KR20010033132A - 미코박테리움 바카이에서 유도한 조성물 및 이의 이용방법 - Google Patents

미코박테리움 바카이에서 유도한 조성물 및 이의 이용방법 Download PDF

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KR20010033132A
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폴 탄
제임스 와트슨
엘리자베스에스. 비셜
말고트에스. 스킨널
로스엘. 프레스티지
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왓슨 제임스 디.
제네시스 리서치 앤드 디벨럽먼트 코포레이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae)에 존재하거나 또는 이로부터 유도한 조성물을 제공하고, 또한 이들 조성물을 감염성 질병, 면역질환, 암을 비롯한 질환의 치료, 예방, 감지에 사용하는 방법을 제공한다. 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 배양 여과물, 지질 제거된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포, 미콜산이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포, 미콜산과 아라비노갈락탄이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M.vaccae)세포의 투여를 비롯하여 항원에 대한 면역반응을 강화하는 방법을 또한 제공한다.

Description

미코박테리움 바카이에서 유도한 조성물 및 이의 이용방법{COMPOSITIONS DERIVED FROM MYCOBACTERIUM VACCAE AND METHODS FOR THEIR USE}
결핵은 만성 감염성 질환으로, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 즉 결핵균에 의해 감염된다. 이 질환은 주로 개발도상국에서 발생하고, 선진국에서도 그 수가 증가되는 문제를 가지고 있는데 매년 새로운 환자가 8백만 명이 발생하고, 3백만 명이 사망을 한다. 감염은 상당한 시간동안 증상이 나타나지 않지만, 이 질병의 대체로 간의 만성적인 염증으로 인하여 발열 및 호흡 증상으로 명확히 나타나는데, 치료를 하지 않고 방치한다면 상당한 치사율을 가진다.
결핵은 방대한 항생제 치료법을 이용하여 일반적으로 치료가 되기는 하지만, 이와 같은 치료는 이 질병이 만연하는 것을 예방하는 데에는 역부족이다. 감염자는 증상을 나타내지는 않지만, 일정 시간동안 전염성을 가진다. 또한, 치료 섭생에 적응하는 것이 중요하지만 환자의 특징을 모니터하는 것이 어렵다. 일부 환자의 경우는 치료과정을 완전히 끝내지 않아, 치료 효과를 얻지 못하고, 약에 저항성을 가지는 결핵균을 발생하도록 하는 경우가 있다.
결핵균이 확산되는 것을 방지하려면 효과적인 백신 및 질병을 초기에 정확하게 진단하는 것이 필수적이다. 현재, 보호면역을 유도하는데 가장 효과적인 방법은 살아있는 균으로 백신을 만드는 것이다. 이 목적으로 이용되는 가장 흔한 결핵균속이 바실러스 칼미테-구에린[Bacillus Calmett-Guerin (BCG)]으로, 이는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 무균 균주이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효과에 대해 논쟁이 되고 있고, 미국과 같은 일부 국가에서는 일반 대중에게 백신을 하지 않고 있다. 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 감염을 진단하는 데에는 피부 테스트를 이용하여 이루어지는데, 이 테스트는 내피를 투베르쿨린(PPD; 단백질-정제된 유도체) 노출시키는 것이다. 주사 후 48-72시간 경에, 주사 부위에 항원-특이적인 T 세포 반응으로 경화가 나타나면 결핵균 항원에 노출되었다는 것을 의미한다. 그러나, 이 테스트는 감응성 및 특이성에서 문제가 있는데, BCG로 백신주사를 맞은 개인과 감염된 개인을 구별할 수 없다는 것이다.
결핵 및 나병의 면역치료법에 이용되었던 잘 알려지지 않은 결핵균 속은 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae)로 사람에게서는 비-병인성이다. 그러나, BGC와 비교하였을 경우에 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 효과에 대해서는 정보가 없고, 일반 대중에게 백신을 접종하는 데에는 널리 사용되지 않았다. 미코박테리움 보비스(M. bovis), BCG, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 결핵균(M. tuberculosis) 감염에 노출된 개인의 면역계가 인지할 수 있는 항원 화합물을 포함하고 있는 것으로 보인다.
여러 특허 및 다른 문헌에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 다른 미코박테리아(Mycobacteria) 분취물을 비롯하여 미코박테리아(Mycobacteria)를 투여하여 다양한 질환의 치료를 밝히고 있다. 특허 4,716,038에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 비롯한 미코박테리아(Mycobacteria)를 투여하여 다양한 형태의 자가면역질환(예, 관절염 질환)의 진단, 이에 대한 예방접종 및 치료를 밝히고 있다. 미국 특허 4,724,144에서는 미코박테리아(Mycobacteria) 질환, 특히, 결핵 및 문둥병의 치료를 위해 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 유도한 항원성 물질로 이루어지는 면역요법 작용제를 공개하는데, 이 작용제는 화학요법에 대한 보조제로서 이용한다. 국제 특허 출원 WO 91/01751에서는 AIDS 발병을 지연 또는 예방하기 위한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 얻은 면역조절 물질의 면역예방제로서의 용도를 밝히고 있다. 국제 특허 출원 WO 94/06466에서는 AIDS 및 이와 관련된 결핵의 유무하에서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 면역조절 물질의 HIV 감염치료법에 대한 용도를 밝히고 있다.
U.S. 특허 5,599,545에서는 항원투여를 위한 미코박테리아(Mycobacteria), 특히, 불활화된 전체 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 항항원체로서의 용도를 밝히고 있는데, 상기 항원은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 대해 내인성이 아니다. 여기에서 항항원체로서의 유용한 효과는 쇼크 단백질 65(hsp 65)에 기인한다는 의견을 제시한다. 국제 특허 출원 WO 92/08484에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 항원성 또는/ 및 면역억제 물질의 포도막염 치료를 위한 용도를 밝히고 있다. 국제 특허 출원 WO 93/16727에서는 감염에 의해 개시된 자가면역반응과 관련된 정신질환 치료를 위한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 항원성 또는/ 및 면역억제 물질의 용도를 밝히고 있다. 국제 특허 출원 WO 95/26742에서는 종양의 성장 또는 확대를 지연 또는 예방하기 위한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 항원성 또는/및 면역억제 물질의 용도를 밝히고 있다. WO 91/02542에서는 만성 염증질환의 치료에서, 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 용도를 밝히는데, 상기 질환에서는, 비정상적인 IL-6 및/또는 TNF가 방출되거나, 또는 환자의 IgG에서 비정상적 비율의 아가락토실 IgG가 나타난다. 여기에 언급된 질환에는 건선, 류머티스 관절염, 미코박테리아(Mycobacteria) 질환, 크로온 병, 일차 담즙 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 낭창, 다중경화증, 길랑-바레 증후군, 일차 당뇨증, 이식거부 현상이 있다.
공지된 미코박테리아(Mycobacteria)종 중에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 가열-치사된 제제가 백신 및 면역요법적 성질을 계속 유지한다는 점에서 특히 독특하다. 가령, 결핵에 대한 예방접종에 사용되는 결핵균(M. tuberculosis)BCG 백신은 살아있는 균주를 이용한다. 가열-치사된 우형 결핵균(M. bovis)BCG 및 결핵균(M. tuberculosis)을 백신으로 사용되는 경우에는, 어떠한 보호 특성도 나타나지 않는다. 항항원체 성질을 지닌 광범위한 미코박테리아(Mycobacteria)종으로부터 다수의 화합물을 분리하였다. 이런 항항원체 효과는 다른 종의 항원에 대한 특정 면역 반응기작을 자극하는데 필수적이다.
항항원체 성질을 보이는 미코박테리아(Mycobacteria)종으로부터 분리한 화합물에는 크게 두 가지 부류가 있다. 제 1 화합물은 수용성 왁스 D 분취물이다(R.G. White, I. Bernnstock, R.G.S. Johns and E. Lederer, Immunology, 1:54, 1958; US Patent 4,036,953). 제 2 화합물은 무라밀 디펩티드-기초의 물질(N-아세틸글루코사민 및 거의 동몰량의 N-글리콜뮤람산)이다(U.S. 특허 3,956,481, 4,036,953). 이들 화합물은 다음과 같은 측면에서 본 발명의 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 상이하다:
1. 이들은 수용성 작용제인 반면, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 수용성 용액에 녹지 않는다.
2. 이들은 미코박테리아(Mycobacteria) 세포벽 단위체의 광범위한 소형 저 중합체로 이루어지며, 다양한 용매에 의해 박테리아로부터 추출하거나 또는 효소로 세포벽으로부터 분해시키는 반면, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 고도 중합된 세포벽을 보유한다.
3. 모든 단백질은 단백질분해 효소로 분해하여 이들 제제로부터 제거한다. 이들 제제의 유일 구성성분은 세포벽 펩티드글리칸 구조의 성분, 다시 말하면, 알라닌, 글루탐산, 디아미노피멜산, N-아세틸글루코사민, N-글리콜일뮤람산이 된다. 대조적으로, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 50% w/w 단백질을 보유하며, 상이한 다수의 단백질 종으로 이루어진다.
폐 조직에 도달하게 하기 위한 비강용 에어로졸 또는 위장관에 도달하게 하기 위한 경구 전달에 의한 백신의 전달은 일반적으로 약독화된 바이러스 균주로 한정하였다. 가령, 사빈(Savin) 백신의 개발이후로, 폴리오바이러스에 대한 예방접종시 이런 바이러스의 약독화된 균주를 경구로 전달하여 왔다. 최근에, Aviron Incorporated와 전미 알레르기, 감염질환 위원회는 비강용 스프레이형태로 투여된 인플루엔자의 성공적인 이용을 발표하였다. 이런 경우에, 약독화된 생존 인플루엔자 균주는 93%의 어린이를 인플루엔자로부터 보호하였다. 죽은 바이러스 또는 박테리아로 이루어지거나 또는 재조합 단백질로 이루어진 백신은 비강용 에어로졸 또는 경구로 전달하지 못하였다. 여기에는 몇 가지 이유가 있다. 비강 투여된 이들 작용제를 이용하여, T 세포 면역 또는 항체합성을 성공적으로 유도했다는 보고는 거의 없다. 또한, 단백질 및 죽은 미생물을 경구로 전달하면, 종종 내성이 발생하는데, 이런 내성은 성공적인 면역화와 대치되는 것이다.
유육종증은 다수의 신체장기, 특히, 폐, 림프절, 간을 손상시키는 육아종성 염증으로 특징지어지는 원인미상의 질병이다. 사르코이드 육종성은 중심부에 상피 및 거대세포, 그리고 T 림프구를 가진 단핵 식세포로 이루어진다. CD4 T 림프구는 상피세포와 밀접하게 연관하는데 반해, CD4와 CD8 T는 말초에 축적된다. 유육종증에서 특징적인 면역학적 이상은 말초혈 및 기관지 폐포 세정 고-글로불린증, 피부에서 결핵 및 다른 유사항원(예, 칸디다균 및 유행성 이하선염)에 대한 '지연형' 고민감성 반응의 억제를 들 수 있다. 말초혈 림프구 수는 감소하고, 말초혈에서 CD4: CD8 비율은 대략 1-1.5:1로 하락한다. 이들은 일반적인 면역결함의 징후가 아니고, 오히려 고조된 면역활성의 결과인데, 이들 면역활성은 질병 활동위치로 '구획된다'. 폐 유육종증 환자에서, 기관지 폐포 세정에 의해 회복된 전체 세포수는 5 내지 10배 증가하고, 림프구의 비율은 10-14% 미만의 정상상태에서 15% 내지 50%로 증가하였다. 회수된 림프구의 90%이상이 T 림프구이고, CD4:CD8 비율은 정상 컨트롤의 1.8:1에서 10.5:1로 증가하는 것으로 알려지고 있다. T 림프구는 주로 Th1 강(class)이며, Th2 강(class)보다는 오히려 IFN-r과 IL-2를 생산한다. 처리이후, 사르코이드 폐에서 Th1 림프구 증가가 조정된다.
유육종증에는 거의 모든 경우에 폐가 포함된다. 병소가 주로 다른 장기에서 발견되는 경우에도, 잠재적으로 폐가 연루된다. 몇 가지 종류의 유육종증은 저절로 해결되지만, 대략 50% 환자에서 영구적인 장기이상이 발생한다. 심한 경우에, 폐 섬유증이 발생하여, 폐이식을 필요로 하는 폐부전으로 진전된다. 유육종증에 대한 주요 치료물질은 코르티코스테로이드이다. 초기에 코르티코스테로이드에 반응을 보인 환자의 경우, 병이 종종 재발하기 때문에, 메토트렉세이트나 사이클로스포린과 같은 다른 면역억제약물로 치료해야 한다.
천식은 일반적인 질환으로 선진국에서 주로 나타난다. 천식은 다양한 자극 원에 대한 기관 기관지수의 반응증가로 특징지어지는데, 여기서 주요 생리장애는 기류 역류 제한이고, 이것은 자발적이거나 또는 약물에 연관하는데, 기도의 염증에서 병리학적 검증이 가능하다. 임상적으로, 천식은 외적과 내적 변종으로 세분할 수 있다.
외적 천식에는 확인가능한 침전물이 생성되는데, 상기 천식은 아토피, 직업, 약물에 의해 유도된 것으로 추정할 수 있다. 아토피성 천식은 특정 면역글로불린 E(IgE)를 생성시켜 Th2-형 면역반응을 강화시키는 것과 연관하는데, 상기 면역반응은 일반적인 공기알레르기원 및/또는 아토피성 증상에 대한 양성 피부의 기준이 된다. 천식은 추가로, 증상의 계절 시기에 따라 계절형 및 다년형으로 구분할 수 있다. 외적 천식에서 기도폐쇄는 기도의 염증에 의해 야기된 비-특이적 기관지 초반응성에 기인한다. 이런 염증은 다양한 염증세포, 예를 들면, 비만 세포, 호산구, 림프구에 의해 방출된 화학물질에 의해 매개된다. 이들 매개물질은 혈관침투, 점액 분비, 기관지 연조직 수축을 야기한다. 아토피성 천식에서, 기도염증을 발생시키는 면역반응은 T 세포의 Th2 강(class)에 의해 야기되는데, 이때, 상기 T 세포는 IL-4, IL-5, IL-10을 분비한다. 아토피성 천식 폐의 림프구는 활성화되는 경우, IL-4, IL-5를 만드는 것으로 보인다. IL-4와 IL-5는 Th2 강의 사이토킨으로, IgE의 생산 및 천식에서 호산구의 관여를 위해 필요하다. 직업관련 천식은 플라스틱산업 노동자에서 무수산, 서부 연필향나무-유도 천식에서 플리카트산과 같은 단백질 부착소에 대한 IgE의 발생, 또는 톨루엔 디이소시아네이트-유도 천식에서 관찰되는 비-IgE 관련기작과 연관하기도 한다. 약물-유도된 천식은 아스피린 또는 다른 비-스테로이드성 항-염증 약물의 투여이후 관찰할 수 있는데, 비강 폴립증과 부비강염과 같은 특징을 보이는 환자에서 대부분 나타난다. 내적 또는 잠복성 천식은 상부 호흡관 감염후 발생하는 것으로 보고되고 있으나, 중년이후의 사람들에게는 처음부터 발생할 수도 있는데, 이들의 천식은 외적 천식보다 치료하기가 힘들다.
천식은 이론적으로는 자극 알레르기원을 피함으로써 예방할 수 있지만, 이것이 항상 가능한 것도 아니고, 자극 알레르기원을 확인하는 것도 쉽지 않다. 천식의 치료요법은 코르티코스테로이드와 기관지 확장약의 이용에 기초하여 염증 및 역전 기도폐쇄를 감소시키는 것이다.
천식과 유사한 면역비정상을 갖는 다른 질환은 알레르기 비염이다. 알레르기 비염은 일반적인 질환으로 전체 인구의 10% 이상이 피해를 입고 있는 것으로 평가된다. 알레르기 비염은 계절형(건초열)으로, 화분(pollen)에 대한 알레르기에 의해 발생한다. 비-계절형 또는 다년형 비염은 말 진드기 또는 동물 비듬에서 나온 것들과 같은 항원에 대한 알레르기에 의해 발병한다.
알레르기 비염에서 비정상적 면역반응은 알레르기원에 대한 특이적인 IgE 항체의 과도한 생성으로 특징지어진다. 염증반응은 천식의 경우처럼 기도 아랫부분에서보다는, 오히려 비강점막에서 일어난다. 천식처럼, 손상을 받은 조직에서 국소성 호산구는 알레르기 비염의 주요특징이 된다. 이런 염증의 결과로 환자에게 재채기, 콧물 및 코막힘이 발생한다. 좀더 심각한 경우에, 염증은 눈(결막염), 입천장, 귀 바깥 부분으로 확대된다. 이것이 생명을 위협하는 것은 아니지만, 알레르기 비염은 정상적인 활동을 하지 못하도록 하고 사람의 작업능력을 방해한다. 현재 치료에는 항히스타민제, 코 중혈완화제를 사용하는데, 예를 들어, 천식의 경우 나트륨 크로모글리케이트와 코르티코스테로이드를 사용한다.
폐암은 암으로 인한 사망의 주요원인이다. 폐암의 발생빈도는 증가중에 있으며, 세계 보건기구는 2000AD까지 매년 2백만건이 새로이 발생할 것으로 추산하고 있다. 폐암은 주로 두 가지 카테고리로 구분한다: 소형세포 폐암(SCLC), 모든 폐암의 20-25%를 차지; 비-소형세포 폐암(NSCLC), 나머지 75%를 차지. 대부분의 SCLC는 흡연에 의해 야기된다. SCLC는 조기에 확산되어, 환자중 90%가 종격 림프절의 흉부 침투 진단을 받는다. SCLC는 화학요법, 또는 화학요법과 방사성요법을 병용하여 치료한다. 완전 반응율은 10% 내지 50%가 된다. 림프절 침투가 없는 소수 환자의 경우, 수술과 화학요법을 병용하면 60%이상의 치료율을 보인다. NSCLC에 대한 예후는 좀더 심각한데, 그 이유는 질병의 진단시, 대부분의 환자에서 질병이 상당히 진전되어 있기 때문이다. 종양의 수술제거는 소수의 환자에게만 가능하고, NSCLC에 대한 5년이상 생존율은 5-10%정도다.
폐암을 유발시키는 원인은 복잡하고 다원적이다. 환경 및 유전인자는 상호작용하여, 순차적으로 비정상을 가증시키는데, 이런 비정상은 통제되지 않는 세포증식, 인접조직으로의 침투, 원거리까지 확산을 유발한다.
폐암 환자에서 세포-매개 및 체액 면역은 손상을 보인다. 방사성치료 및 화학치료는 추가로 환자의 면역기능을 손상시킨다. 불활화된 종양세포 또는 종양항원으로 환자를 면역시켜 숙주 항-종양 반응을 강화하려는 시도가 있어 왔다. 바실러스(Bacillus) 칼메테-구에린(BCG)은 비-특이적 면역을 증가시키기 위하여, 폐암 수술이후 흉부강에 투여한다. 환자에 인터루킨-2로 탈체 처리한 림프구를 투여하여 항-종양 면역을 강화하려는 시도가 있어 왔다. 이들 림포카인-활성화 림프구는 종양세포를 죽일 수 있는 능력을 획득한다. 폐암에 대한 현재의 면역요법은 개발단계에 있으며, 폐암의 표준관리를 위한 이들의 효능은 아직 확립되지 않고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 Th1, Th2로 알려진 흉선-유도된(T) 면역세포의 균형에 영향을 주는 인자와 연관하는 것으로 보이는 피부질환의 치료에 관한다. 이들 T 세포는 사이토킨 분비 표현형으로 확인한다. 치료의 공통적 특징은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 만든 화합물을 사용한다는 것인데, 상기 화합물은 T 세포 및 다른 면역세포의 활성균형을 바꾸는 면역조절 성질을 갖는다.
건선은 일반적인 만성 염증성 피부질환으로, 소수의 환자에서 다양한 형태의 관절염과 연관할 수 있다. 건선에서 결점은 케라티노사이트의 급속한 성장과 피부표면 껍질의 허물인 것으로 보인다. 약물요법은 이런 과정의 속도를 늦추도록 하기 위한 것이다. 이 질환은 일정한 나이에서 분명하게 드러난다. 건선에는 만성적인 피부표면 껍질의 붉은 허물이 생겨난다. 건선은 매우 가시적인 질환이며, 얼굴, 머리가죽, 굵은 신경, 팔다리에 피해를 준다. 이 질환은 감정적으로, 신체적으로 환자를 쇠약하게 하고, 삶의 행복을 빼앗아간다. 미국에서 1백만 내지 3백만명이 건선으로 고생하고 있으며, 매년 25만건이 새로이 발생한다. 미국에서 건선치료에 소모되는 비용은 현재 년간 2억 4천 8백만$로 추산된다.
건선의 병원성과 관련하여 두 가지 가설이 있다. 제 1 가설은 유전인자가 상피 케라티노사이트의 비정상적인 증식을 결정한다는 것이다. 이런 세포는 항상성의 유지에 관계하는 것들과 같은 외부자극에 더 이상 정상적으로 반응하지 않는다. 세포막 사이토킨 수용체의 비정상적 발현 또는 비정상적 막통 시그널 도입은 세포 초증식의 기초가 된다. 건선과 관련한 염증은 초증식성 케라티노사이트로부터 프로-염증성 분자의 방출이후에 발생한다.
제 2 가설은 피부에서 항원-제시 세포와 상호작용하는 세포 T가 프로-염증성, 케라티노사이트-자극 사이토킨을 방출한다는 것이다((Hancock, G.E. et al., J. Exp. Med. 168:1395-1402, 1988). 이런 상황하에서는, 유전적으로 선결정된 개체의 T 세포만이 활성화되는 능력을 보유한다. 케라티노사이트 자체가 항원-제시 세포가 되기도 한다. 건선 병소에서 세포 여과물은 CD8+ T 세포의 유입, 좀더 주도적으로 CD8+ T 세포의 유입을 보여준다(Bos, J.D. et al., ARch. Dermatol. Res. 281:23-3, 1989; Baker, B.S., Br. J. Dermatol. 110:555-564,1984).
대다수(90%)의 건선환자는 상기 질환의 한정된 형태를 갖기 때문에, 디트란올, 타르 제제, 코르티코스테로이드, 최근에 도입된 비타민 D3 유사체(칼시포트리올, 갈시트리올)를 포함하는 국소적 치료를 이용할 수 있다. 소수(10%)의 건선환자는 좀더 심각한 이상을 보이는데, 이를 위해 다수의 전신요법양식을 이용할 수 있다. 특이적인 전신 치료약물에는 UVB, PUVA, 메토트렉세이트, 비타민 A 유도체(아시트레틴), 사이클로스포린과 같은 면역-억제제가 포함된다. 건선을 치료하기 위한 사이클로스포린 및 FK-506의 효능은 상기 질환의 주원인으로서 T 세포 가설에 힘을 실어 준다(Bos, J.D. et al., Lancet Ⅱ:1500-1502, 1989; Ackerman, C. et al., J. Invest. Dermatol. 96:536[abstract],1991).
아토피성 피부염은 만성 소양증성 염증피부질환으로, 알레르기 비염 및 천식과 같은 다양한 알레르기 질환에 대한 유전적 소질이 있는 가계에서 주로 발생한다. 아토피성 피부염은 전체 인구의 약 10%에서 발병한다. 주요 증상은 건조한 피부, 얼굴, 목, 굴근부에 집중된 피부염(습진), 심한 가려움을 동반한 팔다리의 주름이다. 이것은 일반적으로 태어나지 2년이내에 시작된다. 대략 90%의 환자에서, 이런 피부질환은 유아기동안은 사라지지만, 성인이후로 지속으로 나타난다. 이것은 전 세계에서 가장 흔한 피부염중 하나다. 일반적으로, 아토피성 과민증과 아토피성 피부염은 T 세포 비정상이 주원인이며, IgE 생산을 정상적으로 조절하는 T 세포의 기능장애로 인해 상기 면역글로불린이 과도하게 만들어진다.
알레르기성 접촉피부염은 일반적인 피부의 비-감염성 염증질환이다. 접촉 피부염에서, 면역학적 반응은 신체가 특정 항원에 민감해질 때까지는 일어나지 않는다. 연이은 피부의 항원으로의 노출 및 T 세포에 의한 이들 항원의 인식은 다양한 사이토킨의 방출, T 세포의 증식 및 동원을 야기하고, 최종적으로 피부염(습진)을 야기한다.
알레르기 접촉 피부염의 병소에서, 소수의 T 세포만이 유관한 항원에 대하여 특이적이다. 활성화된 T 세포는 가급적 항원-특이성에 상관없이 염증위치로 이동한다. 지연형 초민감성은 MHC 클래스 Ⅱ 항원을 공유한 T 세포(CD4+세포)에 의해 서만 전이될 수 있다. 접촉 알레르기원에 대한 '반응'은 MHC 클래스 I(CD8+세포) 또는 클래스 Ⅱ(CD4+세포)분자를 공유한 T 세포에 의해 전이될 수 있다(Sunday, M.E. et al., J. Immunol. 125:1601-1605, 1980). 케라티노사이트는 T 세포에 대한 항원 제시를 용이하게 하는 인터루킨-1을 생산할 수 있다. 표면항원 세포내 부착분자-1(ICAM-1)의 발현은 케라티노사이트 및 내피에서 사이토킨 종양 괴사인자(TNF)와 인터페론-감마(IFN-r)에 의해 유도된다.
원인을 확인할 수 있는 경우, 이를 제거만 하여도 알레르기 접촉 피부염은 치료된다. 염증이 활발한 상황에서는, 국소성 코르티코스테로이드가 유용하다. 시험관내에서 시폭된 T 세포의 프로-염증성 기능에 대한 지연형 초민감성에서 사이클로스포린의 억제효과를 관찰하였다(Shidani, B. et al., Eur. J. Immunol. 14:314-318,1984). 생쥐에서 초기상태의 T 세포 활성화에 대한 사일클로스포린의 억제효과가 또한 보고되고 있다(Milon, G. et al., Ann. Immunol.(Inst. Pasteur) 135d:237-245,1984).
원형 탈모증은 일반적인 머리털 질환으로, 미국에서 피부학 외래환자 클리닉에서 시행하는 상담의 2%를 차지한다. 이 질환의 징후는 신체상의 털이 있는 부분에 비-흉터 탈모증의 원형 또는 타원형의 허물이 생기는 것이다. 이 질병은 나이에 상관없이 발생한다. 발병은 일반적으로 갑작스러우며, 임상과정은 다양하다.
현재, 모든 또는 임의의 원형 탈모증을 단일 원인으로 설명하는 것은 불가능하다(Rook, A. and Dawber, R. Diseases of the Hair and Scalp; Blackwell Scientific Publications 1982:272-30). 많은 인자들이 관계하는 것으로 보인다. 이런 인자에는 유전인자, 아토피, 추정된 자가면역 병인 질환과의 관련, 다운증후군, 감정적 스트레스가 포함된다. 원형 탈모증 환자에서 아토피 확산이 증가한다. 원형 탈모증은 자가면역질환이라는 증거가 있다. 이런 증거는 랑게르한스 세포 수 증가와 함께 머리털 소낭주위에서 림프성 T 세포 여과물의 지속적인 조직병리학적 발견, 그리고 원형 탈모증이 면역조절 작용제 처리에 반응하며, 원형 탈모증과 다양한 자가면역질환사이에 통계적으로 유의성있는 상관관계가 존재한다는 관찰에 기초한 것이다(Mitchell, A.J. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 11:763-775,1984).
머리털 생검견본에 대한 면역표현형 조사에서 원형 탈모증 활성병소의 추정 피질 및 머리털 소낭상의 상피세포에서 HLA-DR의 발현이 발견되었고, 또한 머리털 소낭주위에서 고 비율 보조/유도 T 세포를 이용한 T 세포 침투, 랑게르한스 세포수 증가, ICAM-1의 발현이 나타났다(Messenger, A.G. et al., J. Invest. Dermatol. 85:569-576, 1985; Gupta, A.K. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 22:242-250,1990).
원형 탈모증에서 다양한 치료양식은 4가지 카테고리로 세분한다: (ⅰ) 비-특이적 국소성 자극제; (ⅱ) 전신 코르티코스테로이드 및 PUVA와 같은 '면역 조절물질'; (ⅲ) 접촉 피부염 유도물질, 사이클로스포린, 이노시플렉스와 같은 '면역 강화물질'; (ⅳ) 미녹시딜(minoxidil)과 같은 작용미상의 약물(Dawber, R.P.R. et al. Textbook of Dermatology, Blackwell Scientific Publications, 5thEd, 1982:2533-2638). 디트란올과 같은 비-특이적 국소성 자극제는 머리의 재성장을 유도하는 국소성 자극이외의 아직 알려지지 않은 기작을 통하여 작용하는 것으로 보인다. 국소성 코르티코스테로이드가 효과적이긴 하지만, 이들은 장기간 치료를 요한다. 병소내의 코르티코스테로이드는 이보다 좀더 효과적인 것으로 입증되긴 했으나, 이들의 이용은 덜 활동적인 질환의 원형 허물 또는 원형 토탈리스에서 눈썹 재성장의 계속유지에 한정한다. 광화학요법은 효과적인 것으로 입증되었는데, 이것은 아마도 T 세포의 기능성 소개체군을 변화시킴으로써 가능해진다. 머리털에서 알레르기 접촉 피부염의 유도와 유지를 통한 국소성 면역요법은 많게는 70%의 원형 탈모증 환자에서 머리털 재성장을 야기한다. 디페닐시프론은 면역활성이 없는 강력한 센시티저이다. 경구 사이클로스포린은 단기적으로는 효과적이다(Gupta, A.K. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 22:242-250, 1990). 이노시플렉스는 면역자극물질로, 공개시험에서 분명하게 효능을 보였다. 국소성 5% 미녹시딜 용액은 원형 탈모증환자에서 약간의 머리털 성장을 유도할 수 있는 것으로 보고되고 있다.
피부암(종)은 이들의 빈도수 및 이들이 야기하는 장애로 인해 국민의 건강을 위협하는 문제중의 하나다. 피부암(종)은 주로 삶의 최고절정기에 있는 개체, 특히, 다량의 일광에 노출되어 상당히 피부가 손상된 개체에게 나타난다. 연간 치료비용과 작업시간의 손실은 미국에서만 한해 2억 5천만$를 초과한다. 주요 세 가지 타입- 기저세포암, 편평세포암, 흑색종-은 명확하게 일광노출과 연관한다.
기저세포암은 피부의 상피종양이다. 이들은 주로 피부의 노출된 부위에 나타난다. 호주에서 실시한 최근의 한 조사에서, 기저세포암의 발생빈도는 100,000명당 년 652건이다. 이것은 편평세포암의 160건 또는 악성 흑색종의 19건과는 대조적이다(Giles, G. et al., Br. Med. J. 296:13-17, 1988). 기저세포암은 모든 암중에서 가장 흔한 암이다. 병소는 일반적으로 수술하여 절개한다. 다른 치료법에는 레티노이드, 5-플루오르우라실, 한랭요법, 방사성요법이 포함된다. 알파 또는 감마 인터페론 또한 기저세포암의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌는데, 이것은 수술에 부적당하거나 또는 수술 자국을 피하려고 하는 환자에게는 대안이 되고 있다(Cornell et al., J. Am. Acad. Dermatol. 23:694-700, 1990; Edwards, L. et al., J. Am. Acad. Dermatol. 22:496-500, 1990).
편평세포암(종)(SCC)은 두 번째로 흔한 피부악성종양이며, 이의 발생빈도는 증가되고 있다. 다수의 잠재적 요인과 관계하는 진전된 전이성 병상(病狀)의 수가 증가하고 있다. 현재 전이성 SCC로 인해 미국에서 매년 2000명 이상이 사망하고 있다; 5년 생존율은 35%이며, 전이의 90%가 3년 이내에 일어난다. 전이는 거의 대부분 제 1 림프 배액 단계에서 일어난다. 진전된 병상에 대한 의료요법의 필요성은 분명하다. 피부의 일차 SCC에 대한 성공적인 의료요법은 잠재적으로 흉터 및 다른 부작용이 발생하는 수술절개에 대한 필요성을 방지한다. 이런 발달은 특히 얼굴상처에 바람직하다.
시험관내에서 이들의 항증식성 면역조절 효과로 인해, 인터페론(IFNs) 또한 흑색종의 치료에 사용되어 왔다(Kirkwood, J.M. et al., J. Invest. Dermatol. 95:180S-4S, 1990). 전이성 흑색종에서 고 또는 저 분량의 전신 IFN-α에서 얻은 반응율은 5-30%이었다. 최근에, IFN-α와 DTIC의 화합물에서 고무적인 결과(30% 반응)를 얻었다. 예비관찰에서 고 위험 흑색종 환자에서 IFN-α의 항항원체로서의 유익한 효과를 알 수 있었다. 전이성 질병에서 IFN 단일요법의 저 효능에도 불구하고, IFN를 항항원체로 하거나 또는 화학요법과 병용하여, 몇 가지 무작위 조사를 실시하고 있다(McLeod, G.R. et al., J. Invest. Dermatol. 95:185S-7S, 1990; Ho, V.C. et al., J. Invest. Dermatol. 22:159-76, 1990).
피부바이러스 병소를 치료하기 위한 모든 가능한 요법중에서, 단지 인터페론만이 특이적인 항-바이러스 작용양식을 보유하는데, 이것의 작용양식은 감염에 대하여 신체의 면역반응을 재현시킴으로써 이루어진다. 비록 인터페론 처리가 감염의 일부 징후의 완화에 도움이 되긴 하지만, 이 치료방법으로 바이러스를 완전히 소멸시킬 수는 없다. 인터페론 처리는 또한 전신 역작용과 관계하고, 각각의 혹으로 여러 번 주사해야 되고, 경제적으로 상당한 비용이 소요된다(Kraus, S.J. et al., Review of Infectionus Diseases 2(6):S620-S632, 1990; Frazer, I.H., Current Opinion in Immunology 8(4):484-491, 1996).
본 발명의 요약
간단히 말하면, 본 발명은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 존재하거나 또는 이로부터 유도한 조성물을 제공하고, 또한 이들 조성물을 감염성 질병, 면역질환, 암을 비롯한 질환의 치료, 예방, 감지에 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명방법은 항원성 및/또는 항항원체 성질을 갖는 조성물을 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명 조성물을 이용하여 치료하는 호흡기계통 질환에는 미코박테리아(Mycobacteria)감염(예, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)), 천식, 유육종증, 폐암이 포함된다. 본 발명 조성물을 이용하여 치료하는 피부 질환에는 건선, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉피부염, 원형 탈모증이 포함되고, 피부암에는 기저세포암(종), 편평세포암(종), 흑색종이 포함된다. 감염성 질환 또는 암의 면역요법, 또는 백신에 사용하기 위한 항항원체를 또한 제공한다.
제 1 측면에서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 유도한 분리된 폴리펩티드는 항원의 또는 이런 항원의 변이체의 면역원성 영역으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 항원은 다음에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열; (b) SEQ ID NO: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열과 50%이상 동일한 아미노산을 갖는 서열; (c) SEQ ID NO: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열과 75%이상 동일한 아미노산을 갖는 서열; (d) SEQ ID NO: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열과 95%이상 동일한 아미노산을 갖는 서열, 여기서 상기 서열의 동일성은 아래와 같이 컴퓨터 알고리즘 BLASTP에 의한 정렬을 이용하여 측정한다.
본 발명 펩티드를 인코드한 DNA 서열, 이들 DNA 서열로 이루어진 발현벡터, 이런 발현벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주세포를 또한 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나이상 펩티드로 이루어진 융합단백질을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나이상의 본 발명 폴리펩티드 또는 이런 폴리펩티드를 인코드한 DNA 분자 및 생리학적으로 수용가능한 담체로 이루어진 제약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 하나이상의 상기 폴리펩티드 또는 이런 폴리펩티드를 인코드한 하나이상의 DNA 서열 및 비-특이적 면역반응 증폭기로 이루어지는 백신을 제공한다. 특정 구체예에서, 비-특이적 면역 반응 강화체는 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 미콜산이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 미콜산과 아라비노갈락탄이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물에서 선택된다.
또 다른 구체예에서, 환자에서 면역반응을 강화하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하나 또는 복수의 상기 제약학적 조성물 및/또는 백신을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 면역반응은 Th1 반응이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 환자에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 상기 질환은 면역질환, 감염성 질환, 피부질환, 호흡기계통 질환에서 선택된다. 이런 질환의 예에는 미코박테리아(Mycobacteria) 감염, 천식, 건선이 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 면역질환, 감염성 질환, 피부질환 또는 호흡기계통 질환의 치료방법을 제공하는데, 상기 방법은 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 이루어진 조성물을 투여하는 것으로 이루어진다.
항원에 대한 면역반응을 강화하는 방법을 또한 제공한다. 한 구체예에서, 이런 방법은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 면역원성 영역으로 이루어진 폴리펩티드를 투여하는 것으로 이루어지고, 상기 항원에는 SEQ ID NO: 89 또는 201의 서열, 또는 이의 변이체가 포함된다. 다른 구체예에서, 이런 방법은 미콜산이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포; 미콜산과 아라비노갈락탄이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포에서 선택된 성분을 포함하는 조성물을 투여하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특징에서, 환자에서 결핵을 감지하는 방법 및 진단 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 환자의 피부 세포를 하나이상의 상기 폴리펩티드와 접촉을 시키고, 환자의 피부에서 면역반응을 감지하는 것으로 구성된다. 제 2 구체예에서, 이 방법은 생물학적 샘플을 하나이상의 상기 폴리펩티드와 접촉시키고, 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체의 존재를 샘플내에서 감지하여, 생물학적 샘플에서 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 이루어진다. 적절한 생물학적 샘플에는 전체 혈액, 가래, 혈청, 혈장, 타액, 척수 및 소변을 포함된다.
환자의 피부 세포에 폴리펩티드를 접촉시킬 수 있는 장치에 상기 하나이상의 폴리펩티드가 복합된 것으로 구성된 진단 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 감지물질과 하나 또는 복수의 본 발명 폴리펩티드로 구성된 진단 키트를 제공한다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 전술한 폴리펩티드에 결합하는 (다클론성 및 단클론성) 항체 및 미코박테리아(Mycobacteria) 감염을 감지하는데 이를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이와 같은 특징 및 다른 특징은 다음의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 분명하게 나타난다. 여기에서 언급을 하는 모든 문헌은 전문을 참고자료로 제공한다.
본 발명은 미코박테리움 바카이(Mycobacterium vaccae)에 존재하거나 또는 이로부터 유도한 조성물에 관하고, 또한 이들 조성물을 감염성 질병, 면역질환, 암을 비롯한 질환의 치료, 예방, 감지에 사용하는 방법에 관한다. 특히, 본 발명은 미코박테리아(Mycobacteria)감염, 천식, 유육종증, 폐암과 같은 호흡기계통 질환, 건선, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉피부염, 원형 탈모증과 같은 피부질환, 기저세포암(종), 편평세포암(종), 흑색종과 같은 피부암의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한다. 본 발명은 또한 비-특이적 면역반응 증폭기 역할을 하는 화합물 에 관하고, 또한 감염성 질환에 대한 예방접종 또는 면역요법에서, 또는 면역질환 및 암의 치료에 있어, 이런 비-특이적 면역반응 증폭기의 항항원체로서의 용도에 관한다.
도 1A 및 1B는 살아있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M.tuberculosis) H37Rv로 감염시키기 이전에, 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 분절안된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 생쥐를 면역하는 경우의 보호효과를 보여준다.
도 2A 및 B는 난알부민 자극 4주전, 10 또는 1000㎍의 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 200-100㎍의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 비강 면역된 생쥐에서 호산구의 비율을 컨트롤과 비교하여 보여준다. 도 2C 및 D는 난알부민 자극 1주전, 100㎍의 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 200㎍의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 비강 면역된 생쥐에서 호산구의 비율을 보여준다. 도 2E는 난알부민 자극이전에, 파스퇴르 계통의 BCG(BCG-P), 콘노트 계통의 BCG(BCG-C), 1mg의 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 200㎍ 의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 비강(i.n.) 또는 피하(s.c)로 면역된 생쥐에서 호산구의 비율을 보여준다.
도 3A는 결핵 감염이전에, 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 지질 및 당지질제거 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)로 생쥐를 면역하는 경우의 효과를 보여준다. 도 3B는 결핵 감염이전에, 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 단백질의 화합물로 생쥐를 면역하는 경우의 효과를 보여준다.
도 4는 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질에 의한 IL-12의 유도를 보여준다.
도 5에서는 중증 면역결핍(SCID)생쥐로부터 얻은 지라세포에서 상이한 농도의 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질에 의한 인터페론-감마 생산의 시험관내 자극을 비교한다.
도 6A, B, C는 C57BL/6(도 6A), BALB/C 생쥐(도 6B) 또는 CH3/HeJ 생쥐(도 6C)에서 얻은 복막 식세포에서, 상이한 농도의 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 단백질, 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도면에서 "지질제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 칭함), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질 및 지질다당류에 의한 인터페론-감마 생산의 자극을 보여준다.
도 7A(i) - (iv)는 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 10㎍, 100㎍, 1㎎와 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 분절안된 배양 여과물 75㎍의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 보여준다. 도 7B(i)-(ii)는 각각 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 비-특이적인 면역 증강효과를 보여준다. 도 7C(i)는 전체 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 보여준다. 도 7C(ii)는 지질 및 당지질제거 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 SDS로 추출한 용해성 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질의 비-특이적인 면역 증폭 효과를 설명한다. 도 7C(iii)는 도 7C(ii)의 준비물의 비-특이적 증폭효과가 단백질분해효소 프로네이즈로 처리하면 파괴된다는 것을 설명한다. 도 7D에서 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도 7D(i))에서는 비-특이적 면역증폭효과가 보인 반면, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis (도 7D(ii)), 미코박테리움 보비스(M. bovis)BCG(도7D(iii)), 미코박테리움 프라이(M. phlei(도 7D(iv)), 미코박테리움 스메가마티스(M. smegmatis(도 7D(v))에서는 비-특이적인 면역 증폭 효과가 보이지 않았다.
도 8A 및 B는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질 GV23, Th1-유도 항항원체 MPL/TDM/CWS 및 CpG ODN, Th2-유도 항항원체 수산화알루미늄, 콜레라 독소에 의한 αβT 세포, rδT 세포, NK 세포에 대한 CD69 발현의 자극을 보여준다.
도 9A-D는 사람 PBMC에 의한 IL-1β, TNF-α, IL-12, IFN-r 생산에 대한 가열-치사된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae)재조합 단백질의 효과를 보여준다.
도 10A-C는 사람 PBMC에 의한 IL-1β, TNF-α, IL-12생산에 대한 다양한 농도의 미코박테리움 바카이(M. vaccae)재조합 단백질 GV-23과 GV-45의 효과를 보여준다.
도 11A-D는 사람 PBMC에서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)재조합 단백질 GV-23, Th1-유도 항항원체 MPL/TDM/CWS 및 CpG ODN, Th2-유도 항항원체 수산화알루미늄, 콜레라 독소에 의한 IL-1β, TNF-α, IL-12, IFN-r 생산의 자극을 보여준다.
도12A-C는 수상돌기 세포에 의한 CD40, CD80, CD86 발현에 대한 다양한 농도의 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질 GV-23과 GV-45의 효과를 보여준다.
도 13은 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질 GV-23에 의한 수상돌기 세포 혼성 백혈구의 강화를 보여준다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 감염성 질환 및 면역질환을 예방, 치료, 진단하기 위한 조성물 및 방법에 관한다. 본 발명 조성물을 이용하여 효과적으로 치료하는 질환에는 호흡기계통 질환(예, 미코박테리아(Mycobacteria) 감염, 천식, 유육종증, 폐암), 피부 질환(건선, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 원형 탈모증), 피부암(예, 기저세포암(종), 편평세포암(종), 흑색종)이 포함된다.
감염성 미생물로부터 보호작용을 하는 효과적인 백신은 두 개 이상의 기능적으로 상이한 성분을 함유한다. 제 1 성분은 항원으로, 상기 항원은 폴리펩티드 또는 탄수화물이 되고, 식세포 및 다른 항원-제시 세포에 의해 가공되어 CD4+T 세포 또는 CD8+T 세포를 위해 전시된다. 이 항원은 면역반응의 "특이적인" 표적이 된다. 백신의 제 2 성분은 비-특이적 면역반응 증폭기(항항원체라고 함)가 되는데, 항원은 상기 성분과 혼합되거나 또는 여기로 통합된다. 항항원체는 구조적으로 무관한 화합물 또는 폴리펩티드에 대한 세포-매개 또는 항체 면역반응을 증폭시킨다. 몇 가지의 공지된 항항원체는 보르데텔라 백일해(Bordetella pertussis), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 미코박테리움 보비스(M. bovis)와 같은 미생물로부터 만든다. 항항원체는 또한 폴리펩티드 항원이 분해되지 않도록 하기 위한 성분, 예를 들면, 수산화알루미늄 또는 광유를 함유한다. 백신의 항원성 성분은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 같은 특정 병원균에 대하여 면역공격을 지시하는 폴리펩티드를 보유하는데, 항항원체는 다수의 상이한 백신조성물에 광범위하게 사용될 수 있다. 박테리아 장독소와 같은 공지된 특정 단백질은 특이적인 면역반응을 유도하는 항원으로, 무관한 단백질에 대한 면역반응을 강화하는 항항원체 역할을 할 수 있다.
특정 암을 비롯하여, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 같은 특정 병원균은 세포-매개 면역으로 알려진 CD4+, CD8+T 세포가 주도하는 면역공격에 의해 효과적으로 억제된다. 폴리오바이러스와 같은 다른 병원균을 억제하려면, B 세포에 의해 만들어진 항체가 필요하다. 이들 상이한 면역공격 강(class)(T 세포 또는 B 세포)은 CD4+T 세포의 상이한 소개체군(일반적으로, Th1, Th2 지칭)으로 조절한다. 항항원체의 원하는 성질은 CD4+T 세포의 Th1 또는 Th2 개체군의 기능을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 능력이다. 건선, 아토피성 피부염, 탈모증을 비롯한 많은 피부 질환 및 피부암은 이들 Th 부분 집합세포의 활성차이에 의해 영향을 받는 것으로 보인다.
두 가지 형태의 Th 부분 집합세포는 뮤린 모형에서 특성화가 잘 이루어져 있으며, 활성시에 방출하는 사이토킨으로 정의한다. Th1 부분 집합세포는 IL-2, IFN-r, 종양괴사인자를 분비하고, 식세포 활성화 및 지연형 초민감성 반응을 매개한다. Th2 부분 집합세포는 B 세포 활성화를 자극하는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10을 방출한다. Th1 및 Th2는 서로를 억제하는데, IL-4는 Th1-형 반응을 억제하고, IFN-r은 Th2-형 반응을 억제한다. 유사한 Th1 및 Th2 부분집합은 사람에게도 발견되었는데, 뮤린모형에서 관찰된 것과 동일한 사이토킨을 방출한다. 특히, 아토피성 사람 림프구의 T-세포 클론 대부분이 IL-4를 생산하는 뮤린 Th2와 유사한 반면, IFN-r은 클론을 거의 만들지 않는다. 따라서, Th2 부분집합의 선택적 발현 및 연이은 IL-4의 생산, IFN-r-생성 세포의 수준감소는 IgE 생산의 우선적인 강화를 유도한다. Th1-형 면역반응의 증폭은 결핵, 유육종증, 천식, 알레르기 비염, 폐암과 같은 호흡기계통 질환을 비롯하여 많은 질환에서 질병상태의 반전에 중심이 된다.
불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 유도한 많은 화합물은 항원 및 항항원체 특성을 갖는데, 이런 특성은 Th1-형 면역반응을 강화하는 역할을 한다. 본 발명의 방법은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및/또는 이의 배양 여과물에서 얻은 하나 또는 복수의 이들 항원 및 항항원체를 화합물을 이용하여, 환자에서 T 세포의 면역활성을 재유도한다. 이런 화합물의 혼합물은 특히, 이 글에서 밝힌 방법에서 효과적이다. 모든 미코박테리아(Mycobacteria)가 교차-반응항원을 보유한다는 것은 이미 공지된 것이지만, 이들이 공통적으로 항항원체 화합물을 함유하고 있는 지는 알려져 있지 않다. 아래에서 본 바와 같이, 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 변형(지질 및 당지질 제거)된 형태는 다수의 다른 미코박테리아(Mycobacteria) 종이 공유하지 않는 Th1-형 항항원체 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 자체 배양 여과물에서 화합물을 생산하고, 상기 화합물은 배양 여과물에서 발견되는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 및 다른 출처의 항원에 대한 면역반응을 또한 증폭시키는 것으로 밝혀졌다.
한 측면에서, 본 발명은 환자에서 호흡기계통 및/또는 폐 질환(예, 결핵, 유육종증, 천식, 알레르기 비염, 폐암)의 면역요법을 위한 방법을 제공하여, Th1-형 면역반응을 강화시킨다. 한 구체예에서, 조성물은 기도의 점막표면으로 직접 전달하여 폐에 이르게 한다. 하지만, 조성물은 또한 피내 또는 피하경로로도 투여한다. 이런 방법에 유용하게 사용되는 조성물은 다음의 성분을 하나이상 포함한다: 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포; 미코박테리움 바카이(M. vaccae)배양 여과물; 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이 세포(DD-M. vaccae); 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포와 미코박테리움 바카이(M. vaccae)배양 여과물에 존재하거나 이들로부터 유도된 화합물. 아래에서 설명한 바와 같이, 이런 조성물을 투여는 특이적인 T 세포 면역 반응 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)감염으로부터 보호강화를 유도하고, 또한 천식의 치료에도 효과적이다. 천식과 같은 질환의 치료에서, 이들 조성물의 정확한 작용방식은 알 수 없지만, 이들은 천식-유도 Th2 면역반응을 억제하는 것으로 여겨진다.
이 글에서, "호흡기계통"은 폐, 비강경로, 기도, 기관지를 의미한다.
이 글에서, "폐로 이르는 또는 폐에 위치한 기도"에는 비강경로, 입, 편도선 조직, 기도, 기관지가 포함된다.
이 글에서, "환자"는 항온 동물, 가급적 사람을 의미한다. 이런 환자는 질환으로 고통받거나 또는 감지가능한 질병이 없을 수도 있다. 다시 말하면, 본 발명 방법은 질병의 예방 또는 치료를 위한 보호면역을 유도하기 위하여 이용한다.
다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 피부 질환, 예를 들면, 건선, 아토피성 피부염, 탈모증, 피부암의 면역요법을 위한 방법을 제공하는데, 여기서 면역요법 작용제는 Th1-형 면역반응에 대한 T 세포의 기능을 변경하여 기존의 면역활성 상태를 변형하거나 재조정하기 위하여 사용한다. 본 발명 방법에 유용하게 이용하는 조성물은 다음의 성분 하나이상으로 이루어진다: 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포; 미코박테리움 바카이(M. vaccae)배양 여과물; 변형된 미코박테리아(Mycobacteria)세포; 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포와 미코박테리움 바카이(M. vaccae)배양 여과물에 존재하거나 이들로부터 유도된 구성성분 및 화합물.
이 글에서, "불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)"는 아래의 실시예 7에서 자세히 밝힌 바와 같이 열에 의해, 또는 2.5 megarad 일회 분량의60코발트와 같이 방사선 처리를 가하여 죽인 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 의미한다. 이 글에서, "변형된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)"에는 지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포, 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포, 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(DD-M. vaccae)세포가 포함된다.
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 제제 및 이의 화학적 조성물은 아래의 실시예 7에서 밝힌다. 아래에서 자세히 밝힌 바와 같이, 본 발명자들은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 당지질성분을 제거하면, 자연 킬러(NK)세포에서 인터페론-감마 생산을 자극하는 분자성분이 제거되고, 이를 통해 다수의 해로운 부작용을 유발하는 사이토킨의 비-특이적 생산을 상당부분 감소시킬 수 있다는 것을 발견했다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 또는 이의 변이체의 하나이상의 면역원성 영역, 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질의 하나 이상의 항항원체 영역으로 이루어지는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구체예에서, 이런 폴리펩티드는 항원 또는 이의 변이체의 면역원성 영역으로 이루어지는데, 여기서 상기 항원에는 SEQ ID NO: 1-4, 9-16, 18-21, 23, 25, 26, 28, 29, 44, 45, 47, 52-55, 63, 64, 70, 75, 89, 94, 98, 100-105, 109, 110, 112, 121, 124, 125, 134, 135, 140, 141, 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 201, 203, 205, 207에서 선택되는 서열이 포함된다.
이 글에서, "폴리펩티드"는 전장 단백질(즉, 항원)을 비롯하여 임의 길이의 아미노산 사슬을 포괄하는데, 여기서 상기 아미노산 잔기는 펩티드 공유결합으로 연결된다. 따라서, 상기 항원중 하나의 면역원성 영역으로 이루어진 폴리펩티드는 완전히 면역원성 영역으로만 이루어지거나 또는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 추가의 서열은 고유 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항원 또는 이종에서 유도하는데, 이런 서열은 면역원성이 되기도 한다. 아래에 자세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)세포 또는 배양 여과물로부터 분리하거나, 또는 합성 또는 재조합 수단으로 만들 수 있다.
