WO2000022117A1 - Tumor-protein - Google Patents

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WO2000022117A1
WO2000022117A1 PCT/DE1999/003334 DE9903334W WO0022117A1 WO 2000022117 A1 WO2000022117 A1 WO 2000022117A1 DE 9903334 W DE9903334 W DE 9903334W WO 0022117 A1 WO0022117 A1 WO 0022117A1
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protein
tumor
tumor protein
amino acid
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PCT/DE1999/003334
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Inventor
Johannes Wilhelmus Gerardus Janssen
Original Assignee
Janssen Johannes Wilhelmus Ger
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a tumor protein, a DNA coding for such a protein and a method for producing such a protein.
  • the invention further relates to antibodies directed against the protein and the use of the DNA and the protein for the diagnosis and / or therapy of tumor
  • Kidney oncocytomas the changes often being in the 11q13 chromosomal region. However, it is very difficult to precisely assign the changes to the individual tumor diseases. In this respect, the understanding of molecular relationships in the development and development of tumor diseases is poor.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which tumor diseases can be investigated causally and, if necessary, ways can be shown by which it is possible to intervene in tumor diseases.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that with one the base sequence of Fig. 3 or one of them by one or more
  • Base pairs of different sequence comprising DNA NIH / 3T3 cells can be transformed or tumors can be induced in nude mice.
  • tumors eg colon carcinoma, kidney carcinoma, lung carcinoma, gastric carcinoma, breast carcinoma, head tumors, neck tumors, bladder tumors, ovarian tumors, melanoma, neuroblastoma and multiple myeloma
  • the DNA is located in the chromosomal region 11q13, about 300 kb centromerically away from the cyclin D1 gene.
  • the DNA codes for a protein which comprises the amino acid sequence of FIG. 1 or a sequence different therefrom by one or more amino acids. A variant of the protein is shown in Fig. 2.
  • the protein comprises 5 hydrophobic areas that act as transmembrane
  • T-P tumor protein
  • T-P tumor protein
  • an amino acid sequence different from one or more amino acids encompasses any amino acid sequence coding for a tumor protein (T-P), the DNA sequence of which hybridizes with the DNA of FIG. 3 and transforms NIH / 3T3 cells or induces tumors in nude mice.
  • T-P tumor protein
  • the DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 3 by additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more base pairs.
  • hybridization indicates hybridization under normal conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the sequence.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid which codes for T-P.
  • the nucleic acid can be an RNA or a DNA, e.g. a cDNA.
  • a DNA is preferred which comprises the following:
  • the DNA of FIG. 3 was deposited as E. coli pCI-14 OCIM with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) under DSM 12327 on July 21, 1998.
  • a DNA different by one or more base pairs encompasses any DNA sequence coding for a tumor protein (T-P) which hybridizes with the DNA of FIG. 3 and transforms NIH / 3T3 cells or induces tumors in nude mice.
  • T-P tumor protein
  • the DNA sequence can differ from the DNA of FIG. 3
  • a DNA according to the invention can be present as such or in combination with any other DNA.
  • a DNA coding for a tumor protein (T-P) according to the invention can be present in an expression vector. Examples of such are known to the person skilled in the art.
  • T-P tumor protein
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • an expression vector for E. coli these are e.g. pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • yeast e.g. to call pY100 and Ycpadl while for that
  • the bacculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • Expression vector to express existing DNA examples include the E. coli strains HB101, DH1, X1776, JM101, JM 109, BL21 and SG 13009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vera and HeLa as well as the insect cells Sf9.
  • DNA according to the invention has to be inserted into an expression vector. He is also aware that this DNA is found in Connection with a DNA coding for another protein or peptide can be inserted so that the DNA according to the invention can be expressed in the form of a fusion protein.
  • Cultivate cells He is also aware of methods for isolating and purifying the protein or fusion protein expressed by the DNA according to the invention.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above protein or fusion protein.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its preparation, it is expedient to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) protein or fragments thereof, where it may be expedient if these are attached to a carrier molecule such as KLH or BSA. Further “boosters” of the animals can be carried out using the same (fusion) protein or fragments thereof. The polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals. For the monoclonal antibody, animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • kits Such comprises one or more of the following components:
  • T-P tumor protein
  • auxiliaries such as carriers, buffers, solvents, controls, etc.
