EP1370661A2 - T-zellepitope des papillomavirus l1- und e7-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie - Google Patents

T-zellepitope des papillomavirus l1- und e7-proteins und ihre verwendung in diagnostik und therapie

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EP1370661A2
EP1370661A2 EP01998642A EP01998642A EP1370661A2 EP 1370661 A2 EP1370661 A2 EP 1370661A2 EP 01998642 A EP01998642 A EP 01998642A EP 01998642 A EP01998642 A EP 01998642A EP 1370661 A2 EP1370661 A2 EP 1370661A2
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EP
European Patent Office
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cells
cell
cell epitope
peptide
compound
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01998642A
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English (en)
French (fr)
Inventor
John Nieland
Andreas Kaufmann
Manuela Schinz
Angela Kather
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medigene AG
Original Assignee
Medigene AG
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1370661A2 publication Critical patent/EP1370661A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • T cell epitopes of the papillomavirus Ll and E7 proteins and their use in diagnostics and therapy
  • the present invention relates to a papilloma virus T-cell epitope having an amino acid sequence YLPPVPVSKWSTDEY ART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL, VGHPYFPIKKPNNNKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP, WACVGVEVGRGQPLGVGISG, QPLGVGISGHPLLNKLDDTE, QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA, DMVDTGFGAMDFTTLQANKS, VTVVDTTRSTNMSLCAAIST, TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL, IFQLCKITLTADVMTYIHSM, PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE, LKKYTFWEV LKEKFSADLD, PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH, YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGG
  • NNGVCWHNQLFVTVVDTTRS PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI, YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL, YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE, VDLLCHEQLSDSEEENDEID, SEEENDEIDGVNHQHLPARR, SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL, FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL, HGPKATLQDI, MHGPKATL or FQQLFLNTL
  • the papilloma viruses also called wart viruses, are double-stranded DNA viruses with a genome size of about 8000 base pairs and an icosahedral capsid with a diameter of approx. 55 nm.
  • HPV human pathogenic papilloma virus
  • the genome of the papillomaviruses can be divided into three areas:
  • the first area concerns a non-coding region that contains regulatory elements for the transcription and replication of the virus.
  • the second region so-called E (early) region, contains various protein-coding sections E1-E7, of which, for example, the E6 and E7 proteins are responsible for the transformation of epithelial cells and the E1 protein controls the DNA copy number.
  • the E6 and E7 regions are so-called oncogenes, which are also expressed in malignant cells.
  • the third region also known as the L (late) region, contains two protein-coding sections L1 and L2 which code for structural components of the virus capsid.
  • L1 protein is understood to mean the main capsid protein of the papillomaviruses (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
  • HPV-16 has been linked to cervical cancer (cervical cancer).
  • HPV-16 is the main risk factor for the formation of cervical neoplasia.
  • the immune system plays an important role in the progression of the disease. Cellular immune responses and, in particular, antigen-specific T-lymphocytes are presumably important for the defense mechanism.
  • the E7 gene is constitutive in highly malignant cervical intra-epithelial neoplasia (CIN II / III) and cervical tumors is expressed in all layers of the infected epithelium. Therefore, the E7 protein in particular is regarded as a potential tumor antigen and as a target molecule for activated T cells (see, for example, WO 93/20844).
  • the E7-induced cellular immune response in the patient does not appear to be strong enough to influence the course of the disease.
  • the immune response may be boosted by appropriate vaccines.
  • the expression of the Ll gene or the coexpression of the Ll and L2 gene can lead to the formation of capsomers, stable capsomers, capsids or virus-like particles (VLPs for virus-like particles) (see for example WO 93/02184, WO 94/20137 or WO 94/05792).
  • Capsomers are understood to be an oligomeric configuration that is made up of five Ll proteins.
  • the capsomer is the basic building block from which viral capsids are built.
  • Stable capsomers are capsomers that are not able to form capsids.
  • Capsids are understood to mean the shell of the papillomavirus, which is composed, for example, of 72 capsomers (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
  • VLP is a capsid that is morphologically and antigenically similar to an intact virus.
  • the VLPs could be used in various animal systems to elicit a humoral immune response, which is characterized by the formation of neutralizing antibodies.
  • the formation of virus-neutralizing antibodies against Ll and / or L2 protein is of less clinical importance if the viral infection has already taken place, since for the elimination of virus-infected cells no antibodies, but a virus-specific cytotoxic T cell - (CTL) response appears to be necessary.
  • CTL cytotoxic T cell -
  • CVLPs for chimeric virus-like particles
  • the CVLPs only triggered a minor humoral immune response against the E7 protein (Müller, M. et al. (1997), supra).
  • some of the CVLPs tested actually induce the desired E7-specific cytotoxic T cell response in mice (see also Peng S. et al. (1998) Virology 240, 147-57).
  • CVLPs are therefore This is of interest both for the development of a vaccine and for the treatment of already existing infections and resulting tumors, since the E7 peptides of tumor cells presented via MHC molecules of class I would represent target molecules of cytotoxic T cells.
  • a vaccine consisting of CVLPs is based on the principle of pseudo-infection of the cells by the CVLPs. This means that the CVLPs enter the cell like viruses, are processed there to form peptides, the peptides are then loaded onto MHC class I and II molecules and ultimately CD8 or CD4 positive T cells are presented.
  • CD8 cells can differentiate into cytotoxic T cells and then produce a cellular immune response
  • CD4 cells develop into T helper cells and stimulate B cells into a humoral or CD8 positive T cells into a cytotoxic immune response and can induce the lysis of infected cells themselves.
  • Small peptides can bind to MHC class I molecules already on the cell surface and then stimulate CD8 or CD4 positive cells to a cellular immune response without further processing.
  • a particular peptide can only be bound by certain MHC molecules. Due to the large polymorphism of the MHC molecules in natural populations, a certain peptide can therefore only be bound and presented by a small part of a population.
  • Presentation within the meaning of the present invention is understood to mean when a peptide or protein fragment binds to an MHC molecule, this binding taking place, for example, in the endoplasmic reticulum, in the extracellular space, the endosomes, proendosomes, lysosomes or protysosomes, and if then this MHC molecule-peptide complex is bound on the extracellular side of the cell membrane, so that it can be specifically recognized by immunoassays. Since CVLPs trigger both a cellular and humoral immune response and are not restricted to MHC, these particles are generally suitable for the development of vaccines, in that the ability to form particles is provided by an Ll component and an additional antigen component in this Ll component is merged.
  • CVLPs When developing such CVLPs, it is absolutely essential to have a functional test system available with which one can directly investigate the immunogenicity of CVLPs. Such a test system should have the property that CVLPs with different antigen contents can be examined with the same test system. Since the cellular immune response is of crucial importance for immunological therapy methods of tumors or viral diseases, the task was to make the cellular immune response caused by type 16 or 18 CVLPs measurable.
  • HPV-16 and HPV-18 T-cell epitopes which, in conjunction with MHC molecules, trigger a cytotoxic T-cell response in vivo and in vitro, for example.
  • the peptides according to the invention therefore have the sequence
  • T cells which recognize a peptide, measurable by the fact that they can be induced to give a T cell response by the peptide, do not necessarily also recognize cells which contain whole proteins - containing the corresponding peptide - were loaded. This can be explained by the fact that peptides often contain protease interfaces, within which the peptides are cut during the processing of the whole proteins in the cell and are therefore destroyed and thus can no longer be recognized by T cells. This problem is, for example, in Feltkamp et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249 confirmed.
  • the present invention therefore relates to a T cell epitope with an amino acid sequence
  • a functionally active variant of the T-cell epitope according to the invention is understood to mean a T-cell epitope which, in a T-cell cytotoxicity test system (see, for example, Examples 2-5 of the present invention), has an effect on the cytotoxicity of the T according to the invention
  • Cell epitope has measured cytotoxicity which corresponds at least to the sum of the mean of the negative controls and three times the standard deviation, preferably of at least approximately 30%, in particular at least approximately 50% and in a particularly preferred manner of at least approximately 80%.
  • a preferred variant is, for example, a T cell epitope with a sequence homology to the T cell epitopes according to the invention of at least approximately 65%, preferably at least approximately 15% and in particular at least approximately 85%) at the amino acid level.
  • Other preferred variants are also T cell epitopes which have a structural homology to the T cell epitopes according to the invention.
  • Such epitopes can be found by generating specific T cells against the T cell epitopes according to the invention (DeBruijn ML et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 2963-70; and DeBruijn ML (1992) Eur. J. Immunol.
  • T cell epitopes are understood to mean cytotoxic T cell epitopes or T helper cell epitopes (T H , T HI or T H2 ).
  • non-cytotoxic T cells are also known which can also recognize MHC I molecules, so that non-cytotoxic T cell epitopes are also included as a variant of the present invention.
  • Another embodiment of the present invention is a T cell epitope that is part of a compound, which compound is not a naturally occurring Ll protein of a papillomavirus and in the case of an HPV-16 T cell epitope is not an exclusively N-terminal or exclusively C-terminal deletion mutant of a naturally occurring Ll protein of a papillomavirus.
  • the compound can be a fusion of the same or different T cell epitopes according to the invention.
  • a T-cell epitope according to the invention and / or a functionally active variant can be contained in an L1 protein of another papillomavirus or in a chimeric L1 protein, for example an HPV18L1E7 or HPV16LlE7 fusion protein.
  • a compound of the invention may have the ability to form CVLPs.
  • the T cell epitope mentioned can preferably be part of a compound, a polypeptide which preferably contains further amino acid sequences, in particular a fusion protein.
  • the compound can be a polypeptide of at least approximately 50 amino acids, preferably of at least approximately 35 amino acids, in particular of at least approximately 20 amino acids, and in a particularly preferred manner of at least approximately 9-12 amino acids in length.
  • the compound In order to detect the compound or to modify its binding activity to T cells, it can contain a chemical, radioactive isotope, non-radioactive isotope, and / or fluorescent label of the T cell epitope and / or of the fusion protein mentioned.
  • Examples of chemical substances known to the person skilled in the art which are suitable for a chemical labeling according to the invention are: biotin, FITC (fluorescein isothiocyanate) or streptavidin.
  • biotin FITC (fluorescein isothiocyanate) or streptavidin.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • streptavidin streptavidin.
  • a possible embodiment is that a peptide is modified such that it contains at least one lysine.
  • Biotin or FITC (fluorescein isothiocyanate) is coupled to this lysine in the manner known to the person skilled in the art.
  • the modified peptide is bound to a corresponding MHC molecule or to a cell with corresponding MHC molecules.
  • the peptide can then be detected via labeled avidin or streptavidin or directly via the fluorescence of the FITC.
  • isotopes known to the person skilled in the art which are suitable for radioactive isotope labeling according to the invention are: H, I, I, P, P or
  • isotopes known to the person skilled in the art which are suitable for non-radioactive isotope labeling according to the invention are: 2 H or 13 C.
  • fluorescent substances known to the person skilled in the art which are suitable for a fluorescent label according to the invention are: 152 Eu, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phaldehyde or fluorescamine.
  • Polypeptides according to the invention with an amino acid length of approximately 50 can be produced, for example, by chemical peptide synthesis. Longer polypeptides are preferably genetically engineered.
  • the present invention therefore furthermore relates to a nucleic acid, for example for the expression of the T cell epitope or the compounds mentioned, which contains, for example, the following components: (a) at least one regulatory element and (b) at least one nucleic acid which is responsible for an amino acid sequence encodes the compound of the invention.
  • the nucleic acid construct mentioned is preferably made of DNA or RNA.
  • Suitable regulatory elements allow, for example, the constitutive, regulatable, tissue-specific, cell cycle-specific or metabolically specific expression in eukaryotic cells or the constitutive, metabolically specific or regulatable expression in prokaryotic cells.
  • Adjustable elements according to the present invention are promoters, activator sequences, enhancers, silencers, and / or repressor sequences.
  • Suitable regulatable elements which enable constitutive expression in eukaryotes are promoters which are recognized by RNA polymerase III or viral promoters such as CMV enhancers, CMV promoters, SV40 promoters and viral promoter and activator sequences derived from, for example, HBV , HCV, HSV, HPV, EBV HTLV or HIV.
  • regulatable elements which enable regulatable expression in eukaryotes are the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor (Gossen M. et al (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
  • controllable elements which enable cell cycle-specific expression in eukaryytes are the promoters of the following genes: cdc25C, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F, B-myb or DHFR (Zwicker J. and Müller R. (1997) Trends Genet 13, 3-6).
  • the nucleic acid according to the invention can also be used, for example, for the production of a DNA vaccine.
  • the coding sequences for these epitopes as well as for other already known epitopes of papillomaviruses can be joined together in any order directly or with several nucleotides in between in an open reading frame.
  • DNA sequences foreign to papillomavirus can be added, which are used, for example, for intracellular targeting of the resulting polypeptide chain, in particular into the endoplasmic reticulum, into the endosomes or the lysomes.
  • the nucleic acid can be present as a plasmid, as part of a viral or non-viral vector.
  • Another object of the present invention is therefore a vector, in particular an expression vector, which contains a nucleic acid according to the invention. holds.
  • the following are particularly suitable as viral vectors: baculoviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes viruses.
  • baculoviruses baculoviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes viruses.
  • virosomes virosomes, liposomes, cationic lipids, or poly-lysine conjugated DNA.
  • Another object of the present invention is also preferably a cell that contains at least one T cell epitope.
  • the cell is transfected, transformed or infected by one of the vectors according to the invention.
  • this cell expresses the polypeptide according to the invention under conditions known to the person skilled in the art which lead to the activation of the regulatable elements used in each case.
  • the polypeptide can then be isolated from this cell and e.g. be cleaned using one of the above markers.
  • Procaryotic and eukaryotic cells in particular bacterial cells such as E. coli, yeast cells such as S.
  • insect cells such as Spodoptera frugiperda cells (Sf-9) or Trichoplusia ni cells or mammalian cells such as COS cells are suitable for genetic engineering or HeLa cells.
  • the expressed compounds according to the invention can then be purified by standard methods.
  • a preferred embodiment is to use the cell itself which expresses the polypeptide according to the invention, in a particularly preferred embodiment the cell presenting parts of the polypeptide according to the invention via MHC-1 molecules on the cell surface.
  • antigen-presenting cells such as B cells, macrophages, dendritic cells, fibroblasts or other HLA A2.01 positive cells, in a preferred embodiment JY, T2, CaSki cells or EBV-transformed B cells Cell lines (BLCL).
  • the invention Cells according to the invention which present a polypeptide containing a T cell epitope can be used as target cells for restimulating immune cells, in particular T cells and / or for measuring the activation of T cells.
  • Target cell in the sense of the present invention is to be understood as a cell which
  • a T cell epitope is presented via MHC molecules and thus specifically induces T cell activation, in particular a cytotoxic T cell reaction against the cell.
  • the compound containing a T cell epitope can be part of a complex which is characterized in that the compound is covalent or via hydrophobic interactions, ion binding or hydrogen bonding with at least one further species such as peptides, proteins, peptoids, linear or branched oligo - Or polysaccharides and nucleic acids is connected.
  • the present invention therefore relates to a complex containing a T cell epitope or a compound and at least one further compound.
  • a preferred embodiment is that the polypeptide is present in connection with MHC class I molecules, for example as HLA A2.01 (or also HLA AI, HLA A24 etc.) tetramer. Human MHC class I molecules are particularly preferred.
  • HLA A2.01 tetramers can be prepared with the corresponding bound peptides, which are able to bind to the T cell receptors of peptide-specific cytotoxic T cells.
  • a further embodiment is the immobilization of the compound according to the invention or of the complex mentioned on carrier materials.
  • Suitable carrier materials are, for example, ceramic, metal, in particular noble metal, glasses, plastics, crystalline materials or thin layers of the carrier, in particular of the materials mentioned, or (bio) molecular filaments such as cellulose or framework proteins.
  • a component of the complex can additionally contain a protein tag.
  • Protein tags according to the invention allow, for example, high affinity absorption to a matrix, stringent washing with suitable buffers without eluting the complex to any appreciable extent, and subsequent targeted elution of the absorbed complex.
  • Examples of protein tags known to the person skilled in the art are a (HIS) 6 tag, a Myc tag, a FL AG tag, a hemaglutenin tag, glutathione transferase (GST) tag, intein with an affinity chitin tag binding tag or maltose binding protein (MBP) tag.
  • the protein tags according to the invention can be N-, C-terminal, and / or internal.
  • Another object of the present invention is a method for in vitro detection of the activation of T cells by at least one compound containing a T cell epitope.
  • a method for in vitro detection of the activation of T cells by at least one compound containing a T cell epitope preferably consists of three steps: a) In a first step, cells are stimulated with at least one T cell epitope according to the invention, preferably with at least one compound containing a T cell epitope according to the invention.
  • This compound can contain at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP, at least one CVLP, and / or at least mean a virus.
  • immune cells are stimulated by incubation with CVLPs.
  • This stimulation can take place, for example, in the form of a vaccination or by incubating immune cells with CVLPs in vitro.
  • Immune cells stimulated in this way are, for example, after a vaccination or in a tumor patient obtained from the blood, from tumors or from lymph nodes, and / or are cultivated.
  • a) cells with at least one T cell epitope according to the invention, at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one target cell presenting a T cell epitope and / or with at least one incubated according to the invention.
  • the activation of T cells is determined. Appropriate methods for this are, for example, the detection of
  • cytokine assay Chokine assay (Chapters 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies
  • DH Shevach EM and Strober W., John Wiley & Sons
  • ELISPOT Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra
  • a 5I Cr release test Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra
  • evidence of proliferation Chapter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra.
  • immune cells such as cytotoxic T cells, T helper cells, B cells, NK cells and other cells.
  • the use of compounds, complexes and / or cells according to the invention which contain the markings according to the invention allows the detection of T cells which recognize the T cell epitope by detecting the
  • Binding of labeled compounds, complexes and / or cells to the T cells In a preferred embodiment, the binding of MHC-polypeptide complexes according to the invention to the surface of the T cells is detected. This can be carried out in such a way that the MHC complexes themselves are labeled, for example fluorescence-labeled, or that in a further step an MHC-specific, Kiert, for example fluorescence-labeled antibodies used to in turn detect the MHC complexes. The fluorescent labeling of the T cells can then be activated, for example, in a luorescens
  • T cells cytokine assay, Elispot, 5I Cr release test, proliferation, see above.
  • coreceptors eg CD28
  • anti-CD28 coreceptor-specific antibodies
  • IL-2 non-specific activators
  • the present invention also relates to a method which contains an additional step a ') which is introduced after step a).
  • a ') In this additional step a) following step a)), the isolated or cultured cells are loaded with at least one target cell with at least one T cell epitope according to the invention, with at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least a complex according to the invention containing a T cell epitope, at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP, at least one CVLP and / or at least one virus, with at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, and / or at least one target cell presenting a T cell epitope co-cultivates for at least about 8 weeks, in particular for at least about 1 week, before step b) follows.
  • Another object of the present invention is a method for producing a target cell presenting a T cell epitope. It is possible to load the target cell with combinations of different T cell epitopes.
  • the target cell is incubated with at least one T cell epitope according to the invention, with at least one compound containing a T cell epitope and / or at least one complex containing a T cell epitope.
  • the target cell is incubated in growth medium which contains polypeptides according to the invention or with MHC class I complexes with bound polypeptides according to the invention.
  • the MHC class I complexes can be present, for example, as HLA A2.01 tetramers.
  • a tetramer usually binds four peptides. These can either be identical or represent different species of peptides.
  • the target cell is transfected, transformed and / or infected with a nucleic acid according to the invention and / or a vector according to the invention.
  • the target cell is infected with a vaccinia virus vector.
  • the method according to the invention is carried out with antigen-presenting cells, for example with B cells, macrophages, dendritic cells, embryonic cells or fibroblasts or other HLA-positive cells, in one embodiment. form carried out with JY, T2, CaSki cells or EBV-transformed B cell lines.
  • the CVLPs used contain a Papillomavirus L1 protein or variants thereof, in particular HPV16 L1 protein and, but not necessarily, a protein heterologous to L1 or variants thereof.
  • the two proteins can be bound directly or indirectly.
  • directly bound means that there is a covalent bond between the two proteins, for example a peptide bond or a disulfide bond.
  • Bound indirectly means that the proteins are bound via non-covalent bonds, for example hydrophobic interactions, ionic bonds or hydrogen bonds.
  • the CVLPs contain a papillomavirus L2 protein in addition to L1 protein or variants thereof.
  • a preferred embodiment of the L1 protein of the present invention is, for example, L1 proteins with one or more deletions, in particular a C-terminal deletion.
  • a C-terminal deletion has the advantage that the efficiency of the formation of virus-like particles can be increased, since the nuclear localization signal located at the C-terminus is deleted.
  • the C-terminal deletion is therefore preferably up to approximately 35 amino acids, in particular approximately 25 to approximately 35 amino acids, especially approximately 32 to approximately 34 amino acids.
