JPH04228087A - B型肝炎ウイルスエンベロープのPreS2およびPreS1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
B型肝炎ウイルスエンベロープのPreS2およびPreS1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、B型肝炎ウイルス表面
抗原のPreS1およびPreS2に特異的に結合する
モノクローナル抗体、および該抗体を用いた試料中のP
reS1およびPreS2のアッセイ法、およびHBV
のサブタイプの決定法に関する。
抗原のPreS1およびPreS2に特異的に結合する
モノクローナル抗体、および該抗体を用いた試料中のP
reS1およびPreS2のアッセイ法、およびHBV
のサブタイプの決定法に関する。
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】B型
肝炎ウイルス(HBV)感染は、世界中で主要な公衆衛
生の問題を呈示している。急性B型肝炎ウイルス感染お
よびその慢性後発症、たとえば肝硬変や肝癌などを防ぐ
最も効果的な方法は予防接種である。良好な結果の得ら
れているB型肝炎ワクチンは、非感染性の22nmの粒
子として慢性ウイルスキャリアの血液から単離されたB
型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)からなる。この
22nmの粒子は、主として24,000dの主要タン
パク質(p24)およびその糖付加体(gp27)から
なる。最近になった導入されたワクチンは、p24をコ
ードするHBV遺伝子Sでトランスフェクションした酵
母細胞で合成されたp24を含んでいる。これらワクチ
ンの安全性および有効性については確立されたが、その
免疫原性については、ある比率の受容者には不完全であ
る。それゆえ、免疫原性の一層大きいHBVワクチンに
対する必要性が存在し、その同定のためにはHBVタン
パク質上の抗原性部位の位置、構造および免疫原性につ
いての一層進んだ知見が必要である。
肝炎ウイルス(HBV)感染は、世界中で主要な公衆衛
生の問題を呈示している。急性B型肝炎ウイルス感染お
よびその慢性後発症、たとえば肝硬変や肝癌などを防ぐ
最も効果的な方法は予防接種である。良好な結果の得ら
れているB型肝炎ワクチンは、非感染性の22nmの粒
子として慢性ウイルスキャリアの血液から単離されたB
型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)からなる。この
22nmの粒子は、主として24,000dの主要タン
パク質(p24)およびその糖付加体(gp27)から
なる。最近になった導入されたワクチンは、p24をコ
ードするHBV遺伝子Sでトランスフェクションした酵
母細胞で合成されたp24を含んでいる。これらワクチ
ンの安全性および有効性については確立されたが、その
免疫原性については、ある比率の受容者には不完全であ
る。それゆえ、免疫原性の一層大きいHBVワクチンに
対する必要性が存在し、その同定のためにはHBVタン
パク質上の抗原性部位の位置、構造および免疫原性につ
いての一層進んだ知見が必要である。
【0002】HBVエンベロープのタンパク質組成はす
でに決定され、ウイルスゲノム中でのマッピングもなさ
れている。図1は、ヘルマンらによって提唱されたモデ
ルをまとめたものである[ヘルマン(N.Herrma
nn)ら、J.Virol.,52、396(1984
)]。このモデルにおいて、3つのHBVエンベロープ
タンパク質およびその糖付加体は1つの連続したオープ
ンリーディングフレーム(ORF)に由来し、該フレー
ムはS領域、PreS2領域およびPreS1領域に分
割されている。このS遺伝子は、ウイルスのサブタイプ
に依存して上記ORFの第三または第四の開始コドンか
ら始まり、主要なHBVエンベロープタンパク質である
Sタンパク質(p24およびその糖付加体であるgp2
7を含む)をコードしている。PreS領域には同じ読
み取り枠中にさらに2つの開始部位が含まれており、そ
のためS遺伝子は2つの一層大きなB型肝炎ウイルス表
面抗原分子、すなわちMタンパク質(PreS2+Sの
55のアミノ酸からなる)およびLタンパク質(Pre
S1+PreS2+Sタンパク質の108または119
アミノ酸からなる)を発現することができる。Mタンパ
ク質は、1カ所が糖付加された形態(gp33)と2カ
所が糖付加された形態(gp36)からなる。Lタンパ
ク質は、糖付加されていない形態(gp39)と1カ所
が糖付加された形態(gp41)からなる。
でに決定され、ウイルスゲノム中でのマッピングもなさ
れている。図1は、ヘルマンらによって提唱されたモデ
ルをまとめたものである[ヘルマン(N.Herrma
nn)ら、J.Virol.,52、396(1984
)]。このモデルにおいて、3つのHBVエンベロープ
タンパク質およびその糖付加体は1つの連続したオープ
ンリーディングフレーム(ORF)に由来し、該フレー
ムはS領域、PreS2領域およびPreS1領域に分
割されている。このS遺伝子は、ウイルスのサブタイプ
に依存して上記ORFの第三または第四の開始コドンか
ら始まり、主要なHBVエンベロープタンパク質である
Sタンパク質(p24およびその糖付加体であるgp2
7を含む)をコードしている。PreS領域には同じ読
み取り枠中にさらに2つの開始部位が含まれており、そ
のためS遺伝子は2つの一層大きなB型肝炎ウイルス表
面抗原分子、すなわちMタンパク質(PreS2+Sの
55のアミノ酸からなる)およびLタンパク質(Pre
S1+PreS2+Sタンパク質の108または119
アミノ酸からなる)を発現することができる。Mタンパ
ク質は、1カ所が糖付加された形態(gp33)と2カ
所が糖付加された形態(gp36)からなる。Lタンパ
ク質は、糖付加されていない形態(gp39)と1カ所
が糖付加された形態(gp41)からなる。
【0003】HBV感染者の血液中では、全B型肝炎ウ
イルス表面抗原のうちごくわずかが完全なビリオン(デ
イン粒子)として存在するにすぎない。他の2つの形態
である22nmの球形粒子および直径が22nmで種々
の長さのフィラメントはカプシドまたはDNAを欠いて
おり、42nmの「デイン」粒子に比べて1×106:
1もの過剰量で産生される。これら形態のタンパク質組
成はかなり異なっている。HBVデイン粒子中の全エン
ベロープタンパク質の20%までがLタンパク質である
のに対して、22nm球形粒子中の全タンパク質の約1
%のみがLタンパク質である。
イルス表面抗原のうちごくわずかが完全なビリオン(デ
イン粒子)として存在するにすぎない。他の2つの形態
である22nmの球形粒子および直径が22nmで種々
の長さのフィラメントはカプシドまたはDNAを欠いて
おり、42nmの「デイン」粒子に比べて1×106:
1もの過剰量で産生される。これら形態のタンパク質組
成はかなり異なっている。HBVデイン粒子中の全エン
ベロープタンパク質の20%までがLタンパク質である
のに対して、22nm球形粒子中の全タンパク質の約1
%のみがLタンパク質である。
【0004】トランスフェクションした細胞中でのLタ
ンパク質の過剰産生は、これら細胞からのLタンパク質
粒子の分泌を抑制する結果を招く。Lタンパク質は、分
泌および完全ビリオンの形態形成に重要な役割を果して
いるかもしれないという仮説が出されている。
ンパク質の過剰産生は、これら細胞からのLタンパク質
粒子の分泌を抑制する結果を招く。Lタンパク質は、分
泌および完全ビリオンの形態形成に重要な役割を果して
いるかもしれないという仮説が出されている。
【0005】Lタンパク質のPreS1領域は、Hep
G2細胞に結合する能力を有することから示されるよ
うに、ヒト肝細胞に対する特異的レセプターを含んでい
るかもしれない[ノイラート(A.R.Neurath
)ら、Cell、46、429(1986)]。重合ヒ
ト血清アルブミンに対するPreS2領域の特異的結合
もまた、HBVが肝細胞原形質膜に結合するための可能
な機構として提唱されている[イマイ(M.Imai)
ら、Gastroenterology、76、242
(1979)]。
G2細胞に結合する能力を有することから示されるよ
うに、ヒト肝細胞に対する特異的レセプターを含んでい
るかもしれない[ノイラート(A.R.Neurath
)ら、Cell、46、429(1986)]。重合ヒ
ト血清アルブミンに対するPreS2領域の特異的結合
もまた、HBVが肝細胞原形質膜に結合するための可能
な機構として提唱されている[イマイ(M.Imai)
ら、Gastroenterology、76、242
(1979)]。
【0006】ウイルスの構造または機能におけるPre
S含有タンパク質の役割にもかかわらず、PreS1お
よびPreS2タンパク質はマウスにおいて高度に免疫
原性であることが示されており、これらタンパク質がS
タンパク質と組み合わされるとSタンパク質に対する免
疫応答が増強されることが示されている[ミリッヒ(D
.R.Milich)ら、Science、228、1
195(1995)]。 PreS2領域の一部のみを含有する合成ペプチドワク
チンはPreS2に対する免疫応答を示し、接種したチ
ンパンジーをウイルスによる攻撃後にHBV感染から防
御した[ノイラートら、Vaccine、4、35(1
986)]。現在利用できるB型肝炎ワクチンはPre
S組成がかなり異なっており、ヒトにおけるPreS含
有ワクチンの相対的な免疫原性はいまだ解明されていな
い。
S含有タンパク質の役割にもかかわらず、PreS1お
よびPreS2タンパク質はマウスにおいて高度に免疫
原性であることが示されており、これらタンパク質がS
タンパク質と組み合わされるとSタンパク質に対する免
疫応答が増強されることが示されている[ミリッヒ(D
.R.Milich)ら、Science、228、1
195(1995)]。 PreS2領域の一部のみを含有する合成ペプチドワク
チンはPreS2に対する免疫応答を示し、接種したチ
ンパンジーをウイルスによる攻撃後にHBV感染から防
御した[ノイラートら、Vaccine、4、35(1
986)]。現在利用できるB型肝炎ワクチンはPre
S組成がかなり異なっており、ヒトにおけるPreS含
有ワクチンの相対的な免疫原性はいまだ解明されていな
い。
【0007】アウスリア(Ausria)RII、アウ
スザイムRIIおよびモノクローナルアウスザイムRは
、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)の検出のた
めに現在利用できるアッセイである(アボット・ラボラ
トリーズ、ノースシカゴ、IL)。モノクローナルアウ
スザイムはタンパク質Sに対するモノクローナル抗体の
みを使用する。これらのHBsAgアッセイは、Lタン
パク質、Mタンパク質およびSタンパク質を識別するこ
とができない。
スザイムRIIおよびモノクローナルアウスザイムRは
、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)の検出のた
めに現在利用できるアッセイである(アボット・ラボラ
トリーズ、ノースシカゴ、IL)。モノクローナルアウ
スザイムはタンパク質Sに対するモノクローナル抗体の
みを使用する。これらのHBsAgアッセイは、Lタン
パク質、Mタンパク質およびSタンパク質を識別するこ
とができない。
【0008】抗HBs検出および定量のための市販の直
接固相ラジオイムノアッセイ(RIA)は、1975年
から利用されている(AUSAB、アボット・ラボラト
リーズ)[ムシャウオー(I.K.Mushahwar
)ら、J.Med.Virol.,2、77(1978
)]。このアッセイでは、ヒト血漿由来のB型肝炎ウイ
ルス表面抗原(hpHBsAg)をコーティングした固
相(ポリスチレンビーズ)とともに血清または血漿試料
をインキュベートする。血清中にHBsAgに対する抗
体(抗HBs)が存在しておれば、それら抗体は固相抗
原に結合するであろう。第二の工程において、放射性標
識したHBsAg(125I−HBsAg)を加え、上
記固定化抗体と反応させる。固相に結合した放射性標識
の量は、適度に、最初の試料中の抗HBsの量に正比例
する。
接固相ラジオイムノアッセイ(RIA)は、1975年
から利用されている(AUSAB、アボット・ラボラト
リーズ)[ムシャウオー(I.K.Mushahwar
)ら、J.Med.Virol.,2、77(1978
)]。このアッセイでは、ヒト血漿由来のB型肝炎ウイ
ルス表面抗原(hpHBsAg)をコーティングした固
相(ポリスチレンビーズ)とともに血清または血漿試料
をインキュベートする。血清中にHBsAgに対する抗
体(抗HBs)が存在しておれば、それら抗体は固相抗
原に結合するであろう。第二の工程において、放射性標
識したHBsAg(125I−HBsAg)を加え、上
記固定化抗体と反応させる。固相に結合した放射性標識
の量は、適度に、最初の試料中の抗HBsの量に正比例
する。
【0009】この試験の酵素結合イムノアッセイ(EI
A)態様は1983年から利用されており、プローブ「
検出」試薬としてアビジン混合物に結合させたビオチン
化HBsAg−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)
を使用している[ムシャウオーら、J.Virol.M
ethods、16、1(1987)]。この試験の改
良形態では、ビオチン/アビジン検出試薬の代わりにビ
オチン/抗ビオチン検出系を採用している[ムシャウオ
ー、J.Virol.Methods、16、45(1
987)]。
A)態様は1983年から利用されており、プローブ「
検出」試薬としてアビジン混合物に結合させたビオチン
化HBsAg−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)
を使用している[ムシャウオーら、J.Virol.M
ethods、16、1(1987)]。この試験の改
良形態では、ビオチン/アビジン検出試薬の代わりにビ
オチン/抗ビオチン検出系を採用している[ムシャウオ
ー、J.Virol.Methods、16、45(1
987)]。
【0010】しかしながら、これらアッセイは主として
抗S抗体を検出する。これらアッセイは抗PreS1抗
体または抗PreS2抗体を検出することができず、抗
PreS1抗体、抗PreS2抗体または抗S抗体を主
として含有する試料を識別することはできない。何人か
の研究者は、PreS1およびPreS2に対する抗体
がしばしばヒトにおけるHBV感染に対する最も初期の
抗体応答であること、ウイルスクリアランスに関連して
いるかもしれないこと、および中和抗体として働くかも
しれないことを報告しており、そのためPreS1およ
びPreS2の両タンパク質および該タンパク質に対す
る抗体を検出することのできるアッセイに対する必要性
が存在する。そのようなアッセイは、PreS含有ワク
チンで免疫したワクチン接種者をモニターするのに用い
ることができる。[たとえば、クリンカート(Klin
kert)ら、J.Virol.,58、522(19
86)参照]。
抗S抗体を検出する。これらアッセイは抗PreS1抗
体または抗PreS2抗体を検出することができず、抗
PreS1抗体、抗PreS2抗体または抗S抗体を主
として含有する試料を識別することはできない。何人か
の研究者は、PreS1およびPreS2に対する抗体
がしばしばヒトにおけるHBV感染に対する最も初期の
抗体応答であること、ウイルスクリアランスに関連して
いるかもしれないこと、および中和抗体として働くかも
しれないことを報告しており、そのためPreS1およ
びPreS2の両タンパク質および該タンパク質に対す
る抗体を検出することのできるアッセイに対する必要性
が存在する。そのようなアッセイは、PreS含有ワク
チンで免疫したワクチン接種者をモニターするのに用い
ることができる。[たとえば、クリンカート(Klin
kert)ら、J.Virol.,58、522(19
86)参照]。
【0011】ヘスら[Liver、7、245(198
7)]は、HBVにより誘導された細胞病理と肝臓生検
からの細胞中のPreS1染色の存在との間の関係を示
したが、PreS1発現の可能な病原的役割は未知であ
る。 アルバーチら[Hepatol.,7、207(198
7)]は、PreS2に対する抗体の存在がウイルス複
製の終了および回復の開始の形跡と関連することを見出
した。それゆえ、暴露個体またはHBV患者へのPre
S1抗体および/またはPreS2抗体の投与は、高度
免疫グロブリン(HBIG)を使用した現在の治療法に
とって重要な補助になるであろう。幾つかのHBIG調
製物にはPreS1および/またはPreS2に対する
抗体が含まれているので、これら抗体の量を決定するこ
とのできるアッセイに対する必要性が存在する。
7)]は、HBVにより誘導された細胞病理と肝臓生検
からの細胞中のPreS1染色の存在との間の関係を示
したが、PreS1発現の可能な病原的役割は未知であ
る。 アルバーチら[Hepatol.,7、207(198
7)]は、PreS2に対する抗体の存在がウイルス複
製の終了および回復の開始の形跡と関連することを見出
した。それゆえ、暴露個体またはHBV患者へのPre
S1抗体および/またはPreS2抗体の投与は、高度
免疫グロブリン(HBIG)を使用した現在の治療法に
とって重要な補助になるであろう。幾つかのHBIG調
製物にはPreS1および/またはPreS2に対する
抗体が含まれているので、これら抗体の量を決定するこ
とのできるアッセイに対する必要性が存在する。
【0012】HBsAgもまた抗原として複雑であり、
群特異的な「a」抗原決定基(すべてのHBsAg粒子
上に存在するものとして定義される)および2セットの
通常相互に排除的なサブタイプ特異的抗原決定基である
d/yとw/rとを含んでいる。このことから、adw
、adr、aywおよびayrというHBsAgの4つ
の主要なサブタイプが得られる。さらに別の抗原決定基
も記載されており、10の異なるHBsAgサブタイプ
の普遍的認識が得られる。たとえば、これらサブタイプ
のうちの2つはadywおよびadywrとして表され
、この場合、「d」と「y」または「w」と「r」の両
方が同じ試料中に存在する。PreS2の5つの異なる
HBVサブタイプのアミノ酸配列がノイラートらにより
示されている[Science、224、392(19
84)]。しかしながら、現在までに報告されている抗
PreS1および抗PreS2モノクローナル抗体はH
BVサブタイプを識別することができず、HBV株の中
でDNA配列のどの変化が抗原性の変異となって現れる
のかはわかっていない。
群特異的な「a」抗原決定基(すべてのHBsAg粒子
上に存在するものとして定義される)および2セットの
通常相互に排除的なサブタイプ特異的抗原決定基である
d/yとw/rとを含んでいる。このことから、adw
、adr、aywおよびayrというHBsAgの4つ
の主要なサブタイプが得られる。さらに別の抗原決定基
も記載されており、10の異なるHBsAgサブタイプ
の普遍的認識が得られる。たとえば、これらサブタイプ
のうちの2つはadywおよびadywrとして表され
、この場合、「d」と「y」または「w」と「r」の両
方が同じ試料中に存在する。PreS2の5つの異なる
HBVサブタイプのアミノ酸配列がノイラートらにより
示されている[Science、224、392(19
84)]。しかしながら、現在までに報告されている抗
PreS1および抗PreS2モノクローナル抗体はH
BVサブタイプを識別することができず、HBV株の中
でDNA配列のどの変化が抗原性の変異となって現れる
のかはわかっていない。
【0013】このような混合サブタイプは、おそらく別
の遺伝子型の2種または3種以上のウイルスに細胞が感
染することによるものと思われる。得られる混合表現型
は、異なるサブタイプの粒子の混合物としてかまたは両
方のサブタイプを含有する粒子として現れる。各粒子上
に両方のサブタイプの抗原決定基が存在する場合は、こ
の混合サブタイプ粒子は単なる表現型の混合、すなわち
ウイルスエンベロープの組み立てにおいて、2つの異な
るウイルスS遺伝子によりコードされるp25およびg
p30タンパク質という2つの異なるサブタイプを混合
することにより得られるものと思われる。それゆえ、こ
のタンパク質の両方の形態からなる粒子は、両方のサブ
タイプ抗原決定基を有している。ウイルスが伝播される
と、別のサブタイプを有する粒子が生成されるであろう
[ポール(D.A.Paul)ら、J.Virol.M
ethods、13、43(1986)]。この複雑さ
のため、感染個体のHBsAgサブタイプの決定法に対
する必要性がなお存在する。 HBVのサブタイプを決定することができれば、偶発的
および周産期伝播の場合の個体群間および個体間におけ
るHBV感染ルートを後付けることができる。
の遺伝子型の2種または3種以上のウイルスに細胞が感
染することによるものと思われる。得られる混合表現型
は、異なるサブタイプの粒子の混合物としてかまたは両
方のサブタイプを含有する粒子として現れる。各粒子上
に両方のサブタイプの抗原決定基が存在する場合は、こ
の混合サブタイプ粒子は単なる表現型の混合、すなわち
ウイルスエンベロープの組み立てにおいて、2つの異な
るウイルスS遺伝子によりコードされるp25およびg
p30タンパク質という2つの異なるサブタイプを混合
することにより得られるものと思われる。それゆえ、こ
のタンパク質の両方の形態からなる粒子は、両方のサブ
タイプ抗原決定基を有している。ウイルスが伝播される
と、別のサブタイプを有する粒子が生成されるであろう
[ポール(D.A.Paul)ら、J.Virol.M