  • TP can be detected with an antibody according to the invention.
  • a relationship between TP and a tumor disease can be established.
  • an autoantibody directed against this protein can be detected with TP.
  • Both detections can be carried out by conventional methods, in particular a Western blot, an ELISA, an immunoprecipitation or by immunofluorescence.
  • the organization and expression of the gene coding for TP can be demonstrated using a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA and primers derived therefrom. This detection can be carried out in the usual way, in particular in a Southern or Northern blot or via "in situ" hybridization or by RT-PCR.
  • the present invention is suitable for taking measures against the presence of T-P in people.
  • T-P can be inhibited with an antibody according to the invention.
  • the expression of the coding for T-P can also be used.
  • DNA can be inhibited by using a nucleic acid according to the invention, in particular a DNA, as the basis for creating anti-sense RNA.
  • a nucleic acid according to the invention in particular a DNA
  • This as such or in the form of a vector expressing it, which may contain an inducible promoter, can be introduced into persons or certain tissues, in particular tumors.
  • T-P can also serve as a basis for developing chemical compounds that can inhibit T-P.
  • the present invention thus represents means of better diagnosing tumor diseases and being able to intervene therapeutically in these diseases.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a variant of TP from FIG. 1.
  • T-P tumor protein
  • T-P tumor protein
  • PolyA + RNA from normal tissue ie heart, brain, placenta, lungs and liver, can be obtained commercially (Clontech).
  • total RNA is isolated from tumor cell lines from colon carcinoma, kidney carcinoma, lung carcinoma and multiple myeloma. 2 ⁇ g of the PolyA + RNAs and 10 ⁇ g of the total RNAs are subjected to agarose gel electrophoresis with subsequent Northern blot hybridization. A [ ⁇ 32 P] dCTP-labeled TP-specific DNA, ie the DNA from FIG. 3, is used as the hybridization sample.
  • the hybridization takes place overnight at 63 ° C with subsequent washing steps, the blots being washed several times in 3xSSC / 0.1% SDS at 63 ° C and then with high or medium stringency.
  • the blots are subjected to 7-day autoradiography (see Fig.
  • the DNA of FIG. 3 is provided with BAMHI linkers, cleaved with BamHI and inserted into the expression vector pQE-8 (Qiagen) cleaved with BamHI.
  • the expression plasmid pQE-8 / T-P is obtained.
  • pQE-8 / T-P is used to transform E.coli SG 13009 (see. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273).
  • the bacteria are in an LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin and
  • Fusion protein is eluted in a pH 3.5 buffer. After neutralization, the fusion protein is subjected to 18% SDS polyacryiamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (see Thomas, J.O. and Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
  • Example 3 Production and detection of an antibody according to the invention
  • a fusion protein according to the invention from Example 2 is subjected to an 18% SDS polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 35 kD band is cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. Pieces of gel are sedimented before the protein concentration of the supernatant is determined by an SDS-polyacrylamide
  • the rabbit's serum is tested in an immunoblot.
  • a fusion protein according to the invention from Example 1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209) .
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229.
  • the nitrocellulose filter is incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody is rabbit serum (1: 10000 in PBS).
  • the nitrocellulose filter is incubated with a second antibody.
  • This antibody is a goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) coupled with alkaline phosphatase in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, there are several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI 2 ) at room temperature until bands become visible.
  • developer solution 36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI 2
  • Antibodies are extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention are detected.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tumor-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Verwendung der DNA und des Proteins zur Diagnose und/oder Therapie von Tumor-Erkrankungen.

Description

Tumor-Protein
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Tumor-Protein, eine für ein solches Protein kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Ver- wendung der DNA und des Proteins zur Diagnose und/oder Therapie von Tumor-
Erkrankungen.
