JP2004149439A

JP2004149439A - 移植拒絶免疫回避剤

Info

Publication number: JP2004149439A
Application number: JP2002315366A
Authority: JP
Inventors: Katsuya Shiraki; 克哉白木; Takeshi Nakano; 赳中野; Takenari Yamanaka; 猛成山中
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-30
Filing date: 2002-10-30
Publication date: 2004-05-27
Also published as: WO2004039395A1

Abstract

【課題】腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の発現に基づくその特性を利用した、生体移植手術における拒絶免疫を有効的に回避する移植拒絶免疫回避剤、ならびに移植拒絶免疫（移植片拒絶反応）を回避する方法を提供すること。
【解決手段】ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）の発現に基づくその特性を利用した、生体移植手術における拒絶免疫を有効的に回避する移植拒絶免疫回避剤、ならびに移植拒絶免疫（移植片拒絶反応）を回避する方法の提供であり、ＴＲＡＩＬを有効成分とすることを特徴とする移植拒絶免疫回避剤であり、生体移植術における移植拒絶免疫を回避するために、生体移植組織または該移植組織の周囲組織を、サイトカインまたは癌化学療法剤により刺激し、ＴＲＡＩＬを発現させる方法である。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体移植手術における拒絶免疫を有効的に回避する移植拒絶免疫回避剤、ならびに移植拒絶免疫（移植片拒絶反応）を回避する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許関連情報】
なし。
【非特許関連情報】
なし。
【０００３】
最近の医療技術として、生体移植術が大きな発展をみせている。特に難治性の器官疾患については肝移植、腎移植、心臓移植等の生体移植術が有効な治療手段であり、これまで種々の生体移植術が行なわれてきている。ところで生体移植術にあっては、移植後の組織の拒絶免疫（移植片拒絶反応）が問題になっており、かかる拒絶反応を抑えるために、これまで種々の免疫抑制剤が開発されてきている。これらの薬剤はいずれも抗原非特異的なものであり、拒絶免疫となる免疫応答を抑制するものとしては、理論的には、抗原特異的に抑制するのが最も好ましいものである。
【０００４】
抗原特異的に免疫を抑制させるためには、免疫寛容を誘導できるような抗原を選択し、免疫応答の誘導を抗原特異的に抑制すればよいが、いったん免疫が成立しているものを抑制することは極めて困難なことである。したがって、今日における免疫抑制剤は、例えば、Ｂ細胞あるいはＴ細胞のような免疫を担当する細胞の分化分裂を阻害する、非特異的な免疫抑制剤が主流を占めている。
【０００５】
本発明者らは、これまで大腸癌をはじめとする悪性腫瘍手術標本、生体標本を精力的に収集し、アポトーシス（細胞死）関連タンパク質の発現、アポトーシスと癌化について研究を続けてきている。アポトーシスは、多細胞生物の細胞数、発生分化、形態および恒常性の維持において、重要な現象であり、この制御の破綻は、細胞の癌化等の原因となるとされている。すなわち、細胞の癌化のプロセスが、アポトーシスに対する耐性能獲得過程でもあると考えられるようになってきている。
【０００６】
一方、大腸癌の頻度は近年増大しており、現在では悪性腫瘍による死因の第４位を占めるまでに至っている。一般に、大腸癌は、免疫療法、化学療法および放射線療法によるアポトーシス誘導に対しては耐性を示し、抗腫瘍効果が期待できない。そこで、本発明者らは、大腸癌に対する治療戦略上重要な要素である、癌化に伴うアポトーシス耐性機序を明らかにするべく、鋭意研究を進めてきた。
【０００７】
その研究の過程において、本発明者らは、新しい腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ）ファミリーである腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：以下「ＴＲＡＩＬ」と略記する場合もある）の働きに注目した。これまでＴＲＡＩＬは、ＴＮＦやＦａｓＬ（Ｆａｓｌｉｇａｎｄ）等の他のＴＮＦファミリーとは異なり正常細胞にはほとんど影響を与えることなく、腫瘍細胞に特異的にアポトーシスを誘導するものであるとされていた。しかしながら本発明者らの知見によれば、大腸癌をはじめとする消化管癌では、ＴＲＡＩＬに対しては比較的耐性を示すばかりでなく、癌細胞自体がＴＲＡＩＬを発現することを見出している。
【０００８】
その一方、大腸癌のみならず、肝細胞癌細胞（ＨＣＣ：Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）がＴＲＡＩＬを発現し、発現されたＴＲＡＩＬによって、リンパ球がアポトーシス（細胞死）されることを新たに見出した。このリンパ球がＴＲＡＩＬの発現によって細胞死に陥ることは、ＴＲＡＩＬ自身、あるいはＴＲＡＩＬの発現により、生体のリンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞等）の攻撃を回避できることを示していることに他ならない。
【０００９】
すなわち、ＴＲＡＩＬの発現による特的なリンパ球の細胞死は、ＴＲＡＩＬが特異的な免疫回避剤として作用するものであることを示している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、ＴＲＡＩＬの発現に基づくその特性を利用した、生体移植手術における拒絶免疫を有効的に回避する移植拒絶免疫回避剤、ならびに移植拒絶免疫（移植片拒絶反応）を回避する方法を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
しかして、かかる課題を解決するための本発明の基本的態様は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：ＴＲＡＩＬ）を有効成分とすることを特徴とする移植拒絶免疫回避剤である。
【００１２】
本発明者らの検討によれば、ＴＲＡＩＬの発現は、種々のサイトカインあるいは癌化学療法剤により、生体移植組織または該移植組織の周囲組織の細胞を刺激することでより効果的に行なわれることを確認した。したがって本発明の別の態様は、生体移植術における移植拒絶免疫を回避するために、生体移植組織または該移植組織の周囲組織を、サイトカインまたは癌化学療法剤により刺激し、ＴＲＡＩＬを発現させる方法でもある。
【００１３】
さらにまた本発明の別の態様は、生体移植組織、または当該生体移植組織の周囲組織にＴＲＡＩＬを発現させることを特徴とする、移植拒絶免疫を回避する方法でもある。
【００１４】
この場合にあっても、ＴＲＡＩＬの発現は、種々のサイトカインあるいは癌化学療法剤により生体移植組織または該移植組織の周囲組織の細胞を刺激することでより効果的に行なわれる。したがって、上記の発明のより具体的な方法としては、ＴＲＡＩＬの発現を、生体移植組織または該移植組織の周囲組織を、サイトカインまたは癌化学療法剤により刺激することにより行なう移植拒絶免疫を回避する方法である。
【００１５】