ethods、13、43(1986)]。この複雑さ
のため、感染個体のHBsAgサブタイプの決定法に対
する必要性がなお存在する。 HBVのサブタイプを決定することができれば、偶発的
および周産期伝播の場合の個体群間および個体間におけ
るHBV感染ルートを後付けることができる。
【0014】
【課題を解決するための手段】本発明は、HBVエンベ
ロープのPreS1タンパク質の少なくとも3つの区別
されるエピトープおよびPreS2タンパク質の少なく
とも4つの区別されるエピトープを定める2つのパネル
のモノクローナル抗体を提供する。これらモノクローナ
ル抗体群のうち6つのものについてのイソタイプおよび
結合特性を以下に詳細に記載する。これらモノクローナ
ル抗体群のうちの5つのもののエピトープ特異性を下記
表1にまとめて示す。
ロープのPreS1タンパク質の少なくとも3つの区別
されるエピトープおよびPreS2タンパク質の少なく
とも4つの区別されるエピトープを定める2つのパネル
のモノクローナル抗体を提供する。これらモノクローナ
ル抗体群のうち6つのものについてのイソタイプおよび
結合特性を以下に詳細に記載する。これらモノクローナ
ル抗体群のうちの5つのもののエピトープ特異性を下記
表1にまとめて示す。
【0015】
【表1】
表1(PreS1およびPreS2タンパク質に対
するモノクローナル抗体)PreS1 含まれるエピ
トープa L結合 M結合 S
結合 群1 27〜35
+ −
− 群2 72〜78
+ −
−PreS2 群1 120〜145
+ + −
群2 123(+グリカン)
− + − 群3
150〜174 −
+ −(a)ノイラー
トらのCell、46、429(1986)による1図
において、PreS1メチオニンから下流にあるアミノ
酸位置
するモノクローナル抗体)PreS1 含まれるエピ
トープa L結合 M結合 S
結合 群1 27〜35
+ −
− 群2 72〜78
+ −
−PreS2 群1 120〜145
+ + −
群2 123(+グリカン)
− + − 群3
150〜174 −
+ −(a)ノイラー
トらのCell、46、429(1986)による1図
において、PreS1メチオニンから下流にあるアミノ
酸位置
【0016】これらエピトープはPreS1またはPr
eS2特異的である。すなわち、これらエピトープは、
HBsAg含有試料(たとえば、デイン粒子など)を処
理して本質的にSタンパク質のすべての抗原性を破壊し
た後にも保持される。これらエピトープはHBV抗体ア
ッセイにおいても有用であるため、これらもその標識形
とともに本発明の範囲に含まれる。各群からのモノクロ
ーナル抗体の幾つかはそれらのエピトープに対して「高
親和性」結合(K=109〜1012)を示す。これら
モノクローナル抗体は、本発明のこの側面での好ましい
態様を表す。
eS2特異的である。すなわち、これらエピトープは、
HBsAg含有試料(たとえば、デイン粒子など)を処
理して本質的にSタンパク質のすべての抗原性を破壊し
た後にも保持される。これらエピトープはHBV抗体ア
ッセイにおいても有用であるため、これらもその標識形
とともに本発明の範囲に含まれる。各群からのモノクロ
ーナル抗体の幾つかはそれらのエピトープに対して「高
親和性」結合(K=109〜1012)を示す。これら
モノクローナル抗体は、本発明のこの側面での好ましい
態様を表す。
【0017】本明細書に記載するように、PreS1お
よびPreS2タンパク質の領域を含むエピトープは、
少なくともその一部は表1に示した領域のアミノ酸配列
によって含まれ、また該領域の側面または隣接するアミ
ノ酸配列をも含む。
よびPreS2タンパク質の領域を含むエピトープは、
少なくともその一部は表1に示した領域のアミノ酸配列
によって含まれ、また該領域の側面または隣接するアミ
ノ酸配列をも含む。
【0018】イムノアッセイ
1.抗原アッセイ
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト血液や血漿などの
生理学的物質中のHBVおよびHBsAgを検出するた
めの特異的で感度に良いイムノアッセイを開発するため
に使用することができる。抗Sに基づいた検出系(モノ
クローナルアウスザイムRアッセイなど)では反応しな
いほどにHBV変異体が既知の変異体とは異なっている
場合は、本発明の抗PreSに基づいた抗原検出アッセ
イを用いて当該試料をスクリーニングすることができる
。
生理学的物質中のHBVおよびHBsAgを検出するた
めの特異的で感度に良いイムノアッセイを開発するため
に使用することができる。抗Sに基づいた検出系(モノ
クローナルアウスザイムRアッセイなど)では反応しな
いほどにHBV変異体が既知の変異体とは異なっている
場合は、本発明の抗PreSに基づいた抗原検出アッセ
イを用いて当該試料をスクリーニングすることができる
。
【0019】本発明のモノクローナル抗体を用いて開発
した一つのアッセイはサンドイッチ型のラジオイムノア
ッセイ(RIA)または酵素結合イムノアッセイ(EI
A)であり、この場合、PreS1またはPreS2タ
ンパク質(たとえば、Lおよび/またはMタンパク質と
して)を含有する液体試料を、これらタンパク質に対す
る「捕捉抗体」(モノクローナルであってもポリクロー
ナルであってもよい)を含む固相と反応させる。捕捉抗
体はSタンパク質領域に結合する抗体であってもよいし
、またはPreS1もしくはPreS2領域中のエピト
ープに特異的に結合する本発明のモノクローナル抗体で
あってもよい。
した一つのアッセイはサンドイッチ型のラジオイムノア
ッセイ(RIA)または酵素結合イムノアッセイ(EI
A)であり、この場合、PreS1またはPreS2タ
ンパク質(たとえば、Lおよび/またはMタンパク質と
して)を含有する液体試料を、これらタンパク質に対す
る「捕捉抗体」(モノクローナルであってもポリクロー
ナルであってもよい)を含む固相と反応させる。捕捉抗
体はSタンパク質領域に結合する抗体であってもよいし
、またはPreS1もしくはPreS2領域中のエピト
ープに特異的に結合する本発明のモノクローナル抗体で
あってもよい。
【0020】ついで、捕捉したPreS1および/また
はPreS2含有タンパク質を、放射性同位体や酵素な
どの検出可能な標識を結合した本発明の抗PreS1ま
たは抗PreS2モノクローナル抗体と反応させて検出
および測定する。別法として、「検出抗体」は、検出可
能な標識のための結合部位を有していてもよく、この結
合した検出モノクローナル抗体に別の工程で検出可能な
標識を加える。検出可能な標識のための結合部位は、検
出抗体に対する第三の標識抗体によって結合されるエピ
トープであってよい。たとえば、結合マウスモノクロー
ナル抗体(たとえば、本発明のモノクローナル抗体など
)を検出するために酵素標識抗マウス抗体を使用するこ
とができる。ついで、たとえば放射性標識の場合は毎分
放射能数(cpm)で、酵素標識により触媒した発色反
応の場合は吸光度(A)単位で、捕捉PreS1または
PreS2含有タンパク質に結合した標識の量を測定し
、標準PreS1およびPreS2含有試料と相関させ
て試料中に存在するPreS1またはPreS2含有タ
ンパク質の量を測定する。
はPreS2含有タンパク質を、放射性同位体や酵素な
どの検出可能な標識を結合した本発明の抗PreS1ま
たは抗PreS2モノクローナル抗体と反応させて検出
および測定する。別法として、「検出抗体」は、検出可
能な標識のための結合部位を有していてもよく、この結
合した検出モノクローナル抗体に別の工程で検出可能な
標識を加える。検出可能な標識のための結合部位は、検
出抗体に対する第三の標識抗体によって結合されるエピ
トープであってよい。たとえば、結合マウスモノクロー
ナル抗体(たとえば、本発明のモノクローナル抗体など
)を検出するために酵素標識抗マウス抗体を使用するこ
とができる。ついで、たとえば放射性標識の場合は毎分
放射能数(cpm)で、酵素標識により触媒した発色反
応の場合は吸光度(A)単位で、捕捉PreS1または
PreS2含有タンパク質に結合した標識の量を測定し
、標準PreS1およびPreS2含有試料と相関させ
て試料中に存在するPreS1またはPreS2含有タ
ンパク質の量を測定する。
【0021】たとえば、本発明のモノクローナル抗体を
用いて開発したPreS1抗原アッセイを下記表2にま
とめて示す。
用いて開発したPreS1抗原アッセイを下記表2にま
とめて示す。
【表2】
表2
固相上の捕捉抗体
検出モノクローナル抗体(a)群1Pr
eS1
群2PreS1(b)ポリクローナルアウスザイムRI
I 群1PreS1 (モルモット;高度
免疫血清)(c)群1PreS1
群1PreS1(d)群2P
reS1
群2PreS1(e)アウスザイムRII(ポリクロ
ーナル) 群1+群2PreS1(f)モノクローナ
ルアウスザイムR(Sタン 群1および/または群2
パク質に対するモノクローナル抗体) Pr
eS1
検出モノクローナル抗体(a)群1Pr
eS1
群2PreS1(b)ポリクローナルアウスザイムRI
I 群1PreS1 (モルモット;高度
免疫血清)(c)群1PreS1
群1PreS1(d)群2P
reS1
群2PreS1(e)アウスザイムRII(ポリクロ
ーナル) 群1+群2PreS1(f)モノクローナ
ルアウスザイムR(Sタン 群1および/または群2
パク質に対するモノクローナル抗体) Pr
eS1
【0022】PreS2抗原アッセイもまた、群
1、2、および/または3モノクローナル抗体PreS
2を組み合わせてまたは単独でアウスザイムRIIまた
はモノクローナルアウスザイムRビーズとともに、また
は固相に結合したPreS2モノクローナル抗体ととも
に用いて開発した。
1、2、および/または3モノクローナル抗体PreS
2を組み合わせてまたは単独でアウスザイムRIIまた
はモノクローナルアウスザイムRビーズとともに、また
は固相に結合したPreS2モノクローナル抗体ととも
に用いて開発した。
【0023】有用な固相としては、アウスザイムRアッ
セイに使用するようなポリスチレンビーズなどのプラス
チックビーズ;プラスチックマイクロタイタープレート
ウエル、および中空繊維およびシートなどの他のプラス
チック細胞培養基体;紙、フェルトまたは合成繊維から
製造したような織物の繊維状固相または不織繊維状固相
、ラテックス微細粒子、シリカなどの多孔性セラミック
ビーズ、アルミナ、ZrO2ビーズなどが挙げられる。 捕捉抗体は、これら基体上または基体中に物理的に吸収
させることもできるし、または当該技術分野で知られた
共有結合法により結合させることもできる。
セイに使用するようなポリスチレンビーズなどのプラス
チックビーズ;プラスチックマイクロタイタープレート
ウエル、および中空繊維およびシートなどの他のプラス
チック細胞培養基体;紙、フェルトまたは合成繊維から
製造したような織物の繊維状固相または不織繊維状固相
、ラテックス微細粒子、シリカなどの多孔性セラミック
ビーズ、アルミナ、ZrO2ビーズなどが挙げられる。 捕捉抗体は、これら基体上または基体中に物理的に吸収
させることもできるし、または当該技術分野で知られた
共有結合法により結合させることもできる。
【0024】検出モノクローナル抗体は、当該技術分野
で知られた幾つかの方法のいずれによって標識してもよ
い。ファトヌー(Feteanu)らの「ラベルド・ア
ンタイボディーズ・イン・バイオロジー・アンド・メデ
ィスン(Labeled Antibodies in
Biologyand Medicine)、214
〜309頁(マックグローヒル、ニューヨーク)(19
78)」には広範囲の標識法が開示されている。種々の
金属放射性同位元素は、ハントウイッチ(D.J.Hn
atowich)ら[Science、220、613
(1983)];ワグナー(Wagner)ら[J.N
ucl.Med.,20、428(1979)];サン
ドバーグ(Sundberg)ら[J.Med.Che
m.,17、1304(1974)];およびサハ(S
aha)[J.Nucl.Med.,6、542(19
76)]らの方法に従って導入することができる。
で知られた幾つかの方法のいずれによって標識してもよ
い。ファトヌー(Feteanu)らの「ラベルド・ア
ンタイボディーズ・イン・バイオロジー・アンド・メデ
ィスン(Labeled Antibodies in
Biologyand Medicine)、214
〜309頁(マックグローヒル、ニューヨーク)(19
78)」には広範囲の標識法が開示されている。種々の
金属放射性同位元素は、ハントウイッチ(D.J.Hn
atowich)ら[Science、220、613
(1983)];ワグナー(Wagner)ら[J.N
ucl.Med.,20、428(1979)];サン
ドバーグ(Sundberg)ら[J.Med.Che
m.,17、1304(1974)];およびサハ(S
aha)[J.Nucl.Med.,6、542(19
76)]らの方法に従って導入することができる。
【0025】使用した放射性同位元素のうち、X線エミ
ッター、ガンマ線エミッター、陽電子エミッター、およ
び蛍光エミッターが抗体の検出には適している。抗体を
標識するのに好ましい放射性同位元素としては、ヨウ素
125、131または123、インジウム111、ルテ
ニウム97、銅67、およびテクネチウム99が挙げら
れる。ハロゲンは、多かれ少なかれ交換して使用するこ
とができる。
ッター、ガンマ線エミッター、陽電子エミッター、およ
び蛍光エミッターが抗体の検出には適している。抗体を
標識するのに好ましい放射性同位元素としては、ヨウ素
125、131または123、インジウム111、ルテ
ニウム97、銅67、およびテクネチウム99が挙げら
れる。ハロゲンは、多かれ少なかれ交換して使用するこ
とができる。
【0026】好ましい標識法の一つには、酸化的方法を
用いてヨウ素−131(I−131)かまたはヨウ素−
125(I−125)のいずれかで標識することが含ま
れ、その際、たとえばグリーンウッド(Greenwo
od)ら[Biochem.J.,89、114(19
63)]により報告されマッコナヘイ(McConah
ay)ら[Int.Arch.Allergy App
ln.Immunol.,29、185(1969)]
によって変更されているように、放射能ヨウ化カリウム
またはヨウ化ナトリウムと抗体の混合物をクロラミン−
T(N−クロロ−p−トルエンスルホンアミドナトリウ
ム塩)で処理する。
用いてヨウ素−131(I−131)かまたはヨウ素−
125(I−125)のいずれかで標識することが含ま
れ、その際、たとえばグリーンウッド(Greenwo
od)ら[Biochem.J.,89、114(19
63)]により報告されマッコナヘイ(McConah
ay)ら[Int.Arch.Allergy App
ln.Immunol.,29、185(1969)]
によって変更されているように、放射能ヨウ化カリウム
またはヨウ化ナトリウムと抗体の混合物をクロラミン−
T(N−クロロ−p−トルエンスルホンアミドナトリウ
ム塩)で処理する。
【0027】一般に、免疫特異性を損なうことなく、で
きるだけ高比率の標識を抗体分子中に導入するのが望ま
しい。各標識抗体に対して、標識抗体−抗原結合の減少
の程度を標準的な競合細胞結合アッセイにより確立する
ことができる。125−Iまたは131−Iを標識とし
て使用した場合に、抗体の最初の結合活性のうち少なく
とも約30%が保存されているのが好ましい。
きるだけ高比率の標識を抗体分子中に導入するのが望ま
しい。各標識抗体に対して、標識抗体−抗原結合の減少
の程度を標準的な競合細胞結合アッセイにより確立する
ことができる。125−Iまたは131−Iを標識とし
て使用した場合に、抗体の最初の結合活性のうち少なく
とも約30%が保存されているのが好ましい。
【0028】本発明の検出モノクローナル抗体は、酵素
を直接共有結合させることによるか、またはビオチン化
酵素とアビジン化酵素との間の反応などの結合反応を使
用することにより、酵素標識することができる(ヨーロ
ッパ特許出願第291,180号明細書(1988年1
1月11日出願)参照)。有用な酵素標識としては西洋
ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシ
ダーゼなどが挙げられる。
を直接共有結合させることによるか、またはビオチン化
酵素とアビジン化酵素との間の反応などの結合反応を使
用することにより、酵素標識することができる(ヨーロ
ッパ特許出願第291,180号明細書(1988年1
1月11日出願)参照)。有用な酵素標識としては西洋
ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシ
ダーゼなどが挙げられる。
【0029】本発明のモノクローナル抗体はまた目的(
MまたはL)タンパク質の固相への結合を妨害しないの
で、本発明のアッセイはまた1工程で行うことができる
。1工程アッセイにおいては、試料、捕捉抗体を含む固
相および検出モノクローナル抗体を適当な液相中で一緒
に混合する。ついで、固相に結合した標識の量を上記の
ようにして検出する。
MまたはL)タンパク質の固相への結合を妨害しないの
で、本発明のアッセイはまた1工程で行うことができる
。1工程アッセイにおいては、試料、捕捉抗体を含む固
相および検出モノクローナル抗体を適当な液相中で一緒
に混合する。ついで、固相に結合した標識の量を上記の
ようにして検出する。
【0030】さらに詳しく説明すると、一つの好ましい
2工程アッセイでは、捕捉抗体としてアウスザイムRI
Iビーズを、検出抗体として群1または群1/群2混合
物のHRP−結合または125I−PreS2モノクロ
ーナル抗体を用いる。このPreS2アッセイの感度は
非常に高かった。すなわち、約1ng PreS2タン
パク質/ml全hpHBsAg、または約0.15ng
PreS2/ml Mタンパク質を検出することがで
きる。このアッセイはまた、実験的に80,000倍過
剰に加えたSタンパク質の存在下でもPreS2タンパ
ク質を検出することができるほどにPreS2に特異的
であった。
2工程アッセイでは、捕捉抗体としてアウスザイムRI
Iビーズを、検出抗体として群1または群1/群2混合
物のHRP−結合または125I−PreS2モノクロ
ーナル抗体を用いる。このPreS2アッセイの感度は
非常に高かった。すなわち、約1ng PreS2タン
パク質/ml全hpHBsAg、または約0.15ng
PreS2/ml Mタンパク質を検出することがで
きる。このアッセイはまた、実験的に80,000倍過
剰に加えたSタンパク質の存在下でもPreS2タンパ
ク質を検出することができるほどにPreS2に特異的
であった。
【0031】PreS1含有Lタンパク質は、捕捉抗体
として(a)モノクローナルアウスザイムRビーズまた
は(b)アウスザイムRIIビーズを、検出モノクロー
ナル抗体として(a)HRP−標識群1PreS1モノ
クローナル抗体、(b)HRP標識または125I標識
PreS1群2モノクローナル抗体、または(c)12
5I標識群1および群2PreS1モノクローナル抗体
を用い、添加したSタンパク質により有意に妨害される
ことなく≦1ng/ml試料にて検出することができる
。PreS1モノクローナル抗体をコーティングしたビ
ーズを使用することにより、添加したSタンパク質によ
るアッセイ妨害を除くことができる。感染個体の血液中
のPreS抗原の出現および/または消失は該疾患の経
過および予後と関係することが報告されており、上記ア
ッセイはHBVの管理において臨床的有用性を有するこ
とがわかる。たとえば、これらタンパク質「マーカー」
の存在または不存在のみを示すアッセイは本発明の定量
アッセイほど有用ではない。
として(a)モノクローナルアウスザイムRビーズまた
は(b)アウスザイムRIIビーズを、検出モノクロー
ナル抗体として(a)HRP−標識群1PreS1モノ
クローナル抗体、(b)HRP標識または125I標識
PreS1群2モノクローナル抗体、または(c)12
5I標識群1および群2PreS1モノクローナル抗体
を用い、添加したSタンパク質により有意に妨害される
ことなく≦1ng/ml試料にて検出することができる
。PreS1モノクローナル抗体をコーティングしたビ
ーズを使用することにより、添加したSタンパク質によ
るアッセイ妨害を除くことができる。感染個体の血液中
のPreS抗原の出現および/または消失は該疾患の経
過および予後と関係することが報告されており、上記ア
ッセイはHBVの管理において臨床的有用性を有するこ
とがわかる。たとえば、これらタンパク質「マーカー」
の存在または不存在のみを示すアッセイは本発明の定量
アッセイほど有用ではない。
【0032】2.抗体アッセイ
本発明のモノクローナル抗体は、HBV上のPreS1
領域およびPreS2領域に対するヒト抗体応答を検出
するための競合イムノアッセイにおいて検出抗体として
用いることができる。好ましい捕捉抗原は、還元剤(ジ
スルフィド結合を開裂)およびヨードアセトアミド(ジ
スルフィド結合の再生成を防ぐため)で処理してS領域
を変性させたヒト血漿由来表面抗原(S+M+Lタンパ
ク質からなる)である。この変性捕捉抗原を固相上への
吸着により固定化させる。ついで、この固定化捕捉抗原
を、(a)前以て選択した量のヒト血清または血漿(H
BV感染のために内在性のHBV抗原を含む)および(
b)前以て選択した量の本発明の標識PreS1または
PreS2モノクローナル抗体と混合する。
領域およびPreS2領域に対するヒト抗体応答を検出
するための競合イムノアッセイにおいて検出抗体として
用いることができる。好ましい捕捉抗原は、還元剤(ジ
スルフィド結合を開裂)およびヨードアセトアミド(ジ
スルフィド結合の再生成を防ぐため)で処理してS領域
