JP2003508034A - サイトカインレセプター共通γ鎖類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サイトカインレセプターファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする新規なヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、サイトカインレセプター共通γ鎖類似体（同類体）（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＲｅｃｅｐｔｏｒＣｏｍｍｏｎ Ｇａｍｍａ Ｃｈａｉｎ Ｌｉｋｅ）、すなわち「ＣＲＣＧＣＬ」）と名付けられた新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬポリペプチドを指向するベクター、宿主細胞、抗体、およびこれらを産生するための組換え方法に関する。また、免疫系に関連する障害を検出するための診断方法、ならびにこのような障害を処置、診断、検出および/または予防するための治療方法も提供される。本発明はさらに、ＣＲＣＧＣＬ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、サイトカインレセプターファミリーのメンバーであるポリペプチド
をコードする、新規なヒト遺伝子に関連する。より詳細には、本発明は、サイト
カインレセプター共通γ鎖類似体（同類体）（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ Ｃｏｍｍｏｎ Ｇａｍｍａ Ｃｈａｉｎ Ｌｉｋｅ）、すなわち「ＣＲＣ
ＧＣＬ」）と名付けられた新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに関する。本発明はまた、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチドを指向するベクター、宿主細胞、抗体、およびこれらを産生するた
めの組換え方法に関する。また、免疫系に関連する障害を検出するための診断方
法、ならびにこのような障害を処置、診断、検出および/または予防するための
治療方法も提供される。本発明はさらに、ＣＲＣＧＣＬ活性のアゴニストおよび
アンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 特異的なレセプター分子に対するサイトカインの結合から、しばしば生化学的
効果および生理学的効果が生じる。次いで、レセプター結合は、特定の（そして
しばしば独立した）シグナル伝達経路を刺激する。（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔら
、Ｃｅｌｌ ７６：２５３〜２６２（１９９４）)。サイトカインとレセプター
との間の相互作用は、種々の細胞プロセス（活性化、増殖、および分化を含む）
の主な調節因子である（Ａｒａｉ，Ｋ．−Ｉら．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．５９：７８３〜８３６（１９９０）；Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．およびＳｅｄｅ
ｒ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ ７６：２４１〜２５１（１９９４））。

【０００３】 全てのサイトカインレセプターシグナル伝達システムのうち、ＩＬ−２および
そのレセプター複合体（ＩＬ−２Ｒ）は、最もよく研究された１つである。ＩＬ
−２は、Ｔ細胞媒介性免疫応答の調節において中心的な役割を果たすサイトカイ
ンである。ＩＬ−２Ｒは、以下の３つのサブユニットから構成される：ＩＬ−２
レセプターα鎖（ＩＬ−２Ｒα）；ＩＬ−２レセプターβ鎖（ＩＬ−２Ｒβ）；
および共通γ鎖（γ鎖）。γ鎖はまた他のサイトカインレセプターに共有される
。

【０００４】 インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプター共通γ鎖（γｃ）に対して結合
するサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−１５
を含む）は、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、およびＢリンパ球、ナチュラルキ
ラー細胞、マクロファージ、および単球）の増殖および分化に重要である。これ
らのサイトカインは、重複する生物学的効果を有し、この効果は、部分的には、
共有されたレセプターサブユニットγｃの使用から生じる。近年、これらのサイ
トカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプター複合体への結合によ
って、多数の重要な細胞内シグナル伝達分子（ヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ ｋ
ｉｎａｓｅ）ＪＡＫ１およびＪＡＫ３を含む）、ならびにシグナル変換因子かつ
転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）の転写因子ファミリーのメンバーを活性化する
ことが示されている。

【０００５】 これらのシグナル伝達経路の発見は、リンパ球成熟におけるそれらの役割に対
する重要な新しい洞察をもたらしてきた。なぜなら、γｃをコードする遺伝子お
よびＪＡＫ３をコードする遺伝子の両方における変異は、重症複合型免疫不全（
ＳＣＩＤ）の類似の形態を生じることがはっきりしたからである。例えば、ヒト
インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターγの変異（Ｘ染色体にマッピング
される）は、Ｘ連鎖重症複合型免疫不全に関する。（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２（８）：１０９９（１９９３））。

【０００６】 従って、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の分化および増殖を調整するポリペプチ
ドの必要性が存在する。なぜなら、このような調節の妨害は、免疫系に関する障
害に関与し得るからである。従って、このような障害を検出、予防、緩和、また
は矯正するのに役割を果たし得る、このようなヒトポリペプチドの同定および特
徴付けの必要性が存在する。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、ＣＲＣＧＣＬの新規なポリヌクレオチドおよびコードされたポリペ
プチドに関する。さらに、本発明は、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法または合
成方法に関する。また、このポリペプチドに関連する障害を検出および／または
診断するための診断方法、ならびにこのような障害を処置および／または予防す
るための治療方法が提供される。本発明はさらに、ＣＲＣＧＣＬの結合パートナ
ーを同定するためのスクリーニング方法に関する。

【０００８】 本発明の１つの実施形態に従って、新規な成熟ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、な
らびにその生物学的に活性でかつ診断上または治療上有用なフラグメント、アナ
ログ（類似体）、および誘導体が提供される。

【０００９】 本発明の別の実施形態に従って、ヒトＣＲＣＧＣＬをコードする単離された核
酸分子が提供される。この核酸分子としては、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡ、ならびにそのアナログおよび生物学的に活性でかつ診断上または治
療上有用なフラグメントおよび誘導体が挙げられる。

【００１０】 このサイトカインレセプターは、ＣＲＣＧＣＬと名付けられ、そして本発明は
、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを含む。このポリペプチドは、図１Ａ〜Ｂのアミノ
酸配列（配列番号２）、またはｃＤＮＡクローン（ＨＴＡＥＫ５３）によりコー
ドされるアミノ酸配列の少なくとも一部を有する。ｃＤＮＡクローン（ＨＴＡＥ
Ｋ５３）は、１９９８年２月２５日に寄託され、ＡＴＣＣ番号２０９６４１を割
当てられ、そして１９９８年３月２３日に再度寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０
９６９１を割当てられた。図１Ａ〜Ｂ（配列番号１）に示される、寄託されたＣ
ＲＣＧＣＬクローンを配列決定することにより決定されたヌクレオチド配列は、
Ｎ末端メチオニンを含む３７１アミノ酸残基の完全ポリペプチド（すなわち、配
列番号２のアミノ酸残基１〜３７１）をコードするオープンリーディングフレー
ム、約２２アミノ酸残基の推定シグナルペプチド（すなわち、配列番号２のアミ
ノ酸残基１〜２２）、約３４９アミノ酸の推定成熟形態（すなわち、配列番号２
のアミノ酸残基２３〜３７１）、そして完全タンパク質の推定分子量約３７ｋＤ
ａを含む。

【００１１】 従って、本発明の１つの実施形態は、以下からなる群より選択されたヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオ
チドから構成される、単離された核酸分子を提供する：（ａ）全長ＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチド（図１Ａ〜Ｂのアミノ酸残基１〜３７１（配列番号２））、または
ＡＴＣＣ寄託番号２０９６９１もしくは２０９６４１の寄託物に含まれるｃＤＮ
Ａクローンによってコードされたポリペプチドを含むか、あるいはこのようなポ
リペプチドから構成されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）
ＣＲＣＧＣＬ細胞外ドメイン（図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）のアミノ酸残基約２３
〜約２２５を構成すると予想される）、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６９１も
しくは２０９６４１の寄託物に含まれるクローンによってコードされた細胞外ド
メインを含むか、あるいはこのような細胞外ドメインから構成されるポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ＣＲＣＧＣＬの機能活性（例えば、生
物学的活性［ＣＲＣＧＣＬリガンドの結合（例えば、ＴＳＬＰ）］；Ｂ細胞リン
パ球産生の促進、および／または胸腺細胞または成熟Ｔ細胞同時刺激；ＳＴＡＴ
５Ｂの活性化）を有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメントをコードするヌク
レオチド配列；（ｄ）ＣＲＣＧＣＬ細胞内ドメイン（図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）
のアミノ酸残基約２６１〜約３７１を構成すると予想される）を含むポリペプチ
ド、またはＡＴＣＣ登録番号２０９６２３の寄託物に含まれるクローンによりコ
ードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＣＲＣＧＣＬ膜
貫通ドメイン（図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）のアミノ酸残基約２２６〜約２６０を
構成すると予想される）、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６９１もしくは２０９
６４１の寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされた膜貫通ドメイ
ンを含むか、あるいはこのような膜貫通ドメインから構成されるポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有
するが、膜貫通ドメインは欠く可溶性ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを含むか、また
はこのようなポリペプチドから構成されるポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；ならびに（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または
（ｆ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。

【００１２】 本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、（ｆ）、または（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に、少なくとも８０％
、８５％もしくは９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または
（ｇ）のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含むか、あるいはこのようなポリヌ
クレオチドから構成された、単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこ
のポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でハイブリダイズしない。

【００１３】 さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、上記の（ａ）、（ｂ）、（
ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣ
Ｌポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドから構成される。本発明の
さらなる核酸実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸付加、置換、および／また
は欠失、ただし５０アミノ酸以下の付加、置換および／または欠失、より好まし
くは、４０アミノ酸以下の付加、置換および／または欠失、なおより好ましくは
、３０アミノ酸以下の付加、置換および／または欠失、そしてなおより好ましく
は、２０アミノ酸以下の付加、置換および／または欠失を含むアミノ酸配列を有
するＣＲＣＧＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを
含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドから構成される単離された核酸分
子に関する。当然ながら、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドは、好ましさが増大する順に、１０、９、８、７、６、５、
４、３、２、もしくは１以上、または１〜１００、１〜１５０、１〜２５、１〜
２０、１〜１５、１〜１０、もしくは１〜５のアミノ酸付加、置換および／また
は欠失を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。保存的置換が好まし
い。

【００１４】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
れらの組換えベクターを含む宿主細胞、そして組換え技術による、このようなベ
クターおよび宿主細胞を作成する方法、ならびにＣＲＣＧＣＬポリペプチドの産
生のためのこれらの使用方法に関する。

【００１５】 本発明のさらなる実施形態に従って、組換え技術によってこのようなポリペプ
チドを産生するためのプロセスが提供される。この組換え技術は、このポリペプ
チドの発現を促進する条件下で、本発明のＣＲＣＧＣＬ核酸配列を含む、組換え
の原核生物宿主細胞および／または真核生物宿主細胞を培養し、引き続きこのポ
リペプチドを回収する工程を包含する。

【００１６】 本発明はさらに、単離されたＣＲＣＧＣＬポリペプチドを提供する。このＣＲ
ＣＧＣＬポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか
、あるいはそのようなアミノ酸配列から構成される、単離されたＣＲＣＧＣＬポ
リペプチドを提供する：（ａ）図１Ａ〜Ｂに示される完全アミノ酸配列（すなわ
ち、配列番号２のアミノ酸残基１〜３７１位）を有する全長ＣＲＣＧＣＬポリペ
プチドのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６９１もしくは２０９６
４１の寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされたアミノ酸配列
；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く、配列番号２に示される完全アミノ酸配列（す
なわち、配列番号２の２〜３７１位）を有する全長ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの
アミノ酸配列；（ｃ）ＣＲＣＧＣＬの機能活性（例えば、生物学的活性［ＣＲＣ
ＧＣＬリガンドの結合（例えば、ＴＳＬＰ）］；Ｂ細胞リンパ球産生の促進、お
よび／または胸腺細胞もしくは成熟Ｔ細胞同時刺激；ＳＴＡＴ５Ｂの活性化）を
有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメント；（ｄ）図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）
の２３〜２２５位のアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣＬポリペプチドの推定細胞
外ドメインのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６９１もしくは２０
９６４１の寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされた推定細胞
外ドメインのアミノ酸配列；（ｅ）ＣＲＣＧＣＬ細胞内ドメイン（図１Ａ〜Ｂ（
配列番号２）のアミノ酸残基約２６１〜約３７１を構成すると予想される）、ま
たはＡＴＣＣ登録番号２０９６９１もしくは２０９６４１の寄託物に含まれるｃ
ＤＮＡプラスミドによりコードされるＣＲＣＧＣＬ細胞内ドメイン；（ｆ）ＣＲ
ＣＧＣＬ膜貫通ドメイン（図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）のアミノ酸残基約２２６〜
約２６０を構成すると予想される）のアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２
０９６９１もしくは２０９６４１の寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによっ
てコードされたアミノ酸配列；（ｇ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有
するが、膜貫通ドメインは欠く可溶性ＣＲＣＧＣＬポリペプチドのアミノ酸配列
（ここで各ドメインは上記で規定される）；ならびに（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（
ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のポリペプチドのフラグメント。本
発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、
（ｆ）、または（ｇ）のに記載のアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一、より
好ましくは少なくとも８５％もしくは９０％同一、そしてなおより好ましくは９
５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、ならびに上記の配列に、少なくとも８０％、８５％、または９０％類
似性、そしてより好ましくは少なくとも９５％類似性を有するアミノ酸配列を有
するポリペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）
、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）に記載のアミノ酸配列
を有するＣＲＣＧＣＬポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含む
か、あるいは、このようなアミノ酸配列から構成される、ポリペプチドに関する
。本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有
するポリペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも
７、少なくとも８、そして好ましくは少なくとも９、少なくとも１０、少なくと
も１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、
少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくと
も５０、そしてより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を有
するこのようなポリペプチドの部分を含む。しかし、任意の長さまでのエピトー
プ保有ポリペプチド、および上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体を
含むエピトープ保有ポリペプチドがまた、本発明に包含される。

【００１７】 本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド
配列を包含する。これらのポリヌクレオチドおよび核酸分子によりコードされる
ポリペプチドがまた、本発明により包含される。

【００１８】 本発明の特定の非排他的な実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載のアミノ酸配列を有す
るＣＲＣＧＣＬポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドに関する。他の実施形態において、本発明は、上記（ａ）、（ｂ）、（
ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載のアミノ酸
配列を有するＣＲＣＧＣＬポリペプチドに特異的に（すなわち、特有に）結合す
る単離された抗体を提供する。

【００１９】 本発明はさらに、本明細書に記載のようなアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチドに特異的に（すなわち、特有に）結合する抗体を単離する方法を提
供する。このような抗体は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得、そ
して以下に記載のように、診断上または治療上有用である。

【００２０】 本発明はまた、可溶性のＣＲＣＧＣＬポリペプチド、特にヒトＣＲＣＧＣＬポ
リペプチド、および／または抗ＣＲＣＧＣＬ抗体を含む薬学的組成物を提供する
。これは、例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスおよび他の寄生生物に
よる感染、免疫不全、炎症性疾患、リンパ節腫脹症、自己免疫疾患、宿主対移植
片病を処置、予防、予測、および／または診断するために、末梢耐性を刺激、い
くつかのトランスフォームされた細胞株を破壊、細胞の活性化、生存および増殖
を媒介するため、免疫調節および炎症性反応を媒介するため、そして免疫応答を
増強または阻害するために、使用され得る。

【００２１】 特定の実施形態において、本発明の可溶性ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、そのア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストは、免疫不全（例えば、重篤な複合型免
疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠
損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ’
ｓ病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後
天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガ
ンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一
過性乳児低ガンマグロブリン血症、非特異的低ガンマグロブリン血症、無ガンマ
グロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−
オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰Ｉｇ
Ｍを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ
欠損を伴うかまたは伴わない）、正常なＩｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損
、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害
（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓ
ｓ型）、網様発育不全、新生児好中球減少症、重篤な先天性白血球減少症、免疫
欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−発育不全症または形成異常症、毛細血管拡張
性運動失調、短肢（ｓｈｏｒｔ ｌｉｍｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症
候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候群）
および重症複合型免疫不全）または免疫欠損と関連する状態を、処置、予防、予
測および／または診断するために投与される。

【００２２】 特定の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬのポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、分類不能
型免疫不全を処置、予防、予測および／または診断するために投与される。

【００２３】 特定の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬのポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、Ｘ連鎖無
ガンマグロブリン血症を処置、予防、予測および／または診断するために投与さ
れる。

【００２４】 別の特定の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬのポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、重症
複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置、予防、予測および／または診断するために
投与される。

【００２５】 別の特定の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポ
リヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト、ヴィスコ
ット−オールドリッチ症候群を処置、予防、予後を判定および／または診断する
ために投与される。

【００２６】 別の特定の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポ
リヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、過剰Ｉ
ｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ欠損を処置、予防、予後を判定および／または診断するた
めに投与される。

【００２７】 別の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリヌク
レオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、自己免疫疾患
（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫
斑病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、自己免疫性血球減少
症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、
再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパ
シー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例
えば、ヘノッホ−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑
病）、ライター病、Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン−バレ
ー症候群、インシュリン依存性糖尿病（ｍｅｌｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎
症性眼、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）、グ
ッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴ
ズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インシュリン耐性など）、自己免疫溶
血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃ
ｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、
特発性アディソン病、不妊症、糸球体腎炎（原発性糸球体腎炎およびＩｇＡネフ
ロパシーなど）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病およびアドレナ
リン作用性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬剤耐
性を含む）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、
脈管炎、心筋梗塞後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー
性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシーならびに他の炎症性障害、肉芽腫性障害、変
性障害および萎縮性障害）または自己免疫疾患に関連する状態を処置、予防、予
後を判定および／または診断するために投与される。特定の好ましい実施形態に
おいて、慢性関節リウマチは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを用いて、処
置、予防、予後を判定および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態
において、全身性エリテマトーデスは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもし
くはポリヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを用
いて、処置、予防、予後を判定および／または診断される。別の特定の好ましい
実施形態において、特発性血小板減少性紫斑病は、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペ
プチドもしくはポリヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストを用いて処置、予防、予後の判定および／または診断される。別の特定の
好ましい実施形態において、ＩｇＡネフロパシーは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチドもしくはポリヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを用いて、処置、予防、予後の判定および／または診断される。好まし
い実施形態において、自己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／または上記の
疾患および障害と関連する状態は、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを用いて
、処置、予防、予後の判定および／または診断される。

【００２８】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞におよびインビボで
細胞に、または多細胞器官に投与するための、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、
ＣＲＣＧＣＬポリペプチドおよび／または抗ＣＲＣＧＣＬ抗体を含む組成物を提
供する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置のために宿
主器官中でＣＲＣＧＣＬポリペプチドを発現するための、ＣＲＣＧＣＬポリヌク
レオチドを含む。最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、免疫欠損
および／または免疫欠損と関連する状態の処置のために宿主器官中でＣＲＣＧＣ
Ｌポリペプチドを発現するための、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドを含む。この
点で特に好ましいのは、ＣＲＣＧＣＬ遺伝子の異常な内因性活性と関連する機能
不全の処置のためにヒト患者で発現することである。

【００２９】 本発明はまた、ＣＲＣＧＣＬによって誘導される細胞性応答を増強または阻害
し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、Ｃ
ＲＣＧＣＬを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞性応答をアッセ
イする工程、および標準の細胞性応答に対してその細胞性応答を比較する工程を
包含し、この標準は、接触が候補化合物の非存在下でなされた場合にアッセイさ
れる。これにより、標準に対して増加した細胞性応答は、その化合物がアゴニス
トであることを示し、そして標準に対して減少した細胞応答は、その化合物がア
ンタゴニストであることを示す。

【００３０】 別の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬリガンドを同定する方法、ならびにこの
ようなリガンドに指向するアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリー
ニングの方法が提供される。このアッセイは、ＣＲＣＧＣＬリガンド（例えば、
ＴＳＬＰ）へのＣＲＣＧＣＬの結合に対して候補化合物が有する効果を決定する
工程を包含する。特に、この方法は、ＣＲＣＧＣＬリガンド（例えば、ＴＳＬＰ
）を本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドおよび候補化合物に接触させる工程なら
びにＣＲＣＧＣＬリガンド（例えば、ＴＳＬＰ）に結合するＣＲＣＧＣＬポリペ
プチドがこの候補化合物の存在に起因して増加するのかまたは減少するのかを決
定する工程を包含する。アンタゴニストを利用して、敗血症性ショック、炎症、
大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶、骨吸収、慢性関節
リウマチ、悪液質（飢餓または栄養失調）、免疫系機能、リンパ腫および自己免
疫障害（例えば、慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス）を予防し得
る。

【００３１】 （詳細な説明） （定義） 以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。

【００３２】 本発明において、「単離された（単離した）」とは、その本来の環境（例えば
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の様式の一部であり得るか
、あるいは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離されている」。なぜなら、その
ベクター、組成物の様式、または特定の細胞は、そのポリヌクレオチドの本来の
環境ではないからである。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種性宿主細
胞において維持される組み換えＤＮＡ分子または溶液中の精製された（部分的に
か実質的に）ＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子
のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。しかし、ライブラリー（
例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるク
ローン中にか、あるいは、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡの調製物もしくは１
つ以上の制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡの調製物中に含まれる核酸は、本発
明の目的のために「単離」されなかった。このライブラリーのメンバーは、ライ
ブラリー（例えば、このクローンおよびこのライブラリーのほかのメンバーを含
む同種の溶液の形態において）、または、細胞もしくは細胞溶解物（例えば、核
型におけるような「染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）」）から除去された染色体の他
のメンバーから単離されなかった。本明細書中でさらに記載されるように、本発
明の単離された核酸分子は、天然にか、組換え的にか、または合成的に産生され
得る。

【００３３】 本発明において、「分泌」ＣＲＣＧＣＬタンパク質とは、ＥＲ、分泌小胞、ま
たは細胞外間隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびに
シグナル配列を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるＣＲＣＧＣＬタンパ
ク質をいう。ＣＲＣＧＣＬ分泌タンパク質が、細胞外間隙に放出される場合、こ
のＣＲＣＧＣＬ分泌タンパク質は、「成熟」ＣＲＣＧＣＬタンパク質を産生する
ために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキソサイトー
シスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る。

【００３４】 本明細書中で使用される場合、ＣＲＣＧＣＬ「ポリヌクレオチド」とは、配列
番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に含まれる核酸配列を有する分子、またはＡ
ＴＣＣに寄託されたクローン内に含まれるｃＤＮＡをいう。例えば、ＣＲＣＧＣ
Ｌポリヌクレオチドは、５’および３’の非翻訳配列、シグナル配列を含むかも
しくは含まないコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメ
イン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、ＣＲＣＧ
ＣＬ「ポリペプチド」とは、広く定義される場合、ポリヌクレオチドから生じた
翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう。しかし、本発明の１つの実施形態
は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ９１５５３（本明細書中で参考として
援用される）のポリヌクレオチド配列を含まない。

【００３５】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、長さが３００ｋｂ、
２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂまたは７．５ｋｂ以下
である。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＣＲＣＧＣ
Ｌコード配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含むが、任意のＣＲＣ
ＧＣＬイントロンの全てまたは一部を含まない。別の実施形態において、ＣＲＣ
ＧＣＬコード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノムにおける
ＣＲＣＧＣＬ遺伝子に対して５’側または３’側）のコード配列を含まない。

【００３６】 本発明では、配列番号１として同定された全長ＣＲＣＧＣＬ配列は、寄託され
たクローンの配列を重複させることによって生成された（コンティグ分析）。配
列番号１についての配列のすべてまたはほとんどを含む代表的クローンを、１９
９８年２月２５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）
に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号２０９６４１を与えられた。第二のクローンをまた
、１９９８年３月２３日にＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号２０９６９１を
与えられた。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａ
ｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。Ａ
ＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約の条項に拠って行われた。

【００３７】 ＣＲＣＧＣＬ「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で、配列番号１に含まれる配列、その相補体、または寄託され
たクローン内に含まれるｃＤＮＡにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含
む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムア
ミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５
０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキ
ストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２
℃での一晩インキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィル
ターを洗浄することをいう。

【００３８】 中程度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でのＣＲＣＧ
ＣＬポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた、意図される。ハイ
ブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出における変化は、
主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したスト
リンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じて達成される。例
えば、中程度に高いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ
＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロ
ッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×
ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらによ
り低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行わ
れ得る。

【００３９】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換を通じて達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬と
しては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、およ
び市販の特許処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性の
問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。

【００４０】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））にのみ、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的
ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド
」の定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ
）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、事実上任意の二
本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。

【００４１】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変
ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ＣＲＣＧＣＬ
ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領
域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖お
よび二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより代表的には二本鎖
または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハ
イブリッド分子から構成され得る。さらに、このＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域
から構成され得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドはまた、安定性のために、ま
たは他の理由のために改変された、１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡ骨格
もしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改
変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがって、「ポリヌクレオチド
」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。

【００４２】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、
すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結した
アミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のア
ミノ酸を含み得る。このＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、翻訳後プロセシングのよ
うな天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学修飾技術によっ
てのいずれかで、改変され得る。このような修飾は、基本テキスト、およびより
詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド
骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ＣＲＣ
ＧＣＬポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の修飾が、所定のＣＲＣＧＣ
Ｌポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが
理解される。また、所定のポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。ＣＲＣＧ
ＣＬポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そし
てＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る
。環状、分枝状および分枝した環状のＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、天然の翻訳
後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾として
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラ
ビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体
の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（
ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、公知の
保護基／ブロッキング基による誘導体化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、
共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化
、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化
、抗体分子または他の細胞性リガンドの連結、メチル化、ミリストイル化、酸化
、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング（例えば、切
断）、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化
のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビ
キチン化が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−
ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第
２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡ
Ｌ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，
Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １
８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。

【００４３】 「配列番号１」とは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド配列をいうが、「配列番
号２」とは、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド配列をいう。

【００４４】 「生物学的活性を有する」ＣＲＣＧＣＬポリペプチドとは、特定の生物学的ア
ッセイで測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、ＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない
活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、このＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチドの用量依存性と同一である必要はないが、むしろＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチドと比較した場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する
（すなわち、候補ポリペプチドは、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドと比較して、より
大きな活性を示すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上
の活性、そして最も好ましくは約１／３以上の活性を示す）。

【００４５】 （ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチドおよびポリペプチド） クローンＨＴＡＥＫ５３を、活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーより単離した
。最初、クローンＨＴＡＫ５３の配列を、配列番号２６として同定し、そして、
配列に存在する明らかなフレームシフトを認識して、推定アミノ酸配列を配列番
号２７として予想した。このフレームシフトを、標準の分子生物学的技術を使用
して容易に除き、配列番号１のヌクレオチド配列および配列番号２に示される推
定アミノ酸配列をを作製した。

【００４６】 寄託されたクローンは、全長１５７３ヌクレオチドを有するｃＤＮＡを含み、
これは３７１アミノ酸残基の推定のオープンリーディングフレームをコードする
（図１Ａ〜１Ｂを参照のこと）。このオープンリーディングフレームは、ヌクレ
オチド位１３に位置するＮ末端メチオニンから始まり、そしてヌクレオチド位１
１２８の停止コドンで終わる。ＣＲＣＧＣＬタンパク質の推定分子量は、約４２
ｋＤａであるべきである。

【００４７】 引き続くノーザン分析もまた、子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、活性化Ｔ細胞、
および肺癌細胞株（Ａ５４９）において１．６ｋｂの転写物を示し、一方短い変
異体はまた、リンパ節および低い程度ではあるが脾臓組織において発現する（パ
ターンは、免疫特異的発現と矛盾がない）。

【００４８】 ＣＲＣＧＣＬ発現は、以下の細胞株においては観察されなかった：ＨＬ６０、
Ｋ５６２、Ｍｏｌｔ−４、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０、Ｇ３６１、ならびに心臓、脳
、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結
腸、または末梢血白血球（パターンは、免疫特異的発現と矛盾がない）。

【００４９】 ＢＬＡＳＴ分析を使用して、配列番号２は、サイトカインレセプターファミリ
ーのメンバーに相同であることが見出された。特に、配列番号２は、インターロ
イキン−２レセプターγについてのＢｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ｍＲＮＡ（受託番号
１５３２０８８）（図２）（配列番号３）の翻訳産物に相同なドメインを含み、
以下の保存ドメインを含む：（ａ）およそのアミノ酸２２６〜２６０に位置する
推定の膜貫通ドメイン；（ｂ）推定のＷＸＷＳ（配列番号３０）またはおよその
アミノ酸１９８〜２０４（Ｔ−ｘ−Ｐ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓ）（配列番号１９）に位
置する［ＳＴＧＬ］−ｘ−Ｗ−［ＳＧ］−ｘ−Ｗ−Ｓ（配列番号１８）ドメイン
（しかし完全には一致しない）；および（ｃ）およそのアミノ酸２６１〜２６８
（Ｉ−Ｐ−Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｄ−Ｐ）（配列番号２１）に位置するモチーフＷ（Ｐ，
Ｅ）Ｘ（Ｖ，Ｉ）Ｐ（Ｎ，Ｓ，Ｄ）Ｐ（配列番号２０）ドメインを有する、推定
のＪａｋ Ｂｏｘ（しかし完全には一致しない）。これらのＣＲＣＧＣＬのポリ
ペプチドフラグメントは、特に本発明において意図される。インターロイキン−
２レセプターγ（アクセッション番号１５３２０８８）は、サイトカインレセプ
ターとして重要であると考えられているので、インターロイキン−２レセプター
γ（アクセッション番号１５３２０８８）とＣＲＣＧＣＬとの間の相同性は、Ｃ
ＲＣＧＣＬはまた細胞の分化および増殖に関与し得ることを示唆する。ＣＲＣＧ
ＣＬはまた、種々の種（例えば、ヒト（アクセッション番号ｇｉ／３４９６３２
））、イヌ属（アクセッション番号ｇｉ／５１７４１２）、およびマウス（ｐｒ
ｉ／Ｓ３７５８２）より単離された他のインターロイキン−２レセプターγ遺伝
子と相同である。

【００５０】 さらに、コードされたポリペプチドは、およそのアミノ酸１〜２２に位置する
推定のリーダー配列を有する（図１Ａ〜１Ｂを参照のこと）。図１Ａ〜１Ｂにも
また示されるように、ＣＲＣＧＣＬの分泌形態の１つの実施形態は、およそのア
ミノ酸２３〜３７１、アミノ酸２３〜２２５、またはアミノ酸１〜２３１を含む
。これらのＣＲＣＧＣＬのポリペプチドフラグメントは、特に本発明に意図され
る。

【００５１】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列ならびにこれ
らのフラグメントを含む：

【００５２】

【化１】 これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドフラグメント
もまた好ましい。

【００５３】 ＣＲＣＧＣＬは活性化Ｔ細胞より単離されるので、本発明の核酸は、生物学的
サンプルに存在する組織または細胞型の差示的な同定についておよび免疫障害の
診断についての試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポ
リペプチドを指向する抗体は、組織または細胞型の差示的な同定についての免疫
学的プローブを提供するに有用である。免疫系の多くの障害について、この遺伝
子の顕著により高いレベルかまたはより低いレベルでの発現は、標準遺伝子発現
レベル（すなわち、この障害を有さない個人からの健康な組織における発現レベ
ル）と比較して、このような障害を有する個人から得られた特定の組織（例えば
、癌のような組織および傷害した組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、
滑液または髄液）において検出され得る。

【００５４】 活性化Ｔ細胞のみにおける組織分布およびサイトカインレセプターＩＬ２およ
びＩＬ１３との相同性は、このタンパク質が免疫組織において（特にＴ細胞にお
いて）発現されるサイトカインレセプターファミリーの新規なメンバーであり、
そして他のリンパ−血液細胞においてアップレギュレートされ得ることを示唆す
る。この遺伝子の免疫系の細胞における組織分布は、このクローンのタンパク質
産物は、免疫疾患および自己免疫疾患（例えば、狼瘡、移植物拒絶、アレルギー
反応、関節炎、喘息、免疫欠損疾患、白血病、ＡＩＤＳ）の処置、予防、検出お
よび／または診断に有用であることを示唆する。さらに、Ｔ細胞におけるこの発
現は、胸腺障害（例えば、グレーヴズ病）、リンパ球性甲状腺炎、甲状腺機能亢
進および甲状腺機能不全の処置、予防および検出における優位な役割を示唆する
。このレセプターはまた、本明細書中に列挙される疾患状態において重要であり
得、低分子またはモノクローナル抗体についての標的として働き、その活性をブ
ロックし得る。

【００５５】 配列番号１として同定されたＣＲＣＧＣＬヌクレオチド配列は、寄託されたク
ローンより得られる部分的に相同な（「重複する」）配列から、そしていくつか
の場合において、さらなる関連ＤＮＡクローンからアセンブリされる。重複配列
は、高度な重複の単一の連続する配列（通常は、それぞれのヌクレオチド位での
３〜５の重複配列）へアセンブリされ、配列番号１として同定される最終配列を
生じる。

【００５６】 従って、配列番号１および翻訳された配列番号２は、十分厳密であり、そして
さもなければ、当該分野において周知の種々の使用および以下にさらに記載され
る使用に適切である。例えば、配列番号１は、配列番号１または寄託されたクロ
ーン中に含まれるｃＤＮＡに含まれる核酸配列を検出する、核酸ハイブリダイゼ
ーションプローブを設計するに有用である。これらのプローブはまた、生物学的
サンプル中の核酸分子にハイブリダイズする。これによって、本発明の種々の法
医学的方法および診断方法を可能にする。同様に、配列番号２より同定されるポ
リペプチドを使用して、ＣＲＣＧＣＬに対して特異的に結合する抗体を作製し得
る。

【００５７】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。このエラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、
または生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在
する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配
列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合
において、作製されるＤＮＡ配列は、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、
１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入また
は欠失）を超えて同一であり得るにもかかわらず、推定アミノ酸配列は、実際の
アミノ酸配列とは異なる。

【００５８】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号１として同定され作製されたヌクレオ
チド配列、および配列番号２として同定された推定の翻訳されたアミノ酸配列の
みではなく、ＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＧＣＬのヒトｃＤＮＡを含むプラスミ
ドＤＮＡのサンプルもまた提供する。寄託されたＣＲＣＧＣＬクローンのヌクレ
オチド配列は、公知の方法に従って寄託されたクローンの配列決定によって容易
に決定され得る。次いで、推定ＣＲＣＧＣＬアミノ酸配列は、このような寄託物
から証明され得る。さらに、寄託されるクローンによってコードされるタンパク
質のアミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によって、または寄託されたヒトＣ
ＲＣＧＣＬｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現させ、このタン
パク質を収集し、そしてその配列を決定することによって、直接的に決定され得
る。

【００５９】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、または寄
託されたクローンに対応するＣＲＣＧＣＬ遺伝子に関する。ＣＲＣＧＣＬ遺伝子
は、本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され
得る。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製
する工程、およびゲノム物質の適切な供給源からＣＲＣＧＣＬ遺伝子を同定また
は増幅する工程を包含する。

【００６０】 本発明においてまた提供されるものは、ＣＲＣＧＣＬの種ホモログである。種
ホモログは、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマー
を作製し、そして対立遺伝子改変体および／または所望のホモログについて適切
な核酸供給源をスクリーニングすることによって単離および同定され得る。

【００６１】 ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このような
ポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に産生され
たポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合
せによって産生されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを調製する
ための手段は、当該分野で十分に理解される。

【００６２】 ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であ
り得るか、またはより大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質）の部分であ
り得る（以下を参照のこと）。分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、精製
を補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安
定性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば
有利である。

【００６３】 ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは実質的に精製される。ＣＲＣＧＣＬポリぺプチド（分泌ポリぺプチ
ドを含む）の組換え的に生成されたバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）は、本明細書
中に記載される技術またはＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：
３１−４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的に精製され得
る。ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドはまた、例えば、ＣＲＣＧＣＬタンパク質に対し
て惹起される本発明の抗体のように、本明細書中に記載される技術または当該分
野において公知のそれ以外の技術を使用して、天然供給源、合成供給源または組
換え供給源から精製され得る。

【００６４】 （ポリヌクレオチドおよびポリぺプチド改変体） 「改変体」とは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリぺプチドとは異な
るが、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドを
いう。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域において
、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリぺプチドに同一である。

【００６５】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列が、ヌクレオチド配列がＣＲＣＧＣＬポリぺプチドをコードする参
照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得る
ことを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照
ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核
酸を得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか、また
は別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチドの５
％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅ
ｒｙ）配列は、配列番号１に示される配列全体、またはＯＲＦ（オープンリーデ
ィングフレーム）、または本明細書中で記載されるように特定される任意のフラ
グメントであり得る。

【００６６】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象
配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照さ
れる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ
．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦ
ＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列におい
て、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配
列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の
結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するため
にＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：
Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅ
ｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａ
ｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃまたはｅ＝１、
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか
より短い方）である。

【００６７】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。

【００６８】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【００６９】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。

【００７０】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列に対して、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによっ
てコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９
５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、
公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本
発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列として
も参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ
．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに
基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整
列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であ
るかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列
整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用い
られる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝
２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ
＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔ
ｏｆｆ Ｓｃまたはｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗ
ｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短
い方）である。

【００７１】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側に位置する。

【００７２】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【００７３】 ＣＲＣＧＣＬ改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における
変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を
生成するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を
含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな
置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合
せにおいて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付
加される改変体もまた、好ましい。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド改変体は、種
々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮ
Ａにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに
変化させる））のために、生成され得る。

【００７４】 天然に存在するＣＲＣＧＣＬ改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そし
て生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態の
うちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙまたはｋ（１９８５））。これらの対立遺
伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのい
ずれかで変化し得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変
体は、変異誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。

【００７５】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。
例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、分泌
タンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３、８、また
は２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性
を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、
このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後
、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。

【００７６】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ改変
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。

【００７７】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および
／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の大多数より少ない残
基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパ
ク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免
疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および
そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得
る。

【００７８】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性（例えば、生物学的活性［Ｃ
ＲＣＧＣＬリガンド（例えば、ＴＳＬＰ）との結合］；Ｂ細胞リンパ球産生、お
よび／または同時刺激胸腺細胞または成熟Ｔ細胞；ＳＴＡＴ５Ｂの活性）を示す
ＣＲＣＧＣＬポリぺプチド改変体を含む。このような改変体としては、活性に対
する影響をほとんど有さないように、当該分野において公知の一般的な法則に従
って選択される、欠失、挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。

【００７９】 本願は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、配列番号２のｍ−ｎとし
て以下に開示されるＮ末端およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする核酸配列）に対して、それらがＣＲＣＧＣＬの機能的活性を有す
るポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％
同一、９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または
９９％同一である核酸分子に関する。特定の核酸分子が、ＣＲＣＧＣＬ機能活性
を有するポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者はこの核酸分子を使用
する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているからである。ＣＲＣＧＣＬ機
能活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、
特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＣＲＣＧＣＬ遺伝子またはその対立遺伝
子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒ
ｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））に記載されるような、ＣＲＣ
ＧＣＬ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッド
（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「Ｆ
ＩＳＨ」）；および特定の組織におけるＣＲＣＧＣＬのｍＲＮＡ発現を検出する
ためのノーザンブロット分析が挙げられる。

【００８０】 しかし、本明細書中に示される核酸配列（実際に、ＣＲＣＧＣＬ機能活性を有
するポリペプチドをコードする核酸配列）に対して、少なくとも８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核
酸分子が好ましい。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドもまた、本発明に含まれる。「ＣＲＣＧＣＬの機能的活性を有するポリペプチ
ド」によって、例えば、イムノアッセイおよび／または生物学的アッセイにおい
て測定されるように、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチド（例えば、全長（すな
わち、完全）ＣＲＣＧＣＬ、成熟ＣＲＣＧＣＬまたは可溶性ＣＲＣＧＣＬ（例え
ば、ＣＲＣＧＣＬの細胞外ドメインに含まれる配列を有する））の機能活性と類
似する活性（しかし、同一である必要はない）を示すポリペプチドが意図される
。例えば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド機能活性は、本明細書中に記載されるポリ
ペプチド配列が完全ＣＲＣＧＣＬとマルチマー（例えば、ホモダイマーおよびホ
モトリマー）を形成して、そしてＣＲＣＧＣＬリガンド（例えば、単球の表面上
に発現されるＣＲＣＧＣＬリガンド）を結合する能力によって測定され得る。例
えば、ＣＲＣＧＣＬ機能活性はまた、ＣＲＣＧＣＬリガンド（例えば、ＴＳＬＰ
）と結合するためのＣＲＣＧＣＬポリペプチドの能力を決定することによって慣
用的に測定され得る。ＣＲＣＧＣＬ機能活性は、ポリペプチドを発現する細胞を
誘導するようなポリペプチドの能力（例えば、細胞表面上に存在しないか、また
はそこで発現される同属リガンド）を決定することによって慣用的に測定される
。さらに、ＣＲＣＧＣＬ機能活性は、Ｂ細胞リンパ球産生、および／または角状
胸腺細胞または成熟Ｔ細胞を促進するＣＲＣＧＣＬポリペプチドの能力；ＳＴＡ
Ｔ５Ｂの活性に対する能力、および／または他のＩ型サイトカインレセプター鎖
（例えば、ＩＬ−７α鎖）を用いてマルチマーを形成する能力を測定することに
よって慣用的に測定され得る。

【００８１】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡクロ
ーンの核酸配列、もしくは図１Ａ〜Ｄ（配列番号１）に示される核酸配列、また
はそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が「
ＣＲＣＧＣＬの機能的活性」を有するポリペプチドをコードすることを直ちに認
識する。事実、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペプチ
ドをコードするので、多くの場合において、これは、上記のアッセイを行うこと
なく、なお当業者に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子につ
いては、妥当な数がまたＣＲＣＧＣＬ機能活性を有するポリペプチドをコードす
ることは当該分野でさらに認識される。これは、以下に記載されるように、当業
者が、タンパク質機能をあまり有意にもたらすようではないまたはもたらさない
ようであるかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を
第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を十分認識しているためである。

【００８２】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンス
は、Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎ
ｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６−１３１０（１９９０）に提供される。ここで、著者らは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど許容性であることを示す。

