JP2003502027A - パピローマウイルスｌ１タンパク質の細胞傷害性ｔ細胞エピトープ、並びに診断法および療法におけるその使用 - Google Patents

パピローマウイルスｌ１タンパク質の細胞傷害性ｔ細胞エピトープ、並びに診断法および療法におけるその使用

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JP2003502027A
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ヨホムス，イングリト
ニーラント，ヨン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アミノ酸配列、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、ＦＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮ、ＳＭＶＴＳＤＡＱＩを有するパピローマウイルスＴ細胞エピトープ、および／または機能的に活性であるその変異体、並びにまた、診断法および療法におけるその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、アミノ酸配列、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ、ＨＬＦ
ＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷＮＦＧＬ
、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭＴＹＩ、
ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、ＦＹＮＰＤ
ＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮ、Ｓ
ＭＶＴＳＤＡＱＩを有するパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ
、以下「乳頭腫ウイルス」ともいう）Ｔ細胞エピトープ、および／または機能的
に活性であるその変異体、並びにまた、診断法および療法におけるその使用に関
する。
【０００２】 いぼ（ｗａｒｔ）ウイルスとも称される、パピローマウイルスは、約８０００
塩基対のゲノムサイズおよび直径およそ５５ ｎｍの二十面体キャプシドを持つ
、二本鎖ＤＮＡウイルスである。現在まで、１００を越える、異なるヒト病原性
パピローマウイルス種（ＨＰＶ）が知られており、このうちいくつか、例えばＨ
ＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３９、ＨＰ
Ｖ−４５、ＨＰＶ−５２またはＨＰＶ−５８は、悪性腫瘍を引き起こす可能性が
あり、そして他のもの、例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１またはＨＰＶ−４２は
、良性腫瘍を引き起こす可能性がある。
【０００３】 パピローマウイルスゲノムは、３つの部分に分けることが可能であり；第一の
部分は、ウイルス転写および複製のための制御配列を含む、非コード領域に合致
する。第二の領域、「Ｅ」（初期）領域は、多様なタンパク質コード部分Ｅ１−
Ｅ７を含み、このうち例えばＥ６およびＥ７タンパク質は、上皮細胞の形質転換
に責任があり、そしてＥ１タンパク質はＤＮＡコピー数を調節する。Ｅ６および
Ｅ７領域は、悪性変性細胞でも発現される「癌遺伝子」である。第三の領域は、
Ｌ（後期）領域とも称され、２つのタンパク質コード部分Ｌ１およびＬ２を含み
、該部分は、ウイルスキャプシドの構造的構成要素をコードする。Ｌタンパク質
の９０％以上がウイルスキャプシドに存在し、Ｌ１：Ｌ２比は一般的に３０：１
である。本発明にしたがい、用語Ｌ１タンパク質は、パピローマウイルスの主な
キャプシドタンパク質を意味する（Ｂａｋｅｒ Ｔ．ら（１９９１）Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ｊ． ６０， １４４５）。
【０００４】 ５０％を超える場合で、ＨＰＶ−１６は、子宮頚癌（子宮頚の癌腫）に関連付
けられる。ＨＰＶ−１６は、子宮頚新生物の形成の主なリスク要因である。免疫
系は、該疾患の進行に重要な役割を果たす。したがって、細胞性免疫反応および
特に抗原特異的Ｔリンパ球は、防御機構におそらく重要である。高い悪性度分類
の悪性子宮頚上皮内新生物（ＣＩＮ ＩＩ／ＩＩＩ）および子宮頚腫瘍では、Ｅ
７遺伝子が、感染上皮のすべての層で、構成性に発現されることが、さらに見出
されてきている。したがって、Ｅ７タンパク質は特に、潜在的な腫瘍抗原および
活性化Ｔ細胞の標的分子とみなされる（例えば、ＷＯ ９３／２０８４４を参照
されたい）。しかし、患者中のＥ７誘導細胞性免疫反応は、疾患の経過に影響を
与えるには十分に強くないようである。免疫反応は、適切なワクチンにより、増
幅させることが可能である可能性がある。
【０００５】 Ｌ１遺伝子の発現および／またはＬ１およびＬ２遺伝子の同時発現は、キャプ
ソマー（ｃａｐｓｏｍｅｒ）、安定なキャプソマー、キャプシドまたはウイルス
様粒子（ＶＬＰ）の形成を導くことが可能であることを示すことが可能であった
（例えばＷＯ ９３／０２１８４、ＷＯ ９４／２０１３７またはＷＯ ９４／
０５７９２を参照されたい）。キャプソマーは５つのＬ１タンパク質で構成され
る、オリゴマー型配置を意味する。キャプソマーは基本的構築ブロックであり、
これがウイルスキャプシドを構成する。安定なキャプソマーは、集合してキャプ
シドを形成することが不可能なキャプソマーである。キャプシドは、例えば７２
キャプソマーで構成されるパピローマウイルスコートを意味する（Ｂａｋｅｒ
Ｔ．ら（１９９１）Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６０， １４４５）。ＶＬＰは、
形態学的にそしてその抗原性において、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ウイ
ルスに同一であるキャプシドを意味する。多様な動物系において、中和抗体の形
成により特徴付けられる体液性免疫反応を引き起こすのに、ＶＬＰを使用するこ
とが可能であった。しかし、ウイルス感染がすでに起こっている場合、抗体より
むしろ、ウイルス感染細胞の除去またはウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴ
Ｌ）反応が必要であるようであるため、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質に対
するウイルス中和抗体の形成は、臨床的に比較的重要性が低い。そして、ＶＬＰ
は、細胞傷害性Ｔ細胞反応を引き起こすことが可能であるが、もっぱらキャプシ
ドタンパク質Ｌ１および／またはＬ２に対して向けられる免疫反応は、パピロー
マウイルスにより引き起こされる腫瘍を調節するのに適していないようである。
【０００６】 したがって、キャプシドタンパク質Ｌ１および潜在的な腫瘍抗原Ｅ７の融合タ
ンパク質を含む、「キメラパピローマウイルス様粒子」（ＣＶＬＰ）（ＷＯ ９
６／１１２７２およびＭｕｌｌｅｒ， Ｍ．ら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
２３４， ９３）が開発されてきている。ＣＶＬＰは、Ｅ７タンパク質に対し
て向けられる体液性免疫反応を少ない度合いでしか引き起こさなかった（Ｍｕｌ
ｌｅｒ， Ｍ．ら（１９９７）、上記）。しかし、試験したいくつかのＣＶＬＰ
は、実際、マウスで望ましいＥ７特異的細胞傷害性Ｔ細胞反応を誘導する（Ｐｅ
ｎｇ Ｓ．ら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０， １４７−５７も参照さ
れたい）。したがって、クラスＩ ＭＨＣ分子を介して提示されるＥ７腫瘍細胞
ペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子に相当するであろうため、ＣＶＬＰは
、ワクチンの開発、並びにすでに確立された感染およびそこから生じる腫瘍の治
療両方のため、関心が持たれる。
【０００７】 ＣＶＬＰを含むワクチンは、ＣＶＬＰ偽感染（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｎｆｅｃｔｉ
ｎｇ）細胞の原理に基づく。これは、ＣＶＬＰおよびウイルスが、同様に細胞中
に進入し、そこでペプチドにプロセシングされ、そしてその後、該ペプチドがＭ
ＨＣクラスＩおよびＩＩ分子上に装填され、そして最後に、ＣＤ８またはＣＤ４
陽性Ｔ細胞に提示されることを意味する。本刺激の結果として、ＣＤ８細胞は細
胞傷害性Ｔ細胞に分化し、そしてその後、細胞性免疫反応を引き起こすことが可
能であり、一方、ＣＤ４細胞はＴヘルパー細胞に発展し、そしてＢ細胞を刺激し
、体液性免疫反応を生じ、またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激し、細胞傷害性免疫反
応を生じ、そしてそれ自体、感染細胞の溶解を引き起こすことが可能である。
【０００８】 小ペプチドは、すでに細胞表面上にあるＭＨＣクラスＩ分子に結合し、そして
その後、ＣＤ８またはＣＤ４陽性細胞をさらにプロセシングすることなく刺激し
、細胞性免疫反応を生じることが可能である。しかし、特定のペプチドは、特定
のＭＨＣ分子にしか結合されない可能性がある。したがって、天然集団では、Ｍ
ＨＣ分子の広い多型のため、特定のペプチドは、集団の少数部分によってのみ結
合され、そして提示される可能性がある。本発明にしたがい、提示は、ペプチド
またはタンパク質断片のＭＨＣ分子への結合を意味し、前記結合は、例えば、小
胞体、細胞外空間、エンドソーム、プロエンドソーム、リソソームまたはプロリ
ソソームで起こることが可能であり、そして前記ＭＨＣ分子−ペプチド複合体は
その後、細胞膜の細胞外側に結合し、したがって免疫細胞に特異的に認識される
ことが可能になる。
【０００９】 ＣＶＬＰは細胞性および体液性免疫反応を両方引き起こし、そしてＭＨＣ制限
でないため、本技術は、一般的に、ワクチン開発に適しており、これはＬ１部分
が粒子を形成する能力を提供し、そしてさらなる抗原部分が前記Ｌ１部分に融合
しているためである。
【００１０】 この種類のＣＶＬＰの開発のため、ＣＶＬＰの免疫原性を直接研究するのに用
いることが可能な、利用可能な機能的アッセイ系を有することが絶対的に必要で
ある。こうしたアッセイ系は、異なる抗原比率を持つＣＶＬＰを、同一アッセイ
系を用いることにより研究することが可能な特性を有するべきである。細胞性免
疫反応は、腫瘍またはウイルス疾患の免疫療法に非常に重要であるため、ＣＶＬ
Ｐにより引き起こされる細胞性免疫反応を測定することを可能にする目的が生じ
た。
【００１１】 本目的は、ＭＨＣ分子と、そして特定の態様において、ＨＬＡ Ａ２．０１
ＭＨＣ分子と関連し、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷
害性Ｔ細胞反応を引き起こすＴ細胞エピトープを同定することにより、達成され
た。前記ペプチドは、好ましくは、配列ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧ
Ｖ、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤ
ＷＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶ
ＭＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、
ＦＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡ
ＨＹＮ、ＳＭＶＴＳＤＡＱＩを有する。これらの配列は、ＨＰＶ１６のＬ１およ
びＥ７ペプチドの一部である。これらは、アミノ酸領域Ｌ１ ８６−９４（５１
０４）、Ｌ１ １２３−１３１（５１０６）、Ｌ１ ２８５−２９３（５１０７
）、Ｌ１ ２７５−２８３（５１０８）、Ｌ１ ２３８−２４６（５１０９）、