を変性させたヒト血漿由来表面抗原(S+M+Lタンパ
ク質からなる)である。この変性捕捉抗原を固相上への
吸着により固定化させる。ついで、この固定化捕捉抗原
を、(a)前以て選択した量のヒト血清または血漿(H
BV感染のために内在性のHBV抗原を含む)および(
b)前以て選択した量の本発明の標識PreS1または
PreS2モノクローナル抗体と混合する。
【0033】固相を洗浄して未結合物質を除き、結合標
識の量を測定する。結合した標識モノクローナル抗体の
量は、結合した抗HBV抗体の量に反比例する。このア
ッセイにより、疾患経過の間の抗HBV抗体の濃度を測
定する方法、またはHBVワクチンの接種者における抗
体産生をモニターする方法が得られる。このアッセイは
また、HBIG調製物中またはワクチン接種者における
内在性または外来性の抗PreS1および抗PreS2
抗体を測定するためにも用いることができる。捕捉抗原
により結合された抗体はまた、検出抗原として本発明の
標識PreS抗原を用いることにより測定することがで
きる。
識の量を測定する。結合した標識モノクローナル抗体の
量は、結合した抗HBV抗体の量に反比例する。このア
ッセイにより、疾患経過の間の抗HBV抗体の濃度を測
定する方法、またはHBVワクチンの接種者における抗
体産生をモニターする方法が得られる。このアッセイは
また、HBIG調製物中またはワクチン接種者における
内在性または外来性の抗PreS1および抗PreS2
抗体を測定するためにも用いることができる。捕捉抗原
により結合された抗体はまた、検出抗原として本発明の
標識PreS抗原を用いることにより測定することがで
きる。
【0034】競合サンドイッチアッセイにおいて捕捉抗
原として有用な他の抗原としては、PreSタンパク質
を含む融合タンパク質上の非PreSエピトープに結合
する哺乳動物ポリクローナル抗体が挙げられる。そのよ
うな非PreSエピトープは、たとえばCKS(3’−
CMP−KDOシンセターゼ)上に認められている。C
KSに対するポリクローナル抗体を固定化し、血清陽性
の血清または血漿および前以て選択した量の(a)CK
S酵素の少なくとも一部およびPreS抗原を含む融合
タンパク質および(b)標識PreSモノクローナル抗
体と混合する。固定化抗体は、CKS酵素の一部および
PreSタンパク質を含む組換え抗原融合タンパク質の
CKS領域に結合する。
原として有用な他の抗原としては、PreSタンパク質
を含む融合タンパク質上の非PreSエピトープに結合
する哺乳動物ポリクローナル抗体が挙げられる。そのよ
うな非PreSエピトープは、たとえばCKS(3’−
CMP−KDOシンセターゼ)上に認められている。C
KSに対するポリクローナル抗体を固定化し、血清陽性
の血清または血漿および前以て選択した量の(a)CK
S酵素の少なくとも一部およびPreS抗原を含む融合
タンパク質および(b)標識PreSモノクローナル抗
体と混合する。固定化抗体は、CKS酵素の一部および
PreSタンパク質を含む組換え抗原融合タンパク質の
CKS領域に結合する。
【0035】上記融合タンパク質のPreS領域は、内
在性の抗PreS抗体および添加した本発明の標識Pr
eSモノクローナル抗体により競合的に結合される結合
部位を提供する。それゆえ、検出した結合標識によるシ
グナルの強度は、試料中に存在する抗PreS抗体の量
に反比例する。上記PreS1およびPreS2アッセ
イの場合と同様に、血清および検出モノクローナル抗体
を順番に捕捉抗原に加えることもできるし、または捕捉
抗原と1工程で混合することもできる。
在性の抗PreS抗体および添加した本発明の標識Pr
eSモノクローナル抗体により競合的に結合される結合
部位を提供する。それゆえ、検出した結合標識によるシ
グナルの強度は、試料中に存在する抗PreS抗体の量
に反比例する。上記PreS1およびPreS2アッセ
イの場合と同様に、血清および検出モノクローナル抗体
を順番に捕捉抗原に加えることもできるし、または捕捉
抗原と1工程で混合することもできる。
【0036】HBsAgのサブタイプの決定 本発明
はまた、ヒト血液の血清や血漿などの生理学的流体中に
存在するHBVの特定のサブタイプを決定するための方
法を提供する。この方法を行うため、まず既知のサブタ
イプのHBVを含有する試料を、固体支持体に結合させ
たモノクローナルまたはポリクローナル抗S抗体の試料
と接触させる。S含有タンパク質の結合により、Lタン
パク質およびMタンパク質中におけるように、PreS
1タンパク質およびPreS2タンパク質もまた捕捉さ
れる。ついで、結合したタンパク質のサブタイプパネル
の成員を2つの部分に分け、同じまたは異なる群からの
PreS1またはPreS2モノクローナル抗体(検出
可能な標識を含む)のペアと順番に反応させる。場合に
より、試料の複数の希釈液を各モノクローナル抗体と反
応させる。ついで、結合した標識の量を定量する。
はまた、ヒト血液の血清や血漿などの生理学的流体中に
存在するHBVの特定のサブタイプを決定するための方
法を提供する。この方法を行うため、まず既知のサブタ
イプのHBVを含有する試料を、固体支持体に結合させ
たモノクローナルまたはポリクローナル抗S抗体の試料
と接触させる。S含有タンパク質の結合により、Lタン
パク質およびMタンパク質中におけるように、PreS
1タンパク質およびPreS2タンパク質もまた捕捉さ
れる。ついで、結合したタンパク質のサブタイプパネル
の成員を2つの部分に分け、同じまたは異なる群からの
PreS1またはPreS2モノクローナル抗体(検出
可能な標識を含む)のペアと順番に反応させる。場合に
より、試料の複数の希釈液を各モノクローナル抗体と反
応させる。ついで、結合した標識の量を定量する。
【0037】選択したモノクローナル抗体のペアに対し
て、既知のサブタイプの一連の試料中の結合標識の相対
量は、特定のサブタイプに特有のパターンを与える。a
yおよびadサブタイプは一対の既知抗Sモノクローナ
ル抗体を用いて容易に同定することができるので、既知
のayまたはad HBsAg試料をPreS1または
PreS2モノクローナル抗体のペアで「スキャニング
」することによりタイプ決定を有効に完了することがで
きる。たとえば、ayw1サブタイプのHBsAgと反
応させた後に得られる2つのPreS2、群1モノクロ
ーナル抗体である50−80−194および116−8
3−406における標識比(たとえば、毎分放射能)は
、他のいかなるHBVサブタイプについて測定したもの
より50倍大きい。平均(1とする)よりも比が約5〜
7増加または減少すれば、サブタイプを識別するのに用
いることができる。
て、既知のサブタイプの一連の試料中の結合標識の相対
量は、特定のサブタイプに特有のパターンを与える。a
yおよびadサブタイプは一対の既知抗Sモノクローナ
ル抗体を用いて容易に同定することができるので、既知
のayまたはad HBsAg試料をPreS1または
PreS2モノクローナル抗体のペアで「スキャニング
」することによりタイプ決定を有効に完了することがで
きる。たとえば、ayw1サブタイプのHBsAgと反
応させた後に得られる2つのPreS2、群1モノクロ
ーナル抗体である50−80−194および116−8
3−406における標識比(たとえば、毎分放射能)は
、他のいかなるHBVサブタイプについて測定したもの
より50倍大きい。平均(1とする)よりも比が約5〜
7増加または減少すれば、サブタイプを識別するのに用
いることができる。
【0038】さらに、所定量のB型肝炎ウイルス表面抗
原に結合することのできる本発明のモノクローナル抗体
の量の相対的な差異により、HBVを含有する生理学的
試料のサブタイプの直接的な決定法が得られる。たとえ
ば、まず血漿や血清などの試料の第一の部分を、固体支
持体に結合させたHBVに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体と接触させることにより、試料
中のB型肝炎ウイルス表面抗原を固定化するのが好まし
い。ついて、該試料の第一部分を、HBV PreS1
タンパク質またはHBV PreS2タンパク質に結合
する第一のモノクローナル抗体(該モノクローナル抗体
は検出可能な標識または検出可能な標識に対する結合部
位を有する)と反応させる。抗PreS1または抗Pr
eS2モノクローナル抗体の選択は、結合量が少なくと
も1種の、好ましくは1種以外のすべてのHBVサブタ
イプが存在しないことを示すように行う。必要なら、こ
れらの工程を繰り返して、固定化HBV表面抗原の第二
の試料に結合した異なるサブクラスのPreSモノクロ
ーナル抗体の量を決定することにより、別のサブタイプ
を考慮外に置くことができる。所定数の工程(好ましく
は1〜3工程)の後に決定される結合した標識モノクロ
ーナル抗体の相対量により、どのHBVサブタイプが存
在するかが示されるのが好ましい。上記のように、知ら
れたモノクローナル抗体を用いて試料をまずayまたは
adとして同定するのが好ましいが、必ずしもそうでな
くてもよい。
原に結合することのできる本発明のモノクローナル抗体
の量の相対的な差異により、HBVを含有する生理学的
試料のサブタイプの直接的な決定法が得られる。たとえ
ば、まず血漿や血清などの試料の第一の部分を、固体支
持体に結合させたHBVに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体と接触させることにより、試料
中のB型肝炎ウイルス表面抗原を固定化するのが好まし
い。ついて、該試料の第一部分を、HBV PreS1
タンパク質またはHBV PreS2タンパク質に結合
する第一のモノクローナル抗体(該モノクローナル抗体
は検出可能な標識または検出可能な標識に対する結合部
位を有する)と反応させる。抗PreS1または抗Pr
eS2モノクローナル抗体の選択は、結合量が少なくと
も1種の、好ましくは1種以外のすべてのHBVサブタ
イプが存在しないことを示すように行う。必要なら、こ
れらの工程を繰り返して、固定化HBV表面抗原の第二
の試料に結合した異なるサブクラスのPreSモノクロ
ーナル抗体の量を決定することにより、別のサブタイプ
を考慮外に置くことができる。所定数の工程(好ましく
は1〜3工程)の後に決定される結合した標識モノクロ
ーナル抗体の相対量により、どのHBVサブタイプが存
在するかが示されるのが好ましい。上記のように、知ら
れたモノクローナル抗体を用いて試料をまずayまたは
adとして同定するのが好ましいが、必ずしもそうでな
くてもよい。
【0039】さらに、陽性コントロールとしての固定化
HBsAgの領域および陰性コントロールとしての無関
係モノクローナル抗体に加えて、たとえば固体表面(ポ
リマー膜など)上の区別される領域上にスポットするこ
とにより1種または2種以上のPreS1および/また
はPreS2モノクローナル抗体を固定化することがで
きる。ついて、等量の試料を各捕捉モノクローナル抗体
に適用するかまたは捕捉モノクローナル抗体を含む表面
を試料(希釈したものまたは正味のもの)で洗浄するこ
とにより、HBVを含有する等量の試料にPreS2ま
たはPreS1「捕捉」モノクローナル抗体の各領域を
暴露させる。
HBsAgの領域および陰性コントロールとしての無関
係モノクローナル抗体に加えて、たとえば固体表面(ポ
リマー膜など)上の区別される領域上にスポットするこ
とにより1種または2種以上のPreS1および/また
はPreS2モノクローナル抗体を固定化することがで
きる。ついて、等量の試料を各捕捉モノクローナル抗体
に適用するかまたは捕捉モノクローナル抗体を含む表面
を試料(希釈したものまたは正味のもの)で洗浄するこ
とにより、HBVを含有する等量の試料にPreS2ま
たはPreS1「捕捉」モノクローナル抗体の各領域を
暴露させる。
【0040】ついて、各捕捉モノクローナル抗体に結合
した2量体複合体をHBVの普遍的な「a」抗原決定基
に対して反応性のモノクローナルまたはポリクローナル
抗体(検出可能な標識または検出可能な標識に対する結
合部位を有する)と反応させて3量体複合体を生成させ
ることにより、該結合HBsAgを検出する。ついて、
各領域に結合した検出抗体の量を測定する。結合した検
出抗体の絶対量(単一領域の捕捉モノクローナル抗体の
場合)または相対量(複数の領域の捕捉モノクローナル
抗体の場合)により、試料中に存在するHBVの部分的
または完全なサブタイプ決定が示される。可視または他
の手段により測定された結合検出モノクローナル抗体の
パターンが試料中のHBVの完全なサブタイプ決定を示
すことができるように、単一の表面上に複数の捕捉モノ
クローナル抗体の領域を極めて近接して使用するのが好
ましい。
した2量体複合体をHBVの普遍的な「a」抗原決定基
に対して反応性のモノクローナルまたはポリクローナル
抗体(検出可能な標識または検出可能な標識に対する結
合部位を有する)と反応させて3量体複合体を生成させ
ることにより、該結合HBsAgを検出する。ついて、
各領域に結合した検出抗体の量を測定する。結合した検
出抗体の絶対量(単一領域の捕捉モノクローナル抗体の
場合)または相対量(複数の領域の捕捉モノクローナル
抗体の場合)により、試料中に存在するHBVの部分的
または完全なサブタイプ決定が示される。可視または他
の手段により測定された結合検出モノクローナル抗体の
パターンが試料中のHBVの完全なサブタイプ決定を示
すことができるように、単一の表面上に複数の捕捉モノ
クローナル抗体の領域を極めて近接して使用するのが好
ましい。
【0041】上記のことは、PreS1またはPreS
2タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を
HBVのサブタイプ決定に初めて使用したことを示す。 一層多数の個体の血漿または血清試料との本発明のモノ
クローナル抗体の反応から観察されるパターンは、S特
異的モノクローナル抗体の場合にクールース(Cour
ouce)ら[Develop.Biol.Stand
ard、54、527(1982)]およびウオンズ(
J.R.Wands)ら[PNAS USA、81、2
737(1984)]によって報告されているように、
本発明のモノクローナル抗体をサブタイプ決定試薬とし
て用いて問題解決手段となり得ることを示している。
2タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を
HBVのサブタイプ決定に初めて使用したことを示す。 一層多数の個体の血漿または血清試料との本発明のモノ
クローナル抗体の反応から観察されるパターンは、S特
異的モノクローナル抗体の場合にクールース(Cour
ouce)ら[Develop.Biol.Stand
ard、54、527(1982)]およびウオンズ(
J.R.Wands)ら[PNAS USA、81、2
737(1984)]によって報告されているように、
本発明のモノクローナル抗体をサブタイプ決定試薬とし
て用いて問題解決手段となり得ることを示している。
【0042】たとえば、図2に示すように、結合HBV
表面抗原とPreS2群3モノクローナル抗体との反応
性により、ayw4として、または(1)ayw2、a
yw3、adrおよびayrまたは(2)adw2、a
dw4およびayw1の2つのグループのサブタイプ群
のいずれか一つとしてHBVのサブタイプを決定するこ
とができる。さらに、結合HBV表面抗原の第二の試料
をPreS2群1aモノクローナル抗体(たとえば、5
0−80−194など)と反応させることにより、ad
w4として、またはそれぞれ2種のサブタイプからなる
3つのグループのいずれかの一つとしてHBVのサブタ
イプを決定することができる。結合HBV表面抗原の第
三の試料を調製し、第三のモノクローナル抗体(第一の
2つの試料の反応性に基づいて選択したもの)と反応さ
せることができる(図2参照)。
表面抗原とPreS2群3モノクローナル抗体との反応
性により、ayw4として、または(1)ayw2、a
yw3、adrおよびayrまたは(2)adw2、a
dw4およびayw1の2つのグループのサブタイプ群
のいずれか一つとしてHBVのサブタイプを決定するこ
とができる。さらに、結合HBV表面抗原の第二の試料
をPreS2群1aモノクローナル抗体(たとえば、5
0−80−194など)と反応させることにより、ad
w4として、またはそれぞれ2種のサブタイプからなる
3つのグループのいずれかの一つとしてHBVのサブタ
イプを決定することができる。結合HBV表面抗原の第
三の試料を調製し、第三のモノクローナル抗体(第一の
2つの試料の反応性に基づいて選択したもの)と反応さ
せることができる(図2参照)。
【0043】本発明のモノクローナル抗体は、水平伝播
中のHBV株の抗原性特性、および抗Sモノクローナル
抗体に基づくサブタイプ決定法では見逃される種々の集
団群における異質性を一層完全に分析するのに有用であ
る。このことは、Sタンパク質の抗原性領域が比較的小
さい点を考慮に入れると特に真実である。
中のHBV株の抗原性特性、および抗Sモノクローナル
抗体に基づくサブタイプ決定法では見逃される種々の集
団群における異質性を一層完全に分析するのに有用であ
る。このことは、Sタンパク質の抗原性領域が比較的小
さい点を考慮に入れると特に真実である。
【0044】ワクチンおよびモノクローナル抗体治療
本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピ
トープの少なくとも幾つかは、これらエピトープに対す
るマウスモノクローナル抗体と競合する内在性抗体を血
清陽性個体で検出し得るという意味で免疫学的優性であ
る。これらエピトープには、表1に示したPreS2、
群2Asn123エピトープが含まれる。それゆえ、本
発明のモノクローナル抗体は、サブユニットHBVワク
チンの有用な成分であるPreS1およびPreS2上
のエピトープを検出し、特徴付け、単離するのに用いる
ことができる。これらワクチンはまた、ヒトにおいてP
reS1および/またはPreS2抗体の力価を増加さ
せるのにも有用であり、HBIG(これら抗体に富む)
の調製源となる。
本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピ
トープの少なくとも幾つかは、これらエピトープに対す
るマウスモノクローナル抗体と競合する内在性抗体を血
清陽性個体で検出し得るという意味で免疫学的優性であ
る。これらエピトープには、表1に示したPreS2、
群2Asn123エピトープが含まれる。それゆえ、本
発明のモノクローナル抗体は、サブユニットHBVワク
チンの有用な成分であるPreS1およびPreS2上
のエピトープを検出し、特徴付け、単離するのに用いる
ことができる。これらワクチンはまた、ヒトにおいてP
reS1および/またはPreS2抗体の力価を増加さ
せるのにも有用であり、HBIG(これら抗体に富む)
の調製源となる。
【0045】本発明はまた、HBVに暴露しているかも
しれないまたはHBVに暴露している患者に、1種また
は2種以上の本発明の抗体を含む単位製剤を投与するこ
とによりHBVに対する血漿免疫原性を産生させる方法
にも関する。それゆえ、本発明の抗体は、疾患の臨床的
進行を遅延させることにより感染患者および/または病
気に罹った患者の予後を改善する予防剤としてか、また
はおそらく、ウイルスの毒性を除去する作用を有する治
療剤として治療学的効能を有するであろうと思われる。 本発明の抗体はまた、B型肝炎免疫グロブリン(HBI
G)の価値ある補助となり得る。PreS1および/ま
たはPreS2モノクローナル抗体を補足したHBIG
治療は、HBV感染個体での肝臓移植後の肝臓再感染を
予防するのに有用である。
しれないまたはHBVに暴露している患者に、1種また
は2種以上の本発明の抗体を含む単位製剤を投与するこ
とによりHBVに対する血漿免疫原性を産生させる方法
にも関する。それゆえ、本発明の抗体は、疾患の臨床的
進行を遅延させることにより感染患者および/または病
気に罹った患者の予後を改善する予防剤としてか、また
はおそらく、ウイルスの毒性を除去する作用を有する治
療剤として治療学的効能を有するであろうと思われる。 本発明の抗体はまた、B型肝炎免疫グロブリン(HBI
G)の価値ある補助となり得る。PreS1および/ま
たはPreS2モノクローナル抗体を補足したHBIG
治療は、HBV感染個体での肝臓移植後の肝臓再感染を
予防するのに有用である。
【0046】単離したモノクローナル抗体は、生物学的
活性についてアッセイしたりインビボで単位剤形として
投与する前に水性IV流体などの薬理学的に許容し得る
液体担体で希釈するのが好ましい[レミングトン(Re
mington)のPharmaceutical S
ciences、オソル(A.Osol)ら編、マック
(Mack Pub.Co.,)、イーストン、PA(
16版、1980)、1488〜1496頁;該文献を
参照のため本明細書に引用する]。得られた溶液を、た
とえば濾過により滅菌する。IgG調製物に一般に用い
られる保存剤、たとえばマルトース、グリシンまたはチ
メロサールなどを薬理学的に許容し得る量で用いること
ができる。
活性についてアッセイしたりインビボで単位剤形として
投与する前に水性IV流体などの薬理学的に許容し得る
液体担体で希釈するのが好ましい[レミングトン(Re
mington)のPharmaceutical S
ciences、オソル(A.Osol)ら編、マック
(Mack Pub.Co.,)、イーストン、PA(
16版、1980)、1488〜1496頁;該文献を
参照のため本明細書に引用する]。得られた溶液を、た
とえば濾過により滅菌する。IgG調製物に一般に用い
られる保存剤、たとえばマルトース、グリシンまたはチ
メロサールなどを薬理学的に許容し得る量で用いること
ができる。
