EA007984B1 - ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA007984B1
EA007984B1 EA200400262A EA200400262A EA007984B1 EA 007984 B1 EA007984 B1 EA 007984B1 EA 200400262 A EA200400262 A EA 200400262A EA 200400262 A EA200400262 A EA 200400262A EA 007984 B1 EA007984 B1 EA 007984B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
sequence
tace
amino acid
cells
Prior art date
Application number
EA200400262A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400262A1 (ru
Inventor
Вишва Диксит
Икбэл Грювэл
Джон Риджуэй
Минхонг Ян
Original Assignee
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Инк.
Publication of EA200400262A1 publication Critical patent/EA200400262A1/ru
Publication of EA007984B1 publication Critical patent/EA007984B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Охватываются новые рецепторы, называемые в данном описании "TACIs" и "BR3", их агонисты и антагонисты и способы применения TACIs и BR3, а также их агонистов и антагонистов для модулирования активности, например молекул, родственных фактору некроза опухолевых клеток (TNF) и TNFR, включая членов семейств TNF и TNFR, называемых TALL-1, APRIL, TACI и ВСМА. Помимо этого включены способы in vitro, in situ и/или in vivo диагностики и/или лечения (обработки) клеток млекопитающих или патологических состояний, обусловленных такими TNF и TNFR-родственными молекулами.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым рецепторам, называемым в данном описании ТАСЕ и ВН3, к их агонистам и антагонистам и к способам применения ТАСЕ и ВН3, а также их агонистов и антагонистов, например, для модулирования активности фактора некроза опухолевых клеток (ΤΝΒ) и родственных ΤΝΒΒ молекул, включая членов семейств ΤΝΡ и ΤΝΒΒ, обозначаемых ТАЬЬ-1, АРК1Б, ТАС1 и ВСМА. Данное изобретение также относится к способам ίη νίίτο, ίη кйи и/или ίη νίνο диагностики и/или лечения клеток млекопитающих или патологических состояний, обусловленных такими ТИР и родственными ТИРЕ молекулами.
Предпосылки создания изобретения
Молекулы различных веществ, таких как фактор некроза опухолей - а (ЮТ-а), фактор некроза опухолей - β (ЮТ-β или лимфотоксин-а), лимфотоксин-β (ЬТ-β), лиганд СБ30, лиганд СБ27, лиганд СБ40, лиганд ОХ-40, лиганд 4-1ВВ, лиганд Аро-1 (также называемый лиганд Рак или лиганд СБ95), лиганд Аро-2 (также обозначаемый ТКА1Б), лиганд Аро-3 (также обозначаемый ТАБАК), АРК1Б, лиганд ОРО (также называемый лиганд ΚΛΝΚ, ОБР или ТКАИСБ) и ТАББ-1 (также обозначаемый В1уБ, ВАРР или ТНАМ<). были идентифицированы как представители цитокинов семейства фактора некроза опухолей (ЮТ) [см. например, Огакк ап4 Бо^ег, В1оо4, 85:3378-3404 (1995); Бсйт14 е! а1., Ргос. Ναίΐ. Аса4. Бск, 83:1881 (1986); Беа1!гу е! а1., Еиг. I. 1ттипо1., 17:689 (1987); Рйй е! а1., I. Вю1. Сйет., 271: 12687-12690 (1996); А11еу е! а1., 1ттипйу, 3:673- 682 (1995); Егошине е! а1., Се11, 72:847-856 (1993); Агтйаде е! а1. №!иге, 357:80-82 (1992), Международная заявка АО 97/01633, опубликованная 16 января 1997 г.; и АО 97/25428, опубликованная 17 июля 1997 г.; Магк!егк е! а1., Сигг. Вю1., 8:525-528 (1998); СЫсйеройюйе е! а1., Вю1. Сйет., 272:32401-32410 (1997); Найпе е! а1., I. Ехр. Ме4., 188:1185-1190 (1998); Международная заявка АО 98/28426, опубликованная 2 июля 1998 г.; АО 98/46751, опубликованная 22 октября 1998 г.; и АО/98/18921, опубликованная 7 мая 1998 г.; Мооге е! а1., 8с1епсе, 285:260-263 (1999); Бйи е! а1., I. Беикосу!е Вю1. 65:680 (1999); Бсйпе14ег е!. а1., I. Ехр. Ме4., 189:1747-1756 (1999); Микйора4йуау е! а1., I. Вю1. Сйет., 274:15978-15981 (1999)]. Сообщалось, что из этих молекул Т№-а, ТКР-β, лиганд СБ30, лиганд 4-1ВВ, лиганд Аро-1, лиганд Аро-2 (Аро2Б/ТКА1Б) и лиганд Аро-3 (ТАЕАК) вовлечены в процесс апоптотической гибели клеток.
Сообщалось, что различные молекулы семейства ЮТ также играют роль (и) в функции или развитии иммунной системы [Огикк е! а1., В1оо4, 85:3378 (1995)]. 2йепд е! а1. сообщали, что ЮТ-α включён в постстимуляционный апоптоз СБ8-позитивных Т-клеток ^йепд е! а1., №!иге, 377:348-351 (1995)]. Другие исследователи сообщали, что лиганд СБ30 может быть вовлечён в делецию аутореактивных Т-клеток в тимусе [Атакама е! а1., Со14 Бргтд НагЬог БаЬога!огу Бутрокшт оп Ргодгатте4 Се11 Беа!й, АЬк1г. №. 10, (1995)]. Лиганд СБ40 активирует многие функции В-клеток, включая пролиферацию, секрецию иммуноглобулина и выживание [Кепкйате е! а1., I. Ехр. Ме4., 180:1889 (1994)]. Сообщалось, что другой цитокин семейства ЮТ, ТАББ-1 (В1уБ) при определённых условиях индуцирует пролиферацию В-клеток и секрецию иммуноглобулина. [Мооге е! а1., см. выше; Бсйпе14ег е! а1., см. выше; Маскау е! а1., Б Ехр. Ме4., 190:1697 (1999); Бйи е! а1., I. Беикосу!е Вю1, 65:680-683 (1999); Огокк е! а1., №!иге, 404:995-999 (2000)].
Мутации в генах рецептора или лиганда мышиного Рак/Аро-1 (называемых, соответственно, 1рг и д14) связаны с некоторыми аутоиммунными нарушениями, указывающими на то, что лиганд Аро-1 может играть роль в регуляции клональной делеции аутореактивных лимфоцитов на периферии [Кгаттег е! а1., Сигг. Ор. 1ттипо1., 6:279-289 (1994); №ща1а е! а1. Баепсе, 267:1449 - 1456 (1995)]. Также сообщалось, что лиганд Аро-1 индуцирует постстимуляционный апоптоз в СБ4-позитивных Т-лимфоцитах и в В-лимфоцитах и может быть включён в элиминирование активированных лимфоцитов, когда уже отпадает необходимость в их функции [Кгаттег е! а1., см. выше; №да1а е! а1., см. выше]. Сообщалось, что агонистические мышиные моноклональные антитела, специфически связывающиеся с рецептором Аро-1, проявляют активность в отношении лизиса клеток, сравнимую с подобной активностью Т№-а [Уопейага е! а1., I. Ехр. Ме4., 169:1747-1756 (1989)].
В литературе сообщалось, что лиганд, родственный ЮТ, называемый лиганд ОРО (также обозначаемый лиганд НАКК, ТКА№.'Е или ОБЕ), частично принимает участие в некоторых сторонах иммунорегуляторной активности. В Международной заявке АО98/28426, опубликованной 2 июля 1998 г., описан лиганд (называемый в этой заявке лиганд НАКК) как трансмембранный белок типа 2, который, как обнаружено, в растворимой форме стимулирует созревание дендритных клеток, повышает способность к аллостимуляции СБ1а+ дендритных клеток в МБК и повышает число жизнеспособных Т-клеток периферической крови 1п уйго в присутствии ТОР-бета. [см. также Ап4егкоп е! а1., №!иге, 390 (1997)]. В Международной заявке АО98/28426 также описано, что лиганд повышает продукцию Т^Р-альфа одной макрофагальной опухолевой клеточной линией (названной НАА264.7; Американская коллекция типовых культур, АТСС Т1В71), но не стимулирует продукцию оксида азота этими опухолевыми клетками.
Предполагаемая роль лиганда ΟРО/ΤΚАNСЕ/Ο^Р в модулировании активности дендритных клеток [см., например, Аопд е! а1., I. Ехр. Ме4., 186:2075-2080 (1997); Аопд е! а1., I. Беикосу!е Вю1., 65:715-724 (1999); 1ок1еп е! а1., I. 1ттипо1., 162:2562-2568 (1999); 1ок1еп е! а1., I. Ехр. Ме4., 191:495-501 (2000)] и во влиянии Т клеточной активности на иммунный ответ [см. например, Васйтапп е! а1., Б Ехр. Ме4.,
- 1 007984
189:1025-1031 (1999); Сгееи е! а1., 1. Ехр. Меб., 189:1017-1020 (1999)] изучалась в литературе. Коид е! а1., №11игс. 397:315-323 (1999) сообщают, что у мышей с нарушенным геном орд1 наблюдается тяжёлый остеопороз, недостаток остеокластов и дефекты при ранней дифференцировке Т- и В-лимфоцитов. Коид е! а1. далее сообщают, что системная активация Т-клеток ίη νίνο приводит к опосредуемому ОРСЬ увеличению остеокластогенезу и утрате кости [Коид е! а1., Ха!иге, 402:304-308 (1999)].
Полагают, что индукция различных клеточных ответов, опосредуемая такими цитокинами семейства ΤΝΕ инициируется их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Ранее были идентифицированы два отдельных рецептора ΤΝΡ длиной, примерно, 55 кДа (ΤΝΕΚ1) и 75 кДа (ΤΝΕΚ2) [НоЬшаи е! а1., 1. Вю1. Сбет., 264:14927-14934 (1989); БгоскЬаиз е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сЬ, 87:3127-3131 (1990); Европейский патент ЕР 417563, опубликованный 20 марта 1991 г.; Ьое!ксбег е! а1., Се11, 61:351 (1990); 8сЬа11 е! а1., Се11, 61:361 (1990); 8тбб е! а1., 8с1еисе, 248:1019-1023 (1990); 1,е\\1к е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. δα, 88:2830-2834 (1991); Сообщи е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 11:3020-3026 (1991)]. Найдено, что эти ΤΝΕΚ имеют общую типичную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточную, трансмембранную и внутриклеточную области. Внеклеточные участки обоих рецепторов обнаружены в природе, также как растворимые ΤΝΕ-связывающие белки [Ыорбаг, Υ. е! а1., ЕМВО 1., 9:3269 (1990); и Кобио, Т. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 87:8331 (1990); На1е е! а1., 1. Се11. Вюсбет. 8ирр1етеи! 15Ε, 1991, р. 113 (Р424)].
Внеклеточная область ΤΝΕΚ типа 1 и типа 2 (ΤΝΕΚ1 и ΤΝΕΚ2) содержит повторяющийся набор аминокислотных последовательностей из четырёх обогащенных цистеином доменов (СРП), обозначенных 1-4, начиная с NН2-конца. [8сба11 е! а1., см. выше; Ьое!ксбег е! а1., см. выше; 8тбб е! а1., см. выше; №рбаг е! а1., см. выше; Кобио е! а1., см. выше; Ваииег е! а1., Се11, 73:431-435 (1993)]. Аналогичный повторяющийся набор СРП существует в некоторых других белках клеточной поверхности, включая р75 рецептор фактора роста нервной ткани (Ν6ΕΚ) [1обикои е! а1., Се11, 47:545 (1986); Рабеке е! а1., №!ите, 325:593 (1987)], В-клеточный антиген СЭ40 [8!атеηкον^с е! а1., ЕМВО 1., 8:1403 (1989)], Τ-клеточный антиген ОХ40 [Ма11е! е! а1., ЕМВО 1., 9:1063 (1990)] и антиген Рак [Зоиебага е! а1., см. выше, и боб е! а1., Се11, 66:233-243 (1991)]. СРЭ также обнаружены в растворимых ΤΝΕΚ (кЕ^Ю-подобных Τ2 белках осповых вирусов фибромы Шоупа и миксомы [Ир!ои е! а1., Уйо1оду, 160:20-29 (1987); 8тбб е! а1., Вюсбет. Вюрбук. Рек. Соттии., 176:335 (1991); Ир!ои е! а1., Упо1оду, 184:370 (1991)]. Оптимальный сравнительный анализ первичной структуры этих последовательностей показывает, что положения цистеиновых остатков являются чётко консервативными. Эти рецепторы иногда в целом называют представителями суперсемейства рецепторов ΤΝΕ/Ν6Ε.
Лиганды семейства ΤΝΕ, идентифицированные до настоящего времени, за исключением лимфотоксина-α, как правило, представляют собой трансмембранные белки типа II, С-конец которых является внеклеточным участком. Напротив, большинство рецепторов семейства рецепторов ΤΝΕ (ΤΝΕΚ), идентифицированных до настоящего времени, как правило, являются трансмембранными белками типа I. Однако, в обоих семействах лигандов и рецепторов ΤΝΕ, гомология, идентифицируемая между представителями семейств, обнаруживается, главным образом, во внеклеточном домене (ЕСЭ). Некоторые из цитокинов семейства ΤΝΕ, включая ΤΝΕ-α, лиганд Аро-1 и лиганд СЭ40, расщепляются протеолитически на клеточной поверхности; полученный белок в каждом случае, как правило, образует гомотримерную молекулу, которая действует как растворимый цитокин. Белки семейства рецепторов ΤΝΕ также обычно расщепляются протеолитически, высвобождая растворимые рецепторные ЕСЭ, которые могут функционировать как ингибиторы родственных цитокинов.
Представитель семейства ΤΝΕΚ, обозначенный ΚΆΝΕ, был идентифицирован как рецептор лиганда ОРС (см. Международную заявку \УО 98/28426, опубликованную 2 июля 1998 г.; Аибегкои е! а1., Ха!иге, 399:175-179 (1997); Ьасеу е! а1., Се11, 93:165-176 (1998). Другая родственная ΤΝΕΚ молекула, называемая ОРС (ΕΌΟΚ-1 или ОС1Б), также была идентифицирована как рецептор лиганда ОРС. [81тоие! е! а1., Се11, 89:309 (1997); Закиба е! а1., Еибостшо1оду, 139:1329 (1998); Υиη е! а1., 1. 1ттиио1, 161:6113-6121 (1998)]. Υип е! а1., см. выше, нашли, что ОРС/РЭСК-1/ОС1Р экспрессируется как в мембрано-связанной форме, так и в секретированной форме и имеет ограниченный тип экспрессии в клетках иммунной системы, включая дендритные клетки, ЕВУ-трансформируемые В-клеточные линии и тонзиллярные В-клетки. Зии е! а1. также пишут, что в В-клетках и дендритных клетках экспрессию ОРС/РЭСК-1/ОС1Р можно активировать с помощью СЭ40, молекулы, включённой в В-клеточную активацию. Однако, Зии е! а1. признают, что неизвестно, как функционирует ОРС/РЭСК-1/ОС1Р в процессе регуляции иммунного ответа.
Позднее были идентифицированы другие представители семейства ΤΝΕΚ. В νοи Ви1о\у е! а1., 8с1еисе, 278:138-141 (1997) исследователи описали плазма-мембранный рецептор, названный трансмембранный активатор и САМЬ-интерактор или 'ТАСГ'. Сообщают, что рецептор ΤАСI содержит богатый цистеином мотив, характерный для семейства ΤΝΕΚ. В анализе ш νίΙΐΌ перекрёстное связывание ΤАСI на поверхности трансфецированных клеток 1шка! с ΤАСI-специфическими антителами привело к активации ΝΕ-КВ. [см. также Международную заявку XVО 98/39361, опубликованную 18 сентября 1998 г.]. Сообщалось, что после нокаута мышей по ΤАСI в их организме имеются гиперчувствительные В-клетки, то
- 2 007984 гда как у мышей с нулевым ВСМА отсутствует различимый фенотип [Уап е! а1., №Шге 1тшипо1оду, 2:638-643 (2001); νοη Ви1о\\ е! а1., 1ттипИу, 14:573-582 (2001); Хи е! а1., Мо1. Се11. Бю1оду, 21: 4067-4074 (2001)].
БааЫ е! а1., ЕМВО 1., 11:3897-3904 (1992) сообщил об идентификации нового гена, названного ВСМ, экспрессия которого, как было обнаружено, совпадает с окончательным формированием Вклеток. Открытая рамка считывания нормальной кДНК ВСМ прогнозирует полипептид длиной 184 аминокислоты с единственным трансмембранным доменом. Эти же исследователи позже назвали этот ген ВСМА. [ЬааЫ е! а1., ШсЧс Ас1бк Кек., 22:1147-1154 (1994)]. Как сообщалось, экспрессия мРНК ВСМА отсутствует в человеческих раковых В-клеточных линиях на стадии про-В-лимфоцитов, и, следовательно, как полагают, связана со стадией дифференцировки лимфоцитов [Отак е! а1., Ιη!. 1тшипо1оду, 7:10931106 (1995)]. У Мабгу е! а1., Ιη!. 1ттипо1оду, 10:1693-1702 (1998) описано клонирование кДНК мышиного ВСМА. Сообщалось, что кДНК мышиного ВСМА кодирует полипептид длиной 185 аминокислот, на 62% идентичный полипептиду человеческого ВСМА. Сравнение первичных структур последовательностей белка мышиного и человеческого ВСМА выявила консервативный мотив из шести цестеиновых остатков в Ν-концевой области, что позволяет предположить, что белок ВСМА принадлежит к суперсемейству ΤΝΕΚ [Мабгу е! а1., кирга].
Сообщалось, что лиганд Та11-1 (В1у8) связывается с рецепторами ТАС1 и ВСМА [Отокк е! а1., см. выше (2000); ТНошркоп е! а1., 1. Ехр Меб., 192:129-135 (2000); Уап е! а1., см. выше (2000); Магк!егк е! а1., Сигг. Вю1., 10:758-785 (2000); Международная заявка XVО 00/40716, опубликованная 13 июля, 2000 г.; Международная заявка νθ 00/67034, опубликованная 9 ноября, 2000 г.]. Аналогично сообщалось, что ТАС1 и ВСМА связываются с лигандом, известным как Артй.
