JP2001516581A - DcR3ポリペプチドというTNFR相同体 - Google Patents
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Abstract
Description
」と命名する新規ポリペプチドの組換え生産に関する。
ンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、Fasリガンド(Apo−1リ ガンド又はCD95リガンドとも称される)、及びApo-2リガンド(トレイル
(TRAIL)とも称される)等の様々な分子が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「TN
F」)ファミリーのメンバーとして同定された[例えば、Gruss及びDower, Blood , 85:3378-3404(1995);Wileyら, Immunity, 3:673-682(1995);Pittiら, J. Biol. Chem. , 271:12687-12690(1996)]。これらの分子のなかでも、TNF-α
、TNF-β、CD30リガンド、4-1BBリガンド、Fasリガンド、及びA
po-2リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告さ
れている。TNF-αとTNF-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトー
シス性細胞死を誘発することが報告されている[Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci. , 83:1881(1986); Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689(1987)]。ゼ ングらは、TNF-αがCD8ポジティブT細胞のポスト刺激性アポトーシスに 関与していることを報告している[Zhengら, Nature, 377:348-351(1995)]。 他の研究者は、CD30リガンドが胸腺における自己反応性T細胞の欠失に関与
していることを報告している[Amakawaら, プログラム細胞死に関するコールド スプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)]。
活性化誘発性細胞死(AICI);(b)免疫特権的部位からの炎症細胞の除去
;及び(c)細胞毒性リンパ球による損傷細胞の殺傷[Nagata, Cell, 88: 355
(1997))]を調節することが明らかになった。T細胞AICDが、ひとたび感染 がクリアされた宿主の免疫反応の停止を助けると報告されている。抗体によるT
細胞レセプター(TCR)の繰り返し刺激は、Tヘルパー細胞の表面におけるF
asリガンド及びFasの発現を誘発し、従って、FasリガンドはFasに結
合し、活性化されたリンパ球のアポトーシスをトリガーして、それらの除去を導
く。免疫特権的部位は、炎症性免疫反応が機能を乱す可能性のある眼、脳又は精
巣といった組織を含む。免疫特権的部位における細胞は、構成的にFasリガン
ドを発現し、Fas依存性アポトーシスを通してFasを発現する浸潤している
白血球を除去する。黒色腫[Hahne等, Science, 274:1363 (1996)]及び肝細胞 ガン[Strand等, Nature Med., 2:1361-1366 (1996)]を含むある種のガンは、 免疫サーベランス(survaillance)を回避するために類似のFasリガンド依存性
機構を用いる。ナチュラルキラー(NK)細胞及び細胞毒性Tリンパ球は、ウイ
ルス又は細菌感染により、又は少なくとも2つの経路での発ガン遺伝子形質転換
により損傷を受けた細胞を除去すると報告されている。一方の経路は、パーフォ
リン及びグランザイムの放出を含み、代替的経路は、標的細胞上のFasの結合
によるFasリガンドの発現及びアポトーシスの誘発を含む[Nagata, 上掲;Mo
retta, Cell, 90:13 (1997)]。
における変異は、幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Fasリガンドが末梢
における自己反応性リンパ球のクローン欠失の調節において役割を担っているこ
とを示している[Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994);Nagata 等, Science, 267:1449-1456 (1995)]。また、Fasリガンドは、CD4ポジ ティブTリンパ球及びBリンパ球における細胞刺激後アポトーシスを誘発すると
報告されており、もはや必要でない場合の活性化されたリンパ球の除去に含まれ
得る[Krammer等, 上掲;Nagata等, 上掲]。Fasレセプターと特異的に結合 するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、TNF-αに匹敵するか類似す る細胞死滅活性を示すことが報告されている[Yoneharaら, J. Exp. Med., 169 :1747-1756(1989)]。
、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。
約55-kDa(TNFR1)と75-kDa(TNFR2)の2つの異なるTNFレ
セプターが同定されており[Hohmanら, J. Biol. Chem., 264:14927-14934(198
9);Brockhausら, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131(1990);1991年3月2
0日に公開されたEP417563]、双方のレセプターの型に対応するヒト及 びマウスcDNAが単離され、特徴付けされている[Loetscherら, Cell, 61:3
51(1990);Schallら, Cell, 61:361(1990);Smithら, Science, 248:1019-102
3(1990);Lewisら, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834(1991);Goodwinら
, Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026(1991)]。広範な多型性が、双方のTNF レセプター遺伝子に関連している[例えば、Takaoら, Immunogenetics, 37:199
-203(1993)を参照]。双方のTNFRは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細
胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分は
また可溶性TNF結合タンパク質として天然に見出される[Nophar, Yら, EMBO J. , 9:3269(1990);及びKohno, Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:83
31(1990)]。更に最近になって、組換え体可溶性TNFレセプターのクローニン
グがヘイル(Hale)らにより報告されている[J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991,
p.113(P424)]。 1型又は2型のTNFR(TNFR1及びTNFR2)の細胞外部分は、NH2
末端から出発して、1〜4とされる4つのシステインに富んだドメイン(CRD)
の反復アミノ酸配列パターンを含む。各CRDは約40のアミノ酸長のものであ
り、良好に保存された位置に4〜6のシステイン残基を含んでいる[Schallら, 上掲 ;Loetscherら, 上掲;Smithら, 上掲;Nopharら, 上掲;Kohnoら, 上掲] 。TNFR1において、4つのCRDのおおよその境界は次の通りである:CR
D1−14から約53までのアミノ酸;CRD2−約54から約97までのアミ
ノ酸;CRD3−約98から約138までのアミノ酸;CRD4−約139から
約167までのアミノ酸。TNFR2において、CRD1は、17〜約54まで
のアミノ酸を、CRD2は約55から約97までのアミノ酸を;CRD3は約9
8から約140までのアミノ酸を;CRD4は約141から約179までのアミ
ノ酸を含む[Bannerら, Cell, 73:431-435(1993)]。また、リガンド結合にお けるCRDの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)らにより記載されている。
Johnsonら, Cell, 47:545(1986);Radekeら, Nature, 325:593(1987)]、B細
胞抗原CD40[Stamenkovicら, EMBO J., 8:1403(1989)]、T細胞抗原OX 40[Malletら, EMBO J., 9:1063(1990)]及びFas抗原[Yoneharaら, 上掲 、及びItohら, Cell, 66:233-243 (1991)]を含む幾つかの他の細胞表面タンパ ク質に存在している。また、CRDはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィ ルスの可溶型TNFR(sTNFR)様のT2タンパク質にも見出されている[Up
tonら, Virology, 160:20-29(1987);Smithら, Biochem. Biophys. Res. Commu n. , 176:335(1991);Uptonら, Virology, 184:370(1991)]。これらの配列の 最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを
示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、TNF/NGFレセプタ
ースーパーファミリーのメンバーと称される。p75NGFRに関する最近の研
究では、CRD1の欠失[Welcher, A.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :159-163(1991)]又はこのドメインにおける5-アミノ酸の挿入[Yan. H及びCh
ao, M.V., J. Biol. Chem., 266:12099-12104(1991)]は、NGF結合にはほと
んど又は全く影響を持たないことが示されている[Yan. H及びChao, M.V., 上掲 ]。p75NGFRは、そのCRD4と膜貫通領域の間に、NGF結合に関与し
ない約60のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む[Peetre, Cら, Eur. J. H ematol.,41 :414-419(1988);Seckinger, Pら, J. Biol. Chem., 264:11966-11
973(1989);Yan. H及びChao, M.V., 上掲]。同様のプロリンに富んだ領域はT NFR2に見出されているが、TNFR1にはない。
る[Itohら, 上掲]。また、Fas抗原の発現は、細胞をTNF-α又は抗Fa sのマウスモノクローナル抗体で処理した場合に、TNFR1のものと共にダウ
ンレギュレーションされることが報告されている[Krammerら, 上掲;Nagataら,
上掲]。従って、Fas及びTNFR1レセプターの双方を同時発現する株化 細胞が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死滅を媒介しているとの仮説を唱
える研究者もいた[同]。
に対して、今日までに同定されているTNFレセプター(TNFR)ファミリーの
レセプター類はI型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、TNFリガンド
及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された
相同性は、主として細胞外ドメイン(「ECD」)において見出されている。TN
F-α、Fasリガンド及びCD40リガンドを含むTNFファミリーサイトカ インのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され;各場合に得ら
れたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体
分子を形成する。また、TNFレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タ
ンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性
レセプターのECDを放出する。
の新たに同定されたTNFRファミリーのメンバーは、CAR1、HVEM及び
オステオプロテゲリン(osteoprotegerin)(OPG)を含む[Brajatsh等, Cell,
87:845-855 (1996);Montgomery等, Cell, 87:427-436 (1996);Marsters等, J
. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997);Simonet等, Cell, 89:309-319 (1997
)]。他の知られたTNFR様分子とは異なり、上掲のシモネット(Simonet)等は
、OPGが疎水的膜貫通スパンニング配列を含まないことを報告している。
性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でTNFR1及びCD95に似てお
り、Apo-3と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を開示している [Marstersら,Curr. Biol., 6:1669(1996)もまた参照されたい]。他の研究者 によれば、Apo-3はDR3、wsl-1及びTRAMPとも称されている[Ch
innaiyanら, Science, 274:990(1996);Kitsonら, Nature, 384:372(1996);B
odmerら, Immunity, 6:79(1997)]。
を開示している[Panら, Science, 276:111-113(1997)]。DR4は細胞自殺器
を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。パンらは、DR4が
Apo-2リガンド又はTRAILとして知られているリガンドに対するレセプ ターであると考えられることを開示している。
また、Apo-2とも称されていた)。DR4と同様に、DR5は、細胞質脂肪 ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達ができる。
リガンド(TRAIL)のデコイレセプターであると開示されている。シェリダ
ンらは、DcR1がインビトロでApo-2リガンド機能を阻害することができ ると報告している。また、TRIDと称されるデコイレセプターに関する開示に
ついては、パンら,上掲を参照。 TNFファミリーのサイトカイン及びそれらのレセプターについての概説は、
Gruss及びDower, 上掲参照。
て重要な役割を担うことができる。多くの個体細胞の運命、例えば増殖、泳動、
分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直近の環
境から受容した情報によって支配される。この情報は、しばしば分泌されたポリ
ペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペ
プチド因子、及びホルモン)によって伝達され、一方それらは、多様な細胞レセ
プター又は膜結合タンパク質によって受容され解読される。これらの膜結合タン
パク質及び細胞レセプターは、それらに限られないが、サイトカインレセプター
、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞相互作用に含ま
れるレセプター、及びセレクチン及びインテグリン等の細胞接着分子を包含する
。例えば、細胞成長及び分化を調節する信号の伝達は、部分的には種々の細胞タ
ンパク質のリン酸化によって調節される。タンパク質チロシンキナーゼというこ
の過程を触媒する酵素も、成長因子レセプターとして作用することができる。例
としては、線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれ
る。
業的用途を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−
リガンド相互作用を阻止する治療薬として用いることができる。また、膜結合タ
ンパク質は、潜在的ペプチド又は関連するレセプター/リガンド相互作用の分子
阻害剤のスクリーニングにも用いることができる。
力がなされてきた。多くの努力は、新たなレセプタータンパク質をコードする配
列を同定するための、哺乳動物組み換えDNAライブラリのスクリーニングに集
中している。
ードするcDNAクローンを同定した。ここで用いられる「DcR3」なる語は
、本出願人が既に「DNA30942」と呼んでいるものと同じポリペプチドを
指す。
含む単離された核酸分子を提供する。一態様において、単離された核酸分子は、
図1(配列番号:1(SEQ ID NO:1))のアミノ酸残基1〜300;図1(配列番 号:1)のアミノ酸残基1〜215;又はxが図1(配列番号:1)の残基21
5〜300のいずれかである場合の残基1〜xを有するDcR3ポリぺプチドを
コードするDNAを含むか、又はこのようなコード核酸配列に相補的であり、少
なくとも中程度、場合によっては高いストリンジェント条件下でそれに安定して
結合したままである。
含んでなるベクターを提供する。また、このようなベクターを含有する宿主細胞
も提供する。例として、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよ
い。DcR3ポリペプチドの生産方法もさらに提供され、宿主細胞を、DcR3
の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からDcR3を回収することを含んで
いる。
に、本発明は、一実施態様においては図1(配列番号:1)の残基1〜300又
は図1(配列番号:1)の残基1〜215又はxが図1(配列番号:1)の残基
215〜300のいずれかである場合の残基1〜xを含んでなるアミノ酸配列を
含む、単離された天然配列DcR3ポリペプチドを提供する。
cR3変異体は、図1(配列番号:1)の推定アミノ酸配列又はここで同定され
るドメイン配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは
天然又は天然発生DcR3の活性を有する。
したDcR3ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。このようなキメ
ラ分子の例には、エピトープタグ配列又は免疫グロブリン配列のFc領域と融合
したDcR3が含まれる。
体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。場合によっ
ては、抗体は、DcR3に結合してそのFasリガンド及び/又はDcR3によ
って認識される他のリガンドへの結合を阻止するモノクローナル抗体である。
アンタゴニストを提供する。また、治療及び診断方法も提供される。 他の実施態様において、本発明は図3(配列番号:3)の核酸配列を含む発現
された配列タグ(EST)を提供する。
には、天然配列DcR3及びDcR3変異体(ここでさらに定義される)が含まれ
る。DcR3は種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離された
もの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。
ポリペプチドを含んでいる。このような天然配列DcR3は、自然から単離する
こともできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列
DcR3」という用語には、特に、DcR3の自然に生じる切断又は分泌形態( 例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプラ
イシングされた型)及びDcR3の自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。 本発明の一実施態様において、天然配列DcR3は、図1(配列番号:1)のアミ
ノ酸1〜300を含有する成熟又は全長天然配列DcR3である。あるいは、D
cR3は図1(配列番号:1)のアミノ酸1〜215を含む。
):1)に示されている推定アミノ酸配列又はここで同定されるドメイン配列と
少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する以下に定義するDcR3を意
味する。このようなDcR3変異体には、例えば、図1の配列(配列番号:1)あ
るいはここで同定されるドメイン配列のN又はC末端において一又は複数のアミ
ノ酸残基が付加され、もしくは欠失されたDcR3ポリペプチドが含まれる。通
常、DcR3変異体は、図1のアミノ酸配列(配列番号:1)と、少なくとも約8
0%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸配列
同一性、さらにより好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有し
ている。
」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間
隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、DcR
3配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとし
て定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライン
メントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、ALIGN
又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュ ータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較
される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意の
アルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定
することができる。
、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を
導入し、DcR3配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドの
パーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のため
のアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、
ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能 なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であ
れば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必
要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメ
ータを決定することができる。
ド」に融合したDcR3、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペ
プチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供
するに十分な数の残基を有しているが、その長さはDcR3の活性を阻害しない
