CN101044158A - 病毒tnf受体和相关蛋白质的趋化因子结合活性 - Google Patents

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Abstract

病毒TNF受体和相关蛋白质的趋化因子结合活性。本发明涉及病毒肿瘤坏死因子受体(vTNFR)CrmB或CrmD的C－末端结构域(CTD)或来自痘病毒的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)，和它们的功能性同源物，包括衍生物和片段，用于结合趋化因子和它们的类似物、和/或提高TNFR的免疫调节性质或阻断趋化因子与其相应的细胞表面受体的结合、和/或调节趋化因子生物学活性。

Description

病毒TNF受体和相关蛋白质的趋化因子结合活性
技术领域
本发明涉及由痘病毒编码并称为细胞因子应答修饰物B和D(CrmB和CrmD)的肿瘤坏死因子受体(TNFR)的C-末端结构域(CTD)及其同源物、衍生物或片段的应用，以调节趋化因子活性和提高TNFR的免疫调节性质。本发明还涉及包含本发明蛋白质的融合多肽、药物组合物和检测试剂盒(test kit)。
背景技术
痘病毒是编码多达200个基因的复合DNA病毒。天花病毒(VaV)是天花的病因，天花是最具破坏性的人类疾病之一，其由于牛痘病病毒(VV)在WHO全球根除运动中用作天花疫苗而被根除。牛痘病毒(CPV)与VV相关，并被认为是在许多哺乳动物中引起偶发性感染的侵蚀性病毒。鼠痘病毒(Ectromelia virus，EV)是天然小鼠病原体，并且是鼠痘的病因，鼠痘是一种普遍的与人类天花类似的小鼠疾病。
免疫应答逐渐成为一种防止通过病原体(如，病毒)感染的有效机制。为了在免疫活性宿主中复制，已经形成了逃避免疫应答的病毒机制(Alcami & Koszinowski，2000)。痘病毒编码广泛的抵抗宿主免疫应答的蛋白质(Alcami，2003，Seet et al.，2003)。由痘病毒编码的免疫调节机制之一是产生结合细胞因子(调节免疫应答的蛋白质家族)的分泌蛋白质。
已经描述了四种由痘病毒编码的分泌性TNFR并且称为细胞因子应答修饰物B(CrmB)、CrmC、CrmD以及CrmE(Hu et al.，1994，Loparev et al.，1998，Saraiva & Alcami，2001，Smith et al.，1996)。这些蛋白质具有与人类TNFR中存在的富半胱氨酸的结构域(CRD)类似并且构成TNF结合胞外结构域的氨基酸序列。所述病毒蛋白质缺少细胞TNFR的跨膜和胞内结构域(图1和图2)。
已经证实所有四种vTNFR都分泌自病毒感染的细胞，结合TNF以及阻断TNF的生物学活性。预测vTNFR的CRD结合TNF，并且这已经对由黏液瘤病毒(M-T2)编码的CrmB同源物得以证明(Schreiber et al.，1997)，并且我们自己的实验表明，CrmD的三个N-末端CRD编码TNF结合和抑制活性(参见下文)。
称为CrmB和CrmD的两个vTNFR的代表性成员是：CPVCrmB(SEQ ID No 11和12)、VaV CrmB(SEQ ID No 9和10)、CPV CrmD(SEQ ID No 1和2)以及EV CrmD(SEQ ID No 3和4)。CrmB和CrmD具有另外的CTD，其没有与数据库中的细胞蛋白类似的氨基酸序列(图1和图2)。这个结构域对于TNF结合不是必需的并且其功能还没有明确。由痘病毒编码的三个开放阅读框(ORF)具有与vTNFR的CTD类似的氨基酸序列。这些ORF的代表性成员为：EV E12(CTD1)(SEQ ID No 5和6)、EV E184(CTD2)(SEQ ID No 19和20)、以及CPV B21R/V218(CTD3)(登记号为O72758以及SEQ ID No 13和14)(图1和图2)。
许多结合趋化因子的分泌性蛋白质已经描述在若干痘病毒和疱疹病毒中(Alcami et al.，1998，Bryant et al.，2003，Grahamet al.，1997，Lalani et al.，1997，Parry et al.，2000，van Berkel et al.，2000)(表1)。这些病毒编码的趋化因子结合蛋白(vCKBP)不具有与细胞七个-跨膜-结构域趋化因子受体或其它细胞蛋白类似的氨基酸序列(Alcami，2003，Seet et al.，2003，Seet & McFadden，2002)。对由CPV编码的35kDa vCKBP和由鼠γ-疱疹病毒68(MHV-68)编码的M3的结构和功能研究已证实，这些病毒蛋白质表现为具有结合趋化因子的能力的新型蛋白质结构域或结构(Alexander et al.，2002，Carfi et al.，1999)。已经证明了一些vCKBP有阻断白细胞迁移入感染组织的能力和病毒致病性(Bridgeman et al.，2001，Graham et al.，1997，Johnston &McFadden，2004，Lalani et al.，1999，Reading et al.，2003)。
到目前为止，病毒TNF受体(vTNFR)细胞因子应答修饰物B(CrmB)和CrmD的C-末端结构域(CTD)没有对时间的规定功能并且没有类似于宿主蛋白质的序列。我们发现这个结构域为这些vTNFR赋予了结合多种趋化因子的能力，并且独立于vTNFR的TNF结合结构域表达的CTD结合细胞因子。还在预测要被分泌的三种另外的痘病毒编码的蛋白中发现了这种蛋白结构域，并且我们证实，由鼠痘病毒(EV)的E12基因和牛痘病毒(CPV)的B21R基因编码的它们中的两个结合趋化因子。我们提出vTNFR的CTD定义了一种结合趋化因子的新型结构的结构域。这些蛋白质可以在体内调节趋化因子活性，并且在许多人类疾病中被用来调节不利的免疫和炎性反应。这种融合于可溶性TNFR的CTD的表达可以提高已经用于临床的TNFR的免疫调节性质。此外，该CTD提高vTNFR的N-末端富半胱氨酸结构域的TNF结合活性，并且vTNFR结合该TNF配体超家族的其他成员。
发明内容
本发明的第一方面，包括一种来自痘病毒的病毒TNF受体CrmB和/或CrmD的C-末端结构域(CTD)及其来自痘病毒的同源物CTD1、CTD2和CTD3，包括功能性同源物、衍生物和片段，以用于结合趋化因子和它们的类似物和/或提高TNFR的免疫调节性。
本发明的一个优选方面包括来自痘病毒的CrmB和/或CrmD的CTD及其来自痘病毒的功能性同源物CTD1、CTD2和CTD3，包括同源物、衍生物和片段，以用于阻断趋化因子与相应的细胞表面受体的结合和/或调节趋化因子结合活性。
可以通过以下方式获得来自痘病毒的CrmB和/或CrmD的CTD的同源物，例如，通过编码来自CrmB和/或CrmD的CTD的核苷酸序列的突变和来自该突变的序列的表达，和/或通过利用相关基因序列或从相关基因序列衍生。可替换地，它们可以这样获得，例如通过筛选包含蛋白质序列或编码蛋白质的核苷酸序列的数据库来鉴定与来自CrmB和/或CrmD的CTD同源的基因序列，例如通过筛选Swissprot数据库，其中可以利用Blast程序例如利用任何可能的算法来确定同源性。可接受的整个序列的同源性水平为至少约20％，例如约30％。来自CrmB和/或CrmD的CTD的功能性片段与其它蛋白质的同源性可以低于这个水平，例如约10％。
可以通过合适的相当于交联测定的方法(利用例如放射性同位素标记的趋化因子)或者通过测量蛋白质-蛋白质相互作用的其它方法(如表面等离子体共振，SPR，BIAcore)来检测包括来自CrmB或CrmD的CTD的衍生物或片段或CTD同源物(CTD1、CTD2、和CTD3)的功能性同源物结合趋化因子的能力。
在本发明的一个更优选具体实施方式中，来自CrmB的CTD包含SEQ ID No 26或SEQ ID No 28中的任何一个；来自CrmD的CTD包含SEQ ID No 22或SEQ ID No 24中的任何一个；并且CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)包含下述中的任何一个：SEQID No 8、SEQ ID No 14、SEQ ID No 6、SEQ ID No 20、SEQ IDNo 18、SEQ ID No 16、以及由基因CPV V201(登记号Q8QMP4)、D12L(登记号P87598)、B6R(登记号O72743)或B21R(登记号O72758)编码的蛋白质。
本发明的第二方面提供了一种编码本发明的CTD(包括同源物、衍生物以及片段)的核酸分子。后者核酸的互补链；以及由于遗传密码的简并而与编码根据本发明的CTD(包括同源物、衍生物、以及片段)的序列不同的核酸分子也落入本发明的范围内。
在本发明的一个优选具体实施方式中，编码来自CrmB的CTD的序列包含SEQ ID No 25或SEQ ID No 27中的任何一个；编码来自CrmD的CTD的序列包含SEQ ID No 21或SEQ ID No 23中的任何一个；编码功能性同源物的CTD的序列包含由下述基因编码的序列中的任何一个：V014(SEQ ID No 7)、V201、V218(SEQID No 13)、D12L、B6R、B21R、E12(SEQ ID No 5)、E184(SEQID No 19)、VACWR189(SEQ ID No 17)或VACWR206(SEQ IDNo 15)(图1和图2)。
根据本发明的第三方面，可以制备一种融合多肽，其包括融合至相同或其它来源的多肽序列的来自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)中的任何一个。
在本发明的一个优选具体实施方式中，来自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)可以与其它物质共价或非共价连接。连接产物可以是融合蛋白。融合至可溶性TNFR的CTD的表达提高已经用于临床的TNFR的免疫调节性能。该C-末端结构域提供一种分子框架(molecular scaffolding)，其提高N-末端CRD的TNF结合活性；例如，CRD(1，2)结合性质以这种方式提高。此外，这种提高可以使vTNFR结合TNF配体超家族的其它成员。
因此，在本发明的又一方面，该融合多肽包括融合至vTNFR的N-末端TNF结合结构域，优选融合至人源的TNFR的来自CrmB或CrmD的CTD或它们的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性类似物、衍生物和片段)。
在本发明的又一具体实施方式中，所制备的包括融合至其它起源的多肽序列的来自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)中的任何一个的融合蛋白为后者赋予趋化因子结合性质。
为了某些目的，可以通过已知的化学连接方法(例如，一个伴侣的生物素化和另一个与生物素的结合伴侣如抗生物素蛋白的衍生化)将结合伴侣(coupling partner)连接至来自CrmB或CrmD的CTD或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)。
如上所述的来自CrmB或CrmD的CTD或它们的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)(包括功能性同源物、衍生物和片段)中的任何一个(本发明的蛋白质)例如可以用于结合趋化因子和它们的类似物(其具有动物源或者具有相应于亲代病毒(该蛋白来自其)的宿主范围的特异性)，和/或结合趋化因子和它们的类似物(其具有人源和/或特异性)。
在本发明的蛋白质的衍生物中，落入本发明范围的是具有编码通过缺失或取代修饰的本发明蛋白质的序列的多肽，其保留本发明的蛋白质的趋化因子结合性质。例如，它可以用于缺失任何免疫原性氨基酸基序，或者用一个免疫原性较小的氨基酸序列替代这样的基序。可替换地，一种可以在宿主中诱导免疫耐受性的修饰可以被引入编码本发明蛋白质的序列中。
本发明还扩展至核苷酸序列，例如并入合适的编码本发明蛋白质的启动子及其经修饰的形式(包括同源物，如片段或它们与其它多肽的融合产物)的DNA盒，以及包含在合适的质粒或其它载体(例如，病毒载体)中的这样的表达盒。
本发明的蛋白质可以例如用来结合C趋化因子、CC趋化因子、CXC趋化因子或CX3C趋化因子，根据本发明的一个方面，本发明的蛋白质可以用来在体外(例如生物样品中)或体内阻断这样的细胞因子与它们的受体的结合或者抑制该生物学活性。
这种作用可以用于例如利用标记反应物的特异性结合测试，例如，用于诊断和测量目的。根据所进行的构建用于所希望目的的实验，该标记反应物可以为本发明的蛋白质、或者一种趋化因子、或者一种趋化因子受体。
因此，本发明的一个方面还在于用于实施这样的实验的组合物，例如本发明的蛋白质的标记产物；这些的任意一种的校准实验等分试样：本发明的蛋白质结合至一种适于参与本文所述的特异性结合实验的固体相的产物；该反应中的结合伴侣之一的校准实验等分试样；以及与这样的试剂的两种或多种相关的检测试剂盒。该实验可以例如是用于一种趋化因子或一种趋化因子受体的测定。
该结合作用还可以用于抑制由可以被本发明的蛋白质结合的趋化因子介导的作用。
根据本发明的又一方面，一种药物组合物(其包含来自CrmB和/或CrmD的CTD和/或CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)和/或其功能性同源物、衍生物或片段、和/或与其它蛋白质和/或表达盒和/或质粒或其它载体的融合物)可以用于在体内结合一种趋化因子或一种趋化因子类似物，或用于在体内阻断一种趋化因子与一种相应的细胞表面受体的结合，以产生免疫调节作用。
根据本发明的又一方面，一种药物组合物可以包含合适治疗(抗炎)量的本发明的蛋白质，以用作抗炎剂。
本发明的蛋白质可以和与本身相容的传统药物赋形剂进行配制，以递送至一个需要治疗的受治者。
根据本发明的一个优选具体实施方式，可以在合适的启动子的控制下，插入编码本发明的蛋白质或包含本发明蛋白质的融合蛋白的任何一种的核苷酸序列。该基因递送系统可以是病毒或非病毒载体系统。当靶细胞在治疗对象的宿主体内时，这样的一种载体可以为靶转染细胞赋予产生本发明的蛋白质(例如，用于抗炎目的)的能力。这样的抗炎目的可以包括，例如用于抑制由趋化因子(例如通过促进疾病或与疾病相关的趋化因子)介导的作用，该疾病例如是一种炎性疾病如风湿性关节炎。抗炎目的还包括在通过载体系统的基因递送后，减少针对该载体系统的元件和/或针对在靶细胞中表达的其它基因产物的宿主免疫应答，不管其是来自于与递送本发明的蛋白质相同的载体还是来自于用于这样的另一个递送基因的单独的递送载体。
本发明的蛋白质或者表达本发明的蛋白质的载体可以通过例如任何合适的全身递送途径施加给体内的细胞。可替换地，这种给予可以通过例如直接注射，如通过静脉注射到靶细胞所在部位处或靶细胞所在部位附近和/或要治疗的受治者的炎症部位而加以靶向。
可以选择施加形式以限制宿主对本发明的蛋白质的免疫应答。例如，本发明的蛋白质或者一种表达它们的载体系统可以与另一种免疫抑制物或抗炎物质一起递送。
本发明的又一方面涉及针对不含本发明的蛋白质和/或vTNFR的VV疫苗。一些vTNFR和CTD相关蛋白通过一些VV菌株进行表达，该VV菌株用作人类的天花疫苗或作为用于表达来自其它病原体的蛋白质以诱导免疫性的重组病毒载体。通过限制病毒复制和/或病毒诱导的免疫病理反应，在用VV进行天花免疫接种后，这些蛋白质的趋化因子结合活性的中和可以减少报道的不良作用。中和vTNFR或CTD的趋化因子结合活性的抗体或试剂可以减弱人类天花，使免于致命的人类天花，并且减少由VV疫苗接种引起的不良作用。
本发明的另一方面包括一种通过用包含本发明的蛋白质的试剂孵育包含趋化因子或趋化因子类似物的样品来检测趋化因子或趋化因子类似物的方法。
本发明的另一方面涉及基于本发明的蛋白质的抗体或抑制vTNFR或CTD同源物的趋化因子结合活性的试剂，本发明的蛋白质在用于制备一种用于治疗由VV疫苗接种引起的不良作用或由天花引起的病理反应的药物中的应用。
本发明的其它方面的形成对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
附图说明
图1：不同病毒中的vTNFR和CTD同源物的示意性表示。标注了每个病毒中的基因名称。
图2：vTNFR CrmB和CrmD与CTD同源物的多个序列对比。
图3：作为IL-8(CXCL8)结合蛋白的EV CrmD的鉴定。(a)125I-IL-8交联来自EV-感染的细胞的介质表明存在不是由VV表达的一种IL-8结合活性。(b)由重组VV表达的EV全长CrmD结合IL-8，而CrmD CRD(1-4)不结合。(c)125I-IL-8与重组CrmD的结合在过量人类或小鼠TNF存在的情况下不被抑制。(d)125I-IL-8与CPV CrmD和CrmB的交联在杆状病毒中表达。
图4：CrmD CRD和CTD在TNF结合和活性抑制中的作用。(a)含EV CrmD CRD和CTD的组合的构建体的示意性表示。(b)125I-TNF与U937细胞的结合与来自感染有表达所示的CrmD构建体的VV重组体的细胞上清液的竞争。(c)在剂量逐渐增加的感染有所示的重组VV或VV VVR的细胞上清液存在的情况下，将重组CrmD构建体的生物学活性确定为小鼠L929细胞中TNF诱导的细胞毒性的百分比。(d)由来自感染有所示的重组杆状病毒的细胞的上清液对TNF诱导的细胞毒性的抑制。