В Магк!егк е! а1., Сигг. Вю1., 6:750 (1996) исследователи описывают природный человеческий полипептид с полноразмерной последовательностью, названный Аро-3, который обнаруживает сходство с семейством ΤΝΕΚ внеклеточными богатыми цистеином повторами и сходен с ΤΝΕΚ1 и СЭ95 тем, что содержит последовательность цитоплазматического домена гибели [см. также Магк!егк е! а1., Сигг. Вю1, 6:1669 (1996)]. Другие исследователи называют Аро-3 также ΌΚ3, тек1-1, ТКАМР и БАКО [СЫтта1уап е! а1.. 8с1епсе, 274:990 (1996); Кйкоп е! а1., №1Шге. 384:372 (1996); Вобтег е! а1., 1ттипйу, 6:79 (1997); 8сгеа!оп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сБ, 94:4615-4619 (1997)].
Рап е! а1. описали другой представитель семейства ТЯР, названный ΌΚ4 [Рап е! а1., 8с1епсе, 276:111-113 (1997); см. также Международную заявку νθ 98/32856, опубликованную 30 июля 1998 г.]. Сообщалось, что ΌΚ4 содержит цитоплазматический домен гибели, способный включать программу самоубийства клетки. Рап е! а1. полагают, что ΌΚ4 является рецептором лиганда, известного как Аро2Б/ТРА1Б.
8Непбап е! а1., 8с1епсе, 277:818-821 (1997) и Рап е! а1., 8с1епсе, 277:815-818 (1997) описывают другую молекулу, которая, как полагают, является рецептором для Аро2Б/ТРА1Б [см. также Международную заявку νθ 98/51793, опубликованную 19 ноября, 1998 г.; Международную заявку νθ 98/41629, опубликованную 24 сентября, 1998 г.]. Эту молекулу также называют ΌΚ5 (её также называют Аро-2; ΊΊΚ\ II.-К ΙΚ.6, Тапдо-63, 1АР08, ТШСК2 или КП.1.ЕИ [8стеа!оп е! а1., Сигг. Вю1., 7:693-696 (1997); νπΚζπΕ е! а1., ЕМВО 1., 16:5386-5387 (1997); νυ е! а1., №1Шге Оепебск, 17:141-143 (1997); Международная заявка ν098/35986, опубликованная 20 августа 1998 г.; Европейская заявка ЕР870827, опубликованная 14 октября 1998 г.; Международная заявка νθ 98/46643, опубликованная 22 октября 1998 г.; νθ 99/02653, опубликованная 21 октября 1999 г.; νθ99/09165, опубликованная 25 января 1999 г.; νθ 99/11791, опубликованная 11 марта 1999 г.]. Сообщалось, что так же как и ΌΚ4, ΌΚ5 содержит цитоплазматический домен гибели и способен передавать сигнал апоптоза. Кристаллическая структура комплекса, образуемого Аро-2Б/ТРА1Б и ΌΚ5, описана в Нуто\\1Ц е! а1., Мо1еси1аг Се11, 4:563 - 571 (1999).
Недавно был идентифицирован ещё один рецептор, ΌΚ6, содержащий домен гибели [Рап е! а1. ЕЕВ8 Бе!!етк, 431:351-356 (1998)]. Полагают, что, помимо того, что он содержит четыре предполагаемых внеклеточных богатых цистеином доменов и цитоплазматический домен гибели, ΌΚ6 содержит предполагаемую содержащую лейцин последовательность наподобие застёжки молнии, которая перекрывается с богатым пролином мотивом в цитоплазматической области. Богатый пролином мотив похож на последовательности, которые связываются с доменами гомологии с кгс-киназой-3 (8Н3), которые обнаружены во многих внутриклеточных молекулах сигнальной трансдукции. В отличие от всех приведённых выше рецепторов, содержащих домены гибели, ΌΚ6 не индуцирует гибель клеток в клеточной линии чувствительного к апоптозу индикатора, МСЕ-7, что наводит на мысль об альтернативной функции этого рецептора. В соответствии с этим наблюдением в настоящее время полагают, что ΌΚ6 не ассоциируется с содержащими домен гибели молекулами адаптера, такими как ЕАЭП, РАГОЭ и ШР, которые опосредуют передачу сигнала в направлении 5'-3' от активированных рецепторов гибели [Рап е! а1., ЕЕВ8 Бе!!., 431:351 (1998)].
Ещё одна группа идентифицированных в последнее время рецепторов названа рецепторыловушки, которые, как полагают, действуют скорее как ингибиторы, нежели как трансдукторы передачи сигнала. Эта группа включает ЭСИ! (называемый также ТРГО, Б1Т или ТРА1Б-Р3) [Рап е! а1.. 8с1епсе,
- 3 007984
276:111-113 (1997); Зйепбап е! а1., 8с1епсе, 277:818-821 (1997); МсЕаг1апе е! а1., 1. Вю1. СНет., 272:2541725420 (1997); ЗсЬпеИег е! а1., ТЕВ8 Ье!!егз, 416:329-334 (1997); Пе§й-Езроз!1 е! а1., 1. Ехр. Меб.. 186:11651170 (1997); и Мопдко1зарауа е! а1., 1. 1ттипо1., 160:3-6 (1998)] и ОСР2 (также называемый ΤΡυΝΏΌ или ТКА1Ь-К4) [Магз!егз е! а1., Сигг. Вю1. 7:1003-1006 (1997); Рап е! а1., ТЕВ8 Ьейегз, 424:41-45 (1998); ПедН-Езрозй е! а1., 1ттипйу, 7:813-820 (1997)], оба являются молекулами клеточной поверхности, а также ОРС [81топе! е! а1., см. выше; Етегу е! а1., см. ниже] и ОСР3 [Ρί!ίί е! а1. №!ше. 396:699-703 (1998)], оба являются секретируемыми растворимыми белками.
Другие недавно идентифицированные представители семейства ΤΝΕΚ включают САК1, НУЕМ, С1ТК, ΖΤΝΕΚ-5, ΝΤΚ-1 и ΤΝΕΕ1 [Вгсдайсй е! а1., Се11, 87:845-855 (1996); Моп!§отегу е! а1, Се11, 87:427436 (1996); Магз!ег8 е! а1., 1. Вю1. СНет., 272:14029-14032 (1997); ШсепЦш е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 94:6216-6221 (1997); Етегу е! а1., 1. Вю1. СНет.. 273:14363-14367 (1998); Международная заявкя νθ 99/04001, опубликованная 28 января 1999 г.; νθ99/07738, опубликованная 18 февраля 1999 г.; νθ 99/33980, опубликованная 8 июля 1999 г.].
Как написано недавно в обзоре Τе\νа^^ е! а1., ΤΝΕΚ1, ΤΝΕΚ2 и СЭ40 модулируют экспрессию провоспалительных и костимулирующих цитокинов, рецепторов цитокинов и молекул клеточной адгезии с помощью активации фактора транскрипции, ΝΕ-кВ Це^ал е! а1., Сигг. Ор. Сепе!. Эеуе1ор.. 6:39-44 (1996)]. ΝΕ-кВ является прототипом семейства димерных факторов транскрипции, субъединицы которых содержат консервативные области Ке1 [Уегта е! а1., Сепез Эеуе1ор. 9:2723-2735 (1996); Ва1б^ш, Апп. Реу. 1ттипо1., 14:649-681 (1996)]. В своей латентной форме ΝΕ-кВ образует комплексы с представителями семейства ингибиторов 1кВ; при инактивации 1кВ в ответ на определённые раздражители высвобождаемый ΝΕ-кВ транслоцируется в ядро, где он связывается со специфическими последовательностями ДНК и активирует транскрипцию гена. Как описано выше, представители семейства ΤΝΕΚ, идентифицированные до настоящего времени, либо включают, либо не включают внутриклеточную область домена гибели. Молекулы некоторых ΤΝΕΚ, не содержащие домен гибели, такие как ΤΝΕΚ2, СЭ40, НУЕМ и СПК, способны модулировать активность ΝΕ-кВ. [см., например, Йо1х е! а1., 1. Ьеикосу!е Вю1., 60:1-7 (1996)].
Обзоры о цитокинах семейства ΤΝΕ и их рецепторах см. АзЬкепах! апб Όίχί!, 8с1епсе. 281:1305-1308 (1998); Со1з!еш, Сигг. Вю1., 7:750-753 (1997); Сгизз апб Эо^ег, см. выше и Ыа§а!а, Се11, 88:355-365 (1997).
Сущность изобретения
Заявители идентифицировали новые молекулы, названные ΤАСI и ВК3. Полипептид ΤАСI охарактеризован как содержащий единственный богатый цистеином домен, в отличие от молекулы полноразмерного человеческого ΤАСI, описанного в уоп Ви1оте е! а1., см. выше, который включает два богатых цистеином домена. Аналогично полипептид ВК3 был охарактеризован как содержащий единственный богатый цистеиновый домен. Заявители неожиданно обнаружили, что лиганды семейства ΤΝΕ, называемые ΤΛΡΕ-1 и Аргб, связываются с рецептором ΤАСI. Также неожиданно заявители обнаружили, что лиганд семейства ΤΝΕ, называемый ΤА^^-1, связывается с рецептором ВК3. В отличие от рецепторов ΤАСI и, по-видимому, не связывается с лигандом Аргб и не активирует ΝΕ-кВ путь. Таким образом, в настоящем изобретении созданы новые методы применения антагонистов или агонистов этих родственных ΤΝΕ лигандов и рецепторов. Антагонисты и агонисты по данному изобретению находят применение, среди прочего, для ш уйго, ш зйи или ш у|уо диагностики или лечения клеток млекопитающих или патологических состояний, обусловленных присутствием (или отсутствием) ΤА^^-1, АРК1Ь, ΤАСI, ВСМА, ΤАСIз или ВК3.
В одном варианте данное изобретение включает молекулы выделенной нуклеиновой кислоты, содержащие ДНК, кодирующую полипептид ΤАСIз. В некоторых аспектах выделенная нуклеиновая кислота содержит ДНК, кодирующую полипептид ΤАС[з, содержащий аминокислотные остатки 1-246 или 1119 на фиг. 5В (8Е0 ГО ΝΟ:14), или комплементарна таким кодирующим нуклеотидным последовательностям и остаётся устойчиво связанной с ними, по меньшей мере, в умеренных и, необязательно, в очень жёстких условиях.
Другой вариант данного изобретения включает векторы, содержащие ДНК, кодирующую полипептид ΤАСIз. Также охватывается клетка-хозяин, содержащая этот вектор. Примерами клеток-хозяев могут быть клетки СНО, Е. сой или дрожжей. Кроме того, охватывается способ продуцирования полипептидов ΤАСIз, который заключается в культивировании клеток-хозяев в условиях, пригодных для экспрессии полипептида ΤАСIз, и регенерации полипептида ΤАСIз из культуры клеток.
В другом варианте изобретение включает выделенные полипептиды ΤАСIз. В частности, изобретение охватывает полипептиды ΤАСIз, которые включают аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-246 на фиг. 5В (8Е0 ГО ΝΟ:14). Дополнительные варианты настоящего изобретения относятся к выделенным последовательностям внеклеточного домена полипептида ΤАСIз, содержащим аминокислоты 1-119 аминокислотной последовательности на фиг. 5В (8Е0 ГО ΝΟ:14) или её фрагменты, в особенности, биологически активные фрагменты.
В другом варианте изобретение включает химерные молекулы, содержащие последовательности полипептида ΤАСIз, или внеклеточного домена, или другого его фрагмента, слитые с гетерологичной
- 4 007984 полипептидной или аминокислотной последовательностью. Примером такой химерной молекулы является полипептид ТАСЬ, слитый с последовательностью эпитопной метки или участка Ес иммуноглобулина.
В другом варианте изобретение включает антитело, которое специфически связывается с полипептидом ТАСЬ или его внеклеточным доменом. Необязательно антитело представляет собой моноклональное антитело.
Ещё в одном варианте изобретение включает диагностические и терапевтические методы применения полипептида ТАСЬ или ДНК, кодирующей полипептид ТАСЕ.
В другом варианте изобретение включает молекулы выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей ДНК, кодирующей полипептид ВК3. В некоторых аспектах выделенная нуклеиновая кислота содержит ДНК, кодирующую полипептид ВКЗ, содержащий аминокислотные остатки 1-184, 1-77 или 2-62 на фиг. 6В (8ЕЦ ГО N0:16), или комплементарна таким кодирующим нуклеотидным последовательностям и остаётся устойчиво связанной с ними, по меньшей мере, в умеренных и, необязательно, в очень жёстких условиях.
В другом варианте изобретение включает векторы, содержащие ДНК, кодирующую полипептид ВК3. Также охватывается клетка-хозяин, содержащая этот вектор. Примерами клеток-хозяев могут быть клетки СНО, Е. сой или дрожжей. Кроме того, охватывается способ продуцирования полипептидов ВК3, который заключается в культивировании клеток-хозяев в условиях, пригодных для экспрессии полипептида ВК3, и регенерации полипептида ВК3 из культуры клеток.
В другом варианте изобретение включает выделенные полипептиды ВК3, которые включают аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-184, 1-77 или 2-62 на фиг. 6В (8ЕЦ ГО N0:16). Дополнительные варианты настоящего изобретения относятся к выделенным последовательностям внеклеточного домена полипептида ВК3, содержащим аминокислоты 1-77 или 2-62 аминокислотной последовательности на фиг. 6В (8Е0 ГО N0:16) или её фрагменты.
В другом варианте изобретение включает химерные молекулы, содержащие последовательности полипептида ВК3 или внеклеточного домена или другого его фрагмента, слитые с гетерологичной полипептидной или аминокислотной последовательностью. Примером такой химерной молекулы является полипептид ВК3, слитый с последовательностью эпитопной метки или участка Ес иммуноглобулина.
В другом варианте изобретение включает антитело, которое специфически связывается с полипептидом ВК3 или его внеклеточным доменом. Необязательно антитело представляет собой моноклональное антитело.
Ещё в одном варианте изобретение включает диагностические и терапевтические методы применения полипептида ВК3 или ДНК, кодирующей полипептид ВК3.
Способы по изобретению включают способы лечения патологических состояний или заболеваний млекопитающих, ассоциированных с или вызванных увеличенной или повышенной экспрессией и/или активностью ТАЕЬ-1 или АРК1Ь. Согласно этим способам лечения млекопитающему, страдающему таким патологическим состоянием или заболеванием, можно вводить антагонисты ТАЕЬ-1 и антагонисты АРК1Ь. Антагонисты ТАЕЬ-1 и антагонисты АРК1Ь, рассматриваемые для применения по изобретению, включают иммуноадгезины рецептора ТАСЕ, а также антитела против рецептора ТАСЕ или рецептора ВК3, которые, предпочтительно, блокируют или понижают соответствующее рецепторное связывание или активацию с помощью лиганда ТАЕЬ-1 и/или лиганда АРК1Ь. Например, иммуноадгезины рецептора ТАСЕ можно применять для лечения ревматоидного артрита или рассеянного склероза. Кроме того, антагонисты ТАЕЬ-1 и антагонисты АРК1Ь, рассматриваемые для применения по изобретению, включают антитела против ТАЕЬ-1 или антитела против АРК1Ь, которые способны блокировать или ослаблять связывание соответствующих лигандов с рецепторами ТАСЬ или ВК3. Кроме того, молекулы антагонистов включают ковалентно модифицированные формы или слитые белки, содержащие ТАСЕ или ВК3. Например, такие антагонисты могут включать пэгированные ТАСЕ или ВК3 и ТАСЕ или ВК3, слитые с гетерологичными последовательностями, такими как эпитопные метки или содержащие лейцин последовательности наподобие застёжки молнии. Необязательно молекула(ы) антагониста(ов), применяемые по этим способам, способны блокировать или нейтрализовать активность как ТАЕЬ-1, так и АРК1Ь, например двойной антагонист, который блокирует или нейтрализует активность как ТАЕЬ-1, так и АРК1Ь. Необязательно молекула(ы) антагониста(ов), применяемые по этим способам, способны блокировать или нейтрализовать активность ТАЕЬ-1, но не АРК1Ь, например, антагонист (такой как ВК3 иммуноадгезин), который блокирует или нейтрализует активность ТАЕЬ-1. Например, ВК3 иммуноадгезин может применяться для лечения аутоиммунного нарушения, такого как волчанка. Способы предполагают применение единственного типа молекулы антагониста или комбинации двух или более типов антагониста.
В другом варианте изобретения охватываются способы применения антагонистов ТАЕЬ-1 для блокирования или нейтрализации взаимодействия между ТАЕЬ-1 и ТАСЕ и/или ВК3. Такие антагонисты могут также блокировать или нейтрализовать взаимодействие между ТАЕЬ-1 и ТАСЕ и/или ВСМА. Например, изобретение включает способ, заключающийся в экспозиции клетки млекопитающих, такой как лейкоцит (предпочтительно, В-клетка), с одним или более антагонистов ТАЕЬ-1 в количестве, эффективном для понижения, нейтрализации или блокирования активности лиганда ТАЕЬ-1. Клетка может
- 5 007984 находиться в клеточной культуре или в организме млекопитающего, например, млекопитающего, страдающего, например, иммунным заболеванием или раком. Таким образом, изобретение включает способ лечения млекопитающего, находящегося в патологическом состоянии, например, страдающим иммунным заболеванием или болеющим раком, заключающийся во введении эффективного количества одного или более антагонистов ТАЬЬ-1 по данному описанию. В конкретных вариантах изобретения иммунное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, такое как артрит или волчанка.
Изобретение также охватывает способы применения антагонистов АРКГЬ для блокирования или нейтрализации взаимодействия между АРКГЬ и ТАСИ. Такие антагонисты могут также блокировать или нейтрализовать взаимодействие между АРКГЬ и ТАС1 и/или ВСМА. Например, изобретение включает способ, заключающийся в экспозиции клетки млекопитающих, такой как лейкоцит (предпочтительно, Вклетка), с одним или более антагонистов АРКГЬ в количестве, эффективно понижающем, нейтрализующем или блокирующем активность лиганда АРКГЬ. Клетка может находиться в клеточной культуре или в организме млекопитающего, например млекопитающего, страдающего, например, иммунным заболеванием или больного раком. Таким образом, изобретение включает способ лечения млекопитающего, находящегося в патологическом состоянии, например страдающим иммунным заболеванием или болеющим раком, заключающийся во введении эффективного количества одного или более антагонистов АРКГЬ по данному описанию.
Изобретение также включает композиции, которые содержат один или более антагонистов ТАТЬ-1 или антагонистов АРКГЬ. Необязательно композиции по изобретению могут включать фармацевтически приемлемые носители или разбавители. Предпочтительно, композиции включают один или более антагонистов ТАЬЬ-1 или антагонистов АРКГЬ в количестве, терапевтически эффективном для лечения патологического состояния или заболевания.