  • a 32 amino acid C-terminal deletion of the HPV16 L1 protein is sufficient to be able to increase the formation of virus-like particles by at least about ten times.
  • the Ll protein can carry one or more mutations or the Ll portion can be composed of Ll proteins from different papillomaviruses.
  • a common characteristic of the L1 proteins according to the invention is that they allow the formation of VLPs or CVLPs and that they contain at least one T cell epitope according to the invention.
  • the L1 protein or variants thereof and the protein heterologous to L1 is a fusion protein. Also included are heterologous proteins that are composed of several different proteins or parts thereof. Epitopes, for example, can also do this
  • Epitopes in the sense of the invention can also be part of a synthetic polypeptide with a length of approximately 50 amino acids, preferably of at least approximately 35 amino acids, in particular of at least approximately 20 amino acids and in a particularly preferred manner of at least approximately 9 amino acids.
  • proteins which are heterologous to L1 and which are derived from a viral protein for example derived from HIV, HBV or HCV, preferably from papillomaviruses, in particular from human papillomaviruses.
  • this is an E protein of a papilloma virus, preferably an E6 and / or E7 protein. It is particularly preferred if the E protein is a deleted E protein, preferably a C-terminally deleted, in particular a C-terminally deleted E7 protein, since these constructs in connection with deleted L1 protein preferably virus-like particles can train. Deletions of up to 55 amino acids are particularly preferred, preferably approximately 5 to approximately 55 amino acids, in particular approximately 38 to approximately 55 amino acids.
  • the protein heterologous to L1 can be derived from antigens that are not viral pathogens. They can also be derived from autoimmune antigens such as thyroglobulin, myelin basic protein or zona pellucida glycoprotein 3 (ZP 3 ), which are associated with certain autoimmune diseases such as thyroiditis, multiple sclerosis, oophoritis or rheumatoid arthritis.
  • autoimmune antigens such as thyroglobulin, myelin basic protein or zona pellucida glycoprotein 3 (ZP 3 ), which are associated with certain autoimmune diseases such as thyroiditis, multiple sclerosis, oophoritis or rheumatoid arthritis.
  • the protein heterologous to L1 originates from tumor antigens, preferably melanoma antigens such as MART, ovarian carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1 or CA125, colon carcinoma antigens such as CA125 or breast carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1, BCRA-2 ,
  • tumor antigens preferably melanoma antigens such as MART, ovarian carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1 or CA125, colon carcinoma antigens such as CA125 or breast carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1, BCRA-2 ,
  • Another object of this invention is a method for the in vitro detection of the activation of T cells, which are obtained by preparation from samples.
  • This method makes it possible to determine whether papillomavirus L1 protein-specific cytotoxic T cells are present in a sample, for example a blood sample from a patient or in tumors or lymph nodes of a tumor patient.
  • a detection method contains the following steps: a ") In a first step, cells are obtained, for example by taking blood from a patient or by preparing, for example, tumors or lymph nodes. The cells are then taken up in growth medium and cultured.
  • Suitable methods include the detection of the production or secretion of cytokines by the T cells, the expression of surface molecules on T cells, the lysis of target cells or the proliferation of cells.
  • cytokine assay Chapters 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunolog y (1999), edited by Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM and Strober W., John Wiley & Sons
  • ELISPOT Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra
  • a 51 Cr release test Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra
  • the proof of proliferation Chapter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra.
  • mun cells such as cytotoxic T cells, T helper cells, B cells, NK cells and other cells can be distinguished.
  • mun cells such as cytotoxic T cells, T helper cells, B cells, NK cells and other cells can be distinguished.
  • the use of compounds, complexes and / or cells according to the invention which contain labels allows the detection of T cells which recognize the T cell epitope.
  • the binding of MHC-polypeptide complexes according to the invention to the surface of the T cells is detected.
  • This can be carried out in such a way that the MHC complexes themselves are labeled, for example fluorescence-labeled, or that in a further step an MHC-specific, labeled, for example fluorescence-labeled antibody is used in order to in turn detect the MHC complexes.
  • the fluorescence labeling of the T cells can then be measured and evaluated, for example, in a luorescent activated cell sorter (FACS).
  • FACS luorescent activated cell sorter
  • cytokine assay Elispot, Cr release test, proliferation, see above.
  • coreceptors e.g. CD28
  • anti-CD28 coreceptor-specific antibodies
  • IL-2 non-specific activators
  • the present invention also relates to a process which contains an additional step a ') which is introduced after step a ").
  • the isolated or cultured cells are included at least one target cell loaded with at least one T cell epitope according to the invention, with a compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least a VLP, at least one CVLP and / or at least one virus, with at least one complex according to the invention containing a T cell epitope, and / or at least one target cell presenting a T cell epitope, cocultivated for at least about 8 weeks, in particular for at least about 1 week, before step b) followed.
  • Epitope at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one VLP, at least one CVLP, and / or at least one virus,
  • the invention further relates to a test system (kit) for in vitro detection of the activation of T cells, comprising: a) at least one T cell epitope according to the invention, at least one compound according to the invention, at least one vector according to the invention, at least one cell according to the invention, and / or at least one complex according to the invention, and b) effector cells of the immune system, preferably T cells, in particular cytotoxic T cells or T helper cells.
  • the test system is used to determine the Ll protein-specific cytotoxic T cells present, for example, in a patient's blood sample or in tumors or lymph nodes of a tumor patient. In this case, the cells described in b) are in the test
  • control cells contained in the system the activation of which by the first kit component, the substances mentioned under a), serves as the standard.
  • the activation observed in this reaction is compared with the T cell activation of cells isolated from patients by the kit component a).
  • the test system is used, for example, to determine the L1 protein-specific antigenicity of a compound containing a T cell epitope, a complex containing a T cell epitope, a capsomer, a stable capsomer, a VLP, a CVLP , and / or a virus is used.
  • the substances described in a) are control substances whose activating effect on the second kit component, the cells mentioned under b), serves as the standard.
  • the activation observed in this reaction is associated with the activating action of a compound containing a T cell epitope, a complex containing a T cell epitope, a capsomer, a stable capsomer, a VLP, a CVLP, and / or a virus the kit component b) compared.
  • Another object of the invention is the use of at least one T cell epitope according to the invention, at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one vector according to the invention containing a nucleic acid coding for a compound containing a T cell epitope, at least a cell according to the invention containing a T-cell epitope for, and / or at least one complex according to the invention containing a T-cell epitope for triggering or for detecting an immune response.
  • Cells which present at least one of the molecules according to the invention via their MHC class I molecules are particularly suitable for stimulating immune cells in vitro and in vivo. Suitable cells for antigen presentation are e.g. B. B cells, dendritic cells, macrophages, fibroblasts or other HLA cells
  • a compound according to the invention for example an HPV18 L1E7 fusion protein, which additionally contains a T cell epitope according to the invention, can be used to detect an immune response.
  • a compound of the invention may have the ability to form CVLPs.
  • Another object of the invention is a medicament or diagnostic agent containing at least one T cell epitope according to the invention, at least one compound according to the invention containing a T cell epitope, at least one vector containing a nucleic acid coding for a T cell epitope Compound, at least one cell according to the invention containing a T cell epitope, and / or at least one complex according to the invention containing a T cell epitope and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a medicament or diagnostic agent according to the invention can be in solution, bound to a solid matrix, and / or admixed with an adjuvant.
  • the drug or diagnostic agent can be administered in various ways.
  • administration forms known to the person skilled in the art are parenteral, local and / or systemic administration by, for. B. oral, intranasal,
  • intravenous, intramuscular, and / or topical application The preferred form of application is influenced, for example, by the natural route of infection of the respective papillomavirus infection.
  • the amount administered depends on the age, weight, general health of the patient and the type of papillomavirus infection.
  • the drug or diagnostic agent can be administered in the form of capsules, solution, suspension, elixir (for oral administration) or sterile solutions or suspensions (for parenteral or intranasal administration).
  • saline or phosphate-buffered saline can be used as the inert and immunologically acceptable carrier.
  • the drug is administered in therapeutically effective amounts. That means amounts sufficient to elicit a protective immunological response.
  • a compound according to the invention for example an HPV 18 L1E7 fusion protein which additionally contains a T cell epitope according to the invention, can be used as a medicament or diagnostic agent.
  • a compound of the invention may have the ability to form CVLPs.
  • FIG. 1 shows the graphic evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific murine T cells with JA WS cells, which present different peptides.
  • the name of the respective peptide is indicated on the X axis, JAWS cells without peptide were only incubated with buffer and served as a negative control.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 2 shows the graphical evaluation of a 51 Cr release experiment after loading RMA cells with the peptide P33 (target cells).
  • the target cells were lysed by T cells (effector cells) stimulated with the peptides P1 to P43, the ratio of the effector cells used to the target cells used being 20.
  • RMA cells incubated with buffer (negative control) or RMA cells incubated with the P33 peptide are plotted on the X axis.
  • The%> of the specifically lysed target cells, determined by the release of 51 Cr from the target cells, are plotted on the Y axis. The% values were calculated using the formula given in Example 4.
  • FIG. 3 shows the graphical evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific murine T cells with LKK cells which present different peptides.
  • the name of the respective peptide is indicated on the X axis, LKK cells without peptide were only incubated with buffer and served as a negative control.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 5 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL which present different HPV 18 peptide pools.
  • the name of the respective peptide pool is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 or E7 stands for BLCL incubated with HPV18 Ll or HPV18 E7 peptide pool (positive- The proportion of CD4-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 6 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL which present different HPV18 peptide pools.
  • the name of the respective peptide pool is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 or E7 stands for BLCL incubated with HPV18 Ll or HPV18 E7 peptide pool (positive- The proportion of CD4-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 7 shows the graphic evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present the Q9 peptide.
  • the name of the respective peptide is indicated on the X axis, BLCL stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • 8 shows the graphical evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present different HPV 16 peptide pools or the P39 peptide.
  • the name of the respective peptide pool (A to H, 1 to 7) or for the respective peptide (P39) is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 stands for BLCL (positive control) incubated with HPV 16 Ll peptide pool
  • the proportion of CD4-positive T cells is plotted on the Y axis of FIG. 8 which is based on IFN ⁇ expression in the FACScan experiment as reactive and thus were classified as T-helper-1 cells (T HI ).
  • T helper 2 cells T helper 2 cells
  • FIG. 9 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL which present different HPV16 peptide pools.
  • the name of the respective peptide pool is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 stands for BLCL (positive controls) incubated with HPV16 L1 peptide pool.
  • L1 stands for BLCL (positive controls) incubated with HPV16 L1 peptide pool.
  • On the Y axis the proportion of CD8-positive T cells is plotted which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment.
  • FIG. 10 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after re-stimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL which present the P33 peptide.
  • the name of the peptide is given on the X-axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 stands for BLCL (positive controls) incubated with HPV16 L1 peptide pool.
  • On the Y-axis is the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment.
  • 11 shows the graphic evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present different HPV 18 peptide pools.
  • the name of the respective peptide pool (A to H, 1 to 7) is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 or E7 stands for with HPV18 Ll or HPV18 E7 peptide pool incubated BLCL (positive control)
  • the proportion of CD4-positive T cells is plotted on the Y axis of FIG. 11 above, which is based on IFN ⁇ expression in the FACScan experiment as reactive and thus as T -Helfer-1 cells (T HI )
  • T HI T -Helfer-1 cells
  • FIG. 11 below shows the proportion of CD4-positive T cells which were classified as T-HeIfer-2 lines (T H 2) on the basis of IL-4 expression in the FACScan experiment.
  • FIG. 12 shows the graphical evaluation of four FACScan experiments after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present different HPV 18 peptides or peptide pools.
  • the name of the respective peptide (Q38, Q39, Q46 or Q47) is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, Ll or E7 stands for with HPV18 Ll or HPV18 E7 peptide pool incubated BLCL (positive control).
  • the proportion of reactive T cells is shown on the Y axis.
  • FIG. 12 top left
  • the proportion of CD4 positive T cells is plotted, which is based on IFN ⁇ expression in the FACScan experiment were classified as reactive and thus as T-helper-1 cells (T H ⁇ ).
  • FIG. 12 shows the proportion of CD 8 positive T cells that were classified as reactive cytotoxic T cells based on IFN ⁇ expression in the FACScan experiment.
  • FIG. 12 shows the proportion of CD4-positive T cells which were classified as T helper 2 cells (T ⁇ _) on the basis of IL-4 expression in the FACScan experiment.
  • FIG. 13 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL which present different HPV16 peptide pools.
  • the name of the respective peptide pool (A to H, 1 to 7) is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 or E7 stands for with HPV16 Ll or HPV16 E7 peptide pool incubated BLCL (positive control), the proportion of CD8-positive T cells is plotted on the Y axis, which were classified as reactive and thus as cytotoxic T cells based on IFN ⁇ expression in the FACScan experiment ,
  • FIG. 14 shows the graphical evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present different HPV 18 peptide pools or a peptide.
  • the name of the respective peptide pool (A to H, 1 to 7) or of the peptide Q30 is indicated on the X axis, "without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 or E7 stands for with HPV18 Ll or HPV18 E7 peptide pool inhibited BLCL (positive control).
  • T HI T-helper-1 cells
  • T H2 T-helper 2 cells
  • 15 shows the graphical evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific murine T cells with RMA cells which present different peptides. The name of the respective peptide is indicated on the X axis, RMA cells without peptide were only incubated with buffer and served as a negative control.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 16 shows the graphical evaluation of a 51 Cr release experiment after loading RMA (top) or LKK cells (bottom) with the peptides Q43, Q44 or Q49 (target cells).
  • the target cells were lysed by T cells (effector cells) stimulated with the HPV18 L1 and E7 peptide pools, the ratio of the effector cells used to the target cells used being 20.
  • the cell type and the peptide are indicated on the X axis, the cell acting as a negative control without a peptide.
  • The% of the specifically lysed target cells, determined by the release of 51 Cr from the target cells, are plotted on the Y axis. The% values were calculated using the formula given in Example 4.
  • a T cell line was generated by in vitro vaccination with H7.1-A2 cells. In the ELISpot assay, it was tested against autologous PBMC containing the HPV18 E7 86 peptide. 9 were loaded, tested.
  • T co stands for a negative control with unspecific T cells
  • PBMC co stands for a negative control with PBMC that were not loaded with peptide. 17 below: Cytolytic activity of HPV18E7 86 . 9 specific T cells. T cell lines from two healthy blood donors were raised against the HPV18 E7 86 epitope.
  • cytotoxicity test 51 chromium release assay
  • BLCL co stands for a negative control of BLCL that were not pulsed with peptide.
  • Fig. 18 above Natural processing rank of the HP VI 8 E7 86 epitope. 9 by dendritic cells. T cell lines against HPV 18 E7 were generated by in vitro vaccination with protein or peptide pool-loaded autologous dendritic cells. In the ELISpot assay the stimulation of HPV18E7 was 86 . 94 specific T cells measured by epitope-loaded dendritic cells (DC).
  • DC epitope-loaded dendritic cells
  • T co stands for a negative control with unspecific T cells
  • DC co stands for a negative control of DCs that were not loaded with peptide.
  • Fig 18 below: Presence of HPV 18 E7 86 . 94 specific T cells in populations of tumor infiltrating lymphocytes. TIL of an HPV 18 positive and HLA-A2 positive patient were expanded in vitro and in the ELISpot assay for reactivity with the HPV 18 E7 86 . 9 epitope tested.
  • T co stands for a negative control with unspecific T cells, K-A2 for a negative control with K-A2 cells that were not loaded with peptide.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • BLCL means B cell lines transformed with the help of the Epstein-Barr virus, which were produced individually for each blood donor (obtained from Dr. Andreas Kaufmann, Jena, Germany).
  • CVLP-stimulated murine T cells were obtained as follows: 354Multiple C57BL / 6 or C 3 H mice were injected twice with 20 ⁇ g each
  • mice The spleens from non-vaccinated mice were removed and the spleen cells were resuspended according to standard methods.
  • APC is related to cells for antigen presenting cells.
  • JA WS cells were purchased from ATCC (CRL-11904).
  • RMA cells come from a thymoma of a C57BL / 6 mouse (see Ljunggren H.G. and Karre K. (1985) J. Exp. Med. 162, 1745-59).
  • ⁇ -mouse CD8 / PE means a monoclonal antibody which is directed against the extracellular part of the murine CDS and contains the fluorescence marker phycoerithrin (Pharmingen, Heidelberg, Germany).
  • ⁇ -mouse CD4 / Cychrome means a monoclonal antibody which is directed against the extracellular part of the murine CD4 and contains the fluorescent marker Cychrome (Pharmingen, Heidelberg, Germany).
  • ⁇ -mouse IFN ⁇ / FITC means a monoclonal antibody which is directed against the murine interferon ⁇ and contains the fluorescent marker FITC (Caltag, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -human CD8 / APC means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of human CD8 and contains the fluorescent marker APC (Caltag, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -human CD4 / PerCP means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of human CD4 and contains the fluorescent marker PerCP (Becton Dickinson, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -human IFN ⁇ / FITC means a monoclonal mouse antibody that is directed against human interferon ⁇ and contains the fluorescent marker FITC (Caltag, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -human IL4 / PE means a monoclonal mouse antibody which is directed against human interleukin 4 and contains the fluorescent marker phycoerithrin (Caltag, Hamburg, Germany).
  • Human GM-CSF (Leukomax) was obtained from Novartis Pharma GmbH (Nuremberg, Germany).
  • Human IL4 was obtained from Becton Dickinson (Hamburg, Germany).
  • Human IL2 was obtained from Becton Dickinson (Hamburg, Germany).
  • FACScan calibur means 'fluorescens activated cell sorter'; the equipment was purchased from Becton Dickenson (Hamburg, Germany).
  • HPV16 L1 peptide pools mean the mixture of peptides P1 to P43, HPV16 E7 peptide pools the mixture of peptides P44 to P51.
  • HPV 18 L1 peptide pools are understood to mean the mixture of peptides Q1 to Q43, and HPV18 E7 peptide pools are the mixture of peptides Q44 to Q52.
  • the genome of HPV 18 is under GenBank Accession No. X05015 is generally available and has been published by Cole and Danos ⁇ J. Mol. Biol. 1987, 193 (4), 599-608).
  • the sequence used for the construction of the fusion proteins according to the invention had the following changes in the Ll gene: At positions 89, 848, 1013 and 1230 of the Ll gene, a C was replaced by a G at the DNA level. At the protein level, the first three changes result in an exchange from Pro to Arg, while the last mutation does not result in a change at the protein level.
  • the E7 gene corresponds to the published sequence.
  • Another method of obtaining the desired nucleic acids is to isolate the papilloma virus-specific genes directly from warts or tumors by means of PCR. Suitable primers for the E6 and E7 genes from HP VI 6 and HPV 18 are e.g. in WO93 / 21958. Further references for the desired nucleic acids are, for example, Kirnbaum, R. et al. (1994), J. Virol., 67, 6929- 6936 and the clones mentioned above in the EMBL database.
  • the first primer has the sequence 5 '-ACC AGA CTC GAG ATG GCT TTG TGG CGG CCT AGT GAC-3'
  • the first primer 5 encodes an Xhol restriction enzyme site.
  • the second primer 5 'encodes an EcoRV restriction enzyme site.
  • a TAA translation stop codon follows the EcoRV site to delete the last 35 amino acids of the HPV18L1 ORF.
  • the PCR product was digested with XhoI / EcoRV and ligated into the vector pBluescript ®, also digested with XhoI / EcoRV.
  • HPV18L1 ⁇ C D I pKS was used to generate the ORF of HPV18E7I.53DI and HPV18E7 1 . 60D ⁇ to clone in the EcoRV site.
  • the PCR products were cleaved with EcoRV and inserted into the EcoRV site of the modified Ll gene.
  • Sf9 Spodoptera frugiperda
  • TNM-FH insect medium Life Technologies, Düsseldorf
  • Recombinant baculoviruses were generated by cotransfection of 5 ug of the recombinant plasmids and 1 ug of linearized Baculo-Gold ® sêtm DNA (Pharmingen, San Diego, CA) into Sf9 cells.
  • Recombinant viruses were purified by end point dilution and / or plaque separation.
  • 10 6 Sf9 cells were infected with recombinant baculovirus and a moi (“multiplicity of infection”) of 0.5 and 1 for 48 h and.
  • the medium was removed and the cells with PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM Kcl, 8.1 mM Na 2 PO 4 , 1.5 mM KH 2 PO 4 , pH 7.2).
  • PBS 140 mM NaCl, 2.7 mM Kcl, 8.1 mM Na 2 PO 4 , 1.5 mM KH 2 PO 4 , pH 7.2.
  • the cells were then analyzed by FACS measurement. tested or lysed in SDS sample buffer and tested by SDS gel chromatography and immunoblot assay.
  • the homogenate was clarified by centrifugation at 10,000 rpm in the Sorvall SS34 rotor.
