxic lymphocyte m aturation factor from human B-lymphoblastoid cells」;及びSF Wolf らJ Im munol(May 1991)146(9):3074-3081,「Cloning of cDNA for natural killer ce ll stimulatory factor,a heterodimeric cytokine with multiple biologic e ffects on T and natural killer cells」にもされている。IL−12は異なる遺伝 子の産物である二本の共有結合ポリペプチド鎖p40及びp35のヘテロダイマーと しても存在する。IL−12レセプターはT細胞及び活性化NK細胞の上に見い出され 、そして70〜75kDa の単一トランスメンブラン糖タンパク質である。IL−12は活 性化NK,CD4+及びCD8+T細胞サブ集団の増殖を促進し、そして抗体依存性細 胞障害及びNK媒介細胞障害の双方を高めることが報告されている。IL−12はまた 、マクロファージを活性化し得るインターフェロン−ガンマー(IFN−ガンマー) のインデューサーでもある。 インターフェロン−ガンマー(サイトカインの一種)の性器いぼへの注射がな されている(LJ Eron ら(1986)New Engl J Med,vol 315(17);及びL Belli ら(C ondylomata International Study Group)(1991),J Amer Med Ass,vol 265(20)( 5月22/29日))。 従来技術はパピロマウィルス関連症状及びそれらが生じせしめうる腫瘍のため の更なる処置を探求することを所望せしめ続けている。 発明の概要及び説明 本発明は、同時に調べた多くの他のサイトカインと異なり、IL-12が臨床試験 において本発明者により調べを退行性HPV 誘導型腫瘍において100 %存在してい るという驚くべき発現に基づく。 HPV 感染に由来する損傷におけるIL−12の存在とこのような損傷の退行との間 の関係により、本発明はパピロマウィルス関連損傷の治療、例えば腫瘍の処置に 一般に関連する様々な観点を提供する。本発明が適用できる症状には任意のパピ ロマウィルス感染症が含まれ、そして特にヒト又は非ヒト動物性パピロマウィル スによる感染の結果として誘導された任意の上皮細胞増殖、例えば良性いぼ又は 皮膚もしくは粘膜表層、例えば皮膚、頸部、膣、外陰、肛門、直腸、陰茎、通路 、尿道、喉道、口腔、口腔前庭、舌及び鼻咽頭のいぼが含まれる。本発明は更に パピロマウィルス感染に関連する悪性損傷、例えば肛門性器癌、例えば頸部、外 陰、肛門、陰茎、並びに皮膚、喉頭及び腸結節癌にも適用できる。特に注目され るのは6及び11型のHPV により生ずるが如き肛門性器いぼの処置である。 従って、本発明によれば、パピロマウィルス関連損傷の処置における治療剤又 はアジュバントとして利用するためのサイトカインインターロイキン−12(IL− 12)及びその機能性類似体を提供する。 かかる損傷は例えば6及び/又は11型のHPV により生ずるいぼ、例えば肛門性 器いぼとしても知られる性器いぼ、又は尖圭コンジローマでありうる。 更に、本発明によりパピロマウィルス関連損傷の処置における治療剤又はアジ ュバントとして提供するのは、IL−12をコードする又はその機能性類似体をコー ドするポリヌクレオチドである。 本発明の態様に係る治療の担いは個体のIL−12の量、特に、例えばパピロマウ ィルスに対する免疫反応が治療効果を有しうる組織箇所、例えばHPV の関係する 損傷箇所又はその付近のIL−12の量を高めることにある。 本発明によれば、IL−12自体を損傷の治療のためにHPV 関連損傷を有する個体 に投与してよい。 他方、本発明の一定の実施例に従うと、IL−12のインデューサー(例えばIL− 12をコードし、且つ細胞に感染したときにコードされたIL−12の発現を及ぼすこ とのできる組換ウィルスベクターにより担持されたポリヌクレオチドの形態)を 損傷の治療のためにHPV 関連損傷を有する個体に投与してよい。一般にかかるイ ンデューサーは、例えば細胞によるIL−12の高揚した内性生産又は放出の結果と してIL−12のレベルを局部的又は全身的に高めることを誘導できる分子状物質の 如き物質であってよい。 即ち、本発明によれば、腫瘍の如きパピロマウィルス関連症状の治療において 利用するための薬理組成物;並びにIL−12及びそのインデューサーを、パピロマ ウィルス関連症状の治療、例えば抗腫瘍処置において利用するための医薬品、組 成物の製造のための方法において利用できる。 IL−12又はそのインデューサーは以下に記載の更なる成分と混合して存在しう る。 即ち、本発明は一の観点において、例えばパピロマウィルス関連腫瘍の処置に おいて利用するための免疫治療剤又はワクチンアジュバントとに利用するための IL−12又はその機能性類似体を含んで成る薬理治療剤を提供する。 この薬理治療剤は(i)ワクチンアジュバントとして利用するためのIL−12又 はその機能性類似体と、(ii)ワクチンとして利用するためのパピロマウィルス 抗原、又はパピロマウィルス抗原をコードし、且つその発現を及ぼすことのでき るベクターとの組合せを含んで成りうる。 成分(ii)は少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質もしくは抗原性フ ラグメント又はその対応の融合タンパク質;イリンがHPV 6,11,16及び/又は 18のタンパク質E1,E2,E4,E5,E6,E7,L1及び/又はL2のう ちの少なくとも一種の配列の少なくとも実体的な部分を存するポリペプチドを含 んで成りうる。−般に、本発明において、31,31,35,45,51,52及び56型のHP V の対応のタンパク質及び抗原も、例えば頸部上皮内新形成に関連するパピロマ ウィルス損傷又はその危険性に関係して、利用できる。 