JPH04228087A - Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのＰｒｅＳ２およびＰｒｅＳ１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのＰｒｅＳ２およびＰｒｅＳ１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面
抗原のＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２に特異的に結合する
モノクローナル抗体、および該抗体を用いた試料中のＰ
ｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２のアッセイ法、およびＨＢＶ
のサブタイプの決定法に関する。
抗原のＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２に特異的に結合する
モノクローナル抗体、および該抗体を用いた試料中のＰ
ｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２のアッセイ法、およびＨＢＶ
のサブタイプの決定法に関する。
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｂ型
肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、世界中で主要な公衆衛
生の問題を呈示している。急性Ｂ型肝炎ウイルス感染お
よびその慢性後発症、たとえば肝硬変や肝癌などを防ぐ
最も効果的な方法は予防接種である。良好な結果の得ら
れているＢ型肝炎ワクチンは、非感染性の２２ｎｍの粒
子として慢性ウイルスキャリアの血液から単離されたＢ
型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなる。この
２２ｎｍの粒子は、主として２４，０００ｄの主要タン
パク質（ｐ２４）およびその糖付加体（ｇｐ２７）から
なる。最近になった導入されたワクチンは、ｐ２４をコ
ードするＨＢＶ遺伝子Ｓでトランスフェクションした酵
母細胞で合成されたｐ２４を含んでいる。これらワクチ
ンの安全性および有効性については確立されたが、その
免疫原性については、ある比率の受容者には不完全であ
る。それゆえ、免疫原性の一層大きいＨＢＶワクチンに
対する必要性が存在し、その同定のためにはＨＢＶタン
パク質上の抗原性部位の位置、構造および免疫原性につ
いての一層進んだ知見が必要である。
肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、世界中で主要な公衆衛
生の問題を呈示している。急性Ｂ型肝炎ウイルス感染お
よびその慢性後発症、たとえば肝硬変や肝癌などを防ぐ
最も効果的な方法は予防接種である。良好な結果の得ら
れているＢ型肝炎ワクチンは、非感染性の２２ｎｍの粒
子として慢性ウイルスキャリアの血液から単離されたＢ
型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなる。この
２２ｎｍの粒子は、主として２４，０００ｄの主要タン
パク質（ｐ２４）およびその糖付加体（ｇｐ２７）から
なる。最近になった導入されたワクチンは、ｐ２４をコ
ードするＨＢＶ遺伝子Ｓでトランスフェクションした酵
母細胞で合成されたｐ２４を含んでいる。これらワクチ
ンの安全性および有効性については確立されたが、その
免疫原性については、ある比率の受容者には不完全であ
る。それゆえ、免疫原性の一層大きいＨＢＶワクチンに
対する必要性が存在し、その同定のためにはＨＢＶタン
パク質上の抗原性部位の位置、構造および免疫原性につ
いての一層進んだ知見が必要である。
【０００２】ＨＢＶエンベロープのタンパク質組成はす
でに決定され、ウイルスゲノム中でのマッピングもなさ
れている。図１は、ヘルマンらによって提唱されたモデ
ルをまとめたものである［ヘルマン（Ｎ．Ｈｅｒｒｍａ
ｎｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２、３９６（１９８４
）］。このモデルにおいて、３つのＨＢＶエンベロープ
タンパク質およびその糖付加体は１つの連続したオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来し、該フレー
ムはＳ領域、ＰｒｅＳ２領域およびＰｒｅＳ１領域に分
割されている。このＳ遺伝子は、ウイルスのサブタイプ
に依存して上記ＯＲＦの第三または第四の開始コドンか
ら始まり、主要なＨＢＶエンベロープタンパク質である
Ｓタンパク質（ｐ２４およびその糖付加体であるｇｐ２
７を含む）をコードしている。ＰｒｅＳ領域には同じ読
み取り枠中にさらに２つの開始部位が含まれており、そ
のためＳ遺伝子は２つの一層大きなＢ型肝炎ウイルス表
面抗原分子、すなわちＭタンパク質（ＰｒｅＳ２＋Ｓの
５５のアミノ酸からなる）およびＬタンパク質（Ｐｒｅ
Ｓ１＋ＰｒｅＳ２＋Ｓタンパク質の１０８または１１９
アミノ酸からなる）を発現することができる。Ｍタンパ
ク質は、１カ所が糖付加された形態（ｇｐ３３）と２カ
所が糖付加された形態（ｇｐ３６）からなる。Ｌタンパ
ク質は、糖付加されていない形態（ｇｐ３９）と１カ所
が糖付加された形態（ｇｐ４１）からなる。
でに決定され、ウイルスゲノム中でのマッピングもなさ
れている。図１は、ヘルマンらによって提唱されたモデ
ルをまとめたものである［ヘルマン（Ｎ．Ｈｅｒｒｍａ
ｎｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２、３９６（１９８４
）］。このモデルにおいて、３つのＨＢＶエンベロープ
タンパク質およびその糖付加体は１つの連続したオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来し、該フレー
ムはＳ領域、ＰｒｅＳ２領域およびＰｒｅＳ１領域に分
割されている。このＳ遺伝子は、ウイルスのサブタイプ
に依存して上記ＯＲＦの第三または第四の開始コドンか
ら始まり、主要なＨＢＶエンベロープタンパク質である
Ｓタンパク質（ｐ２４およびその糖付加体であるｇｐ２
７を含む）をコードしている。ＰｒｅＳ領域には同じ読
み取り枠中にさらに２つの開始部位が含まれており、そ
のためＳ遺伝子は２つの一層大きなＢ型肝炎ウイルス表
面抗原分子、すなわちＭタンパク質（ＰｒｅＳ２＋Ｓの
５５のアミノ酸からなる）およびＬタンパク質（Ｐｒｅ
Ｓ１＋ＰｒｅＳ２＋Ｓタンパク質の１０８または１１９
アミノ酸からなる）を発現することができる。Ｍタンパ
ク質は、１カ所が糖付加された形態（ｇｐ３３）と２カ
所が糖付加された形態（ｇｐ３６）からなる。Ｌタンパ
ク質は、糖付加されていない形態（ｇｐ３９）と１カ所
が糖付加された形態（ｇｐ４１）からなる。
【０００３】ＨＢＶ感染者の血液中では、全Ｂ型肝炎ウ
イルス表面抗原のうちごくわずかが完全なビリオン（デ
イン粒子）として存在するにすぎない。他の２つの形態
である２２ｎｍの球形粒子および直径が２２ｎｍで種々
の長さのフィラメントはカプシドまたはＤＮＡを欠いて
おり、４２ｎｍの「デイン」粒子に比べて１×１０６：
１もの過剰量で産生される。これら形態のタンパク質組
成はかなり異なっている。ＨＢＶデイン粒子中の全エン
ベロープタンパク質の２０％までがＬタンパク質である
のに対して、２２ｎｍ球形粒子中の全タンパク質の約１
％のみがＬタンパク質である。
イルス表面抗原のうちごくわずかが完全なビリオン（デ
イン粒子）として存在するにすぎない。他の２つの形態
である２２ｎｍの球形粒子および直径が２２ｎｍで種々
の長さのフィラメントはカプシドまたはＤＮＡを欠いて
おり、４２ｎｍの「デイン」粒子に比べて１×１０６：
１もの過剰量で産生される。これら形態のタンパク質組
成はかなり異なっている。ＨＢＶデイン粒子中の全エン
ベロープタンパク質の２０％までがＬタンパク質である
のに対して、２２ｎｍ球形粒子中の全タンパク質の約１
％のみがＬタンパク質である。
【０００４】トランスフェクションした細胞中でのＬタ
ンパク質の過剰産生は、これら細胞からのＬタンパク質
粒子の分泌を抑制する結果を招く。Ｌタンパク質は、分
泌および完全ビリオンの形態形成に重要な役割を果して
いるかもしれないという仮説が出されている。
ンパク質の過剰産生は、これら細胞からのＬタンパク質
粒子の分泌を抑制する結果を招く。Ｌタンパク質は、分
泌および完全ビリオンの形態形成に重要な役割を果して
いるかもしれないという仮説が出されている。
【０００５】Ｌタンパク質のＰｒｅＳ１領域は、Ｈｅｐ
Ｇ２細胞に結合する能力を有することから示されるよ
うに、ヒト肝細胞に対する特異的レセプターを含んでい
るかもしれない［ノイラート（Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈ
）ら、Ｃｅｌｌ、４６、４２９（１９８６）］。重合ヒ
ト血清アルブミンに対するＰｒｅＳ２領域の特異的結合
もまた、ＨＢＶが肝細胞原形質膜に結合するための可能
な機構として提唱されている［イマイ（Ｍ．Ｉｍａｉ）
ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、７６、２４２
（１９７９）］。
Ｇ２細胞に結合する能力を有することから示されるよ
うに、ヒト肝細胞に対する特異的レセプターを含んでい
るかもしれない［ノイラート（Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈ
）ら、Ｃｅｌｌ、４６、４２９（１９８６）］。重合ヒ
ト血清アルブミンに対するＰｒｅＳ２領域の特異的結合
もまた、ＨＢＶが肝細胞原形質膜に結合するための可能
な機構として提唱されている［イマイ（Ｍ．Ｉｍａｉ）
ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、７６、２４２
（１９７９）］。
【０００６】ウイルスの構造または機能におけるＰｒｅ
Ｓ含有タンパク質の役割にもかかわらず、ＰｒｅＳ１お
よびＰｒｅＳ２タンパク質はマウスにおいて高度に免疫
原性であることが示されており、これらタンパク質がＳ
タンパク質と組み合わされるとＳタンパク質に対する免
疫応答が増強されることが示されている［ミリッヒ（Ｄ
．Ｒ．Ｍｉｌｉｃｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８、１
１９５（１９９５）］。 ＰｒｅＳ２領域の一部のみを含有する合成ペプチドワク
チンはＰｒｅＳ２に対する免疫応答を示し、接種したチ
ンパンジーをウイルスによる攻撃後にＨＢＶ感染から防
御した［ノイラートら、Ｖａｃｃｉｎｅ、４、３５（１
９８６）］。現在利用できるＢ型肝炎ワクチンはＰｒｅ
Ｓ組成がかなり異なっており、ヒトにおけるＰｒｅＳ含
有ワクチンの相対的な免疫原性はいまだ解明されていな
い。
Ｓ含有タンパク質の役割にもかかわらず、ＰｒｅＳ１お
よびＰｒｅＳ２タンパク質はマウスにおいて高度に免疫
原性であることが示されており、これらタンパク質がＳ
タンパク質と組み合わされるとＳタンパク質に対する免
疫応答が増強されることが示されている［ミリッヒ（Ｄ
．Ｒ．Ｍｉｌｉｃｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８、１
１９５（１９９５）］。 ＰｒｅＳ２領域の一部のみを含有する合成ペプチドワク
チンはＰｒｅＳ２に対する免疫応答を示し、接種したチ
ンパンジーをウイルスによる攻撃後にＨＢＶ感染から防
御した［ノイラートら、Ｖａｃｃｉｎｅ、４、３５（１
９８６）］。現在利用できるＢ型肝炎ワクチンはＰｒｅ
Ｓ組成がかなり異なっており、ヒトにおけるＰｒｅＳ含
有ワクチンの相対的な免疫原性はいまだ解明されていな
い。
【０００７】アウスリア（Ａｕｓｒｉａ）ＲＩＩ、アウ
スザイムＲＩＩおよびモノクローナルアウスザイムＲは
、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出のた
めに現在利用できるアッセイである（アボット・ラボラ
トリーズ、ノースシカゴ、ＩＬ）。モノクローナルアウ
スザイムはタンパク質Ｓに対するモノクローナル抗体の
みを使用する。これらのＨＢｓＡｇアッセイは、Ｌタン
パク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質を識別するこ
とができない。
スザイムＲＩＩおよびモノクローナルアウスザイムＲは
、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出のた
めに現在利用できるアッセイである（アボット・ラボラ
トリーズ、ノースシカゴ、ＩＬ）。モノクローナルアウ
スザイムはタンパク質Ｓに対するモノクローナル抗体の
みを使用する。これらのＨＢｓＡｇアッセイは、Ｌタン
パク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質を識別するこ
とができない。
【０００８】抗ＨＢｓ検出および定量のための市販の直
接固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、１９７５年
から利用されている（ＡＵＳＡＢ、アボット・ラボラト
リーズ）［ムシャウオー（Ｉ．Ｋ．Ｍｕｓｈａｈｗａｒ
）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２、７７（１９７８
）］。このアッセイでは、ヒト血漿由来のＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原（ｈｐＨＢｓＡｇ）をコーティングした固
相（ポリスチレンビーズ）とともに血清または血漿試料
をインキュベートする。血清中にＨＢｓＡｇに対する抗
体（抗ＨＢｓ）が存在しておれば、それら抗体は固相抗
原に結合するであろう。第二の工程において、放射性標
識したＨＢｓＡｇ（１２５Ｉ−ＨＢｓＡｇ）を加え、上
記固定化抗体と反応させる。固相に結合した放射性標識
の量は、適度に、最初の試料中の抗ＨＢｓの量に正比例
する。
接固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、１９７５年
から利用されている（ＡＵＳＡＢ、アボット・ラボラト
リーズ）［ムシャウオー（Ｉ．Ｋ．Ｍｕｓｈａｈｗａｒ
）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２、７７（１９７８
）］。このアッセイでは、ヒト血漿由来のＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原（ｈｐＨＢｓＡｇ）をコーティングした固
相（ポリスチレンビーズ）とともに血清または血漿試料
をインキュベートする。血清中にＨＢｓＡｇに対する抗
体（抗ＨＢｓ）が存在しておれば、それら抗体は固相抗
原に結合するであろう。第二の工程において、放射性標
識したＨＢｓＡｇ（１２５Ｉ−ＨＢｓＡｇ）を加え、上
記固定化抗体と反応させる。固相に結合した放射性標識
の量は、適度に、最初の試料中の抗ＨＢｓの量に正比例
する。
【０００９】この試験の酵素結合イムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）態様は１９８３年から利用されており、プローブ「
検出」試薬としてアビジン混合物に結合させたビオチン
化ＨＢｓＡｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
を使用している［ムシャウオーら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、１６、１（１９８７）］。この試験の改
良形態では、ビオチン／アビジン検出試薬の代わりにビ
オチン／抗ビオチン検出系を採用している［ムシャウオ
ー、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６、４５（１
９８７）］。
Ａ）態様は１９８３年から利用されており、プローブ「
検出」試薬としてアビジン混合物に結合させたビオチン
化ＨＢｓＡｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
を使用している［ムシャウオーら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、１６、１（１９８７）］。この試験の改
良形態では、ビオチン／アビジン検出試薬の代わりにビ
オチン／抗ビオチン検出系を採用している［ムシャウオ
ー、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６、４５（１
９８７）］。
【００１０】しかしながら、これらアッセイは主として
抗Ｓ抗体を検出する。これらアッセイは抗ＰｒｅＳ１抗
体または抗ＰｒｅＳ２抗体を検出することができず、抗
ＰｒｅＳ１抗体、抗ＰｒｅＳ２抗体または抗Ｓ抗体を主
として含有する試料を識別することはできない。何人か
の研究者は、ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２に対する抗体
がしばしばヒトにおけるＨＢＶ感染に対する最も初期の
抗体応答であること、ウイルスクリアランスに関連して
いるかもしれないこと、および中和抗体として働くかも
しれないことを報告しており、そのためＰｒｅＳ１およ
びＰｒｅＳ２の両タンパク質および該タンパク質に対す
る抗体を検出することのできるアッセイに対する必要性
が存在する。そのようなアッセイは、ＰｒｅＳ含有ワク
チンで免疫したワクチン接種者をモニターするのに用い
ることができる。［たとえば、クリンカート（Ｋｌｉｎ
ｋｅｒｔ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５８、５２２（１９
８６）参照］。
抗Ｓ抗体を検出する。これらアッセイは抗ＰｒｅＳ１抗
体または抗ＰｒｅＳ２抗体を検出することができず、抗
ＰｒｅＳ１抗体、抗ＰｒｅＳ２抗体または抗Ｓ抗体を主
として含有する試料を識別することはできない。何人か
の研究者は、ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２に対する抗体
がしばしばヒトにおけるＨＢＶ感染に対する最も初期の
抗体応答であること、ウイルスクリアランスに関連して
いるかもしれないこと、および中和抗体として働くかも
しれないことを報告しており、そのためＰｒｅＳ１およ
びＰｒｅＳ２の両タンパク質および該タンパク質に対す
る抗体を検出することのできるアッセイに対する必要性
が存在する。そのようなアッセイは、ＰｒｅＳ含有ワク
チンで免疫したワクチン接種者をモニターするのに用い
ることができる。［たとえば、クリンカート（Ｋｌｉｎ
ｋｅｒｔ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５８、５２２（１９
８６）参照］。
【００１１】ヘスら［Ｌｉｖｅｒ、７、２４５（１９８
７）］は、ＨＢＶにより誘導された細胞病理と肝臓生検
からの細胞中のＰｒｅＳ１染色の存在との間の関係を示
したが、ＰｒｅＳ１発現の可能な病原的役割は未知であ
る。 アルバーチら［Ｈｅｐａｔｏｌ．，７、２０７（１９８
７）］は、ＰｒｅＳ２に対する抗体の存在がウイルス複
製の終了および回復の開始の形跡と関連することを見出
した。それゆえ、暴露個体またはＨＢＶ患者へのＰｒｅ
Ｓ１抗体および／またはＰｒｅＳ２抗体の投与は、高度
免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）を使用した現在の治療法に
とって重要な補助になるであろう。幾つかのＨＢＩＧ調
製物にはＰｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２に対する
抗体が含まれているので、これら抗体の量を決定するこ
とのできるアッセイに対する必要性が存在する。
７）］は、ＨＢＶにより誘導された細胞病理と肝臓生検
からの細胞中のＰｒｅＳ１染色の存在との間の関係を示
したが、ＰｒｅＳ１発現の可能な病原的役割は未知であ
る。 アルバーチら［Ｈｅｐａｔｏｌ．，７、２０７（１９８
７）］は、ＰｒｅＳ２に対する抗体の存在がウイルス複
製の終了および回復の開始の形跡と関連することを見出
した。それゆえ、暴露個体またはＨＢＶ患者へのＰｒｅ
Ｓ１抗体および／またはＰｒｅＳ２抗体の投与は、高度
免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）を使用した現在の治療法に
とって重要な補助になるであろう。幾つかのＨＢＩＧ調
製物にはＰｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２に対する
抗体が含まれているので、これら抗体の量を決定するこ
とのできるアッセイに対する必要性が存在する。
【００１２】ＨＢｓＡｇもまた抗原として複雑であり、
群特異的な「ａ」抗原決定基（すべてのＨＢｓＡｇ粒子
上に存在するものとして定義される）および２セットの
通常相互に排除的なサブタイプ特異的抗原決定基である
ｄ／ｙとｗ／ｒとを含んでいる。このことから、ａｄｗ
、ａｄｒ、ａｙｗおよびａｙｒというＨＢｓＡｇの４つ
の主要なサブタイプが得られる。さらに別の抗原決定基
も記載されており、１０の異なるＨＢｓＡｇサブタイプ
の普遍的認識が得られる。たとえば、これらサブタイプ
のうちの２つはａｄｙｗおよびａｄｙｗｒとして表され
、この場合、「ｄ」と「ｙ」または「ｗ」と「ｒ」の両
方が同じ試料中に存在する。ＰｒｅＳ２の５つの異なる
ＨＢＶサブタイプのアミノ酸配列がノイラートらにより
示されている［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４、３９２（１９
８４）］。しかしながら、現在までに報告されている抗
ＰｒｅＳ１および抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体はＨ
ＢＶサブタイプを識別することができず、ＨＢＶ株の中
でＤＮＡ配列のどの変化が抗原性の変異となって現れる
のかはわかっていない。
群特異的な「ａ」抗原決定基（すべてのＨＢｓＡｇ粒子
上に存在するものとして定義される）および２セットの
通常相互に排除的なサブタイプ特異的抗原決定基である
ｄ／ｙとｗ／ｒとを含んでいる。このことから、ａｄｗ
、ａｄｒ、ａｙｗおよびａｙｒというＨＢｓＡｇの４つ
の主要なサブタイプが得られる。さらに別の抗原決定基
も記載されており、１０の異なるＨＢｓＡｇサブタイプ
の普遍的認識が得られる。たとえば、これらサブタイプ
のうちの２つはａｄｙｗおよびａｄｙｗｒとして表され
、この場合、「ｄ」と「ｙ」または「ｗ」と「ｒ」の両
方が同じ試料中に存在する。ＰｒｅＳ２の５つの異なる
ＨＢＶサブタイプのアミノ酸配列がノイラートらにより
示されている［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４、３９２（１９
８４）］。しかしながら、現在までに報告されている抗
ＰｒｅＳ１および抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体はＨ
ＢＶサブタイプを識別することができず、ＨＢＶ株の中
でＤＮＡ配列のどの変化が抗原性の変異となって現れる
のかはわかっていない。
【００１３】このような混合サブタイプは、おそらく別
の遺伝子型の２種または３種以上のウイルスに細胞が感
染することによるものと思われる。得られる混合表現型
は、異なるサブタイプの粒子の混合物としてかまたは両
方のサブタイプを含有する粒子として現れる。各粒子上
に両方のサブタイプの抗原決定基が存在する場合は、こ
の混合サブタイプ粒子は単なる表現型の混合、すなわち
ウイルスエンベロープの組み立てにおいて、２つの異な
るウイルスＳ遺伝子によりコードされるｐ２５およびｇ
ｐ３０タンパク質という２つの異なるサブタイプを混合
することにより得られるものと思われる。それゆえ、こ
のタンパク質の両方の形態からなる粒子は、両方のサブ
タイプ抗原決定基を有している。ウイルスが伝播される
と、別のサブタイプを有する粒子が生成されるであろう
［ポール（Ｄ．Ａ．Ｐａｕｌ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、１３、４３（１９８６）］。この複雑さ
のため、感染個体のＨＢｓＡｇサブタイプの決定法に対
する必要性がなお存在する。 ＨＢＶのサブタイプを決定することができれば、偶発的
および周産期伝播の場合の個体群間および個体間におけ
るＨＢＶ感染ルートを後付けることができる。
の遺伝子型の２種または３種以上のウイルスに細胞が感
染することによるものと思われる。得られる混合表現型
は、異なるサブタイプの粒子の混合物としてかまたは両
方のサブタイプを含有する粒子として現れる。各粒子上
に両方のサブタイプの抗原決定基が存在する場合は、こ