よう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトー
プと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチ
ドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残
基(好ましくは約10〜約20の残基)を有する。
使用するときは、その自然環境の成分から同定され及び単離され及び/又は回収
されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの
診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び
他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様におい
て、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することに
より、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分
なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非
還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性が得られるように充 分なほど精製される。DcR3の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しない
ため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインシトゥーのポリペプチ
ドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1
つの精製工程により調製される。
付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単
離されたDcR3核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のもので
ある。ゆえに、単離されたDcR3核酸分子は、天然の細胞中に存在するDcR
3核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたDcR3核酸分子は、例えば、
核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるDcR3を通常発現す
る細胞に含まれるDcR3核酸分子を含む。
たコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適
な対照配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム
結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及
びエンハンサーを利用することが知られている。
」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの
分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドの
DNAに作用可能に関連付けられている;プロモーター又はエンハンサーは、配
列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に関連付けられている;
又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら
、コード配列と作用可能に関連付けられている。一般的に、「作用可能に関連付
けられる」とは、関連付けられたDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場
合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサー
は必ずしも近接しているわけではない。関連づけは簡便な制限部位でのライゲー
ションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従
って、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される
。
ローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体または阻止抗体を含 む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗DcR3抗体組成物を包含している。こ こで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集
団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然
変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
の生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するDcR3の形態を意味する。 「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典
型的には、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNA
の分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴
う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この
活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、FACS分析又はDNA電気泳動法等、
全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。
する、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに
限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含
まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小
細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子
宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌
、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲
状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれ る。
予防的療法及び予防的療法を称する。 ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネ
コを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施
態様においては、哺乳動物はヒトである。
規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で
更に詳細に開示するような、DcR3ポリペプチドをコードするcDNAを同定
し、分離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用い
て、本出願人は、全長天然配列DcR3(図1及び配列番号:1に示す)が、ヒ
トTNFR2と約28%のアミノ酸同一性を有することを見いだした。従って、
現在では、本出願で開示されたDcR3がTNFRファミリーの新たなメンバー
であり、TNFRタンパク質ファミリーの典型的な活性又は特性を持つであろう
と考えられる。OPGのように、他のTNFRファミリーメンバー[Simonet等,
上掲]であるDcR3分子は、今では、膜貫通領域を欠き、分泌されたタンパク 質であることが分かっている。
発されるアポトーシスの阻害を含むFasリガンド活性の阻害ができる可溶性デ
コイレセプターであり得ると今日では考えられている。以下の実施例に示すよう
に、遺伝子増幅実験は、DcR3遺伝子がかなりの数の原発性の肺及び大腸癌に
おいて増幅されることを明らかにし、ある種の癌は、Fasリガンド誘発性アポ
トーシスを阻止するDcR3の様なデコイレセプターの発現により免疫細胞毒性
攻撃を回避できることを示唆している。また、実施例は、DcR3が免疫阻害活
性であり得ることを示し、例えばT細胞媒介疾患におけるその用途を示唆してい
る。DcR3に対する抗体は、DcR3生産性癌の免疫細胞毒性攻撃に対する感
受性化及び腫瘍反応性リンパ球の増殖の促進に用いることができる。
型は、DcR3の標的とするアミノ酸残基を、DcR3の選択された側鎖又はN
又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能
性試薬での誘導体化が、例えばDcR3を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗
DcR3抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用で
ある。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2- フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル 、例えば4-アジドサリチル酸、3,3’-ジチオビス(スクシンイミジル)等の
ジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレ
イミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジド フェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86
(1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミ ド化を含む。
、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化
パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列DcR3に見られる1
又は複数の炭水化物部分の欠失、及び/又は天然配列DcR3に存在しない1又
は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
伴う。この変更は、例えば、1又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列
DcR3(O-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされても よい。DcR3アミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に
、DcR3ポリペプチドをコードするDNAの予め選択された塩基において変異
させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを精製させることを通して変更されて
もよい。
シドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この
技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05
330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981
)に記載されている。
に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコ
ドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、こ
の分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259
:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載 されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Met
h. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソ
グリコシダーゼを用いることにより達成される。
ンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール
、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689
号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載さ
れた方法での結合を含む。
たDcR3を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では
、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供
するタグポリペプチドとDcR3との融合を含む。エピトープタグは、一般的に
はDcR3のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなDcR3のエ
ピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出するこ
とができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに
結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってDcR3
を容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はD
cR3の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。特に
、キメラ分子は、IgG分子に融合した図1(配列番号:1)のアミノ酸残基1
〜215を含むDcR3のECDを含んでもよい。キメラ分子の二価の形態には
、このような融合はIgG分子のFc領域であり得る。
る。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシ
ン(poly-his-gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[
Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];c-mycタグ及びそれに対す
る8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecula
r and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖
タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6
):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp
等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Marti
n等, Science, 255:192-194 (1992)];α-チューブリンエピトープペプチド[S
kinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及びT7遺伝子10タ
ンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:
6393-6397 (1990)]を含む。
スフェクトされた細胞を培養してDcR3を生産する方法に関する。もちろん、
当該分野においてよく知られている他の方法を用いてDcR3を調製することは
できると考えられる。例えば、DcR3配列、又はその一部は、固相技術を用い
た直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewart等, Solid-Phase
Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969);Merrifie
ld, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照]。手動技術又は自動による
インビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・
バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指 示により実施してもよい。DcR3の種々の部分は、別々に化学的に合成され、
化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長DcR3を生産してもよい。
なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得
ることができる。従って、ヒトDcR3DNAは、実施例に記載されるように、
ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。ま
たDcR3コード遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成
により得ることもできる。
パク質を同定するために設計された(DcR3に対する抗体又は少なくとも約2 0−80塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングでき る。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニング
は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているような標準的な手順を 使用して実施することができる。DcR3をコードする遺伝子を単離する他の方
法はPCR法を使用するものである[Sambrookら,上掲;Dieffenbachら,PCR Pri mer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性
が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、ス
クリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリッド化時に検出可能であ
るように標識されていることが好ましい。標識化の方法は、当該分野において良
く知られており、32P標識されたATPのような放射標識、ビオチン化あるい
は酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高厳密性を含むハイブリッド
化条件は、Sambrookら,上掲に提供されている。
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能 とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決
定された領域内又は全長にわたっての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの
)配列同一性は、同一性を測定するのに様々なアルゴリズムを用いるALIGN
、DNAstar、及びINHERIT等のコンピュータソフトウェアプログラ
ムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成
中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらにより記述されている従来のプ
ライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリー
ニングすることにより得られる。
望のDcR3ポリペプチドを合成することにより調製することができる。アミノ
酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性の変更のよう
に、DcR3の翻訳後過程を改変し得ることは当業者であれば理解されることで
ある。
おける変異は、例えば米国特許第5364934号に記載された保存的あるいは
非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して発生させ
ることができる。変異は、DcR3をコードしている一又は複数のコドンの置換
、欠失又は挿入であり、天然配列DcR3に対してDcR3のアミノ酸配列に変
化が生じている。場合によっては、変異は、DcR3分子の一又は複数のドメイ
ンにおいて、少なくとも1つのアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換することに
よりなされる。変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、ア
ラニンスキャニング、及びPCR突然変異誘発のような、当該分野において既知
の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発[Carterら, Nucl. Acids. Res. , 13:4331(1986);Zollerら, Nucl. Acids. Res., 10:6487(1987)
]、カセット突然変異[Wellsら, Gene, 34:315(1985)]、制限選択的突然変異
誘発[Wellら, Philos. Trans. R. Soc. London. SerA, 317:415(1986)]又は 他の既知の技術をクローンDNAに実施してDcR3変異体のDNAを生産する
ことができる。
った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使
用することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミ
ノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステ
インが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越
えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングア
ミノ酸である。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることも好ましい。さ
らに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される[Creighton, The Proteins , (W.H. Freeman & Co., N.Y.);Chothia, J. Mol. Biol., 105:1(1
976)]。アラニン置換により適切な量の変異体を生じない場合には、アイソテリ
ックアミノ酸を使用することができる。
リガンドと接触させることができ、相互作用があれば測定することができる。D
cR3変異体とFasとの相互作用は、例えば以下の実施例に記載したようなイ
ンビトロアッセイにより測定することができる。天然配列DcR3とDcR3変
異体の活性と性質を比較するため任意の数の分析的測定法を使用することができ
、結合性に対して簡便なものは、天然配列DcR3の解離定数Kdと比較したD
cR3変異体とFasとの間に形成された複合体の解離定数Kdである。
R3配列中の代表的な部位には、一又は複数のシステインリッチドメイン内の部
位が含まれる。このような変異は上述の方法を使用することにより達成される。
ターでトランスフェクト又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を
選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された