また、本発明にあっては、刺激するサイトカインがＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）、ＩＬ−１（インターロイキン−１）またはＩＬ−１８（インターロイキン−１８）が特に好ましいものであり、また癌化学療法剤が、アドリアマイシンまたはブレオマイシンがまた特に好ましいものであることが判明した。かかる刺激は、サイトカインまたは癌化学療法剤を投与する手段で行い得る。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を、肝細胞癌細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ；以下「ＨＣＣ」と略記する）によるＴＲＡＩＬの発現、発現されたＴＲＡＩＬによるアポトーシス（細胞死）の検出等の実験結果を詳細に説明しながら、詳細に説明する。
【００１７】
材料および方法：
１）細胞株およびＨＣＣ細胞組織：
ＪｕｒｋａｔＴ細胞（ヒト白血病性Ｔ細胞）、ヒトＨＣＣ細胞株、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ３細胞は、ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ、ＵＳＡ）より購入した。バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔｌｙｍｐｈｏｍａ）細胞株、Ｒａｊｉ（ＪＣＲＢ９０１２）細胞およびＨＣＣ細胞株、Ｈｕｈ７（ＪＣＲＢ０４０３）細胞は、ＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｓｏｕｒｃｅｓＢａｎｋ（大阪）から購入した。
【００１８】
ＪｕｒｋａｔＴ細胞、Ｒａｊｉ細胞およびヒトＨＣＣ細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社：ＢＲＬ、ＮＹ）中、３７℃で培養した。全培地には、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社：ＢＲＬ）および加熱不活性化した１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社：ＢＲＬ）を添加した。ヒトＨＣＣ細胞組織は、１０名の患者より外科的切除術により採取（採取にあたってはインフォームドコンセントを得ている）し、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）用の正常肝組織は検死組織より採取して、コントロールとした。切除したそれぞれの組織は、採取後直ちに−８０℃にて保存するか、または１０％ホルマリン溶液で固定した。
【００１９】
２）ＴＲＡＩＬの検出方法：
ヒトＨＣＣ細胞株中のＴＲＡＩＬの検出は、ウエスタンブロッティング（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）法で行った。すなわち、細胞を採取し、続いて０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（アドリアマイシン：ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、１００ｕ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ社：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣ社：Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）あるいは１０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ−１８（ＭＢＬ社：Ｎａｇａｙａ、ＪＰ）と共に刺激した。
【００２０】
これらの細胞を、氷冷下、ｌｙｓｉｓ緩衝液［５０ｍＭ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ／ＬＮａＣｌ、５ｍＭ／ＬＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ］で洗浄した。遠心分離後、上清を集め、蛋白質の含有量をＢｉｏ−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙｋｉｔ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社：ＣＡ）により測定した。１４％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、各抽出液から等量の蛋白質を分取し、Ｂｉｏ−Ｒａｄｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてニトロセルロース製メンブラン（ＴｏｙｏＲｏｓｈｉ社：ＪＰ）に転移した。
【００２１】
ブロットを、５％ミルク含有−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ液（ｐＨ７．５）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で、室温下２時間インキュベートすることによりブロックし、４℃にてウサギ抗−ＴＲＡＩＬポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社：ＣＡ）で一夜検索した。抗体は、５％ミルク含有−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ液（ｐＨ７．５）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０により１：１，０００に希釈した。
【００２２】
得られた免疫ブロットを、西洋わさびパーオキシダーゼによる複合抗ウサギＩｇＧ（５％ミルク含有−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］で１：２，０００に希釈したもの）により検索した。最終洗浄後、シグナルをＥＣＬｋｉｔ（ＡｍｅｒｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｔｉｃａＢｉｏｔｅｃｈ社：Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）により検出した。
【００２３】
ＴＲＡＩＬｍＲＮＡの発現が、トータルＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ反応により確認された。各細胞株のおよそ１０^７個の細胞、または正常ヒト肝組織の１００ｍｇを、１ｍｌのＵｌｔｒａｓｐｅｃＲＮＡ試薬（ＢｉｏｔｅｃｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社：Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）およびＭｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｒ（ＢｉｏｓｐｅｃＰｒｏｄｕｃｔｓ社：Ｂａｒｔｖｉｌｌｅ、ＯＫ）と共にホモゲナイズし、トータルＲＮＡをプロトコールにしたがって単離した。
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲ反応の詳細は以下のとおりである。すなわちｃＤＮＡを、（ｄｔ）_{１２−１８}プライマーと２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ社：ＢＲＬ）を、２μｇのトータルＲＮＡと、３７℃にて６０分混合することによる延長反応で合成した。ｃＤＮＡに対するＰＣＲ反応を、４個のｄＮＴＰｓ（各々、２００μＭ／Ｌ）、２．５ｍＭ／ＬＭｇＣｌ_２，２．５単位のＥｘＴａｑ（ＴａｋａｒａＳｈｕｚｏ社：Ｋｙｏｔｏ、ＪＰ）および０．４μＭ／Ｌのプライマーを含有する５０μＬの量で行った。
【００２５】