图5：结合至EV CrmD的趋化因子。纯化的重组EV CrmD蛋白被胺连接至一个CM5生物传感芯片达到5000RU的水平。这个芯片用于在BIAcoreX(Uppsala，Sweden)中观察与所有商业上可获得的人类趋化因子的结合。在所有的情况下，以10μl/min的流速注射30μl的一种100nM趋化因子溶液。对于每种趋化因子，针对在解离120s后(复合体的稳定性)的结合水平绘示最大结合水平。小图表：通过SPR动力分析确定的用于所示趋化因子的亲和力。对于动力学分析，纯化的重组EV CrmD蛋白被胺连接至一个CM5生物传感芯片达到1200RU的水平(Rmax＜200RU)。以30μl/min的流速注射不同浓度的趋化因子2分钟，并且另外监测离解5分钟。借助BIAevaluation软件利用1∶1 Langmuir结合模型进行曲线拟合。
图6：骆驼痘病毒(CMLV)和VaV病毒CrmB蛋白的氨基酸序列的对比。保守的残基用星号示出。突变的位点用红色示出。示出了CRD(1-4)和CTD。
图7：VaV CrmB的不同结构域结合TNF和趋化因子。通过SPR分析的人类TNFα(红色)和人类CXCL 12β(CK，蓝色)与全长VaV CrmB、VaV CrmB CRD(1-4)或VaV CrmB CTD纯化蛋白的结合。
图8：由VaV CrmB对TNF和趋化因子生物学活性的抑制。(a)TNF-诱导的细胞毒性的抑制。在37℃，在 的补充有放线菌素D(4□g/ml)的完全DMEM中，将TNF用所示量的纯化重组蛋白预孵育2h。随后将混合物加入到96孔板中的2×104L929细胞(前一天接种)中并且16到18小时后评估细胞死亡。在每种情况下绘示cuadruplicates的O.D.490nm(平均值±SD)。“Celulas”/“celActD”：用于细胞生存力的对照；“TNF”：用于细胞死亡的对照；“CrmB”：用VaV CrmB预孵育的TNF；“CRD”：用VaV CrmB CRD(1-4)预孵育的TNF；“IgG1”：用IgG1预孵育的TNF，用于特异性的对照。(b)趋化性分析。将人类CCL25(100nM)单独地或在增加量的纯化重组蛋白存在的情况下在37℃孵育30分钟，并被置于24孔穿通孔室的下室。这个期间之后，将5×105个MOLT-4细胞在100□l的含0.1％FCS的完全RPMI中加入到上孔，并且将该板在37℃孵育4小时。MOLT-4细胞朝底部孔迁移的％通过FACS分析来确定。将100％的迁移设置为仅在趋化因子存在下迁移的细胞数量。
图9：结合至VaV CrmB的趋化因子。纯化的重组VaV CrmB蛋白被胺连接至一个CM5生物传感芯片达到5000RU的水平。这个芯片用于在BIAcoreX(Uppsala，Sweden)中观察与所有商业上可获得的人类趋化因子的结合。在所有的情况下，以10μl/min的流速注射30μl的一种100nM趋化因子溶液。对于每种趋化因子，针对在解离120s后(复合体的稳定性)的结合水平绘示最大结合水平。小图表：通过SPR动力分析确定的用于所示趋化因子的亲和力。对于动力学分析，纯化的重组VaV CrmB蛋白被胺连接至一个CM5生物传感芯片达到1200RU的水平(Rmax＜200RU)。以30μl/min的流速注射不同浓度的趋化因子2分钟，并且另外监测离解5分钟。借助BIAevaluation软件利用1∶1 Langmuir结合模型进行曲线拟合。
图10：VV 35kDa vCKBP与VaV CrmB的CRD(1-4)的融合为CrmB赋予了结合趋化因子的能力。(a)用于趋化因子结合的交联试验。将来自模拟感染的High5细胞(感染重组杆状病毒“Bac VaV CrmB CRD(1-4)”(Bac106)，“Bac VaV CrmB”(Bac107)，和“Bac VaV CrmB CRD(1-4)/35K”(Bac109))的上清液用400pM的125I-CCL3加以孵育。重组蛋白和CCL3之间的复合体通过利用EDC发生交联，并且通过SDS-PAGE和放射自显影法来分析产物。(b)TNF诱导的细胞毒性的抑制。在
Figure A20058003613000161
的补充有放线菌素D(4□g/ml)的完全DMEM中，将TNF在37℃用相应的上清液预孵育2小时。随后将混合物加入到96孔板中的2×104L929细胞(前一天接种)中并且在16到18小时后评估细胞死亡。对不同样品绘示O.D.490nm。
具体实施方式
本发明以及可用于实现其具体实施方式的材料和方法在下面的实施例中将进一步说明，但不用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1：材料和方法
1.1-痘病毒
CPV、EV和VV通过感染铺满的单层Bsc-I细胞而在体外进行增殖。
1.2-骆驼痘病毒CrmB的克隆和VaV CrmB的产生
利用寡核苷酸CMLV 264 Eco(5’-GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTCG)和CMLV 264 Xho(5’-GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGTTTGG)并且纯化的CMLVDNA作为模版通过PCR来扩增骆驼痘病毒的菌株CMS的ORF 264(相应于CrmB基因)。PCR产物被克隆入EcoRI/XhoI消化的pBacl(Novagen)以产生质粒pRA1。通过DNA测序确定扩增基因中缺少突变。根据制造商的说明，利用“QuikChange Multi Site-DirectedMutagenesis Kit(Strategene)”，通过质粒pRA1的多位点定点突变来获得相应于VaV(菌株Bangladesh 1975；ORF 188)的DNA。引入的突变示于图6中。在若干连续的几轮定点突变后，获得质粒pRA105。这种质粒包含编码融合至由原始pBac1质粒提供的C-末端His标签的VaV(BSH 1975菌株)CrmB的序列。通过直接测序确认了存在所有的突变并且不存在不希望的其它突变。
1.3-表达来自EV或CPV的CrmD的重组杆状病毒(baculovirus)和牛痘病毒的构建
为了在杆状病毒系统中的表达，将编码全长或截短型CrmD(表3)的DNA用特异性寡核苷酸(表4)进行PCR-扩增，并克隆入pBAC-1中。通过在转染有重组pBAC-1质粒和如所述(Alcami et al.，1998)的线性杆状病毒DNA的SF21昆虫细胞中的同源重组而产生重组杆状病毒。
vTNFR也从VV表达系统进行表达。感兴趣的基因被克隆入pMJ601，用于从强大VV启动子表达该基因(Davison & Moss，1990)。通过同源重组将感兴趣的基因插入VV基因组的胸苷激酶座位，在溴脱氧尿苷的存在下选择该重组VV并且通过颜色选择进行鉴定(□-半乳糖苷酶的表达并用X-gal染色)。VTNFR从VV WesternReserve(一种不编码TNF结合活性的病毒株)被表达(Alcami et al.，1999)。
1.4-表达融合于CPV 35kDa蛋白的VaV CrmB、VaV CrmBCRD(1-4)、VaV CrmB CTD、EV E12、EV E184、CPV V218和VaV CrmB CRD(1-4)的重组杆状病毒的产生
融合于C-末端His标签的全长VaV CrmB基因被亚克隆入EcoRI/SphI消化的pFastBac1(Invitrogen)以产生pRA107。利用pRA107作为模版，利用寡核苷酸VaV 188 Eco(5’-GCGGAATTCATGAAGTCCGTATTATACTTG)和VaV 188 CRDs1-4 Xho (5’-GCGCTCGAGACACGATGTGTCGTTAACTGG)，通过PCR扩增包括四个CRD并相应于残基1(M)到192(C)的VaV CrmB的N-末端结构域。该扩增的片段用由EcoRI/XhoI消化的pBac1(Novagen)提供的C-末端his标签符合读框地被克隆，以生成pRA99。用EcoRI/SphI消化pRA99并且携带融合于His标签的VaV CrmB CRD1-4的片段象先前一样被克隆入pFastBac1以产生pRA106。利用pRA107作为模版，将VaV CrmB的CTD(残基T194到L348)用寡核苷酸VaV188Cter-PfIMI(5’-CGCCCACCCAATGGAACTAGGACGACCAC-TACCGG)和H347R 3进行PVR扩增。该片段用PfmII和XhoI消化并且克隆入用同样的酶消化的pRA107中。这产生了pRA108，一种编码由VaVCrmB的29N-末端残基(其包括预测的信号肽)和随后的CrmB的CTD以及另外的His标签构成的融合蛋白的质粒。在所有情况下，通过对全部插入物进行测序而确认了在pRA106、pRA107和pRA108中不存在不希望的突变。
利用寡核苷酸E1(5’-GCGGGA-TCCATGATAAACATAAACATAAACACAATAC)和E2(5’-GCGGCGGCCGCAT-TAATAGTTCTAGTAGCGCAAG)并且纯化的EV(菌株naval.Cam)DNA作为模版通过PCR来扩增EV基因E12。将该PCR产物克隆入Bam HI/NotI消化的pBac1(Novagen)生成质粒pMS51中。E12基因被亚克隆入Bam HI/Xho I消化的pRA106以产生质粒pAH18，其包含融合于pFastbac(Invitrogen)主链中编码His-标签的C-末端序列的E12基因。利用寡核苷酸5’V218 EcoRI(5’-CGCGAATTCATGATGATATACGGATTAATAGC)和3’V218 Sall(5’-GCGGTCGACACCATCGACACCACTCATC)并且纯化的病毒DNA作为模版，PCR-扩增CPV Brighton Red菌株ORFV218。PCR产物被克隆入EcoRI/Xho I消化的pRA106以产生质粒pAH17，其包含融合于pFastbac(Invitrogen)主链中编码His-标签的C-末端序列的CPV V218基因。利用寡核苷酸5’35KBR-S23(5’-CGCCTCGAGTCATTCTCATCCTCATCCTC)和3’35KBR(-stop)(5’-CGCCTCGAGGACACACGCTATAAGTTTTGC)并且纯化的病毒DNA作为模版，PCR-扩增相应于CPV(菌株Brighton Red)35kDa蛋白的残基S23-V246的片段。PCR产物被克隆入Xho I消化的pRA106以产生质粒pRA109。该质粒携带编码VaV CrmB CRD(1-4)的序列，其符合读框地融合于pFastBac主链(Invitrogen)中编码CPV 35kDa vCKBP(不具有其信号肽，而具有C-末端His标签)的序列。
如制造商所述，利用Bac-to-Bac表达系统(Invitrogen)来获得重组杆状病毒。简单地说，质粒pRA106、pRA107、pRA108、pRA109、pAH17和pAH18被转化入感受态DH10Bac细菌(一个转座事件)，产生相应的重组杆粒。这些产物被纯化并转染入High5昆虫细胞，并且转染后三天，从细胞培养物的上清液收获重组杆状病毒vBac106、vBac107、vBac1068、vBac109、vBacAH17和vBacAH18。在一个单独的步骤中进一步扩增这些病毒以产生用于蛋白质生产的高效价重组病毒原种。
用寡核苷酸5’E184(5’-GCGGAATTCATGTATAAAAAAGTAATAACGTTT)和3’E184 XhoI(5’-CGCCTCGAGAAAATCATATTTTGAATAATATGTA)并且纯化的EV DNA作为模版，PCR-扩增来自EV的E184基因。PCR产物被克隆入用EcoRI和XhoI消化的pRA106质粒，产生pAH11。确认正确的DNA序列。如上所述，质粒pAH11被用于产生重组杆状病毒vBacAH11，表达融合于组氨酸标签的EV E184蛋白以促进该蛋白的纯化。
1.5-蛋白质表达和纯化
为了表达该重组蛋白，将High5细胞以高感染复数(multiplicity)(10pfu/细胞)加以感染，并且在感染后三天(d.p.i.)收集来自感染培养物的上清液。通过蛋白质印迹法，和/或在全长和N-末端VaV CrmB构建体的情况下的溶液中TNF结合分析来确认这些上清液中蛋白质的存在(Alcami et al.，1999)。利用YM-3膜(Millipore)在搅拌超滤池(Amicon)上将该样品浓缩至约2.5ml，并且在PD-10脱盐柱(Amersham-Pharamcia Biosciences)上将缓冲液变换为结合缓冲液(50mM磷酸盐、300mM NaCl、10mM咪唑，pH7.4)。按照制造商的说明，利用Vivapure金属鳌合柱(Vivascience)亲和-纯化His-标记的重组蛋白。在考马斯-蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上检查纯化蛋白的纯度和数量。为了TNF保护和趋化性抑制实验，针对PBS透析重组蛋白。
1.6-通过表面等离子共振(SPR)进行生物分子相互作用分析
利用BIAcore X生物传感器(Biacore，Uppsala，Sweden)来确定细胞因子结合特异性和亲和力常数。对于配体筛选实验，在每个情况下，纯化的重组蛋白被胺连接至CM5芯片达到约5000RU(5000pg/mm2)的水平。随后以5μl/min的流速注射在HBS-EP缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％(v/v)表面活性剂P20；pH7.4)中的100nM的商业上可获得的细胞因子(Peprotech，R&D Systems)，并且监测结合和解离。在每次注射后利用10mM甘氨酸-HCl pH2.0再生该表面。对于动力学分析，将重组蛋白以低密度(Rmax＜200RU)固定。随后不同浓度的相应分析物以30μl/min的流速注射超过2分钟并且使其解离另外5分钟。利用BIAevaluation 3.2软件分析所有的Biacore感应图(sensorgram)。通过减去基准流动细胞反应而去除体积折射率变化，并且从全部分析物感应图减去空白注射的平均反应以去除系统假象(artifact)。动力学数据被全面拟合至1∶1的langmuir模型。
1.7-TNF所致的细胞毒性的抑制
如前所述在小鼠L929细胞上进行TNF诱导的细胞毒性实验(Loparev et al.，1998，Saraiva & Alcami，2001，Schreiber et al.，1997，Smith et al.，1996)。在补充有放线菌素D(4□g/ml)(Sigma)的完全DMEM中，将TNF(20ng/ml)(R&D Systems)用纯化的重组蛋白在37℃预孵育2h。随后将该混合物加入到96孔板中前一天接种的2×104个细胞上，并且按照制造商的指导，利用“CellTiter96 Aqueous One Solution cell proliferation assay”(Promega)，在16-18小时后评估细胞死亡。
1.8-趋化性实验
如前所述，利用具有3□m孔径的过滤器的24孔Transwell板(Costar)来评估MOLT-4细胞的迁移(Zaballos et al.，1999)。简单地说，将人类CCL25(100nM)(R&D Systems)单独地或在数量增加的纯化重组蛋白存在的条件下在37℃孵育30分钟，并放置在下室内。然后，在包含0.1％FCS的100□l完全RPMI中将5×105个MOLT-4细胞被加入到上孔，并且在37℃，5％CO2，95％加湿的孵育箱中孵育该板。在4小时后，通过流式细胞仪确定MOLT-4细胞向下室的迁移。
实施例2：结果
2.1-由EV和CPV编码的vTNFR CrmD结合趋化因子
为了寻找结合趋化因子的新型病毒分泌蛋白质，我们用1251-CXCL8进行了交联实验，并且鉴定了由痘病毒EV编码的新型分泌vCKBP(图3a)。这种活性在VV样品中缺少，并且具有比由VV和其它痘病毒编码的35kDa vCKBP更大的分子大小，vCKPB是一种可以交联CXCL8但是由于其对CXCL8的低亲和力而不阻断其生物活性的蛋白质(Alcami et al.，1998，Graham et al.，1997，Lalani et al.，1998)。出乎意料的是，我们发现由EV编码的vTNFR CrmD(已知结合TNF)具有另外的结合CXCL8的性质(图3b)。利用在VV表达系统中表达的截短型的CrmD蛋白，我们已经证实，CrmD的3个N-末端CRD对于阻断TNF活性是必要的(图4a、4b和4c)，而CTD对于TNF结合不是必需的，但是CTD为CrmD赋予了结合趋化因子的能力(图3b)。CrmD的不同结构域看起来涉及TNF和趋化因子结合，因为在TNF存在的情况下，CXCL8交联至CrmD不能被阻断(图3c)，而在CXCL8存在的情况下，TNF结合至CrmD不被抑制(未示出)。利用表面等离子共振(SPR，BIAcore X)技术，我们检测了纯化的EV CrmD与所有商业上可获得的人源和鼠源趋化因子的可能相互作用，并且已经确定CrmD以高亲和力与许多趋化因子结合(图5)。
2.2-由CPV和VaV编码的vTNFR CrmB结合趋化因子
为了检测编码延伸的CTD的其它vTNFR是否结合趋化因子，我们在杆状病毒系统中表达了来自CPV的CrmB，并且证实它在交联实验中结合CXCL8(图3d)。CrmB也由人类病原体VaV(天花的病因)编码。我们通过来自相关的骆驼痘病毒的CrmB基因的大量定点突变产生了VaV的CrmB基因(图6)，并且在杆状病毒系统中表达了该蛋白。我们首先检测了纯化的VaV CrmB蛋白结合TNF(图7)并抑制TNF生物活性(图8a)。我们还通过SPR检测了CrmB与所有可获得的人类趋化因子的结合，并且我们证明了CrmB以高亲和力与大量趋化因子结合(图9)。缺少CTD的截短型VaV CrmB不结合趋化因子(图7)。此外，VaV CrmB的CTD的表达和纯化已经证明了CTD编码CrmB的趋化因子结合活性(图7)。这通过表明TNF和趋化因子结合至CrmB中不同的位点(未示出)的SPA分析得以确认。
2.3-在体外由VaV编码的vTNFR CrmB阻断由CCL25诱导的MoIt4细胞的迁移