常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば媒質、温度、pH等々は、過度の
実験をすることなく当業者が選ぶことができる。 一般に、細胞培養の生産性を
最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biote chnology: a Practical Approach , M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook
等, 上掲に見出すことができる。
ンは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適
した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された
塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生
物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリ
ウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawほか, Gene, 23:315 (1983)及び 1989年6月29日公開の国際特許出願第WO89/05859号に記載され
たように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない
哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (19
78)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一 般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母中への形質転
換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, P roc. Natl. Acad. Sci. USA , 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しか しながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェク
ション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリ ブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることも
できる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, M ethods in Enzymology , 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-
352 (1988)を参照のこと。
宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は
、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体
、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能で
あり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(
ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635
)である。
ドするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセ
ス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9
等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は
、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL 1651);
ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞
、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細
胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216
(1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1
980))ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及び
マウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択 は、この分野の技術常識内にある。
ング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々
なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミ
ド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が
、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知
の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分
としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル
配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プ
ロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当な
ベクターの形成には、当業者に知られた標準的な連結技術を用いる。
列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有
する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産
される。 一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるDc
R3DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペ
ニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選
択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル
配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccha
romyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者 は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリー ダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の EP362179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許出願第 WO90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の
発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリ
ペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の
直接分泌に使用してもよい。
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来す
る複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は
酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイ ルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用 である。
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、 メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子
コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素 を供給するタンパク質をコードする。
キナーゼのように、DcR3核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定するこ
とのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urla
ub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されている ようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である
。酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtr
p1遺伝子である[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979);Kingmanら, Gene, 7 :141(1979);Tschemperら, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例え
ば、ATCC第44076号あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で 成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones,
Genetics, 85:12 (1977)]。
付けられ、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。多種の可能な宿主細胞
により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に
好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Cahng等,
Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリ ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acid s Res. , 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えば
tacプロモーター[deBoer ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1
983)]を含む。細菌系で使用するプロモータもまたDcR3をコードするDNA
と作用可能に関連付けられたシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
の糖分解酵素[Hess ほか, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Bio chemistry , 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リ ン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレ ートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチ
トクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネ
イン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガ
ラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母での発現に好
適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第73657号に更に記載され
ている。
ーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデ
ノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス
、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス
40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動
物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター
、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロ
モーターは宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハ
ンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写
を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハ
ンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェ
トプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス 由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のS
V40エンハンサー(100-270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモ ーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウ
ィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、DcR3コード配列の5'又 は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターか ら5'位に位置している。
A又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの
領域は、DcR3をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片
として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのDcR3の合成に適応化するのに適切な他の方法
、ベクター及び宿主細胞は、Gethingほか, Nature, 293:620-625 (1981); Mante
iほか, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第117060号; 及び欧州特許 第117058号に記載されている。
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写
を定量化するノーザンブロット法[Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:520
1-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインシトゥハイブリッ ド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。また、DNA二本
鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク 二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる
。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面
に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した
抗体の存在を検出することができる。
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列DcR3ポリ
ペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチ
ドに対して、又はDcR3DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外
因性配列に対して調製され得る。
cR3が膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素 的切断を用いて膜から引き離すことができる。DcR3の発現に用いられる細胞
は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の
化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
い。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交
換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹
脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SD
S-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲ
ル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びD cR3のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分
野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990);Scopes
, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New Yo
rk (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ば れる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるDcR3の性
質に依存する。
ーブとして、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及
びDNAの生成においての使用を含む、分子生物学における種々の用途を有して
いる。また、DcR3核酸は、ここに記載される組み換え技術によるDcR3ポ
リペプチドの調製にも有用であろう。
DcR3遺伝子の単離又は図2(配列番号:2)に開示されたDcR3配列に対
して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、DcR3の天然発生変異
体又は他の種からのDcR3をコードするもの)の単離のためのcDNAライブ
ラリのためのハイブリッド化プローブとして使用できる。場合によっては、プロ
ーブの長さは約20〜約50塩基である。ハイブリッド化プローブは、配列番号
2の核酸配列又は天然配列DcR3のプロモーター、エンハンサー成分及びイン
トロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、Dc
R3遺伝子のコード領域を周知のDNA配列を用いて単離して約40塩基の選択
されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド化プローブは、32P又は 35 S等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン/ビオチン結合系を介してプロ
ーブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識さ
れうる。本発明のDcR3遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは
、ヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし
、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを決定
するのに使用できる。ハイブリッド化技術は、以下の実施例において更に詳細に
記載する。
様にプローブとして用いることができる。 また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したDcR3配列の同定
のための配列のプールを生成することができる。
マッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッ
ド化プローブの形成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、イ
ンシトゥハイブリッド形成、既知の染色体標識に対する結合分析、及びライブラ
リーでのハイブリッド化スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染
色体の特定領域にマッピングすることができる。以下の実施例12は、選択され
た染色体マッピング技術を更に記載し、DcR3遺伝子がヒト染色体20にマッ
ピングされたことを決定する。
。例えば以下の実施例13は、DcR3遺伝子が異なる肺及び大腸癌中で増幅さ
れることが見いだされたことを記載している。従って、本発明の分子は、組織を
DcR3遺伝子の増幅について分析することにより、癌の存在又は癌に罹患する
危険性を検知する診断薬として使用することができる。患者組織におけるDcR
3遺伝子増幅の検出は、患者に対する抗DcR3抗体治療の様式を決定するとい
った、患者に望ましい治療様式を選択するに当たり熟練医師によっても用いられ
る。このような診断方法又はアッセイは、この分野で知られたPCR又はFIS
H技術を含む種々の技術を用いて実施できる。また、組織は、DcR3遺伝子増
幅の決定について実施例13で記載した技術を用いて分析してもよい。
合(例えば、DcR3がレセプターである場合)、DcR3は、結合性相互作用
に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。
このような方法によって、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定
することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチ
ド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いる
ことができる。また、レセプターDcR3は、関連するリガンドの単離に使用で
きる。スクリーニングアッセイは、天然DcR3又はDcR3のリガンド又はレ
セプターの生物学的活性ににたリード化合物の発見のために設計される。このよ
うなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリー
ニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮され
る小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知ら
れ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリー
ニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施さ
れる。
又は「ノックアウト」動物を産生するのに使用でき、これらは治療的に有用な試
薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウ ス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に 導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トラン
スジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実施
形態では、DcR3をコードするcDNA又は、確立された技術によりDcR3
をコードするゲノムDNAをクローン化するために使用することができ、ゲノム
配列を、DcR3をコードするDNAを発現する細胞を有するトランスジェニッ
ク動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトラ
ンスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例
えば米国特許第4736866号や第4870009号に記述されている。典型
的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのDcR3導入遺伝子の導入の
標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたDcR3をコードする導入遺
伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はDcR3をコードするDNAの増
大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えば過度の
アポトーシスを伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスタ
ー動物として使用できる。発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導
入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治
療的処置の可能性が示される。
をコードする変更ゲノムDNAと、DcR3をコードする内在性遺伝子との間の
相同的組換えによって、DcR3をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するDc
R3「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、DcR3をコ
ードするcDNAは、確立された技術に従い、DcR3をコードするゲノムDN
Aのクローニングに使用できる。DcR3をコードするゲノムDNAの一部を欠
失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする
遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化
のフランキングDNA(5'と3'末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同
的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照の
こと]。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入さ
れたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞を選択する[例えば、Li
ほか, Cell, 69:915(1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又 はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Te
ratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Rob
ertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照]。その後、キメラ性胚を
適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり
出す。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により
同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む
動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば腫瘍の発達を含む
、DcR3ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病
理的状態の発達に対する防御能力によって特徴付けられる。
cR3が結合する他のリガンドによるアポトーシスを調節し、並びにFasリガ
ンドの他の機能を変化させるために治療的に使用することができる。この治療は
、例えば、インビボ又はエキソビボ遺伝子治療技術を用いて行うことができる。
DcR3をコードする核酸を遺伝子治療に用いることもできる。遺伝子治療の応
用に置いて、遺伝子は細胞中に導入され、治療的に有効な遺伝子産物、例えば検
出可能な遺伝子置換体のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」とは、1回の
処理によって長期間の効果が達成される従来の遺伝子治療、及び治療的に有効な
DNA又はmDNAの1回又は繰り返しの投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方
を包含する。アンチセンスRNA及びDNAは、ある種の遺伝子のインビボ発現
を阻止するための治療薬として用いられる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドが細胞内に移入され、細胞膜による取り込みが制限されていることにより、低
い細胞内濃度にもかかわらず阻害剤として作用することが既に示されている[Za
mecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:4143-4146 (1986)]。オリゴヌクレオ チドは、修飾して、例えば元の荷電したリン酸ジエステル取基を非荷電基で置換
することにより、取り込み性を向上させることができる。
、核酸が対象とする宿主に、インビトロあるいはインビボのいずれで培養細胞中
に移入されるかに依る。哺乳動物にインビトロで核酸を移入するのに適した技術
は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融
合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。現在インビ ボ遺伝子移入技術に好ましいのは、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベク
ターでのトランスフェクション及びウイルスコートのタンパク質−リポソーム媒
介トランスフェクション[Dzau等, Trends in Biotechnology, 11:205-210 (199
3)]を含む。幾つかの状況では、核酸源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞
に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンド等の標的細胞を標的とする
試薬とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイ
トーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化及び/
又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型指向性のカプシド
タンパク質又はその断片、サイクルで内在化を受けるタンパク質に対する抗体、
細胞間局在化を標的とし、細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプ
ター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:44
29-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3410-3414 (1990)
に記載されている。遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については
、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。
抗体)は、アゴニスト又はアンタゴニスト分子として治療的に用いられる。例え
ば、アンタゴニストとして作用できるDcR3分子は、Fasリガンド又はFa
sリガンド誘発活性、あるいはDcR3が結合する他のリガンドの活性の阻害又
は阻止に用いられる。DcR3のこのような形態の例は、DcR3と免疫グロブ
リン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む上記のキメラ分子を含んで
いる。これは、DcR3と免疫グロブリンの細胞外ドメインを含むキメラ分子を
含んでいる。ここに記載したこれらのDcR3分子は、Fasリガンド誘発性ア
ポトーシス又はFasリガンド誘発性リンパ球活性などのFasリガンド活性を
阻害することができ、並びに抗原性刺激に対する反応におけるリンパ球の増殖を
抑制する。実施例に記載する混合されたリンパ球反応アッセイデータに基づいて
、油発された免疫反応は排他的にFasリガンドに媒介される必要はないと考え
られる。
もそれらの誘発及び機構の要素としてTリンパ球の活性化を含み、従って哺乳動
物に有害なこれらの疾患における細胞内及び細胞間事象と共同する疾患における
応用も有する。T細胞の活性化を含む又は依存すると考えられているこのような
免疫媒介された疾患は、それらに限られないが、喘息又は他のアレルギー疾患を
含み、それらは、例えばアレルギー性鼻炎及びアトピー性疾患、慢性関節リウマ
チ及び若年性慢性関節炎、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾
患、グルテン−感受性腸炎、ホウィップル病、多発性硬化症及び他の免疫媒介脱
髄CNS疾患、及び移植拒絶及び対宿主性移植片病を含む移植関連疾患を包含す
る。
って示されるように直接に、あるいは例えば疾患を持つ患者の患部におけるT又
はBリンパ球又は自己免疫あるいはヒト疾患の動物モデルの実験的使用を介して
得られたデータ通した推測によって示されるように間接的に免疫媒介されると考
えられている。[一般的に、Samter's Immunological Diseases, 5th Ed., Vols
. I及びII, Little Brown and Company (1995)参照]。
て使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液の
ようなバッファーが含まれる。溶液のpHは、好ましくは約5〜約8、さらに好
ましくは約7.4〜約7.8である。さらなる担体は、固体疎水性ポリマーの半
透性マトリクスなどの徐放製剤を含み、そのマトリクスは、成形物品、例えばフ
ィルム、リポソームまたはマイクロパーティクルの形状である。例えば投与経路
又は投与されるDcR3分子の濃度によっては、ある種の担体がより好ましくな
ることは、当業者には明らかである。
ように、有効な形態で血流への送達を確実にする他の方法によりなすことができ
る。 投与の有効な用量とスケジュールは経験的に決定することができ、このような
決定は当業者の技量の範囲に含まれる。
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が
含まれる。
当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化
剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生
させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮
下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、DcR3ポリペプ
チド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物にお
ける免疫原性が知られているタンパク質に包合させるのが有用である。このよう
な適切な免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンイ
ンヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全ア
ジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハ
ロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験な く当業者により選択されるであろう。
ル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているよう
なハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法
では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により
免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成
可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもで
きる。
。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用
され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節
細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて
リンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding
, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986)
pp. 59-103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に 齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット及びマウスの
骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化
細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養さ
れる。例えば、親の形質転換細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培 地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HA T培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性
である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォ
ルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニ ア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能
である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト 異種骨髄腫株化細胞も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)
、Brodeurほか, Monoclonal Antibody Production Techniques and Application
s, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。
ル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成
されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ( RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって 測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノ
クローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 1
07:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
RPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物 においてインビボで腹水として成長させることもできる。
セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動
法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精
製方法によって培地又は腹水液から単離又は精製される。
67号に記載された方法により作製することができる。本発明のモノクローナル
抗体をコードするDNAは、常套的な方法によって(例えば、マウス抗体の重鎖 及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブ
を使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドー マ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、D
NAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS
細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタン
パク質を生成等しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内
でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同
マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換すること
により[US. Patent No.4816567;Morrisonほか, 上掲]、又は免疫グロブリン コード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有
結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペ
プチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の
一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生
することができる。
た。これらの抗体のいくらかは、4C4.1.4;5C4.14.7;11C5 .2.8;8D3.1.5;及び4B7.1.1と命名され、ATCCに寄託さ
れ、寄託受入番号 、 、 、 、及び がそれぞれ付与された。一
実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、受入番号 、 、 、 、及び で寄託されたハイブリドーマ株化細胞により分泌される抗体の
一又は複数と同じ生物学的特徴を有する。「生物学的特徴」という用語は、モノ
クローナル抗体のインビトロ及び/又はインビボの活性又は性質、例えばDcR
3に結合する能力又はFasリガンド/DcR3結合を実質的に阻止する能力を
指すために使用される。場合によっては、モノクローナル抗体はここで特に言及
された抗体の少なくとも1つと同じエピトープに結合する。そのようなエピトー
プ結合は、例えばここや実施例において記載したように、種々のアッセイを行う
ことにより測定することができる。
いてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組
換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意
のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残
基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
断片、特にFab断片の調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒ
ト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシ ピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワー ク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、
レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出
されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとん
ど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほと
んど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少な
くとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体
は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリン
の定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522-525 (19
86); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struc
t. Biol., 2:593-596 (1992)]。
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト
抗体の該当する配列を置換することによりウィンター及び共同研究者[Jones等,
Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Ve
rhoeyenほか, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法を使用して行える。よっ
て、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない
分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(U.S. Patent No.4,81
6,567)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のCDR残基及び場
合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によっ
て置換されるヒト抗体である。
. Biol., 227:381 (1992);Marksほか, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含 むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生することもできる。また、Coleら
及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができ る[Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77
(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1):86-95(1991) ]。