増幅サイクルは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を、３５サイクル繰返した。ＰＣＲ増幅産物を、エチジウムブロマイドを含む１．０％アガロースゲル上で展開し、ＵＶ光線下に観察した。ヒトβ−アクチンの増幅がコントロール群にみられた。
【００２６】
重要なプライマーの配列は次のとおりである。
ＴＲＡＩＬセンスフ゜ライマー：５’−ＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧ−３’
ＴＲＡＩＬアンチセンスフ゜ライマー：５’−ＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＴＧ−３’
β‐アクチンセンスフ゜ライマー：５’−ＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＧ−３’
β‐アクチンアンチセンスフ゜ライマー：５’−ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣ−５’
【００２７】
ＴＲＡＩＬ発現検出のための免疫組織学的染色を、１０個の外科的に摘出したＨＣＣ組織について行った。すなわち、パラフィン保護しない部分を加圧釜で１２０℃にて５分間加熱し、抗原を活性化させ、０．３％過酸化水素−メタノール溶液と２０分処理し、内因性のパーオキシダーゼ活性を不活化した。各セクションをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の正常マウス血清により固定し、１：１００（リン酸緩衝液中）に希釈したマウス抗−ＴＲＡＩＬ（Ｄ−３）モノクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、またはコントロールとして、ＴＲＡＩＬ（２５−２８２）コントロール溶融蛋白（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と一夜４℃にてインキュベーとした。各セクションをｓｅｃｏｎｄビオチン化抗体とインキュベーとし、続いて、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ（ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣｋｉｔ：ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社：Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）により３０分間インキュベートした。洗浄後、０．０１％の３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｅｎ−ｈａｙｄｏｒｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＤＡＢ）（和光純薬社）含有基質に展開し、ヘマトキシリンと対比染色した。
【００２８】
３）フローサイトメトリー分析：
０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（アドリアマイシン：Ｓｉｇｍａ社：Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、１００ｕ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ社：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、１０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣ社）、あるいは１０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ−１８（ＭＢＬ社：Ｎａｇａｙａ、ＪＰ）と共に２４時間培養した各細胞株のおよそ１０^６個の細胞を、１％牛胎児血清−リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて２回洗浄し、氷冷下に、ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２（Ａｌｅｘｉｓ社：ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、あるいはコントロールとなるＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄマウスＩｇＭ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と５μｇ／ｍＬ濃度で２時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞をＦＡＣＳｃａｎにより、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社：Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）を使用し、ＴＲＡＩＬの発現を観察した。ＮＦ−κＢ抑制分析の場合には、ＨｅｐＧ２細胞をｐＣＭＶ−ＩκＢαベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社：ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）にトランスフェクションし、１２時間インキュベートした後、続いて、ドキソルビシンあるいはＩＬ−１βと共に２４時間刺激した。
【００２９】
４）共培養実験：
ＨｅｐＧ２細胞を、１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（ｓｉｇｍａ社：Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）あるいは、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ．）に曝し、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、２４−ｗｅｌｌ平板プレート（Ｎｕｎｃ社：Ｒｏｓｋｉｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に、１×１０^５／ｍＬの密度で、１ｍＬの新鮮培地上に撒いた。ＨｅｐＧ２細胞が、約８０％の単層として集合した後、細胞を２％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳで１時間固定した。ＨｅｐＧ２細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）をＰＢＳで３回洗浄後、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ｔａｒｇｅｔ）をＨｅｐ２Ｇ細胞に４８時間添加（ｃｅｌｌｔｏｃｅｌｌｃｏｎｔａｃｔ法）した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＦａｓＬを介するアポトーシス、あるいはＴＲＡＩＬを介するアポトーシスの抑制のために、１００ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬ中和抗体であるハムスターＩｇＧクローン４Ｈ９（ＭＢＬ社）あるいは組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ（１０ｎｇ／ｍＬＲ１、０．５ｎｇ／ｍＬＲ２，１００ｎｇ／ｍＬＲ３，１０ｎｇ／ｍＬＲ４）：Ｆｃ（ＴＲＡＩＬ感受性細胞のＴＲＡＩＬを介した溶解防止のため）（Ａｌｅｘｉｓ社）をＨｅｐ２Ｇ細胞の上清に加え、２％パラホルムアルデヒドで固定した。その後、非付着生育Ｊｕｒｋａｔ細胞を採取し、アポトーシスの分析を行った。ＴＲＡＩＬ溶解型の機能決定のため、ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ−ｃｏｎｔａｃｔ法により、Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用して共培養を、６．５ｍｍＴｒａｎｓｗｅｌｌポリカーボネート膜（ＣＯＲＮＩＮＧ社：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で行った。