Ｌ１ ４２６−４３４（５１１２）、Ｌ１ ２８−３９（２０１６）、Ｌ１ ３
１１−３２０（２０１７）、Ｌ１ ４０８−４１７（２０１８）、Ｌ１ ３８−
４７（２０１９）、Ｌ１ ３９６−４０４（２０２０）、Ｌ１ ３４９−３５７
（２０２２）、Ｌ１ ２９８−３０６（２７／２８）、Ｌ１ ９０−９８（９）
、Ｅ７ １−９（４３）、Ｅ７ １８−２５（４５）およびＥ７ ４４−５３（
４７／４８）を含む。相当するエピトープの名称が括弧内に示される。
【００１２】 Ｅ７エピトープ４３、４５および４７／４８は、すでに、Ｋａｓｔら， （１
９９４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５２， ３９０４
−３９１２に潜在的なエピトープとして公表されてきている。しかし、本刊行物
は、前記ペプチドがＨＬＡ Ａ１分子に結合することが可能であることを示した
のみであり、細胞傷害性Ｔ細胞反応が実際に引き起こされることが可能であるか
どうか示していない。さらに、Ｔ細胞が該ペプチドをタンパク質の一部として認
識することを立証するデータは提供されない。というのは、ＨＬＡ分子へのペプ
チド結合はそれ自体、必ずしも、また、Ｔ細胞に認識されるわけではないことが
、何度も示されてきている。さらに、Ｔ細胞は、ペプチドを認識し、この認識は
、前記細胞においてＴ細胞反応を誘導するペプチドの能力により測定可能である
が、Ｔ細胞は、必ずしも、また、相当するペプチドを含む全タンパク質を装填さ
れている細胞を認識しない。これは、ペプチドが、しばしば、プロテアーゼ切断
部位を含み、ペプチドが細胞において全タンパク質のプロセシング中に該部位内
で切断され、そしてしたがって破壊され、そしてしたがってもはやＴ細胞により
検出されることが不可能であるという事実により、説明することが可能である。
この問題は、例えばＦｅｌｔｋａｍｐら（１９９３）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ． ２３：２２４２−２２４９に確認される。
【００１３】 本発明はしたがって、アミノ酸配列、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧ
Ｖ、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤ
ＷＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶ
ＭＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、
ＦＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡ
ＨＹＮ、ＳＭＶＴＳＤＡＱＩを有するＴ細胞エピトープ、および／または機能的
に活性であるその変異体に関する。
【００１４】 ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥ
ＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹ
Ｌ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、Ｙ
ＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、ＦＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴ
ＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮまたはＳＭＶＴＳＤＡＱＩの機
能的に活性である変異体は、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ系（例えば本発明の実施
例２−５を参照されたい）において、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ
、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷ
ＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭ
ＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、Ｆ
ＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨ
ＹＮまたはＳＭＶＴＳＤＡＱＩの細胞傷害性に比較し、陰性コントロールの平均
および標準偏差の３倍の総計に対応し、好ましくは、少なくともおよそ３０％で
あり、特に、少なくともおよそ５０％であり、そして特に好ましくは、少なくと
もおよそ８０％である細胞傷害性を有する、Ｔ細胞エピトープを意味する。
【００１５】 好ましい変異体の例は、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ、ＨＬＦＮ
ＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷＮＦＧＬ、
ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭＴＹＩ、Ｙ
ＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、ＦＹＮＰＤＴ
ＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮまたは
ＳＭＶＴＳＤＡＱＩに、アミノ酸レベルで、少なくともおよそ６５％、好ましく
は、少なくともおよそ７５％、そして特に、少なくともおよそ８５％の配列相同
性を有する、Ｔ細胞エピトープである。他の好ましい変異体はまた、ＩＬＶＰＫ
ＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、Ｔ
ＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳ
ＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦ
ＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、ＦＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴ
ＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮまたはＳＭＶＴＳＤＡＱＩに、構造的に相同
である、Ｔ細胞エピトープである。こうしたエピトープは、Ｔ細胞エピトープ、
ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱ
ＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ
、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤ
ＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、ＦＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬ
Ｈ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮまたはＳＭＶＴＳＤＡＱＩに対す
る特異的Ｔ細胞を生成し（ＤｅＢｒｕｉｊｎ Ｍ．Ｌ．ら（１９９１）Ｅｕｒ．
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１， ２９６３−７０；およびＤｅＢｒｕｉｊｎ
Ｍ．Ｌ．（１９９２）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２， ３０１３
−２０）、そして例えば、ペプチド特異的Ｔ細胞による認識のため選択された、
合成的に産生されたペプチドに関しアッセイすることにより、見出すことが可能
である（実施例を参照されたい）。Ｔ細胞エピトープは特に、細胞傷害性Ｔ細胞
エピトープを意味する。しかし、同様にＭＨＣ Ｉ分子を認識することが可能な
、非細胞傷害性Ｔ細胞もまた知られ、したがって、本発明はまた、変異体として
、非細胞傷害性Ｔ細胞エピトープも含む。
【００１６】 本発明の別の態様は、化合物の一部であるＴ細胞エピトープであり、該化合物
が、パピローマウイルスの天然発生Ｌ１タンパク質でなく、そしてパピローマウ
イルスの天然発生Ｌ１タンパク質の単独（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）Ｎ末端また
は単独Ｃ末端欠失突然変異体でない、前記エピトープである。
【００１７】 特定の態様において、アミノ酸配列ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ
、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷ
ＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭ
ＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶを有
するＴ細胞エピトープ、および／または機能的に活性であるその変異体は、異な
るパピローマウイルスのＬ１タンパク質中に、またはキメラＬ１タンパク質、例
えばＨＰＶ１８Ｌ１Ｅ７融合タンパク質中に含まれてもよい。本発明のこうした
化合物は、ＣＶＬＰを形成する能力を有する可能性がある。
【００１８】 化合物の一部として、前記Ｔ細胞エピトープは、好ましくは、さらなるアミノ
酸配列を含むポリペプチドであってもよく、そして特に、融合タンパク質であっ
てもよい。特に、該化合物は、長さ少なくともおよそ５０アミノ酸、好ましくは
、少なくともおよそ３５アミノ酸、特に、少なくともおよそ２０アミノ酸、そし
て特に好ましくは、少なくともおよそ９−１２アミノ酸のポリペプチドであって
もよい。
【００１９】 化合物を検出するため、またはそのＴ細胞結合活性を修飾するため、前記化合
物は、Ｔ細胞エピトープおよび／または前記融合タンパク質の化学的、放射性同
位体、非放射性同位体および／または蛍光標識を含んでもよい。
【００２０】 本発明にしたがった化学的標識に適した、当業者に知られる化学的物質の例は
：ビオチン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはストレプト
アビジンである。
【００２１】 可能な態様において、ペプチドは、少なくとも１つのリジンを含むよう修飾さ
れる。当業者に知られる方式で、ビオチンまたはＦＩＴＣ（フルオレセインイソ
チオシアネート）を前記リジンにカップリングする。本方式で修飾されたペプチ
ドを、適切なＭＨＣ分子に、または適切なＭＨＣ分子を含む細胞に結合させる。
ペプチドはその後、標識アビジンまたはストレプトアビジンを介して、あるいは
ＦＩＴＣ蛍光を介して直接、検出することが可能である。
【００２２】 本発明にしたがった放射性同位体標識に適した、当業者に知られる同位体の例
は：3Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、33Ｐまたは14Ｃである。 本発明にしたがった、非放射性同位体標識に適した、当業者に知られる同位体
の例は：2Ｈ、または13Ｃである。
【００２３】 本発明にしたがった蛍光標識に適した、当業者に知られる蛍光物質の例は：15 2 Ｅｕ、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、
フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（ｐｈｔａｌｄｅｈｙ
ｄｅ）またはフルオレスカミンである。
【００２４】 やはり本発明にしたがった標識に用いることが可能な、本明細書に列挙されて
いない、さらなる標識が、当業者に知られる。 当業者に知られる本発明の化学的修飾の例は、アセチル、リン酸および／また
は単糖基の転移である。
【００２５】 長さおよそ５０アミノ酸の本発明のポリペプチドは、例えば化学的ペプチド合
成により、調製することが可能である。より長いポリペプチドは、好ましくは遺