の混合サブタイプ粒子は単なる表現型の混合、すなわち
ウイルスエンベロープの組み立てにおいて、２つの異な
るウイルスＳ遺伝子によりコードされるｐ２５およびｇ
ｐ３０タンパク質という２つの異なるサブタイプを混合
することにより得られるものと思われる。それゆえ、こ
のタンパク質の両方の形態からなる粒子は、両方のサブ
タイプ抗原決定基を有している。ウイルスが伝播される
と、別のサブタイプを有する粒子が生成されるであろう
［ポール（Ｄ．Ａ．Ｐａｕｌ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、１３、４３（１９８６）］。この複雑さ
のため、感染個体のＨＢｓＡｇサブタイプの決定法に対
する必要性がなお存在する。 ＨＢＶのサブタイプを決定することができれば、偶発的
および周産期伝播の場合の個体群間および個体間におけ
るＨＢＶ感染ルートを後付けることができる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＢＶエンベ
ロープのＰｒｅＳ１タンパク質の少なくとも３つの区別
されるエピトープおよびＰｒｅＳ２タンパク質の少なく
とも４つの区別されるエピトープを定める２つのパネル
のモノクローナル抗体を提供する。これらモノクローナ
ル抗体群のうち６つのものについてのイソタイプおよび
結合特性を以下に詳細に記載する。これらモノクローナ
ル抗体群のうちの５つのもののエピトープ特異性を下記
表１にまとめて示す。
ロープのＰｒｅＳ１タンパク質の少なくとも３つの区別
されるエピトープおよびＰｒｅＳ２タンパク質の少なく
とも４つの区別されるエピトープを定める２つのパネル
のモノクローナル抗体を提供する。これらモノクローナ
ル抗体群のうち６つのものについてのイソタイプおよび
結合特性を以下に詳細に記載する。これらモノクローナ
ル抗体群のうちの５つのもののエピトープ特異性を下記
表１にまとめて示す。
【００１５】
【表１】
表１（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２タンパク質に対
するモノクローナル抗体）ＰｒｅＳ１ 含まれるエピ
トープａ Ｌ結合 Ｍ結合 Ｓ
結合 群１ ２７〜３５
＋ −
− 群２ ７２〜７８
＋ −
−ＰｒｅＳ２ 群１ １２０〜１４５
＋ ＋ −
群２ １２３（＋グリカン）
− ＋ − 群３
１５０〜１７４ −
＋ −（ａ）ノイラー
トらのＣｅｌｌ、４６、４２９（１９８６）による１図
において、ＰｒｅＳ１メチオニンから下流にあるアミノ
酸位置
するモノクローナル抗体）ＰｒｅＳ１ 含まれるエピ
トープａ Ｌ結合 Ｍ結合 Ｓ
結合 群１ ２７〜３５
＋ −
− 群２ ７２〜７８
＋ −
−ＰｒｅＳ２ 群１ １２０〜１４５
＋ ＋ −
群２ １２３（＋グリカン）
− ＋ − 群３
１５０〜１７４ −
＋ −（ａ）ノイラー
トらのＣｅｌｌ、４６、４２９（１９８６）による１図
において、ＰｒｅＳ１メチオニンから下流にあるアミノ
酸位置
【００１６】これらエピトープはＰｒｅＳ１またはＰｒ
ｅＳ２特異的である。すなわち、これらエピトープは、
ＨＢｓＡｇ含有試料（たとえば、デイン粒子など）を処
理して本質的にＳタンパク質のすべての抗原性を破壊し
た後にも保持される。これらエピトープはＨＢＶ抗体ア
ッセイにおいても有用であるため、これらもその標識形
とともに本発明の範囲に含まれる。各群からのモノクロ
ーナル抗体の幾つかはそれらのエピトープに対して「高
親和性」結合（Ｋ＝１０９〜１０１２）を示す。これら
モノクローナル抗体は、本発明のこの側面での好ましい
態様を表す。
ｅＳ２特異的である。すなわち、これらエピトープは、
ＨＢｓＡｇ含有試料（たとえば、デイン粒子など）を処
理して本質的にＳタンパク質のすべての抗原性を破壊し
た後にも保持される。これらエピトープはＨＢＶ抗体ア
ッセイにおいても有用であるため、これらもその標識形
とともに本発明の範囲に含まれる。各群からのモノクロ
ーナル抗体の幾つかはそれらのエピトープに対して「高
親和性」結合（Ｋ＝１０９〜１０１２）を示す。これら
モノクローナル抗体は、本発明のこの側面での好ましい
態様を表す。
【００１７】本明細書に記載するように、ＰｒｅＳ１お
よびＰｒｅＳ２タンパク質の領域を含むエピトープは、
少なくともその一部は表１に示した領域のアミノ酸配列
によって含まれ、また該領域の側面または隣接するアミ
ノ酸配列をも含む。
よびＰｒｅＳ２タンパク質の領域を含むエピトープは、
少なくともその一部は表１に示した領域のアミノ酸配列
によって含まれ、また該領域の側面または隣接するアミ
ノ酸配列をも含む。
【００１８】イムノアッセイ
１．抗原アッセイ
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト血液や血漿などの
生理学的物質中のＨＢＶおよびＨＢｓＡｇを検出するた
めの特異的で感度に良いイムノアッセイを開発するため
に使用することができる。抗Ｓに基づいた検出系（モノ
クローナルアウスザイムＲアッセイなど）では反応しな
いほどにＨＢＶ変異体が既知の変異体とは異なっている
場合は、本発明の抗ＰｒｅＳに基づいた抗原検出アッセ
イを用いて当該試料をスクリーニングすることができる
。
生理学的物質中のＨＢＶおよびＨＢｓＡｇを検出するた
めの特異的で感度に良いイムノアッセイを開発するため
に使用することができる。抗Ｓに基づいた検出系（モノ
クローナルアウスザイムＲアッセイなど）では反応しな
いほどにＨＢＶ変異体が既知の変異体とは異なっている
場合は、本発明の抗ＰｒｅＳに基づいた抗原検出アッセ
イを用いて当該試料をスクリーニングすることができる
。
【００１９】本発明のモノクローナル抗体を用いて開発
した一つのアッセイはサンドイッチ型のラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）であり、この場合、ＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２タ
ンパク質（たとえば、Ｌおよび／またはＭタンパク質と
して）を含有する液体試料を、これらタンパク質に対す
る「捕捉抗体」（モノクローナルであってもポリクロー
ナルであってもよい）を含む固相と反応させる。捕捉抗
体はＳタンパク質領域に結合する抗体であってもよいし
、またはＰｒｅＳ１もしくはＰｒｅＳ２領域中のエピト
ープに特異的に結合する本発明のモノクローナル抗体で
あってもよい。
した一つのアッセイはサンドイッチ型のラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）であり、この場合、ＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２タ
ンパク質（たとえば、Ｌおよび／またはＭタンパク質と
して）を含有する液体試料を、これらタンパク質に対す
る「捕捉抗体」（モノクローナルであってもポリクロー
ナルであってもよい）を含む固相と反応させる。捕捉抗
体はＳタンパク質領域に結合する抗体であってもよいし
、またはＰｒｅＳ１もしくはＰｒｅＳ２領域中のエピト
ープに特異的に結合する本発明のモノクローナル抗体で
あってもよい。
【００２０】ついで、捕捉したＰｒｅＳ１および／また
はＰｒｅＳ２含有タンパク質を、放射性同位体や酵素な
どの検出可能な標識を結合した本発明の抗ＰｒｅＳ１ま
たは抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体と反応させて検出
および測定する。別法として、「検出抗体」は、検出可
能な標識のための結合部位を有していてもよく、この結
合した検出モノクローナル抗体に別の工程で検出可能な
標識を加える。検出可能な標識のための結合部位は、検
出抗体に対する第三の標識抗体によって結合されるエピ
トープであってよい。たとえば、結合マウスモノクロー
ナル抗体（たとえば、本発明のモノクローナル抗体など
）を検出するために酵素標識抗マウス抗体を使用するこ
とができる。ついで、たとえば放射性標識の場合は毎分
放射能数（ｃｐｍ）で、酵素標識により触媒した発色反
応の場合は吸光度（Ａ）単位で、捕捉ＰｒｅＳ１または
ＰｒｅＳ２含有タンパク質に結合した標識の量を測定し
、標準ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２含有試料と相関させ
て試料中に存在するＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２含有タ
ンパク質の量を測定する。
はＰｒｅＳ２含有タンパク質を、放射性同位体や酵素な
どの検出可能な標識を結合した本発明の抗ＰｒｅＳ１ま
たは抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体と反応させて検出
および測定する。別法として、「検出抗体」は、検出可
能な標識のための結合部位を有していてもよく、この結
合した検出モノクローナル抗体に別の工程で検出可能な
標識を加える。検出可能な標識のための結合部位は、検
出抗体に対する第三の標識抗体によって結合されるエピ
トープであってよい。たとえば、結合マウスモノクロー
ナル抗体（たとえば、本発明のモノクローナル抗体など
）を検出するために酵素標識抗マウス抗体を使用するこ
とができる。ついで、たとえば放射性標識の場合は毎分
放射能数（ｃｐｍ）で、酵素標識により触媒した発色反
応の場合は吸光度（Ａ）単位で、捕捉ＰｒｅＳ１または
ＰｒｅＳ２含有タンパク質に結合した標識の量を測定し
、標準ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２含有試料と相関させ
て試料中に存在するＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２含有タ
ンパク質の量を測定する。
【００２１】たとえば、本発明のモノクローナル抗体を
用いて開発したＰｒｅＳ１抗原アッセイを下記表２にま
とめて示す。
用いて開発したＰｒｅＳ１抗原アッセイを下記表２にま
とめて示す。
【表２】
表２
固相上の捕捉抗体
検出モノクローナル抗体（ａ）群１Ｐｒ
ｅＳ１
群２ＰｒｅＳ１（ｂ）ポリクローナルアウスザイムＲＩ
Ｉ 群１ＰｒｅＳ１ （モルモット；高度
免疫血清）（ｃ）群１ＰｒｅＳ１
群１ＰｒｅＳ１（ｄ）群２Ｐ
ｒｅＳ１
群２ＰｒｅＳ１（ｅ）アウスザイムＲＩＩ（ポリクロ
ーナル） 群１＋群２ＰｒｅＳ１（ｆ）モノクローナ
ルアウスザイムＲ（Ｓタン 群１および／または群２
パク質に対するモノクローナル抗体） Ｐｒ
ｅＳ１
検出モノクローナル抗体（ａ）群１Ｐｒ
ｅＳ１
群２ＰｒｅＳ１（ｂ）ポリクローナルアウスザイムＲＩ
Ｉ 群１ＰｒｅＳ１ （モルモット；高度
免疫血清）（ｃ）群１ＰｒｅＳ１
群１ＰｒｅＳ１（ｄ）群２Ｐ
ｒｅＳ１
群２ＰｒｅＳ１（ｅ）アウスザイムＲＩＩ（ポリクロ
ーナル） 群１＋群２ＰｒｅＳ１（ｆ）モノクローナ
ルアウスザイムＲ（Ｓタン 群１および／または群２
パク質に対するモノクローナル抗体） Ｐｒ
ｅＳ１
【００２２】ＰｒｅＳ２抗原アッセイもまた、群
１、２、および／または３モノクローナル抗体ＰｒｅＳ
２を組み合わせてまたは単独でアウスザイムＲＩＩまた
はモノクローナルアウスザイムＲビーズとともに、また
は固相に結合したＰｒｅＳ２モノクローナル抗体ととも
に用いて開発した。
１、２、および／または３モノクローナル抗体ＰｒｅＳ
２を組み合わせてまたは単独でアウスザイムＲＩＩまた
はモノクローナルアウスザイムＲビーズとともに、また
は固相に結合したＰｒｅＳ２モノクローナル抗体ととも
に用いて開発した。
【００２３】有用な固相としては、アウスザイムＲアッ
セイに使用するようなポリスチレンビーズなどのプラス
チックビーズ；プラスチックマイクロタイタープレート
ウエル、および中空繊維およびシートなどの他のプラス
チック細胞培養基体；紙、フェルトまたは合成繊維から
製造したような織物の繊維状固相または不織繊維状固相
、ラテックス微細粒子、シリカなどの多孔性セラミック
ビーズ、アルミナ、ＺｒＯ２ビーズなどが挙げられる。 捕捉抗体は、これら基体上または基体中に物理的に吸収
させることもできるし、または当該技術分野で知られた
共有結合法により結合させることもできる。
セイに使用するようなポリスチレンビーズなどのプラス
チックビーズ；プラスチックマイクロタイタープレート
ウエル、および中空繊維およびシートなどの他のプラス
チック細胞培養基体；紙、フェルトまたは合成繊維から
製造したような織物の繊維状固相または不織繊維状固相
、ラテックス微細粒子、シリカなどの多孔性セラミック
ビーズ、アルミナ、ＺｒＯ２ビーズなどが挙げられる。 捕捉抗体は、これら基体上または基体中に物理的に吸収
させることもできるし、または当該技術分野で知られた
共有結合法により結合させることもできる。
【００２４】検出モノクローナル抗体は、当該技術分野
で知られた幾つかの方法のいずれによって標識してもよ
い。ファトヌー（Ｆｅｔｅａｎｕ）らの「ラベルド・ア
ンタイボディーズ・イン・バイオロジー・アンド・メデ
ィスン（Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２１４
〜３０９頁（マックグローヒル、ニューヨーク）（１９
７８）」には広範囲の標識法が開示されている。種々の
金属放射性同位元素は、ハントウイッチ（Ｄ．Ｊ．Ｈｎ
ａｔｏｗｉｃｈ）ら［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２０、６１３
（１９８３）］；ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら［Ｊ．Ｎ
ｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２０、４２８（１９７９）］；サン
ドバーグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）ら［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．，１７、１３０４（１９７４）］；およびサハ（Ｓ
ａｈａ）［Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，６、５４２（１９
７６）］らの方法に従って導入することができる。
で知られた幾つかの方法のいずれによって標識してもよ
い。ファトヌー（Ｆｅｔｅａｎｕ）らの「ラベルド・ア
ンタイボディーズ・イン・バイオロジー・アンド・メデ
ィスン（Ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２１４
〜３０９頁（マックグローヒル、ニューヨーク）（１９
７８）」には広範囲の標識法が開示されている。種々の
金属放射性同位元素は、ハントウイッチ（Ｄ．Ｊ．Ｈｎ
ａｔｏｗｉｃｈ）ら［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２０、６１３
（１９８３）］；ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら［Ｊ．Ｎ
ｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２０、４２８（１９７９）］；サン
ドバーグ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ）ら［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．，１７、１３０４（１９７４）］；およびサハ（Ｓ
ａｈａ）［Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，６、５４２（１９
７６）］らの方法に従って導入することができる。
【００２５】使用した放射性同位元素のうち、Ｘ線エミ
ッター、ガンマ線エミッター、陽電子エミッター、およ
び蛍光エミッターが抗体の検出には適している。抗体を
標識するのに好ましい放射性同位元素としては、ヨウ素
１２５、１３１または１２３、インジウム１１１、ルテ
ニウム９７、銅６７、およびテクネチウム９９が挙げら
れる。ハロゲンは、多かれ少なかれ交換して使用するこ
とができる。
ッター、ガンマ線エミッター、陽電子エミッター、およ
び蛍光エミッターが抗体の検出には適している。抗体を
標識するのに好ましい放射性同位元素としては、ヨウ素
１２５、１３１または１２３、インジウム１１１、ルテ
ニウム９７、銅６７、およびテクネチウム９９が挙げら
れる。ハロゲンは、多かれ少なかれ交換して使用するこ
とができる。
【００２６】好ましい標識法の一つには、酸化的方法を
用いてヨウ素−１３１（Ｉ−１３１）かまたはヨウ素−
１２５（Ｉ−１２５）のいずれかで標識することが含ま
れ、その際、たとえばグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏ
ｏｄ）ら［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８９、１１４（１９
６３）］により報告されマッコナヘイ（ＭｃＣｏｎａｈ
ａｙ）ら［Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐ
ｌｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９、１８５（１９６９）］
によって変更されているように、放射能ヨウ化カリウム
またはヨウ化ナトリウムと抗体の混合物をクロラミン−
Ｔ（Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミドナトリウ
ム塩）で処理する。
用いてヨウ素−１３１（Ｉ−１３１）かまたはヨウ素−
１２５（Ｉ−１２５）のいずれかで標識することが含ま
れ、その際、たとえばグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏ
ｏｄ）ら［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８９、１１４（１９
６３）］により報告されマッコナヘイ（ＭｃＣｏｎａｈ
ａｙ）ら［Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐ
ｌｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９、１８５（１９６９）］
によって変更されているように、放射能ヨウ化カリウム
またはヨウ化ナトリウムと抗体の混合物をクロラミン−
Ｔ（Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミドナトリウ
ム塩）で処理する。
【００２７】一般に、免疫特異性を損なうことなく、で
きるだけ高比率の標識を抗体分子中に導入するのが望ま
しい。各標識抗体に対して、標識抗体−抗原結合の減少
の程度を標準的な競合細胞結合アッセイにより確立する
ことができる。１２５−Ｉまたは１３１−Ｉを標識とし
て使用した場合に、抗体の最初の結合活性のうち少なく
とも約３０％が保存されているのが好ましい。
きるだけ高比率の標識を抗体分子中に導入するのが望ま
しい。各標識抗体に対して、標識抗体−抗原結合の減少
の程度を標準的な競合細胞結合アッセイにより確立する
ことができる。１２５−Ｉまたは１３１−Ｉを標識とし
て使用した場合に、抗体の最初の結合活性のうち少なく
とも約３０％が保存されているのが好ましい。
【００２８】本発明の検出モノクローナル抗体は、酵素
を直接共有結合させることによるか、またはビオチン化
酵素とアビジン化酵素との間の反応などの結合反応を使
用することにより、酵素標識することができる（ヨーロ
ッパ特許出願第２９１，１８０号明細書（１９８８年１
１月１１日出願）参照）。有用な酵素標識としては西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシ
ダーゼなどが挙げられる。
を直接共有結合させることによるか、またはビオチン化
酵素とアビジン化酵素との間の反応などの結合反応を使
用することにより、酵素標識することができる（ヨーロ
ッパ特許出願第２９１，１８０号明細書（１９８８年１
１月１１日出願）参照）。有用な酵素標識としては西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシ
ダーゼなどが挙げられる。
【００２９】本発明のモノクローナル抗体はまた目的（
ＭまたはＬ）タンパク質の固相への結合を妨害しないの
で、本発明のアッセイはまた１工程で行うことができる
。１工程アッセイにおいては、試料、捕捉抗体を含む固
相および検出モノクローナル抗体を適当な液相中で一緒
に混合する。ついで、固相に結合した標識の量を上記の
ようにして検出する。
ＭまたはＬ）タンパク質の固相への結合を妨害しないの
で、本発明のアッセイはまた１工程で行うことができる
。１工程アッセイにおいては、試料、捕捉抗体を含む固
相および検出モノクローナル抗体を適当な液相中で一緒
に混合する。ついで、固相に結合した標識の量を上記の
ようにして検出する。
【００３０】さらに詳しく説明すると、一つの好ましい
２工程アッセイでは、捕捉抗体としてアウスザイムＲＩ
Ｉビーズを、検出抗体として群１または群１／群２混合
物のＨＲＰ−結合または１２５Ｉ−ＰｒｅＳ２モノクロ
ーナル抗体を用いる。このＰｒｅＳ２アッセイの感度は
非常に高かった。すなわち、約１ｎｇ ＰｒｅＳ２タン
パク質／ｍｌ全ｈｐＨＢｓＡｇ、または約０．１５ｎｇ
ＰｒｅＳ２／ｍｌ Ｍタンパク質を検出することがで
きる。このアッセイはまた、実験的に８０，０００倍過
剰に加えたＳタンパク質の存在下でもＰｒｅＳ２タンパ
ク質を検出することができるほどにＰｒｅＳ２に特異的
であった。
２工程アッセイでは、捕捉抗体としてアウスザイムＲＩ
Ｉビーズを、検出抗体として群１または群１／群２混合
物のＨＲＰ−結合または１２５Ｉ−ＰｒｅＳ２モノクロ
ーナル抗体を用いる。このＰｒｅＳ２アッセイの感度は
非常に高かった。すなわち、約１ｎｇ ＰｒｅＳ２タン
パク質／ｍｌ全ｈｐＨＢｓＡｇ、または約０．１５ｎｇ
ＰｒｅＳ２／ｍｌ Ｍタンパク質を検出することがで
きる。このアッセイはまた、実験的に８０，０００倍過
剰に加えたＳタンパク質の存在下でもＰｒｅＳ２タンパ
ク質を検出することができるほどにＰｒｅＳ２に特異的
であった。
【００３１】ＰｒｅＳ１含有Ｌタンパク質は、捕捉抗体
として（ａ）モノクローナルアウスザイムＲビーズまた
は（ｂ）アウスザイムＲＩＩビーズを、検出モノクロー
ナル抗体として（ａ）ＨＲＰ−標識群１ＰｒｅＳ１モノ
クローナル抗体、（ｂ）ＨＲＰ標識または１２５Ｉ標識
ＰｒｅＳ１群２モノクローナル抗体、または（ｃ）１２
５Ｉ標識群１および群２ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体
を用い、添加したＳタンパク質により有意に妨害される
ことなく≦１ｎｇ／ｍｌ試料にて検出することができる
。ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体をコーティングしたビ
ーズを使用することにより、添加したＳタンパク質によ
るアッセイ妨害を除くことができる。感染個体の血液中
のＰｒｅＳ抗原の出現および／または消失は該疾患の経
過および予後と関係することが報告されており、上記ア
ッセイはＨＢＶの管理において臨床的有用性を有するこ
とがわかる。たとえば、これらタンパク質「マーカー」
の存在または不存在のみを示すアッセイは本発明の定量
アッセイほど有用ではない。
として（ａ）モノクローナルアウスザイムＲビーズまた
は（ｂ）アウスザイムＲＩＩビーズを、検出モノクロー
ナル抗体として（ａ）ＨＲＰ−標識群１ＰｒｅＳ１モノ
クローナル抗体、（ｂ）ＨＲＰ標識または１２５Ｉ標識
ＰｒｅＳ１群２モノクローナル抗体、または（ｃ）１２
５Ｉ標識群１および群２ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体
を用い、添加したＳタンパク質により有意に妨害される
ことなく≦１ｎｇ／ｍｌ試料にて検出することができる
。ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体をコーティングしたビ
ーズを使用することにより、添加したＳタンパク質によ
るアッセイ妨害を除くことができる。感染個体の血液中
のＰｒｅＳ抗原の出現および／または消失は該疾患の経
過および予後と関係することが報告されており、上記ア
ッセイはＨＢＶの管理において臨床的有用性を有するこ
とがわかる。たとえば、これらタンパク質「マーカー」
の存在または不存在のみを示すアッセイは本発明の定量
アッセイほど有用ではない。
【００３２】２．抗体アッセイ
本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢＶ上のＰｒｅＳ１
領域およびＰｒｅＳ２領域に対するヒト抗体応答を検出