【0047】得られた溶液は、たとえば静脈内注入や注
射により非経口的に投与するのが好ましい。投与するモ
ノクローナル抗体組成物の量は非常に幅広く変わり、H
BV感染患者の体格および身体条件に依存するであろう
。そのような因子は必然的に経験的なものであり、既知
のHBV段階基準を用いて臨床医により決定され得る。 ある種の臨床場面では、ウイルス粒子が感染標的細胞か
ら放出されるので該ウイルス粒子の感染性を中和するた
めにモノクローナル抗体組成物を複数投与する必要があ
るかもしれない。
射により非経口的に投与するのが好ましい。投与するモ
ノクローナル抗体組成物の量は非常に幅広く変わり、H
BV感染患者の体格および身体条件に依存するであろう
。そのような因子は必然的に経験的なものであり、既知
のHBV段階基準を用いて臨床医により決定され得る。 ある種の臨床場面では、ウイルス粒子が感染標的細胞か
ら放出されるので該ウイルス粒子の感染性を中和するた
めにモノクローナル抗体組成物を複数投与する必要があ
るかもしれない。
【0048】
【実施例】つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではない
。下記実施例において、プロテインA−セファロースC
L−4B、CNBr活性化セファロースCL−4B、セ
ファロースS−300および他のすべてのクロマトグラ
フィーゲルはファルマシア(ピスカタウエイ、NJ)か
ら得た。電気泳動およびウエスタンブロッティング試薬
は、バイオ−ラド(リッチモンド、CA)から得た。西
洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、トヨバ(To
yoba)(ニューヨーク、NY)から得た。Na12
5Iは、アーシャム(アーリントンハイツ、IL)から
得た。9成分HBsAgサブタイプパネルはA−Mクー
ルース(Courouce)[ザ・インターナショナル
・ワークショップ・オブ・HBsAgサブタイプス(t
he International Workshop
of HbsAg Subtypes)、パリ、19
75年4月から]から得た。
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではない
。下記実施例において、プロテインA−セファロースC
L−4B、CNBr活性化セファロースCL−4B、セ
ファロースS−300および他のすべてのクロマトグラ
フィーゲルはファルマシア(ピスカタウエイ、NJ)か
ら得た。電気泳動およびウエスタンブロッティング試薬
は、バイオ−ラド(リッチモンド、CA)から得た。西
洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、トヨバ(To
yoba)(ニューヨーク、NY)から得た。Na12
5Iは、アーシャム(アーリントンハイツ、IL)から
得た。9成分HBsAgサブタイプパネルはA−Mクー
ルース(Courouce)[ザ・インターナショナル
・ワークショップ・オブ・HBsAgサブタイプス(t
he International Workshop
of HbsAg Subtypes)、パリ、19
75年4月から]から得た。
【0049】組換えPreS1(rPreS1)および
組換えPreS2(rPreS2)はオカシンスキー(
G.Okasinski)(アボット・ラボラトリーズ
、シカゴ、IL)から贈呈された。rPreS1は、C
MP−KDOシンセターゼ(CKS)のアミノ末端部分
およびカルボキシ末端含有PreS1残基12〜120
を有する融合タンパク質である。rPreS2は、CK
Sのアミノ末端部分およびカルボキシ末端含有PreS
2残基123〜175を有する融合タンパク質である。 rPreS1およびrPreS2の両方ともHBVサブ
タイプadw2であった。モノクローナル抗体18/1
およびQ19/10は、ガーリッヒ(W.Gerlic
h)から贈呈された[ヘルマンら、J.Virol.,
52、396(1984)参照]。
組換えPreS2(rPreS2)はオカシンスキー(
G.Okasinski)(アボット・ラボラトリーズ
、シカゴ、IL)から贈呈された。rPreS1は、C
MP−KDOシンセターゼ(CKS)のアミノ末端部分
およびカルボキシ末端含有PreS1残基12〜120
を有する融合タンパク質である。rPreS2は、CK
Sのアミノ末端部分およびカルボキシ末端含有PreS
2残基123〜175を有する融合タンパク質である。 rPreS1およびrPreS2の両方ともHBVサブ
タイプadw2であった。モノクローナル抗体18/1
およびQ19/10は、ガーリッヒ(W.Gerlic
h)から贈呈された[ヘルマンら、J.Virol.,
52、396(1984)参照]。
【0050】血清試料をアボット・ラボラトリーズから
供給される市販のRIA−EIA試薬:HBsAgのた
めにモノクローナルアウスザイムRおよびアウスリアR
II;抗HBcのためにコラブ(Corab)R;HB
eAgおよび抗HBeのためにアボットHBeR;およ
びHBV DNAを検出するためにアボットゲノスティ
ックス(Genostics)Rで試験した。
供給される市販のRIA−EIA試薬:HBsAgのた
めにモノクローナルアウスザイムRおよびアウスリアR
II;抗HBcのためにコラブ(Corab)R;HB
eAgおよび抗HBeのためにアボットHBeR;およ
びHBV DNAを検出するためにアボットゲノスティ
ックス(Genostics)Rで試験した。
【0051】デイン粒子中のHBcAgを試験するため
、試料(0.2ml)をモノクローナルアウスザイムR
ビーズとともに40℃で2時間インキュベートした。ビ
ーズを水洗し、ついでトリス緩衝食塩水中の1%ツイー
ン20(200μl)とともに40℃で30分間インキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、HRPに結合したモノ
クローナル抗HBc抗体を含有する溶液とともにインキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、上記基質溶液とともに
インキュベートした。
、試料(0.2ml)をモノクローナルアウスザイムR
ビーズとともに40℃で2時間インキュベートした。ビ
ーズを水洗し、ついでトリス緩衝食塩水中の1%ツイー
ン20(200μl)とともに40℃で30分間インキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、HRPに結合したモノ
クローナル抗HBc抗体を含有する溶液とともにインキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、上記基質溶液とともに
インキュベートした。
【0052】実施例1(PreS1およびPreS2に
対するモノクローナル抗体) A.デイン粒子の調製 高HBsAg力価を有するヒト血漿を2000rpmで
20分間遠心分離にかけて清澄化した。その上澄み液を
SW28ローター中で27,000rpmにて8時間遠
心分離にかけた。得られたペレットを0.01Mトリス
、1mM EDTA、pH7.6(緩衝液A)中に再懸
濁し、この再懸濁液を、2ml 62%ショ糖/緩衝
液Aパッド上に重層しておいた緩衝液A中の10%ショ
糖上に重層した。SW28ローター上で27,000r
pmにて8時間遠心分離にかけた後、フラクションを回
収し、HBcAgについてアッセイした。HBcAgの
ピークのフラクションをプールし、緩衝液A中で1:4
に希釈し、連続15〜62%ショ糖勾配上に重層し、2
7,000rpmで24時間回転させた。フラクション
をプールし、HBsAg、PreS2Ag、PreS1
Ag、およびHBcAgについてアッセイした。
対するモノクローナル抗体) A.デイン粒子の調製 高HBsAg力価を有するヒト血漿を2000rpmで
20分間遠心分離にかけて清澄化した。その上澄み液を
SW28ローター中で27,000rpmにて8時間遠
心分離にかけた。得られたペレットを0.01Mトリス
、1mM EDTA、pH7.6(緩衝液A)中に再懸
濁し、この再懸濁液を、2ml 62%ショ糖/緩衝
液Aパッド上に重層しておいた緩衝液A中の10%ショ
糖上に重層した。SW28ローター上で27,000r
pmにて8時間遠心分離にかけた後、フラクションを回
収し、HBcAgについてアッセイした。HBcAgの
ピークのフラクションをプールし、緩衝液A中で1:4
に希釈し、連続15〜62%ショ糖勾配上に重層し、2
7,000rpmで24時間回転させた。フラクション
をプールし、HBsAg、PreS2Ag、PreS1
Ag、およびHBcAgについてアッセイした。
【0053】B.免疫
8週齢の雌BALB/cマウスに、MP1+TDMアジ
ュバント(#R−700、RIBIイムノケム・リサー
チ)中に乳濁した精製デイン粒子(10μg)で3週間
の間隔をあけて3回免疫した。最後のブースター投与か
ら2週間後に血清試料を採取し、酵素結合イムノアッセ
イ(EIA)およびウエスタンブロッティングにより力
価を評価した。
ュバント(#R−700、RIBIイムノケム・リサー
チ)中に乳濁した精製デイン粒子(10μg)で3週間
の間隔をあけて3回免疫した。最後のブースター投与か
ら2週間後に血清試料を採取し、酵素結合イムノアッセ
イ(EIA)およびウエスタンブロッティングにより力
価を評価した。
【0054】C.抗デイン粒子抗体の検出のためのイム
ノアッセイ 5%β−メルカプトエタノール(BME)、1%SDS
中でデイン粒子を変性し、3分間沸騰させ、PBS中に
2μg/mlに希釈し、室温にて一夜インキュベートし
てマイクロプレートウエル上にコーティングした。ウエ
ルを蒸留水で洗浄し、PBS中の3%BSA(200μ
l)でブロッキングした。プレートを洗浄し、空気乾燥
させた。アッセイにおいて、試料をウエル中、室温にて
2時間インキュベートし、インキュベーションウエルを
洗浄し、HRP結合ヤギ抗マウスIg[#14−18−
09、キルケガール&ペリー・ラボラトリーズ(Kir
kegaard&Perry Laboratorie
s,Inc.)]を加え、1時間インキュベートした。 最後の洗浄の後、OPD基質溶液(アボット・ラボラト
リーズ)(100μl)を各ウエルに加えた。1N硫酸
を加えて発色反応を停止させた。
ノアッセイ 5%β−メルカプトエタノール(BME)、1%SDS
中でデイン粒子を変性し、3分間沸騰させ、PBS中に
2μg/mlに希釈し、室温にて一夜インキュベートし
てマイクロプレートウエル上にコーティングした。ウエ
ルを蒸留水で洗浄し、PBS中の3%BSA(200μ
l)でブロッキングした。プレートを洗浄し、空気乾燥
させた。アッセイにおいて、試料をウエル中、室温にて
2時間インキュベートし、インキュベーションウエルを
洗浄し、HRP結合ヤギ抗マウスIg[#14−18−
09、キルケガール&ペリー・ラボラトリーズ(Kir
kegaard&Perry Laboratorie
s,Inc.)]を加え、1時間インキュベートした。 最後の洗浄の後、OPD基質溶液(アボット・ラボラト
リーズ)(100μl)を各ウエルに加えた。1N硫酸
を加えて発色反応を停止させた。
【0055】D.融合法
応答マウスを2〜4カ月休ませ、ついでリン酸緩衝食塩
水(PBS)中のデイン粒子(10μg)を前融合静脈
内ブースター投与した。3日後、標準的な方法を少し改
変して[コーラー(G.Kohler)ら、Natur
e、256、495(1975)]、脾臓細胞をSP2
/0ミエローマ細胞株と1:1で融合した。この融合ペ
レットを50%PEG(ATCC NW1450)(1
ml)とともに1分間活発に拡散させ、培地(20ml
)中で遠心分離にかけ、細胞をHAT選択IMDM中に
再懸濁し、96ウエル組織培養プレート(#16700
8、NUNC)中にウエル当たり1.5×105リンパ
球にてプレーティングした。ハイブリッド細胞の成育を
促進するため、STMマイトジェン(#R−510、R
IBI)を最初のプレーティング培地中に1〜200倍
希釈にて添加した。マイトジェンは、その後の培地交換
および飼育には使用しなかった。
水(PBS)中のデイン粒子(10μg)を前融合静脈
内ブースター投与した。3日後、標準的な方法を少し改
変して[コーラー(G.Kohler)ら、Natur
e、256、495(1975)]、脾臓細胞をSP2
/0ミエローマ細胞株と1:1で融合した。この融合ペ
レットを50%PEG(ATCC NW1450)(1
ml)とともに1分間活発に拡散させ、培地(20ml
)中で遠心分離にかけ、細胞をHAT選択IMDM中に
再懸濁し、96ウエル組織培養プレート(#16700
8、NUNC)中にウエル当たり1.5×105リンパ
球にてプレーティングした。ハイブリッド細胞の成育を
促進するため、STMマイトジェン(#R−510、R
IBI)を最初のプレーティング培地中に1〜200倍
希釈にて添加した。マイトジェンは、その後の培地交換
および飼育には使用しなかった。
【0056】E.クローンの確立
抗デイン粒子スクリーニングEIAで陽性であったハイ
ブリッド上澄み液をウエスタンブロッティングにより評
価して特異的なバンドパターンを同定した。EIAおよ
びウエスタンブロッティングで陽性であったハイブリッ
ドを限界希釈法によりクローニングした。評価のために
選択したクローンは、プレート当たり約10%の成育を
示したプレートからのものであった。確立したクローン
を上記のようにしてアッセイし、Tフラスコ中で成育さ
せ、1×107細胞/マウスをプリスタンプライミング
したBALB/cマウス[ドミニオン・ラブズ(Dom
inion Labs)]に注射してモノクローナル抗
体を含有する腹水を得た。
ブリッド上澄み液をウエスタンブロッティングにより評
価して特異的なバンドパターンを同定した。EIAおよ
びウエスタンブロッティングで陽性であったハイブリッ
ドを限界希釈法によりクローニングした。評価のために
選択したクローンは、プレート当たり約10%の成育を
示したプレートからのものであった。確立したクローン
を上記のようにしてアッセイし、Tフラスコ中で成育さ
せ、1×107細胞/マウスをプリスタンプライミング
したBALB/cマウス[ドミニオン・ラブズ(Dom
inion Labs)]に注射してモノクローナル抗
体を含有する腹水を得た。
【0057】F.アイソタイプの決定
モノクローナル抗体のアイソタイプの決定は、SBAク
ロノタイピングシステムIIIキット[#5030、サ
ザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ(Sout
hern Biotechnology Associ
ates,Inc.)]にわずかに修正を加えて行った
。EIA96ウエルマイクロプレートに、デイン粒子の
場合に記載したヤギ抗マウスIgG+M(H+L)(キ
ルケガール&ペリー・ラボラトリーズ)の1:1000
倍希釈液(100μl/ウエル)を室温にて一夜コーテ
ィングした。プレートを洗浄し、クローン上澄み液(5
0μl)を適当なウエルに加えて室温にて2時間インキ
ュベートした。プレートを洗浄し、キットアイソタイプ
特異的結合体の1:1000倍希釈液(100μl/ウ
エル)を各試料に加え、30分間インキュベートした。 最後の洗浄後、上記色原体を加えた。
ロノタイピングシステムIIIキット[#5030、サ
ザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ(Sout
hern Biotechnology Associ
ates,Inc.)]にわずかに修正を加えて行った
。EIA96ウエルマイクロプレートに、デイン粒子の
場合に記載したヤギ抗マウスIgG+M(H+L)(キ
ルケガール&ペリー・ラボラトリーズ)の1:1000
倍希釈液(100μl/ウエル)を室温にて一夜コーテ
ィングした。プレートを洗浄し、クローン上澄み液(5
0μl)を適当なウエルに加えて室温にて2時間インキ
ュベートした。プレートを洗浄し、キットアイソタイプ
特異的結合体の1:1000倍希釈液(100μl/ウ
エル)を各試料に加え、30分間インキュベートした。 最後の洗浄後、上記色原体を加えた。
【0058】G.モノクローナル抗体の精製アフィ−ゲ
ルプロテインA MAPS IIキット(バイオ−ラド
)を用い、IgGクローニング株からの抗体をマウス腹
水から精製した。結合緩衝液でカラムを平衡化した後、
腹水を結合緩衝液と1:1の比で混合し、0.2μmフ
ィルターに通し、カラム上に負荷した。試料をカラム上
に負荷した後、10〜15カラム容量の結合緩衝液をカ
ラムに流した。ついで、補給した溶離緩衝液でIgGを
溶離し、pH7.2の中性にし、ついでPBS中に4℃
にて一夜透析した。
ルプロテインA MAPS IIキット(バイオ−ラド
)を用い、IgGクローニング株からの抗体をマウス腹
水から精製した。結合緩衝液でカラムを平衡化した後、
腹水を結合緩衝液と1:1の比で混合し、0.2μmフ
ィルターに通し、カラム上に負荷した。試料をカラム上
に負荷した後、10〜15カラム容量の結合緩衝液をカ
ラムに流した。ついで、補給した溶離緩衝液でIgGを
溶離し、pH7.2の中性にし、ついでPBS中に4℃
にて一夜透析した。
【0059】H.合成ペプチド
ABI固相ペプチド合成機(アプライド・バイオシステ
ムズ)を用い、Met120からPreS2遺伝子下流
およびGly13からPreS1遺伝子下流の翻訳生成
物部分に対応する合成ペプチドを製造した。3つのペプ
チドを構築し、ついで高速液体クロマトグラフィーによ
り精製してPreS2:MQWNSTAFHQTLQD
PRVRGLYLPAGG(120〜145)、TVN
PVLTTASPLSSIFSRIGDPALN(15
0〜174)およびPreS1:GTNLSVPNPL
GFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP
VKDD(13〜51)を得た。上記式中のアミノ酸残
基の略語は、A=アラニン、R=アルギニン、N=アス
パラギン、D=アスパラギン酸、C=システイン、Q=
グルタミン、E=グルタミン酸、G=グリシン、H=ヒ
スチジン、I=イソロイシン、L=ロイシン、K=リジ
ン、F=フェニルアラニン、M=メチオニン、P=プロ
リン、S=セリン、T=スレオニン、W=トリプトファ
ン、Y=チロシン、およびV=バリンである。
ムズ)を用い、Met120からPreS2遺伝子下流
およびGly13からPreS1遺伝子下流の翻訳生成
物部分に対応する合成ペプチドを製造した。3つのペプ
チドを構築し、ついで高速液体クロマトグラフィーによ
り精製してPreS2:MQWNSTAFHQTLQD
PRVRGLYLPAGG(120〜145)、TVN
PVLTTASPLSSIFSRIGDPALN(15
0〜174)およびPreS1:GTNLSVPNPL
GFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP
VKDD(13〜51)を得た。上記式中のアミノ酸残
基の略語は、A=アラニン、R=アルギニン、N=アス
パラギン、D=アスパラギン酸、C=システイン、Q=
グルタミン、E=グルタミン酸、G=グリシン、H=ヒ
スチジン、I=イソロイシン、L=ロイシン、K=リジ
ン、F=フェニルアラニン、M=メチオニン、P=プロ
リン、S=セリン、T=スレオニン、W=トリプトファ
ン、Y=チロシン、およびV=バリンである。
【0060】I.デイン粒子へのモノクローナル抗体結
合のペプチド抑制 PreS1残基13〜51およびPreS2残基120
〜145および150〜174をコードする合成ペプチ
ドを用いて抑制アッセイを行った。変性デイン粒子(2
μg/ml)を含有するPBS溶液を室温にて18時間
インキュベートすることによりマイクロタイターEIA
プレートをコーティングした。EIAプレートにモノク
ローナル抗体を加える前に、モノクローナル抗体(10
μg/ml)を13〜51ペプチド、120〜145ペ
プチドまたは150〜174ペプチドのいずれかのペプ
チド(10μg)とともに20分間プレインキュベート
した。試料(50μl/ウエル)をプレートに加え、2
0分間インキュベートし、洗浄した。HRP結合ヤギ抗
マウスIg(KPL)の1:1000倍希釈液を100
μg/ウエルにて加え、30分間インキュベートし、洗
浄し、o−フェニレンジアミン(OPD)基質で発色反
応を行った。
合のペプチド抑制 PreS1残基13〜51およびPreS2残基120
〜145および150〜174をコードする合成ペプチ
ドを用いて抑制アッセイを行った。変性デイン粒子(2
μg/ml)を含有するPBS溶液を室温にて18時間
インキュベートすることによりマイクロタイターEIA
プレートをコーティングした。EIAプレートにモノク
ローナル抗体を加える前に、モノクローナル抗体(10
μg/ml)を13〜51ペプチド、120〜145ペ
プチドまたは150〜174ペプチドのいずれかのペプ
チド(10μg)とともに20分間プレインキュベート
した。試料(50μl/ウエル)をプレートに加え、2
0分間インキュベートし、洗浄した。HRP結合ヤギ抗
マウスIg(KPL)の1:1000倍希釈液を100
μg/ウエルにて加え、30分間インキュベートし、洗
浄し、o−フェニレンジアミン(OPD)基質で発色反
応を行った。
【0061】J.モノクローナル抗体の親和性バン・ヘ
イニンゲン(V.van Heyningen)のプロ
トコール[Methods in Enzymolog
y、ランゴン(J.J.Langone)ら編、アカデ
ミックプレス(1986)、472f頁]により、モノ
クローナル抗体の親和性を決定した。抗体を低親和性(
K=106〜107)、中程度の親和性(K=107〜
109)および高親和性(K=109〜1012)にラ
