ES2264142T3 - Proteina analoga a transcetolasa. - Google Patents
Proteina analoga a transcetolasa.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UNA PROTEINA DERIVADA DE LA TRANSCETOLASA, UN ADN QUE LA CODIFICA Y DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE LA MISMA. ADEMAS, LA INVENCION TRATA DEL EMPLEO DEL ADN Y LA PROTEINA, ASI COMO DE LOS ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEINA.
Description
Proteína análoga a transcetolasa.
La presente invención se refiere a una proteína
análoga a transcetolasa, a un ADN que la codifica y a un
procedimiento para la preparación de la misma. La invención se
refiere además al uso del ADN y de la proteína así como a
anticuerpos dirigidos contra la proteína.
La transcetolasa es una enzima dependiente de
tiamina que asocia el ciclo del fosfato de pentosa con la
glicólisis. El ciclo de fosfato de pentosa proporciona fosfatos de
azúcar y NADPH. La transcetolasa introduce los fosfatos de azúcar en
exceso en la glicólisis, con lo que la puesta a disposición de NADPH
está garantizada en distintas condiciones metabólicas. El NADPH es
esencial para el mantenimiento del glutatión en el cerebro.
Una deficiencia de tiamina está asociada a
enfermedades neurológicas, como beriberi y síndrome de
Wernicke-Korsakoff. El beriberi se manifiesta como
insuficiencia cardiaca aguda, mientras que el síndrome de
Wernicke-Korsakoff como encefalopatía aguda, seguida
de daño crónico de la memoria a corto plazo.
Las investigaciones indican que la deficiencia
de tiamina no es la causante de las enfermedades anteriores.
También, en pacientes con estas enfermedades, por ejemplo, en
pacientes de síndrome de Wernicke-Korsakoff, no se
presenta transcetolasa mutada. La causa de las enfermedades
anteriores no es por tanto conocida hasta ahora.
La presente invención se basa por tanto en el
objetivo de poner a disposición un agente con el que se investiguen
las causas de las enfermedades neurológicas que están asociadas a
una deficiencia de tiamina, especialmente beriberi y síndrome de
Wernicke-Korsakoff, y dado el caso con el que puedan
tratarse terapéuticamente.
Según la invención, se consigue esto mediante
los objetos de las reivindicaciones.
Es por tanto objeto de la presente invención una
proteína análoga a transcetolasa, en la que la proteína comprende la
secuencia de aminoácidos de la Fig. 1.
La presente invención se basa en el conocimiento
de los solicitantes de que en animales, especialmente mamíferos, muy
especialmente seres humanos, existe una proteína que presenta
homologías con una transcetolasa, dado el caso una actividad de
transcetolasa, pero que se diferencia de una transcetolasa al nivel
de ADN por su hibridación en condiciones habituales. Dicha proteína
presenta al menos la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1. Además,
con uno o varios aminoácidos distintos en la secuencia de
aminoácidos, la proteína se presenta en distinta forma en distintos
tejidos, por ejemplo, cerebro y corazón.
En la presente invención se designa la proteína
anterior como "proteína análoga a transcetolasa" (PAT).
En una forma de realización preferida, una (PAT)
presenta la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2. Dicha (PAT) se
encuentra especialmente en el cerebro de animales, especialmente
mamíferos, muy especialmente seres humanos.
En otra forma de realización preferida, una
(PAT) presenta la secuencia de aminoácidos de la Fig. 3. Dicha (PAT)
se encuentra especialmente en el corazón de animales, especialmente
mamíferos, muy especialmente seres humanos.
Es otro objeto de la presente invención un ácido
nucleico que codifica una (PAT). Éste puede ser un ARN o un ADN.
Éste último puede ser, por ejemplo, un ADN genómico o un ADNc.
Preferiblemente, es un ADN que comprende lo siguiente: el ADN de la
Fig. 1.
Se prefiere especialmente el ADN de la Fig. 2 y
la Fig. 3. El ADN de la Fig. 2 codifica una (PAT) que se presenta
especialmente en el cerebro de animales, especialmente mamíferos,
muy especialmente seres humanos. El ADN de la Fig. 3 codifica una
(PAT) que se presenta especialmente en el corazón de animales,
especialmente mamíferos, muy especialmente seres humanos. El ADN de
la Fig. 2 se depositó en la DSM (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen) como JFC 317 con la referencia
DSM 9994 el 23 de mayo de 1995.
A continuación, se describe un ADN según la
invención en forma de un ADNc. Éste representa, por ejemplo, cada
ADN que entra dentro de la presente invención.
Para la preparación de un ADNc según la
invención es beneficioso partir de una biblioteca de cósmido, por
ejemplo, q1Z (véase Dietrich, A. y col., Nucleic Acids Res.