他方、成分(ii)は少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質もしくは抗 原性フラグメント又はその対応の融合タンパク質をコードし、且つ発現を及ぼす ことのできる組換ウィルスベクターを含んで成りうる。かかるベクターはHPV 6 ,11,16及び/又は18の少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質E1,E 2,E4,E5,E6,E7,L1及び/又はL2の配列の少なくとも実体的な 部分を有するポリペプチドをコードする少なくとも一種の組換ワクシニアウィル スを含んで成りうる。 他方、前述の通り、IL−12のインデューサーを使用してよい。本 発明は一定の態様において、IL−12のp35サブユニットと共にp40サブユニット の如きIL−12の一方もしくは両方のサブユニット(鎖)をコードするポリヌクレ オチド、又は所定の場合、p40サブユニットのみをコードする、並びにその他の 機能性類似体をコードするポリヌクレオチドの、パピロマウィルス関連損傷の処 置における治療剤又はアジュバンドとしての利用を含む。 これは例えばヘテロダイマーIL−12のp40鎖でなくp35鎖を構成的に発現でき るケラチン細胞の如き組織との関連で有用でありうる(G Mullerら、1994,J Clin Invest 94:1799-1805)。IL−12活性はp40サブユニットを包括するヘテロダイ マー形態に、生体内の正常状態で、依存すると報告されている(ML Kobayashiら 1989,J Exp Med 170:827-832;SF Wolfら1991,J Immunol 146:3074-3081)。 即ち、例えば、更なる観点において、本発明は、免疫治療剤又はワクチンアジ ュバントとして利用するための、IL−12もしくはそのp40サブユニット又はその 他機能性類似体をコードし、且つ発現を及ぼすことのできる薬理治療剤を提供す る。 ポリヌクレオチドは組換ウィルスベクター、例えば遺伝子障害ヘルペスウィル スベクター(それらについてはWO 92/05263 及びWO 94/21807(Immunology Ltd/C antab Pharmaceuticals:Inglisら)並びにWO 92/16636(Immunology Ltd:Boursne llら)を参照のこと)の一部を成しうる。これとの関連で、当該ウィルスベクタ ーは例えばgH遺伝子において欠失を存し、且つIL−12もしくはそのp40サブユニ ット又はその他の機能性類似体をコードする1又は複数の挿入外来遺伝子を担持 する突然変異体 HSV1又はHSV2を含んで成りうる。他方、例えば真核細胞の中 での発現のために適当も調節配列を有するプラスミドDNA 又はより複雑なベクタ ーを使用してよい。 IL−12又はその機能性類似体をコードし且つ発現を及ぼすことの できるかかるポリヌクレオチドは、パピロマウィルス抗原と組合せてワクチンア ジュバントとして、又はパピロマウィルス抗原をコードし且つ発現を及ぼすベク ターと組合せてワクチンとして利用できうる。かかるワクチン要素の例は既に記 述した。 所望するなら、IL−12又は類似体をコードするポリヌクレオチドはパピロマウ ィルス抗原をコードする同一のベクターによりコード且つ担持されていてよく、 そして独立のタンパク質として、又は例えばHPV 誘導アミノ酸配列とIL−12鎖の 一方もしくは他方又はその双方に由来するアミノ酸配列を含む融合タンパク質と してコードされうる。 IL−12の内生生産は、任意の他の所望の治療剤、例えばワクチンと一緒に、ア ジュバントの如き刺激剤を局所又は末梢投与することにより、処置被検体におい て誘導させることもできる。 本発明に係る治療方法は、損傷付近において、例えば皮膚又は粘膜の外部又は アクセス可能な腫瘍において本発明に係る薬剤を投与することにより、パピロマ ウィルス関連損傷、例えば腫瘍中の又はそのまわりのIL−12のレベルを高める治 療を含む。 IL−12タンパク質は、本発明に係る薬理組成物中で、例えば損傷箇所にもしく はその付近に局所的に、又は全身的に投与される生物活性ヘテロダイマーIL−12 タンパク質として、唯一の活性成分でありうる。局所投与が好ましい。他方、更 なる活性成分、例えばワクチンを付与してよい。IL−12又はそのインデューサー と一緒に使用できるワクチンには、HPV タンパク質又は抗原をコードする核酸を 担持した死滅HPV 調製物、又は死滅もしくは生存ベクター、例えばワクシニアウ ィルスベクター;又は対応の「裸DNA」を含む。コードする適当なHPV タンパク 質は本明細書全体に記載のものが含まれる。 本発明の例に係る薬理組成物は例えば経口的に、又は皮膚、皮下、静脈内、筋 肉内もしくは皮内注射により服用されるように処方し得る。 本発明の例に係る薬理組成物は、対応の活性成分に加えて、薬理学的に許容さ れるビヒクル、賦形剤、担体、その他のアジュバント、バッファー、安定剤及び その他の公知の材料、好ましくは非毒性であり且つ選択した活性成分と非適合性 でない材料を含んで成りうる。局所投与用の薬理組成物にはクリーム及びエマル ションが含まれる。タンパク質を投与する場合、それらは例えば水性バッファー において、又は公知の徐放形態、例えばリポソーム及びマイクロ粒子で投与でき うる。経口組成物は錠剤又はカプセルとして投与してよく、例えばゼラチン、又 は粉末もしくは液体を含んで成りうる。液体組成物は水、例えば生理食塩水又は デキストロースもしくはその他の糖溶液、グリセリンもしくはその他のグリコー ル、エチレンもしくはプロピレングリコール、又はポリエチレングリコール、石 油、動物、植物、鉱物もしくは合成油を含んで成りうる。 