ンク付けした。精製培養上澄み液または未精製培養上澄
み液中のモノクローナル抗体の親和性は、変性デイン粒
子に対してモノクローナル抗体の50%最大結合を与え
る希釈率または濃度として決定した。結合抗体を検出す
るのにHRP結合ヤギ抗マウスIgを用いた。
イニンゲン(V.van Heyningen)のプロ
トコール[Methods in Enzymolog
y、ランゴン(J.J.Langone)ら編、アカデ
ミックプレス(1986)、472f頁]により、モノ
クローナル抗体の親和性を決定した。抗体を低親和性(
K=106〜107)、中程度の親和性(K=107〜
109)および高親和性(K=109〜1012)にラ
ンク付けした。精製培養上澄み液または未精製培養上澄
み液中のモノクローナル抗体の親和性は、変性デイン粒
子に対してモノクローナル抗体の50%最大結合を与え
る希釈率または濃度として決定した。結合抗体を検出す
るのにHRP結合ヤギ抗マウスIgを用いた。
【0062】K.ポリアクリルアミドゲル電気泳動/ウ
エスタンブロッティング 12%ランニングゲルおよび4%スタッキングゲルを有
するバイオ−ラドスラブゲル装置を用い、分析ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。ゲルお
よび緩衝液組成は、ラムリ(U.K.Laemlli)
のNature、227、680(1970)に記載の
ものを用いた。試料を一般にトリス緩衝液中の1%SD
S、2.52%BME中で5分間沸騰させた。ウエスタ
ンブロッティングは、本質的にトウビン(H.Towb
in)らのJ.Immunol.Methods、72
、313(1984)の記載に従って行った。ニトロセ
ルロース上に試料を移した後、ニトロセルロースをブロ
ッキング緩衝液(1%ウシヘモグロビン、0.1%v/
vツイーン20、PBS中)中に浸漬した。ニトロセル
ロースをモノクローナル抗体とともにインキュベートし
、ブロッキング緩衝液中、0.5〜1μg/mlにて1
〜2時間試験し、ついでリン酸緩衝食塩水(PBS)で
洗浄し、HRP結合ヤギ抗マウスIgGまたはIgM(
0.5〜1.0μg/ml)とともに1〜2時間インキ
ュベートした。ストリップを洗浄し、ついで4−クロロ
−1−ナフトール/過酸化水素基質で発色させた。
エスタンブロッティング 12%ランニングゲルおよび4%スタッキングゲルを有
するバイオ−ラドスラブゲル装置を用い、分析ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。ゲルお
よび緩衝液組成は、ラムリ(U.K.Laemlli)
のNature、227、680(1970)に記載の
ものを用いた。試料を一般にトリス緩衝液中の1%SD
S、2.52%BME中で5分間沸騰させた。ウエスタ
ンブロッティングは、本質的にトウビン(H.Towb
in)らのJ.Immunol.Methods、72
、313(1984)の記載に従って行った。ニトロセ
ルロース上に試料を移した後、ニトロセルロースをブロ
ッキング緩衝液(1%ウシヘモグロビン、0.1%v/
vツイーン20、PBS中)中に浸漬した。ニトロセル
ロースをモノクローナル抗体とともにインキュベートし
、ブロッキング緩衝液中、0.5〜1μg/mlにて1
〜2時間試験し、ついでリン酸緩衝食塩水(PBS)で
洗浄し、HRP結合ヤギ抗マウスIgGまたはIgM(
0.5〜1.0μg/ml)とともに1〜2時間インキ
ュベートした。ストリップを洗浄し、ついで4−クロロ
−1−ナフトール/過酸化水素基質で発色させた。
【0063】L.放射性ヨウ素化および酵素結合体28
0nmでの吸光度を吸光係数、1.38で除することに
より、モノクローナル抗体タンパク質の濃度をmg/m
lにて決定した。他のタンパク質の濃度は、ウシ血清ア
ルブミンを標準として用いたBCA[ビキンコノン酸(
bichinchononic acid)]法(ピア
ス・ケミカル、ロックフォード、IL)により決定した
。クロラミンT法を用い、精製モノクローナル抗体を比
活性20〜30μCi/μgまで放射性ヨウ素化した[
グリーンウッド(Greenwood)ら、Bioch
em.J.,89、114(1963)]。反応混合物
をセファデックスG−50カラムに通すことにより、遊
離の125Iを結合標識から分離した。ナカネ(P.N
akane)らの方法[J.Histochem Cy
tochem.,22、1084(19874)]を用
い、モノクローナル抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ
(HRP)に結合させた。結合比は、1:1〜1:4(
mg/mg)モノクローナル抗体:HRPの範囲であっ
た。
0nmでの吸光度を吸光係数、1.38で除することに
より、モノクローナル抗体タンパク質の濃度をmg/m
lにて決定した。他のタンパク質の濃度は、ウシ血清ア
ルブミンを標準として用いたBCA[ビキンコノン酸(
bichinchononic acid)]法(ピア
ス・ケミカル、ロックフォード、IL)により決定した
。クロラミンT法を用い、精製モノクローナル抗体を比
活性20〜30μCi/μgまで放射性ヨウ素化した[
グリーンウッド(Greenwood)ら、Bioch
em.J.,89、114(1963)]。反応混合物
をセファデックスG−50カラムに通すことにより、遊
離の125Iを結合標識から分離した。ナカネ(P.N
akane)らの方法[J.Histochem Cy
tochem.,22、1084(19874)]を用
い、モノクローナル抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ
(HRP)に結合させた。結合比は、1:1〜1:4(
mg/mg)モノクローナル抗体:HRPの範囲であっ
た。
【0064】M.デイン粒子への競合結合放射性ヨウ素
化モノクローナル抗体を陰性ヒト血漿中に希釈してトレ
ーサー溶液(0.2μCi/ml)を調製した。競合に
使用するモノクローナル抗体を種々の濃度で含有する陰
性ヒト血漿(100μl)に上記トレーサー溶液(10
0μl)を加えた。デイン粒子を2μg/mlでコーテ
ィングしたポリスチレンビーズを加え、この混合物とと
もに40℃にて2時間または室温にて一夜インキュベー
トした。ビーズを蒸留水で洗浄し、放射能をカウントし
た。
化モノクローナル抗体を陰性ヒト血漿中に希釈してトレ
ーサー溶液(0.2μCi/ml)を調製した。競合に
使用するモノクローナル抗体を種々の濃度で含有する陰
性ヒト血漿(100μl)に上記トレーサー溶液(10
0μl)を加えた。デイン粒子を2μg/mlでコーテ
ィングしたポリスチレンビーズを加え、この混合物とと
もに40℃にて2時間または室温にて一夜インキュベー
トした。ビーズを蒸留水で洗浄し、放射能をカウントし
た。
【0065】N.サンドイッチ抗原イムノアッセイポリ
スチレンビーズ(直径6mm)を20μg/mlの濃度
の捕捉抗体で40℃にて2時間コーティングした。ビー
ズをPBSで濯ぎ、ついで3%BSAを含有するPBS
溶液で40℃にて1時間インキュベートした。ビーズを
3%ショ糖を含有するPBSで濯ぎ、ついで空気乾燥し
た。
スチレンビーズ(直径6mm)を20μg/mlの濃度
の捕捉抗体で40℃にて2時間コーティングした。ビー
ズをPBSで濯ぎ、ついで3%BSAを含有するPBS
溶液で40℃にて1時間インキュベートした。ビーズを
3%ショ糖を含有するPBSで濯ぎ、ついで空気乾燥し
た。
【0066】試料を上記抗体コーティングビーズととも
に20〜25℃にて一夜または40℃にて2時間インキ
ュベートした。水洗後、ビーズを125I標識検出抗体
またはHRP結合検出抗体とともに40℃にて2時間イ
ンキュベートした。ビーズを水洗し、ラジオイムノアッ
セイ(RIA)の場合はガンマカウンターで放射能をカ
ウントし、酵素結合イムノアッセイ(EIA)の場合は
HRP基質溶液(0.02%H2O2を含有する0.1
Mクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.5)中の0.3%
o−フェニレンジアミン−2HCl;0.3ml)とと
もにインキュベートした。酵素反応を室温にて30分間
進行させ、ついで1N H2SO4(1ml)を加えて
反応を停止させた。クオンタムII分光光度計(アボッ
ト・ラボラトリーズ)を用いて492nmにおける吸光
度を測定した。
に20〜25℃にて一夜または40℃にて2時間インキ
ュベートした。水洗後、ビーズを125I標識検出抗体
またはHRP結合検出抗体とともに40℃にて2時間イ
ンキュベートした。ビーズを水洗し、ラジオイムノアッ
セイ(RIA)の場合はガンマカウンターで放射能をカ
ウントし、酵素結合イムノアッセイ(EIA)の場合は
HRP基質溶液(0.02%H2O2を含有する0.1
Mクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.5)中の0.3%
o−フェニレンジアミン−2HCl;0.3ml)とと
もにインキュベートした。酵素反応を室温にて30分間
進行させ、ついで1N H2SO4(1ml)を加えて
反応を停止させた。クオンタムII分光光度計(アボッ
ト・ラボラトリーズ)を用いて492nmにおける吸光
度を測定した。
【0067】O.結果
1.デイン粒子の精製
22nm HBsAg粒子の大部分および他の血漿タン
パク質からヒト血漿中のB型肝炎ビリオンをショ糖勾配
遠心分離により分離した。HBcAg、PreS1Ag
、HBsAg、およびPreS2Agの検出のための特
異的イムノアッセイによりフラクションをモニターした
。S抗原活性およびPreS2抗原活性のピークは22
nm粒子と共沈したが、PreS1抗原およびHBcA
gは42nmデイン粒子に対応する有意に大きな粒子と
して共沈した。これらのデータは、PreS2およびS
ではなくPreS1およびHBcAgが小さな22nm
体からデイン粒子を識別するのに役立つことを示してい
る。上記ヘルマンらによってすでに報告されているよう
に、精製HBsAg粒子に比べてデイン粒子においてL
タンパク質(p39、gp41)が優勢であることがS
DS PAGEにより観察された。
パク質からヒト血漿中のB型肝炎ビリオンをショ糖勾配
遠心分離により分離した。HBcAg、PreS1Ag
、HBsAg、およびPreS2Agの検出のための特
異的イムノアッセイによりフラクションをモニターした
。S抗原活性およびPreS2抗原活性のピークは22
nm粒子と共沈したが、PreS1抗原およびHBcA
gは42nmデイン粒子に対応する有意に大きな粒子と
して共沈した。これらのデータは、PreS2およびS
ではなくPreS1およびHBcAgが小さな22nm
体からデイン粒子を識別するのに役立つことを示してい
る。上記ヘルマンらによってすでに報告されているよう
に、精製HBsAg粒子に比べてデイン粒子においてL
タンパク質(p39、gp41)が優勢であることがS
DS PAGEにより観察された。
【0068】2.免疫
精製デイン粒子(サブタイプad;サブタイプayでも
同様の結果が得られる)を用いてマウスを免疫した。ウ
エスタンブロッティングおよびデイン粒子コーティング
ビーズイムノアッセイでの反応性により、10匹のデイ
ン粒子免疫マウスのうち10匹が検出可能な抗PreS
1および抗PreS2力価を生成した。PreS2合成
ペプチド(120〜145)の接種によっても若干の免
疫応答が引き起こされた。デイン粒子はまた、遊離のペ
プチドとしてかまたはアジュバント中のKLHまたはB
SAに結合させるかして接種した合成PreS2ペプチ
ド(12〜53)に比べてもマウスにおいて有意に良好
な免疫原であることが確認された。
同様の結果が得られる)を用いてマウスを免疫した。ウ
エスタンブロッティングおよびデイン粒子コーティング
ビーズイムノアッセイでの反応性により、10匹のデイ
ン粒子免疫マウスのうち10匹が検出可能な抗PreS
1および抗PreS2力価を生成した。PreS2合成
ペプチド(120〜145)の接種によっても若干の免
疫応答が引き起こされた。デイン粒子はまた、遊離のペ
プチドとしてかまたはアジュバント中のKLHまたはB
SAに結合させるかして接種した合成PreS2ペプチ
ド(12〜53)に比べてもマウスにおいて有意に良好
な免疫原であることが確認された。
【0069】固相にコーティングしたデイン粒子を用い
た固相EIAまたはデイン粒子のウエスタンブロッティ
ングによる反応性により、ハイブリドーマを最初にスク
リーニングした。反応性のハイブリドーマを腹水中で成
育させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィ
ーにより腹水からモノクローナル抗体を精製した。
た固相EIAまたはデイン粒子のウエスタンブロッティ
ングによる反応性により、ハイブリドーマを最初にスク
リーニングした。反応性のハイブリドーマを腹水中で成
育させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィ
ーにより腹水からモノクローナル抗体を精製した。
【0070】3.PreS1モノクローナル抗体モノク
ローナル抗体の特徴付けを、adおよびayサブタイプ
の精製デイン粒子との反応性をウエスタンブロッティン
グし、合成ペプチドおよび組換えPreS1またはPr
eS2タンパク質への結合、および相互の競合研究によ
り行った。相対親和性もまた、上記物質および方法の際
に記載のようにして決定した。これらの結果をモノクロ
ーナル抗体PreS1について表3にまとめて示す。
ローナル抗体の特徴付けを、adおよびayサブタイプ
の精製デイン粒子との反応性をウエスタンブロッティン
グし、合成ペプチドおよび組換えPreS1またはPr
eS2タンパク質への結合、および相互の競合研究によ
り行った。相対親和性もまた、上記物質および方法の際
に記載のようにして決定した。これらの結果をモノクロ
ーナル抗体PreS1について表3にまとめて示す。
【0071】表3(PreS1モノクローナル抗体)
【
表3】
表3】
【0072】PreS1モノクローナル抗体の群分けは
、変性デイン粒子をコーティングしたビーズへの結合に
対してモノクローナル抗体が競合する相互競合イムノア
ッセイにより決定した。これらの研究から、PreS1
モノクローナル抗体は3つの異なる群に分離することが
できた。群1および群2はrPreS1と結合し、また
ウエスタンブロッティングにより、デイン粒子(サブタ
イプadおよびay)のLタンパク質(p39およびg
p42)とも反応する。これらのモノクローナル抗体は
、HBsAgタンパク質S(p24およびgp27)ま
たはMタンパク質(gp33およびgp36)とは反応
しない。群1および群2のモノクローナル抗体は、デイ
ン粒子コーティングビーズへの結合に対して競合しない
。 群1のモノクローナル抗体は合成ペプチド(13〜51
)に特異的に結合するが、群2のモノクローナル抗体は
このペプチドには結合しない。群1のモノクローナル抗
体はまた、既知の抗PreS1モノクローナル抗体18
/7と有効に競合する。欠失マッピング研究により、群
1のモノクローナル抗体は領域27〜35に結合し、群
2のモノクローナル抗体は領域72〜102に結合する
ことが示された。
、変性デイン粒子をコーティングしたビーズへの結合に
対してモノクローナル抗体が競合する相互競合イムノア
ッセイにより決定した。これらの研究から、PreS1
モノクローナル抗体は3つの異なる群に分離することが
できた。群1および群2はrPreS1と結合し、また
ウエスタンブロッティングにより、デイン粒子(サブタ
イプadおよびay)のLタンパク質(p39およびg
p42)とも反応する。これらのモノクローナル抗体は
、HBsAgタンパク質S(p24およびgp27)ま
たはMタンパク質(gp33およびgp36)とは反応
しない。群1および群2のモノクローナル抗体は、デイ
ン粒子コーティングビーズへの結合に対して競合しない
。 群1のモノクローナル抗体は合成ペプチド(13〜51
)に特異的に結合するが、群2のモノクローナル抗体は
このペプチドには結合しない。群1のモノクローナル抗
体はまた、既知の抗PreS1モノクローナル抗体18
/7と有効に競合する。欠失マッピング研究により、群
1のモノクローナル抗体は領域27〜35に結合し、群
2のモノクローナル抗体は領域72〜102に結合する
ことが示された。
【0073】群3の抗PreS1モノクローナル抗体は
、上記2つのモノクローナル抗体とは非常に異なった挙
動を示す。これらモノクローナル抗体は、ウエスタンブ
ロッティングによりadサブタイプに対してのみLタン
パク質と反応したが、ayサブタイプに対しては検出し
得る反応性を示さなかった。群3のモノクローナル抗体
は、競合し得る仕方でデインadコーティングビーズに
結合した。これら抗体はまた、サンドイッチイムノアッ
セイ(アウスザイムIIビーズを45μg/mlまでの
HBsAgと反応させ、ついで125I標識モノクロー
ナル抗体を反応させた)においてもいかなるHBsAg
サブタイプとも反応しなかった。群3のモノクローナル
抗体は、固相イムノアッセイまたはウエスタンブロッテ
ィングのいずれにおいてもrPreS1とは実質的に結
合しなかった。一つの高親和性抗PreS2モノクロー
ナル抗体(50−80−194)は、PreS1モノク
ローナル抗体の3つのすべての群のデイン粒子への結合
を高濃度において部分的に抑制した(21〜34%)。 群3のモノクローナル抗体は、ペプチド13〜51に結
合しない。
、上記2つのモノクローナル抗体とは非常に異なった挙
動を示す。これらモノクローナル抗体は、ウエスタンブ
ロッティングによりadサブタイプに対してのみLタン
パク質と反応したが、ayサブタイプに対しては検出し
得る反応性を示さなかった。群3のモノクローナル抗体
は、競合し得る仕方でデインadコーティングビーズに
結合した。これら抗体はまた、サンドイッチイムノアッ
セイ(アウスザイムIIビーズを45μg/mlまでの
HBsAgと反応させ、ついで125I標識モノクロー
ナル抗体を反応させた)においてもいかなるHBsAg
サブタイプとも反応しなかった。群3のモノクローナル
抗体は、固相イムノアッセイまたはウエスタンブロッテ
ィングのいずれにおいてもrPreS1とは実質的に結
合しなかった。一つの高親和性抗PreS2モノクロー
ナル抗体(50−80−194)は、PreS1モノク
ローナル抗体の3つのすべての群のデイン粒子への結合
を高濃度において部分的に抑制した(21〜34%)。 群3のモノクローナル抗体は、ペプチド13〜51に結
合しない。
【0074】すべての他の抗PreS2モノクローナル
抗体および2つの抗Sモノクローナル抗体(H35およ
びH166)は、PreS1モノクローナル抗体結合の
抑制は低いかまたは無視できるものであった。H35お
よびH166は非競合群特異的「a」抗原決定基に結合
し、ピーターソン(Peterson)らによってJ.
Immunol.,132、920(1984)に記載
されている。観察された部分的な抑制は、立体的な障害
によるものである。H166は群1PreS1モノクロ
ーナル抗体結合を25%抑制したが、群2および3に対
しては10%未満の抑制を示した。
抗体および2つの抗Sモノクローナル抗体(H35およ
びH166)は、PreS1モノクローナル抗体結合の
抑制は低いかまたは無視できるものであった。H35お
よびH166は非競合群特異的「a」抗原決定基に結合
し、ピーターソン(Peterson)らによってJ.
Immunol.,132、920(1984)に記載
されている。観察された部分的な抑制は、立体的な障害
によるものである。H166は群1PreS1モノクロ
ーナル抗体結合を25%抑制したが、群2および3に対
しては10%未満の抑制を示した。
【0075】4.PreS2モノクローナル抗体Pre
S2モノクローナル抗体は、相互競合実験により4つの
群に分けることができた。これらモノクローナル抗体の
反応性のプロフィルを下記表4にまとめて示す。 表4(PreS2モノクローナル抗体)
S2モノクローナル抗体は、相互競合実験により4つの
群に分けることができた。これらモノクローナル抗体の
反応性のプロフィルを下記表4にまとめて示す。 表4(PreS2モノクローナル抗体)
【表4】
(*)150〜174抑制は+であった;他のすべての
モノクローナル抗体は(−)であった;116〜94は
試験しなかった。
モノクローナル抗体は(−)であった;116〜94は
試験しなかった。
【0076】PreS2群1モノクローナル抗体は、ウ
エスタンブロッティングによりMおよびLの両タンパク
質上の直線上エピトープと、合成ペプチド120〜14
5と、および残基123〜175を含有するrPreS
2融合タンパク質と反応した。
エスタンブロッティングによりMおよびLの両タンパク
質上の直線上エピトープと、合成ペプチド120〜14
5と、および残基123〜175を含有するrPreS
2融合タンパク質と反応した。
【0077】PreS2群1モノクローナル抗体はまた
、HBVサブタイプとの異なる反応性に基づいて群1a
および1bにさらに分けられる。群1aおよび1bのモ
ノクローナル抗体は異なるが空間的に近接したエピトー
プに結合するので、立体障害により競合が起こる。この
現象は、公知の抗Sモノクローナル抗体H95およびH
35との間でも認められている[ピーターソンら、J.
Immunology、132、920(1984)]
。
、HBVサブタイプとの異なる反応性に基づいて群1a
および1bにさらに分けられる。群1aおよび1bのモ
ノクローナル抗体は異なるが空間的に近接したエピトー
プに結合するので、立体障害により競合が起こる。この
現象は、公知の抗Sモノクローナル抗体H95およびH
35との間でも認められている[ピーターソンら、J.