  • Purification of the L1E7 protein from the clarified crude extract for the immunological assay was carried out by ammonium sulfate precipitation at 35-40% saturation and subsequent anion-exchange chromatography on Fractogel TMAE ® (Merck, Darmstadt), said CVLPs in linear salt gradient at 300- 400mM NaCl be eluted.
  • the protein content of the purified fractions was determined by the Bradford method using bovine serum albumin as the standard.
  • Murine T cells (4x10 5 ) from HPV16Ll ⁇ C * E7 ⁇ .
  • 55 CVLP-inoculated C57BL / 6 mice were stimulated and harvested for 5 weeks with HPV16 Ll peptide pools at 37 ° C. with weekly addition of 1 ⁇ g / ml per individual peptide and 10 5 antigen-presenting cells (irradiated splenocytes).
  • the cells were then in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 1 ⁇ g / ml of the peptides indicated on the X-axis of FIG. 1 and 10 5 antigen-presenting cells (JAWS) restimulated in the presence of 10 IU / ml IL2. Only cells incubated with buffer served as a negative control.
  • JAWS antigen-presenting cells
  • FIG. 1 above for peptides P18, P19, P43 and FIG. 1 below for peptides P35 and P3 shows that the JA WS cells incubated with these peptides restimulate peptide-stimulated CD8-positive murine T- Cells.
  • the peptides P3, P18, P19, P35 and P43 thus contain H2b-restricted cytotoxic T cell epitopes.
  • Target cells which were incubated with culture medium, were used for spontaneous lysis. the.
  • target cells were lysed by adding 0.5% Triton X100.
  • the batches were incubated for 5 hours at 37 ° C. 50 ⁇ l of the supernatant of the batches were placed on luma plates and dried overnight at room temperature. The next morning, the amount of radioactive 51 Cr was determined using a Canberra Packerd B-PIate Counter (counts) and related to the maximally lysed cells of the Triton approach. The% specific lysis was carried out according to the formula:
  • FIG. 2 shows that the RMA cells loaded with the P33 peptide could be effectively lysed by the T cells, but the non-loaded RMA cells could not.
  • the P33 peptide is thus an H2b restricted cytotoxic T cell epitope.
  • Murine T cells (4xl0 5 ) from HPV18 Ll ⁇ CD .E7 ⁇ - 53D ⁇ CVLP and HPV18 Ll cD.E7 ⁇ - 60 Di CVLP-vaccinated C 3 H mice were used for 5 weeks with HPV 18 Ll or E7 peptide pools at 37 ° C stimulated and harvested with weekly addition of 1 ⁇ g / ml per individual peptide and 10 5 antigen-presenting cells (irradiated splenocytes). The cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 1 ⁇ g / ml of the peptides indicated on the X axis of FIG.
  • FIG. 3 shows for peptides Q22, Q23, Q51, Q43 and Q44 and FIG. 4 for peptides Q41 and Q5 that the LKK cells incubated with these peptides restimulate peptide-stimulated murine CD8-positive T Cells.
  • the peptides Q5, Q22, Q23, Q41, Q43, Q44 and Q51 thus contain H2k-restricted cytotoxic T cell epitopes.
  • Human T cells (4 ⁇ 10 5 ) from a non-HLA-typed blood donor were treated with HPN18 L1 ⁇ C DIE7I for 1 week.
  • the 20mer peptides Ql to 52 were according to the matrix
  • the T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2.
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide.
  • FIG. 5 shows that in particular the BLCL incubated with the peptide pools F and 1 brought about a restimulation of CVLP-stimulated human CD4-positive T cells. Furthermore, peptide pools A and 6 showed a restimulation that was clearly above the negative control.
  • the BLCL incubated with the other peptide pools or the negative control or the BLCL incubated with the E7 peptide pool had a small proportion of reactive CD4-positive T cells.
  • the peptide pools F and 1 together contain the peptide Q6, which is therefore responsible for the restimulation of the CVLP-stimulated T cells.
  • the peptide Q6 thus contains a T helper epitope.
  • the peptide pools A and 1 contain Q1, A and 6 Q41 as well as F and 6 Q46 as a common peptide.
  • the peptides Ql, Q41 and Q46 thus contain T helper epitopes.
  • the 20mer peptides P1 to 51 were according to the matrix
  • T cells were then restimulated, fixed, permeabilized and stained as described in Example 6.
  • the evaluation was carried out as described in Example 6.
  • FIG. 6 shows for peptide pools G and 3 that the BLCL incubated with these peptide pools brought about a restimulation of CVLP-stimulated T cells. Furthermore, peptide pools B and C as well as 2 and 4 showed a restimulation that was clearly above the negative control.
  • the PBMC or the negative control incubated with the other peptide pools had a small proportion of reactive CD4-positive T cells, but not the BLCL or the negative control incubated with the other peptide pools or the PBMC incubated with the E7 peptide pool ,
  • the peptide pools G and 3 together contain the peptide P23, B and 2 contain PIO, B and 3 Pl 8, B and 4 P26, C and 2 Pl l, C and 3 P19, C and 4 P27, G and 2 P15 and G and 4 P31. These peptides are therefore each for the restimulation of the CVLP-stimulated T cells
  • the peptides PIO, P1, P15, P18, P19, P23, P26, P27 and P31 thus each contain a T helper epitope.
  • the cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 10 ⁇ g / ml of the HPV 18 Ll peptide Q9 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2. Only cells incubated with buffer served as a negative control.
  • FIG. 7 shows that the BLCL cells incubated with the peptide Q9 brought about a restimulation of HPV18 L1 peptide pool-stimulated CD8-positive T cells.
  • the peptide Q9 thus contains an HLA A24-restricted cytotoxic T cell epitope.
  • the peptide lYNPETQRL binds to MHC class I molecules of the haplotype HLA A24.
  • the peptide lYNPETQRL is therefore responsible for the restimulation of the T cells by the BLCL cells incubated with the Q9 peptide.
  • the peptide IYNPETQRL contained in peptide Q9 of the overlapping 20mers is an HLA A24 restricted cytotoxic T cell epitope.
  • Example 6 human T cells from a non-HLA-typed blood donor were stimulated and harvested with HPV16Ll ⁇ C * E7 ⁇ - 5 5 CVLPs.
  • T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools from Example 7 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2.
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide. Only cells incubated with buffer served as negative controls, and cells incubated with HPV 16 L1 peptide pool as positive controls.
  • FIG. 8 shows that the proportion of CD4 and IFN ⁇ positive cells is very high for the BLCL incubated with the peptide pools G and 5 as well as for the BLCL incubated with P39. Since the peptide pools G and 5 as a common Containing peptide P39, which by itself also caused residual simulation of CVLP-stimulated T cells, the peptide P39 contains a T helper epitope. Since CD4 and IFN ⁇ -positive cells are generally T H ⁇ cells, it is therefore a T H i epitope.
  • CD4 and IL4 positive cells are usually T H2 cells.
  • the peptide P39 contained in G and 5 additionally also contains a Tm epitope or is identical to the T ⁇ i epitope and that the peptide 38 contained in F and 5 additionally contains a T ⁇ epitope.
  • Example 6 human T cells from a non-HLA-typed blood donor were stimulated and harvested with HPV16Ll c * E7 ⁇ - 5 CVLPs.
  • T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools from Example 7 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2.
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide. Only cells incubated with buffer served as negative controls, and cells incubated with HPV 16 Ll pool as positive controls.
  • FIG. 9 shows that the proportion of CD8-positive T cells is high for the BLCL incubated with the peptide pools B, E, G and 1. Since peptide pools B and 1 contain P2 as a common peptide, peptide pools E and 1 contain P5 and G and 1 P7, peptides P2, P5 and P7 each contain a cytotoxic T cell epitope.
  • Example 6 Analogously to Example 6 were human T-cells of a non-HLA-typed blood donor with HPN 16L 1 ⁇ c * E7 1 - stimulated 55 CVLPs and harvested.
  • T cells were then in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 1 ⁇ g / ml peptide P33 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL)
  • FIG. 10 shows that the proportion of CD8-positive cells for the BLCL incubated with the P33 peptide is significantly higher than in the negative control. P33 thus contains a cytotoxic T cell epitope.
  • Example 6 human T cells from a non-HLA-typed blood donor with HPV18L1 ⁇ CDIE7I-53DI CVLPs and HPV18L1 ⁇ CDIE7 1 . 60 DI CVLPs stimulated and harvested at 37 ° C.
  • T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the HPV18 peptide pools from Example 6 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2.
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g ml was added for each individual peptide. Only cells incubated with buffer served as negative control, and cells incubated with HPV 18 Ll peptide pool as positive control.
  • FIG. 11 shows that the proportion of CD4 and IFN ⁇ -positive cells is high for the BLCL incubated with the peptide pools F, G, 5 and 6.
  • the peptide pools F and 5 have the peptide Q38, F and 6 the peptide Q46, G and 5 the peptide Q39 and G and 6 the peptide Q47.
  • the peptides Q38, Q39, Q46 and Q47 each contain a T H ⁇ epitope.
  • Fig. 11 shows that the proportion of CD4 and IL4 positive cells for peptide pool G is particularly high, but the proportion of reactive cells for pools 3, 4, 5 and 6 are approximately the same, so that no clear conclusion about the T ⁇ 2 epitopes could be drawn from this experiment.
  • the peptides Q38, Q39, Q46 and Q47 were tested individually in the example below.
  • Example 6 human T cells (4 ⁇ 10 5 ) from a non-HLA-typed blood donor with HPV18L1 ⁇ C DIE7I. S 3DI CVLPs and HPV18L1 ⁇ DIE7I- 6 OD I CVLPs stimulated and harvested.
  • T cells were then in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 1 ⁇ g / ml peptide Q38, Q39, Q46 or Q47 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2 restimulated. Only cells incubated with buffer served as negative controls, cells incubated with HPV 18 L 1 or E7 peptide pool as positive controls.
  • FIG. 12 shows that the proportion of reactive CD4 and IFN ⁇ positive T cells is particularly high for the BLCL incubated with the peptides Q38 and Q39, but also significantly higher for the peptides Q46 and Q47 is than in the negative control.
  • Q38, Q39, Q46 and Q47 each contain a T H ⁇ epitope.
  • FIG. 12 shows that the proportion of reactive CD4 and IL4 positive T cells for the peptides Q38 and Q39 is particularly high, so that Q38 and Q39 also contain T H2 epitopes in addition to the T ⁇ i epitopes or that the T HI epitopes are also T H2 epitopes.
  • Fig. 12 shows that the proportion of reactive CD8 and IFN ⁇ positive T cells for peptides Q38, Q39 and Q47 is particularly high, so that peptides Q38, Q39 and Q47 furthermore cytotoxic T cell epitopes contain.
  • the proportion of CD8 and IL4 positive cells for the peptides Q38, Q39, Q46 and Q47 is low and comparable to the negative control, which can be explained by the fact that CD8 positive cells generally do not express IL4.
  • Example 6 Analogously to Example 6 were human T-cells of a non-HLA-typed blood donor with HPN16Ll ⁇ c * E7 ⁇ - stimulated CVLPs 55 and harvested. The T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools from Example 7 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2. The amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide. Only cells incubated with buffer served as negative controls and cells incubated with HPV 16 L1 or E7 peptide pool as positive controls.
  • FIG. 13 shows that the proportion of CD8 and IFN ⁇ -positive T cells is high for the BLCL incubated with the peptide pools A, C, E, F, 1 and 6.
  • the peptide pools A and 1 is the peptide P1,
  • the peptide P46 together.
  • the peptides P1, P3, P5, P6, P41, P43, P45 and P46 each contain a cytotoxic T cell epitope.
  • the T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools from Example 6 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 lU / ml IL2.
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide.
  • Only cells incubated with buffer served as negative controls, and cells incubated with HPV 18 L1 or E7 peptide pool as positive controls (FIG. 14 above).
  • the T cells were in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with the peptide pools F and 4 and with 1 ⁇ g / ml peptide Q30 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2 restimulated.
  • FIG. 14 shows that the proportion of CD4 and IFN ⁇ -positive T cells is high for the BLCL incubated with the peptide pools F and 4. Peptide pools F and 4 share peptide Q30. The peptide Q30 thus contains a T H ⁇ epitope.
  • Example 5 murine T cells from CVLP-vaccinated mice were stimulated and harvested with L1 or E7 peptide pools with the addition of antigen-presenting cells. Subsequently, the cells were incubated with the on the X-axis of FIG. 15 indicated peptides (Q3 and Q4 in Fig. 15 above, L1 7 E7. 1 8, E7 2 - ⁇ , E7 ⁇ - 8 in Fig. 15 below), as well as antigen - presenting cells (RMA) restimulated. Only cells incubated with buffer served as a negative control.
  • RMA antigen - presenting cells
  • Example 5 The experiment was also evaluated analogously to Example 5, in that the reactive CD8-positive cells were determined by antibody staining and FACScan.
  • FIG. 15 above shows for the peptides Q3 and Q4 and FIG. 15 below for the peptides L1 4 4 E7 [. 8 , E7 2 -n and E7 ! - 8 that the RMA cells incubated with these peptides caused restimulation of peptide-stimulated murine CD8 T cells.
  • the peptides Q3, Q4, Ll 47 E7 ! - 8 , E7 2 - u and E7! - 8 thus each contain a H2b restricted cytotoxic T-cell titer. 17. Lysis of HPV18 peptide-loaded RMA / LKK cells
  • RMA or LKK cells were radioactively labeled with 51 Cr and incubated with the peptides plotted on the X axis (Q43 and Q44 in FIG. 16 above, Q49 in FIG. 16 below). Cells without a peptide served as negative controls. T cells which had previously been stimulated with the peptide pool were then added.
  • the lysis of the RMA or LKK cells by the T cells was measured on the basis of the release of the 51 Cr and calculated as in Example 4.
  • FIG. 16 shows that the RMA cells loaded with the Q43 or Q44 (FIG. 16 top) or the LKK cells loaded with the Q49 (FIG. 16 bottom) could be effectively lysed by the T cells, the non-loaded RMA or LKK cells, however, are not.
  • the Q43 and Q44 peptides are thus H2b-restricted cytotoxic T-cell epitopes
  • the Q49 is thus an H2k-restricted cytotoxic T-cell epitope.
  • the HLA binding prediction program of the NIH was used for the prediction of 9-mer sequences with high binding strength to HLA-A * 0201 in the E7 protein of HPV type 18 (address: http: // www- bimas.dcrt. nih.gov/molbio/hla ⁇ _bind/). 9-mers were examined because they are the optimal ligands for HLA class I molecules.
  • To predict de the complete amino acid sequence of the HPV 18 E7 protein was fed into the program and determined that 9-mers for the HLA allele A * 0201 should be predicted.
  • the program provides a list in which the 9-mers found are arranged according to binding strength.
  • the binding strength value is given as the half-life in minutes of dissociation of a peptide of the corresponding amino acid sequence (Tj / 2 ).
  • the predicted peptides were synthesized using standard methods (F moc method). Peptide-specific T cell lines have been established against peptides with high predicted HL A-A2 binding strength. For this purpose, each hole of a 96-well plate of lxlO 5 PBMC from healthy HLA-A2 positive donors was sown in 100 ⁇ l medium (RPMI 1640, 10% heat-inactivated AB plasma). 20 ⁇ g / ml peptide was added to the culture medium. The cells were incubated at 37 ° C. and restimulated once a week with irradiated peptide-loaded autologous PBMC.
  • the stimulator PBMC were incubated for 4 hours in medium with 20 ⁇ g / ml peptide. After the irradiation, they were diluted to 100 lxl0 4 / ul with medium and added to the peptide-stimulated PBMC. Half of the medium was aspirated from each well and 100 ⁇ l of the stimulator-PBMC suspension was added. From the 3rd stimulation, 10 U / ml IL-2 and 10 U / ml IL-7 were added. From the 5th stimulation, restimulation was carried out in the same way with peptide-loaded autologous B-lymphoblastic cell lines (BLCL).
  • BLCL peptide-loaded autologous B-lymphoblastic cell lines
  • HeLa cells were transfected with CD80 and HLA-A2 (H7.1-A2). These cells were irradiated and used to stimulate PBMC at Ixl0 4 / hole. It was restimulated 3 times analogously to peptide stimulation.
  • K-A2 - these are K-562 cells (ATCC CCL-243) were transfected with an HLA A2 expression vector, PBMC or dendritic cells) were in 60 ⁇ l medium (RPMI 1640, 0.4 % »Human albumin) are sown in a well of a 96-well round-bottom cell culture plate and loaded with 50 ⁇ g / ml peptide overnight. The next day, 5 ⁇ 10 4 T cells / well in 60 ⁇ l medium (each with 10 U / ml IL-2 and IL-7) were added and incubated for 4 hours. A Millipore nitrocellulose HA plate was coated overnight at 4 ° C.
  • the antibody Ab-7-B6-l-biotin was added (2 ⁇ g / ml in PBS / BSA, 60 ⁇ l well, Hölzel Diagnostika) and incubated overnight at 4 ° C. The next day, the filter plate was washed again 6 times for 2 minutes with PBS / Tween 20 (0.05%) and streptavidin-AP (50 ng / ml in PBS, Sigma (Deisenhofen), 100 ⁇ l well) was added. After 2 hours of incubation at room temperature, the filter plate was washed 3 times 2 minutes with PBS / Tween 20 (0.05%) and 3 times 2 minutes with PBS.
  • the cytotoxicity of HPV 18 E7 86 . 94 specific T cells were determined in the chromium release assay.
  • Autologous BLCL were used as target cells. 5 ⁇ 10 5 cells were taken up in 100 ⁇ l medium (RPMI 1640, 10% FCS) and 20 ⁇ l 51 chromium (NEN) were added. 50 ⁇ g / ml of the corresponding peptide was added to the peptide loading of the BLCL. This was followed by incubation at room temperature for 2 hours, with the cells being carefully resuspended every 20-30 minutes. The cells were washed 3 times with 5 ml of medium. To sediment the cells, they were centrifuged at 1500 rpm for 5 min and carefully resuspended.
  • the targets were taken up in medium and adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / ml. 40 .mu.l of this cell suspension were added to the effectors and K-562 cells CCL-243, which had already been sown in the wells of a 96-well pointed-bottom cell culture plate.
  • the effectors were harvested and taken up in medium (RPMI 1640, 10% FCS, 10 U / ml IL-2 and IL-7). 80 ⁇ l each of this cell suspension were pipetted into a well of a 96-well pointed-bottom cell culture plate (duplicates). The cell number / ml was set so that the desired effector-target ratio was achieved. Unlabeled K-562 cells (40 ⁇ l, 20-fold excess to target cells) were added to the effectors in order to completely block the activity of NK cells which may be present in the cell lines. The effectors were incubated with the K-562 cells for at least 30 minutes before the labeled target cells were added.
  • target cells were incubated with K-562 and medium (low-release control) and target cells with K-562, medium and Tween 20 (high-release control).
  • effectors were also incubated with unlabeled and labeled K-562.
  • the batches were incubated for 4 hours at 37 ° C., 98% atmospheric humidity and 5% CO 2 .
  • the culture plates were then centrifuged at 700 rpm for 5 min in order to sediment the cells. Without stirring up the cell pellet, 100 ⁇ l of the supernatant were pipetted from each well onto an Opti-Plate scintillation counter plate and left overnight at room temperature.
  • TIL Tumor Infiltrating Lymphocytes
  • TIL were obtained from the biopsies of tumors from patients with HPV 18 and HLA-A2 positivity by culture in AIM V medium (Gibco-Invitrogen, Düsseldorf), each with 100 U / ml IL-2 and IL-7 and 0J25 ⁇ l / well Dynal beads T cell expander (Dynal, Hamburg) brought out. This TIL were directly in the ELISpot assay for specificity for the HPV 18 E7 86 - examined 94 peptide epitope.
  • H7.1-A2 restricted peptides of the HPV 18 E7 protein are processed and presented by tumor cells
  • H7.1-A2 transfectants H7.1-A2 transfectants
  • the IFN- ⁇ ELISpot analysis showed a specific reaction against the predicted synthetic peptide FQQLFLNTL (see FIG. 17 above).
  • This peptide has a relatively low binding affinity for HLA-A2 compared to other predicted peptides. Nevertheless, specific T cells were detected.
  • HPV 16 E7 was 28 - 36 used, the induced no IFN- ⁇ secretion. This leads to the conclusion that this peptide is presented by H7.1-A2 cells.
  • T cell lines were produced against the synthetic peptide.
  • the T cells were tested in the chromium release assay.
  • Autologous peptide-loaded BLCL were used as target cells. With an effector to target ratio of 30: 1, a specific lysis of approximately 20% was observed (see FIG. 17 below). No specific lysis was measured against the ControUpeptides HPV 18 E7 7 - ⁇ 5 and HPV 16 E6 28 -36.
  • T cell lines were produced by stimulation with antigen-loaded autologous dendritic cells (DC).