するための競合イムノアッセイにおいて検出抗体として
用いることができる。好ましい捕捉抗原は、還元剤（ジ
スルフィド結合を開裂）およびヨードアセトアミド（ジ
スルフィド結合の再生成を防ぐため）で処理してＳ領域
を変性させたヒト血漿由来表面抗原（Ｓ＋Ｍ＋Ｌタンパ
ク質からなる）である。この変性捕捉抗原を固相上への
吸着により固定化させる。ついで、この固定化捕捉抗原
を、（ａ）前以て選択した量のヒト血清または血漿（Ｈ
ＢＶ感染のために内在性のＨＢＶ抗原を含む）および（
ｂ）前以て選択した量の本発明の標識ＰｒｅＳ１または
ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体と混合する。
領域およびＰｒｅＳ２領域に対するヒト抗体応答を検出
するための競合イムノアッセイにおいて検出抗体として
用いることができる。好ましい捕捉抗原は、還元剤（ジ
スルフィド結合を開裂）およびヨードアセトアミド（ジ
スルフィド結合の再生成を防ぐため）で処理してＳ領域
を変性させたヒト血漿由来表面抗原（Ｓ＋Ｍ＋Ｌタンパ
ク質からなる）である。この変性捕捉抗原を固相上への
吸着により固定化させる。ついで、この固定化捕捉抗原
を、（ａ）前以て選択した量のヒト血清または血漿（Ｈ
ＢＶ感染のために内在性のＨＢＶ抗原を含む）および（
ｂ）前以て選択した量の本発明の標識ＰｒｅＳ１または
ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体と混合する。
【００３３】固相を洗浄して未結合物質を除き、結合標
識の量を測定する。結合した標識モノクローナル抗体の
量は、結合した抗ＨＢＶ抗体の量に反比例する。このア
ッセイにより、疾患経過の間の抗ＨＢＶ抗体の濃度を測
定する方法、またはＨＢＶワクチンの接種者における抗
体産生をモニターする方法が得られる。このアッセイは
また、ＨＢＩＧ調製物中またはワクチン接種者における
内在性または外来性の抗ＰｒｅＳ１および抗ＰｒｅＳ２
抗体を測定するためにも用いることができる。捕捉抗原
により結合された抗体はまた、検出抗原として本発明の
標識ＰｒｅＳ抗原を用いることにより測定することがで
きる。
識の量を測定する。結合した標識モノクローナル抗体の
量は、結合した抗ＨＢＶ抗体の量に反比例する。このア
ッセイにより、疾患経過の間の抗ＨＢＶ抗体の濃度を測
定する方法、またはＨＢＶワクチンの接種者における抗
体産生をモニターする方法が得られる。このアッセイは
また、ＨＢＩＧ調製物中またはワクチン接種者における
内在性または外来性の抗ＰｒｅＳ１および抗ＰｒｅＳ２
抗体を測定するためにも用いることができる。捕捉抗原
により結合された抗体はまた、検出抗原として本発明の
標識ＰｒｅＳ抗原を用いることにより測定することがで
きる。
【００３４】競合サンドイッチアッセイにおいて捕捉抗
原として有用な他の抗原としては、ＰｒｅＳタンパク質
を含む融合タンパク質上の非ＰｒｅＳエピトープに結合
する哺乳動物ポリクローナル抗体が挙げられる。そのよ
うな非ＰｒｅＳエピトープは、たとえばＣＫＳ（３’−
ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）上に認められている。Ｃ
ＫＳに対するポリクローナル抗体を固定化し、血清陽性
の血清または血漿および前以て選択した量の（ａ）ＣＫ
Ｓ酵素の少なくとも一部およびＰｒｅＳ抗原を含む融合
タンパク質および（ｂ）標識ＰｒｅＳモノクローナル抗
体と混合する。固定化抗体は、ＣＫＳ酵素の一部および
ＰｒｅＳタンパク質を含む組換え抗原融合タンパク質の
ＣＫＳ領域に結合する。
原として有用な他の抗原としては、ＰｒｅＳタンパク質
を含む融合タンパク質上の非ＰｒｅＳエピトープに結合
する哺乳動物ポリクローナル抗体が挙げられる。そのよ
うな非ＰｒｅＳエピトープは、たとえばＣＫＳ（３’−
ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）上に認められている。Ｃ
ＫＳに対するポリクローナル抗体を固定化し、血清陽性
の血清または血漿および前以て選択した量の（ａ）ＣＫ
Ｓ酵素の少なくとも一部およびＰｒｅＳ抗原を含む融合
タンパク質および（ｂ）標識ＰｒｅＳモノクローナル抗
体と混合する。固定化抗体は、ＣＫＳ酵素の一部および
ＰｒｅＳタンパク質を含む組換え抗原融合タンパク質の
ＣＫＳ領域に結合する。
【００３５】上記融合タンパク質のＰｒｅＳ領域は、内
在性の抗ＰｒｅＳ抗体および添加した本発明の標識Ｐｒ
ｅＳモノクローナル抗体により競合的に結合される結合
部位を提供する。それゆえ、検出した結合標識によるシ
グナルの強度は、試料中に存在する抗ＰｒｅＳ抗体の量
に反比例する。上記ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２アッセ
イの場合と同様に、血清および検出モノクローナル抗体
を順番に捕捉抗原に加えることもできるし、または捕捉
抗原と１工程で混合することもできる。
在性の抗ＰｒｅＳ抗体および添加した本発明の標識Ｐｒ
ｅＳモノクローナル抗体により競合的に結合される結合
部位を提供する。それゆえ、検出した結合標識によるシ
グナルの強度は、試料中に存在する抗ＰｒｅＳ抗体の量
に反比例する。上記ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２アッセ
イの場合と同様に、血清および検出モノクローナル抗体
を順番に捕捉抗原に加えることもできるし、または捕捉
抗原と１工程で混合することもできる。
【００３６】ＨＢｓＡｇのサブタイプの決定 本発明
はまた、ヒト血液の血清や血漿などの生理学的流体中に
存在するＨＢＶの特定のサブタイプを決定するための方
法を提供する。この方法を行うため、まず既知のサブタ
イプのＨＢＶを含有する試料を、固体支持体に結合させ
たモノクローナルまたはポリクローナル抗Ｓ抗体の試料
と接触させる。Ｓ含有タンパク質の結合により、Ｌタン
パク質およびＭタンパク質中におけるように、ＰｒｅＳ
１タンパク質およびＰｒｅＳ２タンパク質もまた捕捉さ
れる。ついで、結合したタンパク質のサブタイプパネル
の成員を２つの部分に分け、同じまたは異なる群からの
ＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２モノクローナル抗体（検出
可能な標識を含む）のペアと順番に反応させる。場合に
より、試料の複数の希釈液を各モノクローナル抗体と反
応させる。ついで、結合した標識の量を定量する。
はまた、ヒト血液の血清や血漿などの生理学的流体中に
存在するＨＢＶの特定のサブタイプを決定するための方
法を提供する。この方法を行うため、まず既知のサブタ
イプのＨＢＶを含有する試料を、固体支持体に結合させ
たモノクローナルまたはポリクローナル抗Ｓ抗体の試料
と接触させる。Ｓ含有タンパク質の結合により、Ｌタン
パク質およびＭタンパク質中におけるように、ＰｒｅＳ
１タンパク質およびＰｒｅＳ２タンパク質もまた捕捉さ
れる。ついで、結合したタンパク質のサブタイプパネル
の成員を２つの部分に分け、同じまたは異なる群からの
ＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２モノクローナル抗体（検出
可能な標識を含む）のペアと順番に反応させる。場合に
より、試料の複数の希釈液を各モノクローナル抗体と反
応させる。ついで、結合した標識の量を定量する。
【００３７】選択したモノクローナル抗体のペアに対し
て、既知のサブタイプの一連の試料中の結合標識の相対
量は、特定のサブタイプに特有のパターンを与える。ａ
ｙおよびａｄサブタイプは一対の既知抗Ｓモノクローナ
ル抗体を用いて容易に同定することができるので、既知
のａｙまたはａｄ ＨＢｓＡｇ試料をＰｒｅＳ１または
ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体のペアで「スキャニング
」することによりタイプ決定を有効に完了することがで
きる。たとえば、ａｙｗ１サブタイプのＨＢｓＡｇと反
応させた後に得られる２つのＰｒｅＳ２、群１モノクロ
ーナル抗体である５０−８０−１９４および１１６−８
３−４０６における標識比（たとえば、毎分放射能）は
、他のいかなるＨＢＶサブタイプについて測定したもの
より５０倍大きい。平均（１とする）よりも比が約５〜
７増加または減少すれば、サブタイプを識別するのに用
いることができる。
て、既知のサブタイプの一連の試料中の結合標識の相対
量は、特定のサブタイプに特有のパターンを与える。ａ
ｙおよびａｄサブタイプは一対の既知抗Ｓモノクローナ
ル抗体を用いて容易に同定することができるので、既知
のａｙまたはａｄ ＨＢｓＡｇ試料をＰｒｅＳ１または
ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体のペアで「スキャニング
」することによりタイプ決定を有効に完了することがで
きる。たとえば、ａｙｗ１サブタイプのＨＢｓＡｇと反
応させた後に得られる２つのＰｒｅＳ２、群１モノクロ
ーナル抗体である５０−８０−１９４および１１６−８
３−４０６における標識比（たとえば、毎分放射能）は
、他のいかなるＨＢＶサブタイプについて測定したもの
より５０倍大きい。平均（１とする）よりも比が約５〜
７増加または減少すれば、サブタイプを識別するのに用
いることができる。
【００３８】さらに、所定量のＢ型肝炎ウイルス表面抗
原に結合することのできる本発明のモノクローナル抗体
の量の相対的な差異により、ＨＢＶを含有する生理学的
試料のサブタイプの直接的な決定法が得られる。たとえ
ば、まず血漿や血清などの試料の第一の部分を、固体支
持体に結合させたＨＢＶに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体と接触させることにより、試料
中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原を固定化するのが好まし
い。ついて、該試料の第一部分を、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１
タンパク質またはＨＢＶ ＰｒｅＳ２タンパク質に結合
する第一のモノクローナル抗体（該モノクローナル抗体
は検出可能な標識または検出可能な標識に対する結合部
位を有する）と反応させる。抗ＰｒｅＳ１または抗Ｐｒ
ｅＳ２モノクローナル抗体の選択は、結合量が少なくと
も１種の、好ましくは１種以外のすべてのＨＢＶサブタ
イプが存在しないことを示すように行う。必要なら、こ
れらの工程を繰り返して、固定化ＨＢＶ表面抗原の第二
の試料に結合した異なるサブクラスのＰｒｅＳモノクロ
ーナル抗体の量を決定することにより、別のサブタイプ
を考慮外に置くことができる。所定数の工程（好ましく
は１〜３工程）の後に決定される結合した標識モノクロ
ーナル抗体の相対量により、どのＨＢＶサブタイプが存
在するかが示されるのが好ましい。上記のように、知ら
れたモノクローナル抗体を用いて試料をまずａｙまたは
ａｄとして同定するのが好ましいが、必ずしもそうでな
くてもよい。
原に結合することのできる本発明のモノクローナル抗体
の量の相対的な差異により、ＨＢＶを含有する生理学的
試料のサブタイプの直接的な決定法が得られる。たとえ
ば、まず血漿や血清などの試料の第一の部分を、固体支
持体に結合させたＨＢＶに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体と接触させることにより、試料
中のＢ型肝炎ウイルス表面抗原を固定化するのが好まし
い。ついて、該試料の第一部分を、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１
タンパク質またはＨＢＶ ＰｒｅＳ２タンパク質に結合
する第一のモノクローナル抗体（該モノクローナル抗体
は検出可能な標識または検出可能な標識に対する結合部
位を有する）と反応させる。抗ＰｒｅＳ１または抗Ｐｒ
ｅＳ２モノクローナル抗体の選択は、結合量が少なくと
も１種の、好ましくは１種以外のすべてのＨＢＶサブタ
イプが存在しないことを示すように行う。必要なら、こ
れらの工程を繰り返して、固定化ＨＢＶ表面抗原の第二
の試料に結合した異なるサブクラスのＰｒｅＳモノクロ
ーナル抗体の量を決定することにより、別のサブタイプ
を考慮外に置くことができる。所定数の工程（好ましく
は１〜３工程）の後に決定される結合した標識モノクロ
ーナル抗体の相対量により、どのＨＢＶサブタイプが存
在するかが示されるのが好ましい。上記のように、知ら
れたモノクローナル抗体を用いて試料をまずａｙまたは
ａｄとして同定するのが好ましいが、必ずしもそうでな
くてもよい。
【００３９】さらに、陽性コントロールとしての固定化
ＨＢｓＡｇの領域および陰性コントロールとしての無関
係モノクローナル抗体に加えて、たとえば固体表面（ポ
リマー膜など）上の区別される領域上にスポットするこ
とにより１種または２種以上のＰｒｅＳ１および／また
はＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を固定化することがで
きる。ついて、等量の試料を各捕捉モノクローナル抗体
に適用するかまたは捕捉モノクローナル抗体を含む表面
を試料（希釈したものまたは正味のもの）で洗浄するこ
とにより、ＨＢＶを含有する等量の試料にＰｒｅＳ２ま
たはＰｒｅＳ１「捕捉」モノクローナル抗体の各領域を
暴露させる。
ＨＢｓＡｇの領域および陰性コントロールとしての無関
係モノクローナル抗体に加えて、たとえば固体表面（ポ
リマー膜など）上の区別される領域上にスポットするこ
とにより１種または２種以上のＰｒｅＳ１および／また
はＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を固定化することがで
きる。ついて、等量の試料を各捕捉モノクローナル抗体
に適用するかまたは捕捉モノクローナル抗体を含む表面
を試料（希釈したものまたは正味のもの）で洗浄するこ
とにより、ＨＢＶを含有する等量の試料にＰｒｅＳ２ま
たはＰｒｅＳ１「捕捉」モノクローナル抗体の各領域を
暴露させる。
【００４０】ついて、各捕捉モノクローナル抗体に結合
した２量体複合体をＨＢＶの普遍的な「ａ」抗原決定基
に対して反応性のモノクローナルまたはポリクローナル
抗体（検出可能な標識または検出可能な標識に対する結
合部位を有する）と反応させて３量体複合体を生成させ
ることにより、該結合ＨＢｓＡｇを検出する。ついて、
各領域に結合した検出抗体の量を測定する。結合した検
出抗体の絶対量（単一領域の捕捉モノクローナル抗体の
場合）または相対量（複数の領域の捕捉モノクローナル
抗体の場合）により、試料中に存在するＨＢＶの部分的
または完全なサブタイプ決定が示される。可視または他
の手段により測定された結合検出モノクローナル抗体の
パターンが試料中のＨＢＶの完全なサブタイプ決定を示
すことができるように、単一の表面上に複数の捕捉モノ
クローナル抗体の領域を極めて近接して使用するのが好
ましい。
した２量体複合体をＨＢＶの普遍的な「ａ」抗原決定基
に対して反応性のモノクローナルまたはポリクローナル
抗体（検出可能な標識または検出可能な標識に対する結
合部位を有する）と反応させて３量体複合体を生成させ
ることにより、該結合ＨＢｓＡｇを検出する。ついて、
各領域に結合した検出抗体の量を測定する。結合した検
出抗体の絶対量（単一領域の捕捉モノクローナル抗体の
場合）または相対量（複数の領域の捕捉モノクローナル
抗体の場合）により、試料中に存在するＨＢＶの部分的
または完全なサブタイプ決定が示される。可視または他
の手段により測定された結合検出モノクローナル抗体の
パターンが試料中のＨＢＶの完全なサブタイプ決定を示
すことができるように、単一の表面上に複数の捕捉モノ
クローナル抗体の領域を極めて近接して使用するのが好
ましい。
【００４１】上記のことは、ＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ
２タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を
ＨＢＶのサブタイプ決定に初めて使用したことを示す。 一層多数の個体の血漿または血清試料との本発明のモノ
クローナル抗体の反応から観察されるパターンは、Ｓ特
異的モノクローナル抗体の場合にクールース（Ｃｏｕｒ
ｏｕｃｅ）ら［Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ
ａｒｄ、５４、５２７（１９８２）］およびウオンズ（
Ｊ．Ｒ．Ｗａｎｄｓ）ら［ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８１、２
７３７（１９８４）］によって報告されているように、
本発明のモノクローナル抗体をサブタイプ決定試薬とし
て用いて問題解決手段となり得ることを示している。
２タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を
ＨＢＶのサブタイプ決定に初めて使用したことを示す。 一層多数の個体の血漿または血清試料との本発明のモノ
クローナル抗体の反応から観察されるパターンは、Ｓ特
異的モノクローナル抗体の場合にクールース（Ｃｏｕｒ
ｏｕｃｅ）ら［Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ
ａｒｄ、５４、５２７（１９８２）］およびウオンズ（
Ｊ．Ｒ．Ｗａｎｄｓ）ら［ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８１、２
７３７（１９８４）］によって報告されているように、
本発明のモノクローナル抗体をサブタイプ決定試薬とし
て用いて問題解決手段となり得ることを示している。
【００４２】たとえば、図２に示すように、結合ＨＢＶ
表面抗原とＰｒｅＳ２群３モノクローナル抗体との反応
性により、ａｙｗ４として、または（１）ａｙｗ２、ａ
ｙｗ３、ａｄｒおよびａｙｒまたは（２）ａｄｗ２、ａ
ｄｗ４およびａｙｗ１の２つのグループのサブタイプ群
のいずれか一つとしてＨＢＶのサブタイプを決定するこ
とができる。さらに、結合ＨＢＶ表面抗原の第二の試料
をＰｒｅＳ２群１ａモノクローナル抗体（たとえば、５
０−８０−１９４など）と反応させることにより、ａｄ
ｗ４として、またはそれぞれ２種のサブタイプからなる
３つのグループのいずれかの一つとしてＨＢＶのサブタ
イプを決定することができる。結合ＨＢＶ表面抗原の第
三の試料を調製し、第三のモノクローナル抗体（第一の
２つの試料の反応性に基づいて選択したもの）と反応さ
せることができる（図２参照）。
表面抗原とＰｒｅＳ２群３モノクローナル抗体との反応
性により、ａｙｗ４として、または（１）ａｙｗ２、ａ
ｙｗ３、ａｄｒおよびａｙｒまたは（２）ａｄｗ２、ａ
ｄｗ４およびａｙｗ１の２つのグループのサブタイプ群
のいずれか一つとしてＨＢＶのサブタイプを決定するこ
とができる。さらに、結合ＨＢＶ表面抗原の第二の試料
をＰｒｅＳ２群１ａモノクローナル抗体（たとえば、５
０−８０−１９４など）と反応させることにより、ａｄ
ｗ４として、またはそれぞれ２種のサブタイプからなる
３つのグループのいずれかの一つとしてＨＢＶのサブタ
イプを決定することができる。結合ＨＢＶ表面抗原の第
三の試料を調製し、第三のモノクローナル抗体（第一の
２つの試料の反応性に基づいて選択したもの）と反応さ
せることができる（図２参照）。
【００４３】本発明のモノクローナル抗体は、水平伝播
中のＨＢＶ株の抗原性特性、および抗Ｓモノクローナル
抗体に基づくサブタイプ決定法では見逃される種々の集
団群における異質性を一層完全に分析するのに有用であ
る。このことは、Ｓタンパク質の抗原性領域が比較的小
さい点を考慮に入れると特に真実である。
中のＨＢＶ株の抗原性特性、および抗Ｓモノクローナル
抗体に基づくサブタイプ決定法では見逃される種々の集
団群における異質性を一層完全に分析するのに有用であ
る。このことは、Ｓタンパク質の抗原性領域が比較的小
さい点を考慮に入れると特に真実である。
【００４４】ワクチンおよびモノクローナル抗体治療
本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピ
トープの少なくとも幾つかは、これらエピトープに対す
るマウスモノクローナル抗体と競合する内在性抗体を血
清陽性個体で検出し得るという意味で免疫学的優性であ
る。これらエピトープには、表１に示したＰｒｅＳ２、
群２Ａｓｎ１２３エピトープが含まれる。それゆえ、本
発明のモノクローナル抗体は、サブユニットＨＢＶワク
チンの有用な成分であるＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２上
のエピトープを検出し、特徴付け、単離するのに用いる
ことができる。これらワクチンはまた、ヒトにおいてＰ
ｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２抗体の力価を増加さ
せるのにも有用であり、ＨＢＩＧ（これら抗体に富む）
の調製源となる。
本発明のモノクローナル抗体によって認識されるエピ
トープの少なくとも幾つかは、これらエピトープに対す
るマウスモノクローナル抗体と競合する内在性抗体を血
清陽性個体で検出し得るという意味で免疫学的優性であ
る。これらエピトープには、表１に示したＰｒｅＳ２、
群２Ａｓｎ１２３エピトープが含まれる。それゆえ、本
発明のモノクローナル抗体は、サブユニットＨＢＶワク
チンの有用な成分であるＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２上
のエピトープを検出し、特徴付け、単離するのに用いる
ことができる。これらワクチンはまた、ヒトにおいてＰ
ｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２抗体の力価を増加さ
せるのにも有用であり、ＨＢＩＧ（これら抗体に富む）
の調製源となる。
【００４５】本発明はまた、ＨＢＶに暴露しているかも
しれないまたはＨＢＶに暴露している患者に、１種また
は２種以上の本発明の抗体を含む単位製剤を投与するこ
とによりＨＢＶに対する血漿免疫原性を産生させる方法
にも関する。それゆえ、本発明の抗体は、疾患の臨床的
進行を遅延させることにより感染患者および／または病
気に罹った患者の予後を改善する予防剤としてか、また
はおそらく、ウイルスの毒性を除去する作用を有する治
療剤として治療学的効能を有するであろうと思われる。 本発明の抗体はまた、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩ
Ｇ）の価値ある補助となり得る。ＰｒｅＳ１および／ま
たはＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を補足したＨＢＩＧ
治療は、ＨＢＶ感染個体での肝臓移植後の肝臓再感染を
予防するのに有用である。
しれないまたはＨＢＶに暴露している患者に、１種また
は２種以上の本発明の抗体を含む単位製剤を投与するこ
とによりＨＢＶに対する血漿免疫原性を産生させる方法
にも関する。それゆえ、本発明の抗体は、疾患の臨床的
進行を遅延させることにより感染患者および／または病
気に罹った患者の予後を改善する予防剤としてか、また
はおそらく、ウイルスの毒性を除去する作用を有する治
療剤として治療学的効能を有するであろうと思われる。 本発明の抗体はまた、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩ
Ｇ）の価値ある補助となり得る。ＰｒｅＳ１および／ま
たはＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を補足したＨＢＩＧ
治療は、ＨＢＶ感染個体での肝臓移植後の肝臓再感染を
予防するのに有用である。
【００４６】単離したモノクローナル抗体は、生物学的
活性についてアッセイしたりインビボで単位剤形として
投与する前に水性ＩＶ流体などの薬理学的に許容し得る
液体担体で希釈するのが好ましい［レミングトン（Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ）のＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、オソル（Ａ．Ｏｓｏｌ）ら編、マック
（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，）、イーストン、ＰＡ（
１６版、１９８０）、１４８８〜１４９６頁；該文献を
参照のため本明細書に引用する］。得られた溶液を、た
とえば濾過により滅菌する。ＩｇＧ調製物に一般に用い
られる保存剤、たとえばマルトース、グリシンまたはチ
メロサールなどを薬理学的に許容し得る量で用いること
ができる。
活性についてアッセイしたりインビボで単位剤形として
投与する前に水性ＩＶ流体などの薬理学的に許容し得る