伝子操作により生成される。したがって、本発明はさらに、以下の構成要素：（
ａ）少なくとも１つの制御配列および（ｂ）本発明の化合物のアミノ酸配列をコ
ードする少なくとも１つの核酸を含む、前記Ｔ細胞エピトープまたは化合物を発
現するための核酸構築物に関する。前記核酸構築物は、好ましくはＤＮＡまたは
ＲＮＡで作成される。適切な制御配列は、例えば、真核細胞における構成性、制
御可能、組織特異的、細胞周期特異的、または代謝特異的発現、あるいは原核細
胞における構成性、代謝特異的、または制御可能発現を可能にする。本発明にし
たがった制御可能配列は、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、
サイレンサー、および／またはリプレッサー配列である。
【００２６】 真核生物における構成性発現を可能にする、適切な制御可能配列の例は、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩＩに認識されるプロモーターまたはウイルスプロモーター、
例えばＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およ
び例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶに由
来するウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列である。
【００２７】 真核生物における制御可能発現を可能にする制御可能要素の例は、対応するリ
プレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓｅｎ
Ｍ．ら（１９９４）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５，
５１６−２０）。
【００２８】 真核生物における組織特異的発現を可能にする制御可能要素の例は、特定の細
胞種中でのみ発現されるタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターまたはエ
ンハンサー由来のプロモーターまたはアクチベーター配列である。
【００２９】 真核生物における細胞周期特異的発現を可能にする制御可能要素の例は、以下
の遺伝子：ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ、Ｂ
−ｍｙｂまたはＤＨＦＲのプロモーターである（Ｚｗｉｃｋｅｒ Ｊ．およびＭ
ｕｌｌｅｒ Ｒ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １３， ３−６）
。
【００３０】 真核生物における代謝特異的発現を可能にする制御可能要素の例は、低酸素、
グルコース欠乏、リン酸濃縮または熱ショックにより制御されるプロモーターで
ある。
【００３１】 トランスフェクション、形質転換または感染により、前記核酸を導入し、そし
てしたがって真核または原核細胞においてポリペプチドを発現させることを可能
にするため、核酸は、プラスミドとして、あるいはウイルスまたは非ウイルスベ
クターの一部として存在してもよい。したがって、本発明はさらに、本発明のポ
リペプチドをコードする核酸を含むベクター、特に発現ベクターに関する。ここ
で特に適切なウイルスベクターは：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびヘルペスウイルスである。ここで特に
適切な非ウイルスベクターは：ビロソーム、リポソーム、陽イオン性脂質または
ポリリジン結合ＤＮＡである。
【００３２】 本発明はさらに、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、好ましくは提示
する細胞に関する。特定の態様において、細胞は、言及されるベクターの１つに
、トランスフェクション、形質転換され、または感染する。本細胞は、各場合に
用いられる制御可能配列の活性化を導く、当業者に知られる条件下で、本発明の
ポリペプチドを発現する。その後、例えば、上述の標識の１つを使用することに
より、該ポリペプチドを前記細胞から単離し、そして精製してもよい。遺伝子操
作およびそれに続く本発明の発現された化合物の精製による調製に適した細胞は
、原核および真核細胞、特に細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、酵母
細胞、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例え
ばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ
）細胞（Ｓｆ−９）またはトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎ
ｉ）細胞、あるいは哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞またはＨｅＬａ細胞である
。
【００３３】 特定の態様は、本発明のポリペプチドを発現する細胞自体を用い、そして特に
好ましい態様において、該細胞は、細胞表面上のＭＨＣ−１分子を介し、本発明
のポリペプチドの一部を提示する。本発明の細胞を調製するのに適した細胞は、
抗原提示細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞または他
のＨＬＡ Ａ２．０１陽性細胞であり、好ましい態様において、ＪＹ、Ｔ２、Ｃ
ａＳｋｉ細胞またはＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株である。Ｔ細胞エピトープを含むポ
リペプチドを提示する、本発明の細胞は、免疫細胞、特にＴ細胞を再刺激するた
めの、および／またはＴ細胞活性化を測定するための標的細胞として使用しても
よい。本発明にしたがい、標的細胞は、ＭＨＣ分子を介してＴ細胞エピトープを
提示し、そしてしたがって、Ｔ細胞活性化、特に該細胞に対する細胞傷害性Ｔ細
胞反応を特異的に引き起こす細胞を意味する。
【００３４】 さらに、Ｔ細胞エピトープ含有化合物は、該化合物が、共有的に、あるいは疎
水性相互作用、イオン結合または水素結合により、少なくとも１つのさらなる種
、例えばペプチド、タンパク質、ペプトイド、直線または分枝オリゴまたは多糖
および核酸に連結されることにより特徴づけられる複合体の一部であってもよい
。
【００３５】 したがって、本発明は、Ｔ細胞エピトープまたは化合物および少なくとも１つ
のさらなる化合物を含む複合体に関する。好ましい態様において、該ポリペプチ
ドは、ＭＨＣクラスＩ分子に、好ましくはＨＬＡ Ａ２．０１四量体としての該
分子に連結される。ヒトＭＨＣクラスＩ分子が特に好ましい。Ａｌｔｍａｎ Ｊ
．Ｄ．ら（１９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ９４−６）による技術を用
い、例えば、ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合することが
可能な、適切な結合されたペプチドを含むＨＬＡ Ａ２．０１四量体を調製する
ことが可能である。
【００３６】 別の態様は、本発明の化合物または前記複合体の支持体成分への固定である。
適切な支持体成分の例は、セラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチッ
ク、結晶成分、あるいは本支持体、特に前記成分の薄層、あるいは（バイオ）分
子フィラメント、例えばセルロースまたは構造タンパク質である。
【００３７】 本発明の複合体を精製するため、該複合体の構成要素はさらにまた、タンパク
質タグを含んでもよい。本発明のタンパク質タグは、例えばマトリックスに対す
る高親和性吸着、複合体の無視できる溶出を伴う、適切な緩衝液でのストリンジ
ェントな洗浄およびそれに続く吸着された複合体の特異的溶出を可能にする。当
業者に知られるタンパク質タグの例は、（ＨＩＳ）6タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡ
Ｇタグ、赤血球凝集素タグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、
キチン結合親和性を持つインテインタグまたはマルトース結合タンパク質（ＭＢ
Ｐ）タグである。本発明のタンパク質タグは、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内
部に位置してもよい。
【００３８】 本発明は、更に、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの化合物による
Ｔ細胞活性化の in vitro 検出方法に関する。この種類の方法は、好ましくは、
次の三つの工程を含む。
【００３９】 （ａ）第一工程において、細胞を、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一
つの化合物によって刺激する。この化合物は、Ｔ細胞エピトープを含有する少な
くとも一つの本発明の化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本
発明の複合体、少なくとも一つのキャプソメア、少なくとも一つの安定なキャプ
ソメア、少なくとも一つのＶＬＰ、少なくとも一つのＣＶＬＰおよび／または少
なくとも一つのウイルスであってよい。好ましい態様において、免疫細胞を、Ｃ
ＶＬＰと一緒のインキュベーションによって刺激する。この刺激は、例えば、ワ
クチン接種の形で、またはＣＶＬＰと一緒に免疫細胞を in vitro でインキュベ
ートすることによって行うことができる。この方法で刺激される免疫細胞は、例
えば、ワクチン接種後に、または腫瘍患者の場合、血液から、腫瘍からまたはリ
ンパ節から得られるおよび／または培養される。
【００４０】 （ｂ）第二工程において、細胞を、本発明の少なくとも一つのＴ細胞エピトー
プ、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の化合物、Ｔ細胞エピ
トープを提示する少なくとも一つの標的細胞とおよび／または本発明の少なくと
も一つの複合体と一緒にインキュベートする。
【００４１】 （ｃ）第三工程において、Ｔ細胞活性化を決定する。これに適した方法の例は
、Ｔ細胞によるサイトカイン産生または分泌、Ｔ細胞上の表面分子発現、標的細
胞溶解または細胞増殖の検出である。これに適した方法の例は、サイトカインア
ッセイ（cytokinassay）（Chapter 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immu
nology (1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., S
hevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Chapter
6.19 in Current Protocols in Immunology, 上記）、51Ｃｒ放出検定（Chapte
r 3.11 in Current Protocols in Immunology, 上記）または増殖の検出（Chapt
er 3.12 in Current Protocols in Immunology, 上記）である。用いられる方法
により、これに関して、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞
のような免疫細胞と他の細胞とを区別することも可能である。本発明の標識を含
有する、本発明の化合物、複合体、および／または細胞の使用は、標識された化
合物、複合体および／または細胞のＴ細胞への結合の検出によってＴ細胞エピト
ープを認識するＴ細胞の検出を可能にする。好ましい態様において、Ｔ細胞の表
面への本発明のＭＨＣ−ポリペプチド複合体の結合を検出する。これは、ＭＨＣ
複合体自体が標識される、例えば、蛍光標識されるように、または追加の工程に
おいて、ＭＨＣ特異的な標識された、例えば、蛍光標識された抗体が、ＭＨＣ複
合体を順次検出するために用いられるように行うことができる。次に、Ｔ細胞の