Изобретение также включает пункты о получении и наборах, содержащих один или более антагонистов ТАЬЬ-1 или антагонистов АРКГЬ.
Кроме того, изобретение включает способы применения агонистов ТАСИ или агонистов ВК3, например, для стимуляции или активации рецептора ТАСИ или рецептора ВК3. Такие способы применимы для лечения патологических состояний, характеризующихся или ассоциируемых с недостаточной экспрессией или активностью ТАЬЬ-1 или АРКГЬ, таких как иммунодефицит или рак ( например, с помощью бустер-иммунизации в расчёте на иммунный противораковый ответ). Агонисты ТАСИ или агонисты ВК3 могут представлять собой агонистические антитела против ТАСИ или ВК3. Агонистическая активность таких агонистов ТАСИ или агонистов ВК3 может представлять собой повышение активности нативного лиганда для ТАСИ или ВК3, или активность, такую же или практически такую же как (т.е. мимики) активность нативного лиганда для ТАСИ или ВК3.
Таким образом, изобретение также включает композиции, которые содержат один или более агонистов ТАСИ или агонистов ВК3. Необязательно композиции по изобретению включают фармацевтически приемлемые носители или разбавители. Предпочтительно, композиции включают один или более агонистов ТАСИ или агонистов ВК3 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции сигнальной трансдукции с помощью ТАСИ или ВК3.
Кроме того, изобретение включает пункты о получении и наборах, содержащих один или более агонистов ТАСИ или агонистов ВК3.
Изобретение также включает способы скрининга с целью идентифицировать молекулы-кандидаты соединений, таких как низкомолекулярные соединения, полипептиды или антитела, которые ведут себя как агонисты или антагонисты в отношении взаимодействия между ТАЬЬ-1 и ТАСЕ или ВК3, или в отношении взаимодействия между АРКГЬ и ТАСЬ.
Краткое описание фигур
На фиг. 1А, 1В показана полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность нативного человеческого ТАС1 (8Е0 ГО N0:1) (обратная комплементарная последовательность приведена в 8Е0 ГО N0:2), и его предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 3).
На фиг. 2 показана полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность нативного человеческого ВСМА (8Е0 ГО N0:4) (обратная комплементарная последовательность приведена в 8Е0 ГО N0:5), и его предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 6).
На фиг. 3 показана полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность нативного человеческого ВСМА (8Е0 ГО N0:7) (обратная комплементарная последовательность приведена в 8Е0 ГО N0:8), и его предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 9).
На фиг. 4А, 4В показана полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность нативного человеческого АРКГЬ (8Е0 ГО N0:10) (обратная комплементарная последовательность приведена в 8Е0 ГО N0:11), и его предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0:12).
На фиг. 5А показана полинуклеотидная последовательность (инициирующий и терминирующий кодоны подчёркнуты), кодирующая последовательность нативного человеческого ТАСЕ (8Е0 ГО N0:13), а на фиг. 5В показана его предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0:14).
На фиг. 6А показана полинуклеотидная последовательность (инициирующий и терминирующий кодоны подчёркнуты), кодирующая последовательность нативного человеческого ВК3 (8Е0 ГО N0:15), а
- 6 007984 на фиг. 6В показана его предполагаемая аминокислотная последовательность (8ЕО ГО N0:16).
На фиг. 6С показана полинуклеотидная последовательность (инициирующий и терминирующий кодоны подчёркнуты), кодирующая мышиный ВК3 (8Е0 ГО N0:17), а на фиг. 9А показана его предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0:18).
На фиг. 7 А, 7В показаны примеры методов расчёта % идентичности аминокислотной последовательности, называемой Белок сравнения, с аминокислотной последовательностью, называемой РК0. Для целей по данному описанию последовательность РКО может обозначать последовательности ТАС1, ВСМА, ТАЬЬ-1, ЛРВ1Б. ТАСЕ или ВК3, показанные на фиг. по данному описанию.
На фиг. 8 показан сравнительный анализ первичных структур двух аминокислотных последовательностей рецептора ТАС1, обозначенного ЙТАС1 (265) (8Е0 ГО N0:19), который, как полагают, является вариантом, полученным при сплайсинге, и рецептора ЙТАС1, изображённого также на фиг. 1А, 1В ((8Е0 ГО N0: 3).
На фиг. 9А показан сравнительный анализ первичных структур человеческого (8Е0 ГО N0:16) и мышиного (8Е0 ГО N0:18). Аминокислоты, идентичные в человеческом и мышином ВК3, показаны жирным шрифтом. Консервативные аминокислоты показаны знаком плюс. Область, содержащая четыре цистеиновых остатка, подчёркнута, а расчётная перекрывающая мембрану область подчёркнута двойной чертой. На фиг. 9В показан нозерн-блоттинг ВК3. Множественные нозерн блоты тканей человека (слева) и мыши (справа) (С.'1оп1се11) гибридизуют с мечеными 32Р фрагментами кДНК, соответствующими кодирующей области человеческого или мышиного ВК3. На фиг. 9С показан ПЦР анализ панели человеческой кДНК множественных тканей (С4оп1ес11). Фрагменты кДНК амплифицируют, используя генспецифические праймеры. Дорожки 1-9: 1, РВЬ; 2 покоящиеся 0Ό4+ клетки; 3, активированные 0Ό4+ клетки; 4, покоящиеся 0Ό8+ клетки; 5, активированные 0Ό8+ клетки; 6, покоящиеся 0Ό19+ клетки; 7, активированные 0Ό19+ клетки; 8, лимфатический узел; 9, селезёнка.
На фиг. 10А-10Э представлены результаты проведённого анализа, показывающие, что ВК3 является специфическим рецептором для ТАЕЬ-1, но не для АРК1Ь, и не активирует №-кВ путь, (а) С08 7, трансфецированные при использовании 11ВК3 (1,2) или ТАС1 (3, 4) инкубируют с кондиционированной средой, содержащей АР-ТАЕЬ-1 (1, 3) или АР-Аргй (2, 4). Клетки отмывают, фиксируют и окрашивают на АР активность ίη кйи, (Ь) клетки С087, трансфецированные с помощью ТАЬЬ-1 (1,2) или Арг4 (2, 4), инкубируют с 11ВК3-11Ее (1, 3) или ТАС1- йЕс (2, 4). Клетки отмывают, фиксируют, и связанный рецептор-йЕс белок обнаруживают с помощью биотинилированного антитела козы к человеческому белку с последующим добавлением Су3-стрептавидина. (с) ВК3-йЕс (1,2) или ТАС1-йЕс (3, 4) инкубируют с Е1адТАЬЬ-1 (1, 3) или Е1ад- Арг4 (2, 4). Слитые белки рецептор-Ес, осаждаемые с помощью протеин-Аагарозы, подвергают иммуноблоттингу с антителом против Е1ад. Эквивалентные количества лиганда (средняя панель) или рецептор-Ес (нижняя панель) используют в эксперименте по связыванию, (4) Клетки 293Е Цпуйгодеп) трансфецируют, используя 0.25 ид конструкции ЯЕ-кВ репортёрного гена люциферазы, 25 нг рКЪ-ТК и указанные количества экспрессирующих конструкций, кодирующих йВК3, тВК3, ТАС1 и ВСМА. Активацию №-кВ определяют через 20-24 ч, используя набор ПиаЪЬисИегаке Керойег Аккау (Рготеда).
На фиг. 11А-1Е0 проиллюстрированы результаты анализов, показывающих, что ВК3-Ес эффективен при лечении волчанки. На фиг. 11 А, 11В показано, что протеинурия у мышей Н2ВхН0\У (Е1) блокируется с помощью ВК3-Ес; на фиг. 11С показано, что пролеченные ВК3-Ес животные обладают повышенной выживаемостью; на фиг. 11Ό показано, что у животных, пролеченных ВК3-Ес, наблюдается пониженное содержание антител против 4к (двухнитевой)ДНК.
Подробное описание изобретения
I. Определения
Термины ВК3, полипептид ВК3 или рецептор ВК3 , применяемые в данном описании, охватывают полипептиды ВК3 с нативной последовательностью и ВК3 варианты (определение которых даётся в данном описании ниже). ВК3 представляет собой название, данное тем полипептидам, которые кодируются молекулами нуклеиновых кислот, содержащими полинуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 6, и их варианты или фрагменты, молекулами нуклеиновых кислот, содержащими последовательность, показанную на фиг. 6, и её варианты, а также фрагменты указанной выше последовательности. Полипептиды ВК3 по изобретению можно выделять из различных источников, например из разных типов человеческих тканей или из другого источника, или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами.
Полипептид ВК3 с нативной последовательностью представляет собой полипептид, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный полипептид ВК3. Такие полипептиды ВК3 с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Термин полипептид ВК3 с нативной последовательностью конкретно охватывает природные усечённые или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные вариан
- 7 007984 ты полипептида. Полипептиды ВК3 по изобретению включают полипептид ВК3, содержащий непрерывную последовательность или состоящий из этой последовательности аминокислотных остатков 1-184 на фиг. 6В (8ЕО ГО N0: 16).
Внеклеточный домен (внеклеточная область) или ЕСИ ВК3 относится к форме ВК3 полипептида, которая практически не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно Ε0Ό полипептида ВК3 содержит менее, примерно, 1% таких трансмембранньгх и/или цитоплазматических доменов и, предпочтительно, менее, примерно, 0,5% таких доменов. Понятно, что любой(ые) трансмембранный(ые) домен(ы), идентифицируемый(ые) для полипептидов ВК3 по данному изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, повседневно используемыми в технике для идентификации этого типа гидрофобного домена. Точные границы трансмембранного домена могут меняться, но, наиболее вероятно, не более чем примерно, на 5 аминокислот на каждом конце первоначально идентифицированного домена. Ε0Ό формы ВК3 включают трансмембранные домены, содержащие аминокислоты 1-77 или 2-62 на фиг. 6В.
ВК3 вариант (вариант ВК) обозначает полипептид ВК3, содержащий последовательность, идентичную, по меньшей мере, примерно, на 80% аминокислотной последовательности нативного полноразмерного ВК3 или ВК3 Ε0Ό. Необязательно ВК3 вариант включает единственный богатый цистеином домен. Предпочтительно, такой ВК3 вариант ведёт себя как антагонист или агонист по определению ниже. Такие варианты ВК3 полипептида включают, например, полипептиды ВК3, к которым добавлен один или более аминокислотный остаток или из которого делетирован один или более аминокислотный остаток, на Ν- и/или С-конце, а также в одной или более внутренних областей, полноразмерной аминокислотной последовательности. Также рассматриваются фрагменты ВК3 ЕС.П. Обычно аминокислотная последовательность варианта ВК3 полипептида, по меньшей мере, примерно на 80% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 81% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 82% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 83% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 84% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 85% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 86% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 87% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 88% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 89% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 90% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 91% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 92% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 93% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 94% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 95% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 96% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 97% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 98% идентична, и ещё более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 99% идентична аминокислотной последовательности ВК3 полипептида, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, показанной на фиг. 6 или её определённым фрагментом. Варианты ВК3 полипептидов не охватывают нативную последовательность ВК3 полипептида. Обычно длина вариантов ВК3 полипептида составляет по меньшей мере около 10 аминокислот, часто длина составляет по меньшей мере около 20 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 30 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 40 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 50 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 60 аминокислот, более часто длина составляет, по меньшей мере, около 70 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 80 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 90 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 100 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 150 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 200 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 250 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 300 аминокислот или более.
Термины ТАС1, полипептид ТАС1 или рецептор ТАС1 , применяемые в данном описании, охватывают полипептиды ТАС1 с нативной последовательностью и ТАС1 варианты (определение которых даётся в данном описании ниже). ТАС1 представляет собой название, данное тем полипептидам, которые кодируются молекулами нуклеиновых кислот, содержащими полинуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 1, и их варианты или фрагменты, молекулами нуклеиновых кислот, содержащими последовательность, показанную на фиг. 1, и её варианты, а также фрагменты указанной выше последовательности. Полипептиды ТАС1 по изобретению можно выделять из различных источников, например из разных типов человеческих тканей или из другого источника, или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами.
Полипептид ТАС1 с нативной последовательностью представляет собой полипептид, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный полипептид ТАС1. Такие полипептиды ТАС1 с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Термин полипептид ТАС1 с нативной последовательностью конкретно охватывает природные усечённые или секретирован- 8 007984 ные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты полипептида. Полипептиды ТАС1 по изобретению включают, но без ограничения, полипептиды, описанные νοη Ви1оте с1 а1., см. выше, и в Международной заявке \¥О 98/39361, опубликованной 11 сентября 1998 г., вариант, полученный в результате сплайсинга (обозначенный 11ТАС (265), см выше, и изображённый на фиг. 8 (8ЕО ΙΌ N0: 19), и полипептид ТАС1 содержащий непрерывную последовательность аминокислотных остатков 1-293 на фиг. 1 (8Е0 ΙΌ N0: 3).
Внеклеточный домен (внеклеточная область) или ΕΤΌ ТАС1 относится к форме ТАС1 полипептида, которая практически не содержит трансмембранного и' цитоплазматического доменов. Обычно ЕСЭ полипептида ТАС1 содержит менее примерно 1% таких трансмембранных и/или цитоплазматических доменов и, предпочтительно, менее, примерно, 0,5% таких доменов. Понятно, что любой(ые) трансмембранный(ые) домен(ы), идентифицируемый(ые) для полипептидов ТАС1 по данному изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, повседневно используемыми в технике для идентификации этого типа гидрофобного домена. Точные границы трансмембранного домена могут меняться, но, наиболее вероятно, не более чем, примерно, на 5 аминокислот на каждом конце первоначально идентифицированного домена. ЕСЭ формы ТАС1 включают трансмембранные домены, описанные νοη Ви1оте с1 а1., см. выше, и в Международной заявке \¥О 98/39361.
ТАС1 вариант (вариант ТАС1 ) обозначает полипептид ТАС1, содержащий последовательность, идентичную, по меньшей мере, примерно, на 80% аминокислотной последовательности нативного полноразмерного ТАС1 или ТАС1 ЕСЭ. Предпочтительно такой ТАС1 вариант ведёт себя как ТАЕЬ-1 антагонист или АРК1Е агонист по определению ниже. Такие варианты ТАС1 полипептида включают, например, полипептиды ТАС1, к которым добавлен один или более аминокислотный остаток или из которого делегирован один или более аминокислотный остаток, на Ν- и/или С-конце, а также в одной или более внутренних областей, полноразмерной аминокислотной последовательности. Также рассматриваются фрагменты ТАС1 ЕСЭ. Обычно аминокислотная последовательность варианта ТАС1 полипептида, по меньшей мере, примерно на 80% идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, на 81% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 82% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 83% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 84% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 86% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 87% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 88%) идентична более предпочтительно по меньшей мере примерно на 89%) идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 91% идентична более предпочтительно по меньшей мере примерно на 92% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 93%) идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 94% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% идентична более предпочтительно по меньшей мере примерно на 96% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 97% идентична более предпочтительно по меньшей мере примерно на 98% идентична, и ещё более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности ТАС1 полипептида, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, показанной на фиг. 1 или её определённым фрагментом. Варианты ТАС1 полипептидов не охватывают нативную последовательность ТАС1 полипептида. Обычно длина вариантов ТАС1 полипептида составляет по меньшей мере около 10 аминокислот, часто длина составляет по меньшей мере около 20 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 30 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 40 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 50 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 60 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 70 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 80 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 90 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 100 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 150 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 200 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 250 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 300 аминокислот или более.
Термин ТАСЬ, применяемый в данном описании, относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, состоящую из остатков 1-246 на фиг. 5В, или её фрагменты или варианты, и содержащие единственный богатый цистеином домен. Необязательно такие полипептиды ТАСЬ содержат непрерывную последовательность из остатков 1-246 на фиг. 5В. Необязательно такие полипептиды ТАСЬ кодируются молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, показанную на фиг. 5А. Полипептиды ТАСП по изобретению можно выделять из различных источников, например из разных типов человеческих тканей или из другого источника, или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами.
Полипептид ТАСП с нативной последовательностью представляет собой полипептид, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный полипептид ТА
- 9 007984
СК Такие полипептиды ТАС1к с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Термин ТАС1к определённо исключает полипептиды, называемые в данном описании ТАС1. Полипептид ТАС1к с нативной последовательностью представляет собой природный полипептид. Такие полипептиды ТАС1к с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Полипептид ТАС1к может содержать фрагмент или вариант полипептида, показанного на фиг. 5В и имеющего последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична последовательности, показанной на фиг. 5В, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 81% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 82% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 83% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 84% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 86% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 87% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 88% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 89% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 91% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 92% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 93% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 94% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 96% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 97% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 98% идентична, и ещё более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности ТАС1 полипептида, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, показанной на фиг. 5А или её определённым фрагментом. Предпочтительно такой ТАС1к вариант ведёт себя как ТАТЬ-1 антагонист или АРКГЬ антагонист по определению ниже. Такие варианты ТАСЕ полипептида включают, например, полипептиды ТАСЕ. к которым добавлен один или более аминокислотный остаток или из которого делегирован один или более аминокислотный остаток, на Ν- и/или С-конце, а также в одной или более внутренних областей, аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 5В.
Внеклеточный домен (внеклеточная область) или ЕСТ ТАСЕ относится к форме ТАСЕ полипептида, которая практически не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно ЕСЭ полипептида ТАСЕ содержит менее примерно 1% таких трансмембранных и/или цитоплазматических доменов и предпочтительно менее примерно 0,5% таких доменов. Понятно, что любой(ые) трансмембранный(ые) домен(ы), идентифицируемый(ые) для полипептидов ТАСЕ по данному изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, повседневно используемыми в технике для идентификации этого типа гидрофобного домена. Точные границы трансмембранного домена могут меняться, но, наиболее вероятно, не более чем, примерно, на 5 аминокислот на каждом конце первоначально идентифицированного домена. ЕСЭ формы ТАСЕ включают полипептиды, содержащие аминокислотные остатки 1-119 на фиг. 5В и, необязательно, непрерывную последовательность (соседних) аминокислотных остатков 1-119 на фиг. 5В.