이 글에서, "면역원성"은 환자, 예를 들면 사람에서, 또는 생물학적 샘플에서 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 의미한다. 특히, 생물학적 샘플에서 면역원성 항원은 세포 증식, 인터루킨-12 생산 또는 인터페론-r 생산을 촉진할 수 있는데, 상기 샘플은 T 세포, NK 세포, B 세포에서 선택되는 하나 또는 복수의 세포로 이루어지고, 이때, 상기 세포는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)-면역개체로부터 유도한다. 면역원성 항원에 노출시키면, 일반적으로 면역기억이 이루어지는데, 이런 항원에 재-노출되면, 더 신속하고 향상된 반응이 이루어진다.
여기에서 설명하는 것과 같은 항원의 면역원성 부분은 Paul. Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp.243-247에서 요약한 것과 같은 공지의 기술을 이용하여 준비하고, 확인할 수 있다. 이와 같은 기술에는 면역원성 성질에 대한 고유 항원 또는 단백질의 폴리펩티드 영역을 스크리닝하는 것을 포함한다. 여기에서 설명하는 대표적인 증식 및 사이토킨 생산 검사를 이 스크리닝에 이용할 수 있다. 항원의 면역원성 부분은 이와 같은 대표적인 검사에서, 전장의 항원에 의해 발생되는 것과 실제 유사한 면역 반응(가령, 세포 증식, 인터페론-γ생산 또는 인터루킨-12 생산)을 만든다. 환언하면, 항원의 면역원성 부분은 여기에서 설명을 하는 모델 증식 검사에서 전장 항원에 의해 유도되는 증식의 적어도 약 20%, 적절하게는 약 65%, 가장 적절하게는 약 100%를 만들 수 있다. 항원의 면역원성 영역은 여기에서 설명을 하는 모델 증식 검사에서 전장 항원에 의해 유도되는 인터페론-감마 또는 인터루킨-12 생산의 적어도 약 20%, 적절하게는 약 65%, 가장 적절하게는 약 100%를 만들 수 있다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항항원체는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물에서 발견되는 화합물로, 비-특이적으로 면역반응을 촉진한다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질의 경우에, 이들의 기억반응은 Th1-형 면역을 선호한다. 항항원체는 또한, 생물학적 샘플에서 인터루킨-12 또는 인터페론-r 생산을 촉진할 수 있는데, 상기 샘플은 T 세포, NK 세포, B 세포, 식세포에서 선택되는 하나 또는 복수의 세포로 이루어지고, 이때 상기 세포는 건강한 개체로부터 유도한다. 항항원체는 세포 증식을 촉진할 수도 있고, 하지 않을 수도 있다. 이런 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항항원체에는 예를 들면, SEQ ID NO: 89, 117, 160, 162 또는 201에서 자세히 설명한 서열로 이루어진 폴리펩티드가 포함된다.
이 글에서, "폴리뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중-가닥 중합체를 의미하는데, 여기에는 DNA 및 상응하는 RNA 분자(HnRNA 및 mRNA 분자 포함, 센스 및 앤티-센스 가닥 둘 모두), cDNA, 게놈 DNA, 재조합 DNA가 포함되고, 또한 전체 또는 부분 합성된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. HnRNA 분자는 인트론을 보유하고, 일반적으로 DNA 분자와 일-대-일로 대응한다. mRNA 분자는 인트론이 잘려나간 DNA 분자 및 HnRNA와 상응한다. 폴리뉴클레오티드는 전체 유전자 또는 이의 임의일부로 이루어진다. 작동가능 앤티-센스 폴리뉴클레오티드는 상응하는 폴리뉴클레오티드의 단편으로 이루어지고, 따라서, "폴리뉴클레오티드"의 정의에는 이와 같은 작동가능 앤티-센스 단편이 모두 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한, 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포괄한다. 이 글에서, "변이체"에는 본 발명의 서열과 적어도 40%, 좀더 적절하게는 약 60%, 이 보다 좀더 적절하게는 75%, 가장 적절하게는 90% 상동한 잔기(뉴클레오티드 또는 아미노산)를 갖는 임의 서열이 포함된다. 상동한 잔기의 확률은 비교할 두 서열을 정렬시키고, 정렬된 영역상의 동일한 잔기수를 결정하고, 상기 개수를 본 발명의 전장서열로 나누고, 결과에 100을 곱하여 결정한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 정렬하고, 공개적으로 얻을 수 있는 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 다른 폴리뉴클레오티드와 특정 영역에서 상동한 뉴클레오티드의 비율을 결정한다. 폴리뉴클레오티드 서열을 배열하고, 이들의 유사성을 확인하기 위한 두 가지 알고리즘 예는 BLASTN과 FASTA 알고리즘이다. 폴리펩티드 서열의 유사성은 BLASTP 알고리즘을 이용하여 검사할 수 도 있다. BLASTN과 BLASTP 소프트웨어는 NCBI FTP 서브(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)에서 구할 수 있다. BLASTN 알고리즘 버전 2.0.4[Feb-24-1998]은 본 발명에 따른 변이체의 결정에 사용하기 적절하다. BLASTN과 BLASTP를 비롯하여 BLAST 알고리즘 페밀리의 용도는 NCBI의 웹사이트인 URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html 및 Altschul. Stephen F., et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 밝힌다. 컴퓨터 프로그램 FASTA는 인터넷상의 ftp 사이트 ftp://virginia.edu/pub/fasta/에서 얻을 수 있다. 버전 2.0u4(1996, 2)는 본 발명에 따른 변이체의 결정에 사용하기 적절하다. FASTA 알고리즘의 용도는 W.R. Person and D.J.Lipman, "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448(1988) 및 W.R. Person, "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", methods in Enzymology 183:63-98(1990)에서 밝힌다.
다음의 변수는 BLASTN을 이용한 정렬과 유사성의 결정에 적절한데, 상기 정렬과 유사성은 E 수치와 확률 상동성의 한 원인이 된다: 유닉스 운영체제: blastall -p blas수 -d embldb -e 10 -G 1 -E 1 -r 2 -v 50 -b 50 -i queryseq-o 결과; 변수 초기값
-p 프로그램 이름[명단]
-d 데이터베이스[명단]
-e 기대값(E)[실수]
-G 간격을 개시하기 위한 값(0은 초기동작을 야기한다)[정수]
-E 간격을 확대하기 위한 값(0은 초기동작을 야기한다)[정수]
-r 뉴클레오티드 쌍에 대한 보상값(blastn)[정수]
-v 한-줄 기재수(V)[정수]
-b (B)를 보이는 정렬수[정수]
-i 쿼리 파일[파일 인]
-o 선택적 BLAST 리포트 산출 파일[파일 아웃]
BLAST의 경우에, 다음의 변수가 바람직하다: blastall -p blastp -d swissprotdb -e 10 -G 1 -E 1 -v 50 -b 50 -i queryseq-o 결과
-p 프로그램 이름[명단]
-d 데이터베이스[명단]
-e 기대값(E)[실수]
-G 간격을 벌리기 위한 값[정수]
-E 간격을 확대하기 위한 값[정수]
-v 한-줄 기재수(v)[정수]
-b (b)를 보이는 정렬수[정수]
-I 쿼리 파일[파일 인]
-o 선택적 BLAST 리포트 산출 파일[파일 아웃]
BLASTN, BLASTP, FASTA 또는 유사한 알고리즘에 의해 만들어진 쿼리서열에 의한 하나 또는 복수의 데이터베이스에 대한 "적중(hits)"을 통해 서열을 정렬하고, 이의 유사영역을 확인한다. 적중은 유사정도 및 중복되는 서열수로 정한다. 데이터베이스 서열에 의한 비교조회에서, 일반적으로 쿼리서열중 일부 길이의 서열에서만 중복이 나타난다.
BLASTN 및 FASTA 알고리즘에서는 또한 정렬에 대한 "기대"값이 나온다. 기대값(E)은 특정 크기의 데이터베이스를 검색하는 경우에, 특정수의 인접서열상에서 적중 수치의 우연한 관찰을 "기대"할 수 있다는 것을 의미한다. 기대값은 선호되는 EMBL 데이터베이스와 같은 데이터베이스에 대한 적중이 실제적으로 유사값을 나타내는지를 결정하기 위한 유의성 척도로 사용한다. 가령, 적중에 지정된 0.1의 E 수치는 EMBL 데이터베이스 크기의 데이터베이스에서 우연히 유사한 수치를 갖는 서열의 정렬된 영역과 0.1의 쌍을 기대할 수 있는 것으로 해석한다. 이런 기준에서, 서열의 정렬되고 대합된 영역은 90%의 동일가능성을 갖는다. 정렬되고 대합된 영역에 대해 0.01 미만의 E 수치를 갖는 서열의 경우, EMBL 데이터베이스에서 우연히 쌍이 있을 가능성은 BLASTN 또는 FASTA 알고리즘을 이용하는 경우 1% 미만이다.
한 구체예에서 따라, 본 발명의 각 폴리뉴클레오티드에 관하여 "변이" 폴리뉴클레오티드는 가급적 본 발명의 각 폴리뉴클레오티드보다 적거나 동일한 수의 핵산을 갖는 서열로 이루어지고, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 비교하는 경우 0.01 미만의 E 수치를 보인다. 다시 말하면, 변이 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 동일가능성을 갖는 임의의 서열이고, 초기변수로 설정된 BLASTN 또는 FASTA를 이용하는 경우 0.01 미만의 E 수치를 갖는다. 적절한 구체예에서, 변이 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 99% 이상의 동일가능성을 갖는 서열이고, 초기변수로 설정된 BLASTN 또는 FASTA를 이용하는 경우 0.01 미만의 E 수치를 갖는다.
변이 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 엄격한 조건하에서 언급된 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화된다. 이 글에서, "엄격한 조건"은 6X SSC, 0.2% SDS 용액에서 선세척; 65℃, 6X SSC, 0.2% SDS에서 하룻밤동안 혼성화; 이후 1X SSC, 0.1% SDS, 65℃에서 30분동안 2번 세척 및 0.2X SSC, 0.1% SDS, 65℃에서 30분동안 2번 세척을 의미한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 일부 및 다른 변이체는 합성 또는 재조합 방법에 의해 만들 수 있다. 약 100개 아미노산 이하, 일반적으로 약 50개 아미노산 이하의 합성 폴리펩티드는 당분야자가 공지의 기술을 이용하여 만들 수 있다. 가령, 이와 같은 폴리펩티드는 Merrifield 고형상 합성 방법과 같은 상업적으로 이용할 수 있는 고형-상 기술을 이용하여 합성을 할 수 있는데, 이때 아미노산은 길어지는 아미노산에 연속하여 첨가할 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963). 자동화된 폴리펩티드의 합성 장비는 Perkin Elmer/Applied BioSystems, Inc(Foster City, CA)와 같은 시판되는 것을 이용할 수 있고, 제조업자의 지시에 따라 작동할 수 있다. 올리고뉴클레오티드-부위 특이적인 돌연변이발생과 같은 표준 돌연변이 기술을 이용하여 고유 항원의 변이체를 만들 수 있다. 절두형 폴리펩티드를 만들기 위해 표준 기술을 이용하여 DNA 서열의 일부를 제거할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 단백질의 N-단부에는 시그널(또는 리더)서열에 결합되어 있을 수 있는데, 이는 단백질 이전에 관계하는 것으로 동시에 해독되거나 나중에 해독된다. 폴리펩티드에는 또한 폴리펩티드(poly-His)의 합성, 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위한 또는 고형 서포터에 폴리펩티드를 잘 결합시키도록 하기 위한 링크 또는 다른 서열이 결합되어 있을 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에는 이뮤노글로블린 Fc 부분이 결합되어 있을 수 있다.
일반적으로 미코박테리움 바카이(M. vaccae)항원 및 이와 같은 항원을 인코드하는 DNA 서열은 다양한 공정을 이용하여 준비할 수 있다. 예를 들면, 가용성 항원을 하기에서 설명하는 것과 같이, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로부터 분리할 수 있다. 발현 벡터에 항원을 인코드하는 DNA 서열을 삽입하고, 적절한 숙주에서 항원을 발현시켜 재조합적으로 항원을 생산할 수도 있다. 당업자에게 공지된 임의 발현 벡터를 이용할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질변환 또는 형질감염된 임의 적절한 숙주 세포에서 발현을 실행할 수 있다. 적절한 숙주 세포로는 원핵세포, 이스트 및 고등 진핵 세포를 포함한다. 바람직하게는 이용되는 숙주세포는 대장균(E. coli), 결핵균, 곤충, 이스트 또는 포유류 세포주 가령 COS 또는 CHO등이 된다. 이와 같은 방법으로 발현된 DNA 서열은 자연 발생 항원, 자연 발생 항원의 일부분 또는 이의 다른 변이체를 인코드할 수 있다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원을 인코드하는 DNA 서열은 분리한 가용성 항원의 부분적인 아미노산 서열에서 유도한 축중(degenerate) 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 DNA 서열에서 적절한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 적절한 축중 올리고뉴클레오티드는 고안 합성할 수 있으며, 스크리닝 방법은 Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989을 참고로 한다. 하기에서 설명하는 것과 같이, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여, cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 핵산 프로브를 분리한다. 라이브러리 스크린은 분리된 프로브를 이용하여 실행할 수 있다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원을 인코드하는 DNA 분자는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원에 대해 특이적으로 형성된 항-혈청(가령, 토끼 또는 원숭이)과 적절한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 발현 라이브러리를 스크리닝하여 분리할 수 있다.
준비하는 방법에 관계없이, 여기에서 설명하고 있는 항원은 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 가진다. 좀더 구체적으로는 항원은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)면역 개체에서 유도한 T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포에서 세포 증식 또는 사이토킨 생산(가령, 인터페론-감마 또는 인터페론-12 생산)을 유도하는 능력이 있다. 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)면역 개체는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대해 효과적인 T 세포 반응을 가지고 있어서, 결핵 발생에 저항성을 가지는 것으로 간주되는 개인을 말한다. 이와 같은 개인은 결핵 단백질(PPD)에 대한 피부 내 테스트반응에 강한 양성(가령, 10㎜이상 경화된 경우), 결핵 감염의 임의 증상이 없는 것으로 확인할 수 있다. T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포에서 세포 증식 또는 사이토킨 생산을 검사하는 것은 하기에서 설명하는 과정으로 실행할 수 있다. 항원에 대한 면역 반응을 평가하는데 이용할 수 있는 세포 형태를 선택하는 것은 원하는 반응에 따라 달라진다. 가령, 인터루킨-12 생산은 B 세포 또는 대식세포를 포함하는 준비물을 이용하여 평가할 수 있다. 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)면역 개체로부터 유도한 T세포, NK 세포, B세포 및 대식세포는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 준비할 수 있다. 예를 들면, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 준비물은 추가 성분 세포를 분리하지 않고도 이용할 수 있다. PBMCs는 FicollTM(Winthrop Laboratories, NY)을 이용하여 밀도 원심분리에 의해 준비할 수 있다. 여기에서 설명하는 검사에 이용되는 T 세포는 PBMCs에서 바로 정제할 수 있다. 또는 결핵균 단백질에 대한 T 세포주 반응성 또는 개별 결핵균속 단백질에 반응성이 있는 T세포 클론을 이용할 수 있다. 이와 같은 T 세포 클론은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)-면역 개체에서 얻은 PBMCs를 2-4주간 결핵균 단백질로 배양을 하여 만들 수 있다. 이로써 결핵균 단백질-특이적인 T 세포만을 연장시켜 이와 같은 세포만으로 이루어진 세포주가 된다. 이들 세포를 당분야에 공지된 방법을 이용하여 클론시키거나 개별 단백질을 이용하여 테스트를 하여 좀더 정확하게 개별 T 세포 특이성을 정의할 수 있다.
일반적으로, 준비하는 방법에 무관하게, 여기에서 설명하는 폴리펩티드는 실제 순수한 형태로 만든다. 바람직하게는 폴리펩티드는 적어도 약 80%, 좀더 바람직하게는 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 하기에서 설명하는 특정 구체예에서, 실제 순수한 폴리펩티드가 제약학적 조성물 또는 백신에 포함되어, 여기에서 설명하는 하나이상의 방법에 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 제1과 제2 신규한 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질 또는 본 발명의 폴리펩티드와 38kD 항원과 같은 공지의 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원(in Andersen and Hansen, Infect. Immun. 57:2481-2488, 1989)으로 구성된 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질에는 또한 제1과 제2 폴리펩티드사이에 링크 펩티드를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질을 인코드하는 DNA 서열은 공지의 재조합 DNA 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터내에 제1과 제2 폴리펩티드를 인코드하는 별개의 DNA 서열을 합체하여 만들 수 있다. 제 1 폴리펩티드를 인코드하는 DNA서열의 3' 말단은 펩티드 링커를 사용하여 또는 링커없이 제 2 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열의 5'말단에 결찰시켜 서열의 리딩 프레임이 상안에 있게되어 두 개 DNA 서열의 mRNA 해독을 하여 한 개 융합 단백질로 하고, 이 융합 단백질은 제1과 제2 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있다.
펩티드 링크 서열을 이용하여, 각 폴리펩티드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴드할 수 있도록 충분한 거리로 제1과 제2 폴리펩티드를 떨어지게 한다. 이와 같은 펩티드 링크 서열은 당분야에 공지의 표준 기술을 이용하여 융합 단백질에 포함시킬 수 있다. 적절한 펩티드 링크 서열은 다음의 인자에 근거하여 선택할 수 있는데; (1) 유연성있는 연장된 모양을 채택하는 능력; (2) 제1과 제2 폴리펩티드에 있는 기능을 하는 에페토프와 상호작용을 할 수 있는 제 2 구조를 채택하는 능력; (3) 폴리펩티드에서 기능을 하는 에피토프와 반응을 할 수 있는 소수성 또는 전하를 가지는 잔기가 없는 것. 적절한 펩티드 링크 서열에는 Gly, Asn, Ser 잔기를 포함한다. Thr, Ala와 같은 중성 아미노산에 근접한 다른 아미노산이 링크 서열에 이용될 수 있다. 링크로써 유용하게 이용을 할 수 있는 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 및 미국 특허 4,935,233; 4,751,180에서 상술하는 것을 포함한다. 링크 서열은 길이가 1 내지 약 50개 아미노산 잔기가 된다. 제1과 제2 폴리펩티드에 비-필수적인 N-말단 아미노산 부분을 가지고 있어, 기능적 도메인을 분리할 수 있고, 공간적인 방해가 없는 경우에는 펩티드 링크 서열이 필요없다. 융합 단백질을 인코드하는 결찰된 DNA를 당분야에 공지된 기술을 이용하여 절한 발현 시스템안에 클론시킨다.
하기에서 설명하는 것과 같이, 발명자들은 본 발명에 따른 열처리로 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 이용하여, T 세포 및 NK 세포를 활성화시키고; 사람의 PBMC에서 사이토킨(특히 사이토킨의 Th1류) 생산을 자극시키고; 수지상 세포 및 단세포에서 공동-자극 분자의 발형을 강화시켜, 활성을 강화시키게 되고; 수지상 세포 성숙 및 기능을 강화시킬 수 있다고 설명한다. 또한 발명자들은 본 발명의 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질 GV-23의 면역학적 특성과 공지의 Th1-유도 항항원체간에 유사성을 설명하였다. 따라서, GV-23를 이용하여 Th1 면역 반응을 강화시키는 것과 관련된 질병 치료에 이용할 수 있다. 이와 같은 질환을 예로 들면, 알레르기 질환(가령, 천식, 습진), 자가면역 질환(가령, 전신 홍반성 낭창), 감염성 질환(결핵, 나병)등이 포함된다. 또한, GV-23을 수지상 세포 또는 NK 세포 강화물질로 이용하여, 면역 결핍 질환 가령, HIV을 치료할 수 있고, 화학요법과 같은 면역억제성 항암요법을 받은 후에, 암에서 종양 세포에 대한 면역 반응 및 세포독성 반응을 강화시킬 수 있다.
본 발명의 치료 방법을 이용하기 위해, 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물질, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 폴리펩티드, 융합 단백질(또는 이와 같은 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드)을 일반적으로 제약학적 조성물 또는 백신에 포함시키는 것이다. 제약학적 조성물은 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물질, 변형된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 이의 세포 여과물질에서 존재하는 또는 유도된 화합물에서 선택된 한가지 이상의 성분과 생리학적으로 수용가능한 담체로 구성된다. 백신은 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물질, 변형된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 이의 세포 여과물질에서 존재하는 또는 유도된 화합물에서 선택된 한가지 이상의 성분과 비-특이적인 면역 반응 증강물질로 구성될 수 있다. 이와 같은 제약학적 조성물 및 백신에는 상기 논의된 바와 같이 융합 단백질에 결합하게 되는 또는 별도의 폴리펩티드에 존재하게 되는 다른 미코박테리아균 항원을 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 백신에는 전술한 것과 같은 하나이상의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA을 포함하고 폴리펩티드는 즉시 생성된다. 이와 같은 백신에서 DNA는 당분야에 공지된 다양한 수송 시스템내에 존재할 수도 있는데, 예를 들면 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스성 발현 시스템을 포함한다. 적절한 핵산 발현 시스템에는 환자에서 발현하는데 필수적인 DNA 서열(예를 들면 적절한 프로모터 및 종료 시그널)을 포함한다. 박테리아 운반 시스템은 세포 표면에서 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하는 세균(가령 Bacillus-Calmette-Guerrin)을 투여하는 것이다. 적절한 구체예에서, DNA는 바이러스성 발현 시스템(가령 백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 도입시킬 수 있는데, 이는 비-병인성 또는 결손된 복제 컴피턴스 바이러스를 이용하는 것이다. 이와 같이 발현 시스템안에 DNA를 결합시키는 기술은 당분야에 공지되어 있다. Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 and reviewed by Cohen, Science 259:1691-1692, 1993에서 설명하는 것과 같이 DNA는 "naked"일 수도 있다. naked DNA의 수용을 증가시키기 위해서는 세포안으로 효과적으로 이송될 수 있는 생분해가능한 비드에 DNA를 코팅시키면 된다.
상기에서 설명하고 있는 DNA 백신은 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기에서 설명한 38kD와 같은 공지의 결핵 항원과 동시에 또는 연속적으로 투여할 수도 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA를 투여한 후에, 항원을 투여하여 백신의 보호성 면역 효과를 강화시킨다.
개인별로 투여 경로 및 빈도, 약량등이 달라질 수 있고, BCG를 이용하여 면역주사하는데 현재 이용되는 것과 비슷하다. 일반적으로 제약학적 조성물 및 백신은 주사(가령, 경피, 근육, 정맥 또는 피하 주사), 비강(흡입에 의해) 또는 구강으로 투여할 수 있다. 1-36주간 1 내지 3 약량이 투여될 수 있다. 적절하게는 3-4개월 간격으로 3약량이 투여되고, 그 다음에는 주기적으로 부스터(booster) 투여를 할 수 있다. 개인 환자에 적합한 다른 프로토콜을 이용할 수도 있다. 전술한 것과 같이 투여를 할 경우에, 적절한 약량은 적어도 1-2년 동안 환자를 결핵균 감염으로부터 보호할 수 있도록 충분한 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드 또는 DNA의 양을 말한다. 일반적으로 약량에 있는 폴리펩티드의 양은 숙주 체중㎏당 약 1pg 내지 약 100㎎, 적절하게는 약 10pg 내지 약 1㎎, 가장 적절하게는 약 100pg 내지 약 1㎍ 범위가 된다. 적절한 약량 범위는 환자의 체구에 따라 다양하게 되는데, 일반적으로 약 0.1㎖ 내지 약 5㎖범위가 된다.
한 구체예에서, 제약학적 조성물 또는 백신은 폐로 통하는 또는 폐내에 기도의 점막 표면으로 운반하는데 적절한 형태가 된다. 예를 들면, 제약학적 조성물 또는 백신을 액체 조성물에 현탁시켜, 현재 천식 환자에서 이용되는 것과 유사한 에어로졸 또는 약액 분무 장치를 이용하여 환자에 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제약학적 조성물 또는 백신은 주사(피부내로, 근육으로, 정맥 또는 피하로) 또는 구강으로 제공할 수 있는 적절한 형태가 된다.
본 발명의 제약학적 조성물에는 당분야에 공지된 임의 적절한 담체를 이용할 수 있는데, 담체 형태는 투여 방식에 따라 달라진다. 피하 주사와 같은 장관외 투여의 경우에, 담체는 적절하게는 물, 염, 알코올, 지방, 왁스 및 완충액으로 구성된다. 경구 투여의 경우에는 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아레이트 마그네슘, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오스, 포도당, 슈크로즈 및 탄산 마그네슘등과 같은 고형 담체를 이용할 수도 있다. 생분해가능한 미소구(가령, 폴리라틱 갈락티드)등을 본 발명의 제약학적 조성물의 담체로 이용할 수도 있다. 적절한 생분해가능한 미소구는 미국 특허 4,897,268; 5,075,109에서 설명을 하고 있다.
본 발명의 백신에 임의의 다양한 항항원체를 이용하여, 비특이적인 면역반응을 강화시킬 수 있다. 대부분의 항항원체에는 수산화 알루미늄 또는 미네랄 오일과 같은 신속한 대사과정으로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질; 그리고 하기에서 논의되는 것과 같이, 지질 A(lipid A), 보르데텔라 페루투시스(Bordetella pertussis), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M.tuberculosis) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 같은 비-특이적인 면역 반응 자극물질을 포함한다. 적절한 항항원체로는 플루언트 인컴플리트 항항원체(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 플루언트 컴플리트 항항원체(Freund's Complete Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI), 머랙 항항원체(Merck Adjuvant 65)(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)등이 시판되고 있다. 다른 적절한 항항원체에는 알룸, 생분해가능한, 미소구, 모노포스포릴 리피드 A, Quil A등을 포함한다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 피부 테스트를 이용하여 결핵을 진단하기 위해 상기 설명하고 있는 하나이상의 폴리펩티드를 이용하는 방법을 제공한다. 여기에서 사용되는 바와 같이, "피부 테스트"는 환자에서 직접 실행하는 것으로써, 상기에서 설명하는 하나이상의 폴리펩티드를 피부 내로 투여한 후에, 지연된 형태의 과민성(DTH) 반응(가령, 부품, 빨개지거나 또는 피부염)을 측정하는 것이다. 적절하게는 반응은 주사후 적어도 48시간 바람직하게는 48-72시간후에 측정을 한다.
DTH 반응은 세포-중개된 면역 반응으로 시험 항원(가령, 이용되는 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 면역원성 부분)에 이미 노출된 환자에게서 크다. 반응은 룰러(ruler)를 이용하여 시각적으로 측정을 할 수 있다. 일반적으로, 약 0.5㎝ 이상, 바람직하게는 직경이 1.0㎝인 경우에 결핵 감염을 알리는 양성 반응이 된다.
피부 테스트에 이용하는 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 설명한 것과 같이 폴리펩티드, 생리학적으로 수용가능한 담체로 구성된 제약학적 수용가능한 조성물의 형태로 조제한다. 이와 같은 조성물은 일반적으로 하나이상의 폴리펩티드를 약 1㎍ 내지 100㎍, 적절하게는 10㎍ 내지 50㎍을 0.1㎖ 용적 안에 포함한다. 적절하게는 이와 같은 제약학적 조성물에 이용되는 담체는 페놀 또는 Tween 80TM과 같은 보존제를 포함하는 염 용액이 된다.
적절한 구체예에서, 피부 테스트에 이용되는 폴리펩티드는 반응하는 시간동안에 주사부위에 남아 있을 수 있는 충분한 크기가 된다. 일반적으로, 길이가 적어도 9개인 아미노산으로 된 폴리펩티드이면 충분하다. 폴리펩티드는 또한 주사후 한 시간이내에 대식세포 또는 수지상 세포에 의해 적절히 분해되어 T-세포에 제공된다. 이와 같은 폴리펩티드에는 상기 서열 또는 다른 면역원성 또는 비-면역원성 서열이 하나이상 반복된 것을 포함할 수 있다.
또 다른 특징에서, 상기 하나이상의 폴리펩티드 단독 또는 복합한 것을 이용하여 생물학적 샘플내에서 결핵균 감염을 감지하는 방법을 제공한다. 다중 폴리펩티드를 이용하는 구체예에서, 38kD 항원과 같이 여기에서 특징적으로 명기하지 않은 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 여기에서 이용되는 것과 같이, "생물학적 샘플"은 환자로부터 취한 임의 항체를 포함하는 샘플이다. 바람직하게는 샘플은 전체 혈액, 가래, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수 또는 뇨등이 된다. 좀더 적절하게는 샘플은 환자 또는 혈액 공급소에서 구한 혈액, 혈청, 혈장이 될 수 있다. 하기에서 설명하는 검사에서 폴리펩티드를 이용하여 예정된 절단값에 대해 샘플에서 폴리펩티드에 대한 항체의 유무를 결정한다. 이와 같은 항체가 존재한다는 것은 결핵 감염이 있다는 것을 의미한다.
한 가지 이상의 폴리펩티드를 이용하는 구체예에서, 이용된 폴리펩티드는 상보적인 것이 바람직하다(가령, 한가지 성분의 폴리펩티드는 또 다른 성분의 폴리펩티드에 의해 감지되지 않는 감염이 있는 샘플에서 감염을 감지할 수 있는 경향이 있다). 상보적인 폴리펩티드는 결핵균(Mycobacterium)에 감염된 것으로 알려진 환자들로부터 수득한 혈청 샘플을 평가하기 위해 개별적으로 각 폴리펩티드를 이용하여 상보적인 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 각 폴리펩티드로 샘플 테스트 양성(하기에서 설명하는 것과 같음)을 결정한 후에, 테스트하는 대부분의 샘플 또는 모든 샘플에서 감염을 감지할 수 있는 두 가지 이상의 폴리펩티드 복합물을 제조한다. 가령, 결핵에 감염된 개인으로부터 혈청의 25-30%는 임의 단일 단백질 가령, 상기에서 설명하는 38kD 항원에 대한 항체에 음성이다. 상보적인 폴리펩티드는 따라서, 38kD 항원과 복합사용하여 진단 테스트의 감응성을 개선시킨다.
당분야에서는 샘플내에 항체를 감지하는 하나이상의 폴리펩티드를 이용하는 다양한 검사 포맷이 공지되어 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 적절한 구체예에서, 검사는 샘플에 있는 항체에 결합하고 항체를 제거하는 고형 서포트에 고정된 폴리펩티드를 이용하는 것과 관계있다. 결합된 항체는 리포터 기를 포함하는 감지 시약을 이용하여 감지할 수 있다. 적절한 감지 시약에는 항체/폴리펩티드 복합체와 리포터 기로 라벨된 자유 폴리펩티드(가령, 반-경쟁성 검사)에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 또는, 경쟁성 검사를 이용할 수 있는데, 폴리펩티드에 결합하는 항체는 리포터기로 라벨을 할 수 있고, 이는 샘플과 항원을 배양한 후에 고정된 항원에 결합을 할 수 있다. 샘플에 있는 성분이 폴리펩티드에 라벨된 항체가 결합을 방해하는 정도는 고정된 폴리펩티드에 샘플의 반응성 정도를 나타낸다.
고형 서포트는 항원이 부착할 수 있는 임의 고형 물질이 될 수 있다. 적절한 물질은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 고형 테스트는 미량적정 플레이트 또는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 적절한 막에서 테스트가 잘 된다. 또는 서포트는 유리, 유리섬유, 라텍스 또는 폴리스테린 또는 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 재질과 같은 비드 또는 디스크가 된다. 서포트는 미국 특허 5,359,681에서 공지된 것과 같은 자석 입자 또는 광섬유 센서등이 될 수 있다.
폴리펩티드는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 고형 서포트에 결합될 수 있다. 본 발명의 내용에서, "결합된"이란 용어는 흡착과 같은 비공유결합 및 공유 결합을 말하는데, 이는 서포트에 있는 기능기와 항원간에 EH는 교차 결합제에 의해 연결되는 것을 말한다. 흡착에 의해 미량적정 판 또는 막에 결합되는 것이 바람직하다. 이와 같은 경우에, 적정 시간동안에 고형 서포트와 폴리펩티드를 포함하는 완충액을 접촉시켜 흡착이 이루어질 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양해질 수 있는데, 일반적으로 약 1시간 내지 1일이 된다. 일반적으로 약 10ng 내지 1㎍, 바람직하게는 100ng범위의 폴리펩티드와 플라스틱 미량 적정판의 웰과 접촉하는 시간은 적정량의 항원이 결합하는데 충분한 시간이 된다.
고형 서포트에 폴리펩티드의 공유 결합은 일반적으로 폴리펩티드에 있는 하이드록실 또는 아미노기와 같은 기능기와 서포트에 반응할 수 있는 이가기능기 시약과 우선 서포트를 반응시켜 이루어진다. 예를 들면, 폴리펩티드는 벤조퀴논을 이용한 적절한 고분자 코팅을 가지는 서포트에 결합되거나 또는 폴리펩티드에 있는 활성 수소와 아민과 서포트에 있는 알데히드기의 응축에 의해 결합될 수 있다(Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).
특정 구체예에서, 검사는 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA)이다. 이 검사는 고형 서포트에 고정된 폴리펩티드 항원과 샘플을 우선 접촉시키고, 샘플내에 있는 폴리펩티드에 대한 항체가 고정된 폴리펩티드에 결합하도록 한다. 결합안된 샘플은 고정된 폴리펩티드로부터 제거하고, 고정된 폴리펩티드-항체 복합체에 결합할 수 있는 감지 시약을 첨가한다. 고형 서포트에 결합되어 남아 있는 감지 시약의 양은 특정 감지 시약에 적절한 방법을 이용하여 결정을 할 수 있다.
좀더 구체적으로는, 폴리펩티드가 전술한 것과 같이 일반 서포트에 결합하면, 서포트에 남아있는 단백질 결합 부위는 일반적으로 차단된다. 당분야에 공지된 소혈청 알부민 또는 Tween 20TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 같은 공지의 임의 적절한 차단 물질을 이용할 수 있다. 고정된 폴리펩티드는 샘플과 배양을 하고, 항체는 항원에 결합되도록 한다. 샘플은 배양하기 전에 인산 완충염(PBS)으로 적절히 희석한다. 일반적으로, 적절한 배양 시간 또는 접촉 시간은 결핵균(M. tuberculosis)감염된 샘플 내에 있는 항체의 존재를 감지하는데 충분한 시간이 된다. 적절하게는, 접촉 시간은 결합된 항체와 결합안된 항체간에 평형이 적어도 95%가 되는 결합 수준을 얻는데 충분한 시간이 된다. 평형을 이루는데 필요한 시간은 시간에 따른 결합 수준을 검사하여 용이하게 결정을 할 수 있다. 실온에서, 약 30분 정도의 배양 시간이면 충분하다.
결합안된 샘플은 0.1% Tween 20TM을 포함하는 PBS와 같은 적절한 완충액으로 고형 서포트를 세척하여 제거할 수 있다. 그 다음 감지 시약은 고형 서포트에 첨가한다. 적절한 감지 시약은 고정된 항체-폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 임의 화합물이고 당분야에 공지된 다양한 수단중 한가지 방법을 이용하여 감지할 수 있다. 적절하게는 감지 시약에는 리포트기에 공액될 수 있는 결합 시약(단백질 A, 단백질 G, 이뮤노글로블린, 렉틴 또는 자유 항원)을 포함한다. 적절한 리포트기에는 효소(양고추냉이 과산화효소), 기질, 공인자, 저해물질, 염료, 방사선 핵종, 발광기, 형광기 및 바이오틴등을 포함한다. 리포터기에 결합 물질을 공액시키는 것은 당분야에 공지의 방법을 이용한다. 통상적인 결합제를 구입하여 많은 시판되는 원료로부터 다양한 리포터기에 공액시킨다(Zymed Laboratories, San Francisco, CA, and Pierce, Rockford, IL).
감지 시약은 결합된 항체를 감지하는데 충분한 시간동안 고정된 항체-폴리펩티드 복합체와 배양을 시킨다. 적절한 시간은 제조업자의 지시 또는 시간에 따른 결합 수준을 검사하여 일반적으로 결정을 할 수 있다. 그 다음 결합안된 시약은 제거하고, 결합된 감지 시약은 리포터 기를 이용하여 감지한다. 리포터 기를 감지하는데 이용되는 방법은 리포터기의 특징에 따라 달라진다. 방사능활성기의 경우에, 신틸레이션 카운터 또는 자기방사그래프 방법이 일반적이다. 분광광도 방법은 염료, 발광기 및 형광기를 감지하는데 이용된다. 바이오틴은 상이한 리포터기(흔히 방사능활성 또는 형광기 또는 효소)에 결합된 아비딘을 이용하여 감지한다. 효소 리포터 기는 기질(일반적으로 특정 시간에)을 첨가하고, 반응 생성물의 분광광도 또는 다른 분석을 이용하여 감지할 수 있다.
샘플에서 항-결핵균 항체의 유무를 결정하기 위해, 고형 서포트에 결합되어 남아 있는 리포터기에서 감지되는 시그널은 일반적으로 예정된 차단(cut-off) 값을 가지는 시그널에 비교한다. 적절한 한 구체예에서, 차단 값은 감염안된 환자의 샘플과 고정된 항원을 배양하였을 경우에 수득되는 평균 시그널이다. 또 다른 적절한 구체예에서, 차단 값은 Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107 방법에 따라 Receiver Operator Curve을 이용하여 결정을 할 수 있다. 일반적으로, 예정된 차단 값 이상의 시그널은 결핵 감염에 양성으로 간주한다.
신속한 관통(flow-through) 또는 스티립 테스트 포맷에서 검사를 실행할 수 있는데, 이때 항원은 니트로셀룰로오스와 같은 막에 고정시킨다. 관통 테스트에서, 샘플내에 있는 항체는 샘플이 막을 통과할 때 고정된 폴리펩티드에 결합한다. 감지 시약을 포함하는 용액이 막을 통과할 때 감지 시약(가령 단백질 A-콜로이드성 금)이 항체-폴리펩티드 복합체에 결합을 한다. 결합된 감지 시약의 감지는 상기 설명한 것과 같이 실행한다. 스트립 테스트 포맷에서 폴리펩티드가 결합된 막의 한 단부는 샘플을 포함하는 용액에 잠긴다. 샘플은 감지 시약을 포함하는 부분을 통하여 막을 따라 이동하여 고정된 폴리펩티드에까지 도달한다. 폴리펩티드에서 감지 시약의 농도는 샘플에 항-결핵균 항체의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 이 부위에서 감지 시약의 농도는 시각적으로 볼 수 있는 라인과 같은 패턴을 발생한다. 이와 같은 패턴이 없는 경우는 음성을 나타낸다. 일반적으로, 생물학적 샘플에 상기에서 설명하는 ELISA에서 양성 시그널을 발생하는데 충분한 양의 항체 수준을 포함하는 경우에 시각적으로 구별할 수 있는 패턴을 만드는 정도의 막에 고정된 폴리펩티드의 양이 선택된다. 바람직하게는 막에 고정된 폴리펩티드의 양은 약 25ng 내지 1㎍, 바람직하게는 약 50ng 내지 500ng이 된다. 이와 같은 테스트는 일반적으로 환자의 혈청 또는 혈액 소량(가령 한 방울)으로도 실행할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 이용하는데 적합한 다수의 검사 프로토콜이 있다. 상기 설명은 예시에 불과하다.
본 발명은 또한 신규한 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다. 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술중 하나를 이용하여 준비할 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 이와 같은 한 가지 기술중에 하나에서, 항원성 폴리펩티드를 포함하는 이뮤노겐은 임의 다양한 포유류(가령, 쥐, 들쥐, 토끼, 양, 염소)에 우선 주사란다. 한가지 이상의 부스터 면역을 포함하는 예정된 과정에 따라 동물 숙주에 이뮤노겐을 주사하고, 동물의 피를 주기적으로 뽑는다. 적절한 고형서포트에 결합된 폴리펩티드를 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 항체는 이와 같은 항혈청으로부터 정제한다.
원하는 항원성 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체는 Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976의 기술을 이용하여 준비할 수 있다. 간략하게 설명을 하면, 이들 방법은 원하는 특이성(가령, 원하는 폴리펩티드와의 반응성)을 가지는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주를 준비하는 것과 관계한다. 이와 같은 세포주는 전술한 것과 같이 면역주사를 맞은 동물에서 수득되는 췌장 세포에서 생산될 수 있다. 췌장 세포는 골수 세포 융합 짝과 융합하여 불멸화시킬 수 있는데, 바람직하게는 당분야에 공지의 기술을 이용하여 면역주사를 맞은 동물에 공조효과가 있는 것이다.
생성된 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 단일클론 항체를 분리해낼 수 있다. 도한, 다양한 기술을 이용하여 쥐와 같은 적절한 척추동물의 복강안으로 하이브리도마 세포주를 주사하여 결과를 강화시킨다. 그 다음 단클론 항체는 복수 또는 혈액으로부터 수득한다.
진단 테스트에 항체를 이용하여 상기에서 설명하는 유사한 검사 또는 당분야에 공지된 다른 기술을 이용하여 결핵균 항원의 존재를 감지할 수 있고, 이는 환자에서 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 같은 결핵균 감염을 감지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 시약은 상기 하나이상의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 또는 이의 하나이상의 부분으로 구성된다. 예를 들면, DNA 서열의 적어도 10개 연속 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 테스트의 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 이용할 수 있다. 유사하게, 해당 DNA 서열의 적어도 10개 연속하는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 이용하여 특정 서열에 혼성화할 수 있다. PCR계 테스트 및 하이브리드 테스트에 대한 기술은 당분야에 공지된 것이다. 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 가래, 혈액, 혈청, 침, 뇌척수 또는 오줌과 같은 생물학적 샘플에 있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 다른 결핵균 감염을 감지한다. 전술한 것과 같은 올리고뉴클레오티드로 구성된 DNA 프로브 또는 프라이머를 단독 또는 서로 복합하여 이용하거나 또는 전술한 것과 같은 38kD 항원과 같은 이미 확인된 서열과 복합하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 조성물 중량에서 사용된 "약"은 언급한 비율에서 최고 10%까지 변수가 있을 수 있음을 감안하라는 것이다. 동일한 비율을 말할때에 "약"은 언급된 비율에서 최고 1%까지 변수가 있을 수 있음을 감안하라는 것이다.
다음은 실시예를 설명하는 것이나 이에 본 발명을 국한시키는 것은 아니다.
실시예 1
결핵균에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 쥐에 면역 주사하였을 경우에 효과
이 실시예에서는 살아있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 자극하기 전에 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역 주사하는 경우의 효과를 설명한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae (ATCC Number 15483))는 멸균 배지 90(이스트 추출물 2.5g/l; 트립톤, 5g/l; 포도당 1g/l)로 37℃에서 배양한다. 세포는 원심분리에 의해 수득하고, 포도당이 포함된 멸균 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)로 옮기고 하루동안 37℃에서 배양한다. 배지는 그 다음 원심분리하여 세균을 펠렛화시키고, 배양 여과물은 제거한다. 세균 펠렛은 ㎖당 1010미코박테리움 바카이(M. vaccae)가 되도록 10㎎/㎖농도에서 인산완충염에 재현탁시킨다. 그 다음 세포 현탁액은 120℃에서 15분간 증기멸균시킨다. 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통과시켜 멸균 병안으로 옮긴다.
도 1A에서 볼 수 있는 것과 같이, 쥐에 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 1㎎, 100㎍, 10㎍으로 면역 주사하고, 3주 후에 살아있는 미코박테리움 튜베르큘로시스 H37Rv 5×105CFU를 감염시킨다. 이 실시예에서, 감염 후 3 주 뒤에 췌장, 간, 폐 조직을 쥐에서 떼내어, 살아있는 바실라스를 결정한다(CFU로 결정). 면역주사안된 기준 쥐의 조직과 비교하여 바실러스의 수가 간, 폐 조직에서 2log정도 감소하였고, 췌장 조직에서는 1log 정도 감소하였다. 열에 의해 죽인 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv로 면역 주사한 쥐에서는 살아있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv로 감염시킨 쥐에서와 같은 보호성 효과를 가지지 않는다.
도 1B에서는 쥐에 100㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역주사하고, 3주 후에 5×105CFU 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis ) H37Rv로 감염을 시켰는데, 상당한 보호효과를 볼 수 있다. 감염 후 3주 뒤에 쥐에서 췌장, 간, 폐 조직을 떼내어 살아있는 바실러스 수(CFU)를 측정한 결과, 면역주사안한 기준 쥐와 비교를 하였을 경우에 그 수가 약 1-2 log 감소되었다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
원숭이(cynomologous)의 결핵에 미코박테리움 바카이로 피하 및 폐 경로를 통하여 면역주사를 한 효과
본 실시예에서는 살아있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 도전전에 원숭이에서 피하 또는 폐를 통하여 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역 주사한 효과를 설명한다.
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물은 상기 실시예 1에서와 같이 준비하였다. 5군의 원숭이를 이용하였는데, 각 군에는 2마리의 원숭이가 포함된다. 원숭이 2군은 완전히 열처리하여 죽인 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 피하로 또는 폐를 통하여 면역주사하였고; 2군의 원숭이는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양물을 피하 또는 폐를 통하여 면역주사하였고; 기준군은 면역주사를 받지 않았다. 면역주사에 이용된 조성물, 이뮤노겐의 양, 각 원숭이 군에 투여 경로는 표1에서 제공하고 있다.
면역 주사를 하기 전에, 모든 원숭이의 무게(Wt kgs), 체온(temp)을 재고, 혈액 샘플을 취하여, 적혈구 침전 속도(ESR mm/hr) 및 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)에서 준비한 정제 단백질(PPD)로 in vitro 도전에 대한 임파구 증식(LPA)를 결정한다. 면역주사후 33일 후에, 이와 같은 측정을 반복한다. 34일째에, 모든 원숭이는 동일한 양의 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 이용하여 제 2 면역주사를 맞는다. 62일째에, 체중, 체온, ESR, PPD에 대한 LPA를 측정을 하고, 모든 원숭이는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) Erdman 균주 103CFU로 감염을 시킨다. 감염 후 28일에, 체중, 체온, ESR, PPD에 대한 LPA을 모든 원숭이에서 측정을 하고, 폐는 X-레이 사진을 찍어, 살아있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 감염에 의해 결핵이 개시되었는 지를 결정한다.
이 연구 결과는 다음의 표 2A-E에서 나타내고, 그 내용을 요약하면 다음과 같다;
표 2A; 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) Erdman로 감염시킨 후 28일째에, 기준(면역주사를 맞지 않은) 원숭이의 흉부 X-선에서는 두 동물 모두에서 우측 폐문위에 흐릿하게 나타났는데 이는 폐렴이 시작되었다는 것이다. 폐렴이 진행되었고, 감염 56일 후에는 폐 모두에 질병이 나타났다. 예상한 것과 같이, 기준 동물의 체중이 두 마리에서 모두 감소되었고, PDD에 대한 LPA 반응이 강하게 나타나, 이는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대해 T 세포 반응이 강하다는 것을 알 수 있다. ESR을 측정한 결과 매우 다양하게 나타났으나, 강한 면역 반응과 일치하였다.
표 2B; 50㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 피하로 투여받은 두 마리 원숭이에서는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 감염후 84일까지 폐 질병의 징후가 나타나지 않았다. PPD에 대한 LPA 반응에서는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대한 면역 반응이 있어나, 두 동물에서는 체중이 계속 증가되어, 이는 질병의 징후가 낮다는 것과 일치한다.
표 2C; 500㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 폐를 통하여 주사를 맞은 두 마리 원숭이에서는 표 2B의 동물과 거의 동일한 결과를 나타내고 있다. 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 감염된 후 84일에도 폐 질병의 징후가 없고, 체중이 증가되었다. 두 마리 동물에서는 면역과정(0-62일) 및 감염후에 PPD에 대한 LPA 반응이 나타났는데, 이는 폐를 면역화 경로로 이용하고, 연속하여 감염을 시킨 결과로 강력한 T 세포 반응성이 있다는 것을 나타낸다.
500㎍ 전체 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 2회 면역시키면 살아있는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 감염시킨 것에 대해 보호성 효과가 있다는 것을 나타낸다. 표 2D 및 2E에서 제시하는 데이터에서는 100㎍ 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로 면역반응을 시킨 결과를 나타낸 것이다. 피하로 면역주사를 맞은 원숭이에서는 감염후 84일 경에 질병 발생 징후가 나타난 반면에, 폐를 통하여 면역화 주사를 맞은 동물의 경우에는 한 동물에서는 감염 56일에 질병이 나타났고, 한 동물에서는 감염 84일에 질병이 나타났다. 이는 질병의 개시가 상당히 지연되었고, 면역 과정이 어느 정도 보호성 면역반응이 된다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
생쥐의 천식에 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 면역 주사 효과
이 실시예에서는 비강을 통하여 생쥐에서 열처리하여 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 투여하였을 경우에, 폐에서 알레르기성 면역 반응이 발생될 소지를 저해한다는 것을 설명한다. 이는 천식과 유사한 알레르기원-특이적인 폐 질환을 가진 생쥐 모델에서 설명한다. 이와 같은 알레르기 질환의 심각성은 폐에 축적된 호산구의 수가 증가된 것으로 반영된다.
C57BL/6J 생쥐에게 0일과 14일에 복막경로를 통하여 2㎍ 오브알부민/100㎕ 알룸을 제공하고, 연속하여, 28일 경에 비강을 통하여 100㎍ 오브알부민/50㎕ 인산염 완충액(PBS)을 제공한다. 생쥐의 폐에는 호산구가 축적되고, 이는 마취된 생쥐의 기도를 염으로 세척하고. 세척물(BAL)을 수집하고, 호산구의 수를 헤아려 측정할 수 있다.
도 2A 및 2B에서 볼 수 있는 것과 같이, 열처리하여 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도 2A) 10 또는 1000㎍ 또는 하기에서 설명하는 것과 같이 준비된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 10, 100, 200㎍ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도 2B)를 비강으로 오브알부민을 투여하기 전에 4주경에 비강을 통하여 투여한 7마리 생쥐 집단에서는 기준 생쥐와 비교하였을 때 오브알부민 제공후 5일 경에 수집된 BAL 세포에서 호산구의 비율이 감소되었다. 기준 생쥐에는 비강으로 PBS가 제공되었다. 살아있는 미코박테리움 보비스(M. vovis) BCG(2 x 105cfu)를 이용한 경우에도 역시 호산구의 수가 감소되었다. 도 2A 및 2B에서는 생쥐 집단에서의 평균 및 SEM을 나타낸다.
도 2C 및 2D에서는 1000㎍ 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도. 2C) 또는 200㎍ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도. 2D)를 오브알부민으로 처리하기 전에 한주일전에 비강으로 제공을 받은 생쥐에서 기준 생쥐와 비교하였을 때, 호산구의 비율이 감소되었음을 나타내는 것이다. 이와는 대조적으로, 오브알부민으로 처리를 받기 전 1주일에 살아있는 BCG로 처리하는 경우에는 기준 생쥐와 비교하였을 때 폐 호산구다증 발생이 저해되지 않았다는 것을 알 수 있다.
도 2E에서 볼 수 있는 것과 같이, 1㎎의 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 200㎍ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 비강(i.n.) 또는 피하(s.c.)로 면역주사하였을 경우에, PBS를 제공받은 기준 동물과 비교하였을 때 오브알부민으로 처리한 후에 호산구다증이 감쇠되었다. 동일한 실험에서, 파스퇴르의 BCG(BCG-P) 및 Connought(BCG-C) 균주로 오브알부민 처리전에 면역주사하여도 생쥐의 BAL에서 호산구의 비율이 감소되었다.
호산구는 알레르기성 천식에서 기도에 돌기된 혈액 세포이다. 호산구의 분비 생성물은 알레르기 천식의 기도의 점막 라이닝의 부풀게 하고 염증을 일으키게 한다. 도 2A-E에 나타낸 자료에서는 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 처리할 경우에, 폐에 호산구 축적을 감소시켜, 기도, 비강점막 및 상측 호흡기관에 있는 호산구와 연관된 염증을 줄이는데 유용할 것이다.
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 미콜산 및 아라비노갈락탄이 결핍되어있다.
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 37℃에서 48시간동안 수산화칼륨(0.5% KOH)/에탄올로 처리하면 미콜산이 제거된다. 미콜산이 제거된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포를 그 다음 에탄올 및 에테르로 세척하고 건조시킨다. KOH-처리된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 추가로 1% 피리오딕산/3%아세트산으로 1시간동안 실온에서 처리한 후에, 실온에서 1시간 동안 0.1M 보로하이드리드 나트륨으로 추가 처리하면 아라비노갈락탄이 제거된다. 아라비노갈락탄이 제거된 후에, 샘플은 물로 세척하고, 동결건조시킨다. 표 3에서 볼 수 있는 것과 같이, 미콜염 제거된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 뿐만 아니라 미콜산 및 아라비노갈락탄이 제거된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)을 오브알부민에 감응성이 있는 생쥐의 비강으로 제공하였을 경우에, 오브알부민 처리후에 기관지폐포 세정액에서 호산구 축적이 감소되었다.