注射用の薬理組成物は公知の無菌注射用ビヒクルを含んで成り得、それらは往 々にしてパイロジェンフリーであり、そして適当なpH、等張性及び安定性を有し 、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、及び ラクテート型リンガー注射液である。注射によりIL−12を投与するためのビヒク ルの適当な例にはバッファー、ヒト血清アルブミン及びグリシン、又はヒト血清 アルブミン、又は注射用食塩水が含まれうる(L J Eronら(1986)New England J Med vol 315(17);及びBelli ら(Condylomata International Study Group),(199 1),J Amer Med Ass,vol 265(20)(5月22/29日))。 本発明に係る利用のために提供する治療的に有効な量は以下に記 載するものでありうるか、又は腫瘍領域もしくは容積として腫瘍の定量評価によ って容易に決定し得る。 他方、処置の用量及び進行は損傷の生検及びその中に存在するIL−12のレベル 又は発現性の、イムノアッセイもしくはその他の免疫化学測定による(公知のイ ムノアッセイから容易に応用できうるものか、又はIL−12に特異的な適当な結合 力の抗体を利用することによる免疫化学法)又は以下に詳細の如きPCR法による 評価によって評価できうる。 従って、活性成分の用量は本明細書に記載の通りであるか、又はかかるアッセ イ法により供される処置及び処方のもとで、臨床例における損傷の箇所、タイプ 及び症度に従ってかかりつけの医師により調整されうる。 タンパク質IL−12は1回の投与当り1pg〜1mgの範囲、例えば1回の投与当り 10pg〜10μgの範囲、例えば1回の投与当り10pg〜1μgの範囲において唯一の 活性成分として注射されうる。ワクチンアジュバントとして使用する場合、投与 は例えば1回の投与当り1pg−10μg、例えば1回の投与当り 100pg〜1μg の範囲でありうる。 IL−12をコードするDNA の利用において、その用量は例えば1回の投与当り1 ng〜1mg、例えば1回の投与当り100ng〜100μgでありうる。 本明細書に記載の治療はその他の形態の治療、例えば抗腫瘍剤の投与及び/又 はその他の細胞溶解性もしくは細胞破壊処置、例えば外科的切除、低温手術、電 気焼灼、レーザー療法及びポドフィルム(podophyllum)樹脂の適用と組合せてよ い。異なる治療は同時又は連続式に施してよい。 本発明を以下の実施例及び関連の試験方法を参照しながら実施態 様について説明するが、それらは限定の意図はない。 HPV 腫瘍に対する免疫療法としてのIL−12の利用 この利用のため、組換IL−12は、適当な発現系、好ましくは哺乳動物細胞発現 系、しかしながら他に酵母又はバキュロウィルス発現系におけるIL−12のp35及 びp40鎖の双方の発現によりin vitroで製造できうる。かかる発現系はrDNA技術 の業界において公知であり、そして公知のクローニング及び発現ベクター並びに その他の関連の材料をIL−12の発現に容易に応用できうる。WO 92/05256(Geneti cs Institute and Wistar Institute:G Trinchieri ら:Naturalkiller Stimula tory Factor)には、ナチュラルキラー刺激因子の名のもとでヒトカイトカインと してのIL−12が記載され、そしてそれを製造するための方法及びそれを含む薬理 製剤が記載されている。EP 0433827(Hoffmann-la Roche:RA Chizzoniteら:Cyto toxic lympocyte maturation factor and monoclonal antibodies directed the reto)には細胞障害性リンパ球成熟因子(CLMF)の名のもとでIL−12が記載され 、そしてその製造及びヒトB−リンパ芽球細胞系による合成が記載されている。 このようにして製造したIL−12は本質的に標準な技術、例えばWO 92/05256(G enetics Institute and Wistar Institute:G Trinchieri ら)及びEP 0433827(H of fmann-la Roche:RA Chizzoniteら)、並びに上記のその他の文献に記載の技 術により精製できうる。 組換IL−12調製物は性器いぼを処置するために利用でき、そして薬理学的に許 容される担体と一緒に、例えば当該タンパク質の水性溶液として、又は封入形態 として、例えば生物分解性ミクロ粒子もしくはリポソーム中で、又は水性クリー ム製剤中で処方されうる。 例えばHPV いぼ又はその他の損傷に局所塗布するとき、IL−12は例えば0.01〜 1000μg/日の用量範囲で適用してよい。 この目的のため、IL−12の薬理製剤は局所調製物、又は非経口、特に注射用調 製物であってよい。 アジュバントないしHPV ワクチンとしてのIL−12の利用 IL−12はワクチンアジュバントとしての利用によりHPV 障害を処置するのにも 利用できうる。 アジュバントとしてIL−12が添加されうるHPV ワクチンは組換HPV タンパク質 、融合タンパク質、フラグメント、又はペプチドを含む。例えば、パピロマウィ ルス関連症状の予防及び治療のためのパピロマウィルスタンパク質L2並びに関 連のフラグメント及び融合タンパク質の利用を考慮したWO 93/00436(Cancer Re search Campaign Technology:WFH Jarrettら)に記載のものを含む。 かかるワクチンは、その他のアジュバント、例えばアルヒドロゲル(TM)とし て知られる調製物形態の水酸化アルミニウムゲル及び公知の生物分解性ミクロ粒 子又はリポソームと組合せてよい。 IL−12を組合せることのできるその他のHPV ワクチン形態には組換ウィルス様 粒子、例えばWO 93/02184 (University of Queensland and CLS Ltd:I Frazerら :Papilloma Virus Vaccine)に記載のものが含まれる。 