液体担体で希釈するのが好ましい［レミングトン（Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ）のＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、オソル（Ａ．Ｏｓｏｌ）ら編、マック
（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，）、イーストン、ＰＡ（
１６版、１９８０）、１４８８〜１４９６頁；該文献を
参照のため本明細書に引用する］。得られた溶液を、た
とえば濾過により滅菌する。ＩｇＧ調製物に一般に用い
られる保存剤、たとえばマルトース、グリシンまたはチ
メロサールなどを薬理学的に許容し得る量で用いること
ができる。
【００４７】得られた溶液は、たとえば静脈内注入や注
射により非経口的に投与するのが好ましい。投与するモ
ノクローナル抗体組成物の量は非常に幅広く変わり、Ｈ
ＢＶ感染患者の体格および身体条件に依存するであろう
。そのような因子は必然的に経験的なものであり、既知
のＨＢＶ段階基準を用いて臨床医により決定され得る。 ある種の臨床場面では、ウイルス粒子が感染標的細胞か
ら放出されるので該ウイルス粒子の感染性を中和するた
めにモノクローナル抗体組成物を複数投与する必要があ
るかもしれない。
射により非経口的に投与するのが好ましい。投与するモ
ノクローナル抗体組成物の量は非常に幅広く変わり、Ｈ
ＢＶ感染患者の体格および身体条件に依存するであろう
。そのような因子は必然的に経験的なものであり、既知
のＨＢＶ段階基準を用いて臨床医により決定され得る。 ある種の臨床場面では、ウイルス粒子が感染標的細胞か
ら放出されるので該ウイルス粒子の感染性を中和するた
めにモノクローナル抗体組成物を複数投与する必要があ
るかもしれない。
【００４８】
【実施例】つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではない
。下記実施例において、プロテインＡ−セファロースＣ
Ｌ−４Ｂ、ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ、セ
ファロースＳ−３００および他のすべてのクロマトグラ
フィーゲルはファルマシア（ピスカタウエイ、ＮＪ）か
ら得た。電気泳動およびウエスタンブロッティング試薬
は、バイオ−ラド（リッチモンド、ＣＡ）から得た。西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、トヨバ（Ｔｏ
ｙｏｂａ）（ニューヨーク、ＮＹ）から得た。Ｎａ１２
５Ｉは、アーシャム（アーリントンハイツ、ＩＬ）から
得た。９成分ＨＢｓＡｇサブタイプパネルはＡ−Ｍクー
ルース（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ）［ザ・インターナショナル
・ワークショップ・オブ・ＨＢｓＡｇサブタイプス（ｔ
ｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ
ｏｆ ＨｂｓＡｇ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ）、パリ、１９
７５年４月から］から得た。
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではない
。下記実施例において、プロテインＡ−セファロースＣ
Ｌ−４Ｂ、ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂ、セ
ファロースＳ−３００および他のすべてのクロマトグラ
フィーゲルはファルマシア（ピスカタウエイ、ＮＪ）か
ら得た。電気泳動およびウエスタンブロッティング試薬
は、バイオ−ラド（リッチモンド、ＣＡ）から得た。西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、トヨバ（Ｔｏ
ｙｏｂａ）（ニューヨーク、ＮＹ）から得た。Ｎａ１２
５Ｉは、アーシャム（アーリントンハイツ、ＩＬ）から
得た。９成分ＨＢｓＡｇサブタイプパネルはＡ−Ｍクー
ルース（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ）［ザ・インターナショナル
・ワークショップ・オブ・ＨＢｓＡｇサブタイプス（ｔ
ｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ
ｏｆ ＨｂｓＡｇ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ）、パリ、１９
７５年４月から］から得た。
【００４９】組換えＰｒｅＳ１（ｒＰｒｅＳ１）および
組換えＰｒｅＳ２（ｒＰｒｅＳ２）はオカシンスキー（
Ｇ．Ｏｋａｓｉｎｓｋｉ）（アボット・ラボラトリーズ
、シカゴ、ＩＬ）から贈呈された。ｒＰｒｅＳ１は、Ｃ
ＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）のアミノ末端部分
およびカルボキシ末端含有ＰｒｅＳ１残基１２〜１２０
を有する融合タンパク質である。ｒＰｒｅＳ２は、ＣＫ
Ｓのアミノ末端部分およびカルボキシ末端含有ＰｒｅＳ
２残基１２３〜１７５を有する融合タンパク質である。 ｒＰｒｅＳ１およびｒＰｒｅＳ２の両方ともＨＢＶサブ
タイプａｄｗ２であった。モノクローナル抗体１８／１
およびＱ１９／１０は、ガーリッヒ（Ｗ．Ｇｅｒｌｉｃ
ｈ）から贈呈された［ヘルマンら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，
５２、３９６（１９８４）参照］。
組換えＰｒｅＳ２（ｒＰｒｅＳ２）はオカシンスキー（
Ｇ．Ｏｋａｓｉｎｓｋｉ）（アボット・ラボラトリーズ
、シカゴ、ＩＬ）から贈呈された。ｒＰｒｅＳ１は、Ｃ
ＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）のアミノ末端部分
およびカルボキシ末端含有ＰｒｅＳ１残基１２〜１２０
を有する融合タンパク質である。ｒＰｒｅＳ２は、ＣＫ
Ｓのアミノ末端部分およびカルボキシ末端含有ＰｒｅＳ
２残基１２３〜１７５を有する融合タンパク質である。 ｒＰｒｅＳ１およびｒＰｒｅＳ２の両方ともＨＢＶサブ
タイプａｄｗ２であった。モノクローナル抗体１８／１
およびＱ１９／１０は、ガーリッヒ（Ｗ．Ｇｅｒｌｉｃ
ｈ）から贈呈された［ヘルマンら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，
５２、３９６（１９８４）参照］。
【００５０】血清試料をアボット・ラボラトリーズから
供給される市販のＲＩＡ−ＥＩＡ試薬：ＨＢｓＡｇのた
めにモノクローナルアウスザイムＲおよびアウスリアＲ
ＩＩ；抗ＨＢｃのためにコラブ（Ｃｏｒａｂ）Ｒ；ＨＢ
ｅＡｇおよび抗ＨＢｅのためにアボットＨＢｅＲ；およ
びＨＢＶ ＤＮＡを検出するためにアボットゲノスティ
ックス（Ｇｅｎｏｓｔｉｃｓ）Ｒで試験した。
供給される市販のＲＩＡ−ＥＩＡ試薬：ＨＢｓＡｇのた
めにモノクローナルアウスザイムＲおよびアウスリアＲ
ＩＩ；抗ＨＢｃのためにコラブ（Ｃｏｒａｂ）Ｒ；ＨＢ
ｅＡｇおよび抗ＨＢｅのためにアボットＨＢｅＲ；およ
びＨＢＶ ＤＮＡを検出するためにアボットゲノスティ
ックス（Ｇｅｎｏｓｔｉｃｓ）Ｒで試験した。
【００５１】デイン粒子中のＨＢｃＡｇを試験するため
、試料（０．２ｍｌ）をモノクローナルアウスザイムＲ
ビーズとともに４０℃で２時間インキュベートした。ビ
ーズを水洗し、ついでトリス緩衝食塩水中の１％ツイー
ン２０（２００μｌ）とともに４０℃で３０分間インキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、ＨＲＰに結合したモノ
クローナル抗ＨＢｃ抗体を含有する溶液とともにインキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、上記基質溶液とともに
インキュベートした。
、試料（０．２ｍｌ）をモノクローナルアウスザイムＲ
ビーズとともに４０℃で２時間インキュベートした。ビ
ーズを水洗し、ついでトリス緩衝食塩水中の１％ツイー
ン２０（２００μｌ）とともに４０℃で３０分間インキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、ＨＲＰに結合したモノ
クローナル抗ＨＢｃ抗体を含有する溶液とともにインキ
ュベートした。ビーズを洗浄し、上記基質溶液とともに
インキュベートした。
【００５２】実施例１（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２に
対するモノクローナル抗体） Ａ．デイン粒子の調製 高ＨＢｓＡｇ力価を有するヒト血漿を２０００ｒｐｍで
２０分間遠心分離にかけて清澄化した。その上澄み液を
ＳＷ２８ローター中で２７，０００ｒｐｍにて８時間遠
心分離にかけた。得られたペレットを０．０１Ｍトリス
、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６（緩衝液Ａ）中に再懸
濁し、この再懸濁液を、２ｍｌ ６２％ショ糖／緩衝
液Ａパッド上に重層しておいた緩衝液Ａ中の１０％ショ
糖上に重層した。ＳＷ２８ローター上で２７，０００ｒ
ｐｍにて８時間遠心分離にかけた後、フラクションを回
収し、ＨＢｃＡｇについてアッセイした。ＨＢｃＡｇの
ピークのフラクションをプールし、緩衝液Ａ中で１：４
に希釈し、連続１５〜６２％ショ糖勾配上に重層し、２
７，０００ｒｐｍで２４時間回転させた。フラクション
をプールし、ＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ２Ａｇ、ＰｒｅＳ１
Ａｇ、およびＨＢｃＡｇについてアッセイした。
対するモノクローナル抗体） Ａ．デイン粒子の調製 高ＨＢｓＡｇ力価を有するヒト血漿を２０００ｒｐｍで
２０分間遠心分離にかけて清澄化した。その上澄み液を
ＳＷ２８ローター中で２７，０００ｒｐｍにて８時間遠
心分離にかけた。得られたペレットを０．０１Ｍトリス
、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６（緩衝液Ａ）中に再懸
濁し、この再懸濁液を、２ｍｌ ６２％ショ糖／緩衝
液Ａパッド上に重層しておいた緩衝液Ａ中の１０％ショ
糖上に重層した。ＳＷ２８ローター上で２７，０００ｒ
ｐｍにて８時間遠心分離にかけた後、フラクションを回
収し、ＨＢｃＡｇについてアッセイした。ＨＢｃＡｇの
ピークのフラクションをプールし、緩衝液Ａ中で１：４
に希釈し、連続１５〜６２％ショ糖勾配上に重層し、２
７，０００ｒｐｍで２４時間回転させた。フラクション
をプールし、ＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ２Ａｇ、ＰｒｅＳ１
Ａｇ、およびＨＢｃＡｇについてアッセイした。
【００５３】Ｂ．免疫
８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＭＰ１＋ＴＤＭアジ
ュバント（＃Ｒ−７００、ＲＩＢＩイムノケム・リサー
チ）中に乳濁した精製デイン粒子（１０μｇ）で３週間
の間隔をあけて３回免疫した。最後のブースター投与か
ら２週間後に血清試料を採取し、酵素結合イムノアッセ
イ（ＥＩＡ）およびウエスタンブロッティングにより力
価を評価した。
ュバント（＃Ｒ−７００、ＲＩＢＩイムノケム・リサー
チ）中に乳濁した精製デイン粒子（１０μｇ）で３週間
の間隔をあけて３回免疫した。最後のブースター投与か
ら２週間後に血清試料を採取し、酵素結合イムノアッセ
イ（ＥＩＡ）およびウエスタンブロッティングにより力
価を評価した。
【００５４】Ｃ．抗デイン粒子抗体の検出のためのイム
ノアッセイ ５％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１％ＳＤＳ
中でデイン粒子を変性し、３分間沸騰させ、ＰＢＳ中に
２μｇ／ｍｌに希釈し、室温にて一夜インキュベートし
てマイクロプレートウエル上にコーティングした。ウエ
ルを蒸留水で洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（２００μ
ｌ）でブロッキングした。プレートを洗浄し、空気乾燥
させた。アッセイにおいて、試料をウエル中、室温にて
２時間インキュベートし、インキュベーションウエルを
洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ［＃１４−１８−
０９、キルケガール＆ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒ
ｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）］を加え、１時間インキュベートした。 最後の洗浄の後、ＯＰＤ基質溶液（アボット・ラボラト
リーズ）（１００μｌ）を各ウエルに加えた。１Ｎ硫酸
を加えて発色反応を停止させた。
ノアッセイ ５％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１％ＳＤＳ
中でデイン粒子を変性し、３分間沸騰させ、ＰＢＳ中に
２μｇ／ｍｌに希釈し、室温にて一夜インキュベートし
てマイクロプレートウエル上にコーティングした。ウエ
ルを蒸留水で洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（２００μ
ｌ）でブロッキングした。プレートを洗浄し、空気乾燥
させた。アッセイにおいて、試料をウエル中、室温にて
２時間インキュベートし、インキュベーションウエルを
洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ［＃１４−１８−
０９、キルケガール＆ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒ
ｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）］を加え、１時間インキュベートした。 最後の洗浄の後、ＯＰＤ基質溶液（アボット・ラボラト
リーズ）（１００μｌ）を各ウエルに加えた。１Ｎ硫酸
を加えて発色反応を停止させた。
【００５５】Ｄ．融合法
応答マウスを２〜４カ月休ませ、ついでリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）中のデイン粒子（１０μｇ）を前融合静脈
内ブースター投与した。３日後、標準的な方法を少し改
変して［コーラー（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、２５６、４９５（１９７５）］、脾臓細胞をＳＰ２
／０ミエローマ細胞株と１：１で融合した。この融合ペ
レットを５０％ＰＥＧ（ＡＴＣＣ ＮＷ１４５０）（１
ｍｌ）とともに１分間活発に拡散させ、培地（２０ｍｌ
）中で遠心分離にかけ、細胞をＨＡＴ選択ＩＭＤＭ中に
再懸濁し、９６ウエル組織培養プレート（＃１６７００
８、ＮＵＮＣ）中にウエル当たり１．５×１０５リンパ
球にてプレーティングした。ハイブリッド細胞の成育を
促進するため、ＳＴＭマイトジェン（＃Ｒ−５１０、Ｒ
ＩＢＩ）を最初のプレーティング培地中に１〜２００倍
希釈にて添加した。マイトジェンは、その後の培地交換
および飼育には使用しなかった。
水（ＰＢＳ）中のデイン粒子（１０μｇ）を前融合静脈
内ブースター投与した。３日後、標準的な方法を少し改
変して［コーラー（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、２５６、４９５（１９７５）］、脾臓細胞をＳＰ２
／０ミエローマ細胞株と１：１で融合した。この融合ペ
レットを５０％ＰＥＧ（ＡＴＣＣ ＮＷ１４５０）（１
ｍｌ）とともに１分間活発に拡散させ、培地（２０ｍｌ
）中で遠心分離にかけ、細胞をＨＡＴ選択ＩＭＤＭ中に
再懸濁し、９６ウエル組織培養プレート（＃１６７００
８、ＮＵＮＣ）中にウエル当たり１．５×１０５リンパ
球にてプレーティングした。ハイブリッド細胞の成育を
促進するため、ＳＴＭマイトジェン（＃Ｒ−５１０、Ｒ
ＩＢＩ）を最初のプレーティング培地中に１〜２００倍
希釈にて添加した。マイトジェンは、その後の培地交換
および飼育には使用しなかった。
【００５６】Ｅ．クローンの確立
抗デイン粒子スクリーニングＥＩＡで陽性であったハイ
ブリッド上澄み液をウエスタンブロッティングにより評
価して特異的なバンドパターンを同定した。ＥＩＡおよ
びウエスタンブロッティングで陽性であったハイブリッ
ドを限界希釈法によりクローニングした。評価のために
選択したクローンは、プレート当たり約１０％の成育を
示したプレートからのものであった。確立したクローン
を上記のようにしてアッセイし、Ｔフラスコ中で成育さ
せ、１×１０７細胞／マウスをプリスタンプライミング
したＢＡＬＢ／ｃマウス［ドミニオン・ラブズ（Ｄｏｍ
ｉｎｉｏｎ Ｌａｂｓ）］に注射してモノクローナル抗
体を含有する腹水を得た。
ブリッド上澄み液をウエスタンブロッティングにより評
価して特異的なバンドパターンを同定した。ＥＩＡおよ
びウエスタンブロッティングで陽性であったハイブリッ
ドを限界希釈法によりクローニングした。評価のために
選択したクローンは、プレート当たり約１０％の成育を
示したプレートからのものであった。確立したクローン
を上記のようにしてアッセイし、Ｔフラスコ中で成育さ
せ、１×１０７細胞／マウスをプリスタンプライミング
したＢＡＬＢ／ｃマウス［ドミニオン・ラブズ（Ｄｏｍ
ｉｎｉｏｎ Ｌａｂｓ）］に注射してモノクローナル抗
体を含有する腹水を得た。
【００５７】Ｆ．アイソタイプの決定
モノクローナル抗体のアイソタイプの決定は、ＳＢＡク
ロノタイピングシステムＩＩＩキット［＃５０３０、サ
ザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）］にわずかに修正を加えて行った
。ＥＩＡ９６ウエルマイクロプレートに、デイン粒子の
場合に記載したヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ（Ｈ＋Ｌ）（キ
ルケガール＆ペリー・ラボラトリーズ）の１：１０００
倍希釈液（１００μｌ／ウエル）を室温にて一夜コーテ
ィングした。プレートを洗浄し、クローン上澄み液（５
０μｌ）を適当なウエルに加えて室温にて２時間インキ
ュベートした。プレートを洗浄し、キットアイソタイプ
特異的結合体の１：１０００倍希釈液（１００μｌ／ウ
エル）を各試料に加え、３０分間インキュベートした。 最後の洗浄後、上記色原体を加えた。
ロノタイピングシステムＩＩＩキット［＃５０３０、サ
ザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）］にわずかに修正を加えて行った
。ＥＩＡ９６ウエルマイクロプレートに、デイン粒子の
場合に記載したヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ（Ｈ＋Ｌ）（キ
ルケガール＆ペリー・ラボラトリーズ）の１：１０００
倍希釈液（１００μｌ／ウエル）を室温にて一夜コーテ
ィングした。プレートを洗浄し、クローン上澄み液（５
０μｌ）を適当なウエルに加えて室温にて２時間インキ
ュベートした。プレートを洗浄し、キットアイソタイプ
特異的結合体の１：１０００倍希釈液（１００μｌ／ウ
エル）を各試料に加え、３０分間インキュベートした。 最後の洗浄後、上記色原体を加えた。
【００５８】Ｇ．モノクローナル抗体の精製アフィ−ゲ
ルプロテインＡ ＭＡＰＳ ＩＩキット（バイオ−ラド
）を用い、ＩｇＧクローニング株からの抗体をマウス腹
水から精製した。結合緩衝液でカラムを平衡化した後、
腹水を結合緩衝液と１：１の比で混合し、０．２μｍフ
ィルターに通し、カラム上に負荷した。試料をカラム上
に負荷した後、１０〜１５カラム容量の結合緩衝液をカ
ラムに流した。ついで、補給した溶離緩衝液でＩｇＧを
溶離し、ｐＨ７．２の中性にし、ついでＰＢＳ中に４℃
にて一夜透析した。
ルプロテインＡ ＭＡＰＳ ＩＩキット（バイオ−ラド
）を用い、ＩｇＧクローニング株からの抗体をマウス腹
水から精製した。結合緩衝液でカラムを平衡化した後、
腹水を結合緩衝液と１：１の比で混合し、０．２μｍフ
ィルターに通し、カラム上に負荷した。試料をカラム上
に負荷した後、１０〜１５カラム容量の結合緩衝液をカ
ラムに流した。ついで、補給した溶離緩衝液でＩｇＧを
溶離し、ｐＨ７．２の中性にし、ついでＰＢＳ中に４℃
にて一夜透析した。
【００５９】Ｈ．合成ペプチド
ＡＢＩ固相ペプチド合成機（アプライド・バイオシステ
ムズ）を用い、Ｍｅｔ１２０からＰｒｅＳ２遺伝子下流
およびＧｌｙ１３からＰｒｅＳ１遺伝子下流の翻訳生成
物部分に対応する合成ペプチドを製造した。３つのペプ
チドを構築し、ついで高速液体クロマトグラフィーによ
り精製してＰｒｅＳ２：ＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＴＬＱＤ
ＰＲＶＲＧＬＹＬＰＡＧＧ（１２０〜１４５）、ＴＶＮ
ＰＶＬＴＴＡＳＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＡＬＮ（１５
０〜１７４）およびＰｒｅＳ１：ＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬ
ＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰ
ＶＫＤＤ（１３〜５１）を得た。上記式中のアミノ酸残
基の略語は、Ａ＝アラニン、Ｒ＝アルギニン、Ｎ＝アス
パラギン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｃ＝システイン、Ｑ＝
グルタミン、Ｅ＝グルタミン酸、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒ
スチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｌ＝ロイシン、Ｋ＝リジ
ン、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｍ＝メチオニン、Ｐ＝プロ
リン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニン、Ｗ＝トリプトファ
ン、Ｙ＝チロシン、およびＶ＝バリンである。
ムズ）を用い、Ｍｅｔ１２０からＰｒｅＳ２遺伝子下流
およびＧｌｙ１３からＰｒｅＳ１遺伝子下流の翻訳生成
物部分に対応する合成ペプチドを製造した。３つのペプ
チドを構築し、ついで高速液体クロマトグラフィーによ
り精製してＰｒｅＳ２：ＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＴＬＱＤ
ＰＲＶＲＧＬＹＬＰＡＧＧ（１２０〜１４５）、ＴＶＮ
ＰＶＬＴＴＡＳＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＡＬＮ（１５
０〜１７４）およびＰｒｅＳ１：ＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬ
ＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰ
ＶＫＤＤ（１３〜５１）を得た。上記式中のアミノ酸残
基の略語は、Ａ＝アラニン、Ｒ＝アルギニン、Ｎ＝アス
パラギン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｃ＝システイン、Ｑ＝
グルタミン、Ｅ＝グルタミン酸、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒ
スチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｌ＝ロイシン、Ｋ＝リジ
ン、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｍ＝メチオニン、Ｐ＝プロ
リン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニン、Ｗ＝トリプトファ
ン、Ｙ＝チロシン、およびＶ＝バリンである。
【００６０】Ｉ．デイン粒子へのモノクローナル抗体結
合のペプチド抑制 ＰｒｅＳ１残基１３〜５１およびＰｒｅＳ２残基１２０
〜１４５および１５０〜１７４をコードする合成ペプチ
ドを用いて抑制アッセイを行った。変性デイン粒子（２
μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ溶液を室温にて１８時間
インキュベートすることによりマイクロタイターＥＩＡ
プレートをコーティングした。ＥＩＡプレートにモノク
ローナル抗体を加える前に、モノクローナル抗体（１０
μｇ／ｍｌ）を１３〜５１ペプチド、１２０〜１４５ペ
プチドまたは１５０〜１７４ペプチドのいずれかのペプ