vTNFR CrmB和CrmD对一些趋化因子的高亲和力表明这些病毒蛋白质可以用作鳌合趋化因子的假目标受体，并且阻止趋化因子结合到白细胞上的其特异性受体和诱导触发细胞迁移的信号。我们证实，VaV CrmB抑制表达相关受体的MoIt4细胞响应于趋化因子CCL25的迁移(图8b)。
2.4.-与vTNFR的CTD(CTD同源物)相关的蛋白质结合趋化因子
如上所述，由痘病毒编码的三种蛋白质具有与vTNFR(CrmB和CrmD)的CTD类似的氨基酸序列(图1和图2)。称为CTD1、CTD2、CTD3的这些蛋白质具有表明它们是被分泌的N-末端信号肽。这些蛋白质、EV E12(CTD1)、EV184(CTD2)和CPV B21R(CTD3)的两种在杆状病毒系统中的表达已表明两种蛋白质均被分泌入培养基中。检测纯化的EV E12蛋白对于全部小鼠趋化因子的结合，并且发现其以高亲和力结合多种趋化因子(表2)。另外，我们已通过SPR确定：纯化的蛋白CPV B21R和V E184结合来自小鼠的CCL21，CCL24，CCL25，CCL27，CCL28，CXCL10，CXCL11，CXCL12β，CXCL13和CXCL14，以及人类CCL26。已经证实VV VVR B7R(CTD2)被转运到内质网腔并且被留在细胞内而不是被分泌(Price et al.，2000)。一些CTD同源物可以起作用以阻断趋化因子(如CCL27)的活性，已知其也在细胞内被表达(Gortz et al.，2002)。在鼠皮层内模式下缺乏B7R基因的VV突变体被减弱(Price et al.，2000)。
2.5.-来自EV的vTNFR CrmD和来自VaV的CrmB结合其它TNF配体超家族成员
TNF是具有结构类似的免疫调节剂的大家族(称为TNF配体(TNFL)超家族)的成员(Locksley et al.，2001，Wallach，2001)。通过SPR检测EV CrmD和VaV CrmB结合所有商业上可获得的TNF配体超家族成员，并发现其结合APRIL(TNFL 13)(CrmDKd 110 pM；CrmB Kd 2nM)和LIGHT(TNFL14)(CrmD Kd 140nM；CrmB Kd 2nM)。这表明CrmD和CrmB(和可能是其它vTNFR)可以抑制多种TNF配体超家族成员的生物活性。
2.6-vTNFR的CTD可以影响CRD以高亲和力结合TNF的能力
如上所证实的，包括N-末端CRD(1，2)的截短的vTNFR CrmD丧失了对于TNF的亲和力，并且不阻断TNF生物活性，而CRD(1-3)结合TNF并且抑制其活性(图4a、4b、4c)。令人惊奇的是，当CRD(1，2)融合至CTD被表达时，它恢复TNF抑制活性，表明CTD可以提高vTNFR的N-末端CRD的TNF结合活性(图4d)。
2.7-病毒编码的蛋白质形成有独立结合免疫配体的结构域
这里所示的数据表明，vTNFR CrmB和CrmD由两个独立的结构域构成(图1和图2)。N-末端CRD具有结合TNF的能力，而CTD以独立的方式结合趋化因子。这通过如下发现得以证实：当独立表达时，来自CrmB的CRD(1，4)保留TNF结合活性，而来自CrmB的CTD具有趋化因子结合活性。病毒蛋白质的这些区域代表结合免疫调节剂的结构模块或结构域的这个概念通过以下发现被着重强调：(1)纯化的VaV CrmB的CTD结合趋化因子(图7)；(2)由CPV编码的CrmB和CrmD的CTD可以被交换并且仍提供趋化因子结合活性(未示出)；(3)与vTNFR CTD相关的三种不同的蛋白质(EV E12、EV E184和CPV B21R)编码趋化因子结合活性(表2)；以及(4)CPV 35kDa vCKBP与VaV CrmB的CRD(1.4)的融合在不影响TNF抑制活性的情况下为该蛋白提供了结合趋化因子的能力(图10)。因此，这些病毒结构域可以被交换或者结合以产生阻断多种细胞因子的活性的免疫调节蛋白。我们提出vTNFR的CTD限定结合免疫系统涉及的免疫蛋白(如趋化因子)或其他蛋白质的新型蛋白结构/结构域，并为vTNFR赋予结合除了TNF之外的其他免疫调节蛋白的能力。
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表1.由牛痘病毒和疱疹病毒编码的趋化因子结合蛋白
  蛋白   病毒   结合特异性   参考文献
  vCKBP1vCKBP2vCKBP3vCKBP4   M-T735kDa，M-T1，vCC1M3 gG   痘病毒：黏液瘤病毒痘病毒：痘苗病毒、牛痘病毒、缺肢畸形病毒、黏液瘤病毒、天花病毒、口疮病毒γ疱疹病毒：小鼠γ疱疹病毒68α疱疹病毒：马疱疹病毒，牛疱疹病毒   宽CC趋化因子宽   (Lalani et al.，1997)(Alcami et al.，1998，Graham et al.，1997，Seet et al.，2003，Smith et al.，1997，Smith & Alcami，2000)(Parry et al.，2000，van Berkel etal.，2000)(Bryant etal.，2003)
表2.通过SPR获得的EV E12蛋白对于不同趋化因子的亲和力常数(KD)。纯化的重组蛋白被低水平硫醇连接，并且利用BIAcoreX以高流速注射不同浓度的所示细胞因子。每种情况下的KD利用BIAevaluation软件来确定。
  趋化因子   KD(nM)
  mCCL21   0.5
  mCCL25   0.7
  mCCL27   2
  mCXCL11   1
  mCXCL13   1.5
  mCXCL14   1.5
表3：制备的为了表达vTNFR的重组质粒。涉及的插入物是利用所示的寡核苷酸对通过PCR从病毒DNA进行扩增(寡核苷酸序列见表4)。EV是菌株Hampstead，CPV是菌株Brighton Red。
                                              pBacI
  插入物   寡核苷酸   Ta   RS   质粒
EV crmD   5’CrmD-7 55   BamHI pMS1
  3’CrmD-9   XhoI
EV crmD-CRD 1，2   5’CrmD-7 50   BamHI pMS42
  3’CrmD-29   NotI
EV crmD-CRD 1，2，3   5’CrmD-7 50   BamHI pMS46
  3’PT-3   NotI
EV crmD-CRD 1，2，3，4   5’CrmD-7 50   BamHI pMS48
  3’PT-4   NotI
EV crmD-CTD   5’PT-1 50   NotI pPT6
  3’PT-2   XhoI
EV crmD-CRD 1，2-CTD   EV crmD Ct subcloned into NotI/XhoIof pMS42 pPT1
EV crmD-CRD 1，2，3-CTD   EV crmD Ct subcloned into NotI/XhoIof pMS46 pPT2
CPV crmB-CTD   5’PT-5 50   NotI pPT5
  3’PT-6   XhoI
EV crmD-CRD 1，2，3，4-CPV crmB CTD   CPV crmB Ct subcloned into NotI/XhoIof pMS48 pPT3
CPV crmB-CRD 1，2，3，4-EV crmD CTD   5’SF-1          50          EcoRI3’PT-7                      NotI   pPT4
                               PMJ-601
  插入物   寡核苷酸   Ta   RS   RpMJ 601
EV crmD   5’CrmD-7 50   BamHI pMS11
  3’CrmD-15   KpnI
EV crmD-CRD 1，2   5’CrmD-7 50   BamHI pMS21
  3’CrmD-23   HindIII
表4：在杆状病毒和VV系统中用于表达EV CrmD和CPV CrmB的寡核苷酸
                       寡核苷酸序列(5’＞3’)
5’CrmD-7                 CGCGTTTAAACGGATCCATGATGAAGATGACACCATCATA
3’CrmD-9        CGCCTCGAGATCTCTTTCACAATCATTTGGTGG
3’CrmD-15       CGCGGTACCTCAATCTCTTTCACAATCATTTGG
3’CrmD-22       CGCGGTACCTTAATCTATGCTGTTAAAGGACAGATCAC
3’CrmD-23                GCGAAGCTTTTACCATGGGTAGTATCCGGATGCACAGACAC
3’CrmD-24               GCGAAGCTTTTACCATGGACAAGAGGTCTTGTTAACAGGATAC
3’CrmD-29       GCGGCGGCCGCGTAGTATCCGGATGCACAGACAC
5’PT-1          GCGGCGGCCGCCAATTCGAGTATAGGAAGCAGCAGTAC
3’PT-2          GCGCTCGAGATCTCTTTCACAATCATTTGGTGG
3’PT-3          GCGGCGGCCGCATCTATGCTGTTAAAGGACAGATCAC
3’PT-4          GCGGCGGCCGCACAAGAGGTCTTGTTAACAGGATAC
5’PT-5          GCGGCGGCCGCCACTCGGACGACCACTACCGGTCTC
3’PT-6          GCGCTCGAGTAAAAAGTGGGTGGGATACTGGGAA
3’PT-7          GCGGCGGCCGCACACGATGTGTCGTTGACGGGATAC
5’SF-1                  GCGGGTACCGAATTCACCATGGAGTCATATATATTGCTATTGC
                                    序列表
序列表
<110>安东尼奥·阿尔卡米
<120>病毒TNF受体和相关蛋白质的趋化因子结合活性
<130>1
<160>28
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>963
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>基因
<222>(1)..(963)
<223>基因V221
<400>1
atgatgaata tgacaccatc atacatcttg ttggtatata tgttcgtagt cgtaagtgga         60
gatgttcctt atgaacacat taatgggaaa tgtaacggta ccgactataa tagtaataat         120
ctatgttgta aacaatgcga tcctggaatg tatatgactc attcctgtaa taccacttct         180
aatacaaaat gtgacaagtg cccagatggc acctttacat ccattcctaa tcatattccc         240
acgtgtctaa gttgtcgagg caaatgtagc agtaatcatg tagagactaa atcgtgtagt         300
aacacacagg acagagtatg tgtctgtgca tccggatact actgcgaatt tgaaggatca         360
aacggttgca ggctatgtgt accacaaaca aagtgtgatt ctggttacgg tgtatatggc         420
tactcatcta aaggagatgt aatatgtaaa aagtgtccgg gtaatataga taaatgtgat         480
ctgtccttta acagcataga tgtagaaatt aatatgtatc ctgttaacaa gacctcttgt         540
aattcgagta taggaagtag cagtaccata tcaacttccg agttaacaat tactctaaaa         600
catgaggatt gtactactgt ctttattgga gattactatt cagtcgttga taaactagca         660
acttcaggtt tctttacaaa cgataaagta catcaagacc tcacaacgca gtgcaagatt         720
aatctagaaa tcaaatgtaa ttctggagga gaatctagac aactaacacc cacgacgaag         780
gtatacttta tgcctcattc agaaacggta actgtggtag gagactgtct ctctaatctc         840
gatgtctata tagtatatgc caatacggac gcgatatatt ccgacatgga tgtcgtcgct         900
tatcatacta gttatatact aaatgttgat catattccac caaatgattg tgaaagagat         960
tga                                                                       963
<210>2
<211>320
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(320)
<223>细胞因子应答修饰物D(CrmD)
<400>2
Met Met Asn Met Thr Pro Ser Tyr Ile Leu Leu Val Tyr Met Phe Val
1               5                   10                  15
Val Val Ser Gly Asp Val Pro Tyr Glu His Ile Asn Gly Lys Cys Asn
            20                  25                  30
Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asn Asn Leu Cys Cys Lys Gln Cys Asp Pro
        35                  40                  45
Gly Met Tyr Met Thr His Ser Cys Asn Thr Thr Ser Asn Thr Lys Cys
    50                  55                  60
Asp Lys Cys Pro Asp Gly Thr Phe Thr Ser Ile Pro Asn His Ile Pro
65                  70                  75                  80
Thr Cys Leu Ser Cys Arg Gly Lys Cys Ser Ser Asn His Val Glu Thr
                85                  90                  95
Lys Ser Cys Ser Asn Thr Gln Asp Arg Val Cys Val Cys Ala Ser Gly
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Glu Phe Glu Gly Ser Asn Gly Cys Arg Leu Cys Val Pro
        115                 120                 125
Gln Thr Lys Cys Asp Ser Gly Tyr Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Ser Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Val Ile Cys Lys Lys Cys Pro Gly Asn Ile Asp Lys Cys Asp
145                 150                 155                 160
Leu Ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn
                165                 170                 175
Lys Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr
            180                 185                 190
Ser Glu Leu Thr Ile Thr Leu Lys His Glu Asp Cys Thr Thr Val Phe
        195                 200                 205