他方、核酸ベースプラスミドワクチン、例えばWO 96/00583(Merck:JJ Donnell yら:Polynucleotide Vaccine for Papillomavirus)に記載のものをIL−12又は それをコードするポリヌクレオチドと一緒に使用してよい。 他方、組換ベクター、例えばワクシニアウィルス、例えばHPV タンパク質又は 関連の融合タンパク質をコードする遺伝子を担持するもの、例えばWO 92/16636 に記載のものを使用してよい。WO 92/16636 (Immunology Ltd:MEG Boursnell ら :Recombinant Virus Vectors Encoding Human Papillomavirus Proteins) には 、例えばHPV 野生型タンパク質、例えば HPV16E7及び HPV18E7又はそれと免疫学的に交差 反応する突然変異タンパク質の一部又は全体をコードする組換ウィルスベクター が記載されている。 HPV ワクチンアジュバントとして使用する組換IL−12はIL−12と、それと同じ 箇所に投与するワクチンとの混合物であってよい。他方、それは複数の成分を個 々に、例えば同じ箇所且つ同じ時間において、又は別の箇所及び/もしくは時間 において投与する組合せ治療における個々の成分として使用できうる。例えば、 IL−12は、ワクチンを注射により全身投与しながら、局所投与してよい。例えば 、IL−12投与は日常ベースで、例えば0日目から1週間にわたり投与してよく、 一方ワクチンの注射は定期的ベースで、例えば0日目、14日目及び28日目と投与 してよい。 cDNAによるIL−12の導入 IL−12はIL−12をコードするcDNAの如きポリヌクレオチドを導入することによ りHPV 障害の処置において使用できる。 これは例えばIL−12の双方の鎖をコードする裸プラスミドDNA の形態で供与で きうる。これらは類似もしくは異なるものでありうる別々のプロモーターのコン トロール下の、又は単一のプロモーターのコントロール下の同一のプラスミド上 の異なるタンパク質としてコードされうる。 他方、二本鎖をコードするcDNAを融合させ合って単一の融合タンパク質をコー ドするcDNAを作ってよく、それは所望するなら2種のIL−12サブユニットに対応 する配列の間に位置するペプチドスペーサーを存しうる。 他方、IL−12の二本の鎖は別々のプラスミド上でコードされうる。この2つの プラスミドは混合物としてもしくは複数の注射部位において付与するか、又はこ れらのプラスミドを別々の注射部位に別 々に注射してよい。 他方、IL−12のp40サブユニットのみをコードするポリヌクレオチドを、特に 他方のサブユニットp35が構成的に発現されるワクチン細胞の如き細胞の中で発 現を及ぼさせるのに当該ポリヌクレオチドを使用するとき、付与してよい。 ポリヌクレオチド、例えばIL−12のp40及びp35サブユニット又はp40サブユ ニットのいづれかをコードするcDNAは組換ウィルスベクター又は細菌ベクターに より導入されうる。有用なウィルスベクターはレトロウィルス、アデノウィルス 、アデノウィルス関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ポラクスウィルス又はその 他のウィルスを基礎としうる。このウィルスは複製コンピテント、例えば衰弱生 存ウィルスであるか、又は複製欠陥ウィルス、例えば本質的なウィルス遺伝子の 欠失によるウィルスにおける遺伝子欠損に原因して接種を施した被検体において 感染性の新規ウィルス粒子を作ることのできないものでありうる。 有用な細菌性ベクター系にはラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus Iactis )、衰弱サルモネラ(Salmonella)及びその他の安全な細菌系が含まれる。 IL−12鎖は、類似又は異なるものでありうる別々のプロモーターのコントロー ル下にある、又は単一のプロモーターのコントロール下にある同一のウィルス又 は細菌の中の別々のプロモーターとしてコードされうる。他方、二本の鎖をコー ドするcDNAを融合させて上記の単一の融合タンパク質を作ってよい。他方、二本 の鎖は別々のベクターの中でコードされうる。 IL−12cDNAはリポソーム導入によっても導入されうる。 裸プラスミドDNA の投与はプラスミドDNA を含む水性溶液の注射により達成し 得る。一般に、本発明により供される剤の注射ルート は筋肉内、皮下又は皮内ルートであってよく、例えばHPV 関連損傷(腫瘍、いぼ )は直接又はその付近に注射してよい。 他の有用な注射部位はHPV 関連損傷の近辺の皮膚又は粘膜、更にはHPV 関連損 傷から遠方の皮膚又は粘膜である。 その他の近年論じられている方法は、金粒子上にDNA を吸着させ、そしてガン によりこの粒子を注入することにより適用できうる。 ウィルス又は細菌ベースベクターの投与は組成物、例えば改良ウィルス又は細 菌を含む水性組成物の、筋肉内、皮下又は皮内ルートを介する、HPV 関連損傷へ の直接的な、又はそうでなければ損傷のすぐ近く又は離れた箇所への注射による ものであってよい。他にベクターは鼻内、経口又はその他の投与により粘膜表層 に付与してよい。 IL−12ポリヌクレオチド、例えばcDNA又はかかるポリヌクレオチド含有ベクタ ーはHPV 誘導障害の治療のためのワクチンアジュバントとして利用できうる。 関連のワクチンは1又は複数のHPV 関連抗原をコードする裸プラスミドDNA を 含んで成ってよく、その抗原は独立で又は融合タンパク質形態で発現されるHPV ゲノムに由来する1又は複数の遺伝子生成物であってよい。HPV 抗原をコードす るDNA はIL−12遺伝子として同一のプラスミド上にあるか、又は別のプラスミド 上に載っていてよい。 