チド（１０μｇ）とともに２０分間プレインキュベート
した。試料（５０μｌ／ウエル）をプレートに加え、２
０分間インキュベートし、洗浄した。ＨＲＰ結合ヤギ抗
マウスＩｇ（ＫＰＬ）の１：１０００倍希釈液を１００
μｇ／ウエルにて加え、３０分間インキュベートし、洗
浄し、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質で発色反
応を行った。
合のペプチド抑制 ＰｒｅＳ１残基１３〜５１およびＰｒｅＳ２残基１２０
〜１４５および１５０〜１７４をコードする合成ペプチ
ドを用いて抑制アッセイを行った。変性デイン粒子（２
μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ溶液を室温にて１８時間
インキュベートすることによりマイクロタイターＥＩＡ
プレートをコーティングした。ＥＩＡプレートにモノク
ローナル抗体を加える前に、モノクローナル抗体（１０
μｇ／ｍｌ）を１３〜５１ペプチド、１２０〜１４５ペ
プチドまたは１５０〜１７４ペプチドのいずれかのペプ
チド（１０μｇ）とともに２０分間プレインキュベート
した。試料（５０μｌ／ウエル）をプレートに加え、２
０分間インキュベートし、洗浄した。ＨＲＰ結合ヤギ抗
マウスＩｇ（ＫＰＬ）の１：１０００倍希釈液を１００
μｇ／ウエルにて加え、３０分間インキュベートし、洗
浄し、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質で発色反
応を行った。
【００６１】Ｊ．モノクローナル抗体の親和性バン・ヘ
イニンゲン（Ｖ．ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ）のプロ
トコール［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、ランゴン（Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ）ら編、アカデ
ミックプレス（１９８６）、４７２ｆ頁］により、モノ
クローナル抗体の親和性を決定した。抗体を低親和性（
Ｋ＝１０６〜１０７）、中程度の親和性（Ｋ＝１０７〜
１０９）および高親和性（Ｋ＝１０９〜１０１２）にラ
ンク付けした。精製培養上澄み液または未精製培養上澄
み液中のモノクローナル抗体の親和性は、変性デイン粒
子に対してモノクローナル抗体の５０％最大結合を与え
る希釈率または濃度として決定した。結合抗体を検出す
るのにＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇを用いた。
イニンゲン（Ｖ．ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ）のプロ
トコール［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、ランゴン（Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ）ら編、アカデ
ミックプレス（１９８６）、４７２ｆ頁］により、モノ
クローナル抗体の親和性を決定した。抗体を低親和性（
Ｋ＝１０６〜１０７）、中程度の親和性（Ｋ＝１０７〜
１０９）および高親和性（Ｋ＝１０９〜１０１２）にラ
ンク付けした。精製培養上澄み液または未精製培養上澄
み液中のモノクローナル抗体の親和性は、変性デイン粒
子に対してモノクローナル抗体の５０％最大結合を与え
る希釈率または濃度として決定した。結合抗体を検出す
るのにＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇを用いた。
【００６２】Ｋ．ポリアクリルアミドゲル電気泳動／ウ
エスタンブロッティング １２％ランニングゲルおよび４％スタッキングゲルを有
するバイオ−ラドスラブゲル装置を用い、分析ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。ゲルお
よび緩衝液組成は、ラムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｌｌｉ）
のＮａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）に記載の
ものを用いた。試料を一般にトリス緩衝液中の１％ＳＤ
Ｓ、２．５２％ＢＭＥ中で５分間沸騰させた。ウエスタ
ンブロッティングは、本質的にトウビン（Ｈ．Ｔｏｗｂ
ｉｎ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７２
、３１３（１９８４）の記載に従って行った。ニトロセ
ルロース上に試料を移した後、ニトロセルロースをブロ
ッキング緩衝液（１％ウシヘモグロビン、０．１％ｖ／
ｖツイーン２０、ＰＢＳ中）中に浸漬した。ニトロセル
ロースをモノクローナル抗体とともにインキュベートし
、ブロッキング緩衝液中、０．５〜１μｇ／ｍｌにて１
〜２時間試験し、ついでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で
洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ（
０．５〜１．０μｇ／ｍｌ）とともに１〜２時間インキ
ュベートした。ストリップを洗浄し、ついで４−クロロ
−１−ナフトール／過酸化水素基質で発色させた。
エスタンブロッティング １２％ランニングゲルおよび４％スタッキングゲルを有
するバイオ−ラドスラブゲル装置を用い、分析ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行った。ゲルお
よび緩衝液組成は、ラムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｌｌｉ）
のＮａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）に記載の
ものを用いた。試料を一般にトリス緩衝液中の１％ＳＤ
Ｓ、２．５２％ＢＭＥ中で５分間沸騰させた。ウエスタ
ンブロッティングは、本質的にトウビン（Ｈ．Ｔｏｗｂ
ｉｎ）らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７２
、３１３（１９８４）の記載に従って行った。ニトロセ
ルロース上に試料を移した後、ニトロセルロースをブロ
ッキング緩衝液（１％ウシヘモグロビン、０．１％ｖ／
ｖツイーン２０、ＰＢＳ中）中に浸漬した。ニトロセル
ロースをモノクローナル抗体とともにインキュベートし
、ブロッキング緩衝液中、０．５〜１μｇ／ｍｌにて１
〜２時間試験し、ついでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で
洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ（
０．５〜１．０μｇ／ｍｌ）とともに１〜２時間インキ
ュベートした。ストリップを洗浄し、ついで４−クロロ
−１−ナフトール／過酸化水素基質で発色させた。
【００６３】Ｌ．放射性ヨウ素化および酵素結合体２８
０ｎｍでの吸光度を吸光係数、１．３８で除することに
より、モノクローナル抗体タンパク質の濃度をｍｇ／ｍ
ｌにて決定した。他のタンパク質の濃度は、ウシ血清ア
ルブミンを標準として用いたＢＣＡ［ビキンコノン酸（
ｂｉｃｈｉｎｃｈｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］法（ピア
ス・ケミカル、ロックフォード、ＩＬ）により決定した
。クロラミンＴ法を用い、精製モノクローナル抗体を比
活性２０〜３０μＣｉ／μｇまで放射性ヨウ素化した［
グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）ら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，８９、１１４（１９６３）］。反応混合物
をセファデックスＧ−５０カラムに通すことにより、遊
離の１２５Ｉを結合標識から分離した。ナカネ（Ｐ．Ｎ
ａｋａｎｅ）らの方法［Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙ
ｔｏｃｈｅｍ．，２２、１０８４（１９８７４）］を用
い、モノクローナル抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）に結合させた。結合比は、１：１〜１：４（
ｍｇ／ｍｇ）モノクローナル抗体：ＨＲＰの範囲であっ
た。
０ｎｍでの吸光度を吸光係数、１．３８で除することに
より、モノクローナル抗体タンパク質の濃度をｍｇ／ｍ
ｌにて決定した。他のタンパク質の濃度は、ウシ血清ア
ルブミンを標準として用いたＢＣＡ［ビキンコノン酸（
ｂｉｃｈｉｎｃｈｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］法（ピア
ス・ケミカル、ロックフォード、ＩＬ）により決定した
。クロラミンＴ法を用い、精製モノクローナル抗体を比
活性２０〜３０μＣｉ／μｇまで放射性ヨウ素化した［
グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）ら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，８９、１１４（１９６３）］。反応混合物
をセファデックスＧ−５０カラムに通すことにより、遊
離の１２５Ｉを結合標識から分離した。ナカネ（Ｐ．Ｎ
ａｋａｎｅ）らの方法［Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙ
ｔｏｃｈｅｍ．，２２、１０８４（１９８７４）］を用
い、モノクローナル抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）に結合させた。結合比は、１：１〜１：４（
ｍｇ／ｍｇ）モノクローナル抗体：ＨＲＰの範囲であっ
た。
【００６４】Ｍ．デイン粒子への競合結合放射性ヨウ素
化モノクローナル抗体を陰性ヒト血漿中に希釈してトレ
ーサー溶液（０．２μＣｉ／ｍｌ）を調製した。競合に
使用するモノクローナル抗体を種々の濃度で含有する陰
性ヒト血漿（１００μｌ）に上記トレーサー溶液（１０
０μｌ）を加えた。デイン粒子を２μｇ／ｍｌでコーテ
ィングしたポリスチレンビーズを加え、この混合物とと
もに４０℃にて２時間または室温にて一夜インキュベー
トした。ビーズを蒸留水で洗浄し、放射能をカウントし
た。
化モノクローナル抗体を陰性ヒト血漿中に希釈してトレ
ーサー溶液（０．２μＣｉ／ｍｌ）を調製した。競合に
使用するモノクローナル抗体を種々の濃度で含有する陰
性ヒト血漿（１００μｌ）に上記トレーサー溶液（１０
０μｌ）を加えた。デイン粒子を２μｇ／ｍｌでコーテ
ィングしたポリスチレンビーズを加え、この混合物とと
もに４０℃にて２時間または室温にて一夜インキュベー
トした。ビーズを蒸留水で洗浄し、放射能をカウントし
た。
【００６５】Ｎ．サンドイッチ抗原イムノアッセイポリ
スチレンビーズ（直径６ｍｍ）を２０μｇ／ｍｌの濃度
の捕捉抗体で４０℃にて２時間コーティングした。ビー
ズをＰＢＳで濯ぎ、ついで３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ
溶液で４０℃にて１時間インキュベートした。ビーズを
３％ショ糖を含有するＰＢＳで濯ぎ、ついで空気乾燥し
た。
スチレンビーズ（直径６ｍｍ）を２０μｇ／ｍｌの濃度
の捕捉抗体で４０℃にて２時間コーティングした。ビー
ズをＰＢＳで濯ぎ、ついで３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ
溶液で４０℃にて１時間インキュベートした。ビーズを
３％ショ糖を含有するＰＢＳで濯ぎ、ついで空気乾燥し
た。
【００６６】試料を上記抗体コーティングビーズととも
に２０〜２５℃にて一夜または４０℃にて２時間インキ
ュベートした。水洗後、ビーズを１２５Ｉ標識検出抗体
またはＨＲＰ結合検出抗体とともに４０℃にて２時間イ
ンキュベートした。ビーズを水洗し、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）の場合はガンマカウンターで放射能をカ
ウントし、酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）の場合は
ＨＲＰ基質溶液（０．０２％Ｈ２Ｏ２を含有する０．１
Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中の０．３％
ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ；０．３ｍｌ）とと
もにインキュベートした。酵素反応を室温にて３０分間
進行させ、ついで１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（１ｍｌ）を加えて
反応を停止させた。クオンタムＩＩ分光光度計（アボッ
ト・ラボラトリーズ）を用いて４９２ｎｍにおける吸光
度を測定した。
に２０〜２５℃にて一夜または４０℃にて２時間インキ
ュベートした。水洗後、ビーズを１２５Ｉ標識検出抗体
またはＨＲＰ結合検出抗体とともに４０℃にて２時間イ
ンキュベートした。ビーズを水洗し、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）の場合はガンマカウンターで放射能をカ
ウントし、酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）の場合は
ＨＲＰ基質溶液（０．０２％Ｈ２Ｏ２を含有する０．１
Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中の０．３％
ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ；０．３ｍｌ）とと
もにインキュベートした。酵素反応を室温にて３０分間
進行させ、ついで１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（１ｍｌ）を加えて
反応を停止させた。クオンタムＩＩ分光光度計（アボッ
ト・ラボラトリーズ）を用いて４９２ｎｍにおける吸光
度を測定した。
【００６７】Ｏ．結果
１．デイン粒子の精製
２２ｎｍ ＨＢｓＡｇ粒子の大部分および他の血漿タン
パク質からヒト血漿中のＢ型肝炎ビリオンをショ糖勾配
遠心分離により分離した。ＨＢｃＡｇ、ＰｒｅＳ１Ａｇ
、ＨＢｓＡｇ、およびＰｒｅＳ２Ａｇの検出のための特
異的イムノアッセイによりフラクションをモニターした
。Ｓ抗原活性およびＰｒｅＳ２抗原活性のピークは２２
ｎｍ粒子と共沈したが、ＰｒｅＳ１抗原およびＨＢｃＡ
ｇは４２ｎｍデイン粒子に対応する有意に大きな粒子と
して共沈した。これらのデータは、ＰｒｅＳ２およびＳ
ではなくＰｒｅＳ１およびＨＢｃＡｇが小さな２２ｎｍ
体からデイン粒子を識別するのに役立つことを示してい
る。上記ヘルマンらによってすでに報告されているよう
に、精製ＨＢｓＡｇ粒子に比べてデイン粒子においてＬ
タンパク質（ｐ３９、ｇｐ４１）が優勢であることがＳ
ＤＳ ＰＡＧＥにより観察された。
パク質からヒト血漿中のＢ型肝炎ビリオンをショ糖勾配
遠心分離により分離した。ＨＢｃＡｇ、ＰｒｅＳ１Ａｇ
、ＨＢｓＡｇ、およびＰｒｅＳ２Ａｇの検出のための特
異的イムノアッセイによりフラクションをモニターした
。Ｓ抗原活性およびＰｒｅＳ２抗原活性のピークは２２
ｎｍ粒子と共沈したが、ＰｒｅＳ１抗原およびＨＢｃＡ
ｇは４２ｎｍデイン粒子に対応する有意に大きな粒子と
して共沈した。これらのデータは、ＰｒｅＳ２およびＳ
ではなくＰｒｅＳ１およびＨＢｃＡｇが小さな２２ｎｍ
体からデイン粒子を識別するのに役立つことを示してい
る。上記ヘルマンらによってすでに報告されているよう
に、精製ＨＢｓＡｇ粒子に比べてデイン粒子においてＬ
タンパク質（ｐ３９、ｇｐ４１）が優勢であることがＳ
ＤＳ ＰＡＧＥにより観察された。
【００６８】２．免疫
精製デイン粒子（サブタイプａｄ；サブタイプａｙでも
同様の結果が得られる）を用いてマウスを免疫した。ウ
エスタンブロッティングおよびデイン粒子コーティング
ビーズイムノアッセイでの反応性により、１０匹のデイ
ン粒子免疫マウスのうち１０匹が検出可能な抗ＰｒｅＳ
１および抗ＰｒｅＳ２力価を生成した。ＰｒｅＳ２合成
ペプチド（１２０〜１４５）の接種によっても若干の免
疫応答が引き起こされた。デイン粒子はまた、遊離のペ
プチドとしてかまたはアジュバント中のＫＬＨまたはＢ
ＳＡに結合させるかして接種した合成ＰｒｅＳ２ペプチ
ド（１２〜５３）に比べてもマウスにおいて有意に良好
な免疫原であることが確認された。
同様の結果が得られる）を用いてマウスを免疫した。ウ
エスタンブロッティングおよびデイン粒子コーティング
ビーズイムノアッセイでの反応性により、１０匹のデイ
ン粒子免疫マウスのうち１０匹が検出可能な抗ＰｒｅＳ
１および抗ＰｒｅＳ２力価を生成した。ＰｒｅＳ２合成
ペプチド（１２０〜１４５）の接種によっても若干の免
疫応答が引き起こされた。デイン粒子はまた、遊離のペ
プチドとしてかまたはアジュバント中のＫＬＨまたはＢ
ＳＡに結合させるかして接種した合成ＰｒｅＳ２ペプチ
ド（１２〜５３）に比べてもマウスにおいて有意に良好
な免疫原であることが確認された。
【００６９】固相にコーティングしたデイン粒子を用い
た固相ＥＩＡまたはデイン粒子のウエスタンブロッティ
ングによる反応性により、ハイブリドーマを最初にスク
リーニングした。反応性のハイブリドーマを腹水中で成
育させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィ
ーにより腹水からモノクローナル抗体を精製した。
た固相ＥＩＡまたはデイン粒子のウエスタンブロッティ
ングによる反応性により、ハイブリドーマを最初にスク
リーニングした。反応性のハイブリドーマを腹水中で成
育させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィ
ーにより腹水からモノクローナル抗体を精製した。
【００７０】３．ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体モノク
ローナル抗体の特徴付けを、ａｄおよびａｙサブタイプ
の精製デイン粒子との反応性をウエスタンブロッティン
グし、合成ペプチドおよび組換えＰｒｅＳ１またはＰｒ
ｅＳ２タンパク質への結合、および相互の競合研究によ
り行った。相対親和性もまた、上記物質および方法の際
に記載のようにして決定した。これらの結果をモノクロ
ーナル抗体ＰｒｅＳ１について表３にまとめて示す。
ローナル抗体の特徴付けを、ａｄおよびａｙサブタイプ
の精製デイン粒子との反応性をウエスタンブロッティン
グし、合成ペプチドおよび組換えＰｒｅＳ１またはＰｒ
ｅＳ２タンパク質への結合、および相互の競合研究によ
り行った。相対親和性もまた、上記物質および方法の際
に記載のようにして決定した。これらの結果をモノクロ
ーナル抗体ＰｒｅＳ１について表３にまとめて示す。
【００７１】表３（ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体）
【
表３】
表３】
【００７２】ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体の群分けは
、変性デイン粒子をコーティングしたビーズへの結合に
対してモノクローナル抗体が競合する相互競合イムノア
ッセイにより決定した。これらの研究から、ＰｒｅＳ１
モノクローナル抗体は３つの異なる群に分離することが
できた。群１および群２はｒＰｒｅＳ１と結合し、また
ウエスタンブロッティングにより、デイン粒子（サブタ
イプａｄおよびａｙ）のＬタンパク質（ｐ３９およびｇ
ｐ４２）とも反応する。これらのモノクローナル抗体は
、ＨＢｓＡｇタンパク質Ｓ（ｐ２４およびｇｐ２７）ま
たはＭタンパク質（ｇｐ３３およびｇｐ３６）とは反応
しない。群１および群２のモノクローナル抗体は、デイ
ン粒子コーティングビーズへの結合に対して競合しない
。 群１のモノクローナル抗体は合成ペプチド（１３〜５１
）に特異的に結合するが、群２のモノクローナル抗体は
このペプチドには結合しない。群１のモノクローナル抗
体はまた、既知の抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体１８
／７と有効に競合する。欠失マッピング研究により、群
１のモノクローナル抗体は領域２７〜３５に結合し、群
２のモノクローナル抗体は領域７２〜１０２に結合する
ことが示された。
、変性デイン粒子をコーティングしたビーズへの結合に
対してモノクローナル抗体が競合する相互競合イムノア
ッセイにより決定した。これらの研究から、ＰｒｅＳ１
モノクローナル抗体は３つの異なる群に分離することが
できた。群１および群２はｒＰｒｅＳ１と結合し、また
ウエスタンブロッティングにより、デイン粒子（サブタ
イプａｄおよびａｙ）のＬタンパク質（ｐ３９およびｇ
ｐ４２）とも反応する。これらのモノクローナル抗体は
、ＨＢｓＡｇタンパク質Ｓ（ｐ２４およびｇｐ２７）ま
たはＭタンパク質（ｇｐ３３およびｇｐ３６）とは反応
しない。群１および群２のモノクローナル抗体は、デイ
ン粒子コーティングビーズへの結合に対して競合しない
。 群１のモノクローナル抗体は合成ペプチド（１３〜５１
）に特異的に結合するが、群２のモノクローナル抗体は
このペプチドには結合しない。群１のモノクローナル抗
体はまた、既知の抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体１８
／７と有効に競合する。欠失マッピング研究により、群
１のモノクローナル抗体は領域２７〜３５に結合し、群
２のモノクローナル抗体は領域７２〜１０２に結合する
ことが示された。
【００７３】群３の抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体は
、上記２つのモノクローナル抗体とは非常に異なった挙
動を示す。これらモノクローナル抗体は、ウエスタンブ
ロッティングによりａｄサブタイプに対してのみＬタン
パク質と反応したが、ａｙサブタイプに対しては検出し
得る反応性を示さなかった。群３のモノクローナル抗体
は、競合し得る仕方でデインａｄコーティングビーズに
結合した。これら抗体はまた、サンドイッチイムノアッ
セイ（アウスザイムＩＩビーズを４５μｇ／ｍｌまでの
ＨＢｓＡｇと反応させ、ついで１２５Ｉ標識モノクロー
ナル抗体を反応させた）においてもいかなるＨＢｓＡｇ
サブタイプとも反応しなかった。群３のモノクローナル
抗体は、固相イムノアッセイまたはウエスタンブロッテ
ィングのいずれにおいてもｒＰｒｅＳ１とは実質的に結
合しなかった。一つの高親和性抗ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体（５０−８０−１９４）は、ＰｒｅＳ１モノク
ローナル抗体の３つのすべての群のデイン粒子への結合
を高濃度において部分的に抑制した（２１〜３４％）。 群３のモノクローナル抗体は、ペプチド１３〜５１に結
合しない。
、上記２つのモノクローナル抗体とは非常に異なった挙
動を示す。これらモノクローナル抗体は、ウエスタンブ
ロッティングによりａｄサブタイプに対してのみＬタン
パク質と反応したが、ａｙサブタイプに対しては検出し
得る反応性を示さなかった。群３のモノクローナル抗体
は、競合し得る仕方でデインａｄコーティングビーズに
結合した。これら抗体はまた、サンドイッチイムノアッ
セイ（アウスザイムＩＩビーズを４５μｇ／ｍｌまでの
ＨＢｓＡｇと反応させ、ついで１２５Ｉ標識モノクロー
ナル抗体を反応させた）においてもいかなるＨＢｓＡｇ
サブタイプとも反応しなかった。群３のモノクローナル
抗体は、固相イムノアッセイまたはウエスタンブロッテ
ィングのいずれにおいてもｒＰｒｅＳ１とは実質的に結
合しなかった。一つの高親和性抗ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体（５０−８０−１９４）は、ＰｒｅＳ１モノク
ローナル抗体の３つのすべての群のデイン粒子への結合
を高濃度において部分的に抑制した（２１〜３４％）。 群３のモノクローナル抗体は、ペプチド１３〜５１に結
合しない。
【００７４】すべての他の抗ＰｒｅＳ２モノクローナル
抗体および２つの抗Ｓモノクローナル抗体（Ｈ３５およ
びＨ１６６）は、ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体結合の
抑制は低いかまたは無視できるものであった。Ｈ３５お
よびＨ１６６は非競合群特異的「ａ」抗原決定基に結合
し、ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）らによってＪ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２、９２０（１９８４）に記載