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미콜산 및 아라비노갈락탄이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)을 투여하면, 알레르기성 비염과 같은 유사한 면역 이상과 관련된 질환 및 천식의 심각성을 줄일 수 있다. 또한, 도 2E에서 나타낸 실험 대상 생쥐에서 혈청 샘플을 취하고, 표준 효소-연결된 면역검사(ELA)를 이용하여 오브알부민에 대한 항체를 측정하였다. 표 3A에서 볼 수 있는 것과 같이, BCG에 감염된 생쥐의 혈청에는 PBS 기준보다도 오브알부민 특이적인 IgG1 수준이 훨씬 높았다. 대조적으로, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역화된 생쥐에서는 유사한 또는 이보다 낮은 오브알부민 특이적인 IgG1 수준을 나타내었다. IgG1 항체가 Th2 면역 반응의 특징이기 때문에, 이와 같은 결과는 천식을 유도하는 Th2 면역 반응에서 열처리로 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 억제 효과와 일치한다.
처리군 BAL에서 호산구 %
평균 S.E.M.
PBS 58.8 8.4
미콜산이 없는 DD-M. vaccae 21.8 17.4
미콜산 및 아라비노갈락탄이 없는 DD-M. vaccae 16.8 0.3
미콜산이 없는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미콜산과 아라비노갈락탄이 없는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 처리한 생쥐에서 폐 호증구다증의 감소(주; 집단마다 적어도 7마리의 생쥐가 있음)
처리군 혈청 IgG1
평균 SEM
M. vaccae i.n. 185.00 8.3
M. vaccae s.n. 113.64 8.0
DD-M. vaccae i.n. 96.00 8.1
DD-M. vaccae s.n. 110.00 4.1
BCG, Pasteur 337.00 27.2
BCG, Connaught 248.00 46.1
PBS 177.14 11.4
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐에서 낮은 항원-특이적인 IgG1 혈청 수준.
주; 오브알부민-특이적인 IgG1는 항-생쥐IgG1(Serotec)를 이용하여 감지하였다. 집단 평균은 EU50 말단 역가를 이용하여 나타낸다.
실시예 4
미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질이 결핵에서의 면역화 효과
이 실시예에서는 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질을 추가 항항원체를 이용하지 않고 면역화 효과를 설명하는 것이다. 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 재조합 단백질과 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 이용한 면역반응의 효과를 나타낸 것이다.
생쥐에 다음중 한 가지를 이용하여, 3주간 간격을 두고 복막으로 주사하였다;
a) 인산염 완충액(PBS, control)
b) 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(500㎍);
c) DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(50㎍);
d) GV4P, GV7, GV9, GV27B, GV33 단백질(하기에서 설명하는 것과 같이 준비된) 각 15㎍을 포함하는 재조합 단백질 집합;
e) 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 재조합 단백질 집합.
마지막으로 복막 면역주사한 후 3주째에, 생쥐에게 5 x 105살아있는 H37Rv M. tuberculosis 유기체를 감염시켰다. 추가 3주 후에, 생쥐를 죽이고, 이들의 지라를 균질화시켜, 감염의 심각성의 지시인자로써 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 콜로니 형성 단위(CFU)에 대해 검사하였다.
도 3A 및 3B에서 각 점은 개별 생쥐를 나타낸다. PBS만으로 면역주사를 맞은 생쥐에서 회수한 CFU 수를 기저수준으로 삼는다. 실험 생쥐에서 취한 모든 데이터는 기준 생쥐의 기저수준아래의 CFUs 로그 수로 표시한다. 도 3A에서 볼 수 있는 것과 같이, 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐에서는 평균 각 〉1 또는 0.5 logs CFU 감소되었다.
도 3B에서 볼 수 있는 것과 같이, GV4P, GV7, GV9, GV27B, GV33를 포함하는 재조합 단백질 집합으로 면역주사를 맞은 생쥐의 지라에서는 기준 생쥐보다는 약간 적은 CFUs가 나타났다. 그러나, GV4P, GV7, GV9, GV27B, GV33가 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 복합하여 제공되는 경우에, CFUs 감소수준은 〉1.5 logs이상이 된다.
데이터는 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 결핵에 대해 감염된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 재조합 단백질의 면역화 효과를 설명하고, 추가로 결핵에 대한 백신으로 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 재조합 단백질을 개발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
사람 환자의 건선에 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 파하로 주사하였을 경우에 효과
이 실시예에서는 사람 환자의 건선에 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 2회 피하로 주사한 경우의 효과를 설명한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC Number 15483)는 37℃에서 멸균 Medium 90 (이스트 추출물, 2.5g/ℓ; 트립톤, 5g/ℓ; 포도당, 1g/ℓ)에 배양을 한다. 세포는 원심분리에 의해 수득을 하고, 포도당이 첨가된 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 하룻동안 37℃에서 배양을 한다. 배지는 원심분리하여 박테리아를 펠렛화시키고, 배양 여과물을 제거한다. 박테리아 펠렛은 10㎎/㎖ 농도에서 인산 완충염에 재현탁을 시켜 ㎖당 1010M. vaccae 이 되도록 한다. 세포 현탁액은 120℃에서 15분간 증기멸균하고, -20℃에 저장한다. 사용하기 전에 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 현탁액을 해동시키고, 인산염 완충액으로 5㎎/㎕로 농도를 희석시키고, 120℃에서 15분간 가압멸균시키고, 멸균 상태하에서 0.2㎖씩 바이알에 넣어 환자가 사용할 수 있도록 한다.
24명의 건선 환자(남여, 15-61연령대, 다른 전신 질환이 없음) 지원자가 치료를 수락하였다. 임산부는 제외되었다. 환자의 PASI 정도는 12-35로 나타내었다. PASI 숫자는 환자의 신체에 있는 건선 병소의 위치, 크기, 피부 벗겨짐 정도를 측정하는 것이다. 12이상의 PASI 숫치는 신체에 건선 병소가 퍼져있다는 것을 말한다. 연구는 4주간의 유실기간을 가지고 시작하는데, 이때 환자는 전신 항-건선 치료 또는 효과적인 국소 치료법을 받지 않았다.
24명의 환자에 피부로 0.1㎖ 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(500㎍에 상응)을 주사하였다. 이다음에 동량의 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(500㎍)를 두 번째로 피하주사를 3주후에 실시하였다. 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 처음 주사하기 전 4주경에서 처음 주사후 12주까지 건선을 다음과 같이 평가하였다;
A. PASI 숫치는 -4, 0, 3, 6, 12주에 측정한다;
B. 환자에게 제공된 설문지는 0, 3, 6, 12주에 실시한다;
C. 건선 병소 및 각 환자의 사진을 0, 3, 6, 9, 12주에 찍는다. 표 4에 나타낸 데이터는 각 환자의 나이, 성별, 임상적 배경을 설명한 것이다.
모든 환자에서 주사 부위에 비-궤양성 국소화된 연한 홍반이 경화되는 반응이 있다고 설명하였다. 부작용이나 환자가 불편을 느끼는 사항은 없었다. 하기 표 5에서 나타낸 자료에서는 열처리로 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 1회 및 2회 주사한 후 48시간, 72시간, 7일에 주사 부위에 피부 반응을 측정하였다. 하기 표 6에서는 처음 미코박테리움 바카이(M. vaccae)을 투여한 후 그리고 투여후 3, 6, 9, 12, 24주에 환자에서 PASI 수치를 나타내었다.
처음 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 투여한 후 8주 경에 24명의 환자중 16명에서 PASI 수치가 상당히 개선된 것으로 분명하게 나타났다. 24주의 추적이 완료된 14명의 환자중 7명에서는 심각한 질병이 발생하는 임상적인 징후 없이 안정을 유지하였다. 이 결과에 따르면, 건선 환자 치료에서 불활화된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 여러차례 피하로 주사하면 효과가 있다는 것을 설명한다. PASI 수치가 10 이마인 것은 병소 치료가 많이 되었음을 나타내는 것이다. 피부 생검에서도 정상적인 피부 구조로 복구되었다는 것을 알 수 있다. 28주의 추적조사를 받은 처음 7명의 환자중에 한명만이 재발되었다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 치료를 받은 환자는 병이 완화되었다(PASI score=0). 질병의 완화 또는 PASI 수치 개선은 오래 지속되었다. 예를 들면, 환자 PS-003은 20주경에 질병이 완화되었고, 80주까지 질병 완화가 유지되었다. 전체 24명중 13명의 환자에서 PASI 수치가 50% 개선되었다.
환자 PS-001은 16주경에 질병이 완화되었으나, 48주에 재발되어(PASI 2.7), 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 다시 백신처리하였고 연속하여, PASI가 17.8(60주)에서 0.8(84주)로 개선되었다. 따라서, 환자는 반복적인 치료로 이익을 얻었다.
실시예 6
사람 환자 건선에 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 피하 주사 효과
이 실시예에서는 사람 환자의 건선에 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 2회 피하로 주사한 경우의 효과를 설명한다.
7명의 건선 환자(남여, 15-61연령대, 다른 전신 질환이 없음) 지원자가 치료를 수락하였다. 임산부는 제외되었다. 환자의 PASI 정도는 12-24로 나타내었다. PASI 숫자는 환자의 신체에 있는 건선 병소의 위치, 크기, 피부 벗겨짐 정도를 측정하는 것이다. 12이상의 PASI 숫치는 신체에 건선 병소가 퍼져있다는 것을 말한다. 연구는 4주간의 유실기간을 가지고 시작하는데, 이때 환자는 전신 항-건선 치료 또는 효과적인 국소 치료법을 받지 않았다. 7명의 환자에 피부로 0.1㎖ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(100㎍에 상응)을 주사하였다. 이다음에 동량의 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)(100㎍)를 두 번째로 피하주사를 3주후에 실시하였다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 처음 주사하기 전 4주경에서 처음 주사후 4주까지 건선을 다음과 같이 평가하였다;
A. PASI 숫치는 -4, 0, 3, 6주에 측정한다;
B. 환자에게 제공된 설문지는 0, 3, 6주에 실시한다;
C. 건선 병소 및 각 환자의 사진을 0, 3주에 찍는다. 표 7에 나타낸 데이터는 각 환자의 나이, 성별, 임상적 배경을 설명한 것이다.
모든 환자에서 주사 부위에 비-궤양성 국소화된 연한 홍반이 경화되는 반응이 있다고 설명하였다. 부작용이나 환자가 불편을 느끼는 사항은 없었다. 하기 표 8에서 나타낸 자료에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 1회 주사한 후 48시간, 72시간 및 7일에 그리고 2회 주사한 후 48시간, 72시간에 주사 부위에 피부 반응을 측정하였다.
하기 표 9에서는 처음 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)을 투여한 후 그리고 투여후 3, 6, 12, 24주에 환자에서 PASI 수치를 나타내었다.
처음 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 투여한 후 3주 경에 5명의 환자에서 PASI 수치가 상당히 개선된 것으로 분명하게 나타났다. 24주경에 7명 환자에서는 PASI 수치가 상당히 개선되었다.
예를 들면, 환자 PS-031은 32주경에 질병이 완화되었고(PASI=0), 48주까지 유지되었다. 환자 PS-025의 PASI 수치는 12주이상의 경우에 1미만으로 감소되었다. 48주에 심각한 건선(PASI=15.8)의 경우에도, 환자를 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 치료하면, PASI가 바로 각각 6.8(52주) 내지 0.6(56주)로 개선되었다.
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 건선을 치료하면, 질병이 완화 또는 장시간 효과를 볼 수 있다. 환자는 또한 반복적인 치료로 이익을 얻었다.
실시예 7
미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 조성물을 준비
본 실시예에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 다른 구성성분을 처리하는 과정을 설명한다.
지질 및 글리코리피드를 제거한(DD-) 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 준비하는 과정 및 이의 분석 과정
상기 실시예 1에서 설명하는 것과 같이 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 준비하였다. 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 준비하기 위해, 가압멸균한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 원심분리하여 펠렛화하고, 펠렛은 물로 세척한 다음, 다시 원심분리하여 수득하고, 그다음 냉동 건조시킨다. 이와 같이 냉동 건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)라고 한다. 실험에서 사용할 경우에는 원하는 농도로 PBS로 재현탁시켜 이용한다. 동결건조된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 실온에서 60분간 클로로포름/메탄올(2:1)로 처리하여, 지질을 제거하고, 추출한 1회 더 반복한다. 클로로포름/메탄올 추출에서 지질이 제거된 잔기물은 2시간동안 재환류하에서 50% 에탄올로 처리하여, 글리코리피드를 제거한다. 50% 에탄올 추출을 2회 반복한다. 50% 에탄올 추출물을 모아서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질의 원료로 이용한다(하기 참고). 50% 에탄올 추출물의 잔기는 냉동건조시키고, 중량을 측정한다. 준비된 지질이 제거된 그리고 당지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 이용된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 처음 중량의 11.1%에 상응하였다. 생검을 위해, 지질이 제거되고, 당지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(DD-(M. vaccae)는 초음파분쇄를 이용하여 인산염-완충된 염에 재현탁시키고, 증기멸균으로 살균시킨다.
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 조성 분석은 다음에 나타내었다. 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물과 비교하였을 때, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 지방산 조성 및 아미노산 조성에서 큰 변화가 있다는 것을 알 수 있다. 다음에 나타낸 자료에서 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물에는 지질이 10% w/w포함되어 있고, 총 아미노산 함량은 2750nmoles/㎎ 또는 약 33% w/w이다. DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에는 지질이 1.3% w/w 포함되고, 아미노산이 4250nmoles/mg 포함되는데, 이는 약 51% w/w에 해당된다.
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 조성 분석
단당류 조성물
지방산 조성물
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물에는 지질이 10% w/w 포함되고, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에는 지질이 1.3% w/w이 포함된다.
아미노산 조성물
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 불용성 분취물의 총 아미노산 함량은 2750nmoles/mg으로 이는 33% w/w에 해당된다. DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 총 아미노산 함량은 4250nmoles/mg으로 이는 51% w/w에 해당된다.
지질이 제거되고, 당지질이 제거된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)형과 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 미코박테리움 스메가마티스(M. smegmatis)의 조성 비교
상기에서 설명하는 지질을 제거하고 당지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 준비하는 과정을 이용하여, M. tuberculosis 및 M. smegmatis의 지질 및 당지질을 제거하였다. 표 10에서 나타낸 것과 같이, DD-M. vaccae, DD-M. tuberculosis, DD-M. smegmatis에서 아미노산 조성물의 비율 프로파일에서는 큰 차이가 없었다. 그러나, 단백질 총량은 다양하였는데, DD-M. vaccae에는 34% 및 55% 단백질을 포함하는 반면에, DD-M. tuberculosis, DD-M. smegmatis에는 각각 79% 및 72%의 단백질을 포함한다.
단당류 조성 분석에서는 DD-M. vaccae, DD-M. tuberculosis, DD-M. smegmatis에서 상당한 차이가 있었다. DD-M. vaccae의 두 개 배취에서 단당류의 조성은 동일하였으나, DD-M. tuberculosis 및 M. smegmatis와는 상이하였다. 특히, DD-M. vaccae에서는 자유 포도당을 포함하는데 반하여, DD-M. tuberculois 및 M. smegmatis에서는 글리세롤을 포함하고 있다(표 11 참고).
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질
상기와 같이 모아진 50% 에탄올 추출물은 회전 증발시켜 건조시키고, 물에 다시 용해시키고, 냉동-건조를 한다. 회수된 당지질의 양은 이용된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 시작 중량(젖은 상태)의 1.2%에 해당한다. 바이오검사를 위해 당지질은 인산완충염에 용해시킨다.
실시예 8
지질 및 당지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 이에서 수득한 재조합 단백질의 면역 조절 성질
이 실시예에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 여러 성분의 면역 조절 성질을 설명한다.
대식세포로부터 인터루킨-12의 생산
완전히 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 여러 가지 다른 사이토킨 자극 성질을 가지는 것으로 보인다. 대식세포에서 인터루킨 12(IL-12)를 생산함으로써 Th1 면역 반응 자극이 강화된다. IL-12 생산을 자극하는 여러 가지 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 능력을 다음과 같이 설명한다.
C57BL/6J 쥐 집단에 DIFCO 티오글리콜레이트을 복막으로 주사하고, 3일 후에, 복막의 대식세포를 수득하고, 3시간동안 인터페론-감마가 있는 세포 배양물에 둔다. 배양 배지는 교체하고, 다양한 농도의 완전히 열에 의해 죽은(증기멸균) 미코박테리움 바카이(M. vaccae), 동결건조한 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-M. vaccae(상기에서 준비한 것과 같음), 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질을 첨가한다. 37℃에서 3일간 추가 배양을 한 후에, 배양 상청액에 대식세포에 의해 생산된 IL-12가 있는지를 검사한다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 대식세포로부터 IL-12의 생산을 자극하는 것으로 나타났다.
대조적으로, 이와 같은 동일한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 준비물에 대해 천연 킬러(NK) 세포에서 인터페론-감마 생산을 자극하는 능력에 대해 검사하였다. Severe Combined Immunodificient(SCID) 생쥐로부터 지라 세포를 준비하였다. 이와 같은 집단에는 75-80% NK 세포를 포함한다. 지라 세포는 여러 가지 상이한 농도의 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질을 가지는 배지에서 37℃상에서 배양하였다. 도 5에 나타난 자료를 보면, 완전히 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 당지질은 인터페론-감마 생산을 자극하는 것을 알 수 있고, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 상대적으로 약하게 인터페론-감마를 자극하는 것을 알 수 있다. 도 4와 5의 자료를 복합하여보면, 완전히 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)과 비교하였을 때, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 인터페론 감마보다도 더 우수한 IL-12 자극물질이하는 것을 알 수 있다.
이와 같은 발견으로 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 지질, 당지질 성분을 제거하면, NK 세포로부터 인터페론-감마를 자극하는 분자 성분이 제거된다는 것을 알 수 있고, 따라서, 여러 가지 유해한 부작용을 가지는 사이토킨의 중요한 세포 원을 효과적으로 제거할 수 있다는 것이다. 따라서, IL-12 생산을 자극함으로써, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 Th1 면역 강화 능력을 보유하지만, NK 세포로부터 인터페론-감마 생산을 자극함으로써 비-특이적인 효과는 상실하게 된다.
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 항항원체 효과 및 하기에서 설명하는 바와 같이 준비된 본 발명의 여러 가지 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 항원의 항항원체 효과는 뮤린 복부 대식세포의 IL-12 방출 자극을 측정함으로써 결정할 수 있다. 도 6A, B, C에는 별도의 실험으로부터의 데이터를 나타내었는데, 이때 C57BL/6 쥐(도 6A), BALB/C 쥐(도 6B), C3H/HeJ 쥐(도 6C)에는 복막으로 DIFCO 티오글리콜레이트를 제공하고, 3일 후에, 복막 대식세포를 수득하여, 이를 3시간동안 인터페론-감마가 있는 배양물에 둔다. 배양 배지는 교체하고, 다양한 농도의 미코박테리움 바카이 재조합 단백질 GVc-3(GV-3), GVc4P(GV 4P), GVc-7 (GV7), GV-23, GV 27, 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-M. vaccae(도 6A, B, C에서 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 명명함), 미코박테리움 바카이 당지질 또는 지질다당류를 첨가한다. 37℃에서 3일간 배양을 한 후에, 배양 상청액에는 대식세포에 의해 생산되는 IL-12가 존재하는 지에 대해 검사를 한다. 도 6A, B, C에서 볼 수 있는 것과 같이, 재조합 단백질 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 준비물은 대식세포로부터 IL-12의 생산을 자극한다.
계속되는 실험에서, BALB/c 생쥐에서 IFNr-프라임된 복막 대식세포는 3일간 배양된 40㎍/㎖ 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 단백질로 자극을 하고, 대식세포에 의해 생산된 IL-12가 존재하는 지를 검사하였다. 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이 이와 같은 실험에서, 기준 단백질 오브알부민(ova)으로 배양하였을 경우에 IFNr-프라임된 대식세포는 IL-12를 생산하였다. 그러나, 재조합 단백질 GV 24B, 38BP, 38AP, 27, 5, 27B, 3, 23, 22B는 기준 대식세포 배양물에서 감지되는 IL-12의 양보다 2배정도로 자극하였다.
전체 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 배양 여과물에서 비-특이적인 면역 증폭인자의 감지
쥐에서 구조적으로 무관한 단백질인 오브알부민에 대한 세포 독성 T 세포 면역 반응을 발생시키는데 있어서, 상기에서 준비한 것과 같은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양물 상청액(S/N), 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 항항원체 활성에 대해 테스트를 하였다. 이와 같은 항-오브알부민-특이적인 세포 독성 반응은 다음과 같이 감지한다; C57BL/6 쥐(한 집단에 2마리)에 다음의 테스트 항항원체와 함께 100㎍ 오브알부민을 복막내 면역 주사를 한다; 항항원체(가압멸균된 미코박테리움 바카이; 지질이 제거된 미코박테리움 바카이; 지질이 제거되고, 당지질 및 단백질은 SDS로 추출된 미코박테리움 바카이; SDS 단백질 추출물은 프로네이즈(단백질을 붕괴시키는 효소); 전체 미코박테리움 바카이 배양 여과물; 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 튜베르쿨로시스 또는 열 처리에 의해 죽은 미코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 미코박테리움 플라이(M. phlei) 또는 미코박테리움 스메가마투스(M. smegmatus) 또는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물. 10일 후에, 췌장 세포는 E.G7세포로 추가 6일간 in vitro에서 자극을 하는데, 이때 E.G7세포는 오브알부민 유전자로 트랜스펙트된 EL4세포(C57BL/6-유도된 T 세포 임파종)로 오브알부민을 발현시킨다. 비-특이적으로 EL4 표적 세포를 죽이는 또는 오브알부민을 발현시키는 E.G7세포를 특이적으로 죽이는 췌장 세포의 능력에 대해 검사를 한다. 죽이는 활성은 이 검사를 하기 전에 EL4 및 E.G7세포에 라벨된51크로미늄(100μCi per 2×106)의 방출에 의해 감지된다. 죽이는 활성 또는 세포용해 활성은 다음의 식을 이용하여 특정 용해율%로 나타낸다.
일반적으로 오브알부민-특이적인 세포 독성 세포는 항항원체와 함께 오브알부민으로 면역주사를 한 쥐에서만 발생하고, 오브알부민 단복으로 면역 주사를 한 쥐에서는 발생되지 않는다는 것이 공지의 사실이다.
도 7에 만든 다이아그램은 C57BL/6쥐에서 오브알부민에 대한 세포독성 T 세포의 발생에서 다양한 미코박테리움 바카이에서 유도된 항항원체 물질의 효과를 나타낸다. 도 7A에서 볼 수 있는 것과 같이, (i) 10㎍, (ii) 100㎍ (iii) 1㎎ 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 (iv) 75㎍ 미코박테리움 바카이 배양 여과물로 면역주사한 쥐에서 세포독성 세포를 만든다. 도 7B에서는 (i) 1㎎ 전체 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는(ii) 1㎎ 지질을 제거한 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역 주사한 쥐에서 세포독성 세포가 발생되었음을 보여준다. 도 7C(i)에서는 1㎎ 전체 가압멸균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사한 쥐에서 발생된 세포독성 세포를 나타낸다; 도 7C(ii)에서는 당지질이 제거되고, 단백질은 SDS로 추출한 100㎍ 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 있는 활성 물질을 나타낸다. 도 7C(iii)에서는 도 4C(ii)의 항항원체에 있는 활성 물질이 단백질 분해성 효소 프로네이즈로 처리하여 파괴된다는 것을 보여준다. 비교를 위해, 100㎍ SDS-추출된 단백질에는 1㎎ 전체 증기멸균된 미코박테리움 바카이(도 7C(i))의 것보다 더 강한 면역 강화 활성(도 7C(ii))을 가진다는 것을 알 수 있다.
1㎎ 열에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)(도 7D(i))로 면역주사를 맞은 쥐에서 오브알부민에 대한 세포독성 세포가 발생되나, 별도로 1㎎ 열에 의해 죽은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)(도 7D(ii)), 1㎎ 미코박테리움 보비스(M. bovis)BCG(도 7D(iii)), 1㎎ 미코박테리움 플라이(M. phlei)(도 7D(iv)), 1㎎ 미코박테리움 스메가마투스(M. smegmatis)(도 7D(v))로 면역주사를 한 쥐에서는 세포독성 세포가 발생되지 않았다.
이와 같은 발견은 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)가 다른 미코박테리아에서는 항항원체 성질을 가지지 않는다는 것을 설명하는 것이다. 또한, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 지질 및 당지질을 제거하면 NK 세포 자극 활성을 제거하지만, T-세포 자극 활성을 상실하는 것은 아니다.
별도의 실험에서, 오브알부민과 200㎍ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐는 세포독성 세포를 만들 수 있다는 것이다(오브알부민만으로 면역주사를 맞은 기준 생쥐와 비교하였을 때, 기준 생쥐의 〈8%의 것과 비교하면 28% 내지 46% 최대 특이적인 용해를 보임).
상기에서 설명을 하고 있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 등전점 포커스를 이용하여 분취하고, 분취물은 상기에서 설명하는 것과 같이 C57BL/6 쥐에서 항-오브알부민 특이적인 세포 독성 반응 검사에서 항항원체 활성에 대해 검사를 한다. pI가 4.2-4.32(분취물 번호;7-9), 4.49-4.57 (분취물 번호; 13-17), 4.81-5.98(분취물 번호; 23-27)에 상응하는 분취물에서 피크 항항원체 활성이 나타났다.
항체를 이용한 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 단백질의 동정
BALB/c 생쥐는 복막을 통하여, 5주간 일주일에 1회씩 50㎍ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사하였다. 하기에서 설명하는 것과 같이 준비된 표준 효소-연결 면역검사를 이용하여, 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 단백질에 대한 항체에 대해 혈청을 검사하였다.
항혈청은 몇 가지 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 단백질 또는 오브알부민(효소-연결된 검사에서 무관한 음성 기준 단백질로 이용됨)과도 반응을 하지 않았다(자료는 없음), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐의 항혈청은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 12개의 GV 항원과 반응하였다. 그 결과를 다음의 표 12에 나타내었다. 따라서, 확인된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 있는 항혈청은 다음과 같다;GV3, 5P, 5, 7, 9, 22B, 24, 27, 27A, 27B, 33, 45.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 GV 항원과 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항혈청과의 반응성
GV 항원 3 5P 5 7 9 22B 24 27 27A 27B 33 45
반응성* 103 103 103 102 104 103 104 106 105 106 104 104
*는 비-면역화된 생쥐의 혈청보다 더 큰 활성을 가지는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역화된 생쥐의 혈청에서 최대 희석한 것을 나타냄.
T 세포 반응으로 확인된 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 있는 단백질.
BALB/c 생쥐에 각부에 100㎍ DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)와 인컴플리트 Freund's 항항원체를 복합하여 주사하고, 10일 후에 생쥐를 죽여서, 슬와 임파 노드 세포를 얻었다. 면역화된 생쥐와 면역화되지 않은 생쥐의 세포를 in vitro 상에서 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 GV 단백질로 자극하였다. 3일 후에, 세포 증식 및 IFNr 생산을 평가하였다.
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)으로 면역화된 생쥐의 임파노드 세포가 GV 단백질에 대해 T 세포 증식성 반응
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 받은 생쥐의 임파노드 세포는 무관한 단백질 즉, 오브알부민에 대해 반응하여 증식하지는 않았다(자료는 없음). 표 13에서 볼 수 있는 것과 같이, 면역주사를 맞은 생쥐의 임파 노드 세포는 GV 3, 7, 9, 23, 27, 27B, 33에 대해 증식성 반응을 나타내는 것으로 보인다. 비-면역화된 생쥐의 이에 상응하는 세포는 이와 같은 GV 단백질에 대해 증식을 하지 않았고, 이는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐가 이와 같은 단백질로 면역화되었다는 것을 말하는 것이다. 따라서, 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 단백질인 GV 3, 7, 9, 23,27, 27B, 33는 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 존재한다.
in vitro에서 GV 단백질로 도전을 받은 후에 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐의 의 임파 노드 세포에 의한 IFNγ 생산
면역주사를 맞지 않은 생쥐의 임파 노드 세포는 GV 단백질로 자극을 받았을 경우에, IFNγ를 생산하지 않았다. 하기 표 14에서 볼 수 있는 것과 같이, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 생쥐의 임파 노드 세포는 GV 3, 5, 23, 27A, 27B, 33, 45, 46로 자극을 받았을 경우에 약량에 따라 IFNγ를 분비하였고, 이는 생쥐가 이들 단백질로 면역화되었다는 것을 말하는 것이다. 면역화된 생쥐의 세포가 무관한 단백질 가령, 오브알부민과 같은 단백질로 자극을 받았을 경우에 IFNγ생산이 감지되지 않았다. 따라서, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 단백질 GV 3. 5, 23, 27A, 27B, 33, 45, 46이 존재한다는 것이다.
비-특이적인 면역 증폭물질로써 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에 있는 단백질
연속되는 실험에서 5개의 단백질 GV27, 27A, 27B, 23, 45을 오브알부민 항원과 비-특이적인 면역 증폭물질로 이용하여, 실시예 6에서 설명하는 것과 같은 생쥐를 면역화시킨다. 도 12에서 볼 수 있는 것과 같이, 임의 재조합 단백질 GV27, 27A, 27B, 23, 45중 한 개를 50㎍ 오브알부민 50-100㎍과 함께 주사하면, 오브알부민에 대해 세포 독성이 발생되는 항항원체 성질이 설명된다.
실시예 9
미코박테리움 튜베르큘로시스(M. tuberculosis) 감염된 대식세포에 대해 증기살균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 세포독성 CD8 T 세포를 만든다.
본 실시예에서는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)가 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 감염된 대식세포를 적절하게 죽이는 세포독성 CD8 T 세포를 자극하는 능력에 대해 설명한다.
쥐는 실시예 1에서 설명하는 것과 같이 준비한 500㎍ 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 복막 내로 주사하여 면역화시킨다. 면역주사를 한 후 2주 뒤에, 면역주사를 맞은 쥐의 췌장 세포는 CD8 T세포가 있는 칼럼(R＆D Systems, St. Paul, MN, USA)을 통하여 통과시킨다. 칼럼에서 회수한 췌장 세포에는 최고 90% CD8 T 세포가 있는 것으로 나타났다. 이들 T 세포와 면역 주사를 받지 않은 쥐에서 취한 CD8 T 세포를 감염안된 대식세포 또는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 감염된 대식세포를 죽이는 능력에 대해 테스트를 하였다.
대식세포는 1㎖ 3% 티오글리콜레이트를 복막으로 주사한 후에 5일 뒤 쥐의 복강에서 얻는다. 대식세포는 대식세포당 2개 미코박테리아의 비율로 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 하룻밤동안 감염을 시킨다. 모든 대식세포 준비물은 104대식세포 당 2μci에서51크로미늄으로 라벨을 한다. 그 다음 대식세포는 킬러와 표적의 비율을 30:1로 하여 하룻밤동안(약 16시간) CD8 T 세포와 배양을 한다. 특이적인 죽음은51크로미늄이 방출되는 것으로 감지를 하고, 실시예 5에서 계산된 것과 같은 특정 용해%로 나타낸다.
CD8 T 세포를 대식세포와 공동 배양을 한 후 3일 뒤에 IFN-γ의 생산 및 이것이 배지로 방출되는 양은 효소-결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 측정을 할 수 있다. ELISA 플레이트는 쥐 IFN-γ(Pharmigen, San Diego, CA, USA)/PBS에 대한 쥐 단클론성 항체로 4℃에서 피복을 한다. 웰은 한 시간동안 실온에서 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS로 차단을 하였다. 플레이트는 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS로 4번 세척을 하고, ELISA 플레이트에서 배양 배지로 1:2로 희석된 샘플은 실온에서 하룻밤동안 배양한다. 플레이트는 다시 세척을 하고, 바이오티닐화된 단클론 쥐 항-마우스 IFN-γ항체(Pharmigen)는 PBS로 희석을 하여 1㎍/㎖로 한 후에, 각 웰에 첨가한다. 그 다음 플레이트는 실온에서 한 시간동안 배양을 하고, 세척을 하고, 양고추냉이 과산화효소 결합된 아비딘-D(Sigma A-3151)는 PBS에서 1:4,000으로 희석한 후에 첨가한다. 실온에서 추가 1 시간 배양을 한 후에, 플레이트는 세척을 하고, OPD 기질을 첨가한다. 반응은 10분 후에 10% (v/v) HCl를 이용하여 종료시킨다. OD는 490㎚에서 결정한다. 두 개 플레이트 모두에서 배지만 있는 경우에서 배양된 세포의 평균 OD보다 2배 이상 큰 OD값을 가지는 분취물은 양성으로 간주한다.
표 15에서 볼 수 있는 것과 같이 미코박테리움 바카이로 면역주사를 한 쥐의 췌장에서 취한 CD8 T 세포는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 감염된 대식세포에 대해 세포독성이 있으나, 감염되지 않은 대식세포는 용혈시키지 않았다. 면역주사를 하지 않은 쥐의 CD8 T 세포는 대식세포를 용혈시키지 않았다. 고유 또는 면역주사를 맞지 않은 쥐의 CD8 T 세포는 감염된 대식세포와 배양을 하였을 경우에 IFN-γ을 생산하였다. 배양물에서 생산된 IFN-γ의 양은 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 면역주사를 맞은 쥐에서 유도한 CD8 T 세포보다 많았다.
실시예 10
미코박테리움 바카이 배양 여과물로부터 폴리펩티드를 정제 및 특징화
이 실시예에서는 배양 여과물에서 수득한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 가용성 단백질을 준비하는 것에 관계한다. 다른 언급이 없는 한, 다음의 실시예에 있는 모든 비율은 중량비를 나타낸다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae (ATCC Number 15483))는 37℃에서 Medium 90에 배양을 하였다. 세포는 원심분리에 의해 수득하고, 포도당이 포함된 멸균 Middlebrook 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)로 옮기고 하루동안 37℃에서 배양한다. 세포는 원심분리에 의하여 수득하고, 포도당이 있는 Middlebrook 7H9 배지에 옮겨 하루동안 37℃ 배양한다. 배지는 그 다음 원심분리하여(큰 세포는 남기고), 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통과시켜 멸균 병안으로 옮긴다.
배양 여과물은 냉동건조에 의해 농축시키고, MilliQ 물에 재용해시킨다. 소량의 불용성 물질은 0.45μ막을 통하여 여과시켜 제거한다. 배양 여과물은 3,000kD 분자량 차단(MWCO) 막을 포함하고 있는 400㎖ Amicon 교반된 셀에서 막 여과에 의해 염을 제거한다. 압력은 질소 기체를 이용하여 50psi로 유지한다. 배양 여과물은 막 여과에 의해 반복적으로 농축시키고, 물로 희석하여 샘플의 전도율이 1.0 mS이하가 되도록 한다. 이 과정으로 샘플의 용적은 20ℓ에서 약 50㎖로 감소된다. Bradford 단백질 검사(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정한다.
염이 제거된 배양 여과물은 10mM Tris HCl 완충액 pH 8.0으로 균등화시킨 Q-Sepharose(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)(16×100㎜)컬럼에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분류한다. 폴리펩티드는 상기 완충액에서 0 내지 1.0M의 염화나트륨 선형 농도차를 이용하여 용출한다. 컬럼 용출물은 280㎚에서 모니터한다.
이온 교환 칼럼으로부터 용출되는 폴리펩티드 푸울은 3,000 MWCO을 포함하는 400㎖ Amicon 교반된 쎌에서 농축시킨다. 압력은 질소 기체를 이용하여 50psi에서 유지한다. 폴리펩티드는 막 여과에 의해 반복적으로 농축시키고, 1% 글리신으로 희석하여 샘플의 전도율이 0.1mS이하가 되도록 한다.
정제된 폴리펩티드는 Rotofor 장치(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 준비된 등정점 포커슨에 의해 분취한다. pH차는 1.6% pH 3.5-5.0 암포라이트, 0.4% pH 5.0-7.0 암포라이트로 구성된 Ampholytes (Pharmacia Biotech) 혼합물로 만든다. 아세트산(0.5M)을 양극액으로 이용하고, 0.5M 에탄올아민을 음극액으로 이용한다. 제조업자의 지시에 따라 6시간동안 12W 정압에서 등전성 포커스를 실행한다. 20개 분취물을 수득할 수 있다.
등전점 포커스에서 분취물을 복합하고, 폴리펩티드는 Vydac C4 칼럼(Separations Group, Hesperia, CA, USA) 300Å, 5미크론 입자 크기(10×250㎜)에서 정제한다. 폴리펩티드는 아세토니트릴(0-80%v/v)/0.05%(v/v) 트리플로로아세트산(TFA) 선형 농도차로 칼럼으로부터 용출한다. 유속은 분당 2.0㎖이고, HPLC 용출물은 220㎚에서 모니터한다. 폴리펩티드를 포함하는 분취물은 수득하여 개별 샘플의 순도를 최대화한다.
상대적으로 풍부한 폴리펩티드 분취물은 Vydac C4 칼럼(Separations Group) 300Å, 5미크론 입자 크기(4.6×250㎜)에서 정제한다. 폴리펩티드는 아세토니트릴(20-60%v/v)/0.05%(v/v) TFA 선형 농도차로 칼럼으로부터 유속을 분당 1.0㎖로 하여 용출한다. 용출된 폴리펩티드를 포함하는 분취물은 수득하여 개별 샘플의 순도를 최대화한다. 약 20개 폴리펩티드 샘플을 수득하고, 이들은 Laemmli (Laemmli, U.K., Nature 277:680-685, 1970)과정에 따라 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 순도를 분석한다.
상당히 오염된 것으로 나타나는 폴리펩티드 분취물은 Mono Q 칼럼 (Pharmacia Biotech) 10 미크론 입자 크기(5×50㎜)또는 Vydac 디페닐 컬럼(Separations Group) 300Å, 5미크론 입자 크기(4.6×250㎜)에서 추가 정제를 한다. Mono Q 칼럼으로부터 폴리펩티드는 0-0.5M NaCl/10mM Tris HCl pH 8.0선형 경사 농도를 이용하여 용출한다. Vydac 디페닐 컬럼으로부터 폴리펩티드는 아세토니트릴(20-60% v/v)/0.1% TFA의 선형농도를 이용하여 용출한다. 유속은 분당 1.0㎖이고, 컬럼 용출물은 두 가지 칼럼으로부터 220㎚에서 모니터한다. 폴리펩티드 피크 분취물을 수득하고 상기 설명한 것과 같이 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 순도를 분석한다.
서열화를 위해, 폴리펩티드는 개별적으로 BiobreneTM(Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA)-처리된 유리 섬유 여과물에서 건조한다. 폴리펩티드가 있는 여과물은 Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기에 적하하고, 폴리펩티드는 통상적인 Edman 화학을 이용하여 아미노 말단에서부터 서열화한다. 각 폴리펩티드에서 PTH 아미노산 유도체의 보유 시간과 적절한 PTH유도체 표준의 것을 비교하여 아미노산 서열을 결정한다.
일부 항원의 경우에, 항원을 엔도프로테아제 Lys-C로 절단하거나 또는 시아노겐 브로마이드로 항원을 화학적으로 절단하여 내부 서열을 또한 결정하였다. 이들 과정중 어느 것에 따라 생성된 펩티드는 이동상으로 0.05% (v/v) 트리플로오르아세트산을 이용하고, 0.05% (v/v) TFA (1%/min)을 포함하는 아세토니트릴 농도차를 이용하여 Vydac C18 칼럼에서 역상 HPLC에 의해 분리한다. 용출물은 214㎚에서 모니터한다. 주요 내부 펩티드는 이들의 UV 흡수도에 의해 확인되었고, 이의 N-말단 서열은 상기와 같이 결정한다.
전술한 과정을 이용하여, 6개 가용성 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 즉, GVc-1, GVc-2, GVc-7, GVc-13, GVc-20, GVc-22를 분리하였다. GVc-1에 대한 결정된 N-말단 내부 서열은 각 서열 번호 1, 2, 3으로 지정한다. GVc-2의 N-말단 서열은 서열 4이고; GVc-7의 내부 서열은 서열 5-8이 되고; GVc-13의 내부 서열은 서열 9-11이 되고; GVc-20의 내부 서열은 서열 12가 되고; GVc-22의 N-말단 및 내부 서열은 서열 56-59이다. 시아노겐 브로마이드(Met) 또는 Lys-C(Lys)의 공지의 절단 특징에 기초하면, 제공되는 내부 각 서열에는 폴리펩티드에서 이 위치에 존재하는 것으로 가정되는 아미노산 잔기로 시작된다.
GVc-16, GVc-18, GVc-21로 지정한 세 가지 추가적인 폴리펩티드는 상기에서 설명을 하고 있는 미리 준비된 등전점 포커스와 함께 준비된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분리하였다. 특히, 이미 설명한 것과 같은 예비 등전점 포커스 정제 단계로부터 폴리펩티드 혼합물로 구성된 분취물은 15% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE로 정제한다. 샘플은 환원 샘플 완충액에 용해하고, 겔에 얹는다. 분리된 단백질은 10%(v/v) 메탄올을 포함하는 10mM 3-)사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산(CAPS) 완충액 pH 11에서 일렉트로블랏팅하여, 폴리비닐리덴디플로라이드(PVDF)막에 옮긴다. 옮겨진 단백질 밴드는 코마시 블루로 PVDF 막을 착색하여 확인을 할 수 있다. 가장 풍부한 펩티드 종을 포함하는 PVDF 막 부분을 절단하고, Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기의 샘플 카트릿지에 바로 넣는다. 상기에서 설명한 것과 같이 단백질 서열을 결정한다. GVc-16, GVc-18, GVc-21에 대한 N-말단 서열은 서열 13, 14, 15에 나타내었다.
GVc-12, GVc-14, GVc-15, GVc-17, GVc-19로 지정한 추가 항원은 전술한 것과 같이 크로마토그래피 과정에 추가하여 예비 SDS-PAGE 정제 단계를 이용하여 분리한다. 특히, 이미 설명한 것과 같이 Vydac C4 HPLC 정제 단계로부터 항원 혼합물로 구성된 분취물은 폴리아크릴아미드 겔에서 예비 SDS-PAGE에 의해 분취한다. 분리된 단백질은 CAPS 완충액 pH 11에서 일렉트로블랏팅하여, PVDF막에 옮긴다. 옮겨진 단백질 밴드는 코마시 블루로 PVDF 막을 착색하여 확인을 할 수 있다. 가장 풍부한 펩티드 종을 포함하는 PVDF 막 부분을 절단하고, Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기의 샘플 카트릿지에 바로 넣는다. 상기에서 설명한 것과 같이 단백질 서열을 결정한다. GVc-12, GVc-14, GVc-15, GVc-17, GVc-19의 N-말단 서열은 각각 서열 16-20에 나타내었다.
상기 모든 아미노산 서열은 GeneAssist system을 이용하여 SwiaaProt 데이터 베이스(version R32)에서 공지의 아미노산 서열과 비교한다. 아미노산 서열 GVc-2 내지 GVc-22에 상동성인 서열은 없었다. GVc-1에 대한 아미노산 서열은 미코박테리움 보비스(M. bovis)와 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에서 이미 확인된 서열과 일부 유사성을 가지는 것으로 확인되었다. 특히, GVc-1은 세포 표면 단백질인 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) MPT83 뿐만 아니라 MPT70과 약간의 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 이들 단백질은 단백질 족의 일부분을 형성한다(Harboe et al., Scand. J. Immunol. 42:46-51, 1995).
서열 연구에 의해 GVc-13, GVc-14와 GVc-22의 DNA 서열을 분리하였다(각 서열 142, 107, 108). 이에 상응하는 GVc-13, GVc-14와 GVc-22의 아미노산 서열은 각각 서열 143, 109, 110에서 나타낸다. GVc-13을 인코드하는 전체 길이의 유전자에 대해 결정된 DNA 서열은 서열 195이고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 서열 196에 제공된다.
GVc-22를 이용한 추가 연구에서는 GVc-22를 인코드하는 유전자의 일부분만이 클론되었다는 것이다. 발현벡터 pET16에 서브-클론시켜도 단백질 발현이 일어나지 않는다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) BAMHI 게놈 DNA 라이브러리(불완전하게 유전자 단편을 가지는)를 연속하여 스크리닝하면, GVc-22를 인코드하는 완전한 유전자를 분리할 수 있다. 완전하게 클론된 것과 부분적인 GVc-22를 구별하기 위해, 전체 길이 유전자에 의해 발현된 항원을 GV-22B라고 한다. GV-22B를 인코드하는 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측 아미노산 서열은 각 서열 144 및 145에 제공하고 있다.
GVc-1(서열1) 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) MPT70의 아미노산 서열로부터 각각 증폭 프라이머 AD86와 AD112(서열 60, 61)을 만들었다. 이와 같은 프라이머를 이용하여, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA에서 310bp 단편을 증폭시키고, 이를 추가된 dTTP 잔기를 포함하는 EcoRV-처리된 벡터 pBluescript(Stratagene)에 클론시킨다. 클론된 삽입물의 서열은 서열 62에 나타내었다. 이와 같은 클론 삽입체를 이용하여, 람다 ZAP-Express(Stratagene, La Jolla, CA)에서 작제된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 분리된 클론에는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원 MPT83에 상동성인 오픈 리딩 프레임을 포함하여 이를 GV-1/83라고 칭한다. 이 유전자는 또한 M. bovis 항원 MPB83과 상동성을 가진다. 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열은 각 서열 146 및 147에 나타내었다.
서열 1과 2에서 제공하는 아미노산 서열로부터, 축중 올리고뉴클레오티드 EV59 및 EV61(서열: 148 및 149)을 고안하였다. PCR을 이용하여, 표준과정에 준하여(Sambrook et al. Ibid), 100bp 단편을 증폭시키고, 이를 플라스미드 pBluescript Ⅱ SK+로 클론시켜, 서열화시켰다(서열: 150). 클론된 삽입체를 이용하여 람다 ZAP-Express에서 작제된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 분리된 클론에는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 MPT70 및 미코박테리움 보비스(M. bovis) MPB70에 상동성인 오픈 리딩 프레임을 포함하여 이를 GV-1/70라고 칭한다. 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열은 각 서열 151 및 152에 나타내었다.
발현 및 정제를 위해, GV1/83, GV1/70, GVc-13, GVc-14, GV-22B를 인코드하는 유전자를 발현벡터 pET16(Novagen, Madison, WI)에 서브-클론시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라 발현 및 정제를 실행하였다.
정제된 폴리펩티드에 대해 면역 사람 제공자의 말초 혈액에서 T-세포 증식 및 IFN-γ를 유도하는 능력에 대해 스크린하였다. 이와 같은 제공자는 PPD(M. tuberculosis에서 유도된 정제 단백질) 피부 테스트에 양성으로 공지되어 있고, 이의 T 세포는 PPD에 반응하여 증식되는 것으로 나타났다. 제공자 PBMCs와 미코박테리움 바카이(M. vaccae)배양 여과물로부터 정제안된 가용성 단백질은 10%(v/v) 자가이식 혈청, 페니실인(60㎍/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 글루타민(2mM)이 보충된 RPMI 1640로 구성된 배지에서 배양하였다.
3일 후에, 하기에서 설명하는 것과 같이, IFN-γ 수준을 결정하기 위해 각 웰로부터 50㎕ 배지를 빼낸다. 플레이트는 추가 4일간 배양을 하고, 추가 18시간동안 1μCi/well 3중수소 티미딘으로 펄스하고, 수득하여 신틸레이션 카운터로 3중수소가 결합된 양을 결정한다. 배지만으로 배양된 세포에서 관찰되는 증식에 2배 이상 증식을 자극하는 분취물은 양성이라고 간주한다.
IFN-γ는 효소-결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 측정한다. ELISA 플레이트는 4℃에서, 4시간동안 사람 IFN-γ(Endogen, Wobural, MA) 1㎍/㎖인산-완충 염(PBS)에 대한 쥐 단클론성 항체로 피복한다. 웰은 실온에서 1시간동안 0.2% Tween 20을 포함하는 PBS로 차단한다. 플레이트는 그 다음 PBS/0.2% Tween 20으로 4번 세척을 하고, 샘플은 배양 배지로 1:2로 희석을 하고, ELISA 플레이트는 실온에서 하룻밤동안 배양을 한다. 플레이트는 다시 세척을 하고, 바이오티닐화된 다클론성 토끼 항-사람 IFN-γ혈청(Endogen)은 PBS로 1㎍/㎖로 희석을 하고, 각 웰에 첨가한다. 그 다음 플레이트는 실온에서 1시간동안 배양을 하고, 세척을 하고, 양고추냉이 과산화효소-결합된 아비딘 A(Vector Laboratories, Burlingame, CA)는 PBS로 1:4,000으로 희석을 하여 첨가한다. 실온에서 추가 1시간동안 배양을 한 후에, 플레이트는 세척을 하고 오르소페닐렌디아민(OPD) 기질을 첨가한다. 반응은 10분 후에 10%(v/v) HCl로 중단시킨다. 490㎚에서 광학 밀도를 측정한다. 배지만으로 배양된 세포의 평균 OD의 약 2배이상의 OD값을 가지는 분취물은 양성으로 간주한다.
표 16에서는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) T세포의 증식 및 IFN-γ 생산을 자극하는 서열을 포함하는 폴리펩티드의 예를 나타낸 것으로, 이때 (-)는 활성이 부족함; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 크지만 2배 미만인 결과를 나타내는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 활성이 2배 내지 4배를 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타낸다.
실시예 11
2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 배양 여과물로부터 수득된 폴리펩티드의 정제 및 특징화
하기에서 설명하는 것과 같이 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 가용성 단백질을 배양 여과물로부터 분리하였다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae (ATCC Number 15483))는 37℃에서 Medium 90에 배양을 하였다. 미코박테리움 튜베로큘로시스(M. tuberculosis) 균주 H37Rv(ATCC No/ 27294)는 Tween 80 및 올레인산/알부민/덱스트로즈/카탈라제 첨가물(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)가 있는 멸균 Middlebrook 7H9 배지에서 배양하였다. 세포는 원심분리에 의하여 수득하고, 포도당이 있는 Middlebrook 7H9 배지에 옮겨 하루동안 37℃ 배양한다. 배지는 그 다음 원심분리하여(큰 세포는 남기고), 배양 여과물은 0.45μM 필터를 통과시켜 멸균 병안으로 옮긴다.
배양 여과물은 냉동건조에 의해 농축시키고, MilliQ 물에 재용해시킨다. 소량의 불용성 물질은 0.45μ막을 통하여 여과시켜 제거한다.
배양 여과물은 3,000kD 분자량 차단(MWCO) 막을 포함하고 있는 400㎖ Amicon 교반된 셀에서 막 여과에 의해 염을 제거한다. 압력은 질소 기체를 이용하여 60psi로 유지한다. 배양 여과물은 막 여과에 의해 반복적으로 농축시키고, 물로 희석하여 샘플의 전도율이 1.0 mS이하가 되도록 한다. 이 과정으로 샘플의 용적은 20ℓ에서 약 50㎖로 감소된다. Bradford 단백질 검사(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정한다.
염이 제거된 배양 여과물은 10mM Tris HCl 완충액 pH 8.0으로 균등화시킨 Q-Sepharose(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)(16×100㎜)컬럼에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분류한다. 폴리펩티드는 상기 완충액에서 0 내지 1.0M의 염화나트륨 선형 농도차를 이용하여 용출한다. 칼럼 용출물은 280㎚에서 모니터한다.
이온 교환 칼럼으로부터 용출되는 폴리펩티드 푸울은 예비 2D 겔 전기영동에 의해 분취한다. 200-500㎍ 폴리펩티드를 포함하는 샘플은 요소에서 8M로 만들고, 폴리아크릴아미드 포커스 로드 겔(직경 2㎜, 길이 150㎜, pH 5-7)에 얹는다. 등전점 포커스 단계후에, 1차원 겔은 환원 완충액으로 평형시키고, 2차 겔(16% 폴리아크릴아미드)에 얹는다. 도 2A, 2B는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv 배양 여과물에서 각각 관찰되는 2D 겔 패턴을 나타낸다. 2차원 분리에 의해 수득된 폴리펩티드는 10%(v/v)메탄올을 포함하는 10mM CAPS 완충액 pH 11에서 일렉트로블랏팅하여, PVDF막에 옮긴다. 코마시 블루로 PVDF 막을 착색하여 단백질을 확인할 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 포함하는 PVDF 부분을 절단하고, Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492 단백질 서열기의 샘플 카트릿지에 바로 넣는다. 폴리펩티드는 통상적인 Edman 화학을 이용하여 아미노 말단에서부터 서열화한다. 각 폴리펩티드에서 PTH 아미노산 유도체의 보유 시간과 적절한 PTH 유도체 표준의 것을 비교하여 아미노산 서열을 결정한다. 이와 같은 과정을 이용하여, 11개 폴리펩티드 즉 GVs-1, GVs-3, GVs-4, GVs-5, GVs-6, GVs-8, GVs-9, GVs-10, GVs-11, GV-34, GV-35을 분리하였다. 이들 폴리펩티드의 결정된 N-말단 서열은 각 서열 21-29, 63, 64에 나타내었다. 상기에서 설명한 것과 같은 정제 과정을 이용하여, 더 많은 단백질을 정제하여, GVs-9에서 이미 수득한 아미노산 서열을 연장하였다. GVs-9에 대해 연장된 아미노산 서열은 서열 65에 제공하였다. 또한 추가 연구하여, GVs-9 및 GV-35의 DNA 서열을 분리하여 각 서열 111 및 155에 나타내었다. 이에 상응하는 예측 아미노산 서열은 서열 112 및 156에 나타내었다. GV9에 대한 연장된 DNA 서열은 153에 나타내었고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 154에 나타내었다. 예측된 GV-9의 아미노산 서열은 서열 197에 나타내었다.