他方、IL−12をコードするポリヌクレオチドは上記の通りウィルスもしくは細 菌ベクター中で導入されるHPV 抗原をコードするポリヌクレオチドと共に、又は リポソーム導入を介して付与してよい。IL−12及びHPV 抗原は同一のベクター又 は別々のベクターの中でコードされうる。 IL−12鎖をコードするDNA は、合体して生物活性分子を形成する 二種類のタンパク質をコードするか、又は任意的にスペーサーアミノ酸配列によ り分けられたIL−12の双方の鎖の配列を含む融合タンパク質をコードしうる。 試験方法: 以下の試験方法を上記及び更に以下に詳細する本発明者の臨床研究において用 い、そしてそれらは本発明に係る治療の経時的なモニターにも適用される。 腫瘍細胞のサイトカインmRNA分析: ここで分析した腫瘍は尖圭コンジロームを有する患者由来の性器いぼとした。 前述の通り、これらはHPV 感染症に原因する。 性器損傷のサンプリング: 本研究において利用した性器損傷はDepartment of Genito-Urinary Medicine, Jefferiss Wing,St Mary's Hospital,Paddington,London で得た。全ケースにお いて、損傷をサンプリングの24時間前にベータジン(TM)で処置した。損傷を切 り取り、そして直ちに液体窒素の中で瞬間凍結した。サンプルを−70℃で分析す るまで保存した。 生検からのRNA 抽出: RNAを、P Chomczynski ら(1987)Anal Biochem 162:156-161の方法に基づき、 市販の製品RNA20LB(Cambio Cambridge,UK)を用いてサンプルから抽出した。凍結 組織を氷上の少なくとも1mlのRNA20LBを含むチューブの中に入れ、そして電動 ホモジナイザー(OMNI International 1000,Camlab,Cambridge UK)でホモジナイ ズした。得られる懸濁物を1.5ml のオートクレーブ処理したコンペンドルフチュ ーブに移し、そして0.2ml のクロロホルムを2mlづつのホモシネート物に加えた 。サンプルを15秒間強力に撹拌し、そしてその懸濁物を氷上で少なくとも15分放 置し、次いで12,000gで15分、4℃で遠 心分離した。サンプルを二相、即ち、上部水性相と下部有機相に分けた。上相を 新しいチューブに移し、そして等容量のイソプロパノールを加えた。 RNA を沈殿させるため、サンプルを−20℃で少なくとも16時間保存し、次いで 12,000gで4℃で15分遠心分離した。上滴液を除去し、そしてペレットを70%の エタノールで洗った。RNAを真空で簡単に乾かし、50〜100 μlのDEPC処理水に 再懸濁し、そして光度計での260nm での測定により定量した。RNAの少量アリコ ートを−70℃で保存した。 生検から抽出したRNA の品質チェック サンプルから抽出したRNA が分解していないかを確認するため、少量アリコー トを 6.6%のホルムアルデヒドを含むアカリロースゲル上で RNA18S及び28Sに ついてのマーカーと一緒に泳動させた。RNA を0.1 Mの酢酸アンモニウム中のエ チジウムブロミド(0.5μg/ml)で30〜60分かけて染色することにより識別化さ せた。rRNA18S及び28Cに相当するバンドが見えたら、ゲルを写真撮影し、そし てリボソームRNA についての明瞭なバンドを示すサンプルのみを更なる研究のた めに使用した。 RT−PCR によるRNA の酵素的増幅: (a)鋳型としてRNA を利用するDNA 合成: 性器損傷から抽出した全RNA 2μgを逆転写用の鋳型として用いた。RNA を20 μlの最終容量で500ng のポリ(T)18プライマーと65℃で15分インキュベー トし、次いで氷上で冷却した。以下の混合物を各サンプルのために調製して: 10μlの5Xの逆転写酵素バッファー 2μlの0.1 MのDTT(ジチオスレイトール) 5μlの8mMの4種のdNTP混合物(2mMづつ) 2μl(20U)のRNAsin 10μlの水。 この混合物29μlをRNA を含むチューブに加えた。各サンプルに1μl(200 U)のSuperscript(TM) 逆転写酵素を加え、そしてそのチューブを42℃で1時間 インキュベートした。このインキュベーションの終了時に、15μlの10mMのトリ ス−Cl,10mMのEDTA,pH7.5を加え、次いで 200μlの緩衝化フェノールを加え、 サンプルを軽くボルテックスにかけ、次いで高速で室温にて5分間遠心分離した 。上部水性相を新しいチューブに移し、次いで200 μlの24:1のクロロホルム :イソアミルアルコールを加えた。ボルテックス及び高速で室温での遠心後、上 相を新しいチューブに移し、それに20μlの3Mの酢酸ナトリウム及び500μl の無水アルコールを加えた。サンプルを−20℃で一夜又は−70℃で20分保存し、 次いで高速で4℃で15分遠心分離した。上清液を除き、そしてペレットを真空で 軽く乾かし、そして100μlの水に再懸濁した。得られるcDNAを−20℃で保存し た。 (b)特異的なプライマーによるcDNAの増幅: 逆転写により得られるcDNA5μlをサイトカインの特異的な配列の増幅のため に用いた。PCR 増幅のために使用したプライマーは下記の通りである: 以下の混合物を各サンプルについて調製した: 2.5μlの20Xの反応バッファー 3μlの25mMのMgCl2 1μlの40mMの4種のdNTP(10mMづつ) 2.5μlづつの各プライマー 31.5μlの水 43μlの混合物を0.5mlのエッペンドルフチューブに移し、そして5μlの鋳 型DNA を加えた。2μlの熱安定性DNA ポリメラーゼTf1(Cambio,Cambridge UK )を加えた。この混合物の上に20μlの鉱物油を載せ、そして以下の温度で60サ イクル増幅させた:変性94℃で1分;アニーリング55℃で1分;伸長72℃で2分 。 この増幅過程に94℃で5分の長い変性時間を先行させ、そして72℃10分サイク ルを後続させ、ポリメラーゼの残留活性を失わせた。 