Термины ВСМА, полипептид ВСМА или рецептор ВСМА, применяемые в данном описании, охватывают полипептиды ВСМА с нативной последовательностью и ВСМА варианты (определение которых даётся в данном описании ниже). ВСМА представляет собой название, данное тем полипептидам, которые кодируются молекулами нуклеиновых кислот, содержащими полинуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 2, и их варианты или фрагменты, молекулами нуклеиновых кислот, содержащими последовательность, показанную на фиг. 2, и её варианты, а также фрагменты указанной выше последовательности. Полипептиды ВСМА по изобретению можно выделять из различных источников, например из разных типов человеческих тканей или из другого источника, или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами.
Полипептид ВСМА с нативной последовательностью представляет собой полипептид, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный полипептид ВСМА. Такие полипептиды ВСМА с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Термин полипептид ВСМА с нативной последовательностью конкретно охватывает природные усечённые или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты полипептида. Полипептиды ВСМА по изобретению включают, но без ограничения, полипептиды, описанные ЬааЫ е! а1., ЕМВО 1., 11:3897-3904 (1992); ЬааЫ е! а1., Νιιοίοίο Λοίάκ Кек., 22:11471154 (1994); Сгак е! а1., Ιηΐ. 1ттиио1оду, 7:1093-1106 (1995); Мабгу е! а1., Ιη! 1ттиио1оду, 10:1693-1702 (1998); и полипептид ВСМА, содержащий непрерывную последовательность аминокислотных остатков 1-184 на фиг. 2 (8Ер ΙΌ ΝΟ: 6).
Внеклеточный домен (внеклеточная область) или Εί,Ό ВСМА относится к форме ВСМА полипептида, которая практически не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно ЕСЭ полипептида ВСМА содержит менее примерно 1% таких трансмембранных и/или цитоплазмати
- 10 007984 ческих доменов и предпочтительно менее примерно 0,5% таких доменов. Понятно, что любой(ые) трансмембранный(ые) домен(ы), идентифицируемый(ые) для полипептидов ВСМА по данному изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, повседневно используемыми в технике для идентификации этого типа гидрофобного домена. Точные границы трансмембранного домена могут меняться, но, наиболее вероятно, не более чем, примерно, на 5 аминокислот на каждом конце первоначально идентифицированного домена. ЕСП формы ВСМА включают трансмембранные домены, описанные ЬааЫ е! а1, ЕМВО 1.. 11:3897-3904 (1992); ЬааЫ е! а1., Ыис1е1с АсФз Вез., 22:1147 - 1154 (1994); Стаз е! а1., Ιηΐ. 1штипо1оду, 7:1093-1106 (1995); Мабгу е! а1., Ιηΐ. 1ттипо1оду, 10:1693-1702 (1998).
ВСМА вариант (вариант ВСМА ) обозначает полипептид ВСМА, содержащий последовательность, идентичную по меньшей мере примерно, на 80% аминокислотной последовательности нативного ВСМА или ВСМА ЕСЬ. Предпочтительно такой ВСМА вариант ведёт себя как ТАТЬ-1 антагонист или АРКЬЬ антагонист по определению ниже.
Такие варианты ВСМА полипептида включают, например, полипептиды ВСМА, к которым добавлен один или более аминокислотный остаток или из которого делетирован один или более аминокислотный остаток, на Ν- и/или С-конце, а также в одной или более внутренних областей, полноразмерной аминокислотной последовательности. Также рассматриваются фрагменты ВСМА ЕСО. Обычно аминокислотная последовательность варианта ВСМА полипептида по меньшей мере примерно на 80%) идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 81%) идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 82% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 83% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 84% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 86% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 87% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 88% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 89%) идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 91% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 92% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 93% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 94% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 96% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 97% идентична, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 98% идентична, и ещё более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности ВСМА полипептида, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, показанной на фиг. 2 или её определённым фрагментом. Варианты ВСМА полипептидов не охватывают нативную последовательность ВСМА полипептида. Обычно длина вариантов ВСМА полипептида составляет по меньшей мере около 10 аминокислот, часто длина составляет по меньшей мере около 20 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 30 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 40 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 50 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 60 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 70 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 80 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 90 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 100 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 150 аминокислот, более часто длина составляет по меньшей мере около 200 аминокислот, более часто длина составляет, по меньшей мере, около 250 аминокислот, более часто длина составляет, по меньшей мере, около 300 аминокислот или более.
Термины ТАЬЬ-1 или полипептид ТАЬЬ-1, применяемые в данном описании, охватывают полипептиды ТАЬЬ-1 с нативной последовательностью и ТАЬЬ-1 варианты. ТАЬЬ-1 представляет собой название, данное тем полипептидам, которые кодируются молекулами нуклеиновых кислот, содержащими полинуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 3, и их варианты, молекулами нуклеиновых кислот, содержащими последовательность, показанную на фиг. 3, и её варианты, а также фрагменты указанной выше последовательности, которые проявляют биологическую активность ТАЬЬ-1 с нативной последовательностью. Варианты ТАЬЬ-1 имеют последовательность, идентичную предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и, ещё более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичную нативной последовательности ТАЬЬ-1 полипептида, показанной на фиг. 3. Полипептид ТАЬЬ-1 с нативной последовательностью представляет собой полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный полипептид ТАЬЬ-1. Такие полипептиды ТАЬЬ-1 с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Термин полипептид ТАЬЬ-1 с нативной последовательностью конкретно охватывает природные усечённые или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты полипептида. Термин ТАЬЬ-1 включает такие полипептиды, описанные в 8йи е! а1., СепВапк, Ассеззюп №. АЕ136293; Международной заявке АО98/18921, опубликованной 7 мая 1998 г.; Европейской патентной заявке 869180, опубликованной 25 июня 1998 г.; Международных заяв
- 11 007984 ках: ν099/12964, опубликованной 18 марта 1999 г. и XVО 99/33980, опубликованной 8 июля 1999 г.; Мооге е! а1., см. выше; 8сйпе1бег е! а1., см. выше; и Мцкйорабйуау е! а1., см. выше.
Термины АРКТБ или полипептид АРК1Ь , применяемые в данном описании, охватывают полипептиды АРШЬ с нативной последовательностью и АРК1Ь варианты. АРК1Ь представляет собой название, данное тем полипептидам, которые кодируются молекулами нуклеиновых кислот, содержащими полинуклеотидные последовательности, показанные на фиг. 4 А, 4В, и их варианты, молекулами нуклеиновых кислот, содержащими последовательность, показанную на фиг. 4 А, 4В, и её варианты, а также фрагменты указанной выше последовательности, которые проявляют биологическую активность АРК1Ь с нативной последовательностью. Варианты АРРТЬ имеют последовательность, идентичную, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и, ещё более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%) идентичную нативной последовательности АРК1Ь полипептида, показанной на фиг. 4 А, 4В. Полипептид АРКТБ с нативной последовательностью представляет собой полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный полипептид АРК1Ь. Такие полипептиды АРКТБ с нативной последовательностью можно выделять из природных источников или получать методами рекомбинантной ДНК и/или синтетическими методами. Термин полипептид АРК1Ь с нативной последовательностью конкретно охватывает природные усечённые или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты полипептида. Термин АРИЕ включает такие полипептиды, описанные в Найпе е! а1., 1. Ехр. Меб., 188:1185-1190 (1998); ОепВапк Ассекмоп Νο. АЕ046888; Международная заявка νθ 99/00518, опубликованная 7 января 1999 г.; νθ 99/35170, опубликованная 15 июля 1999 г.; νθ 99/12965, опубликованная 18 марта 1999 г.; νθ 99/33980,опубликованная 8 июля 1999 г.; νθ 97/33902, опубликованная 18 сентября 1997 г.; νθ 99/11791, опубликованная 11 марта 1999 г.; Европейская заявка ЕР 911633, опубликованная 28 марта 1999 г.; и Международная заявка νθ 99/50416, опубликованная 7 октября 1999 г.
Жёсткость условий реакций гибридизации легко определяет специалист в данной области техники и, как правило, рассчитывается эмпирически в зависимости от длины зонда, температуры отмывания и концентрации соли. Как правило, более длинный зонд требует для соответствующей гибридизации более высоких температур, тогда как в случае более коротких зондов нужны более низкие температуры. Гибридизация обычно зависит от способности денатурированной ДНК повторно гибридизоваться, когда комплементарные нити присутствуют в окружающей среде при температуре, более низкой, чем их температура плавления. Чем выше степень заданной идентичности между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем при более высокой температуре можно вести реакцию. Из этого следует, что при более высоких температурах условия реакции имеют тенденцию быть более жёсткими, тогда как более низкие температуры смягчают их. Дополнительные подробности и объяснение жёсткости условий реакций гибридизации см. в Ли5иЬе1 е! а1., Сиггеп! Ргойсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, νίΚν 1п1ег8С1епсе РиЫБйегк, (1995).
Жёсткие условия или очень жёсткие условия по данному описанию определяются тем, что (1) для отмывания используют растворы с низкой ионной силой при высокой температуре, 0,015М хлористого натрия/0,0015М цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°С;
(2) применение при гибридизации денатурирующего агента, 50 об.% формамида с 0,1% альбумина бычьей сыворотки/0,1% Еюо11/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрийфосфатного буфера при рН 6,5 с 750 мМ хлористого натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) применение 50% формамида, 5х88С (0,75 М №С1, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5х раствора Денхардта, ДНК гомогенизированной ультразвуком спермы (молоки) осетровых (50 мкг/мл), 0,1% 8Э8 и 10% сульфата декстрана при 42°С с отмыванием при 42°С в 0,2х88С (хлористый натрий/цитрат натрия) и 50%) формамиде при 55% с последующим отмыванием в очень жёстких условиях, а именно 0.1х88С. содержащем ЕИТА (ЭДТА) при 55°С.
Умеренно-жёсткие условия определяются, как описано в ЗашЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогайгу Мапиа1 №\ν Уогк: Со1б 8ргшд НагЬог Рге§8, 1989, и включают применение растворов для отмывания и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и % 8Ό8), менее жёстких, чем описанные выше. Примером умеренно-жёстких условий является инкубация в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем: 20% формамида, 5х88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрата), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5х раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 мг/мл ДНК разрушенной спермы осетровых с последующим отмыванием фильтров в 1х88С, примерно, при 37-50°С. Опытный специалист в данной области техники знает, каким образом скорректировать температуру, ионную силу и т.д., чтобы соответствовать таким факторам, как длина зонда и т.п.
Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она между нею и последовательностью другой нуклеиновой кислоты возникает функциональная связь. Например, ДНК, кодирующая препоследовательность или секреторный лидерный пептид, функционально связана с ДНК, кодирующей полипептид, если она экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию
- 12 007984 последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он позиционирован таким образом, чтобы способствовать трансляции. Как правило, функционально связана означает, что связываемые последовательности ДНК являются смежными, а, в случае секреторного лидерного пептида являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако, энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется лигированием по подходящим сайтам рестрикции. Если такие сайты не существуют, в соответствии с обычной практикой используют олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
Термины аминокислота и аминокислоты относятся ко всем природным Ь-альфа-аминокислотам. Это определение подразумевает, что охватываются норлейцин, орнитин и гомоцистеин. Аминокислоты идентифицируют, используя либо однобуквенные, либо трёхбуквенные обозначения:
Ακρ Ό аспарагиновая кислота Не Ι изолейцин
ТЬг Т треонин Ьеи Б лейцин
8ег 8 серии Туг Υ тирозин
С1и Е глутаминовая кислота РЬе Е фенилаланин
Рго Р пролин Ηίκ Η гистидин
С1у Ο глицин Бук К лизин
ΑΗ А аланин Αιν В аргинин
Сук С цистеин Тгр А триптофан
Vа1 V валин С1п Ω глутамин
Ме! М метионин Ακιι Ν аспарагин
В списке последовательностей и в подписях к фигурам для отнесения и идентификации двух или более аминокислот или нуклеотидов к данному положению в последовательности могут использоваться некоторые другие однобуквенные или трёхбуквенные обозначения.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности (последовательность идентична на столько-то процентов (%)) по отношению к полипептидным последовательностям лиганда или рецептора по данному описанию определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в предполагаемой последовательности (кандидате), которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности такого лиганда или рецептора, идентифицируемой по данному описанию, после совмещения последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимальной идентичности последовательностей, при этом любые консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательностей. Совмещения (выравнивания) с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно достичь различными способами, которые известны в технике, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программы ВЬА8Т, ВЬА8Т-2, ΑΕΙΟΝ, ΑΕΙΟΝ-2 или Медайдп (ΌΝΑ8ΤΑΚ). Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для определения (измерения) совмещения, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального совмещения по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако, для целей по данному описанию величины % идентичности аминокислотной последовательности получают как описано ниже, используя для сравнения последовательностей компьютерную программу ΑΕΙΟΝ-2, полная исходная программа для программы ΑΕΙΟΝ-2 дана в нижеприведённой таблице.
Компьютерная программа ΑΕΙΟΝ-2 для сравнения последовательностей создана Сепе1ее11. 1пс., и исходная программа хранится в υ.8. СорупдЫ ОГПсе, АакЫпд1оп Ό.Ο., 20559, где она зарегистрирована под и.8. СорупдЫ Кед1к1га1юп Νο. ТХИ510087. Доступ к программе ΑΕΙΟΝ-2 через Сепе1еск Шс. , 8ои111 8ап Егапсшсо, СайГотша или исходная программа, см. ниже, может быть транслирована в эту программу. Программу ΑΕΙΟΝ-2 следует транслировать для применения в операционной системе ϋΝΙΧ, предпочтительно, цифровой υΝΙΧ ν4.0Ό. Все параметры для сравнения последовательностей установлены с помощью программы ΑΕΙΟΝ-2 и не меняются.
- 13 007984
Исходная программа /* *
* С-С увеличивается от 12 до 15 * Ζ среднее из Ер * В среднее из ΝΟ * совпадение со стоп _М; стоп-стоп = 0; 1 (джокер) совпадение = 0 */ * беПпе _М -8 /*величина совпадений со стоп*/ _<1ау[26][26] = { /* ΑΒ€ϋΕΡ(3ΗΙΙΚΙ,ΜΝΟΡ(2Κ8ΤυνλνΧΥΖ*/ /* А */ { 2,0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, О, Μ, 1, 0,-2, 1, 1, 0, 0,-6, 0,-3,0}, /* В */ { 0, 3.-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2,0, 0,-3,-2,2, Μ,-1, I, 0,0, 0, 0,-2,-5, 0,-3,1}, /* С »/ {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4, М,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5}, /* ϋ */ { 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2,0, 0,-4,-3, 2,_М,-1, 2,-1, О, 0, 0,-2,-7, 0,-4,2}, /* Е */ { 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_М,-1, 2,-1,0, 0, 0,-2,-7, 0,-4,3}, /* р */ {^..5.-4,.6,-5, 9,-5,-2, 1. 0,-5, 2,0,-4, М,-5,-5,-4,-3,-3.0,-1, 0. О, 7,-5}, .
1*0*1 { 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_М,-1,-1,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, 0}, /♦ Η *! {-1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2, М, О, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, О, 0, 2}, /* I */ {-1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2,2,-2,_М,-2,-2,-2,-1, О, 0, 4,-5, 0,-1,-2},
1*1*1 { О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, 0,_М, О, О, О, О, О, О, О, О, О, 0, 0}, /* К */ {-1, 0,-5, О, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0,1,_М,-1, 1, 3, О, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0}, /* Ь */ {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3,.6, 4,-3,_М,-3,-2,-3,-3,-1, 0, 2,-2, 0,-1,-2}.
/* М */ {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, О, 0, 4, 6,-2, Μ,-2,-1, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1}.
I* N */ { 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,14,-1, 1, О, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1}, /* о */ {_м,_м, м,_м,_м,_м,_м,_м,_м,_м, м,_м,_м,_м, о,_м,_м,_м,_м,_м,_м,_м,_м,_м,_м:,_м}, /* Р */ { 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1,-3,-2,-1,_М, 6, О, О, 1, О, 0,-1,-6, 0,-5, 0}, /* <2 */ { 0,1,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1,-2,-1, 1, М, 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3}, )* К */ {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, О, 0,_М, О, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0},
1*8*1 { 1, О, О, 0, 0,-3, 1,-1,-1, 0, 0,-3,-2, 1, М, 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0},
I* Т */ { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0,0, 0,-1,-1, 0,'М, 0,-1,-1, 1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0}, /* и */ { О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, 0,_М, О, О, О, О, О, О, О, О, О, 0,0}, /* V */ { 0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_М,-1,-2,-2,-1, О, 0, 4,-6, 0,-2,-2}, /* XV */ {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_М,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6}, /‘ X */ { О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, О, 0,_М, О, О, О, О, О, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* Υ */ {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-1,-2,-2, М,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4}.
1*1*1 { 0,1,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1,~М, О, 3, О, О, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} };
- 14 007984 /* */ #1Пс1иде. <5йНо.Ь> #шс!иНе <с!уре.Ь>
МеГше МАХЖР #де£те МАХСАР #де£ше ΙΜΡ5 ΖΜςΗηΡ МХ #<1е&пе ϋΜΑ,Τ #4ебпе ΏΜΙ8 #<1еГше ΏΙΝ50 #йебпе ϋΙΝδΙ #Я<»Япе ΡΙΝ80 #деГше ΡΙΝ81
1024
0 /» л^иотйяе ω рииНге 84» 148“ **““ *** *' ; “й£г.йй™»- ·' /* уа1ие о£ такЬшб Ьааеа ♦/ /* репаНу Ьг ппатаЮЬед Ьааеа ♦/ /* репаКу £ог а бар */ /* репаНу рег Ьаае */ /* репаНу /ог а бар */ /* репаНу рег геак/ие */ δίΠΚί1ШР { кЬог! ιΐϊΐδΐβηείΐ аЬог/ };
η[ΜΑΧΐΜίΤ х[МАХ/МР];
ι* п( !тп (пея £ог Не1у) */ / ’ ν---0 - ’ /*Ъааепо. о£дор таедх / /* НшНа зед ίο 2* 16 -1 ♦/ δίπιεί Лае { ίηί 1опе δίιοεί δίπιεί дор };
зсоге; ο/Γδβί; щпр; ίρ;
/* зсоге а11аз1дор */ /* о&е( о£ ргеу Моск */ /♦ сипел! дор тбех */ /* 1ΐ$ί οίϊιηρδ */ δίπιεί рай { ϊηί δΒοιί ίηί };
скат сЬаг сЬаг сЬаг ίηί ίηί ίηί ίηί ίηί ίηί ίηί ίηί ίηί 1опб δίπιεί «Нац δίπιεί ра(к сЬаг сЬаг /♦ шипЬег о£ 1еабшб арасез */ $рс* пПМРЗГ,/* айеоГдор/еар) */ хЦМРЗ]; /* 1ос οίдор (1аз1 е1ет ЬеГоге дар) / *об1е; *патех(2]; *ргое; *δβςχ[2]; бтах; бтахО; бла; сибдарз; дарх, бару; 1еп0,1ел1; пбарх, пбЧ’У: ялах;
♦хЬт; оЙзе!;
*бх; РРСЧ;
/* оифис /Не пате ♦/ /* зец патеа: ^еСаедаО */ /* ргоб пяте £ог еп таб8 */ /* 5едз: деиецзО /♦ Ьез! Лае: ηννΟ ♦/ /♦ йпа1 Лае */ /♦ вес Ибпа: татО */ /* зе! И репаНгте епб еаР5 */ /* 1о£а1 бара т аеда */ /* зед 1епа ♦/ /* ЮСа1 аке о£ вара */ /* тах асоге: η\νθ */ /* Ьйпар /ог шайНппе */ /♦ сипел! о£Ье! шдор /Яе */ /* Ьо1бз <Надопа1а */ /♦ Ьо1Л рай. /ог аеда */ *саНосО, *таПосО, *ш<1ех0, *з(гсру0;
*весаедО. *е_саНос0;
- 15 007984 /* КееШетап-АУипзсЬ аЦ£птеп1 ргодташ ♦
* иза^е; рго£8 Яе1 Яе2 * «йеге Яе1 апй Яе2 аге Кто бла ог Кто рго(еш зедиепсез.