【００８３】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。

【００８４】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る
。

【００８５】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。

【００８６】 例えば、ＣＲＣＧＣＬのアミノ酸レベルの部位特異的変化は、特定のアミノ酸
を保存的アミノ酸で置換することによって実施され得る。好ましい保存的改変は
、以下が挙げられる：Ｍ１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換）；Ｇ２
（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｒ３（Ｈ、またはＫで置換）；
Ｌ４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｖ５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、またはＭで置換）；Ｌ６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；
Ｌ７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｗ８（Ｆ、またはＹで置換
）；Ｇ９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ１０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ１１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換）；Ｖ１２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｆ１３（Ｗ、ま
たはＹで置換）；Ｌ１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ１５
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ１６（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ１７（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；
Ｗ１８（Ｆ、またはＹで置換）；Ｍ１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで
置換）；Ａ２０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２１（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ２２（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｑ２３（Ｎで置換）；Ｇ２４（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換）；Ｇ２５（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ２６（Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ２７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換）；Ｅ２８（Ｄで置換）；Ｇ２９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換）；Ｖ３０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｑ３１
（Ｎで置換）；Ｉ３２（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｑ３３（
Ｎで置換）；Ｉ３４（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｉ３５（Ａ
、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｙ３６（Ｆ、またはＷで置換）；Ｆ
３７（Ｗ、またはＹで置換）；Ｎ３８（Ｑで置換）；Ｌ３９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ４０（Ｄで置換）；Ｔ４１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｍ、またはＶで置換）；Ｖ４２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）
；Ｑ４３（Ｎで置換）；Ｖ４４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；
Ｔ４５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｗ４６（Ｆ、またはＹで
置換）；Ｎ４７（Ｑで置換）；Ａ４８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換）；Ｓ４９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｋ５０（Ｈ、また
はＲで置換）；Ｙ５１（Ｆ、またはＷで置換）；Ｓ５２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｒ５３（Ｈ、またはＫで置換）；Ｔ５４（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｎ５５（Ｑで置換）；Ｌ５６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｔ５７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置
換）；Ｆ５８（Ｗ、またはＹで置換）；Ｈ５９（Ｋ、またはＲで置換）；Ｙ６０
（Ｆ、またはＷで置換）；Ｒ６１（Ｈ、またはＫで置換）；Ｆ６２（Ｗ、または
Ｙで置換）；Ｎ６３（Ｑで置換）；Ｇ６４（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換）；Ｄ６５（Ｅで置換）；Ｅ６６（Ｄで置換）；Ａ６７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｙ６８（Ｆ、またはＷで置換）；Ｄ６９（Ｅで置
換）；Ｑ７０（Ｎで置換）；Ｔ７２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換
）；Ｎ７３（Ｑで置換）；Ｙ７４（Ｆ、またはＷで置換）；Ｌ７５（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ７６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換）；Ｑ７７（Ｎで置換）；Ｅ７８（Ｄで置換）；Ｇ７９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｈ８０（Ｋ、またはＲで置換）；Ｔ８１（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ８２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｇ８３（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ８５（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ８６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換）；Ｄ８７（Ｅで置換）；Ａ８８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換）；Ｅ８９（Ｄで置換）；Ｑ９０（Ｎで置換）；Ｒ９１（Ｈ、ま
たはＫで置換）；Ｄ９２（Ｅで置換）；Ｄ９３（Ｅで置換）；Ｉ９４（Ａ、Ｇ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ９５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換）；Ｙ９６（Ｆ、またはＷで置換）；Ｆ９７（Ｗ、またはＹで置換）；
Ｓ９８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｉ９９（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｒ１００（Ｈ、またはＫで置換）；Ｎ１０１（Ｑ
で置換）；Ｇ１０２（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｔ１０３（
Ａ、Ｇ，Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｈ１０４（Ｋ、またはＲで置換）
；Ｖ１０６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｆ１０７（Ｗ、また
はＹで置換）；Ｔ１０８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ１０
９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ１１０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｒ１１１（Ｈ、またはＫで置換）；Ｗ１１２（Ｆ、
またはＹで置換）；Ｍ１１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換）；Ｖ
１１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｙ１１５（Ｆ、またはＷ
で置換）；Ｙ１１６（Ｆ、またはＷで置換）；Ｌ１１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｋ１１８（Ｈ、またはＲで置換）；Ｓ１２０（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ１２１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｋ１２３（Ｈ、またはＲで置換）；Ｈ１２４（Ｋ、またはＲで置
換）；Ｖ１２５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｒ１２６（Ｈ、
またはＫで置換）；Ｆ１２７（Ｗ、またはＹで置換）；Ｓ１２８（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｗ１２９（Ｆ、またはＹで置換）；Ｈ１３０（
Ｋ、またはＲで置換）；Ｑ１３１（Ｎで置換）；Ｄ１３２（Ｅで置換）；Ａ１３
３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｖ１３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｔ１３５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置
換）；Ｖ１３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｔ１３７（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ１３９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換）；Ｄ１４０（Ｅで置換）；Ｌ１４１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換）；Ｓ１４２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；
Ｙ１４３（Ｆ、またはＷで置換）；Ｇ１４４（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換）；Ｄ１４５（Ｅで置換）；Ｌ１４６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｌ１４７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｙ１４
８（Ｆ、またはＷで置換）；Ｅ１４９（Ｄで置換）；Ｖ１５０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｑ１５１（Ｎで置換）；Ｙ１５２（Ｆ、またはＷ
で置換）；Ｒ１５３（Ｈ、またはＫで置換）；Ｓ１５４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｆ１５６（Ｗ、またはＹで置換）；Ｄ１５７（Ｅで置換
）；Ｔ１５８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ１５９（Ｄで置
換）；Ｗ１６０（Ｆ、またはＹで置換）；Ｑ１６１（Ｎで置換）；Ｓ１６２（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｋ１６３（Ｈ、またはＲで置換）；
Ｑ１６４（Ｎで置換）；Ｅ１６５（Ｄで置換）；Ｎ１６６（Ｑで置換）；Ｔ１６
７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｎ１６９（Ｑで置換）；Ｖ１
７０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｔ１７１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｉ１７２（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換）；Ｅ１７３（Ｄで置換）；Ｇ１７４ｒｅｐｌａｃｅｄｗｉｔｈＡ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ１７５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換）；Ｄ１７６（Ｅで置換）；Ａ１７７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｅ１７８（Ｄで置換）；Ｋ１７９（Ｈ、またはＲで置換）；Ｙ１
８１（Ｆ、またはＷで置換）；Ｓ１８２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換）；Ｆ１８３（Ｗ、またはＹで置換）；Ｗ１８４（Ｆ、またはＹで置換）；
Ｖ１８５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｒ１８６（Ｈ、または
Ｋで置換）；Ｖ１８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｋ１８８
（Ｈ、またはＲで置換）；Ａ１８９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
）；Ｍ１９０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換）；Ｅ１９１（Ｄで置
換）；Ｄ１９２（Ｅで置換）；Ｖ１９３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで
置換）；Ｙ１９４（Ｆ、またはＷで置換）；Ｇ１９５（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換）；Ｄ１９７（Ｅで置換）；Ｔ１９８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｙ１９９（Ｆ、またはＷで置換）；Ｓ２０１（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｄ２０２（Ｅで置換）；Ｗ２０３（Ｆ、ま
たはＹで置換）；Ｓ２０４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ２
０５（Ｄで置換）；Ｖ２０６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｔ
２０７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｗ２０９（Ｆ、またはＹ
で置換）；Ｑ２１０（Ｎで置換）；Ｒ２１１（Ｈ、またはＫで置換）；Ｇ２１２
（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ２１３（Ｄで置換）；Ｉ２１
４（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｒ２１５（Ｈ、またはＫで置
換）；Ｄ２１６（Ｅで置換）；Ａ２１７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換）；Ａ２１９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ２２０（Ｄ
で置換）；Ｔ２２１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｔ２２３（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｋ２２６（Ｈ、またはＲで置換）
；Ｋ２２８（Ｈ、またはＲで置換）；Ｌ２２９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｓ２３０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｋ２３
１（Ｈ、またはＲで置換）；Ｆ２３２（Ｗ、またはＹで置換）；Ｉ２３３（Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換）；Ｉ２３５（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ
２３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ２３７（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２３８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換）；Ａ２３９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｉ２４０（
Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２４１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２４２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）
；Ｍ２４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換）；Ｖ２４４（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｓ２４５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｌ２４６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２４
７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２４８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２４９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換）；Ｓ２５０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２５１（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｗ２５２（Ｆ、またはＹで置換）；Ｋ
２５３（Ｈ、またはＲで置換）；Ｌ２５４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換）；Ｗ２５５（Ｆ、またはＹで置換）；Ｒ２５６（Ｈ、またはＫで置換）
；Ｖ２５７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｋ２５８（Ｈ、また
はＲで置換）；Ｋ２５９（Ｈ、またはＲで置換）；Ｆ２６０（Ｗ、またはＹで置
換）；Ｌ２６１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｉ２６２（Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ２６４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換）；Ｖ２６５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｄ
２６７（Ｅで置換）；Ｋ２６９（Ｈ、またはＲで置換）；Ｓ２７０（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｉ２７１（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換）；Ｆ２７２（Ｗ、またはＹで置換）；Ｇ２７４（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ２７５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
）；Ｆ２７６（Ｗ、またはＹで置換）；Ｅ２７７（Ｄで置換）；Ｉ２７８（Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｈ２７９（Ｋ、またはＲで置換）；Ｑ
２８０（Ｎで置換）；Ｇ２８１（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；
Ｎ２８２（Ｑで置換）；Ｆ２８３（Ｗ、またはＹで置換）；Ｑ２８４（Ｎで置換
）；Ｅ２８５（Ｄで置換）；Ｗ２８６（Ｆ、またはＹで置換）；Ｉ２８７（Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｔ２８８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、
またはＶで置換）；Ｄ２８９（Ｅで置換）；Ｔ２９０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ
、またはＶで置換）；Ｑ２９１（Ｎで置換）；Ｎ２９２（Ｑで置換）；Ｖ２９３
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ａ２９４（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換）；Ｈ２９５（Ｋ、またはＲで置換）；Ｌ２９６（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｈ２９７（Ｋ、またはＲで置換）；Ｋ２
９８（Ｈ、またはＲで置換）；Ｍ２９９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで
置換）；Ａ３００（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ３０１（Ａ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ３０２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換）；Ｅ３０３（Ｄで置換）；Ｑ３０４（Ｎで置換）；Ｅ３０５
（Ｄで置換）；Ｓ３０６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ３０
７（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ３０９（Ｄで置換）；Ｅ３
１０（Ｄで置換）；Ｌ３１２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｖ
３１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｖ３１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｑ３１５（Ｎで置換）；Ｌ３１６（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ａ３１７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換）；Ｋ３１８（Ｈ、またはＲで置換）；Ｔ３１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ３２０（Ｄで置換）；Ａ３２１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ３２２（Ｄで置換）；Ｓ３２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｒ３２５（Ｈ、またはＫで置換）；Ｍ３２６（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換）；Ｌ３２７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換）；Ｄ３２８（Ｅで置換）；Ｑ３３０（Ｎで置換）；Ｔ３３１
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｅ３３２（Ｄで置換）；Ｅ３３
３（Ｄで置換）；Ｋ３３４（Ｈ、またはＲで置換）；Ｅ３３５（Ｄで置換）；Ａ
３３６（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ３３７（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ３３８（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換）；Ｇ３３９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｓ３４０（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ３４１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換）；Ｑ３４２（Ｎで置換）；Ｌ３４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換）；Ｈ３４５（Ｋ、またはＲで置換）；Ｑ３４６（Ｎで置
換）；Ｌ３４８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｑ３４９（Ｎで
置換）；Ｇ３５０（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ３５１（Ａ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｄ３５２（Ｅで置換）；Ｖ３５３（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｖ３５４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換）；Ｔ３５５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）
；Ｉ３５６（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ３５７（Ａ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｇ３５８（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換）；Ｆ３５９（Ｗ、またはＹで置換）；Ｔ３６０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｆ３６１（Ｗ、またはＹで置換）；Ｖ３６２（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換）；Ｍ３６３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＶで置換）；Ｎ３６４（Ｑで置換）；Ｄ３６５（Ｅで置換）；Ｒ３６６（
Ｈ、またはＫで置換）；Ｓ３６７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）
；Ｙ３６８（Ｆ、またはＷで置換）；Ｖ３６９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、また
はＭで置換）；Ａ３７０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換）；Ｌ３７
１（Ａ，Ｇ，Ｉ，Ｓ，Ｔ，Ｍ，またはＶ。

【００８７】 生じる構築物は、明細書を通じて記載される活性または機能および当該分野で
公知の活性または機能について、従来的にスクリーニングされ得る。好ましくは
、生じる構築物は、ＣＲＣＧＣＬ活性または機能の増加を有するが、残りのＣＲ
ＣＧＣＬ活性または機能は維持される。より好ましくは、生じる構築物は、１以
上の増加したＣＲＣＧＣＬ活性または機能を有するが、残りのＣＲＣＧＣＬ活性
または機能は、維持される。

【００８８】 保存的アミノ酸置換に加えて、ＣＲＣＧＣＬの改変体は、（ｉ）１つ以上の非
保存的なアミノ酸残基での置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コー
ドによってコードされるアミノ酸残基でもよく、そうでなくてもよい、または（
ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基との置換、または（ｉｉｉ）成熟
ポリぺプチドの、別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは
可溶性を増大させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との融
合、または（ｉｖ）ポリぺプチドの、さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ
融合領域ペプチド、またはリーダー配列もしくは分泌配列、または精製を容易に
する配列）との融合、を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書の教
示から、当業者の範囲内にあると考えられる。

【００８９】 例えば、荷電されたアミノ酸の、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ
酸とのアミノ酸置換を含む、ＣＲＣＧＣＬポリぺプチド改変体は、より少ない凝
集性といった改善された特性を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の
凝集は、その凝集体の免疫原活性に起因して活性を減少させ、かつ、クリアラン
スを増加させる（Ｐｉｎｃｋａｒｄら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：
８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−
３７７（１９９３））。

【００９０】 例えば、ＣＲＣＧＣＬの好ましい非保存的置換としては、以下が挙げられる：
Ｍ１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または Ｃで置換）；Ｒ３（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換）；Ｌ４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｖ５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｌ６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｌ７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ８
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換）；Ｇ９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ａ１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ａ１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｖ１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）
；Ｆ１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
、またはＣで置換）；Ｌ１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｌ１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換）；Ｇ１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｇ１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換）；Ｗ１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｍ１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ２８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２９（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ３０（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｉ３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）
；Ｑ３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換）；Ｙ３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ３８（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ｌ３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｅ４０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ４７（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ａ４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ｓ４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｋ５０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ５３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ５４（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｌ５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）
；Ｔ５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｆ５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｈ５９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ６１（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｆ６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｎ６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ６５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ６６（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ａ６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｙ６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ６９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｃ
７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＰで置換）；Ｔ７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ７５（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ７６（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ７７（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｅ７８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｈ８０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｃ８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換）；Ｌ８５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ８６（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ８７（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換）；Ａ８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｅ８９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ９１（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｄ９２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ９３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ９７（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｓ９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）
；Ｉ９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｒ１００（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換）；Ｎ１０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ１０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ１０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｈ１０４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ１０５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＣで置換）；Ｖ１０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換）；Ｆ１０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ１０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ１０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ１１１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ１１２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｍ１１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｖ１１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｙ１１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ１１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ１１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ１１８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ１
１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＣで置換）；Ｓ１２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ１２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｋ１２３（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｈ１２４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換）；Ｖ１２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換）；Ｒ１２６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ１２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１２８（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ１２９（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｈ１３０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ１３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ１３２（Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ａ１３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｖ１３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｔ１３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｖ１３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｔ１３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｃ１３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換）；Ｓ１３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ１４０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ１４１（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１４２（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ１４３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｇ１４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
）；Ｄ１４５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ１４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ１４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ１４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ１４９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｖ１５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；
Ｑ１５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ１５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ１５３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１５４
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ１５５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＣで置換）；Ｆ１５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ１５７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ１５８
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ１５９
（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換）；Ｗ１６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ１６１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１６２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ１６３（Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｑ１６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ１６５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ１６６（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｔ１６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換）；Ｃ１６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換）；Ｎ１６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ１７０（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ１７１（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ１７２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ１７３（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換）；Ｇ１７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ｏ ｒ
Ｃで置換）；Ｌ１７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｄ１７６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ１７７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ１７８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ１７９（
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｃ１８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換）；Ｙ１８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ１８２（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ１８３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ｗ１８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ１８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ１８６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ１８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ１８８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ１８
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｍ１９
０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ１９
１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｄ１９２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ１９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ１９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ１９５（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ１９６（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換）；Ｄ１９７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ１９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ１９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ２００（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換）；Ｓ２０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｄ２０２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ２０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ２０４（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ２０５（
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｖ２０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｔ２０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｃ２０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換）；Ｗ２０９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ２１０（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｒ２１１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ２１３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２１４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ２１５（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ｄ２１６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ２１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｃ２１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換）；Ａ２１９（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ２２０（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｔ２２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｐ２２２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｔ２２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ２２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｐ２２
５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＣで置換）；Ｋ２２６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ２２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｋ
２２８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｌ２２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｓ２３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｋ２３１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ２３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２３３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２３４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２３５（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ２３６（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ２３７（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２３８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ２３９（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２４０（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２４１（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２４２（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｍ２４３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ２４４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ２４５（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２４６（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２４７（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２４８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２４９（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ２５０（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２５１（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ２５２（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ｋ２５３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ２５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｒ２５６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ２５
７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ２５
８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｋ２５９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ２６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ２６１（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２６２（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ２６３（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ
で置換）；Ｓ２６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｖ２６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｐ２６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｄ２６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ２６８（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換）；Ｋ２６９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ２７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ２７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ２７３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＣで置換）；Ｇ２７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｌ２７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｆ２７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ２７７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ２７８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｈ２７９（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換）；Ｑ２８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ２８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ２８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ２８３（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）
；Ｑ２８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ２８５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｗ２８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ
２８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ
２８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ
２８９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ２９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ２９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ２９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ
２９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ
２９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｈ
２９５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｌ２９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｈ２９７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ２９８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｍ２９９（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ３００（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３０１（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ３０２（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ３０３（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｑ３０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ３０５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ３０６（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３０７（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ３０８（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＣで置換）；Ｅ３０９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ３１０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ３１１（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換）；Ｌ３１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｖ３１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｖ３１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｑ３１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ３１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ３１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ３１８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ３１９（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ３２０（
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ａ３２１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｅ３２２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ３２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ３２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｒ３２
５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｍ３２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｌ３２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｄ３２８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ３２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換）；Ｑ３３
０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｔ３３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｅ３３２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｅ３３３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｋ３３
４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｅ３３５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ３３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ３３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ３４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ３４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ３４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ３４３（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ３４４（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換）；Ｈ３４５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｑ３４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｐ３４７（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換）；Ｌ３４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換）；Ｑ３４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ３５２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ３５
３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ３５
４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｔ３５
５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｉ３５
６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３５
７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｇ３５
８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｆ３５
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｔ３６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換）；Ｆ３６１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ３６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｍ３６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｎ３６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｄ３６５（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換）；Ｒ３６６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｓ３６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｙ３６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｖ３６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ａ３７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換）；Ｌ３７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ。

【００９１】 生じる構築物は、明細書を通じて記載される活性または機能および当該分野で
公知の活性または機能について、従来的にスクリーニングされ得る。好ましくは
、生じる構築物は、ＣＲＣＧＣＬ活性または機能の欠損を有するが、残りのＣＲ
ＣＧＣＬ活性または機能は維持される。より好ましくは、生じる構築物は、１以
上のＣＲＣＧＣＬ活性または機能の欠損を有するが、残りのＣＲＣＧＣＬ活性ま
たは機能は、維持される。

【００９２】 さらに、１以上のアミノ酸（例えば、２，３，４，５，６，７，８，９および
１０）は、上記の置換アミノ酸（保存的または非保存的のいずれか）と置換され
得る。置換アミノ酸は、ＣＲＧＣＣＬタンパク質の全長、成熟、またはプロタン
パク質の形態、ならびに以下に列挙されるｍ−ｎ，ｍ−ｎ¹，ｍ¹−ｎおよび／ま
たはｍ¹−ｎ¹の一般式を有する、Ｎ−およびＣ−末端欠損変異体で生じ得る。

【００９３】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、好ましさが常に増大
する順番で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、
５、４、３、２、または１アミノ酸置換を超えない、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド
のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドである
ことが非常に好ましい。特定の実施形態において、図１Ａ〜１Ｂのアミノ酸配列
またはそれらのフラグメント（例えば、本明細書中に記載される成熟形態および
／または他のフラグメント）における付加、置換、および／または欠失の数は、
１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０であ
り、保存的アミノ酸置換が好ましい。

【００９４】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント） 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＴＡＥＫ５３）のヌクレ
オチド配列、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列をコー
ドするヌクレオチド配列、図１Ａ〜１Ｂに示すポリペプチド配列（配列番号２）
をコードするヌクレオチド配列、図１Ａ〜１Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番
号１）、またはこれらに対する相補鎖を有する、単離された核酸分子のフラグメ
ントによって、少なくとも１５ｎｔ長、そしてより好ましくは少なくとも約２０
ｎｔ長、なおより好ましくは少なくとも３０ｎｔ長、そしてさらにより好ましく
は、少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２
５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｎｔ長の
フラグメントが意図される。これらのフラグメントは、本明細書中で議論するよ
うな診断プローブおよびプライマーが挙げられるがこれらに限定されない、多数
の用途を有する。もちろん、より大きなフラグメント（例えば、５０１〜１５０
０ｎｔ長のフラグメント）もまた、本発明に従って、有用である。なぜなら、寄
託されたｃＤＮＡ（クローンＨＴＡＥＫ５３）または図１Ａ〜１Ｂ（配列番号１
）に示すようなヌクレオチド配列の（全てでなければ）大部分に対応するフラグ
メントであるからである。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントによっ
て、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号１
）に示すようなヌクレオチド配列由来の、２０以上の連続した塩基を含むフラグ
メントが意図される。

【００９５】 さらに、ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては
、例えば、以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を有するフラグメントまたは
それに対する相補鎖、あるいは寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡが挙げ
られる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜
２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、
４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜
７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、
９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１
５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０
１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００
、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜
１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１
８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００および／または２
００１から配列番号１の末端。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に
記載された範囲、またはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより
数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きい範囲かまたは小さ
な範囲を含む。

【００９６】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ＣＲＣＧＣＬ機能的
活性を示すポリペプチドをコードする。ＣＲＣＧＣＬ「機能的活性」を示すポリ
ペプチドによって、全長（完全）ＣＲＣＧＣＬタンパク質に関連する１つ以上の
既知の機能的活性を示し得る、ポリペプチドを意味する。このような機能的活性
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的活性［Ｔ細胞
リンパ球産生、および／または同時刺激胸腺細胞もしくは成熟Ｔ細胞の促進、Ｓ
ＴＡＴ５Ｂの活性化、抗原性［抗ＣＲＣＧＣＬ抗体に結合する（または結合に関
してＣＲＣＧＣＬポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（ＣＲＣＧＣＬポ
リペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドと多量体を形成する能力、他のＩ型サイトカインレセプター鎖（例えば、ＩＬ
−７α鎖）と多量体を形成する能力、および／またはＣＲＣＧＣＬポリペプチド
（例えば、ＴＳＬＰ）に対するリガンドと結合する能力］。

【００９７】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、およびそのフラグメント、改変体、誘導体、およ
びアナログの機能的活性は、種々の方法によって、アッセイされ得る。

【００９８】 例えば、全長ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを結合する能力、または抗ＣＲＣＧＣ
Ｌ抗体との結合に関して全長ＣＲＣＧＣＬポリペプチドと競合する能力をアッセ
イする、１つの実施形態においては、当該分野において公知の種々のイムノアッ
セイが使用され得る。このようなアッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射
分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセ
イ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタン
ブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッ
セイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および
免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次
抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、この一次
抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによっ
て検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。免疫アッセ
イにおける結合の検出のための多くの手段が、当該分野で公知であり、そして本
発明の範囲内である。

【００９９】 ＣＲＣＧＣＬリガンドが同定されるか（例えば、ＴＳＬＰ）、または本発明の
ポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化する能力（例えば
、別のＩ型サイトカインレセプター鎖（例えば、ＩＬ−７α鎖）との複合体）が
評価される、別の実施形態では、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマ
トグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィ
ニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ
得る。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．
５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形態において、その基質に結合する
ＣＲＣＧＣＬの生理学的な相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。

【０１００】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例を参照のこと）およびさも
なくば当該分野で公知のアッセイが、慣用的に、ＣＲＣＧＣＬのポリペプチドな
らびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの、ＣＲＣＧＣＬ関
連生物学的活性（インビトロまたはインビボのいずれかにおいて）を誘発する能
力を測定するために適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本
発明の範囲にある。

【０１０１】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるＣＲＣＧＣＬポリペプチドのフラグ
メントに関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＴＡＥＫ５３）によ
ってコードされる単離されたＣＲＣＧＣＬポリペプチドのフラグメントによって
、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列、図１Ａ〜１Ｂに
示されるポリペプチド配列（配列番号２）が、配列番号２に含まれるポリペプチ
ドフラグメントまたは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードさ
れるポリペプチドフラグメントを含むことを意図する。タンパク質フラグメント
は、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより
大きなポリぺプチド内（そのフラグメントが、部分または領域を（最も好ましく
は単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペプチド
フラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸数を含
む：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜
１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、
２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、または２
８１からコード領域の末端まで。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なく
とも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２
０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸の長さであり得る。この文脈におい
て、「約（おおよそ）」とは、特に記載された範囲、いずれかの末端もしくは両
方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ
大きいかまたは小さな範囲または値を含む。

【０１０２】 １以上のアミノ酸の、タンパク質のＮ末端からの欠失が、このタンパク質の１
以上の生物学的機能の欠失という改変を生じたとしても、他の機能活性（例えば
、Ｔ細胞リンパ球産生、および／または同時刺激胸腺細胞もしくは成熟Ｔ細胞の
促進、ＳＴＡＴ５Ｂの活性化、抗原性［抗ＣＲＣＧＣＬ抗体に結合する（または
結合に関してＣＲＣＧＣＬポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（ＣＲＣ
ＧＣＬポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のＣＲＣＧＣＬポ
リペプチドと多量体を形成する能力、他のＩ型サイトカインレセプター鎖（例え
ば、ＩＬ−７α鎖）と多量体を形成する能力、および／またはＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチド（例えば、ＴＳＬＰ）に対するリガンドと結合する能力）はなお、維持
され得る。例えば、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘
導および／またはこれに結合する短縮化ＣＲＣＧＣＬムテインの能力は、完全ポ
リペプチドまたは成熟ポリペプチドの過半数の残基より少ない残基が、Ｎ末端か
ら除去される場合、一般に維持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠失す
る特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を維持するか否かは、本明細
書中で記載されるかそうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易
に決定され得る。多くの欠失されたＮ末端アミノ酸残基を有するＣＲＣＧＣＬム
テインが、幾らかの生物学的活性または免疫学的活性を維持し得ることは、あり
そうにないわけではない。実際に、わずか６ＣＲＣＧＣＬアミノ酸残基から構成
されるペプチドは、しばしば、免疫応答を引き起こし得る。

【０１０３】 従って、ポリペプチドフラグメントは、分泌ＣＲＣＧＣＬタンパク質ならびに
成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントは、アミノ末端また
はカルボキシ末端あるいはその両方から残基を欠失された連続した一連の残基を
有する分泌ＣＲＣＧＣＬタンパク質または成熟形態を含む。例えば、１〜６０の
範囲の任意の数のアミノ酸は、分泌ＣＲＣＧＣＬポリペプチドまたは成熟形態の
いずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、１〜３０の範囲の任意の数の
アミノ酸は、分泌ＣＲＣＧＣＬタンパク質または成熟形態のカルボキシ末端から
欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意
の組合せが、好ましい。同様に、これらのＣＲＣＧＣＬポリペプチドフラグメン
トをコードするポリヌクレオチドもまた、好ましい。

【０１０４】 詳細には、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−３７１によ
って記載され得、ここで、ｍは、２〜３７０の整数であり、ここでｍは、配列番
号２において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに詳細には、本発
明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、配列番号２として
示される本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドのＮ末端欠失の残基のアミノ酸配列
を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する：配列番号２のＧ−２〜Ｌ−３７１；Ｒ−３〜Ｌ−３７１；Ｌ−４〜
Ｌ−３７１；Ｖ−５〜Ｌ−３７１；Ｌ−６〜Ｌ−３７１；Ｌ−７〜Ｌ−３７１；
Ｗ−８〜Ｌ−３７１；Ｇ−９〜Ｌ−３７１；Ａ−１０〜Ｌ−３７１；Ａ−１１〜
Ｌ−３７１；Ｖ−１２〜Ｌ−３７１；Ｆ−１３〜Ｌ−３７１；Ｌ−１４〜Ｌ−３
７１；Ｌ−１５〜Ｌ−３７１；Ｇ−１６〜Ｌ−３７１；Ｇ−１７〜Ｌ−３７１；
Ｗ−１８〜Ｌ−３７１；Ｍ−１９〜Ｌ−３７１；Ａ−２０〜Ｌ−３７１；Ｌ−２
１〜Ｌ−３７１；Ｇ−２２〜Ｌ−３７１；Ｑ−２３〜Ｌ−３７１；Ｇ−２４〜Ｌ
−３７１；Ｇ−２５〜Ｌ−３７１；Ａ−２６〜Ｌ−３７１；Ａ−２７〜Ｌ−３７
１；Ｅ−２８〜Ｌ−３７１；Ｇ−２９〜Ｌ−３７１；Ｖ−３０〜Ｌ−３７１；Ｑ
−３１〜Ｌ−３７１；Ｉ−３２〜Ｌ−３７１；Ｑ−３３〜Ｌ−３７１；Ｉ−３４
〜Ｌ−３７１；Ｉ−３５〜Ｌ−３７１；Ｙ−３６〜Ｌ−３７１；Ｆ−３７〜Ｌ−
３７１；Ｎ−３８〜Ｌ−３７１；Ｌ−３９〜Ｌ−３７１；Ｅ−４０〜Ｌ−３７１
；Ｔ−４１〜Ｌ−３７１；Ｖ−４２〜Ｌ−３７１；Ｑ−４３〜Ｌ−３７１；Ｖ−
４４〜Ｌ−３７１；Ｔ−４５〜Ｌ−３７１；Ｗ−４６〜Ｌ−３７１；Ｎ−４７〜
Ｌ−３７１；Ａ−４８〜Ｌ−３７１；Ｓ−４９〜Ｌ−３７１；Ｋ−５０〜Ｌ−３
７１；Ｙ−５１〜Ｌ−３７１；Ｓ−５２〜Ｌ−３７１；Ｒ−５３〜Ｌ−３７１；
Ｔ−５４〜Ｌ−３７１；Ｎ−５５〜Ｌ−３７１；Ｌ−５６〜Ｌ−３７１；Ｔ−５
７〜Ｌ−３７１；Ｆ−５８〜Ｌ−３７１；Ｈ−５９〜Ｌ−３７１；Ｙ−６０〜Ｌ
−３７１；Ｒ−６１〜Ｌ−３７１；Ｆ−６２〜Ｌ−３７１；Ｎ−６３〜Ｌ−３７
１；Ｇ−６４〜Ｌ−３７１；Ｄ−６５〜Ｌ−３７１；Ｅ−６６〜Ｌ−３７１；Ａ
−６７〜Ｌ−３７１；Ｙ−６８〜Ｌ−３７１；Ｄ−６９〜Ｌ−３７１；Ｑ−７０
〜Ｌ−３７１；Ｃ−７１〜Ｌ−３７１；Ｔ−７２〜Ｌ−３７１；Ｎ−７３〜Ｌ−
３７１；Ｙ−７４〜Ｌ−３７１；Ｌ−７５〜Ｌ−３７１；Ｌ−７６〜Ｌ−３７１
；Ｑ−７７〜Ｌ−３７１；Ｅ−７８〜Ｌ−３７１；Ｇ−７９〜Ｌ−３７１；Ｈ−
８０〜Ｌ−３７１；Ｔ−８１〜Ｌ−３７１；Ｓ−８２〜Ｌ−３７１；Ｇ−８３〜
Ｌ−３７１；Ｃ−８４〜Ｌ−３７１；Ｌ−８５〜Ｌ−３７１；Ｌ−８６〜Ｌ−３
７１；Ｄ−８７〜Ｌ−３７１；Ａ−８８〜Ｌ−３７１；Ｅ−８９〜Ｌ−３７１；
Ｑ−９０〜Ｌ−３７１；Ｒ−９１〜Ｌ−３７１；Ｄ−９２〜Ｌ−３７１；Ｄ−９
３〜Ｌ−３７１；Ｉ−９４〜Ｌ−３７１；Ｌ−９５〜Ｌ−３７１；Ｙ−９６〜Ｌ
−３７１；Ｆ−９７〜Ｌ−３７１；Ｓ−９８〜Ｌ−３７１；Ｉ−９９〜Ｌ−３７
１；Ｒ−１００〜Ｌ−３７１；Ｎ−１０１〜Ｌ−３７１；Ｇ−１０２〜Ｌ−３７
１；Ｔ−１０３〜Ｌ−３７１；Ｈ−１０４〜Ｌ−３７１；Ｐ−１０５〜Ｌ−３７
１；Ｖ−１０６〜Ｌ−３７１；Ｆ−１０７〜Ｌ−３７１；Ｔ−１０８〜Ｌ−３７
１；Ａ−１０９〜Ｌ−３７１；Ｓ−１１０〜Ｌ−３７１；Ｒ−１１１〜Ｌ−３７
１；Ｗ−１１２〜Ｌ−３７１；Ｍ−１１３〜Ｌ−３７１；Ｖ−１１４〜Ｌ−３７
１；Ｙ−１１５〜Ｌ−３７１；Ｙ−１１６〜Ｌ−３７１；Ｌ−１１７〜Ｌ−３７
１；Ｋ−１１８〜Ｌ−３７１；Ｐ−１１９〜Ｌ−３７１；Ｓ−１２０〜Ｌ−３７
１；Ｓ−１２１〜Ｌ−３７１；Ｐ−１２２〜Ｌ−３７１；Ｋ−１２３〜Ｌ−３７
１；Ｈ−１２４〜Ｌ−３７１；Ｖ−１２５〜Ｌ−３７１；Ｒ−１２６〜Ｌ−３７
１；Ｆ−１２７〜Ｌ−３７１；Ｓ−１２８〜Ｌ−３７１；Ｗ−１２９〜Ｌ−３７
１；Ｈ−１３０〜Ｌ−３７１；Ｑ−１３１〜Ｌ−３７１；Ｄ−１３２〜Ｌ−３７
１；Ａ−１３３〜Ｌ−３７１；Ｖ−１３４〜Ｌ−３７１；Ｔ−１３５〜Ｌ−３７
１；Ｖ−１３６〜Ｌ−３７１；Ｔ−１３７〜Ｌ−３７１；Ｃ−１３８〜Ｌ−３７
１；Ｓ−１３９〜Ｌ−３７１；Ｄ−１４０〜Ｌ−３７１；Ｌ−１４１〜Ｌ−３７
１；Ｓ−１４２〜Ｌ−３７１；Ｙ−１４３〜Ｌ−３７１；Ｇ−１４４〜Ｌ−３７
１；Ｄ−１４５〜Ｌ−３７１；Ｌ−１４６〜Ｌ−３７１；Ｌ−１４７〜Ｌ−３７
１；Ｙ−１４８〜Ｌ−３７１；Ｅ−１４９〜Ｌ−３７１；Ｖ−１５０〜Ｌ−３７
１；Ｑ−１５１〜Ｌ−３７１；Ｙ−１５２〜Ｌ−３７１；Ｒ−１５３〜Ｌ−３７
１；Ｓ−１５４〜Ｌ−３７１；Ｐ−１５５〜Ｌ−３７１；Ｆ−１５６〜Ｌ−３７
１；Ｄ−１５７〜Ｌ−３７１；Ｔ−１５８〜Ｌ−３７１；Ｅ−１５９〜Ｌ−３７
１；Ｗ−１６０〜Ｌ−３７１；Ｑ−１６１〜Ｌ−３７１；Ｓ−１６２〜Ｌ−３７
１；Ｋ−１６３〜Ｌ−３７１；Ｑ−１６４〜Ｌ−３７１；Ｅ−１６５〜Ｌ−３７
１；Ｎ−１６６〜Ｌ−３７１；Ｔ−１６７〜Ｌ−３７１；Ｃ−１６８〜Ｌ−３７
１；Ｎ−１６９〜Ｌ−３７１；Ｖ−１７０〜Ｌ−３７１；Ｔ−１７１〜Ｌ−３７
１；Ｉ−１７２〜Ｌ−３７１；Ｅ−１７３〜Ｌ−３７１；Ｇ−１７４〜Ｌ−３７
１；Ｌ−１７５〜Ｌ−３７１；Ｄ−１７６〜Ｌ−３７１；Ａ−１７７〜Ｌ−３７
１；Ｅ−１７８〜Ｌ−３７１；Ｋ−１７９〜Ｌ−３７１；Ｃ−１８０〜Ｌ−３７
１；Ｙ−１８１〜Ｌ−３７１；Ｓ−１８２〜Ｌ−３７１；Ｆ−１８３〜Ｌ−３７
１；Ｗ−１８４〜Ｌ−３７１；Ｖ−１８５〜Ｌ−３７１；Ｒ−１８６〜Ｌ−３７
１；Ｖ−１８７〜Ｌ−３７１；Ｋ−１８８〜Ｌ−３７１；Ａ−１８９〜Ｌ−３７
１；Ｍ−１９０〜Ｌ−３７１；Ｅ−１９１〜Ｌ−３７１；Ｄ−１９２〜Ｌ−３７
１；Ｖ−１９３〜Ｌ−３７１；Ｙ−１９４〜Ｌ−３７１；Ｇ−１９５〜Ｌ−３７
１；Ｐ−１９６〜Ｌ−３７１；Ｄ−１９７〜Ｌ−３７１；Ｔ−１９８〜Ｌ−３７
１；Ｙ−１９９〜Ｌ−３７１；Ｐ−２００〜Ｌ−３７１；Ｓ−２０１〜Ｌ−３７
１；Ｄ−２０２〜Ｌ−３７１；Ｗ−２０３〜Ｌ−３７１；Ｓ−２０４〜Ｌ−３７
１；Ｅ−２０５〜Ｌ−３７１；Ｖ−２０６〜Ｌ−３７１；Ｔ−２０７〜Ｌ−３７
１；Ｃ−２０８〜Ｌ−３７１；Ｗ−２０９〜Ｌ−３７１；Ｑ−２１０〜Ｌ−３７
１；Ｒ−２１１〜Ｌ−３７１；Ｇ−２１２〜Ｌ−３７１；Ｅ−２１３〜Ｌ−３７
１；Ｉ−２１４〜Ｌ−３７１；Ｒ−２１５〜Ｌ−３７１；Ｄ−２１６〜Ｌ−３７
１；Ａ−２１７〜Ｌ−３７１；Ｃ−２１８〜Ｌ−３７１；Ａ−２１９〜Ｌ−３７
１；Ｅ−２２０〜Ｌ−３７１；Ｔ−２２１〜Ｌ−３７１；Ｐ−２２２〜Ｌ−３７
１；Ｔ−２２３〜Ｌ−３７１；Ｐ−２２４〜Ｌ−３７１；Ｐ−２２５〜Ｌ−３７
１；Ｋ−２２６〜Ｌ−３７１；Ｐ−２２７〜Ｌ−３７１；Ｋ−２２８〜Ｌ−３７
１；Ｌ−２２９〜Ｌ−３７１；Ｓ−２３０〜Ｌ−３７１；Ｋ−２３１〜Ｌ−３７
１；Ｆ−２３２〜Ｌ−３７１；Ｉ−２３３〜Ｌ−３７１；Ｌ−２３４〜Ｌ−３７
１；Ｉ−２３５〜Ｌ−３７１；Ｓ−２３６〜Ｌ−３７１；Ｓ−２３７〜Ｌ−３７
１；Ｌ−２３８〜Ｌ−３７１；Ａ−２３９〜Ｌ−３７１；Ｉ−２４０〜Ｌ−３７
１；Ｌ−２４１〜Ｌ−３７１；Ｌ−２４２〜Ｌ−３７１；Ｍ−２４３〜Ｌ−３７
１；Ｖ−２４４〜Ｌ−３７１；Ｓ−２４５〜Ｌ−３７１；Ｌ−２４６〜Ｌ−３７
１；Ｌ−２４７〜Ｌ−３７１；Ｌ−２４８〜Ｌ−３７１；Ｌ−２４９〜Ｌ−３７
１；Ｓ−２５０〜Ｌ−３７１；Ｌ−２５１〜Ｌ−３７１；Ｗ−２５２〜Ｌ−３７
１；Ｋ−２５３〜Ｌ−３７１；Ｌ−２５４〜Ｌ−３７１；Ｗ−２５５〜Ｌ−３７
１；Ｒ−２５６〜Ｌ−３７１；Ｖ−２５７〜Ｌ−３７１；Ｋ−２５８〜Ｌ−３７
１；Ｋ−２５９〜Ｌ−３７１；Ｆ−２６０〜Ｌ−３７１；Ｌ−２６１〜Ｌ−３７
１；Ｉ−２６２〜Ｌ−３７１；Ｐ−２６３〜Ｌ−３７１；Ｓ−２６４〜Ｌ−３７
１；Ｖ−２６５〜Ｌ−３７１；Ｐ−２６６〜Ｌ−３７１；Ｄ−２６７〜Ｌ−３７
１；Ｐ−２６８〜Ｌ−３７１；Ｋ−２６９〜Ｌ−３７１；Ｓ−２７０〜Ｌ−３７
１；Ｉ−２７１〜Ｌ−３７１；Ｆ−２７２〜Ｌ−３７１；Ｐ−２７３〜Ｌ−３７
１；Ｇ−２７４〜Ｌ−３７１；Ｌ−２７５〜Ｌ−３７１；Ｆ−２７６〜Ｌ−３７
１；Ｅ−２７７〜Ｌ−３７１；Ｉ−２７８〜Ｌ−３７１；Ｈ−２７９〜Ｌ−３７
１；Ｑ−２８０〜Ｌ−３７１；Ｇ−２８１〜Ｌ−３７１；Ｎ−２８２〜Ｌ−３７
１；Ｆ−２８３〜Ｌ−３７１；Ｑ−２８４〜Ｌ−３７１；Ｅ−２８５〜Ｌ−３７
１；Ｗ−２８６〜Ｌ−３７１；Ｉ−２８７〜Ｌ−３７１；Ｔ−２８８〜Ｌ−３７
１；Ｄ−２８９〜Ｌ−３７１；Ｔ−２９０〜Ｌ−３７１；Ｑ−２９１〜Ｌ−３７
１；Ｎ−２９２〜Ｌ−３７１；Ｖ−２９３〜Ｌ−３７１；Ａ−２９４〜Ｌ−３７
１；Ｈ−２９５〜Ｌ−３７１；Ｌ−２９６〜Ｌ−３７１；Ｈ−２９７〜Ｌ−３７
１；Ｋ−２９８〜Ｌ−３７１；Ｍ−２９９〜Ｌ−３７１；Ａ−３００〜Ｌ−３７
１；Ｇ−３０１〜Ｌ−３７１；Ａ−３０２〜Ｌ−３７１；Ｅ−３０３〜Ｌ−３７
１；Ｑ−３０４〜Ｌ−３７１；Ｅ−３０５〜Ｌ−３７１；Ｓ−３０６〜Ｌ−３７
１；Ｇ−３０７〜Ｌ−３７１；Ｐ−３０８〜Ｌ−３７１；Ｅ−３０９〜Ｌ−３７
１；Ｅ−３１０〜Ｌ−３７１；Ｐ−３１１〜Ｌ−３７１；Ｌ−３１２〜Ｌ−３７
１；Ｖ−３１３〜Ｌ−３７１；Ｖ−３１４〜Ｌ−３７１；Ｑ−３１５〜Ｌ−３７
１；Ｌ−３１６〜Ｌ−３７１；Ａ−３１７〜Ｌ−３７１；Ｋ−３１８〜Ｌ−３７
１；Ｔ−３１９〜Ｌ−３７１；Ｅ−３２０〜Ｌ−３７１；Ａ−３２１〜Ｌ−３７
１；Ｅ−３２２〜Ｌ−３７１；Ｓ−３２３〜Ｌ−３７１；Ｐ−３２４〜Ｌ−３７
１；Ｒ−３２５〜Ｌ−３７１；Ｍ−３２６〜Ｌ−３７１；Ｌ−３２７〜Ｌ−３７
１；Ｄ−３２８〜Ｌ−３７１；Ｐ−３２９〜Ｌ−３７１；Ｑ−３３０〜Ｌ−３７
１；Ｔ−３３１〜Ｌ−３７１；Ｅ−３３２〜Ｌ−３７１；Ｅ−３３３〜Ｌ−３７
１；Ｋ−３３４〜Ｌ−３７１；Ｅ−３３５〜Ｌ−３７１；Ａ−３３６〜Ｌ−３７
１；Ｓ−３３７〜Ｌ−３７１；Ｇ−３３８〜Ｌ−３７１；Ｇ−３３９〜Ｌ−３７
１；Ｓ−３４０〜Ｌ−３７１；Ｌ−３４１〜Ｌ−３７１；Ｑ−３４２〜Ｌ−３７
１；Ｌ−３４３〜Ｌ−３７１；Ｐ−３４４〜Ｌ−３７１；Ｈ−３４５〜Ｌ−３７
１；Ｑ−３４６〜Ｌ−３７１；Ｐ−３４７〜Ｌ−３７１；Ｌ−３４８〜Ｌ−３７
１；Ｑ−３４９〜Ｌ−３７１；Ｇ−３５０〜Ｌ−３７１；Ｇ−３５１〜Ｌ−３７
１；Ｄ−３５２〜Ｌ−３７１；Ｖ−３５３〜Ｌ−３７１；Ｖ−３５４〜Ｌ−３７
１；Ｔ−３５５〜Ｌ−３７１；Ｉ−３５６〜Ｌ−３７１；Ｇ−３５７〜Ｌ−３７
１；Ｇ−３５８〜Ｌ−３７１；Ｆ−３５９〜Ｌ−３７１；Ｔ−３６０〜Ｌ−３７
１；Ｆ−３６１〜Ｌ−３７１；Ｖ−３６２〜Ｌ−３７１；Ｍ−３６３〜Ｌ−３７
１；Ｎ−３６４〜Ｌ−３７１；Ｄ−３６５〜Ｌ−３７１；Ｒ−３６６〜Ｌ−３７
１。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ
る。