상기 모든 아미노산 서열은 GeneAssist system을 이용하여 SwiaaProt 데이커 베이스(version R35 plus update)에서 공지의 아미노산 서열과 비교한다. GVs-3, GVs-4, GVs-5, Gvs-9를 제외하고는 상당한 상동성이 나타나지는 않았다. GVs-9에서는 두 가지 이미 확인된 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 단백질 즉, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 큐티나제 전구물질 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 가상 22.6 kD 단백질과 어느 정도 상동성을 가지고 있다. GVs-3, GVs-4, GVs-5에서도 미코박테리움 레프레(M. leprae) 85A와 85B 단백질(각 서열 30, 31); 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 85A와 85B 단백질(각 서열 30, 31); 미코박테리움 보비스(M. bovis) 85A와 85B 단백질(각 서열 34, 35); 미코박테리움 레프라(M. leprae) 85C 항원 단백질(서열 36) 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 서열(37)을 나타내었다.
실시예 12
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 85 시리즈의 DNA 클로닝 전략
항원 85A, 85B, 85C에 대한 프로브는 주어진 미코박테리움 종에 있는 족과 미코박테리움 종간에 보존된 항원 85 게놈 서열의 부분에 대한 축중 올리고뉴클레오티드(서열 38, 39)를 이용하여 중합효소 사슬 연쇄 반응(PCR)으로 준비하였다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 스트린젼스 조건을 완화시킨 상태하에서 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA로부터 표적 서열을 증폭시킨다. 약 0.5kb 크기 밴드를 확인하여 정제하고, T-tailed p Bluescript II SK(Stratagene, La Jolla, CA)에 클론시킨다. 항원 85 PCR 생성물 존재에 대해 24개 개별 콜로니를 스크리닝하고, Perkin Elmer/Applied Biosystems Model 377 자동화된 서열화기와 M13계 프라이머, T3와 T7를 이용하여 서열화한다. GenBank 데이터베이스의 상동성 조사에서 23개 콜로니에는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 보비스(M. bovis)에서 공지된 항원 85 유전자에 상당한 상동성이 있는 삽입물을 포함하는 것으로 나타났다. 대략 절반정도가 항원 85C 유전자 서열에 대부분 상동성을 가지고, 나머지는 항원 85B 서열에 더욱 유사한 것이다. 또한, 이들 가상 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 85 게놈 서열은 서로 80% 상동성을 가진다. 이와 같은 높은 유사성 때문에, 항원 85C PCR 단편을 선택하여 세 가지 항원 85 유전자에 대해 매우 낮은 스트린젼시 조건하에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 라이브러리를 스크린한다.
부분적으로 BamHI로 절단한 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA를 비슷하게 절단된 λvector에 클로닝시켜, λZapExpress(Stratagene, La Jolla, CA)에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 라이브러리를 만들었는데, 개별적인 플락 형성 단위는 3.4 x 105이다. 스크리닝을 목적으로, 증폭 안된 이들 라이브러리에서 27000 플락을 8개 100㎠ 플레이트에 저 밀도로 플레이팅한다. 각 플레이트에서, 이중 플락 리프트는 Hybond-N-나일론 막(Amersham International United Kingdom)으로 취하고, 약화된 스트린젼시 조건하에서(55℃), 방사능라벨된 항원 85C PCR 생성물에 하이브리드시킨다. 자가방사그래프에서, 79개 플락은 일관적으로 이와 같은 조건하에서 항원 85C 프로브에 하이브리드된다. 추가 분석을 위하여, 무작위로 13개 양성 하이브리드된 플락을 선별하고, 라이브러리 플락으로부터 분리하는데, 각 양성 클론을 이용하여 약 200개 플락을 포함하는 2차 스크리닝 플레이트를 만든다. 각 플레이트의 이중 리프트는 Hybond-N-나일론 막을 이용하여 취하고, 1차 스크리닝에서 이용된 조건과 같은 조건하에 하이브리드한다. 스크리닝한 13개 플레이트 각각에는 여러개의 양성 하이브리드되는 플락을 확인하였다. 추가 분석을 위해 각 2차 플레이트로부터 두 개의 잘분리된 양성 파아지를 선택한다. in vitro 절단을 위해, 26개 플락을 파아지미드로 전환시키고 제한효소지도를 작성한다. 이 지도를 기초하여 클론을 네 가지 그룹으로 분류할 수 있다. 각 그룹의 몇가지 대표적인 것에 대한 5'와 3'단부에서 서열 데이터를 Perkin Elmer/Applied Biosystems Model 377 자동화된 서열화기와 M13계 프라이머, T3와 T7를 이용하여 얻는다. GeneBank 데이터베이스 FASTA 분석 및 와 GeneAssist 소프터웨어 패키지를 이용하여, 서열의 상동성을 결정한다. 이들 클론 세트중 두 개가 미코박테리움 보비스(M. bovis)와 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 항원 85A 단백질에 상동성인 것으로 나타났는데, 이들 각각에는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 유전자의 5' 또는 3'단부를 포함한다(이 유전자는 내부에 BamHI 부위를 가지기 때문에 라이브러리를 만드는 동안에 절단된다). 남아있는 클론에서는 여러 미코박테리움 종의 항원 85B와 85C에 상동성인 서열을 포함하는 것을 알 수 있다. 각 유전자에 나머지 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해, 적절한 서브클론을 만들고 서열화한다. 겹쳐지는 서열은 DNA Strider software를 이용하여 배열한다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 85A, 85B, 85C에 대한 결정된 DNA 서열을 각각 서열 40-42에 나타내고, 예측된 아미노산 서열은 각각 서열 43-45에 나타내었다.
다음과 같이 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GVc-3, GVc-5를 발현시키고, 정제한다. GVc-3와 GVc-5의 삽입 서열(각 서열 40, 42)로부터 가상 리더 서열로부터 하류 서열 데이터 및 클론의 3' 말단을 이용하여, 증폭 프라이머를 고안하였다. GVc-3에 대한 프라이머 서열을 서열 66, 67에 나타내고, GVc-5에 대한 프라이머 서열은 서열 68, 69에 나타낸다. 클로닝의 편의를 위해, GVc-3에 대한 프라이머에 XhoI 제한 효소 부위를 삽입시키고, GVc-5에 대한 프라이머에 EcoRi와 BamHI 제한 효소 부위를 삽입시킨다. 게놈 미코박테리움 바카이 DNA로부터 증폭후에, 단편은 pProEX HT 원핵세포 발현 벡터(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD)내의 적절한 부위에 클로닝하고, 정확한 리딩 프레임 및 방향을 확인하기 위해 서열화한다. 제조업자의 지시에 따라 재조합 단백질의 발현 및 정제를 한다.
다음과 같이 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GVc-4(항원 85B 상동)의 단편을 발현시킨다. 상기에서 설명한 프라이머 AD58와 AD59를 이용하여, 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA의 485bp 단편을 증폭시킨다. 이 단편은 표준 기술을 이용하여 겔-정제하고, EcoRV-절단한 pBluescript(dTTP 잔기가 첨가되어 dLTdma)안에 클로닝한다. 5개 클론에서 삽입체의 염기 서열을 결정하고, 이들이 서로 동일함을 확인하였다. 이들 삽입물은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 항원 85B에 가장 큰 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 클론중 한 개에서 삽입물은 pProEX HT 원핵 발현 벡터(Gibco BRL)의 EcoRI/XhoI 부위에 스버클론하여, 제조업자의 지시에 따라 발현시키고, 정제한다. 이와 같은 클론은 유전자의 일부만이 발현되었기 때문에 GVc-4P로 명명한다. 부분적인 클론 GVc-4P의 아미노산 및 DNA 서열은 서열 70과 106에 각각 나타내었다.
GV-4P의 클로닝과 유사하게, 증폭 프라이머 AD58 및 AD59를 이용하여, gvS-5(서열 42)를 포함하는 클론에서 485bp 단편을 증폭시킨다. 이와 같은 단편을 발현벡터 pET16에 클론시키고, 이를 GV-5P라고 한다. 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측된 GV-5P의 아미노산 서열은 각각 서열 157 및 158에 제공된다.
후속 연구에서, 상기에서 설명하는 유사한 과정을 이용하여, GVc-3, GVc-4P, GVc-5를 또 다른 벡터 pET16(Novagen, Madison, WI)에 다시 클로닝한다.
상기에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 GVc-3, GVc-4P, GVc-5이 PPD-양성 건강한 제공자로부터 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-γ생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 17에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
실시예 5
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원의 DNA 클로닝 전략
GVc-7의 결정된 아미노산 서열(서열 5-8)에 대한 축중 올리고뉴클레오티드를 이용하여 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GVc-7에 대한 84bp 프로브를 증폭시킨다. 이 프로브를 이용하여, 실시예 12에서 설명하는 것과 같은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA를 스크리닝한다. GVc-7의 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 46에 나타내고, 예측 아미노산 서열은 서열 47에 나타내었다. 데이터뱅크에 있는 것과 이들 서열을 비교하였을 때, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 가상 15.8kD 막 단백질에 상동성이 있는 것으로 나타났다.
가상 리더 서열의 하류 서열을 이용하여 GVc-7 유전자의 발현 클로닝용 증폭 프라이머(서열 71, 72)를 만드는데, 서열 46의 서열을 이용한다. A XhoI 부위를 프라이머에 추가하여 클로닝을 편리하게 한다. 게놈 미코박테리움 바카이(M. vaccae) DNA로부터 증폭시킨 후에, 단편은 pProEX HT 원핵 발현 벡터(Gibco BRL)의 XhoI-절단 부위에 클론시키고, 서열화하여 정확한 리딩 프레임 및 그 방향을 확인한다. 제조업자의 프로토콜에 따라 융합 단백질의 발현 및 정제한다. 후속 연구에서, GVc-7은 벡터 pET16(Novagen)안에 다시 클론시킨다.
상기에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 GVc-7이 PPD-양성 건강한 제공자로부터 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-γ생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 3에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
서열 26에 나타낸 GVs-8 펩티드 서열에 대해 축중 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 73, MPG15라고 칭함)를 만들고, 이를 이용하여 상기에서 설명하는 것과 같이 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝한다. 상이한 항원을 인코드하는 두 개 게놈 클론을 분리하였다. GVs-8A(GV-30이라고 다시 명명), GVs-8B(GV-31이라고 다시 명명), GVs-8C(GV-32라고 다시 명명), GVs-8D(GV-33이라고 다시 명명)의 결정된 DNA 서열은 각 서열 48-51에 나타내었고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 52-55에 각각 나타내었다. 클론 GVs-30에는 공지의 원핵 발일-tRNA 합성효소에 일부 상동성을 가지는 부분을 포함하고; GVs-31에서는 미코박테리움 스메가마티스(M. smegmatis) 세미알데히드 데하이드로게나제에 일부 유사한 부분을 포함하고; GVs-32는 H. influenza 폴일폴리글루카메이트 합성효소 유전자에 일부 유사한 부분을 포함하는 것으로 나타났다. GVs-33는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 레프라(M. leprae)에서 이미 확인된 서열에 일부 유사성을 나타내는 오픈 리딩 프레임을 포함하는데, 이의 기능은 확인되지 않았다.
GV-33에 대한 결정된 부분적인 DNA 서열은 서열 74에 제공되고, 이에 상응하는 예측 아미노산 서열은 서열 75에 제공된다. 클론된 3'말단의 서열 자료에서는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 기존에 확인된 40.6kDa 외측 막 단백질에 상동성을 보인다. 후속 연구에서 GV-33의 전체 길이 DNA(서열 193)을 분리하였다. 이에 상응하는 예측된 아미노산 서열은 서열 194에 제공된다.
GV-33을 인코드하는 유전자는 결정된 뉴클레오티드 서열을 기초로한 프라이머와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA에서 증폭시켰다. 이 DNA 단편은 EcoRv-절단된 pBluescriptII SK+(Stratagene)으로 클론시키고, 그 다음 pET16 발현벡터에 옮긴다. 재조합 단백질은 제조업자의 프로토콜에 따라 정제한다.
상기에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 항원이 PPD-양성 건강한 제공자로부터 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-γ생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 4에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
실시예 14
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 단백질 분리
미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 실시예1에서 설명하는 것과 같이 배양하고, 펠렛화시키고, 증기살균을 한다. 살아있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 배양 여과물은 포도당을 포함하는 7H9 배지에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 24시간 배양한 것의 상청액을 의미한다. Virsonic 초음파기(Virtis, Disa, USA)를 이용하여 얼음에서 30초간 4회 격렬하게 증기살균된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 초음파 파쇄하여 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)를 얻는다. 그 다음 물질은 원심분리한다(9000rpm, 20minutes, JA10 rotor, brake = 5). 생성된 펠렛은 100㎖ 클로로포름/메탄올(2:1)에 현탁시키고, 실온에서 1시간동안 배양한 다음; 다시 원심분리를 하고, 클로로포름/메탄올 추출을 반복한다. 펠렛은 원심분리하여 얻고, 진공하에서 건조시키고, 무게를 재고, 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)로 ㎖당 50㎎(건중량)을 PBS에 재현탁시킨다.
2시간동안 50% v/v 에탄올에 재환류시켜 지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 당지질을 제거한다. 원심분리하여(10,000rpm, JA20 rotor, 15mins, brake = 5) 불용성 물질을 수득한다. 재환류하에 50%v/v 에탄올로 추출하는 과정을 2회 이상 반복한다. 불용성 물질은 원심분리에 의해 모으고, PBS에 세척을 한다. 2시간동안 56℃에서 2% SDS/PBS에서 펠렛을 재현탁을 하여 단백질을 추출한다. 불용성 물질은 원심분리에 의해 모으고, 56℃에서 2% SDS/PBS를 이용한 추출은 2회 이상 반복한다. 모아진 SDS 추출물은 4℃로 냉각을 시키고, 침전된 SDS는 원심분리(10,000rpm, JA20 rotor, 15mins, brake = 5)에 의해 제거한다. 동량의 아세톤을 첨가하고, 2시간동안 -20℃에서 배양을 하여 상청액으로부터 단백질을 침전시킨다. 침전된 단백질은 원심분리에 의해 수득을 하고, 50% v/v 아세톤으로 세척을 하고, 진공 하에서 건조시키고, PBS에 다시 용해를 시킨다.
지질이 제거된 그리고 당지질이 제거된 미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도한 SDS-단백질을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석을 하였다. 실버착색 후에 세 가지 밴드를 확인할 수 있다. 후속 실험에서, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 다량의 SDS 추출된 단백질을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다. Coomassie blue로 착색하면 몇 개의 밴드형태의 단백질을 볼 수 있다. 약 30kDa 중량의 밴드로 나타난 단백질을 GV-45라고 정한다. GV-45에 해당되는 결정된 N-말단 서열은 서열 187에 나타내었다. 약 14kDa의 중량을 가진 단백질은 GV-46라고 정하였다. GV-46에 대한 결정된 N-말단 아미노산 서열은 서열 208에 나타내었다.
후속 연구에서, 상기에서 설명한 SDS-추출한 단백질은 BioRad Prep Cell(Hercules, CA)에서 SDS-PAGE로 준비할 수 있다. 분자량 범위에 상응하는 분취물은 트리클로로아세트산으로 침전을 시켜, 상기에서 설명하는 C57BL/6쥐에서 항-오브알부민-특이적인 세포독성 반응 검사에서 항항원체 활성을 검사하기 전에 SDS를 제거한다. 도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 항항원체 활성은 60-70kDa 분취물에서 최대이다. 이 크기 분포에서 가장 풍부한 단백질은 SDS-PAGE에 의해 정제를 하고, 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF)로 블랏틴시키고, 서열화한다. 처음 10개 아미노산 잔기의 서열은 서열 76에 나타내었다. 전술한 것과 같이 유전자 은행에 있는 서열과 비교하면, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis )의 열 쇼크 단백질 65(GroEL)에 상동성이 있는 것을 알 수 있는데, 이는 이 단백질이 GroEL 족 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 구성원이라는 것을 말한다.
전술한 것과 같이 준비된 미코박테리움 바카이에서 분비된 단백질로 면역 주사를 한 원숭이(cynomologous)의 혈청을 이용하여, BamH1-lambda ZAP Express(Stratagene)에 있는 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 양성 플락은 발색계를 이용하여 확인을 할 수 있다. 이들 플락은 다음의 표준 과정에 따라 순수할 때까지 재스크리닝을 한다. 삽입물을 포함하는 pBK-CMV phagemid 2-1는 제조업자의 프로토콜에 따라 ExAssist helper 존재하에 람다 ZAP Express(Stratagene)로부터 잘라낸다. 이 클론의 삽입물(GV-27아라고 칭함)의 5'말단의 염기 서열은 Perkin Elmer/Applied Biosystems Dvision 자동화 서열기에서 형광 프라이머로 Sanger 서열과정을 이용하여 결정한다. 부분적인 미코박테리움 바카이(M. vaccae) GroEL-상동 클론 GV-27의 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 77에 나타내었고, 이의 아미노산 서열은 서열 78에 나타내었다. 이 클론은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) GroEL에 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae )의 65kDa 열 쇼크 단백질의 부분적인 서열은 Kapur et al.(Arch. Pathol. Lab. Med. 119:131-138, 1995)에 공지되어 있다. Kapure에서 설명하는 단편의 뉴클레오티드 서열은 서열 79에 나타내고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 서열 80에 나타내었다.
후속 연구에서, GV-27의 전체 길이(단 예측된 51개 말단 뉴클레오티드는 제외함) DNA 서열은 서열 113에 나타내었다. 이에 상응하는 예측되는 아미노산 서열은 서열 114에 나타내었다. 추가 연구에 의해, GV-27에 대한 전체 길이의 서열(서열 159)을 분리하였다. 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 160에 제공한다. GV-27은 아미노산 수준에서 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) GroEL과 93.7% 동일한 것으로 밝혀졌다.
GV-27의 N-말단(이하 GV-27A라고 칭함)과 C-말단(이하 GV-27B라고 칭함)으로 구성된 두 개 펩티드 단편은 공지의 기술을 이용하여 준비한다. GV-27A와 GV-27B의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 115와 116에 나타내고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 각각 117과 118에 나타내었다. GV-27A의 서열은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) GroEL의 서열과 95.8% 동일하고, 여기에는 상기에서 설명한 Kapur et al.의 짧은 M. vaccae 서열을 포함한다. GV-27B의 서열은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) HSP65와 약 92.2%가 동일한 것으로 나타났다. GV-27을 분리하는데 이용된 동일한 프로토콜에 따라, pBK-CMV 파아지미드 3-1을 분리하였다. 이 DNA에 의해 인코드되는 항원을 GV-29라고 칭한다. 유전자의 5' 및 3'말단의 결정된 뉴클레오티드 서열을 서열 163 및 164에 각 제공하고, 이에 예측되는 아미노산 서열은 각 서열 165 및 166에 제공한다. GV-29는 이스트의 요소 아미도라제와 상동성이 있는 것으로 나타났다. GV-29를 인코드하는 전체 길이의 결정된 DNA 서열은 서열 198에 제공되고, 이에 상응하는 예측된 아미노산 서열은 서열 199에 제공된다. GV-29를 인코드하는 DNA는 벡터 pET16(Novagen, Madison, WI)에 서브클론하여, 표준 과정에 따라 발현 및 정제시킨다.
실시예 15
미코박테리움 바카이(M. VACCAE) 항원 GV-23, GV-24, GV-25, GV-26, GV-38A , GV-38B에 대한 DNA 클로닝 전략
미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC Number 15483)는 4일간 37℃에서 멸균된 Medium 90에서 생장을 시키고, 원심분리에 의해 수득을 한다. 세포는 1㎖Trizol(Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland)에 재현탁을 시키고, 표준 과정에 따라 RNA를 추출한다. 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv(ATCC Number 27294)는 Tween 80TM과 올레산/알부민/덱스트로즈/카탈라제 첨가물(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)을 포함하는 멸균 Middlebrooke 7H9 배지에 생장을 시키고, 적절한 안정된 조건하에서 수득을 한다. 세포는 1㎖ Trizol(Gibco BRL)에 재현탁을 시키고, 제조업자의 지시에 따라 RNA를 추출한다.
총 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) RNA에는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) rRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드 AD10과 AD11(서열 81, 82)에 총 RNA 분취물이 혼성화되어, 16S와 23S 리보좀 RNA(rRNA)가 없다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 Bottger(FEMS Bicrobiol. Lett. 65:171-176, 1989)에서 공지한 미코박테리움 16S rRNA에서 만든 것이고, 그리고 데이터뱅크에 기탁된 서열에서 만든 것이다. 나일론 막(Hybond N, Amersham International, United Kingdom)에 고정시킨 올리고뉴클레오티드 AD10, AD11에 총 RNA를 혼성화시켜 고갈시킨다. rRNA 밴드가 에티디움 브로마이드-착색된 아가로즈 겔에서 보이지 않을 때까지 하이브리드반응을 반복한다. 20dATP-잔기로 구성된 올리고뉴클레오티드 AD12(서열 83)은 RNA 결찰효소를 이용하여 농축 mRNA 분취물의 3'말단에 결찰을 시킨다. 제 1 가닥 cDNA 합성은 폴리(dT) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 AD7(서열 84)을 이용하여 표준 과정에 따라 실행을 한다.
단일 측면-특정 PCR(3S-PCR)의 주형으로 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)와 미코박테리움 바카이(M. vaccae) cDNA를 이용하였다. 이 프로토콜에서, 축중 올리고뉴클레오티드 AD1(서열 85)은 보존된 리더 서열 및 막 단백질에 기초하여 고안되었다. 5'프라이머로는 프라이머 AD1을 그리고 3'프라이머로는 AD7을 이용하여 30회 증폭을 한 후에, 생성물은 요소/폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 미코박테리움 바카이에 특이적인 DNA 밴드를 잘라내어 프라이머 AD1과 AD7을 이용하여 다시 증폭을 시켰다. 겔 정제후에, 밴드는 pGEM-T(Promega)에 결찰을 시키고 염기 서열을 결정한다.
밴드 12B21의 결정된 뉴클레오티드 서열(서열 86) 및 예측 아미노산 서열(서열 87)을 가지고 조사를 하면, Furuchi et al.(Jnl. Biol. Chem. 266: 20928-20933, 1991)에서 공지한 스페르미딘/푸트레신 ABC 수송 복합체의 ATP-결합 단백질을 인코드하는 대장균(E. coli)의 pota 유전자에 상동성이 있는 것으로 나타났다. 대장균(E. coli)의 스페르미딘/푸트레신 수송 복합체는 네 개 유전자로 구성되고 이는 ABC 수송 족에 속한다. ABC(ATP-결합 카제트) 운반물질은 일반적으로 네 가지 유전자로 구성된다; ATP-결합 유전자, 가상 결합 유전자 및 두 개의 막통과 유전자. 막통과 유전자는 6개 막 스패닝 부분을 가지는 단백질을 인코드한다. 이 ABC 수송물질의 상동성은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza) (Fleischmann et al. Science 269: 496-512, 1995)와 미고플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)(Fraser, et al. Science, 270:397-403, 1995)의 게놈에서 확인되었다.
BamH1-절단된 람다 ZAP Express(Stratagene)에서 만든 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리는 표준 공정에 따라 방사능동위원소 라벨된 238bp 밴드 12B21로 프로브를 시킨다. 플락은 반복적인 스크리닝으로 순수하게 정제하고, 4.5kb 삽입물을 가지는 파아지미드는 서던 블랏팅 및 하이브리드에 의해 확인을 할 수 있다. 전체 길이의 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 상동 pota (ATP-결합 단백질)의 뉴클레오티드 서열은 4.5kb 단편을 서브클로닝시키고 염기 서열화에 의해 확인을 할 수 있다. 유전자는 가상 -10과 -35 프로모터 원소를 포함하는 320bp의 해독안되는 5'부분을 포함하는 1449bp로 구성된다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) pota 상동부의 뉴클레오티드와 예측되는 아미노산 서열은 각각 서열 88과 89에 나타내었다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) pota 상동부의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 발현 클로닝을 위한 프라이머 EV24(서열 90)와 EV25(서열 91)를 만든다. 증폭된 DNA 단편은 pProEX HT 원핵 발현 시스템(Gibco BRL)에 클론시키고, 적절한 대장균(E.coli)에서 발현은 0.6mM 이소프로필티오 β-갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 유도시킨다. 재조합 단백질은 GV-23로 명명하고, 제조업자의 지시에 따라 합체로부터 정제한다. 후속 연구에서, GV-23(서열 88)은 또 다른 벡터 pET16(Novagen)에 다시 클로닝시킨다. 후속 연구에서 서열 89의 아미노산 서열은 34 내지 41잔기 부분에서 ATP 결합 부위를 포함한다. 서열 89의 잔기 116 내지 163에서는 단백질의 ATP-전달 페밀리에서 발견되는 것으로 보이는 보존 부분이 있다. 이와 같은 발견들로 인하여, GV-23은 ATP 결합 단백질이라는 것을 제시하는 것이다.
상기에서 설명하는 4.5kb의 3'말단에서 322bp Sall-BamHl 서브클론은 대장균(E. coli)의 스페르미딘/푸트레신 ABC 수송물질 복합체의 potd 유전자(페리플라즘 단백질)에 상동성을 보여준다. 이 서브클론의 뉴클레오티드 서열은 서열 92에 나타내었다. 유전자를 확인하기 위해, 이 서브클론의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 표준 과정에 따라 lambda Zap Express(Stratagene)의 SalI-부위에서 만든 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리에 프로브한다. 클론은 1342bp가 대장균(E. coli)의 potd 유전자와 상동성을 보여준다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae)의 potd 상동부분은 서브-클로닝과 염기 서열화에 의해 확인한다. 결정된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각 서열 93과 94에 나타내었다.
발현 클로닝을 위해, 결정된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) potd 로부터 프라이머 EV26(서열 95)과 Ev27(서열 96)을 만든다. 증폭된 단편은 pProEX HT 원핵 발현 시스템(Gibco BRL)안에 클론시킨다. 적절한 대장균(E. coli) 숙주에서 발현을 유도하기 위해 0.6mM IPTG를 첨가하고, 재조합 단백질은 GV24라 명명한다. 공급업자의 지시에 따라 합체에서 재조합 항원을 정제한다. 후속연구를 위해, GV-24(서열 93)는 또 다른 적절한 벡터 pET16(Novagen)에 대시 클론시킨다.
정제된 재조합 항원의 용해도를 개선시키기 위해, 시그날 펩티드를 제외한GV-24를 인코드하는 유전자를 발현벡터에 다시 클론시키는데, 이때 증폭 프라이머 EV101 및 EV102(서열 167 및 168)를 이용한다. 구조체는 GV-24B라고 한다. GV-24B의 뉴클레오티드 서열은 서열 169에 나타내고, 이에 상응하는 예측된 아미노산 서열은 서열 170에 제공한다. 이들 단편은 제조업자의 프로토콜에 따라 GV-24B를 발현 및 정제시키기 위해 pET16에 클론시킨다.
상기에서 설명하는 것과 같이, 정제된 재조합 단백질 GV23과 GV-24가 사람 PBL에서 T 세포 증식 및 인터페론-생산을 자극하는 능력을 검사한다. 이 검사의 결과는 다음의 표 20에 나타내었는데, 이때 (-)는 활성이 부족함을 나타내고; (+/-)는 기준 배지의 배경 활성보다 2배정도의 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (+)는 배경에 비해 2배 내지 4배 활성을 가지는 폴리펩티드를 나타내고; (++)는 배경에 비해 4배 이상 활성이 큰 폴리펩티드를 나타내고, ND는 결정되지 않음을 나타낸다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae) potd 상동부분에 인접한 염기 서열에서는 ABC 수송 복합체에서 두 개 막통과 단백질중에 하나인 대장균(E. coli)의 스페르미딘/푸트레신 ABC 수송 복합체의 potb 유전자에 상동성이 있는 것으로 나타났다. 미코박테리움 바카이(M. vaccae) potd 상동부분(GV-25라 명명함)은 추가로 서브클로닝과 염기 서열화에 의해 확인을 할 수 있다. GV-25의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측되는 아미노산 서열은 각 서열 97과 98에 나타내었다.
인접한 509bp의 추가 서브클로닝 및 서열을 조사하였으나 대장균(E. coli )의 두 번째 막통과 단백질인 PotC에 상동성은 나타나지 않았고, 이는 제 2 막통과 단백질은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 상동부분 ABC 수송물질에는 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 그러나, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 아세틸-CoA 아세틸 전이효소에 상동성이 있는 오픈 리딩 프레임은 막통과 단백질의 하류 시작 530bp로 확인되었고, 해독된 단백질은 GV-26으로 명명한다. GV-26의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 단백질 서열은 각 서열 99와 100에 나타내었다.
GV-23을 분리하는 상기 설명하는 과정과 유사한 과정을 이용하여, 3S-PCR 밴드 12B28(서열 119)를 이용하여, 람다 ZAP Express(Stratagen)의 BamHI-부위에서 만들어진 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 라이브러리에서 분리한 클론은 새로운 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 이 유전자에 의해 인코드되는 항원은 GV-38A라 명명한다. GV-38A의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 이의 예측된 아미노산 서열은 각 서열 120과 121에 나타내었다. 후속 연구에서 GV-18A의 연장된 DNA 서열을 분리하고 이를 서열 171에 제공하였다. 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 172에 제공하였다. 유전자 뱅크에 있는 것과 이들 서열을 비교해보면, 코스미드 MTCY428.12.(SPTREMBL:P71915)에서 이미 확인된 미지의 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 단백질에 일부 상동성이 있는 것으로 나타났다.
GV-38A의 상류 제 2 신규한 오픈 리딩 프레임이 확인되었고, 이 유전자에 의해 확인되는 항원은 GV-38B라 명명한다. GV-38B의 결정된 5'와 3'뉴클레오티드 서열은 각 서열 122와 123에 나타내고, 이의 예측된 아미노산 서열은 각 서열 124과 125에 나타내었다. 후속 연구에서 GV-38B에 대한 전체 길이의 DNA 서열을 분리하여 이를 서열 173에 제공하였다. 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 174에 제공하였다. 이 단백질은 코스미드 MTCY428.11.(SPTREMBL:P71914)에서 이미 확인된 미지의 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 단백질에 일부 상동성이 있는 것으로 나타났다.
GV-38A와 GV-38B 항원은 발현 클로닝을 위해 증폭을 시키고, pET16 (Novagen)에 클론시킨다. GV-38A는 프라이머 KR11와 KR12(서열 126, 127)로 증폭을 시키고, GV-38B는 프라이머 KR13와 KR14(서열 128, 129)로 증폭을 시킨다. 숙주 세포 BL21(DE3)에서 단백질 발현은 1mM IPTG를 첨가하여 유도하나 이들 구조에서는 단백질 발현이 되지 않았다. 항원 GV-38A 및 GV-38B의 N-말단은 이들 구조의 발현을 저해하는 소수성 부분으로 확인되었다. GB-38A의 소수성 부분은 6개 막 스패닝 부분이 있는 막통과 부분 모티프로 확인되었다. 소수성 부분 없이 항원을 발현시키기 위해, GV-38A의 프라이머 KR20(서열 130) 및 GV-38B의 프라이머 KR21(서열 131)을 고안하였다. 절두된 GV-38A 유전자는 프라이머 KR20와 KR12으로 증폭을 시키고, 절두형 GV-38B는 KR21와 KR14로 증폭을 시킨다. 절두형 GV38A와 GV-38B의 결정된 뉴클레오티드 서열은 각 서열 132와 133에 나타내었고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 각 서열 134와 135에 나타내었다. 절두된 GV-184A 및 GV-38B의 연장된 DNA 서열을 각 서열 175 및 176에 제공하고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 177 및 178에 나타내었다.
실시예 16
예비 등전점 포커스 및 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 미코박테리움 바카이 배양 여과물의 폴리펩티드 정제 및 특징의 조사
하기에서 설명하는 것과 같은 예비 등전점 포커스 및 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 배양 여과물에서 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 가용성 단백질을 분리하였다. 다른 언급이 없는 한, 다음의 실시예에서 모든 %는 용적당 중량비를 말한다.
미코박테리움 바카이(M. vaccae)(ATCC Number 15483)는 250ℓ멸균 Medium 90에 배양을 하고, 이는 한외여과시켜 10kDa이상의 단백질은 모두 제거한다. 배지는 원심분리하여 박테리아를 제거하고, 0.45m 필터를 통하여 여과시켜 멸균시킨다. 멸균된 여과물은 10kDa 분자량을 차단하는 막으로 한외여과에 의해 농축시킨다.
10% 트리클로로아세트산으로 침전을 시켜 농축된 배양 여과물에서 단백질을 분리하였다. 침전된 단백질은 100mM Tris.HCl pH 8.0에서 다시 용해를 시키고, 동량의 아세톤을 첨가하여 다시 침전을 시킨다. 아세톤 침전물은 물에 용해를 시키고, 단백질은 동량의 클로로포름:메탄올 2:1(v/v)을 첨가하여 다시-침전을 시킨다. 클로로포름:메탄올 침전물은 물에 용해를 시키고, 용액은 냉동-건조를 시킨다.
냉동-건조된 단백질은 등전점 포커스 완충액에 다시 용해를 시키는데, 완충액에는 8M 탈이온화된 요소, 2% Triton X-100, 10mM 디티오트레톨, 2% 암포라이트(pH 2.5 - 5.0)를 포함한다. 샘플은 미리준비된 Ultrodex 겔의 수평 베드에서 16시간동안 8watt 정압으로 등전점 포커스에 의해 분취한다. 단백질은 물로 겔 베드 분취물로부터 용출을 시키고 10% 트리클로로아세트산으로 농축을 시킨다.
원하는 단백질을 포함하는 분취물 푸울은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인을 하고, 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분취한다. 샘플은 12.5% SDS-PAGE 겔에서 분취하고, 니트로셀룰로오즈 막에 일렉트로블랏팅을 한다. 단백질은 Ponceau Red로 착색을 하여 막에 위치시키고, 물로 탈색을 g고, 40% 아세토니트릴/0.1M 중탄산 암모늄 pH 8.9를 이용하여 막으로부터 용출을 시키고, 그 다음 냉동건조하여 농축을 한다.
용출된 단백질은 상기에서 설명하는 것과 같이, 면역 제공자의 말초 혈액 임파세포로부터 증식 및 인터페론-γ분비를 유도하는 능력에 대해 테스트를 한다. 이 검사에서 강한 반응을 나타내는 단백질은 추가 연구를 위해 선별한다.
선택된 단백질은 트리플로오르아세트산-아세토니트릴 시스템을 이용하여 Vydac Protein C4 컬럼에서 역상 크로마토그래피를 하여 추가 정제를 한다. 정제된 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단백질 서열을 조사하고, PVDF 막에 일렉트로블랏팅을 한다. 단백질은 GV-40, GV-41, GV-42, GV-43, GV-44로 명명한다. 이들 폴리펩티드의 결정된 N-말단 서열은 각 서열 101-105에 나타내었다. 후속 연구에서는 GV-42의 5' 말단, 중간 단편 및 3' 말단 DNA 서열(서열 136, 137, 138)을 분리하였다. 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 서열 139, 140, 141에 각각 나타내었다.
실시예 13에서 설명하는 것과 같은 표준 DNA 증폭 및 클로닝 과정을 이용하여 GV-41 및 GV-42를 인코드하는 유전자를 클론하였다. 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 179 및 180에 제공하고, 예측된 아미노산 서열은 서열 181 및 182에 제공하였다. 추가 연구에서는 GV-41을 인코드하는 전체 유전자를 클로닝하였고, 이를 GV-41B라고 한다. GV-41B의 결정된 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열은 서열 202 및 203에 각각 나타내었다. GV-41은 미코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 미코박테리움 레프리(M. leprae)의 리보좀 재사이클링 인자에 상동성을 가지고, GV-42는 미코박테리움 아비움(M. avium) 피브로넥틴 부착 단백질 GAP-A에 상동성을 가진다. GV-42의 전체 서열안에, GV-43의 결정된 아미노산 서열(서열 104)를 확인할 수 있는데, 이는 GV-42 및 GV-42의 아미노산 서열이 동일한 단백질에서 유래되었다는 것을 나타낸다.
표준 과정에 따라 GV-40 및 GV-44에 대한 뮤린 다클론성 항혈청을 준비하였다. 이와 같은 항혈청을 이용하여, 무작위로 전단된 DNA 단편으로 구성된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. GV-40 및 GV-44를 인코드하는 클론을 확인하고, 서열화시킨다. GV-40을 인코드하는 부분적인 서열의 결정된 뉴클레오티드 서열을 서열 183에 제공하고, 예측된 아미노산 서열은 서열 184에 제공한다. GV-40을 인코드하는 완전한 유전자는 클론되지 않았고, 이와 같은 부분적인 유전자에 의해 인코드되는 항원을 GV-40P라고 하였다. GV-40P의 연장된 DNA 서열은 서열 206에 제공하고, 이에 상응하는 예측된 아미노산 서열은 서열 207에 제공하였다. GV-44를 인코드하는 유전자의 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 185에 제공하고, 예측된 아미노산 서열은 서열 186에 제공하였다. 추가 서열화를 위해, GV-44을 인코드하는 전체 길이 유전자의 결정된 DNA 서열을 수득하여 이를 서열 204에 나타내고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 205에 나타낸다. M. leprae 연장 인자 G에 GV-40의 상동성이 발견되었고, M. leprae
글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제에 대해 GV-44의 상동성이 발견되었다.
실시예 17
DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 항원 GV-45 및 GV-46을 분리
10㎖ 2% SDS/PBS에 현탁시키고, 50℃로 2h동안 가열하여, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 단백질을 추출하였다. 불용성 잔기는 원심분리를 이용하여 제거하고, 단백질은 동량의 아세톤을 첨가하고, -20℃에서 1hr동안 배양하여 상청액으로부터 단백질을 침전시킨다. 침전된 단백질은 원심분리에 의해 수집하고, 환원 샘플 완충액에 용해시키고, 준비된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 분별시킨다. 분리된 단백질은 10mM CAPS/0.01% SDS pH 11.0에서 PVDF상에 전기블랏팅시키고, N-말단 서열은 기체상 서열화기를 이용하여 결정하였다.
이와 같은 실험으로부터, 약 30kDa의 분자량을 나타내는 밴드의 단백질을 GV-45라 하고, 이를 분리하였다. GV-45의 결정된 N-말단 서열을 서열 187에 제공하였다. 동일한 실험으로부터 약 14kDa의 단백질(GV-46라고 칭함)을 얻었다. GV-46의 N-말단 서열을 서열 208에 제공하였다. GV-46은 M. tuberculosis 및 M. smegmatis의 매우 보존된 미코박테리아 숙주 결합 인자에 상동성을 가진다.
GV-45의 아미노산 서열에서, 축중성 올리고뉴클레오티드 KR32 및 KR33(서열 188 및 189)을 고안하였다. 100bp 단편을 증폭시키고, 이를 플라스미드 pBluescriptⅡ SK+(Stratagene, La Jolla, CA)에 클론시키고, 표준과정(Sambrook Ibid)에 따라 서열화시킨다(서열 190). 클론된 삽입체를 이용하여, 람다 ZAP-Express(Stratagene)의 BamHI부위에 작제된 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 분리된 클론은 N-말단 및 5개 아미노산 반복체로 구성된 독특한 C-말단에서 박테리아성 히스톤과 유사한 모티프를 포함하는 35kDa M. tuberculosis 및 22kDa M. leprae 단백질에 상동성을 나타낸다. GV-45에 대해 결정된 뉴클레오티드 서열을 서열 191에 나타내고, 이에 상응하는 아미노산 서열은 서열 192에 나타내었다. 추가 서열화로, GV-45의 전체 유전자를 인코드하는 결정된 DNA 서열을 수득하고, 이를 서열 200에 나타내고, 이에 상응하는 예측된 아미노산 서열은 서열 201에 나타내었다.
실시예 18
미코박테리움 바카이(M. vaccae)에서 유도된 재조합 단백질의 면역원성 및 면역조절 성질
A. T 세포 증식 및 IFNγ생산의 유도
미코박테리움 바카이(M. vaccae) 재조합 단백질(GV 재조합 단백질)의 면역원성을 테스트하기 위해, 암컷 BALB/cByJ 생쥐 각 뒷발에 10㎍ 재조합 GV 단백질(인컴플리트 Freund's 항항원체(IFA)에 에멸젼화됨)를 주사하였다. 기준 생쥐는 인산염완충액/IFA을 제공하였다. 10일 후에 고름이 나는 슬와 임파 노드를 잘라내어, 이로부터 수득한 세포는 면역화된 GV 단백질로 자극하여, 삼중수소화된 티미딘을 수용하는 양을 측정하여 증식에 대해 평가하였다. 이와 같은 세포에 의해 생산 및 분비되는 인터페론 감마(IFNγ)의 양은 표준 효소-연결된 면역검사를 이용하여 실시한다.
표 21에서는 증식성 반응을 요약하였는데, 모든 GV 단백질에서는 T 세포 증식성 반응이 유도된다는 것을 알 수 있다. 면역화된 생쥐의 임파 노드 T 세포는 면역화에 이용된 특이적인 GV 단백질에 반응하여 증식하였다. 면역화안된 생쥐의 임파 노드 세포는 GV 단백질에 반응하여 증식하지는 않았다. 표 22의 데이터에서는 IFNγ생산을 나타내는데, 대부분의 GV 단백질이 GV 단백질로 면역화된 생쥐의 임파노드 세포에 의해 IFNγ생산을 자극하는 것을 볼 수 있다. 면역화되지 않은 생쥐의 임파 노드 세포는 각 GV 단백질로 배양하였을 때, IFNγ생산이 감지되지는 않았다.
따라서, GV 단백질은 피하로 주사할 경우에 T 세포 증식 및 IFNγ생산을 촉진시킬 수 있는 면역원이 된다. T 세포 증식 및 IFNγ생산에서 항원-특이적인 자극 효과는 결핵의 추천 백신으로 두 가지 유익한 성질을 가진다.
B. 임파세포 부집단의 활성화
본 발명의 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질, 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 및 DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)가 임파세포 부집단을 활성화시키는 능력을 결정하기 위해 CD69(활성화된 세포에서 발현되는 표면 단백질)의 발현을 상향조절하는 지를 검사하였다.
정상 기증 세포(5 x 106세포s/㎖)의 PBMC를 20㎍/㎖ 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 재조합 GV-22B(서열 145), GV-23(서열 89), GV-27(서열 160), GV27A(서열117), GV-27B(서열162), GV-45(서열 201)로 24시간동안 자극을 하였다. CD69 발현은 CD56, αβT세포 또는 rδT세포에 대한 단클론성 항체를 배양된 세포로 자극하고, 이때 CD69에 대한 단클론항체도 복합된다.
표 23에서는 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae), 또는 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질로 자극을 받은 후에, CD69를 발현시키는 αβT 세포, rδT 세포, NK 세포의 비율을 나타낸 것이다. 이 결과로 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae), GV-23은 기준과 비교하였을 때(자극을 받지 않은 세포), 테스트한 임파세포 부집단에서 CD69 발현을 자극하였고, NK 세포에서는 특히 CD69가 높은 수준으로 발현되었음을 볼 수 있었다. GV-45는 αβT세포에서 CD69 발현을 상향조절하는 것을 알 수 있다.
임파세포 부집단에서 공지의 CD69 발현을 유도하는 재조합 단백질GV-23(20㎍/㎖)의 능력을 공지의 Th1-유도성 항항원체 MPL/TDM/CWS(Monophosphoryl Kipid A/ Trehalose 6'6' dimycolate; Sigma, St. Louis, MO; 1:20로 희석), CpG ODN(Promega, Madison, WI; 20ug/ml), 공지의 Th2-유도 항항원체 수산화알루미늄 (Superfos Biosector, Kvistgard, Denmark; 최종 1:400로 희석), 콜레라 독소(20㎍/㎖)와 비교하였다. MPL/TDM/CWS 및 수산화알루미늄을 세포 독성을 유도하지 않는 최대 농도로 이용하였다. 도 8A-C에서는 αβT세포, rδT세포, NK 세포 각각에서 CD69 발현을 자극한다는 것을 알 수 있다. GV-23, MPL/TDM/CWS, CpG ODN는 NK 세포에서 CD69 발현을 유도하는 반면에, 수산화알루미늄 및 콜레라 독소는 유도하지 못하였다.
C. 사이토킨 생산 자극
PBMC에서 사이토킨 생산을 자극하는 본 발명의 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질의 능력은 다음과 같이 검사하였다. 정상 기증자(5 x 106세포s/ml)의 PBMC는 20㎍/㎖의 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae) 또는 재조합 GV-22B(서열 145), GV-23(서열: 89), GV-27(서열: 160), GV27A(서열: 117), GV-27B(서열: 162), GV-45(서열: 201)로 24 시간동안 자극하였다. 배양 상청액을 수득하고, IL-1β, TNF-α, IL-12, IFN-γ생산에 대해 표준 ELISA 키트(Genzyme, Cambridge, MA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 테스트하였다. 도 9A-D에서는 각각 IL-1β, TNF-α, IL-12, IFN-γ생산을 자극한다는 것을 볼 수 있다. 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae)는 검사된 4가지 모든 사이토킨의 생산을 자극하는데 반하여, 재조합 GV-23 및 GV-45는 IL-1β, TNF-α,IL-12 생산을 자극하는 것을 알 수 있다. 도 10A-C에서는 GV-23 및 GV-45의 농도를 다양하게 하여 각각 사람의 PBMC(상기에서 설명하는 것과 같음)에서 IL-1β, TNF-α, IL-12의 생산을 자극한다는 것을 볼 수 있다.
도 11A-D에서는 PBMC에서 GV23에 의해 각 IL-1β, TNF-α, IL-12, IFN-γ생산이 자극을 받는다는 것을 나타내는데, 이때 항항원체 MPL/TDM/CWS(최종 1:20로 희석), CpG ODN(20㎍/㎖), 수산화알루미늄(최종 1:400로 희석) 및 콜레라 독소(20㎍/㎖)와 비교하였다. GV-23, MPL/TDM/CWS, CpG ODN는 검사된 4개 사이토킨을 상당 수준 유도하였고, 특히 공지의 임의 항항원체보다 GV-23를 이용한 경우에 IL-1β생산이 휠씬 높다는 것을 알 수 있다. 수산화알루미늄 및 콜레라 독소는 단지 소량의 사이토킨만을 유도하였다.
D. 항원제공 세포의 활성화
열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae), 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질이 B세포, 단세포, 수지상 세포에서 공동 자극 분자 CD40, CD80, CD86의 발현을 강화하는 능력에 대해 다음과 같이 검사하였다.
T 세포없이 주로 B 세포 및 단세포, 수지상 세포로 구성된 말초 혈액 단핵 세포를 20㎍/㎖의 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 세포, DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae), 재조합 GV-22B(서열: 145), GV-23(서열: 89), GV-27(서열: 160), GV27A(서열: 117), GV-27B(서열: 162), GV-45(서열: 201)로 48시간 동안 자극하였다. 자극받은 세포를 수득하고, 3색 유동 세포 측정 분석을 이용하여, CD40, CD80, CD86의 상향 조절에 대해 분석하였다. 표 24, 25, 26에서는 기준(자극을 받지 않은 세포), 수지상 세포, 단세포, B 세포각각의 평균 형광 강도의 증가 배수를 나타낸 것이다.
상기에서 볼 수 있는 것과 같이, 수지상 세포, 단세포, B 세포에서 테스트한 모든 조성물에 대해 CD40, CD80, CD86이 증가되었다는 것을 볼 수 있다. 발현 수준은 수지상 세포 대부분에서 증가되었는데, 특히 열처리에 의해 죽은 미코박테리움 바카이(M. vaccae), DD-미코박테리움 바카이(M. vaccae), GV-23, GV-45에서 최대 발현 수준을 얻을 수 있었다. 도 12A-C에서는 다양한 농도의 GV-23 및 GV-45으로 수지상 세포에서 각각 CD40, CD80, CD86의 발현이 자극을 받았음을 알 수 있다.
수지상 세포에서 CD40, CD80, CD86 발현을 자극하는 GV-23의 능력은 Th1-유도 항항원체 MPL/TDM/CWS(최종 1:20농도로 희석), CpG ODN(20㎍/㎖), 공지의 Th2-유도 항항원체 수산화알루미눔(최종 농도 1:400로 희석), 콜레라 독소(20㎍/㎖)의 것과 비교하였다. GV23, MPL/TDM/CWS, CpG ODN는 CD40, CD80, CD86을 상당히 상향 조절하지만, 콜레라 독소 및 수산화알루미늄에 의한 수지상 세포 활성화 유도 정도가 중간 또는 무시할 수준이었다.
E. 수지상 세포 성숙 및 기능
수지상 세포의 성숙 및 기능에 재조합 미코박테리움 바카이(M. vaccae) 단백질 GV-23의 효과는 다음과 같이 검사하였다.
정제된 수지상 세포(5 x 104- 105세포/㎖)는 GV-23(20㎍/㎖) 또는 LPS(10㎍/㎖)(양성 기준)로 자극하였다. 세포는 20 시간동안 배양하고, CD83(성숙표식), CD80 발현을 세포 유동계로 분석하였다. 자극을 받지 않은 세포는 음성 기준으로 삼는다. 다음의 표 27에 그 결과를 나타내었다.
항원을 제공하는 세포로 수지상 세포의 기능을 강화시키는 GV-23의 능력은 혼합형 임파세포 반응(MLR) 검사를 이용하여 결정한다. 정제된 수지상 세포는 배지만으로 또는 GV-23(20㎍/㎖)와 함께 18-20 시간동안 배양시키고, 알로젠 T 세포(2 x 105세포/well)로 자극을 하였다. 배양 3일 후에, (3H)티미딘을 첨가하였다. 세포는 1일 후에 수득하고, 획득된 방사능 활성양을 측정하였다. 도 13에서는 T 세포에 대한 수지상 세포의 비율이 증가되면 (3H)티미딘 획득양이 증가된다는 것을 나타낸다. 자극을 받지 않은 세포와 비교하였을 때, GV-23으로 자극을 받은 수지상 세포에서 상당 수준의 방사능활성이 획득되었고, 이는 GV-23이 수지상 세포 혼합된 백혈구세포 반응을 강화시킨다는 것을 알 수 있다.
본 발명을 설명하기 위해 일부 실시예로 설명하였으나, 본 발명의 범위에 벗어나지 않고 수정 및 변형이 가능하고, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 국한된다.
SEQUENCE LISTING
〈110〉 Tan, Paul L.J.
Watson, James D.
Visser, Elizabeth S.
Skinner, Margot A.
Prestidge, Ross L.