蛍光標識を、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で測定し且つ評価す
ることができる。Ｔ細胞への複合体の結合を検出するもう一つ可能な方法は、Ｔ
細胞活性化を再度測定することである（サイトカイン検定、Elispot、51Ｃｒ放
出検定、増殖、上を参照されたい）。しかしながら、これには、共受容体（例え
ば、ＣＤ２８）の、例えば、共受容体特異的抗体（抗ＣＤ２８）および／または
他の非特異的活性化因子（ＩＬ−２）による同時刺激が必要である。
【００４２】 本発明は、更に、工程（ａ）の後に導入される追加工程（ａ’）を含有する方
法に関する。 （ａ’）工程（ａ）に続くこの追加工程（ａ’）において、単離されるまたは
培養される細胞を、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明の化合物を負荷された少
なくとも一つの標的細胞、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明
の複合体、少なくとも一つのキャプソメア、少なくとも一つの安定なキャプソメ
ア、少なくとも一つのＶＬＰ、少なくとも一つのＣＶＬＰおよび／または少なく
とも一つのウイルスと一緒に、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本
発明の複合体、および／またはＴ細胞エピトープを提示する少なくとも一つの標
的細胞と一緒に、工程（ｂ）の前に少なくとも約８週間、具体的には、少なくと
も約１週間同時培養する。
【００４３】 同時培養とは、細胞を、 （ｉ）Ｔ細胞エピトープを含有する本発明の化合物を負荷された少なくとも一
つの標的細胞、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の複合体、
少なくとも一つのキャプソメア、少なくとも一つの安定なキャプソメア、少なく
とも一つのＶＬＰ、少なくとも一つのＣＶＬＰおよび／または少なくとも一つの
ウイルスの存在下において、 （ii）Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の複合体の存在下
において、 （iii）Ｔ細胞エピトープを提示する少なくとも一つの標的細胞の存在下にお
いて、 同一成長培地および同一組織培養容器中で成長させることを意味する。
【００４４】 本発明は、更に、Ｔ細胞エピトープを提示する標的細胞を製造する方法に関す
る。ここで、異なったＴ細胞エピトープの組合せを標的細胞に負荷することは可
能である。好ましい態様において、標的細胞を、Ｔ細胞エピトープを含有する少
なくとも一つの化合物および／またはＴ細胞エピトープを含有する少なくとも一
つの複合体と一緒にインキュベートする。特に好ましい態様において、標的細胞
を、本発明のポリペプチドを含有する成長培地中でまたは本発明の結合したポリ
ペプチドを含むＭＨＣクラスＩ複合体と一緒にインキュベートする。ＭＨＣクラ
スＩ複合体は、例えば、ＨＬＡ Ａ２．０１四量体として存在しうる。これに関
して、四量体は、通常は、４個のペプチドを結合している。これらは、同一であ
りうるし、またはそれ以外には、異なったペプチド種でありうる。更に好ましい
態様において、標的細胞を、核酸および／またはベクターを用いてトランスフェ
クションさせる、形質転換させるおよび／または感染させる。特に好ましい態様
では、標的細胞を、ワクシニアウイルスベクターを用いて感染させる。本発明の
方法は、抗原提示細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、胚性細胞
または線維芽細胞または他のＨＬＡ Ａ２．０１陽性細胞を用いて、そして好ま
しい態様では、ＪＹ、Ｔ２、ＣａＳｋｉ細胞またはＥＢＶで形質転換されたＢ細
胞系を用いて行われる。
【００４５】 用いられるＣＶＬＰは、乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質またはその変異型、特
に、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質および、必然的ではないが、Ｌ１に異種のタン
パク質またはその変異型を含有する。それら二つのタンパク質は、直接的にまた
は間接的に結合していてよい。本発明によれば、直接的に結合するとは、二つの
タンパク質が互いに、例えば、ペプチド結合またはジスルフィド結合によって共
有結合していることを意味する。間接的に結合するとは、それらタンパク質が、
非共有結合、例えば、疎水的相互作用、イオン結合または水素結合によって結合
していることを意味する。もう一つの態様において、ＣＶＬＰは、Ｌ１タンパク
質またはその変異型の他に、乳頭腫ウイルスＬ２タンパク質を含有する。
【００４６】 本発明のＬ１タンパク質の好ましい態様の例は、一つまたはそれ以上の欠失、
特に、Ｃ末端欠失を有するＬ１タンパク質である。Ｃ末端欠失は、Ｃ末端に位置
する核局在化シグナルが欠失しているので、ウイルス様粒子形成の効率を増加さ
せることが可能であるという利点を有する。したがって、Ｃ末端欠失は、好まし
くは、約３５個までのアミノ酸、具体的には、約２５個〜約３５個のアミノ酸、
特に、約３２個〜約３４個のアミノ酸である。例えば、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパ
ク質の３２アミノ酸長さＣ末端欠失は、ウイルス様粒子の形成を少なくとも約１
０倍増加させうるのに充分である。更に、Ｌ１タンパク質は、一つまたはそれ以
上の突然変異を有することがありうるし、またはＬ１部分は、種々の乳頭腫ウイ
ルスのＬ１タンパク質から構成されていてよい。本発明のＬ１タンパク質の共通
の特徴は、それらが、ＶＬＰまたはＣＶＬＰの形成を可能にするということおよ
びそれらが本発明の少なくとも一つのＴ細胞エピトープを含有するということで
ある。
【００４７】 好ましい態様において、Ｌ１タンパク質またはその変異型およびＬ１に異種の
タンパク質は、融合タンパク質である。複数の種々のタンパク質またはそれらの
一部分から構成される異種タンパク質も含まれる。これらは、例えば、タンパク
質のエピトープ、具体的には、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープでもありうる。これ
に関して、本発明によるエピトープは、約５０アミノ酸、好ましくは、少なくと
も約３５アミノ酸、具体的には、少なくとも約２０アミノ酸、特に好ましくは、
少なくとも約９アミノ酸長さの合成ポリペプチドの一部分であってもよい。
【００４８】 好ましくは、ウイルスタンパク質に由来する、例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶまたは
ＨＣＶ、好ましくは、乳頭腫ウイルス、詳しくは、ヒト乳頭腫ウイルスに由来す
る、Ｌ１に異種のタンパク質である。
【００４９】 好ましい態様において、そのウイルスタンパク質は、乳頭腫ウイルスＥタンパ
ク質、好ましくは、Ｅ６および／またはＥ７タンパク質である。Ｅタンパク質が
欠失Ｅタンパク質、好ましくは、Ｃ末端欠失、特には、Ｃ末端欠失Ｅ７タンパク
質である場合には、欠失Ｌ１タンパク質に関連するこれら構築物は、好ましくは
、ウイルス様粒子を形成しうるので、それは特に好適である。特に好ましいのは
、５５個までのアミノ酸、好ましくは、約５個〜約５５個のアミノ酸、特に、約
３８個〜約５５個のアミノ酸の欠失である。
【００５０】 もう一つの態様において、Ｌ１に異種のタンパク質は、非ウイルス病原体の抗
原に由来しうる。同様に、それらは、例えば、チログロブリン、ミエリン塩基性
タンパク質または透明帯糖タンパク質３（ＺＰ3）のような自己免疫抗原に由来
しうるが、これらは、例えば、甲状腺炎、多発性硬化症、卵巣炎または慢性関節
リウマチのような特定の自己免疫疾患に関係している。好ましい態様において、
Ｌ１に異種のタンパク質は、腫瘍抗原、好ましくは、ＭＡＲＴのような黒色腫抗
原、Ｈｅｒ２ ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２）、ＢＣＲＡ−１またはＣＡ１２５のよ
うな卵巣癌抗原、ＣＡ１２５のような結腸癌抗原、またはＨｅｒ２ ｎｅｕ（ｃ
−ｅｒｂＢ２）、ＢＣＲＡ−１、ＢＣＲＡ−２のような胸部癌抗原に由来する。
【００５１】 本発明は、更に、試料からの調製によって得られるＴ細胞の活性化の in vitr
o 検出方法に関する。この方法は、ある試料、例えば、患者の血液試料または腫
瘍患者の腫瘍若しくはリンパ節が、乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質特異的細胞傷
害性Ｔ細胞を含有しているかどうか決定することを可能にする。この種類の検出
方法は、次の行程を含む。
【００５２】 （ａ”）第一工程において、細胞を、例えば、患者から採血することによって
または例えば、腫瘍またはリンパ節の調製によって得る。次に、それら細胞を成
長培地中に取り、培養する。
【００５３】 （ｂ）第二工程において、細胞を、Ｔ細胞エピトープを提示する少なくとも一
つの標的細胞と一緒にまたはＴ細胞エピトープを含有する化合物を成分として含
む少なくとも一つの複合体と一緒にインキュベートする。
【００５４】 （ｃ）第三工程において、Ｔ細胞活性化を決定する。これに適した方法の例は
、Ｔ細胞によるサイトカイン産生または分泌、Ｔ細胞上の表面分子発現、標的細
胞溶解または細胞増殖の検出である。これに適した方法の例は、サイトカインア
ッセイ（Chapter 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), e
dited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. and
Strober W., John Wiley & Sons）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Chapter 6.19 in Current
Protocols in Immunology, 上記）、51Ｃｒ放出検定（Chapter 3.11 in Curren
t Protocols in Immunology, 上記）または増殖の検出（Chapter 3.12 in Curre
nt Protocols in Immunology, 上記）である。用いられる方法により、これに関
して、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞のような免疫細胞
と他の細胞とを区別することも可能である。本発明の標識を含有する、本発明の
化合物、複合体、および／または細胞の使用は、標識された化合物、複合体およ
び／または細胞のＴ細胞への結合の検出によってＴ細胞エピトープを認識するＴ
細胞の検出を可能にする。好ましい態様では、Ｔ細胞の表面への本発明のＭＨＣ
−ポリペプチド複合体の結合を検出する。これは、ＭＨＣ複合体自体が標識され
る、例えば、蛍光標識されるように、または追加の工程において、ＭＨＣ特異的
な標識された、例えば、蛍光標識された抗体が、ＭＨＣ複合体を順次検出するた
めに用いられるように行うことができる。次に、Ｔ細胞の蛍光標識を、例えば、
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で測定し且つ評価することができる。Ｔ細
胞への複合体の結合を検出するもう一つ可能な方法は、Ｔ細胞活性化を再度測定
することである（サイトカイン検定、Elispot、51Ｃｒ放出検定、増殖、上を参
照されたい）。しかしながら、これには、共受容体（例えば、ＣＤ２８）の、例
えば、共受容体特異的抗体（抗ＣＤ２８）および／または他の非特異的活性化因
子（ＩＬ−２）による同時刺激が必要である。
【００５５】 本発明は、更に、工程（ａ”）の後に導入される追加工程（ａ’）を含有する
方法に関する。 （ａ’）工程（ａ”）に続くこの追加工程（ａ’）において、単離されるまた
は培養される細胞を、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明の化合物を負荷された
少なくとも一つの標的細胞、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発