適当なバンドの存在はエチジウムブロミドを含む 1.5%のアガロースゲル上で PCR 生成物20μlを泳動させることにより確認した。ゲルを適当な時間泳動後、 それを写真撮影し、そしてDNA をニトロセルロース膜に移すのに使用した。この ゲルを 0.5MのNaOH,1MのNaClの中で20分づつサイクルに2回かけて変性させ 、次いで水で 洗い、そして 0.5MのTris-Cl,pH7.4,3MのNaClの中で20分のサイクルに2回か けて中和した。ゲルをQuickdraw ブロッティング紙(Sigma International)を用 い20XのSSC の中でニトロセルロース膜に一夜かけて移した。次いでこの膜を20 XのSSC で平衡化し、風乾し、そして80℃2時間かけて焼き、次いで使用するま で4℃で保存した。 (C)PCR 生成物の同一性の確認 PCR 生成物の同一性を確認するため、膜をPCR により増幅させたサイトカイン の内部配列を認識するジゴキシゲニンラベル化プローブと、Boehringer Mannhei m によるそのin-situ ハイブリダイゼーションガイドのプロトコールに従ってハ イブリダイズさせた。PCR生成物とのハイブリダイゼーションのために使用した プローブは下記の通りである。 膜を少なくとも20ml/100 cm2において、0.1 %V/VのN−ラウロイルサル コシン、0.02%V/VのSDS 及び1%の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキ ング試薬の中に37℃で1時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション を4ml/100 cm2においてハイブリダイゼーションバッファーの中で10pmol/ml のオリゴヌクレオチドと37℃で4時間行った。次いで膜を2XのSSC,0.1%V/ VのSDS で1回の洗浄当り5分かけて2回洗い、次いで0.1XのSSC,0.1 %V/ VのSDS で37℃で15分づつ2回洗った。膜をバッファー1(核酸100 mM,NaCl 150 mM,pH7.5)中で数分間平衡化し、次いで1%のブロッキング試薬の中で30分イン キュベーションした。次いで膜を1:5000に希釈したアルカリホスファターゼと コンジュゲーションした抗DIG 抗体(Boehringer Mannheim)と30分、室温で静か に振とうしながらインキュベーションした。膜をバッファー1で5分かけて2回 洗い、次いでバッファー3(100mMのトリス−Cl,pH9.5,100mMのNaCl,50mM のMgCl2 )にすばやく移した。膜を変色溶液(10mlのバッファー3中の45μlのNBT,35μ lのX−ホスフェート)と16時間かけてインキュベーションし、そして反応をバ ッファー1の中での洗浄によりブロッキングした。ポジティブコントロール及び サンプルの双方中の適正なサイズのバンドの識別化は増幅cDNAの特異性を表示し た。 結果: 臨床研究におけるRT−PCR 分析の結果を添付表a〜eに示す。異なる表への分 割は退行性又は非退行性いぼにおけるサイトカイン発現のパターンにおける類似 性に基づく。表はIL−2p40又は IFN−ガンマー転写の徴候のない非退行性いぼ のケースに関する。表bは IL−12p 40転写の徴候がないが、IFN−ガンマー転写の徴候のある非退行性いぼ のケースに関する。表cはIL−12p40転写の徴候のある非退行性いぼのケースに 関する。表dは退行性いぼのケースに関する。 シグナルの強度は、同一の反応において増幅させ、次いでアクチンバンドの強 度との対比により標準化したサンプル間での対比により決定した。 この研究において、本発明者は正常組織における遺伝子発現に基づいたデータ を得るため、正常頸部組織も分析した。これらのサンプルはHPV 感染症に関連し ないとの理由のために取り出した子宮に由来し、そしてその他のサンプルと同様 に瞬間凍結した。 損傷は全て、異なるレベルではあるにせよ、IL−1ベーター、IL−8,IL−12 p 35及び TGF−ベーター1についての転写物を示した。IL− 3,IL− 4又はIL− 10についてはどのいぼサンプルもポジティブでなかった。IL− 4は正常な頸部組 織においてのみ認められた(NC×2)。これらの2つのサンプルはIL− 6につい てはポジティブであり、一方IL− 5についての転写物は5種類のサンプルにおい て認められた。 非退行性損傷を表aにおいてグループ分けし、そしてIL− 2,IL−12p 40又は IFN−ガンマーについての転写物を示さなかった。3種類のサンプルのみが TNF −ガンマー及びベーターの双方についての転写物を示し、そして残りの4種は示 さなかった。ほとんどのサンプルがT−細胞の存在を示す転写物CD4及びCD8の 両方を有していた。3種類のサンプルはT細胞についても、その他の免疫系細胞 についてもの転写物を示さなかった。表1bにおける一部の損傷は同一のパター ンを示した。これらの損傷はアクチンについての低い強度のバンドを有すること に注目すべきであり、従ってT細胞につ いてのシグナルは感度の限界値よりも低いかもしれない。 表bにおいてグループ分けした非退行性いぼは IFN−ガンマーについての転写 物は示したが、IL− 2についての2種類の転写物のみを有していた。TNF につい ての転写物はほとんどの損傷に関して低く、しかしながら2種類のサンプルは双 方とも高いレベルを有した。一般にこれらの損傷は高度のサイトカイン転写率を 示し、それ故表aにおいてグループ分けした損傷と比べて強い免疫系の活性化を 示した。 表cにおいてグループ分けした非退行性いぼは、先のグループのいづれにも存 在しないIL−12p 40についての転写物を示した。3つの損傷はIL- 2についてネ ガティブであり、そして最初の2つはIL− 2についてもネガティブであり、そし て最初の2つは IFN−ガンマー転写物についてもネガティブであり、一方残りの 損傷はこれらのサイトカインの双方についての転写物を有していた。