【０１０５】 また上記のように、１以上のアミノ酸の、タンパク質のＣ末端からの欠失が、
このタンパク質の１以上の生物学的機能の欠失という改変を生じたとしても、他
の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体を形成する能力、ＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチドリガンドと結合する能力）はなお、維持され得る。例えば、ポリペプチ
ドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／またはこれに結合す
る短縮化ＣＲＣＧＣＬムテインの能力は、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプ
チドの過半数の残基より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合、一般に維持
される。完全ポリペプチドのＣ末端残基を欠失する特定のポリペプチドが、この
ような免疫学的活性を維持するか否かは、本明細書中で記載されるかそうでなけ
れば当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多くの欠失さ
れたＣ末端アミノ酸残基を有するＣＲＣＧＣＬムテインが、幾らかの生物学的活
性または免疫学的活性を維持し得ることは、ありそうにないわけではない。実際
に、わずか６ＣＲＣＧＣＬアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば、
免疫応答を引き起こし得る。

【０１０６】 従って、本発明はさらに、一般式１−ｎ（ここで、ｎは２〜３７１の整数であ
り、ｎは、配列番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する）で記載され
るように、図１Ａ〜１Ｂに示されるＣＲＣＧＣＬポリペプチドのアミノ酸配列（
配列番号２）のカルボキシ末端から欠失した１つ以上の残基を有するポリペプチ
ドを提供する。さらに詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドを含む、配列番号２として示される本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドのＣ末端欠失の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２のＭ−１〜Ａ−３
７０；Ｍ−１〜Ｖ−３６９；Ｍ−１〜Ｙ−３６８；Ｍ−１〜Ｓ−３６７；Ｍ−１
〜Ｒ−３６６；Ｍ−１〜Ｄ−３６５；Ｍ−１〜Ｎ−３６４；Ｍ−１〜Ｍ−３６３
；Ｍ−１〜Ｖ−３６２；Ｍ−１〜Ｆ−３６１；Ｍ−１〜Ｔ−３６０；Ｍ−１〜Ｆ
−３５９；Ｍ−１〜Ｇ−３５８；Ｍ−１〜Ｇ−３５７；Ｍ−１〜Ｉ−３５６；Ｍ
−１〜Ｔ−３５５；Ｍ−１〜Ｖ−３５４；Ｍ−１〜Ｖ−３５３；Ｍ−１〜Ｄ−３
５２；Ｍ−１〜Ｇ−３５１；Ｍ−１〜Ｇ−３５０；Ｍ−１〜Ｑ−３４９；Ｍ−１
〜Ｌ−３４８；Ｍ−１〜Ｐ−３４７；Ｍ−１〜Ｑ−３４６；Ｍ−１〜Ｈ−３４５
；Ｍ−１〜Ｐ−３４４；Ｍ−１〜Ｌ−３４３；Ｍ−１〜Ｑ−３４２；Ｍ−１〜Ｌ
−３４１；Ｍ−１〜Ｓ−３４０；Ｍ−１〜Ｇ−３３９；Ｍ−１〜Ｇ−３３８；Ｍ
−１〜Ｓ−３３７；Ｍ−１〜Ａ−３３６；Ｍ−１〜Ｅ−３３５；Ｍ−１〜Ｋ−３
３４；Ｍ−１〜Ｅ−３３３；Ｍ−１〜Ｅ−３３２；Ｍ−１〜Ｔ−３３１；Ｍ−１
〜Ｑ−３３０；Ｍ−１〜Ｐ−３２９；Ｍ−１〜Ｄ−３２８；Ｍ−１〜Ｌ−３２７
；Ｍ−１〜Ｍ−３２６；Ｍ−１〜Ｒ−３２５；Ｍ−１〜Ｐ−３２４；Ｍ−１〜Ｓ
−３２３；Ｍ−１〜Ｅ−３２２；Ｍ−１〜Ａ−３２１；Ｍ−１〜Ｅ−３２０；Ｍ
−１〜Ｔ−３１９；Ｍ−１〜Ｋ−３１８；Ｍ−１〜Ａ−３１７；Ｍ−１〜Ｌ−３
１６；Ｍ−１〜Ｑ−３１５；Ｍ−１〜Ｖ−３１４；Ｍ−１〜Ｖ−３１３；Ｍ−１
〜Ｌ−３１２；Ｍ−１〜Ｐ−３１１；Ｍ−１〜Ｅ−３１０；Ｍ−１〜Ｅ−３０９
；Ｍ−１〜Ｐ−３０８；Ｍ−１〜Ｇ−３０７；Ｍ−１〜Ｓ−３０６；Ｍ−１〜Ｅ
−３０５；Ｍ−１〜Ｑ−３０４；Ｍ−１〜Ｅ−３０３；Ｍ−１〜Ａ−３０２；Ｍ
−１〜Ｇ−３０１；Ｍ−１〜Ａ−３００；Ｍ−１〜Ｍ−２９９；Ｍ−１〜Ｋ−２
９８；Ｍ−１〜Ｈ−２９７；Ｍ−１〜Ｌ−２９６；Ｍ−１〜Ｈ−２９５；Ｍ−１
〜Ａ−２９４；Ｍ−１〜Ｖ−２９３；Ｍ−１〜Ｎ−２９２；Ｍ−１〜Ｑ−２９１
；Ｍ−１〜Ｔ−２９０；Ｍ−１〜Ｄ−２８９；Ｍ−１〜Ｔ−２８８；Ｍ−１〜Ｉ
−２８７；Ｍ−１〜Ｗ−２８６；Ｍ−１〜Ｅ−２８５；Ｍ−１〜Ｑ−２８４；Ｍ
−１〜Ｆ−２８３；Ｍ−１〜Ｎ−２８２；Ｍ−１〜Ｇ−２８１；Ｍ−１〜Ｑ−２
８０；Ｍ−１〜Ｈ−２７９；Ｍ−１〜Ｉ−２７８；Ｍ−１〜Ｅ−２７７；Ｍ−１
〜Ｆ−２７６；Ｍ−１〜Ｌ−２７５；Ｍ−１〜Ｇ−２７４；Ｍ−１〜Ｐ−２７３
；Ｍ−１〜Ｆ−２７２；Ｍ−１〜Ｉ−２７１；Ｍ−１〜Ｓ−２７０；Ｍ−１〜Ｋ
−２６９；Ｍ−１〜Ｐ−２６８；Ｍ−１〜Ｄ−２６７；Ｍ−１〜Ｐ−２６６；Ｍ
−１〜Ｖ−２６５；Ｍ−１〜Ｓ−２６４；Ｍ−１〜Ｐ−２６３；Ｍ−１〜Ｉ−２
６２；Ｍ−１〜Ｌ−２６１；Ｍ−１〜Ｆ−２６０；Ｍ−１〜Ｋ−２５９；Ｍ−１
〜Ｋ−２５８；Ｍ−１〜Ｖ−２５７；Ｍ−１〜Ｒ−２５６；Ｍ−１〜Ｗ−２５５
；Ｍ−１〜Ｌ−２５４；Ｍ−１〜Ｋ−２５３；Ｍ−１〜Ｗ−２５２；Ｍ−１〜Ｌ
−２５１；Ｍ−１〜Ｓ−２５０；Ｍ−１〜Ｌ−２４９；Ｍ−１〜Ｌ−２４８；Ｍ
−１〜Ｌ−２４７；Ｍ−１〜Ｌ−２４６；Ｍ−１〜Ｓ−２４５；Ｍ−１〜Ｖ−２
４４；Ｍ−１〜Ｍ−２４３；Ｍ−１〜Ｌ−２４２；Ｍ−１〜Ｌ−２４１；Ｍ−１
〜Ｉ−２４０；Ｍ−１〜Ａ−２３９；Ｍ−１〜Ｌ−２３８；Ｍ−１〜Ｓ−２３７
；Ｍ−１〜Ｓ−２３６；Ｍ−１〜Ｉ−２３５；Ｍ−１〜Ｌ−２３４；Ｍ−１〜Ｉ
−２３３；Ｍ−１〜Ｆ−２３２；Ｍ−１〜Ｋ−２３１；Ｍ−１〜Ｓ−２３０；Ｍ
−１〜Ｌ−２２９；Ｍ−１〜Ｋ−２２８；Ｍ−１〜Ｐ−２２７；Ｍ−１〜Ｋ−２
２６；Ｍ−１〜Ｐ−２２５；Ｍ−１〜Ｐ−２２４；Ｍ−１〜Ｔ−２２３；Ｍ−１
〜Ｐ−２２２；Ｍ−１〜Ｔ−２２１；Ｍ−１〜Ｅ−２２０；Ｍ−１〜Ａ−２１９
；Ｍ−１〜Ｃ−２１８；Ｍ−１〜Ａ−２１７；Ｍ−１〜Ｄ−２１６；Ｍ−１〜Ｒ
−２１５；Ｍ−１〜Ｉ−２１４；Ｍ−１〜Ｅ−２１３；Ｍ−１〜Ｇ−２１２；Ｍ
−１〜Ｒ−２１１；Ｍ−１〜Ｑ−２１０；Ｍ−１〜Ｗ−２０９；Ｍ−１〜Ｃ−２
０８；Ｍ−１〜Ｔ−２０７；Ｍ−１〜Ｖ−２０６；Ｍ−１〜Ｅ−２０５；Ｍ−１
〜Ｓ−２０４；Ｍ−１〜Ｗ−２０３；Ｍ−１〜Ｄ−２０２；Ｍ−１〜Ｓ−２０１
；Ｍ−１〜Ｐ−２００；Ｍ−１〜Ｙ−１９９；Ｍ−１〜Ｔ−１９８；Ｍ−１〜Ｄ
−１９７；Ｍ−１〜Ｐ−１９６；Ｍ−１〜Ｇ−１９５；Ｍ−１〜Ｙ−１９４；Ｍ
−１〜Ｖ−１９３；Ｍ−１〜Ｄ−１９２；Ｍ−１〜Ｅ−１９１；Ｍ−１〜Ｍ−１
９０；Ｍ−１〜Ａ−１８９；Ｍ−１〜Ｋ−１８８；Ｍ−１〜Ｖ−１８７；Ｍ−１
〜Ｒ−１８６；Ｍ−１〜Ｖ−１８５；Ｍ−１〜Ｗ−１８４；Ｍ−１〜Ｆ−１８３
；Ｍ−１〜Ｓ−１８２；Ｍ−１〜Ｙ−１８１；Ｍ−１〜Ｃ−１８０；Ｍ−１〜Ｋ
−１７９；Ｍ−１〜Ｅ−１７８；Ｍ−１〜Ａ−１７７；Ｍ−１〜Ｄ−１７６；Ｍ
−１〜Ｌ−１７５；Ｍ−１〜Ｇ−１７４；Ｍ−１〜Ｅ−１７３；Ｍ−１〜Ｉ−１
７２；Ｍ−１〜Ｔ−１７１；Ｍ−１〜Ｖ−１７０；Ｍ−１〜Ｎ−１６９；Ｍ−１
〜Ｃ−１６８；Ｍ−１〜Ｔ−１６７；Ｍ−１〜Ｎ−１６６；Ｍ−１〜Ｅ−１６５
；Ｍ−１〜Ｑ−１６４；Ｍ−１〜Ｋ−１６３；Ｍ−１〜Ｓ−１６２；Ｍ−１〜Ｑ
−１６１；Ｍ−１〜Ｗ−１６０；Ｍ−１〜Ｅ−１５９；Ｍ−１〜Ｔ−１５８；Ｍ
−１〜Ｄ−１５７；Ｍ−１〜Ｆ−１５６；Ｍ−１〜Ｐ−１５５；Ｍ−１〜Ｓ−１
５４；Ｍ−１〜Ｒ−１５３；Ｍ−１〜Ｙ−１５２；Ｍ−１〜Ｑ−１５１；Ｍ−１
〜Ｖ−１５０；Ｍ−１〜Ｅ−１４９；Ｍ−１〜Ｙ−１４８；Ｍ−１〜Ｌ−１４７
；Ｍ−１〜Ｌ−１４６；Ｍ−１〜Ｄ−１４５；Ｍ−１〜Ｇ−１４４；Ｍ−１〜Ｙ
−１４３；Ｍ−１〜Ｓ−１４２；Ｍ−１〜Ｌ−１４１；Ｍ−１〜Ｄ−１４０；Ｍ
−１〜Ｓ−１３９；Ｍ−１〜Ｃ−１３８；Ｍ−１〜Ｔ−１３７；Ｍ−１〜Ｖ−１
３６；Ｍ−１〜Ｔ−１３５；Ｍ−１〜Ｖ−１３４；Ｍ−１〜Ａ−１３３；Ｍ−１
〜Ｄ−１３２；Ｍ−１〜Ｑ−１３１；Ｍ−１〜Ｈ−１３０；Ｍ−１〜Ｗ−１２９
；Ｍ−１〜Ｓ−１２８；Ｍ−１〜Ｆ−１２７；Ｍ−１〜Ｒ−１２６；Ｍ−１〜Ｖ
−１２５；Ｍ−１〜Ｈ−１２４；Ｍ−１〜Ｋ−１２３；Ｍ−１〜Ｐ−１２２；Ｍ
−１〜Ｓ−１２１；Ｍ−１〜Ｓ−１２０；Ｍ−１〜Ｐ−１１９；Ｍ−１〜Ｋ−１
１８；Ｍ−１〜Ｌ−１１７；Ｍ−１〜Ｙ−１１６；Ｍ−１〜Ｙ−１１５；Ｍ−１
〜Ｖ−１１４；Ｍ−１〜Ｍ−１１３；Ｍ−１〜Ｗ−１１２；Ｍ−１〜Ｒ−１１１
；Ｍ−１〜Ｓ−１１０；Ｍ−１〜Ａ−１０９；Ｍ−１〜Ｔ−１０８；Ｍ−１〜Ｆ
−１０７；Ｍ−１〜Ｖ−１０６；Ｍ−１〜Ｐ−１０５；Ｍ−１〜Ｈ−１０４；Ｍ
−１〜Ｔ−１０３；Ｍ−１〜Ｇ−１０２；Ｍ−１〜Ｎ−１０１；Ｍ−１〜Ｒ−１
００；Ｍ−１〜Ｉ−９９；Ｍ−１〜Ｓ−９８；Ｍ−１〜Ｆ−９７；Ｍ−１〜Ｙ−
９６；Ｍ−１〜Ｌ−９５；Ｍ−１〜Ｉ−９４；Ｍ−１〜Ｄ−９３；Ｍ−１〜Ｄ−
９２；Ｍ−１〜Ｒ−９１；Ｍ−１〜Ｑ−９０；Ｍ−１〜Ｅ−８９；Ｍ−１〜Ａ−
８８；Ｍ−１〜Ｄ−８７；Ｍ−１〜Ｌ−８６；Ｍ−１〜Ｌ−８５；Ｍ−１〜Ｃ−
８４；Ｍ−１〜Ｇ−８３；Ｍ−１〜Ｓ−８２；Ｍ−１〜Ｔ−８１；Ｍ−１〜Ｈ−
８０；Ｍ−１〜Ｇ−７９；Ｍ−１〜Ｅ−７８；Ｍ−１〜Ｑ−７７；Ｍ−１〜Ｌ−
７６；Ｍ−１〜Ｌ−７５；Ｍ−１〜Ｙ−７４；Ｍ−１〜Ｎ−７３；Ｍ−１〜Ｔ−
７２；Ｍ−１〜Ｃ−７１；Ｍ−１〜Ｑ−７０；Ｍ−１〜Ｄ−６９；Ｍ−１〜Ｙ−
６８；Ｍ−１〜Ａ−６７；Ｍ−１〜Ｅ−６６；Ｍ−１〜Ｄ−６５；Ｍ−１〜Ｇ−
６４；Ｍ−１〜Ｎ−６３；Ｍ−１〜Ｆ−６２；Ｍ−１〜Ｒ−６１；Ｍ−１〜Ｙ−
６０；Ｍ−１〜Ｈ−５９；Ｍ−１〜Ｆ−５８；Ｍ−１〜Ｔ−５７；Ｍ−１〜Ｌ−
５６；Ｍ−１〜Ｎ−５５；Ｍ−１〜Ｔ−５４；Ｍ−１〜Ｒ−５３；Ｍ−１〜Ｓ−
５２；Ｍ−１〜Ｙ−５１；Ｍ−１〜Ｋ−５０；Ｍ−１〜Ｓ−４９；Ｍ−１〜Ａ−
４８；Ｍ−１〜Ｎ−４７；Ｍ−１〜Ｗ−４６；Ｍ−１〜Ｔ−４５；Ｍ−１〜Ｖ−
４４；Ｍ−１〜Ｑ−４３；Ｍ−１〜Ｖ−４２；Ｍ−１〜Ｔ−４１；Ｍ−１〜Ｅ−
４０；Ｍ−１〜Ｌ−３９；Ｍ−１〜Ｎ−３８；Ｍ−１〜Ｆ−３７；Ｍ−１〜Ｙ−
３６；Ｍ−１〜Ｉ−３５；Ｍ−１〜Ｉ−３４；Ｍ−１〜Ｑ−３３；Ｍ−１〜Ｉ−
３２；Ｍ−１〜Ｑ−３１；Ｍ−１〜Ｖ−３０；Ｍ−１〜Ｇ−２９；Ｍ−１〜Ｅ−
２８；Ｍ−１〜Ａ−２７；Ｍ−１〜Ａ−２６；Ｍ−１〜Ｇ−２５；Ｍ−１〜Ｇ−
２４；Ｍ−１〜Ｑ−２３；Ｍ−１〜Ｇ−２２；Ｍ−１〜Ｌ−２１；Ｍ−１〜Ａ−
２０；Ｍ−１〜Ｍ−１９；Ｍ−１〜Ｗ−１８；Ｍ−１〜Ｇ−１７；Ｍ−１〜Ｇ−
１６；Ｍ−１〜Ｌ−１５；Ｍ−１〜Ｌ−１４；Ｍ−１〜Ｆ−１３；Ｍ−１〜Ｖ−
１２；Ｍ−１〜Ａ−１１；Ｍ−１〜Ａ−１０；Ｍ−１〜Ｇ−９；Ｍ−１〜Ｗ−８
；Ｍ−１〜Ｌ−７。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
本発明に含まれる。

【０１０７】 さらに、上記のＮ末端またはＣ末端欠失のいずれかは、Ｎ末端およびＣ末端を
欠失したＣＲＣＧＣＬポリペプチドを生じるように組み合わせら得る。本発明は
また、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方を欠失した１以上のアミノ酸を有
するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、配列番号２の残基ｍ−ｎを有
するとして一般的に記載され得、ここで、ｎおよびｍは、上記されるような整数
である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に
含まれる。

【０１０８】 従って、配列番号２の可溶性ドメインを含むＮ末端欠失変異体もまた企図され
、そしてこれは、一般式ｍ¹−２３１によって記載され得、ここで、ｍ¹は、２〜
２２６の整数であり、ｍ¹は、配列番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対
応する。さらに詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを含む、配列番号２として示される本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドのＮ
末端欠失の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２のＧ−２〜Ｋ−２３１；
Ｒ−３〜Ｋ−２３１；Ｌ−４〜Ｋ−２３１；Ｖ−５〜Ｋ−２３１；Ｌ−６〜Ｋ−
２３１；Ｌ−７〜Ｋ−２３１；Ｗ−８〜Ｋ−２３１；Ｇ−９〜Ｋ−２３１；Ａ−
１０〜Ｋ−２３１；Ａ−１１〜Ｋ−２３１；Ｖ−１２〜Ｋ−２３１；Ｆ−１３〜
Ｋ−２３１；Ｌ−１４〜Ｋ−２３１；Ｌ−１５〜Ｋ−２３１；Ｇ−１６〜Ｋ−２
３１；Ｇ−１７〜Ｋ−２３１；Ｗ−１８〜Ｋ−２３１；Ｍ−１９〜Ｋ−２３１；
Ａ−２０〜Ｋ−２３１；Ｌ−２１〜Ｋ−２３１；Ｇ−２２〜Ｋ−２３１；Ｑ−２
３〜Ｋ−２３１；Ｇ−２４〜Ｋ−２３１；Ｇ−２５〜Ｋ−２３１；Ａ−２６〜Ｋ
−２３１；Ａ−２７〜Ｋ−２３１；Ｅ−２８〜Ｋ−２３１；Ｇ−２９〜Ｋ−２３
１；Ｖ−３０〜Ｋ−２３１；Ｑ−３１〜Ｋ−２３１；Ｉ−３２〜Ｋ−２３１；Ｑ
−３３〜Ｋ−２３１；Ｉ−３４〜Ｋ−２３１；Ｉ−３５〜Ｋ−２３１；Ｙ−３６
〜Ｋ−２３１；Ｆ−３７〜Ｋ−２３１；Ｎ−３８〜Ｋ−２３１；Ｌ−３９〜Ｋ−
２３１；Ｅ−４０〜Ｋ−２３１；Ｔ−４１〜Ｋ−２３１；Ｖ−４２〜Ｋ−２３１
；Ｑ−４３〜Ｋ−２３１；Ｖ−４４〜Ｋ−２３１；Ｔ−４５〜Ｋ−２３１；Ｗ−
４６〜Ｋ−２３１；Ｎ−４７〜Ｋ−２３１；Ａ−４８〜Ｋ−２３１；Ｓ−４９〜
Ｋ−２３１；Ｋ−５０〜Ｋ−２３１；Ｙ−５１〜Ｋ−２３１；Ｓ−５２〜Ｋ−２
３１；Ｒ−５３〜Ｋ−２３１；Ｔ−５４〜Ｋ−２３１；Ｎ−５５〜Ｋ−２３１；
Ｌ−５６〜Ｋ−２３１；Ｔ−５７〜Ｋ−２３１；Ｆ−５８〜Ｋ−２３１；Ｈ−５
９〜Ｋ−２３１；Ｙ−６０〜Ｋ−２３１；Ｒ−６１〜Ｋ−２３１；Ｆ−６２〜Ｋ
−２３１；Ｎ−６３〜Ｋ−２３１；Ｇ−６４〜Ｋ−２３１；Ｄ−６５〜Ｋ−２３
１；Ｅ−６６〜Ｋ−２３１；Ａ−６７〜Ｋ−２３１；Ｙ−６８〜Ｋ−２３１；Ｄ
−６９〜Ｋ−２３１；Ｑ−７０〜Ｋ−２３１；Ｃ−７１〜Ｋ−２３１；Ｔ−７２
〜Ｋ−２３１；Ｎ−７３〜Ｋ−２３１；Ｙ−７４〜Ｋ−２３１；Ｌ−７５〜Ｋ−
２３１；Ｌ−７６〜Ｋ−２３１；Ｑ−７７〜Ｋ−２３１；Ｅ−７８〜Ｋ−２３１
；Ｇ−７９〜Ｋ−２３１；Ｈ−８０〜Ｋ−２３１；Ｔ−８１〜Ｋ−２３１；Ｓ−
８２〜Ｋ−２３１；Ｇ−８３〜Ｋ−２３１；Ｃ−８４〜Ｋ−２３１；Ｌ−８５〜
Ｋ−２３１；Ｌ−８６〜Ｋ−２３１；Ｄ−８７〜Ｋ−２３１；Ａ−８８〜Ｋ−２
３１；Ｅ−８９〜Ｋ−２３１；Ｑ−９０〜Ｋ−２３１；Ｒ−９１〜Ｋ−２３１；
Ｄ−９２〜Ｋ−２３１；Ｄ−９３〜Ｋ−２３１；Ｉ−９４〜Ｋ−２３１；Ｌ−９
５〜Ｋ−２３１；Ｙ−９６〜Ｋ−２３１；Ｆ−９７〜Ｋ−２３１；Ｓ−９８〜Ｋ
−２３１；Ｉ−９９〜Ｋ−２３１；Ｒ−１００〜Ｋ−２３１；Ｎ−１０１〜Ｋ−
２３１；Ｇ−１０２〜Ｋ−２３１；Ｔ−１０３〜Ｋ−２３１；Ｈ−１０４〜Ｋ−
２３１；Ｐ−１０５〜Ｋ−２３１；Ｖ−１０６〜Ｋ−２３１；Ｆ−１０７〜Ｋ−
２３１；Ｔ−１０８〜Ｋ−２３１；Ａ−１０９〜Ｋ−２３１；Ｓ−１１０〜Ｋ−
２３１；Ｒ−１１１〜Ｋ−２３１；Ｗ−１１２〜Ｋ−２３１；Ｍ−１１３〜Ｋ−
２３１；Ｖ−１１４〜Ｋ−２３１；Ｙ−１１５〜Ｋ−２３１；Ｙ−１１６〜Ｋ−
２３１；Ｌ−１１７〜Ｋ−２３１；Ｋ−１１８〜Ｋ−２３１；Ｐ−１１９〜Ｋ−
２３１；Ｓ−１２０〜Ｋ−２３１；Ｓ−１２１〜Ｋ−２３１；Ｐ−１２２〜Ｋ−
２３１；Ｋ−１２３〜Ｋ−２３１；Ｈ−１２４〜Ｋ−２３１；Ｖ−１２５〜Ｋ−
２３１；Ｒ−１２６〜Ｋ−２３１；Ｆ−１２７〜Ｋ−２３１；Ｓ−１２８〜Ｋ−
２３１；Ｗ−１２９〜Ｋ−２３１；Ｈ−１３０〜Ｋ−２３１；Ｑ−１３１〜Ｋ−
２３１；Ｄ−１３２〜Ｋ−２３１；Ａ−１３３〜Ｋ−２３１；Ｖ−１３４〜Ｋ−
２３１；Ｔ−１３５〜Ｋ−２３１；Ｖ−１３６〜Ｋ−２３１；Ｔ−１３７〜Ｋ−
２３１；Ｃ−１３８〜Ｋ−２３１；Ｓ−１３９〜Ｋ−２３１；Ｄ−１４０〜Ｋ−
２３１；Ｌ−１４１〜Ｋ−２３１；Ｓ−１４２〜Ｋ−２３１；Ｙ−１４３〜Ｋ−
２３１；Ｇ−１４４〜Ｋ−２３１；Ｄ−１４５〜Ｋ−２３１；Ｌ−１４６〜Ｋ−
２３１；Ｌ−１４７〜Ｋ−２３１；Ｙ−１４８〜Ｋ−２３１；Ｅ−１４９〜Ｋ−
２３１；Ｖ−１５０〜Ｋ−２３１；Ｑ−１５１〜Ｋ−２３１；Ｙ−１５２〜Ｋ−
２３１；Ｒ−１５３〜Ｋ−２３１；Ｓ−１５４〜Ｋ−２３１；Ｐ−１５５〜Ｋ−
２３１；Ｆ−１５６〜Ｋ−２３１；Ｄ−１５７〜Ｋ−２３１；Ｔ−１５８〜Ｋ−
２３１；Ｅ−１５９〜Ｋ−２３１；Ｗ−１６０〜Ｋ−２３１；Ｑ−１６１〜Ｋ−
２３１；Ｓ−１６２〜Ｋ−２３１；Ｋ−１６３〜Ｋ−２３１；Ｑ−１６４〜Ｋ−
２３１；Ｅ−１６５〜Ｋ−２３１；Ｎ−１６６〜Ｋ−２３１；Ｔ−１６７〜Ｋ−
２３１；Ｃ−１６８〜Ｋ−２３１；Ｎ−１６９〜Ｋ−２３１；Ｖ−１７０〜Ｋ−
２３１；Ｔ−１７１〜Ｋ−２３１；Ｉ−１７２〜Ｋ−２３１；Ｅ−１７３〜Ｋ−
２３１；Ｇ−１７４〜Ｋ−２３１；Ｌ−１７５〜Ｋ−２３１；Ｄ−１７６〜Ｋ−
２３１；Ａ−１７７〜Ｋ−２３１；Ｅ−１７８〜Ｋ−２３１；Ｋ−１７９〜Ｋ−
２３１；Ｃ−１８０〜Ｋ−２３１；Ｙ−１８１〜Ｋ−２３１；Ｓ−１８２〜Ｋ−
２３１；Ｆ−１８３〜Ｋ−２３１；Ｗ−１８４〜Ｋ−２３１；Ｖ−１８５〜Ｋ−
２３１；Ｒ−１８６〜Ｋ−２３１；Ｖ−１８７〜Ｋ−２３１；Ｋ−１８８〜Ｋ−
２３１；Ａ−１８９〜Ｋ−２３１；Ｍ−１９０〜Ｋ−２３１；Ｅ−１９１〜Ｋ−
２３１；Ｄ−１９２〜Ｋ−２３１；Ｖ−１９３〜Ｋ−２３１；Ｙ−１９４〜Ｋ−
２３１；Ｇ−１９５〜Ｋ−２３１；Ｐ−１９６〜Ｋ−２３１；Ｄ−１９７〜Ｋ−
２３１；Ｔ−１９８〜Ｋ−２３１；Ｙ−１９９〜Ｋ−２３１；Ｐ−２００〜Ｋ−
２３１；Ｓ−２０１〜Ｋ−２３１；Ｄ−２０２〜Ｋ−２３１；Ｗ−２０３〜Ｋ−
２３１；Ｓ−２０４〜Ｋ−２３１；Ｅ−２０５〜Ｋ−２３１；Ｖ−２０６〜Ｋ−
２３１；Ｔ−２０７〜Ｋ−２３１；Ｃ−２０８〜Ｋ−２３１；Ｗ−２０９〜Ｋ−
２３１；Ｑ−２１０〜Ｋ−２３１；Ｒ−２１１〜Ｋ−２３１；Ｇ−２１２〜Ｋ−
２３１；Ｅ−２１３〜Ｋ−２３１；Ｉ−２１４〜Ｋ−２３１；Ｒ−２１５〜Ｋ−
２３１；Ｄ−２１６〜Ｋ−２３１；Ａ−２１７〜Ｋ−２３１；Ｃ−２１８〜Ｋ−
２３１；Ａ−２１９〜Ｋ−２３１；Ｅ−２２０〜Ｋ−２３１；Ｔ−２２１〜Ｋ−
２３１；Ｐ−２２２〜Ｋ−２３１；Ｔ−２２３〜Ｋ−２３１；Ｐ−２２４〜Ｋ−
２３１；Ｐ−２２５〜Ｋ−２３１；Ｋ−２２６〜Ｋ−２３１。これらのポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。

【０１０９】 さらに、配列番号２の可溶性ドメインを含むＣ末端欠失変異体がまた意図され
、一般式２３−ｎ¹によって記載され得、ここで、ｎ¹は、２９〜２３０の整数で
あり、ここで、ｎ¹は、配列番号２において同定されるアミノ酸残基の位置に対
応する。本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む配列番
号２として示される本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドの可溶性ドメインのＣ末
端欠失の残基のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを包含する：配列番号２のＱ−２３〜Ｓ−２３０；
Ｑ−２３〜Ｌ−２２９；Ｑ−２３〜Ｋ−２２８；Ｑ−２３〜Ｐ−２２７；Ｑ−２
３〜Ｋ−２２６；Ｑ−２３〜Ｐ−２２５；Ｑ−２３〜Ｐ−２２４；Ｑ−２３〜Ｔ
−２２３；Ｑ−２３〜Ｐ−２２２；Ｑ−２３〜Ｔ−２２１；Ｑ−２３〜Ｅ−２２
０；Ｑ−２３〜Ａ−２１９；Ｑ−２３〜Ｃ−２１８；Ｑ−２３〜Ａ−２１７；Ｑ
−２３〜Ｄ−２１６；Ｑ−２３〜Ｒ−２１５；Ｑ−２３〜Ｉ−２１４；Ｑ−２３
〜Ｅ−２１３；Ｑ−２３〜Ｇ−２１２；Ｑ−２３〜Ｒ−２１１；Ｑ−２３〜Ｑ−
２１０；Ｑ−２３〜Ｗ−２０９；Ｑ−２３〜Ｃ−２０８；Ｑ−２３〜Ｔ−２０７
；Ｑ−２３〜Ｖ−２０６；Ｑ−２３〜Ｅ−２０５；Ｑ−２３〜Ｓ−２０４；Ｑ−
２３〜Ｗ−２０３；Ｑ−２３〜Ｄ−２０２；Ｑ−２３〜Ｓ−２０１；Ｑ−２３〜
Ｐ−２００；Ｑ−２３〜Ｙ−１９９；Ｑ−２３〜Ｔ−１９８；Ｑ−２３〜Ｄ−１
９７；Ｑ−２３〜Ｐ−１９６；Ｑ−２３〜Ｇ−１９５；Ｑ−２３〜Ｙ−１９４；
Ｑ−２３〜Ｖ−１９３；Ｑ−２３〜Ｄ−１９２；Ｑ−２３〜Ｅ−１９１；Ｑ−２
３〜Ｍ−１９０；Ｑ−２３〜Ａ−１８９；Ｑ−２３〜Ｋ−１８８；Ｑ−２３〜Ｖ
−１８７；Ｑ−２３〜Ｒ−１８６；Ｑ−２３〜Ｖ−１８５；Ｑ−２３〜Ｗ−１８
４；Ｑ−２３〜Ｆ−１８３；Ｑ−２３〜Ｓ−１８２；Ｑ−２３〜Ｙ−１８１；Ｑ
−２３〜Ｃ−１８０；Ｑ−２３〜Ｋ−１７９；Ｑ−２３〜Ｅ−１７８；Ｑ−２３
〜Ａ−１７７；Ｑ−２３〜Ｄ−１７６；Ｑ−２３〜Ｌ−１７５；Ｑ−２３〜Ｇ−
１７４；Ｑ−２３〜Ｅ−１７３；Ｑ−２３〜Ｉ−１７２；Ｑ−２３〜Ｔ−１７１
；Ｑ−２３〜Ｖ−１７０；Ｑ−２３〜Ｎ−１６９；Ｑ−２３〜Ｃ−１６８；Ｑ−
２３〜Ｔ−１６７；Ｑ−２３〜Ｎ−１６６；Ｑ−２３〜Ｅ−１６５；Ｑ−２３〜
Ｑ−１６４；Ｑ−２３〜Ｋ−１６３；Ｑ−２３〜Ｓ−１６２；Ｑ−２３〜Ｑ−１
６１；Ｑ−２３〜Ｗ−１６０；Ｑ−２３〜Ｅ−１５９；Ｑ−２３〜Ｔ−１５８；
Ｑ−２３〜Ｄ−１５７；Ｑ−２３〜Ｆ−１５６；Ｑ−２３〜Ｐ−１５５；Ｑ−２
３〜Ｓ−１５４；Ｑ−２３〜Ｒ−１５３；Ｑ−２３〜Ｙ−１５２；Ｑ−２３〜Ｑ
−１５１；Ｑ−２３〜Ｖ−１５０；Ｑ−２３〜Ｅ−１４９；Ｑ−２３〜Ｙ−１４
８；Ｑ−２３〜Ｌ−１４７；Ｑ−２３〜Ｌ−１４６；Ｑ−２３〜Ｄ−１４５；Ｑ
−２３〜Ｇ−１４４；Ｑ−２３〜Ｙ−１４３；Ｑ−２３〜Ｓ−１４２；Ｑ−２３
〜Ｌ−１４１；Ｑ−２３〜Ｄ−１４０；Ｑ−２３〜Ｓ−１３９；Ｑ−２３〜Ｃ−
１３８；Ｑ−２３〜Ｔ−１３７；Ｑ−２３〜Ｖ−１３６；Ｑ−２３〜Ｔ−１３５
；Ｑ−２３〜Ｖ−１３４；Ｑ−２３〜Ａ−１３３；Ｑ−２３〜Ｄ−１３２；Ｑ−
２３〜Ｑ−１３１；Ｑ−２３〜Ｈ−１３０；Ｑ−２３〜Ｗ−１２９；Ｑ−２３〜
Ｓ−１２８；Ｑ−２３〜Ｆ−１２７；Ｑ−２３〜Ｒ−１２６；Ｑ−２３〜Ｖ−１
２５；Ｑ−２３〜Ｈ−１２４；Ｑ−２３〜Ｋ−１２３；Ｑ−２３〜Ｐ−１２２；
Ｑ−２３〜Ｓ−１２１；Ｑ−２３〜Ｓ−１２０；Ｑ−２３〜Ｐ−１１９；Ｑ−２
３〜Ｋ−１１８；Ｑ−２３〜Ｌ−１１７；Ｑ−２３〜Ｙ−１１６；Ｑ−２３〜Ｙ
−１１５；Ｑ−２３〜Ｖ−１１４；Ｑ−２３〜Ｍ−１１３；Ｑ−２３〜Ｗ−１１
２；Ｑ−２３〜Ｒ−１１１；Ｑ−２３〜Ｓ−１１０；Ｑ−２３〜Ａ−１０９；Ｑ
−２３〜Ｔ−１０８；Ｑ−２３〜Ｆ−１０７；Ｑ−２３〜Ｖ−１０６；Ｑ−２３
〜Ｐ−１０５；Ｑ−２３〜Ｈ−１０４；Ｑ−２３〜Ｔ−１０３；Ｑ−２３〜Ｇ−
１０２；Ｑ−２３〜Ｎ−１０１；Ｑ−２３〜Ｒ−１００；Ｑ−２３〜Ｉ−９９；
Ｑ−２３〜Ｓ−９８；Ｑ−２３〜Ｆ−９７；Ｑ−２３〜Ｙ−９６；Ｑ−２３〜Ｌ
−９５；Ｑ−２３〜Ｉ−９４；Ｑ−２３〜Ｄ−９３；Ｑ−２３〜Ｄ−９２；Ｑ−
２３〜Ｒ−９１；Ｑ−２３〜Ｑ−９０；Ｑ−２３〜Ｅ−８９；Ｑ−２３〜Ａ−８
８；Ｑ−２３〜Ｄ−８７；Ｑ−２３〜Ｌ−８６；Ｑ−２３〜Ｌ−８５；Ｑ−２３
〜Ｃ−８４；Ｑ−２３〜Ｇ−８３；Ｑ−２３〜Ｓ−８２；Ｑ−２３〜Ｔ−８１；
Ｑ−２３〜Ｈ−８０；Ｑ−２３〜Ｇ−７９；Ｑ−２３〜Ｅ−７８；Ｑ−２３〜Ｑ
−７７；Ｑ−２３〜Ｌ−７６；Ｑ−２３〜Ｌ−７５；Ｑ−２３〜Ｙ−７４；Ｑ−
２３〜Ｎ−７３；Ｑ−２３〜Ｔ−７２；Ｑ−２３〜Ｃ−７１；Ｑ−２３〜Ｑ−７
０；Ｑ−２３〜Ｄ−６９；Ｑ−２３〜Ｙ−６８；Ｑ−２３〜Ａ−６７；Ｑ−２３
〜Ｅ−６６；Ｑ−２３〜Ｄ−６５；Ｑ−２３〜Ｇ−６４；Ｑ−２３〜Ｎ−６３；
Ｑ−２３〜Ｆ−６２；Ｑ−２３〜Ｒ−６１；Ｑ−２３〜Ｙ−６０；Ｑ−２３〜Ｈ
−５９；Ｑ−２３〜Ｆ−５８；Ｑ−２３〜Ｔ−５７；Ｑ−２３〜Ｌ−５６；Ｑ−
２３〜Ｎ−５５；Ｑ−２３〜Ｔ−５４；Ｑ−２３〜Ｒ−５３；Ｑ−２３〜Ｓ−５
２；Ｑ−２３〜Ｙ−５１；Ｑ−２３〜Ｋ−５０；Ｑ−２３〜Ｓ−４９；Ｑ−２３
〜Ａ−４８；Ｑ−２３〜Ｎ−４７；Ｑ−２３〜Ｗ−４６；Ｑ−２３〜Ｔ−４５；
Ｑ−２３〜Ｖ−４４；Ｑ−２３〜Ｑ−４３；Ｑ−２３〜Ｖ−４２；Ｑ−２３〜Ｔ
−４１；Ｑ−２３〜Ｅ−４０；Ｑ−２３〜Ｌ−３９；Ｑ−２３〜Ｎ−３８；Ｑ−
２３〜Ｆ−３７；Ｑ−２３〜Ｙ−３６；Ｑ−２３〜Ｉ−３５；Ｑ−２３〜Ｉ−３
４；Ｑ−２３〜Ｑ−３３；Ｑ−２３〜Ｉ−３２；Ｑ−２３〜Ｑ−３１；Ｑ−２３
〜Ｖ−３０；Ｑ−２３〜Ｇ−２９。これらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドがまた本発明に包含される。