* ТЬе зедиепсез сап Ье ίη иррег- ог кптег-сазе ап тау сопГаш ашЬищпу * Апу 1шез Ье^шпиц; ууЙЬ ог'<'аге чрюгеб * Мах 61е 1еп§Л к 65535 (1йш1е<1 Ьу ипзц>пе<1 зЬогГ х ίη Йе рпр $«гисГ) * А зедиепсе «ЙЬ 1/3 ог тоге οίίΒ е1етеп1з АССТи ίβ аззитеб ю Ье ϋΝΑ * Оигри( ϊ$ т 1Ье Яе *аН£п.ои( *
* ТЬе ргодгят тау сгеа(е а йпр Йе ϊπ /{тр ίο ЬоМ ίηίο аЬоиГ (гаоеЬаск, * Оп^та! уегзюп άβνείορβά ипбег Β8ϋ 4.3 оп а уах 8650 */ #шс1и<1е пзу.Ь” #тс1иде дау-.Ь
з1акс }; 4Ьуа1(26] = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0.3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
зГабс _рЬуа1[2б] = { 1, 2[(1 < <(Ό'-Ά'))|(1< <('Ν'-Ά')), 4, 8, 16, 32,64, 128, 256, 0х№НФЖ КСЮ, 1 < <11, К <12, 1<<13, 1<<14, 1< <15, 1<<16, 1 < < 17, 1< <18,1< <19, 1<<20, 1 < <21, 1<<22, 1 < <23, 1<<24, 1<<25|(1<<('Е'-’А'))|(1<<('Ц’-'А'))
таш(ас, ау) Π13ΙΤ1 ίηί ас;
сЬаг *ау[ ];
{ рго£ = ау[0]; 1Г(ас!=3){ фппЙ<8С<1егг,иза£е: %з Ше1 Яе2\п’, ргое); фппЩзИегг.’угЬеге Яе1 апй Яе2 аге кто Лва ог ίνο ргогет зециепсез .Кп); фгтЩзйегг, ТЬе зедиепсез сап Ье ίη иррег- ог 1о*уег-сазе\п); фпнЯзЫегг/Апу 1тез Ье{рпшпз νίΛ ог ’ < ’ аге щпогейХп’); 1рппЙ(5Йегг,Оифиг ίβ ίη Йе Яе \а1щп.ои1\\п’);
βχΐί(1);
патех[0] — ау[1);
патсх[1] = ау(2];
зедх[0] = £еГзед(патех[0], &1еп0);
зецх[1] «= £е1зед(патех[1], &1еп1);
хЬт = (<1па)? _4Ьуа1: _рЪуа1;
епД^арз =0; /* 1 ίο репаНхе епД^арз */ оЯе = 'аНдп.ои!’'; /* οιιίρΰί Яе ·/
ηνθ; геабрпрзО; /* 611 ίη Ле таГпх, %а 1Ье роззМе ]трз */ /* (Ье асШа1 рпрз */
ρπηίΟ; /* ρπηί з(а(з, аНептеп! */
с1еапир(0); /* ипНпкапу (тр Яез */
}
- 16 007984 /* до СЬе айдптди, гешт ЪеЯ зсоге: ташО * дна: так» шРйсЬапд &ηίώ, ΡΝΑ5, 80,1382-1386,1983 * рго: РАМ 250 уа1иеа * иЪед зсогез аге едой, ν/е ргеГег пйзшаСсЬез со апу до, ргейгг * а ηον до ίο ехсепдшя ап оплоте до, апд ргеГег а до ίη зедх * (о а до ίη $ες у.
*/ η·»0 ηνν <
сЬаг *ρ*· *ру; /* $еф апйрЬге */
ίηί *пде!у, *де!у; /* кеер паск οί <Ыу ♦/
ίηί пдек, дек; /* кеер Сгаск οί дек ♦/
ίηί ♦Стр; /♦ Гог зигаррцщ го«Ю, τοινί ♦/
ϊηί ппз; /* зсоге Гог еасЬ Суре */
ίηί тзО, Ш81; /* шзегйоп репа1де$ */
ге&&ег ϊά; /* <Да^опа1 шдех */
гед&ег ч: /*]тр шйех*/
Γεςκίβτ *со10, *со!1; /♦ зсоге Гог сигг, 1азС Γο\ν */
Γ6£ΐ£ίβΓ хх, уу; /♦ тдех ίηίο зедз ♦/
άχ = (зСгисС <Па§ *)8_са11ос(’1о ДО дйДО, 1еп0+1еп1+1,5ίζεοί($ίτύ<1 дса^)); пде1у = (ϊηί *)§_са11ос(“Со до пде1у, 1еп1+1, 5ίζεοί(ϊηί));
де!у = (ίηί *)£_са11ос(Со ДО де1у, 1еп1 +1,звеоГ(шС)); соЮ = (ίηί *)Е_са11ос(*1о ДО соЮ, 1еп1 +1, айеоЦш!)); со11 = (ίηί *)й_са11ос(Чо ДО соИ , 1еп1 +1, ϊΐζεοΓ(ίηί)); шзО = (дпа)? ϋΙΝ50 : РШ50;
шз1 = (дпа)? ϋΙΝ81: ΡΙΝ81;
атах = -10000;
ίί (епддоз) {
Гог <со10[0] = де!у(0] = -тзО, уу = 1; уу < = 1еп1; уу+ +) { соЮ[уу] = <3е1у(уу] ·= со10[уу-1] - шз1; ш1е1у[уу] = уу;
} соЮ[0] = 0; /* ЧУаСвппап Ви11 МаСЬ ВЫ 84 */ }
е!зе
Гог (уу = 1; уу < = 1еп1; уу++) <Ыу[уу] = -шаО; .
/♦ Й11 ш шассЬ. шаСпх */
Гог (рх = 5βςχ[Ο], хх = 1; хх < = 1еп0; рх+ +, хх+ +) { /* пийайге йгзС епсгу ίη со!
·/ ίί (епддо5) { ίί(χχ== 1) со!1[0] = дек = -(тз0+ш51);
е]$е со!1[0] = дек = соЮ[О] - шз1; пдек = хх;
} е1ае{ со11[0] = 0; дек = -тзО; пдек = О;
}
- 17 007984 • · .ηντ Гог (ру = 5ефс[1], уу = 1; УУ < = 1еп1; ру++, уу++) { тй = со10[уу-1];
ίί (дпа) тй += (хЬт[*рх-'А,]&хЬт[*ру-,А'])? ϋΜΑΤ : ϋΜΚ;
еке тй + = _дау[*рх-’А*][*ру-’А'];
/♦ ирйаГе репаку Гог де1 ш х $ед;
* йуог ηβνν йе1 ονβτ опдопд <1е1 * 1£Поте МАХОАР ίΓ ινβΐβΗίΪΒ^ епддарз */
ИДепддарз | ] п4е1у[уу] < МАХОАР) { ίΓ (соЮ[уу] ~ йвО > = йе!у[уу]) { де1у[уу] = со10[уу] - (ηβΟ+πβΙ): пде!у[уу] = 1;
} еке { де!у[уу] -= ΐηδΐ; пде!у(уу]++;
} } еке {
1Г(соЮ[уу] - (пв0+т$1) > — де!у[уу]) { де1у[уу] = соКЦуу] - (ΐη8θ+ίη51)ζ пде!у[уу) - 1;
} еке пде1у[уу]+4·;
} /* ирдасе репаку &>г де1 ΐη у 8βς;
* &νοΓ печг де1 ονβτ опяопя де!
*/ ’ ’ ίΓ (епддарз 11 пдек < МАХОАР) { ίΓ (со!1[уу-1] - ϊηδΟ > = дек) { дек = со!1[уу-1] - (Ш80+Ш41);
ηάεΐχ = 1;
} еке { йе1х-= πυΐ; пдек++;
} } еке { ίΓ (со11[уу-1] - (ίηδΟ+ίηδΙ) > = дек) { дек = со11(уу-1] - (пв0+ш81); .
пдек = 1;
} еке · пдек++;
} /* рюк дае тахнпит зсоге; ^е'ге (ауогшд * тй ονβτ апу де1 апд дек ονβτ дЫу */
- 18 007984
...пте
И—хх-уу + 1еа1-1;
ί£(πώ >= <Ых&&1Ш5 > = беЭДуу]) соЩуу] “ шв;
еке К (йе1х > = йе1у[уу]) { соЩуу] *= (Их; У - ФфсОД'тр; ’ ΐΓ ((ЬЦИЦрлЦО] && (Шла 11 (пбе1х > = ΜΑΧΙΜΡ &&хх > <1х[И].]р.х{У1+МХ) 11 тк > άχ[ί(Ι].3θθΓβ+ΟΙΝ80)) { 4х[Щ.упф++;
И (+ +У > = ΜΑΧΙΜΡ) { шгй»тт«АгЛ· ’’* 9
У = άχ[ϊ<1].ϊ.)πιρ = 0; бхр<1].0Й5еС = о£ЬеС; о£ЬеС += 5Йео£(5Сп1сС рпр) + айеоССойаес);
} <1х[к1].)р.п[У] = ηάβΐχ; <к[«П 6р.х[у] = хх; <1х[кЦ.асоге «= άβΐχ;
} еке{ со11(уу1 = <Ну[уу]; У = Лфб].утр;
ί£(άχ[ί<Ι].1ρ.η[0] && (!бпа 11 (пбеЭДуу] > = ΜΑΧΙΜΡ &&хх > йхИУр.хЩ+МХ) 11 тк > άχβά].βεοκ+ϋΙΝ80)) { <1х0^.утр++;
ί£ (++у > = ΜΑΧΙΜΡ) { ν/π№ρΐφ$(ϊφ; ц = ЛхСмЦ.угар = 0; ФсИ-ойаес = ойаес; ойзеС += ааеоДаЬпхсНтр) + ейео€(о№е0;
} άφά] Ур.л[У] = -пбе1у[уу); йх[И)4р.хЦЙ « хх;
ί£(хх == 1ео0 && уу < 1еи1) { /* 1а«со1 ·/
ΪΓ (елй§ара) со11[уу] -= таО+Ш51*(1еп1-уу); «£(со1Цуу] > стах) { атах = со11[уу];
4тах — к1;
}
ΪΓ (ео<1£ар$ &&. хх < 1еп0) со11(уу-1] -= ша0+та1*(1еп0-хх);
И (соЩуу-1] > атах) { атах = со11(уу-1];
4тах = ΐά;
} стр — соЮ; соЮ = со!1; со11 = Стр;
} (νοΐ<1) &ее((сЬаг *)п<1е1у); (νοίά) &ее((с!шг *)<Иу); (той) £гее((сЬаг *)соЮ); (νοΜ) (гее((сЪаг *)со!1);
- 19 007984 /* *
* ρπηίΟ — оо1у гоийпе νίβϊΜβ ои131бе ΰώ тоби1е *
* йа1ю:
* ДОтМО — Ьгасе ЪаскЬеЛ рабг, сош( таСсЬез: ρπηίΟ * рг_а1|ртО — рпШ аН£птеп( οί безспЬеб ш аггау р[ ]: рпп(0 * битрЫоскО — битр а Ыоск οί 1шез νηΐΗ пшпЬегз, згагз: ргаНгпО * тшкО — ри£ ои£ а питЬег 1ше: битрЫоскО * рибтеО — рШ ои1 а Ипе (пате, [пшп], $βς, [пит]): бшпрЫоскО * «аг$О - -рл а 1те οί $θι$: битрЫоскО * 5(прпате0 - $(пр апу рай апб ргебх (гот а зецпате ♦/ #шс1ибе тУ.Ь’ #бе/ше 8РС 3 #беГшеР_Ы№ 256 Мебпе Р_5РС 3 /* пзахшшт оифи1 Пае */ /* зрасе Ье№ееп пате ог пит апб зед */ ех!егп _бау[2б][26]; ϊηί о1еп;
НЬЕ *ίχ;
/♦ зы оифиг Ппе 1еп£(Ь ♦/ /* ои(рШ Йе */ рглиО {
ϊηί 1х, 1у, бгз^ар, 1аз1£ар; /* оуейар */ ρηηί ίί ((£х = (ореп(ойе, »’)) == 0) { {рппЙ(Ябегг,%8: сапЧтойе %з\п’, рго£, ойе); с1еапир(1);
} фгшй[£х, <&51 зедиепсе: %з (1еп£<Ь = %б)\п, патех[0], 1еп0); ίρπη£ί(ίχ, <зесопб зециепсс: %з (1еп£(Ь — %б)\п, патех[1], 1еа1); о1еп = 60; 4
1х = 1еп0;
1у = 1еп1;
Йт^ар = 1аз1§ар = О;
ϊί (бтах < 1еп1 -1) { /♦ 1еабт£ еар ίη х */ рр[0].зрс = бгОДар = 1еп1 - бтах - 1; 1у -= рр{0].8рс;
} екеΐί(бтах > 1еп1 - 1) { /*Ιββάϊηβ£арту*/ рр[1].зрс = Йгз1еар = бтах - (1еп1 - 1); 1х -= рр(1].зрс;
} ίί (бтахО < 1еп0 - 1) { /* ββΠίηβ 84? ® х */
1аз1£ар = 1ео0 - бтахО -1;
1х -= 1азС£ар;
} еке ίί (бтахО > 1епО - 1) { /* йаШвд £ар ту*/ 1азС£ар = бтахО - (1еп0 ~ 1); 1у -= 1аз^ар;
}
8еста1(1х, 1у, &одар, кэддо);
ргаНепО;
}
- 20 007984 /* * Пасе Ьаск <Ье Ьей раШ, сошИ шаГсЬез ♦/ йайс
ВейпабЩ 1у, бгйеар, 1айрр) ιηΐ 1х, 1у;
ϊηί бгйеар, 1айеар;
ίηί скат ДоиЫе шп, Ю, И, εΐζΟ, βίχΐ; οαίχ[32];
ДоиЫе геехйег °θ·а^· гедк&г сЬаг *Ρθ, *РЪ /· Ш1а1 ша1сЬе5, всоге ·/ , ю = Ϊ1 = 8ΐζθ = 8Ϊζ1 = 0; ρθ = 5ецх[0] + ρρΐΐ]·5!*0’ ρΐ = 8ефс[1] + ррф].врс; п0 = рр[П-!фс + 1;
п1 = рр[0].5рс + 1;
шп = 0;
<ЬИе ( *ρθ && *Р1) ( !£($ίζθ) { р1++; п1++; я±0-;
} г е!хе ΐΓ (εΐζΐ) { р0++; п0++;
5ΐζ1~;
}. { е!§е {
И (хЬт[*рО-' А']&хЬт[*р1-' А'1)
К(пО++ ““ ррЮЗ-’Ф0©
8Ϊ20 = ρρ£01.ηΓ«θ++Γ·
р0++; р1++;
} /* ρά иОшй1о£У‘» ЕрепаНгтё еМеарз, ЬазеиЛс^ЬоЛЯ * еке, кпоск о£Г оуеЛаодв ап<1 йке Йюпег соте
и = (и < 1у)? ы; V; рс! = 100.*(<1оиЫе)пш/(доиЫе)1х; ίρίϊηΐίϊίχ, \п); . , ~
ЬптКй, ’ < М тайЛ«з т ап отейар о£ % пт, (пт =— 1)? : е®’ Iх·
- 21 007984 ίρπη(£(&, * <еарз ίη йга1 аефкпсе: %<Г, варх); ...£€ϋη3Ϊ
И (варх) { (νοΜ) $рппй(ои1х, ’ (%ά %а%а)“, п$арх, (<Ьа)? Ьа$е:”гезИие, (пварх = = 1)? .-а); φτΐηίί(&,%8’, отйх);
фппсйДх, ”, £ар5 шаесопЛ аедиепсе: %ά\ вару);
*(бару) { (νοίά) $ргШ(ои1х, ’ (%Л п§ару, (Лпа)? ”Ьазе’:*геак1ие”, (п^ару == 1)? ”*:а); фгшЩ6с,*%а”, ошх);
} ίί (Лоа) φπηί£(&, \п<5соге: %й(та1с11 = %ά, тйтагск = %ά, вар реваку = %<1 + %ά рег Ьаае)\п”, атах, ϋΜΑΤ, ОМИ, ϋΙΝ$0, ΟΙΝ51);
еке φπηίίζβς “\п<5соге: %ά (Оауко£ГРАМ 250 тайтх, £ар реваку = %ά + %ά рег геа10ие)\п, ядах, ΡΙΝ80, ΡΙΝ81);
И(епдварз) φπηίίζίχ, ’<еш1вар8репаН2е<1.1еАев0вар: %ά %&%&, пвк£ еаДвар: %ά %а%а\п”,
___ /л__νο . ___? л___« _ 1УЛ . *·„ ^шаа// Οα5Ο . 1«ши& , --л)! · 5 1аа1вар, (Лоа)? Ъаае: ’геяйие”, (1а$Ч»ар == 1)? : а”);
еке
} фппЙ(Щ <епЛвар5 по£ репайгвЛКп’);
з£айс пт; /♦ та1сЬез ίη соге — £ог скеСктв */
зГаДс 1тах; /* 1еп£Лз οί είπρρβά б1е пашеа */
з£аИс ШЯ; /* ,μηρ ϊηάοχ &г а раЛ */
а£аЦс пс[2]; /* пигпЬег а£ аСагГ οί сиггет 1ше */
$£аНс ш[2); /* сиггет йет пшпЬег - ίοτ варршв */
з1а£1с 5ϊζ[2];
з1айс скат *Р5[21; /* рй· ίο сиггет е1етеп£ */
аЭДкскаг *ро{2]: /* ря ю пей оифш скат х1ог */
5Шк скат οιΚ[2][Ρ_ΙΤΝΕ]; /* ои£ри£ 1те */
з(аНс скат Яаг[РОПЧЕ]; /* аеС Ьу аигаО */
/* * ргш1 а11£шпепс οί ЛеаспЬеЛ ίη зГгисС раЙг рр[ ]
*/ кГаНс рг_аНртО {
ΐηί пп; /♦ сЬаг соияс */ ίηί тоге;
ге£&ег ΐ;
Гог (ί = 0,1тах = 0; ί <2; ί+ +) { πη = ЯпрпатефатехШ); ΐΓ(ηη > 1тах) 1тах = ηη;
пей = 1;
πί[ί] = 1;
5ίζ[ί] = чИ = 0: ρΦΙ = $βςχ[ί1;
ρο[ϊ] = оиф]; }
- 22 007984 ίοΓ<ππ·=ηπι — 0, тоге · 1;тоге;){ ...рг_аЙ§П й>г (I = тоге « 0; ϊ < 2; ί++) { /* * άο тс Ьа*е тоге οί ΰώ аедиепсе?