されている。観察された部分的な抑制は、立体的な障害
によるものである。Ｈ１６６は群１ＰｒｅＳ１モノクロ
ーナル抗体結合を２５％抑制したが、群２および３に対
しては１０％未満の抑制を示した。
抗体および２つの抗Ｓモノクローナル抗体（Ｈ３５およ
びＨ１６６）は、ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体結合の
抑制は低いかまたは無視できるものであった。Ｈ３５お
よびＨ１６６は非競合群特異的「ａ」抗原決定基に結合
し、ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）らによってＪ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２、９２０（１９８４）に記載
されている。観察された部分的な抑制は、立体的な障害
によるものである。Ｈ１６６は群１ＰｒｅＳ１モノクロ
ーナル抗体結合を２５％抑制したが、群２および３に対
しては１０％未満の抑制を示した。
【００７５】４．ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体Ｐｒｅ
Ｓ２モノクローナル抗体は、相互競合実験により４つの
群に分けることができた。これらモノクローナル抗体の
反応性のプロフィルを下記表４にまとめて示す。 表４（ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体）
Ｓ２モノクローナル抗体は、相互競合実験により４つの
群に分けることができた。これらモノクローナル抗体の
反応性のプロフィルを下記表４にまとめて示す。 表４（ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体）
【表４】
（＊）１５０〜１７４抑制は＋であった；他のすべての
モノクローナル抗体は（−）であった；１１６〜９４は
試験しなかった。
モノクローナル抗体は（−）であった；１１６〜９４は
試験しなかった。
【００７６】ＰｒｅＳ２群１モノクローナル抗体は、ウ
エスタンブロッティングによりＭおよびＬの両タンパク
質上の直線上エピトープと、合成ペプチド１２０〜１４
５と、および残基１２３〜１７５を含有するｒＰｒｅＳ
２融合タンパク質と反応した。
エスタンブロッティングによりＭおよびＬの両タンパク
質上の直線上エピトープと、合成ペプチド１２０〜１４
５と、および残基１２３〜１７５を含有するｒＰｒｅＳ
２融合タンパク質と反応した。
【００７７】ＰｒｅＳ２群１モノクローナル抗体はまた
、ＨＢＶサブタイプとの異なる反応性に基づいて群１ａ
および１ｂにさらに分けられる。群１ａおよび１ｂのモ
ノクローナル抗体は異なるが空間的に近接したエピトー
プに結合するので、立体障害により競合が起こる。この
現象は、公知の抗Ｓモノクローナル抗体Ｈ９５およびＨ
３５との間でも認められている［ピーターソンら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３２、９２０（１９８４）］
。
、ＨＢＶサブタイプとの異なる反応性に基づいて群１ａ
および１ｂにさらに分けられる。群１ａおよび１ｂのモ
ノクローナル抗体は異なるが空間的に近接したエピトー
プに結合するので、立体障害により競合が起こる。この
現象は、公知の抗Ｓモノクローナル抗体Ｈ９５およびＨ
３５との間でも認められている［ピーターソンら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３２、９２０（１９８４）］
。
【００７８】群２および群３のＰｒｅＳ２モノクローナ
ル抗体は、ウエスタンブロッティングによりＭタンパク
質にのみ強く結合したが、固定化デイン粒子への結合に
際しては相互競合を示さなかった。ＰｒｅＳ２群２のモ
ノクローナル抗体は、相互競合研究に基づいて群２ａお
よび２ｂに分けた。群２ａのモノクローナル抗体（１１
６−３４−２６３）は群２ｂのモノクローナル抗体のデ
イン粒子コーティングビーズへの結合を完全にブロッキ
ングしたが、群２ｂのモノクローナル抗体は１２０μｇ
／ｍｌの濃度（競合モノクローナル抗体の２０００倍過
剰を示す）においてさえも群２ａのモノクローナル抗体
の結合をブロッキングする能力を示さなかった。この差
別的な抑制はデイン粒子へのモノクローナル抗体の親和
性の相違によるものではない。というのは、幾つかの群
２ａのモノクローナル抗体（たとえば、１１６−９４−
１４０）は１１５−３２−１８１と等価もしくは低い親
和性を示したからである（データは示していない）。群
２ａまたは２ｂのモノクローナル抗体はまた、合成ペプ
チド（１２０−１４５）との反応性およびウエスタンブ
ロッキングにおいてＬタンパク質との反応性において異
なっていた。
ル抗体は、ウエスタンブロッティングによりＭタンパク
質にのみ強く結合したが、固定化デイン粒子への結合に
際しては相互競合を示さなかった。ＰｒｅＳ２群２のモ
ノクローナル抗体は、相互競合研究に基づいて群２ａお
よび２ｂに分けた。群２ａのモノクローナル抗体（１１
６−３４−２６３）は群２ｂのモノクローナル抗体のデ
イン粒子コーティングビーズへの結合を完全にブロッキ
ングしたが、群２ｂのモノクローナル抗体は１２０μｇ
／ｍｌの濃度（競合モノクローナル抗体の２０００倍過
剰を示す）においてさえも群２ａのモノクローナル抗体
の結合をブロッキングする能力を示さなかった。この差
別的な抑制はデイン粒子へのモノクローナル抗体の親和
性の相違によるものではない。というのは、幾つかの群
２ａのモノクローナル抗体（たとえば、１１６−９４−
１４０）は１１５−３２−１８１と等価もしくは低い親
和性を示したからである（データは示していない）。群
２ａまたは２ｂのモノクローナル抗体はまた、合成ペプ
チド（１２０−１４５）との反応性およびウエスタンブ
ロッキングにおいてＬタンパク質との反応性において異
なっていた。
【００７９】群２ａのモノクローナル抗体のＭタンパク
質への排他的結合は、遊離のＰｒｅＳ２アミノ末端に依
存していることか、またはアスパラギン１２３における
炭水化物残基に依存していることのいずれかにより説明
される。このグリカン残基のモノクローナル抗体結合に
おける役割を決定するため、デイン粒子を種々のグリコ
シダーゼで処理した。
質への排他的結合は、遊離のＰｒｅＳ２アミノ末端に依
存していることか、またはアスパラギン１２３における
炭水化物残基に依存していることのいずれかにより説明
される。このグリカン残基のモノクローナル抗体結合に
おける役割を決定するため、デイン粒子を種々のグリコ
シダーゼで処理した。
【００８０】ノイラミニダーゼ単独、ノイラミニダーゼ
＋β−ガラクトシダーゼ、またはノイラミニダーゼ＋β
−ガラクトシダーゼ＋β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼでの処理は、群２ａのモノクローナル抗体の反応性
または他のいずれのＰｒｅＳ２モノクローナル抗体の反
応性にも殆ど影響を与えないかまたは有意の影響を与え
なかった。エンドグリコシダーゼＦで処理すると群２ａ
のモノクローナル抗体（１１６−３４−２６３）の反応
性は完全に損なわれたが、群１のモノクローナル抗体結
合には影響を与えなかった。
＋β−ガラクトシダーゼ、またはノイラミニダーゼ＋β
−ガラクトシダーゼ＋β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼでの処理は、群２ａのモノクローナル抗体の反応性
または他のいずれのＰｒｅＳ２モノクローナル抗体の反
応性にも殆ど影響を与えないかまたは有意の影響を与え
なかった。エンドグリコシダーゼＦで処理すると群２ａ
のモノクローナル抗体（１１６−３４−２６３）の反応
性は完全に損なわれたが、群１のモノクローナル抗体結
合には影響を与えなかった。
【００８１】市販のエンドグリコシダーゼＦには２種の
グリコシダーゼ活性がある、すなわちエンドＦおよびペ
プチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ：Ｅ．
Ｃ．３．５．１．５２）である。エンドＦは、エンドグ
リコシダーゼＨ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９６）のように
、幾つかのアスパラギン結合グリカン（主として高マン
ノースタイプのもの）のジ−Ｎ−アセチルキトビオース
残基の間のオリゴ糖鎖を開裂する。ＰＮＧａｓｅＦは、
グリコシルアミン結合部位で加水分解し、炭水化物を含
まないペプチド鎖を生成する。エンドグリコシダーゼＨ
は１１６−３４−２６３のデイン粒子への結合に殆どま
たは全く影響を及ぼさないので、市販のエンドグリコシ
ダーゼＦ中のＰＮＧａｓｅＦ活性が開裂を引き起こして
モノクローナル抗体の結合の損失を引き起こしたらしい
。活性の識別、または炭水化物を除去するのに酵素活性
の組み合わせが必要であるのかどうかについては、解明
は試みられていない。このＰｒｅＳ２結合グリカンの炭
水化物配列は、いまだ決定されていない。
グリコシダーゼ活性がある、すなわちエンドＦおよびペ
プチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ：Ｅ．
Ｃ．３．５．１．５２）である。エンドＦは、エンドグ
リコシダーゼＨ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９６）のように
、幾つかのアスパラギン結合グリカン（主として高マン
ノースタイプのもの）のジ−Ｎ−アセチルキトビオース
残基の間のオリゴ糖鎖を開裂する。ＰＮＧａｓｅＦは、
グリコシルアミン結合部位で加水分解し、炭水化物を含
まないペプチド鎖を生成する。エンドグリコシダーゼＨ
は１１６−３４−２６３のデイン粒子への結合に殆どま
たは全く影響を及ぼさないので、市販のエンドグリコシ
ダーゼＦ中のＰＮＧａｓｅＦ活性が開裂を引き起こして
モノクローナル抗体の結合の損失を引き起こしたらしい
。活性の識別、または炭水化物を除去するのに酵素活性
の組み合わせが必要であるのかどうかについては、解明
は試みられていない。このＰｒｅＳ２結合グリカンの炭
水化物配列は、いまだ決定されていない。
【００８２】エンドグリコシダーゼＦ処理がＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ後のＭタンパク質の見かけの分子量に及ぼす影響
を評価するために、処理デイン粒子および未処理デイン
粒子をウエスタンブロッティングにより分析した。未処
理デイン粒子のＭタンパク質バンドは、すべてのＰｒｅ
Ｓ２モノクローナル抗体との強い反応性を示した。処理
後にはデインタンパク質に対する反応性は群２ａモノク
ローナル抗体で観察されなかった。しかしながら、２８
、３０、３５および４０ｋＤａのバンドは群１のモノク
ローナル抗体と反応しなかった。上記２８および３０ｋ
Ｄａのバンドは、糖除去したＭタンパク質に対応するよ
うに思われる。高分子量バンドの出現は予期しないもの
であったが、糖除去したＭタンパク質または凝集したＭ
タンパク質の異常な移動度を表している。
ＡＧＥ後のＭタンパク質の見かけの分子量に及ぼす影響
を評価するために、処理デイン粒子および未処理デイン
粒子をウエスタンブロッティングにより分析した。未処
理デイン粒子のＭタンパク質バンドは、すべてのＰｒｅ
Ｓ２モノクローナル抗体との強い反応性を示した。処理
後にはデインタンパク質に対する反応性は群２ａモノク
ローナル抗体で観察されなかった。しかしながら、２８
、３０、３５および４０ｋＤａのバンドは群１のモノク
ローナル抗体と反応しなかった。上記２８および３０ｋ
Ｄａのバンドは、糖除去したＭタンパク質に対応するよ
うに思われる。高分子量バンドの出現は予期しないもの
であったが、糖除去したＭタンパク質または凝集したＭ
タンパク質の異常な移動度を表している。
【００８３】これらのデータは、結合グリカンの存在が
群２ａのモノクローナル抗体とＰｒｅＳ２との反応性に
は必須であるが、群１のモノクローナル抗体の反応性に
対しては必須ではなかった。群２ｂＰｒｅＳ２のモノク
ローナル抗体活性の９０％までがエンドグリコシダーゼ
Ｆ処理により破壊されたが、デイン粒子のインキュベー
トをさらに続けても糖付加したＭタンパク質に幾つかの
残留結合が残っていた。糖付加したＭタンパク質との１
１５−３２−１８１の反応性をウエスタンブロッティン
グにより確認した。Ｑ１９／１０、Ｍタンパク質との強
い反応性を示す抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体［ゲル
ケン（Ｇ．Ｇｅｒｋｅｎ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｙ、９２、１８６４（１９８７）］もまた糖除
去したＭタンパク質に対して弱い反応性を示した。
群２ａのモノクローナル抗体とＰｒｅＳ２との反応性に
は必須であるが、群１のモノクローナル抗体の反応性に
対しては必須ではなかった。群２ｂＰｒｅＳ２のモノク
ローナル抗体活性の９０％までがエンドグリコシダーゼ
Ｆ処理により破壊されたが、デイン粒子のインキュベー
トをさらに続けても糖付加したＭタンパク質に幾つかの
残留結合が残っていた。糖付加したＭタンパク質との１
１５−３２−１８１の反応性をウエスタンブロッティン
グにより確認した。Ｑ１９／１０、Ｍタンパク質との強
い反応性を示す抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体［ゲル
ケン（Ｇ．Ｇｅｒｋｅｎ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｙ、９２、１８６４（１９８７）］もまた糖除
去したＭタンパク質に対して弱い反応性を示した。
【００８４】群３のＰｒｅＳ２モノクローナル抗体（１
２８−６０３−１０８）は、他のいかなるＰｒｅＳ２モ
ノクローナル抗体とも相互に競合せず、ウエスタンブロ
ッティングにおいてＭタンパク質とは強い反応性を示し
たが、デイン粒子のＬタンパク質（ａｄおよびａｙ）と
は反応しなかった。このモノクローナル抗体は合成ペプ
チド（１５０−１７４）サブタイプａｙｗには結合した
が、１２０−１４５（ａｄｗ２配列）、マウスＬ細胞で
産生されたＳ遺伝子のみを含有するｒＨＢｓＡｇ［ミム
（Ｌ．Ｍｉｍｍ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
、２５、２１１（１９８９）］、または大腸菌で産生さ
せた残基１２３−１７０（配列ａｄｗ）を含有するｒＰ
ｒｅＳ２とは反応しなかった。このようなｒＰｒｅＳ２
タンパク質への１２８−６０３結合の欠如は、上記のよ
うに独特のＨＢＶサブタイプ特異性により説明すること
ができる。
２８−６０３−１０８）は、他のいかなるＰｒｅＳ２モ
ノクローナル抗体とも相互に競合せず、ウエスタンブロ
ッティングにおいてＭタンパク質とは強い反応性を示し
たが、デイン粒子のＬタンパク質（ａｄおよびａｙ）と
は反応しなかった。このモノクローナル抗体は合成ペプ
チド（１５０−１７４）サブタイプａｙｗには結合した
が、１２０−１４５（ａｄｗ２配列）、マウスＬ細胞で
産生されたＳ遺伝子のみを含有するｒＨＢｓＡｇ［ミム
（Ｌ．Ｍｉｍｍ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
、２５、２１１（１９８９）］、または大腸菌で産生さ
せた残基１２３−１７０（配列ａｄｗ）を含有するｒＰ
ｒｅＳ２とは反応しなかった。このようなｒＰｒｅＳ２
タンパク質への１２８−６０３結合の欠如は、上記のよ
うに独特のＨＢＶサブタイプ特異性により説明すること
ができる。
【００８５】群４のモノクローナル抗体は、他のいずれ
のＰｒｅＳ２モノクローナル抗体群とも相互の競合を示
さず、デイン粒子のａｄサブタイプとは強い反応性を示
したが、デイン粒子のａｙサブタイプとは反応しなかっ
た。これらのモノクローナル抗体は、ｒＰｒｅＳ２また
は１２０−１４５（ａｄｗ２）ペプチドとは反応しなか
った。このモノクローナル抗体は、タイプａｙｗ１のＰ
ｒｅＳ２タンパク質と反応した。
のＰｒｅＳ２モノクローナル抗体群とも相互の競合を示
さず、デイン粒子のａｄサブタイプとは強い反応性を示
したが、デイン粒子のａｙサブタイプとは反応しなかっ
た。これらのモノクローナル抗体は、ｒＰｒｅＳ２また
は１２０−１４５（ａｄｗ２）ペプチドとは反応しなか
った。このモノクローナル抗体は、タイプａｙｗ１のＰ
ｒｅＳ２タンパク質と反応した。
【００８６】ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体は、デイン
粒子へのＰｒｅＳ２モノクローナル抗体の結合を有意に
抑制しなかった。しかしながら、ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体である５０−８０−１９４は、２０μｇ／ｍｌ
以上にて群１および群２のＰｒｅＳ１モノクローナル抗
体のデイン粒子への結合を部分的に抑制した（２１〜３
４％）。他のすべてのＰｒｅＳ２モノクローナル抗体は
、ＰｒｅＳ１結合の抑制は無視できるものであった（＜
１０％）。興味深いことに、５０−８０−１９４は非常
に高濃度（＞５０μｇ／ｍｌ）にて群２のＰｒｅＳ２モ
ノクローナル抗体の結合を３０〜３８％抑制することが
できた。Ｈ１６６（抗Ｓモノクローナル抗体）は、群１
のＰｒｅＳ１結合を２５％抑制したが、群２のＰｒｅＳ
１モノクローナル抗体に対しては実質的に抑制を示さな
かった。これらのデータは、Ｓエピトープ、ＰｒｅＳ２
エピトープおよびＰｒｅＳ１エピトープがデイン粒子の
表面上で極めて近接していることを示唆している。
粒子へのＰｒｅＳ２モノクローナル抗体の結合を有意に
抑制しなかった。しかしながら、ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体である５０−８０−１９４は、２０μｇ／ｍｌ
以上にて群１および群２のＰｒｅＳ１モノクローナル抗
体のデイン粒子への結合を部分的に抑制した（２１〜３
４％）。他のすべてのＰｒｅＳ２モノクローナル抗体は
、ＰｒｅＳ１結合の抑制は無視できるものであった（＜
１０％）。興味深いことに、５０−８０−１９４は非常
に高濃度（＞５０μｇ／ｍｌ）にて群２のＰｒｅＳ２モ
ノクローナル抗体の結合を３０〜３８％抑制することが
できた。Ｈ１６６（抗Ｓモノクローナル抗体）は、群１
のＰｒｅＳ１結合を２５％抑制したが、群２のＰｒｅＳ
１モノクローナル抗体に対しては実質的に抑制を示さな
かった。これらのデータは、Ｓエピトープ、ＰｒｅＳ２
エピトープおよびＰｒｅＳ１エピトープがデイン粒子の
表面上で極めて近接していることを示唆している。
【００８７】実施例２（ＨＢＶのサブタイプ決定）ＨＢ
ｓＡｇサブタイプパネル［パリス（Ｐａｒｉｓ）］反応
性における有意の差異が、同じ競合性群の間においてさ
えもモノクローナル抗体間で観察された。Ｓ、ＰｒｅＳ
２またはＰｒｅＳ１モノクローナル抗体を対にして比較
して、各領域内の結合を標準化した（表５）。
ｓＡｇサブタイプパネル［パリス（Ｐａｒｉｓ）］反応
性における有意の差異が、同じ競合性群の間においてさ
えもモノクローナル抗体間で観察された。Ｓ、ＰｒｅＳ
２またはＰｒｅＳ１モノクローナル抗体を対にして比較
して、各領域内の結合を標準化した（表５）。
【００８８】表５（選択モノクローナル抗体結合比とし
て表したパリスサブタイプパリスとの差異モノクローナ
ル抗体反応性）
て表したパリスサブタイプパリスとの差異モノクローナ
ル抗体反応性）
【表５】
（ａ）結合を標準化するため、パリスサブタイプ試料へ
のＳまたはＰｒｅＳモノクローナル抗体結合のＳ／Ｎ値
を、同じ領域内の別のモノクローナル抗体結合のＳ／Ｎ
値で除した。下線を引いてある値は、ａｙｗ３サブタイ
プと有意に相違しているものである。Ｓ／Ｎ値の決定は
、物質および方法において記載したものと同様にして行
った。 （ｂ）最後の数字の表記は、表２−３に示すように、簡
潔のため省いた。
のＳまたはＰｒｅＳモノクローナル抗体結合のＳ／Ｎ値
を、同じ領域内の別のモノクローナル抗体結合のＳ／Ｎ
値で除した。下線を引いてある値は、ａｙｗ３サブタイ
プと有意に相違しているものである。Ｓ／Ｎ値の決定は
、物質および方法において記載したものと同様にして行
った。 （ｂ）最後の数字の表記は、表２−３に示すように、簡
潔のため省いた。
【００８９】抗Ｓモノクローナル抗体の結合比を用いて
、ａｄサブタイプはａｙサブタイプから容易に識別する
ことができ、ａｄｗ２サブタイプはａｄｒおよびａｄｗ
４サブタイプと容易に識別することができ、ａｙｗ１サ
ブタイプは他のａｙｗサブタイプから容易に識別するこ
とができた。ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体反応性に基
づき、ａｙｗ２およびａｙｗ３以外のすべてのパリスサ
ブタイプを互いに識別することができた。
、ａｄサブタイプはａｙサブタイプから容易に識別する
ことができ、ａｄｗ２サブタイプはａｄｒおよびａｄｗ
４サブタイプと容易に識別することができ、ａｙｗ１サ
ブタイプは他のａｙｗサブタイプから容易に識別するこ
とができた。ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体反応性に基
づき、ａｙｗ２およびａｙｗ３以外のすべてのパリスサ
ブタイプを互いに識別することができた。
【００９０】表６（パリスサブタイプパネルとのＰｒｅ
Ｓ２およびＰｒｅＳ１モノクローナル抗体の相対的反応
性）（１９７５）
Ｓ２およびＰｒｅＳ１モノクローナル抗体の相対的反応
性）（１９７５）
【表６】
（ａ）＋＋：Ｓ／Ｎ＞１００、＋：５＜Ｓ／Ｎ＜７５、
−：Ｓ／Ｎ＜５［Ｓ／Ｎは、試料含有ＨＢｓＡｇのｃｐ
ｍを陰性ヒト血漿のｃｐｍで除したもの］（ｂ）＋＋：
Ｓ／Ｎ＞３０、＋：５＜Ｓ／Ｎ＜３０、−：Ｓ／Ｎ＜５
−：Ｓ／Ｎ＜５［Ｓ／Ｎは、試料含有ＨＢｓＡｇのｃｐ
ｍを陰性ヒト血漿のｃｐｍで除したもの］（ｂ）＋＋：
Ｓ／Ｎ＞３０、＋：５＜Ｓ／Ｎ＜３０、−：Ｓ／Ｎ＜５
【００９１】群１のＰｒｅＳ２モノクローナル抗体、５
０−８０−１９４および１１６−１８３−４０６は、サ
ブタイプａｙｒ、ａｄｗ４、またはａｄｒと殆どまたは
全く反応性を示さなかった。しかしながら、これらモノ
クローナルのａｙｗ１サブタイプへの結合は有意に異な
っていた。５０−８０−１９４はａｙｗ１に強く結合し
たが、１１６−１８３−４０６はこのサブタイプに対し
て実質的に結合を示さなかった（表５−６）。
０−８０−１９４および１１６−１８３−４０６は、サ
ブタイプａｙｒ、ａｄｗ４、またはａｄｒと殆どまたは
全く反応性を示さなかった。しかしながら、これらモノ
クローナルのａｙｗ１サブタイプへの結合は有意に異な
っていた。５０−８０−１９４はａｙｗ１に強く結合し
たが、１１６−１８３−４０６はこのサブタイプに対し
て実質的に結合を示さなかった（表５−６）。
【００９２】別の群１のモノクローナル抗体である１２
８−４１０−１９４は、ａｄｗ２を除いてすべてのサブ
タイプに対して１１６−１８３−４０６と同じ反応性で
あった。実際、１２８−４１０−１９４は、ａｙｗ２−
４サブタイプに対してのみ高親和性にて結合する。第四
の群１のモノクローナル抗体である２５−１９−１１７
は、すべてのパリスサブタイプ成員と結合するが、サブ
タイプａｙｗ１およびａｄｗ４に対しては有意に低い親
和性を示した。
８−４１０−１９４は、ａｄｗ２を除いてすべてのサブ
タイプに対して１１６−１８３−４０６と同じ反応性で
あった。実際、１２８−４１０−１９４は、ａｙｗ２−
４サブタイプに対してのみ高親和性にて結合する。第四
の群１のモノクローナル抗体である２５−１９−１１７
は、すべてのパリスサブタイプ成員と結合するが、サブ
タイプａｙｗ１およびａｄｗ４に対しては有意に低い親
和性を示した。
【００９３】群１のモノクローナル抗体とは対照的に、
群２ａのモノクローナル抗体（１１６−３４−２６３）
はすべてのパリスサブタイプに対して高い親和性を示す
。 群２ａのモノクローナル抗体（１１６−３４−２６３）
と群２ｂのモノクローナル抗体（１１５−３２−１８１
）とを比較すると、１１５−３２−１８１および１１５
−３２−１８１および１１６−３４−２６３の両方の結
合ともアスパラギン１２３部位でのグリカンに依存して
はいるが、ａｙｒサブタイプは群２ａに対して有意に一
層反応性であることを示していた。それゆえ、ＰｒｅＳ
２群２のモノクローナル抗体は、すべてのＨＢＶサブタ
イプに対して実質的に等しく結合することができるので
、サンドイッチ型のイムノアッセイにおいて検出抗体と
して好ましい。
群２ａのモノクローナル抗体（１１６−３４−２６３）
はすべてのパリスサブタイプに対して高い親和性を示す
。 群２ａのモノクローナル抗体（１１６−３４−２６３）
と群２ｂのモノクローナル抗体（１１５−３２−１８１
）とを比較すると、１１５−３２−１８１および１１５