〈120〉 Compositions Derived from Mycobacterium Vaccae and
Methods for Their Use
〈130〉 11000.1002c2PCT
〈150〉 09/205,426
〈151〉 1998-12-04
〈150〉 09/156,181
〈151〉 1998-09-17
〈150〉 09/095,855
〈151〉 1998-06-11
〈150〉 08/996,624
〈151〉 1997-12-23
〈150〉 08/997,362
〈151〉 1997-12-23
〈150〉 08/997,080
〈151〉 1997-12-23
〈160〉 208
〈170〉 FastSEQ for Windows Version 3.0
〈210〉 1
〈211〉 25
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(7)
〈400〉 1
Ala Pro Val Gly Pro Gly Xaa Ala Ala Tyr Val Gln Gln Val Pro Asp
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ser Val Gln Gly Met Ala
20 25
〈210〉 2
〈211〉 10
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈400〉 2
Met Xaa Asp Gln Leu Lys Val Asn Asp Asp
1 5 10
〈210〉 3
〈211〉 11
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈400〉 3
Met Xaa Pro Val Pro Val Ala Thr Ala Ala Tyr
1 5 10
〈210〉 4
〈211〉 21
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 4
Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Tyr Val Asp His Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Asp Leu
20
〈210〉 5
〈211〉 29
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (25)...(25)
〈400〉 5
Met Gln Ala Phe Asn Ala Asp Ala Tyr Ala Phe Ala Lys Arg Glu Lys
1 5 10 15
Val Ser Leu Ala Pro Gly Val Pro Xaa Val Phe Glu Thr
20 25
〈210〉 6
〈211〉 21
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (6)...(6)
〈400〉 6
Met Ala Asp Pro Asn Xaa Ala Ile Leu Gln Val Ser Lys Thr Thr Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gln Ala Ala
20
〈210〉 7
〈211〉 11
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 7
Met Pro Ile Leu Gln Val Ser Gln Thr Gly Arg
1 5 10
〈210〉 8
〈211〉 14
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (6)...(6)
〈400〉 8
Met Xaa Asp Pro Ile Xaa Leu Gln Leu Gln Val Ser Ser Thr
1 5 10
〈210〉 9
〈211〉 16
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 9
Lys Ala Thr Tyr Val Gln Gly Gly Leu Gly Arg Ile Glu Ala Arg Val
1 5 10 15
〈210〉 10
〈211〉 9
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈400〉 10
Lys Xaa Gly Leu Ala Asp Leu Ala Pro
1 5
〈210〉 11
〈211〉 14
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (12)...(12)
〈223〉 Residue can be either Glu or Ile
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈400〉 11
Lys Xaa Tyr Ala Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Xaa Ala Ala
1 5 10
〈210〉 12
〈211〉 11
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (10)...(10)
〈400〉 12
Lys Asn Pro Gln Val Ser Asp Glu Leu Xaa Thr
1 5 10
〈210〉 13
〈211〉 21
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (9)...(9)
〈400〉 13
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Xaa Gly Asp Pro Ala Ala Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Met Ser Thr
20
〈210〉 14
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (5)...(5)
〈400〉 14
Glu Ala Glu Val Xaa Tyr Leu Gly Gln Pro Gly Glu Leu Val Asn
1 5 10 15
〈210〉 15
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈223〉 Residue can be either Gly or Ala
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (15)...(15)
〈223〉 Residue can be either Pro or Ala
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(7)
〈400〉 15
Ala Xaa Val Val Pro Pro Xaa Gly Pro Pro Ala Pro Gly Ala Xaa
1 5 10 15
〈210〉 16
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 16
Ala Pro Ala Pro Asp Leu Gln Gly Pro Leu Val Ser Thr Leu Ser
1 5 10 15
〈210〉 17
〈211〉 25
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 17
Ala Thr Pro Asp Trp Ser Gly Arg Tyr Thr Val Val Thr Phe Ala Ser
1 5 10 15
Asp Lys Leu Gly Thr Ser Val Ala Ala
20 25
〈210〉 18
〈211〉 25
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (15)...(15)
〈223〉 Residue can be either Ala or Arg
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (23)...(23)
〈223〉 Residue can be either Val or Leu
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (16)...(16)
〈400〉 18
Ala Pro Pro Tyr Asp Asp Arg Gly Tyr Val Asp Ser Thr Ala Xaa Xaa
1 5 10 15
Ala Ser Pro Pro Thr Leu Xaa Val Val
20 25
〈210〉 19
〈211〉 8
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 19
Glu Pro Glu Gly Val Ala Pro Pro
1 5
〈210〉 20
〈211〉 25
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (21)...(22)
〈400〉 20
Glu Pro Ala Gly Ile Pro Ala Gly Phe Pro Asp Val Ser Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Ala Val Asp Pro Xaa Xaa Tyr Val Val
20 25
〈210〉 21
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(7)
〈400〉 21
Ala Pro Val Gly Pro Gly Xaa Ala Ala Tyr Val Gln Gln Val Pro
1 5 10 15
〈210〉 22
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 22
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Met Val Pro Ser
1 5 10 15
〈210〉 23
〈211〉 19
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 23
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Met Val Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Met Gly
〈210〉 24
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 24
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Asp Val Phe Ser
1 5 10 15
〈210〉 25
〈211〉 14
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(2)
〈400〉 25
Xaa Xaa Thr Gly Leu His Arg Leu Arg Met Met Val Pro Asn
1 5 10
〈210〉 26
〈211〉 20
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (16)...(16)
〈223〉 Residue can be either Ser or Val
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (17)...(17)
〈223〉 Residue can be either Gln or Val
〈400〉 26
Val Pro Ala Asp Pro Val Gly Ala Ala Ala Gln Ala Glu Pro Ala Xaa
1 5 10 15
Xaa Arg Ile Asp
20
〈210〉 27
〈211〉 14
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (4)...(4)
〈223〉 Residue can be either Tyr or Pro
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (8)...(8)
〈223〉 Residue can be either Val or Gly
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (9)...(9)
〈223〉 Residue can be either Ile or Tyr
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (3)...(3)
〈400〉 27
Asp Pro Xaa Xaa Asp Ile Glu Xaa Xaa Phe Ala Arg Gly Thr
1 5 10
〈210〉 28
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 28
Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Asp Tyr Ala Arg Asp Ala Gly Phe
1 5 10 15
〈210〉 29
〈211〉 16
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈223〉 Residue can be either Leu or Pro
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(1)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (5)...(5)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(7)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (10)...(10)
〈400〉 29
Xaa Xaa Leu Ala Xaa Ala Xaa Leu Gly Xaa Thr Val Asp Ala Asp Gln
1 5 10 15
〈210〉 30
〈211〉 330
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium leprae
〈400〉 30
Met Lys Phe Val Asp Arg Phe Arg Gly Ala Val Ala Gly Met Leu Arg
1 5 10 15
Arg Leu Val Val Glu Ala Met Gly Val Ala Leu Leu Ser Ala Leu Ile
20 25 30
Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Glu Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu
35 40 45
Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile
50 55 60
Lys Val Gln Phe Gln Asn Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn
85 90 95
Thr Thr Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Ile Ser Val Val Met
100 105 110
Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala
115 120 125
Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr
130 135 140
Ser Glu Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Ser Asn Lys Gln Ile Lys Pro Thr
145 150 155 160
Gly Ser Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Leu Ser Ala Leu Thr
165 170 175
Leu Ala Ile Tyr His Pro Asp Gln Phe Ile Tyr Val Gly Ser Met Ser
180 185 190
Gly Leu Leu Asp Pro Ser Asn Ala Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu
195 200 205
Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro
210 215 220
Ser Thr Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp Pro Thr Val Asn Val Gly
225 230 235 240
Thr Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Met Tyr Cys Gly Asn Gly
245 250 255
Lys Pro Thr Glu Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Leu Leu Glu
260 265 270
Gly Leu Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Gly Tyr Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Asp Ser Gly Thr His
290 295 300
Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Glu Gln Leu Asn Asp Met Lys Pro Asp Leu
305 310 315 320
Gln Gln Tyr Leu Gly Ala Thr Pro Gly Ala
325 330
〈210〉 31
〈211〉 327
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium leprae
〈400〉 31
Met Ile Asp Val Ser Gly Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Trp Leu Leu
1 5 10 15
Val Gly Ala Ala Ala Thr LeuPro Ser Leu Ile Ser Leu Ala Gly Gly
20 25 30
Ala Ala Thr Ala Ser Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr
35 40 45
Leu Gln Val Pro Ser Glu Ala Met Gly Arg Thr Ile Lys Val Gln Phe
50 55 60
Gln Asn Gly Gly Asn Gly Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Ser Ala Phe
85 90 95
Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly
100 105 110
Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala
115 120 125
Gly Cys Thr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro
130 135 140
Lys Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ser Val Lys Ser Thr Gly Ser Ala Val
145 150 155 160
Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Ala Tyr
165 170 175
His Pro Asp Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Met Asp
180 185 190
Ser Ser Gln Gly Ile Glu Pro Gln Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp
195 200 205
Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Pro Asn Asp Pro
210 215 220
Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Ile Leu Gln Ala Gly Lys Leu Val Ala
225 230 235 240
Asn Asn Thr His Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Ser Glu
245 250 255
Leu Gly Gly Thr Asn Val Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val His
260 265 270
Gly Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Gly Ala Gly Gly His
275 280 285
Asn Ala Val Phe Asn Leu Asn Ala Asp Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr
290 295 300
Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Asn Thr Leu
305 310 315 320
Met Ala Val Pro Arg Ser Gly
325
〈210〉 32
〈211〉 338
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium tuberculosis
〈400〉 32
Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg
1 5 10 15
Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val
20 25 30
Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile
85 90 95
Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val
100 105 110
Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro
115 120 125
Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro
145 150 155 160
Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu
165 170 175
Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met
180 185 190
Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly
195 200 205
Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly
210 215 220
Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val
225 230 235 240
Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn
245 250 255
Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu
260 265 270
Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn
275 280 285
Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr
290 295 300
His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp
305 310 315 320
Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln
325 330 335
Gly Ala
〈210〉 33
〈211〉 325
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium tuberculosis
〈400〉 33
Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met
1 5 10 15
Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val
35 40 45
Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro
85 90 95
Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val
100 105 110
Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly
115 120 125
Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu
130 135 140
Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala
165 170 175
Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met
195 200 205
Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser
210 215 220
Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu
225 230 235 240
Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro
245 250 255
Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe
260 265 270
Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly
275 280 285
Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp
290 295 300
Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser
305 310 315 320
Ser Leu Gly Ala Gly
325
〈210〉 34
〈211〉 338
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium bovis
〈400〉 34
Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg
1 5 10 15
Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val
20 25 30
Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile
85 90 95
Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val
100 105 110
Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro
115 120 125
Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro
145 150 155 160
Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu
165 170 175
Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met
180 185 190
Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly
195 200 205
Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp Gly
210 215 220
Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu Asn Val
225 230 235 240
Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys Gly Asn
245 250 255
Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Phe Leu
260 265 270
Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn
275 280 285
Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser Gly Thr
290 295 300
His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp
305 310 315 320
Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln
325 330 335
Gly Ala
〈210〉 35
〈211〉 323
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium bovis
〈400〉 35
Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met
1 5 10 15
Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val
35 40 45
Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro
85 90 95
Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val
100 105 110
Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly
115 120 125
Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Leu Leu Thr Ser Glu
130 135 140
Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala
165 170 175
Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp
195 200 205
Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala
225 230 235 240
Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu
245 250 255
Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg
260 265 270
Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Lys Pro Ala Gly Gly His
275 280 285
Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr
290 295 300
Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Ala Gly
〈210〉 36
〈211〉 333
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium leprae
〈400〉 36
Met Lys Phe Leu Gln Gln Met Arg Lys Leu Phe Gly Leu Ala Ala Lys
1 5 10 15
Phe Pro Ala Arg Leu Thr Ile Ala Val Ile Gly Thr Ala Leu Leu Ala
20 25 30
Gly Leu Val Gly Val Val Gly Asp Thr Ala Ile Ala Val Ala Phe Ser
35 40 45
Lys Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met
50 55 60
Gly His Asp Ile Lys Ile Gln Phe Gln Gly Gly Gly Gln His Ala Val
65 70 75 80
Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Glu Asp Tyr Asn Gly Trp Asp
85 90 95
Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Glu Tyr Tyr His Ser Gly Leu Ser Val
100 105 110
Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asn Trp Tyr Gln
115 120 125
Pro Ser Gln Gly Asn Gly Gln His Tyr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe
130 135 140
Leu Thr Gln Glu Met Pro Ser Trp Leu Gln Ala Asn Lys Asn Val Leu
145 150 155 160
Pro Thr Gly Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ser Gly Ser Ser Ala
165 170 175
Leu Ile Leu Ala Ser Tyr Tyr Pro Gln Gln Phe Pro Tyr Ala Ala Ser
180 185 190
Leu Ser Gly Phe Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp Pro Thr Met Ile
195 200 205
Gly Leu Ala Met Asn Asp Ser Gly Gly Tyr Asn Ala Asn Ser Met Trp
210 215 220
Gly Pro Ser Thr Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp Pro Met Val Gln
225 230 235 240
Ile Pro Arg Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Val Tyr Cys Gly
245 250 255
Asn Gly Ala Pro Asn Glu Leu Gly Gly Asp Asn Ile Pro Ala Lys Phe
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Thr Leu Ser Thr Asn Glu Ile Phe Gln Asn Thr Tyr
275 280 285
Ala Ala Ser Gly Gly Arg Asn Gly Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly
290 295 300
Thr His Ser Trp Pro Tyr Trp Asn Gln Gln Leu Val Ala Met Lys Pro
305 310 315 320
Asp Ile Gln Gln Ile Leu Asn Gly Ser Asn Asn Asn Ala
325 330
〈210〉 37
〈211〉 340
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium tuberculosis
〈400〉 37
Met Thr Phe Phe Glu Gln Val Arg Arg Leu Arg Ser Ala Ala Thr Thr
1 5 10 15
Leu Pro Arg Arg Val Ala Ile Ala Ala Met Gly Ala Val Leu Val Tyr
20 25 30
Gly Leu Val Gly Thr Phe Gly Gly Pro Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser
35 40 45
Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Ala Ser Met
50 55 60
Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Gly Gly Gly Pro His Ala Val
65 70 75 80
Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp
85 90 95
Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Glu Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Val
100 105 110
Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Thr Asp Trp Tyr Gln
115 120 125
Pro Ser Gln Ser Asn Gly Gln Asn Tyr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe
130 135 140
Leu Thr Arg Glu Met Pro Ala Trp Leu Gln Ala Asn Lys Gly Val Ser
145 150 155 160
Pro Thr Gly Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ser Gly Gly Ser Ala
165 170 175
Leu Ile Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Gln Gln Phe Pro Tyr Ala Ala Ser
180 185 190
Leu Ser Gly Phe Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp Pro Thr Leu Ile
195 200 205
Gly Leu Ala Met Asn Asp Ser Gly Gly Tyr Asn Ala Asn Ser Met Trp
210 215 220
Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp Pro Met Val Gln
225 230 235 240
Ile Pro Arg Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Val Tyr Cys Gly
245 250 255
Asn Gly Thr Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asp Asn Ile Pro Ala Lys Phe
260 265 270
Leu Glu Gly Leu Thr Leu Arg Thr Asn Gln Thr Phe Arg Asp Thr Tyr
275 280 285
Ala Ala Asp Gly Gly Arg Asn Gly Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly
290 295 300
Thr His Ser Trp Pro Tyr Trp Asn Glu Gln Leu Val Ala Met Lys Ala
305 310 315 320
Asp Ile Gln His Val Leu Asn Gly Ala Thr Pro Pro Ala Ala Pro Ala
325 330 335
Ala Pro Ala Ala
340
〈210〉 38
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Probe made in a lab
〈400〉 38
agcggctggg acatcaacac 20
〈210〉 39
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Probe made in a lab
〈400〉 39
cagacgcggg tgttgttggc 20
〈210〉 40
〈211〉 1211
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 40
ggtaccggaa gctggaggat tgacggtatg agacttcttg acaggattcg tgggccttgg 60
gcacgccgtt tcggcgtcgt ggctgtcgcg acagcgatga tgcctgcttt ggtgggcctg 120
gctggagggt cggcgaccgc cggagcattc tcccggccag gtctgccggt ggagtacctg 180
atggtgcctt cgccgtcgat ggggcgcgac atcaagatcc agttccagag cggtggcgag 240
aactcgccgg ctctctacct gctcgacggc ctgcgtgcgc aggaggactt caacggctgg 300
gacatcaaca ctcaggcttt cgagtggttc ctcgacagcg gcatctccgt ggtgatgccg 360
gtcggtggcc agtccagctt ctacaccgac tggtacgccc ccgcccgtaa caagggcccg 420
accgtgacct acaagtggga gaccttcctg acccaggagc tcccgggctg gctgcaggcc 480
aaccgcgcgg tcaagccgac cggcagcggc cctgtcggtc tgtcgatggc gggttcggcc 540
gcgctgaacc tggcgacctg gcacccggag cagttcatct acgcgggctc gatgtccggc 600
ttcctgaacc cctccgaggg ctggtggccg ttcctgatca acatctcgat gggtgacgcc 660
ggcggcttca aggccgacga catgtggggc aagaccgagg ggatcccaac agcggttgga 720
cagcgcaacg atccgatgct gaacatcccg accctggtcg ccaacaacac ccgtatctgg 780
gtctactgcg gtaacggcca gcccaccgag ctcggcggcg gcgacctgcc cgccacgttc 840
ctcgaaggtc tgaccatccg caccaacgag accttccgcg acaactacat cgccgcgggt 900
ggccacaacg gtgtgttcaa cttcccggcc aacggcacgc acaactgggc gtactggggt 960
cgcgagctgc aggcgatgaa gcctgacctg caggcgcacc ttctctgacg gttgcacgaa 1020
acgaagcccc cggccgattg cggccgaggg tttcgtcgtc cggggctact gtggccgaca 1080
taaccgaaat caacgcgatg gtggctcatc aggaacgccg agggggtcat tgcgctacga 1140
cacgaggtgg gcgagcaatc cttcctgccc gacggagagg tcaacatcca cgtcgagtac 1200
tccagcgtga a 1211
〈210〉 41
〈211〉 485
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 41
agcggctggg acatcaacac cgccgccttc gagtggtacg tcgactcggg tctcgcggtg 60
atcatgcccg tcggcgggca gtccagcttc tacagcgact ggtacagccc ggcctgcggt 120
aaggccggct gccagaccta caagtgggag acgttcctga cccaggagct gccggcctac 180
ctcgccgcca acaagggggt cgacccgaac cgcaacgcgg ccgtcggtct gtccatggcc 240
ggttcggcgg cgctgacgct ggcgatctac cacccgcagc agttccagta cgccgggtcg 300
ctgtcgggct acctgaaccc gtccgagggg tggtggccga tgctgatcaa catctcgatg 360
ggtgacgcgg gcggctacaa ggccaacgac atgtggggtc caccgaagga cccgagcagc 420
gcctggaagc gcaacgaccc gatggtcaac atcggcaagc tggtggccaa caacaccccc 480
ctctc 485
〈210〉 42
〈211〉 1052
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 42
gttgatgaga aaggtgggtt gtttgccgtt atgaagttca cagagaagtg gcggggctcc 60
gcaaaggcgg cgatgcaccg ggtgggcgtt gccgatatgg ccgccgttgc gctgcccgga 120
ctgatcggct tcgccggggg ttcggcaacg gccggggcat tctcccggcc cggtcttcct 180
gtcgagtacc tcgacgtgtt ctcgccgtcg atgggccgcg acatccgggt ccagttccag 240
ggtggcggta ctcatgcggt ctacctgctc gacggtctgc gtgcccagga cgactacaac 300
ggctgggaca tcaacacccc tgcgttcgag tggttctacg agtccggctt gtcgacgatc 360
atgccggtcg gcggacagtc cagcttctac agcgactggt accagccgtc tcggggcaac 420
gggcagaact acacctacaa gtgggagacg ttcctgaccc aggagctgcc gacgtggctg 480
gaggccaacc gcggagtgtc gcgcaccggc aacgcgttcg tcggcctgtc gatggcgggc 540
agcgcggcgc tgacctacgc gatccatcac ccgcagcagt tcatctacgc ctcgtcgctg 600
tcaggcttcc tgaacccgtc cgagggctgg tggccgatgc tgatcgggct ggcgatgaac 660
gacgcaggcg gcttcaacgc cgagagcatg tggggcccgt cctcggaccc ggcgtggaag 720
cgcaacgacc cgatggtcaa catcaaccag ctggtggcca acaacacccg gatctggatc 780
tactgcggca ccggcacccc gtcggagctg gacaccggga ccccgggcca gaacctgatg 840
gccgcgcagt tcctcgaagg attcacgttg cggaccaaca tcgccttccg tgacaactac 900
atcgcagccg gcggcaccaa cggtgtcttc aacttcccgg cctcgggcac ccacagctgg 960
gggtactggg ggcagcagct gcagcagatg aagcccgaca tccagcgggt tctgggagct 1020
caggccaccg cctagccacc caccccacac cc 1052
〈210〉 43
〈211〉 326
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 43
Met Arg Leu Leu Asp Arg Ile Arg Gly Pro Trp Ala Arg Arg Phe Gly
1 5 10 15
Val Val Ala Val Ala Thr Ala Met Met Pro Ala Leu Val Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Gly Ser Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val
35 40 45
Glu Tyr Leu Met Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Ile
50 55 60
Gln Phe Gln Ser Gly Gly Glu Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Gln Glu Asp Phe Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Gln
85 90 95
Ala Phe Glu Trp Phe Leu Asp Ser Gly Ile Ser Val Val Met Pro Val
100 105 110
Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Thr Asp Trp Tyr Ala Pro Ala Arg Asn
115 120 125
Lys Gly Pro Thr Val Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu
130 135 140
Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser
145 150 155 160
Gly Pro Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ala Ala Leu Asn Leu Ala
165 170 175
Thr Trp His Pro Glu Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Met Ser Gly Phe
180 185 190
Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp Pro Phe Leu Ile Asn Ile Ser Met
195 200 205
Gly Asp Ala Gly Gly Phe Lys Ala Asp Asp Met Trp Gly Lys Thr Glu
210 215 220
Gly Ile Pro Thr Ala Val Gly Gln Arg Asn Asp Pro Met Leu Asn Ile
225 230 235 240
Pro Thr Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Val Tyr Cys Gly Asn
245 250 255
Gly Gln Pro Thr Glu Leu Gly Gly Gly Asp Leu Pro Ala Thr Phe Leu
260 265 270
Glu Gly Leu Thr Ile Arg Thr Asn Glu Thr Phe Arg Asp Asn Tyr Ile
275 280 285
Ala Ala Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asn Phe Pro Ala Asn Gly Thr
290 295 300
His Asn Trp Ala Tyr Trp Gly Arg Glu Leu Gln Ala Met Lys Pro Asp
305 310 315 320
Leu Gln Ala His Leu Leu
325
〈210〉 44
〈211〉 161
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 44
Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Ala Ala Phe Glu Trp Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Gly Leu Ala Val Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
20 25 30
Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys
35 40 45
Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu Leu Pro Ala Tyr Leu Ala Ala Asn
50 55 60
Lys Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala
65 70 75 80
Gly Ser Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Gln
85 90 95
Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp
100 105 110
Pro Met Leu Ile Asn Ile Ser Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala
115 120 125
Asn Asp Met Trp Gly Pro Pro Lys Asp Pro Ser Ser Ala Trp Lys Arg
130 135 140
Asn Asp Pro Met Val Asn Ile Gly Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Pro
145 150 155 160
Leu
〈210〉 45
〈211〉 334
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 45
Met Lys Phe Thr Glu Lys Trp Arg Gly Ser Ala Lys Ala Ala Met His
1 5 10 15
Arg Val Gly Val Ala Asp Met Ala Ala Val Ala Leu Pro Gly Leu Ile
20 25 30
Gly Phe Ala Gly Gly Ser Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Val Glu Tyr Leu Asp Val Phe Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Arg Val Gln Phe Gln Gly Gly Gly Thr His Ala Val Tyr Leu Leu
65 70 75 80
Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr
85 90 95
Pro Ala Phe Glu Trp Phe Tyr Glu Ser Gly Leu Ser Thr Ile Met Pro
100 105 110
Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ser Arg
115 120 125
Gly Asn Gly Gln Asn Tyr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln
130 135 140
Glu Leu Pro Thr Trp Leu Glu Ala Asn Arg Gly Val Ser Arg Thr Gly
145 150 155 160
Asn Ala Phe Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ala Ala Leu Thr Tyr
165 170 175
Ala Ile His His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Ser Ser Leu Ser Gly
180 185 190
Phe Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp Pro Met Leu Ile Gly Leu Ala
195 200 205
Met Asn Asp Ala Gly Gly Phe Asn Ala Glu Ser Met Trp Gly Pro Ser
210 215 220
Ser Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp Pro Met Val Asn Ile Asn Gln
225 230 235 240
Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Ile Tyr Cys Gly Thr Gly Thr
245 250 255
Pro Ser Glu Leu Asp Thr Gly Thr Pro Gly Gln Asn Leu Met Ala Ala
260 265 270
Gln Phe Leu Glu Gly Phe Thr Leu Arg Thr Asn Ile Ala Phe Arg Asp
275 280 285
Asn Tyr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Phe Asn Phe Pro Ala
290 295 300
Ser Gly Thr His Ser Trp Gly Tyr Trp Gly Gln Gln Leu Gln Gln Met
305 310 315 320
Lys Pro Asp Ile Gln Arg Val Leu Gly Ala Gln Ala Thr Ala
325 330
〈210〉 46〈211〉 795
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 46
ctgccgcggg tttgccatct cttgggtcct gggtcgggag gccatgttct gggtaacgat 60
ccggtaccgt ccggcgatgt gaccaacatg cgaacagcga caacgaagct aggagcggcg 120
ctcggcgcag cagcattggt ggccgccacg gggatggtca gcgcggcgac ggcgaacgcc 180
caggaagggc accaggtccg ttacacgctc acctcggccg gcgcttacga gttcgacctg 240
ttctatctga cgacgcagcc gccgagcatg caggcgttca acgccgacgc gtatgcgttc 300
gccaagcggg agaaggtcag cctcgccccg ggtgtgccgt gggtcttcga aaccacgatg 360
gccgacccga actgggcgat ccttcaggtc agcagcacca cccgcggtgg gcaggccgcc 420
ccgaacgcgc actgcgacat cgccgtcgat ggccaggagg tgctcagcca gcacgacgac 480
ccctacaacg tgcggtgcca gctcggtcag tggtgagtca cctcgccgag agtccggcca 540
gcgccggcgg cagcggctcg cggtgcagca ccccgaggcg ctgggtcgcg cgggtcagcg 600
cgacgtaaag atcgctggcc ccgcgcggcc cctcggcgag gatctgctcc gggtagacca 660
ccagcacggc gtctaactcc agacccttgg tctgcgtggg tgccaccgcg cccgggacac 720
cgggcgggcc gatcaccacg ctggtgccct cccggtccgc ctccgcacgc acgaaatcgt 780
cgatggcacc ggcga 795
〈210〉 47
〈211〉 142
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 47
Met Arg Thr Ala Thr Thr Lys Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala
1 5 10 15
Leu Val Ala Ala Thr Gly Met Val Ser Ala Ala Thr Ala Asn Ala Gln
20 25 30
Glu Gly His Gln Val Arg Tyr Thr Leu Thr Ser Ala Gly Ala Tyr Glu
35 40 45
Phe Asp Leu Phe Tyr Leu Thr Thr Gln Pro Pro Ser Met Gln Ala Phe
50 55 60
Asn Ala Asp Ala Tyr Ala Phe Ala Lys Arg Glu Lys Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Pro Gly Val Pro Trp Val Phe Glu Thr Thr Met Ala Asp Pro Asn Trp
85 90 95
Ala Ile Leu Gln Val Ser Ser Thr Thr Arg Gly Gly Gln Ala Ala Pro
100 105 110
Asn Ala His Cys Asp Ile Ala Val Asp Gly Gln Glu Val Leu Ser Gln
115 120 125
His Asp Asp Pro Tyr Asn Val Arg Cys Gln Leu Gly Gln Trp
130 135 140
〈210〉 48
〈211〉 300
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 48
gccagtgcgc caacggtttt catcgatgcc gcacacaacc ccggtgggcc ctgcgcttgc 60
cgaaggctgc gcgacgagtt cgacttccgg tatctcgtcg gcgtcgtctc ggtgatgggg 120
gacaaggacg tggacgggat ccgccaggac ccgggcgtgc cggacgggcg cggtctcgca 180
ctgttcgtct cgggcgacaa ccttcgaaag ggtgcggcgc tcaacacgat ccagatcgcc 240
gagctgctgg ccgcccagtt gtaagtgttc cgccgaaatt gcattccacg ccgataatcg 300
〈210〉 49
〈211〉 563
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 49
ggatcctcgg ccggctcaag agtccgcgcc gaggtggatg tgacgctgga cggctacgag 60
ttcagtcggg cctgcgaggc gctgtaccac ttcgcctggg acgagttctg cgactggtat 120
gtcgagcttg ccaaagtgca actgggtgaa ggtttctcgc acaccacggc cgtgttggcc 180
accgtgctcg atgtgctgct caagcttctg cacccggtca tgccgttcgt caccgaggtg 240
ctgtggaagg ccctgaccgg gcgggccggc gcgagcgaac gtctgggaaa tgtggagtca 300
ctggtcgtcg cggactggcc cacgcccacc ggatacgcgc tggatcaggc tgccgcacaa 360
cggatcgccg acacccagaa gttgatcacc gaggtgcgcc ggttccgcag cgatcagggt 420
ctggccgacc gccagcgggt gcctgcccgg ttgtccggca tcgacaccgc gggtctggac 480
gcccatgtcc cggcggtgcg cgcgctggcc tggcttgacc gagggtgatg agggcttcac 540
cgcgtccgaa tcggtcgagg tgc 563
〈210〉 50
〈211〉 434
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 50
gggccgggcc cgaggatgag caagttcgaa gtcgtcaccg ggatggcgtt cgcggctttc 60
gccgacgcgc ccatcgacgt cgccgtcgtc gaggtcgggc tcggtggtcg ctgggacgcg 120
acgaacgtgg tgaacgcacc ggtcgcggtc atcaccccga tcggggtgga ccacaccgac 180
tacctcggtg acacgatcgc cgagatcgcc ggggagaagg ccggaaatca tcacccgcca 240
gccgacgacc tggtgccgac cgacaccgtc gccgtgctgg cgcggcaggt tcccgaggcc 300
atggaggtgc tgctggccca ggcggtgcgc tcggatgcgg ctgtagcgcg cgaggattcg 360
gagtgcgcgg tgctgggccg tcaggtcgcc atcggcggca gctgctccgg ttgcaggggc 420
tcggtggcgt ctac 434
〈210〉 51
〈211〉 438
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 51
ggatcccact cccgcgccgg cggcggccag ctggtacggc cattccagcg tgctgatcga 60
ggtcgacggc taccgcgtgc tggccgaccc ggtgtggagc aacagatgtt cgccctcacg 120
ggcggtcgga ccgcagcgca tgcacgacgt cccggtgccg ctggaggcgc ttcccgccgt 180
ggacgcggtg gtgatcgcca acgaccacta cgaccacctc gacatcgaca ccatcgtcgc 240
gttggcgcac acccagcggg ccccgttcgt ggtgccgttg ggcatcggcg cacacctgcg 300
caagtggggc gtccccgagg cgcggatcgt cgagttggac tggcacgaag cccaccgcat 360
cgacgacctg acgctggtct gcacccccgc ccggcacttc tccggccggt tgttctcccg 420
cgactcgacg ctgtgggc 438
〈210〉 52
〈211〉 87
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 52
Ala Ser Ala Pro Thr Val Phe Ile Asp Ala Ala His Asn Pro Gly Gly
1 5 10 15
Pro Cys Ala Cys Arg Arg Leu Arg Asp Glu Phe Asp Phe Arg Tyr Leu
20 25 30
Val Gly Val Val Ser Val Met Gly Asp Lys Asp Val Asp Gly Ile Arg
35 40 45
Gln Asp Pro Gly Val Pro Asp Gly Arg Gly Leu Ala Leu Phe Val Ser
50 55 60
Gly Asp Asn Leu Arg Lys Gly Ala Ala Leu Asn Thr Ile Gln Ile Ala
65 70 75 80
Glu Leu Leu Ala Ala Gln Leu
85
〈210〉 53
〈211〉 175
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 53
Gly Ser Ser Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Glu Val Asp Val Thr Leu
1 5 10 15
Asp Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ala Cys Glu Ala Leu Tyr His Phe Ala
20 25 30
Trp Asp Glu Phe Cys Asp Trp Tyr Val Glu Leu Ala Lys Val Gln Leu
35 40 45
Gly Glu Gly Phe Ser His Thr Thr Ala Val Leu Ala Thr Val Leu Asp
50 55 60
Val Leu Leu Lys Leu Leu His Pro Val Met Pro Phe Val Thr Glu Val
65 70 75 80
Leu Trp Lys Ala Leu Thr Gly Arg Ala Gly Ala Ser Glu Arg Leu Gly
85 90 95
Asn Val Glu Ser Leu Val Val Ala Asp Trp Pro Thr Pro Thr Gly Tyr
100 105 110
Ala Leu Asp Gln Ala Ala Ala Gln Arg Ile Ala Asp Thr Gln Lys Leu
115 120 125
Ile Thr Glu Val Arg Arg Phe Arg Ser Asp Gln Gly Leu Ala Asp Arg
130 135 140
Gln Arg Val Pro Ala Arg Leu Ser Gly Ile Asp Thr Ala Gly Leu Asp
145 150 155 160
Ala His Val Pro Ala Val Arg Ala Leu Ala Trp Leu Asp Arg Gly
165 170 175
〈210〉 54
〈211〉 144
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 54
Gly Pro Gly Pro Arg Asn Ser Lys Phe Glu Val Val Thr Gly Met Ala
1 5 10 15
Phe Ala Ala Phe Ala Asp Ala Pro Ile Asp Val Ala Val Val Glu Val
20 25 30
Gly Leu Gly Gly Arg Trp Asp Ala Thr Asn Val Val Asn Ala Pro Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Pro Ile Gly Val Asp His Thr Asp Tyr Leu Gly Asp
50 55 60
Thr Ile Ala Glu Ile Ala Gly Glu Lys Ala Gly Asn His His Pro Pro
65 70 75 80
Ala Asp Asp Leu Val Pro Thr Asp Thr Val Ala Val Leu Ala Arg Gln
85 90 95
Val Pro Glu Ala Asn Glu Val Leu Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Asp
100 105 110
Ala Ala Val Ala Arg Glu Asp Ser Glu Cys Ala Val Leu Gly Arg Gln
115 120 125
Val Ala Ile Gly Gly Ser Cys Ser Gly Cys Arg Gly Ser Val Ala Ser
130 135 140
〈210〉 55
〈211〉 145
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 55
Asp Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Gly His Ser Ser
1 5 10 15
Val Leu Ile Glu Val Asp Gly Tyr Arg Val Leu Ala Asp Pro Val Trp
20 25 30
Ser Asn Arg Cys Ser Pro Ser Arg Ala Val Gly Pro Gln Arg Met His
35 40 45
Asp Val Pro Val Pro Leu Glu Ala Leu Pro Ala Val Asp Ala Val Val
50 55 60
Ile Ser Asn Asp His Tyr Asp His Leu Asp Ile Asp Thr Ile Val Ala
65 70 75 80
Leu Ala His Thr Gln Arg Ala Pro Phe Val Val Pro Leu Gly Ile Gly
85 90 95
Ala His Leu Arg Lys Trp Gly Val Pro Glu Ala Arg Ile Val Glu Leu
100 105 110
Asp Trp His Glu Ala His Arg Ile Asp Asp Leu Thr Leu Val Cys Thr
115 120 125
Pro Ala Arg His Phe Ser Gly Arg Leu Phe Ser Arg Asp Ser Thr Leu
130 135 140
Trp
145
〈210〉 56
〈211〉 10
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(1)
〈223〉 Residue can be either Gly, Ile, Leu or Val
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈223〉 Residue can be either Ile, Leu, Gly, or Ala
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (5)...(5)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (9)...(9)
〈400〉 56
Xaa Xaa Ala Pro Xaa Gly Asp Ala Xaa Arg
1 5 10
〈210〉 57
〈211〉 8
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(7)
〈223〉 Residue can be either Ile or Leu
〈400〉 57
Pro Glu Ala Glu Ala Asn Xaa Arg
1 5
〈210〉 58
〈211〉 11
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (4)...(4)
〈223〉 Residue can be either Gln or Gly
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (5)...(5)
〈223〉 Residue can be either Gly or Gln
〈400〉 58
Thr Ala Asn Xaa Xaa Glu Tyr Tyr Asp Asn Arg
1 5 10
〈210〉 59
〈211〉 34
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 59
Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Glu Ala Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Thr
1 5 10 15
Ala Asn Pro Ala Glu Tyr Tyr Asp Leu Arg Gly Ile Leu Ala Pro Ile
20 25 30
Gly Asp
〈210〉 60
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 60
ccggtgggcc cgggctgcgc 20
〈210〉 61
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 61
tggccggcca ccacgtggta 20
〈210〉 62
〈211〉 313
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 62
gccggtgggc ccgggctgcg cggaatacgc ggcagccaat cccactgggc cggcctcggt 60
gcagggaatg tcgcaggacc cggtcgcggt ggcggcctcg aacaatccgg agttgacaac 120
gctgtacggc tgcactgtcg ggccagctca atccgcaagt aaacctggtg gacaccctca 180
acagcggtca gtacacggtg ttcgcaccga ccaacgcggc atttagcaag ctgccggcat 240
ccacgatcga cgagctcaag accaattcgt cactgctgac cagcatcctg acctaccacg 300
tggtggccgg cca 313
〈210〉 63
〈211〉 18
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(17)
〈400〉 63
Glu Pro Ala Gly Pro Leu Pro Xaa Tyr Asn Glu Arg Leu His Thr Leu
1 5 10 15
Xaa Gln
〈210〉 64
〈211〉 25
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (21)...(21)
〈400〉 64
Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Gly Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Val Gln Gln Xaa Asp Thr Phe Leu
20 25
〈210〉 65
〈211〉 26
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (3)...(3)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (21)...(22)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (24)...(24)
〈400〉 65
Asp Pro Xaa Pro Asp Ile Glu Val Glu Phe Ala Arg Gly Thr Gly Ala
1 5 10 15
Glu Pro Gly Leu Xaa Xaa Val Xaa Asp Ala
20 25
〈210〉 66
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 66
accgccctcg agttctcccg gccaggtctg cc 32
〈210〉 67
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 67
aagcacgagc tcagtctctt ccacgcggac gt 32
〈210〉 68
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 68
catggatcca ttctcccggc ccggtcttcc 30
〈210〉 69
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 69
tttgaattct aggcggtggc ctgagc 26
〈210〉 70
〈211〉 161
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 70
Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Ala Ala Phe Glu Trp Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Gly Leu Ala Val Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
20 25 30
Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys
35 40 45
Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu Leu Pro Ala Tyr Leu Ala Ala Asn
50 55 60
Lys Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala
65 70 75 80
Gly Ser Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Gln
85 90 95
Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp
100 105 110
Pro Met Leu Ile Asn Ile Ser Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala
115 120 125
Asn Asp Met Trp Gly Arg Thr Glu Asp Pro Ser Ser Ala Trp Lys Arg
130 135 140
Asn Asp Pro Met Val Asn Ile Gly Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Pro
145 150 155 160
Leu
〈210〉 71
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 71
gagagactcg agaacgccca ggaagggcac cag 33
〈210〉 72
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 72
gagagactcg agtgactcac cactgaccga gc 32
〈210〉 73
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈221〉 unsure
〈222〉 (3)...(3)
〈221〉 unsure
〈222〉 (6)...(6)
〈221〉 unsure
〈222〉 (9)...(9)
〈221〉 unsure
〈222〉 (15)...(15)
〈400〉 73
ggngcngcnc argcngarcc 20
〈210〉 74
〈211〉 825
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 74
ttggatccca ctcccgcgcc ggcggcggcc agctggtacg gccattccag cgtgctgatc 60
gaggtcgacg gctaccgcgt gctggccgac ccggtgtgga gcaacagatg ttcgccctca 120
cgggcggtcg gaccgcagcg catgcacgac gtcccggtgc cgctggaggc gcttcccgcc 180
gtggacgcgg tggtgatcag ccacgaccac tacgaccacc tcgacatcga caccatcgtc 240
gcgttggcgc acacccagcg ggccccgttc gtggtgccgt tgggcatcgg cgcacacctg 300
cgcaagtggg gcgtccccga ggcgcggatc gtcgagttgg actggcacga agcccaccgc 360
atagacgacc tgacgctggt ctgcaccccc gcccggcact tctccggacg gttgttctcc 420
cgcgactcga cgctgtgggc gtcgtgggtg gtcaccggct cgtcgcacaa ggcgttcttc 480
ggtggcgaca ccggatacac gaagagcttc gccgagatcg gcgacgagta cggtccgttc 540
gatctgaccc tgctgccgat cggggcctac catcccgcgt tcgccgacat ccacatgaac 600
cccgaggagg cggtgcgcgc ccatctggac ctgaccgagg tggacaacag cctgatggtg 660
cccatccact gggcgacatt ccgcctcgcc ccgcatccgt ggtccgagcc cgccgaacgc 720
ctgctgaccg ctgccgacgc cgagcgggta cgcctgaccg tgccgattcc cggtcagcgg 780
gtggacccgg agtcgacgtt cgacccgtgg tggcggttct gaacc 825
〈210〉 75
〈211〉 273
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 75
Leu Asp Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Gly His Ser
1 5 10 15
Ser Val Leu Ile Glu Val Asp Gly Tyr Arg Val Leu Ala Asp Pro Val
20 25 30
Trp Ser Asn Arg Cys Ser Pro Ser Arg Ala Val Gly Pro Gln Arg Met
35 40 45
His Asp Val Pro Val Pro Leu Glu Ala Leu Pro Ala Val Asp Ala Val
50 55 60
Val Ile Ser His Asp His Tyr Asp His Leu Asp Ile Asp Thr Ile Val
65 70 75 80
Ala Leu Ala His Thr Gln Arg Ala Pro Phe Val Val Pro Leu Gly Ile
85 90 95
Gly Ala His Leu Arg Lys Trp Gly Val Pro Glu Ala Arg Ile Val Glu
100 105 110
Leu Asp Trp His Glu Ala His Arg Ile Asp Asp Leu Thr Leu Val Cys
115 120 125
Thr Pro Ala Arg His Phe Ser Gly Arg Leu Phe Ser Arg Asp Ser Thr
130 135 140
Leu Trp Ala Ser Trp Val Val Thr Gly Ser Ser His Lys Ala Phe Phe
145 150 155 160
Gly Gly Asp Thr Gly Tyr Thr Lys Ser Phe Ala Glu Ile Gly Asp Glu
165 170 175
Tyr Gly Pro Phe Asp Leu Thr Leu Leu Pro Ile Gly Ala Tyr His Pro
180 185 190
Ala Phe Ala Asp Ile His Met Asn Pro Glu Glu Ala Val Arg Ala His
195 200 205
Leu Asp Leu Thr Glu Val Asp Asn Ser Leu Met Val Pro Ile His Trp
210 215 220
Ala Thr Phe Arg Leu Ala Pro His Pro Trp Ser Glu Pro Ala Glu Arg
225 230 235 240
Leu Leu Thr Ala Ala Asp Ala Glu Arg Val Arg Leu Thr Val Pro Ile
245 250 255
Pro Gly Gln Arg Val Asp Pro Glu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Trp Arg
260 265 270
Phe
〈210〉 76
〈211〉 10
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 76
Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala
1 5 10
〈210〉 77
〈211〉 337
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 77
gatccctaca tcctgctggt cagctccaag gtgtcgaccg tcaaggatct gctcccgctg 60
ctggagaagg tcatccaggc cggcaagccg ctgctgatca tcgccgagga cgtcgagggc 120
gaggccctgt ccacgctggt ggtcaacaag atccgcggca ccttcaagtc cgtcgccgtc 180
aaggctccgg gcttcggtga ccgccgcaag gcgatgctgc aggacatggc catcctcacc 240
ggtggtcagg tcgtcagcga aagagtcggg ctgtccctgg agaccgccga cgtctcgctg 300
ctgggccagg cccgcaaggt cgtcgtcacc aaggaca 337
〈210〉 78
〈211〉 112
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 78
Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln Ala Gly Lys Pro Leu Leu
20 25 30
Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val
35 40 45
Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly
50 55 60
Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr
65 70 75 80
Gly Gly Gln Val Val Ser Glu Arg Val Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala
85 90 95
Asp Val Ser Leu Leu Gly Gln Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp
100 105 110
〈210〉 79
〈211〉 360
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 79
ccgtacgaga agatcggcgc tgagctggtc aaagaggtcg ccaagaagac cgacgacgtc 60
gcgggcgacg gcaccaccac cgccaccgtg ctcgctcagg ctctggttcg cgaaggcctg 120
cgcaacgtcg cagccggcgc caacccgctc ggcctcaagc gtggcatcga gaaggctgtc 180
gaggctgtca cccagtcgct gctgaagtcg gccaaggagg tcgagaccaa ggagcagatt 240
tctgccaccg cggcgatctc cgccggcgac acccagatcg gcgagctcat cgccgaggcc 300
atggacaagg tcggcaacga gggtgtcatc accgtcgagg agtcgaacac cttcggcctg 360
〈210〉 80
〈211〉 120
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 80
Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys
1 5 10 15
Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala
20 25 30
Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn
35 40 45
Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Ala Val Thr
50 55 60
Gln Ser Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Thr Gln Ile Gly Glu Leu
85 90 95
Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val
100 105 110
Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu
115 120
〈210〉 81
〈211〉 43
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 81
actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tag 43
〈210〉 82
〈211〉 43
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 82
cgacaaggaa cttcgctacc ttaggaccgt catagttacg ggc 43