Ile Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe
    210                 215                 220
Phe Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile
225                 230                 235                 240
Asn Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Gly Glu Ser Arg Gln Leu Thr
    245                 250                 255
Pro Thr Thr Lys Val Tyr Phe Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val
            260                 265                 270
Val Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn
        275                 280                 285
Thr Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser
    290                 295                 300
Tyr Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp
305                 310                 315                 320
<210>3
<211>960
<212>DNA
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>基因
<222>(1)..(960)
<223>基因E3
<400>3
atgatgaaga tgacaccatc atacatcttg ttggtatata tgttcgtagt cgtaagtgga         60
gatgttccgt atacacccat taatgggaaa tgtaacggta cagactataa cagtaataat         120
ctatgttgta aacaatgcaa tcctggaatg tatatgactc attcctgtaa taccacttct         180
aatacaaaat gtgacaagtg cccagatgac acctttacat ccattcctaa tcatagtccc         240
gcgtgtctaa gttgtcgagg caaatgtagc agtaatcaag tagagactaa atcgtgtagt         300
aacacacagg acagagtatg tgtctgtgca tccggatact actgcgaatt tgaaggatca         360
aacggttgca ggctatgtgt accacaaaca aagtgtggtt ctggttacgg tgtatatggc         420
tactcatcta aaggagatgt aatatgtaaa aagtgtccgg gtaatataga taaatgtgat         480
ctgtccttta acagcataga tgtagaaatt aatatgtatc ctgttaacaa gacctcttgt         540
aattcgagta taggaagcag cagtaccata tcaacttccg agttaacaat tactctaaca         600
catgaggatt gtactcctgt ctttattgga gattactatt cagtcgttga taaactagca         660
acttcaggtt tctttacaaa cgataaagta catcaagacc tcacaacgca gtgcaagatt         720
aatctagaaa tcaaatgtaa ttctggaaga gaatctagac aactaacacc cacgacgaag         780
gtatacctta tgcctcattc agaaacggta actgtggtag gagactgtct ctctaatctc         840
gatgtctata tagtatatgc caatacggac gcgatatatt ccgacatgga cgtcgtcgcg         900
tatcatacta gttatatact aaatgttgat catattccac caaatgattg tgaaagagat         960
<210>4
<211>320
<212>PRT
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(320)
<223>细胞因子应答修饰物D(CrmD)
<400>4
Met Met Lys Met Thr Pro Ser Tyr Ile Leu Leu Val Tyr Met Phe Val
1               5                   10                  15
Val Val Ser Gly Asp Val Pro Tyr Thr Pro Ile Asn Gly Lys Cys Asn
            20                  25                  30
Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asn Asn Leu Cys Cys Lys Gln Cys Asn Pro
        35                  40                  45
Gly Met Tyr Met Thr His Ser Cys Asn Thr Thr Ser Asn Thr Lys Cys
    50                  55                  60
Asp Lys Cys Pro Asp Asp Thr Phe Thr Ser Ile Pro Asn His Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Ser Cys Arg Gly Lys Cys Ser Ser Asn Gln Val Glu Thr
                85                  90                  95
Lys Ser Cys Ser Asn Thr Gln Asp Arg Val Cys Val Cys Ala Ser Gly
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Glu Phe Glu Gly Ser Asn Gly Cys Arg Leu Cys Val Pro
        115                 120                 125
Gln Thr Lys Cys Gly Ser Gly Tyr Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Ser Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Val Ile Cys Lys Lys Cys Pro Gly Asn Ile Asp Lys Cys Asp
145                 150                 155                 160
Leu Ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn
                165                 170                 175
Lys Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr
            180                 185                 190
Ser Glu Leu Thr Ile Thr Leu Thr His Glu Asp Cys Thr Pro Val Phe
        195                 200                 205
Ile Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe
    210                 215                 220
Phe Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile
225                 230                 235                 240
Asn Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Arg Glu Ser Arg Gln Leu Thr
                245                 250                 255
Pro Thr Thr Lys Val Tyr Leu Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val
            260                 265                 270
Val Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn
        275                 280                 285
Thr Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser
    290                 295                 300
Tyr Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp
305                 310                 315                 320
<210>5
<211>609
<212>DNA
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>基因
<222>(1)..(609)
<223>基因E12
<400>5
atgataaaca taaacataaa cacaatacta atattcgcat cattatttgt tgcatcgttt         60
gcaaatgatt atcctccacc cggtttcttc gaaaacaaat acattacaga tacatttaat         120
tacatatcta tagattttga actatatcca gttaacgtat catcttgtaa tcgactaagt         180
acaaaacaat catccgatat tatcacgact tctgaattaa caattactgt taatagtaca         240
gactgcgatc cagtctttgt aacagaatat tattctgtaa aggataaaac tgctgtagcc         300
ggacttttca cagatactac aaaaaaacaa aatacatcca agatgtgtac gctgaatgta         360
gaagtaaaat gtaacgctga aacggaacct gtattaatcg gtaattttac acgtgttcct         420
gaaacagcat caacccacgc tgaaaatttc actttaatag gcaactgtct atcagatctc         480
catctctata ttgcgtacgt caataccgat gagggatttg aagaggatac tgctactatt         540
catataggaa acatgatcga tattagcggt atacctccaa atacttgcgc tactagaact         600
attaattag                                                                 609
<210>6
<211>202
<212>PRT
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(202)
<223>CTD-1
<400>6
Met Ile Asn Ile Asn Ile Asn Thr Ile Leu Ile Phe Ala Ser Leu Phe
1               5                    10                 15
Val Ala Ser Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Pro Pro Gly Phe Phe Glu Asn
            20                  25                  30
Lys Tyr Ile Thr Asp Thr Phe Asn Tyr Ile Ser Ile Asp Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Tyr Pro Val Asn Val Ser Ser Cys Asn Arg Leu Ser Thr Lys Gln Ser
    50                  55                  60
Ser Asp Ile Ile Thr Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Thr
65                  70                  75                  80
Asp Cys Asp Pro Val Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Ser Val Lys Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Ala Val Ala Gly Leu Phe Thr Asp Thr Thr Lys Lys Gln Asn Thr
            100                 105                 110
Ser Lys Met Cys Thr Leu Asn Val Glu Val Lys Cys Asn Ala Glu Thr
        115                 120                 125
Glu Pro Val Leu Ile Gly Asn Phe Thr Arg Val Pro Glu Thr Ala Ser
    130                 135                 140
Thr His Ala Glu Asn Phe Thr Leu Ile Gly Asn Cys Leu Ser Asp Leu
145                 150                 155
              160
His Leu Tyr Ile Ala Tyr Val Asn Thr Asp Glu Gly Phe Glu Glu Asp
                165                 170
               175
Thr Ala Thr Ile His Ile Gly Asn Met Ile Asp Ile Ser Gly Ile Pro
            180                 185                 190
Pro Asn Thr Cys Ala Thr Arg Thr Ile Asn
        195                 200
<210>7
<211>609
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>基因
<222>(1)..(609)
<223>基因V014
<400>7
atgataaaca taaacataaa cacaatacta atattcgcat cattatttgt tgcatcgttt         60
gcaaatgatt atcctccacc cggtttcttc gaagacaaat acattacaaa tacatttaac         120
tacatatcta tagattttga actatatcca gttaacgtat catcttgtaa tcgactaagt         180