Immunology、132、920(1984)]
。
【0078】群2および群3のPreS2モノクローナ
ル抗体は、ウエスタンブロッティングによりMタンパク
質にのみ強く結合したが、固定化デイン粒子への結合に
際しては相互競合を示さなかった。PreS2群2のモ
ノクローナル抗体は、相互競合研究に基づいて群2aお
よび2bに分けた。群2aのモノクローナル抗体(11
6−34−263)は群2bのモノクローナル抗体のデ
イン粒子コーティングビーズへの結合を完全にブロッキ
ングしたが、群2bのモノクローナル抗体は120μg
/mlの濃度(競合モノクローナル抗体の2000倍過
剰を示す)においてさえも群2aのモノクローナル抗体
の結合をブロッキングする能力を示さなかった。この差
別的な抑制はデイン粒子へのモノクローナル抗体の親和
性の相違によるものではない。というのは、幾つかの群
2aのモノクローナル抗体(たとえば、116−94−
140)は115−32−181と等価もしくは低い親
和性を示したからである(データは示していない)。群
2aまたは2bのモノクローナル抗体はまた、合成ペプ
チド(120−145)との反応性およびウエスタンブ
ロッキングにおいてLタンパク質との反応性において異
なっていた。
ル抗体は、ウエスタンブロッティングによりMタンパク
質にのみ強く結合したが、固定化デイン粒子への結合に
際しては相互競合を示さなかった。PreS2群2のモ
ノクローナル抗体は、相互競合研究に基づいて群2aお
よび2bに分けた。群2aのモノクローナル抗体(11
6−34−263)は群2bのモノクローナル抗体のデ
イン粒子コーティングビーズへの結合を完全にブロッキ
ングしたが、群2bのモノクローナル抗体は120μg
/mlの濃度(競合モノクローナル抗体の2000倍過
剰を示す)においてさえも群2aのモノクローナル抗体
の結合をブロッキングする能力を示さなかった。この差
別的な抑制はデイン粒子へのモノクローナル抗体の親和
性の相違によるものではない。というのは、幾つかの群
2aのモノクローナル抗体(たとえば、116−94−
140)は115−32−181と等価もしくは低い親
和性を示したからである(データは示していない)。群
2aまたは2bのモノクローナル抗体はまた、合成ペプ
チド(120−145)との反応性およびウエスタンブ
ロッキングにおいてLタンパク質との反応性において異
なっていた。
【0079】群2aのモノクローナル抗体のMタンパク
質への排他的結合は、遊離のPreS2アミノ末端に依
存していることか、またはアスパラギン123における
炭水化物残基に依存していることのいずれかにより説明
される。このグリカン残基のモノクローナル抗体結合に
おける役割を決定するため、デイン粒子を種々のグリコ
シダーゼで処理した。
質への排他的結合は、遊離のPreS2アミノ末端に依
存していることか、またはアスパラギン123における
炭水化物残基に依存していることのいずれかにより説明
される。このグリカン残基のモノクローナル抗体結合に
おける役割を決定するため、デイン粒子を種々のグリコ
シダーゼで処理した。
【0080】ノイラミニダーゼ単独、ノイラミニダーゼ
+β−ガラクトシダーゼ、またはノイラミニダーゼ+β
−ガラクトシダーゼ+β−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼでの処理は、群2aのモノクローナル抗体の反応性
または他のいずれのPreS2モノクローナル抗体の反
応性にも殆ど影響を与えないかまたは有意の影響を与え
なかった。エンドグリコシダーゼFで処理すると群2a
のモノクローナル抗体(116−34−263)の反応
性は完全に損なわれたが、群1のモノクローナル抗体結
合には影響を与えなかった。
+β−ガラクトシダーゼ、またはノイラミニダーゼ+β
−ガラクトシダーゼ+β−N−アセチルグルコサミニダ
ーゼでの処理は、群2aのモノクローナル抗体の反応性
または他のいずれのPreS2モノクローナル抗体の反
応性にも殆ど影響を与えないかまたは有意の影響を与え
なかった。エンドグリコシダーゼFで処理すると群2a
のモノクローナル抗体(116−34−263)の反応
性は完全に損なわれたが、群1のモノクローナル抗体結
合には影響を与えなかった。
【0081】市販のエンドグリコシダーゼFには2種の
グリコシダーゼ活性がある、すなわちエンドFおよびペ
プチド−N−グリコシダーゼF(PNGaseF:E.
C.3.5.1.52)である。エンドFは、エンドグ
リコシダーゼH(E.C.3.2.1.96)のように
、幾つかのアスパラギン結合グリカン(主として高マン
ノースタイプのもの)のジ−N−アセチルキトビオース
残基の間のオリゴ糖鎖を開裂する。PNGaseFは、
グリコシルアミン結合部位で加水分解し、炭水化物を含
まないペプチド鎖を生成する。エンドグリコシダーゼH
は116−34−263のデイン粒子への結合に殆どま
たは全く影響を及ぼさないので、市販のエンドグリコシ
ダーゼF中のPNGaseF活性が開裂を引き起こして
モノクローナル抗体の結合の損失を引き起こしたらしい
。活性の識別、または炭水化物を除去するのに酵素活性
の組み合わせが必要であるのかどうかについては、解明
は試みられていない。このPreS2結合グリカンの炭
水化物配列は、いまだ決定されていない。
グリコシダーゼ活性がある、すなわちエンドFおよびペ
プチド−N−グリコシダーゼF(PNGaseF:E.
C.3.5.1.52)である。エンドFは、エンドグ
リコシダーゼH(E.C.3.2.1.96)のように
、幾つかのアスパラギン結合グリカン(主として高マン
ノースタイプのもの)のジ−N−アセチルキトビオース
残基の間のオリゴ糖鎖を開裂する。PNGaseFは、
グリコシルアミン結合部位で加水分解し、炭水化物を含
まないペプチド鎖を生成する。エンドグリコシダーゼH
は116−34−263のデイン粒子への結合に殆どま
たは全く影響を及ぼさないので、市販のエンドグリコシ
ダーゼF中のPNGaseF活性が開裂を引き起こして
モノクローナル抗体の結合の損失を引き起こしたらしい
。活性の識別、または炭水化物を除去するのに酵素活性
の組み合わせが必要であるのかどうかについては、解明
は試みられていない。このPreS2結合グリカンの炭
水化物配列は、いまだ決定されていない。
【0082】エンドグリコシダーゼF処理がSDS−P
AGE後のMタンパク質の見かけの分子量に及ぼす影響
を評価するために、処理デイン粒子および未処理デイン
粒子をウエスタンブロッティングにより分析した。未処
理デイン粒子のMタンパク質バンドは、すべてのPre
S2モノクローナル抗体との強い反応性を示した。処理
後にはデインタンパク質に対する反応性は群2aモノク
ローナル抗体で観察されなかった。しかしながら、28
、30、35および40kDaのバンドは群1のモノク
ローナル抗体と反応しなかった。上記28および30k
Daのバンドは、糖除去したMタンパク質に対応するよ
うに思われる。高分子量バンドの出現は予期しないもの
であったが、糖除去したMタンパク質または凝集したM
タンパク質の異常な移動度を表している。
AGE後のMタンパク質の見かけの分子量に及ぼす影響
を評価するために、処理デイン粒子および未処理デイン
粒子をウエスタンブロッティングにより分析した。未処
理デイン粒子のMタンパク質バンドは、すべてのPre
S2モノクローナル抗体との強い反応性を示した。処理
後にはデインタンパク質に対する反応性は群2aモノク
ローナル抗体で観察されなかった。しかしながら、28
、30、35および40kDaのバンドは群1のモノク
ローナル抗体と反応しなかった。上記28および30k
Daのバンドは、糖除去したMタンパク質に対応するよ
うに思われる。高分子量バンドの出現は予期しないもの
であったが、糖除去したMタンパク質または凝集したM
タンパク質の異常な移動度を表している。
【0083】これらのデータは、結合グリカンの存在が
群2aのモノクローナル抗体とPreS2との反応性に
は必須であるが、群1のモノクローナル抗体の反応性に
対しては必須ではなかった。群2bPreS2のモノク
ローナル抗体活性の90%までがエンドグリコシダーゼ
F処理により破壊されたが、デイン粒子のインキュベー
トをさらに続けても糖付加したMタンパク質に幾つかの
残留結合が残っていた。糖付加したMタンパク質との1
15−32−181の反応性をウエスタンブロッティン
グにより確認した。Q19/10、Mタンパク質との強
い反応性を示す抗PreS2モノクローナル抗体[ゲル
ケン(G.Gerken)ら、Gastroenter
ology、92、1864(1987)]もまた糖除
去したMタンパク質に対して弱い反応性を示した。
群2aのモノクローナル抗体とPreS2との反応性に
は必須であるが、群1のモノクローナル抗体の反応性に
対しては必須ではなかった。群2bPreS2のモノク
ローナル抗体活性の90%までがエンドグリコシダーゼ
F処理により破壊されたが、デイン粒子のインキュベー
トをさらに続けても糖付加したMタンパク質に幾つかの
残留結合が残っていた。糖付加したMタンパク質との1
15−32−181の反応性をウエスタンブロッティン
グにより確認した。Q19/10、Mタンパク質との強
い反応性を示す抗PreS2モノクローナル抗体[ゲル
ケン(G.Gerken)ら、Gastroenter
ology、92、1864(1987)]もまた糖除
去したMタンパク質に対して弱い反応性を示した。
【0084】群3のPreS2モノクローナル抗体(1
28−603−108)は、他のいかなるPreS2モ
ノクローナル抗体とも相互に競合せず、ウエスタンブロ
ッティングにおいてMタンパク質とは強い反応性を示し
たが、デイン粒子のLタンパク質(adおよびay)と
は反応しなかった。このモノクローナル抗体は合成ペプ
チド(150−174)サブタイプaywには結合した
が、120−145(adw2配列)、マウスL細胞で
産生されたS遺伝子のみを含有するrHBsAg[ミム
(L.Mimm)ら、J.Virol.Methods
、25、211(1989)]、または大腸菌で産生さ
せた残基123−170(配列adw)を含有するrP
reS2とは反応しなかった。このようなrPreS2
タンパク質への128−603結合の欠如は、上記のよ
うに独特のHBVサブタイプ特異性により説明すること
ができる。
28−603−108)は、他のいかなるPreS2モ
ノクローナル抗体とも相互に競合せず、ウエスタンブロ
ッティングにおいてMタンパク質とは強い反応性を示し
たが、デイン粒子のLタンパク質(adおよびay)と
は反応しなかった。このモノクローナル抗体は合成ペプ
チド(150−174)サブタイプaywには結合した
が、120−145(adw2配列)、マウスL細胞で
産生されたS遺伝子のみを含有するrHBsAg[ミム
(L.Mimm)ら、J.Virol.Methods
、25、211(1989)]、または大腸菌で産生さ
せた残基123−170(配列adw)を含有するrP
reS2とは反応しなかった。このようなrPreS2
タンパク質への128−603結合の欠如は、上記のよ
うに独特のHBVサブタイプ特異性により説明すること
ができる。
【0085】群4のモノクローナル抗体は、他のいずれ
のPreS2モノクローナル抗体群とも相互の競合を示
さず、デイン粒子のadサブタイプとは強い反応性を示
したが、デイン粒子のayサブタイプとは反応しなかっ
た。これらのモノクローナル抗体は、rPreS2また
は120−145(adw2)ペプチドとは反応しなか
った。このモノクローナル抗体は、タイプayw1のP
reS2タンパク質と反応した。
のPreS2モノクローナル抗体群とも相互の競合を示
さず、デイン粒子のadサブタイプとは強い反応性を示
したが、デイン粒子のayサブタイプとは反応しなかっ
た。これらのモノクローナル抗体は、rPreS2また
は120−145(adw2)ペプチドとは反応しなか
った。このモノクローナル抗体は、タイプayw1のP
reS2タンパク質と反応した。
【0086】PreS1モノクローナル抗体は、デイン
粒子へのPreS2モノクローナル抗体の結合を有意に
抑制しなかった。しかしながら、PreS2モノクロー
ナル抗体である50−80−194は、20μg/ml
以上にて群1および群2のPreS1モノクローナル抗
体のデイン粒子への結合を部分的に抑制した(21〜3
4%)。他のすべてのPreS2モノクローナル抗体は
、PreS1結合の抑制は無視できるものであった(<
10%)。興味深いことに、50−80−194は非常
に高濃度(>50μg/ml)にて群2のPreS2モ
ノクローナル抗体の結合を30〜38%抑制することが
できた。H166(抗Sモノクローナル抗体)は、群1
のPreS1結合を25%抑制したが、群2のPreS
1モノクローナル抗体に対しては実質的に抑制を示さな
かった。これらのデータは、Sエピトープ、PreS2
エピトープおよびPreS1エピトープがデイン粒子の
表面上で極めて近接していることを示唆している。
粒子へのPreS2モノクローナル抗体の結合を有意に
抑制しなかった。しかしながら、PreS2モノクロー
ナル抗体である50−80−194は、20μg/ml
以上にて群1および群2のPreS1モノクローナル抗
体のデイン粒子への結合を部分的に抑制した(21〜3
4%)。他のすべてのPreS2モノクローナル抗体は
、PreS1結合の抑制は無視できるものであった(<
10%)。興味深いことに、50−80−194は非常
に高濃度(>50μg/ml)にて群2のPreS2モ
ノクローナル抗体の結合を30〜38%抑制することが
できた。H166(抗Sモノクローナル抗体)は、群1
のPreS1結合を25%抑制したが、群2のPreS
1モノクローナル抗体に対しては実質的に抑制を示さな
かった。これらのデータは、Sエピトープ、PreS2
エピトープおよびPreS1エピトープがデイン粒子の
表面上で極めて近接していることを示唆している。
【0087】実施例2(HBVのサブタイプ決定)HB
sAgサブタイプパネル[パリス(Paris)]反応
性における有意の差異が、同じ競合性群の間においてさ
えもモノクローナル抗体間で観察された。S、PreS
2またはPreS1モノクローナル抗体を対にして比較
して、各領域内の結合を標準化した(表5)。
sAgサブタイプパネル[パリス(Paris)]反応
性における有意の差異が、同じ競合性群の間においてさ
えもモノクローナル抗体間で観察された。S、PreS
2またはPreS1モノクローナル抗体を対にして比較
して、各領域内の結合を標準化した(表5)。
【0088】表5(選択モノクローナル抗体結合比とし
て表したパリスサブタイプパリスとの差異モノクローナ
ル抗体反応性)
て表したパリスサブタイプパリスとの差異モノクローナ
ル抗体反応性)
【表5】
(a)結合を標準化するため、パリスサブタイプ試料へ
のSまたはPreSモノクローナル抗体結合のS/N値
を、同じ領域内の別のモノクローナル抗体結合のS/N
値で除した。下線を引いてある値は、ayw3サブタイ
プと有意に相違しているものである。S/N値の決定は
、物質および方法において記載したものと同様にして行
った。 (b)最後の数字の表記は、表2−3に示すように、簡
潔のため省いた。
のSまたはPreSモノクローナル抗体結合のS/N値
を、同じ領域内の別のモノクローナル抗体結合のS/N
値で除した。下線を引いてある値は、ayw3サブタイ
プと有意に相違しているものである。S/N値の決定は
、物質および方法において記載したものと同様にして行
った。 (b)最後の数字の表記は、表2−3に示すように、簡
潔のため省いた。
【0089】抗Sモノクローナル抗体の結合比を用いて
、adサブタイプはayサブタイプから容易に識別する
ことができ、adw2サブタイプはadrおよびadw
4サブタイプと容易に識別することができ、ayw1サ
ブタイプは他のaywサブタイプから容易に識別するこ
とができた。PreS2モノクローナル抗体反応性に基
づき、ayw2およびayw3以外のすべてのパリスサ
ブタイプを互いに識別することができた。
、adサブタイプはayサブタイプから容易に識別する
ことができ、adw2サブタイプはadrおよびadw
4サブタイプと容易に識別することができ、ayw1サ
ブタイプは他のaywサブタイプから容易に識別するこ
とができた。PreS2モノクローナル抗体反応性に基
づき、ayw2およびayw3以外のすべてのパリスサ
ブタイプを互いに識別することができた。
【0090】表6(パリスサブタイプパネルとのPre
S2およびPreS1モノクローナル抗体の相対的反応
性)(1975)
S2およびPreS1モノクローナル抗体の相対的反応
性)(1975)
【表6】
(a)++:S/N>100、+:5<S/N<75、
−:S/N<5[S/Nは、試料含有HBsAgのcp
mを陰性ヒト血漿のcpmで除したもの](b)++:
S/N>30、+:5<S/N<30、−:S/N<5
−:S/N<5[S/Nは、試料含有HBsAgのcp
mを陰性ヒト血漿のcpmで除したもの](b)++:
S/N>30、+:5<S/N<30、−:S/N<5
【0091】群1のPreS2モノクローナル抗体、5
0−80−194および116−183−406は、サ
ブタイプayr、adw4、またはadrと殆どまたは
全く反応性を示さなかった。しかしながら、これらモノ
クローナルのayw1サブタイプへの結合は有意に異な
っていた。50−80−194はayw1に強く結合し
たが、116−183−406はこのサブタイプに対し
て実質的に結合を示さなかった(表5−6)。
0−80−194および116−183−406は、サ
ブタイプayr、adw4、またはadrと殆どまたは
全く反応性を示さなかった。しかしながら、これらモノ
クローナルのayw1サブタイプへの結合は有意に異な
っていた。50−80−194はayw1に強く結合し
たが、116−183−406はこのサブタイプに対し
て実質的に結合を示さなかった(表5−6)。
【0092】別の群1のモノクローナル抗体である12
8−410−194は、adw2を除いてすべてのサブ
タイプに対して116−183−406と同じ反応性で
あった。実際、128−410−194は、ayw2−
4サブタイプに対してのみ高親和性にて結合する。第四
の群1のモノクローナル抗体である25−19−117
は、すべてのパリスサブタイプ成員と結合するが、サブ
タイプayw1およびadw4に対しては有意に低い親
和性を示した。
8−410−194は、adw2を除いてすべてのサブ
タイプに対して116−183−406と同じ反応性で
あった。実際、128−410−194は、ayw2−
4サブタイプに対してのみ高親和性にて結合する。第四
の群1のモノクローナル抗体である25−19−117
は、すべてのパリスサブタイプ成員と結合するが、サブ
タイプayw1およびadw4に対しては有意に低い親
和性を示した。
【0093】群1のモノクローナル抗体とは対照的に、
群2aのモノクローナル抗体(116−34−263)
はすべてのパリスサブタイプに対して高い親和性を示す
。 群2aのモノクローナル抗体(116−34−263)
と群2bのモノクローナル抗体(115−32−181
)とを比較すると、115−32−181および115
−32−181および116−34−263の両方の結
合ともアスパラギン123部位でのグリカンに依存して
はいるが、ayrサブタイプは群2aに対して有意に一
層反応性であることを示していた。それゆえ、PreS
2群2のモノクローナル抗体は、すべてのHBVサブタ
イプに対して実質的に等しく結合することができるので
、サンドイッチ型のイムノアッセイにおいて検出抗体と
して好ましい。
群2aのモノクローナル抗体(116−34−263)
はすべてのパリスサブタイプに対して高い親和性を示す
。 群2aのモノクローナル抗体(116−34−263)
と群2bのモノクローナル抗体(115−32−181
)とを比較すると、115−32−181および115
−32−181および116−34−263の両方の結
合ともアスパラギン123部位でのグリカンに依存して
はいるが、ayrサブタイプは群2aに対して有意に一
層反応性であることを示していた。それゆえ、PreS
2群2のモノクローナル抗体は、すべてのHBVサブタ
イプに対して実質的に等しく結合することができるので
、サンドイッチ型のイムノアッセイにおいて検出抗体と
して好ましい。
【0094】群3PreS2のモノクローナル抗体であ
る128−603−108は、他のPreS2モノクロ
ーナル抗体とは異なるサブタイプ反応性を示した。この
モノクローナル抗体は、サブタイプadw2、adw4
またはayw1とは有意の結合を示さず、またayw2
、ayw3、ayrおよびadrに比べてayw4に対
して低い親和性を有する。
る128−603−108は、他のPreS2モノクロ
ーナル抗体とは異なるサブタイプ反応性を示した。この
モノクローナル抗体は、サブタイプadw2、adw4
またはayw1とは有意の結合を示さず、またayw2
、ayw3、ayrおよびadrに比べてayw4に対
して低い親和性を有する。
【0095】PreS1領域には炭水化物が結合してい
ないので、マッピングしたエピトープはすべてアミノ酸
配列のみに基づいて定められる。最も著しいサブタイプ
の相違は、2つの群2PreS1モノクローナル抗体、
すなわち116−86−293および115−16−4
07の間で観察される。115−16−407は116
−86−293に比べてayw1、ayrおよびadw
2に対して弱く結合する。この反応性の相違の最も簡単
な説明は、このエピトープ中で3つのすべてのサブタイ
プに共通するアミノ酸が一つ変化したことである。
ないので、マッピングしたエピトープはすべてアミノ酸
配列のみに基づいて定められる。最も著しいサブタイプ
の相違は、2つの群2PreS1モノクローナル抗体、
すなわち116−86−293および115−16−4
07の間で観察される。115−16−407は116
−86−293に比べてayw1、ayrおよびadw
2に対して弱く結合する。この反応性の相違の最も簡単
な説明は、このエピトープ中で3つのすべてのサブタイ
プに共通するアミノ酸が一つ変化したことである。
【0096】PreS1群2のモノクローナル抗体(1
16−86−293)および群1のモノクローナル抗体
(116−80−179)の反応性を比較しても興味深
い。116−80−179に対する116−86−29
3の結合比は、adw4サブタイプに対するものが他の
すべてのサブタイプに対するものより大きい(表5)。 このことについては2つの説明が可能である。群2のエ
ピトープよりもPreS1領域のアミノ末端に近い群1
のエピトープが優先的に欠失もしくは破壊されているか
(たとえば、タンパク質加水分解により)、またはad
w4が群1PreS1の領域中に独特の配列を有してい
る。異なるハイブリドーマからの幾つかのPreS1モ
ノクローナル抗体は、パリスHBsAgサブタイプとの
反応性について殆ど変化がないかまたはわずかしか変化
を示さない。このことは、PreS1群1および群2の
エピトープが比較的保存されていることを示唆している
。
16−86−293)および群1のモノクローナル抗体
(116−80−179)の反応性を比較しても興味深
い。116−80−179に対する116−86−29
3の結合比は、adw4サブタイプに対するものが他の
すべてのサブタイプに対するものより大きい(表5)。 このことについては2つの説明が可能である。群2のエ
ピトープよりもPreS1領域のアミノ末端に近い群1
のエピトープが優先的に欠失もしくは破壊されているか
(たとえば、タンパク質加水分解により)、またはad
w4が群1PreS1の領域中に独特の配列を有してい
る。異なるハイブリドーマからの幾つかのPreS1モ
ノクローナル抗体は、パリスHBsAgサブタイプとの
反応性について殆ど変化がないかまたはわずかしか変化
を示さない。このことは、PreS1群1および群2の
エピトープが比較的保存されていることを示唆している
。
【0097】表6の8つの主要なサブタイプに加えて、
他の3つのサブタイプがパリスで同定された(1975
)。その一つであるayw3*は、Sモノクローナル抗
体結合およびPreSモノクローナル抗体結合に基づい
てはayw2およびayw3と識別できない(表5)。 他のサブタイプであるadrq−は、adr[クールー
ス−ポーティー(Courouce−Pauty)らに
よってadrq+とも呼ばれる;Vox Sang.,
44、197(1983)]殆ど同一の反応性を示した
(表5)。これらサブタイプの微妙な差異は、ポリクロ
ーナルまたはアフィニティー吸着ポリクローナル抗血清
との差別的反応性に基づいて以前になされている。ad
ywと呼ばれるパリスサブタイプは、adサブタイプと
ayサブタイプとが別の粒子上に存在する患者から得ら
れた[ポール(D.Paul)、J.Virol.,M
ethods、13、43(1986)]。SおよびP
reSモノクローナル抗体反応性はadw粒子とayw
粒子との混合物と一致するものであったが、ay粒子か
らad粒子を分離する試みはなされておらず、この試み
がなされれば個々のサブタイプの一層詳細な特徴付けが
可能となるであろう。
他の3つのサブタイプがパリスで同定された(1975
)。その一つであるayw3*は、Sモノクローナル抗
体結合およびPreSモノクローナル抗体結合に基づい
てはayw2およびayw3と識別できない(表5)。 他のサブタイプであるadrq−は、adr[クールー
ス−ポーティー(Courouce−Pauty)らに
よってadrq+とも呼ばれる;Vox Sang.,
44、197(1983)]殆ど同一の反応性を示した
(表5)。これらサブタイプの微妙な差異は、ポリクロ
ーナルまたはアフィニティー吸着ポリクローナル抗血清
との差別的反応性に基づいて以前になされている。ad
ywと呼ばれるパリスサブタイプは、adサブタイプと
ayサブタイプとが別の粒子上に存在する患者から得ら
れた[ポール(D.Paul)、J.Virol.,M
ethods、13、43(1986)]。SおよびP
reSモノクローナル抗体反応性はadw粒子とayw
粒子との混合物と一致するものであったが、ay粒子か
らad粒子を分離する試みはなされておらず、この試み
がなされれば個々のサブタイプの一層詳細な特徴付けが
可能となるであろう。
【0098】以上のデータから種々の感染個体のHBs
Agサブタイプを決定することが可能である。公知の抗
Sモノクローナル抗体であるH95およびH10(それ
ぞれdサブタイプまたはyサブタイプと強く反応する)
との血清HBsAg反応性を測定することにより、まず
サブタイプdとサブタイプyとを識別することができる
。別法として、もっぱら本発明のPreS1モノクロー
ナル抗体およびPreS2モノクローナル抗体を用いた
サブタイプ決定法を行うことができる。本発明の代表的
なサブタイプ決定法の模式図を図2に示す。図2におい
て、第三の数字を簡潔のためモノクローナル抗体の表示
から省いてある。本発明のモノクローナル抗体において
は観察されるHBVサブタイプ反応性の差異が大きいの
で、S特異的モノクローナル抗体を用いた詳細な結合曲
線の作成は必要ではない。
Agサブタイプを決定することが可能である。公知の抗
Sモノクローナル抗体であるH95およびH10(それ
ぞれdサブタイプまたはyサブタイプと強く反応する)
との血清HBsAg反応性を測定することにより、まず
サブタイプdとサブタイプyとを識別することができる
。別法として、もっぱら本発明のPreS1モノクロー
ナル抗体およびPreS2モノクローナル抗体を用いた
サブタイプ決定法を行うことができる。本発明の代表的
なサブタイプ決定法の模式図を図2に示す。図2におい
て、第三の数字を簡潔のためモノクローナル抗体の表示
から省いてある。本発明のモノクローナル抗体において
は観察されるHBVサブタイプ反応性の差異が大きいの
で、S特異的モノクローナル抗体を用いた詳細な結合曲
線の作成は必要ではない。
【0099】本発明のサブタイプ決定法の他の態様にお
いては、HBV PreS1タンパク質およびPreS
2タンパク質に対する複数のモノクローナル抗体を固相
上の個々の位置にスポットし、単一の試料から同時に決
定することが可能となるようにする。好ましい固相は、
超音波ホーンで複数の孤立した「島」を浮き彫りにした
ニトロセルロース膜である。一般に、13個の直径2.