〈210〉 83
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 83
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
〈210〉 84
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 84
ggaaggaagc ggccgctttt tttttttttt t 31
〈210〉 85
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 85
gagagagagc ccgggcatgc tsctsctsct s 31
〈210〉 86
〈211〉 238
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 86
ctcgatgaac cgctcggagc gctcgacctg aagctgcgcc acgtcatgca gttcgagctc 60
aagcgcatcc agcgggaggt cgggatcacg ttcatctacg tgacccacga ccaggaagag 120
gcgctcacga tgagtgaccg catcgcggtg atgaacgccg gcaacgtcga acagatcggc 180
agcccgaccg agatctacga ccgtcccgcg acggtgttcg tcgccagctt catcgaat 238
〈210〉 87
〈211〉 79
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 87
Leu Asp Glu Pro Leu Gly Ala Leu Asp Leu Lys Leu Arg His Val Met
1 5 10 15
Gln Phe Glu Leu Lys Arg Ile Gln Arg Glu Val Gly Ile Thr Phe Ile
20 25 30
Tyr Val Thr His Asp Gln Glu Glu Ala Leu Thr Met Ser Asp Arg Ile
35 40 45
Ala Val Met Asn Ala Gly Asn Val Glu Gln Ile Gly Ser Pro Thr Glu
50 55 60
Ile Tyr Asp Arg Pro Ala Thr Val Phe Val Ala Ser Phe Ile Glu
65 70 75
〈210〉 88
〈211〉 1518
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 88
cactcgccat gggtgttaca ataccccacc agttcctcga agtaaacgaa cagaaccgtg 60
acatccagct gagaaaatat tcacagcgac gaagcccggc cgatgcctga tggggtccgg 120
catcagtaca gcgcgctttc ctgcgcggat tctattgtcg agtccggggt gtgacgaagg 180
aatccattgt cgaaatgtaa attcgttgcg gaatcacttg cataggtccg tcagatccgc 240
gaaggtttac cccacagcca cgacggctgt ccccgaggag gacctgccct gaccggcaca 300
cacatcaccg ctgcagaacc tgcagaacag acggcggatt ccgcggcacc gcccaagggc 360
gcgccggtga tcgagatcga ccatgtcacg aagcgcttcg gcgactacct ggccgtcgcg 420
gacgcagact tctccatcgc gcccggggag ttcttctcca tgctcggccc gtccgggtgt 480
gggaagacga ccacgttgcg catgatcgcg ggattcgaga ccccgactga aggggcgatc 540
cgcctcgaag gcgccgacgt gtcgaggacc ccacccaaca agcgcaacgt caacacggtg 600
ttccagcact acgcgctgtt cccgcacatg acggtctggg acaacgtcgc gtacggcccg 660
cgcagcaaga aactcggcaa aggcgaggtc cgcaagcgcg tcgacgagct gctggagatc 720
gtccggctga ccgaatttgc cgagcgcagg cccgcccagc tgtccggcgg gcagcagcag 780
cgggtggcgt tggcccgggc actggtgaac taccccagcg cgctgctgct cgatgaaccg 840
ctcggagcgc tcgacctgaa gctgcgccac gtcatgcagt tcgagctcaa gcgcatccag 900
cgggaggtcg ggatcacgtt catctacgtg acccacgacc aggaagaggc gctcacgatg 960
agtgaccgca tcgcggtgat gaacgccggc aacgtcgaac agatcggcag cccgaccgag 1020
atctacgacc gtcccgcgac ggtgttcgtc gccagcttca tcggacaggc caacctctgg 1080
gcgggccggt gcaccggccg ctccaaccgc gattacgtcg agatcgacgt tctcggctcg 1140
acgctgaagg cacgcccggg cgagaccacg atcgagcccg gcgggcacgc caccctgatg 1200
gtgcgtccgg aacgcatccg ggtcaccccg ggctcccagg acgcgccgac cggtgacgtc 1260
gcctgcgtgc gtgccaccgt caccgacctg accttccaag gtccggtggt gcggctctcg 1320
ctggccgctc cggacgactc gaccgtgatc gcccacgtcg gccccgagca ggatctgccg 1380
ctgctgcgcc ccggcgacga cgtgtacgtc agctgggcac cggaagcctc cctggtgctt 1440
cccggcgacg acatccccac caccgaggac ctcgaagaga tgctcgacga ctcctgagtc 1500
acgcttcccg attgccga 1518
〈210〉 89
〈211〉 376
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 89
Val Ile Glu Ile Asp His Val Thr Lys Arg Phe Gly Asp Tyr Leu Ala
1 5 10 15
Val Ala Asp Ala Asp Phe Ser Ile Ala Pro Gly Glu Phe Phe Ser Met
20 25 30
Leu Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys Thr Thr Thr Leu Arg Met Ile Ala
35 40 45
Gly Phe Glu Thr Pro Thr Glu Gly Ala Ile Arg Leu Glu Gly Ala Asp
50 55 60
Val Ser Arg Thr Pro Pro Asn Lys Arg Asn Val Asn Thr Val Phe Gln
65 70 75 80
His Tyr Ala Leu Phe Pro His Met Thr Val Trp Asp Asn Val Ala Tyr
85 90 95
Gly Pro Arg Ser Lys Lys Leu Gly Lys Gly Glu Val Arg Lys Arg Val
100 105 110
Asp Glu Leu Leu Glu Ile Val Arg Leu Thr Glu Phe Ala Glu Arg Arg
115 120 125
Pro Ala Gln Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Val Ala Leu Ala Arg
130 135 140
Ala Leu Val Asn Tyr Pro Ser Ala Leu Leu Leu Asp Glu Pro Leu Gly
145 150 155 160
Ala Leu Asp Leu Lys Leu Arg His Val Met Gln Phe Glu Leu Lys Arg
165 170 175
Ile Gln Arg Glu Val Gly Ile Thr Phe Ile Tyr Val Thr His Asp Gln
180 185 190
Glu Glu Ala Leu Thr Met Ser Asp Arg Ile Ala Val Met Asn Ala Gly
195 200 205
Asn Val Glu Gln Ile Gly Ser Pro Thr Glu Ile Tyr Asp Arg Pro Ala
210 215 220
Thr Val Phe Val Ala Ser Phe Ile Gly Gln Ala Asn Leu Trp Ala Gly
225 230 235 240
Arg Cys Thr Gly Arg Ser Asn Arg Asp Tyr Val Glu Ile Asp Val Leu
245 250 255
Gly Ser Thr Leu Lys Ala Arg Pro Gly Glu Thr Thr Ile Glu Pro Gly
260 265 270
Gly His Ala Thr Leu Met Val Arg Pro Glu Arg Ile Arg Val Thr Pro
275 280 285
Gly Ser Gln Asp Ala Pro Thr Gly Asp Val Ala Cys Val Arg Ala Thr
290 295 300
Val Thr Asp Leu Thr Phe Gln Gly Pro Val Val Arg Leu Ser Leu Ala
305 310 315 320
Ala Pro Asp Asp Ser Thr Val Ile Ala His Val Gly Pro Glu Gln Asp
325 330 335
Leu Pro Leu Leu Arg Pro Gly Asp Asp Val Tyr Val Ser Trp Ala Pro
340 345 350
Glu Ala Ser Leu Val Leu Pro Gly Asp Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asp
355 360 365
Leu Glu Glu Met Leu Asp Asp Ser
370 375
〈210〉 90
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 90
gagagactcg aggtgatcga gatcgaccat gtc 33
〈210〉 91
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 91
agagactcga gcaatcggga agcgtgactc a 31
〈210〉 92
〈211〉 323
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 92
gtcgactaca aagaagactt caacgacaac gagcagtggt tcgccaaggt caaggagccg 60
ttgtcgcgca agcaggacat aggcgccgac ctggtgatcc ccaccgagtt catggccgcg 120
cgcgtcaagg gcctgggatg gctcaatgag atcagcgaag ccggcgtgcc caatcgcaag 180
aatctgcgtc aggacctgtt ggactcgagc atcgacgagg gccgcaagtt caccgcgccg 240
tacatgaccg gcatggtcgg tctcgcctac aacaaggcag ccaccggacg cgatatccgc 300
accatcgacg acctctggga tcc 323
〈210〉 93
〈211〉 1341
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 93
ccccaccccc ttccctggag ccgacgaaag gcacccgcac atgtcccgtg acatcgatcc 60
ccacctgctg gcccgaatga ccgcacgccg caccttgcgt cgccgcttca tcggcggtgg 120
cgccgcggcc gccgcgggcc tgaccctcgg ttcgtcgttc ctggcggcgt gcgggtccga 180
cagtgggacc tcgagcacca cgtcacagga cagcggcccc gccagcggcg ccctgcgcgt 240
ctccaactgg ccgctctata tggccgacgg tttcatcgca gcgttccaga ccgcctcggg 300
catcacggtc gactacaaag aagacttcaa cgacaacgag cagtggttcg ccaaggtcaa 360
ggagccgttg tcgcgcaagc aggacatagg cgccgacctg gtgatcccca ccgagttcat 420
ggccgcgcgc gtcaagggcc tgggatggct caatgagatc agcgaagccg gcgtgcccaa 480
tcgcaagaat ctgcgtcagg acctgttgga ctcgagcatc gacgagggcc gcaagttcac 540
cgcgccgtac atgaccggca tggtcggtct cgcctacaac aaggcagcca ccggacgcga 600
tatccgcacc atcgacgacc tctgggatcc cgcgttcaag ggccgcgtca gtctgttctc 660
cgacgtccag gacggcctcg gcatgatcat gctctcgcag ggcaactcgc cggagaatcc 720
gaccaccgag tccattcagc aggcggtcga tctggtccgc gaacagaacg acagggggtc 780
agatccgtcg cttcaccggc aacgactacg ccgacgacct ggccgcagaa acatcgccat 840
cgcgcaggcg tactccggtg acgtcgtgca gctgcaggcg gacaaccccg atctgcagtt 900
catcgttccc gaatccggcg gcgactggtt cgtcgacacg atggtgatcc cgtacaccac 960
gcagaaccag aaggccgccg aggcgtggat cgactacatc tacgaccgag ccaactacgc 1020
caagctggtc gcgttcaccc agttcgtgcc cgcactctcg gacatgaccg acgaactcgc 1080
caaggtcgat cctgcatcgg cggagaaccc gctgatcaac ccgtcggccg aggtgcaggc 1140
gaacctgaag tcgtgggcgg cactgaccga cgagcagacg caggagttca acactgcgta 1200
cgccgccgtc accggcggct gacgcggtgg tagtgccgat gcgaggggca taaatggccc 1260
tgcggacgcg aggagcataa atggccggtg tcgccaccag cagccgtcag cggacaaggt 1320
cgctccgtat ctgatggtcc t 1341
〈210〉 94
〈211〉 393
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 94
Met Ser Arg Asp Ile Asp Pro His Leu Leu Ala Arg Met Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Thr Leu Arg Arg Arg Phe Ile Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Gly Leu Thr Leu Gly Ser Ser Phe Leu Ala Ala Cys Gly Ser Asp Ser
35 40 45
Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ser Gln Asp Ser Gly Pro Ala Ser Gly Ala
50 55 60
Leu Arg Val Ser Asn Trp Pro Leu Tyr Met Ala Asp Gly Phe Ile Ala
65 70 75 80
Ala Phe Gln Thr Ala Ser Gly Ile Thr Val Asp Tyr Lys Glu Asp Phe
85 90 95
Asn Asp Asn Glu Gln Trp Phe Ala Lys Val Lys Glu Pro Leu Ser Arg
100 105 110
Lys Gln Asp Ile Gly Ala Asp Leu Val Ile Pro Thr Glu Phe Met Ala
115 120 125
Ala Arg Val Lys Gly Leu Gly Trp Leu Asn Glu Ile Ser Glu Ala Gly
130 135 140
Val Pro Asn Arg Lys Asn Leu Arg Gln Asp Leu Leu Asp Ser Ser Ile
145 150 155 160
Asp Glu Gly Arg Lys Phe Thr Ala Pro Tyr Met Thr Gly Met Val Gly
165 170 175
Leu Ala Tyr Asn Lys Ala Ala Thr Gly Arg Asp Ile Arg Thr Ile Asp
180 185 190
Asp Leu Trp Asp Pro Ala Phe Lys Gly Arg Val Ser Leu Phe Ser Asp
195 200 205
Val Gln Asp Gly Leu Gly Met Ile Met Leu Ser Gln Gly Asn Ser Pro
210 215 220
Glu Asn Pro Thr Thr Glu Ser Ile Gln Gln Ala Val Asp Leu Val Arg
225 230 235 240
Glu Gln Asn Asp Arg Gly Ser Asp Pro Ser Leu His Arg Gln Arg Leu
245 250 255
Arg Arg Arg Pro Gly Arg Arg Asn Ile Ala Ile Ala Gln Ala Tyr Ser
260 265 270
Gly Asp Val Val Gln Leu Gln Ala Asp Asn Pro Asp Leu Gln Phe Ile
275 280 285
Val Pro Glu Ser Gly Gly Asp Trp Phe Val Asp Thr Met Val Ile Pro
290 295 300
Tyr Thr Thr Gln Asn Gln Lys Ala Ala Glu Ala Trp Ile Asp Tyr Ile
305 310 315 320
Tyr Asp Arg Ala Asn Tyr Ala Lys Leu Val Ala Phe Thr Gln Phe Val
325 330 335
Pro Ala Leu Ser Asp Met Thr Asp Glu Leu Ala Lys Val Asp Pro Ala
340 345 350
Ser Ala Glu Asn Pro Leu Ile Asn Pro Ser Ala Glu Val Gln Ala Asn
355 360 365
Leu Lys Ser Trp Ala Ala Leu Thr Asp Glu Gln Thr Gln Glu Phe Asn
370 375 380
Thr Ala Tyr Ala Ala Val Thr Gly Gly
385 390
〈210〉 95
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 95
atgtcccgtg acatcgatcc cc 22
〈210〉 96
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 96
atcggcacta ccaccgcgtc a 21
〈210〉 97
〈211〉 861
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 97
gccggcgctc gcatatctcg cgatcttctt ccgtggtgcc gttcttctcg ctggcacgca 60
cctcgttgtc ggagaccggc ggctcggtgt tcatgccgac gctgacgttc gcctgggact 120
tcggcaacta cgtcgacgcg ttcacgatgt accacgagca gatcttccgc tcgttcggct 180
acgcgttcgt cgccacggtg ctgtgcctgt tgctggcgtt cccgctggcc tacgtcatcg 240
cgttcaaggc cggccggttc aagaacctga tcctggggct ggtgatcctg ccgttcttcg 300
tcacgttcct gatccgcacc attgcgtgga agacgatcct ggccgacgaa ggctgggtgg 360
tcaccgcgct gggcgccatc gggctgctgc ctgacgaggg ccggctgctg tccaccagct 420
gggcggtcat cggcggtctg acctacaact ggatcatctt catgatcctg ccgctgtacg 480
tcagcctgga gaagatcgac ccgcgtctgc tggaggcctc ccaggacctc tactcgtcgg 540
cgccgcgcag cttcggcaag gtgatcctgc cgatggcgat gcccggggtg ctggccggga 600
gcatgctggt gttcatcccg gccgtcggcg acttcatcaa cgccgactat ctcggcagta 660
cccagaccac catgatcggc aacgtgatcc agaagcagtt cctggtcgtc aaggactatc 720
cggcggcggc cgcgctgagt ctggggctga tgttgctgat cctgatcggc gtgctcctct 780
acacacgggc gctgggttcg gaggatctgg tatgaccacc caggcaggcg ccgcactggc 840
caccgccgcc cagcaggatc c 861
〈210〉 98
〈211〉 259
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 98
Val Val Pro Phe Phe Ser Leu Ala Arg Thr Ser Leu Ser Glu Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Val Phe Met Pro Thr Leu Thr Phe Ala Trp Asp Phe Gly Asn
20 25 30
Tyr Val Asp Ala Phe Thr Met Tyr His Glu Gln Ile Phe Arg Ser Phe
35 40 45
Gly Tyr Ala Phe Val Ala Thr Val Leu Cys Leu Leu Leu Ala Phe Pro
50 55 60
Leu Ala Tyr Val Ile Ala Phe Lys Ala Gly Arg Phe Lys Asn Leu Ile
65 70 75 80
Leu Gly Leu Val Ile Leu Pro Phe Phe Val Thr Phe Leu Ile Arg Thr
85 90 95
Ile Ala Trp Thr Ile Leu Ala Asp Glu Gly Trp Val Val Thr Ala Leu
100 105 110
Gly Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp Glu Gly Arg Leu Leu Ser Thr Ser
115 120 125
Trp Ala Val Ile Gly Gly Leu Thr Tyr Asn Trp Ile Ile Phe Met Ile
130 135 140
Leu Pro Leu Tyr Val Ser Leu Glu Lys Ile Asp Pro Arg Leu Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Leu Tyr Ser Ser Ala Pro Arg Ser Phe Gly Lys Val
165 170 175
Ile Leu Pro Met Ala Met Pro Gly Val Leu Ala Gly Ser Met Leu Val
180 185 190
Phe Ile Pro Ala Val Gly Asp Phe Ile Asn Ala Asp Tyr Leu Gly Ser
195 200 205
Thr Gln Thr Thr Met Ile Gly Asn Val Ile Gln Lys Gln Phe Leu Val
210 215 220
Val Lys Asp Tyr Pro Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Gly Leu Met Leu
225 230 235 240
Leu Ile Leu Ile Gly Val Leu Leu Tyr Thr Arg Ala Leu Gly Ser Glu
245 250 255
Asp Leu Val
〈210〉 99
〈211〉 277
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 99
gtaatctttg ctggagcccg tacgccggta ggcaaactca tgggttcgct caaggacttc 60
aagggcagcg atctcggtgc cgtggcgatc aagggcgccc tggagaaagc cttccccggc 120
gtcgacgacc ctgctcgtct cgtcgagtac gtgatcatgg gccaagtgct ctccgccggc 180
gccggccaga tgcccgcccg ccaggccgcc gtcgccgccg gcatcccgtg ggacgtcgcc 240
tcgctgacga tcaacaagat gtgcctgtcg ggcatcg 277
〈210〉 100
〈211〉 92
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 100
Val Ile Phe Ala Gly Ala Arg Thr Pro Val Gly Lys Leu Met Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Asp Phe Lys Gly Ser Asp Leu Gly Ala Val Ala Ile Lys Gly
20 25 30
Ala Leu Glu Lys Ala Phe Pro Gly Val Asp Asp Pro Ala Arg Leu Val
35 40 45
Glu Tyr Val Ile Met Gly Gln Val Leu Ser Ala Gly Ala Gly Gln Met
50 55 60
Pro Ala Arg Gln Ala Ala Val Ala Ala Gly Ile Pro Trp Asp Val Ala
65 70 75 80
Ser Leu Thr Ile Asn Lys Met Cys Leu Ser Gly Ile
85 90
〈210〉 101
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(1)
〈223〉 Residue can be either Glu or Pro
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (2)...(2)
〈223〉 Residue can be either Pro or Glu
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (7)...(7)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (12)...(12)
〈400〉 101
Xaa Xaa Ala Asp Arg Gly Xaa Ser Lys Tyr Arg Xaa
1 5 10
〈210〉 102
〈211〉 24
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(1)
〈400〉 102
Xaa Ile Asp Glu Ser Leu Phe Asp Ala Glu Glu Lys Met Glu Lys Ala
1 5 10 15
Val Ser Val Ala Arg Asp Ser Ala
20
〈210〉 103
〈211〉 23
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(2)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (15)...(15)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (17)...(17)
〈400〉 103
Xaa Xaa Ile Ala Pro Ala Thr Ser Gly Thr Leu Ser Glu Phe Xaa Ala
1 5 10 15
Xaa Lys Gly Val Thr Met Glu
20
〈210〉 104
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 104
Pro Asn Val Pro Asp Ala Phe Ala Val Leu Ala Asp Arg Val Gly
1 5 10 15
〈210〉 105
〈211〉 9
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(1)
〈400〉 105
Xaa Ile Arg Val Gly Val Asn Gly Phe
1 5
〈210〉 106
〈211〉 485
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 106
agcggctggg acatcaacac cgccgccttc gagtggtacg tcgactcggg tctcgcggtg 60
atcatgcccg tcggcgggca gtccagcttc tacagcgact ggtacagccc ggcctgcggt 120
aaggccggct gccagaccta caagtgggag acgttcctga cccaggagct gccggcctac 180
ctcgccgcca acaagggggt cgacccgaac cgcaacgcgg ccgtcggtct gtccatggcc 240
ggttcggcgg cgctgacgct ggcgatctac cacccgcagc agttccagta cgccgggtcg 300
ctgtcgggct acctgaaccc gtccgagggg tggtggccga tgctgatcaa catctcgatg 360
ggtgacgcgg gcggctacaa ggccaacgac atgtggggtc gcaccgagga cccgagcagc 420
gcctggaagc gcaacgaccc gatggtcaac atcggcaagc tggtcgccaa caacaccccc 480
ctctc 485
〈210〉 107
〈211〉 501
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (441)...(441)
〈221〉 unsure
〈222〉 (450)...(450)
〈400〉 107
atgccggtgc gacgtgcgcg cagtgcgctt gcgtccgtga ccttcgtcgc ggccgcgtgc 60
gtgggcgctg agggcaccgc actggcggcg acgccggact ggagcgggcg ctacacggtg 120
gtgacgttcg cctccgacaa actcggcacg agtgtggccg cccgccagcc agaacccgac 180
ttcagcggtc agtacacctt cagcacgtcc tgtgtgggca cctgcgtggc caccgcgtcc 240
gacggcccgg cgccgtcgaa cccgacgatt ccgcagcccg cgcgctacac ctgggacggc 300
aggcagtggg tgttcaacta caactggcag tgggagtgct tccgcggcgc cgacgtcccg 360
cgcgagtacg ccgccgcgcg ttcgctggtg ttctacgccc cgaccgccga cgggtcgatg 420
ttcggcacct ggcgcaccga natcctggan ggcctctgca agggcaccgt gatcatgccg 480
gtcgcggcct atccggcgta g 501
〈210〉 108
〈211〉 180
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 108
atgaaccagc cgcggcccga ggccgaggcg aacctgcggg gctacttcac cgccaacccg 60
gcggagtact acgacctgcg gggcatcctc gccccgatcg gtgacgcgca gcgcaactgc 120
aacatcaccg tgctgccggt agagctgcag acggcctacg acacgttcat ggccggctga 180
〈210〉 109
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 109
Met Pro Val Arg Arg Ala Arg Ser Ala Leu Ala Ser Val Thr Phe Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Cys Val Gly Ala Glu Gly Thr Ala Leu Ala Ala Thr Pro
20 25 30
Asp Trp Ser Gly Arg Tyr Thr Val Val Thr Phe Ala Ser Asp Lys Leu
35 40 45
Gly Thr Ser Val Ala Ala Arg Gln Pro Glu Pro Asp Phe Ser Gly Gln
50 55 60
Tyr Thr Phe Ser Thr Ser Cys Val Gly Thr Cys Val Ala Thr Ala Ser
65 70 75 80
Asp Gly Pro Ala Pro Ser Asn Pro Thr Ile Pro Gln Pro Ala Arg Tyr
85 90 95
Thr Trp Asp Gly Arg Gln Trp Val Phe Asn Tyr Asn Trp Gln Trp Glu
100 105 110
Cys Phe Arg Gly Ala Asp Val Pro Arg Glu Tyr Ala Ala Ala Arg Ser
115 120 125
Leu Val Phe Tyr Ala Pro Thr Ala Asp Gly Ser Met Phe Gly Thr Trp
130 135 140
Arg Thr Asp Ile Leu Asp Gly Leu Cys Lys Gly Thr Val Ile Met Pro
145 150 155 160
Val Ala Ala Tyr Pro Ala
165
〈210〉 110
〈211〉 74
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 110
Pro Arg Asp Thr His Pro Gly Ala Asn Gln Ala Val Thr Ala Ala Met
1 5 10 15
Asn Gln Pro Arg Pro Glu Ala Glu Ala Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Thr
20 25 30
Ala Asn Pro Ala Glu Tyr Tyr Asp Leu Arg Gly Ile Leu Ala Pro Ile
35 40 45
Gly Asp Ala Gln Arg Asn Cys Asn Ile Thr Val Leu Pro Val Glu Leu
50 55 60
Gln Thr Ala Tyr Asp Thr Phe Met Ala Gly
65 70
〈210〉 111
〈211〉 503
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (358)...(358)
〈400〉 111
atgcaggtgc ggcgtgttct gggcagtgtc ggtgcagcag tcgcggtttc ggccgcgtta 60
tggcagacgg gggtttcgat accgaccgcc tcagcggatc cgtgtccgga catcgaggtg 120
atcttcgcgc gcgggaccgg tgcggaaccc ggcctcgggt gggtcggtga tgcgttcgtc 180
aacgcgctgc ggcccaaggt cggtgagcag tcggtgggca cctacgcggt gaactacccg 240
gcaggattcg gacttcgaca aatcggcgcc catgggcgcg gccgacgcat cggggcgggt 300
gcagtggatg gccgacaact gcccggacac caagcttgtc ctgggcggca tgtcgcangg 360
cgccggcgtc atcgacctga tcaccgtcga tccgcgaccg ctgggccggt tcacccccac 420
cccgatgccg ccccgcgtcg ccgaccacgt ggccgccgtt gtggtcttcg gaaatccgtt 480
gcgcgacatc cgtggtggcg gtc 503
〈210〉 112
〈211〉 167
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (119)...(119)
〈400〉 112
Met Gln Val Arg Arg Val Leu Gly Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Ala Leu Trp Gln Thr Gly Val Ser Ile Pro Thr Ala Ser Ala
20 25 30
Asp Pro Cys Pro Asp Ile Glu Val Ile Phe Ala Arg Gly Thr Gly Ala
35 40 45
Glu Pro Gly Leu Gly Trp Val Gly Asp Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg
50 55 60
Pro Lys Val Gly Glu Gln Ser Val Gly Thr Tyr Ala Val Asn Tyr Pro
65 70 75 80
Ala Gly Phe Asp Phe Asp Lys Ser Ala Pro Met Gly Ala Ala Asp Ala
85 90 95
Ser Gly Arg Val Gln Trp Met Ala Asp Asn Cys Pro Asp Thr Lys Leu
100 105 110
Val Leu Gly Gly Met Ser Xaa Gly Ala Gly Val Ile Asp Leu Ile Thr
115 120 125
Val Asp Pro Arg Pro Leu Gly Arg Phe Thr Pro Thr Pro Met Pro Pro
130 135 140
Arg Val Ala Asp His Val Ala Ala Val Val Val Phe Gly Asn Pro Leu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Arg Gly Gly Gly
165
〈210〉 113
〈211〉 1569
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 113
atggccaaga caattgcgta tgacgaagag gcccgccgtg gcctcgagcg gggcctcaac 60
gccctcgcag acgccgtaaa ggtgacgttg ggcccgaagg gtcgcaacgt cgtgctggag 120
aagaagtggg gcgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggacc cgtacgagaa gatcggcgct gagctggtca aagaggtcgc caagaagacc 240
gacgacgtcg cgggcgacgg caccaccacc gccaccgtgc tcgctcaggc tctggttcgc 300
gaaggcctgc gcaacgtcgc agccggcgcc aacccgctcg gcctcaagcg tggcatcgag 360
aaggctgtcg aggctgtcac ccagtcgctg ctgaagtcgg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattt ctgccaccgc ggcgatttcc gccggcgaca cccagatcgg cgagctcatc 480
gccgaggcca tggacaaggt cggcaacgag ggtgtcatca ccgtcgagga gtcgaacacc 540
ttcggcctgc agctcgagct caccgagggt atgcgcttcg acaagggcta catctcgggt 600
tacttcgtga ccgacgccga gcgccaggaa gccgtcctgg aggatcccta catcctgctg 660
gtcagctcca aggtgtcgac cgtcaaggat ctgctcccgc tgctggagaa ggtcatccag 720
gccggcaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggccct gtccacgctg 780
gtggtcaaca agatccgcgg caccttcaag tccgtcgccg tcaaggctcc gggcttcggt 840
gaccgccgca aggcgatgct gcaggacatg gccatcctca ccggtggtca ggtcgtcagc 900
gaaagagtcg ggctgtccct ggagaccgcc gacgtctcgc tgctgggcca ggcccgcaag 960
gtcgtcgtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggct cgggcgattc cgatgccatc 1020
gccggccggg tggctcagat ccgcgccgag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgc 1080
gagaagctgc aggagcgcct ggccaagctg gccggcggtg ttgcggtgat caaggccgga 1140
gctgccaccg aggtggagct caaggagcgc aagcaccgca tcgaggacgc cgtccgcaac 1200
gcgaaggctg ccgtcgaaga gggcatcgtc gccggtggcg gcgtggctct gctgcagtcg 1260
gctcctgcgc tggacgacct cggcctgacg ggcgacgagg ccaccggtgc caacatcgtc 1320
cgcgtggcgc tgtcggctcc gctcaagcag atcgccttca acggcggcct ggagcccggc 1380
gtcgttgccg agaaggtgtc caacctgccc gcgggtcacg gcctcaacgc cgcgaccggt 1440
gagtacgagg acctgctcaa ggccggcgtc gccgacccgg tgaaggtcac ccgctcggcg 1500
ctgcagaacg cggcgtccat cgcggctctg ttcctcacca ccgaggccgt cgtcgccgac 1560
aagccggag 1569
〈210〉 114
〈211〉 523
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 114
Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Ala Val Thr Gln
115 120 125
Ser Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ser
130 135 140
Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Thr Gln Ile Gly Glu Leu Ile
145 150 155 160
Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg
180 185 190
Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Ala Glu Arg
195 200 205
Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys
210 215 220
Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln
225 230 235 240
Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
245 250 255
Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln
275 280 285
Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Val Ser Glu Arg Val Gly
290 295 300
Leu Ser Leu Glu Thr Ala Asp Val Ser Leu Leu Gly Gln Ala Arg Lys
305 310 315 320
Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ser Gly Asp
325 330 335
Ser Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Ala Glu Ile Glu
340 345 350
Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu
370 375 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn
385 390 395 400
Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Ala
405 410 415
Leu Leu Gln Ser Ala Pro Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Thr Gly Asp
420 425 430
Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Arg Val Ala Leu Ser Ala Pro Leu
435 440 445
Lys Gln Ile Ala Phe Asn Gly Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
450 455 460
Lys Val Ser Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Ala Thr Gly
465 470 475 480
Glu Tyr Glu Asp Leu Leu Lys Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val
485 490 495
Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Ala Leu Phe Leu
500 505 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu
515 520
〈210〉 115
〈211〉 647
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 115
atggccaaga caattgcgta tgacgaagag gcccgccgtg gcctcgagcg gggcctcaac 60
gccctcgcag acgccgtaaa ggtgacgttg ggcccgaagg gtcgcaacgt cgtgctggag 120
aagaagtggg gcgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggacc cgtacgagaa gatcggcgct gagctggtca aagaggtcgc caagaagacc 240
gacgacgtcg cgggcgacgg caccaccacc gccaccgtgc tcgctcaggc tctggttcgc 300
gaaggcctgc gcaacgtcgc agccggcgcc aacccgctcg gcctcaagcg tggcatcgag 360
aaggctgtcg aggctgtcac ccagtcgctg ctgaagtcgg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattt ctgccaccgc ggcgatttcc gccggcgaca cccagatcgg cgagctcatc 480
gccgaggcca tggacaaggt cggcaacgag ggtgtcatca ccgtcgagga gtcgaacacc 540
ttcggcctgc agctcgagct caccgagggt atgcgcttcg acaagggcta catctcgggt 600
tacttcgtga ccgacgccga gcgccaggaa gccgtcctgg aggatcc 647
〈210〉 116
〈211〉 927
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 116
gatccctaca tcctgctggt cagctccaag gtgtcgaccg tcaaggatct gctcccgctg 60
ctggagaagg tcatccaggc cggcaagccg ctgctgatca tcgccgagga cgtcgagggc 120
gaggccctgt ccacgctggt ggtcaacaag atccgcggca ccttcaagtc cgtcgccgtc 180
aaggctccgg gcttcggtga ccgccgcaag gcgatgctgc aggacatggc catcctcacc 240
ggtggtcagg tcgtcagcga aagagtcggg ctgtccctgg agaccgccga cgtctcgctg 300
ctgggccagg cccgcaaggt cgtcgtcacc aaggacgaga ccaccatcgt cgagggctcg 360
ggcgattccg atgccatcgc cggccgggtg gctcagatcc gcgccgagat cgagaacagc 420
gactccgact acgaccgcga gaagctgcag gagcgcctgg ccaagctggc cggcggtgtt 480
gcggtgatca aggccggagc tgccaccgag gtggagctca aggagcgcaa gcaccgcatc 540
gaggacgccg tccgcaacgc gaaggctgcc gtcgaagagg gcatcgtcgc cggtggcggc 600
gtggctctgc tgcagtcggc tcctgcgctg gacgacctcg gcctgacggg cgacgaggcc 660
accggtgcca acatcgtccg cgtggcgctg tcggctccgc tcaagcagat cgccttcaac 720
ggcggcctgg agcccggcgt cgttgccgag aaggtgtcca acctgcccgc gggtcacggc 780
ctcaacgccg cgaccggtga gtacgaggac ctgctcaagg ccggcgtcgc cgacccggtg 840
aaggtcaccc gctcggcgct gcagaacgcg gcgtccatcg cggctctgtt cctcaccacc 900
gaggccgtcg tcgccgacaa gccggag 927
〈210〉 117
〈211〉 215
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 117
Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Ala Val Thr Gln
115 120 125
Ser Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ser
130 135 140
Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Thr Gln Ile Gly Glu Leu Ile
145 150 155 160
Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg
180 185 190
Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Ala Glu Arg
195 200 205
Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp
210 215
〈210〉 118
〈211〉 309
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 118
Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln Ala Gly Lys Pro Leu Leu
20 25 30
Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val
35 40 45
Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly
50 55 60
Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr
65 70 75 80
Gly Gly Gln Val Val Ser Glu Arg Val Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala
85 90 95
Asp Val Ser Leu Leu Gly Gln Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp
100 105 110
Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ile Ala Gly
115 120 125
Arg Val Ala Gln Ile Arg Ala Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr
130 135 140
Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val
145 150 155 160
Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg
165 170 175
Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu
180 185 190
Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Gln Ser Ala Pro
195 200 205
Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Thr Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn
210 215 220
Ile Val Arg Val Ala Leu Ser Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe Asn
225 230 235 240
Gly Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Ser Asn Leu Pro
245 250 255
Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Ala Thr Gly Glu Tyr Glu Asp Leu Leu
260 265 270
Lys Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln
275 280 285
Asn Ala Ala Ser Ile Ala Ala Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val
290 295 300
Ala Asp Lys Pro Glu
305
〈210〉 119
〈211〉 162
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 119
ctcgtacagg cgacggagat ctccgacgac gccacgtcgg tacggttggt cgccaccctg 60
ttcggcgtcg tgttgttgac gttggtgctg tccgggctca acgccaccct catccagggc 120
gcaccagaag acagctggcg caggcggatt ccgtcgatct tc 162
〈210〉 120
〈211〉 1366
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (955)...(955)
〈221〉 unsure
〈222〉 (973)...(973)
〈400〉 120
gatgagcagc gtgctgaact cgacctggtt ggcctgggcc gtcgcggtcg cggtcgggtt 60
cccggtgctg ctggtcgtgc tgaccgaggt gcacaacgcg ttgcgtcggc gcggcagcgc 120
gctggcccgc ccggtgcaac tcctgcgtac ctacatcctg ccgctgggcg cgttgctgct 180
cctgctggta caggcgatgg agatctccga cgacgccacg tcggtacggt tggtcgccac 240
cctgttcggc gtcgtgttgt tgacgttggt gctgtccggg ctcaacgcca ccctcatcca 300
gggcgcacca gaagacagct ggcgcaggcg gattccgtcg atcttcctcg acgtcgcgcg 360
cttcgcgctg atcgcggtcg gtatcaccgt gatcatggcc tatgtctggg gcgcgaacgt 420
ggggggcctg ttcaccgcac tgggcgtcac ttccatcgtt cttggcctgg ctctgcagaa 480
ttcggtcggt cagatcatct cgggtctgct gctgctgttc gagcaaccgt tccggctcgg 540
cgactggatc accgtcccca ccgcggcggg ccggccgtcc gcccacggcc gcgtggtgga 600
agtcaactgg cgtgcaacac atatcgacac cggcggcaac ctgctggtaa tgcccaacgc 660
cgaactcgcc ggcgcgtcgt tcaccaatta cagccggccc gtgggagagc accggctgac 720
cgtcgtcacc accttcaacg ccgcggacac ccccgatgat gtctgcgaga tgctgtcgtc 780
ggtcgcggcg tcgctgcccg aactgcgcac cgacggacag atcgccacgc tctatctcgg 840
tgcggccgaa tacgagaagt cgatcccgtt gcacacaccc gcggtggacg actcggtcag 900
gagcacgtac ctgcgatggg tctggtacgc cgcgcgccgg caggaacttc gcctnaacgg 960
cgtcgccgac ganttcgaca cgccggaacg gatcgcctcg gccatgcggg ctgtggcgtc 1020
cacactgcgc ttggcagacg acgaacagca ggagatcgcc gacgtggtgc gtctggtccg 1080
ttacggcaac ggggaacgcc tccagcagcc gggtcaggta ccgaccggga tgaggttcat 1140
cgtagacggc agggtgagtc tgtccgtgat cgatcaggac ggcgacgtga tcccggcgcg 1200
ggtgctcgag cgtggcgact tcctggggca gaccacgctg acgcgggaac cggtactggc 1260
gaccgcgcac gcgctggagg aagtcaccgt gctggagatg gcccgtgacg agatcgagcg 1320
cctggtgcac cgaaagccga tcctgctgca cgtgatcggg gccgtg 1366
〈210〉 121
〈211〉 455
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (318)...(318)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (324)...(324)
〈400〉 121
Met Ser Ser Val Leu Asn Ser Thr Trp Leu Ala Trp Ala Val Ala Val
1 5 10 15
Ala Val Gly Phe Pro Val Leu Leu Val Val Leu Thr Glu Val His Asn
20 25 30
Ala Leu Arg Arg Arg Gly Ser Ala Leu Ala Arg Pro Val Gln Leu Leu
35 40 45
Arg Thr Tyr Ile Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gln
50 55 60
Ala Met Glu Ile Ser Asp Asp Ala Thr Ser Val Arg Leu Val Ala Thr
65 70 75 80
Leu Phe Gly Val Val Leu Leu Thr Leu Val Leu Ser Gly Leu Asn Ala
85 90 95
Thr Leu Ile Gln Gly Ala Pro Glu Asp Ser Trp Arg Arg Arg Ile Pro
100 105 110
Ser Ile Phe Leu Asp Val Ala Arg Phe Ala Leu Ile Ala Val Gly Ile
115 120 125
Thr Val Ile Met Ala Tyr Val Trp Gly Ala Asn Val Gly Gly Leu Phe
130 135 140
Thr Ala Leu Gly Val Thr Ser Ile Val Leu Gly Leu Ala Leu Gln Asn
145 150 155 160
Ser Val Gly Gln Ile Ile Ser Gly Leu Leu Leu Leu Phe Glu Gln Pro
165 170 175
Phe Arg Leu Gly Asp Trp Ile Thr Val Pro Thr Ala Ala Gly Arg Pro
180 185 190
Ser Ala His Gly Arg Val Val Glu Val Asn Trp Arg Ala Thr His Ile
195 200 205
Asp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Val Met Pro Asn Ala Glu Leu Ala Gly
210 215 220
Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Ser Arg Pro Val Gly Glu His Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Val Thr Thr Phe Asn Ala Ala Asp Thr Pro Asp Asp Val Cys Glu
245 250 255
Met Leu Ser Ser Val Ala Ala Ser Leu Pro Glu Leu Arg Thr Asp Gly
260 265 270
Gln Ile Ala Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Ile
275 280 285
Pro Leu His Thr Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Arg Ser Thr Tyr Leu
290 295 300
Arg Trp Val Trp Tyr Ala Ala Arg Arg Gln Glu Leu Arg Xaa Asn Gly
305 310 315 320
Val Ala Asp Xaa Phe Asp Thr Pro Glu Arg Ile Ala Ser Ala Met Arg
325 330 335
Ala Val Ala Ser Thr Leu Arg Leu Ala Asp Asp Glu Gln Gln Glu Ile
340 345 350
Ala Asp Val Val Arg Leu Val Arg Tyr Gly Asn Gly Glu Arg Leu Gln
355 360 365
Gln Pro Gly Gln Val Pro Thr Gly Met Arg Phe Ile Val Asp Gly Arg
370 375 380
Val Ser Leu Ser Val Ile Asp Gln Asp Gly Asp Val Ile Pro Ala Arg
385 390 395 400
Val Leu Glu Arg Gly Asp Phe Leu Gly Gln Thr Thr Leu Thr Arg Glu
405 410 415
Pro Val Leu Ala Thr Ala His Ala Leu Glu Glu Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Met Ala Arg Asp Glu Ile Glu Arg Leu Val His Arg Lys Pro Ile Leu
435 440 445
Leu His Val Ile Gly Ala Val
450 455
〈210〉 122
〈211〉 898
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 122
atgacaattc tgccctggaa tgcgcgaacg tctgaacacc cgacgcgaaa aagacgcggg 60
cgctaccacc tcctgtcgcg gatgagcatc cagtccaagt tgctgctgat gctgcttctg 120
accagcattc tctcggctgc ggtggtcggt ttcatcggct atcagtccgg acggtcctcg 180
ctgcgcgcat cggtgttcga ccgcctcacc gacatccgcg agtcgcagtc gcgcgggttg 240
gagaatcagt tcgcggacct gaagaactcg atggtgattt actcgcgcgg cagcactgcc 300
acggaggcga tcggcgcgtt cagcgacggt ttccgtcagc tcggcgatgc gacgatcaat 360
accgggcagg cggcgtcatt gcgccgttac tacgaccgga cgttcgccaa caccaccctc 420
gacgacagcg gaaaccgcgt cgacgtccgc gcgctcatcc cgaaatccaa cccccagcgc 480
tatctgcagg cgctctatac cccgccgttt cagaactggg agaaggcgat cgcgttcgac 540
gacgcgcgcg acggcagcgc ctggtcggcc gccaatgcca gattcaacga gttcttccgc 600
gagatcgtgc accgcttcaa cttcgaggat ctgatgctgc tcgacctcga gggcaacgtg 660
gtgtactccg cctacaaggg gccggatctc gggacaaaca tcgtcaacgg cccctatcgc 720
aaccgggaac tgtcggaagc ctacgagaag gcggtcgcgt cgaactcgat cgactatgtc 780
ggtgtcaccg acttcgggtg gtacctgcct gccgaggaac cgaccgcctg gttcctgtcc 840
ccggtcgggt tgaaggaccg agtcgacggt gtgatggcgg tccagttccc cggaattc 898
〈210〉 123
〈211〉 1259
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 123
cgcaattgat gacggcgcgg ggacagtggc gtgacaccgg gatgggagac accggtgaga 60
ccatcctggt cggaccggac aatctgatgc gctcggactc ccggctgttc cgcgagaacc 120
gggagaagtt cctggccgac gtcgtcgagg ggggaacccc gccggaggtc gccgacgaat 180
cggttgaccg ccgcggcacc acgctggtgc agccggtgac cacccgctcc gtcgaggagg 240
cccaacgcgg caacaccggg acgacgatcg aggacgacta tctcggccac gaggcgttac 300
aggcgtactc accggtggac ctgccgggac tgcactgggt gatcgtggcc aagatcgaca 360
ccgacgaggc gttcgccccg gtggcgcagt tcaccaggac cctggtgctg tcgacggtga 420
tcatcatctt cggcgtgtcg ctggcggcca tgctgctggc gcggttgttc gtccgtccga 480
tccggcggtt gcaggccggc gcccagcaga tcagcggcgg tgactaccgc ctcgctctgc 540
cggtgttgtc tcgtgacgaa ttcggcgatc tgacaacagc tttcaacgac atgagtcgca 600
atctgtcgat caaggacgag ctgctcggcg aggagcgcgc cgagaaccaa cggctgatgc 660
tgtccctgat gcccgaaccg gtgatgcagc gctacctcga cggggaggag acgatcgccc 720
aggaccacaa gaacgtcacg gtgatcttcg ccgacatgat gggcctcgac gagttgtcgc 780
gcatgttgac ctccgaggaa ctgatggtgg tggtcaacga cctgacccgc cagttcgacg 840
ccgccgccga gagtctcggg gtcgaccacg tgcggacgct gcacgacggg tacctggcca 900
gctgcgggtt aggcgtgccg cggctggaca acgtccggcg cacggtcaat ttcgcgatcg 960
aaatggaccg catcatcgac cggcacgccg ccgagtccgg gcacgacctg cggctccgcg 1020
cgggcatcga caccgggtcg gcggccagcg ggctggtggg gcggtccacg ttggcgtacg 1080
acatgtgggg ttcggcggtc gatgtcgcct accaggtgca gcgcggctcc ccccagcccg 1140
gcatctacgt cacctcgcgg gtgcacgagg tcatgcagga aactctcgac ttcgtcgccg 1200
ccggggaggt cgtcggcgag cgcggcgtcg agacggtctg gcggttgcag ggccacccg 1259
〈210〉 124
〈211〉 299
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 124
Met Thr Ile Leu Pro Trp Asn Ala Arg Thr Ser Glu His Pro Thr Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Gly Arg Tyr His Leu Leu Ser Arg Met Ser Ile Gln Ser
20 25 30
Lys Leu Leu Leu Met Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Ser Ala Ala Val
35 40 45
Val Gly Phe Ile Gly Tyr Gln Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Ala Ser
50 55 60
Val Phe Asp Arg Leu Thr Asp Ile Arg Glu Ser Gln Ser Arg Gly Leu
65 70 75 80
Glu Asn Gln Phe Ala Asp Leu Lys Asn Ser Met Val Ile Tyr Ser Arg
85 90 95
Gly Ser Thr Ala Thr Glu Ala Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Phe Arg
100 105 110
Gln Leu Gly Asp Ala Thr Ile Asn Thr Gly Gln Ala Ala Ser Leu Arg
115 120 125
Arg Tyr Tyr Asp Arg Thr Phe Ala Asn Thr Thr Leu Asp Asp Ser Gly
130 135 140
Asn Arg Val Asp Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg
145 150 155 160
Tyr Leu Gln Ala Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala
165 170 175
Ile Ala Phe Asp Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn
180 185 190
Ala Arg Phe Asn Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe
195 200 205
Glu Asp Leu Met Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala
210 215 220
Tyr Lys Gly Pro Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg
225 230 235 240
Asn Arg Glu Leu Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser
245 250 255
Ile Asp Tyr Val Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu
260 265 270
Glu Pro Thr Ala Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val
275 280 285
Asp Gly Val Met Ala Val Gln Phe Pro Gly Ile
290 295
〈210〉 125
〈211〉 419
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 125
Gln Leu Met Thr Ala Arg Gly Gln Trp Arg Asp Thr Gly Met Gly Asp
1 5 10 15
Thr Gly Glu Thr Ile Leu Val Gly Pro Asp Asn Leu Met Arg Ser Asp
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Arg Glu Asn Arg Glu Lys Phe Leu Ala Asp Val Val
35 40 45
Glu Gly Gly Thr Pro Pro Glu Val Ala Asp Glu Ser Val Asp Arg Arg
50 55 60
Gly Thr Thr Leu Val Gln Pro Val Thr Thr Arg Ser Val Glu Glu Ala
65 70 75 80
Gln Arg Gly Asn Thr Gly Thr Thr Ile Glu Asp Asp Tyr Leu Gly His
85 90 95
Glu Ala Leu Gln Ala Tyr Ser Pro Val Asp Leu Pro Gly Leu His Trp
100 105 110
Val Ile Val Ala Lys Ile Asp Thr Asp Glu Ala Phe Ala Pro Val Ala
115 120 125
Gln Phe Thr Arg Thr Leu Val Leu Ser Thr Val Ile Ile Ile Phe Gly
130 135 140
Val Ser Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Arg Leu Phe Val Arg Pro Ile
145 150 155 160
Arg Arg Leu Gln Ala Gly Ala Gln Gln Ile Ser Gly Gly Asp Tyr Arg
165 170 175
Leu Ala Leu Pro Val Leu Ser Arg Asp Glu Phe Gly Asp Leu Thr Thr
180 185 190
Ala Phe Asn Asp Met Ser Arg Asn Leu Ser Ile Lys Asp Glu Leu Leu
195 200 205
Gly Glu Glu Arg Ala Glu Asn Gln Arg Leu Met Leu Ser Leu Met Pro
210 215 220
Glu Pro Val Met Gln Arg Tyr Leu Asp Gly Glu Glu Thr Ile Ala Gln
225 230 235 240
Asp His Lys Asn Val Thr Val Ile Phe Ala Asp Met Met Gly Leu Asp
245 250 255
Glu Leu Ser Arg Met Leu Thr Ser Glu Glu Leu Met Val Val Val Asn
260 265 270
Asp Leu Thr Arg Gln Phe Asp Ala Ala Ala Glu Ser Leu Gly Val Asp
275 280 285
His Val Arg Thr Leu His Asp Gly Tyr Leu Ala Ser Cys Gly Leu Gly
290 295 300
Val Pro Arg Leu Asp Asn Val Arg Arg Thr Val Asn Phe Ala Ile Glu
305 310 315 320
Met Asp Arg Ile Ile Asp Arg His Ala Ala Glu Ser Gly His Asp Leu
325 330 335
Arg Leu Arg Ala Gly Ile Asp Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Leu Val
340 345 350
Gly Arg Ser Thr Leu Ala Tyr Asp Met Trp Gly Ser Ala Val Asp Val
355 360 365
Ala Tyr Gln Val Gln Arg Gly Ser Pro Gln Pro Gly Ile Tyr Val Thr
370 375 380
Ser Arg Val His Glu Val Met Gln Glu Thr Leu Asp Phe Val Ala Ala
385 390 395 400
Gly Glu Val Val Gly Glu Arg Gly Val Glu Thr Val Trp Arg Leu Gln
405 410 415
Gly His Pro
〈210〉 126
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 126
ccggatccga tgagcagcgt gctgaac 27
〈210〉 127
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 127
gcggatccca cggccccgat cacgtg 26
〈210〉 128
〈211〉 33
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 128
ccggatccaa tgacatttct gccctggaat gcg 33
〈210〉 129
〈211〉 32
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 129
ccggatccat tcggtggccc tgcaaccgcc ag 32
〈210〉 130
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 130
ccggatccgg agcaaccgtt ccggctc 27
〈210〉 131
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 131
ccggatcccg gctatcagtc cggacgg 27
〈210〉 132
〈211〉 844
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 132
gagcaaccgt tccggctcgg cgactggatc accgtcccca ccgcggcggg ccggccgtcc 60
gcccacggcc gcgtggtgga agtcaactgg cgtgcaacac atatcgacac cggcggcaac 120
ctgctggtaa tgcccaacgc cgaactcgcc ggcgcgtcgt tcaccaatta cagccggccc 180
gtgggagagc accggctgac cgtcgtcacc accttcaacg ccgcggacac ccccgatgat 240
gtctgcgaga tgctgtcgtc ggtcgcggcg tcgctgcccg aactgcgcac cgacggacag 300
atcgccacgc tctatctcgg tgcggccgaa tacgagaagt cgatcccgtt gcacacaccc 360
gcggtggacg actcggtcag gagcacgtac ctgcgatggg tctggtacgc cgcgcgccgg 420
caggaacttc gcctaacggc gtcgccgacg attcgacacg ccggaacgga tcgcctcggc 480
catgcgggct gtggcgtcca cactgcgctt ggcagacgac gaacagcagg agatcgccga 540
cgtggtgcgt ctggtccgtt acggcaacgg ggaacgcctc cagcagccgg gtcaggtacc 600
gaccgggatg aggttcatcg tagacggcag ggtgagtctg tccgtgatcg atcaggacgg 660
cgacgtgatc ccggcgcggg tgctcgagcg tggcgacttc ctggggcaga ccacgctgac 720
gcgggaaccg gtactggcga ccgcgcacgc gctggaggaa gtcaccgtgc tggagatggc 780
ccgtgacgag atcgagcgcc tggtgcaccg aaagccgatc ctgctgcacg tgatcggggc 840
cgtg 844
〈210〉 133
〈211〉 742
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 133
ggctatcagt ccggacggtc ctcgctgcgc gcatcggtgt tcgaccgcct caccgacatc 60
cgcgagtcgc agtcgcgcgg gttggagaat cagttcgcgg acctgaagaa ctcgatggtg 120
atttactcgc gcggcagcac tgccacggag gcgatcggcg cgttcagcga cggtttccgt 180
cagctcggcg atgcgacgat caataccggg caggcggcgt cattgcgccg ttactacgac 240
cggacgttcg ccaacaccac cctcgacgac agcggaaacc gcgtcgacgt ccgcgcgctc 300
atcccgaaat ccaaccccca gcgctatctg caggcgctct ataccccgcc gtttcagaac 360
tgggagaagg cgatcgcgtt cgacgacgcg cgcgacggca gcgcctggtc ggccgccaat 420
gccagattca acgagttctt ccgcgagatc gtgcaccgct tcaacttcga ggatctgatg 480
ctgctcgacc tcgagggcaa cgtggtgtac tccgcctaca aggggccgga tctcgggaca 540
aacatcgtca acggccccta tcgcaaccgg gaactgtcgg aagcctacga gaaggcggtc 600
gcgtcgaact cgatcgacta tgtcggtgtc accgacttcg ggtggtacct gcctgccgag 660
gaaccgaccg cctggttcct gtccccggtc gggttgaagg accgagtcga cggtgtgatg 720
gcggtccagt tccccggaat tc 742
〈210〉 134
〈211〉 282
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (145)...(145)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (151)...(151)
〈400〉 134
Glu Gln Pro Phe Arg Leu Gly Asp Trp Ile Thr Val Pro Thr Ala Ala
1 5 10 15
Gly Arg Pro Ser Ala His Gly Arg Val Val Glu Val Asn Trp Arg Ala
20 25 30
Thr His Ile Asp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Val Met Pro Asn Ala Glu
35 40 45
Leu Ala Gly Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Ser Arg Pro Val Gly Glu His
50 55 60
Arg Leu Thr Val Val Thr Thr Phe Asn Ala Ala Asp Thr Pro Asp Asp
65 70 75 80
Val Cys Glu Met Leu Ser Ser Val Ala Ala Ser Leu Pro Glu Leu Arg
85 90 95
Thr Asp Gly Gln Ile Ala Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Ala Glu Tyr Glu
100 105 110
Lys Ser Ile Pro Leu His Thr Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Arg Ser
115 120 125
Thr Tyr Leu Arg Trp Val Trp Tyr Ala Ala Arg Arg Gln Glu Leu Arg
130 135 140
Xaa Asn Gly Val Ala Asp Xaa Phe Asp Thr Pro Glu Arg Ile Ala Ser
145 150 155 160
Ala Met Arg Ala Val Ala Ser Thr Leu Arg Leu Ala Asp Asp Glu Gln
165 170 175
Gln Glu Ile Ala Asp Val Val Arg Leu Val Arg Tyr Gly Asn Gly Glu
180 185 190
Arg Leu Gln Gln Pro Gly Gln Val Pro Thr Gly Met Arg Phe Ile Val
195 200 205
Asp Gly Arg Val Ser Leu Ser Val Ile Asp Gln Asp Gly Asp Val Ile
210 215 220
Pro Ala Arg Val Leu Glu Arg Gly Asp Phe Leu Gly Gln Thr Thr Leu
225 230 235 240
Thr Arg Glu Pro Val Leu Ala Thr Ala His Ala Leu Glu Glu Val Thr
245 250 255
Val Leu Glu Met Ala Arg Asp Glu Ile Glu Arg Leu Val His Arg Lys
260 265 270
Pro Ile Leu Leu His Val Ile Gly Ala Val
275 280
〈210〉 135
〈211〉 247
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 135
Gly Tyr Gln Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Ala Ser Val Phe Asp Arg
1 5 10 15
Leu Thr Asp Ile Arg Glu Ser Gln Ser Arg Gly Leu Glu Asn Gln Phe
20 25 30
Ala Asp Leu Lys Asn Ser Met Val Ile Tyr Ser Arg Gly Ser Thr Ala
35 40 45
Thr Glu Ala Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Phe Arg Gln Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Thr Ile Asn Thr Gly Gln Ala Ala Ser Leu Arg Arg Tyr Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ala Asn Thr Thr Leu Asp Asp Ser Gly Asn Arg Val Asp
85 90 95
Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg Tyr Leu Gln Ala
100 105 110
Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala Ile Ala Phe Asp
115 120 125
Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn Ala Arg Phe Asn
130 135 140
Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe Glu Asp Leu Met
145 150 155 160
Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala Tyr Lys Gly Pro
165 170 175
Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg Asn Arg Glu Leu
180 185 190
Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser Ile Asp Tyr Val
195 200 205
Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu Glu Pro Thr Ala
210 215 220
Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val Asp Gly Val Met
225 230 235 240
Ala Val Gln Phe Pro Gly Ile
245
〈210〉 136
〈211〉 45
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (18)...(18)
〈400〉 136
atgagcgaaa tcgcccgncc ctggcgggtt ctggcatgtg gcatc 45
〈210〉 137
〈211〉 340
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (273)...(273)
〈221〉 unsure
〈222〉 (286)...(286)
〈400〉 137
gccaccggcg gcgccgccgc ggtgcccgcc ggggtgagcg ccccggcggt cgcgccggcc 60
cccgcgatgc ccgcccgccc ggtgtccacg atcgcgccgg cgacctcggg cacgctcagc 120
gagtttttcg ccgccaaggg cgtcacgatg gagccgcagt ccagccgcga cttccgcgcc 180
ctcaacatcg tgctgccgaa gccgcggggc tgggagcaca tcccggaccc gaacgtgccg 240
gacgcgttcg cggtgctggc cgaccgggtc agnggtaaag gtcagnagtc gacaaacgcc 300
cacgtggtgg tcgacaaaca cgtaggcgag ttcgacggca 340
〈210〉 138
〈211〉 235
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (16)...(16)
〈400〉 138
ggtgaccacc agcgtngaac aggtcgttgc cgaagccgcg gaggccaccg acgcgattgt 60
caacggcttc aaggtcagcg ttccgggtcc gggtccggcc gcaccgccac ctgcacccgg 120
tgcccccggt gtcccgcccg cccccggcgc cccggcgctg ccgctggccg tcgcaccacc 180
cccggctccc gctgttcccg ccgtggcgcc cgcgccacag ctgctgggac tgcag 235
〈210〉 139
〈211〉 15
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 139
Met Ser Glu Ile Ala Arg Pro Trp Arg Val Leu Ala Cys Gly Ile
1 5 10 15
〈210〉 140
〈211〉 113
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (96)...(96)
〈400〉 140
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Gly Val Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Val Ala Pro Ala Pro Ala Met Pro Ala Arg Pro Val Ser Thr Ile Ala
20 25 30
Pro Ala Thr Ser Gly Thr Leu Ser Glu Phe Phe Ala Ala Lys Gly Val
35 40 45
Thr Met Glu Pro Gln Ser Ser Arg Asp Phe Arg Ala Leu Asn Ile Val
50 55 60
Leu Pro Lys Pro Arg Gly Trp Glu His Ile Pro Asp Pro Asn Val Pro
65 70 75 80
Asp Ala Phe Ala Val Leu Ala Asp Arg Val Gly Gly Lys Gly Gln Xaa
85 90 95
Ser Thr Asn Ala His Val Val Val Asp Lys His Val Gly Glu Phe Asp
100 105 110
Gly
〈210〉 141
〈211〉 73
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 141
Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Val Val Ala Ala Ala Asp Ala Thr Glu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asn Gly Phe Lys Val Ser Val Pro Gly Pro Gly Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Pro Ala Pro Gly
35 40 45
Ala Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Val
50 55 60
Pro Ala Val Ala Pro Ala Pro Gln Leu
65 70
〈210〉 142
〈211〉 273
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 142
gcgacctacg tgcagggggg tctcggccgc atcgaggccc gggtggccga cagcggatac 60
agcaacgccg cggccaaggg ctacttcccg ctgagcttca ccgtcgccgg catcgaccag 120
aacggtccga tcgtgaccgc caacgtcacc gcggcggccc cgacgggcgc cgtggccacc 180
cagccgctga cgttcatcgc cgggccgagc ccgaccggat ggcagctgtc caagcagtcc 240
gcactggccc tgatgtccgc ggtcatcgcc gca 273
〈210〉 143
〈211〉 91
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 143
Ala Thr Tyr Val Gln Gly Gly Leu Gly Arg Ile Glu Ala Arg Val Ala
1 5 10 15
Asp Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Lys Gly Tyr Phe Pro Leu Ser
20 25 30
Phe Thr Val Ala Gly Ile Asp Gln Asn Gly Pro Ile Val Thr Ala Asn
35 40 45
Val Thr Ala Ala Ala Pro Thr Gly Ala Val Ala Thr Gln Pro Leu Thr
50 55 60
Phe Ile Ala Gly Pro Ser Pro Thr Gly Trp Gln Leu Ser Lys Gln Ser
65 70 75 80
Ala Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Ile Ala Ala
85 90
〈210〉 144
〈211〉 554
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 144
gatgtcacgc ccggagaatg taacgttcga ccggagaacg ccgtcggcac aacgagttac 60
gtttgagcac ttcagatctc ggttaccttg gatttcaggc gggggaagca gtaaccgatc 120
caagattcga aggacccaaa caacatgaaa ttcactggaa tgaccgtgcg cgcaagccgc 180
gcgccctggc cggcgtcggg gcggcatgtc tgttcggcgg cgtggccgcg gcaaccgtgg 240
cggcacagat ggcgggcgcc cagccggccg agtgcaacgc cagctcactc accggcaccg 300
tcagctcggt gaccggtcag gcgcgtcagt acctagacac ccacccgggc gccaaccagg 360
ccgtcaccgc ggcgatgaac cagccgcggc ccgaggccga ggcgaacctg cggggctact 420
tcaccgccaa cccggcggag tactacgacc tgcggggcat cctcgccccg atcggtgacg 480
cgcagcgcaa ctgcaacatc accgtgctgc cggtagagct gcagacggcc tacgacacgt 540
tcatggccgg ctga 554
〈210〉 145
〈211〉 136
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 145
Met Lys Phe Thr Gly Met Thr Val Arg Ala Ser Arg Arg Ala Leu Ala
1 5 10 15
Gly Val Gly Ala Ala Cys Leu Phe Gly Gly Val Ala Ala Ala Thr Val
20 25 30
Ala Ala Gln Met Ala Gly Ala Gln Pro Ala Glu Cys Asn Ala Ser Ser
35 40 45
Leu Thr Gly Thr Val Ser Ser Val Thr Gly Gln Ala Arg Gln Tyr Leu
50 55 60
Asp Thr His Pro Gly Ala Asn Gln Ala Val Thr Ala Ala Met Asn Gln
65 70 75 80
Pro Arg Pro Glu Ala Glu Ala Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Thr Ala Asn
85 90 95
Pro Ala Glu Tyr Tyr Asp Leu Arg Gly Ile Leu Ala Pro Ile Gly Asp
100 105 110
Ala Gln Arg Asn Cys Asn Ile Thr Val Leu Pro Val Glu Leu Gln Thr
115 120 125
Ala Tyr Asp Thr Phe Met Ala Gly
130 135
〈210〉 146
〈211〉 808
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (15)...(15)
〈400〉 146
ccaagtgtga cgcgngtgtg acggtagacg ttccgaccaa tccaacgacg ccgcagctgg 60
gaatcacccg tgtgccaatt cagtgcgggc aacggtgtcc gtccacgaag ggattcagga 120
aatgatgaca actcgccgga agtcagccgc agtggcggga atcgctgcgg tggccatcct 180
cggtgcggcc gcatgttcga gtgaggacgg tgggagcacg gcctcgtcgg ccagcagcac 240
ggcctcctcc gcgatggagt ccgcgaccga cgagatgacc acgtcgtcgg cggccccttc 300
ggccgaccct gcggccaacc tgatcggctc cggctgcgcg gcctacgccg agcaggtccc 360
cgaaggtccc gggtcggtgg ccgggatggc agccgatccg gtgacggtgg cggcgtcgaa 420
caacccgatg ctgcagacgc tgtcccaggc gctgtccggc cagctcaatc cgcaggtcaa 480
tctcgtcgac accctcgacg gcggtgagtt caccgtgttc gcgccgaccg acgacgcgtt 540
cgccaagatc gatccggcca cgctggagac cctcaagacg gactccgaca tgctgaccaa 600
catcctgacc taccacgtcg tgcccggcca ggccgcgccc gatcaggtgg tcggcgagca 660
tgtgacggtg gagggggcgc cggtcacggt gtccgggatg gccgaccagc tcaaggtcaa 720
cgacgcgtcg gtggtgtgcg gtggggtgca gaccgccaac gcgacggtgt atctgatcga 780
caccgtgctg atgccgccgg cagcgtag 808
〈210〉 147
〈211〉 228
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 147
Met Met Thr Thr Arg Arg Lys Ser Ala Ala Val Ala Gly Ile Ala Ala
1 5 10 15
Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Cys Ser Ser Glu Asp Gly Gly Ser
20 25 30
Thr Ala Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ala Ser Ser Ala Met Glu Ser Ala
35 40 45
Thr Asp Glu Met Thr Thr Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ala Asp Pro Ala
50 55 60
Ala Asn Leu Ile Gly Ser Gly Cys Ala Ala Tyr Ala Glu Gln Val Pro
65 70 75 80
Glu Gly Pro Gly Ser Val Ala Gly Met Ala Ala Asp Pro Val Thr Val
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Asn Pro Met Leu Gln Thr Leu Ser Gln Ala Leu Ser
100 105 110
Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp Thr Leu Asp Gly Gly
115 120 125
Glu Phe Thr Val Phe Ala Pro Thr Asp Asp Ala Phe Ala Lys Ile Asp
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Glu Thr Leu Lys Thr Asp Ser Asp Met Leu Thr Asn
145 150 155 160
Ile Leu Thr Tyr His Val Val Pro Gly Gln Ala Ala Pro Asp Gln Val
165 170 175
Val Gly Glu His Val Thr Val Glu Gly Ala Pro Val Thr Val Ser Gly
180 185 190
Met Ala Asp Gln Leu Lys Val Asn Asp Ala Ser Val Val Cys Gly Gly
195 200 205
Val Gln Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Leu Ile Asp Thr Val Leu Met
210 215 220
Pro Pro Ala Ala
225
〈210〉 148
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈221〉 unsure
〈222〉 (12)...(12)
〈221〉 unsure
〈222〉 (17)...(17)
〈400〉 148
gcsccsgtsg gnccggntgy gc 22
〈210〉 149
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈221〉 unsure
〈222〉 (10)...(10)
〈221〉 unsure
〈222〉 (13)...(13)
〈221〉 unsure
〈222〉 (16)...(16)
〈221〉 unsure
〈222〉 (20)...(20)
〈400〉 149
rtasgcsgcn gtngcnacng g 21
〈210〉 150
〈211〉 102
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 150
gcccccgtcg gccccggctg tgcggcctac gtgcaacagg tgccggacgg gccgggatcg 60
gtgcagggca tggcgagctc gcccgtagcg accgccgcgt at 102
〈210〉 151
〈211〉 683
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 151
gcccgccaac taaaaccgcc gatcatccac tgcaggaagg aatctcacga tcatgaacat 60
cagcatgaaa actcttgccg gagcgggttt cgcgatgacc gccgccgtcg gtctgtcgct 120
gggtaccgca ggcagcgccg cagccgcgcc ggtcggaccg gggtgtgcgg cctacgtgca 180
acaggtgccg gacgggccgg gatcggtgca gggcatggcg agctcgccgg tggccaccgc 240
ggcggccgac aacccgctgc tcaccacgct ctcgcaggcg atctcgggtc agctcaaccc 300
gaacgtcaat ctcgtcgaca cgttcaacgg cggccagttc accgtgttcg cgccgaccaa 360
tgacgccttc gccaagatcg atccggccac gctggagacc ctcaagaccg attccgacct 420
gctgaccaag atcctcacct accacgtcgt gcccggccag gccgcgcccg atcaggtggt 480
cggcgagcat gtgacggtgg agggggcgcc ggtcacggtg tccgggatgg ccgaccagct 540
caaggtcaac gacgcgtcgg tggtgtgcgg tggggtgcag accgccaacg cgacggtgta 600
tctgatcgac accgtgctga tgccgccggc agcgtagccg ggcggcacca cagaagaggg 660
tcccccgcac ccggcctccc ccg 683
〈210〉 152
〈211〉 231
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 152
Asp Thr Val Leu Met Pro Pro Ala Asn Asn Arg Arg Ser Ser Thr Ala
1 5 10 15
Gly Arg Asn Leu Thr Ile Met Asn Ile Ser Met Lys Thr Leu Ala Gly
20 25 30
Ala Gly Phe Ala Met Thr Ala Ala Val Gly Leu Ser Leu Gly Thr Ala
35 40 45
Gly Ser Ala Ala Ala Ala Pro Val Gly Pro Gly Cys Ala Ala Tyr Val
50 55 60
Gln Gln Val Pro Asp Gly Pro Gly Ser Val Gln Gly Met Ala Ser Ser
65 70 75 80
Pro Val Ala Thr Ala Ala Ala Asp Asn Pro Leu Leu Thr Thr Leu Ser
85 90 95
Gln Ala Ile Ser Gly Gln Leu Asn Pro Asn Val Asn Leu Val Asp Thr
100 105 110
Phe Asn Gly Gly Gln Phe Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Asp Ala Phe
115 120 125
Ala Lys Ile Asp Pro Ala Thr Leu Glu Thr Leu Lys Thr Asp Ser Asp
130 135 140
Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Tyr His Val Val Pro Gly Gln Ala Ala
145 150 155 160
Pro Asp Gln Val Val Gly Glu His Val Thr Val Glu Gly Ala Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Gly Met Ala Asp Gln Leu Lys Val Asn Asp Ala Ser Val
180 185 190
Val Cys Gly Gly Val Gln Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Leu Ile Asp
195 200 205
Thr Val Leu Met Pro Pro Ala Ala Pro Gly Gly Thr Thr Glu Glu Gly
210 215 220
Pro Pro His Pro Ala Ser Pro
225 230
〈210〉 153
〈211〉 1125
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (358)...(358)
〈400〉 153
atgcaggtgc ggcgtgttct gggcagtgtc ggtgcagcag tcgcggtttc ggccgcgtta 60
tggcagacgg gggtttcgat accgaccgcc tcagcggatc cgtgtccgga catcgaggtg 120
atcttcgcgc gcgggaccgg tgcggaaccc ggcctcgggt gggtcggtga tgcgttcgtc 180
aacgcgctgc ggcccaaggt cggtgagcag tcggtgggca cctacgcggt gaactacccg 240
gcaggattcg gacttcgaca aatcggcgcc catgggcgcg gccgacgcat cggggcgggt 300
gcagtggatg gccgacaact gcccggacac caagcttgtc ctgggcggca tgtcgcangg 360
cgccggcgtc atcgacctga tcaccgtcga tccgcgaccg ctgggccggt tcacccccac 420
cccgatgccg ccccgcgtcg ccgaccacgt ggccgccgtt gtggtcttcg gaaatccgtt 480
gcgcgacatc cgtggtggcg gtccgctgcc gcagatgagc ggcacctacg ggccgaagtc 540
gatcgatctg tgtgcgctcg acgatccgtt ctgctcgccc ggcttcaacc tgccggccca 600
cttcgcctac gccgacaacg gcatggtgga ggaagccgcg aacttcgccc gcctggaacc 660
gggccagagc gtcgagctgc ccgaggcgcc ctacctgcac ctgttcgtcc cgcggggcga 720
ggtaacgctg gaggacgccg gaccgctgcg cgaaggcgac gcagtgcgtt tcaccgcatc 780
gggcggccag cgggtgaccg ccaccgcgcc cgcggagatc ctcgtctggg agatgcatgc 840
gggactcggt gcggcataag cgaataggag tcctgctggc cggcgcagca ctgctcgccg 900
gatgcacatc cgaacctgga cccgggccgt cggcggcacc ggccccgacg agcacaaccg 960
agagcgcacc cggtcccgga ctcgtcccgg tgaccgtcgc ggtcgacgaa cctctggccg 1020
acgcgccgtt cgaccagccc cgggaggccc tggtgccgca gggttggacg ctgtcggtgt 1080
gggcgcggac cgcccggccg cggctggccg cgtgggcccc ggacg 1125
〈210〉 154
〈211〉 748
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (119)...(119)
〈400〉 154
Met Gln Val Arg Arg Val Leu Gly Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Ala Leu Trp Gln Thr Gly Val Ser Ile Pro Thr Ala Ser Ala
20 25 30
Asp Pro Cys Pro Asp Ile Glu Val Ile Phe Ala Arg Gly Thr Gly Ala
35 40 45
Glu Pro Gly Leu Gly Trp Val Gly Asp Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg
50 55 60
Pro Lys Val Gly Glu Gln Ser Val Gly Thr Tyr Ala Val Asn Tyr Pro
65 70 75 80
Ala Gly Phe Asp Phe Asp Lys Ser Ala Pro Met Gly Ala Ala Asp Ala
85 90 95
Ser Gly Arg Val Gln Trp Met Ala Asp Asn Cys Pro Asp Thr Lys Leu
100 105 110
Val Leu Gly Gly Met Ser Xaa Gly Ala Gly Val Ile Asp Leu Ile Thr
115 120 125
Val Asp Pro Arg Pro Leu Gly Arg Phe Thr Pro Thr Pro Met Pro Pro
130 135 140
Arg Val Ala Asp His Val Ala Ala Val Val Val Phe Gly Asn Pro Leu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Arg Gly Gly Gly Pro Arg Leu Glu Pro Arg Gly Leu Asn
165 170 175
Met Glu Thr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr Tyr Arg Gly
180 185 190
Leu Tyr Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ala Ser Pro
195 200 205
Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Glu Ala Ser Pro Ala Ser Pro
210 215 220
Pro Arg Pro His Glu Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Pro His Glu Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala His Ile Ser
245 250 255
Pro His Glu Ala Leu Ala Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala
260 265 270
Ser Asn Gly Leu Tyr Met Glu Thr Val Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala
275 280 285
Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Asn Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Arg
290 295 300
Gly Leu Glu Gly Leu Pro Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Ser Glu Arg
305 310 315 320
Val Ala Leu Gly Leu Leu Glu Pro Arg Gly Leu Ala Leu Ala Pro Arg
325 330 335
Thr Tyr Arg Leu Glu His Ile Ser Leu Glu Pro His Glu Val Ala Leu
340 345 350
Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg
355 360 365
Leu Glu Gly Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Arg Leu
370 375 380
Glu Ala Arg Gly Gly Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val
385 390 395 400
Ala Leu Ala Arg Gly Pro His Glu Thr His Arg Ala Leu Ala Ser Glu
405 410 415
Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Ala Arg Gly Val Ala Leu
420 425 430
Thr His Arg Ala Leu Ala Thr His Arg Ala Leu Ala Pro Arg Ala Leu
435 440 445
Ala Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu Val Ala Leu Thr Arg Pro Gly Leu
450 455 460
Met Glu Thr His Ile Ser Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Arg Gly
485 490 495
Ser Glu Arg Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Arg
500 505 510
Gly Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Ala Arg Gly
515 520 525
Met Glu Thr His Ile Ser Ile Leu Glu Ala Arg Gly Thr His Arg Thr
530 535 540
Arg Pro Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu
545 550 555 560
Tyr Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ser Pro Gly
565 570 575
Leu His Ile Ser Ala Ser Asn Ala Arg Gly Gly Leu Ala Arg Gly Thr
580 585 590
His Arg Ala Arg Gly Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Ala Arg
595 600 605
Gly Pro Arg Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ala Arg Gly Ala Arg Gly Gly
610 615 620
Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Gly Thr His Arg Ser Glu Arg Gly Leu
625 630 635 640
Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Arg Gly
645 650 655
Pro Arg Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg Gly
660 665 670
Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser Pro
675 680 685
Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala
690 695 700
Leu Ala Ala Ser Pro Ala Arg Gly Pro Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala
705 710 715 720
Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Val Ala Leu Gly Leu Tyr Pro
725 730 735
Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Pro Arg Gly Leu Tyr
740 745
〈210〉 155
〈211〉 666
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 155
atgaaggcaa atcattcggg atgctacaaa tccgccggcc cgatatggtc gcatccatcg 60
ccgctttgtt cgcccgcact ggcaccatct catgcaggtc tggacaatga gctgagcctg 120
ggcatccacg gccagggccc ggaacgactg accattcagc agtgggacac cttcctcaac 180
ggcgtcttcc cgttggaccg caaccggttg acccgggagt ggttccactc gggcaaggcg 240
acctacgtcg tggccggtga aggtgccgac gagttcgagg gcacgctgga gctgggctac 300
caggtgggct ttccgtggtc gctgggcgtg ggcatcaact tcagctacac caccccgaac 360
atcacgtacg acggttacgg cctcaacttc gccgacccgc tgctgggctt cggtgattcc 420
atcgtgaccc cgccgctgtt cccgggtgtc tcgatcacgg cggacctggg caacggcccc 480
ggcatccagg aggtcgcgac cttctccgtg gacgtggccg gccccggtgg ttccgtggtg 540
gtgtccaacg cgcacggcac ggtcaccggt gctgccggtg gtgtgctgct gcgtccgttc 600
gcccgcctga tctcgtcgac cggcgacagc gtcaccacct acggcgcacc ctggaacatg 660
aactga 666
〈210〉 156
〈211〉 221
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 156
Met Lys Ala Asn His Ser Gly Cys Tyr Lys Ser Ala Gly Pro Ile Trp
1 5 10 15
Ser His Pro Ser Pro Leu Cys Ser Pro Ala Leu Ala Pro Ser His Ala
20 25 30
Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Gly Val His Gly Gln Gly Pro Glu
35 40 45
His Leu Thr Ile Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro
50 55 60
Leu Asp Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Lys Ala
65 70 75 80
Thr Tyr Val Val Ala Gly Glu Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu
85 90 95
Glu Leu Gly Tyr His Val Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile
100 105 110
Asn Phe Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Thr Tyr Asp Gly Tyr Gly Leu
115 120 125
Asn Phe Ala Asp Pro Leu Leu Gly Phe Gly Asp Ser Ile Val Thr Pro
130 135 140
Pro Leu Phe Pro Gly Val Ser Ile Thr Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro
145 150 155 160
Gly Ile Gln Glu Val Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Ala Gly Pro Gly
165 170 175
Gly Ser Val Val Val Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala
180 185 190
Gly Gly Val Leu Leu Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ser Ser Thr Gly
195 200 205
Asp Ser Val Thr Thr Tyr Gly Ala Pro Trp Asn Met Asn
210 215 220
〈210〉 157
〈211〉 480
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 157
aacggctggg acatcaacac ccctgcgttc gagtggttct acgagtccgg cttgtcgacg 60
atcatgccgg tcggcggaca gtccagcttc tacagcgact ggtaccagcc gtctcggggc 120
aacgggcaga actacaccta caagtgggag acgttcctga cccaggagct gccgacgtgg 180
ctggaggcca accgcggagt gtcgcgcacc ggcaacgcgt tcgtcggcct gtcgatggcg 240
ggcagcgcgg cgctgaccta cgcgatccat cacccgcagc agttcatcta cgcctcgtcg 300
ctgtcaggct tcctgaaccc gtccgagggc tggtggccga tgctgatcgg gctggcgatg 360
aacgacgcag gcggcttcaa cgccgagagc atgtggggcc cgtcctcgga cccggcgtgg 420
aagcgcaacg acccgatggt caacatcaac cagctggtgg ccaacaacac ccggatctgg 480
〈210〉 158
〈211〉 161
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 158
Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Phe Tyr Glu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Ser Thr Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
20 25 30
Asp Trp Tyr Gln Pro Ser Arg Gly Asn Gly Gln Asn Tyr Thr Tyr Lys
35 40 45
Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu Leu Pro Thr Trp Leu Glu Ala Asn
50 55 60
Arg Gly Val Ser Arg Thr Gly Asn Ala Phe Val Gly Leu Ser Met Ala
65 70 75 80
Gly Ser Ala Ala Leu Thr Tyr Ala Ile His His Pro Gln Gln Phe Ile
85 90 95
Tyr Ala Ser Ser Leu Ser Gly Phe Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp
100 105 110
Pro Met Leu Ile Gly Leu Ala Met Asn Asp Ala Gly Gly Phe Asn Ala
115 120 125
Glu Ser Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp
130 135 140
Pro Met Val Asn Ile Asn Gln Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp
145 150 155 160
Ile
〈210〉 159
〈211〉 1626
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 159
atggccaaga caattgcgta tgacgaagag gcccgccgtg gcctcgagcg gggcctcaac 60
gccctcgcag acgccgtaaa ggtgacgttg ggcccgaagg gtcgcaacgt cgtgctggag 120
aagaagtggg gcgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag 180
ctggaggacc cgtacgagaa gatcggcgct gagctggtca aagaggtcgc caagaagacc 240
gacgacgtcg cgggcgacgg caccaccacc gccaccgtgc tcgctcaggc tctggttcgc 300
gaaggcctgc gcaacgtcgc agccggcgcc aacccgctcg gcctcaagcg tggcatcgag 360
aaggctgtcg aggctgtcac ccagtcgctg ctgaagtcgg ccaaggaggt cgagaccaag 420
gagcagattt ctgccaccgc ggcgatttcc gccggcgaca cccagatcgg cgagctcatc 480
gccgaggcca tggacaaggt cggcaacgag ggtgtcatca ccgtcgagga gtcgaacacc 540
ttcggcctgc agctcgagct caccgagggt atgcgcttcg acaagggcta catctcgggt 600
tacttcgtga ccgacgccga gcgccaggaa gccgtcctgg aggatcccta catcctgctg 660
gtcagctcca aggtgtcgac cgtcaaggat ctgctcccgc tgctggagaa ggtcatccag 720
gccggcaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggccct gtccacgctg 780
gtggtcaaca agatccgcgg caccttcaag tccgtcgccg tcaaggctcc gggcttcggt 840
gaccgccgca aggcgatgct gcaggacatg gccatcctca ccggtggtca ggtcgtcagc 900
gaaagagtcg ggctgtccct ggagaccgcc gacgtctcgc tgctgggcca ggcccgcaag 960
gtcgtcgtca ccaaggacga gaccaccatc gtcgagggct cgggcgattc cgatgccatc 1020
gccggccggg tggctcagat ccgcgccgag atcgagaaca gcgactccga ctacgaccgc 1080
gagaagctgc aggagcgcct ggccaagctg gccggcggtg ttgcggtgat caaggccgga 1140
gctgccaccg aggtggagct caaggagcgc aagcaccgca tcgaggacgc cgtccgcaac 1200
gcgaaggctg ccgtcgaaga gggcatcgtc gccggtggcg gcgtggctct gctgcagtcg 1260
gctcctgcgc tggacgacct cggcctgacg ggcgacgagg ccaccggtgc caacatcgtc 1320
cgcgtggcgc tgtcggctcc gctcaagcag atcgccttca acggcggcct ggagcccggc 1380
gtcgttgccg agaaggtgtc caacctgccc gcgggtcacg gcctcaacgc cgcgaccggt 1440
gagtacgagg acctgctcaa ggccggcgtc gccgacccgg tgaaggtcac ccgctcggcg 1500
ctgcagaacg cggcgtccat cgcggctctg ttcctcacca ccgaggccgt cgtcgccgac 1560
aagccggaga aggcgtccgc acccgcgggc gacccgaccg gtggcatggg cggtatggac 1620
ttctaa 1626
〈210〉 160
〈211〉 541
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 160
Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro
50 55 60
Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
85 90 95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Ala Val Thr Gln
115 120 125
Ser Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ser
130 135 140
Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Thr Gln Ile Gly Glu Leu Ile
145 150 155 160
Ala Glu Ala Met Asp LysVal Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu
165 170 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg
180 185 190
Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Ala Glu Arg
195 200 205
Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys
210 215 220
Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln
225 230 235 240
Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
245 250 255
Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln
275 280 285
Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Val Ser Glu Arg Val Gly
290 295 300
Leu Ser Leu Glu Thr Ala Asp Val Ser Leu Leu Gly Gln Ala Arg Lys
305 310 315 320
Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ser Gly Asp
325 330 335
Ser Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Ala Glu Ile Glu
340 345 350
Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu
370 375 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn
385 390 395 400
Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Ala
405 410 415
Leu Leu Gln Ser Ala Pro Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Thr Gly Asp
420 425 430
Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Arg Val Ala Leu Ser Ala Pro Leu
435 440 445
Lys Gln Ile Ala Phe Asn Gly Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
450 455 460
Lys Val Ser Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Ala Thr Gly
465 470 475 480
Glu Tyr Glu Asp Leu Leu Lys Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val
485 490 495
Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Ala Leu Phe Leu
500 505 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Ala Ser Ala Pro
515 520 525
Ala Gly Asp Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Met Asp Phe
530 535 540
〈210〉 161
〈211〉 985
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 161
ggatccctac atcctgctgg tcagctccaa ggtgtcgacc gtcaaggatc tgctcccgct 60
gctggagaag gtcatccagg ccggcaagcc gctgctgatc atcgccgagg acgtcgaggg 120
cgaggccctg tccacgctgg tggtcaacaa gatccgcggc accttcaagt ccgtcgccgt 180
caaggctccg ggcttcggtg accgccgcaa ggcgatgctg caggacatgg ccatcctcac 240
cggtggtcag gtcgtcagcg aaagagtcgg gctgtccctg gagaccgccg acgtctcgct 300
gctgggccag gcccgcaagg tcgtcgtcac caaggacgag accaccatcg tcgagggctc 360
gggcgattcc gatgccatcg ccggccgggt ggctcagatc cgcgccgaga tcgagaacag 420
cgactccgac tacgaccgcg agaagctgca ggagcgcctg gccaagctgg ccggcggtgt 480
tgcggtgatc aaggccggag ctgccaccga ggtggagctc aaggagcgca agcaccgcat 540
cgaggacgcc gtccgcaacg cgaaggctgc cgtcgaagag ggcatcgtcg ccggtggcgg 600
cgtggctctg ctgcagtcgg ctcctgcgct ggacgacctc ggcctgacgg gcgacgaggc 660
caccggtgcc aacatcgtcc gcgtggcgct gtcggctccg ctcaagcaga tcgccttcaa 720
cggcggcctg gagcccggcg tcgttgccga gaaggtgtcc aacctgcccg cgggtcacgg 780
cctcaacgcc gcgaccggtg agtacgagga cctgctcaag gccggcgtcg ccgacccggt 840
gaaggtcacc cgctcggcgc tgcagaacgc ggcgtccatc gcggctctgt tcctcaccac 900
cgaggccgtc gtcgccgaca agccggagaa ggcgtccgca cccgcgggcg acccgaccgg 960
tggcatgggc ggtatggact tctaa 985
〈210〉 162
〈211〉 327
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 162
Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln Ala Gly Lys Pro Leu Leu
20 25 30
Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val
35 40 45
Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly
50 55 60
Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr
65 70 75 80
Gly Gly Gln Val Val Ser Glu Arg Val Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala
85 90 95
Asp Val Ser Leu Leu Gly Gln Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp
100 105 110
Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ile Ala Gly
115 120 125
Arg Val Ala Gln Ile Arg Ala Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr
130 135 140
Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val
145 150 155 160
Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg
165 170 175
Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu
180 185 190
Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Gln Ser Ala Pro
195 200 205
Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Thr Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn
210 215 220
Ile Val Arg Val Ala Leu Ser Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe Asn
225 230 235 240
Gly Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Ser Asn Leu Pro
245 250 255
Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Ala Thr Gly Glu Tyr Glu Asp Leu Leu
260 265 270
Lys Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln
275 280 285
Asn Ala Ala Ser Ile Ala Ala Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val
290 295 300
Ala Asp Lys Pro Glu Lys Ala Ser Ala Pro Ala Gly Asp Pro Thr Gly
305 310 315 320
Gly Met Gly Gly Met Asp Phe
325
〈210〉 163
〈211〉 403
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 163
ggatccgcgg caccggctgg tgacgaccaa gtacaacccg gcccgcacct ggacggccga 60
gaactccgtc ggcatcggcg gcgcgtacct gtgcatctac gggatggagg gccccggcgg 120
ctatcagttc gtcggccgca ccacccaggt gtggagtcgt taccgccaca cggcgccgtt 180
cgaacccgga agtccctggc tgctgcggtt tttcgaccga atttcgtggt atccggtgtc 240
ggccgaggag ctgctggaat tgcgagccga catggccgca ggccggggct cggtcgacat 300
caccgacggc gtgttctccc tcgccgagca cgaacggttc ctggccgaca acgccgacga 360
catcgccgcg ttccgttccc ggcaggcggc cgcgttctcc gcc 403
〈210〉 164
〈211〉 336
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 164
cggaccgcgt gggcggccgc cggcgagttc gaccgcgccg agaaagccgc gtcgaaggcc 60
accgacgccg ataccgggga cctggtgctc tacgacggtg cgagcgggtc gacgctccgt 120
tcgcgtcgag cgtgtggaag gtcgacgtcg ccgtcggtga ccgggtggtg gccggacagc 180
cgttgctggc gctggaggcg atgaagatgg agaccgtgct gcgcgccccg gccgacgggg 240
tggtcaccca gatcctggtc tccgctgggc atctcgtcga tcccggcacc ccactggtcg 300
tggtcggcac cggagtgcgc gcatgagcgc cgtcga 336
〈210〉 165
〈211〉 134
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 165
Asp Pro Arg His Arg Leu Val Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ala Arg Thr
1 5 10 15
Trp Thr Ala Glu Asn Ser Val Gly Ile Gly Gly Ala Tyr Leu Cys Ile
20 25 30
Tyr Gly Met Glu Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Phe Val Gly Arg Thr Thr
35 40 45
Gln Val Trp Ser Arg Tyr Arg His Thr Ala Pro Phe Glu Pro Gly Ser
50 55 60
Pro Trp Leu Leu Arg Phe Phe Asp Arg Ile Ser Trp Tyr Pro Val Ser
65 70 75 80
Ala Glu Glu Leu Leu Glu Leu Arg Ala Asp Met Ala Ala Gly Arg Gly
85 90 95
Ser Val Asp Ile Thr Asp Gly Val Phe Ser Leu Ala Glu His Glu Arg
100 105 110
Phe Leu Ala Asp Asn Ala Asp Asp Ile Ala Ala Phe Arg Ser Arg Gln
115 120 125
Ala Ala Ala Phe Ser Ala
130
〈210〉 166
〈211〉 108
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 166
Arg Thr Ala Trp Ala Ala Ala Gly Glu Phe Asp Arg Ala Glu Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Ala Thr Asp Ala Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Glu Arg Val Asp Ala Pro Phe Ala Ser Ser Val Trp Lys Val
35 40 45
Asp Val Ala Val Gly Asp Arg Val Val Ala Gly Gln Pro Leu Leu Ala
50 55 60
Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Val Leu Arg Ala Pro Ala Asp Gly
65 70 75 80
Val Val Thr Gln Ile Leu Val Ser Ala Gly His Leu Val Asp Pro Gly
85 90 95
Thr Pro Leu Val Val Val Gly Thr Gly Val Arg Ala
100 105
〈210〉 167
〈211〉 31
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 167
atagaattcg tccgacagtg ggacctcgag c 31
〈210〉 168
〈211〉 27
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 168
atagaattcc caccgcgtca gccgccg 27
〈210〉 169
〈211〉 1111
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 169
gtccgacagt gggacctcga gcaccacgtc acaggacagc ggccccgcca gcggcgccct 60
gcgcgtctcc aactggccgc tctatatggc cgacggtttc atcgcagcgt tccagaccgc 120
ctcgggcatc acggtcgact acaaagaaga cttcaacgac aacgagcagt ggttcgccaa 180
ggtcaaggag ccgttgtcgc gcaagcagga cataggcgcc gacctggtga tccccaccga 240
gttcatggcc gcgcgcgtca agggcctggg atggctcaat gagatcagcg aagccggcgt 300
gcccaatcgc aagaatctgc gtcaggacct gttggactcg agcatcgacg agggccgcaa 360
gttcaccgcg ccgtacatga ccggcatggt cggtctcgcc tacaacaagg cagccaccgg 420
acgcgatatc cgcaccatcg acgacctctg ggatcccgcg ttcaagggcc gcgtcagtct 480
gttctccgac gtccaggacg gcctcggcat gatcatgctc tcgcagggca actcgccgga 540
gaatccgacc accgagtcca ttcagcaggc ggtcgatctg gtccgcgaac agaacgacag 600
ggggtcagat ccgtcgcttc accggcaacg actacgccga cgacctggcc gcagaaacat 660
cgccatcgcg caggcgtact ccggtgacgt cgtgcagctg caggcggaca accccgatct 720
gcagttcatc gttcccgaat ccggcggcga ctggttcgtc gacacgatgg tgatcccgta 780
caccacgcag aaccagaagg ccgccgaggc gtggatcgac tacatctacg accgagccaa 840
ctacgccaag ctggtcgcgt tcacccagtt cgtgcccgca ctctcggaca tgaccgacga 900
actcgccaag gtcgatcctg catcggcgga gaacccgctg atcaacccgt cggccgaggt 960
gcaggcgaac ctgaagtcgt gggcggcact gaccgacgag cagacgcagg agttcaacac 1020
tgcgtacgcc gccgtcaccg gcggctgacg cggtggtagt gccgatgcga ggggcataaa 1080
tggccctgcg gacgcgagga gcataaatgg c 1111
〈210〉 170
〈211〉 348
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 170
Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ser Gln Asp Ser Gly Pro Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ala Leu Arg Val Ser Asn Trp Pro Leu Tyr Met Ala Asp Gly
20 25 30
Phe Ile Ala Ala Phe Gln Thr Ala Ser Gly Ile Thr Val Asp Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Phe Asn Asp Asn Glu Gln Trp Phe Ala Lys Val Lys Glu Pro
50 55 60
Leu Ser Arg Lys Gln Asp Ile Gly Ala Asp Leu Val Ile Pro Thr Glu
65 70 75 80
Phe Met Ala Ala Arg Val Lys Gly Leu Gly Trp Leu Asn Glu Ile Ser
85 90 95
Glu Ala Gly Val Pro Asn Arg Lys Asn Leu Arg Gln Asp Leu Leu Asp
100 105 110
Ser Ser Ile Asp Glu Gly Arg Lys Phe Thr Ala Pro Tyr Met Thr Gly
115 120 125
Met Val Gly Leu Ala Tyr Asn Lys Ala Ala Thr Gly Arg Asp Ile Arg
130 135 140
Thr Ile Asp Asp Leu Trp Asp Pro Ala Phe Lys Gly Arg Val Ser Leu
145 150 155 160
Phe Ser Asp Val Gln Asp Gly Leu Gly Met Ile Met Leu Ser Gln Gly
165 170 175
Asn Ser Pro Glu Asn Pro Thr Thr Glu Ser Ile Gln Gln Ala Val Asp
180 185 190
Leu Val Arg Glu Gln Asn Asp Arg Gly Gln Ile Arg Arg Phe Thr Gly
195 200 205
Asn Asp Tyr Ala Asp Asp Leu Ala Ala Gly Asn Ile Ala Ile Ala Gln
210 215 220
Ala Tyr Ser Gly Asp Val Val Gln Leu Gln Ala Asp Asn Pro Asp Leu
225 230 235 240
Gln Phe Ile Val Pro Glu Ser Gly Gly Asp Trp Phe Val Asp Thr Met
245 250 255
Val Ile Pro Tyr Thr Thr Gln Asn Gln Lys Ala Ala Glu Ala Trp Ile
260 265 270
Asp Tyr Ile Tyr Asp Arg Ala Asn Tyr Ala Lys Leu Val Ala Phe Thr
275 280 285
Gln Phe Val Pro Ala Leu Ser Asp Met Thr Asp Glu Leu Ala Lys Val
290 295 300
Asp Pro Ala Ser Ala Glu Asn Pro Leu Ile Asn Pro Ser Ala Glu Val
305 310 315 320
Gln Ala Asn Leu Lys Ser Trp Ala Ala Leu Thr Asp Glu Gln Thr Gln
325 330 335
Glu Phe Asn Thr Ala Tyr Ala Ala Val Thr Gly Gly
340 345
〈210〉 171
〈211〉 1420
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (955)...(955)
〈221〉 unsure
〈222〉 (973)...(973)
〈400〉 171
gatgagcagc gtgctgaact cgacctggtt ggcctgggcc gtcgcggtcg cggtcgggtt 60
cccggtgctg ctggtcgtgc tgaccgaggt gcacaacgcg ttgcgtcggc gcggcagcgc 120
gctggcccgc ccggtgcaac tcctgcgtac ctacatcctg ccgctgggcg cgttgctgct 180
cctgctggta caggcgatgg agatctccga cgacgccacg tcggtacggt tggtcgccac 240
cctgttcggc gtcgtgttgt tgacgttggt gctgtccggg ctcaacgcca ccctcatcca 300
gggcgcacca gaagacagct ggcgcaggcg gattccgtcg atcttcctcg acgtcgcgcg 360
cttcgcgctg atcgcggtcg gtatcaccgt gatcatggcc tatgtctggg gcgcgaacgt 420
ggggggcctg ttcaccgcac tgggcgtcac ttccatcgtt cttggcctgg ctctgcagaa 480
ttcggtcggt cagatcatct cgggtctgct gctgctgttc gagcaaccgt tccggctcgg 540
cgactggatc accgtcccca ccgcggcggg ccggccgtcc gcccacggcc gcgtggtgga 600
agtcaactgg cgtgcaacac atatcgacac cggcggcaac ctgctggtaa tgcccaacgc 660
cgaactcgcc ggcgcgtcgt tcaccaatta cagccggccc gtgggagagc accggctgac 720
cgtcgtcacc accttcaacg ccgcggacac ccccgatgat gtctgcgaga tgctgtcgtc 780
ggtcgcggcg tcgctgcccg aactgcgcac cgacggacag atcgccacgc tctatctcgg 840
tgcggccgaa tacgagaagt cgatcccgtt gcacacaccc gcggtggacg actcggtcag 900
gagcacgtac ctgcgatggg tctggtacgc cgcgcgccgg caggaacttc gcctnaacgg 960
cgtcgccgac ganttcgaca cgccggaacg gatcgcctcg gccatgcggg ctgtggcgtc 1020
cacactgcgc ttggcagacg acgaacagca ggagatcgcc gacgtggtgc gtctggtccg 1080
ttacggcaac ggggaacgcc tccagcagcc gggtcaggta ccgaccggga tgaggttcat 1140
cgtagacggc agggtgagtc tgtccgtgat cgatcaggac ggcgacgtga tcccggcgcg 1200
ggtgctcgag cgtggcgact tcctggggca gaccacgctg acgcgggaac cggtactggc 1260
gaccgcgcac gcgctggagg aagtcaccgt gctggagatg gcccgtgacg agatcgagcg 1320
cctggtgcac cgaaagccga tcctgctgca cgtgatcggg gccgtgatcg ccgaccggcg 1380
cgcgcacgaa cttcggttga tggcggactc gcaggactga 1420
〈210〉 172
〈211〉 471
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (318)...(318)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (324)...(324)
〈400〉 172
Met Ser Ser Val Leu Asn Ser Thr Trp Leu Ala Trp Ala Val Ala Val
1 5 10 15
Ala Val Gly Phe Pro Val Leu Leu Val Val Leu Thr Glu Val His Asn
20 25 30
Ala Leu Arg Arg Arg Gly Ser Ala Leu Ala Arg Pro Val Gln Leu Leu
35 40 45
Arg Thr Tyr Ile Leu Pro Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gln
50 55 60
Ala Met Glu Ile Ser Asp Asp Ala Thr Ser Val Arg Leu Val Ala Thr
65 70 75 80
Leu Phe Gly Val Val Leu Leu Thr Leu Val Leu Ser Gly Leu Asn Ala
85 90 95
Thr Leu Ile Gln Gly Ala Pro Glu Asp Ser Trp Arg Arg Arg Ile Pro
100 105 110
Ser Ile Phe Leu Asp Val Ala Arg Phe Ala Leu Ile Ala Val Gly Ile
115 120 125
Thr Val Ile Met Ala Tyr Val Trp Gly Ala Asn Val Gly Gly Leu Phe
130 135 140
Thr Ala Leu Gly Val Thr Ser Ile Val Leu Gly Leu Ala Leu Gln Asn
145 150 155 160
Ser Val Gly Gln Ile Ile Ser Gly Leu Leu Leu Leu Phe Glu Gln Pro
165 170 175
Phe Arg Leu Gly Asp Trp Ile Thr Val Pro Thr Ala Ala Gly Arg Pro
180 185 190
Ser Ala His Gly Arg Val Val Glu Val Asn Trp Arg Ala Thr His Ile
195 200 205
Asp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Val Met Pro Asn Ala Glu Leu Ala Gly
210 215 220
Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Ser Arg Pro Val Gly Glu His Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Val Thr Thr Phe Asn Ala Ala Asp Thr Pro Asp Asp Val Cys Glu
245 250 255
Met Leu Ser Ser Val Ala Ala Ser Leu Pro Glu Leu Arg Thr Asp Gly
260 265 270
Gln Ile Ala Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Ile
275 280 285
Pro Leu His Thr Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Arg Ser Thr Tyr Leu
290 295 300
Arg Trp Val Trp Tyr Ala Ala Arg Arg Gln Glu Leu Arg Xaa Asn Gly
305 310 315 320
Val Ala Asp Xaa Phe Asp Thr Pro Glu Arg Ile Ala Ser Ala Met Arg
325 330 335
Ala Val Ala Ser Thr Leu Arg Leu Ala Asp Asp Glu Gln Gln Glu Ile
340 345 350
Ala Asp Val Val Arg Leu Val Arg Tyr Gly Asn Gly Glu Arg Leu Gln
355 360 365
Gln Pro Gly Gln Val Pro Thr Gly Met Arg Phe Ile Val Asp Gly Arg
370 375 380
Val Ser Leu Ser Val Ile Asp Gln Asp Gly Asp Val Ile Pro Ala Arg
385 390 395 400
Val Leu Glu Arg Gly Asp Phe Leu Gly Gln Thr Thr Leu Thr Arg Glu
405 410 415
Pro Val Leu Ala Thr Ala His Ala Leu Glu Glu Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Met Ala Arg Asp Glu Ile Glu Arg Leu Val His Arg Lys Pro Ile Leu
435 440 445
Leu His Val Ile Gly Ala Val Ile Ala Asp Arg Arg Ala His Glu Leu
450 455 460
Arg Leu Met Asp Ser Gln Asp
465 470
〈210〉 173
〈211〉 2172
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 173
tagatgacaa ttctgccctg gaatgcgcga acgtctgaac acccgacgcg aaaaagacgc 60
gggcgctacc acctcctgtc gcggatgagc atccagtcca agttgctgct gatgctgctt 120
ctgaccagca ttctctcggc tgcggtggtc ggtttcatcg gctatcagtc cggacggtcc 180
tcgctgcgcg catcggtgtt cgaccgcctc accgacatcc gcgagtcgca gtcgcgcggg 240
ttggagaatc agttcgcgga cctgaagaac tcgatggtga tttactcgcg cggcagcact 300
gccacggagg cgatcggcgc gttcagcgac ggtttccgtc agctcggcga tgcgacgatc 360
aataccgggc aggcggcgtc attgcgccgt tactacgacc ggacgttcgc caacaccacc 420
ctcgacgaca gcggaaaccg cgtcgacgtc cgcgcgctca tcccgaaatc caacccccag 480
cgctatctgc aggcgctcta taccccgccg tttcagaact gggagaaggc gatcgcgttc 540
gacgacgcgc gcgacggcag cgcctggtcg gccgccaatg ccagattcaa cgagttcttc 600
cgcgagatcg tgcaccgctt caacttcgag gatctgatgc tgctcgacct cgagggcaac 660
gtggtgtact ccgcctacaa ggggccggat ctcgggacaa acatcgtcaa cggcccctat 720
cgcaaccggg aactgtcgga agcctacgag aaggcggtcg cgtcgaactc gatcgactat 780
gtcggtgtca ccgacttcgg gtggtacctg cctgccgagg aaccgaccgc ctggttcctg 840
tccccggtcg ggttgaagga ccgagtcgac ggtgtgatgg cggtccagtt cccgatcgcg 900
cggatcaacg aattgatgac ggcgcgggga cagtggcgtg acaccgggat gggagacacc 960
ggtgagacca tcctggtcgg accggacaat ctgatgcgct cggactcccg gctgttccgc 1020
gagaaccggg agaagttcct ggccgacgtc gtcgaggggg gaaccccgcc ggaggtcgcc 1080
gacgaatcgg ttgaccgccg cggcaccacg ctggtgcagc cggtgaccac ccgctccgtc 1140
gaggaggccc aacgcggcaa caccgggacg acgatcgagg acgactatct cggccacgag 1200
gcgttacagg cgtactcacc ggtggacctg ccgggactgc actgggtgat cgtggccaag 1260
atcgacaccg acgaggcgtt cgccccggtg gcgcagttca ccaggaccct ggtgctgtcg 1320
acggtgatca tcatcttcgg cgtgtcgctg gcggccatgc tgctggcgcg gttgttcgtc 1380
cgtccgatcc ggcggttgca ggccggcgcc cagcagatca gcggcggtga ctaccgcctc 1440
gctctgccgg tgttgtctcg tgacgaattc ggcgatctga caacagcttt caacgacatg 1500
agtcgcaatc tgtcgatcaa ggacgagctg ctcggcgagg agcgcgccga gaaccaacgg 1560
ctgatgctgt ccctgatgcc cgaaccggtg atgcagcgct acctcgacgg ggaggagacg 1620
atcgcccagg accacaagaa cgtcacggtg atcttcgccg acatgatggg cctcgacgag 1680
ttgtcgcgca tgttgacctc cgaggaactg atggtggtgg tcaacgacct gacccgccag 1740
ttcgacgccg ccgccgagag tctcggggtc gaccacgtgc ggacgctgca cgacgggtac 1800
ctggccagct gcgggttagg cgtgccgcgg ctggacaacg tccggcgcac ggtcaatttc 1860
gcgatcgaaa tggaccgcat catcgaccgg cacgccgccg agtccgggca cgacctgcgg 1920
ctccgcgcgg gcatcgacac cgggtcggcg gccagcgggc tggtggggcg gtccacgttg 1980
gcgtacgaca tgtggggttc ggcggtcgat gtcgctaacc aggtgcagcg cggctccccc 2040
cagcccggca tctacgtcac ctcgcgggtg cacgaggtca tgcaggaaac tctcgacttc 2100
gtcgccgccg gggaggtcgt cggcgagcgc ggcgtcgaga cggtctggcg gttgcagggc 2160
caccggcgat ga 2172
〈210〉 174
〈211〉 722
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 174
Met Thr Ile Leu Pro Trp Asn Ala Arg Thr Ser Glu His Pro Thr Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Gly Arg Tyr His Leu Leu Ser Arg Met Ser Ile Gln Ser
20 25 30
Lys Leu Leu Leu Met Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Ser Ala Ala Val
35 40 45
Val Gly Phe Ile Gly Tyr Gln Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Ala Ser
50 55 60
Val Phe Asp Arg Leu Thr Asp Ile Arg Glu Ser Gln Ser Arg Gly Leu
65 70 75 80
Glu Asn Gln Phe Ala Asp Leu Lys Asn Ser Met Val Ile Tyr Ser Arg
85 90 95
Gly Ser Thr Ala Thr Glu Ala Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Phe Arg
100 105 110
Gln Leu Gly Asp Ala Thr Ile Asn Thr Gly Gln Ala Ala Ser Leu Arg
115 120 125
Arg Tyr Tyr Asp Arg Thr Phe Ala Asn Thr Thr Leu Asp Asp Ser Gly
130 135 140
Asn Arg Val Asp Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg
145 150 155 160
Tyr Leu Gln Ala Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala
165 170 175
Ile Ala Phe Asp Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn
180 185 190
Ala Arg Phe Asn Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe
195 200 205
Glu Asp Leu Met Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala
210 215 220
Tyr Lys Gly Pro Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg
225 230 235 240
Asn Arg Glu Leu Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser
245 250 255
Ile Asp Tyr Val Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu
260 265 270
Glu Pro Thr Ala Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val
275 280 285
Asp Gly Val Met Ala Val Gln Phe Pro Ile Ala Arg Ile Asn Glu Leu
290 295 300
Met Thr Ala Arg Gly Gln Trp Arg Asp Thr Gly Met Gly Asp Thr Gly
305 310 315 320
Glu Thr Ile Leu Val Gly Pro Asp Asn Leu Met Arg Ser Asp Ser Arg
325 330 335
Leu Phe Arg Glu Asn Arg Glu Lys Phe Leu Ala Asp Val Val Glu Gly
340 345 350
Gly Thr Pro Pro Glu Val Ala Asp Glu Ser Val Asp Arg Arg Gly Thr
355 360 365
Thr Leu Val Gln Pro Val Thr Thr Arg Ser Val Glu Glu Ala Gln Arg
370 375 380
Gly Asn Thr Gly Thr Thr Ile Glu Asp Asp Tyr Leu Gly His Glu Ala
385 390 395 400
Leu Gln Ala Tyr Ser Pro Val Asp Leu Pro Gly Leu His Trp Val Ile
405 410 415
Val Ala Lys Ile Asp Thr Asp Glu Ala Phe Ala Pro Val Ala Gln Phe
420 425 430
Thr Arg Thr Leu Val Leu Ser Thr Val Ile Ile Ile Phe Gly Val Ser
435 440 445
Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Arg Leu Phe Val Arg Pro Ile Arg Arg
450 455 460
Leu Gln Ala Gly Ala Gln Gln Ile Ser Gly Gly Asp Tyr Arg Leu Ala
465 470 475 480
Leu Pro Val Leu Ser Arg Asp Glu Phe Gly Asp Leu Thr Thr Ala Phe
485 490 495
Asn Asp Met Ser Arg Asn Leu Ser Ile Lys Asp Glu Leu Leu Gly Glu
500 505 510
Glu Arg Ala Glu Asn Gln Arg Leu Met Leu Ser Leu Met Pro Glu Pro
515 520 525
Val Met Gln Arg Tyr Leu Asp Gly Glu Glu Thr Ile Ala Gln Asp His
530 535 540
Lys Asn Val Thr Val Ile Phe Ala Asp Met Met Gly Leu Asp Glu Leu
545 550 555 560
Ser Arg Met Leu Thr Ser Glu Glu Leu Met Val Val Val Asn Asp Leu
565 570 575
Thr Arg Gln Phe Asp Ala Ala Ala Glu Ser Leu Gly Val Asp His Val
580 585 590
Arg Thr Leu His Asp Gly Tyr Leu Ala Ser Cys Gly Leu Gly Val Pro
595 600 605
Arg Leu Asp Asn Val Arg Arg Thr Val Asn Phe Ala Ile Glu Met Asp
610 615 620
Arg Ile Ile Asp Arg His Ala Ala Glu Ser Gly His Asp Leu Arg Leu
625 630 635 640
Arg Ala Gly Ile Asp Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Leu Val Gly Arg
645 650 655
Ser Thr Leu Ala Tyr Asp Met Trp Gly Ser Ala Val Asp Val Ala Asn
660 665 670
Gln Val Gln Arg Gly Ser Pro Gln Pro Gly Ile Tyr Val Thr Ser Arg
675 680 685
Val His Glu Val Met Gln Glu Thr Leu Asp Phe Val Ala Ala Gly Glu
690 695 700
Val Val Gly Glu Arg Gly Val Glu Thr Val Trp Arg Leu Gln Gly His
705 710 715 720
Arg Arg
〈210〉 175
〈211〉 898
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 175
gagcaaccgt tccggctcgg cgactggatc accgtcccca ccgcggcggg ccggccgtcc 60
gcccacggcc gcgtggtgga agtcaactgg cgtgcaacac atatcgacac cggcggcaac 120
ctgctggtaa tgcccaacgc cgaactcgcc ggcgcgtcgt tcaccaatta cagccggccc 180