−３２−１８１および１１６−３４−２６３の両方の結
合ともアスパラギン１２３部位でのグリカンに依存して
はいるが、ａｙｒサブタイプは群２ａに対して有意に一
層反応性であることを示していた。それゆえ、ＰｒｅＳ
２群２のモノクローナル抗体は、すべてのＨＢＶサブタ
イプに対して実質的に等しく結合することができるので
、サンドイッチ型のイムノアッセイにおいて検出抗体と
して好ましい。
【００９４】群３ＰｒｅＳ２のモノクローナル抗体であ
る１２８−６０３−１０８は、他のＰｒｅＳ２モノクロ
ーナル抗体とは異なるサブタイプ反応性を示した。この
モノクローナル抗体は、サブタイプａｄｗ２、ａｄｗ４
またはａｙｗ１とは有意の結合を示さず、またａｙｗ２
、ａｙｗ３、ａｙｒおよびａｄｒに比べてａｙｗ４に対
して低い親和性を有する。
る１２８−６０３−１０８は、他のＰｒｅＳ２モノクロ
ーナル抗体とは異なるサブタイプ反応性を示した。この
モノクローナル抗体は、サブタイプａｄｗ２、ａｄｗ４
またはａｙｗ１とは有意の結合を示さず、またａｙｗ２
、ａｙｗ３、ａｙｒおよびａｄｒに比べてａｙｗ４に対
して低い親和性を有する。
【００９５】ＰｒｅＳ１領域には炭水化物が結合してい
ないので、マッピングしたエピトープはすべてアミノ酸
配列のみに基づいて定められる。最も著しいサブタイプ
の相違は、２つの群２ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体、
すなわち１１６−８６−２９３および１１５−１６−４
０７の間で観察される。１１５−１６−４０７は１１６
−８６−２９３に比べてａｙｗ１、ａｙｒおよびａｄｗ
２に対して弱く結合する。この反応性の相違の最も簡単
な説明は、このエピトープ中で３つのすべてのサブタイ
プに共通するアミノ酸が一つ変化したことである。
ないので、マッピングしたエピトープはすべてアミノ酸
配列のみに基づいて定められる。最も著しいサブタイプ
の相違は、２つの群２ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体、
すなわち１１６−８６−２９３および１１５−１６−４
０７の間で観察される。１１５−１６−４０７は１１６
−８６−２９３に比べてａｙｗ１、ａｙｒおよびａｄｗ
２に対して弱く結合する。この反応性の相違の最も簡単
な説明は、このエピトープ中で３つのすべてのサブタイ
プに共通するアミノ酸が一つ変化したことである。
【００９６】ＰｒｅＳ１群２のモノクローナル抗体（１
１６−８６−２９３）および群１のモノクローナル抗体
（１１６−８０−１７９）の反応性を比較しても興味深
い。１１６−８０−１７９に対する１１６−８６−２９
３の結合比は、ａｄｗ４サブタイプに対するものが他の
すべてのサブタイプに対するものより大きい（表５）。 このことについては２つの説明が可能である。群２のエ
ピトープよりもＰｒｅＳ１領域のアミノ末端に近い群１
のエピトープが優先的に欠失もしくは破壊されているか
（たとえば、タンパク質加水分解により）、またはａｄ
ｗ４が群１ＰｒｅＳ１の領域中に独特の配列を有してい
る。異なるハイブリドーマからの幾つかのＰｒｅＳ１モ
ノクローナル抗体は、パリスＨＢｓＡｇサブタイプとの
反応性について殆ど変化がないかまたはわずかしか変化
を示さない。このことは、ＰｒｅＳ１群１および群２の
エピトープが比較的保存されていることを示唆している
。
１６−８６−２９３）および群１のモノクローナル抗体
（１１６−８０−１７９）の反応性を比較しても興味深
い。１１６−８０−１７９に対する１１６−８６−２９
３の結合比は、ａｄｗ４サブタイプに対するものが他の
すべてのサブタイプに対するものより大きい（表５）。 このことについては２つの説明が可能である。群２のエ
ピトープよりもＰｒｅＳ１領域のアミノ末端に近い群１
のエピトープが優先的に欠失もしくは破壊されているか
（たとえば、タンパク質加水分解により）、またはａｄ
ｗ４が群１ＰｒｅＳ１の領域中に独特の配列を有してい
る。異なるハイブリドーマからの幾つかのＰｒｅＳ１モ
ノクローナル抗体は、パリスＨＢｓＡｇサブタイプとの
反応性について殆ど変化がないかまたはわずかしか変化
を示さない。このことは、ＰｒｅＳ１群１および群２の
エピトープが比較的保存されていることを示唆している
。
【００９７】表６の８つの主要なサブタイプに加えて、
他の３つのサブタイプがパリスで同定された（１９７５
）。その一つであるａｙｗ３＊は、Ｓモノクローナル抗
体結合およびＰｒｅＳモノクローナル抗体結合に基づい
てはａｙｗ２およびａｙｗ３と識別できない（表５）。 他のサブタイプであるａｄｒｑ−は、ａｄｒ［クールー
ス−ポーティー（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ−Ｐａｕｔｙ）らに
よってａｄｒｑ＋とも呼ばれる；Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，
４４、１９７（１９８３）］殆ど同一の反応性を示した
（表５）。これらサブタイプの微妙な差異は、ポリクロ
ーナルまたはアフィニティー吸着ポリクローナル抗血清
との差別的反応性に基づいて以前になされている。ａｄ
ｙｗと呼ばれるパリスサブタイプは、ａｄサブタイプと
ａｙサブタイプとが別の粒子上に存在する患者から得ら
れた［ポール（Ｄ．Ｐａｕｌ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、１３、４３（１９８６）］。ＳおよびＰ
ｒｅＳモノクローナル抗体反応性はａｄｗ粒子とａｙｗ
粒子との混合物と一致するものであったが、ａｙ粒子か
らａｄ粒子を分離する試みはなされておらず、この試み
がなされれば個々のサブタイプの一層詳細な特徴付けが
可能となるであろう。
他の３つのサブタイプがパリスで同定された（１９７５
）。その一つであるａｙｗ３＊は、Ｓモノクローナル抗
体結合およびＰｒｅＳモノクローナル抗体結合に基づい
てはａｙｗ２およびａｙｗ３と識別できない（表５）。 他のサブタイプであるａｄｒｑ−は、ａｄｒ［クールー
ス−ポーティー（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ−Ｐａｕｔｙ）らに
よってａｄｒｑ＋とも呼ばれる；Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，
４４、１９７（１９８３）］殆ど同一の反応性を示した
（表５）。これらサブタイプの微妙な差異は、ポリクロ
ーナルまたはアフィニティー吸着ポリクローナル抗血清
との差別的反応性に基づいて以前になされている。ａｄ
ｙｗと呼ばれるパリスサブタイプは、ａｄサブタイプと
ａｙサブタイプとが別の粒子上に存在する患者から得ら
れた［ポール（Ｄ．Ｐａｕｌ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、１３、４３（１９８６）］。ＳおよびＰ
ｒｅＳモノクローナル抗体反応性はａｄｗ粒子とａｙｗ
粒子との混合物と一致するものであったが、ａｙ粒子か
らａｄ粒子を分離する試みはなされておらず、この試み
がなされれば個々のサブタイプの一層詳細な特徴付けが
可能となるであろう。
【００９８】以上のデータから種々の感染個体のＨＢｓ
Ａｇサブタイプを決定することが可能である。公知の抗
Ｓモノクローナル抗体であるＨ９５およびＨ１０（それ
ぞれｄサブタイプまたはｙサブタイプと強く反応する）
との血清ＨＢｓＡｇ反応性を測定することにより、まず
サブタイプｄとサブタイプｙとを識別することができる
。別法として、もっぱら本発明のＰｒｅＳ１モノクロー
ナル抗体およびＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を用いた
サブタイプ決定法を行うことができる。本発明の代表的
なサブタイプ決定法の模式図を図２に示す。図２におい
て、第三の数字を簡潔のためモノクローナル抗体の表示
から省いてある。本発明のモノクローナル抗体において
は観察されるＨＢＶサブタイプ反応性の差異が大きいの
で、Ｓ特異的モノクローナル抗体を用いた詳細な結合曲
線の作成は必要ではない。
Ａｇサブタイプを決定することが可能である。公知の抗
Ｓモノクローナル抗体であるＨ９５およびＨ１０（それ
ぞれｄサブタイプまたはｙサブタイプと強く反応する）
との血清ＨＢｓＡｇ反応性を測定することにより、まず
サブタイプｄとサブタイプｙとを識別することができる
。別法として、もっぱら本発明のＰｒｅＳ１モノクロー
ナル抗体およびＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を用いた
サブタイプ決定法を行うことができる。本発明の代表的
なサブタイプ決定法の模式図を図２に示す。図２におい
て、第三の数字を簡潔のためモノクローナル抗体の表示
から省いてある。本発明のモノクローナル抗体において
は観察されるＨＢＶサブタイプ反応性の差異が大きいの
で、Ｓ特異的モノクローナル抗体を用いた詳細な結合曲
線の作成は必要ではない。
【００９９】本発明のサブタイプ決定法の他の態様にお
いては、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１タンパク質およびＰｒｅＳ
２タンパク質に対する複数のモノクローナル抗体を固相
上の個々の位置にスポットし、単一の試料から同時に決
定することが可能となるようにする。好ましい固相は、
超音波ホーンで複数の孤立した「島」を浮き彫りにした
ニトロセルロース膜である。一般に、１３個の直径２．
５ｍｍの円をパターンとして用い、これら円に捕捉抗体
を適用する。捕捉モノクローナル抗体をニトロセルロー
スの「島」にスポットし、乾燥する。非特異的結合を防
ぐため、ブロッキング工程においてＢＳＡまたはゼラチ
ンで反応表面をオーバーコーティングするのが好ましい
。ついで、固相をプラスチック試験カードに組み立てる
。単一の反応表面上に３０までのモノクローナル抗体（
または、異なる濃度でモノクローナル抗体を適用するこ
とができる）を適用することができる。
いては、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１タンパク質およびＰｒｅＳ
２タンパク質に対する複数のモノクローナル抗体を固相
上の個々の位置にスポットし、単一の試料から同時に決
定することが可能となるようにする。好ましい固相は、
超音波ホーンで複数の孤立した「島」を浮き彫りにした
ニトロセルロース膜である。一般に、１３個の直径２．
５ｍｍの円をパターンとして用い、これら円に捕捉抗体
を適用する。捕捉モノクローナル抗体をニトロセルロー
スの「島」にスポットし、乾燥する。非特異的結合を防
ぐため、ブロッキング工程においてＢＳＡまたはゼラチ
ンで反応表面をオーバーコーティングするのが好ましい
。ついで、固相をプラスチック試験カードに組み立てる
。単一の反応表面上に３０までのモノクローナル抗体（
または、異なる濃度でモノクローナル抗体を適用するこ
とができる）を適用することができる。
【０１００】１３個の一連のモノクローナル抗体、すな
わち、Ｓ領域に対する３つのモノクローナル抗体（Ｈ９
５、Ｈ１６６およびＨ１０）、ＰｒｅＳ２領域に対する
７つのモノクローナル抗体（５０−８０−１９４、２５
−１９−１１７、１１６−１８３−４０６、１２８−４
１０−１９４、１１６−３４−２６３、１１５−３２−
１８１、１２８−６０３−１０８）、およびＰｒｅＳ１
領域に対する３つのモノクローナル抗体（１１６−８０
−１７９、１１６−８６−２９３、１１５−１６−４０
７）は、エンベロープ領域におけるＨＢＶサブタイプ変
異に対して特に有用である。ＨＢｓＡｇのスポットおよ
び無関係のモノクローナル抗体のスポットも、それぞれ
陽性コントロールおよび陰性コントロールとして含まれ
ている。
わち、Ｓ領域に対する３つのモノクローナル抗体（Ｈ９
５、Ｈ１６６およびＨ１０）、ＰｒｅＳ２領域に対する
７つのモノクローナル抗体（５０−８０−１９４、２５
−１９−１１７、１１６−１８３−４０６、１２８−４
１０−１９４、１１６−３４−２６３、１１５−３２−
１８１、１２８−６０３−１０８）、およびＰｒｅＳ１
領域に対する３つのモノクローナル抗体（１１６−８０
−１７９、１１６−８６−２９３、１１５−１６−４０
７）は、エンベロープ領域におけるＨＢＶサブタイプ変
異に対して特に有用である。ＨＢｓＡｇのスポットおよ
び無関係のモノクローナル抗体のスポットも、それぞれ
陽性コントロールおよび陰性コントロールとして含まれ
ている。
【０１０１】アッセイにおいては、試料（正味のものま
たは希釈したもの）を反応表面に適用し、３５〜４１℃
で１〜１８時間撹拌する。反応表面を緩衝溶液で洗浄し
、ついでＨＢＶの普遍的なａ抗原決定基に対する酵素標
識モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（結合
体）を加え、１〜２時間インキュベートする。結合体を
吸引除去し、反応表面を再び洗浄し、結合体に対する沈
殿基質を含有する溶液を加える。反応を停止させるため
、反応表面を緩衝溶液で洗浄し、乾燥させる。個々のス
ポットの色を視覚で評価するかまたはフロントフェース
反射計で定量する。
たは希釈したもの）を反応表面に適用し、３５〜４１℃
で１〜１８時間撹拌する。反応表面を緩衝溶液で洗浄し
、ついでＨＢＶの普遍的なａ抗原決定基に対する酵素標
識モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（結合
体）を加え、１〜２時間インキュベートする。結合体を
吸引除去し、反応表面を再び洗浄し、結合体に対する沈
殿基質を含有する溶液を加える。反応を停止させるため
、反応表面を緩衝溶液で洗浄し、乾燥させる。個々のス
ポットの色を視覚で評価するかまたはフロントフェース
反射計で定量する。
【０１０２】実施例３（ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２抗
原アッセイ） Ａ．ＰｒｅＳ２抗原アッセイ ＰｒｅＳ２抗原アッセイにおいては特に、ヤギ抗ＨＢｓ
抗体（アボット・ラボラトリーズ）をコーティングした
ビーズを、放射性標識または酵素標識したモノクローナ
ル抗体（５０−８０−１９４または２５−１９−１１７
）とともに用いた。殆どの実験は、結合ポリクローナル
モルモット抗Ｓ抗体、および１２５Ｉ標識モノクローナ
ル抗ＰｒｅＳ２抗体（群２：１１６−３４−２６３およ
び／または群１：５０−８０−１９４）の混合物を含有
するトレーサー溶液からなるアウスザイムＲＩＩビーズ
（アボット・ラボラトリーズ）を用いて行った。
原アッセイ） Ａ．ＰｒｅＳ２抗原アッセイ ＰｒｅＳ２抗原アッセイにおいては特に、ヤギ抗ＨＢｓ
抗体（アボット・ラボラトリーズ）をコーティングした
ビーズを、放射性標識または酵素標識したモノクローナ
ル抗体（５０−８０−１９４または２５−１９−１１７
）とともに用いた。殆どの実験は、結合ポリクローナル
モルモット抗Ｓ抗体、および１２５Ｉ標識モノクローナ
ル抗ＰｒｅＳ２抗体（群２：１１６−３４−２６３およ
び／または群１：５０−８０−１９４）の混合物を含有
するトレーサー溶液からなるアウスザイムＲＩＩビーズ
（アボット・ラボラトリーズ）を用いて行った。
【０１０３】Ｂ．ＰｒｅＳ１抗原アッセイＰｒｅＳ１抗
原を検出するため、モノクローナルアウスザイムＲまた
はアウスザイムＲＩＩビーズを、放射性標識または酵素
標識モノクローナル抗体１１６−２９−１２９（群１）
とともに用いた。また、モノクローナル抗体１１６−８
０−１７９（群１）をコーティングしたビーズを、プロ
ーブとして放射性標識または酵素標識した１１６−８−
１５１または１１６−７２−２７０（ともに群２）とと
もに用いた。
原を検出するため、モノクローナルアウスザイムＲまた
はアウスザイムＲＩＩビーズを、放射性標識または酵素
標識モノクローナル抗体１１６−２９−１２９（群１）
とともに用いた。また、モノクローナル抗体１１６−８
０−１７９（群１）をコーティングしたビーズを、プロ
ーブとして放射性標識または酵素標識した１１６−８−
１５１または１１６−７２−２７０（ともに群２）とと
もに用いた。
【０１０４】Ｃ．結果
１．ＰｒｅＳ２抗原アッセイ
ヤギ抗ＨＢｓ抗体（アボット・ラボラトリーズ）コーテ
ィングビーズ、および第二の工程にＰｒｅＳ２モノクロ
ーナル抗体（２５−１９−１１７）（群１ｂ）、ついで
ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた検出工程を行う
３工程態様アッセイを多くの実験に用い、良好な感度お
よび選択性を得た。アウスザイムＲＩＩビーズ、および
検出モノクローナル抗体としてＨＲＰ結合または１２５
Ｉ−ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体［２５−１９−１１
７（１ｂ）、５０−８０−１９４（１ａ）＋１１６−３
４−２６３（群２ａ）］を用いて、等価な感度および選
択性を有する２工程法をも開発した。
ィングビーズ、および第二の工程にＰｒｅＳ２モノクロ
ーナル抗体（２５−１９−１１７）（群１ｂ）、ついで
ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた検出工程を行う
３工程態様アッセイを多くの実験に用い、良好な感度お
よび選択性を得た。アウスザイムＲＩＩビーズ、および
検出モノクローナル抗体としてＨＲＰ結合または１２５
Ｉ−ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体［２５−１９−１１
７（１ｂ）、５０−８０−１９４（１ａ）＋１１６−３
４−２６３（群２ａ）］を用いて、等価な感度および選
択性を有する２工程法をも開発した。
【０１０５】モノクローナルアウスザイムＲによりＨＢ
ｓＡｇについて陰性と試験された１００の試料は、上記
ＰｒｅＳ２抗原アッセイでもすべて反応しなかった。こ
れら陰性群に基づいて、ＥＩＡアッセイについて０．０
５＋ＮＣｘ、ＲＩＡについて４×ＮＣｘのカットオフを
選択した（陰性群平均から７よりも大きい標準偏差）。 ＰｒｅＳ２Ａｇを定量するため、ｈｐＨＢｓＡｇ調製物
の希釈を各アッセイで行った。ｈｐＨＢｓＡｇ調製物中
の全Ｍタンパク質のパーセントをクマシー染色ＳＤＳゲ
ルのスキャニング密度計により測定した。これら定量実
験に使用した調製物には１５％のＭタンパク質が含まれ
ていた。ＰｒｅＳ２アッセイの感度は、全ｈｐＨＢｓＡ
ｇが約１ｎｇ／ｍｌ、Ｍタンパク質が０．１５ｎｇ／ｍ
ｌと決定された。
ｓＡｇについて陰性と試験された１００の試料は、上記
ＰｒｅＳ２抗原アッセイでもすべて反応しなかった。こ
れら陰性群に基づいて、ＥＩＡアッセイについて０．０
５＋ＮＣｘ、ＲＩＡについて４×ＮＣｘのカットオフを
選択した（陰性群平均から７よりも大きい標準偏差）。 ＰｒｅＳ２Ａｇを定量するため、ｈｐＨＢｓＡｇ調製物
の希釈を各アッセイで行った。ｈｐＨＢｓＡｇ調製物中
の全Ｍタンパク質のパーセントをクマシー染色ＳＤＳゲ
ルのスキャニング密度計により測定した。これら定量実
験に使用した調製物には１５％のＭタンパク質が含まれ
ていた。ＰｒｅＳ２アッセイの感度は、全ｈｐＨＢｓＡ
ｇが約１ｎｇ／ｍｌ、Ｍタンパク質が０．１５ｎｇ／ｍ
ｌと決定された。
【０１０６】Ｓ遺伝子のみを含む組換えＨＢｓＡｇは、
３００μｇ／ｍｌまでの濃度では抗ＰｒｅＳ２アッセイ
を抑制せず、８０，０００倍過剰のＳタンパク質の存在
下でＰｒｅＳ２Ａｇを検出し得ることが示された。ＨＢ
Ｖキャリアからの２００の血漿試料を、モノクローナル
アウスザイムＲアッセイを用いてＨＢｓＡｇについて、
上記ＰｒｅＳ２Ａｇアッセイを用いてＭタンパク質につ
いて定量アッセイした。ＨＢｅＡｇ陽性キャリアの９９
％（１０２／１０３）および抗ＨＢｅ陽性キャリアの９
５％（８１／８５）がＰｒｅＳ２Ａｇアッセイにより反
応性であった。平均してＭタンパク質レベルは、抗ＨＢ
ｅ陽性グループに比べるとＨＢｅＡｇ陽性キャリアの方
が１１倍高かった（ＨＢｓＡｇレベルは５倍高かった）
。
３００μｇ／ｍｌまでの濃度では抗ＰｒｅＳ２アッセイ
を抑制せず、８０，０００倍過剰のＳタンパク質の存在
下でＰｒｅＳ２Ａｇを検出し得ることが示された。ＨＢ
Ｖキャリアからの２００の血漿試料を、モノクローナル
アウスザイムＲアッセイを用いてＨＢｓＡｇについて、
上記ＰｒｅＳ２Ａｇアッセイを用いてＭタンパク質につ
いて定量アッセイした。ＨＢｅＡｇ陽性キャリアの９９
％（１０２／１０３）および抗ＨＢｅ陽性キャリアの９
５％（８１／８５）がＰｒｅＳ２Ａｇアッセイにより反
応性であった。平均してＭタンパク質レベルは、抗ＨＢ
ｅ陽性グループに比べるとＨＢｅＡｇ陽性キャリアの方
が１１倍高かった（ＨＢｓＡｇレベルは５倍高かった）
。
【０１０７】Ｍタンパク質濃度が１０μｇ／ｍｌよりも
高い試料は、例外なくＨＢｅＡｇ陽性グループに入った
。この値以下では、ＨＢｅＡｇ陽性試料と抗ＨＢｅ陽性
試料との間でＭタンパク質濃度がかなり重複していた。 これら集団の下位群におけるＨＢＶ ＤＮＡ濃度を決定
したが、Ｍタンパク質との相関は不良であった（データ
は示していない）。
高い試料は、例外なくＨＢｅＡｇ陽性グループに入った
。この値以下では、ＨＢｅＡｇ陽性試料と抗ＨＢｅ陽性
試料との間でＭタンパク質濃度がかなり重複していた。 これら集団の下位群におけるＨＢＶ ＤＮＡ濃度を決定
したが、Ｍタンパク質との相関は不良であった（データ
は示していない）。
【０１０８】これらのデータを総合すると、ＰｒｅＳ２
抗原は、抗Ｓ特異的試験（モノクローナルアウスザイム
Ｒ）から得られる以上の情報は得られず、活性なウイル
ス複製の正確な指標としては働かないことを示唆してい
る。
抗原は、抗Ｓ特異的試験（モノクローナルアウスザイム
Ｒ）から得られる以上の情報は得られず、活性なウイル
ス複製の正確な指標としては働かないことを示唆してい
る。
【０１０９】２．ＰｒｅＳ１抗原アッセイＰｒｅＳ１Ａ
ｇの検出のため４つのサンドイッチイムノアッセイを行
った。１つはモノクローナルアウスザイムＲビーズおよ
び検出系としてＨＲＰ結合ＰｒｅＳ１モノクローナル抗
体（１１６−２９−１２９、群１）を用いたものであり
、第二のものは、固相捕捉抗体としてＰｒｅＳ１モノク
ローナル抗体（１１６−８０−１７９、群１）および検
出モノクローナル抗体としてＨＲＰ結合または放射性標
識ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体（１１６−７２−２７
０、群３）を用いたものであり、第三のものはアウスザ
イムＲＩＩビーズおよび検出モノクローナル抗体として
１２５Ｉ標識１１６−２９−１２９および１１６−８−
１５１（群２）を含有するトレーサーを用いたものであ
り、第四のものはアウスザイムＲＩＩビーズおよび１２
５Ｉ標識１１６−８０−１７９（群１）および１１６−
８６−２９０（群２）を用いたものである。
ｇの検出のため４つのサンドイッチイムノアッセイを行
った。１つはモノクローナルアウスザイムＲビーズおよ
び検出系としてＨＲＰ結合ＰｒｅＳ１モノクローナル抗
体（１１６−２９−１２９、群１）を用いたものであり
、第二のものは、固相捕捉抗体としてＰｒｅＳ１モノク
ローナル抗体（１１６−８０−１７９、群１）および検
出モノクローナル抗体としてＨＲＰ結合または放射性標
識ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体（１１６−７２−２７
０、群３）を用いたものであり、第三のものはアウスザ
イムＲＩＩビーズおよび検出モノクローナル抗体として
１２５Ｉ標識１１６−２９−１２９および１１６−８−
１５１（群２）を含有するトレーサーを用いたものであ
り、第四のものはアウスザイムＲＩＩビーズおよび１２
５Ｉ標識１１６−８０−１７９（群１）および１１６−
８６−２９０（群２）を用いたものである。
【０１１０】ＰｒｅＳ１Ａｇを定量するため、精製デイ
ン粒子の希釈を各アッセイで行った。Ｍタンパク質の場
合に用いた手順と同様にして、デイン調製物中に含まれ
る全Ｌタンパク質のパーセントを決定した。定量に使用
したデイン調製物は、約１０％のＬタンパク質を含んで
いた。アッセイのカットオフ値を決定するため、１００
のＨＢｓＡｇ陰性血清および血漿をアッセイにかけた。 ＥＩＡにおいて０．０５＋ＮＣｘのカットオフ値を、Ｒ
ＩＡにおいて４×ＮＣｘのカットオフ値（陰性集団の平
均から７以上の標準偏差）を用いた場合には、すべての
試料は反応しなかった。
ン粒子の希釈を各アッセイで行った。Ｍタンパク質の場
合に用いた手順と同様にして、デイン調製物中に含まれ
る全Ｌタンパク質のパーセントを決定した。定量に使用
したデイン調製物は、約１０％のＬタンパク質を含んで
いた。アッセイのカットオフ値を決定するため、１００
のＨＢｓＡｇ陰性血清および血漿をアッセイにかけた。 ＥＩＡにおいて０．０５＋ＮＣｘのカットオフ値を、Ｒ
ＩＡにおいて４×ＮＣｘのカットオフ値（陰性集団の平
均から７以上の標準偏差）を用いた場合には、すべての
試料は反応しなかった。
【０１１１】ＨＢＶキャリヤ（ｎ＝２２９）からのすべ