5mmの円をパターンとして用い、これら円に捕捉抗体
を適用する。捕捉モノクローナル抗体をニトロセルロー
スの「島」にスポットし、乾燥する。非特異的結合を防
ぐため、ブロッキング工程においてBSAまたはゼラチ
ンで反応表面をオーバーコーティングするのが好ましい
。ついで、固相をプラスチック試験カードに組み立てる
。単一の反応表面上に30までのモノクローナル抗体(
または、異なる濃度でモノクローナル抗体を適用するこ
とができる)を適用することができる。
いては、HBV PreS1タンパク質およびPreS
2タンパク質に対する複数のモノクローナル抗体を固相
上の個々の位置にスポットし、単一の試料から同時に決
定することが可能となるようにする。好ましい固相は、
超音波ホーンで複数の孤立した「島」を浮き彫りにした
ニトロセルロース膜である。一般に、13個の直径2.
5mmの円をパターンとして用い、これら円に捕捉抗体
を適用する。捕捉モノクローナル抗体をニトロセルロー
スの「島」にスポットし、乾燥する。非特異的結合を防
ぐため、ブロッキング工程においてBSAまたはゼラチ
ンで反応表面をオーバーコーティングするのが好ましい
。ついで、固相をプラスチック試験カードに組み立てる
。単一の反応表面上に30までのモノクローナル抗体(
または、異なる濃度でモノクローナル抗体を適用するこ
とができる)を適用することができる。
【0100】13個の一連のモノクローナル抗体、すな
わち、S領域に対する3つのモノクローナル抗体(H9
5、H166およびH10)、PreS2領域に対する
7つのモノクローナル抗体(50−80−194、25
−19−117、116−183−406、128−4
10−194、116−34−263、115−32−
181、128−603−108)、およびPreS1
領域に対する3つのモノクローナル抗体(116−80
−179、116−86−293、115−16−40
7)は、エンベロープ領域におけるHBVサブタイプ変
異に対して特に有用である。HBsAgのスポットおよ
び無関係のモノクローナル抗体のスポットも、それぞれ
陽性コントロールおよび陰性コントロールとして含まれ
ている。
わち、S領域に対する3つのモノクローナル抗体(H9
5、H166およびH10)、PreS2領域に対する
7つのモノクローナル抗体(50−80−194、25
−19−117、116−183−406、128−4
10−194、116−34−263、115−32−
181、128−603−108)、およびPreS1
領域に対する3つのモノクローナル抗体(116−80
−179、116−86−293、115−16−40
7)は、エンベロープ領域におけるHBVサブタイプ変
異に対して特に有用である。HBsAgのスポットおよ
び無関係のモノクローナル抗体のスポットも、それぞれ
陽性コントロールおよび陰性コントロールとして含まれ
ている。
【0101】アッセイにおいては、試料(正味のものま
たは希釈したもの)を反応表面に適用し、35〜41℃
で1〜18時間撹拌する。反応表面を緩衝溶液で洗浄し
、ついでHBVの普遍的なa抗原決定基に対する酵素標
識モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体(結合
体)を加え、1〜2時間インキュベートする。結合体を
吸引除去し、反応表面を再び洗浄し、結合体に対する沈
殿基質を含有する溶液を加える。反応を停止させるため
、反応表面を緩衝溶液で洗浄し、乾燥させる。個々のス
ポットの色を視覚で評価するかまたはフロントフェース
反射計で定量する。
たは希釈したもの)を反応表面に適用し、35〜41℃
で1〜18時間撹拌する。反応表面を緩衝溶液で洗浄し
、ついでHBVの普遍的なa抗原決定基に対する酵素標
識モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体(結合
体)を加え、1〜2時間インキュベートする。結合体を
吸引除去し、反応表面を再び洗浄し、結合体に対する沈
殿基質を含有する溶液を加える。反応を停止させるため
、反応表面を緩衝溶液で洗浄し、乾燥させる。個々のス
ポットの色を視覚で評価するかまたはフロントフェース
反射計で定量する。
【0102】実施例3(PreS1およびPreS2抗
原アッセイ) A.PreS2抗原アッセイ PreS2抗原アッセイにおいては特に、ヤギ抗HBs
抗体(アボット・ラボラトリーズ)をコーティングした
ビーズを、放射性標識または酵素標識したモノクローナ
ル抗体(50−80−194または25−19−117
)とともに用いた。殆どの実験は、結合ポリクローナル
モルモット抗S抗体、および125I標識モノクローナ
ル抗PreS2抗体(群2:116−34−263およ
び/または群1:50−80−194)の混合物を含有
するトレーサー溶液からなるアウスザイムRIIビーズ
(アボット・ラボラトリーズ)を用いて行った。
原アッセイ) A.PreS2抗原アッセイ PreS2抗原アッセイにおいては特に、ヤギ抗HBs
抗体(アボット・ラボラトリーズ)をコーティングした
ビーズを、放射性標識または酵素標識したモノクローナ
ル抗体(50−80−194または25−19−117
)とともに用いた。殆どの実験は、結合ポリクローナル
モルモット抗S抗体、および125I標識モノクローナ
ル抗PreS2抗体(群2:116−34−263およ
び/または群1:50−80−194)の混合物を含有
するトレーサー溶液からなるアウスザイムRIIビーズ
(アボット・ラボラトリーズ)を用いて行った。
【0103】B.PreS1抗原アッセイPreS1抗
原を検出するため、モノクローナルアウスザイムRまた
はアウスザイムRIIビーズを、放射性標識または酵素
標識モノクローナル抗体116−29−129(群1)
とともに用いた。また、モノクローナル抗体116−8
0−179(群1)をコーティングしたビーズを、プロ
ーブとして放射性標識または酵素標識した116−8−
151または116−72−270(ともに群2)とと
もに用いた。
原を検出するため、モノクローナルアウスザイムRまた
はアウスザイムRIIビーズを、放射性標識または酵素
標識モノクローナル抗体116−29−129(群1)
とともに用いた。また、モノクローナル抗体116−8
0−179(群1)をコーティングしたビーズを、プロ
ーブとして放射性標識または酵素標識した116−8−
151または116−72−270(ともに群2)とと
もに用いた。
【0104】C.結果
1.PreS2抗原アッセイ
ヤギ抗HBs抗体(アボット・ラボラトリーズ)コーテ
ィングビーズ、および第二の工程にPreS2モノクロ
ーナル抗体(25−19−117)(群1b)、ついで
HRP結合ヤギ抗マウスIgGを用いた検出工程を行う
3工程態様アッセイを多くの実験に用い、良好な感度お
よび選択性を得た。アウスザイムRIIビーズ、および
検出モノクローナル抗体としてHRP結合または125
I−PreS2モノクローナル抗体[25−19−11
7(1b)、50−80−194(1a)+116−3
4−263(群2a)]を用いて、等価な感度および選
択性を有する2工程法をも開発した。
ィングビーズ、および第二の工程にPreS2モノクロ
ーナル抗体(25−19−117)(群1b)、ついで
HRP結合ヤギ抗マウスIgGを用いた検出工程を行う
3工程態様アッセイを多くの実験に用い、良好な感度お
よび選択性を得た。アウスザイムRIIビーズ、および
検出モノクローナル抗体としてHRP結合または125
I−PreS2モノクローナル抗体[25−19−11
7(1b)、50−80−194(1a)+116−3
4−263(群2a)]を用いて、等価な感度および選
択性を有する2工程法をも開発した。
【0105】モノクローナルアウスザイムRによりHB
sAgについて陰性と試験された100の試料は、上記
PreS2抗原アッセイでもすべて反応しなかった。こ
れら陰性群に基づいて、EIAアッセイについて0.0
5+NCx、RIAについて4×NCxのカットオフを
選択した(陰性群平均から7よりも大きい標準偏差)。 PreS2Agを定量するため、hpHBsAg調製物
の希釈を各アッセイで行った。hpHBsAg調製物中
の全Mタンパク質のパーセントをクマシー染色SDSゲ
ルのスキャニング密度計により測定した。これら定量実
験に使用した調製物には15%のMタンパク質が含まれ
ていた。PreS2アッセイの感度は、全hpHBsA
gが約1ng/ml、Mタンパク質が0.15ng/m
lと決定された。
sAgについて陰性と試験された100の試料は、上記
PreS2抗原アッセイでもすべて反応しなかった。こ
れら陰性群に基づいて、EIAアッセイについて0.0
5+NCx、RIAについて4×NCxのカットオフを
選択した(陰性群平均から7よりも大きい標準偏差)。 PreS2Agを定量するため、hpHBsAg調製物
の希釈を各アッセイで行った。hpHBsAg調製物中
の全Mタンパク質のパーセントをクマシー染色SDSゲ
ルのスキャニング密度計により測定した。これら定量実
験に使用した調製物には15%のMタンパク質が含まれ
ていた。PreS2アッセイの感度は、全hpHBsA
gが約1ng/ml、Mタンパク質が0.15ng/m
lと決定された。
【0106】S遺伝子のみを含む組換えHBsAgは、
300μg/mlまでの濃度では抗PreS2アッセイ
を抑制せず、80,000倍過剰のSタンパク質の存在
下でPreS2Agを検出し得ることが示された。HB
Vキャリアからの200の血漿試料を、モノクローナル
アウスザイムRアッセイを用いてHBsAgについて、
上記PreS2Agアッセイを用いてMタンパク質につ
いて定量アッセイした。HBeAg陽性キャリアの99
%(102/103)および抗HBe陽性キャリアの9
5%(81/85)がPreS2Agアッセイにより反
応性であった。平均してMタンパク質レベルは、抗HB
e陽性グループに比べるとHBeAg陽性キャリアの方
が11倍高かった(HBsAgレベルは5倍高かった)
。
300μg/mlまでの濃度では抗PreS2アッセイ
を抑制せず、80,000倍過剰のSタンパク質の存在
下でPreS2Agを検出し得ることが示された。HB
Vキャリアからの200の血漿試料を、モノクローナル
アウスザイムRアッセイを用いてHBsAgについて、
上記PreS2Agアッセイを用いてMタンパク質につ
いて定量アッセイした。HBeAg陽性キャリアの99
%(102/103)および抗HBe陽性キャリアの9
5%(81/85)がPreS2Agアッセイにより反
応性であった。平均してMタンパク質レベルは、抗HB
e陽性グループに比べるとHBeAg陽性キャリアの方
が11倍高かった(HBsAgレベルは5倍高かった)
。
【0107】Mタンパク質濃度が10μg/mlよりも
高い試料は、例外なくHBeAg陽性グループに入った
。この値以下では、HBeAg陽性試料と抗HBe陽性
試料との間でMタンパク質濃度がかなり重複していた。 これら集団の下位群におけるHBV DNA濃度を決定
したが、Mタンパク質との相関は不良であった(データ
は示していない)。
高い試料は、例外なくHBeAg陽性グループに入った
。この値以下では、HBeAg陽性試料と抗HBe陽性
試料との間でMタンパク質濃度がかなり重複していた。 これら集団の下位群におけるHBV DNA濃度を決定
したが、Mタンパク質との相関は不良であった(データ
は示していない)。
【0108】これらのデータを総合すると、PreS2
抗原は、抗S特異的試験(モノクローナルアウスザイム
R)から得られる以上の情報は得られず、活性なウイル
ス複製の正確な指標としては働かないことを示唆してい
る。
抗原は、抗S特異的試験(モノクローナルアウスザイム
R)から得られる以上の情報は得られず、活性なウイル
ス複製の正確な指標としては働かないことを示唆してい
る。
【0109】2.PreS1抗原アッセイPreS1A
gの検出のため4つのサンドイッチイムノアッセイを行
った。1つはモノクローナルアウスザイムRビーズおよ
び検出系としてHRP結合PreS1モノクローナル抗
体(116−29−129、群1)を用いたものであり
、第二のものは、固相捕捉抗体としてPreS1モノク
ローナル抗体(116−80−179、群1)および検
出モノクローナル抗体としてHRP結合または放射性標
識PreS1モノクローナル抗体(116−72−27
0、群3)を用いたものであり、第三のものはアウスザ
イムRIIビーズおよび検出モノクローナル抗体として
125I標識116−29−129および116−8−
151(群2)を含有するトレーサーを用いたものであ
り、第四のものはアウスザイムRIIビーズおよび12
5I標識116−80−179(群1)および116−
86−290(群2)を用いたものである。
gの検出のため4つのサンドイッチイムノアッセイを行
った。1つはモノクローナルアウスザイムRビーズおよ
び検出系としてHRP結合PreS1モノクローナル抗
体(116−29−129、群1)を用いたものであり
、第二のものは、固相捕捉抗体としてPreS1モノク
ローナル抗体(116−80−179、群1)および検
出モノクローナル抗体としてHRP結合または放射性標
識PreS1モノクローナル抗体(116−72−27
0、群3)を用いたものであり、第三のものはアウスザ
イムRIIビーズおよび検出モノクローナル抗体として
125I標識116−29−129および116−8−
151(群2)を含有するトレーサーを用いたものであ
り、第四のものはアウスザイムRIIビーズおよび12
5I標識116−80−179(群1)および116−
86−290(群2)を用いたものである。
【0110】PreS1Agを定量するため、精製デイ
ン粒子の希釈を各アッセイで行った。Mタンパク質の場
合に用いた手順と同様にして、デイン調製物中に含まれ
る全Lタンパク質のパーセントを決定した。定量に使用
したデイン調製物は、約10%のLタンパク質を含んで
いた。アッセイのカットオフ値を決定するため、100
のHBsAg陰性血清および血漿をアッセイにかけた。 EIAにおいて0.05+NCxのカットオフ値を、R
IAにおいて4×NCxのカットオフ値(陰性集団の平
均から7以上の標準偏差)を用いた場合には、すべての
試料は反応しなかった。
ン粒子の希釈を各アッセイで行った。Mタンパク質の場
合に用いた手順と同様にして、デイン調製物中に含まれ
る全Lタンパク質のパーセントを決定した。定量に使用
したデイン調製物は、約10%のLタンパク質を含んで
いた。アッセイのカットオフ値を決定するため、100
のHBsAg陰性血清および血漿をアッセイにかけた。 EIAにおいて0.05+NCxのカットオフ値を、R
IAにおいて4×NCxのカットオフ値(陰性集団の平
均から7以上の標準偏差)を用いた場合には、すべての
試料は反応しなかった。
【0111】HBVキャリヤ(n=229)からのすべ
てのHBeAg陽性試料および抗HBe陽性試料の96
.6%(57/59)が、PreS1Agアッセイにお
いて反応性であった。PreS1Ag濃度は、8ng/
ml未満から16ng/mlを越えるものまで広範囲に
わたって変わった。L抗原が0.9μg/mlを越える
ものは抗HBe陽性試料では認められなかったのに対し
て、HBeAg陽性試料では37.5%あった。血清中
のLタンパク質の濃度が0.9μg/ml未満では、H
BeAg反応性試料と抗HBe反応性試料との間でPr
eS1Ag濃度に有意の重複が観察される。
てのHBeAg陽性試料および抗HBe陽性試料の96
.6%(57/59)が、PreS1Agアッセイにお
いて反応性であった。PreS1Ag濃度は、8ng/
ml未満から16ng/mlを越えるものまで広範囲に
わたって変わった。L抗原が0.9μg/mlを越える
ものは抗HBe陽性試料では認められなかったのに対し
て、HBeAg陽性試料では37.5%あった。血清中
のLタンパク質の濃度が0.9μg/ml未満では、H
BeAg反応性試料と抗HBe反応性試料との間でPr
eS1Ag濃度に有意の重複が観察される。
【0112】HBeAg陽性試料の93%が血清中に検
出可能なHBV DNAを有していた(平均[HBV−
DNA]=63.8pg/ml、0.5〜445pg/
mlの範囲)のに対して、抗HBe陽性試料では20%
であった(平均[HBV−DNA]=2.14pg/m
l、1.7〜2.4pg/mlの範囲)。
出可能なHBV DNAを有していた(平均[HBV−
DNA]=63.8pg/ml、0.5〜445pg/
mlの範囲)のに対して、抗HBe陽性試料では20%
であった(平均[HBV−DNA]=2.14pg/m
l、1.7〜2.4pg/mlの範囲)。
【0113】高HBV DNA濃度を有する血清は、高
濃度のPreS1Agを有する傾向がある。これらマー
カーの間に有意の定量的相関(R=0.52)が存在す
る。PreS1Ag濃度とHBsAg濃度との間には低
い定量的相関が存在する(R=0.38)。
濃度のPreS1Agを有する傾向がある。これらマー
カーの間に有意の定量的相関(R=0.52)が存在す
る。PreS1Ag濃度とHBsAg濃度との間には低
い定量的相関が存在する(R=0.38)。
【0114】実施例4(抗体アッセイ)血清陽性の個体
の血液中の抗PreS2抗体についてアッセイを行うた
め、還元しインドアセトアミドを付加したSタンパク質
を含むHBsAgをコーティングした単一の0.25イ
ンチポリスチレンビーズに血清(200μl)を加えた
。この混合物を25℃で18時間インキュベートし、つ
いで水洗し、125I標識モノクローナル抗体50−8
0−194(1μCi/ml;200μl)を動物血清
を含有する希釈液中に加えた。混合物を40℃にて2時
間インキュベートし、洗浄して遊離のモノクローナル抗
体を除去し、ビーズをカウントした。一人のHBV患者
のHBsAg、抗HBs抗体および抗PreS2抗体の
経時変化を下記表7にまとめて示す。
の血液中の抗PreS2抗体についてアッセイを行うた
め、還元しインドアセトアミドを付加したSタンパク質
を含むHBsAgをコーティングした単一の0.25イ
ンチポリスチレンビーズに血清(200μl)を加えた
。この混合物を25℃で18時間インキュベートし、つ
いで水洗し、125I標識モノクローナル抗体50−8
0−194(1μCi/ml;200μl)を動物血清
を含有する希釈液中に加えた。混合物を40℃にて2時
間インキュベートし、洗浄して遊離のモノクローナル抗
体を除去し、ビーズをカウントした。一人のHBV患者
のHBsAg、抗HBs抗体および抗PreS2抗体の
経時変化を下記表7にまとめて示す。
【0115】
【表7】
表7
各日における アウスザイムR アウサブR
競合抗PreS抗体患者の血液 HB
sAg (抗HBs) S/CO*
解釈 1 −
− 1.624
− 31 +
− 1.62
0 − 36
+ − 1.