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
において、結合特異性の一方はDcR3に対してであり、他方は任意の他の抗原
、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに
対してである。
は、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つ
の免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく[Milstein及びCuello, Natu
re, 305:537-539 (1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えた
ため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的
混合物を生成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分
子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。
同様の手順が1993年5月13日公開の国際特許出願第93/08829号、
及びTrauneckerほか, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
DNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための更な
る詳細については、例えばSureshほか,Methods in Enzymology, 121:210(1986) を参照されたい。
に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞
に対してターゲティングさせるため(米国特許第4676980号)及びHIV感
染の治療のために(WO91/00360、WO92/200373;EP03 089)提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学 における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられ
る。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成す
ることにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬
の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例
えば米国特許第4676980号に開示されているものが含まれる。
、DcR3の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、血清又は腫瘍での発現
の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセ
イ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antib
odies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]等の この分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用い
られる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接
に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は
、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合
物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウ ワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体を検出可能な部位に包合す
るためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、Hunter等 Nature, 144:945
(1962);David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974);Pain等, J. Immunol. Met
h., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982
)に記載された方法を含む。
ニティー精製にも有用である。この方法においては、DcR3に対する抗体を、
当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のよ
うな適当な支持体に固定する。次に、固定された抗体を、精製するDcR3を含
む試料と接触させた後、固定された抗体に結合したDcR3以外の試料中の物質
を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、DcR3を抗
体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
、Fasリガンド誘発性アポトーシスを阻止するか、潜在的な自己免疫/炎症効
果を阻止するDcR3の活性をアンタゴナイズするために使用することができる
。DcR3アンタゴニストは、癌治療において、例えばDcR3が癌細胞の免疫
細胞毒性殺傷を阻害するのを防止することにより作用することができる。それら
は、例えば、Fasリガンド−DcR3結合の阻止又はDcR3消滅又は除去の
増強又は促進によって達成される。当業者は、免疫反応の活性化又は刺激を抑制
でき、従ってあるレベルの免疫抑制が可能であり、それにより哺乳類の免疫サー
ベイランスシステム及び反応の回避において癌細胞を助ける能力を持つ分子が存
在することを知っている。免疫系の天然阻害剤の例は、Tリンパ球の同時刺激機
構の阻害によりTリンパ球活性化を阻害することのできるCTLA4である。こ
の阻害のインビボでのアンタゴナイズは、哺乳動物が免疫学的に癌を拒絶する能
力を向上させることが示された。インビボでの抗体によるCTLA4の阻止が、
確立された癌に対する免疫反応を向上させ、その後この癌を拒絶させることが報
告されている。[Kwon等, Proc. Nat. Acad. Sci., 94:8099-8103 (1997);Leac
h等, Science, 271:1734-1736 (1996)]。
る。アンタゴニストの投与のための有効投与量及びスケジュールは、経験的に決
定され、そのような決定をするのも技術常識の範囲内である。当業者は、投与さ
れるべきアンタゴニストの投与量が、例えば、アンタゴニストを受容する哺乳動
物、投与経路、特に用いられるアンタゴニストの型及び哺乳動物に投与される他
の薬剤によって変化することを理解するであろう。抗体アンタゴニストについて
の適当な投与量の選択の助言は抗体の治療的使用に関する文献、例えばHandbook
of Monoclonal Antibodies, Ferrone等, 編, Noges 発行, Park Ridge, N.J.,
(1985)ch. 22,及びpp.303-357;Smith等, Antibodies in Human Diagnosis and
Therapy, Haber等編, Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見いだされ
る。アンタゴニスト単独で用いられる典型的な日々の投与量は、1日当たり約1
μg/kgから100mg/kg又はそれ以上の範囲であり、上記の要因に応じ
て変化する。
付加的な治療法を哺乳動物に施すことが考えられ、そのようなものには、限定さ
れるものではないが、化学療法及び放射線療法、イムノアジュバント、サイトカ
イン、及び抗体ベース療法が含まれる。例としては、インターロイキン(例えば 、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6)、白血病阻害因子、インターフェロン 、TGF-β、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、HER-2抗体及び抗
CD20抗体が含まれる。哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発することが
知られている他の薬剤を用いてもよく、そのような薬剤にはTNF-α、TNF-
β(リンホトキシン-α)、CD30リガンド、及び4-1BBリガンドが含まれる
。
されている化学物質又は薬物、例えばドキソルビシン、5-フルオロウラシル、 シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブス ルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メル
ファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチンが含まれる。このような化学療法
に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、
熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法
及び用量スケジュールはまた化学療法サービス,M.C.Perry編, Williams & Wilki
ns, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、上述されたもの
のような、製薬的に許容可能な担体で好ましく投与される。アンタゴニストは、
一又はそれ以上の他の治療薬に続いて又は同時に投与してもよい。アンタゴニス
ト及び治療薬の量は、例えば、用いられる薬剤の型、治療される癌、及び投与の
スケジュール及び経路に依存するが、一般的には各々が個々に用いられる場合よ
り少ない。
は、熟練した実務者に良く知られた種々の方法で監視できる。例えば、腫瘍の大
きさは、物理的又は標準的なX線画像化技術によって観察できる。
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。
造者の使用説明に従い使用した。ATCC受入番号により次の実施例及び明細書
全体を通して特定している細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(Mannasas,Virginia)である。
ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータデー素は、公的なESTデ
ータベース(例えば、GenBank)、個人的ESTデータベース(LIFESEQTM、In
cyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)、及びジェネンテクからのEST商品 を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altschul等, Metho
ds in Enzymology, 266:460-480 (1996)]を用いて、EST配列の6フレーム翻
訳物に対するECDタンパク質配列の比較として行なった。BLASTスコアが70 (90の場合もある)又はそれ以上となり、周知のタンパク質をコードしない比
較物をクラスター分析し、プログラム「phrap」(Phil Green, University of W
ashington, Seattle, Washington)で共通DNA配列に組み立てた。
のEST商品(配列番号:3、図3及び4参照)、個人データベースからの6つ
のEST(配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番
号:8及び配列番号:9、図4参照)及び公的データベースからのEST(配列
番号:10)を含む。
配列を含むcDNAライブラリーを同定して、DcR3の全長コード配列のクロ
ーンを単離するためのプローブとして用いた。
に、ライブラリーからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅
した。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びP
CRプライマーの一つを用いてDcR3遺伝子をコードするクローンを単離した
。
DNAクローンを単離するために用いるcDNAライブラリーは、Invitrogen,
San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。
cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミキナー
ゼアダプターの平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそ
のサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター(pRKBな
ど;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes
等, Science, 253:1278-1280 (1991))に独特のXhol及びNotI部位にお いてクローン化した。
;配列番号:2)及びDcR3の誘導されたタンパク質配列(図1;配列番号:
1)を与えた。
42は、単一の読み取り枠を含み、ヌクレオチド位置101−103に見かけの
翻訳開始部位を有する[Kozak等, 上掲](図2;配列番号:2)。予測された ポリペプチド前駆体は300アミノ酸長である。配列のN末端は典型的な分泌シ
グナル(図1;配列番号:1のアミノ酸1−23)を含む。DcR3アミノ酸配
列の分析により、図5及び6に示すように4つのCRDの存在が明らかとなった
。DcR3は膜貫通領域を含まない。また、図1(配列番号:1)のアミノ酸1
〜215は、4つのCRDを含むECDを表すと考えられる(図5)。DcR3
は、図1の残基173に1つの潜在的N結合グリコシル化部位を有する。クロー
ンDNA30942は、ATCCに寄託され(DNA30942−1134と特
定されている)、ATCC寄託番号209254が付与された。
cR3は、TNFR2(28.7%)及びOPG(31%)に対して幾分のアミ
ノ酸配列同一性を示した。図5及び6参照。DcR3及びOPGの4つのCRD
における全てのシステインは保持されたが;DcR3のC末端部分は、約100
残基分短かった。
ロット分析によって検査した。ヒトRNAブロットを、全長DcR3cDNAを
ベースにした32P標識DNAプローブにハイブリダイズした。ヒト胎児RNA
ブロットMTN(クローンテック)、ヒト成人RNAブロットMTN-II(クローン
テック)及びヒト癌株化細胞RNAブロット(クローンテック)をDNAプローブ と共にインキュベートした。次いでブロットをハイブリダイゼーション用バッフ
ァー(5X SSPE;2X デンハード溶液;100mg/mLの変性剪断され たサケ精子DNA;50%のホルムアミド;2%のSDS)に入ったプローブと 共に、42℃で60時間インキュベートした。ブロットを2X SSC;0.0 5%のSDSを用い、室温で1時間、数回洗浄し、ついで0.1X SSC;0 .1%のSDSを用い、50℃で30分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後
、リン光体イメージャー分析(Fuji)により展開させた。
臓、大腸、及び肺に検出した(図7)。さらに、比較的高いDcR3mRNAレ
ベルがヒト大腸癌株化細胞、SW480で検出された(図7参照)。
ーブとしての使用を記載する。 DcR3のコード配列(図2、配列番号:2に示す)を含むDNAは、ヒト組
織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける同種DNA(
DcR3の天然発生変異体など)のスクリーニングのためのプローブとして用い
られる。
び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射標識DcR3誘導プローブのフ
ィルターへのハイブリダイゼーションは、50%ホルムアルデヒド、5xSSC
、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム
、pH6.8、2xデンハード溶液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、
42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.
1%SDSの水溶液中、42℃で行った。 次いで、全長天然配列DcR3をコードするDNAと所望の配列同一性を有す
るDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
る。 DcR3をコードするDNA配列(配列番号:2)は、最初に選択されたPC
Rプライマーを用いて増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限
酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクター
が用いられる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたも
の;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977))であり、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で設計され、脱リン酸さ
れる。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好
ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、polyhisリーダー(最初の 6つのSTIIコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む) 、DcR3コード領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
された方法を用いた形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレー
トで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列分析で確認される。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜
成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。
次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。 更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離した。遠心分離で得られた細
胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化Dc
R3タンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる
条件下で精製した。
例示する。 A.発現ベクターとしてpRK5(1989年3月15日発行のEP3072
47参照)を用いた。場合によっては、DcR3DNAを選択した制限酵素でp
RK5に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いてDc R3DNAの挿入を行う。得られたベクターは、pRK5−DcR3と呼ばれる
。
293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては
滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの媒質中で組織培養プレー
トにおいて成長させて集密化し、約10μgのpRK5−DcR3DNAを約1
μgのVA RNA遺伝子をコードするDNA[Thimmappaya等, Cell, 31:543
(1982))]と混合し、500μlの1mMトリス-HCl、0.1mMEDTA、
0.227MCaCl2に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの5
0mMHEPES(pH7.35)、280mMのNaCl、1.5mMのNa
PO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、29
3細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養媒質を吸引し、2mlのPB
S中20%グリセロールを30分間添加した。293細胞は、次いで血清無し媒
質で洗浄し、新鮮な媒質を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
又は200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メ
チオニンを含む培養媒質で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件
媒質を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理
したゲルを乾燥させ、DcR3ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわた
ってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベー
ションを施し(血清無し媒質)、媒質を選択されたバイオアッセイで試験した。
ci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に過 渡的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ
、700μgのpRK5−DcR3DNAを添加する。細胞は、まずスピナーフ
ラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。DNA−デキストラン
沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロー
ルで90分間処理し、組織培養媒質で洗浄し、組織培養媒質、5μg/mlウシ
インシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラス
コに再度導入した。約4日後に、条件媒質を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞
片を除去した。発現されたDcR3を含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラム
クロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
DcR3はpRK5ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は
、次いで、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のpoly-hisタグを持
つ枠に融合させた。poly-hisタグDcR3挿入物は、次いで、安定なクローンの
選択のための選択マーカーDHFRを含むSV40誘導ベクターにサブクローニ
ングした。最後に、CHO細胞をSV40誘導細胞で(上記のように)トランス
フェクトした。発現されたpoly-hisタグDcR3を含む培養媒質は、濃縮して、
Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製した
タンパク質のSDS−PAGEによる分析により、分泌されたタンパク質が約3
5kDaの分子量を有していることが明らかとなった。
分泌のための酵母菌発現ベクターを形成する。DcR3をコードするDNA、選
択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限