acaaaacaat catcagatgt tatatcgact tctgaattga caattactgt taatagtaca         240
gattgtgatc cagtctttgt aacagaatat tactctgtaa aggataaaac tgctatagcc         300
ggacttttca cagatactac aaaaaaacaa aatacatcca agatgtgtac gctgaatata         360
gaagtaaaat gtaacgctga aacggaacct gtattaatcg gtaattttac acgcgttcct         420
gaaaaagcat caacacacgc tgaaaatttc actttaatag gcaactgtct atcagatctc         480
catctctata ttgcgtatgt caataccgat gaggaatttg aagaggatac tgctactgtt         540
catataggaa acaaactcga tattaacggt atacctccaa atatgtgcgc taccagaacc         600
attaattag                                                                 609
<210>8
<211>202
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(202)
<223>CTD-1
<400>8
Met Ile Asn Ile Asn Ile Asn Thr Ile Leu Ile Phe Ala Ser Leu Phe
1               5                   10                  15
Val Ala Ser Phe Ala Asn Asp Tyr Pro Pro Pro Gly Phe Phe Glu Asp
            20                  25                  30
Lys Tyr Ile Thr Asn Thr Phe Asn Tyr Ile Ser Ile Asp Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Tyr Pro Val Asn Val Ser Ser Cys Asn Arg Leu Ser Thr Lys Gln Ser
    50                  55                  60
Ser Asp Val Ile Ser Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Thr
65                  70                  75
                 80
Asp Cys Asp Pro Val Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Ser Val Lys Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Ala Ile Ala Gly Leu Phe Thr Asp Thr Thr Lys Lys Gln Asn Thr
            100                 105                 110
Ser Lys Met Cys Thr Leu Asn Ile Glu Val Lys Cys Asn Ala Glu Thr
        115                 120                 125
Glu Pro Val Leu Ile Gly Asn Phe Thr Arg Val Pro Glu Lys Ala Ser
    130                 135                 140
Thr His Ala Glu Asn Phe Thr Leu Ile Gly Asn Cys Leu Ser Asp Leu
145                 150                 155                 160
His Leu Tyr Ile Ala Tyr Val Asn Thr Asp Glu Glu Phe Glu Glu Asp
                165                 170                 175
Thr Ala Thr Val His Ile Gly Asn Lys Leu Asp Ile Asn Gly Ile Pro
            180                 185                 190
Pro Asn Met Cys Ala Thr Arg Thr Ile Asn
        195                 200
<210>9
<211>1047
<212>DNA
<213>天花主要病毒菌株Bangladesh
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1047)
<223>基因G2R
<400>9
atgaagtccg tattatactt gtatatattg tttctctcat gtataataaa cggaagagat         60
gcagcaccgt atacaccacc caatggaaag tgtaaagaca ccgaatacaa acgccataat         120
ctgtgttgtt tatcgtgtcc tccgggaaca tacgcttcca gattatgtga tagcaagact         180
aacacacaat gtacaccgtg tggttcgggt acctttacat ctcgcaataa tcatttaccc         240
gcttgtctaa gttgtaacgg aagatgcaat agtaatcagg tagagacgcg atcgtgtaac         300
acgactcaca atagaatctg tgaatgctct cccggatatt attgtcttct taaaggatca         360
tccggatgca aggcatgtgt ttcccaaaca aaatgtggaa taggatacgg agtatccgga         420
cacacgtctg ttggagacgt catctgttct ccgtgtggtt tcggaacata ttctcacacc         480
gtctcttccg cagataaatg cgaacccgta cccaacaata catttaacta tatcgatgtg         540
gaaattacac tgtatccagt taacgacaca tcgtgtactc ggacgaccac taccggtctc         600
agcgaatcca tcttaacgtc ggaactaact attactatga atcatacaga ttgcaatccc         660
gtatttcgtg aggaatactt ctctgtcctt aataaggtag caacttcagg attttttaca         720
ggagaaaata gatatcaaaa tatttcaaag gtgtgtactt taaattttga gattaaatgt         780
aataacaaag gttcttcctt caaacagcta acgaaagcaa agaatgatga cggtatgatg         840
tcgcattcgg agacggtaac tctagcgggt gactgtctat ctagcgtcga catctatata         900
ctatatagta ataccaatgc tcaagactac gaaactgata caatctctta tcgtgtgggt         960
aatgttctcg atgatgatag ccatatgccc ggtagttgca atatacataa accgatcact         1020
aattccaaac ccacccgctt tttatag                                             1047
<210>10
<211>348
<212>PRT
<213>天花主要病毒菌株Bangladesh
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(348)
<223>细胞因子应答修饰物B(CrmB)
<400>10
Met Lys Ser Val Leu Tyr Leu Tyr Ile Leu Phe Leu Ser Cys Ile Ile
1                5                  10                  15
Asn Gly Arg Asp Ala Ala Pro Tyr Thr Pro Pro Asn Gly Lys Cys Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Glu Tyr Lys Arg His Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro
        35                  40                  45
Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln Cys
    50                  55                  60
Thr Pro Cys Gly Ser Gly Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu Pro
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asn Ser Asn Gln Val Glu Thr
                85                  90                  95
Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Glu Cys Ser Pro Gly
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Leu Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val Ser
        115                 120                 125
Gln Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Ser Val
    130                 135                 140
Gly Asp Val Ile Cys Ser Pro Cys Gly Phe Gly Thr Tyr Ser His Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Ser Ala Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Asn Asn Thr Phe Asn
                165                 170                 175
Tyr Ile Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser Cys
            180                 185                 190
Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Leu Thr Ser Glu
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Thr Met Asn His Thr Asp Cys Asn Pro Val Phe Arg Glu
    210                 215                 220
Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe Thr
225                 230                 235                 240
Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn Phe
                245                 250                 255
Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Phe Lys Gln Leu Thr Lys
            260                 265                 270
Ala Lys Asn Asp Asp Gly Met Met Ser His Ser Glu Thr Val Thr Leu
        275                 280                 285
Ala Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu Tyr Ser Asn
    290                 295                 300
Thr Asn Ala Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr Arg Val Gly
305                 310                 315                 320
Asn Val Leu Asp Asp Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys Asn Ile His
            325                 330                 335
Lys Pro Ile Thr Asn Ser Lys Pro Thr Arg Phe Leu
            340                 345
<210>11
<211>1068
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1068)
<223>基因V005
<400>11
atgaagtcat atatattgct attgctgctt tcatgtataa tcataataaa cagcgatata         60
acaccgcatg aaccatccaa cggaaagtgt aaagacaacg aatacaaacg ccatcatcta         120
tgttgtttat cgtgtcctcc gggaacatac gcttccagat tatgcgatag caagactaac         180
acaaacacac aatgtacgcc gtgtgcgtcg gacaccttta cgtctcgcaa taatcattta         240
cccgcttgtc taagttgtaa cggaagatgc gatagtaatc aggtagagac gcgatcgtgt         300
aacacgactc acaatagaat ctgtgattgt gctcccggat attattgttt tctcaaagga         360
tcatccggat gcaaggcatg tgtttcccaa acaaagtgtg gaataggata cggagtatcc         420
ggacacacgc ctaccggaga cgtcgtctgt tctccgtgtg gtctcggaac atattctcac         480
accgtctctt ccgtagataa atgcgaaccc gtacccagta atacctttaa ctatatcgat         540
gtggaaatta atctgtatcc cgtcaacgac acatcgtgta ctcggacgac cactaccggt         600
ctcagtgaat ccatctcaac ttcggaacta acgattacta tgaatcataa agactgcgat         660
cccgtctttc gtaatggata cttctccgtt cttaatgagg tagcaacttc agggttcttt         720
acaggacaaa atagatatca gaatatttca aaggtatgca ctctgaattt cgagattaaa         780
tgtaataaca aagattctta ttcttcctcc aaacagttaa cgaaaacaaa gaatgatgac         840