  • the DC were loaded with recombinant HPV 18 E7 protein or a pool of overlapping 20-mer peptides, which represent the entire HPV 18 E7 (see FIG. 18 above: “E7 protein induced” or “E7 peptide pool inducted”).
  • the induced T cells were determined in the ELISpot assay for specificity for the HPV 18 E7 6 . 9 epitope tested.
  • HPV 18 E7 86 were found in both T cell lines. 94 specific T cells were detected (see Fig. 18 above). This means that the immunoproteasome processes the epitope.
  • TIL The biological relevance of HPV 18 E7 86 . 9 epitops were examined on TIL populations. TIL were isolated from a tumor biopsy of an HPV 18 and HLA-A2 positive patient and expanded linearly in vitro without antigen-specific Stimulation. They were confronted in the ELISpot assay with HPVl 8 E7 S 6. 9 loaded K-A2 (HLA-A2 transfected K-562 cells as stimulators).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz und/oder eine funktionell aktive Variante davon, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.

Description

T-Zellepitope des Papillomavirus Ll- und E7-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Papillomavirus T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz YLPPVPVSKWSTDEY ART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL, VGHPYFPIKKPNNNKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP, WACVGVEVGRGQPLGVGISG, QPLGVGISGHPLLNKLDDTE, QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA, DMVDTGFGAMDFTTLQANKS, VTVVDTTRSTNMSLCAAIST, TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL, IFQLCKITLTADVMTYIHSM, PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE, LKKYTFWEV LKEKFSADLD, PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH, YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK, GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV, SIYNPETQRLVWACAGVEIG, IYNPETQRL, PDYLQMSADPYGDSMFFCLR, GDS FFCLRREQLFARHFWN,
NNGVCWHNQLFVTVVDTTRS, PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI, YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL, YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE, VDLLCHEQLSDSEEENDEID, SEEENDEIDGVNHQHLPARR, SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL, FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL, HGPKATLQDI, MHGPKATL oder FQQLFLNTL
und/oder eine funktionell aktive Nariante davon, sowie ihre Verwendung in Dia- gnostik und Therapie.
Die Papillomviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA- Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder- förmigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humanpathogene Papillomavirastypen (HPV) bekannt, von denen einige, z.B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-11 oder HPV-42 gutartige Tumore verursachen können. Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B. das E6- und das E7 -Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das El -Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7 -Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region ge- nannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte Ll und L2, die für Strukturkomponenten des Viruskapsids kodieren. Das Ll -Protein ist zu über 90% im vi- ralen Kapsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1 :L2 im allgemeinen 30:1 ist. Unter dem Begriff Ll -Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung das Hauptkapsid Protein der Papillomaviren (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
In über 50% der Fälle wird HPV- 16 mit Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV- 16 ist der Hauptrisiko faktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Das Immunsystem spielt eine wichtige Rolle beim Fort- schreiten der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanis- mus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradig malignen cervicalen intra- epithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalen Tumoren das E7-Gen konsti- tutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird vor allem das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z.B. WO 93/20844). Die E7-induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden. Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des Ll-Gens bzw. die Coexpressi- on des Ll- und L2-Gens zur Bildung von Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden oder Virus-ähnliche Partikel (VLPs für virus-like particle) führen kann (siehe z.B. WO 93/02184, WO 94/20137 oder WO 94/05792). Unter Capsomeren versteht man eine oligomere Konfiguration, die aus fünf Ll -Proteinen aufgebaut ist. Das Capsomer ist der Grundbaustein, aus denen virale Capside aufgebaut sind. Unter stabilen Capsomeren versteht man Capsomere, die nicht dazu in der Lage sind sich zu Capsiden zusammenzusetzen. Unter Capsiden versteht man die Hülle des Papillomavirus, die beispielsweise aus 72 Capsomeren zusammengesetzt ist (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445). Unter VLP versteht man ein Capsid, das morphologisch und in seiner Antigenität einem intakten Virus gleicht. Die VLPs konnten zur Auslösung einer humoralen Immunantwort, die durch Bildung von neutralisierenden Antikörpern charakterisiert ist, in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern gegen Ll- und/oder L2 -Protein ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virasinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen keine Antikörper, sondern eine virus-spezifische zytotoxische T-ZelI-(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint. Und obwohl VLPs in der Lage sind eine zytotoxische T-Zell-Antwort auszulösen, scheint eine ausschließlich gegen die Kapsidproteine Ll und/oder L2 gerichtete Immunantwort nicht zur Bekämpfung eines durch Papillomaviren bedingten Tumors geeignet.
Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus-ähnliche Partikel (CVLPs für chimeric virus-like particle) entwickelt, die aus einem HPV- 16 Fusionsprotein des Kapsidproteins Ll und des potentiellen Tumorantigen E7 bestehen (WO 96/11272 und Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93). Die CVLPs lösten nur im geringen Maße eine gegen das E7-Protein gerichtete humorale Immunantwort aus (Müller, M. et al. (1997), supra). Einige der getesteten CVLPs induzieren je- doch tatsächlich die erwünschte E7-spezifische zytotoxische T-Zellantwort in Mäusen (siehe auch Peng S. et al. (1998) Virology 240,147-57). CVLPs sind des- halb sowohl für die Entwicklung eines Impfstoffes als auch für die Behandlung bereits bestehender Infektionen und daraus resultierender Tumore interessant, da die über MHC-Moleküle der Klasse I-präsentierten E7-Peptide von Tumorzellen Zielmoleküle von zytotoxischen T-Zellen darstellen würden.
Einem Impfstoff bestehend aus CVLPs liegt das Prinzip der Pseudoinfektion der Zellen durch die CVLPs zugrunde. Dies bedeutet, daß die CVLPs wie Viren in die Zelle gelangen, dort zu Peptiden prozessiert werden, die Peptide dann auf MHC- Klasse I und II-Moleküle geladen werden und letztendlich CD8- bzw. CD4- positiven T-Zellen präsentiert werden. CD8-Zellen können als Folge dieser Stimulation zu zytotoxischen T-Zellen differenzieren und dann eine zelluläre Immunantwort bewirken, CD4-Zellen hingegen entwickeln sich zu T-Helferzellen und stimulieren B-Zellen zu einer humoralen oder CD8-positive T-Zellen zu einer zytotoxischen Immunantwort und können selbst die Lyse von infizierten Zellen induzieren.
Kleine Peptide können bereits auf der Zelloberfläche an MHC-Klasse I-Moleküle binden und dann ohne weitere Prozessierung CD8- oder CD4-positive Zellen zu einer zellulären Immunantwort stimulieren. Ein bestimmtes Peptid kann jedoch nur durch bestimmte MHC-Moleküle gebunden werden. Durch den großen Poly- morphismus der MHC-Moleküle in natürlichen Populationen kann deshalb ein bestimmtes Peptid lediglich durch einen kleinen Teil einer Population gebunden und präsentiert werden. Unter Präsentation im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, wenn ein Peptid oder Proteinfragment an ein MHC-Molekül bindet, wobei diese Bindung beispielsweise im endoplasmatischen Retikulum, im extrazellulären Raum, den Endosomen, Proendosomen, Lysosomen oder Protyso- somen, stattfinden kann, und wenn dann dieser MHC-Molekül-Peptid-Komplex auf der extrazellulären Seite der Zellmembran gebunden ist, so daß er durch Im- munzeüen spezifisch erkannt werden kann. Da CVLPs sowohl eine zelluläre als auch humorale Immunantwort auslösen und nicht MHC-restringiert sind, eignen sich diese Partikel generell zur Entwicklung von Impfstoffen, indem die Fähigkeit zur Partikelbildung durch einen Ll -Anteil zur Verfügung gestellt wird und ein zusätzlicher Antigenanteil an diesen Ll- Anteil fusioniert wird.
Bei der Entwicklung derartiger CVLPs ist es unbedingt notwendig, ein funktio- nelles Testsystem zur Verfügung zu haben, mit dem man direkt die Immunogeni- tat von CVLPs untersuchen kann. Ein derartiges Testsystem sollte die Eigenschaft besitzen, daß CVLPs mit unterschiedlichen Antigenanteilen mit demselben Testsystem untersucht werden können. Da für immunologische Therapieverfahren von Tumoren oder Viruserkrankungen die zelluläre Immunantwort von entscheidender Bedeutung ist, stellte sich die Aufgabe, die durch CVLPs vom Typ 16 bzw. 18 hervorgerufene zelluläre Immunantwort meßbar zu machen.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang durch die Identifikation von HPV- 16 bzw. HPV- 18 T-Zell-Epitopen, die in Verbindung mit MHC-Molekülen in vivo und in vitro beispielsweise eine zytotoxische T-Zellantwort auslösen. Die erfindungsge- mäßen Peptide haben daher die Sequenz
YLPPVPVS WSTDEYVART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL, VGHPYFPIKKPN NKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP, WACVGVEVGRGQPLGVGISG, QPLGVGISGHPLLNKLDDTE, QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA, D VDTGFGAMDFTTLQANKS, VTVVDTTRSTNMSLCAAIST, TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL, IFQLCKITLTADVMTYIHSM, PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE, LKKYTFWEVNLKEKFSADLD, PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH, YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK, GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV, SIY PETQRLVWACAGVEIG, IYNPETQRL, PDYLQMSADPYGDS FFCLR, GDSMFFCLRREQLFARHFWN, NNGVCWHNQLFVTVVDTTRS, PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI, YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL, YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE, VDLLCHEQLSDSEEENDEID. SEEENDEIDGVNHQHLPARR. SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL, FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL, HGPKATLQDI, MHGPKATL oder FQQLFLNTL. Potentielle Epitope sind bereits in Käst et al., (1994) Journal of Immunology 152, 3904-3912 publiziert. Allerdings wird in dieser Publikation lediglich gezeigt, daß diese Peptide an HLA AI Moleküle binden können, jedoch nicht, daß tatsächlich ein zytotoxische T-Zellantwort ausgelöst werden kann. Des weiteren sind keine Daten aufgeführt, die dokumentieren, daß die Peptide als Bestandteil eines Proteins durch T-Zellen erkannt werden. Es wurde vielfach gezeigt, daß Peptide, die per se an HLA-Moleküle binden, nicht notwendigerweise auch durch T-Zellen erkannt werden. Des weiteren ist bekannt, daß T-Zellen, die zwar ein Peptid er- kennen, meßbar dadurch daß sie sich durch das Peptid zu einer T-Zellantwort induzieren lassen, nicht notwendigerweise auch Zellen erkennen, die mit ganzen Proteinen - enthaltend das entsprechende Peptid - beladen wurden. Dies ist dadurch zu erklären, daß oft Peptide Proteaseschnittstellen enthalten, innerhalb derer die Peptide während der Prozessierung der ganzen Proteine in der Zelle geschnit- ten und somit zerstört werden und somit nicht mehr durch T-Zellen erkannt werden können. Diese Problematik wird beispielsweise in Feltkamp et al. (1993), Eur. J. Immunol. 23: 2242-2249 bestätigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein T-Zell-Epitop mit einer Aminosäure- sequenz
YLPPVPVSKWSTDEYVART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL, VGHPYFPIKKPNNNKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP, WACVGVEVGRGQPLGVGISG, QPLGVGISGHPLLNKLDDTE, QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA, DMVDTGFGAMDFTTLQANKS, VTVVDTTRSTNMSLCAAIST, TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL, IFQLCKITLTADVMTYIHSM, PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE, LKKYTFWEVNLKEKFSADLD, PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH, YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK, GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV, SIYNPETQRLVWACAGVEIG, IYNPETQRL, PDYLQMSADPYGDSMFFCLR, GDSMFFCLRREQLFARHFWN, NNGVCWHNQLFVTVVDTTRS, PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI, YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL, YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE, VDLLCHEQLSDSEEENDEID, SEEENDEIDGVNHQHLPARR, SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL, FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL, HGPKATLQDI, MHGPKATL oder FQQLFLNTL und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
Unter einer funktioneil aktiven Variante der erfindugnsgemäßen T-Zell-Epitope versteht man ein T-Zell-Epitop, das in einem T-Zell-Zytotoxizitäts-Testsystem (siehe beispielsweise Beispiele 2-5 der vorliegenden Erfindung) eine, an der Zytotoxizität des erfindungsgemäßen T-Zell-Epitops gemessene Zytotoxizität besitzt, die mindestens der Summe aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und der dreifachen Standardabweichung entspricht, vorzugsweise von mindestens ca. 30%, insbesondere mindestens ca. 50% und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 80%.
Eine bevorzugte Variante ist beispielsweise ein T-Zell-Epitop mit einer Sequenzhomologie zu den erfindungsgemäßen T-Zell-Epitopen von mindestens ca. 65%, vorzugsweise mindestens ca. 15% und insbesondere mindestens ca. 85%) auf Aminosäureebene. Andere bevorzugte Varianten sind auch T-Zell-Epitope, die eine strukturelle Homologie zu den erfindungsgemäßen T-Zell-Epitopen besitzen. Solche Epitope können aufgefunden werden, indem man gegen die erfindungsgemäßen T-Zell-Epitope spezifische T-Zellen generiert (DeBruijn M.L. et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 2963-70; und DeBruijn M.L. (1992) Eur. J. Immunol. 22, 3013-20) und beispielsweise synthetisch hergestellte Peptide nach Wahl auf Erkennung durch die peptidspezifischen T-Zellen getestet werden (siehe Beispiele). Insbesondere werden unter T-Zellepitopen zytotoxische T-Zellepitope oder T- Helferzellepitope (TH, THI oder TH2) verstanden. Es sind jedoch auch nicht zyto- toxische T-Zellen bekannt, die ebenfalls MHC I-Moleküle erkennen können, so daß auch nicht-zytotoxische T-Zellepitope als Variante von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein T-Zell-Epitop, das Teil einer Verbindung ist, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes Ll Protein eines Papillomavirus und im Falle eines HPV- 16 T-Zell-Epitops keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich C-terminale Deletions- mutante eines natürlich vorkommenden Ll Proteins eines Papillomavirus ist. Bei¬
spielsweise kann die Verbindung eine Fusion von gleichen oder verschiedenen erfindungsgemäßen T-Zell-Epitopen darstellen.
In einer besonderen Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop und/oder eine funktioneil aktive Variante in einem Ll -Protein eines anderen Papillomavirus oder in einem Chimären Ll -Protein, beispielsweise einem HPV18L1E7- oder HPV16LlE7-Fusionsprotein, enthalten sein. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Vorzugsweise kann das genannte T-Zell-Epitop als Teil einer Verbindung ein Polypeptid, das in bevorzugter Weise weitere Aminosäuresequenzen enthält, ins- besondere ein Fusionsprotein sein. Insbesondere kann die Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-12 Aminosäuren Länge sein.
Um die Verbindung zu detektieren oder in ihrer Aktivität der Bindung an T-Zellen zu modifizieren, kann sie eine chemische, radioaktive Isotopen-, nicht radioaktive Isotopen-, und/oder Fluoreszensmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins enthalten.
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße chemische Markierung eignen, sind: Biotin, FITC (Fluorescei- nisothiocyanat) oder Streptavidin. Eine mögliche Ausführungsform ist, daß ein Peptid derart modifiziert wird, daß es mindestens ein Lysin enthält. An dieses Lysin wird in der dem Fachmann bekannter Weise Biotin oder FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt. Ein derar-
tig modifiziertes Peptid wird an ein entsprechendes MHC-Molekül oder an eine Zelle mit entsprechenden MHC-Molekülen gebunden. Daraufhin kann das Peptid über markiertes Avidin oder Streptavidin bzw. direkt über die Fluoreszenz des FITC nachgewiesen werden.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfindungs- gemäße radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: H, I, I, P, P oder
14, C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen, die sich für eine erfmdungs- gemäße nicht radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind: 2H oder 13C.
Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine erfindungsgemäße Fluoreszensmarkierung eignen, sind: 152Eu, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o- Phtaldehyd oder Fluorescamin.
Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bekannt, die auch im Sinne dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können.
Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemäßen chemischen Modifikationen sind die Übertragung von Acetyl-, Phosphat-, und/oder Monosacharid- gruppen Erfindungsgemäße Polypeptide mit einer Aminosäurelänge von ca. 50 können beispielsweise durch eine chemische Peptidsynthese hergestellt werden. Längere Polypetide werden vorzugsweise gentechnisch erzeugt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nukleinsäure, beispielsweise zur Expression des genannten T-Zell-Epitops oder der Verbindungen, die beispielsweise folgende Komponenten enthält: (a) mindestens ein regulatorisches Element und (b) mindestens eine Nukleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Verbindung kodiert. Das genannte Nukleinsäu- rekonstrukt ist vorzugsweise aus DNA oder RNA. Geeignete regulatorische Elemente erlauben beispielsweise die konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische Expression in eukaryotischen Zellen oder die konstitutive, metabolischspezifische oder regulierbare Expression in prokaryotischen Zellen. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfin- d ng sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer, und/oder Repres- sorsequenzen.
Beispiele für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eu- karyonten ermöglichen sind Promotoren die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, wie CMV -Enhancer, CMV-Promotor, SV40 Promotor und virale Promotor-und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV HTLV oder HIV.
Beispiele für regulierbare Elemente, die regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen sind der Tetrazyklinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Euka- ryonten ermöglichen sind die Promotoren der folgenden Gene: cdc25C, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolisch spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glucose- mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann beispielsweise auch für die Herstellung einer DNA-Vakzine verwendet werden. Dazu können die kodierenden Sequenzen für diese Epitope sowie für andere bereits bekannte Epitope von Papillomaviren in beliebiger Reihenfolge direkt oder mit mehreren Nukleotiden dazwischen in einem offenen Leserahmen aneinandergefügt werden. Femer können Papillomavi- rus-fremde DNA-Sequenzen angefügt werden, die zum Beispiel für ein intrazel- luläres Targeting der entstehenden Polypeptidkette eingesetzt werden, insbesondere in das endoplasmatische Retikulum, in die Endosomen oder die Lysomen.
Um die Einführung der genannten Nukleinsäure in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen, oder nicht viralen Vektors vorliegen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure ent- hält. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniavi- ren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht virale Vekto-
ren eignen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder Poly-Lysin konjugierte DNA.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Zelle, die mindestens ein T-Zell-Epitop enthält, vorzugsweise präsentiert. In einer besonderen Ausführungsform wird die Zelle durch einen der erfindungs gemäßen Vektoren transfiziert, transformiert oder infiziert. Beispielsweise exprimiert diese Zelle unter dem Fachmann bekannten Bedingungen, die zur Aktivierung der jeweils verwendeten regulierbaren Elemente führen, das erfindungsgemäße Polypeptid. Das Polypeptid kann dann aus dieser Zelle isoliert und z.B. unter Verwendung einer der oben genannten Markierungen aufgereinigt werden. Zur gentechnischen Herstellung eignen sich prokaryotische und eukaryotische Zellen, insbesondere Bakterienzellen wie beispielsweise E. coli, Hefezellen wie beispielsweise S. cerevi- siae, Insekten Zellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen (Sf-9) oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen. Anschließend können die exprimierten, erfindungsgemäßen Verbindungen nach Standardverfahren aufgereinigt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist es, die Zelle, die das erfindungsgemäße Polypeptide exprimiert, selbst zu verwenden, wobei in einer besonders bevorzug- ten Ausführungsform die Zelle Teile das erfindungsgemäßen Polypeptids über MHC-1 Moleküle auf der Zelloberfläche präsentiert. Für die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle sind Antigen-präsentierende Zellen wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen, Fibroblasten oder anderen HLA A2.01 positive Zellen, in einer bevorzugten Ausführungsform JY-, T2, CaSki- Zellen oder EBV-transformierte B-Zellinien (BLCL), geeignet. Die erfindungs- gemäßen Zellen, die ein Polypeptid enthaltend ein T-Zell-Epitop, präsentieren, können als Zielzellen zur Restimulation von Immunzellen, insbesondere T-Zellen und/oder zur Messung der Aktivierung von T-Zellen eingesetzt werden. Unter Zielzelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle zu verstehen, die ü-
ber MHC-Moleküle ein T-Zell-Epitope präsentiert und damit spezifisch eine T- Zell-Aktivierung hervorruft, insbesondere eine zytotoxische T-Zell-Reaktion gegen die Zelle.
Ferner kann die ein T-Zell-Epitop enthaltene Verbindung, Teil eines Komplexes sein, der dadurch charakterisiert ist, daß die Verbindung kovalent oder über hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindung oder Wasserstoffbrückenbindungen mit mindestens einer weiteren Spezies wie Peptide, Proteine, Peptoide, lineare oder verzweigte Oligo- oder Polysacharide und Nukleinsäuren verbunden ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Komplex enthaltend ein T- Zell-Epitop oder eine Verbindung und mindestens eine weitere Verbindung. Eine bevorzugte Ausführungsform ist, daß das Polypeptid in Verbindung mit MHC Klasse I-Molekülen, zum Beispiel als HLA A2.01 (oder auch HLA AI, HLA A24 etc.) Tetramer vorliegt. Besonders bevorzugt sind humane MHC-Klasse I Moleküle. Durch die Technik von Altman J.D. et al. (1996, Science 274, 94-6) lassen sich beispielsweise HLA A2.01 -Tetramer e mit den entsprechenden gebundenen Peptiden herstellen, die in der Lage sind, an die T-Zellrezeptoren von peptidspezi- fischen zytotoxischen T-Zellen zu binden.