酵素部位に挿入してR3の細胞内発現を指示する。分泌のために、DcR3をコ
ードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーター、
酵母菌アルファ因子分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)DcR3
の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
し、選択された発酵媒質中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%ト
リクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析でき、次いでクマ
シーブルー染色で染色することができる。 続いて組み換えDcR3は、発酵媒質から遠心分離により酵母菌細胞を除去し
、選択されたカートリッジフィルターを用いて媒質を濃縮することによって単離
及び精製される。DcR3を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィ
ー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
に融合させた。このようなエピトープタグは、poly-hisタグ及び免疫グロブリン
タグ(IgGのFc領域)を含む。pVL1393(Navogen)などの市販され ているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いるこ
とができる。簡単には、DcR3又はDcR3の所定部位(細胞外ドメインをコ
ードする配列、例えば図1(配列番号:1)のアミノ酸1〜215等)が、5’
及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマ
ーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、
次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされ
る。
DNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CR
L 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて共トランスフェク トすることにより生成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出さ
れたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現
は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Ox
ford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
ニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Na
ture, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換え
Sf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞は、洗浄し、超音波処理用バッ
ファー(25mLHepes、pH7.9;12.5mM MgCl2;0.1
mM EDTA;10%グリセロール;0.1% NP−40;0.4M KC
l)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分
離で透明化し、上清を添加バッファー(50mMリン酸塩、300mM NaC
l、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルタ
ーで濾過した。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mL
の総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの添加バッファーで平衡さ
せた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに添加した。カラムを、
分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで添加バッファーで洗浄し
た。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄場ファー(
50mMリン酸塩;300mM NaCl、10%グリセロール、pH6.0)
で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッ
ファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収
し、SDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)へのN
i2+−NTA−複合体でのウェスタンブロットで分析した。溶離したHis1 0 −タグDcR3を含む分画をプールし、添加バッファーで透析した。
ンA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む周知のクロマトグラフィ
ー技術を用いて実施できる。
示する。 モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば
、Goding,上掲に記載されている。用いられる免疫原は、精製DcR3、DcR 3を含む融合タンパク質、細胞表面に組み換えDcR3を発現する細胞を含む。
免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
は腹膜内に1−100マイクログラムで注入したDcR3免疫原で免疫化する。
あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Resear
h, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウ スは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免
疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫
する。DcR3抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レト
ロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓を取
り出した。脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ACTTか
ら番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等のマウス骨髄腫株化
細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT
(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)媒質を含む96ウェル組織
培養プレートに蒔き、皮融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリ
ッドの増殖を阻害した。
リーニングされる。所望のDcR3に対するモノクローナル抗体を分泌する「陽
性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。 陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹膜内注入し、抗Dc
R3モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細
胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中
に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続く
ゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロ
テインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィー
を用いることもできる。
トされた293細胞に結合するか否かを測定するために行った。ヒト293細胞
(ATCC CRL 1573)は、空のpRK5ベクター(実施例5参照)又は
全長TNF−アルファをコードするpRK5[Pennica等, Nature, 312:724-729
(1984)]、Fasリガンド[Suda等, Cell, 75:1169-1178 (1993)]、LIGH
T[Mauri等, Immunity, 8:21 (1998),Apo−2リガンド[1997年7月1
7日発行のWO97/25428]、Apo−3(TWEAKとも呼ばれる)[
Marsters等, Current Biology, 8:525 (1998); Chicheportiche等, J. biol. Ch
em., 272:32401 (1997)]、又はOPG(TRANCE、RANKLとも呼ばれ る)[Wong等, J. Biol. Chem., 272:25190 (1997); Anderson等, Nature, 390:
175 (1997); Lacey等, Cell, 93:165 (1998)]で一過性トランスフェクトされた
。次いで、細胞を、組み換えビオチン化FcタグDcR3(上記実施例7に記載
したように発現され、プロテインAクロマトグラフィーで精製されたもの[Ashk
enazi等, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 8:104 (1995)])
、TNFR1のFcタグ外部ドメイン(対照)、又はPBSバッファー(対照)
とともに37℃で1時間インキュベートした。さらに、細胞をフィコエリトリン
複合ストレプトアビディン(Gibco BRl)とともに37℃で30分間インキュベ ートし、次いで蛍光標示式細胞分取器で分析した。
合するが、TNF−アルファでトランスフェクトされた細胞には結合しないこと
を示した(図8A参照)。また、DcR3はLIGHTに有意な結合性を示すが
、Apo−2リガンド、Apo−3リガンド、又はOPGには結合しない(デー
タは示さず)。
共免疫沈降アッセイも行った。 精製した、可溶性Fasリガンド(Alexis Biochemicals)(1マイクログラ ム)を、FcタグDcR3(上記)、TNFR1、又はFas外部ドメイン(5
マイクログラム)とともに室温で1時間インキュベートし、プロテインA−セフ
ァロース(Repligen)で免疫沈降させた。沈殿物をSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(4−20%勾配)により、還元条件(25mMジチオトレイトール
)で溶解させ、免疫ブロットで可視化し、次いで2マイクログラム/mlのウサ
ギポリクローナル抗Fasリガンド抗体(Oncogene Research Products)での強
化化学発光検出(Amersham)を行った。また、可溶性Fasリガンド自体も、比
較のために直接添加した。
れた可溶性Fasリガンドに結合したが、TNFR1にはしなかった。この結果
は、DcR3がFasリガンドに結合できる他のTNFRファミリーのメンバー
(Fas以外)であることを示唆している。
フェクションによるアポトーシス誘発に対するDcR3の影響を試験した。 ヒトHelaS3細胞(ATCC CCL 22)に、pRK5(実施例5参
照)、又はpRK5コード全長Fasリガンド[Suda等, 上掲](1マイクログ
ラム/106細胞)で一過性トランスフェクトをした。トランスフェクトした細
胞を、PBSバッファー、FcタグTNFR1、FcタグFas、又はFcタグ
DcR3(実施例9参照)(50マイクログラム/ml)の存在下で、37℃/5%
CO2において18時間インキュベートした。次いで、Marsters等, Curr. Biol
., 6:1669-1676 (1996)に既に記載されているように、アネキシン結合について のFACSによりアポトーシスを分析した。
ドは、約25%のHela細胞においてアポトーシスを誘発した。FcタグFa
s又はFcタグDcR3は、この効果を有意に阻害したが、FcタグTNFR1
はしなかった。
DcR3の影響を測定するためにアッセイを行った。 CD3+リンパ球を各ヒトドナーの末梢血から単離し、植物性凝集素(2マイ
クログラム/ml)で24時間刺激し、そして(Marsters等, Curr. Biol., 上 掲 (1996)に既に記載されているように)IL−2(100U/ml)の存在下 で5日間培養した。次いで、細胞をPBSバッファー又は抗CD3抗体(Ortho
Pharmaceuticals)で被覆したウェルに蒔き、PBSバッファー、対照用IgG 、FcタグFas又はFcタグDcR3(10マイクログラム/ml)の存在下
、37℃/5%CO2でインキュベートした。18時間後、CD4+細胞のアポ
トーシスを、上記A欄に記載したようにFACSで測定した。
である。抗CD3抗体でのTCR結合は、IL−2刺激したCD4+T細胞にお
けるアポトーシスレベルの約2倍増加させた。図9B参照。以前の報告[Dhein 等, Nature, 373:438 (1995)]に一致して、FcタグFasは実質的に効果を阻
止し、FcタグDcR3はアポトーシスの誘発を同程度に阻止した。
プロセスに対するDcR3の影響を測定するためにアッセイを行った[Arase等,
J. Exp. Med., 181:1235 (1995); Medvedev等, Cytokine, 9:394 (1997)]。 NK細胞は、各ドナーの末梢血から、抗CD56磁気マイクロビーズ(Mylten
yi Biotech)を豊富化することにより調製し、PRMI1640/10%FBS
媒質中で、37℃/5%CO2において24時間、51Cr添加ジャーカットT
白血病細胞とともに、エフェクター対標的比率1:1から1:5で、PBSバッ
ファー、対照用IgG、又はFcタグFas又はFcタグDcR3(10マイク
ログラム/ml)の存在下でインキュベートした。次いで、標的細胞死滅のレベ
ルを、エフェクターー標的共培養における51Crの放出量を、同数のジャーカ
ット細胞の洗浄剤溶解による51Cr放出量と比較して測定した。
均+−SEMである。NK細胞は、ジャーカットT細胞においてかなりの細胞死
滅をトリガーする。FcタグFas及びDcR3は、標的細胞死滅を実質的に阻
害するが、対照用IgGはしなかった。結果は、DcR3の結合がFasリガン
ド活性を阻害することを示した。
析によって試験した。RHマッピングを、ヒト-マウス細胞の放射線ハイブリッ ドパネル(Research Genetics)とDcR3 cDNAのコード領域に基づくプライ
マーを使用するPCRにより実施した[Gelbら,Hum. Genet., 98:141(1996)] 。スタンフォードヒトゲノムセンターデータベースを使用したPCRデータの解
析では、DcR3はマーカーAFM218xe7に結合し、5.4のLODを持
ち、ヒト染色体20(20q13)の長手の離間帯にマッピングされることを示
した。
されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、DcR3ポリペプチド
がある種の癌における治療的処置のための有用な標的であることを示している。
このような治療薬は、DcR3コード遺伝子のアンタゴニスト、例えば、DcR
3に対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
ら(Qiagen試薬を用いて)単離したゲノムDNAであった。DNAはヘキスト線
量3258挿入蛍光測定を用いた蛍光測定法で定量した。規格化対照として、1
0人の正常で健康な個体からの末梢血からDNAを単離し、それをプールして健
常個体における遺伝子コピーのアッセイ用対照として用いた(「NorHu」)
。
Aがスクリーニングされる肺及び大腸癌において過剰発現されるか否かの測定に
、5’ヌクレアーゼアッセイ(TaqManTM)及び現実時間定量的PCR(Gelmin
i等, Clin. Chem., 43:752-758 (1997); ABI Prizm 7700 Sequence Detection
SystemTM, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, Ca)を
用いた。一次肺腫瘍外科試料は、アイオワ大学から提供され、一次大腸腫瘍試料
はリーズ大学から提供された。肺腫瘍組織のパネルは、8つの腺癌、7つの扁平
上皮細胞癌、、1つの非小細胞癌、1つの小細胞癌、及び1つの気管支腺癌を含
んでいた。大腸腫瘍組織のパネルは、17の腺癌を含んでいた。癌株化細胞は、
ATCC:SW480大腸腺癌(ATCC CCL 228);COLO320
DM腺癌(ATCC CCL 220);SK−CO−1腺癌(ATCC HT
B 39);SW403腺癌(ATCC CCL 230);及びHT29大腸
腺癌から得た。
1デルタCt単位は、1PCRサイクル又は平常に対して約2倍増幅に相当し、
2単位は4倍に相当し、3単位は6倍に相当する。定量化は、DcR3コード遺
伝子から誘導したプライマー及びTaqManTM蛍光プローブを用いて得た。
独特な核酸配列を含む可能性が最も高く、イントロンのスプライスアウトを持つ
可能性が最も低いDcR3の領域、例えば、3’−非翻訳領域がプライマー誘導
に好ましい。DcR3遺伝子増幅に用いたプライマー及びプローブの配列は次の
通りである: hu.DcR3.TMP (プローブ) ACACGATGCGTGCTCCAAGCAGAA(配列番号:14) hu.DcR3.TMP (前方プライマー) CTTCTTCGCGCACGCTG(配列番号:15) a.DcR3.TMP (後方プライマー) ATCACGCCGGCACCAG(配列番号:16)
間における増幅の監視にTaqDNAポリメラーゼ酵素の5’エキソヌクレアー
ゼ活性を使用する。PCR反応の単位複製配列典型を精製するために2つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いた。第3のオリゴヌクレオチド、又はプローブ
は、2つのプライマー間に局在化したヌクレオチド配列の検出に用いた。プロー
ブは、TaqDNAポリメラーゼ酵素で延長不可能であり、リポーター蛍光染料
及び消光剤蛍光染料で標識される。リポーター染料からの任意のレーザー励起放
出は、それらがプローブ上にあるように2つの染料が接近している場合には消光
染料で消光される。増幅反応の間、プローブはTaqDNAポリメラーゼ酵素で
テンプレート依存的に切断される。得られたプローブ断片は、溶液中で分解し、
リポーター染料放出からのシグナルは第2のフルオロフォアの消光効果を受けな
い。リポーター染料の1分子が、合成された新たな分子のために遊離され、消光
されないリポーター染料がデータの定量的解釈の基礎とされる。
な現実時間定量的PCR装置で行われる。系は、温度サイクル器、レーザー、電
荷結合素子(CCD)カメラ、及びコンピュータからなる。系は、温度サイクル
器において96ウェル形式で試料を増幅する。増幅の間、レーザー励起された蛍
光シグナルが、96ウェル全てについての光ファイバーケーブルを通して実時間
で回収され、CCDカメラで検出される。系は、器具を作動させデータを分析す
るソフトウェアを備えている。
される。これは、リポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルより上ま
で蓄積されるサイクルとして定義される。Ct値は、核酸試料における特定標的
配列の出発コピー相対数の定量的尺度として用いられる。
の9つが、2から18倍のDcR3の遺伝子増幅を示した(図10参照)。結果
を確認するために、DcR3ベースのプライマー及びプローブのさらに3つの独
立した組での大腸腫瘍DNAを定量的PCRで分析した。本質的に同様の増幅が
観察された(データは示さず)。 ヒト大腸腫瘍株化細胞の遺伝子増幅分析は、5細胞のうち3つがDcR3の有
意な遺伝子増幅を示し(図10)、一次腫瘍組織におけるDcR3の増幅に一致
することを明らかにした。
ンは、細菌性人工染色体(BAC)ライブラリー(Genome Systems)から単離し
た。BAC(68374rev及び68374fwd)からの隣接領域の増幅は、大腸腫瘍パネル
における2つの最も近い利用可能な遺伝子マーカー、AFM218xe7(T1
60)及びSHGC−36268(T159)(AFM218xe7から約50
0kbにマッピングされる)に沿って測定した。 DcR3は、最も高い増幅を示し、次いで68374rev、さらに68374fwd及びT1
60が続き、これらはほぼ同じ増幅程度を示したが、T159は増幅を示さなか
った(図10)。結果は、DcR3が、癌において増幅された染色体20領域の
エピセンターにあり、DcR3が腫瘍生存を促進する可能性と一致する。
D4+Tリンパ球機能を評価するためにMLRアッセイを実施した。「一方向」
MLRアッセイにおいて、末梢血単核細胞(PBMC)のドナー集団が、PBM
Cの放射線刺激集団に暴露される。MLRプロトコールは、Coligan等, Current
Protocols in Immunology, publ. John Wiley & Sons, Inc. (1994)に記載され
ている。次いで、アッセイ結果により、提示されたアロ抗原での刺激に対するレ
スポンダーTリンパ球の増殖を促進又は阻害できる分子が同定される。
のドナー細胞はレスポンダーPBMCの提供に用いた。次いで、各細胞調製物を
、アッセイを行うまで50%ウシ胎児血清及び50%DMSO中で凍結した。 次に、細胞を、アッセイ媒質中において37℃/5%CO2で終夜解凍した。
アッセイ媒質は、RPMI媒質;10%ウシ胎児血清;1%ペニシリン/ストレ
プトマイシン;1%グルタミン;1%HEPES;1%非必須アミノ酸及び1%
ピルビン酸塩を含む。洗浄の後、細胞をアッセイ媒質中に、3x106細胞/m
lの濃度で再懸濁させた。刺激剤細胞として用いたドナー細胞は、約3000R
adsを用いて放射した。
クロリットルの1%又は0.1%に希釈した試験試料(FcタグDcR3、上記
実施例9に記載、O.D.で測定して2、40、1000及び25,000ng
/mlの濃度);50マイクロリットルの放射刺激剤細胞;50マイクロリット
ルのレスポンダーPBMC細胞。100マイクロリットルの細胞培養媒質又は1
00マイクロリットルのCD4−IgGを対照として用いた。次いで、培養プレ
ートを37℃/5%CO2で4日間インキュベートした。5日目に、各ウェルを
トリチウム化チミジン(1マイクロキュリー/ウェル;Amersham)でパルスした
。6時間後、細胞を3回洗浄し、標識の取り込みについてのシンチレーションカ
ウントにより評価した。
LRにおけるTリンパ球の応答に対する用量依存的な阻害活性があることを示し
ている。反応媒質中でDcR3−IgGのレベルが2ng/mlから25,00
0ng/mlに増加すると、Tリンパ球増殖の有意な減少があり、DcR3−I
gGが40、1000又は25,000ng/mlのいずれかで添加された場合
にトリチル化チミジン標識の取り込みの減少によって示された。このMLRの阻
害は用量依存的であり、陽性対照及びMLRに影響を持たない対照IgG融合タ
ンパク質(CD4−IgG)の効果に比較して有意であった。
から単離した。細胞は、新たに取り出した脾臓から回収し、(上記A欄に記載さ
れたように)アッセイ媒質中に配置した。次いで、PBMCを、細胞をLympholy
teTM(Organon Teknika)上にかぶせることにより単離し、2000rpmで 20分間遠心分離した。一分子細胞層を回収し、アッセイ媒質で洗浄し、アッセ
イ媒質中に1x107細胞/mlの濃度で再懸濁した。一方のドナーは、刺激剤
PBMCを提供するのに用い、他方のドナー細胞はレスポンダーPBMCを提供
するのに用いた。
。PBMC細胞を次のように培養プレートウェルに蒔いた(3回):100マイ
クロリットルの1%又は0.1%に希釈した試験試料(FcタグDcR3、O.