明の複合体、少なくとも一つのキャプソメア、少なくとも一つの安定なキャプソ
メア、少なくとも一つのＶＬＰ、少なくとも一つのＣＶＬＰおよび／または少な
くとも一つのウイルスと一緒に、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの
本発明の複合体、および／またはＴ細胞エピトープを提示する少なくとも一つの
標的細胞と一緒に、工程（ｂ）の前に少なくとも約８週間、具体的には、少なく
とも約１週間同時培養する。
【００５６】 同時培養とは、細胞を、 （ｉ）Ｔ細胞エピトープを含有する本発明の化合物を負荷された少なくとも一
つの標的細胞、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の複合体、
少なくとも一つのキャプソメア、少なくとも一つの安定なキャプソメア、少なく
とも一つのＶＬＰ、少なくとも一つのＣＶＬＰおよび／または少なくとも一つの
ウイルスの存在下において、 （ii）Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の複合体の存在下
において、 （iii）Ｔ細胞エピトープを提示する少なくとも一つの標的細胞の存在下にお
いて、 同一成長培地および同一組織培養容器中で成長させることを意味する。
【００５７】 本発明は、更に、Ｔ細胞の活性化の in vitro 検出のための検定システム（キ
ット）であって、 （ａ）少なくとも一つの本発明のＴ細胞エピトープ、少なくとも一つの本発明
の化合物、少なくとも一つの本発明のベクター、少なくとも一つの本発明の細胞
および／または少なくとも一つの本発明の複合体、および （ｂ）免疫系のエフェクター細胞、好ましくは、Ｔ細胞、具体的には、細胞傷
害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞 を含む検定システムに関する。
【００５８】 具体的な態様において、検定システムは、例えば、患者の血液試料中または腫
瘍患者の腫瘍若しくはリンパ節中に存在するＬ１タンパク質特異的細胞傷害性Ｔ
細胞を決定するのに用いられる。この場合、（ｂ）に記載の細胞は、検定システ
ム中に含有される対照細胞であり、第一キット成分である（ａ）に挙げられる物
質によるその活性化は、標準として役立つ。この反応で認められる活性化を、患
者から単離された細胞の、キット成分（ａ）によるＴ細胞活性化と比較する。
【００５９】 もう一つ具体的な態様において、検定システムは、例えば、Ｔ細胞エピトープ
を含有する化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する複合体、キャプソメア、安定な
キャプソメア、ＶＬＰ、ＣＶＬＰおよび／またはウイルスのＬ１タンパク質特異
的抗原性を決定するのに用いられる。この場合、（ａ）に記載の物質は、第二キ
ット成分である（ｂ）に挙げられる細胞への活性化作用が標準として役立つ対照
物質である。この反応で認められる活性化を、キット成分（ｂ）へのＴ細胞エピ
トープ含有化合物、Ｔ細胞エピトープを含む複合体、キャプソメア、安定なキャ
プソメア、ＶＬＰ、ＣＶＬＰおよび／またはウイルスの活性化作用と比較する。
【００６０】 本発明は、更に、免疫応答を引き起こすまたは検出するための、少なくとも一
つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の
化合物、Ｔ細胞エピトープ含有化合物をコードする核酸を含有する少なくとも一
つの本発明のベクター、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の
細胞、および／またはＴ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の複
合体の使用に関する。
【００６１】 in vitro の並びに in vivo の免疫細胞刺激に適した細胞は、具体的には、本
発明の分子の少なくとも一つを、それらのＭＨＣクラスＩ分子によって提示する
細胞である。抗原提示に適した細胞の例は、免疫細胞と一緒に培養されることに
よって特定のＴ細胞を刺激することができるＢ細胞、樹状細胞、マクロファージ
、線維芽細胞または他のＨＬＡ Ａ２．０１陽性細胞である。
【００６２】 具体的な態様において、免疫応答を検出するために、本発明の化合物、例えば
、本発明のＴ細胞エピトープを更に含有するＨＰＶ１８ Ｌ１Ｅ７融合タンパク
質を用いることは可能である。このような本発明の化合物は、ＣＶＬＰを形成す
る能力を有することがありうる。
【００６３】 本発明は、更に、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の化合
物、Ｔ細胞エピトープ含有化合物をコードする核酸を含有する少なくとも一つの
ベクター、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の細胞、および
／またはＴ細胞エピトープを含有する少なくとも一つの本発明の複合体、および
適宜、薬学的に許容しうる担体を含有する薬剤または診断薬に関する。
【００６４】 当業者に知られている担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改質セルロー
ス、ポリアクリルアミド、アガロース、水酸化アルミニウムまたは磁鉄鉱である
。
【００６５】 本発明の薬剤または診断薬は、溶液中に存在してよい、固体マトリックスに結
合していてよいおよび／またはアジュバントと混合されていてよい。 この薬剤または診断薬は、いろいろな方法で投与することができる。当業者に
知られている投与形式の例は、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内および／
または局所投与による非経口、限局性および／または全身性投与である。好適な
投与形式は、例えば、特定の乳頭腫ウイルス感染の自然の感染経路によって影響
される。投与される量は、患者の年齢、体重および全身の健康状態、および乳頭
腫ウイルス感染の種類に依る。この薬剤または診断薬は、カプセル剤、液剤、懸
濁剤、エリキシル剤（経口投与用）または滅菌液剤若しくは懸濁剤（非経口また
は鼻腔内投与用）の形で投与することができる。用いることができる不活性な且
つ免疫学的に許容しうる担体は、例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食
塩水である。薬剤は、治療的有効量で投与される。これらは、防御免疫応答を引
き起こすのに充分な量である。
【００６６】 具体的な態様において、本発明の化合物、例えば、本発明のＴ細胞エピトープ
を更に含有するＨＰＶ１８ Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を薬剤または診断薬として
用いることは可能である。このような本発明の化合物は、ＣＶＬＰを形成する能
力を有することがありうる。
【００６７】 図面および次の実施例は、本発明を制限することなく、より詳細に説明するた
めのものである。 実施例 １．出発物質の説明 ・ＨＰＶ１６ Ｌ１ΔC*Ｅ７1-55ＣＶＬＰの製造は、ドイツ特許出願ＤＥ１９
８１２９４１号にしたがって行われた。Mueller M.et al. (1997) Virology 234
,93-111 も参照されたい。
【００６８】 ・Ｌ１ ＶＬＰの製造は、Mueller M.et al. (1997) Virology 234,93-111 に
したがって行われた。 ・ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９９２として入手することができるＴ２細胞は、抗
原プロセッシングに関連した輸送においてある欠点を有し、これは、小胞体中へ
のＭＨＣ−１分子の負荷を止める。それにもかかわらず、細胞表面上に存在して
いる負荷されないＭＨＣ−１分子は、例えば、ペプチド含有培地中で細胞をイン
キュベートすることによって負荷することができるので、これら細胞は、抗原を
提示するのに極めて適している。
【００６９】 ・ＷＥＨＩ細胞は、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１４８として入手することができ
る。 ・ＰＢＭＣは、例えば、Rudolf M.P. et al. (1999), Biol.Chem. 380,335-40
にその単離が記載されている末梢血単核細胞を意味する。
【００７０】 ・ＢＬＣＬは、エプスタイン・バールウイルス（Dr.Andreas Kaufmann, Fried
rich-Schiller University, Jena, Germany から入手される）によって形質転換
されたＢ細胞系を意味する。
【００７１】 ・ＢＢ７．２は、α−ＨＬＡ Ａ２．０１特異的単クローン性マウス抗体（Ａ
ＴＣＣ ＨＢ−８２）を意味する。 ・α−ｈｕｍＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８の細胞外部分に対して向けられる単ク
ローン性マウス抗体を意味する。
【００７２】 ・α−ｈｕｍＣＤ３／ＰＥは、ヒトＣＤ３（ε）の細胞外部分に対して向けら
れ且つ蛍光マーカーフィコエリトリンを含有する単クローン性マウス抗体を意味
する（Medac, Hamburg, Germany）。
【００７３】 ・α−ｈｕｍＣＤ４／Cychrome は、ヒトＣＤ４の細胞外部分に対して向けら
れ且つ蛍光マーカー Cychromeを含有する単クローン性マウス抗体を意味する（
ＤＡＫＯ；Glostrup, Denmark）。
【００７４】 ・α−ｈｕｍγインターフェロン／ＦＩＴＣは、ヒトγインターフェロンに対
して向けられ且つ蛍光マーカーＦＩＴＣを含有する単クローン性ラット抗体を意
味する（Medac, Hamburg, Germany）。
【００７５】 ・α−ｈｕｍＣＤ８／ＰＥは、ヒトＣＤ８の細胞外部分に対して向けられ且つ
蛍光マーカーフィコエリトリンを含有する単クローン性マウス抗体を意味する（
Pharmingen, Heidelberg, Germany）。
【００７６】 ・インフルエンザＭＰは、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸
５８〜６６ＧＩＬＧＦＶＦＴＬを意味する（Dunbar P.R. et al. (1998) Curr.B
iol. 26,413-6 を参照されたい）。
【００７７】 ・ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドは、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質のアミノ酸
１１〜２０ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴを意味する。 ・Parker による http://www-bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla#bind/index.ht
ml のペプチド予想プログラムで行われる可能なＨＬＡ Ａ２．０１結合ペプチ
ドに関するアルゴリズムに基づいて（Parker,KC et al. (1994) J.Immunol. 152
:163）、下のペプチドを、ＨＰＶ１６Ｌ１の候補として識別し、合成した。具体
的なペプチドの一定のアミノ酸位置を、GenBank 受託番号ｋ０２７１８として寄
託されたＬ１配列のＭｅｔ（＋１）に関して示す（下の表１を参照されたい）。
【００７８】
【表１】
【００７９】 ・更に、どの場合にも９個のアミノ酸だけオーバーラップし且つＨＰＶ１６Ｌ
１およびＥ７タンパク質の配列を包含する２０マーペプチドを合成した。それら
ペプチドを、１〜５２まで逐次的に番号を付けた。それらの名称および配列を、
次の表に要約するが、ここにおいて、“ｒｅｓｔｒ．”は制限される意味である
。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】 ・ゴルジプラグ（Golgi Plug）は、Pharmingen（Hamburg, Germany）によって
入手可能である。 ・モネンシンは、Sigma（Deisenhofen, Germany）によって入手可能である。