gactccatca tgccgcattc ggaatcggta actctagtgg gcgactgtct atccagcgtc         900
gacatctata tactatatag taataccaat actcaagact acgaaactga tacaatctct         960
tatcatgtgg gtaatgttct cgatgtcgat agccatatgc ccggtaggtg cgatacacat         1020
aaactgatta ctaattccaa ttcccagtat cccacccact ttttatag                      1068
<210>12
<211>355
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(355)
<223>细胞因子应答修饰物B(CrmB)
<400>12
Met Lys Ser Tyr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ile Ile Ile Ile
1               5                   10                  15
Asn Ser Asp Ile Thr Pro His Glu Pro Ser Asn Gly Lys Cys Lys Asp
            20                  25                  30
Asn Glu Tyr Lys Arg His His Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro Gly
        35                  40                  45
Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Asn Thr Gln
    50                  55                  60
Cys Thr Pro Cys Ala Ser Asp Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asp Ser Asn Gln Val Glu
                85                  90                  95
Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Asp Cys Ala Pro
            100                 105                 110
Gly Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val
        115                 120                 125
Ser Gln Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Pro
    130                 135                 140
Thr Gly Asp Val Val Cys Ser Pro Cys Gly Leu Gly Thr Tyr Ser His
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Ser Val Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Ser Asn Thr Phe
                165                 170                 175
Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser
            180                 185                 190
Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val Phe Arg
    210                 215                 220
Asn Gly Tyr Phe Ser Val Leu Asn Glu Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe
225                 230                 235                 240
Thr Gly Gln Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Asp Ser Tyr Ser Ser Ser Lys Gln
            260                 265                 270
Leu Thr Lys Thr Lys Asn Asp Asp Asp Ser Ile Met Pro His Ser Glu
        275                 280                 285
Ser Val Thr Leu Val Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile
    290                 295                 300
Leu Tyr Ser Asn Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser
305                 310                 315                 320
Tyr His Val Gly Asn Val Leu Asp Val Asp Ser His Met Pro Gly Arg
                325                 330                 335
Cys Asp Thr His Lys Leu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Gln Tyr Pro Thr
            340                 345                 350
His Phe Leu
        355
<210>13
<211>582
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>基因
<222>(1)..(582)
<223>基因V218
<400>13
atgatgatat acggattaat agcctgtctt atattcgtga cttcatccac cgctagtccc         60
ctttacattc ccgttattcc acccattacg gaagataaat cgtttaatag tgtagaggta         120
ttagtttcct tgtttagaga tgagcaaaaa gactatactg taacttcgca gttcaataac         180
tacactatcg ataccaaaga ctggactatc aacgtactat ccacacctga tggtctggag         240
ataccattga ccaatataac ttattggtca cggtttccaa ctataggtca tgcattgttc         300
aaatcagagt ccgaggatat cttccaaaag aacatgagta ttctaggtgt ctctattgaa         360
tgtaagaagc catcgacatc atttactttt ttgaccgtgc gtaaaatatc tcgagtattt         420
aatagatttc cagatatggc ttactatcga ggagactgtc tagaagtcgt ttatgtaaca         480
atgacttata aaaatactaa aactggagag actgattaca catacctctc taatgtgggg         540
attcctgaat actatcggtt gatgagtggt gtcgatggtt ga                            582
<210>14
<211>193
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(193)
<223>CTD-3
<400>14
Met Met Ile Tyr Gly Leu Ile Ala Cys Leu Ile Phe Val Thr Ser Ser
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Pro Leu Tyr Ile Pro Val Ile Pro Pro Ile Thr Glu Asp
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Asn Ser Val Glu Val Leu Val Ser Leu Phe Arg Asp Glu
        35                  40                  45
Gln Lys Asp Tyr Thr Val Thr Ser Gln Phe Asn Asn Tyr Thr Ile Asp
    50                  55                  60
Thr Lys Asp Trp Thr Ile Asn Val Leu Ser Thr Pro Asp Gly Leu Glu
65                  70                  75                  80
Ile Pro Leu Thr Asn Ile Thr Tyr Trp Ser Arg Phe Pro Thr Ile Gly
                85                  90                  95
His Ala Leu Phe Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ile Phe Gln Lys Asn Met
            100                 105                 110
Ser Ile Leu Gly Val Ser Ile Glu Cys Lys Lys Pro Ser Thr Ser Phe
        115                 120                 125
Thr Phe Leu Thr Val Arg Lys Ile Ser Arg Val Phe Asn Arg Phe Pro
    130                 135                 140
Asp Met Ala Tyr Tyr Arg Gly Asp Cys Leu Glu Val Val Tyr Val Thr
145                 150                 155                 160
Met Thr Tyr Lys Asn Thr Lys Thr Gly Glu Thr Asp Tyr Thr Tyr Leu
                165                 170                 175
Ser Asn Val Gly Ile Pro Glu Tyr Tyr Arg Leu Met Ser Gly Val Asp
            180                 185                 190
Gly
<210>15
<211>573
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Western Reserve
<220>
<221>基因
<222>(1)..(573)
<223>基因VACWR206
<400>15
atgatgatat acggattaat agcgtgtctt atattcgtga cttcatccat cgctagtcca         60
ctttatattc ccgttattcc acccatttcg gaagataaat cgttcaatag tgtagaggta         120
ttagtttcct tgtttagaga tgaccaaaaa gactatacgg taacttctca gttcaataac         180
tacactatcg ataccaaaga ctggactatc ggcgtactat ccacacctga tggtttggat         240
ataccattga ctaatataac ttattggtca cggtttacta taggtcgtgc attgttcaaa         300
tcagagtctg aggatatttt ccaaaagaaa atgagtattc taggtgtttc tatagaatgt         360
aagaagtcgt cgacattact tacttttttg accgtgcgta aaatgactcg agtatttaat         420
aaatttccag atatggctta ttatcgagga gactgtttaa aagccgttta tgtaacaatg         480
acttataaaa atactaaaac tggagagact gattacacgt acctctctaa tggggggttg         540
cctgcatact atcgtaatgg ggtcgatggt tga                                      573
<210>16
<211>190
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Western Reserve
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(190)
<223>CTD-3
<400>16
Met Met Ile Tyr Gly Leu Ile Ala Cys Leu Ile Phe Val Thr Ser Ser
1               5                   10                  15
Ile Ala Ser Pro Leu Tyr Ile Pro Val Ile Pro Pro Ile Ser Glu Asp
            20                  25                  30
Lys Ser Phe Asn Ser Val Glu Val Leu Val Ser Leu Phe Arg Asp Asp
        35                  40                  45
Gln Lys Asp Tyr Thr Val Thr Ser Gln Phe Asn Asn Tyr Thr Ile Asp
    50                  55                  60
Thr Lys Asp Trp Thr Ile Gly Val Leu Ser Thr Pro Asp Gly Leu Asp
65                  70                  75                  80
Ile Pro Leu Thr Asn Ile Thr Tyr Trp Ser Arg Phe Thr Ile Gly Arg
                85                  90                  95
Ala Leu Phe Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ile Phe Gln Lys Lys Met Ser
            100                 105                 110
Ile Leu Gly Val Ser Ile Glu Cys Lys Lys Ser Ser Thr Leu Leu Thr
        115                 120                 125
Phe Leu Thr Val Arg Lys Met Thr Arg Val Phe Asn Lys Phe Pro Asp
    130                 135                 140
Met Ala Tyr Tyr Arg Gly Asp Cys Leu Lys Ala Val Tyr Val Thr Met
145                 150                 155                 160