D.で測定して25、250、2500及び25,000ng/mlの濃度で用
いた);50マイクロリットルの放射刺激剤細胞;50マイクロリットルのレス
ポンダーPBMC細胞。100マイクロリットルの細胞培養媒質又は100マイ
クロリットルのCD4−IgGを対照として用いた。次いで、培養プレートを3
7℃/5%CO2で4日間インキュベートした。5日目に、各ウェルをトリチウ
ム化チミジン(1マイクロキュリー/ウェル;Amersham)でパルスした。6時間
後、細胞を3回洗浄し、標識の取り込みについてのシンチレーションカウントに
より評価した。
MLRにおけるTリンパ球の応答に対する用量依存的な阻害活性があることを示
している。反応媒質中でDcR3−IgGのレベルが25ng/mlから25,
000ng/mlに増加すると、Tリンパ球増殖の有意な減少があり、トリチル
化チミジン標識の取り込みの減少によって示された。このMLRの阻害は用量依
存的であり、陽性対照及びMLRに影響を持たない対照IgG融合タンパク質(
CD4−IgG)の効果に比較して有意であった。
及び50%DMSO中で凍結した。 次に、細胞を、アッセイ媒質中において37℃/5%CO2で終夜解凍した。
アッセイ媒質は、RPMI媒質;10%ウシ胎児血清;1%ペニシリン/ストレ
プトマイシン;1%グルタミン;10mM HEPES;及び50マイクログラ
ム/mlゲンタマイシンを含む。洗浄の後、細胞をアッセイ媒質中に再懸濁させ
、37℃/5%CO2で終夜インキュベートした。
ヒトCD3(Amacから購入)又はマウス抗ヒトCD28(Biodesignから購入) 又は抗CD3及び抗CD28抗体の両方で被覆した。両方の抗体は、カルシウム
及びマグネシウム無しのハイクローンD(Hyclone D)-PBSで希釈した。抗CD
3抗体を10ng/ウェルの濃度で添加し、抗CD28抗体を25ng/ウェル
で添加し、全容量を100マイクロリットル/ウェルとした。プレートを、PB
S中4℃で終夜インキュベートした。
/mlの濃度で媒質中に再懸濁し、プレートに100マイクロリットル/ウェル
で添加した。次いで、100マイクロリットルの試験試料(FcタグDcR3、
O.D.で測定して25、250、2500及び25,000ng/mlの濃度
で用いた)又は対照物を各ウェルに添加し、各ウェルの全容量を200マイクロ
リットルとした。100マイクロリットルの細胞培養媒質又は100マイクロリ
ットルのCD4−IgGを対照として用いた。次いで、培養プレートを37℃/
5%CO2で72時間インキュベートした。続いて、各ウェルをトリチウム化チ
ミジン(1マイクロキュリー/ウェル;Amersham)でパルスした。6時間後、細
胞を3回洗浄し、標識の取り込みについてのシンチレーションカウントにより評
価した。
時刺激アッセイにおけるTリンパ球の応答に対する用量依存的な阻害効果がある
ことを示している。反応媒質中でDcR3−IgGのレベルが25ng/mlか
ら25,000ng/mlに増加すると、Tリンパ球増殖の有意な減少があり、
トリチル化チミジン標識の取り込みの減少によって示されている。このヒト同時
刺激アッセイの阻害は用量依存的であり、陽性対照及びヒト同時刺激アッセイに
影響を持たない対照IgG融合タンパク質(CD4−IgG)の効果に比較して
有意であった。
emical Research Inc., Hamilton, MTから購入したMPL-TDMアジュバント で希釈)を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、1週間の日間隔で11回注射す ることで、Balb/cマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫
化した。既に開示されたように[Ashkenaziら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88:1
0535-10539(1991)]、pRK5においてヒト免疫グロブリンG1重鎖のヒンジ及
びFc領域に、DcR3(図1)のアミノ酸残基1−300を融合させることに
よりDcR3イムノアドヘシンタンパク質を産生した。イムノアドヘシンタンパ
ク質を、昆虫細胞で発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたようにして 、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
懸濁液を、1%のペニシリン-ストレプトマイシンが補填されたDMEM培地(Bi
owhitakker Corp.から得たもの)中で調製した。ついで、リンパ節細胞を35% のポリエチレングリコールを使用し、マウス骨髄腫細胞P3X63AgU.1(AT
CC CRL 1597)と融合させ、96ウェル培養プレートで培養した。融合の結果得ら
れたハイブリドーマをHAT培地において選択した。融合から10日後に、ハイ
ブリドーマ培地の上清をELISAでスクリーニングし、DcR3イムノアドヘ
シンタンパク質又はCD4−IgGタンパク質に結合するモノクローナル抗体の
存在を試験した。
トIgG Fc(Cappel Laboratories社から購入)が入ったものを50μl添加し
て、96-ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb;Nunc, Kamstrup, Denmar
k)をコーティングし、4℃で終夜インキュベートした。ついでプレートを洗浄バ
ッファー(0.05%のトゥイーン20を含有するPBS)で3回洗浄した。つい
で、マイクロタイタープレートのウェルを、PBSに2.0%のウシ血清アルブ
ミンが入ったもの200μlで阻止し、室温で1時間インキュベートした。つい
でプレートを、洗浄バッファーで、再度3回洗浄した。
振盪装置上で、室温で1時間インキュベートし、続いて洗浄バッファーで3回洗
浄した。
加した。100μlのP3X63AgU.1骨髄腫細胞の条件培地を、対照とし て他の所定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で1時間インキュ
ベートし、続いて洗浄バッファーで3回洗浄した。
加し、プレートを振盪装置上で、室温で1時間インキュベートした。プレートを
洗浄バッファーで3回洗浄し、ついで各ウェルに50μlの基質(TMBマイク ロウェル・ペルオキシダーゼ基質、Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を添
加し、室温で10分間インキュベートした。50μlのTMB1-成分終止溶液(
ジエチレングリコール, Kirkegaard & Perry)を各ウェルに添加して反応を終了 させ、450nmでの吸光度を自動マイクロタイタープレート読取装置で読み取
った。
が陽性であると判断された(バックグラウンドのおよそ4倍高いと算出)。選択し
たハイブリドーマを、ELISA(後述)において、DcR3のFasリガンド
への結合を阻害するそれらの能力について試験した。潜在的な阻止又は非阻止分
泌ハイブリドーマを、限定希釈によって2回クローニングした。
セプターに結合できるか否かを測定するためにELISAを実施した。特に、4
C4.1.4;11C5.2.8;8D3.1.5;5C4.14.7;及び4
B7.1.1抗体は、各々、ここに記載したDcR3及びDR4[Panら,上掲]
、DR5[Sheridan等, 上掲及びPan等, 上掲]、DcR1[Sheridan等, 上掲 ]、及びOPG[Simonet等, 上掲]に対する結合性を試験した。ELISAは 、本質的に上述の実施例15に記載したようにして実施した。抗原特異性は、1
0マイクログラム/mlのDcR3抗体を用いて測定した。 結果を図12に示す。DcR3の5つの抗体全ては、DcR3に特異的に結合
した(図13も参照)。5つのDcR3抗体のいずれも、アッセイにおける他の
レセプターへの交差反応性を示さなかった。
nc, Kamstrup, Denmark)を、各ウェルに50μlの炭酸塩バッファー中の2μg
/mlヤギ抗ヒトIgG Fc(Cappel Laboratories社から購入)を添加すること
によりコーティングし、4℃で終夜インキュベートした。ついでプレートを洗浄
バッファー(0.05%のトゥイーン20を含有するPBS)で3回洗浄した。つ
いで、マイクロタイタープレートのウェルを、PBSに2.0%のウシ血清アル
ブミンが入ったもの200μlで阻止し、室温で1時間インキュベートした。つ
いでプレートを、洗浄バッファーで、再度3回洗浄した。
μlを各々のウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で1時間インキ
ュベートし、続いて洗浄バッファーで3回洗浄した。 洗浄工程に続き、100μlの精製した抗体4C4.1.4;11C5.2.
8;8D3.1.5;5C4.14.7;又は4B7.1.1を、アッセイ用バ
ッファー中の所定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で1時間イ
ンキュベートし、続いて洗浄バッファーで3回洗浄した。
(35ng/mlの濃度)を各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキ
ュベートした。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、続いて1:2000希
釈のHRP−ストレプトアビディン(Zymed)100μlをウェルに添加し、1 時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで3回再度洗浄した。次い
で各ウェルに50μlの基質(TMBマイクロウェル・ペルオキシダーゼ基質、Ki
rkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)を添加し、室温で5分間インキュベート した。50μlのTMB1-成分終止溶液(ジエチルグリコール, Kirkegaard & P
erry)を各ウェルに添加して反応を終了させ、450nmでの吸光度を自動マイ クロタイタープレート読取装置で読み取った。 結果を図12に示す。%阻止活性は、Fasリガンドに対してDcR3抗体の
100倍過剰において決定した。3つの抗体、4B7.1.1;11C5.2.