更に、TNF −アルファーが全ての損傷において存在し、そしてやや高めのレベルで転写され た。 表dにおいてグループ分けした退行性いぼは表Cにおける損傷で認められるも のと非常に似たサイトカインプロフィールを示した。IL−12p 40、IFN−ベータ ー及び IFN−ガンマーについての転写物が全ての損傷において存在し、そしてIL − 2転写物が5種類の損傷のうちの4種に存在していた。正常な頸部はIL− 2, TNF についての転写物を示し、そしてーのケースにおいては IFN−ガンマーにつ いての転写物を示したが、IL−12 40については示さなかった(表e参照)。 従って、正常頸部組織の検査はIL− 1ベーター,IL− 2,IL− 4,IL− 8,IL −12p 35,TNF−ベーター,INF−ガンマー及びTGF−ベーターについての転写物 を示した。IL− 2はおそらくは正常上 皮細胞において存在することが示されている常在性T細胞集団の中に存在する。 このリンパ球集団の存在は細胞性マーカーCD3,CD4及びCD8についての転写物 により確認された。IL− 1ベーター、IL− 4,IL− 8,IL−12p 35,TNF−ベー ター、IFN−ガンマー及びTGF−ベーターはワクチン細胞もしくはランゲルハンス 島又はその両者により生成されうる。 サンプルの第一グループにおいて、IL− 1ベーター、IL− 8,IL−12p 35,TN F 及びTGF−ベーターについての転写物が存在していた。CD3,CD4及びCD8転 写物により示されるように一部のサンプル中にT細胞が存在していたが、IL− 2 又はIFN−ガンマーについての転写物は検出されなかった。 サンプルの第二グループにおいて、サイトカインのパターンはIL− 1ベーター 、IL− 8,IL−12p 35,TNF,IFN−ガンマー及びTGF−ベーターについての転写 物を有する正常頸部組織の中において見い出せるものと似ていた。いくつかのケ ースにおいて、IL− 2についての転写物もあった。このパターンはより正常な状 況を示唆するものと考えられる。 第三及び第四グループにおけるサンプルは非常に類似のサイトカイン発現のパ ターンを有した。これらの損傷において、IL− 1アルファー、IL−ベーター、IL − 2,IL− 5,IL− 8,IL−12p35,IL−12p 40,TNF−アルファー、TNF−ベー ター、IFN−ガンマー及びTCF−ベーターについての転写物があった。IL− 1アル ファー及びTNF は前炎症反応、それ故免疫反応を示した。これらの損傷と先のグ ループにおけるものとの最もめざましい違いは、正常頸部組織においては検出さ れないIL−12p 4Oについての転写物の存在にあると考えられる。IL−12はTh1リ ンパ球の活性化にとって必須であると信じられ、そしてその存在はこのような損 傷の中でCD4+T細胞 の集団はDTH 型の反応を誘導する過程にあることを示唆する(既にウィルスの浄 化との関連で報告:S Aibaら、1986,Cancer 58:1246-1251)。 少数の非退行性損傷におけるIL−12p 40転写物の出現は、これらのサンプルを 採取した被検体が非常に早期の退行段階にあるが、臨床的向上がいまだ測定でき ない時期にある可能性を示唆するものと信じられる。 これらの結果はHPV 感染症に対応する局所免疫反応におけるIL−12の中心的な 役割を示唆し、そしてIL−12がいぼ退行の主因又は補助因子であることの期待を 高める。 IL−12タンパク質分析: 退行性及び非退行性性器いぼの生検をIL−12の発現について分析でき、そして 結果を比較した。p35,p40及びヘテロダイマーの存在は容易に応用できる免疫化 学技術を利用して調べられうる。IL−12を認識する抗体は市販されている。 IL−12タンパク質は、ワクチン細胞及び白血球の双方において、退行性いぼか ら採取した材料の中で検出されうる。発現のレベルは、ワクチン細胞よりも白血 球、特に樹状突起細胞において高い。 本明細書に記載の研究は、いぼ退行におけるIL−12についての役割並びにIL− 12及びいぼ退行の樹状細胞発現間での連結を示唆する。 in-vivo モデルにおけるIL−12投与の効果 HPV 16E6もしくはE7又は双方を発現するマウスワクチン細胞は分化した上 皮細胞の再生を可能にする移植技術を利用して、同系マウスの側腹部上に移植で きうる。これらの動物の耳におけるE7又は E6の皮内負荷は遅延型の過敏(DT H)反応をもたらす、DTH の誘導と、第一グラフトを形成するために用いるE7発 現細胞の数と の間に関係がある。限界播種量であってそれを下回ると、上皮細胞は形成される が、DTH が誘引されない量がある。このような条件下での免疫的非反応性はその 後の負荷に基づいて維持され、そしてグラフトされた細胞は拒絶されない。細胞 は誘導型の非反応性の欠如(これはHPV 感染のモデルとなる)及びかかる感染に 原因する腫瘍に対した備った免疫反応において拒絶される。C McLeanら(1993)JG en Virol 74:239-245;MA Chambersら(1994)Eur J Immunol 24:748-45;MA Chambe rs ら(1994)J Gen Virol 75:165-169;及びMA Chambers らProceedings of the 2nd International Workshop on HPV Immunology,Cambridge UK'(1993年6月)ed .MA Stanley(Plenum Press London 1994)pp267-274)を参照のこと。 マウスはワクチン細胞グラフティングにより、例えば104〜5×105個のワクチ ン細胞という低レベルの抗原、次いで高い播種量、例えば107個のワクチン細胞 による第二グラフトにより感作できる。グラフトは拒絶されない。