·/ а(!*1»И) сзпйлие;
тоге++;
И (ррр]-«рс) { /* 1еаШп£ $расс ♦/ *роИ++ -' ·; ρρ[ί].δρο—;
} еке ϊ<8ΐζ[ί]) { /*та£ар*/ *роД++ = «ад-;
} еЬе { /* тс'ге ри£ш£ а аец ЫешеШ ·/ *роШ = *Р5Й;
. ίί (Щотсг(*Р«П])) · »ρ5[ί] = Юиррег(*р5р]);
рор]++;
р«Ш++;
/♦ ♦ аге тс а! пех£ £ар Гог ййа икр ·/
1г(шш ==рршадвв) { /♦ * тс леей № тще а11 &ар5 • аг 1осайоп */ «ад “ ррШ-п&’И++];
эгЬПе (ЫД =*=·“ ррР].хЙШ1)_ «ед +- ррш-ад1Ч++];
} тИ++;
} } ΐί(4-+ηη == Ыеа 11 !тоге&&пп) { (ГшпрЫоскО;
£ог (ΐ = 0; ί < 2; Ϊ++) рор] = ои£р];
пп = О;
} }
} /* * <1итр а Ыоск οί Нова, шскийте пишЬеге, яага: рг аРрО »/ ~ $1аЦс
ЛцпрЫоскО ' ДитрЫоск {
герхГег ϊ;
ίοΓ (ϊ = 0; ϊ < 2; ΐ++) *ρο[ϊ]— = ·\0·;
- 23 007984
...ДитрЫоск (νοϊά) рисс(’\п', £х);
Гог (ΐ = 0; ΐ < 2; ΐ+ +) {
1£(*оиф] &&(*оис[1] != 11 *(ρο[ΐ]) !=”)){ ΐΓ(ΐ==0) пиш£(1);
ίί (ί = = 0 && *οιιΐ[1])
5(ак0; рийше(1); ϊΓ(ί == 0&& *оиг[1])
1ргшй(6с, 51аг); ΐΓ(ί== 1) пшп8<1);
} }
} /* * рш оис а пшпЬег 1ше: йитрЫоскО */ £(абс пипках) пит$ ΐπί ϊχ; /* ιτιΗαυ ΐη 0пгГ Ί ΗηίΗίπσ ялп 1ше */ сЬаг
Γ0£Κί«·
Γβ^ίδίβΓ сЬаг ηΙίηβ[Ρ_ΜΝΕ]; ϊ. ΐ;
*ρη, *ρχ, *ру;
£ог (ρη = ηΐϊηε, ί = 0; ί < 1шах+Р_5РС; ΐ++, ρη++) *ρη = '
Гог (ί = ηε[ίχ], ру = оиСрх]; *ру; ру+ +, ρη+ +) { И(*РУ== II *РУ =='-') *ρη = ' еке { ί£(ί%10 == 0 11 α == 1 &&пс[к] != 1)) { ϊ = (ΐ < 0)? -ί: ί;
Гог (ρχ = ρη; б ] /= 10, ρχ~) *ρχ = ]%10 + '0'; ίΓ(ϊ < 0) *ρχ = }
еЕе *ρη = ' ΐ++;
} }
*ρη = ’\0';
ηο[ϊχ] = ί;
Гог (ρη = πίϊηβ; *ρη; ρη+ +) (νοίά) риСс(*рп, 6с);
(νοκΐ) ри1с('\п', 6с);
} /* * рис оис а 1те (пате, [пит], [пит]): скипрЫоскО */
5(аНс ри11ше(Ьс) ΐπΓ ίχ; { рийте
- 24 007984
...ри(1ше ϊηί ί;
ге£&ег Лаг *рх;
Гог(рх = пашсх[к], ϊ = 0; *рх&& *рх != рх++, ί++) (νοΜ) р<йс(*рх, &);
Гог (; ΐ < 1тах+Р_5РС; ί+ +) (νοϊά) рийс 6с);
/* сЬезе сошй йот 1: · * ηϊ[ ] 15 сиггий е1етел1 (йот 1) * пс[ ] Ϊ5 питЬег а< $!аг1 οί сиггелс 1ше */
Гог (рх = ои![к]; *рх; рх++) . (νοΐά) ри1с(*рх&0х7Р, 6с);
(νοίά) ртс('\п', £х);
} /* * ри£ а йпе οί $£агз (5βς5 айгауз ϊη ои![0], оШ[1]): ЛппрЫоскО ·/
5Ш1С «аг50 81аГ5 £
ϊηί ί;
ге§й(ег сЬаг *р0, *р1, сх, *рх;
ЙЧ!*оис(0] 11 (♦оиДО] == ' ' &&. *(ро[0]) == '') 11 !*ои![1] 11 (*0и![1] == ' ' && *(ро[1]) == 1 ')) ге1игп;
рх — всаг;
Гог (ϊ = 1тах+Р_8РС; ί; ΐ-) *рх++ = '
Гог (ρθ = оифО], р1 — оиг£1]; *р0 && *р1; р0++, р1 + +) { ίί (15а1рЬа(*рО) && йа1рЬа(*р!)) {
ΪΓ (хЬт[*рО-’А']&Лт[*р1-'А']) { сх = ’*·; шп++;
} еЬе ΪΓ (!Лпа && _<1ау[*р0-'А'][*р1-'А'] > 0) сх = еЕе сх = ' = сх;
} ёке *рх+ + }
*рх++ = ’\п';
*рх = '\0';
} /* * ίϊτΐρ ра± ог ргейх йот рп, гегит 1еп: ргаПдпО */
51аЬс , , . , „ ^прпате
5Гпрпате(рп) сЬаг *рщ /* Й1е пате (тау Ъе раШ) ·/ {
гедй1ег сбаг *рх, *ру;
РУ = 0; .
Гог (рх = рп; *рх; рх++) ίΓ(*ρχ== 7') ру = рх + 1;
»Г(РУ) (νοΐά) 5йсру(рп, ру);
геГигп(5£г1еп(рп));
}
- 25 007984 /* * скаппрО - скапор апу Ιπψ 61е * ДОесЮ -иаб ίηχβς, βΛ άοκ,Ίβη, шахкп * 8_са11ос0 - саПосО «Μι еггог сЬескш * геафшрзО - £в£ &е дооб }трх, йот £шр Й1е ΐ£ песеххагу * тайерпрхО - «п1е а йПеб аггау о£ дпрх (о а йпр б1е: п«0 ♦/ #тс1и<1е “т».Ь‘ #шс!ибе <хух/б1е.Ь>
сЬаг НЬЕ *рпате = ’/стр/ΙιοπΐβΧΧΧΧΧΧ; *б; /* (тр Й1е Еог ΐιηρχ */
ΐηί с1еапирО; /* с!еашф Стр Й1е */
Ιοη£ кеекО;
/*
* гепюче апу йпр Й1е ίί ινβ Ηον */
с1еапир(1) ίιιί ΐ;
{
К (б) (νοϊά) 1ш1тк0вате); ехй(1);
} /* * геаб, геШт ρίτ ίο χες, хеХ бпа, 1ео, тах!еп * χΰρ 1те$хСагНпе ννϊύιот '>' * хед ш иррег ог Ιοννβτ сазе скапир
*/ сЬаг *
8е1хед(й1е, 1еп) сЬаг *й1е; !* Д1е пате */
ш *1еп; /* хед 1еп ♦/
{ сЬаг 1ше[1024], *рхед;
ге£в1егсЬаг *ρχ. *ру;
ίηί па18С, беп;
НЕЕ *ф;
ίΕ«Φ = Еореп(й1е,*г)) == 0) {
фгшЩабегг,%х: сап'сгеаб %5\п, ргой, Й1е); ехй(1);
} беп = паС^с = 0;
«Ήΐε (ц>ёи(иПё, 1024, Ер)) {
1£(Чте == || *1те == <’ || *1те == ’>') сопХтие;
Гог (рх = 1те; *рх ! = '\п’; рх+ +) ί£ (Йиррег(*рх) 11 ίχ1ον»τ(*ρχ)) . беп++;
} ϊΕ ((ρχβς = та11ос((ип51£пе<1Хиеп+б))) >== 0) { фппхЕ(х(бегг,%х: та11ос0 йИеб из ββί %ά ЬуГех Еог %х\п, ρτοβ, беп+6, Я1е); ехй(1);
} рзед[0] «= рхед[1] = рхед[2] = рхед[3] - '\0';
- 26 007984 ру = ρεβς + 4; *1еп = бел; геМп(1(ф);
...§е(зец иФЙе (ί£βκ(1ίπβ, 1024, ф)) { ϊί(*1ΐηβ == |) *1ше == '<’ || *1те == '>’) соийпие;
Гог (рх = 1ше; *рх != ’\п’; рх+ +) { И (киррег(*рх)) *ру+ + = *рх; еке ίί (кклуег(*рх» *ру++ = юиррег(*рх);
ίί (ш<1ех(АТ6Си,*(ру-1))) па£§с+ + ;
} *ру+ + = '\0'; *ру = ’'0';
(νοΜ) £с1о5е(ф); бла = пафс > (Оеп/3); ге1игп(р5«}+4);
сЬаг §_са11ос(т55, пх, ах) *Ш5£; пх, δζ;
§_саПос сЬаг ΐηΐ /* рго^гат, са11ш£ гошше */ /* питЪег апд $ие οί екапепй */ сЬаг *рх, *са11ос0·, ίί ((рх = са11ос((ии51£п«1)пх, (шкфиефзг)) = = 0) { ίί (*Ш5£) { фгйкфхйетг, %а: £_са11ос0 «айей %з (η=%ά, ίζ=%ά)\η’, рго?, тз£, пх. ехй(1);
«ζ);
} ге1игп(рх);
/» * £βΐ Нпа1 )тр5 Фот άχ[ ] ог ипр 61β, εβί рр[ ], гем! бтах: таш.0 */ геафтргО {
геаф'шрз ΐηί ίηί ге^ЗДег £ά = -1; 8ΪΖ, ϊθ, Ϊ1; ί, ь χχ;
«£(6){ (νοΐά) Гс1о5е(§);
ίί «й = орепОпате, 0_ΚϋΟΝΙΎ, 0)) < 0) { фппй($и1еп·, %б: сапЧорепО %ε\η, рго£, рате); с!еапир<1);
} £ог (ί = Ϊ0 = Ϊ1 = 0, ЛпахО = Йтах, хх = 1еп0; ; Ϊ+ +) { м>Ьйе (1) {
Гог (ΐ = <Хх[4гаах].цтр;; > = 0 && «ЩдтахПр.хЩ > = хх; ί—)
- 27 007984 ‘ ...геад^трз
ΙΓ<5 < 0&&Лх[Лтах].о£Е5«&&0) { .
(умфЪееЦЙ, Лх[Лтах).о&ее, 0); .
(νοΜ) геаЛ(ГЛ, (сЬаг *)&Лх[Лшахир, $ίζβοΓ(5ίπκ« дир));
(νοιά) геаЛ(й, (сЬаг *)&Лх[Лтах].о&«, зЬео((Лх[Лтах].овзе<:)); Лх[Лтах).утр = ΜΑΧΙΜΡ-1;
} е!$е
Ьгеак;
}
Щ1 >= 1МР8){ фгтй(51Легг, %5: юо шалу £ар$ ш аЛяпшешХп*, ρτοβ); с1еапир(1);
} ΪΓ0 >=0){ . ίϊζ = Лх[Лтах]Ор.пО];
хх = Лх[Лтах] 4р.хШ; «Злах += 5Ϊζ;
ϊΓ($ίζ < 0) { /* £ар ϊη аесодд ϊβς */ ρρ[1].η[ϊ1] = -δϊζ;
хх += ίϊζ;
/* ΐά = χχ - уу + 1еп1 - 1 */
- ρρ[1].χ[ΐ1] “Π -Лтах + 1еп1 - 1;
еару++; пеару -= ίϊζ;
/* црюге МАХОАР ууЬеп Лоте епЛеарз */ ίϊζ = (-ίϊζ < МАХОАР 11 елЛ§арз)? -ίϊζ : МАХОАР;
Ϊ1++;
} еке ΐΓ(ίϊζ > 0) { /* дар ίη 6κί аец */ рр[0].п[Ю] = ίϊζ;
рр[0].хП0] = хх;
£арх++; п^арх + = $ϊζ;
/* щпоге МАХОАР тейеп Лоте епйеарз */ ίϊζ = ($ϊζ < МАХОАР 11 епЛеарз)? ίϊζ : МАХОАР; Ϊ0++;
} }
еке
Ьгеак;
} /* геуегее Ле огЛег оГ .μηρί */
Гог 0 = 0, Ϊ0—; ,) < Ю; ϊ+ +, Ϊ0—) { ϊ = рр[О].п0); рр(0].п[й = рр[0].п[Ю]; ρρ(Ο].η[ϊΟ] = ί; ϊ = и>[0].хЩ; ρρ[Ο].ι(Π = рр[0].х[Ю]; рр[0].х[Ю] = ϊ;
}
Гог о = о. И-; ϊ < ϊΐ; ΐ++, Η-) { ί = ΡΡίΠ-ηβΙ; ΡΡΟΙ-ηβ] = ρρ[1].ηΠ1]; ρρ[1].η(ί1] - ϊ;
ϊ = ρρ[1].χβ]; рр[1].хШ = рр[1].х[Щ; ρρΙΠ-ΦΙ] = ΰ } 1Г(£Л >= 0) (νοϊά) с1о$е(ГЛ);
ίΓ(Ο <
(νοίά) шйшкОпате);
= 0; ойзег = 0;
} }
- 28 007984 /* * «гйе а ίϊΠβά Зтр $1гис£ 0Й8е1 о£ (Ье ргеу опе (ΐί апу): ηνΟ *!
у<п1е)тр5(Ьс) 1¥ГЙе|П1р5 ίηί к;
<
сЬаг *тйетр();
Н(!6) { ίί (тйетр(]пате) < 0) { фПОщашстт, %5; Сап ΐ ШиёшрО %$ш, рГО£, Зшшс); с1еапир(1);
} ίί «О = Гореа0паше, «г·)) == 0) { фппй(5к1егг, %$: сап'С «гйе %5\п, ргоеЦпате); ехй(1);
} }
(νοίά) Г\мп1е((сЬаг *)&άχ[ίχ]4ρ, авеоГЩпк! утр), 1, §);
(νοίά) Ь№п(е((сЬаг *)&4х[1х].о£Ье1, вйеоЦдхрхкойзеС), 1, 5);
}
Для целей по данному описанию % идентичности данной аминокислотной последовательности А по отношению к данной аминокислотной последовательности В, с или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В (что иначе можно выразить как данная аминокислотная последовательность А, которая на столько-то % идентична по отношению к данной аминокислотной последовательности В, или с или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В) вычисляют следующим образом:
100 х соотношение Χ/Υ, где X обозначает число аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные пары с помощью программы сравнения первичных последовательностей (совмещения) ΑΕΙΟΝ-2 при использовании этой программы для сравнения А и В, и где Υ обозначает общее число аминокислотных остатков в В. Следует отдавать себе отчёт, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А по отношению к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А. В качестве примеров расчёта % идентичности аминокислотной последовательности на фиг. 7А, 7В показано, как рассчитывать % идентичности аминокислотной последовательности, обозначенной белок сравнения, аминокислотной последовательности, обозначенной РКО.
Если конкретно не указано иначе, все значения идентичности аминокислотной последовательности в данном описании, выраженные в %, получают, как описано выше, используя компьютерную программу совмещения последовательностей ΑΕΙΟΝ-2. Однако % идентичности аминокислотной последовательности можно определять, используя программу сравнения последовательностей ΝΟΒΙ-ΒΕΑ8Τ2 (А11зИы1 е! а1., ΝυοΛίο Αοίάδ Кез., 25:3389-3402 (1977)). Программу сравнения последовательностей ΝΟΒΙ-ΒΕΑ8Τ2 можно переслать по Интернету, ^еЬ сайт ΝΟΒΙ. ΝΟΒΙ-ΒΕΑ8Τ2 использует несколько параметров поиска, причём все эти параметры поиска устанавливают значение по умолчанию, включая, например, разрешённое (иптазк) = да, нить (зЕапй) = все, ожидаемые вхождения = 10, минимальная длина при низкой сложности = 15/5, значение е многопроходного режима = 0,01, константа многопроходного режима = 25, йгорокк конечного совмещения с введением гэпов (щелей) = 25 и оценочная матрица = ΒΕΟ8ϋΜ62.
В ситуациях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей применяют ΝΟΒΙΒΕΑ8Τ2, % идентичности данной аминокислотной последовательности А данной аминокислотной последовательности А по отношению к данной аминокислотной последовательности В, с или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В (что иначе можно выразить как данная аминокислотная последовательность А, которая на столько-то %% идентична по отношению к данной аминокислотной последовательности В, или с или по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В) вычисляют следующим образом:
100 х соотношение Χ/Υ, где X обозначает число аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные пары с помощью программы сравнения первичных последовательностей (совмещения) ΝΟΒΙ-ΒΕΑ8Τ2 при использовании этой программы для сравнения А и В, и где Υ обозначает общее число аминокислотных остатков в В. Следует отдавать себе отчёт, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А по отношению к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А.