【００３０】
５）アポトーシスの検出：
ＴＲＡＩＬを発現したＨｅｐＧ２細胞を、４８時間培養後、Ｊｕｒｋａｔ細胞核を４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ社）で染色し、蛍光発色顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社：Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。生存Ｊｕｒｋａｔ細胞の評価は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイ法で行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、９６穴ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ（微量滴定）プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＧｌａｓｓＷｏｒｋｅｒｓ社：Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上に置き、各プレートを２４時間３７℃にて、５％炭酸ガス雰囲気下にインキュベートした。生存細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６Ａｓｓａｙｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社：Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用し、製品規格にしたがって行った。各ｗｅｌｌの５７０ｎｍにおける吸収を、ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で行った。
【００３１】
６）ＮＦ− κ ＢＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＧｅｎｅＡｓｓａｙ：
ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃベクター（Ｍｅｒｃｕｒｙ^ＴＭＰａｔｈｗａｙＰｒｏｆｉｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）をクローニング技術により得た。ヒトＨＣＣ細胞（２×１０^５個）を６ｗｅｌｌｐｌａｔｅにより増殖日前より３倍に生育させた。細胞は、ＦｕＧＥＮＥ６（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社：Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で増殖し、３７℃で１８時間インキュベートした。培地を除き、細胞をｃｏｍｐｌｅｔｅ培地でインキュベートした。細胞を１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ社）、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣＬｔｄ．）あるいは１０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＩＬ−１８（ＭＢＬ社）で、最終的に２４時間刺激した。
【００３２】
ＮＦ−κＢ抑制測定の場合には、ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）と増殖し、ｐＣＭＶ−ＩκＢαベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）と合わせて１２時間インキュベートし、ドキソルビシンまたはＩＬ−１βと、２４時間刺激した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（発光酵素）活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＢｅｒｔｈｏｌｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社：Ｎａｓｈｕａ、ＮＨ）法を用いた細胞抽出より行った。結果は、刺激を与えない細胞から得られたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（発光酵素）活性から誘発されたものとして表示した。
【００３３】
それぞれの結果は以下のとおりであった。
【００３４】
Ａ）ＨＣＣ細胞株におけるＴＲＡＩＬの発現：
ＴＲＡＩＬの転写は、ＨＣＣ細胞株（Ｈｕｈ７，Ｈｅｐ３Ｂ，ＨｅｐＧ２）、Ｒａｊｉ細胞、および正常肝組織：コントロール群）において、ＲＴ−ＰＣＲ反応で分析した。コントロールとしてヒトβ−アクチンの増幅を、サンプル負荷および完全性を期すために行った。
その結果を図１に示した。図からも判明するように、ＴＲＡＩＬの４１３−ｂｐＲＴ−ＰＣＲのフラグメントがヒトＨＣＣ細胞株、Ｒａｊｉ細胞および正常肝組織で６個観察されており、これはＲＲＡＩＬが発現していることを示している。
【００３５】
すなわち、図１は、ヒト肝癌細胞（ＨＣＣ）細胞株、Ｒａｊｉ細胞、および正常肝組織に対するＲＴ−ＰＣＲ反応による、ＴＲＡＩＬの増幅を示す図であるが、４１３−ｂｐにおけるヒトＴＲＡＩＬシークエンス、および８３８−ｂｐにおけるβ−アクチンのシークエンスがトータルＲＮＡから増幅され、各細胞株、正常肝組織から単離され、アガロースゲル電気泳動図としてエチジウムブロマイド染色で観察されているのが判明する。
【００３６】
Ｂ）ヒトＨＣＣ組織でのＴＲＡＩＬの発現：
ＴＲＡＩＬのｉｎｓｉｔｅでの発現を確認するため、免疫組織学的な手法により、１０個のＨＣＣ組織を使用して検討した。
ＨＣＣ組織では、１０個の検討のうち、４個（４０％）のケースにおいて、ＴＲＡＩＬの染色が観察された。細胞レベルでは、ＴＲＡＩＬの発現は、最初、細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａ）と細胞膜上に生じた（その状態を図２として示した）。これに対して、非腫瘍領域近傍および肝硬変組織では、ＴＲＡＩＬの発現は、門脈のリンパ球以外、全く認められなかった。
【００３７】
すなわち、図２は、ヒトＨＣＣ細胞と、（Ａ）抗−ＴＲＡＩＬ抗体、（Ｂ）ＴＲＡＩＬコントロール熔融タンパク質（当初倍率：４００倍）と組合せによる組織学的染色を示した。図の結果からも判明するように、ＴＲＡＩＬの染色は、細胞質と、細胞表面に生じていることが理解される。
【００３８】
Ｃ）ヒトＨＣＣ細胞株でのドキソルビシンにより誘発されるＴＲＡＩＬのアップレグレーション：
ＴＲＡＩＬの発現を、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検討した。ドキソルビシン投与の結果、ヒトＨＣＣ細胞株（Ｈｕｈ７，Ｈｅｐ３Ｂ，ＨｅｐＧ２）では、用量依存的にＴＲＡＩＬの発現が増強された。その結果を図３として示した。すなわち、図３は、ヒトＨＣＣ細胞株について、ドキソルビシンによる刺激（各０，０．０１，０．１，１μｇ／ｍＬ濃度での刺激）により誘発させたＴＲＡＩＬ（３６ｋ−Ｄａ）の発現を示したが、細胞溶解物がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離され、ニトロセルロースに転移されていることが理解される。なお、ＴＲＡＩＬのレベルは、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法で行った。