動物にE7を 、タンパク質又は組換ワクシニアウィルスによりコードされ且つ発現されるもの として、負荷する。 IL−12をかかる抗原負荷されたかかる動物に供することができる。IL−12供給 の様々なルート、例えばそれをコードする裸核酸の注射及び組換ワクシニアウィ ルスゲノムにおいて担持された対応の核酸よりそれを発現できるワクシニアウィ ルスによる感染は容易に試験できる。DTH の誘導及びグラフトの拒絶はプロトコ ールの効率の尺度として利用できうる。IL−12の供与は、DTH 反応により明示さ れる、ワクチン細胞グラフトに対して備った免疫反応を高める。IL−12供与の様 々なルートの効果はそれ故容易に試験できる。 本発明は本発明の範囲を逸脱することなく様々な改良及び変更がなされうるこ とが当業者に明らかである。本開示内容は本明細書記 載の特徴の組合せに及ぶ。本明細書において引用する文献はその内容全体を本明 細書に組入れている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12N 15/09 ZNA C12P 21/02 C C12P 21/02 A61K 37/02 C12N 15/00 ZNAA //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:92)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.パピロマウィルス関連損傷の処置における治療剤もしくはアジュバントと してのインターロイキン−12(IL−12)もしくはその機能性類似体、又はIL−12 をコードするもしくはその機能性類似体をコードするポリヌクレオチドの利用。 2.6型及び/又は11型HPV により生じたいぼ、例えば尖圭コンジロームの処 置のための請求項1記載の利用。 3.パピロマウィルス関連損傷の処置における免疫治療剤又はワクチンアジュ バントとして利用するための、IL−12又はその機能性類似体を含んで成る薬理治 療剤。 4.(i)ワクチンアジュバントとして利用するためのIL−12又はその機能性 類似体と、(ii)ワクチンとして利用するためのパピロマウィルス抗原、又はパ ピロマウィルス抗原をコードし、且つ発現を及ぼすことのできるベクターとの組 合せを含んで成る薬理治療剤。 5.成分(ii)が少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質もしくは抗原 性フラグメント又はその対応の融合タンパク質を含んで成る、請求項4記載の薬 理治療剤。 6.成分(ii)が6,11,16及び/又は18型のHPV のタンパク質E6,E7, L1及び/又はL2のうちの少なくとも一種のタンパク質の配列の少なくとも実 体的な部分を有するポリペプチドを含んで成る、請求項4記載の薬理治療剤。 7.成分(ii)が少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質もしくは抗原 性フラグメント又はその対応の融合タンパク質をコードし、且つその発現を及ぼ すことのできる組換ウィルスベクターを含んで成る、請求項4記載の薬理治療剤 。 8.前記組換ウィルスが6,11,16及び/又は18型のHPV のE6,E7,L1 及び/又はL2から選ばれる少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質の配 列の少なくとも実体的な部分を有するポリペプチドをコードする少なくとも一種 の組換ワクシニアウィルスを含んで成る、請求項7記載の薬理治療剤。 9.免疫治療剤又はワクチンアジュバントとして利用するための、IL−12又は その機能性類似体をコードし、且つその発現を及ぼすことのできるポリヌクレオ チドを含んで成る薬理治療剤。 10.前記ポリヌクレオチドが組換ウィルスベクターの一部を成している、請求 項9記載の薬理治療剤。 11.前記ウィルスベクターが遺伝子障害ヘルペスウィルスベクターを含んで成 る、請求項10記載の薬理治療剤。 12.前記ウィルスベクターが、gH遺伝子において欠失を有し、且つIL−2又は その機能性類似体をコードする1又は複数の挿入外来遺伝子を(gH欠失の遺伝子 座において)担持している突然変異HSV1又は HSV2を含んで成る、請求項11記 載の薬理治療剤。 13.(i)ワクチンアジュバントとして利用するためのIL−12又はその機能性 類似体をコードし、且つその発現を及ぼすことのできるポリヌクレオチドと、( ii)ワクチンとして利用するためのパピロマウィルス抗原又はパピロマウィルス 抗原をコードし、且つその発現を及ぼすことのできるベクターとの組合せを含ん で成る、薬理治療剤。 14.成分(ii)が少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質もしくは抗原 性フラグメント又はその対応の融合タンパク質を含んで成る、請求項13記載の薬 理治療剤。 15.成分(ii)が6,11,16及び/又は18型のHPV のタンパク質E6,E7, L1及び/又はL2のうちの少なくとも一種のタンパ ク質の配列の少なくとも実体的な部分を有するポリペプチドを含んで成る、請求 項13記載の薬理治療剤。 16.成分(ii)が少なくとも一種のパピロマウィルスタンパク質もしくは抗原 性フラグメント又はその対応の融合タンパク質をコードし、且つその発現を及ぼ すことのできる組換ウィルスベクターを含んで成る、請求項13記載の薬理治療剤 。 17.前記組換ウィルスベクターが6,11,16及び/又は18型のHPV のE6,E 7,L1及び/又はL2から選ばれる少なくとも一種のパピロマウィルスタンパ ク質の配列の少なくとも実体的な部分を有するポリペプチドをコードする少なく とも一種の組換ワクシニアウィルスを含んで成る、請求項16記載の薬理治療剤。
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