Bei vielen Tumor-Erkrankungen liegen Veränderungen im Genom vor. Dies können z.B. Amplifikationen oder Translokationen sein. Solche Veränderungen finden sich z.B. bei Mantelzeil-Lymphomen, squamösen Zellkarzinomen, Brustkrebs und
Nieren-Onkozytomen, wobei die Veränderungen oftmals im chromosomalen Bereich 11q13 vorliegen. Eine genaue Zuordnung der Veränderungen zu den einzelnen Tumor-Erkrankungen ist allerdings sehr schwierig. Insofern ist auch das Verstehen von molekularen Zusammenhängen bei der Entstehung und Ausbildung von Tumor-Erkrankungen gering.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Tumor-Erkrankungen ursächlich untersucht und ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in Tumor-Erkrankungen eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß mit einer die Basensequenz von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere
Basenpaare unterschiedliche Sequenz umfassenden DNA NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nacktmäusen Tumoren induziert werden können. Ferner hat er erkannt, daß die DNA in Tumoren, z.B. Colonkarzinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom, Magenkarzinom, Brustkarzinom, Kopftumoren, Nackentumoren, Blasen- tumoren, Ovarialtumoren, Melanom, Neuroblastom und multiples Myelom, stärker exprimiert wird als in Normal-Gewebe (vgl. Fig. 4). Desweiteren hat er gefunden, daß die DNA im chromosomalen Bereich 11q13, etwa 300 kb zentromerisch entfernt vom Cyclin D1-Gen lokalisiert ist. Die DNA kodiert für ein Protein, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Sequenz umfaßt. Eine Variante des Proteins ist in Fig. 2 angegeben. Das Protein umfaßt 5 hydrophobe Bereiche, die als Transmembran-
Helices fungieren können. Das Protein wird nachstehend mit Tumor-Protein (T-P) bezeichnet.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein Tumor- Protein (T-P) bereitzustellen, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche für ein Tumor-Protein (T-P) kodierende Aminosäuresequenz, deren DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nacktmäusen Tumoren induziert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Der
Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz hin.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für T-P kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA, z.B. eine cDNA, sein.
Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
(a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybri- disiert, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code ver- wandte DNA.
Die DNA von Fig. 3 wurde als E.coli pCI-14 OCIM bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 12327 am 21. Juli 1998 hinterlegt.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA" umfaßt jegliche für ein Tumor-Protein (T-P) kodierende DNA-Sequenz, die mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und NIH/3T3 Zellen transformiert bzw. in Nacktmäusen Tumoren induziert. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3 durch
Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße, für ein Tumor- Protein (T-P) kodierende DNA in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY100 und Ycpadl zu nennen, während für die
Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus- Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem
Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, X1776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vera und HeLa sowie die Insektenzellen Sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte
Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragmenten davon zu immunisieren, wobei es günstig sein kann, wenn diese an ein Trägermolekül, wie KLH oder BSA, gekoppelt sind. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu- sions) protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklo- nalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
(a) eine erfindungsgemäße DNA,
(b) ein erfindungsgemäßes Tumor- Protein (T-P),
(c) einen erfindungsgemäßen Antikörper, sowie
(d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.
Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Tumor-Erkrankungen ursächlich zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann T-P nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung von T-P zu einer Tumor-Erkrankung hergestellt werden. Ferner kann mit T-P ein gegen dieses Protein gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für T-P kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher Weise, insbesondere in einem Southern oder Northern Blot oder über "in situ" Hybridisierung bzw. durch RT-PCR, erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen gegen das Vorliegen von T-P in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikör- per kann T-P inhibiert werden. Auch kann die Expression der für T-P kodierenden
DNA inhibiert werden, indem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, als Basis zur Erstellung von Anti-Sinn-RNA verwendet wird. Diese kann als solche oder in Form eines sie exprimierenden Vektors, wobei dieser einen induzierbaren Promotor enthalten kann, in Personen bzw. bestimmte Gewebe, insbesondere Tumoren, eingeführt werden. Desweiteren kann T-P als Basis dienen, chemische Verbindungen zu entwickeln, die T-P inhibieren können.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Mittel dar, Tumor-Erkrankungen besser zu diagnostizieren und in diese Erkrankungen therapeutisch eingreifen zu können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Tumor- Proteins (T-
P)- Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz einer Variante von T-P von Fig. 1.