19, (1991), 2567-2572), que comprende el clon de la
región Xq28 del genoma humano. Dichos clones se fijan a una membrana
de filtro y se hibridan con conjuntos de ADNc marcados obtenidos
mediante transcripción inversa de ARNm de tejidos de cerdo, por
ejemplo, cerebro, músculo, hígado, corazón (véase Coy, J.F., y col.,
Mammalian Genome, 5, (1994), 131-137).
Aquellos clones que presentan una señal de hibridación con los
conjuntos de ADNc se usan para el examen de una biblioteca de ADNc
humano, por ejemplo, de tejido de cerebro o corazón fetal. Para ello
es especialmente adecuada la biblioteca de ADNc
\lambda-Zap, Stratagene, nº de cat. 936206. Se
obtiene un ADNc según la invención.
Un ADNc según la invención puede presentarse en
un vector o vector de expresión. Los ejemplos de los mismos son
conocidos por el experto. En el caso de un vector de expresión para
E. coli estos son, por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC,
pGEX-2T, pET3b y pQE-8,
prefiriéndose el último. Para la expresión en levadura han de
citarse, por ejemplo, pY100 e Ycpad1, mientras que para la expresión
en células animales han de darse, por ejemplo, pKCR, pEFBOS, cDM8 y
pCEV4. Para la expresión en células de insecto es especialmente
adecuado el vector de expresión de baculovirus
pAcSGHisNT-A.
El experto conoce las células adecuadas para
expresar un ADN presente en un vector de expresión según la
invención. Los ejemplos de dichas células comprenden las cepas de
E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 y SG 13009,
prefiriéndose la última, la cepa de levadura de Saccharomyces
cerevisiae y las células animales L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero y
HeLa, así como las células de insecto sf9.
El experto sabe de qué manera insertar un ADNc
según la invención en un vector de expresión. Le es también conocido
que este ADN puede insertarse en combinación con un ADN que codifica
otra proteína o péptido, de modo que el ADNc según la invención
puede expresarse en forma de una proteína de fusión.
Además, el experto conoce las condiciones de
cultivo de células transformadas o transfectadas. Le son también
conocidos procedimientos para aislar y purificar la proteína
expresada mediante el ADN según la invención. Dicha proteína, que
puede ser también una proteína de fusión, es por tanto igualmente
objeto de la presente invención.
Es otro objeto de la presente invención un
anticuerpo dirigido contra una proteína o proteína de fusión
anterior. Dicho anticuerpo puede prepararse mediante procedimientos
habituales. Puede ser policlonal o monoclonal. Para su preparación
es beneficioso inmunizar animales, especialmente conejos o gallinas
para un anticuerpo monoclonal y ratones para uno monoclonal, con una
proteína (de fusión) anterior o fragmentos de la misma. Pueden
realizarse "recuerdos" adicionales a los animales con la misma
proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo
policlonal puede obtenerse a partir del suero o la yema de huevo del
animal. Para los anticuerpos monoclonales, se fusionan células de
bazo de los animales con células de mieloma.
La presente invención posibilita investigar la
causa de enfermedades neurológicas que están asociadas a una
deficiencia de tiamina, como beriberi y síndrome de
Wernicke-Korsakoff. Con un anticuerpo según la
invención, pueden detectarse (PAT) en los fluidos corporales de
personas. Puede establecerse una relación de la (PAT) con el origen
y formación de las enfermedades anteriores. Además, con una (PAT)
según la invención puede detectarse un autoanticuerpo dirigido
contra esta proteína. Ambas detecciones pueden realizarse mediante
procedimientos habituales, especialmente una transferencia Western,
un ELISA, una inmunoprecipitación o mediante inmunofluorescencia.
Además, con un ácido nucleico según la invención, especialmente un
ADN y cebadores derivados del mismo, puede detectarse la expresión
del gen que codifica la (PAT). Esta detección puede realizarse de
modo habitual, especialmente en una transferencia Southern.
Además, la presente invención es adecuada para
tomar medidas a favor y en contra de la presencia de (PAT) en
personas. Con un anticuerpo según la invención, puede inhibirse la
(PAT) en personas. Por otro lado, con una (PAT) según la invención,
especialmente después de acoplamiento con una proteína no
considerada extraña por el cuerpo, por ejemplo transferrina o BSA,
aumenta la cantidad de (PAT) en las personas. Puede conseguirse
correspondientemente también con un ácido nucleico según la
invención, especialmente un ADN que está establecido bajo el control
de un promotor inducible en tejidos determinados, por ejemplo,
cerebro, corazón, y que después de su expresión conduce a la puesta
a disposición de (PAT) en estos tejidos. Además, puede usarse
también un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN,
para la inhibición de (PAT). Para ello, se usa el ácido nucleico,
por ejemplo, como base para la elaboración de oligonucleótidos sin
sentido para la inhibición de la expresión del gen que codifica la
(PAT).