【０１１０】 さらに、シグナル配列がこれらのＣ末端構築物に付加され得る。例えば、配列
番号２のアミノ酸１〜２２、配列番号２のアミノ酸２〜２２、配列番号２のアミ
ノ酸３〜２２、配列番号２のアミノ酸４〜２２、配列番号２のアミノ酸５〜２２
、配列番号２のアミノ酸６〜２２、配列番号２のアミノ酸７〜２２、配列番号２
のアミノ酸８〜２２、配列番号２のアミノ酸９〜２２、配列番号２のアミノ酸１
０〜２２、配列番号２のアミノ酸１１〜２２、配列番号２のアミノ酸１２〜２２
、配列番号２のアミノ酸１３〜２２、配列番号２のアミノ酸１４〜２２、配列番
号２のアミノ酸１５〜２２、配列番号２のアミノ酸１６〜２２、配列番号２のア
ミノ酸１７〜２２、配列番号２のアミノ酸１８〜２２、配列番号２のアミノ酸１
９〜２２、配列番号２のアミノ酸２０〜２２、または配列番号２のアミノ酸２１
〜２２が上に列挙されたそれぞれのＣ末端構築物のＮ末端に付加され得る。

【０１１１】 また、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６４１または２０９６９１に含まれるｃＤＮＡ
クローンによってコードされる完全なＣＲＣＧＣＬアミノ酸配列の一部からなる
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれ、ここでこの部分は、ＡＴ
ＣＣ寄託番号２０９６４１または２０９６９１に含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端から１〜約３６１のアミノ酸
の任意の整数のアミノ酸残基を除外するか、またはカルボキシ末端から１〜約３
６１のアミノ酸の任意の整数のアミノ酸残基を除外するか、あるいは、ＡＴＣＣ
寄託番号２０９６４１または２０９６９１に含まれるｃＤＮＡクローンによって
コードされる完全なアミノ酸配列の上記アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失
の任意の組み合わせである。上記欠失変異のポリペプチド形態の全てをコードす
るポリヌクレオチドがまた提供される。

【０１１２】 本出願はまた、本明細書中ｍ−ｎで記載されるＣＲＣＧＣＬポリペプチド配列
と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であ
るポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態において、本出願
は、本明細書中に記載される特定のＣＲＣＧＣＬ Ｎ末端およびＣ末端欠失のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に関する。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。

【０１１３】 本発明の特に好ましいフラグメントには、ＣＲＣＧＣＬの構造的または機能的
寄与によって特徴付けられるフラグメントがある。このようなフラグメントには
、以下を含むアミノ酸残基が挙げられる：完全（すなわち、全長）ＣＲＣＧＣＬ
（配列番号２）のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α−領域」
）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびター
ン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」
）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域
、ならびに高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラム
のデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメータを使用して同定されるように、１．
５より大きいかまたは１．５に等しい抗原性指標を有する４つ以上の隣接したア
ミノ酸を含む）。特定の好ましい領域は、図３に示される領域であり、そして図
１Ａ−１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される、
上述のタイプの領域を含むが、これらに限定されない。このような好ましい配列
は、以下を含む：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ予測α−領域、β−領域、ター
ン領域、およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測α−領域、β−領域、
ターン領域、およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ予測親水性領域
および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表
面形成領域；ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域（これは、こ
れらのコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを使用して予測された）
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって
包含される。

【０１１４】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＣＲＣＧＣＬの機
能的寄与をコードする。これに関して本発明の好ましい実施形態は、以下を含む
かまたは以下からなるフラグメントを含む：ＣＲＣＧＣＬのαへリックスおよび
αへリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域
（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイル
およびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親
媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域および高度抗原性指標領
域。

【０１１５】 上記のように、図１Ａ−１Ｂおよび／または表１に示されるＣＲＣＧＣＬの構
造的もしくは機能的特性を表わすデータを、デフォルトパラメータに設定される
ＤＮＡ^*ＳＴＡＲの種々の同定されたモジュールおよびアルゴリズムを使用して
、作製した。好ましい実施形態において、表１の欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、
およびＸＩＶに示されるデータを使用して、抗原性について高度な可能性を示す
ＣＲＣＧＣＬの領域を決定し得る。高抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開
始のプロセスにおいて生じ得る環境で、ポリペプチドの表面におそらく曝露され
るポリペプチドの領域を示す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ
ＩＩＩ、および／またはＩＶに示されるデータから決定される。

【０１１６】 これらに関して特定の好ましい領域は、図３にて示されるが、表１に示される
ように、図３に示されるデータの表形式において表され得るか、または同定され
得る。図３（最初のデフォルトパラメータに対して設定される）を作製するため
に使用されるＤＮＡ^*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムを使用して、表形式（
表１を参照のこと）の図３においてデータを示した。図３におけるデータの表形
式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る。

【０１１７】 図３および表１に示される上記の好ましい領域は、図１Ａ−１Ｂに示されるア
ミノ酸配列の分析によって同定される上記の型の領域を含むが、これらに限定さ
れない。図３および表１に示されるように、そのような好ましい領域は、Ｇａｒ
ｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−
領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ α−領域、β−領域、およびコイル−領域、Ｋ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ
α−両親媒性領域およびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ β−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌ
ｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、および高抗原性指標
のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域を含む。

【０１１８】

【表１】 この点について、非常に好ましいフラグメントには、上記において記載された
いくつかの特徴のような、いくつかの構造的特徴を組み合わせるＣＲＣＧＣＬの
領域を含むフラグメントがある。

【０１１９】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＣＲＣＧＣＬフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの活性に類
似するが、必ずしも同一ではない、活性を示すフラグメントである。フラグメン
トの生物学的な活性には、改善された望ましい活性、または減少された望ましく
ない活性が挙げられる。

【０１２０】 しかし、ＥＳＴ配列のような多くのポリヌクレオチド配列は、配列データベー
スを介して公に利用可能でありアクセス可能である。これらの配列のいくつかは
、配列番号１に関連し、そして本発明の概念の前に公に利用可能であったかもし
れない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲か
ら特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。本発明の１つの
実施形態は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ９１５５３（本明細書中においてその全
体において参考として援用される）が除外される。さらに、好ましくは、本発明
からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番
号１の１〜１５５９の任意の整数であり、ｂは１５〜１５７３の整数であり、こ
こでａおよびｂの両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し
、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが
除外される。

【０１２１】 （エピトープおよび抗体） 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あ
るいはＡＴＣＣ寄託番号２０９６９１もしくは２０９６４１に含まれるポリヌク
レオチド配列によってコードされるか、または配列番号１またはＡＴＣＣ寄託番
号２０９６９１もしくは２０９６４１の配列の相補鎖に、上記で規定されたよう
なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低いストリン
ジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、あるいはそ
れらからなるポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列
のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号2に開示さ
れる配列）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖の
ポリヌクレオチド配列、および上記で規定されたストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション
条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。

【０１２２】 本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺
乳動物、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有
するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピト
ープを含むポリペプチドならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを包含する。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物に
おいて抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知
の任意の方法（例えば、以下に記載された抗体作製の方法）によって測定された
。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の任意の方法（例え
ば、本明細書中に記載されたイムノアッセイ）によって測定されるように、抗体
がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫
特異的な結合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応
性を除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を必要とはし
ない。

【０１２３】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６３１，２１
１号にさらに記載される）を参照のこと）。

【０１２４】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なく
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。好ましいポ
リペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、
５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００
アミノ酸残基長の免疫原性エピトープあるいは抗原性エピトープを含む。さらな
る非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書で開示された抗原性エピト
ープ、ならびにそれらの一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、このエピト
ープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有
用である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書に開示された抗原性エピトー
プ、ならびにこれらの抗原性エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の
組み合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイの標的分子として使用
され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９
８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１
９８３）を参照のこと）。

【０１２５】 同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に
従って抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓ
ｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６
６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピト
ープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性
エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上
の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、ア
ルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を
惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十分に長い場合で
は（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリアなしで提示され
得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、
変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を惹
起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにお
いて）。

【０１２６】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔ
ｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を
参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し
得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソ
イド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイン
トアジュバントまたは免疫応答を刺激すると知られる任意の他のアジュバントを
含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブー
スター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週
間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離の
ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の
血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で
周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出に
よる）により上昇し得る。

【０１２７】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）と融合さ
れ得、キメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易
にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリ
ペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されてい
る。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，
３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。免疫系に対して上皮障害を横切
る抗原の増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結
合パートナーへ結合された抗原（例えば、インシュリン）について実証された（
例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４および同ＷＯ９９／０４８１３を参照
のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因するジスルフィド結合二量体構
造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフ
ラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であるこ
とが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープを
コードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タ
グまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子と組換えられ、発現さ
れたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ
らによって記載される系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融合タンパク質の
容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において
、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドへサブクローン化され、その結果
、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からな
るアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融合タンパク質について
の基質結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて
感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へ
ロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を
用いて選択的に溶出され得る。

【０１２８】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
方法を使用することにより、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこ
れらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には
、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３
０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、
ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ
およびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３
（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によってその全体に
おいて参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番
号１に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポリヌクレ
オチド配列において変化を生じるように２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブ
ルすることを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはそ
のコードされるポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏ
ｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダム変異
誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクシ
ョン、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の、１つ以上
の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換え
られ得る。

【０１２９】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２の改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、
免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち
、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グ
ロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラ
スであり得る。特定の実施形態では、本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１
である。別の特定の実施形態では、本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ４で
ある。

【０１３０】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのア
ミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは
１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因
性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、およ
び例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号
において記載のような）を含む。

【０１３１】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。

【０１３２】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。

【０１３３】 本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載されるか、または特定化さ
れ得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチド
に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも
８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも
６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の
方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有する
ポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態におい
て、本発明の抗体は、ヒトタンパク質の、マウスホモログ、ラットホモログおよ
び／またはウサギホモログならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する
。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％
未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５
０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方
法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本
発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に
開示された、任意の単一特異的な抗原性または免疫原性ポリペプチド、あるいは
２、３、４、５以上の特異的抗原性および／または免疫原生ポリペプチドの組み
合わせに関する。さらに本発明には、（本明細書中に記載されるような）ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗
体が含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するその結合親
和性によって記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０ ^-2 Ｍ、１０^-2Ｍ、５×１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１０^-4Ｍ、５×１０ ^-5 Ｍ、１０^-5Ｍ、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０ ^-8 Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１
０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、
５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、または１０^-15Ｍ未満の解離定数す
なわちＫ_dを有する結合親和性が挙げられる。

【０１３４】 本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定される際の、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なく
とも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なく
とも６０％、または少なくとも５０％、エピトープに対する結合を競合的に阻害
する。

【０１３５】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンドと本発明のポリペプ
チド部分または全体のいずれかとの相互作用を途絶させる抗体を含む。好ましく
は、本発明の抗体は、本明細書中で開示される抗原性エピトープまたはその一部
に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方
を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を妨げないがレセプターの活性化を
妨げるレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプターの活性化（すなわち、
シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分野で
公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、レセプター
のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいは（例えば、
上記に記載されたような）免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によるその
基質を検出することによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の非
存在下での活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少
なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、ま
たは少なくとも５０％、リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体が提
供される。

【０１３６】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるＣＲＣＧ
ＣＬ特異的抗体、ならびにＣＲＣＧＣＬ−リガンド複合体（例えば、ＴＳＬＰに
結合したＣＲＣＧＣＬ）を認識し、そして、好ましくは、結合していないレセプ
ターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しない抗体の特徴とする。同
様に、本発明には、リガンド（例えば、ＴＳＬＰ）に結合し、そしてリガンドの
レセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによっ
てＣＲＣＧＣＬ活性化を妨げるが、リガンドがＣＲＣＧＣＬに結合することは妨
げない抗体が含まれる。さらに本発明に含まれるのは、ＣＲＣＧＣＬを活性化す
る抗体である。これらの抗体は、レセプターアゴニストのように作用し得、すな
わち、リガンド媒介のレセプター活性化の生物学的活性の全体またはサブセット
（ｓｕｂｓｅｔ）のいずれかを、例えば、ＣＲＣＧＣＬの二量化、またはヘテロ
二量体化（例えば、異種ポリペプチド（例えば、ＩＬ−７レセプターα鎖）との
ＣＲＣＧＣＬの二量体化）を誘導することによって増強または活性化する。この
抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特定の生物学的活性を含む
生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはインバース（ｉｎｖｅ
ｒｓｅ）アゴニストとして特定化され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野
で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１
；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１
９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１
６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉ
ｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１
９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３
−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（
１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏ
ｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献はすべて、本
明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０１３７】 本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法
ならびに治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化する
のために使用され得るが、これに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的
サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定す
るためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９
８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。

【０１３８】 以下により詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組
成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端も
しくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプ
チドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）さ
れ得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子
およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または
毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０
８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１
４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。

【０１３９】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨が
ないような抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含む
。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル
化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ
）、アミド化、公知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）に
よる誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質へ
の連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、
特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを
含むが、これらに限定されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導
体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【０１４０】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバント
が、免疫学的応答を増加させるために使用され得、宿主種に依存し、そしてフロ
イント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉ
ｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール
リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−
ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜
在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなア
ジュバントはまた、当該分野で周知である。

【０１４１】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクロ
ーナル抗体が生成される方法ではない。

【０１４２】 ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、慣用的であり、そして当該分野に周知であり、そして実施例（例えば、実施
例１６）に詳細に議論される。非限定的な例においては、マウスは、本発明のポ
リペプチドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一
旦免疫応答が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出
される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周
知の技術によって任意の適切なメラノーマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能
な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限定希釈によっ
て選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリ
ペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について当該分野で公知の方法によっ
てアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌ
ｕｉｄ）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによ
って、産生され得る。

【０１４３】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、産生す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞を用
いた本発明の抗原と免疫させたマウスから単離された脾細胞とを融合させること
によって、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリド
ーマクローンについての融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングする
ことによって産生される。

【０１４４】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって産生さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。

【０１４５】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特に、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナト
リアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合
ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメイ
ンを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識
した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または補足された抗原を使用する
）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子
ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え
的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメイ
ンを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状フ
ァージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製す
るために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示され
る方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇ
ｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅ
ｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４
）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０
２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１
８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２
０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９
号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，
９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５
７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第
５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号
および同第５，９６９，１０８号（上記の参考文献は、本明細書中でその全体が
参考として援用される）。

【０１４６】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを作製するために単離されそして用いられ得、そして（例えば、以下
に詳細が記載されるように）哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作製するための技術はまた、当該
分野で公知の方法を用いて使用され得る。このような方法は、例えば、以下に開
示される：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗ
ａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は
、その全体が参考として援用される）。

【０１４７】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を作製するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗体に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための
ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば
、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ．ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと。これらはそれらの全
体が参考として本明細書中に援用される）。抗体は、以下を含む当該分野で公知
の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３
９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５
３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉ
ｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８
（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ
９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａ
ｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。

【０１４８】 完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は
、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得、これらの方法としては、ヒ
ト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプ
レイ方法が挙げられる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６
，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３
、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ
９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体が
参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。

【０１４９】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。この改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞
に微量注入して、キメラマウスを産生する。次に、このキメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部
）を用いて通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従
来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ
得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間のトランスジェニック
マウスの再編成によってかくまわれ（ｈａｒｂｏｒｅｄ）、そしてその後、クラ
ススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によ
って、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の
産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏ
ｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５
−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産
生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコール
の詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２
／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０
５９８ ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号
；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０
１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８
５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を
参照のこと（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。さら
に、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａ
ｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を
用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。

【０１５０】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。

【０１５１】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために
順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照
のこと）。例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する
結合を競合的に阻害する抗体を用いて、このポリペプチドのマルチマー化および
／または結合ドメインを「模倣し」、そして結果として、ポリペプチドおよび／
またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを生成し得る。
このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフ
ラグメントは、治療レジメンにおいて使用されて、ポリペプチドリガンドを中和
し得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペ
プチドを結合し得るか、そして／またはそのリガンド／レセプターを結合し得、
それによって、その生物学的活性をブロックし得る。

【０１５２】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（
例えば、上記のような）、抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドへ特異的に
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号２のアミ
ノ酸配列を有するポリヌクレオチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチ
ド、に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。

【０１５３】 当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得
、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば
、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレ
オチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例え
ば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９
４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部
分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチド
のアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴ
ヌクレオチドの増幅を含む。

【０１５４】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブ
ラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体
の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブ
ラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））を、例
えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定す
るために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プラ
イマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣ
Ｒによって作製された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法
を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。

【０１５５】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。

【０１５６】 特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列
は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために、当該分野で周知の方法
、例えば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列を比較して、配
列超可変性領域を決定する方法、によって、調べられ得る。慣用的組換えＤＮＡ
技術を使用して、一つ以上のＣＤＲが、フレームワーク領域内、例えば、上記の
ように、非ヒト抗体をヒト化させるためにヒトフレームワーク領域内に挿入され
得る。このフレームワーク領域は、天然に存在、または共通するフレームワーク
領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレ
ームワーク領域の一覧については、例えばＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ． ２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フ
レームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生成するポリヌクレオチドは、
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上で
考察したように、一つ以上のアミノ酸の置換は、フレームワーク領域内で起こり
、そして好ましくは、このアミノ酸置換は、その抗原への抗体の結合を改善する
。さらに、このような方法は、アミノ酸置換させるため、または鎖内ジスルフィ
ド結合に参加している一つ以上の可変領域システイン残基を欠失させて、一つ以
上の鎖内ジスルフィド結合が欠けた抗体分子を生成させるために、使用され得る
。ポリペプチドに対する他の改変は、本発明および当該分野の技術によって達成
される。

【０１５７】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、スプライシングすることによる、「
キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：
４５２−４５４（１９８５））の産生のために開発された技術が、使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物の種に由来する分子（
例えばマウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有
する分子）であり、例えばヒト化抗体である。

【０１５８】 あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６
，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９９８）；
Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８
７９−５８８３（１９９８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４
４−５４（１９８９））は、一本鎖抗体を産生するために適合され得る。一本鎖
抗体は、アミノ酸架橋を介して、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結
し、一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおけ
る機能的Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。

【０１５９】 （抗体産生の方法） 本発明の抗体は、抗体の合成について当該技術分野で公知の方法によって、特
に化学合成によって、または好ましくは組換え発現技術によって、産生され得る
。

【０１６０】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現は
、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。
本発明の、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの部分（好ま
しくは重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチド
が一旦得られれば、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術
を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、ヌクレオチド配列
をコードする抗体を含むポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製する
ための方法は、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、抗体コード配
列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するた
めに使用され得る。これらの方法は、例えば，インビトロ組換えＤＮＡ技術、合
成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。従って、本発明は、本発明の抗体
分子をコードするヌクレオチド配列、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはプロ
モーターに作動可能に連結された、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、を含む複
製可能ベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコー
ドするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ８６／０５８
０７号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２
２，４６４号を参照のこと。）、そして、この抗体の可変領域は、重鎖または軽
鎖の全体の発現のためにこのようなベクター内にクローニングされ得る。

【０１６１】 発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、次いでトランスフ
ェクト細胞は、従来の技術によって本発明の抗体を産生するために培養される。
従って、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその重
鎖もしくは軽鎖、または異種のプロモーターに作動可能に連結された、本発明の
一本鎖抗体を含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態
では、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記の詳細のように、免
疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞において共発現され得る。

【０１６２】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベク
ター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用い
て形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のよう
な微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換され
た酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコード
する配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感
染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイ
クウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞
系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、
Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム
に由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳
動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保
有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞
）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そして
より好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組
換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由
来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされ
た、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗
体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０
１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（
１９９０））。

【０１６３】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク
質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクタ
ーには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列が
ｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）
で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８
３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ
＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１
９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるため
に使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶
解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および
結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る
。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、Ｇ
ＳＴ部分から放出され得る。

【０１６４】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。

【０１６５】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ
ー、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。

【０１６６】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。

【０１６７】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生のために、安定発現が好ましい。例え
ば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含
む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例
えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル
化部位、など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され
得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増
殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける
選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染
色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度は
クローニングし得、細胞株に拡大され得ることを可能にする。この方法は、抗体
分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作
された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリ
ーニングおよび評価において、特に有用であり得る。

【０１６８】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０
２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８
に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−
５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９
１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉ
ｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１
９９３）；Ｍａｙ、１９９３年、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１
５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓ
ａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術
の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用
され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋ
ｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、
ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。

【０１６９】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。

【０１７０】 宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチ
ドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る
。

【０１７１】 一旦、本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成される
か、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子
の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換
、アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティ
ーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、
またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る
。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるか
またはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合さ
れ得、精製を容易にする。

【０１７２】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞型に対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が
使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、イン
ビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使
用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１
２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ
．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌ
ｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。こ
れらは、その全体が参考として援用される。

【０１７３】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。

【０１７４】 上で考察されたように、配列番号２のポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメン
ト、または変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半
減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫アッセイに
おいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに、配
列番号２に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して、精
製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２
つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の
種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，８２
７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）
）。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合また
は結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタン
パク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効
率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：
３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は
、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学
的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質
が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望
ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、
Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈＩ
Ｌ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するため
の高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されて
きた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。

【０１７５】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキ
サ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用
な別のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエ
ピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ３７：７６７（１
９８４））、および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これに限定されない。

【０１７６】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン
の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進行をモニターするた
めに、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と連結させること
によって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子
団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮
影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオン、が挙げられる
。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）に対して直接的、ま
たは間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する媒介物（例えば、当
該分野で公知のリンカー）を介して、連結または結合され得る。例えば、本発明
に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属イオンに関しては、
米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ま
たはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例とし
ては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適
切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイ
ン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例として
は、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシ
フェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放射性物質の例として
は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。

【０１７７】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ））に結合され得る。細胞毒また
は細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を含む。例としては、パ
クリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、
臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎ
ｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビ
シン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ
ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ア
クチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカ
イン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン
、ならびにこれらのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮
抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン
、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、
クロルメチン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ
）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン
（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブ
スルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、
ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、ア
ントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびド
キソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシ
ン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒ
ａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン
およびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。

【０１７８】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス剤（例
えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９
号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照の
こと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１
０５号））、血栓症剤もしくは抗脈管形成剤（例えば、アンジオスタチンもしく
はエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インタ
ーロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、イ
ンターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他
の増殖因子）、が挙げられ得る。

【０１７９】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。

【０１８０】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。

【０１８１】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。

【０１８２】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。

【０１８３】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために使
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて使用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。

【０１８４】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。

【０１８５】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射性アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ
免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙
げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そし
て当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として援
用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫アッ
セイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図さ
れない）。

【０１８６】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前に清澄する工程）に関して、認め得る。
免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。

【０１８７】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロッキングする工程、洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中
で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロッキングする工程、
洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素
基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あ
るいは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次
抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロッキングする工
程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する
工程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバ
ックグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認
め得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ
ｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。

【０１８８】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬ
ＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１１．２．１を参照のこと。

【０１８９】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の
抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む
。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に
結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。

【０１９０】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、本発
明の抗体のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体
（本明細書中に記載されるような、本発明の抗体のフラグメント、アナログおよ
び誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げられる
が、これらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書
中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定
されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。本発明のポリペプ
チドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置お
よび／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する
工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか
、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供さ
れ得る。

【０１９１】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。

【０１９２】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。

【０１９３】 本発明の抗体は、単独で、あるいはＣＲＣＧＣＬリガンド（例えば、ＴＳＬＰ
）もしくはそのフラグメントに対する他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗
体、および／または他のＩ型サイトカインレセプター鎖（例えば、ＩＬ−７レセ
プターα鎖）と組み合わせて、投与され得る。

【０１９４】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。

【０１９５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
対する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性と
しては、５×１０^-2Ｍ、１０^-2Ｍ、５×１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１
０^-4Ｍ、５×１０^-5Ｍ、１０^-5Ｍ、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１
０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、
１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^{- 13} Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、および１０^-15
Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。

【０１９６】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。

【０１９７】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。

【０１９８】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。

【０１９９】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接する核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。

【０２００】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸を用いて形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る
。これらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ
遺伝子治療としてそれぞれ公知である。

【０２０１】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の任意の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として
構築し、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスベクタ
ーまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと
）を用いる感染により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸
のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝
子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または
細胞表面のレセプターまたはトランスフェクト剤でコーティングすることにより
、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、ある
いは、核に入ることが公知であるペプチドとそれらを結合させて投与することに
より、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与
することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：
４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現す
る細胞の型を標的化にするために用いられ得る）などのいずれかにより達成され
得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、こ
のリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウ
イルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを可能にす
る。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化すること
により、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；
同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２
０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして
相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌ
ｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ
３４２：４３５−４３８（１９８９））。

【０２０２】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。

【０２０３】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染し得ると
いう利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３
：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説を
示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１
９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベクタ
ーの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。

【０２０４】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。

【０２０５】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。

【０２０６】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、この細胞により発現可能であり、
好ましくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。

【０２０７】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。

【０２０８】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。

【０２０９】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。

【０２１０】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。
インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞および
／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例
えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒ
ｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，
Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔ
ｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７
１（１９８６）を参照のこと）。

【０２１１】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は
、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能である。

【０２１２】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明
するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者の組織サンプルに対
する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化
合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイお
よび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定さ
れ得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するため
に用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙
げられ、このアッセイでは、患者の組織サンプルが培養中に増殖し、そして化合
物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対
するそのような化合物の効果が観察される。

【０２１３】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験体は、好まし
くは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれ
らに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好
ましくはヒトである。

【０２１４】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投
与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与経路は、本明細書
中で以下に記載されたものの中から選択され得る。

【０２１５】 様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可
能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照の
こと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。
導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、およ
び経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意
の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘
膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により
）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は
、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物
を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、
例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテー
テルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例
えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、
肺投与もまた使用され得る。

【０２１６】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料のものである）によ
り達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タ
ンパク質が吸収されない材料を使用するように注意が払われなければならない。

【０２１７】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。

【０２１８】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出系におい
て送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅ
ｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ
．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５
０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７
４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ
得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．
，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄ
ｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（
編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐ
ｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８
：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１
（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９
８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出系は
、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要と
する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１
３８頁（１９８４）を参照のこと）。

【０２１９】 他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説において議論される（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。

【０２２０】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
でコーティングすることにより、もしくは薬物をトランスフェクトすることによ
り、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投
与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、
そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。
あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えによ
り宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。

【０２２１】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用について、連邦規制当局もしくは米国政府により承認されたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。

【０２２２】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために適応された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【０２２３】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のような、アニオンを伴って形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アン
モニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン
、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものの
ような、カチオンを伴って形成される塩が挙げられる。

【０２２４】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の、処置、阻害および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、
標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に
応じて使用されて最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から
外挿され得る。

【０２２５】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体のより低い投薬量および頻度のより低い投与は、し
ばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（
例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよ
び組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。

【０２２６】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による承認を反映する。

【０２２７】 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を提供し
、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個
体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および
（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を
包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポ
リペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。

【０２２８】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生についての素因
を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提
供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させるこ
と、またはより早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生または
さらなる進行を予防する。

【０２２９】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な
抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、
グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１
Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１
１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノー
ル）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならび
にビオチンが挙げられる。

【０２３０】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。

【０２３１】 被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜
２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。
インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒ
ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編
、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。

【０２３２】 用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標
識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与
後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。
別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日
間である。

【０２３３】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患また
は障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最
初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。

【０２３４】 標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法
を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされない
が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影
法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査
法が挙げられる。

【０２３５】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子射出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
を用いて患者から検出される。

【０２３６】 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。

【０２３７】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。

【０２３８】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。

【０２３９】 さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、第二の標識化モノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原
を含み得る。

【０２４０】 １つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光比色基
質、発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存
在下で固相をインキュベートすることにより検出される。

【０２４１】 上記アッセイにおいて、固体表面試薬は、固体支持体物質（例えば、ポリマー
ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料）へタンパク
質物質を付着することについての公知の技術によって調製される。これらの付着
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着または固体支持体上の化学
的反応基へのタンパク質の共有結合性の付着（代表的に、遊離のアミン基（例え
ば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、もしくはアルデヒド基）による）
を包含する。あるいは、ストレプトアビジンコートプレートが、ビオチン化抗原
と組み合わせて使用され得る。

【０２４２】 従って、本発明は、この診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを
提供する。このキットは、一般に、表面に結合した組換え抗原を有する支持体、
および表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識化抗ヒト抗体
を含む。

【０２４３】 （融合タンパク質） 任意のＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、融合タンパク質を生成するために使用さ
れ得る。例えば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、第２のタンパク質に融合される
場合、抗原性タグとして使用され得る。ＣＲＣＧＣＬポリペプチドに対して惹起
された抗体は、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドに結合することによって、第２のタン
パク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、輸
送シグナルに基づいて細胞位置を標的化するため、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは
、一旦他のタンパク質に融合されると、標的分子として使用され得る。

【０２４４】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドに融合され得るドメインの例としては、異種シグナ
ル配列だけでなく、他の異種機能的領域が挙げられる。この融合は、必ずしも直
接的である必要はなく、リンカー配列を介して起こり得る。

【０２４５】 特定の好ましい実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬタンパク質は、ＣＲ
ＣＧＣＬポリペプチドが上記で一般的にｍ−ｎ、ｍ−ｎ’、ｍ’−ｎおよび／ま
たはｍ’−ｎ’と記載されたものである融合タンパク質を含む。好ましい実施形
態において、本願は、本明細書中に記載される特定のＮ末端欠失変異体およびＣ
末端欠失変異体（例えば、上記で一般的に式ｍ−ｎ、ｍ−ｎ’、ｍ’−ｎおよび
／またはｍ’−ｎ’によって記載された欠失）のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードする核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％同一である核酸分子に関する。これらのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０２４６】 さらに、融合タンパク質はまた、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの特性を改善する
ように操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域
は、宿主細胞からの精製、またはその後の操作および貯蔵の間、安定性および持
続性を改善するために、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドのＮ末端に付加され得る。ま
た、ペプチド部分は、精製を容易にするために、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドに付
加され得る。このような領域は、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの最終調製の前に、
除去され得る。ポリペプチドの操作を容易にするためのペプチド部分の付加は、
当該分野で精通し慣用的な技術である。

【０２４７】 当業者に理解されるように、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチド（フラグメン
トおよび特にそれらのエピトープ保有フラグメントを含む）は、免疫グロブリン
（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン部分またはそれらの一部分
（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ（ドメイン全体お
よびそれらの一部分の両方を含む））またはアルブミン（組み換えアルブミンを
含むがこれに限定されない）と結合され得、キメラポリペプチドを生じる。この
ような融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボで増大した半減期を
示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよ
び哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインから
なるキメラタンパク質について示されている。（ＥＰ Ａ３９４，８２７；Ｔｒ
ａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８））。（Ｉ
ｇＧに起因する）ジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、
単量体分泌タンパク質またはタンパク質のフラグメント単独よりも、他の分子の
結合および中和においてより効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら
，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。これら
の融合タンパク質をコードする核酸を含むかあるいはこの核酸からなるポリヌク
レオチドもまた本発明によって包含される。

【０２４８】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）
。

【０２４９】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドはマーカー配列（例えば、ＣＲＣＧＣＬポ
リペプチドの精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態に
おいて、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例え
ば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎ
ｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）で
あり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎ
ｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２
４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の
都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ
」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する
（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。

【０２５０】 従って、任意のこれら上記の融合物は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたは
ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを使用して操作され得る。

【０２５１】 （ＣＲＣＧＣＬの組み換えおよび合成産生） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組み換え
ベクターで遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組換え技術および合成技術によ
るポリペプチドの産生に関連する。例えば、ベクターは、ファージベクター、プ
ラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得
る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製欠損であり得る
。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ
）宿主細胞にのみ生じる。

【０２５２】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを
含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウ
ム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベク
ターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使
用してインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【０２５３】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げ
れば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイ
ルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結の
ための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む
。この構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻
訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置される終
結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。

【０２５４】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他
の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシ
リン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ
Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細
胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植
物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培
地および条件は、当該分野で公知である。

【０２５５】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中
には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系における使
用のために好ましいベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚ
ｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂ
ａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な
ベクターは当業者に容易に明らかである。

【０２５６】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの
標準的研究室マニュアルに記載される。ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、実際、組
換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。

【０２５７】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そ
して精製され得る。例えば、Ｌｉｎら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｂｅｔａ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ １１９：１８３−１９２（１９８６）（これは、その全体において本明細
書中で参考として援用される）を参照のこと。最も好ましくは、高速液体クロマ
トグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。

【０２５８】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドはまた、以下を含む：直接単離されるかま
たは培養されるかにかかわらず、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から
精製された産物；化学的合成手順の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細
胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または
真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順に使用さ
れる宿主に依存して、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、グリコシル化されてもまた
はグリコシル化されていなくてもよい。さらに、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドはま
た、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の改変され
たメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコード
されるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタン
パク質から高い効率で除去されることは当該分野において周知である。ほとんど
のタンパク質においてＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原核生物において効
果的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセ
スは、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存しており、非効率
的である。

【０２５９】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核生物
系においてＣＲＣＧＣＬタンパク質を発現するために使用される。Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓは、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝し得るメチロ
トローフィック酵母である。メタノール代謝経路の主要な工程は、Ｏ₂を用いて
メタノールをホルムアルデヒドへ酸化することである。この反応は、酵素アルコ
ールオキシダーゼにより触媒される。メタノールをその唯一の炭素源として代謝
するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、アルコールオキシダーゼのＯ ₂ に対する比較的低い親和性に一部起因して、高レベルのアルコールオキシダー
ゼを生成しなければならない。結論として、主要炭素源としてのメタノールに依
存して、増殖培地中に２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子のうちの１つ（ＡＯ
Ｘ１）のプロモーター領域は、非常に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯ
Ｘ１遺伝子から生成されたアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質の約３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．
Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏ
ｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏ
ｐｐ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１
９８７）を参照のこと。従って、異種コード配列（例えば、本発明のＣＲＣＧＣ
Ｌポリヌクレオチド）は、ＡＯＸ１調節配列の全てまたは一部の調節転写の下で
、メタノールの存在下で増殖するＰｉｃｈｉａ酵母において例外的に高レベルで
発現され得る。

【０２６０】 １つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、本明細書中上記のよ
うに、Ｐｉｃｈｉａ酵母系において、本質的に以下に記載されるように本発明の
ＣＲＣＧＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために使用される：「
Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈ
ｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８。この発現ベク
ターは、マルチプルクローニング部位の上流に配置された酵母α因子プレプロペ
プチドシグナル配列（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモ
ーターによって、本発明のＣＲＣＧＣＬタンパク質を発現および分泌するために
使用される。

【０２６１】 多くの他の酵母ベクターは、提唱された発現構築物が転写、翻訳、分泌（必要
であれば）などについての適切に配置されたシグナル（必要に応じて、インフレ
ームＡＵＧを含む）を提供する限り、当業者が容易に理解するように、ｐＰＩＣ
９Ｋの代わりに使用され得る（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚ
ｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ、ｐ
ＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５
Ｋ、およびＰＡＯ８１５）。

【０２６２】 別の実施形態において、例えば、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドのよ
うな異種コード配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまた
はｐＧＡＰＺａｌｐｈａ）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニングし、
そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させることにより達成され得る
。

【０２６３】 本明細書中において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加
えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａ
ｒｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞
を含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ＣＲＣＧＣＬコード
配列）を欠失または置換するように、そして／または本発明のＣＲＣＧＣＬポリ
ヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド
配列）を含むように操作され、そして内因性のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドを
活性化、変更、および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチ
ド配列）を含むように操作されている。例えば、当該分野で公知の技術は、相同
組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハン
サー）ならびに内因性ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド配列を作動可能に連結する
ために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５
，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６
／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２
６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々
は、それら全体において参考として援用される）。

【０２６４】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら
，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、
本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、
ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミ
ノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ
−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ
−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプ
ロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サ
ルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、
ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニ
ン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、
Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ
。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。

【０２６５】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるＣＲＣＧＣＬポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を
含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、ト
リプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄による特
異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在
下での代謝合成；など。

【０２６６】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭
水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオ
ニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例え
ば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、こ
のタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。

【０２６７】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ＣＲＣＧＣ
Ｌの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこ
と）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレング
リコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得
る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの分子内の
所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る
。

【０２６８】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、存在す
る場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または
抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレン
グリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば
、ポリエチレングリコールは、約２００；５００；１０００；１５００；２００
０；２５００；３０００；３５００；４０００；４５００；５０００；５５００
；６０００；６５００；７０００；７５００；８０００；８５００；９０００；
９５００；１０，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，
０００；１２，５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５
００；１５，０００；１５，５００；１６，０００；１６，５００；１７，００
０；１７，５００；１８，０００；１８，５００；１９，０００；１９，５００
：２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；
５０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７
５，０００；８０，０００；８５，０００；９０，０００；９５，０００；また
は１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

【０２６９】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエ
チレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４３，５７
５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；および
Ｃａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（
１９９９）（これらの各々の開示は、本明細書中で参考として援用される）。

【０２７０】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。

【０２７１】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学系を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）またはタ
ンパク質の１つより多くの型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸またはシステインおよびそれらの組み合わせ）にポ
リエチレングリコールを結合し得る。

【０２７２】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分
子から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコー
ル分子のタンパク質（またはポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ
化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る
。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノ
ペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端
ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパ
ク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミ
ノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達
成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末
端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

【０２７３】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、か
なり多数の手段によって、達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、
直接的または介在性リンカーによってのいずれかによってタンパク質に付着され
得る。タンパク質にポリエチレングリコールを付着させるためのリンカーレス（
ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）システムは、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）
；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１
８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０
５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載される。こ
れらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。

【０２７４】 介在性リンカーを伴わずに、ポリエチレングリコールを直接、タンパク質のア
ミノ酸残基に付着させるための一つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ
）されたＭＰＥＧを利用する。トレシル化されたＭＰＥＧは、塩化トレシル（Ｃ
ｌＳＯ₂ＣＨ₂ＣＦ₃）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエ
チレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される。トレシル化されたＭ
ＰＥＧを用いるタンパク質の反応の際に、ポリエチレングリコールが、直接タン
パク質のアミン基と付着される。従って、本発明は、２，２，２−トリフルオロ
エタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレン
グリコール分子と本発明のタンパク質を反応させることによって産生されるタン
パク質ポリエチレングリコール結合体を含む。

【０２７５】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在性リンカーを使用して、タ
ンパク質と付着され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この全体
の開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質とポリエチレン
グリコールを連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエ
チレングリコール抱合体（ここで、ポリエチレングリコールは、リンカーによっ
てタンパク質と付着される）はまた、化合物（例えば、ＭＰＥＧ−スクシンイミ
ジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥ
Ｇ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカーボネート（ｔｒｉｃｈｌｏ
ｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボ
ネート、および種々のＭＰＥＧスクシネート誘導体）とタンパク質との反応によ
って、産生され得る。多数のさらなるポリエチレングリコール誘導体およびポリ
エチレングリコールをタンパク質に付着するための反応化学は、ＷＯ９８／３２
４６６に記載され、その全体の開示は、本明細書中に参考として援用される。本
明細書中で設定された反応化学を使用して産生されるペグ化タンパク質産物は、
本発明の範囲内に含まれる。

【０２７６】 本発明の各タンパク質に付着されるポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０、以上のポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、タンパク質分
子当たりの置換の平均程度は、例えば、１−３、２−４、３−５、４−６、５−
７、６−８、７−９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１
４、１３−１５、１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９、または１
８−２０のポリエチレングリコール部分の範囲内である。置換の程度を決定する
ための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議
論される。

【０２７７】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち
、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。
従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプ
チド、それらの調製ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に
関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、
トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマー
は、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーで
ある。

【０２７８】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペ
プチド（本明細書中に記載される、ＣＲＣＧＣＬのフラグメント、改変体、スプ
ライス改変体および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これ
らのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣＬポリペプ
チドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配
列を有するＣＲＣＧＣＬポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の
実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマ
ーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するＣＲＣＧ
ＣＬポリペプチドを含む）あるいはホモトリマー（例えば、同一および／または
異なるアミノ酸配列を有するＣＲＣＧＣＬポリペプチドを含む）である。さらな
る実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、
少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。

【０２７９】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＣＲＣＧＣＬポ
リペプチドに加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質の
ポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチ
マーは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドに加えて、Ｉ型サイトカインレセプ
ターまたはそのフラグメントを含む。さらなる特定の実施形態において、本発明
のマルチマーは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドに加えて、ＩＬ−７αレセ
プター鎖またはそのフラグメントを含む。特定の実施形態では、本発明のマルチ
マーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さら
なる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともホモダイマ
ー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。

【０２８０】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチ
ドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質に
おける異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される
。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドとの、および／または本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチド間での共有結合によ
って形成される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号
２に記載されるか、またはクローンＨＴＡＥＫ５３によってコードされるポリペ
プチドに含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含
み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）
ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残
基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操
作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ＣＲＣＧＣＬ融合タンパク
質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る
。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある
（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、こ
の共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＣＲＣＧＣＬ−Ｆｃ
融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合
タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のサイトカイ
ンファミリーレセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅ
ｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば
、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で
参考として援用される）を参照のこと）。

【０２８１】 別の実施形態では、２以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通
して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に
参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチド
リンカーによって隔てられた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、
従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。

【０２８２】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質に
おいて見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成また
はトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本発
明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメ
インの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３
０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成また
はトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを含
む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶
性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回
収される。

【０２８３】 本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性という利点を提供
し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを
優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏ
ｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および
米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタント
プロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するト
リマータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製
において用いられ得る。

【０２８４】 別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質
の会合は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペ
プチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。

【０２８５】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポ
リペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的
に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、これらの改変されたポリペプチ
ドの１以上を含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書
中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれるこ
とが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得
る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。

【０２８６】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、
そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリ
ペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。

【０２８７】 特定の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、第２のサイ
トカインレセプター鎖を有するヘテロダイマー内にある。好ましい実施形態にお
いて、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、ＩＬ−７レセプターα鎖を有する
ヘテロダイマー内にある。

【０２８８】 （ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定されたＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、試薬として多数の
方法において使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり
、そして公知の技術を利用する。

【０２８９】 実際の配列データ（反復多形性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとん
ど利用可能ではないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するま
まである。放射性ハイブリッドのパネルを使用した場合、ＣＲＣＧＣＬは、性染
色体の偽常染色体（ｐｓｅｕｄｏａｕｔｏｓｏｍａｌ）領域（ＰＡＲ）に位置し
、Ｘ（Ｘｐ２２．３）およびＹ（Ｙｐ１３．３）両方に位置付けられる。面白い
ことに、２つの他のサイトカインレセプター（ＩＬ３ＲａおよびＧＭＣＳＦＲａ
）は、この領域に位置する。Ｋｒｅｍｅｒら、「Ａ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｘ−Ｙ ｐｓｅｕｄｏ
ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｇｉｏｎ」Ｂｌｏｏｄ ８２（１）２２−２８（１９
９３）を参照のこと。従って、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、Ｘ染色体およ
びＹ染色体の偽常染色体領域のマーカーとして、連鎖分析に使用され得る。