Fig. 3 zeigt die für ein erfindungsgemäßes Tumor-Protein (T-P) kodierende DNA- Sequenz. Die Codons 810 - 1577 betreffen T-P von Fig. 1 , während die Codons 540 - 680 und 777 - 1577 sich auf die T-P-Variante von Fig. 2 beziehen.
Fig. 4 zeigt den Nachweis von T-P-Sequenzen in Normal-Geweben (4A) bzw. Tumoren (4B).
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 : Nachweis eines erfindungsgemäßen Tumor-Proteins (T-P) in Normal-Geweben bzw. Tumoren
Es wird PolyA+RNA aus Normal-Gewebe, d.h. Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge und Leber käuflich erhalten (Clontech). Ferner wird Gesamt-RNA aus Tumorzeliinien von Colonkarzinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom und multiplem Myelom isoliert. Jeweils 2μg der PolyA+RNAs und 10μg der Gesamt-RNAs werden einer Agarose-Gelektrophorese mit anschließender Northern Blot-Hybridisierung unterzogen. Als Hybridisierungsprobe wird eine [α32P]dCTP markierte T-P spezifische DNA, d.h. die DNA von Fig. 3, verwendet. Die Hybridisierung erfolgt Übernacht bei 63°C mit anschließenden Waschschritten, wobei die Blots mehrfach in 3xSSC/0.1 % SDS bei 63°C und anschließend unter hoher bzw. mittlerer Stringenz gewaschen werden. Die Blots werden einer 7-tägigen Autoradiographie unterzogen (vgl. Fig.
4A und 4B).
Es zeigt sich, daß in Tumoren eine starke Bande von T-P-Sequenzen nachgewiesen werden kann. Ferner zeigt es sich, daß diese Bande in Normalgewebe nur schwach ist. Beispiel 2: Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Tumor-Proteins (T-P)
Die DNA von Fig. 3 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert.
Es wird das Expressionsplasmid pQE-8/T-P erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen T-P von Fig. 1 (C-Terminuspartner). pQE-8/T-P wird zur Transformation von E.coli SG 13009(vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin und
25μg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni- NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene
Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18 % SDS-Polyacryiamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions) protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.
Beispiel 3: Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18 % SDS-Poly- acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 35 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert: Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 35 μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und
0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek- trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse- Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot- Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 :10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alka- lischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-lgG-Antikör- per (Dianova) (1 :5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase- Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium, 100mM Tris-HCI, pH 9.5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung werden 40μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung werden 12μg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA) Tag 56 3. Immunisierung (icFA) Tag 84 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 Fusion
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1. Tumor-Protein (T-P), umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert.
2. Tumor-Protein nach Anspruch 1 , umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 2.
3. DNA, kodierend für das Tumor-Protein nach Anspruch 1 oder 2, umfassend:
(a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert, oder
(b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 3.
Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 4.
6. Verfahren zur Herstellung des Tumor-Proteins nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedingungen.
7. Antikörper, gerichtet gegen das Tumor-Protein nach Anspruch 1 oder 2.
8. Verwendung des Tumor-Proteins nach Anspruch 1 oder 2 oder einer DNA nach Anspruch 3 zur Diagnose und/oder Therapie von Tumor-Erkrankungen. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Tumor-Erkrankungen Colonkar- zinom, Nierenkarzinom, Lungenkarzinom, Magenkarzinom, Brustkarzinom, Kopftumoren, Nackentumoren, Blasentumoren, Ovarialtumoren, Melanom, Neuroblastom und multiples Myelom umfassen.
PCT/DE1999/003334 1998-10-14 1999-10-14 Tumor-protein WO2000022117A1 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001029214A1 (en) * 1999-10-15 2001-04-26 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Colon-tumour-associated antigens

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