La presente invención representa por tanto una
gran contribución para el registro diagnóstico y terapéutico de
enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de
tiamina, especialmente beriberi y síndrome de
Wernicke-Korsakoff.
La fig. 1 muestra la secuencia de bases y la
secuencia de aminoácidos derivada de la misma de una (PAT) según la
invención,
La fig. 2 muestra la secuencia de bases y la
secuencia de aminoácidos derivada de la misma de una (PAT)
específica de cerebro según la invención (las flechas indican la
situación de (PAT) de la Fig. 1), y
La fig. 3 muestra la secuencia de bases y la
secuencia de aminoácidos derivada de la misma de una (PAT)
específica de corazón según la invención (las flechas indica la
situación de (PAT) de la Fig. 1).
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos.
Para la preparación de una (PAT) según la
invención se usó el ADN de la Fig. 2 o 3 como molde. Se llevó a cabo
un procedimiento de PCR. Respecto al ADN de la Fig. 2, se usó como
par cebador: 5'-CAGAGATCTATGAGGTA
CAAGCAGTCAG-3' y 5'-GGGAAGCTTTTAGTTCAGCAACATGC-3'. Respecto al ADN de la Fig. 3, se usó como par cebador: 5'-CAGAGATCTATGTGGCGTATCCATGC-3' y 5'-GGGAAGCTTTTAGTTCAGCAACATGC-3'. La preparación de PCR o las condiciones de PCR fueron respectivamente las siguientes:
CAAGCAGTCAG-3' y 5'-GGGAAGCTTTTAGTTCAGCAACATGC-3'. Respecto al ADN de la Fig. 3, se usó como par cebador: 5'-CAGAGATCTATGTGGCGTATCCATGC-3' y 5'-GGGAAGCTTTTAGTTCAGCAACATGC-3'. La preparación de PCR o las condiciones de PCR fueron respectivamente las siguientes:
| ADN molde (Fig. 1): | 1 \mul= 1 ng |
| Pfu polimerasa, tampón 10x: | 10 \mul= 1 x |
| DMSO: | 10 \mul= 10% |
| dNTP: | 1 \mul= 200 \muM cada uno |
| oligonucleótido, 1,5 \mul cada uno: | 3 \mul= 150 ng cada uno |
| H_{2}O bidest.: | hasta 99 \mul. |
- 92ºC, 5 min
- adición de 1 \mul de pfu polimerasa
(Stratagene)= 2,5 unidades
- adición de parafina
92ºC, 1 min
58ºC, 1 min 1 ciclo
72ºC, 10 min
92ºC, 1 min
58ºC, 1 min 39 ciclos
72ºC, 2 min
72ºC, 10 min 1 ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN amplificado se escindió respectivamente
con BglII y HindIII y se insertó en los vectores de expresión
pEQ-8 (Diagen) escindidos con BglII y HindIII. Se
obtuvo el plásmido de expresión pQ/TVP-G
(pQ/TVP-H). Éste codifica una proteína de fusión de
6 restos de histidina (asociado N-terminal) y la
(PAT) según la invención de la Fig. 2 (Fig. 3) (asociado
C-terminal). Se usó pQ/TVP-G
(pQ/TVP-H) para la transformación de SG 13009 de
E. coli (véase Gottesman, S. y col., J. Bacteriol. 148,
(1981), 265-273). Se cultivaron las bacterias en un
medio LB con ampicilina 100 \mug/ml y kanamicina 25 \mug/ml, y
se indujeron durante 4 h con
\beta-D-tiogalactopiranósido de
isopropilo (IPTG) 60 \muM. Mediante la adición de clorhidrato de
guanidinio 6 M, se consiguió la lisis de las bacterias, a
continuación se llevó a cabo con el lisado una cromatografía
(Ni-resina NTA) en presencia de urea 8 M
correspondientemente a los datos del fabricante (Diagen) del
material de cromatografía. Se eluyó la proteína de fusión unida en
un tampón a pH 3,5. Después de su neutralización, se sometió la
proteína de fusión a una electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y se tiñó con azul de Coomasie
(véase Thomas, J.O. y Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149
(1975), 709-733).
Se ha mostrado que puede prepararse una proteína
(de fusión) según la invención en forma altamente pura.