【０２９０】 簡単に言うと、配列は、配列番号１で示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得
る。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエクソンにまた
がらないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得る。
次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドの
ＰＣＲスクリーニングのために使用される。配列番号１に対応するヒトＣＲＣＧ
ＣＬ遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。

【０２９１】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ＣＲＣＧＣＬポ
リヌクレオチドの下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の
染色体フラグメントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マ
ッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌ
ａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、およ
び染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーション
による前選択、およびコンピューターマッピング技術（例えば、その全体が本明
細書中に参考として援用される、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ １６：４５６−４５９（１９９８）を参照のこと）を含む。

【０２９２】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレ
ッド（ｓｐｒｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
を使用して達成され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリ
ヌクレオチドを使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチ
ドが好ましい。この技術の概説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ」，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参
照のこと。

【０２９３】 染色体マッピングについては、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、個々に（単
一染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（
複数部位および／または複数染色体をマークするために）使用され得る。

【０２９４】 本発明のポリヌクレオチドは、同様に、放射線ハイブリッドマッピング、ＨＡ
ＰＰＹマッピング、および長範囲制限マッピングに有用である。これらの技術お
よび当該分野で公知の他の技術の概説について、例えば、Ｄｅａｒ「Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄ
ｏｎ（１９９７）；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１〜６９４（
１９９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３〜４９
２（１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０
９〜４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．６２：２６５〜２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ、Ｊ．Ｈｅ
ｒｅｄ．９０：６８〜７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考とし
て本明細書中に援用される）を参照のこと。

【０２９５】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の共遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立する
。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉ
ａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通して
オンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピン
グ解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体領
域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子のう
ちの１つであり得る。

【０２９６】 従って、一旦、共遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのＣＲ
ＣＧＣＬポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。
まず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッ
ドにおいて、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、
点変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で観察されたが、正
常な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得るこ
とを示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のＣＲＣＧＣＬポリペプチドおよ
び対応する遺伝子の完全な配列決定は、変異を多形性と区別するために要求され
る。新しい多形性が同定される場合、この多形ポリペプチドは、さらなる連鎖分
析のために使用され得る。

【０２９７】 さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現
が、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変
化（変化した発現、染色体再配列、または変異）は、診断マーカーまたは予後マ
ーカーとして使用され得る。

【０２９８】 前記に加えて、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、三重らせん形成を通して、
またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために
使用され得る。両方の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合
に依存する。これらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜
４０塩基長であり、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（
アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１
）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的で
ある。三重らせん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、
アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子
の翻訳を妨げる。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本明細
書に開示される情報は、疾患を処置するための努力において、アンチセンスまた
は三重らせんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。

【０２９９】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝
子治療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する
生物へ正常遺伝子を挿入することである。ＣＲＣＧＣＬは、高度に正確な様式で
このような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標は、宿主ゲノム中に
は存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主細胞中に新しい形質
を生成することである。

【０３００】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同
定するために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フ
ラグメント長の多形性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、
個体のゲノムＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するた
め固有なバンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方
法は、「認識票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、ま
たは盗まれたりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限
界を受けない。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤ
ＮＡマーカーとして使用され得る。

【０３０１】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際
の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物とし
て使用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして
単離するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選
択されたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有
するので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータ
ベースが個体について確立されると、その個体が生存しているまたは死亡してる
、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプルからなされ得る。

【０３０２】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液など）のような非常に小さな生物学的サンプルから得られたＤＮ
Ａ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多形性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、個
体を同定するための法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，
ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２）
）。一旦、これらの特異的多形性遺伝子座が増幅されると、これらは１つ以上の
制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤ
ＮＡでプローブされたサザンブロットについてのバンドの同定セットを生じる。
同様に、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多形性マーカ
ーとして使用され得る。

【０３０３】 特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性もまた、存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、ＣＲＣＧＣＬ配列から調製される、特定の組織
に特異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネ
ルは、種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これ
らの試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得
る。

【０３０４】 ＣＲＣＧＣＬは、子宮頚癌細胞株（ＨｅＬａ）、活性Ｔ細胞および肺癌細胞株
（Ａ５４９）中で発現されることが見出され、さらに、短い変異が、リンパ節お
よびより少ない範囲で脾臓でもまた発現されるので、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオ
チドは、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のための
ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。同様に、ＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチドに関するポリペプチドおよび抗体は、組織または細胞型の示差的同定の
ための免疫学的プローブを提供するのに有用である。さらに、上記組織または細
胞の、特に免疫系の多くの障害のため、「標準」ＣＲＣＧＣＬ遺伝子発現レベル
（すなわち、免疫系障害を有しない個体由来の健康組織のＣＲＣＧＣＬ発現レベ
ル）に対して、ＣＲＣＧＣＬの有意に高いかまたは低いレベルの遺伝子発現が、
このような障害を有する個体から採取された一定の組織（例えば、癌性組織およ
び創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）において
検出され得る。

【０３０５】 従って、本発明は、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、
：（ａ）個体の細胞または体液中のＣＲＣＧＣＬ遺伝子発現レベルをアッセイす
る工程；（ｂ）標準的なＣＲＣＧＣＬ遺伝子発現レベルと、このＣＲＣＧＣＬ遺
伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レベルと比較して、アッセイ
されたＣＲＣＧＣＬ遺伝子発現レベルの増加または減少が、免疫系において障害
を示す、工程をふくむ。

【０３０６】 「ＣＲＣＧＣＬ遺伝子発現レベルをアッセイする（こと）」とは、本発明のポ
リペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベル
を、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク質レベル
またはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対的（例え
ば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対
して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定または評価
することを意図する。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリペプチドレ
ベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリペプチドレ
ベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、関連障害を有さない
個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは関連障害を有さ
ない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定される。当該分野で認
識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが公知
になれば、これを、比較のための標準として反復して用い得る。

【０３０７】 「生物学的サンプル」とは、本発明のポリペプチドまたは対応するｍＲＮＡを
含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意の生
物学的サンプルを意図する。示されるように、生物学的サンプルは、本発明のポ
リペプチドを含む体液（リンパ、血清、血漿、尿、精液、滑液および髄液など）
、および本発明のポリペプチドを発現することが見出された組織供給源を含む。
哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。
生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。

【０３０８】 上記で提供された方法は好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適
用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，
８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載さ
れる、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明
のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップは、本発明の単離され
たポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチドとの間
の多形性を同定するため、使用され得る。このような多形の知識（すなわち、そ
の多形の位置、およびその多形の存在）は、多くの障害（例えば、免疫系障害、
筋肉障害、神経障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖
性障害、ならびに／または癌性疾患および癌性状態など）について、疾患遺伝子
座を同定する際に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５
９号および同第５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は
、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【０３０９】 好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドが結合された遺伝子チ
ップは、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離され
たポリヌクレオチドとの間の多形性を同定するために使用され得、そして、免疫
系の障害（特にＢ細胞リンパ球産生の異常助長または胸腺細胞もしくは成熟Ｔ細
胞の異常同時刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）に関する）を示す、検出する
、処置する、予防する、および／または診断するために使用され得る。

【０３１０】 本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポリ
ヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体支
持体、すなわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として役立つ
。本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡア
ナログであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについてのモ
ノマー単位が市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
。ＤＮＡの一定の成分（リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体など）は
、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ
．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７（
１９９７）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉ
ｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開示され
るように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、そし
てヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合する
よりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力が存
在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性があることによる。これによっ
て、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジ
ェンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容易に
する。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用いられ
得る。さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダ
イゼーションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マーにお
ける単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃〜１
６℃であるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるからで
ある。また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーションが
、低いイオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を減少さ
せることを意味する。

【０３１１】 少なくとも、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオドは、サザンブロットのゲル上の分子
量マーカーとして、特定の細胞型における特異的ｍＲＮＡの存在についての診断
プローブとして、新規のポリヌクレオドを発見するプロセスにおける「減算した
（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」公知の配列に対するプローブとして、「遺伝子
チップ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択および作製するた
めに、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を惹起するために、および免疫応答
を導き出す抗原として使用され得る。

【０３１２】 （ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの使用） ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、多くの方法において使用され得る。以下の記述
は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利用する。

【０３１３】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを用いて、抗体に基づく技術によって、生物学的サ
ンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る。例えば、組織中のタンパク質発
現は、古典的な免疫組織学的な方法を用いて、研究され得る。（Ｊａｌｋａｎｅ
ｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０
９６（１９８７））。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体
に基づく方法には、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩ
ＳＡ）および放射性免疫検定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ
の標識は、当該分野で公知であり、そして酵素標識（グルコースオキシダーゼな
ど）ならびに放射性同位体（ヨウ素（、¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（ ³⁵ Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ、）、およびテクネチウム（ ^99m Ｔｃ）など）、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミ
ン）ならびにビオチンが挙げられる。

【０３１４】 生物学的サンプル中の分泌タンパク質のレベルをアッセイすることに加えて、
タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質のインビ
ボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥ
ＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放射性同
位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射線を放
射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲのための
適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水
素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識することに
より抗体中に取り込まれ得る。

【０３１５】 放射性同位体（例えば、¹³¹Ｉ、¹¹²Ｉｎ、^99mＴｃ、）、放射線不透過性物質
、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分
で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物に導
入（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）される。被験体のサイズおよび
用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量
を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被
験体について、注射される放射能の量は、通常、^99mＴｃの約５〜２０ミリキュ
リーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、特異的
タンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ
．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉ
ｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ第１３章：Ｔｈｅ Ｒ
ａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ
．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。

【０３１６】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体
の細胞または体液におけるＣＲＣＧＣＬポリペプチドの発現をアッセイする工程
；（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準の遺伝子の発現レベルと比較し、それによっ
て標準の発現レベルと比較してアッセイされたＣＲＣＧＣＬポリペプチドの遺伝
子発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。

【０３１７】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、疾患を処置、検出および／または予防
するため使用され得る。例えば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの非存在またはレベ
ルの減少を元に戻すこと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在ま
たはレベルの減少を補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビ
ンＳ）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子）、ポリペプチ
ドの活性を活性化すること（例えば、レセプターに結合することによって）、遊
離リガンドについて膜結合レセプターと競合させることによって膜結合レセプタ
ーの活性を減少させること（例えば、炎症を低減させる際に用いられる可溶性Ｔ
ＮＦレセプター）、または所望の応答をもたらすこと（例えば、血管の成長）の
試みにおいて、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを患者は投与され得る。

【０３１８】 同様に、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドに対して指向される抗体もまた、疾患を処
置する、診断する、検出するおよび／または予防するために用いられ得る。例え
ば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドに対して指向される抗体の投与は、ポリペプチド
を結合して、そしてポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与
は、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセプター）へ結合することにより、
ポリペプチドを活性化し得る。

【０３１９】 少なくとも、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用
され得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、ＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドはまた、抗体を惹起するために使用され得、次いで、この抗体が、組換え細胞
からのタンパク質発現を測定するために使用される。さらに、ＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチドが使用され、以下の生物学的活性を試験し得る。

【０３２０】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するための遺伝子治療方法
である。この遺伝子治療方法は、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドの発現を達
成するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）
配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの
発現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結し
たＣＲＣＧＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。この
ような遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明
細書中に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。

【０３２１】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでＣＲＣＧＣＬポリヌクレオ
チドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、このポリペプチドを
用いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知
である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）
；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０
４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔ
ｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６
）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４
６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これら
は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作され
る細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接
的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。

【０３２２】 以下により詳細に考察されるように、このＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築
物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓
、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。この
ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性の
キャリア中で送達され得る。

【０３２３】 １つの実施形態においては、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、裸のポリヌク
レオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとは、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいか
なる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェ
クチンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、ＣＲＣＧＣＬ
ポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処
方物中およびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、
例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同
第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記
載される。

【０３２４】 遺伝子治療方法において使用されるＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする
配列を含まない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
から入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよ
びｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐ
ｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは
、当業者に容易に明らかである。

【０３２５】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＣＲＣＧＣＬ ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、ＣＲＣＧＣＬにつ
いてネイティブなプロモーターであり得る。

【０３２６】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。

【０３２７】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺
、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢
、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含す
る）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間
の、細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性
組織のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ
ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または
骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチ
ャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達
は、以下で議論される理由のために好ましい。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構
築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本
ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂
細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非
分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚
線維芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチ
ドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。

【０３２８】 裸の酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍ
ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量
は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましく
は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識す
るように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切か
つ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態お
よび投与経路に依存し得る。

【０３２９】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路（特に、肺または気管支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のた
めのエアロゾル処方物の吸入など）もまた用いられ得る。さらに、裸のＣＲＣＧ
ＣＬ ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテ
ルによって動脈に送達され得る。

【０３３０】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。

【０３３１】 実施例で証明するように、裸のＣＲＣＧＣＬ核酸配列はインビボで投与され得
、ウサギの大腿動脈中でＣＲＣＧＣＬポリペプチドの首尾良い発現を生じる。

【０３３２】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。

【０３３３】 特定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は、リポソー
ム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は
、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製
物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との
間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい
。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書
中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細
書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製された
転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介す
ることが示されている。

【０３３４】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと）より入
手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａ
ｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。

【０３３５】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。

【０３３６】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知であ
る。

【０３３７】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの
各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴が、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。

【０３３８】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和するこ
とによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単
膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭ
ＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソ
ームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｎ
ａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し
、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリ
ポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非
常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を
見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用
される方法としては、Ｃａ²⁺−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕ
ｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４
８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７；エーテル注入（Ｄ
ｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅ
ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３
４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，
Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４
５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ、Ｆ．およびＰａｐ
ａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で
参考として援用される。

【０３３９】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。

【０３４０】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。

【０３４１】 特定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬをコードする配列を含むＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ
肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫
不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、
これらに限定されない。

【０３４２】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株に
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０
）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２
、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ
−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限
定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージ
ング細胞に形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション
、リポソームの使用、およびＣａＰＯ₄沈殿が挙げられるが、それらに限定され
ない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソ
ームにカプセル化し得るか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。

【０３４３】 このプロデューサー細胞株は、ＣＲＣＧＣＬをコードするポリヌクレオチドを
含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロ
ウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかにおい
て、真核生物細胞に形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、ＣＲ
ＣＧＣＬを発現する。

【０３４４】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるＣＲＣＧ
ＣＬポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
アデノウイルスは、それがＣＲＣＧＣＬをコードし、そして発現し、それと同時
に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるよ
うに操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色
体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽
減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れ
た安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら、（１９７
４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終
的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アン
チトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１
〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５
５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとす
る広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６）。

【０３４５】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。

【０３４６】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰ
プロモーター）に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが
、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１からＬ５までのすべてまたは一
部のうちの１つ以上にて欠失され得る。

【０３４７】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中では
ない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。
３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組
み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。その
ようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特
許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７
８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８
，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。

【０３４８】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次
いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿など
を含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパ
ーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切な
ヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニ
アウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞が
トランスフェクトおよび感染されると、それらはＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたは
インビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞に形質導
入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたＣＲＣＧＣＬポリヌク
レオチド構築物を含み、そしてＣＲＣＧＣＬを発現する。

【０３４９】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＲＣＧＣＬをコードしている
配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在してい
るが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで発現
する、遺伝子の活性化を含む。

【０３５０】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターは、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、ＣＲＣＧＣＬの所望される内
在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換
えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。

【０３５１】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。

【０３５２】 裸のポリヌクレオチドとしてか、または上記により詳細に記載されるようなリ
ポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈
殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、このプ
ロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、局
所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモー
ター−標的化配列を送達し得る。この方法を、以下により詳細に記載する。

【０３５３】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性ＣＲＣＧＣＬ配列は
、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在
性ＣＲＣＧＣＬ配列の発現を駆動する。

【０３５４】 ＣＲＣＧＣＬをコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成タンパク質をコ
ードする他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。脈管形成タンパク質とし
ては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、上皮増殖因子α
およびβ、血小板由来の内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子
α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファー
ジコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、および一酸化
窒素シンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【０３５５】 好ましくは、ＣＲＣＧＣＬをコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質
の分泌を容易にする分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、
ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現さ
れる、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列は、目
的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランスフェク
トされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公知の方
法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。

【０３５６】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量で１つ以上の分子が
発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式が使用
され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティッ
ク（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲ
ルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物質
、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（
錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティング適用または局所
適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈殿し
た裸のプラスミドの直接注入、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注
入は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。

【０３５７】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域中に直接注入により
投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物
の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、そして好ましくは数
ミリメートルで注射することをいう。

【０３５８】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。

【０３５９】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するためのリガンドを含むリ
ポソームを含む。

【０３６０】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１
１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐え
る能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成
することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、
当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げら
れる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌク
レオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。

【０３６１】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。

【０３６２】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトが特に好ましい。

【０３６３】 （ＣＲＣＧＣＬの生物学的活性） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストをアッセイに用いて、１つ以上の生物学的活性
について試験し得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ある
いはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストが、特定のアッセイにおい
て活性を示す場合、ＣＲＣＧＣＬは、その生物学的活性に関連した疾患に関与し
得るようである。従って、ＣＲＣＧＣＬを用いて、関連する疾患を処置、診断、
検出および／または予防し得る。

【０３６４】 ＣＲＣＧＣＬは、Ｉ型サイトカインレセプターファミリーのメンバーに相同な
細胞表面レセプターであり、従って、他のＩ型サイトカインレセプターファリミ
ーメンバーに類似する活性を有するはずである。文献中の現在の研究は、Ｉ型サ
イトカインレセプターがいくつかのタンパク質鎖と複合体形成し得ること、なら
びにこれらの異種複合体が、細胞質チロシンキナーゼのＪＡＫファミリーならび
にＳＴＡＴタンパク質（ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂ）を活性
化し得、このことはＢ細胞および／またはＴ細胞のシグナル伝達および活性化を
導くことを実証する。従って、ＣＲＣＧＣＬは、Ｂ細胞およびＴ細胞の表面上の
、他のＩ型サイトカインレセプタータンパク質鎖（例えば、ＩＬ−７レセプター
α鎖）、または他のＢ細胞およびＴ細胞レセプター分子と特異的に相互作用し、
免疫細胞の、活性化、増殖、生存、および／または分化に影響を与え得る。ＣＲ
ＣＧＣＬは、ＪＡＫファミリーのメンバーおよびＳＴＡＴタンパク質を活性化し
得る。ＣＲＣＧＣＬは、ＳＴＡＴ５Ｂを活性化し得る。

【０３６５】 同様に、可溶性ＣＲＣＧＣＬは、治療での使用または免疫調節のための重要な
同時刺激性分子であり得る。リガンド（例えば、天然リガンド（例えば、ＴＳＬ
Ｐ）および／または抗体）は、ＣＲＣＧＣＬ、または他のＩ型サイトカインレセ
プターに結合することにより可溶性ＣＲＣＧＣＬの作用を模倣し得る。

【０３６６】 ＣＲＣＧＣＬの結合は、Ｂ細胞リンパ球産生を誘導し、そして胸腺細胞と成熟
Ｔ細胞とを同時に刺激する。この結合は、膜結合ＣＲＣＧＣＬとの同型会合、他
のＩ型サイトカインレセプタータンパク質鎖（例えば、ＩＬ−７レセプターα鎖
）と複合体化した膜結合ＣＲＣＧＣＬとの同型会合、あるいは他のＴ細胞または
Ｂ細胞レセプターとの会合を通じて生じ得る。リガンド（例えば、天然リガンド
（例えば、ＴＳＬＰ）および／または抗体）は、ＣＲＣＧＣＬ、または他のＩ型
サイトカインレセプターへの結合により、Ｂ細胞リンパ球産生の誘導を模倣し得
、そして胸腺細胞と成熟Ｔ細胞とを同時に刺激し得る。

【０３６７】 従って、ＣＲＣＧＣＬは、治療分子として有用であり得る。それは、造血細胞
、特に、Ｂ細胞およびＴ細胞の増殖、活性化、成熟、生存、および／または分化
を制御するために使用され得る。特に、ＣＲＣＧＣＬは、免疫調節を媒介するた
めの有用な治療剤であり得る。免疫細胞のこの制御は、免疫障害（例えば、自己
免疫疾患または免疫抑制（以下を参照））の処置、検出、および／または予防に
特に重要である。好ましくは、免疫障害の処置、検出、および／または予防を、
ＣＲＣＧＣＬの分泌型、遺伝子治療、またはエキソビボ適用を使用することで実
行し得る。さらに、ＣＲＣＧＣＬのインヒビター（ブロッキング抗体または変異
型のいずれか）は、ＣＲＣＧＣＬの発現を調節し得る。これらのインヒビターは
、ＣＲＣＧＣＬの誤った調節に関連する疾患を処置、検出、および／または予防
するために有用であり得る。

【０３６８】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した
本発明のポリペプチド（例えば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドまたは抗ＣＲＣＧＣ
Ｌ抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のため
の方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞
中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（
例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細胞の
ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得
る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。

【０３６９】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドまたは抗ＣＲＣ
ＧＣＬ抗体）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊
）のための方法を提供する。

【０３７０】 「毒素」により、内因性細胞傷害性エフェクター系を結合および活性化させる
化合物、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触
媒サブユニット、細胞毒（細胞障害性因子）、あるいは、細胞死を引き起こす規
定された条件下にある細胞表面内またはその表面上に通常は存在しない任意の分
子または酵素を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、当
該分野で公知の放射性同位体、化合物（例えば、固有のもしくは誘導された内因
性細胞傷害性エフェクター系を結合する抗体（またはその補体固定含有部分））
、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）、α毒素
、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポ
リン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌ
ｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃ
ｉｎ）およびコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。「毒素」はま
た、細胞分裂抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射性金属イオン（例え
ば、α−エミッター（例えば、²¹³Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば
、¹⁰³Ｐｄ、¹³³Ｘｅ、¹³¹Ｉ、⁶⁸Ｇｅ、⁵⁷Ｃｏ、⁶⁵Ｚｎ、⁸⁵Ｓｒ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、^{9 0} Ｙ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁵³Ｇｄ、¹⁶⁹Ｙｂ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁴Ｍｎ、⁷⁵Ｓｅ、¹¹³Ｓｎ、⁹⁰イッ
トリウム、¹¹⁷スズ、¹⁸⁶レニウム、¹⁶⁶ホルミウム、および¹⁸⁸レニウム）；発光
標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび
ローダミン）、ならびにビオチンを含む。

【０３７１】 当該分野において公知の技術は、本発明の抗体を標識化するために適用され得
る。このような技術としては、二官能性結合化剤の使用（例えば、米国特許第５
，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；
同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２
５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２
，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同
第５，８０８，００３号を参照のこと；これらの各々の内容は、本明細書によっ
て参考としてその全体が援用される）が挙げられるが、これに限定されない。細
胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例として
は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジ
ンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（
ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキ
ソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒ
ｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトザントロン、ミトラマイシン
、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プ
ロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン
、ならびにそのアナログもしくはホモログ、が挙げられる。治療剤には、代謝拮
抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン
、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃ
ｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、
チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（Ｂ
ＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈ
ｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシ
ン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジ
クロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（
例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗
生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシ
ン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（Ａ
ＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン
）、が挙げられるが、それらに限定されない。

【０３７２】 「細胞傷害性プロドラッグ」により、細胞に通常存在する酵素により細胞傷害
性化合物へと変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法に従って使用さ
れ得る細胞傷害性プロドラッグには、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタ
ミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのホスフェート（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ）誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシ
ンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【０３７３】 個体におけるＣＲＣＧＣＬの活性の標準または正常なレベルにおける減少によ
って引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ＣＲＣＧＣＬのポリペプチ
ド（例えば、可溶性細胞外ドメインまたは完全なタンパク質を発現する細胞の形
態）あるいはアゴニストの投与によって処置され得ることが理解される。従って
、本発明はまた、ＣＲＣＧＣＬの活性の増大したレベルを必要とする個体の処置
の方法を提供する。この方法は、このような個体におけるＣＲＣＧＣＬの活性レ
ベルを増大するのに効果的な量の本発明の単離されたＣＲＣＧＣＬのポリペプチ
ドあるいはそのアゴニスト（例えば、作動性ＣＲＣＧＣＬ抗体）を含有する薬学
組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。

【０３７４】 個体におけるＣＲＣＧＣＬの活性の標準または正常なレベルにおける増加によ
って引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ＣＲＣＧＣＬのポリペプチ
ド（例えば、可溶性細胞外ドメインまたは完全なタンパク質を発現する細胞の形
態）あるいはアンタゴニスト（例えば、作動性ＣＲＣＧＣＬ抗体）の投与によっ
て処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＣＲＣＧＣＬの活性
の減少したレベルを必要とする個体の処置の方法を提供する。この方法は、この
ような個体におけるＣＲＣＧＣＬの活性レベルを減少するのに効果的な量の本発
明の単離されたＣＲＣＧＣＬのポリペプチドあるいはそのアンタゴニストを含有
する薬学組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。

【０３７５】 ウイルスは、ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ＣＲＣＧ
ＣＬのアゴニストおよび／またはアンタゴニストにより処置され得る疾患または
症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤ
ＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスならびにウイルス科が挙げられるがこれらに
限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテ
リウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科
、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ
、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス
科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹）、モノネガウイ
ルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、モルビ
リウイルス、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフル
エンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイル
ス、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウ
イルス科（例えば、痘瘡または痘疹）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス
）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、お
よびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルス
は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る
：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウム
ウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝
炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、アルゼンチン
出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、チンクグニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレ
ー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキット
リンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病
、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）
、およびウイルス血症。ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの
症状または疾患のいずれかが処置、予防、診断および／または検出され得る。特
定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストは、以下の処置、予防、および／または診
断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶおよび／または肝炎（例えば、Ｂ型
肝炎）。さらなる特定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチド、
ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、１以上の他の市販
の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらなる特定の
実施形態において、ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはア
ゴニストは、ＡＩＤＳを処置、予防および／または診断するために使用される。
さらなる特定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬのポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、クリプトスポリジウム症を
有する患者を処置、予防、および／または診断するために使用される。

【０３７６】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、および／またはＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアン
タゴニストによって処置され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラ
ム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定さ
れない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌ
ｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔ
ｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、
Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂ
ｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄ
ｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇ
ｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ
）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎ
ｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌ
ｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌ
ｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅ
ｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、
Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐｈ
ｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐ
ｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍ
ｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌならびにＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
およびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は、以
下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心
内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例え
ば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター
病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ
掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば
、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核
、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、
性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅ
ｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、ポリヌ
クレオチド、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意
のこれらの症状もしくは疾患を処置、予防、診断および／または検出し得る。特
定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、ポリペプチド、そのア
ゴニストまたはアンタゴニストは、以下を処置、予防および／または診断するた
めに使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヅム、および／またはＢ型髄膜炎
。

【０３７７】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、ポリペプチド、ＣＲＣＧＣＬのアゴ
ニストおよび／もしくはアンタゴニストにより処置され得る、寄生生物性因子が
引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられる
がこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプト
スポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、
外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア
症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏ
ｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａ
ｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患ま
たは症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば
、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、Ａ
ＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。ＣＲＣＧＣＬ
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴ
ニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置、予防、診断および／ま
たは検出し得る。特定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、そのアゴニストもしくはアンタゴニストは、マラリアを処置、予防
および／または診断するために使用される。

【０３７８】 別の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドおよび／または、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、内
耳感染（例えば、中耳炎）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅおよび他の病原性生物の感染によって特徴付けられる他の感染を処置
、予防、および／または診断するために使用される。

【０３７９】 特定の実施形態において、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド
あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ＣＲＣＧＣＬ抗体）
を使用して、欠損した血清免疫グロブリン産生、再発性感染、および／または免
疫系機能不全により特徴付けられる疾患を、処置または予防する。さらに、ＣＲ
ＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそのアゴニストもしく
はアンタゴニスト（例えば、抗ＣＲＣＧＣＬ抗体）を使用して、関節、骨、皮膚
、および／または耳下腺の感染、血行性の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血
症網膜炎、および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示
されるもの）、炎症性疾患、および悪性疾患、ならびに／またはこれらの感染、
疾患、障害および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態
（ＣＶＩＤ、他の初期免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞
炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重篤な帯状疱疹
）、および／またはニューモシスティスカリニが挙げられるが、これらに限定さ
れない）を、処置または予防する。

【０３８０】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのア
ゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患または障害または状態の
１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：第１
次免疫不全、免疫媒介血小板減少症、川崎病、骨髄移植（例えば、成人または子
供における最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例えば
、成人性または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、および輸
血後紫斑病。

【０３８１】 さらに、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるい
はそのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患、障害または状
態の１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：
ギャン−バレー症候群、貧血症（例えば、パルボウイルスＢ１９関連貧血症、感
染（例えば、再発性感染）の高い危険にある安定多発性骨髄腫（ｓｔａｂｌｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）を有する患者、自己免疫溶血性貧血（例え
ば、温型（ｗａｒｍ−ｔｙｐｅ）自己免疫溶血性貧血）、血小板減少症（例えば
、新生児血小板減少症）および免疫媒介好中球減少症）、移植（例えば、サイト
メガロウイルス（ｃｙｔａｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）−陽性器官のＣ
ＭＶ−陰性レシピエント）、低ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹患
の危険因子を有する低ガンマグロブリン血症新生児）、癲癇（例えば、難治性癲
癇）、全身性血管炎症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚
筋炎、および多発性筋炎）。

【０３８２】 本発明のさらに好ましい実施形態は、以下の用途におけるＣＲＣＧＣＬポリペ
プチド、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、ならびにその機能的アゴニストおよび
／またはアンタゴニストの使用を含むが、これらに限定されない： １つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の量の減少
を産生するための免疫系を阻害するための、より高い親和性抗体の産生（例えば
、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を阻害するための、そして／または免
疫応答を減少させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスタ
ー、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラクダ、
ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（最も
好ましくはヒト）への投与。特定の非限定的実施形態では、本発明のＣＲＣＧＣ
Ｌポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＧの量の減少を産生す
るための免疫系をブーストするために投与される。別の特定の非限定的な実施形
態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチド、および／またはそのアゴニス
トは、ＩｇＡの量の増加を産生するための免疫系を阻害するために投与される。
別の特定の非限定的な実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチド、
および／またはそのアゴニストは、ＩｇＭの量の減少を産生するための免疫系を
阻害するために投与される。

【０３８３】 免疫抑制治療を受ける前に個体の免疫状態を高める試薬として。

【０３８４】 血清免疫グロブリン濃度を減少するための試薬として。

【０３８５】 骨髄移植および／または他の移植の前、その間、またはその後の免疫系インヒ
ビターとして（例えば、同種器官移植または異種器官移植）。移植に関して本発
明の組成物は、移植の前に、移植と同時に、そして／または移植の後に投与され
得る。

【０３８６】 免疫応答性を減少するための試薬として。本発明のＣＲＣＧＣＬアゴニストの
投与によって改善または処置されるＢ細胞免疫不全としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣ
ＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマ
グロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ病、先天性無ガンマグロブリン血
症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人
発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグ
ロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、
非特異的低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不
全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、
過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的
ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正
常なＩｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖
欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠
損、退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓｓ型）、網様発育不全、新生児好中
球減少症、重篤な先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−
発育不全症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短肢（ｓｈｏｒｔ ｌ
ｉｍｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロ
フ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、Ｍ
ＨＣクラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全。

【０３８７】 ＣＲＣＧＣＬアゴニストは、Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体の間で免疫
応答性をブーストするための因子として使用され得る。本発明のＣＲＣＧＣＬア
ゴニストを投与することによって改善または処置され得る、Ｂ細胞機能の後天的
欠損を生じる状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＩ
Ｖ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）。

【０３８８】 ＣＲＣＧＣＬアゴニストは、一時的な免疫不全を有する個体の間で免疫応答性
をブーストするための因子として使用され得る。ＣＲＣＧＣＬアゴニストを投与
することによって改善または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる状態とし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウイルス感染（例えば、イ
ンフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの
回復、またはストレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復、手術
からの回復。

【０３８９】 ＴＨ１細胞応答の反対としての体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に対す
る、個体の免疫系を指向する因子として。

【０３９０】 腫瘍増殖を阻害する手段として。

【０３９１】 手術、外傷または遺伝子欠損の後のリンパ組織の生成および／または再生のた
めの治療として。

【０３９２】 ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる、遺伝的に受け継がれ
た障害のための、遺伝子に基づく治療として。

【０３９３】 ＣＲＣＧＣＬ媒介応答を阻害または増強する抗体の産生のための抗原として。

【０３９４】 Ｌｅｓｈｍａｎｉａなどの単球に影響する寄生虫疾患を防御するために、単球
／マクロファージを阻害する手段として。

【０３９５】 移植の前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示を減
少させ、従って回復を調節する。

【０３９６】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、アゴニストお
よび／もしくはアンタゴニストを使用して、インビトロまたはインビボでＩｇＥ
濃度を調節し得る。

【０３９７】 さらに、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、その
アゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、ＩｇＥ媒介アレルギー反
応を処置、予防および／または診断し得る。このようなアレルギー反応としては
、喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。

【０３９８】 特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、選択的Ｉｇ
Ａ欠損を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。

【０３９９】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、毛細管
拡張性運動疾患を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される
。

【０４００】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、共通可
変性免疫不全を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。

【０４０１】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、Ｘ連鎖
無ガンマグロブリン血症を処置、予防、診断、および／または改善するために投
与される。

【０４０２】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、重症複
合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置、予防、診断、および／または改善するために
投与される。

【０４０３】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、ヴィス
コット−オールドリッチ症候群を処置、予防、診断、および／または改善するた
めに投与される。

【０４０４】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、過剰Ｉ
ｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ欠損を処置、予防、診断、および／または改善するために
投与される。

【０４０５】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗
ＣＲＣＧＣＬ抗体）は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、白血病、組織球
性白血病、単球性白血病（例えば、急性単球性白血病）、白血病性細網症、Ｓｈ
ｉｌｌｉｎｇ型単球性白血病、ならびに／あるいは単球および／または単球細胞
および／または組織から誘導される他の白血病を処置、予防、診断、および／ま
たは改善するために投与される。

【０４０６】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、例えば
、結核と共に見られるような単球性類白血病反応を処置、予防、診断、および／
または改善するために投与される。

【０４０７】 別の特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、単球性
白血球増加症、単球性白血球減少症、単球減少症、および／または単球増加症を
処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。

【０４０８】 特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、および／または抗ＣＲＣＧＣＬ抗体および／またはそのアゴニス
トおよび／もしくはアンタゴニスト使用して、原発性Ｂリンパ球障害および／も
しくは疾患、ならびに／またはそれに付随する状態を処置、予防、検出および／
または診断する。

【０４０９】 好ましい実施形態においては、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、ポリヌクレオチド
および／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストを使用して、身
体の任意の１以上の種々の粘膜に影響する疾患もしくは障害または身体の任意の
１以上の種々の粘膜に関連する状態を処置、予防、および／または診断する。こ
のような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、粘膜破壊、粘膜性結腸炎、粘膜性リ
ーシュマニア症（例えば、アメリカリーシュマニア症、皮膚フランベシア、鼻咽
頭リーシュマニア症、および新世界リーシュマニア症）、粘膜皮膚リンパ節症候
群（例えば、川崎病）、小腸粘膜炎、粘膜性類表皮癌、粘膜性類上皮腫、粘膜上
皮形成異常、ムコイド腺癌、ムコイド変性、ミクソイド変性；粘膜腫変性；粘膜
腫症、ムコイド中膜変性（例えば、嚢胞性中膜壊死）、ムコリピドーシス（例え
ば、ムコリピドーシスＩ、ムコリピドーシスＩＩ、ムコリピドーシスＩＩＩ、ム
コリピドーシスＩＶを含む）、粘液溶解障害、粘液性膜性腸炎、小腸粘膜炎、ム
コ多糖体沈着症（例えば、Ｉ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、ハーラー症候群）
、ＩＳ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、シャイエ症候群またはＶ型ムコ多糖体沈
着症）、ＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、ハンター症候群）、ＩＩＩ型ムコ
多糖体沈着症（すなわち、サンフィリポ症候群）、ＩＶ型ムコ多糖体沈着症（す
なわち、モルキオ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、マロトー−ラ
ミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、βグルクロニダーゼ欠損
に起因するムコ多糖体沈着症）、およびムコスルファチドーシス）、ムコ多糖尿
、粘液膿性結膜炎、膿様粘液、ムコール症（すなわち、接合真菌症、粘膜病（す
なわち、ウシウイルス性下痢）、粘液性大腸炎（例えば、粘液性結腸炎および粘
膜性大腸炎）、ならびにムコビシドーシス（例えば、嚢胞性線維症、膵嚢胞性線
維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵臓の線維嚢胞病、ムコビシドーシ
ス、および粘液過剰症）。非常に好ましい実施形態においては、ＣＲＣＧＣＬポ
リペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタ
ゴニストを使用して、粘膜炎（特に化学療法に関連するような）を処置、予防、
および／または診断する。

【０４１０】 好ましい実施形態においては、ＣＲＣＧＣＬポリペプチド、ポリヌクレオチド
および／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストを使用して、静
脈洞炎に影響する疾患もしくは障害または静脈洞炎に関連する状態を、処置、予
防、および／または診断する。

【０４１１】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ＣＲＣＧＣＬのアゴニ
ストおよび／もしくはアンタゴニストによって処置、予防、および／または診断
され得る、さらなる状態、疾患または症状は、骨髄炎である。

【０４１２】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ＣＲＣＧＣＬのアゴニ
ストおよび／もしくはアンタゴニストによって処置、予防、および／または診断
され得る、さらなる状態、疾患または症状は、心内膜炎である。

【０４１３】 上記のすべての適用は、獣医学に適用され得る。

【０４１４】 ＣＲＣＧＣＬアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、Ｂ細胞悪性疾患（
例えば、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、プ
ラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、およびＥＢＶ形質転換病）
のための治療、ならびに、非定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血
症（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム病、関連特発性単一クローン性高ガンマ
グロブリン血症、およびプラズマ細胞腫などの疾患において明らかな、慢性高ガ
ンマグロブリン血症のための治療として使用され得る。

【０４１５】 免疫抑制剤。

【０４１６】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、アゴニストお
よび／もしくはアンタゴニストを使用して、インビトロまたはインビボにおける
ＩｇＥ濃度を調節し得る。

【０４１７】 別の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストの投与を使用して
、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応（喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これ
らに限定されない）を処置、予防、および／または診断し得る。

【０４１８】 上記に列挙した適用は、広範な種々の宿主における使用を有する。このような
宿主としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、
ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ
、非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態においては、宿主は、マウス、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ
またはネコである。好ましい実施形態においては、宿主は哺乳動物である。最も
好ましい実施形態においては、宿主はヒトである。

【０４１９】 アゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、
本明細書中で記載されるような）と共に、組成物中で使用され得る。

【０４２０】 上記の適用のすべては、獣医学に適用され得る。さらに、本明細書中に記載さ
れたすべての適用はまた、獣医学に適用され得る。

【０４２１】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに／また
はそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストを使用して、哺乳動物（好ま
しくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害および／またはこれらの障害に関
連する状態を、処置、予防、および／または診断し得る。多くの自己免疫障害は
、免疫細胞による、自己を外来物質とみなす不適切な認識によって生じる。この
不適切な認識は、宿主細胞の破壊を引き起こす免疫応答を生じる。従って、免疫
応答（特に、Ｂ細胞の増殖および／または免疫グロブリンの産生）を阻害し得る
本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに／または
そのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の処置
および／または予防における効果的な治療であり得る。従って、好ましい実施形
態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬアゴニストおよび／またはＣＲＣＧＣＬア
ンタゴニストを使用して、自己免疫障害を治療、予防、および／または診断し得
る。

【０４２２】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアン
タゴニストを用いて処置、予防、および／または診断され得る、自己免疫障害お
よびこれらの障害に関連する状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、特発性血小板
減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎
、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸
球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎性眼炎、
多発性内分泌腺症、紫斑病（例えば、ヘンノッホ−シェーンライン紫斑病）、ラ
イター病、スティッフマン症候群、自己免疫性肺炎、ギャン−バレー症候群、イ
ンスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼病。

【０４２３】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらは非常にあり得る）としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本
甲状腺炎）（例えば、細胞媒介性および体液性甲状腺細胞障害性によってしばし
ば特徴付けられる）、全身性エリテマトーデス（例えば、循環および局所的に産
生される免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、グッドパスチャー症候
群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）、天疱瘡（例えば
、表皮棘融解抗体によってしばしば特徴付けられる）、レセプター自己免疫（例
えば、（ａ）グレーブス病（例えば、ＴＳＨレセプター抗体によってしばしば特
徴付けられる）、（ｂ）重症筋無力症（例えば、アセチルコリンレセプター抗体
によってしばしば特徴付けられる）、および（ｃ）インスリン抵抗性（例えば、
インスリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる））、自己免疫性溶
血性貧血（例えば、抗体感受性ＲＢＣの食作用によってしばしば特徴付けられる
）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感受性血小板の食作用によっ
てしばしば特徴付けられる）。

【０４２４】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体によってし
ばしば特徴付けられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅ
ｒｍａ）（例えば、核小体抗体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に
対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋症／皮膚筋炎（例えば
、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗
壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、
特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒介性副腎細胞傷害性によってしば
しば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付け
られる）、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）（例えば
、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱
性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けら
れる）、シェーグレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非
ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例え
ば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、な
らびにアドレナリン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナ
リン作動性薬剤抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）。

【０４２５】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特
徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗
体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体
ならびに／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例え
ば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心
筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対する
ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮
膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特
徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、炎症性筋障害、ならびに多くの他の炎症性障
害、肉芽種性障害、変性障害、および萎縮性障害。

【０４２６】 好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、抗ＣＲＣＧＣＬを用いて、処
置、予防、および／または診断される。

【０４２７】 特定の好ましい実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬ、アゴニスト、ア
ンタゴニストを用いて、慢性関節リウマチが処置、予防、および／または診断さ
れる。

【０４２８】 特定の好ましい実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬ、アゴニスト、ア
ンタゴニストを用いて、ループスが処置、予防、および／または診断される。

【０４２９】 特定の好ましい実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬ、アゴニスト、ア
ンタゴニストを用いて、ループスに関連する腎炎が処置、予防、および／または
診断される。

【０４３０】 同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、
アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドならびに／またはアゴニストおよび／もしくはアン
タゴニストにより処置され得る。さらに、これらの分子を使用し、抗原性分子に
対するアナフィラキシー、過敏症または血液型不適合性を処置、予防、および／
または診断し得る。

【０４３１】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／ま
たはアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストをまた使用し、器官拒絶または
対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置、予防および／または診断し得る。器官拒
絶は、免疫応答を介した宿主免疫細胞による移植組織の破壊によって起こる。同
様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与しているが、この場合、外来性の移植免
疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性
を阻害する、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならび
に／またはアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストの投与は、器官拒絶また
はＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。

【０４３２】 同様に、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、なら
びに／またはアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストをもまた使用し、炎症
を調節し得る。例えば、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、ならびに／またはアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、炎症
応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使用して、
慢性の前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関連する炎症
（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）
）、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節炎に関連
する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイト
カインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連
する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまた
はＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両方の状態の
炎症状態を処置、予防および／または診断し得る。