Eine weitere Ausführangsform ist die Immobilisierung der erfindungsgemäßen Verbindung oder des genannten Komplexes an Trägermaterialien. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose oder Gerüstproteine.
Zur Aufreinigung des erfindungsgemäßen Komplexes kann eine Komponente des Komplexes zusätzlich noch ein Protein-Tag enthalten. Erfindungsgemäße Protein- Tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringen- tes Waschen mit geeigneten Puffern ohne den Komplex im nennenswerten Maße zu eluieren und anschließende gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele von dem Fachmann bekannten Protein-Tags, sind ein (HIS)6-Tag, ein Myc- Tag, ein FL AG-Tag, ein Hämaglutenin-Tag, Glutathion-Transferase (GST)-Tag, Intein mit einem Affinitäts- Chitin-binding Tag oder Maltose binding protein (MBP)-Tag. Die erfϊndungsgemäßen Protein-Tags können sich N-, C-terminal, und/oder intern befinden.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop. Ein derartiges Verfahren besteht vorzugsweise aus drei Schritten: a) In einem ersten Schritt werden Zellen mit mindestens einem erfindungs- gemäßen T-Zell-Epitop, vorzugsweise mit mindestens einer Verbindungen enthaltend ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop stimuliert. Diese Verbindung kann mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Cap- somer, mindestens ein VLP, mindestens ein CVLP, und/oder mindestens ein Virus bedeuten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Immunzellen durch die Inkubation mit CVLPs stimuliert. Diese Stimulation kann beispielsweise in Form einer Impfung erfolgen, oder durch Inkubation von Immunzellen mit CVLPs in vitro. Derartig stimulierte Immunzellen werden beispielsweise nach einer Impfung oder bei einem Tumorpatienten aus dem Blut, aus Tumoren oder aus Lymphknoten gewonnen, und/oder werden kultiviert.
b) In einem zweiten Schritt werden Zellen mit mindestens einem erfindungs- gemäßen T-Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell- Epitop präsentiert und/oder mit mindestens einem erfϊndungsgemäßen Komplex inkubiert. c) In einem dritten Schritt erfolgt die Bestimmung der Aktivierung von T- Zellen. Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der
Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Im- munology (1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies
D.H., Shevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 5ICr- Freisetzungstest (Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B- Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen, die erfindungsgemäße Markierungen enthalten, erlaubt die Detek- tion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop erkennen über den Nachweis der
Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und/oder Zellen an die T- Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-Komplexe an die Oberfläche der T- Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt werden, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC-spezifischen, mar- kierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem luorescens Activated
Cell Sorter' (FACS) messen und auswerten. Eine andere Möglichkeit zum
Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T-Zellen ist erneut die Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cytokinassay, Elispot, 5ICr- Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), bei- spielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (Anti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt a') enthält, der nach Schritt a) eingeführt wird. a') In diesem zusätzlichen dem Schritt a) nachfolgenden Schritt a') werden die isolierten oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit mindestens einem erfindungsgemäßen T-Zell-Epitop, mit mindestens einer erfϊndungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP und/oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere für mindestens ca. 1 Woche cokuitiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:
(i) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit mindestens einem erfindungsgemäßen T-Zell-Epitop, mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, minde- stens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
(ii) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
(iii) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop präsentiert, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehälter zu verste- hen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer T-Zell-Epitop präsentierenden Zielzelle. Hierbei ist es möglich, die Zielzelle mit Kombinationen von unterschiedlichen T-Zell-Epitopen zu beladen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit mindestens einem erfindungsgemäßen T-Zell-Epitop, mit mindestens einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop und/oder mindestens einem Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop inkubiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle in Wachstumsmedium, das erfindungsgemäße Polypeptide enthält, oder mit MHC Klasse I-Komplexen mit gebundenen erfindungsgemäßen Polypeptiden inkubiert. Die MHC Klasse I-Komplexe können beispielsweise als HLA A2.01- Tetramere vorliegen. Ein Tetramer bindet dabei in der Regel vier Peptide. Diese können sowohl identisch sein oder aber unterschiedliche Spezies von Peptiden repräsentieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert, transformiert und/oder infiziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielzelle mit einem Vakziniavirasvektor infiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Antigen-präsentierenden Zellen beispielsweise mit B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen, embryonalen Zel- len oder Fibroblasten oder anderen HLA-positiven Zellen, in einer Ausführungs- form mit JY-, T2-, CaSki- Zellen oder EBV-transformierten B-Zellinien durchgeführt.
Die verwendeten CVLPs enthalten ein Papillomavirus Ll -Protein oder Varianten davon, insbesondere HPV16 Ll -Protein und, jedoch nicht notwendigerweise, ein zu Ll heterologes Protein oder Varianten davon. Die zwei Proteine können direkt oder indirekt gebunden vorliegen. Direkt gebunden meint im Sinne der Erfindung, daß eine kovalente Bindung zwischen den beiden Proteinen vorliegt, beispielsweise eine Peptidbindung oder eine Disulfidbindung. Indirekt gebunden bedeutet, daß die Proteine über nicht-kovalente Bindungen gebunden sind, beispielsweise hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen oder Wasserstoffbrücken. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die CVLPs zusätzlich zu Ll -Protein oder Varianten davon ein Papillomavirus L2-Protein.
Eine bevorzugte Ausführung des Ll -Proteins der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Ll -Proteine mit einer oder mehreren Deletionen, insbesondere einer C-terminalen Deletion. Eine C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus-ähnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleare Lokalisationssignal deletiert wird. Die C- terminale Deletion beträgt daher vorzugsweise bis zu ca. 35 Aminosäuren, insbesondere ca. 25 bis ca. 35 Aminosäuren, vor allem ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren. Beispielsweise ist eine 32 Aminosäuren lange C-terminale Deletion des HPV16 Ll -Proteins ausreichend, um die Bildung von virus-ähnlichen Partikeln um das mindestens ca. zehnfache steigern zu können. Des weiteren kann das Ll -Protein eine oder mehrere Mutationen tragen oder der Ll -Anteil aus Ll -Proteinen verschiedener Papillomaviren zusammengesetzt sein. Gemeinsames Kennzeichen der erfindungsgemäßen Ll -Proteine ist, daß sie die Bildung von VLPs bzw. CVLPs zulassen und daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ll -Protein oder Varianten davon und das zu Ll heterologe Protein ein Fusionsprotein. Beinhaltet sind auch heterologe Proteine, die aus mehreren verschiedenen Proteinen oder Teilen davon zusammengesetzt sind. Dies können beispielsweise auch Epitope, insbesondere
zytotoxische T-Zellepitope von Proteinen sein. Epitope im Sinne der Erfindung können dabei auch Teil eines synthetischen Polypeptids mit einer Länge von ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9 Aminosäuren sein.
Bevorzugt sind zu Ll heterologe Proteine, die von einem viralen Protein abgeleitet sind, beispielsweise abgeleitet von HIV, HBV oder HCV, vorzugsweise von Papillomaviren, insbesondere von humanen Papillomaviren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies ein E-Protein eines Papillomavirus, vorzugsweise ein E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist bevorzugt, wenn das E-Protein ein deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletier- tes, insbesondere ein C-terminal deletiertes E7-Protein, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem Ll -Protein bevorzugt virus-ähnliche Partikel ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren.
In einer weiteren Ausführungsform kann das zu Ll heterologe Protein von Anti- genen nicht viraler Erreger abstammen. Ebenso können sie von Autoimmunanti- genen wie z.B. Thyroglobulin, Myelin basic protein oder Zona Pellucida Glyco- protein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z.B. Thyroiditis, Multiple Sklerose, Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind, abge- leitet sein. In einer bevorzugten Ausführung stammt das zu Ll heterologe Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ova- rialcarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncar- cinomantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c- erbB2), BCRA-1, BCRA-2.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen, die durch Präparation aus Proben gewonnen werden. Dieses Verfahren erlaubt es zu bestimmen, ob in einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten, Papillomavirus Ll -Protein-spezifische zytotoxische T-Zellen vorhanden sind. Ein derartiges Nachweisverfahren enthält die folgenden Schritte: a") In einem ersten Schritt werden Zellen gewonnen, beispielsweise durch Blutabnahme von einem Patienten oder durch die Präparation zum Beispiel von Tumoren oder Lymphknoten. Anschließend werden die Zellen in Wachstumsmedium aufgenommen und kultiviert. b) In einem zweiten Schritt werden Zellen mit mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert oder mit mindestens einem Komplex, der als eine Komponente eine Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitope umfaßt, inkubiert. c) In einem dritten Schritt erfolgt die Bestimmung der Aktivierang von T- Zellen. Hierfür geeignete Verfahren sind beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispiels- weise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), edited by Coligan J.E., Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. and Strober W., John Wiley & Sons), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr-Freisetzungstest (Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nach- weis der Proliferation (Chapter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Im- munzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B-Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen, Komplexen, und/oder Zellen, die Markierungen enthalten, erlaubt die Detektion von T-Zellen, die das T-Zell-Epitop er-
kennen über den Nachweis der Bindung markierter Verbindungen, Komplexe, und/oder Zellen an die T-Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung erfindungsgemäßer MHC-Polypeptid-Komplexe an die Oberfläche der T-Zellen nachgewiesen. Dies kann derart durchgeführt wer- den, daß die MHC-Komplexe selbst markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert sind, oder daß man in einem weiteren Schritt einen MHC- spezifischen, markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten Antikörper verwendet, um wiederum die MHC-Komplexe nachzuweisen. Die Fluoreszenzmarkierung der T-Zellen läßt sich dann beispielsweise in einem luo- rescens Activated Cell Sorter' (FACS) messen und auswerten. Eine andere
Möglichkeit zum Nachweis der Bindung von den Komplexen an die T- Zellen ist erneut die Messung der Aktivierung von T-Zellen (Cytokinassay, Elispot, Cr-Freisetzungstest, Proliferation, siehe oben). Allerdings benötigt man hierfür die gleichzeitige Stimulation von Korezeptoren (z. B. CD28), beispielsweise durch Korezeptor-spezifische Antikörper (Anti-CD28) und/oder andere unspezifische Aktivatoren (IL-2).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das einen zusätzlichen Schritt a') enthält, der nach Schritt a") eingeführt wird. a') In diesem zusätzlichen dem Scliritt a") nachfolgenden Schritt a')werden die isolierten oder kultivierten Zellen mit mindestens einer Zielzelle beladen mit mindestens einem erfindungsgemäßen T-Zell-Epitop, mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, minde- stens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP und/oder mindestens einem Virus, mit mindestens einem erfϊndungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell- Epitop, und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere für mindestens ca. 1 Woche cokultiviert, bevor sich Schritt b) anschließt.
Unter Cokultivierung ist das Wachstum der Zellen:
(i) in Gegenwart von mindestens einer Zielzelle beladen mit mindestens einem erfindungsgemäßen T-Zell-Epitop, mit einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, minde- stens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-
Epitop, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, mindestens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
(ii) in Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop,
(iii) in Gegenwart mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop präsentiert, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehälter zu verstehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem (Kit) zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend: a) mindestens ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop, mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor, mindestens eine erfindungsgemäße Zelle, und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex, und b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen. Das Testsystem wird in einer besonderen Ausführungsform zur Bestimmung der, beispielsweise in einer Blutprobe eines Patienten oder in Tumoren oder Lymphknoten eines Tumorpatienten vorhandenen Ll -Protein-spezifischen zytotoxischen T-Zellen verwendet. In diesem Fall sind die in b) beschriebenen Zellen im Test¬
system enthaltene Kontrollzellen, deren Aktivierung durch die erste Kitkomponente, die unter a) genannten Substanzen, als Standard dient. Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit die T-Zell-Aktivierung von aus Patienten isolierten Zellen durch die Kitkomponente a) verglichen.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird das Testsystem beispielsweise zur Bestimmung der Ll -Protein-spezifischen Antigenität einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines Komplexes enthaltend ein T-Zell-Epitop, eines Capsomers, eines stabilen Capsomers, eines VLPs, eines CVLPs, und/oder eines Virus verwendet. In diesem Fall sind die in a) beschriebenen Substanzen Kontrollsubstanzen deren aktivierende Wirkung auf die zweite Kitkomponente, die unter b) genannten Zellen, als Standard dient. Die in dieser Reaktion beobachteten Aktivierung wird mit der aktivierenden Wirkung einer Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop, einem Capsomer, einem stabilen Capsomer, einem VLP, ein CVLP, und/oder einem Virus auf die Kitkomponente b) verglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem erfindungsgemäßen T-Zell-Epitop, mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einem erfindungsgemäßen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthaltende Verbindung, mindestens einer erfindungsgemäßen Zelle enthaltend ein T-Zell- Epitop zur, und/oder mindestens einem erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort. Zur Stimulation von Immunzellen in vitro wie in vivo eignen sich insbesondere Zellen, die mindestens eines der erfindungsgemäßen Moleküle über ihre MHC- Klasse I-Moleküle präsentieren. Zur Antigen-Präsentation geeignete Zellen sind z. B. B -Zellen, dendritische Zellen, Macrophagen, Fibroblasten oder andere HLA-
positive Zellen, die durch eine gemeinsame Kultivierung mit Immunzellen eine Stimulation von spezifischen T-Zellen erreichen können.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung beispielsweise ein HPV18 LlE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthält, zur Detektion einer Immunantwort eingesetzt werden. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfmdungsgemäßes T-Zell-Epitop, mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop, mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine ein T-Zell-Epitop enthal- tende Verbindung, mindestens eine erfindungsgemäße Zelle enthaltend ein T- Zell-Epitop, und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Trägern sind Glas, Polystyren, Polypro- pylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Zellulose, Polyacrylamide, Agarose, Aluminiumhydroxid oder Magnitid. Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Lösung vorliegen, an eine feste Matrix gebunden sein, und/oder mit einem Adjuvans versetzt sein.
Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann auf verschiedene Weisen verabreicht werden. Beispiele von dem Fachmann bekannten Verabreichungsformen sind parenterale, lokale und/oder systemische Applikation durch z. B. orale, intranasale,
intravenöse, intramuskuläre, und/oder topische Applikation. Die bevorzugte Ap- plikationsform wird beispielsweise durch den natürlichen Infektionsweg der jeweiligen Papillomavirasinfektion beeinflußt. Die verabreichte Menge richtet sich nach Alter, Gewicht, allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten und dem Typ der Papillomavirasinfektion. Das Arzneimittel oder Diagnostikum kann in Form von Kapseln, Lösung, Suspension, Elixier (für orale Applikation) oder ste- rile Lösungen bzw. Suspensionen (für parenterale oder intranasale Applikation) verabreicht werden. Als inerter und immunologisch akzeptabler Träger kann beispielsweise Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung verwendet werden. Das Arzneimittel wird in therapeutisch effektiven Mengen verabreicht. Das bedeutet Mengen, die ausreichend sind, um eine schützende immunologische Ant- wort hervorzurufen.
In einer besonderen Ausführangsform kann eine erfindungsgemäße Verbindung beispielsweise ein HPV 18 LlE7-Fusionsprotein, das zusätzlich ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop enthält, als Arzneimittel oder Diagnostikum eingesetzt wer- den. Eine solche erfindungsgemäße Verbindung kann die Fähigkeit zur Bildung von CVLPs besitzen.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit JA WS-Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, JAWS-Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ-Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung eines 51 Cr-Freisetzungsexperiments nach Beladung von RMA-Zellen mit dem Peptid P33 (Zielzellen). Die Zielzellen wurden durch mit den Peptiden Pl bis P43 stimulierte T-Zellen (Effektorzellen) ly- siert, wobei das Verhältnis der eingesetzten Effektorzellen zu den eingesetzten Zielzellen 20 betrag. Auf der X-Achse sind RMA-Zellen mit Puffer inkubiert (Negativkontrolle) bzw. RMA-Zellen mit dem P33 -Peptid inkubiert, aufgetragen. Auf der Y-Achse sind die %> der spezifisch lysierten Zielzellen, bestimmt durch die Freisetzung von 51Cr aus den Zielzellen, aufgetragen. Die %-Werte wurden nach der in Beispiel 4 angegebenen Formel berechnet.
Fig. 3 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit LKK-Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, LKK-Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ-Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 4 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach
Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit LKK -Zellen, die unterschiedli- ehe Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, LKK-Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ-Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 5 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV 18 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrollen). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 6 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV18 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrollen). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 7 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Resti- mulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die das Q9 Peptid präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, BLCL steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wur- den. Fig. 8 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV 16 Peptidpools bzw. das P39-Peptid präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools (A bis H, 1 bis 7) bzw. für das jeweilige Peptid (P39) angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll steht für mit HPV 16 Ll-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrolle). Auf der Y-Achse der Fig. 8 oben ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv und somit als T-Helfer-1 -Zellen (THI) klassifiziert wurden. Auf der Y-Achse der Fig. 8 unten ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IL-4-Expression im FACScan-Experiment als T-Helfer-2-Zellen (TH2) klassifiziert wurden.
Fig. 9 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV16 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll steht für mit HPV16 Ll-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrollen). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T- Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 10 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Re- Stimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die das P33 Peptid präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des Peptids angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll steht für mit HPV16 Ll-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrollen). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden. Fig. 11 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV 18 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools (A bis H, 1 bis 7) angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrolle). Auf der Y-Achse der Fig. 11 oben ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv und somit als T-Helfer-l -Zellen (THI) klassifiziert wurden. Die Werte für Ll und E7 wurden gemeinsam mit der Negativ-Kontrolle mit einer unterschiedlichen Y- Achsen-Skalierung in einer separaten Graphik dargestellt (oben rechts). Auf der Y-Achse der Fig. 11 unten ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IL-4-Expression im FACScan-Experiment als T-HeIfer-2-Zeilen (TH2) klassifiziert wurden.
Fig. 12 zeigt die graphische Auswertung von vier FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV 18 Peptide bzw. Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids (Q38, Q39, Q46 oder Q47) angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrolle). Auf der Y-Achse ist jeweils der Anteil reaktiver T-Zellen angegeben. In Fig. 12 (oben links) ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv und somit als T-Helfer-l -Zellen (THι) klassifiziert wurden.
In Fig. 12 (oben rechts) ist der Anteil der CD 8 -positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktive zytotoxische T-Zellen klassifiziert wurden. In Fig. 12 (unten links) ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IL-4-Expression im FACScan-Experiment als T-Helfer-2-Zellen (Tκ_) klassifiziert wurden.
In Fig. 12 (unten rechts) ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die IL-4 exprimieren.
Fig. 13 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV16 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools (A bis H, 1 bis 7) angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV16 Ll- bzw. HPV16 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv-Kontrolle). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv und somit als zytotoxische T-Zellen klassifiziert wurden.
Fig. 14 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV 18 Peptidpools bzw. ein Peptid präsentieren. Auf der X- Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools (A bis H, 1 bis 7) bzw. des Peptids Q30 angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ- Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inhibierte BLCL (Positiv-Kontrolle). Auf der Y-Achse der Fig. 14 oben ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv und somit als T-Helfer-l -Zellen (THI) klassifiziert wurden. Auf der Y-Achse der Fig. 14 unten ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IL-4-Expression im FACScan-Experiment als T-Helfer-2-Zellen (TH2) klassifiziert wurden. Fig. 15 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit RMA-Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, RMA-Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ-Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 16 zeigt die graphische Auswertung eines 51 Cr-Freisetzungsexperiments nach Beladung von RMA- (oben) bzw. LKK-Zellen (unten) mit den Peptiden Q43, Q44 bzw. Q49 (Zielzellen). Die Zielzellen wurden durch mit den HPV18 Ll und E7- Peptidpools stimulierte T-Zellen (Effektorzellen) lysiert, wobei das Verhältnis der eingesetzten Effektorzellen zu den eingesetzten Zielzellen 20 betrag. Auf der X- Achse ist der Zelltyp sowie das Peptid angegeben, wobei die Zelle ohne Peptid als Negativ-Kontrolle fungiert. Auf der Y-Achse sind die % der spezifisch lysierten Zielzellen, bestimmt durch die Freisetzung von 51Cr aus den Zielzellen, aufgetragen. Die %- Werte wurden nach der Beispiel 4 angegebenen Formel berechnet.