同様の実験をブレオマイシンによる刺激でも検討したが、ブレオマイシンによる刺激でも、ヒトＨＣＣ細胞株は、用量依存的にＴＲＡＩＬの発現を増強していた。
【００３９】
以上の結果を踏まえ、ヒトＨＣＣ細胞株においては、ドキソルビシンが、特異的に細胞表面でＴＲＡＩＬを発現するものであるかどうかを確認するため、ヒトＨＣＣ細胞をドキソルビシンと処理し、ＴＲＡＩＬの発現を血液学的に検討した。その結果を図４に示した。図中に示した結果からも判明するように、培地に０．０１〜１μｇ／ｍＬのドキソルビシンを２４時間添加した場合には、ＨＣＣ細胞株では、細胞表面でのＴＲＡＩＬの発現が増強されていることが理解される。
【００４０】
すなわち、図４はヒトＨＣＣ細胞における、ドキソルビシンで誘発された細胞表面上でのＴＲＡＩＬの発現を示した結果である。ＨＣＣ細胞を、２４時間種々の濃度のドキソルビシンに曝し、ＴＲＡＩＬの発現をフローサイトメトリー分析により検討した結果、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用したフローサイトメトリー分析（点線のグラフ）あるいはＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｍｏｕｓｅＩｇＧを使用したフローサイトメトリー分析（実線の棒グラフ）ともに、細胞表面上でのＴＲＡＩＬの発現が確認された。
【００４１】
Ｄ）ＴＲＡＩＬ− 発現ＨＣＣ細胞のＪｕｒｋａｔＴ− リンパ球の殺細胞（アポトーシス）効果：
ＨＣＣ細胞株の細胞表面におけるＴＲＡＩＬの機能的な発現を検討するため、代表的なヒト白血病性Ｔ細胞の一種であるＪｕｒｋａｔ細胞をｔａｒｇｅｔｃｅｌｌとして使用し、共培養実験を行った。
Ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＨｅｐＧ２細胞を１μｇ／ｍＬのドキソルビシンで刺激した）：Ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）を（Ｅ：Ｔ＝４：８）の比率で混合し、４８時間、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞と共培養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存を、ＭＴＴａｓｓａｙおよびＤＡＰＩ染色で観察した結果、目に見えて細胞死（アポトーシス）が進行していた。
【００４２】
図５にＭＴＴａｓｓａｙでの結果を、図６にＤＡＰＩ染色での結果を示した。
ドキソルビシン（１μｇ／ｍＬ）と２４時間処理した後のＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞を、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＨｅｐＧ２細胞）：Ｔａｒｇｅｔ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）で（Ｅ：Ｔ＝４：１）の比率で、１００ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬ中和抗体ハムスターＩｇＧクローン４Ｈ９、あるいは組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ（１０ｎｇ／ｍＬＲ１、０．５ｎｇ／ｍＬＲ２、１００ｎｇ／ｍＬＲ３、１０ｎｇ／ｍＬＲ４）：Ｆｃ（ＴＲＡＩＬ感受性細胞のＴＲＡＩＬを介する溶解の阻害剤）の存在／非存在下で共培養させた。ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞と共培養したときのＪｕｒｋａｔ細胞の生存率を、コントロール細胞に対する生存細胞としてパーセントで示した（図５）。データは、６回の実験の平均値±ＳＤで示した。
【００４３】
一方、図６は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞と共培養した場合の結果を示したものであるが、典型的なアポトーシスの性質である、ＤＡＰＩ染色による核の凝集化およびフラグメント化を示している。
【００４４】
共細胞に際して、Ｊｕｒｋａｔ細胞をヒト組換えＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃ（ＴＲＡＩＬ−を介する細胞溶解の抑制剤）あるいはＦａｓＬ中和型ハムスターＩｇＧクローン４Ｈ９と前処理すると、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞により生じるアポトーシスから、Ｊｕｒｋａｔ細胞が著しく防御されていることが理解される。Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス率（％）は、それぞれ２６．６％（ドキソルビシン刺激のみ）、１３．４％（ドキソルビシン刺激／ＦａｓＬ中和型ＩｇＧ）、０．９％（ドキソルビシンの刺激／ヒト組換えＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃ）、０％（ドキソルビシンの刺激／ヒト組換えＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃ／ＦａｓＬ中和型ＩｇＧ）であった。
【００４５】
以上の結果から、Ｈｅｐ２Ｇ細胞はでドキソルビシンにより、ＴＲＡＩＬｐａｔｈｗａｙでアポトーシスが主に生じており、Ｆａｓ／ＦａｓＬｓｙｓｔｅｍではないする仮説が、ＴＲＡＩＬＢｌｏｃｋｉｎｇとＦａｓｂｌｏｃｋｉｎｇ実験により支持された。ＦａｓＬの機能的な溶解型は、活性化ヒトＴ−リンパ球細胞の培養上清に認められた。ＨｅｐＧ２処理上清中におけるＴＲＡＩＬの溶解型の機能的な意義を解明するため、ｔｒａｎｓｗｅｌｌｐｏｌｙｃａｒｏｂｏｎａｔｅ膜を使用して、ＨｅｐＧ２細胞とＪｕｒｋａｔ細胞の直接の接触を生じないようにした共培養実験を行った。しかしながら、Ｊｕｒｋａｔ細胞には、１μｇ／ｍＬのドキソルビシンと処理後、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞と共培養してもアポトーシスは生じなかった。
【００４６】
Ｅ）ヒトＨＣＣ細胞株でのＴＮＦ− α ，ＩＬ−１ βおよびＩＬ−１８により誘発されるＴＲＡＩＬのアップレグレーション：
ＴＮＦ−α，ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８により刺激されたＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２，Ｈｅｐ３Ｂ，Ｈｕｈ７）中におけるサイトカインにより誘導されたＴＲＡＩＬの発現を確認するため、ウエスタンブロティング法の解析を行った。ＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍＬ），ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍＬ）との処理は、ヒトＨＣＣ細胞株においてＴＲＡＩＬの発現を増強していた。その結果を図７に示した。
【００４７】