Термин эпитоп мечен, применяемый в данном описании, относится к химерному полипептиду, содержащему полипептид, слитый с полипептидом-меткой (!ад ро1урерййе). Полипептид-метка содержит достаточное количество остатков, чтобы создать эпитоп, против которого можно приготовить антитело. Полипептид-метка совершенно уникален, так что антитело практически не участвует в перекрёстных реакциях с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки, как правило, содержат по
- 29 007984 меньшей мере шесть аминокислотных остатков, а обычно около 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно, около 10-20 аминокислотных остатков).
Применяемый в данном описании термин иммуноадгезин означает антителоподобные молекулы, которые объединяют специфичность гетерологичного белка (адгезии) с эффекторными функциями константных областей иммуноглобулина. Структурно иммуноадгезины представляют собой слияние аминокислотной последовательности с заданной специфичностью связывания, иной, нежели распознавание антигена и сайт связывания антитела (т.е. гетерологичной), и последовательностью константной области иммуноглобулина. Участок адгезина молекулы иммуноадгезина, как правило, представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, сайт связывания рецептора или лиганда. Последовательность константной области иммуноглобулина в иммуноадгезине можно получать из любого иммуноглобулина, таких как ГдС-1, ГдС-2, ГдС-3 или 1дС-4 подтипов, ГдА (включая ГдА-1 и ГдА-2), ГдЕ, ГдЭ или ГдМ.
Термин антагонист применяется в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует один или более типов биологической активности полипептида ТАЬЬ-1, полипептида АРКЬЬ, или как ТАЬЬ-1, так и АРКГЬ, ίη νίίτο, ίη зйи, или ίη νίνο. Примеры таких типов биологической активности полипептидов ТАЬЬ-1 и АРКГЬ включают связывание ТАЬЬ-1 или АРКГЬ с ТАСГ, ВСМА, ТАСЕ или ВК3, активацию №-кБ и активацию пролиферации и секреции Гд В-клетками, нарушения, связанные с состоянием иммунной системы, такие как ревматоидный артрит, а также типы биологической активности, о которых дополнительно сообщается в литературе. Антагонист может функционировать прямо (непосредственно) или косвенно (опосредованно). Например, антагонист может действовать, частично или полностью блокируя, ингибируя или нейтрализуя один или более типов биологической активности полипептида ТАЬЬ-1, полипептида АРКГЬ, или как ТАЬЬ-1, так и АРКГЬ, ίη νίίτο, ίη ыГи, или ίη νίνο в результате непосредственного связывания с ТАЬЬ-1, АРКГЬ, ВСМА, ТАСЕ или ВК3. Антагонист может также действовать косвенно (опосредованно), частично или полностью блокируя, ингибируя или нейтрализуя один или более типов биологической активности полипептида ТАЬЬ-1, полипептида АРКГЬ, или как ТАЬЬ-1, так и АРКГЬ, ίη νίίτο, ίη Ли или ίη νίνο в результате, например, блокирования или ингибирования другой эффекторной молекулы. Молекула антагониста может включать двойную антагонистическую активность, при которой молекула способна частично или полностью блокировать, ингибировать или нейтрализовать биологическую активность как ТАЬЬ-1, так и АРКГЬ.
Термин агонист применяется в самом широком смысле слова и включает любую молекулу, которая частично или полностью повышает, стимулирует или активирует один или более типов биологической активности полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3, или как ТАСЕ, так и ВК3, ίη νίίτο, ίη кйи, или ίη νίνο. Примеры таких типов биологической активности ТАСЕ и ВК3 могут включать активацию №кВ, индукцию продукции и секреции иммуноглобулина и клеточную пролиферацию. Агонист может действовать прямо (непосредственно) или косвенно (опосредованно). Например, агонист может действовать, или как ТАСЕ, так и ВК3, ίη νίΐτο, ίη Ли или ίη νίνο в результате непосредственного связывания с ТАСЕ или с ВК3, что вызывает рецепторную активацию или сигнальную трансдукцию. Агонист может также действовать опосредованно, частично или полностью повышая, стимулируя или активируя один или более типов биологической активности полипептида ТАСЕ, полипептида ВК3, или как ТАСЕ, так и ВК3, ίη νίίτο, ίη Ли или ίη νίνο в результате, например, стимуляции другой эффекторной молекулы, которая затем вызывает рецепторную активацию или сигнальную трансдукцию ТАСЕ и ВК3. Предполагается, что агонист может вести себя как молекула энхансера, который действует опосредованно, повышая активацию или активность ТАСЕ и ВК3. Например, агонист может повышать активность эндогенного ТАЬЬ-1 и АРКГЬ у млекопитающих. Это можно осуществлять, например, предварительно получая комплекс ТАСЕ или ВК3, или стабилизацией комплексов соответствующего лиганда с рецептором ТАСЕ или ВК3 (например, стабилизацией нативного комплекса, образующегося между ТАЬЬ-1 и ТАСЕ или АРКГЬ и ТАСЕ).
Термин антагонист ТАЬЬ-1 или антагонист АРКГЬ относится к любой молекуле, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность ТАЬЬ-1 или АРКГЬ, соответственно, или как ТАЬЬ-1, так и АРКГЬ, и включает, но без ограничения, растворимые формы рецептора ТАСЕ или рецептора ВК3, такие как последовательность внеклеточного домена ТАСЕ или ВК3, иммуноадгезины рецептора ТАСЕ, иммуноадгезины рецептора ВК3, слитые белки рецептора ТАСЕ, слитые белки рецептора ВК3, ковалентно модифицированные формы рецептора ТАСЕ, ковалентно модифицированные формы рецептора ВК3, варианты ТАСЕ, варианты ВК3, антитела рецептора ТАСЕ, антитела рецептора ВК3, антитела ТАЬЬ-1 и антитела АРКГЬ. Для того чтобы определить, что молекула антагониста ТАЬЬ-1 частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность ТАЬЬ-1 или АРКГЬ, можно провести анализ для оценки влияния молекулы антагониста, например, на связывание ТАЬЬ-1 или АРКГЬ с ТАСЕ или с ВК3, или на активацию Ж-кВ соответствующим лигандом. Такие анализы можно проводить в известных ίη νίίτο или ίη νίνο форматах, например, в клетках, экспрессирующих ВК3 и/или ТАСЕ. Предпочтительно, антагонист ТАЬЬ-1, приме
- 30 007984 няемый в методах по данному описанию, способен блокировать или нейтрализовать по меньшей мере один тип ТАЬЬ-1 активности, который необязательно можно определять методами анализа по данному описанию. Для того чтобы определить, что молекула антагониста АРКГЬ частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность ТАЬЬ-1 или АРКГЬ, можно провести анализ для оценки влияния молекулы антагониста, например, на связывание ТАЬЬ-1 или АРКЬЬ с ТАСЬ или с ВК3, или на активацию ΝΕ-кВ лигандом.
Такие анализы можно проводить в известных ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό форматах, например, используя клетки, тренсфецированные при использовании ТАСЬ или ВК3 (или как ТАСЬ, так и ВК3). Предпочтительно антагонист АРКГЬ, применяемый в методах по данному описанию, способен блокировать или нейтрализовать по меньшей мере один тип АРКГЬ активности, который необязательно можно определять анализом связывания или анализом продукции ГдМ. Необязательно антагонист ТАЬЬ-1 или антагонист АРКГЬ способны ослаблять или ингибировать связывание либо ТАЬЬ-1, либо АРКГЬ (либо как ТАЬЬ-1, так и АРКГЬ) с ТАСЬ или с ВК3 по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%) и наиболее предпочтительно на 100% по сравнению с негативной контрольной молекулой, в анализе связывания. В одном варианте изобретения антагонист ТАЬЬ-1 или антагонист АРКГЬ содержат антитела, которые конкурентно ингибируют связывание другого лиганда или антитела с ТАСЬ или с ВК3. Методы определения специфичности или аффинности (сродства) антител с помощью конкурентного ингибирования известны в технике [см., Наг1о\у е! а1., АпЕЬойек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ (1998); СоШдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ίη Гттипо1оду, Сгееп РиЬбкЫпд Аккос, ΝΥ (1992, 1993); Ми11ег, МеГй. Епхут.. 92:589-601 (1983)].
Термин агонист ТАСГк или агонист ВК3 относится к любой молекуле, которая частично или полностью повышает, стимулирует или активирует биологическую активность полипептида ТАСГк или полипептида ВК3, соответственно, или как ТАСГк, так и ВК3, и включает, но без ограничения, антитела против рецептора ТАСГк и антитела против рецептора ВК3. Чтобы определить, что молекула агониста ТАСГк может частично или полностью повышать, стимулировать или активировать биологическую активность ТАСГк или ВК3, можно провести анализы для оценки влияния молекулы агониста, например, на клетки, трансфецированные при использовании РВЬк, или ТАСГ, или ВК3. Такие анализы можно проводить в известных ш νίΙΐΌ или т у1уо форматах. Предпочтительно, чтобы агонист ТАСГк, применяемый в методах по данному описанию, мог повышать или активировать по меньшей мере один тип ТАСГк активности, который необязательно можно определять методами анализа по данному описанию. Чтобы определить, что молекула агониста ВК3 частично или полностью повышает, стимулирует или активирует биологическую активность ТАСГк или ВК3, можно провести анализы для оценки влияния молекулы агониста, например, на активность ТАСГк или ВК3. Такие анализы можно проводить в известных т νίΙΐΌ или ш у1уо форматах, например, используя клетки, трансфецированные с помощью РВЬк или ВК3 . Предпочтительно, чтобы агонист ТАСГк или агонист ВК3 могли стимулировать или активировать ТАСГк или ВК3, соответственно, в той степени, в которой это делает(ют) нативный(ые) лиганд(ы) для рецепторов ТАСГк или ВК3.
Термин антитело применяется в самом широком смысле и конкретно охватывает, например, единичные моноклональные антитела против ВК3, ТАСГк, ТАЬЬ-1, АРКГЬ, ТАСГ или ВСМА, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, одноцепочечные антитела и фрагменты антител. Антитело по данному описанию включает молекулы интактного иммуноглобулина или антител, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (т.е. биспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух интактных антител) и фрагменты иммуноглобулина (такие как ЕаЬ, Е(аЬ')2 или Εν), коль скоро они проявляют любой из заданных агонистических или антагонистических свойств по данному описанию.
Антитела, как правило, представляют собой белки или полипептиды, которые проявляют специфичность связывания со специфическим антигеном. Нативные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, состоящие из двух идентичных лёгких (Ь) цепей и двух идентичных тяжёлых (Н) цепей. Как правило, каждая лёгкая цепь связана с тяжёлой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя число дисульфидных связей между тяжёлыми цепями различных изотипов иммуноглобулина меняется. Каждая тяжёлая и лёгкая цепь также содержит регулярно расположенные дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжёлая цепь содержит на одном конце вариабельную область (УН), за которой следует несколько константных областей. Каждая лёгкая цепь содержит вариабельную область на одном конце (Уь) И константную область на другом конце; константная область лёгкой цепи совмещается с первой константной областью тяжёлой цепи, а вариабельная область лёгкой цепи совмещается с вариабельной областью тяжёлой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют область взаимодействия (интерфейс) между вариабельными областями лёгкой и тяжёлой цепей [С1оГйа е! а1., I. Мо1. Вю1., 186:651-653 (1985); Nονοΐηу апб НаЬег, Ргос. Асаб. 8сЕ И8А, 82:4592-596 (1985)]. Лёгкие цепи антител любых видов позвоночных, в зависимости от аминокислотных последовательностей их константных областей, можно отнести к одному из двух чётко определённых типов, называемых каппа и лямбда. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их
- 31 007984 тяжёлых цепей иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Имеется пять основных классов иммуноглобулинов: 1дА, 1дИ, 1дЕ, 1дС и 1дМ, и некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например 1д6-1, 1д6-2, 1дС-3 и 1д6-4; 1дА-1 и 1дА-2.
Константные области тяжёлой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, гамма и мю, соответственно.
Фрагменты антител представляют собой часть (участок) интактного антитела, как правило, антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2 и Εν, диабоди (б1аЬобу, ИЬ).
Термин вариабельный применяется в данном описании для характеристики некоторых участков вариабельных областей (доменов), последовательности в которых отличаются в антителах и используются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела с конкретным антигеном для него. Однако вариабельность обычно неравномерно распределена по вариабельным доменам антител. Как правило, она концентрируется в трёх сегментах, которые называются области, определяющие комплементарность (СИКк), или гипервариабельные области, в вариабельных доменах как лёгкой, так и тяжёлой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называются остов (каркас) (ЕК). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжёлой и лёгкой цепей содержит четыре ЕК области, в значительной степени принимающие конфигурацию (β-складок, связанные тремя СИКк, которые образуют петли, связывающие β-складчатую структуру, а в некоторых случаях образующие её часть. СИК§ в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью ЕК участков и, с СИК§ из другой цепи, вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител [см. КаЬа!, Е.А. с1 а1, 8сс.|испес5 оГ Рго1сп5 оГ 1ттипо1одюа1 1п1сгс51. №Фопа1 ΙηδΙίΙυΙοκ оГ НсаИй, ВсШскба, МИ (1987)]. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.
Термин моноклональное антитело, применяемый в данном описании, относится к антителу, получаемому из популяции практически гомогенных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела представляют собой высокоспецифические антитела, направленные против единственного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов обычного (поликлонального) антитела, которые, как правило, включают различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты в антигене.
Моноклональные антитела по данному описанию включают химерные, гибридные и рекомбинантные антитела, продуцируемые при сплайсинге вариабельной (включающего гипервариабельный участок) области представляющего интерес антитела с константной областью (например, гуманизированные антитела), или лёгкую цепь с тяжёлой цепью, или цепь одного вида с цепью другого вида, или слияния с гетерологичными белками, вне зависимости от вида источника или названия класса или подкласса иммуноглобулина, а также фрагменты антител (например, ЕаЬ, Е(аЬ')2 и Εν), коль скоро они проявляют заданную биологическую активность или заданные свойства. См., например, патент США 4816567 и Мадс е1 а1., в Мопос1опа1 АпбЬобу Ргобисбоп Тсс11пк.|ис5 апб Аррйсабопк, рр.79-97 (Магсс1 Искксг, 1пс. №\ν Уогк, 1987).
Таким образом, определение моноклональный указывает на характер антитела как получаемого из практически гомогенной популяции антител, а не конструируемого, как требует продуцирование антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для применения по данному изобретению можно получать методом гибридом, впервые описанным КоЫсг апб М1к1ст, №1игс, 256:495 (1975), или методом рекомбинантной ДНК, как это описано в патенте США 4816567. Моноклональные антитела можно также выделять из фаговых библиотек, полученных методами, описанными, например, МсСаГГсйу с! а1., №1игс, 348:552-554 (1990).
Гуманизированные формы не человеческих (например, мышиных) антител представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Εν, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2 или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность не человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела по большей части представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело реципиента), в котором остатки вариабельной области (СИК) реципиента замещены на остатки СИК не человеческих видов (антитело донора), таких как мышь, крыса или кролик, обладающие заданной специфичностью, аффинностью (сродством) и способностью. В некоторых примерах остатки остовной области (ЕК) области Εν человеческого иммуноглобулина заменяются на соответствующие остатки иммуноглобулина не человеческого происхождения. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не обнаружены ни в антителе реципиента, ни в ведённых последовательностях СИК или остова. Эти модификации предприняты для того, чтобы дополнительно очистить и оптимизировать продуктивность антитела. В основном гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одной, и как правило, двух вариабельных областей, в которых все или практически все СИК области соответст
- 32 007984 вуют СОВ областям не человеческого иммуноглобулина и все или практически все ЕВ области представляют собой ЕВ области согласованной последовательности человеческого иммуноглобулина. Оптимально гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константного участка или константной области (Ес) иммуноглобулина, как правило, часть константного участка или константной области человеческого иммуноглобулина.
Человеческое антитело представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности, продуцируемой в организме человека и/или полученной любым методом получения человеческих антител, известным в технике или любым методом по данному описанию. Это определение человеческого антитела охватывает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид с человеческой тяжёлой цепью или по меньшей мере один полипептид с человеческой лёгкой цепью, например антитело, содержащее полипептиды с мышиной лёгкой цепью и человеческой тяжёлой цепью. Человеческие антитела можно получать различными известными в технике методами. В одном варианте изобретения человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, при условии, что эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Уаидйап е! а1. Уинге Вю!есйпо1оду, 14:309-314 (1996): 8йее!з е! а1. ΡΝΛ8, (И8А) 95:6157-6162 (1998)); НоодепЬоот апб Ат!ег, 1. Мо1. Вю1. 227:381 (1991); Магкз е! а1, 1. Мо1. Вю1, 222:581 (1991)). Человеческие антитела можно также получать, вводя локусы человеческого иммуноглобулина в трансгенных животных, например мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулина частично или полностью инактивированы. При стимуляции наблюдается продукция человеческого антитела, которое очень похоже на антитело в организме человека во всех отношениях, включая реаранжировку, сборку генов и (сывороточный) спектр антител. Этот подход описан, например, в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и в следующих научных публикация: Магкз е! а1., Вю/Тесйпо1оду, 10:779-783 (1992); ЬопЬегд е! а1., №1иге. 368: 856-859 (1994); Мотзоп, №11иге. 368:812-13 (1994); Е|з11\\з1б е! а1., №!иге Вю!есйпо1оду, 14: 845-51 (1996); №иЬегдег, №1иге Вю!есйпо1оду, 14: 826 (1996); ЬопЬегд апб Низхаг, 1п!ет. Веу. 1ттипо1., 13:65-93 (1995). Или же человеческое антитело можно получать иммортализацией человеческих В-лимфоцитов, продуцируя антитело, направленное против антигена-мишени (такие Влимфоциты можно получать от человека (индивидуума) или же иммунизировать ш уйго). См., например, Со1е е! а1., Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1ез апб Сапсег Тйегару, А1ап В. Ызз, р. 77 (1985); Воегпег е! а1., 1. 1ттипо1., 147(1):86-95(1991); и патент США 5750373.