Thr Tyr Lys Asn Thr Lys Thr Gly Glu Thr Asp Tyr Thr Tyr Leu Ser
                165                 170                 175
Asn Gly Gly Leu Pro Ala Tyr Tyr Arg Asn Gly Val Asp Gly
            180                 185                 190
<210>17
<211>549
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Western Reserve
<220>
<221>基因
<222>(1)..(549)
<223>基因VACWR189
<400>17
atgtataaaa aactaataac gtttttattt gtaataggtg cattagcatc ctattcgaat         60
aatgagtaca ctccgtttaa taaactgagt gtaaaactct atatagatgg agtagataat         120
atagaaaatt catatactga tgataataat gaattggtgt taaattttaa agagtacaca         180
atttctatta ttacagagtc atgcgacgtc ggatttgatt ccatagatat agatgttata         240
aacgactata aaattattga tatgtatacc attgactcgt ctactattca acgcagaggt         300
cacacgtgta gaatatctac caaattatca tgccattatg ataagtaccc ttatattcac         360
aaatatgatg gtgatgagcg acaatattct attactgcag agggaaaatg ctataaagga         420
ataaaatatg aaataagtat gatcaacgat gatactctat tgagaaaaca tactcttaaa         480
attggatcta cttatatatt tgatcgtcat ggacatagta atacatatta ttcaaaatat         540
gatttttaa                                                                 549
<210>18
<211>182
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Western Reserve
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(182)
<223>CTD-2
<400>18
Met Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Phe Leu Phe Val Ile Gly Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Ser Tyr Ser Asn Asn Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Lys Leu Ser Val Lys
            20                  25                  30
Leu Tyr Ile Asp Gly Val Asp Asn Ile Glu Asn Ser Tyr Thr Asp Asp
        35                  40                  45
Asn Asn Glu Leu Val Leu Asn Phe Lys Glu Tyr Thr Ile Ser Ile Ile
    50                  55                  60
Thr Glu Ser Cys Asp Val Gly Phe Asp Ser Ile Asp Ile Asp Val Ile
65                  70                  75                  80
Asn Asp Tyr Lys Ile Ile Asp Met Tyr Thr Ile Asp Ser Ser Thr Ile
                85                  90                  95
Gln Arg Arg Gly His Thr Cys Arg Ile Ser Thr Lys Leu Ser Cys His
            100                 105                 110
Tyr Asp Lys Tyr Pro Tyr Ile His Lys Tyr Asp Gly Asp Glu Arg Gln
        115                 120                 125
Tyr Ser Ile Thr Ala Glu Gly Lys Cys Tyr Lys Gly Ile Lys Tyr Glu
    130                 135                 140
Ile Ser Met Ile Asn Asp Asp Thr Leu Leu Arg Lys His Thr Leu Lys
145                 150                 155                 160
Ile Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Asp Arg His Gly His Ser Asn Thr Tyr
                165                 170                 175
Tyr Ser Lys Tyr Asp Phe
            180
<210>19
<211>546
<212>DNA
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>基因
<222>(1)..(546)
<223>基因E184
<400>19
atgtataaaa aactaataac gtttttattt gtaataggtg cagtagcatc ttattcgaat         60
aatgagtaca ctccgtttaa taaacttagt gtaaaactgt atatagatgg agtagataat         120
atagaaaatt catatactga taataatgaa ttggtgttaa attttaaaga gtacacaatt         180
tctattatta cagagtcatg cgacgtcgga tttgattcca tagatataga tgttataaac         240
gactataaaa ttcttgatat gtataccatt gactcgtcta ccattcaacg cagaggtcac         300
acatgcaaaa tatctaccaa attatcatgc cattatgata agcaccctta tattcacaaa         360
tatgagggtg atgagcgaca atattctatt actgcagagg gaaaatgcta taaaggaata         420
aaatatgaaa taagtatgat gcacgatgat acgctattga gaaaacatac tcttaaaatt         480
ggatctactt atatattcga tcgccatgga catagtaata catattattc aaaatatgat         540
ttttaa                                                                    546
<210>20
<211>181
<212>PRT
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(181)
<223>CTD-2
<400>20
Met Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Phe Leu Phe Val Ile Gly Ala Val Ala
1                5                  10                  15
Ser Tyr Ser Asn Asn Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Lys Leu Ser Val Lys
            20                  25                  30
Leu Tyr Ile Asp Gly Val Asp Asn Ile Glu Asn Ser Tyr Thr Asp Asn
        35                  40                  45
Asn Glu Leu Val Leu Asn Phe Lys Glu Tyr Thr Ile Ser Ile Ile Thr
    50                  55                  60
Glu Ser Cys Asp Val Gly Phe Asp Ser Ile Asp Ile Asp Val Ile Asn
65                  70                  75                  80
Asp Tyr Lys Ile Leu Asp Met Tyr Thr Ile Asp Ser Ser Thr Ile Gln
                85                  90                  95
Arg Arg Gly His Thr Cys Lys Ile Ser Thr Lys Leu Ser Cys His Tyr
            100                 105                 110
Asp Lys His Pro Tyr Ile His Lys Tyr Glu Gly Asp Glu Arg Gln Tyr
        115                 120                 125
Ser Ile Thr Ala Glu Gly Lys Cys Tyr Lys Gly Ile Lys Tyr Glu Ile
    130                 135                 140
Ser Met Met His Asp Asp Thr Leu Leu Arg Lys His Thr Leu Lys Ile
145                 150                 155                 160
Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Asp Arg His Gly His Ser Asn Thr Tyr Tyr
                165                 170                 175
Ser Lys Tyr Asp Phe
            180
<210>21
<211>480
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>C区
<222>(1)..(480)
<223>来自细胞因子应答修饰物D(CmrD)的CTD
<400>21
tcctttaaca gcatagatgt agaaattaat atgtatcctg ttaacaagac ctcttgtaat         60
tcgagtatag gaagtagcag taccatatca acttccgagt taacaattac tctaaaacat         120
gaggattgta ctactgtctt tattggagat tactattcag tcgttgataa actagcaact         180
tcaggtttct ttacaaacga taaagtacat caagacctca caacgcagtg caagattaat         240
ctagaaatca aatgtaattc tggaggagaa tctagacaac taacacccac gacgaaggta         300
tactttatgc ctcattcaga aacggtaact gtggtaggag actgtctctc taatctcgat         360
gtctatatag tatatgccaa tacggacgcg atatattccg acatggatgt cgtcgcttat         420
catactagtt atatactaaa tgttgatcat attccaccaa atgattgtga aagagattga         480
<210>22
<211>159
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(159)
<223>来自细胞因子应答修饰物D(CrmD)的CTD
<400>22
Ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn Lys
1                5                  10                  15
Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Glu Leu Thr Ile Thr Leu Lys His Glu Asp Cys Thr Thr Val Phe Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe Phe
    50                  55                  60
Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile Asn
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Gly Glu Ser Arg Gln Leu Thr Pro
                85                  90                  95
Thr Thr Lys Val Tyr Phe Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val Val
            100                 105                 110
Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn Thr
        115                 120                 125
Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp
145                 150                 155
<210>23
<211>477
<212>DNA
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>C区
<222>(1)..(477)
<223>来自细胞因子应答修饰物D(CrmD)的CTD
<400>23
tcctttaaca gcatagatgt agaaattaat atgtatcctg ttaacaagac ctcttgtaat         60
tcgagtatag gaagcagcag taccatatca acttccgagt taacaattac tctaacacat         120
gaggattgta ctcctgtctt tattggagat tactattcag tcgttgataa actagcaact         180
tcaggtttct ttacaaacga taaagtacat caagacctca caacgcagtg caagattaat         240
ctagaaatca aatgtaattc tggaagagaa tctagacaac taacacccac gacgaaggta         300
taccttatgc ctcattcaga aacggtaact gtggtaggag actgtctctc taatctcgat         360
gtctatatag tatatgccaa tacggacgcg atatattccg acatggacgt cgtcgcgtat         420
catactagtt atatactaaa tgttgatcat attccaccaa atgattgtga aagagat            477