8;及び5C4.14.7は、有意な阻止活性を示した(図14も参照)。
イソタイプ特異的ヤギ抗マウスIg(Fisher Biotech, Pittsburgh, PA)で、マイ
クロタイタープレートを4℃で一晩かけてコーティングすることにより決定した
。ついでプレートを洗浄バッファー(上述の実施例15に記載したもの)で洗浄し
た。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを200μlの2%ウシ血清ア
ルブミン(BSA)で阻止し、室温で1時間インキュベートした。プレートを、再
度洗浄バッファーで3回洗浄した。次に、100μlのハイブリドーマ培養上清
又は5μg/mlの精製抗体を所定ウェルに加えた。プレートを室温で30分イ
ンキュベートし、ついで50μlのHRP-抱合ヤギ抗マウスIgG(実施例15
において上述したもの)を各ウェルに添加した。プレートを室温で30分インキ ュベートした。プレートに結合したHRPのレベルを、上述のHRP基質を使用
して検出した。
.1.1抗体がIgG1抗体であることが示された。またこの分析により、5C
4.14.7抗体がIgG2b抗体であり、4C4.1.4抗体がIgG2a抗
体であることが示された。これらの結果も図12に示す。
y Blvd., Manassas, Virginia, USA(ATCC)に寄託した: 材料 ATCC寄託番号 寄託日 DNA30942-1134 209254 1997年9月16日 4C4.1.4 ___ 1998年9月 日 5C4.14.7 ___ 1998年9月 日 11C5.2.8 ___ 1998年9月 日 8D3.1.5 ___ 1998年9月 日 4B7.1.1 ___ 1998年9月 日
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の
合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の3 7CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し た者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に
取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政
府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであると
みなされるものではない。
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側
面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが
表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。
実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記
の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るも
のである。
寄託の受託番号を特定すること)
10)を示す図である。
トを示す図である。4つのシステインに富むドメイン(CRD)を、CRD1、
CRD2、CRD3及びCRD4として示した。
つのシステインに富むドメイン(CRD)を、CRD1、CRD2、CRD3及
びCRD4として特定した。
組織及びヒト癌株化細胞におけるDcR3mRNAの発現を示す図である。
るためのFACS分析の結果を示す図である。
測定するための共免疫沈降アッセイの結果を示す図である
のインビトロアッセイの結果を示す図である。
のインビトロアッセイの結果を示す図である。
のインビトロアッセイの結果を示す図である。
けるDcR3遺伝子の増幅を測定するためのアッセイの結果を示す図である。
けるDcR3遺伝子の増幅を測定するためのアッセイの結果を示す図である。
におけるDcR3遺伝子の増幅を測定するためのアッセイの結果を示す図である
。
示す図である。
示す図である。
示す図である。
8D3.1.5;及び4B7.1.1抗体と呼ばれるある種のDcR3抗体の抗
原特異性及び阻止活性を示す表である。
8D3.1.5;及び4B7.1.1抗体と呼ばれるある種のDcR3抗体の抗
原特異性を示すFIGである。
8D3.1.5;及び4B7.1.1抗体と呼ばれるある種のDcR3抗体の阻
止活性を測定するためのELISAの結果を示す図である。
Claims (66)
- 【請求項1】 図1(配列番号:1)のアミノ酸残基1〜300を含んでなる
天然配列DcR3ポリペプチドと、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を
有する単離されたDcR3ポリペプチド。 - 【請求項2】 前記DcR3ポリペプチドが少なくとも約90%のアミノ酸
配列同一性を有する請求項1に記載のDcR3ポリペプチド。 - 【請求項3】 前記DcR3ポリペプチドが少なくとも約95%のアミノ酸
配列同一性を有する請求項2に記載のDcR3ポリペプチド。 - 【請求項4】 前記DcR3ポリペプチドが、Fasリガンドに結合する請
求項1に記載のDcR3ポリペプチド。 - 【請求項5】 図1(配列番号:1)のアミノ酸残基1〜300を含んでなる
単離された天然配列DcR3ポリペプチド。 - 【請求項6】 図1(配列番号:1)のアミノ酸残基1〜215を含んでなる
単離されたDcR3ポリペプチド。 - 【請求項7】 アミノ酸残基1〜Xを含んでなり、Xが図1(配列番号:1)
のアミノ酸残基215〜300のいずれか1つである単離されたDcR3ポリペ
プチド。 - 【請求項8】 1つ又はそれ以上のシステインに富むドメインを含むポリペ
プチドを含んでなり、前記1つ又はそれ以上のシステインに富むドメインが、図
6に示すCRD1、CRD2、CRD3又はCRD4のアミノ酸配列を含む、単
離されたTNFR相同体。 - 【請求項9】 異種性アミノ酸配列に融合した請求項1に記載のDcR3ポ
リペプチド又は請求項7に記載の配列を含んでなるキメラ分子。 - 【請求項10】 前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求
項9に記載のキメラ分子。 - 【請求項11】 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求
項9に記載のキメラ分子。 - 【請求項12】 前記免疫グロブリン配列がIgG Fcドメインである請 求項11に記載のキメラ分子。
- 【請求項13】 前記配列が図1(配列番号:1)のアミノ酸残基1〜215
を含んでなる請求項11に記載のキメラ分子。 - 【請求項14】 請求項1に記載のDcR3ポリペプチド又は請求項7に記
載の配列に結合する抗体。 - 【請求項15】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項14に記載の
抗体。 - 【請求項16】 前記抗体が阻止抗体を含む請求項14に記載の抗体。
- 【請求項17】 前記抗体がキメラ抗体を含む請求項14に記載の抗体。
- 【請求項18】 前記抗体がヒト抗体を含む請求項14に記載の抗体。
- 【請求項19】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された4C4.1.4モノクローナル抗体の生物学的特徴を
有する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項20】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された5C4.14.7モノクローナル抗体の生物学的特徴
を有する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項21】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された11C5.2.8モノクローナル抗体の生物学的特徴
を有する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項22】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された8D3.1.5モノクローナル抗体の生物学的特徴を
有する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項23】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された4B7.1.1モノクローナル抗体の生物学的特徴を
有する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項24】 当該抗体が、ATCC寄託番号___として寄託されたハ
イブリドーマ株化細胞により産生された4C4.1.4モノクローナル抗体が結
合するエピトープと同様のエピトープに結合する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項25】 当該抗体が、ATCC寄託番号___として寄託されたハ
イブリドーマ株化細胞により産生された5C4.14.7モノクローナル抗体が
結合するエピトープと同様のエピトープに結合する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項26】 当該抗体が、ATCC寄託番号___として寄託されたハ
イブリドーマ株化細胞により産生された11C5.2.8モノクローナル抗体が
結合するエピトープと同様のエピトープに結合する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項27】 当該抗体が、ATCC寄託番号___として寄託されたハ
イブリドーマ株化細胞により産生された8D3.1.5モノクローナル抗体が結
合するエピトープと同様のエピトープに結合する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項28】 当該抗体が、ATCC寄託番号___として寄託されたハ
イブリドーマ株化細胞により産生された4B7.1.1モノクローナル抗体が結
合するエピトープと同様のエピトープに結合する請求項15に記載の抗体。 - 【請求項29】 請求項15に記載の抗体を産生するハイブリドーマ株化細
胞。 - 【請求項30】 ATCC寄託番号___として寄託された4C4.1.4
ハイブリドーマ株化細胞。 - 【請求項31】 ATCC寄託番号___として寄託された5C4.14.
7ハイブリドーマ株化細胞。 - 【請求項32】 ATCC寄託番号___として寄託された11C5.2.
8ハイブリドーマ株化細胞。 - 【請求項33】 ATCC寄託番号___として寄託された8D3.1.5
ハイブリドーマ株化細胞。 - 【請求項34】 ATCC寄託番号___として寄託された4B7.1.1
ハイブリドーマ株化細胞。 - 【請求項35】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された4C4.1.4モノクローナル抗体。 - 【請求項36】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された5C4.14.7モノクローナル抗体。 - 【請求項37】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された11C5.2.8モノクローナル抗体。 - 【請求項38】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された8D3.1.5モノクローナル抗体。 - 【請求項39】 ATCC寄託番号___として寄託されたハイブリドーマ
株化細胞により産生された4B7.1.1モノクローナル抗体。 - 【請求項40】 請求項1に記載のDcR3ポリペプチド又は請求項7に記
載の配列をコードしている核酸配列を含んでなる単離された核酸。 - 【請求項41】 前記核酸配列が図1(配列番号:1)のアミノ酸残基1〜3
00を含んでなる天然配列DcR3ポリペプチドをコードする請求項40に記載
の核酸。 - 【請求項42】 請求項40に記載の核酸を含んでなるベクター。
- 【請求項43】 ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される対照配
列に作用可能に結合した請求項42に記載のベクター。 - 【請求項44】 請求項42に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 【請求項45】 CHO細胞を含んでなる請求項44に記載の宿主細胞。
- 【請求項46】 酵母細胞を含んでなる請求項44に記載の宿主細胞。
- 【請求項47】 大腸菌を含んでなる請求項44に記載の宿主細胞。
- 【請求項48】 DcR3ポリペプチドをコードしている核酸分子を使用し
てDcR3ポリペプチドの生産を行う方法において、請求項44に記載の宿主細
胞を培養することを含んでなる方法。 - 【請求項49】 DcR3ポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を
含む非ヒト、トランスジェニック動物。 - 【請求項50】 マウス又はラットである請求項49に記載の動物。
- 【請求項51】 DcR3ポリペプチドをコードする変更遺伝子を有する細
胞を含む、非ヒト、ノックアウト動物。 - 【請求項52】 マウス又はラットである請求項51に記載の動物。
- 【請求項53】 請求項1又は7に記載のDcR3と担体を含んでなる組成
物。 - 【請求項54】 請求項14に記載のDcR3抗体及び担体を含んでなる組
成物。 - 【請求項55】 容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物が
DcR3ポリペプチド又はDcR3抗体を含む製造品。 - 【請求項56】 インビボ又はエキソビボにおいてDcR3ポリペプチド又
はDcR3抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項55に記
載の製造品。 - 【請求項57】 哺乳動物細胞におけるアポトーシスを変調する方法におい
て、DcR3ポリペプチド又はDcR3ポリペプチドを含むキメラ分子に前記細
胞を暴露することを含んでなる方法。 - 【請求項58】 哺乳動物細胞におけるFasリガンド誘発性アポトーシス
を阻害する方法において、DcR3ポリペプチド又はDcR3ポリペプチドを含
むキメラ分子に前記細胞を暴露することを含んでなる方法。 - 【請求項59】 哺乳動物細胞におけるFasリガンド誘発活性を阻害する
方法において、DcR3ポリペプチド又はDcR3ポリペプチドを含むキメラ分
子に前記細胞を暴露することを含んでなる方法。 - 【請求項60】 哺乳動物ガン細胞をDcR3抗体に暴露することを含んで
なる哺乳類動物のガンの処置方法。 - 【請求項61】 前記ガン細胞においてDcR3遺伝子が増幅される請求項
60に記載の方法。 - 【請求項62】 前記哺乳動物ガン細胞が、肺ガン細胞又は大腸ガン細胞で
ある請求項60に記載の方法。 - 【請求項63】 前記哺乳動物ガン細胞が、化学治療又は放射線治療に暴露
される請求項61に記載の方法。 - 【請求項64】 哺乳動物細胞を、DcR3遺伝子の増幅について分析する
ことを含んでなるガンを検出又は診断する方法。 - 【請求項65】 哺乳動物におけるT細胞媒介免疫反応を阻害する方法にお
いて、DcR3ポリペプチド又はDcR3ポリペプチドを含むキメラ分子に、哺
乳動物細胞を暴露することを含んでなる方法。 - 【請求項66】 配列番号:3又はその補体の核酸配列を含んでなる単離さ
れた核酸。
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