図７は、ヒトＨＣＣセルラインにおけるＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）、あるいはＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍＬ）で誘発されたＴＲＡＩＬ（３６−ｋＤａ）の発現の結果を示した図である。なお、細胞溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびニトロセルロースへの転移で取り除き、ＴＲＡＩＬレベルは、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ法により実施した。
【００４８】
これらのサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−１８）がヒトＨＣＣ細胞中で、ＴＲＡＩＬの発現を細胞表面上で起こしているかどうかの検討のため、ヒトＨＣＣ細胞をＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍＬ），ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍＬ）と処理し、フローサイトメトリー法で細胞表面上でのＴＲＡＩＬの発現を検討した。その結果を図８に示したが、図中の結果から判明するように、培地にＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８を２４時間添加した場合には、ＨＣＣ細胞株ではＴＲＡＩＬの細胞表面上における発現を、十分に誘発していた。
【００４９】
すなわち、図８にヒトＨＣＣ細胞上における、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、あるいはＩＬ−１８で誘発したＴＲＡＩＬの細胞表面上での発現を示したが、点線のグラフは、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用したフローサイトメトリーａｓｓａｙでの結果であり、実線のグラフは、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄマウスＩｇＭを使用したフローサイトメトリーａｓｓａｙによる結果である。
【００５０】
次いで、ヒトＨＣＣ細胞株上でのＴＲＡＩＬの機能的発現を確認するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞をｔａｒｇｅｔ細胞として共培養実験を行った。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βで刺激したＨｅｐＧ２細胞）：Ｔａｒｇｅｔ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）細胞を（Ｅ：Ｔ＝２：１）の比率で混合し、４８時間ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２と共培養したところ、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＭＴＴａｓｓａｙ法で目に見えたアポトーシスが生じていた。その結果を図９に示した。
【００５１】
すなわち、２４時間ＩＬ−β （１０ｎｇ／ｍＬ）と処理した後のＴＲＡＩＬを発現するＨｅｐＧ２をＥｆｆｅｃｔｏｒとし、ＴａｒｇｅｔとしてＪｕｒｋａｔ細胞をその混合比率（Ｅ：Ｔ＝２：１）で、４８時間、５００ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬ中和抗体クローン４Ｈ９、あるいは組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ（１０ｎｇ／ｍＬＲ１、０．５ｎｇ／ｍＬＲ２、１００ｎｇ／ｍＬＲ３、１０ｎｇ／ｍＬＲ４）：Ｆｃ（ＴＲＡＩＬ感受性細胞のＴＲＡＩＬを介する溶解の抑制剤）の存在または非存在下に共培養した。その結果、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２と共培養したＪｕｒｋａｔ細胞の生存率を、コントロール細胞に対する生存細胞としてパーセントで示した。なお、データは、６回実験を行ない、その平均値±ＳＤで示したものである。
【００５２】
以上の結果から、Ｊｕｒｋａｔ細胞をヒト組換えＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃ（１０ｎｇ／ｍＬＲ１、０．５ｎｇ／ｍＬＲ２、１００ｎｇ／ｍＬＲ３、１０ｎｇ／ｍＬＲ４）、あるいは５００ｎｇ／ｍＬＦａｓＬ中和型抗体ハムスターＩｇＧクローン４Ｈ９との前処理した場合、共培養では、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞により生じるアポトーシスからＪｕｒｋａｔ細胞を防御していた。Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス率（％）は、それぞれ１７．１％（ＩＬ−１β刺激のみ）、８．４％（ＩＬ−１β／ＦａｓＬ中和型ＩｇＧ）、７．２％（ＩＬ−１β／ヒト組換えＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃ）、０．１％（ＩＬ−１β／ヒト組換えＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃ／ＦａｓＬ中和型ＩｇＧ）であった。
【００５３】
Ｆ）ＨＣＣ細胞株におけるＮＦ− κ ＢとＴＲＡＩＬ発現の関係：
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８は、ＮＦ−κＢのタンパクアクチベータであると報告されているので、発光酵素ルシフェラーゼ遺伝子分析を、２４時間ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８と刺激したＨＣＣ細胞で行った。１００Ｕ／ｍＬのＴＮＦ−αのｆｏｌｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（平均値±Ｓ．Ｄ．）は、６．１±０．１（ＨｅｐＧ２）、５．０±０．４（Ｈｅｐ３Ｂ）、７．５±０．４（Ｈｕｈ７）であった。１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−βでは、８．０±０．４（ＨｅｐＧ２）、７．１±０．４（Ｈｅｐ３Ｂ）、１８．２±０．１（Ｈｕｈ７）であった。１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８では、５．５±０．３（ＨｅｐＧ２）、４．４±０．４（Ｈｅｐ３Ｂ）、７．１±０．１（Ｈｕｈ７）であった。
【００５４】
以上の実験結果からは、これらのサイトカインの刺激によるＨＣＣのフローサイトメトリーおよびウエスタンブロティング法によるＮＦ−κＢ誘発とＴＲＡＩＬ発現の間に有意な関係があることが確認された。ＮＦ−κＢの誘発によるＴＲＡＩＬ発現のアップレグレーションを確認するため、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅａｓｓａｙを検討した。すなわち、ｐＣＭＶ−ＩκＢａベクターにトランスフェクションしたＨｅｐ２Ｇ２細胞を、ドキソルビシン（１μｇ／ｍＬ）あるいはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベートした。さらに、Ｈｅｐ２Ｇ細胞においドキソルビシンまたはＩＬ−１で誘発させたＮＦ−κＢ活性は、ｐＣＭＶ−ＩκＢａベクターとの共トランスフェクションで、実質的に阻害されることを確認した。その結果を図１０に示した。
【００５５】