Fig. 17 oben: HPV18E786.94 epitopreaktive T Zellen in H7J-A2 spezifischen T- Zelllinien. Durch in vitro Vakzinierung mit H7.1-A2 Zellen wurde eine T- Zelllinie generiert. Im ELISpot assay wurde sie gegen autologe PBMC, die mit dem Peptid HPV18 E786.9 beladen waren, getestet. T co steht für eine Negativ- Kontrolle mit unspezifischen T-Zellen, PBMC co steht für eine Negativ-Kontrolle mit PBMC, die nicht mit Peptid beladen wurden. Fig. 17 unten: Zytolytische Aktivität von HPV18E786.9 -spezifιschen T-Zellen. T Zelllinien zweier gesunder Blutdonoren wurden gegen das Epitop HPV18 E786. 4 hergestellt und im Zytotoxizitätstest (51Chrom-release assay) auf Lyse peptidge- pulster autologer BLCL (Effektor: Targetzellverhältnis von 30:1) getestet. BLCL co steht für eine Negativ-Kontrolle von BLCL, die nicht mit Peptid gepulst waren. Fig. 18 oben: Natürliche Prozessierang des Epitops HP VI 8 E786.9 durch dendritische Zellen. T-Zelllinien gegen HPV 18 E7 wurden durch in vitro Vakzinierung mit Protein- bzw. Peptidpool-beladenen autologen dendritischen Zellen generiert. Im ELISpot assay wurde die Stimulation von HPV18E786.94 spezifischen T-Zellen durch epitopbeladene dendritische Zellen (DC) gemessen. T co steht für eine Negativ-Kontrolle mit unspezifischen T-Zellen, DC co steht für eine Negativ- Kontrolle von DCs, die nicht mit Peptid beladen wurden. Fig 18 unten: Präsenz von HPV 18 E786.94 spezifischen T-Zellen in Populationen tumorinfiltrierender Lymphozyten. TIL einer HPV 18 positiven und HLA-A2 po- sitiven Patientin wurden in vitro expandiert und im ELISpot assay auf Reaktivität mit dem HPV 18 E786.9 Epitop getestet. T co steht für eine Negativ-Kontrolle mit unspezifischen T-Zellen, K-A2 für eine Negativ-Kontrolle von K-A2-Zellen, die nicht mit Peptid beladen waren.
Beispiele
1. Beschreibung der Ausgangsmaterialien
• Die Herstellung der HPV16LlΔc*E7ι-5 CVLPs erfolgte gemäß der deutschen Patentanmeldung DE 19812941, siehe auch Müller M. et al. (1997) Virology 234, 93-111.
• PBMC bedeutet periphere Blutmononukleäre Zellen, deren Isolierung wird beispielsweise in Rudolf M. P. et al. (1999), Biol. Chem. 380, 335-40 be- schrieben.
• BLCL bedeutet jeweils mit Hilfe des Epstein-Barr-Virus transformierte B- Zellinien, die für jeden Blutspender individuell hergestellt wurden (erhalten von Dr. Andreas Kaufmann, Jena, Deutschland).
• CVLP-stimulierter muriner T-Zellen wurden wie folgt gewonnen: 354Mehrere C57BL/6- oder C3H-Mäuse wurden 2 mal mit je 20 μg
HPV16L1AC*E7..55 CVLPs oder mit einem 1:1 Gemisch aus HPV18 L1ΔCDIE7I.53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE7I.60DI CVLPs bzw. zur Kontrolle mit Puffer immunisiert. Nach 2 Wochen wurden die Milzzellen nach Standardmethoden gewonnen.
• Splenozyten wurden wie folgt gewonnen:
Die Milz von nicht geimpften Mäusen wurde entnommen und die Milzzellen nach Standardmethoden resuspendiert.
• APC steht im Zusammenhang mit Zellen für Antigen-präsentierende Zellen. • JA WS-Zellen wurden von ATCC bezogen (CRL- 11904).
• LKK wurden von ATCC bezogen (CCL- 1 ).
• RMA-Zellen stammen aus einem Thymom einer C57BL/6-Maus (siehe Ljunggren H.G. and Karre K. (1985) J. Exp. Med. 162, 1745-59).
• α-mouse CD8/PE bedeutet ein monoklonaler Ratten- Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil des murinen CDS gerichtet ist und den Fluores- zenzmarker Phycoerithrin enthält (Pharmingen, Heidelberg, Deutschland).
• α-mouse CD4/Cychrome bedeutet ein monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil des murinen CD4 gerichtet ist und den Fluo- reszenzmarker Cychrome enthält (Pharmingen, Heidelberg, Deutschland).
• α-mouse IFNγ/FITC bedeutet ein monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen das murine Interferon γ gerichtet ist und den Fluoreszenzmarker FITC enthält (Caltag, Hamburg, Deutschland).
• α-human CD8/APC bedeutet ein monoklonaler Maus Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil des humanen CD8 gerichtet ist und den Fluoreszenzmarker APC enthält (Caltag, Hamburg, Deutschland).
• α-human CD4/PerCP bedeutet ein monoklonaler Maus Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil des humanen CD4 gerichtet ist und den Fluoreszenzmarker PerCP enthält (Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland). • α-human IFNγ/FITC bedeutet ein monoklonaler Maus Antikörper, der gegen das humane Interferon γ gerichtet ist und den Fluoreszenzmarker FITC enthält (Caltag, Hamburg, Deutschland).
• α-human IL4/PE bedeutet ein monoklonaler Maus Antiköφer, der gegen das humane Interleukin 4 gerichtet ist und den Fluoreszenzmarker Phycoe- rithrin enthält (Caltag, Hamburg, Deutschland).
• Humanes GM-CSF (Leukomax) wurde von Novartis Pharma GmbH (Nürnberg, Deutschland) bezogen.
• Humanes IL4 wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezo- gen.
• Humanes IL2 wurde von Becton Dickinson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• Monensin wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. • Triton XI 00 wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
• Zellen wurden jeweils bei 37°C und 5% CO2 in RPMI-Medium (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum, Kanamycin und Ampillin kultiviert.
• Luma-Platten und er Canberra-Packerd B-Plate Counter wurden von Can- berra-Packerd, Dreieich, Deutschland bezogen.
• FACScan calibur bedeutet 'fluorescens activated cell sorter'; die Apparatur wurde von Becton Dickenson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• Cellquest Software wurde von Becton Dickenson (Hamburg, Deutschland) bezogen. • Es wurden um jeweils 9 Aminosäuren überlappende 20mer-Peptide synthetisiert, welche die Sequenz des Ll und des E7 Proteins von HPV 16 umfassen. Die Peptide wurden von 1 bis 52 durchnummeriert. Ihr Name und ihre Sequenz sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Tabelle 1 : Synthetische überlappende 20mer Peptide von HPV16 Ll und E7 Peptid Nr. Sequenz relative Position
HPV16 L1-Peptide
Pl MSLWLPSEATVYLPPVPVSK 1 -20
P2 YLPPVPVSKVVSTDEYVART 12 -31
P3 STDEYVARTNIYYHAGTSRL 23 -42
P4 YYHAGTSRLLAVGHPYFPIK 34 -53
P5 VGHPYFPIKKPNNNKILVPK 45 -64
P6 NNNKILVPKVSGLQYRVFRI 56 -75
P7 GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP 67 -86
P8 PDPNKFGFPDTSFYNPDTQR 78 -97
P9 SFYNPDTQRLVWACVGVEVG 89 -108
P 10 WACVGVE VGRGQ PLGVG I S G 100 -119
Pl l QPLGVGISGHPLLNKLDDTE 11 1 -130
P12 LLNKLDDTENASAYAANAGV 122 -141
P13 SAYAANAGVDNRECISMDYK 133 -152
P14 RECISMDYKQTQLCLIGCKP 144 -163
P15 QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP 155 -174
P16 GEHWGKGSPCTNVAVNPGDC 166 -185
P17 NVAVNPGDCPPLELINTVIQ 177 -196
P18 LELINTVIQDGDMVDTGFGA 188 -207
P19 DMVDTGFGAMDFTTLQANKS 199 -218
P20 FTTLQANKSEVPLDICTSIC 210 -229
P21 PLDICTSICKYPDYIKMVSE 221 -240
P22 PDYIKMVSEPYGDSLFFYLR 232 -251
P23 GDSLFFYLRREQMFVRHLFN 243 -262
P24 QMFVRHLFNRAGAVGENVPD 254 -273
P25 GAVGENVPDDLYIKGSGSTA 265 -284
P26 YIKGSGSTANLASSNYFPTP 276 -295
P27 ASSNYFPTPSGSMVTSDAQI 287 -306
P28 SMVTSDAQIFNKPYWLQRAQ 298 -317 P29 KPYWLQRAQGHNNGICWGNQ 309 -328
P30 NNGICWGNQLFVTVVDTTRS 320 -339
P31 VTVVDTTRSTNMSLCAAIST 331 -350
P32 MSLCAAISTSETTYKNTNFK 342 -361
P33 TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL 353 -372
P34 LRHGEEYDLQFIFQLCKITL 364 -383
P35 IFQLCKITLTADVMTYIHSM 375 -394
P36 DVMTYIHSMNSTILEDWNFG 386 -405
P37 TILEDWNFGLQPPPGGTLED 397 -416
P38 PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA 408 -427
P39 RFVTSQAIACQKHTPPAPKE 419 -438
P40 KHTPPAPKEDPLKKYTFWEV 430 -449
P41 LKKYTFWEVNLKEKFSADLD 441 -460
P42 KEKFSADLDQFPLGRKFLLQ 452 -471
P43 PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH 463 -473 und
E7 1-9
HPV16E7 Peptide
P44 MHGDTPTLHEYMLDLQPETT 1 -20
P45 MLDLQPETTDLYCYEQLNDS 12-31
P46 YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA 23-42
P47 EEDEIDGPAGQAEPDRAHYN 34-53
P48 AEPDRAHYNIVTFCCKCDST 45 -64
P49 TFCCKCDSTLRLCVQSTHVD 56 -75
P50 LCVQSTHVDIRTLEDLLMGT 67 -86
P51 TLEDLLMGTLGIVCPICSQKP 78 -97
Unter HPV16 Ll -Peptidpools wird das Gemisch der Peptide Pl bis P43, unter HPV16 E7-Peptidpools das Gemisch der Peptide P44 bis P51 verstanden.
Des weiteren wurden um jeweils 9 Aminosäuren überlappende 20mer~ Peptide synthetisiert, welche die Sequenz des Ll und des E7 Proteins von HPV18 umfassen. Die Peptide wurden von 1 bis 52 durchnummeriert. Ihr Name und ihre Sequenz sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Tabelle 2: Synthetische überlappende 20mer Peptide von HPV18 Ll und E7
Peptid Nr. Sequenz relative Position
HPV18L1 Peptide
Ql MALWRPSDNTVYLPPPSVAR 1 -20
Q2 YLPPPSVARVVNTDDYVTRT 12-31
Q3 NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL 23-42
Q4 FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP 34 -53
Q5 VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK 45 -64
Q6 GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV 56-75
Q7 AYQYRVFRVQLPDPNKFGLP 67 -86
Q8 PDPNKFGLPDTSIYNPETQR 78-97
Q9 SIYNPETQRLVWACAGVEIG 89-108
Q10 WACAGVEIGRGQPLGVGLSG 100-119
Qll QPLGVGLSGHPFYNKLDDTΞ 111-130
Q12 FYNKLDDTESSHAATSNVSE 122 -141
Q13 HAATSNVSEDVRDNVSVDYK 133 -152
Q14 RDNVSVDYKQTQLCILGCAP 144-163
Q15 QLCILGCAPAIGEHWAKGTA 155 -174
Q16 GEHWAKGTACKSRPLSQGDC 166-185
Q17 SRPLSQGDCPPLELKNTVLE 177 -196
Q18 LELKNTVLEDGDMVDTGYGA 188-207
Q19 DMVDTGYGAMDFSTLQDTKC 199-218
Q20 FSTLQDTKCEVPLDICQSIC 210-229
Q21 PLDICQSICKYPDYLQMSAD 221 -240
Q22 PDYLQMSADPYGDSMFFCLR 232-251
Q23 GDSMFFCLRREQLFARHFWN 243 -262
Q24 QLFARHFWNRAGTMGDTVPQ 254 -273
Q25 GTMGDTVPQSLYIKGTGMRA 265 -284
Q26 YIKGTGMRASPGSCVYSPSP 276-295
Q27 GSCVYSPSPSGSIVTSDSQL 287-306 Q28 SIVTSDSQLFNKPYWLHKAQ 298-317
Q29 KPYWLHKAQGHNNGVCWHNQ 309 -328
Q'30 NNGVCWHNQLFVTWDTTRS 320 -339
Q31 VTWDTTRSTNLTICASTQS 331 -350
Q32 LTICASTQSPVPGQYDATKF 342 -361
Q33 PGQYDATKFKQYSRHVEEYD 353 -372
Q34 YSRHVEEYDLQFIFQLCTIT 364 -383
Q35 FIFQLCTITLTADVMSYIHS 375 -394
Q36 ADVMSYIHSMNSSILEDWNF 386-405
Q37 SSILEDWNFGVPPPPTTSLV 397 -416
Q38 PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI 408 -427
Q39 YRFVQSVAITCQKDAAPAEN 419 -438
Q40 QKDAAPAENKDPYDKLKFWN 430 -449
Q41 PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL 441 -460
Q42 LKEKFSLDLDQYPLGRKFLV 452 -471
Q43 YPLGRKFLVQAGMHGPKATL 463 -474 und E7 1-8
HPV18 E7 Peptide
Q44 MHGPKATLQDIVLHLEPQNE 1 - 20
Q45 VLHLEPQNEIPVDLLCHEQL 12 - 31
Q46 VDLLCHEQLSDSEEENDEID 23 - 42
Q47 SEEENDEIDGVNHQHLPARR 34 - 53
Q48 NHQHLPARRAEPQRHTMLCM 45 - 64
Q49 PQRHTMLCMCCKCEARIKLV 56 - 75
Q50 KCEARIKLWESSADDLRAF 67 - 86
Q51 SSADDLRAFQQLFLNTLSFV 78 - 97
Q52 LFLNTLSFVCPWCASQQ 89 -104
Unter HPV 18 Ll -Peptidpools wird das Gemisch der Peptide Ql bis Q43, unter HPV18 E7-Peptidpools das Gemisch der Peptide Q44 bis Q52 verstanden. 2. Herstellung von HPN18 1ΔCDIE7I.53DI CVLPS und HPV18 LlΔCDιE7ι. 60DI CVLPs
a) Herstellung der Konstrakte Die kodierenden Nukleinsäuren für die einzelnen Papillomaviras-spezifischen Proteine wurden beispielsweise über eine PCR („polymerase chain reaction")-
Amplifizierang aus einer Genbank isoliert und kloniert. Das Genom von HPV 18 ist unter der GenBank Accession No. X05015 allgemein erhältlich und wurde von Cole und Danos publiziert {J. Mol. Biol. 1987, 193 (4), 599-608).
Die für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Fusionsproteine zugrunde gelegte Sequenz besaß dazu folgende Änderungen im Ll Gen: An den Positionen 89, 848, 1013 und 1230 des Ll-Gens wurde auf DNA-Ebene ein C gegen ein G ausgetauscht. Auf Protein-Ebene führen die ersten drei Änderungen zu einem Austausch von Pro nach Arg, während die letzte Mutation keine Änderung auf Protein-Ebene zur Folge hat. Das E7 Gen entspricht der publizierten Sequenz.
Eine andere Methode, die gewünschten Nukleinsäuren zu erhalten, ist, die Papil- lomavirus-spezifischen Gene direkt aus Warzen oder Tumore mittels PCR zu isolieren. Geeignete Primer für die E6- und E7-Gene aus HP VI 6 und HPV 18 sind z.B. in WO93/21958 offenbart. Weitere Literaturstellen für die gewünschten Nukleinsäuren sind beispielsweise Kirnbaum, R. et al. (1994), J. Virol., 67, 6929- 6936 bzw. die oben bereits erwähnten in der EMBL-Datenbank hinterlegten Klo- ne.
Zur Herstellung von HPV18L1ΔCDI wurden zwei Primer konstruiert, die zum offenen Leserahmen (ORF) von HPV18L1 komplementär sind. Der erste Primer hat die Sequenz 5 ' -ACC AGA CTC GAG ATG GCT TTG TGG CGG CCT AGT GAC-3 '
und der zweite Primer
5 ' -ATA GCC 7AAG CTT AAT GAT ATC CTG AÄC CAA AAA TTT ACG TCC-3 '
Der erste Primer kodiert 5' eine Xhol Restriktionsenzymschnittstelle. Der zweite Primer kodiert 5' eine EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle. Auf die EcoRV Stelle folgt ein TAA Translationsstopkodon, um die letzten 35 Aminosäuren des HPV18L1 ORF zu deletieren. Das PCR-Produkt wurde mit XhoI/EcoRV gespalten und in den ebenfalls XhoI/EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript® ligiert. Das erhaltene Konstrukt HPV18L1ΔCDI pKS wurde benutzt, um den ORF von HPV18E7I.53DI und HPV18E71.60Dι in die EcoRV Stelle zu klonieren.
Zur Klonierung der HPV18 E7 Fragmente wurden Primer mit einer 5 '-EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle verwendet. Es wurde folgende Primerpaare einge- setzt:
5'-GGC CAT GAT ATC ATG CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG-3
(5 '-Ende des E7 Gens)
und
5'-GGC CAT GAT ATC TCG TCG GGC TGG TAA ATG TTG ATG-3'
(3 '-Ende des E7I-53DI Fragments) bzw.
5'-GGC CAT GAT ATC TGT GTG ACG TTG TGG TTC GGC TC-3
(3 '-Ende des E7I.60DI Fragments).
Die PCR Produkte wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV Stelle des modifizierten Ll-Gens insertiert.
Die Klone wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert. Anschließend wurden die HPV18L1ΔCDIE7]. 3DI bzw. HPV18L1ΔCD.E7I.6ODI Fusionsgene durch Bglll/EcoRI Restriktionsverdau aus dem Vektor pBluescript® herausgeschnitten und in den Bglll/EcoRI gespaltenen Baculovirus Transfervektor pVL1392 Iigiert, um rekombinante Baculoviren herzustellen.
b) Herstellung rekombinanter Baculoviren
Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen wurden als Monolayer oder in Suspensionskultur in TNM-FH Insektenmedium (Life Technologies, Karlsruhe) mit 10% fötalem Kälberserum und herangezogen. Rekombinante Baculoviren wurden durch Cotransfektion von 5 μg der rekombinanten Plasmide und 1 μg von lineari- siertem Baculo-Gold® DNA (Pharmingen, San Diego, CA) in Sf9 Zellen hergestellt. Rekombinante Viren wurden durch Endpunktverdünnung und/oder Plaque- Vereinzelung gereinigt. Um die Expression zu testen, wurden 106 Sf9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus und einer m.o.i. („multiplicity of infection") von 0,5 und 1 für 48h und infiziert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM Kcl, 8,1 mM Na2PO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden dann durch FACS-Messung un- tersucht oder in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-Gelchromatographie und Immunoblotassay getestet.
c) Reinigung von Chimären virus-ähnlichen Partikeln
Für die Herstellung von CVLPs wurden Sf9 oder SF-t-Zellen bei 27°C bis zu einer Dichte von 1,5-2 x 106 Zellen pro ml in den serumfreien Medien InsectXPress (Biowhittaker, Verviers, Belgien) oder Sf 900II (Life Technologies, Karlsrahe) gezüchtet. Eine 200 ml Kultur wurde mit einer m.o.i. von 1 bis 2 mit rekombi- nanten Baculoviren für 48h infiziert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und bei -80°C eingefroren. Frier-Tau Lyse erfolgte durch Zugabe von 4 Vol. Extraktionspuffer (200 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,5). Die Klärung des Homo- genats erfolgte durch Zentrifugation bei 10.000 rpm im Sorvall SS34 Rotor. Die Aufreinigung des L1E7 Proteins aus dem geklärten Rohextrakt für die immunolo- gischen Assays erfolgte durch Ammoniumsulfat-Fällung bei 35-40% Sättigung und anschließende Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel® TMAE (Merck, Darmstadt), wobei die CVLPs im linearen Salzgradienten bei 300- 400mM NaCl eluiert werden. Die Bestimmung des Proteingehalts der gereinigten Fraktionen erfolgte nach der Bradford-Methode unter Verwendung von Rinder- serumalbumin als Standard.
3. Restimulation von HPV 16 Ll Peptid-stimulierten murinen T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Murine T-Zellen (4x105) von HPV16LlΔC*E7ι.55 CVLP-gei pften C57BL/6- Mäusen wurden für 5 Wochen mit HPV16 Ll Peptidpools bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml je einzelnes Peptid sowie 105 Antigen- präsentierenden Zellen (bestrahlte Splenozyten) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 1 μg/ml der auf der X- Achse der Fig. 1 angegebenen Peptide sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (JAWS) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurden 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wur- den für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-mouse CD8/PE, mit α-mouse CD4/Cychrome und mit α-mouse Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 1 oben zeigt für die Peptide P18, P19, P43 bzw. Fig. 1 unten für die Peptide P35 und P3, daß die mit diesen Peptiden inkubierten JA WS-Zellen eine Restimulation von Peptid-stimulierten CD8-positiven murinen T-Zellen bewirkten. Die Peptide P3, P18, P19, P35 und P43 enthalten somit H2b-restringierte zytotoxische T-Zellepitope.