<210>24
<211>159
<212>PRT
<213>鼠痘病毒菌株Naval
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(159)
<223>来自细胞因子应答修饰物D(CrmD)的CTD
<400>24
ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn Lys
1               5                   10                  15
Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Glu Leu Thr Ile Thr Leu Thr His Glu Asp Cys Thr Pro Val Phe Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe Phe
    50                  55                  60
Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile Asn
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Arg Glu Ser Arg Gln Leu Thr Pro
                85                  90                  95
Thr Thr Lys Val Tyr Leu Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val Val
            100                 105                 110
Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn Thr
        115                 120                 125
Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser Tyr
    130                 135                 140
Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp
145                 150                 155
<210>25
<211>546
<212>DNA
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>C区
<222>(1)..(546)
<223>细胞因子应答修饰物B(CrmB)的CTD
<400>25
acctttaact atatcgatgt ggaaattaat ctgtatcccg tcaacgacac atcgtgtact         60
cggacgacca ctaccggtct cagtgaatcc atctcaactt cggaactaac gattactatg         120
aatcataaag actgcgatcc cgtctttcgt aatggatact tctccgttct taatgaggta         180
gcaacttcag ggttctttac aggacaaaat agatatcaga atatttcaaa ggtatgcact         240
ctgaatttcg agattaaatg taataacaaa gattcttatt cttcctccaa acagttaacg         300
aaaacaaaga atgatgacga ctccatcatg ccgcattcgg aatcggtaac tctagtgggc         360
gactgtctat ccagcgtcga catctatata ctatatagta ataccaatac tcaagactac         420
gaaactgata caatctctta tcatgtgggt aatgttctcg atgtcgatag ccatatgccc         480
ggtaggtgcg atacacataa actgattact aattccaatt cccagtatcc cacccacttt         540
ttatag                                                                    546
<210>26
<211>181
<212>PRT
<213>牛痘病毒菌株Brighton Red
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(181)
<223>细胞因子应答修饰物B(CrmB)的CTD
<400>26
Thr Phe Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp
1               5                   10                  15
Thr Ser Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val
        35                  40                  45
Phe Arg Asn Gly Tyr Phe Ser Val Leu Asn Glu Val Ala Thr Ser Gly
    50                  55                  60
Phe Phe Thr Gly Gln Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr
65                  70                  75                  80
Leu Asn Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Asp Ser Tyr Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Lys Gln Leu Thr Lys Thr Lys Asn Asp Asp Asp Ser Ile Met Pro His
            100                 105                 110
Ser Glu Ser Val Thr Leu Val Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile
        115                 120                 125
Tyr Ile Leu Tyr Ser Asn Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr
    130                 135                 140
Ile Ser Tyr His Val Gly Asn Val Leu Asp Val Asp Ser His Met Pro
145                 150                 155                 160
Gly Arg Cys Asp Thr His Lys Leu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Gln Tyr
                165                 170                 175
Pro Thr His Phe Leu
            180
<210>27
<211>528
<212>DNA
<213>天花主要病毒菌株Bangladesh
<220>
<221>C区
<222>(1)..(528)
<223>细胞因子应答修饰物B(CrmB)的CTD
<400>27
acatttaact atatcgatgt ggaaattaca ctgtatccag ttaacgacac atcgtgtact         60
cggacgacca ctaccggtct cagcgaatcc atcttaacgt cggaactaac tattactatg         120
aatcatacag attgcaatcc cgtatttcgt gaggaatact tctctgtcct taataaggta         180
gcaacttcag gattttttac aggagaaaat agatatcaaa atatttcaaa ggtgtgtact         240
ttaaattttg agattaaatg taataacaaa ggttcttcct tcaaacagct aacgaaagca         300
aagaatgatg acggtatgat gtcgcattcg gagacggtaa ctctagcggg tgactgtcta         360
tctagcgtcg acatctatat actatatagt aataccaatg ctcaagacta cgaaactgat         420
acaatctctt atcgtgtggg taatgttctc gatgatgata gccatatgcc cggtagttgc         480
aatatacata aaccgatcac taattccaaa cccacccgct ttttatag                      528
<210>28
<211>175
<212>PRT
<213>天花主要病毒菌株Bangladesh
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(175)
<223>细胞因子应答修饰物B(CrmB)的CTD
<400>28
Thr Phe Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Pro Val Asn Asp
1               5                   10                  15
Thr Ser Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Leu
            20                  25                  30
Thr Ser Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Thr Asp Cys Asn Pro Val
        35                  40                  45
Phe Arg Glu Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly
    50                  55                  60
Phe Phe Thr Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr
65                  70                  75                  80
Leu Asn Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Phe Lys Gln
                85                  90                  95
Leu Thr Lys Ala Lys Asn Asp Asp Gly Met Met Ser His Ser Glu Thr
            100                 105                 110
Val Thr Leu Ala Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu
        115                 120                 125
Tyr Ser Asn Thr Asn Ala Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr
    130                 135                 140
Arg Val Gly Asn Val Leu Asp Asp Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys
145                 150                 155                 160
Asn Ile His Lys Pro Ile Thr Asn Ser Lys Pro Thr Arg Phe Leu
                165                 170                 175

Claims (21)

1.一种用于结合趋化因子和它们的类似物和/或提高TNFR的免疫调节性的病毒肿瘤坏死因子受体(vTNFR)CrmB或CrmD的C-末端结构域(CTD)或来自痘病毒的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)以及它们的功能性同源物，包括它们的衍生物和片段。
2.一种用于阻断趋化因子与它们的相应细胞表面受体的结合和/或调节趋化因子生物学活性的vTNFR CrmB或CrmD的CTD或来自痘病毒的CTD同源物(CTD1、CTD2和CTD3)以及它们的功能性同源物，包括它们的衍生物、和片段。
3.根据权利要求1-2任一项所述的来自CrmB的CTD，其中所述来自CrmB的CTD包含SEQ ID N°26或SEQ ID N°28。
4.根据权利要求1-2任一项所述的来自CrmD的CTD，其中所述来自CrmD的CTD包含SEQ ID N°22或SEQ ID N°24。
5.根据权利要求1-2任一项所述的CTD同源物，其中所述CTD包含SEQ ID N°8、SEQ ID N°14、SEQ ID N°6、SEQ ID N°20、SEQ ID N°18或SEQ ID N°16，或者包含由基因V201、D12L、B6R或B21R编码的蛋白质中的任一个。
6.一种融合多肽，包含融合至相同来源或其他来源的根据权利要求1-5任一项所述的CTD或CTD同源物。
7.根据权利要求6所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含融合至vTNFR的N-末端TNF结合结构域的根据权利要求1-5任何一个所述的CTD。
8.根据权利要求7所述的融合多肽，其中所述TNFR是人类来源的。
9.一种多核苷酸，包括编码根据权利要求1-5任一项所述的CTD或CTD同源物或根据权利要求6-8任一项所述的的融合多肽的序列。
10.根据权利要求6-9任一项所述的多核苷酸，包含表达盒，其中所述序列表达自组织特异性或组成型启动子。
11.根据权利要求6-9任一项所述的多核苷酸，其中所述序列形成病毒载体或表达质粒的一部分。
12.一种用于在体内结合趋化因子或趋化因子类似物的药物组合物，包括分别根据权利要求1-5任一项所述的CTD和/或CTD同源物；和/或根据权利要求6-9任一项所述的融合多肽；和/或根据权利要求10和11所述的表达盒和/或病毒载体。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，用于在体内阻断趋化因子与相应的细胞表面趋化因子受体的结合或抑制趋化因子的生物学活性。
14.根据权利要求12-13任一项所述的药物组合物，用于产生抗炎作用。
15.根据权利要求12-14任一项所述的药物组合物，其包含另外的免疫抑制剂或抗炎物质。
16.一种检测试剂盒，包括根据权利要求1-5任一项所述的CTD和经标记或固定的反应物，用于在体外检测或测量趋化因子、趋化因子类似物或趋化因子受体。
17.根据权利要求1-5任一项所述的CTD或CTD同源物、和/或根据权利要求6-9任一项所述的融合多肽、和/或根据权利要求10和11任一项的表达盒和/或病毒载体分别在制备用于给予受治者以产生抗炎作用的药物中的应用。
18.根据权利要求1-5任一项所述的CTD或CTD同源物在制备用于给予受治者以结合存在于病毒或寄生虫中的趋化因子类似物从而阻断所述病毒或寄生虫进入细胞的药物中的应用。
19.通过灭活或缺失根据权利要求1-5任一项所述的CTD同源物的至少一个和/或vTNFR进行的牛痘病毒疫苗的减毒。
20.用于治疗由牛痘病毒疫苗接种引起的不良作用和/或由人类天花中天花病毒引起的病症的药物的应用和制备，其是基于对CTD同源物或vTNFR的抗体的诱导，或者使用抑制根据权利要求1-5任一项所述的CTD同源物或vTNFR的趋化因子结合活性的抗体或试剂。
21.一种检测包含趋化因子或趋化因子类似物的方法，其是基于将可能包含所述待检测物质的样品与包含根据权利要求1-5任一项所述的CTD或CTD同源物的试剂进行接触，由此结合所述趋化因子或趋化因子类似物。
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