ＩκＢの、ＨｅｐＧ２細胞におけるＮＦ−κＢの活性化の抑制を示したが、ＮＦ−κＢの活性化は、ＮＦ−κＢ−発光酵素（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｒｅｐｏｒｔｅｒＧｅｎｅａｓｓａｙ法を使用して行なった。結果は、ドキソルビシン（１μｇ／ｍＬ）あるいはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したＨｅｐＧ２細胞を組み込んだｐＣＭＶ−ＩκＢベクター中で観察された発光酵素活性のｆｏｌｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎとして示したものであり、３回の実験の平均値±ＳＤで示してある。
【００５６】
さらに、ＮＦ−κＢの可能性のある役割を確認するために、ＨＣＣ細胞の表面上に発現したＴＲＡＩＬを、フローサイトメトリー法で分析した。ｐＣＭＶ−ＩκＢａベクターでトランスフェクションしたＨｅｐ２Ｇ細胞を２４時間、ドキソルビシン（１μｇ／ｍＬ）あるいはＩＬ−１βとインキュベートした。その結果を図１１に示した。
【００５７】
図１１に示すように、ＩκＢのＨｅｐＧ２細胞とのトランスフェクションは、ドキソルビシンあるいはＩＬ−１βとの刺激により、ＨＣＣセルラインにおけるＴＲＡＩＬの細胞表面でのＴＲＡＩＬの発現のダウンレグレーションを誘発している。
【００５８】
すなわち、図１１にはヒトＨＣＣ細胞における、ＩκＢのトランスフェクションが、細胞表面上でのＴＲＡＩＬの発現を抑制している結果を示した。ｐＣＭＶ−ＩκＢベクターにトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞をドキソルビシン（１μｇ／ｍＬ）あるいはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に２４時間インキュベートした。ＴＲＡＩＬの発現をフローサイトメトリーａｎａｌｙｓｉｓで確認した。各グラフにおいて、細いラインはコントロールのＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄマウスＩｇＭ（コントロール群）との染色を、太いラインは、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２との陽性細胞染色を、また点線は、ＩκＢをトランスフェクションした後のＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２との陽性細胞染色を示したものである。
【００５９】
以上の各実験結果から、ドキソルビシン（アドリアマイシン）あるいはブレオマイシンの処理では、ヒトＨＣＣにおける、細胞表面でのＴＲＡＩＬの発現を増強していることが理解される。さらに、ＮＦ−κＢ誘発サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８）の処理は、ヒトＨＣＣ細胞株においても、細胞表面でのＴＲＡＩＬの発現を増強しているものであった。
【００６０】
新生細胞は、Ｔ細胞の免疫応答を種々の手段により防止しているものであった。その手段は、ＭＨＣクラスＩ分子のｄａｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂ７のようなｃｏｓｔｉｍａｔｏｒｙシグナルの欠如、ＴＧＦ−βのような免疫抑制タンパク質の分泌、腫瘍浸潤リンパ球からζシグナル形質導入チェインの消失、および新生細胞のＣＴＬＡ−４受容体の相互作用であると思われる。
【００６１】
ところで、ＦａｓＬは、Ｔ細胞の免疫応答防止因子の一つである。免疫系−免疫学的寛容部位、例えば目の虹彩細胞および精巣のセルトリ細胞においては、ＦａｓＬの発現は、ＦａｓＬが免疫寛容の保持に重要なものであることを示している。さらに、数多くのＦａｓＬ発現の研究が、ヒトの多様化した腫瘍（メラノーマ黒色腫、肺、結腸、肝、脾臓、食道、子房、星状細胞腫）で行なわれており、腫瘍における免疫寛容に寄与していることが知られている。
【００６２】
一方、ＨＣＣでは、ＨＣＣにおける免疫逃避が、主にＦａｓ発現の消失によるものであり、ＦａｓＬの発現には関係なく調節されるとする発表もある（Ｎａｇａｏｅｔａｌ．）。さらに、ＨＣＣ細胞株でのＦａｓＬの発現は、ｉｎｖｉｔｒｏ実験で、リンパ球との共培養により、Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄアポトーシスを誘発するとの発表もある（ｓｔｒａｎｄｅｔａｌ．）。また、ＦａｓＬは、腫瘍を防御する免疫寛容あるいは細胞の免疫的攻撃の保護を調整するとの報告もある（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌｅｔａｌ．）。その一方で、ＦａｓＬは、免疫寛容あるいは腫瘍免疫回避よりも、むしろ炎症のメディエーターであることを示唆する報告もある（Ｒｅｓｔｉｆｏｅｔａｌ．）。したがって、ＦａｓＬが、免疫攻撃から組織あるいは腫瘍を防御することによる免疫寛容をメディエートするのかは議論の分かれるところである。
【００６３】
これに対してＴＲＡＩＬは、ＴＮＦのファミリーの一つであり、種々の形質転換細胞にアポトーシスを生じさせるものであることが最近判明してきている。ＴＲＡＩＬが、ある種の癌細胞の観察から回避に重要な役割を演じており、またこれらの癌の転移に著しい寄与していることは明らかである。本発明者らの研究では、免疫組織学的な染色で、ＨＣＣ組織では膜と細胞質にＴＲＡＩＬに特異的な染色が示された（１０ケースのうち４ケース）。さらに、化学療法剤（ドキソルビシン、ブレオマイシン）がＨＣＣセルラインで細胞表面ＴＲＡＩＬ発現を増強させていた。
【００６４】
活性化Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫学的な防御の重要な作動物質である。ＦａｓＬとＦａｓの相互作用は、ＴハイブリドーマおよびＴリンパ球のａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ（ＡＩＣＤ）を誘発し、細胞免疫応答のｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎをコントロールする。ＴＮＦ／ＴＮＦＲシステムは、また、成熟Ｔ細胞のＡＩＣＤに重要な役割を演じている。悪性細胞の排除は、ＦａｓＬの経由するアポトーシスの誘導である。ＦａｓＬにより誘発されるアポトーシスは正常および成熟細胞で認められる。ＴＲＡＩＬのためには、Ｍａｓｔｅｒらは、試験管実験で、ＩＬ−２の存在下で活性化された単核細胞では、ＴＲＡＩＬにより誘発される２３％の特異的アポトーシスが生じたと報告している。我々の実験では、ＨｅｐＧ２細胞表面で、ドキソルビシンで誘発されたＴＲＡＩＬが共培養したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを生じさせていた。
【００６５】
さらに、ドキソルビシンは共培養実験では、ＴＲＡＩＬ中和抗体よりＦａｓＬ中和抗体と一緒に培養したＪｕｒｋａｔ細胞にアポトーシスを生じさせていた。我々の実験結果は、腫瘍細胞は、ＦａｓＬ−Ｆａｓの相互作用よりも、むしろＴＲＡＩＬ−ＴＲＡＩＬ受容体の相互作用を経由する腫瘍−反応Ｔ細胞クローンの末梢消失を生じさせていることを強く示唆していた。Ｍｕｌｌａｒらの報告では、ブレオマイシン処理後のＦａｓリガンドは、ｐ５３ｗｔおよびｐ５３不完全ＨＣＣセルラインで生じており、突然変異ｐ５３のセルラインでは生じていないとされている。しかしながら、我々のデータは、ＴＲＡＩＬの発現とｐ５３の状態の明確な関係は明らかにされなかった。ＴＲＡＩＬは、ｐ５３野生型（ＨｅｐＧ２）、ｐ５３突然変異型（Ｈｕｈ７）およびｐ５３欠如型（Ｈｅｐ３Ｂ）ＨＣＣ細胞で同じように誘発されていた。
【００６６】