4. Lyse von mit P33 beladenen RMA-Zellen
RMA-Zellen wurden mit 51Cr für eine Stunde bei 37°C inkubiert, dreimal mit Medium gewaschen und in 2 Aliquots aufgeteilt. Zum einen Aliquot der Zellen wurden 10 μg/ml de P33 -Peptids gegeben, das andere Aliquot diente als Negativkontrolle in Abwesenheit des Peptids. Anschließend wurden jeweils 2000 der Zellen (=Zielzellen) zu 40.000 T-Zellen (=Effektorzellen) in einem Gesamtvolumen von 150 μl gegeben. Die T-Zellen waren zuvor über 5 Wochen mit einem Gemisch aus 43 Peptiden (Peptide 1-43, je 1 μg/ml) stimuliert worden.
Parallel wurden Ansätze für spontane und maximale Lyse der Zellen angesetzt. Für die spontane Lyse dienten Zielzellen, die mit Kulturmedium inkubiert wur- den. Für die maximale Lyse wurden Zielzellen durch Zugabe von 0,5% Triton XlOO lysiert.
Die Ansätze wurden für 5h bei 37°C inkubiert. 50 μl Überstand der Ansätze wur- den auf Luma-Platten gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Am nächsten morgen wurde die Menge an radioaktivem 51Cr mit Hilfe eines Can- berra-Packerd B-PIate Counter bestimmt (counts) und in Relation zu den maximal lysierten Zellen des Triton-Ansatzes gesetzt. Dabei wurden die % spezifische Lyse nach der Formel:
x = 100 • (counts - spontan counts) / (maximal counts - spontan counts) bestimmt.
Fig. 2 zeigt, daß die mit dem P33 -Peptid beladenen RMA-Zellen effektiv durch die T-Zellen lysiert werden konnten, die nicht beladenen RMA-Zellen hingegen nicht. Das P33-Peptid ist somit ein H2b restringiertes zytotoxisches T-Zellepitop.
5. Restimulation von HPN18 Peptid-stimulierten murinen T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Murine T-Zellen (4xl05) von HPV18 LlΔCD.E7ι-53Dι CVLP- und HPV18 Ll cD.E7ι-60Di CVLP-geimpften C3H-Mäusen wurden für 5 Wochen mit HPV 18 Ll oder E7 Peptidpools bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml je einzelnes Peptid sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte Splenozyten) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 1 μg/ml der auf der X-Achse der Fig. 3 angegebenen Peptide sowie 105 Antigen-präsentierende Zellen (LKK) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen. Nach einer Stunde wurden 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-mouse CD8/PE, mit α-mouse CD4/Cychrome und mit α-mouse Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 3 zeigt für die Peptide Q22, Q23, Q51, Q43 und Q44 bzw. Fig. 4 für die Peptide Q41 und Q5, daß die mit diesen Peptiden inkubierten LKK-Zellen eine Restimulation von Peptid-stimulierten murinen CD8-positiven T-Zellen bewirkten. Die Peptide Q5, Q22, Q23, Q41, Q43, Q44 und Q51 enthalten somit H2k-restringierte zytotoxische T-Zellepitope.
6. Restimulation von HPN18 CNLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Humane T-Zellen (4xl05) eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders wurden für 1 Woche mit HPN18 L1ΔCDIE7I.53DI CVLPS und HPV18 L1ΔCDIE7I.60DI CVLPs, 800 U/ml humanem GM-CSF und 500 U/ml humanem IL4 sowie für weitere 5 Wo- chen mit HPV18 1ΔCDIE7I.53DI CVLPS und HPV18 LlΔCDiE7ι-60Di CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml des CVLPs-Gemisches (Verhältnis 1:1 der beiden Konstrukte) sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet. Die 20mer-Peptide Ql bis 52 wurden gemäß der Matrix
in Peptidpools A bis H bzw. 1 bis 7 zusammengefaßt.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde.
Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv- Kontrollen mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert. Ergebnis: Fig. 5 zeigt, daß insbesondere die mit den Peptidpools F und 1 inkubierten BLCL eine Restimulation von CVLP-stimulierten humanen CD4- positiven T-Zellen bewirkten. Des weiteren zeigten die Peptidpools A und 6 eine deutlich über der Negativkontrolle liegende Restimulation. Die mit den übrigen Peptidpools inkubierten BLCL bzw. die Negativkontrolle oder die mit dem E7- Peptidpool inkubierten BLCL wiesen hingegen einen geringen Anteil an reaktiven CD4-positiven T-Zellen auf. Die Peptidpools F und 1 enthalten gemeinsam das Peptid Q6, das somit für die Restimulation der CVLP-stimulierten T-Zellen verantwortlich ist. Das Peptid Q6 enthält somit ein T-Helferepitop. Die Peptidpools A und 1 enthalten als gemeinsames Peptid Ql, A und 6 Q41 sowie F und 6 Q46. Somit enthalten auch die Peptide Ql, Q41 und Q46 T-Helferepitope.
7. Restimulation von HPV 16 CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA -typisierten Blutspenders mit HPV16LlΔC*E7ι- CVLPs stimuliert und geerntet.
Die 20mer-Peptide Pl bis 51 wurden gemäß der Matrix
in Peptidpools A bis H bzw. 1 bis 7 zusammengefaßt.
Anschließend wurden die T-Zellen wie in Beispiel 6 beschrieben restimuliert, fixiert, permeabilisiert und gefärbt. Die Auswertung erfolgte ebenso wie in Beispiel 6 beschrieben.
Ergebnis: Fig. 6 zeigt für die Peptidpools G und 3, daß die mit diesen Peptidpools inkubierten BLCL eine Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten. Des weiteren zeigten die Peptidpools B und C sowie 2 und 4 eine deutlich über der Negativkontrolle liegende Restimulation. Die mit den übrigen Peptidpools inkubierten PBMC bzw. die Negativkontrolle inkubierten PBMC wiesen hingegen einen geringen Anteil an reaktiven CD4-positiven T-Zellen auf, nicht aber die mit den übrigen Peptidpools inkubierten BLCL bzw. die Negativkontrolle oder die mit dem E7-Peptidpool inkubierten PBMC. Die Peptidpools G und 3 enthalten gemeinsam das Peptid P23, B und 2 enthalten PIO, B und 3 Pl 8, B und 4 P26, C und 2 Pl l, C und 3 P19, C und 4 P27, G und 2 P15 sowie G und 4 P31. Diese Peptide sind somit jeweils für die Restimulation der CVLP-stimulierten T-Zellen
verantwortlich. Die Peptide PIO, Pl l, P15, P18, P19, P23, P26, P27 und P31 enthalten somit jeweils ein T-Helferepitop.
8. Restimulation von HPV 18 Ll -Peptid stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 3 wurden humane T-Zellen (4xl05) eines HLA A24-positiven Spenders für 3 Wochen mit dem HPV18 Ll-Peptidpool bei 37°C unter wöchentli- cher Zugabe 1 μg/ml je einzelnes Peptid sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geemtet.
Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml des HPV 18 Ll -Peptids Q9 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor- identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ- Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurden 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wur- den für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α-human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 7 zeigt, daß die mit dem Peptid Q9 inkubierten BLCL-Zellen eine Restimulation von HPV18 Ll-Peptidpool-stimulierten CD8-positiven T-Zellen bewirkten. Somit enthält das Peptid Q9 ein HLA A24-restringiertes zytotoxisches T-Zellepitop.
Anhand des Algorithmus für potentielle HLA A24-bindende Peptide (Paker, KC et al. (1994) J. Immunol. 152:163), durchgeführt in dem sogenannten Peptid- Prediction Program von Parker unter http.J/www- bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/, wurde festgestellt, daß das Peptid lYNPETQRL an MHC-Klasse I Moleküle des Haplotyps HLA A24 bindet. Das Peptid lYNPETQRL ist somit für die Restimulation der T-Zellen durch die mit dem Q9-Peptid inkubierten BLCL-Zellen verantwortlich ist. Somit ist das Peptide lYNPETQRL, das in dem Peptid Q9 der überlappenden 20mere enthalten ist, ein HLA A24-restringiertes zytotoxisches T-Zellepitop.
9. Restimulation von HPV16 CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders mit HPV16LlΔC*E7ι-55 CVLPs stimuliert und geemtet.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools aus Beispiel 7 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor- identischen BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inku- bierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPV 16 Ll-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per-
meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 8 (oben) zeigt, daß der Anteil der CD4- und IFNγ-positiven Zellen für die mit den Peptidpools G und 5 inkubierten BLCL ebenso wie für die mit P39 inkubierten BLCL sehr hoch ist. Da die Peptidpools G und 5 als gemeinsames Peptid P39 enthalten, das für sich alleine ebenfalls eine Restimualtion von CVLP- stimulierten T-Zellen bewirkte, enthält das Peptid P39 ein T-Helferepitop. Da CD4- und IFNγ-positive Zellen in der Regel THι -Zellen sind, handelt es sich somit um ein THi-Epitop.
Des weiteren war der Anteil der CD4- und IL4-positiven Zellen (Fig. 8 unten) für die mit den Peptidpools F, G und 5 inkubierten BLCL deutlich erhöht gegenüber dem Anteil reaktiven Zellen, die mit den übrigen Peptidpools inkubierten BLCL bzw. der Negativkontrolle. CD4- und IL4-positive Zellen sind in der Regel TH2- Zellen. Dies wiederum besagt, daß das in G und 5 enthaltene Peptid P39 zusätzlich auch ein Tm-Epitop enthält oder mit dem Tπi-Epitop identisch ist und daß zusätzlich das in F und 5 enthaltene Peptid 38 ein T^-Epitop enthält.
10. Restimulation von HPV 16 CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders mit HPV16Ll c*E7ι-5 CVLPs stimuliert und geerntet.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools aus Beispiel 7 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor- identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inku- bierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPV 16 Ll-Pool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 9 zeigt, daß der Anteil der CD8-positiven T-Zellen für die mit den Peptidpools B, E, G und 1 inkubierten BLCL hoch ist. Da die Peptidpools B und 1 als gemeinsames Peptid P2, die Peptidpools E und 1 P5 sowie G und 1 P7 enthalten, enthalten die Peptide P2, P5 und P7 je ein zytotoxisches T-Zellepitop.
11. Restimulation von HPV 16 CNLP-stimulierten T-Zellen mit P33- stimulierten Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Blut- Spenders mit HPN 16L 1 Δc*E71 -55 CVLPs stimuliert und geerntet.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 1 μg/ml Peptid P33 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL) in
Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv-Kontrolle mit HPV16 Ll-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weite- re 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4 PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierang in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 10 zeigt, daß der Anteil der CD8-positiven Zellen für die mit dem P33 Peptid inkubierten BLCL deutlich höher ist als in der Negativkontrolle. P33 enthält somit ein zytotoxisches T-Zellepitop.
12. Restimulation von HPN18 CNLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders mit HPV18L1ΔCDIE7I-53DI CVLPs und HPV18L1ΔCDIE71.60DI CVLPs bei 37°C stimuliert und geerntet.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den HPV18- Peptidpools aus Beispiel 6 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor- identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inku- bierte Zellen, als Positiv-Kontrolle mit HPV 18 Ll-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert. Ergebnis: Fig. 11 (oben) zeigt, daß der Anteil der CD4- und IFNγ-positiven Zellen für die mit den Peptidpools F, G, 5 und 6 inkubierten BLCL hoch ist. Den Peptidpools F und 5 ist das Peptid Q38, F und 6 das Peptid Q46, G und 5 das Peptid Q39 sowie G und 6 das Peptid Q47 gemeinsam. Somit enthalten die Peptide Q38, Q39, Q46 und Q47 je ein THι-Epitop.
Fig. 11 (unten) zeigt, daß der Anteil der CD4- und IL4-positiven Zellen für den Peptidpool G besonders hoch ist, allerdings sind der Anteil der reaktiven Zellen für die Pools 3, 4, 5 und 6 etwa gleich hoch, so daß aus diesem Versuch kein ein- deutiger Rückschluß auf die Tπ2-Epitope gezogen werden konnte. Die Peptide Q38, Q39, Q46 und Q47 wurden jedoch im nachfolgenden Beispiel individuell getestet.
13. Restimulation von HPV18 CVLP-stimulierten T-Zellen mit Q38-, Q39-, Q46- bzw. Q47-Peptid-stimulierten Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen (4xl05) eines nicht-HLA- typisierten Blutspenders mit HPV18L1ΔCDIE7I.S3DI CVLPs und HPV18L1Δ DIE7I- 6ODI CVLPs stimuliert und geemtet.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit je 1 μg/ml Peptid Q38, Q39, Q46 oder Q47 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (do- nor-identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPV 18 L 1 - oder E7-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 12 (oben links) zeigt, daß der Anteil der reaktiven CD4- und IFNγ- positiven T-Zellen für die mit den Peptiden Q38 und Q39 inkubierten BLCL besonders hoch ist, aber auch für die Peptide Q46 und Q47 noch deutlich höher ist als in der Negativkontrolle. Somit enthalten Q38, Q39, Q46 und Q47 je ein THι- Epitop.
Fig. 12 (unten links) zeigt, daß der Anteil der reaktiven CD4- und IL4-positiven T-Zellen für die Peptide Q38 und Q39 besonders hoch ist, so daß Q38 und Q39 neben den Tπi-Epitopen zusätzlich auch TH2-Epitope enthalten bzw. daß die THI- Epitope gleichzeitig auch TH2-Epitope sind.
Fig. 12 (Oben rechts) zeigt, daß der Anteil der reaktiven CD8- und IFNγ-positiven T-Zellen für die Peptide Q38, Q39 und Q47 besonders hoch ist, so daß die Peptide Q38, Q39 und Q47 des weiteren zytotoxische T-Zellepitope enthalten. Der Anteil an CD8- und IL4-ρositiven Zellen ist für die Peptide Q38, Q39, Q46 und Q47 gering und vergleichbar zur Negativkontrolle, was dadurch zu erklären ist, daß CD8-positive Zellen in der Regel kein IL4 exprimieren.
14. Restimulation von HPV16 CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders mit HPN16LlΔc*E7ι-55 CVLPs stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools aus Beispiel 7 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor- identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPV 16 Ll bzw. E7-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weite- re 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per-
meabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α- human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cell- quest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 13 zeigt, daß der Anteil der CD8- und IFNγ-positiven T-Zellen für die mit den Peptidpools A, C, E, F, 1 und 6 inkubierten BLCL hoch ist. Den Peptidpools A und 1 ist das Peptid Pl ,
C und 1 das Peptid P3,
E und 1 das Peptid P5,
F und 1 das Peptid P6,
A und 6 das Peptid P41, C und 6 das Peptid P43,
E und 6 das Peptid P45 und
F und 6 das Peptid P46 gemeinsam. Somit enthalten die Peptide Pl, P3, P5, P6, P41, P43, P45 und P46 je ein zytotoxisches T-Zellepitop.
15. Restimulation von HPV 18 CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders mit HPV18L1ΔCDIE7I.53DI CVLPs und CVLPs bei 37°C stimuliert und geerntet.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools aus Beispiel 6 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor- identische BLCL) in Anwesenheit von 10 lU/ml IL2 restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPV 18 Ll bzw. E7-Peptidpool inkubierte Zellen (Fig. 14 oben). Für Fig. 14 unten wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools F und 4 sowie mit 1 μg/ml Peptid Q30 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD8/APC mit α-human CD4/PerCP und mit α-human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert. Ergebnis: Fig. 14 (oben) zeigt, daß der Anteil der CD4- und IFNγ-positiven T- Zellen für die mit den Peptidpools F und 4 inkubierten BLCL hoch ist. Den Peptidpools F und 4 ist das Peptid Q30 gemeinsam. Somit enthält das Peptid Q30 ein THι-Epitop.
Dieses Ergebnis konnte durch den Versuch dargestellt in Fig. 14 unten bestätigt werden. Der Anteil der reaktiven CD4- und IFNγ-positiven T-Zellen ist jeweils vergleichbar, egal ob die T-Zellen mit den Peptidpools F-, 4- oder mit dem Peptid Q30-inkubierten BLCL restimuliert wurden.
16. Restimulation von HPV18 Peptid-stimulierten murinen T-Zellen
Analog zu Beispiel 5 wurden murine T-Zellen von CVLP-geimpften Mäusen mit Ll oder E7 Peptidpools unter Zugabe von Antigen-präsentierenden Zellen stimu- liert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen mit den auf der X-Achse der Fig. 15 angegebenen Peptide (Q3 und Q4 in Fig. 15 oben, L1 7 E71.8, E72-π, E7ι-8 in Fig. 15 unten) sowie Antigen-präsentierenden Zellen (RMA) restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Die Auswertung des Experiments erfolgte ebenfalls analog zu Beispiel 5, indem die reaktiven CD8-positiven Zellen durch Antikörperfärbung und FACScan bestimmt wurden.
Ergebnis: Fig. 15 oben zeigt für die Peptide Q3 und Q4 bzw. Fig. 15 unten für die Peptide L14 4E7[.8, E72-n und E7!-8, dass die mit diesen Peptiden inkubierten RMA-Zellen eine Restimulation von Peptid-stimulierten murinen CD8-T-Zellen bewirkten. Die Peptide Q3, Q4, Ll47 E7!-8, E72-u und E7!-8 enthalten somit jeweils ein H2b restringiertes zytotoxisches T-Zelleptitop. 17. Lyse von HPV18 Peptid-belandenen RMA-/LKK-Zellen
Analog zu Beispiel 4 wurden RMA- bzw. LKK-Zellen mit 51Cr radioaktiv markiert und mit den auf der X-Achse aufgetragenen Peptiden (Q43 und Q44 in Fig. 16 oben, Q49 in Fig. 16 unten) inkubiert. Zellen ohne Peptid dienten als Negativkontrollen. Anschließend wurden T-Zellen hinzugegeben, die zuvor mit dem Pep- tidpool stimuliert worden waren.
Die Lyse der RMA- bzw. LKK-Zellen durch die T-Zellen wurde anhand der Frei- setzung des 51Cr gemessen und wie in Beispiel 4 berechnet.
Ergebnis: Fig. 16 zeigt, dass die mit dem Q43 oder Q44 beladenen RMA-Zellen (Fig. 16 oben) bzw. die mit dem Q49 beladenen LKK-Zellen (Fig. 16 unten) effektiv durch die T-Zellen lysiert werden konnten, die nicht beladenen RMA- bzw. LKK-Zellen hingegen nicht. Das Q43- und das Q44-Peptid sind somit H2b- restringierte zytotoxische T-Zellepitope, das Q49 ist somit ein H2k-restringiertes zytotoxisches T-Zellepitop.
18. Identifizierung des zytolytischen T-Zell-Epitops HP VI 8 E786-94
A HLA-Bindungs-Vorhersage
Für die Vorhersage von 9-mer-Sequenzen mit hoher Bindungsstärke an HLA- A*0201 im E7-Protein des HPV-Typs 18 wurde das HLA-Bindungsvorhersage- Programm des NIH genutzt (Adresse: http://www- bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla\_bind/). Es wurden 9-mere untersucht, da sie die optimalen Liganden für HLA-Klasse I Moleküle darstellen. Zur Vorhersage wur- de die vollständige Aminosäuresequenz des HPV 18 E7-Proteins in das Programm eingespeist und festgelegt, daß 9-mere für das HLA-Allel A*0201 vorhergesagt werden sollen. Das Programm liefert eine Liste, in der die gefundenen 9-mere nach Bindungsstärke angeordnet sind. Der Wert für die Bindungsstärke ist als Halbwertszeit in Minuten der Dissoziation eines Peptides der entsprechenden Aminosäuresequenz (Tj/2) angegeben.
B In vitro Vakzinierung von PBMC
Die vorhergesagten Peptide wurden nach Standardmethoden synthetisiert (F moc Methode). Gegen Peptide mit hoher vorhergesagter HL A-A2 -Bindungsstärke wurden peptidspezifische T-Zelllinien etabliert. Dazu wurden je Loch einer 96- Lochplatte lxlO5 PBMC von gesunden, HLA-A2 positiven Donoren in 100 μl Medium (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertes AB-Plasma) ausgesät. Dem Kultur- medium wurden 20 μg/ml Peptid zugegeben. Die Zellen wurden bei 37°C inkubiert und 1 mal wöchentlich mit bestrahlten peptidbeladenen autologen PBMC restimuliert. Die Stimulator-PBMC wurden für 4 Stunden in Medium mit 20 μg/ml Peptid inkubiert. Nach der Bestrahlung wurden sie auf lxl04/100 μl mit Medium verdünnt und zu den peptidstimulierten PBMC gegeben. Dazu wurde die Hälfte des Mediums aus jeder Vertiefung abgesaugt und 100 μl der Stimulator- PBMC Suspension zugegeben. Ab der 3. Stimulation wurden 10 U/ml IL-2 und 10 U/ml IL-7 zugesetzt. Ab der 5. Stimulation wurde auf die gleiche Art und Weise mit peptidbeladenen autologen B-lymphoblastischen Zelllinien (BLCL) restimuliert.