564 − 44
− +
0.968 + 52
− +
0.982 + 62
− +
0.858 + 93
− +
0.192 +122
− +
0.166 ++(*)cp
m(試料)/cpm(カットオフ)の比;陰性コントロ
ールの値=2;S/COが<1.0である場合には試料
はPreS2タンパク質に対する抗体について陽性(+
)であるとする。
競合抗PreS抗体患者の血液 HB
sAg (抗HBs) S/CO*
解釈 1 −
− 1.624
− 31 +
− 1.62
0 − 36
+ − 1.
564 − 44
− +
0.968 + 52
− +
0.982 + 62
− +
0.858 + 93
− +
0.192 +122
− +
0.166 ++(*)cp
m(試料)/cpm(カットオフ)の比;陰性コントロ
ールの値=2;S/COが<1.0である場合には試料
はPreS2タンパク質に対する抗体について陽性(+
)であるとする。
【0116】HBVエンベロープのPreS1領域中の
少なくとも3つの識別されるエピトープおよびPreS
2領域中の少なくとも4つの識別されるエピトープによ
り定められるモノクローナル抗体を産生させた。ウエス
タンブロッティングにより観察されるように、これらの
パターンはすべて、デイン粒子を熱、SDS、およびβ
−メルカプトエタノール(BME)で処理した後も保持
される。これらの処理は、Sタンパク質上の抗原性部位
の殆どを破壊する。抗原決定基は直線状のエピトープで
あるかもしれないし、またはニトロセルロースにタンパ
ク質を移した後に再形成し得る立体配座的なものである
。 PreS1領域およびPreS2領域にはシステインは
存在しないので、天然のコンホーメーションを保持する
ためにジスルフィド結合を適切に再形成する必要はない
。この点は、Sのたいていの抗原性エピトープ(p24
およびgp27)がジスルフィド結合生成および粒子と
して適当に組み立てられることに依存していることと対
照的である。殆どのS抗原決定基は、ウエスタンブロッ
ティングのために試料を調製する間のSDS/BME変
性工程で破壊される。
少なくとも3つの識別されるエピトープおよびPreS
2領域中の少なくとも4つの識別されるエピトープによ
り定められるモノクローナル抗体を産生させた。ウエス
タンブロッティングにより観察されるように、これらの
パターンはすべて、デイン粒子を熱、SDS、およびβ
−メルカプトエタノール(BME)で処理した後も保持
される。これらの処理は、Sタンパク質上の抗原性部位
の殆どを破壊する。抗原決定基は直線状のエピトープで
あるかもしれないし、またはニトロセルロースにタンパ
ク質を移した後に再形成し得る立体配座的なものである
。 PreS1領域およびPreS2領域にはシステインは
存在しないので、天然のコンホーメーションを保持する
ためにジスルフィド結合を適切に再形成する必要はない
。この点は、Sのたいていの抗原性エピトープ(p24
およびgp27)がジスルフィド結合生成および粒子と
して適当に組み立てられることに依存していることと対
照的である。殆どのS抗原決定基は、ウエスタンブロッ
ティングのために試料を調製する間のSDS/BME変
性工程で破壊される。
【0117】天然のデイン粒子との反応性についてもす
べてのモノクローナル抗体を試験したので、これらのモ
ノクローナル抗体によって定められるすべてのエピトー
プがウイルス表面上に暴露されていなければならない。 データの示すところによれば、抗PreS2モノクロー
ナル抗体の一つの群(群2)については、PreS2領
域中のアスパラギン(Asn)123部位のグリカンは
抗原決定基の必須部分を構成している。このモノクロー
ナル抗体は他のヒト血清グリカンとは結合しないので、
ヒト血液型群タンパク質であるグリコホリンA(MN抗
原)について示されているように、この抗原決定基は炭
水化物とタンパク質の両方からできているらしい。
べてのモノクローナル抗体を試験したので、これらのモ
ノクローナル抗体によって定められるすべてのエピトー
プがウイルス表面上に暴露されていなければならない。 データの示すところによれば、抗PreS2モノクロー
ナル抗体の一つの群(群2)については、PreS2領
域中のアスパラギン(Asn)123部位のグリカンは
抗原決定基の必須部分を構成している。このモノクロー
ナル抗体は他のヒト血清グリカンとは結合しないので、
ヒト血液型群タンパク質であるグリコホリンA(MN抗
原)について示されているように、この抗原決定基は炭
水化物とタンパク質の両方からできているらしい。
【0118】本発明のPreS2およびPreS1モノ
クローナル抗体は、ヒト血清および血漿中のMタンパク
質およびLタンパク質を検出するための特異的で高感度
のイムノアッセイを開発するのに有用であることがわか
った。以前の報告によれば、HBeAgの血清マーカー
の存在とMタンパク質の存在との間に絶対的な相関関係
が主張されていた[イマイ(M.Imai)ら、Gas
troent.,76、242(1979)]。文献中
にみられる他の主張は、PreS1Agの存在または不
存在が感染およびHBV DNAの存在と相関するとい
うものである。データはヒューらの仕事(上記)を支持
しており、HBeAg個体はHBsAg、PreS2A
g、PreS1AgおよびHBV DNAの平均濃度が
高いけれども、HBeAg状態との定性的な相関が欠け
ていることを示している。
クローナル抗体は、ヒト血清および血漿中のMタンパク
質およびLタンパク質を検出するための特異的で高感度
のイムノアッセイを開発するのに有用であることがわか
った。以前の報告によれば、HBeAgの血清マーカー
の存在とMタンパク質の存在との間に絶対的な相関関係
が主張されていた[イマイ(M.Imai)ら、Gas
troent.,76、242(1979)]。文献中
にみられる他の主張は、PreS1Agの存在または不
存在が感染およびHBV DNAの存在と相関するとい
うものである。データはヒューらの仕事(上記)を支持
しており、HBeAg個体はHBsAg、PreS2A
g、PreS1AgおよびHBV DNAの平均濃度が
高いけれども、HBeAg状態との定性的な相関が欠け
ていることを示している。
【0119】本発明の高感度イムノアッセイを用いて検
出した場合に、実質的にすべてのHBsAgキャリヤが
血清または血漿中に検出し得るPreS1およびPre
S2Agを有していることがわかった。それゆえ、本発
明のPreS Agアッセイは、Sタンパク質(HBs
Ag)特異的試験(モノクローナルアウスザイムR)と
同様の診断およびスクリーニング情報を与えることが明
らかである。HBsAg、PreS1、およびPreS
2抗原の定量は、Sタンパク質、Mタンパク質およびL
タンパク質の濃度がそれぞれ100μg/ml、10μ
g/mlおよび0.8μg/mlの閾値を越える個体は
HBeAg陽性でありHBV DNA陽性であるという
情報をも与える(感度=0.5pg/ml)。しかしな
がら、上記閾値に達しないB型肝炎ウイルスエンベロー
プ抗原濃度を有するHBV感染個体の大部分については
、抗HBe/HBeAg状態またはHBV DNA検出
可能性を正確に予測することができなかった。
出した場合に、実質的にすべてのHBsAgキャリヤが
血清または血漿中に検出し得るPreS1およびPre
S2Agを有していることがわかった。それゆえ、本発
明のPreS Agアッセイは、Sタンパク質(HBs
Ag)特異的試験(モノクローナルアウスザイムR)と
同様の診断およびスクリーニング情報を与えることが明
らかである。HBsAg、PreS1、およびPreS
2抗原の定量は、Sタンパク質、Mタンパク質およびL
タンパク質の濃度がそれぞれ100μg/ml、10μ
g/mlおよび0.8μg/mlの閾値を越える個体は
HBeAg陽性でありHBV DNA陽性であるという
情報をも与える(感度=0.5pg/ml)。しかしな
がら、上記閾値に達しないB型肝炎ウイルスエンベロー
プ抗原濃度を有するHBV感染個体の大部分については
、抗HBe/HBeAg状態またはHBV DNA検出
可能性を正確に予測することができなかった。
【0120】本発明の高親和性のPreS2およびPr
eS1モノクローナル抗体の他の用途としては、Lタン
パク質の肝細胞結合領域のマッピング、並びにHBV感
染肝細胞および実験的にトランスフェクションした肝細
胞株の細胞間および細胞表面染色が挙げられる。本発明
の低親和性のPreS1およびPreS2モノクローナ
ル抗体は、組換えによるまたは血漿由来のPreS2お
よびPreS1含有タンパク質を高収率でアフィニティ
ー精製するのに有効に使用することができた。
eS1モノクローナル抗体の他の用途としては、Lタン
パク質の肝細胞結合領域のマッピング、並びにHBV感
染肝細胞および実験的にトランスフェクションした肝細
胞株の細胞間および細胞表面染色が挙げられる。本発明
の低親和性のPreS1およびPreS2モノクローナ
ル抗体は、組換えによるまたは血漿由来のPreS2お
よびPreS1含有タンパク質を高収率でアフィニティ
ー精製するのに有効に使用することができた。
【0121】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ株の幾つかの試料は、特許手続き上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(AT
CC)(メリーランド20852、ロックビル、パーク
ローンドライブ、12301)に寄託してあり、その受
託番号を下記表8に示す。
イブリドーマ株の幾つかの試料は、特許手続き上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(AT
CC)(メリーランド20852、ロックビル、パーク
ローンドライブ、12301)に寄託してあり、その受
託番号を下記表8に示す。
【0122】
【表8】
表8
ハイブリドーマ
ATCC受託番号HBV 116−29−1
29 HBV 10118HBV 11
6−8−151 HBV 10119
HBV 116−86−293 HBV
10120HBV 50−80−194
HBV 10121HBV 116−34−
263 HBV 10122HBV 1
28−603−108 HBV 10445H
BV 115−32−181 HBV
10444HBV 128−410−194
HBV 10443
ATCC受託番号HBV 116−29−1
29 HBV 10118HBV 11
6−8−151 HBV 10119
HBV 116−86−293 HBV
10120HBV 50−80−194
HBV 10121HBV 116−34−
263 HBV 10122HBV 1
28−603−108 HBV 10445H
BV 115−32−181 HBV
10444HBV 128−410−194
HBV 10443
【図1】 HBVエンベロープのタンパク質組成を示
す模式図である。
す模式図である。
【図2】 本発明のHBVのサブタイプ決定法の一態
様を示す模式図である。
様を示す模式図である。
Claims (9)
- 【請求項1】 アミノ酸配列:TVNPVLTTAS
PLSSIFSRIGDPALNからなるB型肝炎ウイ
ルス(HBV)PreS2タンパク質の領域中のエピト
ープに結合するモノクローナル抗体であって、HBV
Mタンパク質には結合するが、HBV Sタンパク質ま
たはHBV Lタンパク質には結合しないモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項2】 放射活性ハロゲン原子である放射性同
位体または酵素からなる、検出可能な量の結合標識をさ
らに含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項3】 B型肝炎ウイルス(HBV)のサブタ
イプの決定法であって、(a)固定化B型肝炎ウイルス
表面抗原の試料の第一の部分を、HBV PreS1タ
ンパク質またはHBV PreS2タンパク質と結合し
検出可能な標識を含む第一のモノクローナル抗体と反応
させ、ついで (b)結合した標識第一モノクローナル抗体の量を計算
し、その際、該量は少なくとも1種のHBVサブタイプ
が存在しないことを示すものであることを特徴とする方
法。 - 【請求項4】 試料の第二の部分および第二のHBV
PreS1タンパク質または第二のHBV PreS
2タンパク質に結合し検出可能な標識を含む第二の標識
モノクローナル抗体を用いて工程(a)および(b)を
さらに繰り返すことにより、結合した標識第二モノクロ
ーナル抗体の量が少なくとも1種の別のHBVサブタイ
プが存在しないことを示すようにする、請求項3に記載
の方法。 - 【請求項5】 試料の第三の部分および第三のHBV
PreS1タンパク質または第三のHBV PreS
2タンパク質に結合し検出可能な標識を含む第三の標識
モノクローナル抗体を用いて工程(a)および(b)を
さらに繰り返すことにより、結合した標識第三モノクロ
ーナル抗体の量が1種以外のすべてのHBVサブタイプ
が存在しないことを示すようにする、請求項4に記載の
方法。 - 【請求項6】 各モノクローナル抗体をそれぞれ放射
性標識または酵素標識する、請求項3、4または5に記
載の方法。 - 【請求項7】 B型肝炎ウイルス表面抗原の固定化を
、B型肝炎ウイルス表面抗原に対するポリクローナル抗
体に結合させることによって行い、該ポリクローナル抗
体は固体支持体に固定化させたものである、請求項3、
4または5に記載の方法。 - 【請求項8】 B型肝炎ウイルス(HBV)のサブタ
イプの決定法であって、(a)固体表面上のそれぞれ別
々の領域に複数のモノクローナル抗体を固定化し、各モ
ノクローナル抗体が異なるHBV PreS1エピトー
プまたはHBV PreS2エピトープに結合するよう
にし、(b)それぞれ別々の領域の各モノクローナル抗
体をHBVを含有する試料の等量部と接触させることに
より、少なくとも幾つかの該複数の該モノクローナル抗
体と該HBVとの間に2量複合体を生成させ、 (c)それぞれ別々の各領域を、HBVのa抗原決定基
と結合し検出可能な標識を含む抗体と接触させて該標識
抗体と該2量複合体との間に3量複合体を生成させ、つ
いで (d)各領域に結合した標識の量を測定し、その際、各
領域に結合した標識の相対的な量は試料中のHBVの完
全なサブタイプを示すものであることを特徴とする方法
。 - 【請求項9】 複数のモノクローナル抗体が、HBV
PreS1エピトープに結合する少なくとも1種のモ
ノクローナル抗体およびPreS2エピトープに結合す
る少なくとも1種のモノクローナル抗体を含む、請求項
8に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US52228690A | 1990-05-11 | 1990-05-11 | |
US522,286 | 1990-05-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04228087A true JPH04228087A (ja) | 1992-08-18 |
Family
ID=24080257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3107401A Pending JPH04228087A (ja) | 1990-05-11 | 1991-05-13 | B型肝炎ウイルスエンベロープのPreS2およびPreS1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0456215A1 (ja) |
JP (1) | JPH04228087A (ja) |
KR (1) | KR910019642A (ja) |
AU (1) | AU646039B2 (ja) |
CA (1) | CA2041772A1 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08504954A (ja) * | 1993-04-28 | 1996-05-28 | ラッキー リミテッド | B型およびc型肝炎同時診断用診断キットおよび方法 |
JP2002528120A (ja) * | 1998-11-03 | 2002-09-03 | ヒルト,エーベルハルト | 細胞透過媒介性ポリペプチド |
WO2008053901A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | METHOD FOR ANALYSIS OF HEPATITIS B VIRUS s ANTIGEN |
JP2021503503A (ja) * | 2017-11-16 | 2021-02-12 | アンティジェネシス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーAntigenesis LLC | リソソーム誘発性免疫原性細胞死のシステムおよび方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU8630898A (en) * | 1997-06-27 | 1999-01-19 | Akzo Nobel N.V. | Antibodies and other binding molecules specific for hepatitis b viral antigens |
DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
WO2016188386A1 (en) * | 2015-05-22 | 2016-12-01 | Huahui Health Ltd. | Anti-Pre-S1 HBV Antibodies |
CN117214434B (zh) * | 2023-08-14 | 2024-05-14 | 吉林大学 | 一种基于HBV PreS1+PreS2区域蛋白分型试剂盒及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2637184A1 (fr) * | 1988-10-05 | 1990-04-06 | Inst Nat Sante Rech Med | Anticorps monoclonal reconnaissant une region pre-s1 de la grande proteine d'enveloppe du virus de l'hepatite b et ses applications, notamment pour le diagnostic in vitro et le traitement de l'hepatite b |
EP0389983A3 (en) * | 1989-03-31 | 1991-01-16 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies to pres2 and pres1 polypeptides of the hepatitis b viral envelope |
-
1991
- 1991-05-03 CA CA002041772A patent/CA2041772A1/en not_active Abandoned
- 1991-05-08 EP EP91107488A patent/EP0456215A1/en not_active Withdrawn
- 1991-05-10 AU AU76481/91A patent/AU646039B2/en not_active Ceased
- 1991-05-11 KR KR1019910007604A patent/KR910019642A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-05-13 JP JP3107401A patent/JPH04228087A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08504954A (ja) * | 1993-04-28 | 1996-05-28 | ラッキー リミテッド | B型およびc型肝炎同時診断用診断キットおよび方法 |
JP2002528120A (ja) * | 1998-11-03 | 2002-09-03 | ヒルト,エーベルハルト | 細胞透過媒介性ポリペプチド |
WO2008053901A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | METHOD FOR ANALYSIS OF HEPATITIS B VIRUS s ANTIGEN |
JP5261822B2 (ja) * | 2006-10-30 | 2013-08-14 | 株式会社先端生命科学研究所 | B型肝炎ウイルスs抗原の分析方法 |
US9052320B2 (en) | 2006-10-30 | 2015-06-09 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for analysis of hepatitis B virus s antigen |
JP2021503503A (ja) * | 2017-11-16 | 2021-02-12 | アンティジェネシス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーAntigenesis LLC | リソソーム誘発性免疫原性細胞死のシステムおよび方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU646039B2 (en) | 1994-02-03 |
CA2041772A1 (en) | 1991-11-12 |
KR910019642A (ko) | 1991-12-19 |
EP0456215A1 (en) | 1991-11-13 |
AU7648191A (en) | 1991-11-14 |
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