【００８３】 ・ＩＬ−２は、Becton Dickinson（Hamburg, Germany）から入手した。 ・ＰＢＳ中のＭＴＴ溶液は、ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍｌの臭化３−［４，５−
ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムを意味す
る（Sigma, Deisenhofen, Germany）。
【００８４】 ・ＰＢＳは、リン酸緩衝化生理食塩水を意味し、１６．６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 、８．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４から成る。 ・細胞は、それぞれの場合に、１０％ウシ胎児血清、カナマイシンおよびアン
ピシリンを含むＲＰＭＩ培地（Gibco ＢＲＬ，Eggenstein; Germany）中におい
て３７℃および５％ＣＯ2で培養した。
【００８５】 ・Luma プレートおよび Canberra-Packerd Ｂプレートカウンターは、Canberr
a-Packerd, Dreieich, Germany から入手した。 ・ＦＡＣＳｃａｎカリバー（calibur）は、蛍光活性化セルソーターを意味し
；その装置は、Becton Dickenson（Hamburg, Germany）から入手した。
【００８６】 ・Cellquest ソフトウェアは、Becton Dickinson（Hamburg, Germany）から入
手した。 ２．ＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞によるペプチド特異的ＴＮＦα分泌 （ａ）ＣＶＬＰ特異的Ｔ細胞の調製 ＨＬＡ Ａ２．０１陽性ドナーのヒトＴ細胞（４ｘ１０5個）を、ＨＰＶ１６
Ｌ１ΔC*Ｅ７1-55ＣＶＬＰを用いて、１μｇ／ｍｌ ＣＶＬＰ、１０5個の照
射された末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）および１０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を週１回
加えながら３７℃で８週間刺激し、そして採取した。
【００８７】 （ｂ）抗原を用いた刺激 それら細胞を、１００μｌの培地中、１０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２の存在下にお
いて種々の抗原（各１０μｇ／ｍｌのＰＭＢＣ＋Ｅ７ペプチド；ＰＭＢＣ＋ＨＰ
Ｖ１６ Ｌ１ΔC*Ｅ７1-55（ＣＶＬＰ）；ＰＭＢＣ＋５１０４、５１０５、５１
０６、５１０７、５１０８、５１０９、５１１２、５１１３）を用いて３７℃で
一晩刺激した。この時間中に、刺激される細胞はＴＮＦαを産生する。
【００８８】 （ｃ）ＴＮＦαの検出 翌日、５０μｌの上澄みを取り出し、凍結させ、再融解させ（一緒に取り出さ
れるかもしれない細胞を破壊するために）、そして０．９ｘ１０6個のＷＥＨＩ
細胞、２μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤおよび４００ｍＭ ＬｉＣｌを含有する
５０μｌの細胞懸濁液に加えた。それら細胞を３７℃で２４時間インキュベート
した。この時間中に、ＴＮＦα（上澄み中に存在する場合）は、ＷＥＨＩ細胞の
アポトーシスを引き起こす。ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液５０μｌの
添加は、非アポトーシス細胞を３時間以内に褐色に染色したが、アポトーシス細
胞は黄色のままであった。細胞は全て、１００μｌの溶解緩衝液（３４％ Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド，２０％ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、３７℃で
少なくとも６時間インキュベートすることによって溶解し、その結果、色素が放
出された。最後に、溶液の吸収を５９５ｎｍで測定した。
【００８９】 図１は、いろいろな抗原の関数として５９５ｎｍで測定される吸収を示す。低
吸収は、低色素産生を意味し、したがって、対応するＴ細胞が刺激されたために
多数のＴＮＦαに暴露された多数のアポトーシス細胞を意味する。したがって、
Ｔ細胞刺激は、５９５ｎｍでの吸収が減少すると共に増大した。
【００９０】 結果：ペプチド５１０４、５１０６、５１０７、５１０８、５１０９および５
１１２は、ＣＶＬＰ特異的Ｔ細胞を刺激することが可能であった。 ３．Ｔ２細胞へのペプチドの結合 （ａ）Ｔ２細胞の負荷 ＨＬＡ Ａ２．０１陽性ドナーの２．５ｘ１０6個のＴ２細胞を、２％ヒト血
清を含有する培地中において、０、１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの５
１０５、５１０６、５１０７、５１０９、５１１２、５１１３、インフルエンザ
ＭＰ、２０１６、２０１７、２０１８、２０１９、２０２０、２０２１、２０２
２、２０２３、２０２４、２０２５ペプチドの存在下の３７℃で一晩インキュベ
ートした。この時間中に、適合するペプチドは、非生理学的に空のＭＨＣ−１分
子に結合することによってそれら分子を安定化させることができるが、適合する
ペプチドを含まないＭＨＣ−１分子は、比較的速やかに細胞中に再吸収される。
したがって、特異的に結合するペプチドは、細胞表面上のＭＨＣ−１分子の数を
増加させる。
【００９１】 （ｂ）Ｔ２細胞のＭＨＣ−１複合体へのペプチド結合の検出 翌朝、細胞を採取し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢ
Ｓを用いて洗浄し、そしてＭＨＣ−１分子を検出した。これは、抗体ＢＢ７．２
と一緒に氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、α−マウスＦＩＴＣ抗体を
用いて氷上で更に３０分間染色することによって行われる。それら細胞を再度洗
浄し、ＦＡＣＳｃａｎカリバー中で測定し、Cellquest ソフトウェアを用いて分
析した。
【００９２】 図２は、いろいろなペプチドの関数として測定される蛍光を示す。 結果：Ｌ１ペプチド５１０６、５１０７、５１０９、５１１２、２０１６、２
０１７、２０１８、２０１９、２０２０および２０２２とのインキュベーション
後のＴ２細胞は、既知のインフルエンザペプチドＭＰとのインキュベーション後
と同様、細胞表面上に有意に多いＭＨＣ分子を示し、ＭＨＣ分子への対応するペ
プチドの結合が示される。
【００９３】 ４．種々の抗原提示細胞を用いたＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞の再刺激 ＨＬＡ Ａ２．０１陽性ドナーのヒトＴ細胞（４ｘ１０5個）を、ＨＰＶ１６
Ｌ１ΔC*Ｅ７1-55ＣＶＬＰを用いて、１μｇ／ｍｌ ＣＶＬＰおよび１０5個
の抗原提示細胞（照射ＰＭＢＣ）を週１回加えながら３７℃で８週間刺激し、そ
して採取した。次に、それら細胞を、１００μｌの培地中において３７℃で、１
０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２および０．５μｇ／ｍｌ α−ヒトＣＤ２８の存在下で１
０μｇ／ｍｌの種々の抗原を用い、 （ａ）ＣＶＬＰと一晩インキュベートされるＰＢＭＣを用いて （ｂ）Ｌ１ ２０２２ペプチドと一晩インキュベートされるＰＢＭＣを用いて （ｃ）Ｌ１ ２０２５ペプチド（対照ペプチド）と一晩インキュベートされる
ＰＢＭＣを用いて再刺激した。
【００９４】 １時間後、１μｌのゴルジプラグを加えた。それら細胞を３７℃で更に５時間
インキュベートした。次に、細胞を固定し、透過性にし、そしてα−ｈｕｍＣＤ
３／ＰＥ、α−ｈｕｍＣＤ４／Cychrome およびα−ｈｕｍγインターフェロン
／ＦＩＴＣを用いて染色した。それら細胞を、それらの標識に関してＦＡＣＳｃ
ａｎカリバーで調べ、Cellquest ソフトウェアによってデータを分析した。
【００９５】 結果：図３は、ＣＶＬＰとインキュベートされるＰＢＭＣも、Ｌ１ペプチド２
０２２とインキュベートされるＰＢＭＣも、ＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞を再刺
激したが、対照ペプチドとインキュベートされるＰＢＭＣはしなかったことを示
す。
【００９６】 ５．種々の抗原提示細胞を用いたＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞の再刺激 ＨＬＡ Ａ１陽性ドナーのヒトＴ細胞（４ｘ１０5個）を、ＨＰＶ１６ Ｌ１
ΔC*Ｅ７1-55ＣＶＬＰを用いて、１μｇ／ｍｌ ＣＶＬＰおよび１０5個の抗原
提示細胞（照射ＰＭＢＣ）を週１回加えながら３７℃で５週間刺激し、そして採
取した。次に、それら細胞を、１００μｌの培地中において３７℃で、１０ＩＵ
／ｍｌ ＩＬ２の存在下、図４のＸ軸に沿って示される１０μｇ／ｍｌのペプチ
ドを用いて再刺激した。緩衝液だけを用いてインキュベートされる細胞は、負の
対照として役立った。
【００９７】 １時間後、１μｌのモネンシン（３００μＭ）を加えた。それら細胞を３７℃
で更に５時間インキュベートした。次に、細胞を固定し、透過性にし、そしてα
−ｈｕｍＣＤ８／ＰＥ、α−ｈｕｍＣＤ４／Cychrome およびα−ｈｕｍγイン
ターフェロン／ＦＩＴＣを用いて染色した。それら細胞を、それらの標識に関し
てＦＡＣＳｃａｎカリバーで調べ、Cellquest ソフトウェアによってデータを分
析した。
【００９８】 結果：図４は、ペプチド４３、４７および４８と一緒にインキュベートされる
ＰＢＭＣは、ＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞を再刺激したが、残りのペプチドとイ
ンキュベートされるＰＢＭＣはしなかったことを示す。ペプチド４３は、配列Ｍ
ＨＧＤＴＰＴＬＨの９マーペプチドを含有し、二つのオーバーラップするペプチ
ド４７および４８は、配列ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮの１０マーペプチドを含有し、
これらは、どの場合も、Kast et al.（上記）にＨＬＡ Ａ１結合ペプチドとし
て記載されているが、これらに関して、関数検出を行うことは、これまでのとこ
ろ不可能であった。
【００９９】 ６．種々の抗原提示細胞を用いたＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞の再刺激 非ＨＬＡに分類されるドナーのヒトＴ細胞（４ｘ１０5個）を、ＨＰＶ１６
Ｌ１ΔC*Ｅ７1-55ＣＶＬＰを用いて、１μｇ／ｍｌ ＣＶＬＰおよび１０5個の
抗原提示細胞（照射ＰＭＢＣ）を週１回加えながら３７℃で６週間刺激し、そし
て採取した。次に、それら細胞を、１００μｌの培地中において３７℃で、１０
ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２の存在下、図５のＸ軸に沿って示される１０μｇ／ｍｌのペ
プチドを用いて再刺激した。緩衝液だけを用いてインキュベートされる細胞は、
負の対照として役立った。
【０１００】 １時間後、１μｌのモネンシン（３００μＭ）を加えた。それら細胞を３７℃
で更に５時間インキュベートした。次に、細胞を固定し、透過性にし、そしてα
−ｈｕｍＣＤ８／ＰＥ、α−ｈｕｍＣＤ４／Cychrome およびα−ｈｕｍγイン
ターフェロン／ＦＩＴＣを用いて染色した。それら細胞を、それらの標識に関し
てＦＡＣＳｃａｎカリバーで調べ、Cellquest ソフトウェアによってデータを分
析した。
【０１０１】 結果：図５は、ペプチド２７および２８と一緒にインキュベートされるＰＢＭ
Ｃは、ＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞を再刺激したが、残りのペプチドとインキュ
ベートされるＰＢＭＣはしなかったことを示す。二つのオーバーラップするペプ
チド２７および２８は、配列ＳＭＶＴＳＤＡＱＩのペプチドを含有するので、実