Zur in vitro Vakzinierung mit allogenen Tumorzellen wurden HeLa Zellen mit CD80 und HLA-A2 transfiziert (H7.1-A2). Diese Zellen wurden bestrahlt und zur Stimulation von PBMC bei Ixl04/Loch eingesetzt. Es wurde 3 mal analog zu Peptidstimulation restimuliert. C ELISpot-Assay
lxl 04 Stimulatorzellen (K-A2 - dies sind K-562-Zellen (ATCC CCL-243) wurden mit einem HLA A2 -Expressionsvektor transfiziert, PBMC oder dendritische Zel- len) wurden in 60 μl Medium (RPMI 1640, 0,4%» Humanalbumin) in eine Vertiefung einer 96-Loch-Rundboden-Zellkulturplatte ausgesät und mit 50 μg/ml Peptid über Nacht beladen. Am nächsten Tag wurden 5x104 T-Zellen/Loch in 60μl Medium (mit je 10 U/ml IL-2 und IL-7) zugegeben und 4 Stunden inkubiert. Eine Millipore Nitrocellulose HA-Platte wurde über Nacht bei 4°C mit dem monoklo- nalen Antikörper 1-Dlk anti-human IFN-γ (10 μg/ml in PBS, 60 μl/Loch, Hölzel Diagnostika, Köln) beschichtet. Am nächsten Tag wurde 3 mal mit 150 μl sterilem PBS pro Vertiefung jeweils 5 min gewaschen und 1 Stunde bei 37°C mit Medium geblockt. Das Blocking-Medium wurde entfernt, die Zellen von der Rundboden-Zellkulturplatte auf die Filterplatte übertragen und weitere 20 bis 22 Stun- den inkubiert. Danach wurden die Zellen und das Medium entfernt und die Filterplatte 6 mal 2 min mit PBS/Tween 20 (0.05%) gewaschen. Dann wurde der Antikörper Ab-7-B6-l-biotin zugegeben (2 μg/ml in PBS/BSA, 60 μlNertiefung, Hölzel Diagnostika) und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Filteφlatte wieder 6 mal 2 Minuten mit PBS/Tween 20 (0.05%) gewaschen und Streptavidin-AP (50 ng/ml in PBS, Sigma (Deisenhofen), 100 μlNertiefung) zugesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Filteφlatte 3 mal 2 Minuten mit PBS/Tween 20 (0.05%) und 3 mal 2 Minuten mit PBS gewaschen. Es wurden dann 60 μl BCIP/NBT-Substrat (Sigma, Deisenhofen) zugesetzt und weiter 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, bis blauschwarze Flek- ken erschienen. Die Reaktion wurde mit Wasser abgestoppt und die Platte getrocknet. Die Auszählung der Flecken (spots) erfolgte am ELISpot-Auslese- System der Firma ZEISS-VISION (Halbergmoos). D Zytotoxizitätstest
Die Zytotoxizität von HPV 18 E786.94 spezifischen T-Zellen wurde im Chrom- release Assay bestimmt. Als Targetzellen wurden autologe BLCL eingesetzt. Jeweils 5xl05 Zellen wurden in 100 μl Medium (RPMI 1640, 10% FCS) aufgenommen und mit 20 μl 51 Chrom (NEN) versetzt. Zur Peptidbeladung der BLCL wurde 50 μg/ml des entsprechenden Peptids zugefügt. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei Raumtemperatur über 2 Stunden, wobei die Zellen alle 20-30 min vorsichtig resuspendiert wurden. Es folgte eine 3 malige Waschung der Zellen mit 5 ml Medium. Zum Sedimentieren der Zellen wurden sie dabei jeweils 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert und vorsichtig resuspendiert. Die Targets wurden in Medium aufgenommen und auf lxl 05 Zellen/ml eingestellt. 40μl dieser Zellsuspension wurden jeweils zu den bereits in die Vertiefungen einer 96-Loch Spitzbo- den-Zellkultuφlatte ausgesäten Effektoren und K-562-Zellen CCL-243 gegeben.
Die Effektoren (epitopspezifische T-Zellen) wurden geemtet und in Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 10 U/ml IL-2 und IL-7) aufgenommen. Je 80 μl dieser Zellsuspension wurden in eine Vertiefung einer 96-Loch-Spitzboden- Zellkultuφlatte pipettiert (Duplikate). Dabei wurde die Zellzahl/ml so eingestellt, daß das gewünschte Effektor-Target-Verhältnis erreicht wurde. Den Effektoren wurden unmarkierte K-562-Zellen (40 μl, 20 facher Überschuß zu Targetzellen) zugefügt, um die in den Zelllinien eventuell vorhandene Aktivität von NK-Zellen vollständig zu blockieren. Die Effektoren wurden mit den K-562 -Zellen mindestens 30 Minuten inkubiert, bevor die markierten Targetzellen zugesetzt wurden.
Als Kontrollen (6-fach-Ansätze) wurden zum einen Targetzellen mit K-562 und Medium inkubiert (Low-Release-Kontrolle) und zum anderen Targetzellen mit K- 562, Medium und Tween 20 (High-Release-Kontrolle). Um zu kontrollieren, ob die NK-Aktivität vollständig geblockt wurde, wurden außerdem Effektoren mit unmarkierten und markierten K-562 inkubiert. Die Ansätze wurden 4 Stunden bei 37°C, 98% Luftfeuchte und 5 % CO2 inkubiert. Danach wurden die Kultuφlatten 5 min bei 700 U/min zentrifügiert, um die Zellen zu sedimentieren. Aus jeder Vertiefung wurden, ohne das Zellpellet aufzuwirbeln, 100 μl des Überstandes auf eine Opti-Plate-Scintillationszählplatte pipettiert, und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am nächsten Tag wurden 150 μl Scintillationsflüssigkeit Microscint 40, Canberra-Packard, Deieich) zugegeben und die Anzahl der Zerfalle pro Minute in den einzelnen Ansätzen im Scintillationszählgerät (Topcount, Canberra-Packard, Dreieich) gemessen. Abschließend wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen der Mehrfachan- sätze gebildet.
Die Berechnung der spezifischen Lyse wurde nach der folgenden Formel vorgenommen: spezifische Lyse (%) = 100 x (Ergebnis - Low Release) x (High Release - Low Release)"1
E Kultur von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL)
Aus den Biopsien von Tumoren von Patientinnen mit HPV 18 und HLA-A2 Posi- tivität wurden TIL durch Kultur in AIM V Medium (Gibco-Invitrogen, Karlsruhe) mit jeweils 100 U/ml IL-2 und IL-7 und 0J25 μl/well Dynal beads T cell expan- der (Dynal, Hamburg) zum auswachsen gebracht. Diese TIL wurden direkt im ELISpot assay auf ihre Spezifität für das HPV 18 E786-94 Peptidepitop untersucht.
F Ergebnisse
Um zu bestimmen, welche HLA-A2 restringierten Peptide des HPV 18 E7 Proteins von Tumorzellen prozessiert und präsentiert werden, wurde durch in vitro Vakzinierung mit HeLa CD80/HLA-A2 Transfektanten (H7.1-A2) eine T- Zelllinie generiert. In der IFN-γ ELISpot Analyse zeigte sich eine spezifische Reaktion gegen das vorhergesagte synthetische Peptid FQQLFLNTL (siehe Fig. 17 oben). Dieses Peptid hat im Vergleich zu anderen vorhergesagte Peptiden eine relativ geringe Bindungsaffinität an HLA-A2. Trotzdem wurden spezifische T- Zellen detektiert. Als Kontrollpeptid wurde HPV 16 E728-36 verwendet, das keine IFN-γ Sekretion induzierte. Dies lässt den Schluß zu, dass dieses Peptid von H7.1- A2 Zellen präsentiert wird.
Um zu testen, ob HPV 18 E786.94 spezifische T-Zellen zytolytische Aktivität besitzen wurden T-Zelllinien gegen das synthetische Peptid hergestellt. Die T-Zellen wurden im Chrom release assay getestet. Als Targetzellen wurden autologe pep- tidbeladene BLCL eingesetzt. Bei einem Effektor zu Target Verhältnis von 30:1 wurde eine spezifische Lyse von ca. 20% beobachtet (siehe Fig. 17 unten). Gegen die KontroUpeptide HPV 18 E77-ι5 und HPV 16 E628-36 wurde keine spezifische Lyse gemessen.
Um zu übeφrüfen, ob das HPV 18 E786.9 Peptid auch vom Immunoproteasom natürlich prozessiert wird, wurden T-Zelllinien durch Stimulation mit antigen- beladenen autologen dendritischen Zellen (DC) hergestellt. Die DC wurden mit rekombinantem HPV 18 E7 Protein bzw. einem Pool aus überlappenden 20-mer Peptiden, die das gesamte HPV 18 E7 repräsentieren, beladen (siehe Fig. 18 oben: „E7 Protein induziert" bzw. „E7 Peptidpool indutziert"). Die induzierten T-Zellen wurden im ELISpot assay auf Spezifität für das HPV 18 E7 6.9 Epitop getestet. In beiden T-Zelllinien wurden HPV 18 E786.94 spezifische T-Zellen detektiert (siehe Fig. 18 oben). Das bedeutet, dass das Immunoproteasom das Epitop prozessiert.
Die biologische Relevanz des HPV 18 E786.9 Epitops wurde an TIL Populationen untersucht. TIL wurden aus einer Tumorbiopsie einer HPV 18 und HLA-A2 posi- tiven Patientin isoliert und in vitro linear expandiert ohne antigenspezifische Re- Stimulation. Sie wurden im ELISpot assay mit HPVl 8 E7S6.9 beladenen K-A2 (HLA-A2 transfizierten K-562 Zellen als Stimulatoren) konfrontiert.
In den TIL Populationen findet sich eine deutliche Reaktion gegen HPV 18 E786.9 jedoch nicht gegen das von Rudolf MP et al. (2001, Clinical Cancer Research 7 (3 Suppl):788s-795s) beschriebene Epitop HPVl 8 E77.j5 (siehe Fig. 18 unten). Das Peptid HPVl 8 E77.]5 hat eine 2,5-fach höhere Bindungsaffinität an HLA-A2. Diese Ergebnisse deuten auf die natürliche Präsenz von HPVl 8 E786.9 spezifischen T-Zellen in Tumoren hin, was die Relevanz des gefundenen Peptidepitops unterstreicht.
19. Zusammenfassung der Beispiele 3 bis 18
Die gewonnenen Daten der Beispiele 3 bis 18 sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt:
Tabelle 3: HPN16-Peptide /-Epitope
Tabelle 4: HPV18-Peptide /-Epitope

Claims

Patentansprüche
1. T-Zell-Epitop mit einer Aminosäuresequenz
YLPPVPVSKWSTDEYVART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL, VGHPYFPIKKPNNNKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP, WACVGVEVGRGQPLGVGISG. QPLGVGISGHPLLNKLDDTE, QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA,
DMVDTGFGAMDFTTLQANKS, VTVVDTTRSTNMSLCAAIST, TTYKNTNFKEYLRHGEEYDLJFQLCKITLTADV TYIHSM, PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE, LKKYTFWEVNLKEKFSADLD, PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH, YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK,
GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV, SIYNPETQRLVWACAGVEIG, lYNPETQRL, PDYLQMSADPYGDSMFFCLR, GDSMFFCLRREQLFARHFWNS NNGVCWHNQLFVTVVDTTRS, PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI, YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL, YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE,
VDLLCHEQLSDSEEENDEID, SEEENDEIDGVNHQHLPARR, SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL, FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL, HGPKATLQDI, MHGPKATL, oder FQQLFLNTL
und/oder eine funktionell aktive Variante davon.
2. T-Zell-Epitop nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Variante eine Sequenzhomologie zu YLPPVPVSKWSTDEYVART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL,
VGHPYFPIKKPNNNKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP, WACVGVEVGRGQPLGVGISG. QPLGVGISGHPLLNKLDDTE, QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA, DMVDTGFGAMDFTTLQANKS, VTVVDTTRSTNMSLCAAIST, TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL, IFQLCKITLTADVMTYIHSM,
PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE, LKKYTFWEVNLKEKFSADLD. PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH, YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK, GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV, SIYNPETQRLVWACAGVEIG, lYNPETQRL, PDYLQMSADPYGDSMFFCLR. GDSMFFCLRREQLFARHFWN, NNGVCWHNQLFVTWDTTRS. PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI, YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL,
YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE, VDLLCHEQLSDSEEENDEID, SEEENDEIDGVNHQHLPARR, SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL, FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL, HGPKATLQDI, MHGPKATL, oder FQQLFLNTL von mindestens ca. 65%, vorzugsweise mindestens ca. 75% und insbesondere mindestens ca. 85% auf Aminosäureebene besitzt.
3. T-Zell-Epitop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Variante eine strukturelle Homologie zu
YLPPVPVSKWSTDEYVART, STDEYVARTNIYYHAGTSRL,
VGHPYFPIKKPNNNKILVPK, GLQYRVFRIHLPDPNKFGFP,
WACVGVEVGRGQPLGVGISG. QPLGVGISGHPLLNKLDDTE,
QLCLIGCKPPIGEHWGKGSP, LELINTVIQDGDMVDTGFGA, DMVDTGFGAMDFTTLQANKS, VTWDTTRSTNMSLCAAIST,
TTYKNTNFKEYLRHGEEYDL, IFQLCKITLTADVMTYIHSM,
PPPGGTLEDTYRFVTSQAIA, RFVTSQAIACQKHTPPAPKE,
LKKYTFWEVNLKEKFSADLD, PLGRKFLLQAGMHGDTPTLH,
YCYEQLNDSSEEEDEIDGPA, VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK, GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV, SIYNPETQRLVWACAGVEIG, lYNPETQRL,
PDYLQMSADPYGDSMFFCLR, GDSMFFCLRREQLFARHFWN,
NNGVCWHNQLFVTVVDTTRS, PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI,
YRFVQSVAITCQKDAAPAEN, PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL,
YPLGRKFLVQAGMHGPKATL, MHGPKATLQDIVLHLEPQNE, VDLLCHEQLSDSEEENDEID, SEEENDEIDGVNHQHLPARR,
SSADDLRAFQQLFLNTLSFV, NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL,
FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP, PQRHTMLCMCCKCEARIKLV, GMHGPKATL,
HGPKATLQDI, MHGPKATL, oder FQQLFLNTL hat.
4. T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das T-Zell-Epitop eine zytotoxische Antwort auslöst oder eine T- Helferzellfunktion vermittelt.
5. Verbindung enthaltend ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung kein natürlich vorkommendes Ll Protein eines Papillomavirus und im Falle eines HPV- 16 T-Zell-Epitops keine ausschließlich N-terminale oder ausschließlich C-terminale Deletionsmutante eines natürlich vorkommenden Ll Proteins eines Papillomavirus ist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Polypeptid, insbesondere ein Fusionsprotein ist.
7. Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ein Polypeptid von mindestens ca. 50 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens ca. 35 Aminosäuren, insbesondere von mindestens ca. 20 Aminosäuren und in besonders bevorzugter Weise von mindestens ca. 9-13 Aminosäuren Länge ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung eine chemische, radioaktive, nicht radioaktive Isotopen und/oder Fluoreszenzmarkierung des T-Zell-Epitops und/oder des genannten Fusionsproteins, und/oder eine chemische Modifikation des T- Zell-Epitops und/oder Fusionsproteins enthält.
Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4 oder eine Verbindung enthaltend ein T-Zell- Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8 kodiert.
10. Vektor, insbesondere ein Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 enthält.
11. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein T-Zell-Epitop ge- maß einem der Ansprüche 1-4 oder eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 enthält, vorzugsweise präsentiert.
12. Zelle nach Ansprach 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Ansprach 10 transfiziert, transformiert, und/oder infiziert ist.
13. Zelle nach Ansprach 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit mi- nestens einem T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4, mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T-Zell-
Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8, inkubiert wurde.
14. Zelle nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, ins- besondere eine JY-, T2-, CaSki-Zelle oder EB V-transformierte Zelle ist.
15. Komplex enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 oder eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und mindestens eine weitere Verbindung.
16. Komplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mindestens ein MHC-Klasse I-Molekül, vorzugsweise als HLA A2.01, AI oder A24 Tetramer enthält.
17. Komplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte MHC-Klasse I Molekül ein humanes MHC-Klasse I Molekül, insbesondere ein HLA A2.01, AI oder A24 Molekül ist.
18. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen durch mindestens einem T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 oder durch mindestens eine Verbindung, enthaltend ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, das folgende Schritte enthält: a) Stimulation von Zellen mit mindestens einer genannten Verbindung; b) Zugabe von mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4 präsentiert oder eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17, und c) Bestimmung der Aktivierung von T-Zellen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt a) folgenden zusätzlichen Schritt a') enthält: a') Cokultivierung der Zellen für mindestens ca. I Woche, insbesondere mindestens ca. 8 Wochen mit: (i) mindestens einer Zielzelle beladen mit einem T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17, mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem VLP, minde- stens einem CVLP, und/oder mindestens einem Virus,
(ii) mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17,
(iii) und/oder mindestens einer Zielzelle, die ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1 -4 präsentiert, bevor sich Schritt b) anschließt.
20. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 11, 13, 14, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle mit mindestens einem T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mit mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8 und/oder mindestens einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 enthaltend ein T- Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 5-8, inkubiert wird.
21. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 11, 12, 14, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 und/oder einem Vektor gemäß Ansprach 10 transfiziert, transformiert und/oder infiziert wird.
22. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle eine B-Zelle, ein Makrophage, eine dendritische Zelle, ein Fibroblast, insbesondere eine JY-, T2-, CaSki- Zelle oder EBV-transformierte Zelle ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Schritt a) folgender Schritt a") durchgeführt wird: a") Gewinnung und Präparation von Proben enthaltend T-Zellen und anschließende Kultivierung.
24. Testsystem zum in vitro Nachweis der Aktivierung von T-Zellen enthaltend: a) mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14, und/oder mindestens ei- nen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17, und b) Effektorzellen des Immunsystems, vorzugsweise T-Zellen, insbesondere zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
25. Verwendung mindestes eines T-Zell-Epitops gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens eines Vektors gemäß Anspruch 10, mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14, und/oder mindestens eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 15-17 zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
26. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens einen Vektor gemäß Ansprach 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14, und/oder min- destens einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
27. Arzneimittel oder Diagnostikum nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein T-Zell-Epitop gemäß einem der Ansprüche 1-4, mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 5-8, mindestens ein Vektor gemäß Anspruch 10, mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 11-14, und/oder mindestens ein Komplex gemäß einem der Ansprüche 15-17 in Lösung vorliegt, an eine feste Matrix gebunden ist, und/oder mit einem Adjuvans versetzt ist.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL105554A (en) * 1992-05-05 1999-08-17 Univ Leiden Peptides of human papillomavirus for use in preparations elicit a human T cell response
DE10137102A1 (de) 2001-07-30 2003-02-27 Deutsches Krebsforsch Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CA3167595A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Hpv epitopes targeted by t cells infiltrating cervical malignancies for use in vaccines
AU2015213420B2 (en) * 2007-05-31 2017-02-16 Isa Pharmaceuticals B.V. HPV epitopes targeted by T cells infiltrating cervical malignancies for use in vaccines
WO2009055491A2 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 University Of Rochester Respiratory syncytial virus vaccine based on chimeric papillomavirus virus-like particles or capsomeres
US20120045413A1 (en) * 2010-04-09 2012-02-23 Mayumi Nakagawa Human papilloma virus peptide-specific T-cell response for treatment of warts
WO2013111448A1 (ja) * 2012-01-25 2013-08-01 学校法人 久留米大学 ヒトパピローマウイルスタイプ１６ｌ１由来ｂ細胞エピトープペプチド
KR101680567B1 (ko) * 2014-07-09 2016-11-29 연세대학교 산학협력단 인유두종바이러스 펩타이드의 자궁경부암 진단 및 치료 용도
KR20190020098A (ko) 2016-06-20 2019-02-27 아이에스에이 파마슈티컬즈 비.브이. 펩타이드 백신의 제형
WO2021080847A1 (en) * 2019-10-21 2021-04-29 Flaskworks, Llc Systems and methods for cell culturing

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8803870D0 (sv) * 1988-10-28 1988-10-28 Medscand Ab Method for detection of human papillomavirus (hpv) for diagnostic purposes
GB2279651A (en) * 1993-07-01 1995-01-11 British Tech Group Synthetic peptides of human papillomavirus
SE9501512D0 (sv) * 1995-04-24 1995-04-24 Euro Diagnostica Ab Synthetic peptide-defined eptopes useful for vaccination against papillomavirus
DE19925199A1 (de) * 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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