【０４３３】 特定の実施形態において、本発明の抗ＣＲＣＧＣＬ抗体を使用して、炎症を処
置、予防、調節、検出および／または診断する。

【０４３４】 特定の実施形態において、本発明の抗ＣＲＣＧＣＬ抗体を使用して、炎症性障
害を処置、予防、調節、検出および／または診断する。

【０４３５】 別の特定の実施形態において、本発明の抗ＣＲＣＧＣＬ抗体を使用して、アレ
ルギーおよび／または過敏症を処置、予防、調節、検出および／または診断する
。

【０４３６】 特定の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニス
トを使用して、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置、予防、および／または診
断する。

【０４３７】 別の実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト
を使用して、線維症および線維症に関連する状態（例えば、嚢胞性線維症（膵臓
の嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵線維嚢胞症、ムコビシ
ドーシス、および粘液過剰症のような線維症を含む）、心内膜心筋線維症、特発
性腹膜後線維症、軟膜線維症、縦隔線維症、結節性表皮下線維組織増殖症、中心
静脈周囲線維化、筋周囲線維化、パイプ軸線維症、置換性線維形成、外膜下線維
症、シンマーズ陶製パイプ柄状線維症があるが、これらに限定されない）を、処
置、予防、および／または診断する。

【０４３８】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチドならびにそれらの
アゴニストおよびアンタゴニストを用いて、診断、処置、または予防され得る、
増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、以下が挙
げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン
依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞
腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮
腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポ
ジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自己免疫障害
（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎性慢性関節リウマ
チ）；ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデ
ノウイルス）；炎症；対宿主性移植片病；急性移植片拒絶および慢性移植片拒絶
。従って、好ましい実施形態においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニ
ストを使用して、自己免疫疾患を処置、予防、および／または診断するため、な
らびに／あるいは癌の増殖、進行、および／または転移を阻害し、このような癌
としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：本明細書中に記載された
癌（例えば、リンパ球性白血病（例えば、ＭＬＬおよび慢性リンパ球性白血病（
ＣＬＬ）を含む）および濾胞性リンパ腫）。別の実施形態においては、本発明の
ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニ
ュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを使用して、癌
細胞または癌組織（例えば、Ｂ細胞系関連癌（例えば、ＣＬＬおよびＭＬＬ）、
リンパ球性白血病、またはリンパ腫）を活性化、分化または増殖させ、そしてそ
れによって細胞を、癌治療（例えば、化学療法または放射線療法）に対してより
脆弱にする。

【０４３９】 さらに、他の実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまた
はポリペプチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、
、以下のような悪性腫瘍および関連する障害の増殖、進行、および／または転移
を阻害する：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性
白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血
病、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒
球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リン
パ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンス
トレームマクロ大グロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（肉腫および癌腫（
例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管
肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイン
グ腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、
扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢
胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮
腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌
、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、
松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉ
ｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。

【０４４０】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにそれら
のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて診断、処置、または予防され得る、
増加したアポトーシスに関連する疾患としては、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；
神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化
症、色素性網膜炎、小脳変性）；脊髄形成異常性症候群（例えば、再生不良性貧
血）、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作および再灌流障害によって引き起こ
される障害）、毒素誘導性肝疾患（例えば、アルコールによって引き起こされる
障害）、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振。従って、好ましい実施形態
においては、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチドならび
に／あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、上記に列挙
される疾患および障害を処置、予防、および／または診断する。

【０４４１】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
れらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／また
は状態の診断および処置または予防において有用である。このような疾患および
状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌（例えば、免疫
細胞間連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または変
化に関連する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非小
細胞癌、肺の小細胞癌、胃癌など）、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節症）
、微生物（例えば、ウイルス、細菌など）感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩ
Ｖ−２感染、ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ
、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むが、これらに限定されない）、アデノ
ウイルス感染、ポックスウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染、肝炎ウイ
ルス（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、ヘリコバクターピロリ感染、侵
襲性ブドウ球菌感染など）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）
、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、低脈
管形成または減少した循環（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作など
））、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病
、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移植
片拒絶（急性および慢性）、対宿主性移植片病、骨髄形成異常による疾患（例え
ば、再生不良性貧血など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝疾患（例えば、
急性肝炎および慢性肝炎、肝傷害ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多
発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球体
腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴス病、橋本
甲状腺炎など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病合併症（例
えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ、
喘息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、ならびに潰瘍性大腸炎。

【０４４２】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
れらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、新脈管形成の促進、創傷治
癒（例えば、傷、火傷、および骨折）において有用である。本発明のポリヌクレ
オチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストはまた、特定の抗原、抗ウイルス性免疫応答に対する
免疫応答性を増強するためのアジュバントとして有用である。

【０４４３】 より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドなら
びに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、免疫応答
の調節（すなわち、増強および減少）において有用である。例えば、本発明のポ
リヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線療法、化学
療法、および移植の準備または手術、外傷、放射線療法、化学療法、および移植
からの回復において有用であり得るか、あるいは高齢者および免疫無防備状態の
個体における免疫応答および／または免疫回復をブーストするために使用され得
る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに
／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、例えば、自己
免疫性障害の処置または予防における、免疫抑制剤として有用である。特定の実
施形態においては、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、
慢性炎症、アレルギーまたは自己免疫状態（例えば、本明細書中に記載されるか
、そうでなければ、当該分野において公知の自己免疫状態）を処置または予防す
るために使用され得る。

【０４４４】 好ましくは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに／
あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ＣＲＣＧ
ＣＬ抗体）を用いる処置は、有効量の本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチド、ある
いはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを、患者に投与することによるか
、あるいは患者から細胞を取り除き、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドをその細胞
に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）ことによるかの
いずれかであり得る。さらに、本明細書中でさらに考察されるように、ＣＲＣＧ
ＣＬポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染性疾患に対する免疫応答を生
じるためのワクチンにおけるアジュバントとして使用され得る。

【０４４５】 （免疫活性） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走
化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の欠損または障害の処置にお
いて有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多
能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）お
よびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫の欠
損または障害の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌または
いくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）
または感染的であり得る。さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の免
疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使
用され得る。

【０４４６】 興味深いことに、ＣＲＣＧＣＬは、ＸおよびＹ染色体上の偽常染色体領域をマ
ッピングする。ＣＲＣＧＣＬの変異はまた、おそらく免疫障害（特に、活性化Ｔ
細胞に関する免疫障害）を導き得ると考えられる。さらに、ＣＲＣＧＣＬの変異
は、自己免疫疾患（特に、Ｘ連鎖自己免疫疾患）に含まれ得る。

【０４４７】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストは、造血細胞の欠損または障害の処置または検
出において有用であり得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の（または
多くの）型の造血細胞の減少に関連した障害を処置する試みにおいて、多能性幹
細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。免疫不
全症候群の例としては、血液タンパク質の障害（例えば、無ガンマグロブリン血
症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全
、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全
症候群、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ
）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビ
ン尿症が挙げられるが、それらに限定されない。

【０４４８】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を
止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性
または血栓崩壊活性を増大させることにより、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストを
使用し、血液凝固の障害（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板
の障害（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じ
る創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得るＣ
ＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴ
ニストまたはアンタゴニストを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作
（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置において、これらの分子は重
要であり得る。

【０４４９】 自己免疫障害の処置または検出において、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、
はまた、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質
として不適切に自己認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の
破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、
分化または走化性を阻害し得るＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストの投与は、自己免
疫障害の防止において効果的な治療であり得る。

【０４５０】 処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力
症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、類天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ラ
イター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデ
ス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、
および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、それらに限定されない。

【０４５１】 同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、
アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストに
より処置され得る。さらに、これらの分子を使用し、抗原性分子に対するアナフ
ィラキシー、過敏症または血液型不適合性を処置し得る。

【０４５２】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストを使用し、器官拒絶または対宿主性移植片病（
ＧＶＨＤ）を処置および／または予防し得る。器官拒絶は、免疫応答を介した宿
主免疫細胞による移植組織の破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤ
にもまた関与しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊す
る。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、ＣＲＣＧＣＬ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまた
はアンタゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治
療であり得る。

【０４５３】 同様に、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストをもまた使用し、炎症を調節し得る。
例えば、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧ
ＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、炎症応答に関与する細胞の増殖およ
び分化を阻害し得る。これらの分子を使用して、慢性の前立腺炎、肉芽腫性前立
腺炎およびマラコプラキア、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、
敗血症、または全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する
炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒
絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導
する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連す
る炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生
じる炎症を含む、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置し得る。

【０４５４】 （過剰増殖障害） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストを使用し、新生物を含む過剰増殖障害を処置ま
たは検出し得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいは
ＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、直接的または間接的な相互
作用を介してこの障害の増殖を阻害し得る。あるいは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、過剰増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。

【０４５５】 例えば、免疫応答を増大させること、特に過剰増殖障害の抗原性の質を増大さ
せることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって
、過剰増殖障害を処置し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫
応答を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは
、免疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過剰増殖障害を処置
する方法であり得る。

【０４５６】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストによって処置または検出され得る過剰増殖障害
の例としては、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺
（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部
、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、なら
びに泌尿生殖器に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。

【０４５７】 同様に、他の過剰増殖障害もまた、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストにより処置
または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられ
るがこれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パ
ラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンスト
レームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰
増殖性疾患、加えて上記に列挙した器官系に見出される新生物。

【０４５８】 （心臓血管障害） ＣＲＣＧＣＬをコードするＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、四肢虚
血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障害を処置し得る。

【０４５９】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。

【０４６０】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。

【０４６１】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。

【０４６２】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。

【０４６３】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。

【０４６４】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。

【０４６５】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞
疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静
脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａ
ｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静
脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる
。

【０４６６】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。

【０４６７】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。

【０４６８】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈
瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の
塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出
血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症
候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃ
ｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。

【０４６９】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。

【０４７０】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。

【０４７１】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置
に対して特に有効である。実施例において示されるように、実験的に誘導された
虚血ウサギ後肢へのＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与は
、血圧比、血流、血管造影的スコア、および毛細管密度を回復し得る。

【０４７２】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投
与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射
、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速
器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口ま
たは坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロ
ゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で
公知である。ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、薬学
的組成物の一部として投与され得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドを送達する
方法は本明細書中でより詳細に記載される。

【０４７３】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移を含む異常な新生血管形成、
関節炎、いくつかの型の眼の障害および乾癬により支配される。例えば、Ｍｏｓ
ｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら
、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａ
ｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（
１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．
Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋ
ｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を
参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態
に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有
意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。

【０４７４】 本発明は、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチ
ド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生
血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置
し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、
および癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説について
は、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏ
ｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【０４７５】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ＣＲＣＧＣＬア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管
形成に関連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ
膜炎、未熟児網膜症、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼
の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａ
ｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）
およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（
１９７８）による総説を参照のこと。

【０４７６】 さらに、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ＣＲＣ
ＧＣＬアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）で処置され得る障害と
しては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、
血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、
過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ
）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。

【０４７７】 さらに、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドおよびポリペプチド（ＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストを含む）で処置され得る障害および／
または状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形腫瘍、
血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポ
ージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、お
よび化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖
尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体
後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷
治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折
、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎ
ａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈
管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張
症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、
アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必
要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病
（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のよう
な新脈管形成を有する疾患。

【０４７８】 （細胞レベルでの疾患） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬ
のアンタゴニストもしくはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存
の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リ
ンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：
結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸
癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞
腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫およ
び卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬
化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂ
ｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマ
トーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス
感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、
炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げら
れる。好ましい実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増
殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される
。

【０４７９】 ＣＲＣＣＧのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬア
ゴニストもしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の
増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転
移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：
白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽
球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならび
に慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白
血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン
病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、な
らびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟
骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａ
ｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫
瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁
平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞
腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノ
ーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱
癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣
細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎ
ａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、こ
れらに限定されない）。

【０４８０】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬ
のアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポト
ーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害
（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網
膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例え
ば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチ
ェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全
身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、
脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷
害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（
例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏ
ｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによっ
て引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。

【０４８１】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストを、
治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラ
チノサイトを刺激するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激する
ために、利用するためのプロセスが提供される。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
またはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニスト
は、以下を含む創傷治癒を刺激することにおいて臨床的に有用であり得る：外科
的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷
、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性
の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質による熱傷、および他の異
常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロ
イド、放射能療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に
関連する合併症。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならび
にＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮膚の欠失後の皮膚の
回復を促進するために使用され得る。

【０４８２】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬ
のアゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮
膚移植片の付着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するため
に使用され得る。以下は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
ＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への付着を増大するた
めに使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａ
ｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ
ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植
片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移
植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移
植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ
）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒ
ａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストは
、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善するために使用さ
れ得る。

【０４８３】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬ
のアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵
臓、胃、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細
胞増殖における変化を生じると考えられる。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺
胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細
胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれる
それらの先祖）の増殖を促進し得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細胞、
ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。

【０４８４】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感
染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。ＣＲＣＧＣＬポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬアゴニストまたはア
ンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。ＣＲＣＧＣＬポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはア
ンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏ
ｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。

【０４８５】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬア
ゴニストまたはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮
膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増
殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。ＣＲＣＧ
ＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニスト
またはアンタゴニストは、表皮水疱症、これらの損傷の再上皮形成を促進するこ
とによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着に
おける欠損を処置するために使用され得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストはま
た、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびに
より迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を助けるため
に使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）
は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って、
ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのア
ゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎ
ｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾患の進行を予
防するために、使用され得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、
胃腸管全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸
粘膜を、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用さ
れ得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧ
ＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの発
現下に関連する疾患を処置するために使用され得る。

【０４８６】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への
損傷を予防および治癒するために使用され得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
またはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニスト
のような増殖因子は、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、増
殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上
皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死
を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じる）および吸入損傷（すな
わち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを使用して効果的に
処置され得る。また、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、なら
びにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の
増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における硝子
膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を
処置または予防することを助け得る。

【０４８７】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬア
ゴニストまたはアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そ
して従って、肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝
炎ウイルスおよび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａ
ｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒
素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。

【０４８８】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予
防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された
患者において、いくつかの島細胞機能が残っている場合、ＣＲＣＧＣＬポリヌク
レオチドまたはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、その疾患の持続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その
島機能を維持するために使用され得る。また、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは
、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使用さ
れ得る。

【０４８９】 （感染性疾患） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストは、感染因子を処置または検出するために用い
られ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／ま
たはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され
得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開
始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴ
ニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得
る。

【０４９０】 ウイルスは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣ
ＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾
患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、
以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに
限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテ
リウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコ
ウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、フラビウイルス
科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロ
ウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎ
ｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウ
イルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ）、パポバ
ウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例
えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レ
トロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびト
ガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以
下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節
炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、脳炎、眼性感染症（例えば
、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活
動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキッ
トリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬
病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ
）、およびウイルス血症。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
またはＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれ
らの症状または疾患が処置または検出され得る。

【０４９１】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
またはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニスト
によって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラ
ム陰性細菌科およびグラム陽性細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されな
い：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉ
ｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏ
ｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ
、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉ
ｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ
、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例え
ば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒ
ｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａ
ｌ。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患ま
たは症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブド
ウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周
囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または
蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、
腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ
結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅
熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏ
ｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド
またはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて、これらの症状もしくは疾患のいずれかを処置または検出し得る。

【０４９２】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたははアンタゴニストにより処置または検出され得る、寄
生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーが挙げられ
るがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプ
トスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫
、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリ
ア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈ
ｏｍｏｎａｓ）症。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種
々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾
患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（
例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。Ｃ
ＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬのアゴニ
ストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処
置または検出し得る。

【０４９３】 好ましくは、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣ
ＲＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、患者に有効量の
ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、Ｃ
ＲＣＧＣＬポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に
戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、ＣＲＣＧ
ＣＬポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて
、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。

【０４９４】 （再生） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして
誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９
９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、
切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅ
ｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維
症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修
復、置換、または保護し得る。

【０４９５】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。

【０４９６】 さらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣ
ＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を
増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回
復時間が早まる。本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
ならびにＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、損傷を回避
する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手
根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生の
さらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に
関連する潰瘍が挙げられる。

【０４９７】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＣ
ＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴ
ニストまたはアンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用
いて処置され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障
害、または機械的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患
、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連す
る疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、
局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソ
ン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群
）はすべて、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲ
ＣＧＣＬのアゴニストまたはアンタゴニストを用いて処置され得る。

【０４９８】 （走化性） ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細
胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞
および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、また
は過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の
外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。

【０４９９】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次
いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の
数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫
系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫
細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。
走化性分子として、ＣＲＣＧＣＬはまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を
処置するために使用され得る。

【０５００】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストまたはアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図され
る。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、ＣＲＣ
ＧＣＬポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＣＲＣＧＣＬのアゴニス
トまたはアンタゴニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。

【０５０１】 （結合活性） ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、ＣＲＣＧＣＬに結合する分子、またはＣＲＣＧ
ＣＬが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。このＣＲ
ＣＧＣＬとこの分子との結合は、結合したＣＲＣＧＣＬまたは分子の活性を活性
化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。その
ような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レ
セプター）、または低分子が挙げられる。

【０５０２】 好ましくは、この分子は、このＣＲＣＧＣＬの天然のリガンド（例えば、ＴＳ
ＬＰ）、ＴＳＬＰのフラグメント、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物
、もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９
９１）を参照のこと）。いずれの場合においても、この分子は、公知の技術を用
いて合理的に設計され得る。

【０５０３】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ＣＲＣＧＣＬを、分
泌タンパク質としてかまたは細胞膜上のいずれかで発現する適切な細胞を産生す
る工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、ＣＲＣＧＣＬを発
現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を、好ましくは、
ＣＲＣＧＣＬまたはこの分子のいずれかの結合、活性の刺激、または活性の阻害
を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触させる。

【０５０４】 アッセイは、ＣＲＣＧＣＬへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結
合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおい
て検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＣＲＣＧＣＬへの結合によっ
て生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。

【０５０５】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、ＣＲＣＧＣＬを含む溶液と混合する工程、ＣＲＣ
ＧＣＬ／分子の活性または結合を測定する工程、およびＣＲＣＧＣＬ／分子の活
性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。

【０５０６】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＣＲＣＧＣＬ
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ＣＲＣＧＣＬへの直接的もしくは間
接的のいずれかの結合、または基質（例えば、ＴＳＬＰ）についてのＣＲＣＧＣ
Ｌとの競合によって、ＣＲＣＧＣＬのレベルまたは活性を測定し得る。

【０５０７】 さらに、ＣＲＣＧＣＬが結合するレセプターは、当業者に公知の多くの方法（
例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、第５章（
１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポリアデニ
ル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用いられ、
例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対する複数
のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、およびこのＲＮ
Ａから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてこのポリ
ペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするため
に使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされた細胞は
、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。このポリペプ
チドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位のヨウ素
化または封入を含む）によって標識化され得る。

【０５０８】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。

【０５０９】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、この標識ポリペプチドは、
レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性に連結し得る。架
橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィルムに曝露さ
れる。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、ペプチドフ
ラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され得る。微小
配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌクレオチド
プローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定レセプター
をコードする遺伝子を同定する。

【０５１０】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、ＣＲＣＧＣＬの活性を調節し得、それによって
ＣＲＣＧＣＬのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、
米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０
，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、な
らびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏ
ｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；
ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これらの特許および刊行
物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。１つの実
施形態において、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの
変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは
、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントの
、所望のＣＲＣＧＣＬ分子へのアセンブリを含む。別の実施形態において、ＣＲ
ＣＧＣＬポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換えの前に、誤り
がちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施
形態において、ＣＲＣＧＣＬの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイ
ン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切
片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施形態に
おいて、この異種分子は、サイトカインレセプターファミリーのメンバーである
。さらに好ましい実施形態において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖
因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング
増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧ
Ｆ）、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ
−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタ
プレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２
、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａ
ｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、
ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子で
ある。

【０５１１】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＣＲＣＧＣＬフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドの活性に類
似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメン
トの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活性
を含み得る。

【０５１２】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および³[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で組み合
わせる工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化
合物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖
の量と比較して、各々の場合における³[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって
、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、 ³ [Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィー
によって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、
この手順により同定され得る。

【０５１３】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
ＣＲＣＧＣＬレセプターが測定され、そしてこの化合物がレセプターに結合し、
そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜
在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセ
カンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル
またはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。

【０５１４】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ＣＲＣＧＣＬ／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における
特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッ
セイは、適切に操作された細胞または組織からのＣＲＣＧＣＬの産生を阻害また
は増強し得る因子を発見し得る。従って、本発明は、以下の工程を含むＣＲＣＧ
ＣＬに結合する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物をＣＲ
ＣＧＣＬとともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを
決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニス
トを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物をＣＲＣＧＣＬとともにインキ
ュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ＣＲ
ＣＧＣＬの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。

【０５１５】 また、図３および表１に開示されるβプリーツシート領域を用いることによっ
て、ＣＲＣＧＣＬに結合する分子を実験的に同定し得る。従って、本発明の特定
の実施形態は、図３／表１に開示される各βプリーツシート領域のアミノ酸配列
を含むか、あるいはこれらの配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図３／表１に開示されるβプリ
ーツシート領域の任意の組み合わせまたは図３／表１に開示されるβプリーツシ
ート領域のすべてを含むか、あるいはこれらからなるＣＲＣＧＣＬポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる好ましい実施形態は
、図３／表１に開示されるβプリーツシート領域の各々のＣＲＣＧＣＬアミノ酸
配列を含むか、あるいはこれらの配列からなるポリペプチドに関する。本発明の
さらなる実施形態は、図３／表１に開示されるβプリーツシート領域の任意の組
み合わせまたは図３／表１に開示されるβプリーツシート領域のすべてを含むか
、あるいはこれらからなるＣＲＣＧＣＬポリペプチドに関する。

【０５１６】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号１に含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸、および／または寄託されたクローン
２０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸
である。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生
成され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば
、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を
参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス
技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重ら
せんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏ
ｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で議論される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅ
ｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７
９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；および
Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において議論
される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの
結合に基づく。

【０５１７】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。

【０５１８】 １つの実施形態において、本発明のＣＲＣＧＣＬアンチセンス核酸は、外来の
配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が
転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクタ
ーは、ＣＲＣＧＣＬアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベク
ターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソ
ームのベクターのままであるか、または染色体に組込まれ得る。このようなベク
ターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。
ベクターは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分
野で公知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。ＣＲＣＧＣＬをコードする配
列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作
用する、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモー
ターは、誘導性または構成的であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０
初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ
、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復
に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９
７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９
８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定さ
れない。

【０５１９】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくともＣＲＣＧＣＬ遺伝子のＲＮＡ転写物
の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、
必ずしも必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相
補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な
二重鎖を形成する配列を意味し；従って、二本鎖ＣＲＣＧＣＬアンチセンス核酸
の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成が
アッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセン
ス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど
、ＣＲＣＧＣＬ ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含み得、これは、安定
な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなお形成し得る。
当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために標準的な手順を使用す
ることによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。

【０５２０】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３
５を参照のこと。従って、図１Ａ〜Ｂに示されるＣＲＣＧＣＬの５’−または３
’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性
ＣＲＣＧＣＬ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得
る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コ
ドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明
に従って使用され得る。ＣＲＣＧＣＬ ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコ
ード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセ
ンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは
６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面にお
いて、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１
７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチ
ドである。

【０５２１】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格にお
いて改変され、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得
る。このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビ
ボで宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促
進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ
ら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切断
剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ａ
ｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６
：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を含み得
る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、
ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切断
剤など）に結合体化され得る。

【０５２２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。

【０５２３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。

【０５２４】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。

【０５２５】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−ア
ノマーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的
なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対
に、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、
２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１
５：３２７−３３０）。

【０５２６】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例えば、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８８、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）により合成され得、メチルホス
ホネートオリゴヌクレオチドは、制御された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）の使
用などにより調製され得る。

【０５２７】 一方、ＣＲＣＧＣＬコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、
使用され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も
好ましい。

【０５２８】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、ＣＲＣＧＣＬ ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リ
ボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相
補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する
。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基の配列を有するこ
とである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は
当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）に、より十分に記載される。ＣＲ
ＣＧＣＬ（図１Ａ〜Ｂ）のヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッド
型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部
位がＣＲＣＧＣＬ ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すなわち、効率
を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操
作される。

【０５２９】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいてＣＲＣＧＣＬを発現する細胞に送達されるべきである
。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの
導入のための上記と同じ様式で細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は、
強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｌ ＩＩプロモー
ターのような）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用する
ことを含み、その結果、トランスフェクトした細胞は、内因性ＣＲＣＧＣＬメッ
セージを破壊しそして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リボ
ザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効
率のために必要とされる。

【０５３０】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織上で
の本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、そ
れにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において）
遅延または防止する。

【０５３１】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患をも阻害し得、
そして水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手
術後の上皮レンズ細胞の増殖をも防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェ
ン活性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要
求され得る。

【０５３２】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
をも防止し得る。

【０５３３】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
も処置し得る。

【０５３４】 （他の活性） 本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種
々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因
する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。これらの
ポリペプチドをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再
形成を刺激し得る。

【０５３５】 本発明のポリペプチドをまた、傷害、熱傷、手術後組織修復、および瘢痕に起
因する創傷の処置にも利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞
（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それ
ゆえダメージを受けた組織または疾患組織の修復または置換を促進するからであ
る。

【０５３６】 本発明のポリペプチドをまた使用して、ニューロンの成長を刺激し、そして特
定のニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキ
ンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンのダメージを
処置および予防し得る。ＣＲＣＧＣＬは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得
、それゆえ、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または骨の移植
片における補助のために利用され得る。

【０５３７】 本発明のポリペプチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することに
より、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。

【０５３８】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドをまた、抜け毛を予防するためにも利用し得る。な
ぜなら、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノ
サイト増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のポリペプチドを
利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄
細胞の増殖および分化を刺激し得る。

【０５３９】 ＣＲＣＧＣＬポリペプチドをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、ま
たは始原組織の細胞培養を支持するために使用し得る。

【０５４０】 本発明のポリペプチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。

【０５４１】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、先に議論されるように、造血系統に
加えて胚性幹細胞の分化または増殖を増加または減少し得る。

【０５４２】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体
重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例
えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、ＣＲＣＧＣＬポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬのアゴニストもしくは
アンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギ
ーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。

【０５４３】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒ
ｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの
耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、
ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他
の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を
変更するために使用され得る。

【０５４４】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＣＲＣＧＣＬの
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂
質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分
を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。

【０５４５】 上記に列挙される用途は、広範な種々の宿主において使用される。このような
宿主としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウサ
ギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミ
ニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、
非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は哺乳動物である。最も好まし
い実施形態において、宿主は、ヒトである。

【０５４６】 概して、本発明を記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによ
って容易に理解される。この実施例は例示の目的のために提供されるものであり
、限定することを意図するものではない。

【０５４７】 （実施例） （実施例１：寄託されたサンプルからのＣＲＣＧＣＬ ｃＤＮＡクローンの単
離） ＣＲＣＧＣＬのｃＤＮＡを、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩマルチクローニング部位に挿入する。Ｕｎｉ−ＺＡＰ
ＸＲは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）に形質転換され得る。（例え
ば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：５９−（１９９３）を参照
のこと）。

【０５４８】 寄託されたサンプルからＣＲＣＧＣＬを単離するために２つのアプローチが使
用され得る。第１に、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給元または関連
する刊行物もしくは特許によって提供される技術）を用いて、寄託されたクロー
ンを適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形
質転換し得る。形質転換体を、１．５％寒天プレート（適切な選択剤（例えば、
アンピシリン）を含む）に、プレート当たり約１５０形質転換体（コロニー）の
密度でプレートする。次いで、単一のコロニーを使用して、当業者に周知の核酸
単離技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を用いて
ＤＮＡを生成する。

【０５４９】 あるいは、配列番号１の両端（すなわち、クローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴ
によって囲まれる配列番号１の領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの
２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラ
スミドを鋳型として用いて、ＣＲＣＧＣＬ ｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ
連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡ鋳型との反応
混合物の２５μｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットの
Ｔａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；
５５℃でのアニールを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産物を
アガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバンド
を切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングお
よび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。

【０５５０】 寄託されたクローンに存在し得ないＣＲＣＧＣＬ遺伝子の５’非コード部分ま
たは３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これ
らの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特
異的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および
３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５
’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の５’末端の欠失を生成するた
めに利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。

【０５５１】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的のＣＲＣＧＣＬ遺伝子の公知の配列に特
異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、ＣＲＣＧＣＬ全長遺伝子
の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そし
てこれを使用して全長遺伝子を生成し得る。

【０５５２】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された全ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮ
Ａの５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。こ
の反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連
結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。

【０５５３】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末
端配列がＣＲＣＧＣＬ遺伝子に属することを確認する。

【０５５４】 （実施例２：ＣＲＣＧＣＬゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号１に対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。

【０５５５】 （実施例３：ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの組織分布） ＣＲＣＧＣＬのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに
よって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決定する
。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるＣＲＣＧＣＬプローブ
を、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ^TM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ｐ ³² で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^TMカラム
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造
者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、この精製した
標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。

【０５５６】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。

【０５５７】 （実施例４：ＣＲＣＧＣＬの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号１の５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。

【０５５８】 （実施例５：ＣＲＣＧＣＬの細菌性発現） 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例
１に概説するように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用して増幅して挿入フラグメントを合成する。ｃＤ
ＮＡ挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物
をクローニングするために、プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
のような制限部位を好ましくは含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂ
ａＩは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗
生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプ
ロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒ
スチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。

【０５５９】 詳細には、細菌性ベクターにおいてＣＲＣＧＣＬタンパク質をクローン化する
ために、５’プライマーは、配列番号１におけるＣＲＣＧＣＬ配列のアミノ末端
コード配列の多数のヌクレオチドを伴うＮｃｏ Ｉ制限部位を含む、配列５’
ＧＴＴＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡ ３’（配列番
号１４）を有する。当業者は、もちろん、５’プライマーが始まるタンパク質コ
ード配列における点が、上記の部分より短いかまたは長い完全なＣＲＣＧＣＬタ
ンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するために変
更され得ることを理解する。３’プライマーは、配列番号１のＣＲＣＧＣＬ Ｄ
ＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な多数のヌクレオチドを後に伴う、Ｂ
ｇｌＩＩ制限部位を含む配列５’ ＧＧＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡ
ＣＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＣ ３’（配列番号１５）を有する。

【０５６０】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）を与えるプラスミドｐＲ
ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、ＬＢプレート上で生
育するそれらの能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認す
る。

【０５６１】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種
するために使用する。細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ
．⁶⁰⁰）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化により誘導され、Ｐ／Ｏの障害物を除去し、遺伝子発現の
増加を導く。

【０５６２】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩ
ＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有する
タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手
順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１
９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。

【０５６３】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、そのカラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。

【０５６４】 次いで、精製したＣＲＣＧＣＬタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌに対して透析することにより再生させる。あるいは、ＣＲＣＧＣＬタンパク
質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よく再折畳みされ得る。推
奨条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６
Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて
行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって
溶出させる。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ６の
緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。
精製したＣＲＣＧＣＬタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で冷凍
する。

【０５６５】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメント
を含み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６
４５、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マ
ーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌ
ｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレータ
ー配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレ
ッサー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレ
ーター配列を合成的に作製する。

【０５６６】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。

【０５６７】 操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。より好ましくは、細菌性ベクター（ｐＱＥ
６０）はまた、ＣＲＣＧＣＬを発現するために使用され得る。

【０５６８】 （実施例６：封入体からのＣＲＣＧＣＬポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で発現されたＣＲＣＧＣＬポリペプチドを精製するために使用され得る。
他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。

【０５６９】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。

【０５７０】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。

【０５７１】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。

【０５７２】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。

【０５７３】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。このカラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩
衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣ
ｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に
モニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する
。

【０５７４】 次いでＣＲＣＧＣＬポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と
混合する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏ
ｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂
および弱アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ
酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸
ナトリウム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０
カラムを１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナト
リウム、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．５の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ₂₈₀モニタリング
下で収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した
）ポリペプチドを含む画分をプールする。

【０５７５】 得られたＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で
９５％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる
場合、いかなる主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルから観察されないはずである。精製ＣＲＣＧＣＬタンパク質はまた
、エンドトキシン／ＬＰＳ混在について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ
含量はＬＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。

【０５７６】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるＣＲＣＧＣＬのクローニングお
よび発現） この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ＣＲＣ
ＧＣＬポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入し、ＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドを発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ核多核体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、
続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含
む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的な
ポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、この
プラスミドは、同方向の弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ
．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポ
リアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、クローン化したＣＲＣＧＣ
Ｌポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する、野生型ウイルス
ＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と両方の側で隣接する
。

【０５７７】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。

【０５７８】 具体的には、ＡＵＧ開始コドンおよび任意の天然で関連するリーダー配列を含
む、寄託されたクローンに含まれるＣＲＣＧＣＬ ｃＤＮＡ配列を、実施例１に
記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配
列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナル
ペプチドを必要としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａ
ｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔ
ｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉ
ｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＮＯ．：１５５５（１９８７）に記載される標準的な
方法を用いて、このベクターを、バキュロウイルスリーダー配列を含むように改
変し得る（ｐＡ２ＧＰ）。

【０５７９】 より詳細には、受託されたクローンにおける全長ＣＲＣＧＣＬタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡ配列（開始コドンおよび配列番号１において示される天然で関
連するリーダー配列を含む）は、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。例えば、５’プライマー
は、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位、真核生物細胞における翻訳の開始のために有効な
シグナルを含む、配列５’ＣＣＧＧＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴ
ＴＴＧＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧ３’（配列番号１６）（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７））、その後に続く図１
Ａ〜１Ｂにおいて示される完全なＣＲＣＧＣＬタンパク質の配列の多数のヌクレ
オチド、を有し得る。あるいは、５’プライマー：５’ＣＣＧＧＴＴＡＧＡＴＣ
ＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧ３’（配列番号２８）（
これもまたＢｇｌ ＩＩ制限部位を有する）もまた、使用され得る。この３’プ
ライマーはまた、ＸｂａＩ制限酵素部位を含む配列５’ ＣＣＧＧＴＴＴＣＴＡ
ＧＡＴＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＣ ３’（配列番号１７
）、その後に続く、図１Ａ〜１Ｂにおける３’非コード配列に相補的な多数のヌ
クレオチド、を有する。

【０５８０】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロース
ゲルから単離する。次いで、このフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そし
て再び１％アガロースゲル上で精製する。

【０５８１】 このプラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野
で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る
。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。

【０５８２】 このフラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕ
ｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。このプラスミドを含む細菌を、個々のコロ
ニー由来のＤＮＡを消化し、そしてゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とにより同定する。クローニングしたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定に
よって確認する。

【０５８３】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時
トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ウイルスＤＮＡおよ
び５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清のグレー
ス培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いで、このプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をこのプレートから
除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。次いで、培養を２７℃で４日間継続する。

【０５８４】 ４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によっ
て記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラ
ークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする。（この型の「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養お
よびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチッ
プ（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そ
して組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播
種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集
し、次いで４℃に貯蔵する。

【０５８５】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染効率（「ＭＯ
Ｉ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。
放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可
能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの ³⁵ Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに
１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパ
ク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオートラ
ジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。

【０５８６】 精製ＣＲＣＧＣＬタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を
使用して、産生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。

【０５８７】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるＣＲＣＧＣＬポリペプチドの発現） ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを、哺乳動物細胞において発現させ得る。代表的な
哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメ
ント、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化
に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋ
ｏｚａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびア
クセプター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由
来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ
、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）の初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例え
ば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。

【０５８８】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａ
ｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃｏ
ｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、およ
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。

【０５８９】 あるいは、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは、染色体に組み込まれたＣＲＣＧＣＬ
ポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、
ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフ
ェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。

【０５９０】 トランスフェクトされたＣＲＣＧＣＬ遺伝子はまた、大量のコードされたタン
パク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）
マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開
発に有用である（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ
．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１
４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別
の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐ
ｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂ
ｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５（１９
９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ
、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体
に組み込まれた、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。

【０５９１】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、ＣＲＣＧＣＬのクロ
ーニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロ
インスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、ならびに、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。

【０５９２】 具体的には、プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、適切な制限酵素を用いて消化
し、次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲル
から単離する。また、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）が好まれる。

【０５９３】 分泌タンパク質の産生のために天然に存在するシグナル配列が用いられる場合
、このベクターは、第２のシグナルペプチドを含む必要はない。あるいは、天然
に存在するシグナル配列が用いられない場合、このベクターは、細胞からこのタ
ンパク質を分泌させる目的で、異種シグナル配列を含むように改変され得る（例
えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。

【０５９４】 次いで、増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩ
Ｏ １０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、同じ制限酵素
で消化し、そして１％アガロースゲルで精製する。次いで、単離されたフラグメ
ントおよび脱リン酸したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで
、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、
そしてプラスミドｐＣ６またはｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を、
例えば、制限酵素分析を用いて同定する。

【０５９５】 例えば、可溶性ＣＲＣＧＣＬポリペプチド（例えば、アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｌｙ
ｓ２３１）もまた、発現され得る。Ｂｇｌ ＩＩ制限部位を有する、５’プライ
マー：５’ＣＣＧＧＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧ
ＴＴＣＴＧ３’（配列番号２８）および３’プライマー：５’ＧＧＣＣＧＧＴＣ
ＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＧ３’（配列番号３１）
が、ＰＣＲアミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｌｙｓ２３１に対して使用され得る。増幅された
産物を、哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐＣ４またはｐＣ６）中に挿入し得る
。

【０５９６】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リ
ポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと同時トランスフ
ェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性
で選択マーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付
与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、１ｍｇ
／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この細胞を
トリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサー
トおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドー
マクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約
１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメト
トレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）
を使用して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで
、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度のメトト
レキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウ
ェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクロー
ンが得られるまで繰り返す。ＣＲＣＧＣＬの発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する
。

【０５９７】 （実施例９：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 次の一般的アプローチを用いて、Ｎ末端またはＣ末端欠失ＣＲＣＧＣＬ欠失変
異体をクローン化し得る。概して、約１５〜２５ヌクレオチドの２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチドの所望の５’位および
３’位に由来する。このプライマーの５’位および３’位を、所望のＣＲＣＧＣ
Ｌポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決定する。開始コドンおよび停止コ
ドンを５’ プライマーおよび３’プライマーにそれぞれ添加し、必要ならば、
ポリヌクレオチドフラグメントによりコードされたＣＲＣＧＣＬポリペプチドフ
ラグメントを発現する。好ましいＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドフラグメントは
、本明細書中の「Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」 の節で上記で開示されたＮ末端およびＣ末端欠失
変異体をコードするフラグメントである。

【０５９８】 所望のベクターにおけるＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドフラグメントのクロー
ニングを容易にする制限部位を含む付加的なヌクレオチドもまた、５’ プライ
マー配列および３’プライマー配列へ添加し得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチ
ドフラグメントを、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよび本明細書
中で議論されるまたは当該分野において公知の条件を用いて、ゲノムのＤＮＡま
たは寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅する。本発明のＣＲＣＧＣＬポリヌク
レオチドフラグメントによってコードされたＣＲＣＧＣＬポリペプチドフラグメ
ントを、全長ポリペプチドと同じ一般的方法において、発現し、そして精製し得
るが、慣用的な改変が、特定のフラグメントと全長ポリペプチドとの間の化学的
および物理的性質における差異のために、必要であり得る。

【０５９９】 本発明を例示するが限定しないように、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドフラグメン
トＩ−３５〜Ｆ−２７６をコードするポリヌクレオチドを次のように増幅し、そ
してクローン化する：制限酵素部位、続いてＩ−３５で始まるポリペプチドフラ
グメントのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列とインフレームに開始
コドンを含むＡ５’プライマーを生成する。制限酵素部位、続いてＦ−２７６で
終結するＣＲＣＧＣＬポリペプチドフラグメントのＣ末端部分をコードするポリ
ヌクレオチド配列をインフレームに停止コドンを含む相補的な３’プライマーを
生成する。

【０６００】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターをプライマー中の
部位を認識する制限酵素を用いて消化する。消化したポリヌクレオチドを次いで
、一緒に連結する。好適にはプロモーターから下流にＣＲＣＧＣＬポリペプチド
フラグメントコード領域を配置するように、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドフラ
グメントを、制限した発現ベクターへ挿入する。連結混合物を標準的手順を用い
て、および本明細書中の実施例において記載されるように、コンピテントなＥ．
ｃｏｌｉ細胞へ形質転換する。プラスミドＤＮＡを抵抗性コロニーから単離し、
そしてクローン化されたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決
定によって確認する。

【０６０１】 （実施例１０：ＣＲＣＧＣＬのタンパク質融合物） ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。こ
れらの融合タンパク質は、種々の適用のために使用され得る。例えば、ＣＲＣＧ
ＣＬポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、
およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参
照のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３３１：８４−８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、
ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。
ＴＲ９ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内
局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融
合タンパク質の活性を増大または減少し得る。融合タンパク質はまた、１つより
多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合
タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大さ
せ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融
合を概説する以下のプロトコル、または実施例５に記載のプロトコルを改変する
ことによって作製され得る。

【０６０２】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を含むべきである。

【０６０３】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）発現ベクターが使用される場合
、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ
Ｉ部位が破壊されるべきであることに注意のこと。次いで、ヒトＦｃ部分を含む
ベクターが、ＢａｍＨＩで再制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に
記載するＰＣＲプロトコルによって単離されたＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドが
、このＢａｍＨＩ部位に連結される。

【０６０４】 あるいは、可溶性ＣＲＣＧＣＬポリペプチド（例えば、アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｌ
ｙｓ２３１）はまた、Ｆｃタンパク質に融合され得る。例えば、５’プライマー
：

【０６０５】

【化２】 （配列番号２８）（Ｂｇ１ ＩＩ制限部位を有する）および３’プライマー：

【０６０６】

【化３】 （配列番号２９）は、ＰＣＲアミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｌｙｓ２３１の対して使用され
得る。増幅産物は、Ｆｃに融合されて、上記のようにＦＣ融合タンパク質を生成
し、そして哺乳動物発現のためにｐＣ４ベクターまたはバキュロウイルス発現の
ためにｐＡ２に連結される。

【０６０７】 いずれかの場合において、ポリヌクレオチドは、終止コドンを伴わずクローニ
ングされ、さもなければ、融合タンパク質は生成されないことに注意する。さら
に、天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される
場合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存
在するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を
含むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。

【０６０８】 上記の融合タンパク質は、実施例７に記載されるように、当該分野で公知の技
術および本明細書中に記載される技術を使用して、バキュロウイルス系において
発現するために、ｐＡ２ベクターに挿入され得る。

【０６０９】 ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域：

【０６１０】

【化４】 （実施例１１：抗体の産生） （（ａ）ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、Ｃ
ＲＣＧＣＬを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する
ために動物に投与される。好ましい方法において、ＣＲＣＧＣＬの調製物が調製
され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次い
で、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このような調
製物は、動物に導入される。