Ejemplo
2
Se sometió una proteína de fusión del ejemplo 1
según la invención a una electroforesis en gel de SDS poliacrilamida
al 18%. Después de teñir el gel con acetato de sodio 4 M, se recortó
una banda de aprox. 59 (16,5) kDa del gel y se incubó en disolución
de sal común tamponada con fosfato. Sedimentaron trozos de gel antes
de determinar la concentración de proteína del sobrenadante mediante
una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, a
la que siguió una tinción con azul de Coomasie. Con la proteína de
fusión purificada en gel se inmunizaron animales del modo
siguiente:
Se utilizaron 35 \mug de proteína de fusión
purificada en gel por inmunización en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml de
coadyuvante de Freund completo e incompleto.
- Día 0:
- 1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo).
- Día 14:
- 2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, CFI).
- Día 28:
- 3ª inmunización (CFI).
- Día 56:
- 4ª inmunización (CFI).
- Día 80:
- Desangrado.
Se ensayó el suero del conejo por
inmunotransferencia. Para ello, se sometió una proteína de fusión
del ejemplo 1 según la invención a una electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y se transfirió a un filtro de
nitrocelulosa (véase Khyse-Andersen, J., J.
Biochem. Biophys. Meth., 10, (1984), 203-209).
El análisis de transferencia Western se llevó a cabo como se
describe en Bock, C.-T. y col., Virus Genes 8, (1994),
215-229. Para ello, se incubó el filtro de
nitrocelulosa durante una hora a 37ºC con un primer anticuerpo. Este
anticuerpo era el suero del conejo (1:10.000 en PBS). Después de
varias etapas de lavado con PBS, se incubó el filtro de
nitrocelulosa con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo era un
anticuerpo de IgG monoclonal de cabra anti-conejo
acoplado a fosfatasa alcalina (Dianova) (1:5.000) en PBS. Después de
30 min de incubación a 37ºC, siguieron varias etapas de lavado con
PBS y a continuación la reacción de detección de fosfatasa alcalina
con disolución de revelado (fosfato de
5'-bromo-4-cloro-3-indolilo
36 \muM, azul de nitrotetrazoilo 400 \muM,
Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5
mM) a temperatura ambiente hasta que fueron visibles las bandas.
Se ha mostrado que pueden prepararse anticuerpos
policlonales según la invención.
Se utilizan 40 \mug de proteína de fusión
purificada en gel en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml de coadyuvante de Freund
completo o incompleto por inmunización.
- Día 0:
- 1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo).
- Día 28:
- 2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto; CFI).
- Día 50:
- 3ª inmunización (CFI).
Se extrajeron anticuerpos de yema de huevo y se
ensayaron en transferencia Western. Se detectaron anticuerpos
policlonales según la invención.
Se utilizaron 12 \mug de proteína de fusión
purificada por gel en 0,25 ml de PBS y 0,25 ml de coadyuvante de
Freund completo o incompleto por inmunización; en la 4ª
inmunización, se disolvió la proteína de fusión en 0,5 ml (sin
coadyuvante).
- Día 0:
- 1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo).
- Día 28:
- 2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, CFI).
- Día 56:
- 3ª inmunización (CFI).
- Día 84:
- 4ª inmunización (PBS).
- Día 87:
- Fusión.
Se ensayaron los sobrenadantes de los hibridomas
por transferencia Western. Se detectaron anticuerpos monoclonales
según la invención.
Claims (13)
1. Proteína análoga a transcetolasa, en la que
la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1.
2. Proteína análoga a transcetolasa,
caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de
la Fig. 2.
3. Proteína análoga a transcetolasa,
caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de
la Fig. 3.
4. Ácido nucleico, caracterizado porque
comprende la secuencia de bases de la Fig. 1.
5. Ácido nucleico, caracterizado porque
comprende la secuencia de bases de la Fig. 2.
6. Ácido nucleico, caracterizado porque
comprende la secuencia de bases de la Fig. 3.
7. Plásmido de expresión, caracterizado
porque comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones
4 a 6.
8. Transformante, caracterizado porque
contiene el plásmido de expresión según la reivindicación 7.
9. Procedimiento para la preparación de una
proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque comprende el cultivo del transformante
según la reivindicación 8.
10. Anticuerpo, caracterizado porque se
dirige específicamente contra una proteína según una de las
reivindicaciones 1 a 3.
11. Uso de una proteína según una de las
reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un agente para el
diagnóstico o la terapia de enfermedades neurológicas que están
asociadas a una deficiencia de tiamina como, por ejemplo, beriberi y
síndrome de Wernicke-Korsakoff.
12. Uso de un ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 4 a 6, para la preparación de un agente para el
diagnóstico o la terapia de enfermedades neurológicas que están
asociadas a una deficiencia de tiamina como, por ejemplo, beriberi y
síndrome de Wernicke-Korsakoff.
13. Uso de un anticuerpo según la reivindicación
10 para la preparación de un agente para el diagnóstico o la terapia
de enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia
de tiamina como, por ejemplo, beriberi y síndrome de
Wernicke-Korsakoff.
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