いずれにしても、ＴＲＡＩＬの発現は、アポトーシスに深く関連性があることとより、本発明者らは、本発明の目的であるＨＣＣ細胞表面でのＴＲＡＩＬの発現を検討した。ＩＬ−１８は、メラノーマ細胞でＦａｓＬを発現する一定の因子である。ＩＬ−１８は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような初期の炎症性サイトカインの速効的な産生を通して恒久的な炎症のカスケードを生じさせる。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８は、ＮＦ−κＢを含むサイトカインであると知られている。ＮＦ−κＢは、種々のサイトカインの転写を調整し、炎症および免疫応答を調整し、特異的細胞遺伝子の発現を増加させることで細胞生育特性をもっている。これらは、少なくとも２７個の異なったサイトカインおよびケモカインをコードする遺伝子を含み、ＭＨＣ膜のような免疫認識を含み、タンパク質は抗原提示を含み、受容体は、好中球粘着および移動を必要とする。
【００６７】
ＮＦ−κＢは、また、細胞死応答の抑制に重要な役割を果たし、ＮＦ−κＢの活性化は、抗細胞死の閾値を増加させ、ＴＮＦのような細胞毒性サイトカインに、ｃａｓｐａｓｅ８の活性化を発現させることにより組織を暴露させる。したがって、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８）−誘発ＮＦ−κＢの活性化は、ＨＣＣ細胞表面でＴＲＡＩＬを発現するものとの仮説がされる。これに関連して、我々の結果は、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８）−誘発ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢで阻害され、ＨＣＣ細胞表面でＴＲＡＩＬを発現していた。
【００６８】
以上の事実と、前記した実験結果をまとめると、（１）：細胞表面でのＴＲＡＩＬの発現は、化学療法剤、およびＮＦ−κＢ−誘発サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８等）で刺激されたＨＣＣで広く生じているものであり、（２）：ＨＣＣ細胞は、ＴＲＡＩＬのアップレグレーションを示し、細胞毒性のＴ細胞を死滅させることにより、移植側の免疫システムに腫瘍細胞を回避させることを許しているものであろう。
【００６９】
この、ＴＲＡＩＬの発現はＴ細胞における特異的なアポトーシスを誘導するばかりでなく、また、免疫を担当するＴ細胞あるいはＢ細胞の分化分裂を阻害する。したがって、ＴＲＡＩＬが非特異的な免疫抑制剤となり、生体移植における免疫拒絶に対して有効な免疫拒絶回避剤となることを示しているものである。
【００７０】
【発明の効果】
以上記載のように、本発明により、ＴＲＡＩＬの発現に基づくその特性を利用した生体移植手術における拒絶免疫を有効的に回避する移植拒絶免疫回避剤、ならびに移植拒絶免疫（移植片拒絶反応）を回避する方法が提供され、今後の移植医療の発展に対して多大の光明を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト肝癌細胞（ＨＣＣ）セルライン、Ｒａｊｉ細胞、および正常肝組織に対するＲＴ−ＰＣＲ反応による、ＴＲＡＩＬの増幅を示す図である。
【図２】図２は、ヒトＨＣＣ細胞と、（Ａ）抗−ＴＲＡＩＬ抗体、（Ｂ）ＴＲＡＩＬコントロール熔融タンパク質（当初倍率４００倍）との組織学的染色を示した。
【図３】図３は、ヒトＨＣＣセルラインについて、ドキソルビシン（０，０．０１，０．１，１μｇ／ｍＬ）により誘発させたＴＲＡＩＬ（３６ｋＤａ）の発現を示した結果である。
【図４】図４は、ヒトＨＣＣ細胞における、ドキソルビシンで誘発された細胞表面のＴＲＡＩＬの発現を示した図である。点線で示したグラフはＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用したフローサイトメトリー分析結果であり、実線で示したグラフは、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｍｏｕｓｅＩｇＧを使用したフローサイトメトリー分析結果である。
【図５】図５は、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２細胞を、ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＨｅｐＧ２）：ｔａｒｇｅｔ（Ｊｕｒｋａｔ）と共培養し、さらに、ＦａｓＬ中和抗体ハムスターＩｇＧ，クローン４Ｈ９、あるいは組換えヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ：Ｆｃを存在／非存在下にさせで共培養した時のＴＲＡＩＬの発現を示した図である。
【図６】図６は、Ｊｕｒｋａｔ細胞における、ＴＲＡＩＬ−発現ＨｅｐＧ２細胞が誘発したアポトーシスの結果を示した図である。
【図７】図７は、ヒトＨＣＣセルラインにおけるＴＮＦ−α（１００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）、あるいはＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍＬ）で誘発されたＴＲＡＩＬ（３６−ｋＤａ）の発現を示した図である。
【図８】図８は、ヒトＨＣＣセルラインにおける、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、あるいはＩＬ−１８で誘発したＴＲＡＩＬの細胞表面での発現を示した図である。点線で示したグラフは、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＴＲＡＩＬ−Ｒ２を使用したフローサイトメトリーａｓｓａｙ結果であり、実線で示したグラフは、ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄマウスＩｇＭを使用したフローサイトメトリーａｓｓａｙの結果である。
【図９】図９は、ＴＲＡＩＬ発現ＨｅｐＧ２とＪｕｒｋａｔ細胞を共培養し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存の結果を示した図である。
【図１０】図１０は、ＩκＢの、ＨｅｐＧ２細胞におけるＮＦ−κＢの活性化の抑制を示した図である。
【図１１】図１１は、ヒトＨＣＣ細胞における、ＩκＢの組込みが細胞表面のＴＲＡＩＬの発現を抑制している結果を示した図である。

Claims

腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：ＴＲＡＩＬ）を有効成分とすることを特徴とする移植拒絶免疫回避剤。
生体移植術における移植拒絶免疫を回避するために、生体移植組織または該移植組織の周囲組織を、サイトカインまたは癌化学療法剤により刺激し、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：ＴＲＡＩＬ）を発現させる方法。
生体移植組織、または当該生体移植組織の周囲組織に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：ＴＲＡＩＬ）を発現させることを特徴とする、移植拒絶免疫を回避する方法。
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ：ＴＲＡＩＬ）の発現を、生体移植組織または該移植組織の周囲組織を、サイトカインまたは癌化学療法剤により刺激することにより行なう請求項３に記載の方法。
生体移植組織または該移植組織の周囲組織を刺激するサイトカインがＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）、ＩＬ−１（インターロイキン−１）またはＩＬ−１８（インターロイキン−１８）である請求項２または４に記載の方法。
生体移植組織または該移植組織の周囲組織を刺激する癌化学療法剤が、アドリアマイシンまたはブレオマイシンである請求項２または４に記載の方法。