【０６１１】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
それらのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体
は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このよ
うな手順は、動物（好ましくは、マウス）をＣＲＣＧＣＬポリぺプチドで免疫す
ること、またはより好ましくは、分泌ＣＲＣＧＣＬポリぺプチド発現細胞で免疫
することを包含する。このような細胞を、任意の適切な組織培養培地において培
養し得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そ
して約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、およ
び約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル
培地）において、細胞を培養することが好ましい。

【０６１２】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合す
る。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、
ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好まし
い。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持
し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−
２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。次いで、このような選択を介して得られるハイブリドーマ細胞を、ＣＲＣＧ
ＣＬポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセ
イする。

【０６１３】 あるいは、ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディ
オタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法
は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ること
が可能であるという事実を使用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体
を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物
の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリド
ーマ細胞を、ＣＲＣＧＣＬタンパク質特異的抗体に結合する能力がＣＲＣＧＣＬ
によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニ
ングする。このような抗体は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質特異的抗体に対する抗イ
ディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＣＲＣＧＣＬタンパク
質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。

【０６１４】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および他のフラグメントが、本明
細書中に開示される方法にしたがって使用され得る。このようなフラグメントは
、代表的に、酵素（例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するために）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために））を使用して
、蛋白分解性切断によって、生成される。あるいは、分泌ＣＲＣＧＣＬタンパク
質結合フラグメントが、組換えＤＮＡ技術の適用を介して、または合成化学を通
して生成され得る。

【０６１５】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましい。このような抗体を、上記のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することによって
産生し得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である。（総説
については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５
）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉ
ｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １
７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら
、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕ
ｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。

【０６１６】 （（ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのＣＲＣＧＣＬに対する抗体フラグメ
ントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ＣＲＣＧＣＬに対する反
応性を含む抗体フラグメント大きなライブラリーに構築する。このＣＲＣＧＣＬ
は、ドナーが曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい（例えば、米
国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書中に援用される
）を参照のこと）。

【０６１７】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７号に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖ
ｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュ
ーするため、ファージミドを保有する約１０⁹Ｅ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌ
の２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に播種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ
．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−
ＧＬＵに播種し、２×１０⁸ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ
、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）を添加し、そして培養物
を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で
４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠
心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシ
リンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩
増殖させる。ファージをＷＯ９２／０１０４７号に記載のように調製する。

【０６１８】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原へのより大きい結合アビデ
ィティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供
給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させる
ことにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで
３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間イ
ンキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ
．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００
ｍｌ中に再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ粒子
を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精
製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター
（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０¹³形質
導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。

【０６１９】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリぺプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０¹³ＴＵのファージをそのチューブに適用
し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次い
でさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミ
ンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを
溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分
間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期
のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを１％グルコ
ースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレー
ティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３
ヘルパーファージでレスキューし、引き続く回の選択のためのファージを調製す
る。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３
回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０
回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。

【０６２０】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択からの溶出ファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニ
ーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６
中の本発明のポリぺプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタイ
タープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣＲ
フィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次
いで配列決定することによりさらに特徴付ける。 （実施例１２：ハイスループットスクリーニングアッセイのためのＣＲＣＧＣＬ
タンパク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきＣＲＣＧＣＬポリぺプチドを含有する上
清を産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１に記載されるスクリーニ
ングアッセイにおいて使用され得る。

【０６２１】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。

【０６２２】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０⁵細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。

【０６２３】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。

【０６２４】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。

【０６２５】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ₂（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ₄−５Ｈ₂
Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ₃）₃−９Ｈ₂Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ
ｅＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ₂；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ₄；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ₃；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｈ₂ Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ₂ＨＰＯ₄；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ₄−
７Ｈ₂Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ
ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミ
トリン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン
酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステ
アリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコ
ース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−
アルギニン−ＨＣＬ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ₂Ｏ；６．６
５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２Ｈ
ＣＬ−Ｈ₂Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣＬ；７．３５ｍｇ
／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７
５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣＬ−Ｈ ₂ Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣＬ；３２．３４ｍｇ／
ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．
０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０
５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；
９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ₂
Ｏ；および９９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチ
ン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリ
ン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０
２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣＬ；０
．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣＬ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；
３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣＬ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；０．６８
０ｍｇ／ＬのビタミンＢ₁₂；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／Ｌの
Ｎａヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプト
レシンナトリウム−２ＨＣＬ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．
００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．
１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合体化
したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合
体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；１０ｍｇ／Ｌの酢酸レチナールと複
合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調製す
る。２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて容量オスモル濃度を３
２７ｍＯｓｍに調節する（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭＥＭ
中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。培地を濾
過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカル
中に収集する。

【０６２６】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。

【０６２７】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１４〜２
１に記載するアッセイにおいて使用し得る。

【０６２８】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ＣＲＣＧＣＬポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質
として）か、または他のタンパク質の発現を誘導するＣＲＣＧＣＬによって（こ
のポリペプチドは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特
に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおいて活性によって
特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。

【０６２９】 （実施例１３：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋｓ−ＳＴ
ＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質
は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメン
トまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。
これらのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化
させる。

【０６３０】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮ−αに対する応答が
広範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定
されており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴ
ヘルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と
呼ばれたが、骨髄性細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている
。それは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。

【０６３１】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
の代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。
これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞におい
て触媒的に不活性である。

【０６３２】 Ｊａｋｓは、以下の表２に要約されるように広範なレセプターによって活性化
される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋｓを活
性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ
）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９
、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプター
を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０
を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存さ
れたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチ
ーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５）をコードする膜
近接領域）を共有する。

【０６３３】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。

【０６３４】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表２を参照のこと）。従
って、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａ
ｋｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。

【０６３５】 ＣＲＣＧＣＬがＪａｋ１と相互作用することの予備データが存在する。

【０６３６】

【表２】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用される、プロモ
ーターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラ
テジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマー
は、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカイン
での誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４
つの直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７
−４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代
わりに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対
して相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プラ
イマーの配列は以下である：

【０６３７】

【化５】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号７）。

【０６３８】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：

【０６３９】

【化６】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク
質が挙げられる。

【０６４０】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。

【０６４１】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１４〜１５に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。

【０６４２】 他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１６および１７に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。

【０６４３】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、およびＣＲＣＧＣＬを含
有する上清がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定することによっ
て、Ｔ細胞活性を評価する。ＣＲＣＧＣＬのＴ細胞の活性を実施例１３で作製し
たＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を
増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を
示す。このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託
番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−
１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞
もまた使用し得る。

【０６４４】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。

【０６４５】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００ｕｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ
−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０ｕｇのプラスミドＤＮＡとを組
み合わせる。５０ｕｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを
添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。

【０６４６】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０⁷個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０⁷細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０⁷個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。

【０６４７】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞は、実施例１２に記載のプロトコールにより産生されるようにＣＲ
ＣＧＣＬポリペプチドまたはＣＲＣＧＣＬ誘導ポリペプチドを含む上清で処理さ
れる。

【０６４８】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。

【０６４９】 １２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を分与する
ために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００ｕｌの細胞を、１２チャ
ンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。

【０６５０】 全てのプレートに播種した後、５０ｕｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。

【０６５１】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５ｕｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカ
バーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１８に記載のＳＥＡＰアッセイを
実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプ
レートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを
繰り返すための物質の供給源として供する。

【０６５２】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。

【０６５３】 上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作
製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。

【０６５４】 （実施例１５：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、ＣＲＣＧＣＬが骨髄性細胞を増殖および／また
は分化させるか否かを決定することによりＣＲＣＧＣＬの活性を評価する。骨髄
性細胞の活性を実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物
を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴ
ＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した骨
髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株）であるが
、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１をも使用し得る。

【０６５５】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ⁷個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中
で増殖させる。

【０６５６】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８ｕｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５ｕＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および６７５ｕＭ ＣａＣｌ₂
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。

【０６５７】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。

【０６５８】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。

【０６５９】 これらの細胞を１×１０⁸個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０⁵細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００ｕｌの細胞（すな
わち、１×１０⁵細胞／ウェル）をプレートする。

【０６６０】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０ｕｌを添加す
る。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１
００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化
させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロー
ルウェルにおいて観察される。実施例１８に記載のプロトコルに従って上清をＳ
ＥＡＰアッセイする。

【０６６１】 （実施例１６：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、ＣＲＣＧＣＬによる細胞の活性化を評価し得る。

【０６６２】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカ
ノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮
増殖因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、ＰＣ１２細胞の活性化をＣＲＣＧＣＬにより評価し得
る。

【０６６３】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る： ５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号９） ５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３
’（配列番号１０）。

【０６６４】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡ
Ｓ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を
用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターと
を連結する。

【０６６５】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８
−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０ｃ
ｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添
加し、そして２時間風乾させる。

【０６６６】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。

【０６６７】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが
、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖
させるべきである。

【０６６８】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニン
グする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次い
で、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。

【０６６９】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし、そして
より低血清の培地を添加し、５×１０⁵細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させる
。

【０６７０】 ２００ｕｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０⁵細胞／ウェルに等しい）。実施例１２により産生された５０ｕｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間添加する。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰ
Ｃ１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／ｕｌの神経
成長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導
が陽性コントロールウェルにおいて見られる。実施例１８に従って、上清をＳＥ
ＡＰアッセイする。

【０６７１】 （実施例１７：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−ＫＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。

【０６７２】 刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そ
して分解され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これ
により標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝
子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１
ＭＨＣが挙げられる。

【０６７３】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１１におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−ＫＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−ＫＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活性化に関連する疾患（例え
ば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。

【０６７４】 ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１１）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０
初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そし
てＸｈｏＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号１２）。

【０６７５】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号７）。

【０６７６】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：

【０６７７】

【化７】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。

【０６７８】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。

【０６７９】 一旦、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１４に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１４に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。

【０６８０】 （実施例１８：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１４〜１７に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。

【０６８１】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５ｕｌの２．５×希
釈緩衝液を３５ｕｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。

【０６８２】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表３を参照のこと）。５０ｕｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分
間インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてル
ミノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回
に５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。

【０６８３】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。

【０６８４】

【表３】 （実施例１９：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定するハイスル
ープットスクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変し得る。

【０６８５】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−３の代わりに使用し得る。

【０６８６】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ₂
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００ｕｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００ｕｌを残す。

【０６８７】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため、
１２ｕｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０ｕｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー
トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００ｕｌを残
す。

【０６８８】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０⁶細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたり、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３の１０％プルロ
ン酸ＤＭＳＯ溶液４ｕｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００ｕｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷａ
ｓｈ中で２００ｕｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００ｕｌに
する。

【０６８９】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。

【０６９０】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０ｕｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、細胞内Ｃａ ⁺⁺ 濃度の増加を生じる、ＣＲＣＧＣＬまたはＣＲＣＧＣＬにより誘導される分子
のいずれかの分子により引き起こされる細胞外シグナル伝達事象を示す。

【０６９１】 （実施例２０：チロシンキナーゼ活性を同定するハイスループットスクリーニ
ングアッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。

【０６９２】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナ
ーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（
例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシン
キナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質
ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカ
インスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ
−ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介
する。

【０６９３】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、ＣＲＣＧＣ
ＬまたはＣＲＣＧＣＬにより誘導される分子がチロシンキナーゼシグナル伝達経
路を活性化し得るか否かを同定することは興味深い。従って、以下のプロトコル
を設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る新規なヒト分泌
タンパク質を同定する。

【０６９４】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し
、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａ
ｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増
殖実験において使用し得る。

【０６９５】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０ｕｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．
１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７およびＢｏｅｈｅ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手
したプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添
加し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレート
を真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉ
ｆｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェ
ル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明
澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有
物を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。

【０６９６】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。

【０６９７】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。

【０６９８】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５ｕＭビオチン化ペプチド１０ｕｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ²⁺（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）１０ｕｌ、５×アッセイ緩衝液（４０
ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＭｎＣｌ₂、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０ｕｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５ｕｌ、最後に水５ｕｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０ｕｌを加えて反応を開始させる。

【０６９９】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイアッセイを停止し、反応物を氷上に置く。

【０７００】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させ得る
。ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋
ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒ
ｏｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各
ウェルに添加して、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記の
ように洗浄する。

【０７０１】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（３０分間まで）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用することによって、４０５ｎｍにおけるサンプ
ルの吸光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルは、ＥＬＩＳＡ
リーダーを使用して定量され、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映す
る。

【０７０２】 （実施例２１：リン酸化活性を同定する高スループットスクリーニングアッセ
イ） 実施例２０に記載のタンパク質チロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１キナーゼおよびＥ
ｒｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、
ｐ３８ ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ
、筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのよう
な他の分子のリン酸化、ならびに他の任意のホスホセリン分子、ホスホチロシン
分子またはホスホスレオニン分子を、以下のアッセイにおいてこれらの分子をＥ
ｒｋ−１またはＥｒｋ−２の代わりに用いることにより検出し得る。

【０７０３】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、このプレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで
ＲＴにて１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（
Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）
する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナ
ル抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５
回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。

【０７０４】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させ、次いで、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施
例１２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次いで、細胞を可溶化し、
抽出物を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。

【０７０５】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１キナーゼ
およびＥｒｋ−２キナーゼのリン酸化されたエピトープを特異的に認識する市販
のポリクローナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）
。この抗体を標準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗
体をユーロピウム（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ）ストレプトアビジンおよびユーロピウム
蛍光増強剤とＷａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置内で連続的にインキュベートする
（時間分解性蛍光）ことによって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグ
ナルの増加は、ＣＲＣＧＣＬまたはＣＲＣＧＣＬによって誘導された分子による
リン酸化を示す。

【０７０６】 （実施例２２：ＣＲＣＧＣＬ遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次いで、当該分野で公知のプロトコルを使用して、ｃ
ＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと
）。次いで、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライ
マーを利用するＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は
、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）
に記載の緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒
間；および７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。

【０７０７】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して、５’末端にＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＣＲＣＧ
ＣＬの選択されたエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰ
ＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、ＣＲＣＧＣＬにおける疑わし
い変異を有するＰＣＲ産物をクローン化かつ配列決定し、直接配列決定の結果を
確認する。

【０７０８】 ＣＲＣＧＣＬのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ,T.A.およびGraham,M.W.ら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記
載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹
患個体には存在しないＣＲＣＧＣＬにおける変異により同定する。

【０７０９】 ゲノム再配置もまた、ＣＲＣＧＣＬ遺伝子における改変を決定する方法として
観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキ
シ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用い
てニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ,Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記載のようにＦＩ
ＳＨを行う。ＣＲＣＧＣＬゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーション
のために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリ
ダイゼーションを行う。

【０７１０】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルターとを組み合わせて用いて得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．
Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａ
ｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析およ
び染色体部分長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたＣＲＣＧＣＬのゲノ
ム領域の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらのＣＲＣ
ＧＣＬの変化を、関連疾患の診断マーカーとして使用する。

【０７１１】 （実施例２３：生物学的サンプル中のＣＲＣＧＣＬポリペプチドの異常レベル
を検出する方法） ＣＲＣＧＣＬポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＣＲＣ
ＧＣＬレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表
現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、従って、当業者は以下のアッセ
イをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。

【０７１２】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＣＲＣＧＣＬを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、ＣＲＣＧＣＬに対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌでコ
ーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれか
であって、実施例１１に記載の方法により産生される。ウェルに対するＣＲＣＧ
ＣＬの非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。

【０７１３】 次いで、コーティングしたウェルを、ＣＲＣＧＣＬ含有サンプルを用いてＲＴ
で２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用
して結果を確認すべきである。次いで、プレートを脱イオン水または蒸留水で三
回洗浄し、非結合ＣＲＣＧＣＬを除去する。

【０７１４】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。

【０７１５】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルホス
フェート（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間
インキュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定す
る。コントロールサンプルの系列希釈を使用して検量線を作成し、そしてＸ軸（
対数スケール）にＣＲＣＧＣＬポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール
）に蛍光または吸光度をプロットする。検量線を用いて、ＣＲＣＧＣＬサンプル
中のポリペプチド濃度を補間する。

【０７１６】 （実施例２４：ポリペプチドを処方すること） ＣＲＣＧＣＬ組成物が処方され、そして個々の患者の臨床症状（特にＣＲＣＧ
ＣＬポリペプチド単独での処置の副作用）、送達の部位、投与の方法、投与のス
ケジュール管理、および担当医に知られたその他の因子を考慮し、良好な医療実
施と一致する様式で投薬される。本明細書に記載の目的のための「有効量」は、
それ故、このような考慮により決定される。

【０７１７】 一般的提案として、投与量あたり腹腔内投与されるＣＲＣＧＣＬの合計薬学的
有効量は、患者体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが
、上記のように、これは、治療の自由裁量を受ける。より好ましくは、この投与
量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そしてヒトにとって最も好ましくは
、このホルモンについて約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日とのである。連続的に与
えられる場合、代表的には、ＣＲＣＧＣＬは、一日あたり１−４注射であるか、
または、例えば、ミニポンプを用いる連続皮下注入によるかのいずれかで、約１
μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投与量速度で投与される。静脈内
バッグ溶液もまた採用され得る。変化を観察するために必要な処置の長さ、およ
び応答が生じる間隔をともなう処置は、所望の効果に依存して変化するようであ
る。

【０７１８】 投与されるべき本発明の組成物の有効投与量は、生物学的半減期、生体利用性
、および毒性のようなパラメーターを割り当てる当業者に周知の手順により決定
され得る。このような決定は、特に本明細書で提供された詳細な開示を考慮して
、当業者の能力の中に十分ある。

【０７１９】 治療の間のＣＲＣＧＣＬポリペプチドへの生物の生態暴露はまた、治療的およ
び／または薬学的に有効な投薬養生法を決定することにおいて重要な役割を演じ
得る。比較的長期間の比較的低投与量のＣＲＣＧＣＬポリペプチドの反復投与の
ような投薬の変形は、比較的短期間の比較的長期間のＣＲＣＧＣＬの反復投与で
達成される効果とは治療的および／または薬学的に区別可能である効果を有し得
る。

【０７２０】 Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ、Ｅ．Ｊら（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ
Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−４４（１９６６））により提供される当
量表面積投与量変換係数を用いて、当業者は、与えられた実験系におけるＣＲＣ
ＧＣＬの使用から得られたデータを、別の実験系における投与量あたり投与され
るべきＣＲＣＧＣＬポリペプチドの薬学的有効量の正確な推定に簡単に変換し得
る。ＣＲＣＧＣＬの投与により得られた実験データは、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらに
より提供された変換係数により、ラット、サル、イヌ、およびヒトにおけるＣＲ
ＣＧＣＬの薬学的有効投与量の正確な推定に変換され得る。以下の変換表（表Ｉ
ＩＩ）は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらにより提供されるデータの要約である。表ＩＩ
Ｉは、１つの種からのｍｇ／ｋｇの項で表された投与量を、表に記載の別の種に
おけるｍｇ／ｋｇとして表された当量表面積投与量に変換するためのほぼ正確な
係数を与える。

【０７２１】

【表４】 従って、例えば、表ＩＩＩに提供される変換係数を用いて、マウスにおける５
０ｍｇ／ｋｇの投与量は、サルにおける１２．５ｍｇ／ｋｇのほぼ正確な投与量
に変換される。なぜなら（５０ｍｇ／ｋｇ）×（１／４）＝１２．５ｍｇ／ｋｇ
。さらなる例として、マウスにおける０．０２、０．０８、０．８、２および８
ｍｇ／ｋｇの投与量は、ヒトにおける１．６６７μｇ／ｋｇ、６．６７μｇ／ｋ
ｇ、６６．７μｇ／ｋｇ、１６６．７μｇ／ｋｇ、および０．６６７μｇ／ｋｇ
の有効投与量にそれぞれ等しい。

【０７２２】 ＣＲＣＧＣＬを含む薬学的組成物は、経口、経直腸、非経口、嚢内（ｉｎｔｒ
ａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、（粉末、軟膏、ゲル、ドロップまた
は経皮パッチによるような）局所的、頬から、または経口もしくは鼻スプレーで
投与される。１つの実施形態では、「薬学的に受容可能なキャリア」は、非毒性
の固形、半固形もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイ
プの製剤補助剤を意味する。詳細な実施形態では、「薬学的に受容可能」は、動
物、そしてより特定すればヒトにおける使用に、連邦もしくは州政府の規制機関
に認可されたか、または合衆国薬局方もしくはその他の一般に認められた薬局方
中に列挙されたことを意味する。この実施形態に従う適切な薬学的キャリアの非
制限的な例は、Ｅ．Ｖ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に提供され、そして滅菌液体、例え
ば、石油、動物、植物または合成起源（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油
などのような）のものを含む水および油を含む。薬学的組成物が静脈内に投与さ
れるとき、水が好適なキャリアである。生理食塩水およびデキストロース水溶液
およびグリセロール溶液が、特に注射可能溶液に液体キャリアとして採用され得
る。所望であれば、この組成物はまた、微量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝
化剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、ピル、カプ
セル、粉末、持続放出処方物などの形態をとり得る。

【０７２３】 本明細書で用いる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、皮下お
よび関節内注射および注入を含む投与の様式をいう。

【０７２４】 好適な実施形態では、本発明のＣＲＣＧＣＬ組成物（ポリペプチド、ポリヌク
レオチド、および抗体、およびそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニス
トを含む）は、皮下投与される。

【０７２５】 別の好適な実施形態では、本発明のＣＲＣＧＣＬ組成物（ポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、および抗体、およびそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストを含む）は、静脈内投与される。

【０７２６】 ＣＲＣＧＣＬはまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出組成物の
適切な例は、適切なポリマー性材料（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル
のような成形物品の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性材料
（例えば、受容可能な油中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂、および節約
可溶性誘導体（例えば、節約可溶性塩）を含む。

【０７２７】 持続放出マトリックスは、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号
、ＥＰ 第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ、Ｕら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４
７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタアクリレート）（
Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−
２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９
８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）
またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ第１３３，９８８号）を含
む。

【０７２８】 持続放出組成物はまた、リポソームにトラップされた本発明の組成物を含む（
一般について、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏ
ｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、第３１７−３２７および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。
ＣＲＣＧＣＬを含むリポソームは、それ自体公知の方法、ＤＥ第３，２１８，１
２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ第５
２，３２２号；ＥＰ第３６，６７６号；ＥＰ第８８，０４６号；ＥＰ第１４３，
９４９号；ＥＰ第１４２，６４１号；日本特許出願第８３−１１８００８号；米
国特許番号第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；およびＥＰ
第１０２，３２４号により調製される。通常、このリポソームは、小さな（約２
００−８００Å）単層タイプであり、そこでは脂質含量が、約３０モルパーセン
トより大きいコレステロールであって、選択された比率が最適分泌ポリペプチド
治療のために調節されている。

【０７２９】 本発明の別の実施形態では、持続放出組成物は、当該分野で公知の結晶処方物
を含む。

【０７３０】 なお別の実施形態では、本発明の組成物はポンプにより送達される（Ｌａｎｇ
ｅｒ、上述；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ
．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５
０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７
４（１９８９）を参照のこと）。

【０７３１】 その他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：
１５２７−１５３３（１９９０））中で論議されている。

【０７３２】 非経口投与には、１つの実施形態で、ＣＲＣＧＣＬは、一般に、所望の程度の
純度のそれを、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン
）中に、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち、採用された投与量および濃度
でレシピエントに非毒性であり、かつ処方物のその他の成分と適合するもの、と
混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化試薬
およびポリペプチドに有害であることが知られるその他の化合物を含まない。

【０７３３】 一般に、この処方物は、ＣＲＣＧＣＬを、液体キャリアもしくは微細に分割さ
れた固形キャリアまたはその両方と均一かつ緊密に接触させることにより調製さ
れる。次いで、必要であれば、この産物は、所望の製剤に成形される。好ましく
は、キャリアは非経口キャリアであり、より好ましくは、レシピエントの血液と
等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、
リンゲル溶液、およびデキストロース溶液を含む。固着油およびエチルオレエー
トのような非水性ビヒクルもまた、リポソーム同様、本明細書で有用である。

【０７３４】 このキャリアは、等張性および化学的安定性を増大する物質のような微量の添
加剤を含む。このような材料は、採用された投与量および濃度でレシピエントに
非毒性であって、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸およびその他の有機
酸またはその塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（
約１０残基より少ない）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプ
チド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；
ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アス
パラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびセル
ロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含
むその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールもしくはソル
ビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／または
ポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を
含む。

【０７３５】 代表的には、ＣＲＣＧＣＬは、このようなビヒクル中に約０．１ｍｇ／ｍｌ〜
１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨ
で処方される。先に記載の特定の賦形剤、キャリア、または安定化剤の使用は、
ポリペプチド塩類の形成を生じることが理解される。

【０７３６】 治療投与のために用いられるＣＲＣＧＣＬは滅菌され得る。無菌は、滅菌濾過
膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通じる濾過により容易に達成される。一般に
、治療ポリペプチド組成物は、無菌アクセスポートをもつコンテナ中、例えば、
静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパーをもつバイアル
に配置される。

【０７３７】 ＣＲＣＧＣＬポリペチドは、通常、単位もしくは多投与量コンテナ、例えば、
シールされたアンプルもしくはバイアル中に、水溶液としてもしくは再調製のた
めの凍結乾燥形態といて貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバ
イアルが５ｍｌの無菌濾過１％（ｗ／ｖ）ＣＲＣＧＣＬポリペプチド溶液で充填
され、そして得られる混合物が凍結乾燥される。注入溶液は、静菌剤Ｗａｔｅｒ
−ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを用いて凍結乾燥されたＣＲＣＧＣＬポリペプチ
ドを再構成することにより調製される。

【０７３８】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で充填された１つ以上
のコンテナを備えた薬学的パックまたはキットを提供する。そのようなコンテナ
（単数または複数）と組み合わせ、生物学的産物の製造、使用または販売を規制
する政府機関により指示された形式の注意書が存在し得、この注意書は、ヒト投
与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。さらに、Ｃ
ＲＣＧＣＬは、その他の治療化合物と組み合わせて利用され得る。

【０７３９】 本発明の組成物は、単独またはその他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る治療薬は、制限されないで、サイト
カインレセプターファミリーのその他のメンバー（例えば、ＩＬ−７レセプター
α鎖）、ＴＮＦファミリーのメンバー、化学的治療薬、抗生物質、ステロイド系
および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫治療剤、および／または成長因子を
含む。組み合わせは、付随して、例えば、混合物としてか、別々ではあるが同時
に、または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤
が治療混合物として一緒に投与される提示、そしてまた組み合わされた薬剤が別
々ではあるが同時に、例えば、同じ個体に別の静脈内ラインによるような手順を
含む。「組み合わせ」投与は、最初に与えられた化合物または薬剤の１つ、次い
で第２番目が続く別個の投与をさらに含む。

【０７４０】 特定の実施形態では、本発明の組成物は、Ｉ型サイトカインレセプターファミ
リーのメンバーと組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与
され得るＩ型サイトカインセレプターファミリーメンバーは、制限されないで、
ＩＬ−７レセプターα鎖、ＬＩ−２レセプターα鎖、ＬＩ−２レセプターβ鎖、
ＬＩ−４レセプターα鎖、共通α鎖、共通β鎖、および／またはＩＬ−１３レセ
プターを含む。

【０７４１】 好適な実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−７レセプターα鎖と組み合わ
せて投与される。

【０７４２】 さらなる実施形態では、本発明の組成物は、Ｉ型サイトカインファミリーのメ
ンバーと組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る
Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーは、制限されないで、ＴＳＬＰ、ＩＬ−
７、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１
１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−１５を含む。

【０７４３】 好適な実施形態では、本発明の組成物は、ＴＳＬＰと組み合わせて投与される
。

【０７４４】 １つの実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み
合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るＴＮＦ、ＴＮ
Ｆ関連またはＴＮＦ様分子は、制限されないで、ＴＮＦαの可溶性形態、リンホ
トキシンα（ＴＮＦβとしてもまた知られるＬＴ−α）、ＬＴ−β（複合体ヘテ
テロトリマーＬＴ−α２−β中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７
Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−
γ（国際公開第ＷＯ ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開第ＷＯ ９
７／３３８９９号）、エンドカイン−α（国際公開第ＷＯ ９８／０７８８０号
）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９４号）、ＯＰＧ、およびノイロカ
イン−α（国際公開第ＷＯ ９８／１８９２１号）、ＯＸ４０、および神経成長
因子（ＮＧＦ）、およびＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢ
Ｂの可溶性形態、ＴＲ２（国際公開第ＷＯ ９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国
際公開第ＷＯ ９７／３３９０４号）、ＤＲ４（国際公開第ＷＯ ９８／３２８
５６号）、ＴＲ５（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９３号）、ＴＲ６（国際公開
第ＷＯ ９８／３０６９４号）、ＴＲ７（国際公開第ＷＯ ９８／４１６２９号
）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開第ＷＯ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国
際公開第ＷＯ９８／５４２０２号）、３１２Ｃ（国際公開第ＷＯ ９８／０６８
４２号）、およびＴＲ１２、および可溶性形態ＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣ
Ｄ１５３を含む。

【０７４５】 別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと
組み合わせて用いられ、感染および／または任意の疾患、障害、および／または
それらにともなう症状を処置、予防、および／または診断する。１つの実施形態
では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと組み合わせて用いられ
、任意のグラム陽性細菌感染および／または任意の疾患、障害、および／または
それらにともなう症状を処置、予防、および／または診断する。別の実施形態で
は、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと組み合わせて用いられ、
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ
以上のメンバーと関連する任意の疾患、障害、および／または症状を処置、予防
、および／または診断する。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭ
ＯＶＡＸ−２３^TMと任意の組み合わせで用いられ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｉの１つ以上のメンバーと関連する任意の疾患、障害、および／または症状を処
置、予防、および／または診断する。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｐ
ＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３^TMと組み合わせて用いられ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと関連する任意の疾患、障害、および／または症状を
処置、予防、および／または診断する。

【０７４６】 本発明の組成物は、単独、または化学的治療剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ス
テロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫治療剤およびサイトカイ
ン類を含むその他の治療剤と組み合わせて投与され得る。組み合わせは、付随し
て、例えば、混合物としてか、別々ではあるが同時に、または逐次的にかのいず
れかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物として一緒に投
与される提示、そしてまた組み合わされた薬剤が別々ではあるが同時に、例えば
、同じ個体に別の静脈内ラインによるような手順を含む。「組み合わせ」投与は
、最初に与えられた化合物または薬剤の１つ、次いで第２番目が続く別個の投与
をさらに含む。

【０７４７】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０
Ｌ）、ＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶＲＥＮＤ^TM）、ＣＤ４０Ｌの生物
学的活性フラグメント、改変体、または誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、ア
ゴニストまたはアンタゴニスト抗体）、および／または抗ＣＤ４０抗体（例えば
、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体）と組み合わせて投与される。

【０７４８】 別の実施形態では、本発明の組成物は、抗凝固剤と組み合わせて投与される。
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗凝固剤は、制限されないで、ヘパ
リン、ワルファリン、およびアスピリンを含む。特定の実施形態では、本発明の
組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合わせて投与される。別
の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ワルファリンと組み合わせて投与さ
れる。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ワルファリンおよびアスピ
リンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、
ワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組
成物は、ヘパリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明
の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。

【０７４９】 別の実施形態において、本発明の組成物は、抗カルジオリピン抗体の産生を抑
制する因子と組合せて投与される。特定の実施形態において、本発明のポリヌク
レオチドは、抗カルジオリピン抗体のリン脂質結合血漿タンパク質β２−糖タン
パク質Ｉ（ｂ２ＧＰＩ）に結合する能力をブロックおよび／または低減する因子
と組み合わせて投与される。

【０７５０】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲ^TM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
Ｘ^TM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ^TM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲ
ＩＴ^TM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ^TM（ラミブジン／３ＴＣ）、およ
びＣＯＭＢＩＶＩＲ^TM（ジドブジン／ラミブジン）。本発明の組成物と組み合わ
せて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥ^TM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩ
ＰＴＯＲ^TM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡ^TM（エファビレンツ）。本
発明の組成物と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮ^TM（インディナ
ビル）、ＮＯＲＶＩＲ^TM（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥ^TM（サキナビル））
、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ^TM（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗
レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵
素阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置、予防
および／もしくは診断するため、ならびに／またはＨＩＶ感染を処置、予防およ
び／もしくは診断するために、本発明の組成物との任意の組み合わせで使用され
得る。

【０７５１】 他の実施形態において、本発明の組成物は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥ^TM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ^TM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥ^TM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ^TM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥ^TM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TM、ＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（フィルグラスチ
ム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ^TM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａ
ｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明の組成物は
、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置、
予防および／または診断するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭ
ＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ^TM、ＤＡＰＳＯＮＥ^TM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ^TM、およ
び／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ^TMと任意に組み合わせて使用される。別の特定
の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置、予防および／または診断するために、ＩＳ
ＯＮＩＡＺＩＤ^TM、ＲＩＦＡＭＰＩＮ^TM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ^TM、および
／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定
の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、予防および／または診断するた
めに、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ^TM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TM、および／また
はＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態において、本発明の組成物は、日和見サイトメガロウイルス感染を予防
的に処置、予防および／または診断するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ^TM、Ｆ
ＯＳＣＡＲＮＥＴ^TM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲ^TMとの任意の組み合わ
せで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見真菌
感染を予防的に処置、予防および／または診断するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯ
ＬＥ^TM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ^TM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬ
Ｅ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明
の組成物は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防
的に処置、予防および／または診断するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ^TMおよび／
またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ^TMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定
の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎ
ｄｉｉ感染を予防的に処置、予防および／または診断するために、ＰＹＲＩＭＥ
ＴＨＡＭＩＮＥ^TMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ^TMとの任意の組み合わせ
で使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見細菌感
染を予防的に処置、予防および／または診断するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ ^TM および／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ^TMとの任意の組み合わせで使用される。

【０７５２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０７５３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質とともに投与される
。本発明の組成物とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、ア
ミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマ
イシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、シプ
ロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生
物質、メトロニダゾル、ペニシリン類、キノロン類、リファンピン、ストレプト
マイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン類、トリメトプリム、トリメトプ
リム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げられるが、これら
に限定されない。

【０７５４】 本発明の組成物とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【０７５５】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥ^TM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ^TM／ＮＥＯＲＡＬ^TM／Ｓ
ＡＮＧＤＹＡ^TM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ^TM（タクロリムス）、ＣＥ
ＬＬＣＥＰＴ^TM（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコルチコステロ
イド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥ^TM （シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態におい
て、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る
。

【０７５６】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るステロイドとしては
、経口コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロン（例え
ば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられるが、これらに限定されない。特定
の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンと組み合わせて投与され
る。さらなる特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンおよび
免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびプレドニゾンとと
もに投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載され、そしてこの免疫抑制剤
としては、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩ
Ｖが挙げられるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態において、本発
明の組成物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定
の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制
剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロンとと
もに投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載され、そしてこの免疫抑制剤
としては、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩ
Ｖが挙げられるが、これらに限定されない。

【０７５７】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗マラリア剤としては、ヒド
ロキシクロロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【０７５８】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投
与される。

【０７５９】 非限定的な実施形態において、本発明の組成物は、以下の薬物の１、２、３、
４、５、１０以上と組み合わせて投与され得る：ＮＲＤ−１０１（Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅｔｈａｉｄ）
、オキサプロジンカリウム（ｏｘａｐｒｏｚｉｎ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）（Ｍｏ
ｎｓａｎｔｏ）、メカセルミン（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）
、ペムトレキシド二ナトリウム（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ）（
Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、アトレレウトン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａｂｂｏｔ
ｔ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテ
ナック（ｅｌｔｅｎａｃ）（Ｂｙｋ Ｇｕｌｄｅｎ）、カンパス（ｃａｍｐａｔ
ｈ）、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ
Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３
０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢ
Ｆ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療（ＩＬ−１Ｒ
ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａ
ｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、パクリタキセル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１
６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ Ｗｈａ）、ダルブフェロンメシレート（ｄａｒｂｕｆｅｌ
ｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦ
レセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ト
ロカード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５
（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｌｅｕｋｏ Ｖａｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉ
ｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）
、およびブチキソコートプロピオネート（ｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏ
ｎａｔｅ）（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。

【０７６０】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、以下の薬物の１、２、３、４
、５以上と組み合わせて投与される：メトトレキサート、スルファサラジン、ア
ウロチオリンゴ酸ナトリウム、アウラノフィン（ａｕｒａｎｏｆｉｎ）、シクロ
スポリン、ペニシルアミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、本明細書
中で記載されるような）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＮＢＲ
ＥＬ^TM（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、ＬＪＰ ３９４（Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびプレドニゾロン。

【０７６１】 より好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤、メトトレ
キサート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよび／またはスルファサラジンと組
み合わせて投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレ
キサートと組み合わされて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物
は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の
組成物は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別
の実施形態において、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与
される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキサート、
抗ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形
態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMと組み合わせて投与される。別
の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TMおよびメトトレキサー
トと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮ
ＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与され
る。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサ
ートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において
、１つ以上の抗マラリア剤は、上記の組み合わせのうちの１つと組み合わせられ
る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤（例えば、ヒド
ロキシクロロキン）、ＥＮＢＲＥＬ^TM、メトトレキサートおよびスルファサラジ
ンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮ
Ｆ抗体、およびメトトレキサートと組み合わせて投与される。

【０７６２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投
与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲ^TM、ＩＶＥＥＧ
ＡＭ^TM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ^TM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／Ｄ^TMおよび
ＧＡＭＩＭＵＮＥ^TMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫
グロブリン調製物と組み合わせて投与される。

【０７６３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。

【０７６４】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【０７６５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＧＭ
−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、Ｉ
Ｌ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α
、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられるが、これ
らに限定されない。別の実施形態において、本発明の組成物は、以下を含むがこ
れらに限定されない任意のインターロイキンとともに投与され得る：ＩＬ−１α
、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７
、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉ
Ｌ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、Ｉ
Ｌ−２０、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２。

【０７６６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥ^TM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭ^TM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮ^TM（ＦＩＬ
ＧＲＡＳＴＩＭ^TM）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０７６７】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ
−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示
されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０
７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびド
イツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（
ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本
明細書で参考として援用される。

【０７６８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。

【０７６９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。このようなコンビナト
リアル（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）治療は、連続的および／または同時に投
与され得る。

【０７７０】 （実施例２５：ＣＲＣＧＣＬのレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内におけるＣＲＣＧＣＬ活性のレベルを低下させる必要のある個
体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＣＲＣＧＣＬアンタ
ゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明にお
ける使用のために好ましいアンタゴニストは、ＣＲＣＧＣＬ特異的抗体である。

【０７７１】 さらに、個体におけるＣＲＣＧＣＬの標準または正常発現レベルの低下により
引き起こされる状態は、ＣＲＣＧＣＬを、好ましくは分泌形態で投与することに
より処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＣＲＣＧＣＬポリ
ペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、この
ような個体に、このような個体でＣＲＣＧＣＬ活性レベルを増加させる量のＣＲ
ＣＧＣＬを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。

【０７７２】 例えば、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチド
を、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポ
リペプチドは分泌形態である。用量スキームの、投与および処方に基づく正確な
詳細は、実施例２４に提供される。

【０７７３】 （実施例２６：ＣＲＣＧＣＬのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内におけるＣＲＣＧＣＬ活性のレベルを増加させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＣＲＣＧＣＬま
たはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。

【０７７４】 アンチセンス技術を使用してＣＲＣＧＣＬの産生を阻害する。この技術は、癌
のような様々な病因に起因するＣＲＣＧＣＬポリペプチド、好ましくは分泌形態
のポリペプチドのレベルを低下させる方法の１つの例である。

【０７７５】 例えば、ＣＲＣＧＣＬのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば
、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド
の処方は、実施例２４に提供される。

【０７７６】 （実施例２７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドを発現し得る線維芽細
胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者
から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織
の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を各フラスコに置く。こ
のフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そして室温で一晩放置する。室温で２４
時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そ
して新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間
インキュベートする。

【０７７７】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。

【０７７８】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。

【０７７９】 ＣＲＣＧＣＬをコードするｃＤＮＡを、実施例１に記述するように、それぞれ
５’および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好
ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格
および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントの連結
に適切な条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質
転換する。次に、それを、カナマイシン含有寒天上にプレーティングし、ベクタ
ーが適切に挿入されたＣＲＣＧＣＬを有することを確認する。

【０７８０】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、ＣＲＣＧＣＬ遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に
加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケ
ージング細胞はＣＲＣＧＣＬ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここ
で、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。

【０７８１】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過して、はがれ
たプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽
細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、ＣＲ
ＣＧＣＬタンパク質が産生されているか否かを決定する。

【０７８２】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する （実施例２８：内因性ＣＲＣＧＣＬ遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性ＣＲＣＧＣＬ配列を、例えば、
米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日出願）；国際公開第Ｗ
Ｏ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ ９４
／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；お
よびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）
に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工
程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現さ
れないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包
含する。

【０７８３】 プロモーターおよび標的配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。この
標的配列は、プロモーターに隣接し、内因性ＣＲＣＧＣＬの５’非コード配列と
相同である。この標的配列は、このＣＲＣＧＣＬの５’末端に十分に近く、その
結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結
される。このプロモーターおよび標的配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好
ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制
限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的配列の３’末端は、増幅したプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的配列の５’末端
は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。

【０７８４】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的配列を、適切な制限酵素で消化
し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化
した標的配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混合物
を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築物を
アガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿
により精製する。

【０７８５】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）と共に投与され得る。このような送達方法は
、当該分野で公知である。

【０７８６】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが起こり、この内因性ＣＲ
ＣＧＣＬ配列に作動可能に連結されるプロモーターを生じる。これは、この細胞
中におけるＣＲＣＧＣＬの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野
で公知の他の任意の方法により、検出され得る。

【０７８７】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に置く。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、ト
リプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸
濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供
する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ
、０．７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞
を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１
ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸
濁物は、約３×１０⁶細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直
後に実施すべきである。

【０７８８】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ＣＲＣＧＣＬの
遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１
８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで
消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢ
ａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのＣＲＣＧＣＬ非コード配列
をＰＣＲを介して増幅する：一方のＣＲＣＧＣＬ非コード配列（ＣＲＣＧＣＬフ
ラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部
位を備えて増幅する；他方のＣＲＣＧＣＬ非コード配列（ＣＲＣＧＣＬフラグメ
ント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を
備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびＣＲＣＧＣＬフラグメントを、
適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＣＲＣＧＣＬフ
ラグメント１−ＸｂａＩ；ＣＲＣＧＣＬフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し
、そして共に連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。

【０７８９】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０⁶細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合は劇的に増加する。これらのパラメーターを考慮すると、パルス時間約１４〜
２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。

【０７９０】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。

【０７９１】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注射する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。

【０７９２】 （実施例２９：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ＣＲＣＧＣＬポリペプ
チドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ
、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＣＲＣＧＣＬ配列の導入に関する。
ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＣＲＣ
ＧＣＬポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に
連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野
で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特
許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂ
ａｔａ Ｈ．ら（１９９７）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４
７０−４７９；Ｃｈａｏ Ｊ．ら（１９９７）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．
３５（６）：５１７−５２２；Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．（１９９７），Ｎｅｕｒｏ
ｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ
Ｂ．ら（１９９６）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１；Ｔｓｕ
ｒｕｍｉ Ｙ．ら（１９９６）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２
８１−３２９０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【０７９３】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達
する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙
空間への注入）によって送達され得る。ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は
、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。