てのＨＢｅＡｇ陽性試料および抗ＨＢｅ陽性試料の９６
．６％（５７／５９）が、ＰｒｅＳ１Ａｇアッセイにお
いて反応性であった。ＰｒｅＳ１Ａｇ濃度は、８ｎｇ／
ｍｌ未満から１６ｎｇ／ｍｌを越えるものまで広範囲に
わたって変わった。Ｌ抗原が０．９μｇ／ｍｌを越える
ものは抗ＨＢｅ陽性試料では認められなかったのに対し
て、ＨＢｅＡｇ陽性試料では３７．５％あった。血清中
のＬタンパク質の濃度が０．９μｇ／ｍｌ未満では、Ｈ
ＢｅＡｇ反応性試料と抗ＨＢｅ反応性試料との間でＰｒ
ｅＳ１Ａｇ濃度に有意の重複が観察される。
てのＨＢｅＡｇ陽性試料および抗ＨＢｅ陽性試料の９６
．６％（５７／５９）が、ＰｒｅＳ１Ａｇアッセイにお
いて反応性であった。ＰｒｅＳ１Ａｇ濃度は、８ｎｇ／
ｍｌ未満から１６ｎｇ／ｍｌを越えるものまで広範囲に
わたって変わった。Ｌ抗原が０．９μｇ／ｍｌを越える
ものは抗ＨＢｅ陽性試料では認められなかったのに対し
て、ＨＢｅＡｇ陽性試料では３７．５％あった。血清中
のＬタンパク質の濃度が０．９μｇ／ｍｌ未満では、Ｈ
ＢｅＡｇ反応性試料と抗ＨＢｅ反応性試料との間でＰｒ
ｅＳ１Ａｇ濃度に有意の重複が観察される。
【０１１２】ＨＢｅＡｇ陽性試料の９３％が血清中に検
出可能なＨＢＶ ＤＮＡを有していた（平均［ＨＢＶ−
ＤＮＡ］＝６３．８ｐｇ／ｍｌ、０．５〜４４５ｐｇ／
ｍｌの範囲）のに対して、抗ＨＢｅ陽性試料では２０％
であった（平均［ＨＢＶ−ＤＮＡ］＝２．１４ｐｇ／ｍ
ｌ、１．７〜２．４ｐｇ／ｍｌの範囲）。
出可能なＨＢＶ ＤＮＡを有していた（平均［ＨＢＶ−
ＤＮＡ］＝６３．８ｐｇ／ｍｌ、０．５〜４４５ｐｇ／
ｍｌの範囲）のに対して、抗ＨＢｅ陽性試料では２０％
であった（平均［ＨＢＶ−ＤＮＡ］＝２．１４ｐｇ／ｍ
ｌ、１．７〜２．４ｐｇ／ｍｌの範囲）。
【０１１３】高ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を有する血清は、高
濃度のＰｒｅＳ１Ａｇを有する傾向がある。これらマー
カーの間に有意の定量的相関（Ｒ＝０．５２）が存在す
る。ＰｒｅＳ１Ａｇ濃度とＨＢｓＡｇ濃度との間には低
い定量的相関が存在する（Ｒ＝０．３８）。
濃度のＰｒｅＳ１Ａｇを有する傾向がある。これらマー
カーの間に有意の定量的相関（Ｒ＝０．５２）が存在す
る。ＰｒｅＳ１Ａｇ濃度とＨＢｓＡｇ濃度との間には低
い定量的相関が存在する（Ｒ＝０．３８）。
【０１１４】実施例４（抗体アッセイ）血清陽性の個体
の血液中の抗ＰｒｅＳ２抗体についてアッセイを行うた
め、還元しインドアセトアミドを付加したＳタンパク質
を含むＨＢｓＡｇをコーティングした単一の０．２５イ
ンチポリスチレンビーズに血清（２００μｌ）を加えた
。この混合物を２５℃で１８時間インキュベートし、つ
いで水洗し、１２５Ｉ標識モノクローナル抗体５０−８
０−１９４（１μＣｉ／ｍｌ；２００μｌ）を動物血清
を含有する希釈液中に加えた。混合物を４０℃にて２時
間インキュベートし、洗浄して遊離のモノクローナル抗
体を除去し、ビーズをカウントした。一人のＨＢＶ患者
のＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ抗体および抗ＰｒｅＳ２抗体の
経時変化を下記表７にまとめて示す。
の血液中の抗ＰｒｅＳ２抗体についてアッセイを行うた
め、還元しインドアセトアミドを付加したＳタンパク質
を含むＨＢｓＡｇをコーティングした単一の０．２５イ
ンチポリスチレンビーズに血清（２００μｌ）を加えた
。この混合物を２５℃で１８時間インキュベートし、つ
いで水洗し、１２５Ｉ標識モノクローナル抗体５０−８
０−１９４（１μＣｉ／ｍｌ；２００μｌ）を動物血清
を含有する希釈液中に加えた。混合物を４０℃にて２時
間インキュベートし、洗浄して遊離のモノクローナル抗
体を除去し、ビーズをカウントした。一人のＨＢＶ患者
のＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ抗体および抗ＰｒｅＳ２抗体の
経時変化を下記表７にまとめて示す。
【０１１５】
【表７】
表７
各日における アウスザイムＲ アウサブＲ
競合抗ＰｒｅＳ抗体患者の血液 ＨＢ
ｓＡｇ （抗ＨＢｓ） Ｓ／ＣＯ＊
解釈 １ −
− １．６２４
− ３１ ＋
− １．６２
０ − ３６
＋ − １．
５６４ − ４４
− ＋
０．９６８ ＋ ５２
− ＋
０．９８２ ＋ ６２
− ＋
０．８５８ ＋ ９３
− ＋
０．１９２ ＋１２２
− ＋
０．１６６ ＋＋（＊）ｃｐ
ｍ（試料）／ｃｐｍ（カットオフ）の比；陰性コントロ
ールの値＝２；Ｓ／ＣＯが＜１．０である場合には試料
はＰｒｅＳ２タンパク質に対する抗体について陽性（＋
）であるとする。
競合抗ＰｒｅＳ抗体患者の血液 ＨＢ
ｓＡｇ （抗ＨＢｓ） Ｓ／ＣＯ＊
解釈 １ −
− １．６２４
− ３１ ＋
− １．６２
０ − ３６
＋ − １．
５６４ − ４４
− ＋
０．９６８ ＋ ５２
− ＋
０．９８２ ＋ ６２
− ＋
０．８５８ ＋ ９３
− ＋
０．１９２ ＋１２２
− ＋
０．１６６ ＋＋（＊）ｃｐ
ｍ（試料）／ｃｐｍ（カットオフ）の比；陰性コントロ
ールの値＝２；Ｓ／ＣＯが＜１．０である場合には試料
はＰｒｅＳ２タンパク質に対する抗体について陽性（＋
）であるとする。
【０１１６】ＨＢＶエンベロープのＰｒｅＳ１領域中の
少なくとも３つの識別されるエピトープおよびＰｒｅＳ
２領域中の少なくとも４つの識別されるエピトープによ
り定められるモノクローナル抗体を産生させた。ウエス
タンブロッティングにより観察されるように、これらの
パターンはすべて、デイン粒子を熱、ＳＤＳ、およびβ
−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で処理した後も保持
される。これらの処理は、Ｓタンパク質上の抗原性部位
の殆どを破壊する。抗原決定基は直線状のエピトープで
あるかもしれないし、またはニトロセルロースにタンパ
ク質を移した後に再形成し得る立体配座的なものである
。 ＰｒｅＳ１領域およびＰｒｅＳ２領域にはシステインは
存在しないので、天然のコンホーメーションを保持する
ためにジスルフィド結合を適切に再形成する必要はない
。この点は、Ｓのたいていの抗原性エピトープ（ｐ２４
およびｇｐ２７）がジスルフィド結合生成および粒子と
して適当に組み立てられることに依存していることと対
照的である。殆どのＳ抗原決定基は、ウエスタンブロッ
ティングのために試料を調製する間のＳＤＳ／ＢＭＥ変
性工程で破壊される。
少なくとも３つの識別されるエピトープおよびＰｒｅＳ
２領域中の少なくとも４つの識別されるエピトープによ
り定められるモノクローナル抗体を産生させた。ウエス
タンブロッティングにより観察されるように、これらの
パターンはすべて、デイン粒子を熱、ＳＤＳ、およびβ
−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で処理した後も保持
される。これらの処理は、Ｓタンパク質上の抗原性部位
の殆どを破壊する。抗原決定基は直線状のエピトープで
あるかもしれないし、またはニトロセルロースにタンパ
ク質を移した後に再形成し得る立体配座的なものである
。 ＰｒｅＳ１領域およびＰｒｅＳ２領域にはシステインは
存在しないので、天然のコンホーメーションを保持する
ためにジスルフィド結合を適切に再形成する必要はない
。この点は、Ｓのたいていの抗原性エピトープ（ｐ２４
およびｇｐ２７）がジスルフィド結合生成および粒子と
して適当に組み立てられることに依存していることと対
照的である。殆どのＳ抗原決定基は、ウエスタンブロッ
ティングのために試料を調製する間のＳＤＳ／ＢＭＥ変
性工程で破壊される。
【０１１７】天然のデイン粒子との反応性についてもす
べてのモノクローナル抗体を試験したので、これらのモ
ノクローナル抗体によって定められるすべてのエピトー
プがウイルス表面上に暴露されていなければならない。 データの示すところによれば、抗ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体の一つの群（群２）については、ＰｒｅＳ２領
域中のアスパラギン（Ａｓｎ）１２３部位のグリカンは
抗原決定基の必須部分を構成している。このモノクロー
ナル抗体は他のヒト血清グリカンとは結合しないので、
ヒト血液型群タンパク質であるグリコホリンＡ（ＭＮ抗
原）について示されているように、この抗原決定基は炭
水化物とタンパク質の両方からできているらしい。
べてのモノクローナル抗体を試験したので、これらのモ
ノクローナル抗体によって定められるすべてのエピトー
プがウイルス表面上に暴露されていなければならない。 データの示すところによれば、抗ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体の一つの群（群２）については、ＰｒｅＳ２領
域中のアスパラギン（Ａｓｎ）１２３部位のグリカンは
抗原決定基の必須部分を構成している。このモノクロー
ナル抗体は他のヒト血清グリカンとは結合しないので、
ヒト血液型群タンパク質であるグリコホリンＡ（ＭＮ抗
原）について示されているように、この抗原決定基は炭
水化物とタンパク質の両方からできているらしい。
【０１１８】本発明のＰｒｅＳ２およびＰｒｅＳ１モノ
クローナル抗体は、ヒト血清および血漿中のＭタンパク
質およびＬタンパク質を検出するための特異的で高感度
のイムノアッセイを開発するのに有用であることがわか
った。以前の報告によれば、ＨＢｅＡｇの血清マーカー
の存在とＭタンパク質の存在との間に絶対的な相関関係
が主張されていた［イマイ（Ｍ．Ｉｍａｉ）ら、Ｇａｓ
ｔｒｏｅｎｔ．，７６、２４２（１９７９）］。文献中
にみられる他の主張は、ＰｒｅＳ１Ａｇの存在または不
存在が感染およびＨＢＶ ＤＮＡの存在と相関するとい
うものである。データはヒューらの仕事（上記）を支持
しており、ＨＢｅＡｇ個体はＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ２Ａ
ｇ、ＰｒｅＳ１ＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの平均濃度が
高いけれども、ＨＢｅＡｇ状態との定性的な相関が欠け
ていることを示している。
クローナル抗体は、ヒト血清および血漿中のＭタンパク
質およびＬタンパク質を検出するための特異的で高感度
のイムノアッセイを開発するのに有用であることがわか
った。以前の報告によれば、ＨＢｅＡｇの血清マーカー
の存在とＭタンパク質の存在との間に絶対的な相関関係
が主張されていた［イマイ（Ｍ．Ｉｍａｉ）ら、Ｇａｓ
ｔｒｏｅｎｔ．，７６、２４２（１９７９）］。文献中
にみられる他の主張は、ＰｒｅＳ１Ａｇの存在または不
存在が感染およびＨＢＶ ＤＮＡの存在と相関するとい
うものである。データはヒューらの仕事（上記）を支持
しており、ＨＢｅＡｇ個体はＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ２Ａ
ｇ、ＰｒｅＳ１ＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡの平均濃度が
高いけれども、ＨＢｅＡｇ状態との定性的な相関が欠け
ていることを示している。
【０１１９】本発明の高感度イムノアッセイを用いて検
出した場合に、実質的にすべてのＨＢｓＡｇキャリヤが
血清または血漿中に検出し得るＰｒｅＳ１およびＰｒｅ
Ｓ２Ａｇを有していることがわかった。それゆえ、本発
明のＰｒｅＳ Ａｇアッセイは、Ｓタンパク質（ＨＢｓ
Ａｇ）特異的試験（モノクローナルアウスザイムＲ）と
同様の診断およびスクリーニング情報を与えることが明
らかである。ＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ１、およびＰｒｅＳ
２抗原の定量は、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質およびＬ
タンパク質の濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、１０μ
ｇ／ｍｌおよび０．８μｇ／ｍｌの閾値を越える個体は
ＨＢｅＡｇ陽性でありＨＢＶ ＤＮＡ陽性であるという
情報をも与える（感度＝０．５ｐｇ／ｍｌ）。しかしな
がら、上記閾値に達しないＢ型肝炎ウイルスエンベロー
プ抗原濃度を有するＨＢＶ感染個体の大部分については
、抗ＨＢｅ／ＨＢｅＡｇ状態またはＨＢＶ ＤＮＡ検出
可能性を正確に予測することができなかった。
出した場合に、実質的にすべてのＨＢｓＡｇキャリヤが
血清または血漿中に検出し得るＰｒｅＳ１およびＰｒｅ
Ｓ２Ａｇを有していることがわかった。それゆえ、本発
明のＰｒｅＳ Ａｇアッセイは、Ｓタンパク質（ＨＢｓ
Ａｇ）特異的試験（モノクローナルアウスザイムＲ）と
同様の診断およびスクリーニング情報を与えることが明
らかである。ＨＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ１、およびＰｒｅＳ
２抗原の定量は、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質およびＬ
タンパク質の濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、１０μ
ｇ／ｍｌおよび０．８μｇ／ｍｌの閾値を越える個体は
ＨＢｅＡｇ陽性でありＨＢＶ ＤＮＡ陽性であるという
情報をも与える（感度＝０．５ｐｇ／ｍｌ）。しかしな
がら、上記閾値に達しないＢ型肝炎ウイルスエンベロー
プ抗原濃度を有するＨＢＶ感染個体の大部分については
、抗ＨＢｅ／ＨＢｅＡｇ状態またはＨＢＶ ＤＮＡ検出
可能性を正確に予測することができなかった。
【０１２０】本発明の高親和性のＰｒｅＳ２およびＰｒ
ｅＳ１モノクローナル抗体の他の用途としては、Ｌタン
パク質の肝細胞結合領域のマッピング、並びにＨＢＶ感
染肝細胞および実験的にトランスフェクションした肝細
胞株の細胞間および細胞表面染色が挙げられる。本発明
の低親和性のＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２モノクローナ
ル抗体は、組換えによるまたは血漿由来のＰｒｅＳ２お
よびＰｒｅＳ１含有タンパク質を高収率でアフィニティ
ー精製するのに有効に使用することができた。
ｅＳ１モノクローナル抗体の他の用途としては、Ｌタン
パク質の肝細胞結合領域のマッピング、並びにＨＢＶ感
染肝細胞および実験的にトランスフェクションした肝細
胞株の細胞間および細胞表面染色が挙げられる。本発明
の低親和性のＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２モノクローナ
ル抗体は、組換えによるまたは血漿由来のＰｒｅＳ２お
よびＰｒｅＳ１含有タンパク質を高収率でアフィニティ
ー精製するのに有効に使用することができた。
【０１２１】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ株の幾つかの試料は、特許手続き上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）（メリーランド２０８５２、ロックビル、パーク
ローンドライブ、１２３０１）に寄託してあり、その受
託番号を下記表８に示す。
イブリドーマ株の幾つかの試料は、特許手続き上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）（メリーランド２０８５２、ロックビル、パーク
ローンドライブ、１２３０１）に寄託してあり、その受
託番号を下記表８に示す。
【０１２２】
【表８】
表８
ハイブリドーマ
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＶ １１６−２９−１
２９ ＨＢＶ １０１１８ＨＢＶ １１
６−８−１５１ ＨＢＶ １０１１９
ＨＢＶ １１６−８６−２９３ ＨＢＶ
１０１２０ＨＢＶ ５０−８０−１９４
ＨＢＶ １０１２１ＨＢＶ １１６−３４−
２６３ ＨＢＶ １０１２２ＨＢＶ １
２８−６０３−１０８ ＨＢＶ １０４４５Ｈ
ＢＶ １１５−３２−１８１ ＨＢＶ
１０４４４ＨＢＶ １２８−４１０−１９４
ＨＢＶ １０４４３
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢＶ １１６−２９−１
２９ ＨＢＶ １０１１８ＨＢＶ １１
６−８−１５１ ＨＢＶ １０１１９
ＨＢＶ １１６−８６−２９３ ＨＢＶ
１０１２０ＨＢＶ ５０−８０−１９４
ＨＢＶ １０１２１ＨＢＶ １１６−３４−
２６３ ＨＢＶ １０１２２ＨＢＶ １
２８−６０３−１０８ ＨＢＶ １０４４５Ｈ
ＢＶ １１５−３２−１８１ ＨＢＶ
１０４４４ＨＢＶ １２８−４１０−１９４
ＨＢＶ １０４４３
【図１】 ＨＢＶエンベロープのタンパク質組成を示
す模式図である。
す模式図である。
【図２】 本発明のＨＢＶのサブタイプ決定法の一態
様を示す模式図である。
様を示す模式図である。
Claims (9)
- 【請求項１】 アミノ酸配列：ＴＶＮＰＶＬＴＴＡＳ
ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＡＬＮからなるＢ型肝炎ウイ
ルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ２タンパク質の領域中のエピト
ープに結合するモノクローナル抗体であって、ＨＢＶ
Ｍタンパク質には結合するが、ＨＢＶ Ｓタンパク質ま
たはＨＢＶ Ｌタンパク質には結合しないモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項２】 放射活性ハロゲン原子である放射性同
位体または酵素からなる、検出可能な量の結合標識をさ
らに含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のサブタ
イプの決定法であって、（ａ）固定化Ｂ型肝炎ウイルス
表面抗原の試料の第一の部分を、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１タ
ンパク質またはＨＢＶ ＰｒｅＳ２タンパク質と結合し
検出可能な標識を含む第一のモノクローナル抗体と反応
させ、ついで （ｂ）結合した標識第一モノクローナル抗体の量を計算
し、その際、該量は少なくとも１種のＨＢＶサブタイプ
が存在しないことを示すものであることを特徴とする方
法。 - 【請求項４】 試料の第二の部分および第二のＨＢＶ
ＰｒｅＳ１タンパク質または第二のＨＢＶ ＰｒｅＳ
２タンパク質に結合し検出可能な標識を含む第二の標識
モノクローナル抗体を用いて工程（ａ）および（ｂ）を
さらに繰り返すことにより、結合した標識第二モノクロ
ーナル抗体の量が少なくとも１種の別のＨＢＶサブタイ
プが存在しないことを示すようにする、請求項３に記載
の方法。 - 【請求項５】 試料の第三の部分および第三のＨＢＶ
ＰｒｅＳ１タンパク質または第三のＨＢＶ ＰｒｅＳ
２タンパク質に結合し検出可能な標識を含む第三の標識
モノクローナル抗体を用いて工程（ａ）および（ｂ）を
さらに繰り返すことにより、結合した標識第三モノクロ
ーナル抗体の量が１種以外のすべてのＨＢＶサブタイプ
が存在しないことを示すようにする、請求項４に記載の
方法。 - 【請求項６】 各モノクローナル抗体をそれぞれ放射
性標識または酵素標識する、請求項３、４または５に記
載の方法。 - 【請求項７】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の固定化を
、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対するポリクローナル抗
体に結合させることによって行い、該ポリクローナル抗
体は固体支持体に固定化させたものである、請求項３、
４または５に記載の方法。 - 【請求項８】 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のサブタ
イプの決定法であって、（ａ）固体表面上のそれぞれ別
々の領域に複数のモノクローナル抗体を固定化し、各モ
ノクローナル抗体が異なるＨＢＶ ＰｒｅＳ１エピトー
プまたはＨＢＶ ＰｒｅＳ２エピトープに結合するよう
にし、（ｂ）それぞれ別々の領域の各モノクローナル抗
体をＨＢＶを含有する試料の等量部と接触させることに
より、少なくとも幾つかの該複数の該モノクローナル抗
体と該ＨＢＶとの間に２量複合体を生成させ、 （ｃ）それぞれ別々の各領域を、ＨＢＶのａ抗原決定基
と結合し検出可能な標識を含む抗体と接触させて該標識
抗体と該２量複合体との間に３量複合体を生成させ、つ
いで （ｄ）各領域に結合した標識の量を測定し、その際、各
領域に結合した標識の相対的な量は試料中のＨＢＶの完
全なサブタイプを示すものであることを特徴とする方法
。 - 【請求項９】 複数のモノクローナル抗体が、ＨＢＶ
ＰｒｅＳ１エピトープに結合する少なくとも１種のモ
ノクローナル抗体およびＰｒｅＳ２エピトープに結合す
る少なくとも１種のモノクローナル抗体を含む、請求項
８に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52228690A | 1990-05-11 | 1990-05-11 | |
| US522,286 | 1990-05-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228087A true JPH04228087A (ja) | 1992-08-18 |
Family
ID=24080257
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3107401A Pending JPH04228087A (ja) | 1990-05-11 | 1991-05-13 | Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープのＰｒｅＳ２およびＰｒｅＳ１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0456215A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04228087A (ja) |
| KR (1) | KR910019642A (ja) |
| AU (1) | AU646039B2 (ja) |
| CA (1) | CA2041772A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08504954A (ja) * | 1993-04-28 | 1996-05-28 | ラッキー リミテッド | Ｂ型およびｃ型肝炎同時診断用診断キットおよび方法 |
| JP2002528120A (ja) * | 1998-11-03 | 2002-09-03 | ヒルト，エーベルハルト | 細胞透過媒介性ポリペプチド |
| WO2008053901A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | METHOD FOR ANALYSIS OF HEPATITIS B VIRUS s ANTIGEN |
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| DE10339927A1 (de) * | 2003-08-29 | 2005-03-24 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen |
| WO2016188386A1 (en) * | 2015-05-22 | 2016-12-01 | Huahui Health Ltd. | Anti-Pre-S1 HBV Antibodies |
| CN117214434B (zh) * | 2023-08-14 | 2024-05-14 | 吉林大学 | 一种基于HBV PreS1+PreS2区域蛋白分型试剂盒及其制备方法和应用 |
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-
1991
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- 1991-05-13 JP JP3107401A patent/JPH04228087A/ja active Pending
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|---|---|
| AU646039B2 (en) | 1994-02-03 |
| CA2041772A1 (en) | 1991-11-12 |
| KR910019642A (ko) | 1991-12-19 |
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