gtgggagagc accggctgac cgtcgtcacc accttcaacg ccgcggacac ccccgatgat 240
gtctgcgaga tgctgtcgtc ggtcgcggcg tcgctgcccg aactgcgcac cgacggacag 300
atcgccacgc tctatctcgg tgcggccgaa tacgagaagt cgatcccgtt gcacacaccc 360
gcggtggacg actcggtcag gagcacgtac ctgcgatggg tctggtacgc cgcgcgccgg 420
caggaacttc gcctaacggc gtcgccgacg attcgacacg ccggaacgga tcgcctcggc 480
catgcgggct gtggcgtcca cactgcgctt ggcagacgac gaacagcagg agatcgccga 540
cgtggtgcgt ctggtccgtt acggcaacgg ggaacgcctc cagcagccgg gtcaggtacc 600
gaccgggatg aggttcatcg tagacggcag ggtgagtctg tccgtgatcg atcaggacgg 660
cgacgtgatc ccggcgcggg tgctcgagcg tggcgacttc ctggggcaga ccacgctgac 720
gcgggaaccg gtactggcga ccgcgcacgc gctggaggaa gtcaccgtgc tggagatggc 780
ccgtgacgag atcgagcgcc tggtgcaccg aaagccgatc ctgctgcacg tgatcggggc 840
cgtgatcgcc gaccggcgcg cgcacgaact tcggttgatg gcggactcgc aggactga 898
〈210〉 176
〈211〉 2013
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 176
ggctatcagt ccggacggtc ctcgctgcgc gcatcggtgt tcgaccgcct caccgacatc 60
cgcgagtcgc agtcgcgcgg gttggagaat cagttcgcgg acctgaagaa ctcgatggtg 120
atttactcgc gcggcagcac tgccacggag gcgatcggcg cgttcagcga cggtttccgt 180
cagctcggcg atgcgacgat caataccggg caggcggcgt cattgcgccg ttactacgac 240
cggacgttcg ccaacaccac cctcgacgac agcggaaacc gcgtcgacgt ccgcgcgctc 300
atcccgaaat ccaaccccca gcgctatctg caggcgctct ataccccgcc gtttcagaac 360
tgggagaagg cgatcgcgtt cgacgacgcg cgcgacggca gcgcctggtc ggccgccaat 420
gccagattca acgagttctt ccgcgagatc gtgcaccgct tcaacttcga ggatctgatg 480
ctgctcgacc tcgagggcaa cgtggtgtac tccgcctaca aggggccgga tctcgggaca 540
aacatcgtca acggccccta tcgcaaccgg gaactgtcgg aagcctacga gaaggcggtc 600
gcgtcgaact cgatcgacta tgtcggtgtc accgacttcg ggtggtacct gcctgccgag 660
gaaccgaccg cctggttcct gtccccggtc gggttgaagg accgagtcga cggtgtgatg 720
gcggtccagt tcccgatcgc gcggatcaac gaattgatga cggcgcgggg acagtggcgt 780
gacaccggga tgggagacac cggtgagacc atcctggtcg gaccggacaa tctgatgcgc 840
tcggactccc ggctgttccg cgagaaccgg gagaagttcc tggccgacgt cgtcgagggg 900
ggaaccccgc cggaggtcgc cgacgaatcg gttgaccgcc gcggcaccac gctggtgcag 960
ccggtgacca cccgctccgt cgaggaggcc caacgcggca acaccgggac gacgatcgag 1020
gacgactatc tcggccacga ggcgttacag gcgtactcac cggtggacct gccgggactg 1080
cactgggtga tcgtggccaa gatcgacacc gacgaggcgt tcgccccggt ggcgcagttc 1140
accaggaccc tggtgctgtc gacggtgatc atcatcttcg gcgtgtcgct ggcggccatg 1200
ctgctggcgc ggttgttcgt ccgtccgatc cggcggttgc aggccggcgc ccagcagatc 1260
agcggcggtg actaccgcct cgctctgccg gtgttgtctc gtgacgaatt cggcgatctg 1320
acaacagctt tcaacgacat gagtcgcaat ctgtcgatca aggacgagct gctcggcgag 1380
gagcgcgccg agaaccaacg gctgatgctg tccctgatgc ccgaaccggt gatgcagcgc 1440
tacctcgacg gggaggagac gatcgcccag gaccacaaga acgtcacggt gatcttcgcc 1500
gacatgatgg gcctcgacga gttgtcgcgc atgttgacct ccgaggaact gatggtggtg 1560
gtcaacgacc tgacccgcca gttcgacgcc gccgccgaga gtctcggggt cgaccacgtg 1620
cggacgctgc acgacgggta cctggccagc tgcgggttag gcgtgccgcg gctggacaac 1680
gtccggcgca cggtcaattt cgcgatcgaa atggaccgca tcatcgaccg gcacgccgcc 1740
gagtccgggc acgacctgcg gctccgcgcg ggcatcgaca ccgggtcggc ggccagcggg 1800
ctggtggggc ggtccacgtt ggcgtacgac atgtggggtt cggcggtcga tgtcgctaac 1860
caggtgcagc gcggctcccc ccagcccggc atctacgtca cctcgcgggt gcacgaggtc 1920
atgcaggaaa ctctcgactt cgtcgccgcc ggggaggtcg tcggcgagcg cggcgtcgag 1980
acggtctggc ggttgcaggg ccaccggcga tga 2013
〈210〉 177
〈211〉 297
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (145)...(145)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (151)...(151)
〈400〉 177
Glu Gln Pro Phe Arg Leu Gly Asp Trp Ile Thr Val Pro Thr Ala Ala
1 5 10 15
Gly Arg Pro Ser Ala His Gly Arg Val Val Glu Val Asn Trp Arg Ala
20 25 30
Thr His Ile Asp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Val Met Pro Asn Ala Glu
35 40 45
Leu Ala Gly Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Ser Arg Pro Val Gly Glu His
50 55 60
Arg Leu Thr Val Val Thr Thr Phe Asn Ala Ala Asp Thr Pro Asp Asp
65 70 75 80
Val Cys Glu Met Leu Ser Ser Val Ala Ala Ser Leu Pro Glu Leu Arg
85 90 95
Thr Asp Gly Gln Ile Ala Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Ala Glu Tyr Glu
100 105 110
Lys Ser Ile Pro Leu His Thr Pro Ala Val Asp Asp Ser Val Arg Ser
115 120 125
Thr Tyr Leu Arg Trp Val Trp Tyr Ala Ala Arg Arg Gln Glu Leu Arg
130 135 140
Xaa Asn Gly Val Ala Asp Xaa Phe Asp Thr Pro Glu Arg Ile Ala Ser
145 150 155 160
Ala Met Arg Ala Val Ala Ser Thr Leu Arg Leu Ala Asp Asp Glu Gln
165 170 175
Gln Glu Ile Ala Asp Val Val Arg Leu Val Arg Tyr Gly Asn Gly Glu
180 185 190
Arg Leu Gln Gln Pro Gly Gln Val Pro Thr Gly Met Arg Phe Ile Val
195 200 205
Asp Gly Arg Val Ser Leu Ser Val Ile Asp Gln Asp Gly Asp Val Ile
210 215 220
Pro Ala Arg Val Leu Glu Arg Gly Asp Phe Leu Gly Gln Thr Thr Leu
225 230 235 240
Thr Arg Glu Pro Val Leu Ala Thr Ala His Ala Leu Glu Glu Val Thr
245 250 255
Val Leu Glu Met Ala Arg Asp Glu Ile Glu Arg Leu Val His Arg Lys
260 265 270
Pro Ile Leu Leu His Val Ile Gly Ala Val Ala Asp Arg Arg Ala His
275 280 285
Glu Leu Arg Leu Met Asp Ser Gln Asp
290 295
〈210〉 178
〈211〉 670
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 178
Gly Tyr Gln Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Ala Ser Val Phe Asp Arg
1 5 10 15
Leu Thr Asp Ile Arg Glu Ser Gln Ser Arg Gly Leu Glu Asn Gln Phe
20 25 30
Ala Asp Leu Lys Asn Ser Met Val Ile Tyr Ser Arg Gly Ser Thr Ala
35 40 45
Thr Glu Ala Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Phe Arg Gln Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Thr Ile Asn Thr Gly Gln Ala Ala Ser Leu Arg Arg Tyr Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ala Asn Thr Thr Leu Asp Asp Ser Gly Asn Arg Val Asp
85 90 95
Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg Tyr Leu Gln Ala
100 105 110
Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala Ile Ala Phe Asp
115 120 125
Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn Ala Arg Phe Asn
130 135 140
Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe Glu Asp Leu Met
145 150 155 160
Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala Tyr Lys Gly Pro
165 170 175
Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg Asn Arg Glu Leu
180 185 190
Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser Ile Asp Tyr Val
195 200 205
Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu Glu Pro Thr Ala
210 215 220
Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val Asp Gly Val Met
225 230 235 240
Ala Val Gln Phe Pro Ile Ala Arg Ile Asn Glu Leu Met Thr Ala Arg
245 250 255
Gly Gln Trp Arg Asp Thr Gly Met Gly Asp Thr Gly Glu Thr Ile Leu
260 265 270
Val Gly Pro Asp Asn Leu Met Arg Ser Asp Ser Arg Leu Phe Arg Glu
275 280 285
Asn Arg Glu Lys Phe Leu Ala Asp Val Val Glu Gly Gly Thr Pro Pro
290 295 300
Glu Val Ala Asp Glu Ser Val Asp Arg Arg Gly Thr Thr Leu Val Gln
305 310 315 320
Pro Val Thr Thr Arg Ser Val Glu Glu Ala Gln Arg Gly Asn Thr Gly
325 330 335
Thr Thr Ile Glu Asp Asp Tyr Leu Gly His Glu Ala Leu Gln Ala Tyr
340 345 350
Ser Pro Val Asp Leu Pro Gly Leu His Trp Val Ile Val Ala Lys Ile
355 360 365
Asp Thr Asp Glu Ala Phe Ala Pro Val Ala Gln Phe Thr Arg Thr Leu
370 375 380
Val Leu Ser Thr Val Ile Ile Ile Phe Gly Val Ser Leu Ala Ala Met
385 390 395 400
Leu Leu Ala Arg Leu Phe Val Arg Pro Ile Arg Arg Leu Gln Ala Gly
405 410 415
Ala Gln Gln Ile Ser Gly Gly Asp Tyr Arg Leu Ala Leu Pro Val Leu
420 425 430
Ser Arg Asp Glu Phe Gly Asp Leu Thr Thr Ala Phe Asn Asp Met Ser
435 440 445
Arg Asn Leu Ser Ile Lys Asp Glu Leu Leu Gly Glu Glu Arg Ala Glu
450 455 460
Asn Gln Arg Leu Met Leu Ser Leu Met Pro Glu Pro Val Met Gln Arg
465 470 475 480
Tyr Leu Asp Gly Glu Glu Thr Ile Ala Gln Asp His Lys Asn Val Thr
485 490 495
Val Ile Phe Ala Asp Met Met Gly Leu Asp Glu Leu Ser Arg Met Leu
500 505 510
Thr Ser Glu Glu Leu Met Val Val Val Asn Asp Leu Thr Arg Gln Phe
515 520 525
Asp Ala Ala Ala Glu Ser Leu Gly Val Asp His Val Arg Thr Leu His
530 535 540
Asp Gly Tyr Leu Ala Ser Cys Gly Leu Gly Val Pro Arg Leu Asp Asn
545 550 555 560
Val Arg Arg Thr Val Asn Phe Ala Ile Glu Met Asp Arg Ile Ile Asp
565 570 575
Arg His Ala Ala Glu Ser Gly His Asp Leu Arg Leu Arg Ala Gly Ile
580 585 590
Asp Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Leu Val Gly Arg Ser Thr Leu Ala
595 600 605
Tyr Asp Met Trp Gly Ser Ala Val Asp Val Ala Asn Gln Val Gln Arg
610 615 620
Gly Ser Pro Gln Pro Gly Ile Tyr Val Thr Ser Arg Val His Glu Val
625 630 635 640
Met Gln Glu Thr Leu Asp Phe Val Ala Ala Gly Glu Val Val Gly Glu
645 650 655
Arg Gly Val Glu Thr Val Trp Arg Leu Gln Gly His Arg Arg
660 665 670
〈210〉 179
〈211〉 520
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 179
gtgatcgacg aaaccctctt ccatgccgag gagaagatgg agaaggccgt ctcggtggca 60
cccgacgacc tggcgtcgat tcgtaccggc cgcgcgaacc ccggcatgtt caaccggatc 120
aacatcgact actacggcgc ctccaccccg atcacgcagc tgtccagcat caacgtgccc 180
gaggcgcgca tggtggtgat caagccctac gaggcgagcc agctgcgcct catcgaggat 240
gcgatccgca actccgacct cggcgtcaat ccgaccaacg acggcaacat catccgggtg 300
tcgatcccgc agctcaccga ggagcgccgc cgcgacctgg tcaagcaggc caaggccaag 360
ggcgaggacg ccaaggtgtc ggtgcgcaac atccgtcgca acgatatgaa cacctttcgc 420
atcgcaccgg tacggctgcc gacgccaccg ccgtcgtaga agcgacagag gatcgcaggt 480
aacggtattg gccacgcctt ctgtggcggg ccgacaccac 520
〈210〉 180
〈211〉 1071
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 180
cgtggggaag gattgcactc tatgagcgaa atcgcccgtc cctggcgggt tctggcaggt 60
ggcatcggtg cctgcgccgc gggtatcgcc ggggtgctga gcatcgcggt caccacggcg 120
tcggcccagc cgggcctccc gcagcccccg ctgcccgccc ctgccacagt gacgcaaacc 180
gtcacggttg cgcccaacgc cgcgccacaa ctcatcccgc gccccggtgt gacgcctgcc 240
accggcggcg ccgccgcggt gcccgccggg gtgagcgccc cggcggtcgc gccggccccc 300
gcgctgcccg cccgcccggt gtccacgatc gccccggcca cctcgggcac gctcagcgag 360
ttcttcgccg ccaagggcgt cacgatggag ccgcagtcca gccgcgactt ccgcgccctc 420
aacatcgtgc tgccgaagcc gcggggctgg gagcacatcc cggacccgaa cgtgccggac 480
gcgttcgcgg tgctggccga ccgggtcggc ggcaacggcc tgtactcgtc gaacgcccag 540
gtggtggtct acaaactcgt cggcgagttc gaccccaagg aagcgatcag ccacggcttc 600
gtcgacagcc agaagctgcc ggcgtggcgt tccaccgacg cgtcgctggc cgacttcggc 660
ggaatgccgt cctcgctgat cgagggcacc taccgcgaga acaacatgaa gctgaacacg 720
tcccggcgcc acgtcattgc caccgcgggg cccgaccact acctggtgtc gctgtcggtg 780
accaccagcg tcgaacaggc cgtggccgaa gccgcggagg ccaccgacgc gattgtcaac 840
ggcttcaagg tcagcgttcc gggtccgggt ccggccgcac cgccacctgc acccggtgcc 900
cccggtgtcc cgcccgcccc cggcgccccg gcgctgccgc tggccgtcgc accacccccg 960
gctcccgctg ttcccgccgt ggcgcccgcg ccacagctgc tgggactgca gggatagacg 1020
tcgtcgtccc ccgggcgaag cctggcgccc gggggacgac ggcccctttc t 1071
〈210〉 181
〈211〉 152
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 181
Val Ile Asp Glu Thr Leu Phe His Ala Glu Glu Lys Met Glu Lys Ala
1 5 10 15
Val Ser Val Ala Pro Asp Asp Leu Ala Ser Ile Arg Thr Gly Arg Ala
20 25 30
Asn Pro Gly Met Phe Asn Arg Ile Asn Ile Asp Tyr Tyr Gly Ala Ser
35 40 45
Thr Pro Ile Thr Gln Leu Ser Ser Ile Asn Val Pro Glu Ala Arg Met
50 55 60
Val Val Ile Lys Pro Tyr Glu Ala Ser Gln Leu Arg Leu Ile Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ile Arg Asn Ser Asp Leu Gly Val Asn Pro Thr Asn Asp Gly Asn
85 90 95
Ile Ile Arg Val Ser Ile Pro Gln Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Asp
100 105 110
Leu Val Lys Gln Ala Lys Ala Lys Gly Glu Asp Ala Lys Val Ser Val
115 120 125
Arg Asn Ile Arg Arg Asn Asp Met Asn Thr Phe Arg Ile Ala Pro Val
130 135 140
Arg Leu Pro Thr Pro Pro Pro Ser
145 150
〈210〉 182
〈211〉 331
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 182
Met Ser Glu Ile Ala Arg Pro Trp Arg Val Leu Ala Gly Gly Ile Gly
1 5 10 15
Ala Cys Ala Ala Gly Ile Ala Gly Val Leu Ser Ile Ala Val Thr Thr
20 25 30
Ala Ser Ala Gln Pro Gly Leu Pro Gln Pro Pro Leu Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Thr Val Thr Gln Thr Val Thr Val Ala Pro Asn Ala Ala Pro Gln Leu
50 55 60
Ile Pro Arg Pro Gly Val Thr Pro Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Val
65 70 75 80
Pro Ala Gly Val Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Ala Pro Ala Leu Pro
85 90 95
Ala Arg Pro Val Ser Thr Ile Ala Pro Ala Thr Ser Gly Thr Leu Ser
100 105 110
Glu Phe Phe Ala Ala Lys Gly Val Thr Met Glu Pro Gln Ser Ser Arg
115 120 125
Asp Phe Arg Ala Leu Asn Ile Val Leu Pro Lys Pro Arg Gly Trp Glu
130 135 140
His Ile Pro Asp Pro Asn Val Pro Asp Ala Phe Ala Val Leu Ala Asp
145 150 155 160
Arg Val Gly Gly Asn Gly Leu Tyr Ser Ser Asn Ala Gln Val Val Val
165 170 175
Tyr Lys Leu Val Gly Glu Phe Asp Pro Lys Glu Ala Ile Ser His Gly
180 185 190
Phe Val Asp Ser Gln Lys Leu Pro Ala Trp Arg Ser Thr Asp Ala Ser
195 200 205
Leu Ala Asp Phe Gly Gly Met Pro Ser Ser Leu Ile Glu Gly Thr Tyr
210 215 220
Arg Glu Asn Asn Met Lys Leu Asn Thr Ser Arg Arg His Val Ile Ala
225 230 235 240
Thr Ala Gly Pro Asp His Tyr Leu Val Ser Leu Ser Val Thr Thr Ser
245 250 255
Val Glu Gln Ala Val Ala Glu Ala Ala Glu Ala Thr Asp Ala Ile Val
260 265 270
Asn Gly Phe Lys Val Ser Val Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ala Pro Pro
275 280 285
Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Ala
290 295 300
Leu Pro Leu Ala Val Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Val Pro Ala Val
305 310 315 320
Ala Pro Ala Pro Gln Leu Leu Gly Leu Gln Gly
325 330
〈210〉 183
〈211〉 207
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 183
acctacgagt tcgagaacaa ggtcacgggc ggccgcatcc cgcgcgagta catcccgtcg 60
gtggatgccg gcgcgcagga cgccatgcag tacggcgtgc tggccggcta cccgctggtt 120
aacgtcaagc tgacgctgct cgacggtgcc taccacgaag tcgactcgtc ggaaatggca 180
ttcaaggttg ccggctccca ggtcata 207
〈210〉 184
〈211〉 69
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 184
Thr Tyr Glu Phe Glu Asn Lys Val Thr Gly Gly Arg Ile Pro Arg Glu
1 5 10 15
Tyr Ile Pro Ser Val Asp Ala Gly Ala Gln Asp Ala Met Gln Tyr Gly
20 25 30
Val Leu Ala Gly Tyr Pro Leu Val Asn Val Lys Leu Thr Leu Leu Asp
35 40 45
Gly Ala Tyr His Glu Val Asp Ser Ser Glu Met Ala Phe Lys Val Ala
50 55 60
Gly Ser Gln Val Ile
65
〈210〉 185
〈211〉 898
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (637)...(637)
〈221〉 unsure
〈222〉 (662)...(662)
〈400〉 185
cgacctccac ccgggcgtga ggccaaccac taggctggtc accagtagtc gacggcacac 60
ttcaccgaaa aaatgaggac agaggagaca cccgtgacga tccgtgttgg tgtgaacggc 120
ttcggccgta tcggacgcaa cttcttccgc gcgctggacg cgcagaaggc cgaaggcaag 180
aacaaggaca tcgagatcgt cgcggtcaac gacctcaccg acaacgccac gctggcgcac 240
ctgctgaagt tcgactcgat cctgggccgg ctgccctacg acgtgagcct cgaaggcgag 300
gacaccatcg tcgtcggcag caccaagatc aaggcgctcg aggtcaagga aggcccggcg 360
gcgctgccct ggggcgacct gggcgtcgac gtcgtcgtcg agtccaccgg catcttcacc 420
aagcgcgaca aggcccaggg ccacctcgac gcgggcgcca agaaggtcat catctccgcg 480
ccggccaccg atgaggacat caccatcgtg ctcggcgtca acgacgacaa gtacgacggc 540
agccagaaca tcatctccaa cgcgtcgtgc accacgaact gcctcggccc gctggcgaag 600
gtcatcaacg acgagttcgg catcgtcaag ggcctgntga ccaccatcca cgcctacacc 660
cnggtccaga acctgcagga cggcccgcac aaggatctgc gccgggcccg cgccgccgcg 720
ctgaacatcg tgccgacctc caccggtgcc gccaaggcca tcggactggt gctgcccgag 780
ctgaagggca agctcgacgg ctacgcgctg cgggtgccga tccccaccgg ctcggtcacc 840
gacctgaccg ccgagctggg caagtcggcc accgtggacg agatcaacgc cgcgatga 898
〈210〉 186
〈211〉 268
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (182)...(182)
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (190)...(190)
〈400〉 186
Val Thr Ile Arg Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Asn
1 5 10 15
Phe Phe Arg Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Glu Gly Lys Asn Lys Asp
20 25 30
Ile Glu Ile Val Ala Val Asn Asp Leu Thr Asp Asn Ala Thr Leu Ala
35 40 45
His Leu Leu Lys Phe Asp Ser Ile Leu Gly Arg Leu Pro Tyr Asp Val
50 55 60
Ser Leu Glu Gly Glu Asp Thr Ile Val Val Gly Ser Thr Lys Ile Lys
65 70 75 80
Ala Leu Glu Val Lys Glu Gly Pro Ala Ala Leu Pro Trp Gly Asp Leu
85 90 95
Gly Val Asp Val Val Val Glu Ser Thr Gly Ile Phe Thr Lys Arg Asp
100 105 110
Lys Ala Gln Gly His Leu Asp Ala Gly Ala Lys Lys Val Ile Ile Ser
115 120 125
Ala Pro Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ile Val Leu Gly Val Asn Asp
130 135 140
Asp Lys Tyr Asp Gly Ser Gln Asn Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr
145 150 155 160
Thr Asn Cys Leu Gly Pro Leu Ala Lys Val Ile Asn Asp Glu Phe Gly
165 170 175
Ile Val Lys Gly Leu Xaa Thr Thr Ile His Ala Tyr Thr Xaa Val Gln
180 185 190
Asn Leu Gln Asp Gly Pro His Lys Asp Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala
195 200 205
Ala Leu Asn Ile Val Pro Thr Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Ile Gly
210 215 220
Leu Val Leu Pro Glu Leu Lys Gly Lys Leu Asp Gly Tyr Ala Leu Arg
225 230 235 240
Val Pro Ile Pro Thr Gly Ser Val Thr Asp Leu Thr Ala Glu Leu Gly
245 250 255
Lys Ser Ala Thr Val Asp Glu Ile Asn Ala Ala Met
260 265
〈210〉 187
〈211〉 41
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (39)...(39)
〈400〉 187
Met Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asp Val Leu Thr Glu Lys Leu Gly Ser
1 5 10 15
Asp Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ala Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile
20 25 30
Val Ala Ala Val Pro Lys Xaa Val Val
35 40
〈210〉 188
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈221〉 unsure
〈222〉 (12)...(12)
〈400〉 188
atgaayaarg cngarctsat ygaygt 26
〈210〉 189
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈400〉 189
atsgtrtgva cvacgttytc 20
〈210〉 190
〈211〉 84
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Made in a lab
〈221〉 unsure
〈222〉 (2)...(2)
〈400〉 190
gnactcattg acgtactcac tgagaagctg ggctcggatt gtcggcaagc gactgcggca 60
atggagaacg tggtccacac cata 84
〈210〉 191
〈211〉 337
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (2)...(2)
〈400〉 191
gnactcattg acgtactcac tgagaagctg ggctcggatt gtcggcaagc gactgcggcg 60
gtggagaatg ttgtcgacac catcgtgcgc gccgtgcaca agggtgagag cgtcaccatc 120
acgggcttcg gtgttttcga gcagcgtcgt cgcgcagcac gcgtggcacg caatccgcgc 180
accggcgaga ccgtgaaggt caagcccacc tcagtcccgg cattccgtcc cggcgctcag 240
ttcaaggctg ttgtctctgg cgcacagaag cttccggccg agggtccggc ggtcaagcgc 300
ggtgtgaccg cgacgagcac cgcccgcaag gcagcca 337
〈210〉 192
〈211〉 111
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (1)...(1)
〈400〉 192
Xaa Leu Ile Asp Val Leu Thr Glu Lys Leu Gly Ser Asp Arg Gln Ala
1 5 10 15
Thr Ala Ala Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile Val Arg Ala Val His
20 25 30
Lys Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Gly Phe Gly Val Phe Glu Gln Arg
35 40 45
Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg Thr Gly Glu Thr Val
50 55 60
Lys Val Lys Pro Thr Ser Val Pro Ala Phe Arg Pro Gly Ala Gln Phe
65 70 75 80
Lys Ala Val Val Ser Gly Ala Gln Lys Leu Pro Ala Glu Gly Pro Ala
85 90 95
Val Lys Arg Gly Val Thr Ala Thr Ser Thr Ala Arg Lys Ala Ala
100 105 110
〈210〉 193
〈211〉 1164
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 193
ggtggcgcgc atcgagaagc gcccgccccg gttcacgggc gcctgatcat ggtgcgggcg 60
gcgctgcgct acggcttcgg gacggcctca ctgctggccg gcgggttcgt gctgcgcgcc 120
ctgcagggca cgcctgccgc cctcggcgcg actccgggcg aggtcgcgcc ggtggcgcgc 180
cgctcgccga actaccgcga cggcaagttc gtcaacctgg agcccccgtc gggcatcacg 240
atggatcgcg acctgcagcg gatgctgttg cgcgatctgg ccaacgccgc atcccagggc 300
aagccgcccg gaccgatccc gctggccgag ccgccgaagg gggatcccac tcccgcgccg 360
gcggcggcca gctggtacgg ccattccagc gtgctgatcg aggtcgacgg ctaccgcgtg 420
ctggccgacc cggtgtggag caacagatgt tcgccctcac gggcggtcgg accgcagcgc 480
atgcacgacg tcccggtgcc gctggaggcg cttcccgccg tggacgcggt ggtgatcagc 540
cacgaccact acgaccacct cgacatcgac accatcgtcg cgttggcgca cacccagcgg 600
gccccgttcg tggtgccgtt gggcatcggc gcacacctgc gcaagtgggg cgtccccgag 660
gcgcggatcg tcgagttgga ctggcacgaa gcccaccgca tagacgacct gacgctggtc 720
tgcacccccg cccggcactt ctccggacgg ttgttctccc gcgactcgac gctgtgggcg 780
tcgtgggtgg tcaccggctc gtcgcacaag gcgttcttcg gtggcgacac cggatacacg 840
aagagcttcg ccgagatcgg cgacgagtac ggtccgttcg atctgaccct gctgccgatc 900
ggggcctacc atcccgcgtt cgccgacatc cacatgaacc ccgaggaggc ggtgcgcgcc 960
catctggacc tgaccgaggt ggacaacagc ctgatggtgc ccatccactg ggcgacattc 1020
cgcctcgccc cgcatccgtg gtccgagccc gccgaacgcc tgctgaccgc tgccgacgcc 1080
gagcgggtac gcctgaccgt gccgattccc ggtcagcggg tggacccgga gtcgacgttc 1140
gacccgtggt ggcggttctg aacc 1164
〈210〉 194
〈211〉 370
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 194
Met Val Arg Ala Ala Leu Arg Tyr Gly Phe Gly Thr Ala Ser Leu Leu
1 5 10 15
Ala Gly Gly Phe Val Leu Arg Ala Leu Gln Gly Thr Pro Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Ala Thr Pro Gly Glu Val Ala Pro Val Ala Arg Arg Ser Pro Asn
35 40 45
Tyr Arg Asp Gly Lys Phe Val Asn Leu Glu Pro Pro Ser Gly Ile Thr
50 55 60
Met Asp Arg Asp Leu Gln Arg Met Leu Leu Arg Asp Leu Ala Asn Ala
65 70 75 80
Ala Ser Gln Gly Lys Pro Pro Gly Pro Ile Pro Leu Ala Glu Pro Pro
85 90 95
Lys Gly Asp Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Gly His
100 105 110
Ser Ser Val Leu Ile Glu Val Asp Gly Tyr Arg Val Leu Ala Asp Pro
115 120 125
Val Trp Ser Asn Arg Cys Ser Pro Ser Arg Ala Val Gly Pro Gln Arg
130 135 140
Met His Asp Val Pro Val Pro Leu Glu Ala Leu Pro Ala Val Asp Ala
145 150 155 160
Val Val Ile Ser His Asp His Tyr Asp His Leu Asp Ile Asp Thr Ile
165 170 175
Val Ala Leu Ala His Thr Gln Arg Ala Pro Phe Val Val Pro Leu Gly
180 185 190
Ile Gly Ala His Leu Arg Lys Trp Gly Val Pro Glu Ala Arg Ile Val
195 200 205
Glu Leu Asp Trp His Glu Ala His Arg Ile Asp Asp Leu Thr Leu Val
210 215 220
Cys Thr Pro Ala Arg His Phe Ser Gly Arg Leu Phe Ser Arg Asp Ser
225 230 235 240
Thr Leu Trp Ala Ser Trp Val Val Thr Gly Ser Ser His Lys Ala Phe
245 250 255
Phe Gly Gly Asp Thr Gly Tyr Thr Lys Ser Phe Ala Glu Ile Gly Asp
260 265 270
Glu Tyr Gly Pro Phe Asp Leu Thr Leu Leu Pro Ile Gly Ala Tyr His
275 280 285
Pro Ala Phe Ala Asp Ile His Met Asn Pro Glu Glu Ala Val Arg Ala
290 295 300
His Leu Asp Leu Thr Glu Val Asp Asn Ser Leu Met Val Pro Ile His
305 310 315 320
Trp Ala Thr Phe Arg Leu Ala Pro His Pro Trp Ser Glu Pro Ala Glu
325 330 335
Arg Leu Leu Thr Ala Ala Asp Ala Glu Arg Val Arg Leu Thr Val Pro
340 345 350
Ile Pro Gly Gln Arg Val Asp Pro Glu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Trp
355 360 365
Arg Phe
370
〈210〉 195
〈211〉 650
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 195
gacacaccag caccactgtt aacctcgcta gatcagtcgg ccgaacggaa ggacagccgt 60
gaccctgaaa accctagtca ccagcatgac cgctggggca gcagcagccg caacactcgg 120
cgctgccgcc gtgggtgtga cctcgattgc cgtcggtgcg ggtgtcgccg gcgcgtcgcc 180
cgcggtgctg aacgcaccgc tgctttccgc ccctgccccc gatctgcagg gaccgctggt 240
ctccaccttg agcgcgctgt cgggcccggg ctccttcgcc ggcgccaagg ccacctacgt 300
ccagggcggt ctcggccgca tcgaggcccg ggtggccgac agcggataca gcaacgccgc 360
ggccaagggc tacttcccgc tgagcttcac cgtcgccggc atcgaccaga acggtccgat 420
cgtgaccgcc aacgtcaccg cggcggcccc gacgggcgcc gtggccaccc agccgctgac 480
gttcatcgcc gggccgagcc cgaccggatg gcagctgtcc aagcagtccg cactggccct 540
gatgtccgcg gtgggtgatc tcccgcacga ttctggtccg cagcgccgtc acatgtgtgg 600
cggcgctcgg gctgggtggg tgcctgggcg gctgcgcgca agatgaacat 650
〈210〉 196
〈211〉 159
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 196
Met Thr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Gly Ala Ala Ala Val
1 5 10 15
Gly Val Thr Ser Ile Ala Val Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Val Leu Asn Ala Pro Leu Leu Ser Ala Pro Ala Pro Asp Leu Gln
35 40 45
Gly Pro Leu Val Ser Thr Leu Ser Ala Leu Ser Gly Pro Gly Ser Phe
50 55 60
Ala Gly Ala Lys Ala Thr Tyr Val Gln Gly Gly Leu Gly Arg Ile Glu
65 70 75 80
Ala Arg Val Ala Asp Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Lys Gly Tyr
85 90 95
Phe Pro Leu Ser Phe Thr Val Ala Gly Ile Asp Gln Asn Gly Pro Ile
100 105 110
Val Thr Ala Asn Val Thr Ala Ala Ala Pro Thr Gly Ala Val Ala Thr
115 120 125
Gln Pro Leu Thr Phe Ile Ala Gly Pro Ser Pro Thr Gly Trp Gln Leu
130 135 140
Ser Lys Gln Ser Ala Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Ile Ala Ala
145 150 155
〈210〉 197
〈211〉 285
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 197
Met Gln Val Arg Arg Val Leu Gly Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Val
1 5 10 15
Ser Ala Ala Leu Trp Gln Thr Gly Val Ser Ile Pro Thr Ala Ser Ala
20 25 30
Asp Pro Cys Pro Asp Ile Glu Val Ile Phe Ala Arg Gly Thr Gly Ala
35 40 45
Glu Pro Gly Leu Gly Trp Val Gly Asp Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg
50 55 60
Pro Lys Val Gly Glu Gln Ser Val Gly Thr Tyr Ala Val Asn Tyr Pro
65 70 75 80
Ala Gly Phe Asp Phe Asp Lys Ser Ala Pro Met Gly Ala Ala Asp Ala
85 90 95
Ser Gly Arg Val Gln Trp Met Ala Asp Asn Cys Pro Asp Thr Lys Leu
100 105 110
Val Leu Gly Gly Met Ser Gln Gly Ala Gly Val Ile Asp Leu Ile Thr
115 120 125
Val Asp Pro Arg Pro Leu Gly Arg Phe Thr Pro Thr Pro Met Pro Pro
130 135 140
Arg Val Ala Asp His Val Ala Ala Val Val Val Phe Gly Asn Pro Leu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Arg Gly Gly Gly Pro Leu Pro Gln Met Ser Gly Thr Tyr
165 170 175
Gly Pro Lys Ser Ile Asp Leu Cys Ala Leu Asp Asp Pro Phe Cys Ser
180 185 190
Pro Gly Phe Asn Leu Pro Ala His Phe Ala Tyr Ala Asp Asn Gly Met
195 200 205
Val Glu Glu Ala Ala Asn Phe Ala Arg Leu Glu Pro Gly Gln Ser Val
210 215 220
Glu Leu Pro Glu Ala Pro Tyr Leu His Leu Phe Val Pro Arg Gly Glu
225 230 235 240
Val Thr Leu Glu Asp Ala Gly Pro Leu Arg Glu Gly Asp Ala Val Arg
245 250 255
Phe Thr Ala Ser Gly Gly Gln Arg Val Thr Ala Thr Ala Pro Ala Glu
260 265 270
Ile Leu Val Trp Glu Met His Ala Gly Leu Gly Ala Ala
275 280 285
〈210〉 198
〈211〉 743
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 198
ggatccgcgg caccggctgg tgacgaccaa gtacaacccg gcccgcacct ggacggccga 60
gaactccgtc ggcatcggcg gcgcgtacct gtgcatctac gggatggagg gccccggcgg 120
ctatcagttc gtcggccgca ccacccaggt gtggagtcgt taccgccaca cggcgccgtt 180
cgaacccgga agtccctggc tgctgcggtt tttcgaccga atttcgtggt atccggtgtc 240
ggccgaggag ctgctggaat tgcgagccga catggccgca ggccggggct cggtcgacat 300
caccgacggc gtgttctccc tcgccgagca cgaacggttc ctggccgaca acgccgacga 360
catcgccgcg ttccgttccc ggcaggcggc cgcgttctcc gccgagcgga ccgcgtgggc 420
ggccgccggc gagttcgacc gcgccgagaa agccgcgtcg aaggccaccg acgccgatac 480
cggggacctg gtgctctacg acggtgacga gcgggtcgac gctccgttcg cgtcgagcgt 540
gtggaaggtc gacgtcgccg tcggtgaccg ggtggtggcc ggacagccgt tgctggcgct 600
ggaggcgatg aagatggaga ccgtgctgcg cgccccggcc gacggggtgg tcacccagat 660
cctggtctcc gctgggcatc tcgtcgatcc cggcacccca ctggtcgtgg tcggcaccgg 720
agtgcgcgca tgagcgccgt cga 743
〈210〉 199
〈211〉 243
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 199
Asp Pro Arg His Arg Leu Val Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ala Arg Thr
1 5 10 15
Trp Thr Ala Glu Asn Ser Val Gly Ile Gly Gly Ala Tyr Leu Cys Ile
20 25 30
Tyr Gly Met Glu Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Phe Val Gly Arg Thr Thr
35 40 45
Gln Val Trp Ser Arg Tyr Arg His Thr Ala Pro Phe Glu Pro Gly Ser
50 55 60
Pro Trp Leu Leu Arg Phe Phe Asp Arg Ile Ser Trp Tyr Pro Val Ser
65 70 75 80
Ala Glu Glu Leu Leu Glu Leu Arg Ala Asp Met Ala Ala Gly Arg Gly
85 90 95
Ser Val Asp Ile Thr Asp Gly Val Phe Ser Leu Ala Glu His Glu Arg
100 105 110
Phe Leu Ala Asp Asn Ala Asp Asp Ile Ala Ala Phe Arg Ser Arg Gln
115 120 125
Ala Ala Ala Phe Ser Ala Glu Arg Thr Ala Trp Ala Ala Ala Gly Glu
130 135 140
Phe Asp Arg Ala Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ala Thr Asp Ala Asp Thr
145 150 155 160
Gly Asp Leu Val Leu Tyr Asp Gly Asp Glu Arg Val Asp Ala Pro Phe
165 170 175
Ala Ser Ser Val Trp Lys Val Asp Val Ala Val Gly Asp Arg Val Val
180 185 190
Ala Gly Gln Pro Leu Leu Ala Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Val
195 200 205
Leu Arg Ala Pro Ala Asp Gly Val Val Thr Gln Ile Leu Val Ser Ala
210 215 220
Gly His Leu Val Asp Pro Gly Thr Pro Leu Val Val Val Gly Thr Gly
225 230 235 240
Val Arg Ala
〈210〉 200
〈211〉 858
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 200
gaaatcccgc gtctgaaacc ctcttttcgc ggcgcccctc aggacggtaa gggggccaag 60
cggattgaaa aatgttcgct gaatgagcct gaaattgcgc gtggctcttg gaaatcagca 120
gcgatgggtt taccgtgtcc actagtcggt ccaaagagga ccactggttt tcggaggttt 180
tgcatgaaca aagcagagct catcgacgta ctcactgaga agctgggctc ggatcgtcgg 240
caagcgactg cggcggtgga gaacgttgtc gacaccatcg tgcgcgccgt gcacaagggt 300
gagagcgtca ccatcacggg cttcggtgtt ttcgagcagc gtcgtcgcgc agcacgcgtg 360
gcacgcaatc cgcgcaccgg cgagaccgtg aaggtcaagc ccacctcagt cccggcattc 420
cgtcccggcg ctcagttcaa ggctgttgtc tctggcgcac agaagcttcc ggccgagggt 480
ccggcggtca agcgcggtgt gaccgcgacg agcaccgccc gcaaggcagc caagaaggct 540
ccggccaaga aggctgccgc gaagaaggcc gcgccggcca agaaggctcc ggcgaagaag 600
gctgcgacca aggctgcacc ggccaagaag gccactgccg ccaagaaggc cgcgccggcc 660
aagaaggcca ctgccgccaa gaaggctgca ccggccaaga aggctccggc caagaaggct 720
gcgaccaagg ctgcaccggc caagaaggct ccggccaaga aggccgcgac caaggctgca 780
ccggccaaga aggctccggc cgccaagaag gcgcccgcca agaaggctcc ggccaagcgc 840
ggcggacgca agtaagtc 858
〈210〉 201
〈211〉 223
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 201
Met Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asp Val Leu Thr Glu Lys Leu Gly Ser
1 5 10 15
Asp Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ala Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile
20 25 30
Val Arg Ala Val His Lys Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Gly Phe Gly
35 40 45
Val Phe Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg
50 55 60
Thr Gly Glu Thr Val Lys Val Lys Pro Thr Ser Val Pro Ala Phe Arg
65 70 75 80
Pro Gly Ala Gln Phe Lys Ala Val Val Ser Gly Ala Gln Lys Leu Pro
85 90 95
Ala Glu Gly Pro Ala Val Lys Arg Gly Val Thr Ala Thr Ser Thr Ala
100 105 110
Arg Lys Ala Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Thr Lys Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Lys Lys Ala Thr Ala Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys
145 150 155 160
Lys Ala Thr Ala Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala
165 170 175
Lys Lys Ala Ala Thr Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys
180 185 190
Lys Ala Ala Thr Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Ala Lys
195 200 205
Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Arg Gly Gly Arg Lys
210 215 220
〈210〉 202
〈211〉 570
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 202
agacagacag tgatcgacga aaccctcttc catgccgagg agaagatgga gaaggccgtc 60
tcggtggcac ccgacgacct ggcgtcgatt cgtaccggcc gcgcgaaccc cggcatgttc 120
aaccggatca acatcgacta ctacggcgcc tccaccccga tcacgcagct gtccagcatc 180
aacgtgcccg aggcgcgcat ggtggtgatc aagccctacg aggcgagcca gctgcgcctc 240
atcgaggatg cgatccgcaa ctccgacctc ggcgtcaatc cgaccaacga cggcaacatc 300
atccgggtgt cgatcccgca gctcaccgag gagcgccgcc gcgacctggt caagcaggcc 360
aaggccaagg gcgaggacgc caaggtgtcg gtgcgcaaca tccgtcgcaa ggcgatggag 420
gaactctccc ggatcaagaa ggacggcgac gccggcgaag accaagtgac ccgcgccgag 480
aaggatctcg acaagagcac ccaccagtac acgaatcaga tcgacgaact ggtcaagcac 540
aaggaaggcg agttgctgga ggtctgacca 570
〈210〉 203
〈211〉 187
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (186)...(186)
〈400〉 203
Val Ile Asp Glu Thr Leu Phe His Ala Glu Glu Lys Met Glu Lys Ala
1 5 10 15
Val Ser Val Ala Pro Asp Asp Leu Ala Ser Ile Arg Thr Gly Arg Ala
20 25 30
Asn Pro Gly Met Phe Asn Arg Ile Asn Ile Asp Tyr Tyr Gly Ala Ser
35 40 45
Thr Pro Ile Thr Gln Leu Ser Ser Ile Asn Val Pro Glu Ala Arg Met
50 55 60
Val Val Ile Lys Pro Tyr Glu Ala Ser Gln Leu Arg Leu Ile Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ile Arg Asn Ser Asp Leu Gly Val Asn Pro Thr Asn Asp Gly Asn
85 90 95
Ile Ile Arg Val Ser Ile Pro Gln Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Asp
100 105 110
Leu Val Lys Gln Ala Lys Ala Lys Gly Glu Asp Ala Lys Val Ser Val
115 120 125
Arg Asn Ile Arg Arg Lys Ala Met Glu Glu Leu Ser Arg Ile Lys Lys
130 135 140
Asp Gly Asp Ala Gly Glu Asp Glu Val Thr Arg Ala Glu Lys Asp Leu
145 150 155 160
Asp Lys Ser Thr His Gln Tyr Thr Asn Gln Ile Asp Glu Leu Val Lys
165 170 175
His Lys Glu Gly Glu Leu Leu Glu Val Xaa Pro
180 185
〈210〉 204
〈211〉 1364
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 204
cgacctccac ccgggcgtga ggccaaccac taggctggtc accagtagtc gacggcacac 60
ttcaccgaaa aaatgaggac agaggagaca cccgtgacga tccgtgttgg tgtgaacggc 120
ttcggccgta tcggacgcaa cttcttccgc gcgctggacg cgcagaaggc cgaaggcaag 180
aacaaggaca tcgagatcgt cgcggtcaac gacctcaccg acaacgccac gctggcgcac 240
ctgctgaagt tcgactcgat cctgggccgg ctgccctacg acgtgagcct cgaaggcgag 300
gacaccatcg tcgtcggcag caccaagatc aaggcgctcg aggtcaagga aggcccggcg 360
gcgctgccct ggggcgacct gggcgtcgac gtcgtcgtcg agtccaccgg catcttcacc 420
aagcgcgaca aggcccaggg ccacctcgac gcgggcgcca agaaggtcat catctccgcg 480
ccggccaccg atgaggacat caccatcgtg ctcggcgtca acgacgacaa gtacgacggc 540
agccagaaca tcatctccaa cgcgtcgtgc accacgaact gcctcggccc gctggcgaag 600
gtcatcaacg acgagttcgg catcgtcaag ggcctgatga ccaccatcca cgcctacacc 660
caggtccaga acctgcagga cggcccgcac aaggatctgc gccgggcccg cgccgccgcg 720
ctgaacatcg tgccgacctc caccggtgcc gccaaggcca tcggactggt gctgcccgag 780
ctgaagggca agctcgacgg ctacgcgctg cgggtgccga tccccaccgg ctcggtcacc 840
gacctgaccg ccgagctggg caagtcggcc accgtggacg agatcaacgc cgcgatgaag 900
gctgcggccg agggcccgct caagggcatc ctcaagtact acgacgcccc gatcgtgtcc 960
agcgacatcg tcaccgatcc gcacagctcg atcttcgact cgggtctgac caaggtcatc 1020
gacaaccagg ccaaggtcgt gtcctggtac gacaacgagt ggggctactc caaccgcctc 1080
gtcgacctgg tcgccctggt cggcaagtcg ctgtaggggc gagcgaagcg acgggagaac 1140
agaggcgcca tggcgatcaa gtcactcgac gaccttctgt ccgaaggggt gacggggcgg 1200
ggcgtactcg tgcgctccga cctgaacgtc cccctcgacg gcgacacgat caccgacccg 1260
gggcgcatca tcgcctcggt gccgacgttg aaggcgttga gtgacgccgg cgccaaggtg 1320
gtcgtcaccg cgcatctggg caggcccaag ggtgagccgg atcc 1364
〈210〉 205
〈211〉 340
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 205
Val Thr Ile Arg Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Asn
1 5 10 15
Phe Phe Arg Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Glu Gly Lys Asn Lys Asp
20 25 30
Ile Glu Ile Val Ala Val Asn Asp Leu Thr Asp Asn Ala Thr Leu Ala
35 40 45
His Leu Leu Lys Phe Asp Ser Ile Leu Gly Arg Leu Pro Tyr Asp Val
50 55 60
Ser Leu Glu Gly Glu Asp Thr Ile Val Val Gly Ser Thr Lys Ile Lys
65 70 75 80
Ala Leu Glu Val Lys Glu Gly Pro Ala Ala Leu Pro Trp Gly Asp Leu
85 90 95
Gly Val Asp Val Val Val Glu Ser Thr Gly Ile Phe Thr Lys Arg Asp
100 105 110
Lys Ala Gln Gly His Leu Asp Ala Gly Ala Lys Lys Val Ile Ile Ser
115 120 125
Ala Pro Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ile Val Leu Gly Val Asn Asp
130 135 140
Asp Lys Tyr Asp Gly Ser Gln Asn Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr
145 150 155 160
Thr Asn Cys Leu Gly Pro Leu Ala Lys Val Ile Asn Asp Glu Phe Gly
165 170 175
Ile Val Lys Gly Leu Met Thr Thr Ile His Ala Tyr Thr Gln Val Gln
180 185 190
Asn Leu Gln Asp Gly Pro His Lys Asp Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala
195 200 205
Ala Leu Asn Ile Val Pro Thr Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Ile Gly
210 215 220
Leu Val Leu Pro Glu Leu Lys Gly Lys Leu Asp Gly Tyr Ala Leu Arg
225 230 235 240
Val Pro Ile Pro Thr Gly Ser Val Thr Asp Leu Thr Ala Glu Leu Gly
245 250 255
Lys Ser Ala Thr Val Asp Glu Ile Asn Ala Ala Met Lys Ala Ala Ala
260 265 270
Glu Gly Pro Leu Lys Gly Ile Leu Lys Tyr Tyr Asp Ala Pro Ile Val
275 280 285
Ser Ser Asp Ile Val Thr Asp Pro His Ser Ser Ile Phe Asp Ser Gly
290 295 300
Leu Thr Lys Val Ile Asp Asn Gln Ala Lys Val Val Ser Trp Tyr Asp
305 310 315 320
Asn Glu Trp Gly Tyr Ser Asn Arg Leu Val Asp Leu Val Ala Leu Val
325 330 335
Gly Lys Ser Leu
340
〈210〉 206
〈211〉 522
〈212〉 DNA
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 206
acctacgagt tcgagaacaa ggtcacgggc ggccgcatcc cgcgcgagta catcccgtcg 60
gtggatgccg gcgcgcagga cgccatgcag tacggcgtgc tggccggcta cccgctggtt 120
aacgtcaagc tgacgctgct cgacggtgcc taccacgaag tcgactcgtc ggaaatggca 180
ttcaaggttg ccggctccca ggtcatgaag aaggctgccg cccaggcgca gccggtgatc 240
ctggagccag tgatggcggt cgaggtcacg acgcccgagg attacatggg tgaagtgagc 300
ggcgacctga actcccgccg tggtcagatc caggccatgg aggagcggag cggtgctcgt 360
gtcgtgaagg cgcaggttcc gctgtcggag atgttcggct acgtcggaga ccttcggtcg 420
aagacccagg gccgggccaa ctactccatg gtgttcgact cgtacgccga agttccggcg 480
aacgtgtcga aggagatcat cgcgaaggcg acgggccagt aa 522
〈210〉 207
〈211〉 173
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 207
Thr Tyr Glu Phe Glu Asn Lys Val Thr Gly Gly Arg Ile Pro Arg Glu
1 5 10 15
Tyr Ile Pro Ser Val Asp Ala Gly Ala Gln Asp Ala Met Gln Tyr Gly
20 25 30
Val Leu Ala Gly Tyr Pro Leu Val Asn Val Lys Leu Thr Leu Leu Asp
35 40 45
Gly Ala Tyr His Glu Val Asp Ser Ser Glu Met Ala Phe Lys Val Ala
50 55 60
Gly Ser Gln Val Met Lys Lys Ala Ala Ala Gln Ala Gln Pro Val Ile
65 70 75 80
Leu Glu Pro Val Met Ala Val Glu Val Thr Thr Pro Glu Asp Tyr Met
85 90 95
Gly Glu Val Ile Gly Asp Leu Asn Ser Arg Arg Gly Gln Ile Gln Ala
100 105 110
Met Glu Glu Arg Ser Gly Ala Arg Val Val Lys Ala Gln Val Pro Leu
115 120 125
Ser Glu Met Phe Gly Tyr Val Gly Asp Leu Arg Ser Lys Thr Gln Gly
130 135 140
Arg Ala Asn Tyr Ser Met Val Phe Asp Ser Tyr Ala Glu Val Pro Ala
145 150 155 160
Asn Val Ser Lys Glu Ile Ile Ala Lys Ala Thr Gly Gln
165 170
〈210〉 208
〈211〉 12
〈212〉 PRT
〈213〉 Mycobacterium vaccae
〈400〉 208
Ala Leu Pro Gln Leu Thr Asp Glu Gln Arg Ala Ala
1 5 10

Claims (43)

  1. 분리된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 항원의 면역원성 영역으로 이루어지는 폴리펩티드에 있어서, 상기 항원은 SEQ ID NOS: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 분리된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 항원의 면역원성 영역으로 이루어지는 폴리펩티드에 있어서, 상기 항원은 다음에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
    (a) 컴퓨터 알고리즘 BLASTP로 측정하는 경우, SEQ ID NOS: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열과 50% 동일한 아미노산을 갖는 서열;
    (b) 컴퓨터 알고리즘 BLASTP로 측정하는 경우, SEQ ID NOS: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열과 75% 동일한 아미노산을 갖는 서열;
    (c) 컴퓨터 알고리즘 BLASTP로 측정하는 경우, SEQ ID NOS: 143, 145, 147, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165, 166, 170, 172, 174, 177, 178, 181, 182, 184, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 199, 201, 203, 205, 207에서 자세히 기술한 서열과 95% 동일한 아미노산을 갖는 서열.
  3. 분리된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 항원의 면역원성 영역으로 이루어지는 폴리펩티드에 있어서, 상기 항원은 다음에서 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
    (a) SEQ ID NOS: 142, 144, 146, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 164, 169, 171, 173, 175, 176, 179, 180, 183, 185, 191, 193, 195, 198, 200에서 자세히 기술한 서열;
    (b) SEQ ID NOS: 142, 144, 146, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 164, 169, 171, 173, 175, 176, 179, 180, 183, 185, 191, 193, 195, 198, 200에서 자세히 기술한 서열의 보체;
    (c) 컴퓨터 알고리즘 BLASTN로 측정하는 경우, (a) 또는 (b)의 서열과 99% 이상의 동일가능성을 갖는 서열.
  4. 제 1-3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코드한 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제 5항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  7. 제 6항에 있어서, 대장균(E.coli), 미코박테리아(Mycobacteria), 곤충, 효모, 포유동물 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 제 1-3항에 따른 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제 1-3항에 따른 폴리펩티드 및 생리학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  10. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 생리학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  11. 제 8항에 따른 융합 단백질 및 생리학적으로 수용가능한 담체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 제 1-3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 비-특이적 면역반응 증폭기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
  13. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 비-특이적 면역반응 증폭기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
  14. 제 8항에 따른 융합 단백질 및 비-특이적 면역반응 증폭기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
  15. 제 12-14항 어느 한 항에 있어서, 비-특이적 면역반응 증폭기는 항항원체인 것을 특징으로 하는 백신.
  16. 제 12-14항 어느 한 항에 있어서, 비-특이적 면역반응 증폭기는 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신:
    (a) 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포;
    (b) 불활화된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포;
    (c) 미코박테리움 바카이(M.vaccae)배양 여과물.
  17. 환자에서 면역반응을 강화하는 방법에 있어서, 제 9-11항 중 어느 한 항에 따른 제약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 환자에서 면역반응을 강화하는 방법에 있어서, 제 12-14항 중 어느 한 항에 따른 백신을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역반응은 Th1 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 환자에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제 9-11항 중 어느 한 항에 따른 제약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 환자에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제 12-14항 중 어느 한 항에 따른 백신을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 면역질환, 감염성 질환, 피부질환, 호흡기계통 질환에서 선택되는 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 23항에 있어서, 질환은 미코박테리아(Mycobacteria) 감염, 천식, 건선에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 환자에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 다음에서 선택되는 성분을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 지질 및 당지질 제거된 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포;
    (b) 미콜산이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포;
    (c) 미콜산과 아라비노갈락탄이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포;
    여기서, 상기 질환은 면역질환, 감염성 질환, 피부 질환, 호흡기계통 질환에서 선택된다.
  25. 제 24항에 있어서, 질환은 미코박테리아(Mycobacteria) 감염, 천식, 건선에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 항원에 대한 비-특이적 면역반응을 강화하는 방법에 있어서, 상기 방법은 폴리펩티드를 투여하는 것으로 이루어지고, 상기 폴리펩티드는 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 항원의 면역원성 영역으로 이루어지고, 이때, 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 항원에는 다음에서 선택되는 서열이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) SEQ ID NO: 89, 201에서 자세히 기술한 서열;
    (b) 컴퓨터 알고리즘 BLASTP로 측정하는 경우, SEQ ID NO: 89, 201에서 자세히 기술한 서열과 80% 이상 동일한 아미노산을 갖는 서열.
  27. 환자에서 미코박테리아(Mycobacteria) 감염을 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 하나 또는 복수의 폴리펩티드와 환자의 피부세포를 접촉시키고;
    (b) 환자의 피부에서 면역반응을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 면역반응은 경화성인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 다음과 같이 이루어지는 것을 특징으로 하는 진단키트:
    (a) 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드;
    (b) 환자의 피부세포와 폴리펩티드를 접촉시키기 위한 장치.
  30. 생물샘플에서 미코박테리아(Mycobacteria) 감염을 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 생물샘플을 접촉시키고;
    (b) 상기 샘플에서 상기 폴리펩티드와 결합하는 항체의 존재를 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 폴리펩티드는 고형 지지체에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 생물샘플은 전체혈액, 혈청, 혈장, 타액, 척수액, 소변에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 생물샘플에서 미코박테리아(Mycobacteria) 감염을 감지하는 방법에 있어서,
    (a) 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 결합할 수 있는 결합작용제와 생물샘플을 접촉시키고;
    (b) 상기 샘플에서 상기 결합작용제와 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드를 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 결합작용제는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 결합작용제는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 다음과 같이 이루어지는 것을 특징으로 하는 진단키트:
    (a) 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드;
    (b) 감지 시약.
  37. 제 36항에 있어서, 폴리펩티드는 고형 지지체상에 고착되는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 36항에 있어서, 감지 시약은 결합 작용제와 접합하는 리포트 작용기로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 38항에 있어서, 결합 작용제는 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A, 렉틴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 38항에 있어서, 리포트 작용기는 방사성동위원소, 형광 작용기, 냉광 작용기, 효소, 비오틴, 염료입자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  42. 제 1-3항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 결합하는 것을 특징으로 하는 다클론 항체.
  43. 항원에 대한 비-특이적 면역반응을 강화하는 방법에 있어서, 다음에서 선택된 성분을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 미콜산이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포;
    (b) 미콜산 및 아라비노갈락탄이 고갈된, 지질 및 당지질 제거 미코박테리움 바카이(M.vaccae) 세포.
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