【０７９４】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドはまた、当業
者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６
−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８
５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。

【０７９５】 この遺伝子治療方法において使用されるＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドベクタ
ー構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も
含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの
発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸
配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオ
チド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入
されて、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示さ
れた。

【０７９６】 ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺
、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢
、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含す
る）の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網
線維間のムコ多糖基質、血管または房の壁における弾性線維、線維性組織のコラ
ーゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じ基質（ｔｈａｔ ｓａｍ
ｅ ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じ基質（ｔｈａｔ ｓａ
ｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャン
ネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、
以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への
注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性
の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発
現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞ま
たは皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌ
クレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特に適格である
。

【０７９７】 裸のＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効
投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好
ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり
、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。も
ちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に応じて変化
する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、
そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織
の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路（例え
ば、特に肺もしくは気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロ
ゾル処方物の吸入）もまた用いられ得る。さらに、裸のＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルに
よって動脈に送達され得る。

【０７９８】 インビボで筋肉に注入されたＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの用量応答効果を
、以下のようにして決定する。ＣＲＣＧＣＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
の生成のための適切なＣＲＣＧＣＬ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論
に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）
を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれか
をする。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。

【０７９９】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＣＲＣＧＣＬ鋳型ＤＮＡを、０．
１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわた
って、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深
さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてそ
の皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。

【０８００】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｃ
ＲＣＧＣＬタンパク質発現について組織化学的に染色する。ＣＲＣＧＣＬタンパ
ク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採
取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のＣＲＣＧＣＬ Ｄ
ＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮ
ＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。
マウスにおける上記実験の結果を、裸のＣＲＣＧＣＬ ＤＮＡを用いて、ヒトお
よび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するため
に使用し得る。

【０８０１】 （実施例３０：ＣＲＣＧＣＬトランスジェニック動物） ＣＲＣＧＣＬポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され
得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤ
ギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパン
ジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動
物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載さ
れるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一
部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。

【０８０２】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞にお
ける遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−
３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８
３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺
伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性多能性（ｐｌ
ｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細
胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５
７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。この
ような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、
Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ
．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。

【０８０３】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞への核移入（Ｃ
ａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕ
ｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。

【０８０４】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子ターゲッティングが好ま
しい。

【０８０５】 手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同
ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同組換えを
介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれそのヌクレオチド配列の機
能を破壊する目的のために、設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選
択的に導入され得、それにより、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、その導入された細胞型に
おいてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要
とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明
らかである。この段落に記載される書類の各々の内容は、本明細書中に参考とし
て援用される。

【０８０６】 本願を通じて開示されるＣＲＣＧＣＬポリペプチドのいずれかを使用して、ト
ランスジェニック動物を作製し得る。例えば、配列番号２のアミノ酸Ｍ１〜Ｋ２
３１をコードするＤＮＡを、挿入されたフラグメントを遍在的に発現するプロモ
ーター（例えば、アクチンプロモーター）を含むベクターに挿入し得る。このよ
うなフラグメントを作製するために使用し得るプライマーは、太字で示されるＢ
ｇｌＩＩ制限部位を含む５’プライマー：

【０８０７】

【化８】 （配列番号３２）、および太字で示されるＸｂａ制限部位を含む３’プライマー
：

【０８０８】

【化９】 （配列番号３１）を含む。この構築物は、遍在的発現のためのアクチンプロモー
ターの制御下にあるＣＲＣＧＣＬの推定可溶性ドメインを発現する。この構築物
中に含まれるＣＲＣＧＣＬの領域は、配列番号２のＭ１〜Ｋ２３１に広がる。

【０８０９】 同様に、全長ＣＲＣＧＣＬタンパク質をコードするＤＮＡもまた、ベクターに
挿入し得る。

【０８１０】 あるいは、本発明のポリヌクレオチドを、組織特異的プロモーターを介して組
織特異的発現を制御する、ベクターに挿入し得る。例えば、トランスフェリンプ
ロモーターを有する構築物は、トランスジェニック動物の肝臓中でＣＲＣＧＣＬ
ポリペプチドを発現する。従って、配列番号２のアミノ酸Ｍ１〜Ｋ２３１をコー
ドするＤＮＡを、太字で示されるＢｇｌＩＩ制限部位を含む５’プライマー：

【０８１１】

【化１０】 （配列番号２８）、および太字で示されるＸｂａ制限部位を含む３’プライマー
：

【０８１２】

【化１１】 （配列番号３１）を使用して増幅し得る。

【０８１３】 同様に、全長ＣＲＣＧＣＬタンパク質をコードするＤＮＡもまた、組織特異的
発現のためのベクターに挿入し得る。

【０８１４】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。

【０８１５】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配されるか、同系交配されるか
、異系交配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そ
のような交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立
するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺
伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合ト
ランスジェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤ
ＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組
み込み部位についてホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニッ
ク動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々の
ホモ接合系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウン
ド上に導入遺伝子を配置するための交配。

【０８１６】 本発明のトランスジェニック動物は、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの生物学的機
能の詳述、異常なＣＲＣＧＣＬ発現に関連する状態および／または障害の研究、
ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのス
クリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する
。

【０８１７】 （実施例３１：ＣＲＣＧＣＬノックアウト動物） 内因性ＣＲＣＧＣＬ遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用してＣ
ＲＣＧＣＬ遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノック
アウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃ
ｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃ
ｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明
細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド
配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同なＤＮＡに隣
接される、本発明の変異体非機能性ポリヌクレオチド（または完全に関連のない
ＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いて
かまたは用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をト
ランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的
の遺伝子を含むが、発現しない細胞中でノックアウトを生じるために使用する。
標的化された相同組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺
伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が
不活性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る
研究および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ
ｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし
、このアプローチは、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換
えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化
される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。

【０８１８】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するように
遺伝子操作されている細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように
遺伝子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する
。このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ド
ナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）
、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。例え
ば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝子を
組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラスミド
、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの
使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペプチ
ドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列を破壊するためおよ
び／または本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するた
めに、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで、この細胞を遺伝子操作する。
本発明のポリペプチドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性
プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、ＣＲＣＧＣ
Ｌポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチ
ドを発現および好ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中にてか、ま
たは腹腔内に、患者中へ全身的に導入し得る。

【０８１９】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。

【０８２０】 投与される細胞が非自己細胞または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを
、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投
与し得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、構成成分とすぐ隣の細
胞外環境との交換が可能である間は、この形態により導入細胞が宿主免疫系によ
って認識され得ない。

【０８２１】 本発明のノックアウト動物は、ＣＲＣＧＣＬポリペプチドの生物学的機能の詳
述、異常なＣＲＣＧＣＬ発現に関連する状態および／または障害の研究、ならび
にこのような状態および／または障害を改善させる場合に有効な化合物のスクリ
ーニングにおいて有用な動物モデル系を含むがそれらに限定されない、用途を有
する。例えば、ノックアウトマウスを、ＡＡ００８６９４およびＷ９８３７２と
して開示される配列（その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用し
て、作製し得る。

【０８２２】 （実施例３２：Ｂ細胞の増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ
） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間での
、可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナ
ルは、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせ
る）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝
え得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｉ
Ｌ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナ
ルおよび阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深
いことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の共
刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団
中の活性、増殖、分化、ホーミング、寛容、および細胞死を誘導し得る。

【０８２３】 Ｂ細胞共刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーファ
ミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、そ
のそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に種
々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそれ
らの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセイ
は、これらのＢ細胞集団に対して、増殖および分化の点で種々のタンパク質が有
し得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細
胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするよう
に設計された２つのアッセイである。

【０８２４】 （インビトロアッセイ）−精製されたＣＲＣＧＣＬタンパク質、またはそれら
の短縮形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化も
しくは阻害および／または細胞死を誘導する能力について評価する。精製したヒ
ト扁桃腺Ｂ細胞に対するＣＲＣＧＣＬタンパク質の活性（０．１〜１０，０００
ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって定性的に測定する）を、標準的なＢリンパ球共
刺激アッセイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞を、
プライミング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕ
ｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいず
れかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは
、トリチウムチミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭの架橋
と協同してＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因子を、このアッセイを用いて容
易に同定し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯
渇によりヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、Ｃ
Ｄ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％より多くのＢ細胞であ
る。

【０８２５】 それぞれのサンプルの種々の希釈物を９６ウェルプレートの個々のウェルに配
置し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０^-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍ
ｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０^-5希釈のＳＡＣ
を含有するＲＰＭ１６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０⁵Ｂ細胞
を添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３Ｈ−チ
ミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）での２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量
する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地
である。

【０８２６】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、またはＣＲＣＧ
ＣＬタンパク質の２ｍｇ／ｋｇ、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（ｉ
．ｐ．）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠
殺し、そして分析のために種々の組織および血清を収集する。正常な脾臓および
ＣＲＣＧＣＬタンパク質で処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細
胞に対するＣＲＣＧＣＬタンパク質の活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ鞘の
拡散および／または赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ
細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカー
である、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓
細胞への任意の生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領
域に浸潤する漠然と規定されたＢ細胞区域内のＢ細胞提示の増加に起因するか否
かを決定する。

【０８２７】 ＣＲＣＧＣＬタンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー
分析を用いて、ＣＲＣＧＣＬタンパク質が、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２
０）ｄｕｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的
に増加するか否かを示す。

【０８２８】 同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価の相対的増加である。従って、血清のＩｇＭレベルおよびＩｇＡレベルを
緩衝液処置マウスとＣＲＣＧＣＬタンパク質処置マウスとの間で比較する。

【０８２９】 本実施例において記載する試験は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験し
た。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、ＣＲＣＧＣＬアゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬアンタゴ
ニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８３０】 （実施例３３：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣに対して実行し、そして³Ｈ−チミジ
ンの取り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェ
ルプレートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ま
たはアイソタイプが適合するコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１） １００μｌ／
ウェル（０．０５Ｍ 炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で
一晩、コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ
／Ｈ勾配遠心分離により単離し、そしてＣＲＣＧＣＬタンパク質の種々の濃度で
の存在下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコート
したプレートの４連のウェル（５×１０⁴／ウェル）に添加する（総量２００μ
ｌ）。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃
で４８時間の培養の後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１
００μｌの上清を取り出し、そして、増殖に対する効果が観察される場合、ＩＬ
−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵する。ウェルに
０．５μＣｉの³Ｈチミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７
℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そして³Ｈチミジンの取り込み
を増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。Ｉ
Ｌ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。
Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体をＣＲＣＧＣＬタンパク質の効果に
ついての陰性コントロールとして用いる。

【０８３１】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、ＣＲＣＧＣＬアゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬアンタゴ
ニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８３２】 （実施例３４：ＭＨＣクラスＩＩ、共刺激分子および接着分子の発現ならびに
単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に対するＣＲＣＧＣＬの効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖中の前駆体の増殖により生成する：
接着性ＰＢＭＣまたは溶出単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および
ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞
は、未成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０および
ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処
理は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、共刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。

【０８３３】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、ＣＲＣＧＣＬまたは
ＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよ
び０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希
釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体
とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞
をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメト
リーにより分析する。

【０８３４】 （サイトカインの生成に対する効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン
、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−
１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害
性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のように
ＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０⁶／ｍｌ）を、ＣＲＣＧＣＬの漸増
する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロー
ルとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そして市
販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供される
標準的プロトコールを用いる。

【０８３５】 （ＭＨＣクラスＩＩ、共刺激分子および接着分子の発現に対する効果） 細胞
表面抗原の３つの主なファミリー（接着分子、抗原提示に関与する分子、および
Ｆｃレセプター）が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の
共刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提
示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプター
の発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と
相関し得る。

【０８３６】 ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、ＣＲＣＧＣＬまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日処
理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄
し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標
識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる
洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
でのフローサイトメトリーにより分析する。

【０８３７】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。ＣＲＣＧＣＬ、アゴニストまたはＣＲＣＧＣＬのアン
タゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。
これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓ
ｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅ
ｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒ
ｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣ
から単離する。

【０８３８】 （単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的
に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（
ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の
濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コント
ロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有
するＰＢＳ中で２×１０⁶／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の
前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムに
おけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。

【０８３９】 （サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後
のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性であ
る。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。
ヒト単球を、５×１０⁵細胞／ｍｌの密度で、ＣＲＣＧＣＬの漸増する濃度とと
もに、および同じ条件下で、ただしこのＣＲＣＧＣＬの非存在下で、インキュベ
ートする。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、ＣＲＣＧＣＬの存在下で
ＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存
する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市
販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ，ＭＮ）を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用して
実施する。

【０８４０】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０⁵細胞／ウェルでプレートする。ＣＲＣＧＣＬの
漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％Ｆ
ＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベーション後
、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロファージの
単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキストロース
、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物質
（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２時間イン
キュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加して反応
を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成されるＨ₂Ｏ₂ の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ₂Ｏ₂溶液の標準曲線をそれぞれの実験
について実施する。

【０８４１】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８４２】 （実施例３５：ＣＲＣＧＣＬの生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた本発明の組換えＣＲＣＧＣＬを、皮質ニューロン細胞の生存、神経突起成長
または表現形分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸性タンパク質
免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセイのた
めの皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く行き渡
っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の以前に
報告された増強に基づく。例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて、これら
の細胞へのＣＲＣＧＣＬの活性を解明し得る。

【０８４３】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら
、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ
ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２〜３０
１６（１９８６）、アッセイは、本明細書でその全体が参考として援用される）
。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つの応答
が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでなく、どの
レセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する。神経
突起成長を誘導するＣＲＣＧＣＬの能力を、一次の皮質ニューロン培養パラダイ
ムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２で得られた
応答と比較し得る。

【０８４４】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ₂アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはＣＲＣＧＣＬ
と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍ
ａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ₂についてアッセイする。ＩＬ
−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間
、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換し
た後、細胞をＣＲＣＧＣＬＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、Ｆ
ＧＦ−２またはＣＲＣＧＣＬと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そ
してＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩ
Ｌ−６についてアッセイする。

【０８４５】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２またはＣＲＣＧＣＬとともに基礎培地中で３日
間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍａｒ Ｂ
ｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、ＣＲＣＧＣＬでの刺激に匹敵して用いられ得
る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。

【０８４６】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ⁺）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ⁺は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ⁺は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミド二リン酸
：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達
を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。

【０８４７】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒
性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証
している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９０）。

【０８４８】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、ＣＲＣＧＣＬは、インビトロにおける
ドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、ＣＲＣＧＣＬがＦＧＦ
−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価され得、そして、
ＣＲＣＧＣＬはまた、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ
処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試験され得る。ＣＲＣＧＣＬ
の潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにおいてイン
ビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖す
ることにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオル
チニン−ラミニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃｍ²の密
度で播いた。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホルモン補充物（Ｎ
Ｉ）を含有するＦ１２培地中で維持する。インビトロで８日後培養物をパラホル
ムアミドで固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニュー
ロンについての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理する。分離
した細胞培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごとに変化させ、そ
してこの因子をまたその時点ごとに添加する。

【０８４９】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もしＣＲＣＧＣＬがドーパミ
ン作動性の生存を延長するように作用するならば、このＣＲＣＧＣＬがパーキン
ソン病に関与し得ることを示唆する。

【０８５０】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８５１】 （実施例３６：血管内皮細胞の増殖へのＣＲＣＧＣＬの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０⁴細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。配列番号２のＣＲＣＧＣＬタンパク質および陽性コントロール（例
えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４
日目および６日目に、培地を交換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅ
ｒを用いて細胞数を決定する。

【０８５２】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、ＣＲＣＧＣＬが血管内皮細胞を増殖し得ることを
示す。

【０８５３】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８５４】 （実施例３７：血管内皮細胞の増殖へのＣＲＣＧＣＬの刺激効果） 増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ₁₆₅または０．５％ＦＢＳ中のＣ
ＲＣＧＣＬ）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（
１：０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間インキュベー
トさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸収を測定する。コ
ントロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンドの吸収を差し引き
し、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施する。Ｌｅａｋ
ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２〜５１８
（１９９４）を参照のこと。

【０８５５】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８５６】 （実施例３８：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微
鏡試験のために標本にし、そしてＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵ
ｒｄ係数は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞の割合として計算される
。さらに、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時使用に
より、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を
実行する。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３６
）：２１９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと。

【０８５７】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８５８】 （実施例３９：内皮遊走の刺激） 本実施例は、ＣＲＣＧＣＬがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し得る可能性を探
索するために用いられ得る。

【０８５９】 内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３：
２３９〜２４７）。８μｍの孔径を有するポリビニルピロリドンを含まないポリ
カーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、そして滅菌
空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＭ
１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希釈を改変Ｂ
ｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期継代（２〜
６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離に必要な最
小の時間トリプシン処理する。底部チャンバと上部チャンバとの間のフィルター
を配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１９９中に懸濁した２．５×
１０⁵細胞を上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、５％ＣＯ２
を用いて湿潤にしたチャンバ中で３７℃で５時間インキュベートして細胞を遊走
させた。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そして非遊走
細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン（ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）
でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅｍｓａ溶液（
Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で染色
する。遊走は、それぞれのウェルにおいて、３つの無作為の高出力視野（４０×
）の細胞を計数することにより定量し、そしてすべての群を４連で実行する。

【０８６０】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８６１】 （実施例４０：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮により放出された一酸化窒素は、血管内皮弛緩の介在物質であると考
えられている。従って、ＣＲＣＧＣＬの活性は、このＣＲＣＧＣＬに応答する内
皮細胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。

【０８６２】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）およびＣＲＣＧＣＬへの４時間の曝露の後のコンフルエ
ントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の一酸化窒
素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により測定して、硝酸還元酵素による一酸化硝酸
由来の硝酸塩の還元後の亜硝酸塩の総量を測定する。一酸化窒素放出に対するＣ
ＲＣＧＣＬの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。

【０８６３】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ₂＋２ＫＩ＋２Ｈ₂ＳＯ₄６２ＮＯ＋Ｉ₂＋２Ｈ₂Ｏ＋２Ｋ₂ＳＯ₄ 標準検量線を、ＫＩおよびＨ₂ＳＯ₄を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ ₂ （０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）
を添加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オー
センティックなＮＯ気体からのＮＯを測定することにより、事前に決定する（１
０５０）。この培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリ
ン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で
５ｍｌの濾過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞
プレートを、３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌ
ｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープロー
ブをウェルに垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表
面の２ｍｍ下で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、
陽性コントロールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０⁶内皮細胞あた
りのピコモル濃度として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数
）における４〜６の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参
照のこと。

【０８６４】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８６５】 （実施例４１：新脈管形成における索形成に対するＣＲＣＧＣＬの効果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合に微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。

【０８６６】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代目）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５
継代目で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培
養プレートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅ
ｎｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃に
て３０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、コートしたウェルに７，５００細胞／
ウェルで播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、この
Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液またはＣＲＣＧＣＬ（０．
１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ’Ｃｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの細胞
をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ
ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッセイ
を三連で行なう。

【０８６７】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。

【０８６８】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８６９】 （実施例４２：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。ＣＲ
ＣＧＣＬの、ＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。

【０８７０】 Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精
卵および日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）を、
３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分化
したＣＡＭおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。

【０８７１】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１
３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無
塩成長因子を蒸留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペッ
トで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３
％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２
Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８
］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために
包埋する。コントロールを、キャリアディスクのみで行う。

【０８７２】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８７３】 （実施例４３：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） ＣＲＣＧＣＬのインビボ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様構造の、マ
ウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカプセル中に新し
い脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、この混合物は凝固
する）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り除き、そし
て新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。

【０８７４】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌでＣＲＣＧＣＬと混合し、冷３ｍｌシリンジ中
に入れる。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、腹部の中腹側面の２つの部
位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０．５ｍｌ／
部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ
を取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維組織を取り
除く）。複製のプラグ全体を中性緩衝化１０％ホルムアミド中で固定し、パラフ
ィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後、組織
学的試験のための切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異なる領域
からの切片を、処理する。選択した切片をｖＷＦの存在について染色する。この
アッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ
）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基底レベルを決定する
。

【０８７５】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８７６】 （実施例４４：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） ＣＲＣＧＣＬの虚血に対するインビボでの効果を研究するため、ウサギ後肢虚
血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａ
ｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿動脈の
外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播および外腸骨
動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から生じる側
副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４７：
１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で、ウサギの手術後の回復お
よび内因性の側副血管の発達を可能にする。手術後１０日目（０日目）に、ベー
スライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、ＣＲＣＧＣＬを含む５０
０ｍｇの裸の発現プラスミドを用いて、（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒ．ら、Ｈｕｍ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｇ．ら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））に記載さ
れるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移入技術に
より、トランスフェクトする。ＣＲＣＧＣＬを処置に用いる場合、５００ｍｇの
ＣＲＣＧＣＬタンパク質またはコントロールの単回ボーラスを、注入カテーテル
を通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動脈中に送達する。３０日目に、種々
のパラメーターを、これらのウサギで測定する：（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期
血圧 対 正常肢の収縮期血圧の比；（ｂ）血流および逆流−停止ＦＬ：非拡張
状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全拡張状態の間の血流（また、血管量の間
接的測定）、そして逆流は、最大ＦＬ：停止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管
造影値（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影
により測定する。値を、かぶせたグリッド内の円の百分率（ウサギ大腿の総数ｍ
で割った横断不透明化動脈を用いる）により決定する；（ｄ）毛細管（ｃａｐｉ
ｌｌａｒｙ）密度−後肢から得た光学顕微鏡用切片において決定した側副毛細血
管の数。

【０８７７】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８７８】 （実施例４５：ＣＲＣＧＣＬの血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然高血圧ラット（ＳＨＲ
）において、ＣＲＣＧＣＬが血圧に影響を与える能力を、試験する。漸増用量（
０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）のＣＲＣＧＣＬを
、１３〜１４週齢の自然高血圧ラット（ＳＨＲ）に投与する。データを、平均＋
／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用いて行い、そして統計的な
有意性を、緩衝液単独への応答に対するｐ＜０．０５として定義する。

【０８７９】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８８０】 （実施例４６：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
のＣＲＣＧＣＬの発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用いて研究す
る。

【０８８１】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚、 ｂ）虚血皮膚創傷、 ｃ）通常の創傷。

【０８８２】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
背下部におよぶ筋皮弁）を生じさせること、 ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくること（直径４〜６ｍｍ）、 ｃ）１ｍｇ〜１００ｍｇの種々の投薬量範囲でＣＲＣＧＣＬを用いて、（創傷
後の０、１、２、３、４日目に）切除創傷の局所的な処置をすること、 ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集すること。

【０８８３】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８８４】 （実施例４７：末梢動脈疾患モデル） ＣＲＣＧＣＬを用いる新脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合、虚血周囲の血
流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以下を含む
： ａ）一方の側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方の
側の後肢は、コントロールの役割をする。

【０８８５】 ｂ）ＣＲＣＧＣＬを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲で、一週間あたり静
脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜３週間、送達
する。

【０８８６】 ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１、２、および３週間目に、Ｃ
ＲＣＧＣＬの発現の分析ならびに組織学のために収集する。生検もまた、他方の
側の対側後肢の正常な筋肉において行う。

【０８８７】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質での活性を試験
した。しかし、当業者は、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、アゴニストの活性、および／またはＣＲＣＧＣＬのアンタゴニストの
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０８８８】 （実施例４８：虚血性心筋疾患モデル） ＣＲＣＧＣＬを、側副血管の発達を刺激し得、そして冠状動脈閉塞後の新しい
血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ＣＲＣＧＣＬ発現の変
化を、インサイチュで研究する。この実験プロトコルは、以下を包含する： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる ｂ）ＣＲＣＧＣＬタンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲で、静脈
内および／または筋肉内に１週間あたり３回（おそらくそれより多く）で２〜４
週間にわたり送達する ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片
化し、そしてインサイチュで分析する。

【０８８９】 本実施例に記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質の活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチ
ド（例えば、遺伝子治療）、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストの活性を試験し得る。

【０８９０】 （実施例４９：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、新生血管形成に対するＣＲＣＧＣＬの効果を示す。この実
験プロトコルは、以下を包含する： ａ）角膜の中心から支質層へと１〜１．５ｍｍの長さの切開を作ること ｂ）眼の外側の角に面する切開の唇縁の下にへらを挿入すること ｃ）ポケットを作ること（その基底は、眼の縁から１〜１．５ｍｍである） ｄ）５０ｎｇ〜５μｇのＣＲＣＧＣＬを含む小丸剤を、このポケット内に配置
すること ｅ）ＣＲＣＧＣＬ処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲内で（毎日
の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得ること。

【０８９１】 本実施例に記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質の活性を試験した。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレオチ
ド（例えば、遺伝子治療）、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストの活性を試験し得る。

【０８９２】 （実施例５０：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド損傷創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） ＣＲＣＧＣＬが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷治癒の遺
伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層（ｆｕ
ｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、十分に特徴付けられ、臨床的に
関連性があり、そして再現可能な損傷創傷治癒モデルである。糖尿病性創傷の治
癒は、収縮ではなく肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅ
ｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅ
ｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９
９０））。

【０８９３】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マ
ウスは、第４染色体上に単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏ
ｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８３
−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変異
糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したまたは
正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａｎｄ
ｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ−
Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７
（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６
−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管病変、基底
膜肥厚、および糸球体濾過異常が、これらの動物において記載されている（Ｎｏ
ｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９
８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７（
１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４
６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３
１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖
症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐
性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７
（１９７８））。

【０８９４】 これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖
尿病において観察される治癒に類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇ
ｈら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０
））。

【０８９５】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いる（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、
そしてこれらの動物は研究の開始時に８週齢である。動物を個別に飼育し、そし
て自由に食物および水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この実
験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅ
ｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎ
ｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイド
ラインに従って行う。

【０８９６】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷処理日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡｖ
ｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよび
２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を剃
毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲を
、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、Ｋ
ｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創傷
の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷は開放させたままで
ある。処置の適用を、創傷させた日から開始して５日間連続で、局所的に与える
。処置の前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに
洗浄する。

【０８９７】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを
用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創
傷を連続した上皮が覆う場合に治癒したとみなす。

【０８９８】 ＣＲＣＧＣＬを、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲のＣＲＣＧＣＬ（１
日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロ
ール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。

【０８９９】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。

【０９００】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の以下
の３つの群を評価する：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）ＣＲＣＧＣ
Ｌ。

【０９０１】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、ならびに創傷の面積
の合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日目
）と処置後（８日目）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日
目のこの創傷面積は、６４ｍｍ²（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算
を以下の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。

【０９０２】 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見が、ＣＲＣＧＣＬを用いる処置によっ
て改変されたかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、
線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａ
ｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０）
）。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓ
ｅｒｖｅｒ）が用いる。

【０９０３】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。

【０９０４】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そして
ヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱
落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位
は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい
増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。

【０９０５】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。０．０５未満のｐ値を有意とみ
なす。

【０９０６】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ Ｓ．Ｍ．，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉ
ｄｓ ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏ
ｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）；Ｗａｈｌ Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ Ｚ．ら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコ
イドは、新脈管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ Ｒ．Ｈ．ら、Ａ
ｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞
増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低下させること
、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ Ｂ．Ｆ．
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈ
ｌ Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅ
ａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉ
ｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によっ
て創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、
ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ Ｂ．
Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗ
ａｈｌ Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ
ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃ
ｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐ
ｉｅｒｃｅ Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：２２２９−２２３３（１９８９））。

【０９０７】 ＣＲＣＧＣＬが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治癒が、メ
チルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除皮膚創傷
に対するＣＲＣＧＣＬの複数の局所適用の効果を評価する。

【０９０８】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラットの
治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋ
ｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食
物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔ
ｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏ
ｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って
行う。

【０９０９】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５ｍ
ｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動
物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄
する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷
をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放する
。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した日
から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷を
滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。

【０９１０】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを
用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創
傷を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。

【０９１１】 ＣＲＣＧＣＬを、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲のＣＲＣＧＣＬ（１
日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロ
ール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。

【０９１２】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。

【０９１３】 各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）未処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、および３）ＣＲＣＧＣＬ処置群。

【０９１４】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、ならびに創傷の面積
の合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日目
）と処置後（８日目）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日
目のこの創傷面積は、６４ｍｍ²（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算
を以下の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。

【０９１５】 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態学的な外見を、ＣＲＣＧＣＬを用いる処置によって改善したかどう
かを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察
者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を決定す
る。

【０９１６】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。０．０５未満のｐ値を有意とみ
なす。

【０９１７】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチド（例えば、遺伝子治療）、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストおよび／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。

【０９１８】 （実施例５１：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立におけるＣＲＣＧＣＬ
の治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製する
ことである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパの脈管の量の定量、総血
漿タンパク質の量、および組織病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７
〜１０日間観察される。恐らくより重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週
間まで続く。

【０９１９】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の皮内に、
０．０５ｍｌの１％エバンスブルーを注射する。次いで、足への色素の注射の後
、周径測定および体積測定を行う。

【０９２０】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置確認する。次いで、この領域の主要なリンパ管を、電気凝固（ｅｌｅｃｔｒｉ
ｃａｌｌｙ ｃｏａｇｕｌａｔｅ）するか、または縫合結紮（ｓｕｔｕｒｅ ｌ
ｉｇａｔｅ）する。

【０９２１】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。

【０９２２】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。

【０９２３】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に飼育する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。

【０９２４】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２名の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均化する。読み取りを、コ
ントロールおよび水腫肢の両方から得る。

【０９２５】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１名の人物によって記録し、一方他方は、脚
を印を付けた領域まで漬ける。

【０９２６】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２⁺比較について結論付ける。

【０９２７】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。

【０９２８】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、そして切断
するまで、標識化サンプルバッグに−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉
を、蛍光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。

【０９２９】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチド（例えば、遺伝子治療）、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストおよび／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。

【０９３０】 （実施例５２：ＣＲＣＧＣＬによるＴＮＦα誘導性接着分子発現の抑制） 炎症および新脈管形成の領域へのリンパ球の補充は、リンパ球上の細胞表面接
着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作用を
伴う。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方において、細
胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、
および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）発
現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管内皮に
おける発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の間に局
所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所濃度は
、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。

【０９３１】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力な炎症誘発性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。

【０９３２】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介するＣＲＣＧＣＬの潜在能力を試験
し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを使用する
）を使用して、ＦＧＦタンパク質ファミリーのメンバーを用いて同時刺激した場
合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。

【０９３３】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ₂を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０⁴細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。

【０９３４】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。

【０９３５】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＡＣＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ
および抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ
／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境におい
て、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ
）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。

【０９３６】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０⁰）＞１０^-0.5＞１０^-1＞１０^-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０
ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。

【０９３７】 本実施例において記載される研究は、ＣＲＣＧＣＬタンパク質活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＣＲＣＧＣＬポリヌクレ
オチド（例えば、遺伝子治療）、ＣＲＣＧＣＬのアゴニストおよび／またはアン
タゴニストの活性を試験し得る。

【０９３８】 （実施例５３：ＣＲＣＧＣＬアゴニストおよびＩＬ−７による、骨髄からのＴ
細胞増殖の誘導） 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドおよび／またはそれらのアゴニストを、ヒ
ト骨髄からのＴ細胞増殖の誘導について試験する。

【０９３９】 ヒト骨髄由来の単核細胞（ＢＭ ＭＮＱ）を、Ｆｉｃｏｌｌに対する骨髄全体
の遠心分離によって単離する。ＢＭ ＭＮＣを、１０％ウシ胎仔血清、ならびに
１フラスコあたり６または７ｍｌの総容量において４．５〜１０×ＩＯ’細胞／
ｍｌの間の範囲の濃度のアミノ酸およびビタミン補充物を補充した、ＭｃＣｏｙ
培地において培養する（Ｔ２５）。本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドおよび／
またはそれらのアゴニスト、ならびに他のサイトカイン（すなわち、ＩＬ−７、
ＳＬＦ（すなわち、Ｓｌ因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）、または幹細胞因子
、またはマスト細胞増殖因子）またはｆｌｔ３Ｌ）を、単独または組み合わせの
いずれかにおいて、０日目に培養物に添加する。１４日後、そしてその後毎週、
この培養物の半分を、係数のために取り出す。新鮮な培地およびサイトカインを
、この培養物に添加して、総容量を６または７ｍｌに戻す。

【０９４０】 収集した細胞をまた、培養の１４日後、そしてその後毎週、細胞表面抗原に特
異的な抗体を使用するフローサイトメトリーを通して分析する。使用される抗体
は、Ｔ細胞抗原（すなわち、α／β Ｔ細胞レセプター、γ／δ Ｔ細胞レセプ
ター、およびＣＤ３）、Ｂ細胞抗原（すなわち、ＣＤ１９および表面ＩｇＭ）、
ナチュラルキラー細胞抗原（すなわち、ＣＤ５６）、単球抗原（すなわち、ＣＤ
１４）、および顆粒球抗原（すなわち、ＣＤ１５）に特異的であり得る。

【０９４１】 本発明のＣＲＣＧＣＬポリペプチドおよび／またはそれらのアゴニスト、なら
びにＩＬ−７のＢＭ ＭＮＣへの添加は、細胞増殖を誘導する。

【０９４２】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示に照らして可能であり、従って、それらは、添付の特許請求の範囲内である
。

【０９４３】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の開示全体（
特許、特許出願、学術論文、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示物を含
む）は、本明細書中に参考として援用される。さらに、米国特許出願番号６０／
０７８，５６３号（１９９８年３月１９日出願）、同６０／０８６，５０５号（
１９９８年５月２２日出願）、同０９／２６３，６２６号（１９９９年３月５日
出願）、および同０９／３７６，４３０号（１９９９年８月１８日出願）からの
配列表を、本明細書中で参考として援用する。

【０９４４】

【表５】 ＡＴＣＣ受託番号２０９６４１ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。

【０９４５】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０９４６】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。

【０９４７】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。

【０９４８】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ受託番号２０９６４１ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０９４９】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０９５０】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。

【０９５１】

【表６】 ＡＴＣＣ受託番号２０９６９１ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。

【０９５２】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０９５３】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。

【０９５４】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。

【０９５５】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ受託番号２０９６９１ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０９５６】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０９５７】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＣＲＣＧＣＬのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定のアミノ
酸配列（配列番号２）を示す。推定のリーダー配列は、アミノ酸約１〜２２に位
置する。

【図２】 図２は、ＢＬＡＳＴ分析による、ＣＲＣＧＣＬタンパク質と最も近いホモログ
の翻訳産物であるＢｏｓ Ｔａｕｒｕｓインターロイキン−２レセプターγ（受
託番号１５３２０８８）（配列番号３）との間の相同領域を示す。これらの２つ
のポリペプチドの間の同一なアミノ酸に、黒い影を付し、一方、保存的アミノ酸
を四角で囲んだ。影および／または四角の領域を試験することによって、当業者
はこれらの２つのポリペプチドの間で保存されたドメインを容易に同定し得る。
これらの保存されたドメインは、好ましい本発明の実施形態である。

【図３】 図３は、ＣＲＣＧＣＬアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコ
イル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標、およ
び表面確率、が示され、そして初期設定を使用して作製された。「抗原性指標−
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」のグラフにおいて、正のピークは、ＣＲＣＧＣＬタ
ンパク質の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが
得られ得る領域）の位置を示す。これらのグラフによって規定されたドメインは
、本発明によって意図される。図３に図式的に要約されたデータを表にしたもの
を、表１に見出し得る。欄を、見出し「Ｒｅｓ」「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」およびロ
ーマ数字のＩ〜ＸＩＶで標識する。欄の見出しは、図３および表１に示されるア
ミノ酸配列の以下の特性をいう：「Ｒｅｓ」：配列番号２ならびに表１Ａおよび
１Ｂのアミノ酸残基；「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」：配列番号２ならびに表１Ａおよび
１Ｂの対応する残基の位置；Ｉ：α、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；Ｉ
Ｉ：α、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−
Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＶ：β、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ターン、領域−
Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩ：ターン、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ
；ＶＩＩ：コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親水性プロ
ット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；ＩＸ：親水性プロット−Ｈｏｐｐ−Ｗｏ
ｏｄｓ；Ｘ：α、ＸＩ：β、両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩＩ：可撓
性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；ＸＩＩＩ；抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏ
ｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩＶ：表面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月９日（２００１．３．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図２】 図２Ａ〜Ｂは、ＢＬＡＳＴ分析による、ＣＲＣＧＣＬタンパク質と最も近いホ
モログの翻訳産物であるＢｏｓ Ｔａｕｒｕｓインターロイキン−２レセプター
γ（受託番号１５３２０８８）（配列番号３）との間の相同領域を示す。これら
の２つのポリペプチドの間の同一なアミノ酸に、黒い影を付し、一方、保存的ア
ミノ酸を四角で囲んだ。影および／または四角の領域を試験することによって、
当業者はこれらの２つのポリペプチドの間で保存されたドメインを容易に同定し
得る。これらの保存されたドメインは、好ましい本発明の実施形態である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４９】 ＢＬＡＳＴ分析を使用して、配列番号２は、サイトカインレセプターファミリ
ーのメンバーに相同であることが見出された。特に、配列番号２は、インターロ
イキン−２レセプターγについてのＢｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ｍＲＮＡ（受託番号
１５３２０８８）（図２Ａ〜Ｂ）（配列番号３）の翻訳産物に相同なドメインを
含み、以下の保存ドメインを含む：（ａ）およそのアミノ酸２２６〜２６０に位
置する推定の膜貫通ドメイン；（ｂ）推定のＷＸＷＳ（配列番号３０）またはお
よそのアミノ酸１９８〜２０４（Ｔ−ｘ−Ｐ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓ）（配列番号１９
）に位置する［ＳＴＧＬ］−ｘ−Ｗ−［ＳＧ］−ｘ−Ｗ−Ｓ（配列番号１８）ド
メイン（しかし完全には一致しない）；および（ｃ）およそのアミノ酸２６１〜
２６８（Ｉ−Ｐ−Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｄ−Ｐ）（配列番号２１）に位置するモチーフＷ
（Ｐ，Ｅ）Ｘ（Ｖ，Ｉ）Ｐ（Ｎ，Ｓ，Ｄ）Ｐ（配列番号２０）ドメインを有する
、推定のＪａｋ Ｂｏｘ（しかし完全には一致しない）。これらのＣＲＣＧＣＬ
のポリペプチドフラグメントは、特に本発明において意図される。インターロイ
キン−２レセプターγ（アクセッション番号１５３２０８８）は、サイトカイン
レセプターとして重要であると考えられているので、インターロイキン−２レセ
プターγ（アクセッション番号１５３２０８８）とＣＲＣＧＣＬとの間の相同性
は、ＣＲＣＧＣＬはまた細胞の分化および増殖に関与し得ることを示唆する。Ｃ
ＲＣＧＣＬはまた、種々の種（例えば、ヒト（アクセッション番号ｇｉ／３４９
６３２））、イヌ属（アクセッション番号ｇｉ／５１７４１２）、およびマウス
（ｐｒｉ／Ｓ３７５８２）より単離された他のインターロイキン−２レセプター
γ遺伝子と相同である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 29/00 ４Ｃ０８５ 48/00 31/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 29/00 35/00 ４Ｈ０４５ 31/00 37/02 35/00 37/06 37/02 43/00 １０５ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/715 43/00 １０５ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 ムーア， ポール エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20874， ジャーマンタウン， レサーバーク ド ライブ 19005 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 HA14 HA17 4B063 QA08 QA18 QQ08 QQ79 QR48 QR77 QS33 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA14 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZB022 ZB072 ZB082 ZB112 ZB212 ZB262 ZB322 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB02 ZB07 ZB08 ZB11 ZB21 ZB26 ZB32 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA51 DA75 EA20 EA51 FA74

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９０％以上
   同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
   ： （ａ）配列番号１のポリヌクレオチドフラグメント、またはＡＴＣＣ寄託番号
   ：２０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチ
   ドフラグメント； （ｂ）配列番号２のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド
   、またはＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるｃＤ
   ＮＡ配列； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメインをコードするポリヌクレオチド、ま
   たはＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるｃＤＮＡ
   配列； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド、
   またはＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるｃＤＮ
   Ａ配列； （ｅ）生物学的活性を有する、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌ
   クレオチド、またはＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４１もしくは２０９６９１に含
   まれるｃＤＮＡ配列； （ｆ）配列番号１の改変体である、ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１の対立遺伝子改変体である、ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号２の種相同体をコードする、ポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）に特定されたポリヌクレオチドのいずれか１つに、スト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、ここ
   で該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列を有
   する核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、ポリヌク
   レオチド。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、成熟形態タンパク質
   または分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の
   単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号２に同定さ
   れる配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４
   １もしくは２０９６９１に含まれるコード配列を含む、請求項１に記載の単離さ
   れた核酸分子。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号１のヌクレ
   オチド配列全体、またはＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４１もしくは２０９６９１
   に含まれるｃＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
   ら連続してヌクレオチドを欠失している、請求項２に記載の単離された核酸分子
   。
6. 【請求項６】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
   ら連続してヌクレオチドを欠失している、請求項３に記載の単離された核酸分子
   。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
   ー。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む組換え宿主細胞
   を作成する、方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
   。
10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
11. 【請求項１１】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９０％以
    上同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド： （ａ）配列番号２のポリペプチドフラグメント、またはＡＴＣＣ寄託番号：２
    ０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるコードされた配列のポリペプチドフ
    ラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号２のポリペプチドフラグメント、また
    はＡＴＣＣ寄託番号：２０９６４１もしくは２０９６９１に含まれるコードされ
    た配列のポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号：２０９
    ６４１もしくは２０９６９１に含まれるコードされた配列のポリペプチドドメイ
    ン； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号：２０
    ９６４１もしくは２０９６９１に含まれるコードされた配列のポリペプチドエピ
    トープ； （ｅ）分泌タンパク質の成熟形態； （ｆ）分泌された全長タンパク質； （ｇ）配列番号２の改変体； （ｈ）配列番号２の対立遺伝子改変体；あるいは （ｉ）配列番号２の種相同体。
12. 【請求項１２】 前記成熟型または全長の分泌タンパク質が、Ｃ末端または
    Ｎ末端のいずれかから連続してアミノ酸を欠失している、請求項１１に記載の単
    離されたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作成する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項１４に記載の組換え
    宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生されるポリペプチド
    。
17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または寛解するための方法であ
    って、請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ドの治療上有効な量を、哺乳動物被検体に投与する工程を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 分泌タンパク質の発現または活性に関連する、被験体にお
    ける病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって
    以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を
    決定する工程； （ｂ）該変異の存在または非存在に基いて、病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 分泌タンパク質の発現または活性に関連する、被験体にお
    ける病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって
    以下： （ａ）生物学的サンプルにおける、請求項１１に記載のポリペプチドの発現の
    存在または量を決定する工程； （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基いて、病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定するための方法であって、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドと結合パートナーを接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが、該ポリペプチドの活性に影響するか否かを決定す
    る工程、 を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 配列番号２のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子。
22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて、活性を同定する方法であって
    、該方法は、以下： （ａ）細胞において配列番号１を発現する工程； （ｂ）上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生される、産物。
24. 【請求項２４】 請求項１１に記載のポリペプチドを含有する、マルチマー
    。