際に認識されるペプチドは、本質的には、この配列を包含するはずである。
【０１０２】 ７．種々の抗原提示細胞を用いたＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞の再刺激 ＨＬＡ Ａ１陽性ドナーのヒトＴ細胞（４ｘ１０5個）を、ＨＰＶ１６ Ｌ１
ΔC*Ｅ７1-55ＣＶＬＰを用いて、１μｇ／ｍｌ ＣＶＬＰおよび１０5個の抗原
提示細胞（照射ＰＭＢＣ）を週１回加えながら３７℃で６週間刺激し、そして採
取した。
【０１０３】 ２０マーペプチド１〜５１を、行列によってペプチドプールＡ〜Ｈおよび１〜
７で組み合わせた。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】 次に、ＨＬＡ Ａ１陽性ドナーのそれらＴ細胞を、１００μｌの培地中の３７
℃で、１０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２の存在下においてそれらペプチドプールを用いて
再刺激した。これに関して、個々のペプチドそれぞれについて１μｇ／ｍｌを加
えるような量のペプチドプールを用いた。緩衝液だけを用いてインキュベートさ
れる細胞は、負の対照として役立った。
【０１０６】 １時間後、１μｌのゴルジプラグを加えた。それら細胞を３７℃で更に５時間
インキュベートした。次に、細胞を固定し、透過性にし、そしてα−ｈｕｍＣＤ
８／ＰＥ、α−ｈｕｍＣＤ４／Cychrome およびα−ｈｕｍγインターフェロン
／ＦＩＴＣを用いて染色した。それら細胞を、それらの標識に関してＦＡＣＳｃ
ａｎカリバーで調べ、Cellquest ソフトウェアによってデータを分析した。
【０１０７】 結果：図６は、ペプチドプールＥおよび６と一緒にインキュベートされるＰＢ
ＭＣは、ＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞を再刺激したが、残りのペプチドプールと
インキュベートされるＰＢＭＣはしなかったことを示す。ペプチドプールＥおよ
び６は両方とも、ペプチド４５を含有するので、これは、おそらく、ＣＶＬＰに
刺激されたＴ細胞の再刺激に関与している。ペプチド４５は、順に、ペプチドＥ
ＴＴＤＬＹＣＹを含有し、これは、Kast et al.（上記）によってＨＬＡ Ａ１
結合ペプチドとして記載されているが、これに関して、関数検出を行うことは、
これまでのところ不可能であった。
【０１０８】 更に、ＨＬＡ Ａ２４陽性ドナーのＴ細胞を、上のペプチドプールを用いて再
刺激し、分析した。 結果：図７は、ペプチドプールＡおよび２と一緒にインキュベートされるＰＢ
ＭＣは、ＣＶＬＰに刺激されたＴ細胞を再刺激したが、残りのペプチドプールと
インキュベートされるＰＢＭＣはしなかったことを示す。ペプチドプールＡおよ
び２は両方とも、ペプチド９を含有するので、これは、おそらく、ＣＶＬＰに刺
激されたＴ細胞の再刺激に関与している。Parker et al.（上記）による予想は
、配列ＦＹＮＰＤＴＱＲＬを有し、したがって、おそらくはペプチド９の活性に
関与するＨＬＡ Ａ２４に可能なペプチドを生じる。
【０１０９】 ８．ペプチド９を負荷されたＢＬＣＬ細胞の溶解 ＨＬＡ Ａ２４陽性ドナーのＢＬＣＬ細胞を、51Ｃｒと一緒に３７℃で１時間
インキュベートし、培地を用いて３回洗浄し、二つのアリコートに分けた。１０
μｇ／ｍｌのペプチド９を、一方の細胞アリコートに加え、もう一方のアリコー
トは、ペプチド不存在下に負の対照として役立てた。次に、それぞれの場合にお
いて、２０００個の細胞（＝標的細胞）を増加量のＴ細胞（＝エフェクター細胞
）に１５０μｌの全量で加えた。それらＴ細胞を、４３種類のペプチドの混合物
（ペプチド１〜４３，各１μｇ／ｍｌ）を用いて５週間にわたって予め刺激した
。自然のおよび最大の細胞溶解のための反応混合物を平行して設定した。自然の
溶解には、培地中でインキュベートされた標的細胞を用い、最大溶解には、０．
５％トリトンを用いてインキュベートされた標的細胞を用いた。それら混合物を
３７℃で５時間インキュベートした。５０μｌの混合物上澄みを、Luma プレー
トに入れ、室温で一晩乾燥させた。翌朝、放射性51Ｃｒの量を、Canberra-Packe
rd Ｂプレートカウンターによって測定し（計数）、トリトン混合物の最大溶解
細胞と比較した。特異的溶解百分率を、次の式にしたがって決定した。
【０１１０】 ｘ＝１００・（計数−自然計数）／（最大計数−自然計数） 図８は、ペプチド９を負荷されたＢＬＣＬ細胞をＴ細胞が効率よく溶解するこ
とは可能であったが、負荷されていないＢＬＣＬ細胞を溶解することはできなか
ったことを示す。したがって、ペプチド９は、ＨＬＡ Ａ２４に制限される細胞
傷害性Ｔ細胞エピトープである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、いろいろな抗原提示末梢血リンパ球（ＰＢＬ）によって順に刺激され
たＴ細胞の上澄みと一緒にインキュベートされたＷＥＨＩ細胞溶解産物の５９５
ｎｍでの吸収として測定されるＭＴＴ染色の図式分析を示す。特異的抗原提示Ｐ
ＢＬによって刺激されたＴ細胞は、ＴＮＦαを放出する。これは、ＷＥＨＩ細胞
のアポトーシスを引き起こすので、これら細胞はもはや、ＭＴＴを処理して帯褐
色色素にすることができない。低吸収は、低色素産生を意味し、したがって、対
応するＴ細胞が刺激されたために多数のＴＮＦαに暴露された多数のアポトーシ
ス細胞を意味する。したがって、Ｔ細胞の刺激は、特定の抗原に関して５９５ｎ
ｍでの吸収が減少すると共に増大する。
【図２】 図２は、細胞表面上に位置するＭＨＣ−１分子がＦＩＴＣ標識抗体を用いて標
識されたＴ２細胞の、ＦＡＣＳ分析で測定される蛍光の図式分析を示す。Ｘ軸上
に示されるペプチドをＭＨＣ−１分子が特異的に結合することができる細胞は、
それらＭＨＣ複合体が細胞表面上に蓄積しうるように特異的結合がそれら複合体
を安定化させるので、増加した多数のＭＨＣ−１分子を有する。
【図３】 図３は、異なった抗原を提示する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いてＣＶＬ
Ｐ特異的ヒトＴ細胞を再刺激後の３回のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析を示す。各実
験についてのＴ細胞特異的ＣＤ３の含量を左から右へ示し、活性細胞に特異的で
あるヒトγインターフェロンの含量を下から上へ示す。
【図４】 図４は、異なった抗原を提示する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いてＨＬＡ
Ａ１陽性ドナーの特異的ヒトＴ細胞を再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析を
示す。ＰＢＭＣに負荷された具体的なペプチドの名称を、左から右へ示す。“な
し”は、緩衝液だけを用いてインキュベートされたＰＢＭＣである。Ｙ軸は、γ
インターフェロン発現に基づいてＦＡＣＳｃａｎ実験で反応性と分類されたＣＤ
８陽性Ｔ細胞の比率を示す。
【図５】 図５は、異なった抗原を提示する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、非Ｈ
ＬＡと分類されたドナーの特異的ヒトＴ細胞を再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の
分析を示す。ＰＢＭＣに負荷された具体的なペプチドの名称を、左から右へ示す
。“なし”は、緩衝液だけを用いてインキュベートされたＰＢＭＣである。Ｙ軸
は、γインターフェロン発現に基づいてＦＡＣＳｃａｎ実験で反応性と分類され
たＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率を示す。
【図６】 図６は、異なった抗原を提示する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いてＨＬＡ
Ａ１陽性ドナーの特異的ヒトＴ細胞を再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析を
示す。ＰＢＭＣに負荷された具体的なペプチドプールの名称を、左から右へ示す
。“なし”は、緩衝液だけを用いてインキュベートされたＰＢＭＣである。Ｙ軸
は、γインターフェロン発現に基づいてＦＡＣＳｃａｎ実験で反応性と分類され
たＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率を示す。
【図７】 図７は、異なった抗原を提示する末梢血単核細胞（ＢＬＣＬ）を用いてＨＬＡ
Ａ２４陽性ドナーの特異的ヒトＴ細胞を再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析
を示す。ＢＬＣＬに負荷された具体的なペプチドプールの名称を、左から右へ示
す。“なし”は、緩衝液だけを用いてインキュベートされたＢＬＣＬである。Ｙ
軸は、γインターフェロン発現に基づいてＦＡＣＳｃａｎ実験で反応性と分類さ
れたＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率を示す。
【図８】 図８は、ペプチド９を用いてＨＬＡ Ａ２４陽性ドナーのＢＬＣＬ細胞（＝標
的細胞）を負荷後の51Ｃｒ放出実験の分析を示す。それら標的細胞は、ペプチド
１−４３を用いて刺激されたＴ細胞（＝エフェクター細胞）によって溶解された
。Ｘ軸は、用いられたエフェクター細胞対用いられた標的細胞の比を示し、Ｙ軸
は、標的細胞からの51Ｃｒ放出によって決定される、特異的に溶解された標的細
胞の％を示す。それら％値は、実施例７に与えられる式によって計算された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/46 Ｃ０７Ｋ 14/025 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 31/12 Ｃ１２Ｎ 7/04 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/025 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 7/04 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 CA06 DA02 EA04 GA11 HA01 4B063 QA18 QQ08 QR48 QS31 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC20 BA02 CA46 4C076 AA12 BB01 BB13 BB15 BB25 CC35 EE56 FF31 4C084 AA02 AA07 AA22 BA01 BA22 BA23 DC50 MA17 NA14 ZB331 ZB332 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 MA02 NA14 ZB33 4H045 AA11 BA10 BA16 CA01 DA86 EA29 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ酸配列、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ
    、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷ
    ＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭ
    ＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、Ｆ
    ＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨ
    ＹＮ、ＳＭＶＴＳＤＡＱＩを有するＴ細胞エピトープ、および／または機能的に
    活性であるその変異体。
  2. 【請求項２】 前記変異体が、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ
    、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷ
    ＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭ
    ＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、Ｆ
    ＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨ
    ＹＮまたはＳＭＶＴＳＤＡＱＩに、アミノ酸レベルで、少なくともおよそ６５％
    、好ましくは、少なくともおよそ７５％、そして特に、少なくともおよそ８５％
    の配列相同性を有することで特徴付けられる、請求項１に記載のＴ細胞エピトー
    プ。
  3. 【請求項３】 前記変異体が、ＩＬＶＰＫＶＳＧＬ、ＲＬＶＷＡＣＶＧＶ
    、ＨＬＦＮＲＡＧＴＶ、ＹＬＲＲＥＱＭＦＶ、ＴＬＱＡＮＫＳＥＶ、ＩＬＥＤＷ
    ＮＦＧＬ、ＳＬＷＬＰＳＥＡＴＶＹＬ、ＮＬＡＳＳＮＹＦＰＴ、ＴＬＴＡＤＶＭ
    ＴＹＩ、ＹＬＰＰＶＰＶＳＫＶ、ＹＤＬＱＦＩＦＱＬ、ＩＣＷＧＮＱＬＦＶ、Ｆ
    ＹＮＰＤＴＱＲＬ、ＭＨＧＤＴＰＴＬＨ、ＥＴＴＤＬＹＣＹ、ＱＡＥＰＤＲＡＨ
    ＹＮまたはＳＭＶＴＳＤＡＱＩに、構造的に相同であることで特徴付けられる、
    請求項１に記載のＴ細胞エピトープ。
  4. 【請求項４】 Ｔ細胞エピトープが細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであるこ
    とで特徴付けられる、請求項１−３のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ。
  5. 【請求項５】 パピローマウイルスの天然発生Ｌ１タンパク質でなく、そ
    してパピローマウイルスの天然発生Ｌ１タンパク質の単独Ｎ末端または単独Ｃ末
    端欠失突然変異体でない、請求項１ないし４のいずれかに記載のＴ細胞エピトー
    プを含む化合物。
  6. 【請求項６】 化合物がポリペプチド、特に融合タンパク質であることで
    特徴付けられる、請求項５に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 化合物が、長さ少なくともおよそ５０アミノ酸、好ましく
    は、少なくともおよそ３５アミノ酸、特に、少なくともおよそ２０アミノ酸、そ
    して特に好ましくは、少なくともおよそ９−１３アミノ酸のポリペプチドである
    ことで特徴付けられる、請求項５または６に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 化合物が、Ｔ細胞エピトープおよび／または前記融合タン
    パク質の化学的、放射性、非放射性同位体、および／または蛍光標識、並びに／
    あるいはＴ細胞エピトープおよび／または融合タンパク質の化学的修飾を含むこ
    とで特徴付けられる、請求項５−７のいずれかに記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｔ細胞エピトープまたは請求項５−８のいずれかに記載の
    Ｔ細胞エピトープを含む化合物をコードすることで特徴付けられる核酸。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の核酸を含むことで特徴付けられる、ベ
    クター、特に発現ベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項５−８のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細
    胞エピトープを含む、好ましくは提示することで特徴付けられる細胞。
  12. 【請求項１２】 細胞を、請求項９に記載の核酸および／または請求項１
    ０に記載のベクターでトランスフェクション、形質転換するおよび／または該核
    酸および／またはベクターに感染させることで特徴付けられる、請求項１１に記
    載の細胞。
  13. 【請求項１３】 細胞を、請求項５−８のいずれかに記載の少なくとも１
    つの化合物および／または請求項５−８のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを
    含む、請求項１５−１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体とインキュ
    ベーションしたことで特徴付けられる、請求項１１に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】 細胞がＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞
    、特に、ＪＹ、Ｔ２、ＣａＳｋｉ細胞またはＥＢＶ形質転換細胞であることで特
    徴付けられる、請求項１１または１２に記載の細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１−４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ、ま
    たは請求項５−８のいずれかに記載の化合物、および少なくとも１つのさらなる
    化合物を含む、複合体。
  16. 【請求項１６】 少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子を、好ましくはＨ
    ＬＡ Ａ２．０１四量体として含むことで特徴付けられる、請求項１５に記載の
    複合体。
  17. 【請求項１７】 前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ヒトＭＨＣクラスＩ分子、
    特にＨＬＡ Ａ２．０１分子であることで特徴付けられる、請求項１６に記載の
    複合体。
  18. 【請求項１８】 請求項１−４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを含
    む少なくとも１つの化合物によるＴ細胞活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出法であっ
    て、以下の工程： ａ）少なくとも１つの前記化合物を用いた細胞の刺激； ｂ）請求項１−４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープまたは請求項１５−１７
    のいずれかに記載の複合体を提示する、少なくとも１つの標的細胞の添加、およ
    び ｃ）Ｔ細胞活性化の決定 を含む、前記方法。
  19. 【請求項１９】 工程ａ）の後に、以下のさらなる工程ａ’）： ａ’）少なくともおよそ１週間、特に、少なくともおよそ８週間： （ｉ）請求項５−８のいずれかに記載の化合物、請求項１５−１７のいずれか
    に記載の少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソマー、少なくとも
    １つの安定なキャプソマー、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬ
    Ｐ、および／または少なくとも１つのウイルスを装填した少なくとも１つの標的
    細胞、 （ｉｉ）請求項１５−１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体、 （ｉｉｉ）および／または請求項１−４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ
    を提示する少なくとも１つの標的細胞 と、細胞の同時培養 を、工程ｂ）の前に含むことで特徴付けられる、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 標的細胞を、請求項５−８のいずれかに記載の少なくと
    も１つの化合物および／または請求項５−８のいずれかに記載のＴ細胞エピトー
    プを含む、請求項１５−１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体とイン
    キュベーションすることで特徴付けられる、請求項１１、１３、１４、１８また
    は１９のいずれかに記載の標的細胞の産生法。
  21. 【請求項２１】 標的細胞を、請求項９に記載の核酸および／または請求
    項１０に記載のベクターでトランスフェクション、形質転換するおよび／または
    該核酸および／または該ベクターに感染させることで特徴付けられる、請求項１
    １、１２、１４、１８または１９のいずれかに記載の標的細胞の産生法。
  22. 【請求項２２】 標的細胞がＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽
    細胞、特に、ＪＹ、Ｔ２、ＣａＳｋｉ細胞またはＥＢＶ形質転換細胞であること
    で特徴付けられる、請求項２０または２１に記載の標的細胞の産生法。
  23. 【請求項２３】 工程ａ）の代わりに、以下の工程ａ”）： ａ”）Ｔ細胞を含む試料の産生および調製、並びにそれに続く培養 を行うことで特徴付けられる、請求項１８または１９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ａ）請求項１−４のいずれかに記載の少なくとも１つの
    Ｔ細胞エピトープ、請求項５−８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物、
    請求項１０に記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１−１４のいずれかに
    記載の少なくとも１つの細胞、および／または請求項１５−１７のいずれかに記
    載の少なくとも１つの複合体、および ｂ）免疫系のエフェクター細胞、好ましくはＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞また
    はＴヘルパー細胞 を含む、Ｔ細胞活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出のためのアッセイ系。
  25. 【請求項２５】 免疫反応を引き起こすまたは検出するための、請求項１
    −４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５−８のい
    ずれかに記載の少なくとも１つの化合物、請求項１０に記載の少なくとも１つの
    ベクター、請求項１１−１４のいずれかに記載の少なくとも１つの細胞、および
    ／または請求項１５−１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体の使用。
  26. 【請求項２６】 請求項５−８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合
    物、請求項１０に記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１−１４のいずれ
    かに記載の少なくとも１つの細胞、および／または請求項１５−１７のいずれか
    に記載の少なくとも１つの複合体、並びに適切な場合、薬学的に許容しうるキャ
    リアーを含む、医薬品または診断剤。
  27. 【請求項２７】 請求項５−８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合
    物、請求項１０に記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１−１４のいずれ
    かに記載の少なくとも１つの細胞、および／または請求項１５−１７のいずれか
    に記載の少なくとも１つの複合体が、溶液中に、固体マトリックスに結合し、お
    よび／またはアジュバントと混合され、存在することで特徴付けられる、請求項
    ２６に記載の医薬品または診断剤。
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