Термин Ес участок применяется для определения С-концевого участка тяжёлой цепи иммуноглобулина, которую можно получить гидролизом интактного антитела с помощью папаина. Участок Ес может представлять собой Ес участок нативной последовательности или участком Ес варианта. Несмотря на то, что границы участка Ес тяжёлой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, обычно определяют протяжённость участка Ес тяжёлой цепи человеческого 1дС от аминокислотного остатка, примерно, в положении Суз226 или, примерно, в положении Рго230 до карбоксильного конца Ес участка (в данном описании применяется система нумерации по КаЬа! е! а1. см. выше). Участок Ес обычно содержит две константных области, домен СН2 и домен СН3, и необязательно включает домен СН4.
Под цепью Ес участка в данном описании подразумевается одна из двух полипептидных цепей участка Ес.
Домен СН2 участка Ес человеческого 1дС (также называемый домен Су2) обычно включает фрагмент от аминокислотного остатка, примерно, в положении 231 до аминокислотного, примерно в положении 340. Уникальность домена СН2 в том, что он не объединяется (не структурируется) непосредственно с другим доменом. Скорее между двумя СН2-доменами молекулы интактного нативного 1дС располагаются две Ν-связанные углеводные цепи. Высказывались предположения, что углевод может быть заменой объединения домен-домен и способствовать стабилизации СН2-домена. Вийоп, Мо1ес. 1ттипо1, 22:161-206 (1985). СН2-домен по данному описанию может быть СН2-доменом нативной последовательности или СН2-доменом варианта.
СН3-домен представляет собой фрагмент от С-конца до СН2-домена на участке Ес (т. е. от аминокислотного остатка около положения 341 до аминокислотного остатка около положения 447 1дС). Участок СН3 по данному описанию может быть СН3-доменом нативной последовательности или СН3доменом варианта (например, СН3-домен с введённым выступом в одной его цепи и соответствующая ему введённая впадина в другой его цепи); см. патент США 5821333). Такие вариантные СН3-домены можно использовать для получения полиспецифических (например, биспецифических) антител по данному описанию.
Шарнирный участок обычно определяют как участок протяжённостью от около С1и216 или около Суз226 до около Рго230 человеческого 1дС-1 (Вийоп, Мо1ес. 1ттипо1., 22: 161-206 (1985)). Шарнирные участки других изотипов 1§С можно совместить с последовательностью первого и последнего цистеиновых остатков, образующих 8-8 связи между тяжёлыми цепями в тех же самых положениях. Шарнирный участок может быть шарнирным участком нативной последовательности или шарнирным участком варианта. Две полипептидные цепи шарнирного участка варианта, как правило, сохраняют по меньшей мере один цистеиновый остаток на полипептидную цепь, так что две полипептидные цепи шарнирного участка варианта могут образовывать дисульфидную связь между двумя цепями. Предпочтительный шарнир
- 33 007984 ный участок по данному описанию представляет собой человеческий шарнирный участок нативной последовательности, например нативный участок нативной последовательности человеческого Ι§0-1.
Функциональный Ес участок содержит по меньшей мере одну эффекторную функцию Ес участка нативной последовательности. Примеры эффекторных функций включают С1с.| связывание; коплементзависимую цитотоксичность (СЭС); Ес-рецепторное связывание; антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичность ΑΌ); фагоцитоз; отрицательная негативная регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В клеточного рецептора; БСК), и т.д. Такие эффекторные функции требуют, чтобы участок Ес был соединён со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и могут оцениваться с помощью известных в технике методов анализа для оценки эффекторных функций таких антител.
Участок Ес нативной последовательности содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природного участка Ес. Ес участок варианта содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности участка Ес вследствие, по меньшей мере, модификации одной аминокислоты. Предпочтительно, участок Ес варианта содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с участком Ес нативной последовательности исходного полипептида, например около одной-десяти аминокислотных замен, и предпочтительно примерно от одной до пяти аминокислотных замен на Ес участке нативной последовательности исходного полипептида. Последовательность участка Ес варианта по данному описанию предпочтительно по меньшей мере примерно на 80% идентична последовательности нативного Ес участка и/или Ес участка исходного полипептида, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% идентична этим последовательностям, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% идентична этим последовательностям.
Антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность и ΑΌ относятся к опосредованной клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Ес рецепторы (ЕсКз) (например, природные клетки-киллеры (ΝΚ), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ΑΌ, ΝΚ клеток, экспрессируют только ЕсуКШ, тогда как моноциты экспрессируют ЕсуШ, ЕсуКЛ и ЕсуКШ. Данные об экспрессии ЕсК на гемопоэтических клетках суммированы в табл. 3 на стр. 464 в Кауе1с11 апб КапеГ Αηηυ. Кеу. ИптипоК 9:457-92 (1991). Для оценки ΑΌ активности молекулы, представляющей интерес, можно провести ίη νίίτο ΑΌ анализ, такой как описанный в патентах США 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, применимые в таких анализах, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (ΝΚ). Или же, или помимо этого, ΑΌ активность молекулы, представляющей интерес, можно оценивать ίη νινο, например, на животной модели, такой, которая описана в С1упез е( а1., ΡΝΑ8 (Ό8Α), 95:652-656 (1998).
Человеческие эффекторные клетки представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или более ЕсКз и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, ЕсуКШ и осуществляют ΑΌ эффекторную функцию. Примеры человеческих лейкоцитов, которые опосредуют ΑΌ, включают мононуклеарные клетки человеческой крови (РВМС), природные клетки-киллеры (ΝΚ), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительными являются клетки РВМС и ΝΚ. Эффекторные клетки можно выделять из их нативных источников, например из крови или РВМС, как указано в данном описании.
Термины Ес рецептор или Ес применяются для описания рецептора, который связывается с участком Ес антитела. Предпочтительным ЕсК с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным ЕсК является ЕсК, который связывается с антителом Ι§0 (гамма рецептор) и охватывает рецепторы подклассов ЕсуШ, ЕсуКЛ и ЕсуКШ, включая аллельные варианты и формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы ЕсуКЛ включают ЕсуШ^ (активаторный рецептор) и ЕсуКШ (ингибиторный рецептор), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся прежде всего в их цитоплазматических доменах. Активаторный рецептор ЕсуМ^ содержит иммунорецепторный тирозиновый активаторный мотив (ΙΤΑΜ) в цитоплазматической области. Ингибиторный рецептор ЕсуКШ содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ΙΤΙΜ) в цитоплазматическом домене (см. обзор Оасгоп, Αηηυ. Кеу. ИптипоК 15:203-234 (1997)). Обзор по ЕсКз см. Кауе1с11 апб К1пе1, Αηηυ. Кеу. Iттипο1., 9:457-92 (1991); Саре1 е( а1., Iттипοтеίйοбз, 4:25-34 (1994); и бе Нааз е( а1., 1. ЬаЬ. С1т. Меб., 126:330-41 (1995). Другие ЕсКз, включая те, которые ещё только будут идентифицированы, охватываются в данном описании термином ЕсК. Термин также включает рецептор новорождённых, ЕсКп, который отвечает за перенос материнского ΙβΟδ в плод (Сиуег е( а1., 1. Iттипο1., 117:587 (1976); и К1т е( а1., 1. Iттипο1., 24:249 (1994)).
Комплементзависимая цитотоксичность и С относится к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (С1с.|) с молекулой (например, антитела) в виде комплекса с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно провести С анализ, например, как описано Саххапо-8ап1ого е( а1., ί. ^типоБ МеШобз, 202:163 (1996).
- 34 007984
Антитело с созревшей аффинностью представляет собой антитело с одним или более изменениями в его одном или более СОЮ которые приводят к повышению сродства антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, которое не содержит этого (этих) изменения(-й). Предпочтительные антитела с созревшей аффинностью имеют наномолярные или даже пикомолярные величины аффинности к антигену-мишени. Антитела с созревшей аффинностью получают известные в технике производители. Магкк е! а1. В^ο/ΤесЬηο1οду, 10:779-783 (1992) описывает созревание аффинности в результате перестановки домена УН и УЬ. Случайный мутагенез остатков СЭИ и/или остова описан в ВагЬак е! а1. Ргос ΝηΙ. Асаб. δα, И8А 91:3809-3813 (1994); 8сЫег е! а1. Сеие, 169:147-155 (1995); Уебоп е! а1. 1. 1ттиио1., 155:1994-2004 (1995); 1асккои е! а1., 1. 1ттиио1., 154(71:3310-9 (1995); и Намктк е! а1., 1. Мо1. Вю1. 226:889-896 (1992).
Термин иммуноспецифический, применяемый, например, в выражении иммуноспецифическое связывание антител, относится к взаимодействию с антигенспецифическим связыванием, которое происходит между антигенсвязывающим сайтом антитела и специфическим антигеном, распознаваемым этим антителом.
Выделенный, изолированный, применяемый для описания различных белков по данному описанию, обозначает белок, который был идентифицирован и отделён и/или очищен от компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой материалы, которые, как правило, мешают применению белка для диагностических и терапевтических целей и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворённые вещества. В предпочтительных вариантах изобретения белок очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, используя секвенатор с вращением, или (2) до гомогенности методом δΌδ-РАСЕ в условиях восстановления и при отсутствии восстановления, используя окрашивание кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Изолированный белок включает белок ш к1!и в рекомбинантных клетках, если не останется по меньшей мере один компонент природного окружения белка. Обычно, однако, изолированный белок получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки.
Лечение или терапия относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам.
Млекопитающее для целей лечения или терапии относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, животных в зоопарках, спортивных животных или домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно, млекопитающее означает человека.
Патологическое состояние, связанное с ΤА^^-1 и Патологическое состояние, связанное с АРШЬ относятся к патологиям или состояниям, обусловленным аномальными уровнями экспрессии или активности ΤА^^-1 или АРГОВ, соответственно, при уровнях экспрессии или активности, избыточных или недостаточных по сравнению с нормальными здоровыми млекопитающими, если такие избыточные или пониженные уровни встречаются в системном, локализованном или в конкретном типе тканей или клеток или месте в организме. Патологические состояния, связанные с ΤА^^-1, и патологические состояния, связанные с АРШБ, включают острые и хронические иммунные заболевания и рак.
Термины рак, раковый и злокачественный относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но без ограничения, карциному, в том числе аденокарциному, лимфому, бластому, меланому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак лёгкого, немелкоклеточный рак лёгкого, рак желудочно-кишечного тракта, лимфому Ходжкина и не-Ходжкина, рак поджелудочной железы, глиобластому, цервикальный рак, рак яичников, рак печени, такой как печёночная карцинома и гепатома, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак толстой кишки, эндометриальную карциному, миелому (например, множественную миелому), рак слюнных желёз, рак почки, такой как гипернефрома и опухоль Вильмса, базалиому, меланому, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, тестикулярный рак, рак пищевода и различные типы рака головы и шеи. Необязательно рак экспрессирует раковую клетку, ^66-1, АРМЫ, ΤАСI, ΤАСIк, ВВ3 или ВСМА или связан с раковой клеткой, ^66-1, АРШБ, ΤАСI, ΤАСIк, ВВ3 или ВСМА. Например, в литературе сообщалось, что рак ободочной кишки, лёгкого и меланома экспрессируют АРГОВ. Предпочтительные типы рака для лечения по данному описанию включают лимфому, лейкоз и миелому и их подтипы, такие как лимфома Беркитта, множественная миелома, острый лимфобластный лейкоз или лимфолейкоз, лимфома Ходжкина и не Ходжкина, острый миелоидный лейкоз.
Термин иммунное заболевание означает заболевание, при котором компонент иммунной системы млекопитающего вызывает, опосредует или иным образом вносит вклад в распространение заболевания у млекопитающего. Также охватываются заболевания, при которых стимуляция или вмешательство иммунного ответа оказывает благотворное воздействие на течение заболевания. Этим термином охватываются аутоиммунные заболевания, иммунно-опосредованные воспалительные заболевания, воспалительные заболевания, не опосредованные иммунной системой воспалительные заболевания, инфекционные
- 35 007984 заболевания и иммунодефицитные заболевания. Примеры иммунных и воспалительных заболеваний, часть из них является иммунными или опосредованными Т-клетками заболеваниями, которые можно лечить методами по данному изобретению, включают системную красную волчанку, ревматоидный артрит, болезнь Стилла-Шоффара, спондилоартропатии, системный склероз (склеродермию), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена (Сегрена), системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунную гемолитическую анемию (иммунную панцитопению, пароксизмальную ночную гемоглобинурию), аутоиммунную тромбоцитопению (идиопатическую геморрагическую пурпуру, иммунно-опосредованную тромбоцитопению), тиреоидит (болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, иммунноопосредованное заболевание почек (гломерулонефрит, канальцево-интерстициальный нефрит), болезни, при которых происходит демиелинизация центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, идиопатическую демиелинизирующую полиневропатию или синдром ГийенаБарре-Штроля и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, гепатобилиарные заболевания, такие как инфекционный гепатит (гепатит А, В, С Ό, Е и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, гранулёматозный гепатит, и склерозирующий холангит, воспалительные и фиброзные лёгочные заболевания, такие как воспалительное заболевание кишечника (язвенный колит: болезнь Крона), глютеновую энтеропатию, болезнь Уиппла, аутоиммунные или иммунно-опосредованные кожные заболевания, включая буллёзные кожные заболевания, экссудативную эритему и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, диффузный нейродермит (атопический дерматит), пищевую аллергию и крапивницу, иммунные заболевания лёгких, такие как эозинофильные пневмонии, идиопатический пневмосклероз и аллергический пневмонит, заболевания, обусловленные трансплантацией, включая отторжение трансплантата и гомологичную болезнь. Инфекционные заболевания включают СПИД (ВИЧинфекцию), гепатит А, В, С, Ό и Е, бактериальные инфекции, грибковые инфекции, протозойные инфекции и паразитарные инфекции.
Аутоиммунное заболевание применяется в данном описании в широком, общем смысле в отношении нарушений или состояний млекопитающих, при которых разрушение нормальной или здоровой ткани возникает вследствие гуморального или клеточного иммунного ответа отдельного млекопитающего на компоненты ткани. Примеры включают, но без ограничения, красную волчанку, тиреоидит, ревматоидный артрит, псориаз, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет и воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ).
Термин пролекарство, применяемый в данном описании, относится к предшественнику или производному фармацевтически активного вещества, которое является менее цитотоксичным в отношении раковых клеток по сравнению с исходным лекарственным веществом и способно ферментативно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. См., например, ХУПшап. Ргобгидк ίη Саисег СНетоЛегару ВюсНетКй 8ос1е1у Тгаикас!юик, 14, рр. 375-382, 615411 Мее!шд Ве1Гак! (1986) и 8!е11а е! а1., Ргобгидк: А С11етюа1 АрргоасН !о Тагде!еб Эгид ИеНуегу, И1гес!еб Эгид ИеБуегу, ВогсБагб! е! а1., (еб.), рр. 247-267, Нитаиа Ргекк (1985). Пролекарства по данному изобретению включают, но без ограничения, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, пролекарства, модифицированные Ό-аминокислотами, гликозилированные пролекарства, пролекарства, содержащие бета-лактам, пролекарства, содержащие необязательно замещённый феноксиацетамид, или пролекарства, содержащие необязательно замещённый фенилацетамид, пролекарства, содержащие 5-фторцитозин и другие 5-фторуридины, которые можно превратить в более активную нецитотоксичную лекарственную форму. Примеры цитотоксических лекарственных веществ, которые можно дериватизировать в пролекарственную форму для применения по данному изобретению, включают, но без ограничения, описанные ниже химиотерапевтические агенты.
Термин цитотоксический агент, применяемый в данном описании, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывают разрушение клеток. Предполагается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, А!211, I131, I125, Υ90, Ке186, Ке188, 8т153, Βί212, Р32 и радиоактивные изотопы Ьи), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как низкомолекулярные токсины и ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты.
Химиотерапевтический агент представляет собой химическое соединение, применимое для лечения состояний, подобных раку. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (СΥТΟXАN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа (те!игебора) и уредопа (игебора); этиленимины, метилмеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (в особенности буллатацин (Ьи11а!ас1и) и буллатацинон (Ьи11а!астоие)); камптотехин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карцелезин и бизелезин); риптофицины (в особенности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, К\У-2181 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодистин; спонгистатин;
- 36 007984 мустины, такие как хлорамбуцил, хлорнафтазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мельпалан, новэмбихин, фенестрин, преднимустин, трофосфамид, урацилмустард (цгасй тц81агб); нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в особенности калихеамицин γ1 Ι и калихеамицин θ1 Ι, см., например, Апдете. Сйет. 1п!1. Еб. Епд1., 33:183-186 (1994); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарзиностатина и хромофоры родственных хромопротеиновых энедииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактонеомицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ЕИ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, триампурин, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-ЕИ; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; ингибиторы функции коры надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; вещества, пополняющие содержание фолиевой кислоты, такие как фролиновая (?) кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиниум ацетат; эпотилон; этоглюцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; Р8К®; разоксан; ризоксин; сизофран; спирогеманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2, 2', 2-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно Т-2 токсин, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ага-С); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксель (ТАХОЙ®, ВпкЮВМуегк 8с.|шЬЬ Опсо1оду, Рппсе1оп, N1) и доксетаксель (ТАХОТЕКЕ®), Кйопе-Рои1епс Когег, Ап!опу, Егапсе); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платиновые аналоги, такие как цисплатин и карбрплатин; винбластин; платина; этопозид (УР-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы КЕ8 2000; дифторметилорнитин (ΌΕΜΌ); ретиноевую кислоту; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеприведённых соединений. Также под это определение подпадают антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли как эстрогены, включая тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, ЬУ117018, онапристон и торемифен (Фарестон); и антиандрогенные соединения, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеприведённых соединений.
Агент, ингибирующий рост в применении по данному описанию относится к соединению или к композиции, которые ингибируют рост клетки либо ш уйго, либо ш у1уо. Таким образом, агент, ингибирующий рост, означает такой агент, который значительно снижает процентное содержание клеток, сверхэкспрессирующих такие гены в 8 фазе. Примеры агентов, ингибирующих рост, включают агенты, которые блокируют развитие клеточного цикла (в ином месте, нежели 8 фаза), такие агенты, которые индуцируют блокирование входа в 01-фазу и в М-фазу. Классические блокаторы М-фазы включают ушсак (винкристин и винбластин), таксол и ингибиторы топо II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Агенты, которые блокируют вход в 01-фазу, также переходят к блокированию 8-фазы, например, агенты, алкилирующие ДНК, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ага-С. Дополнительные сведения можно найти в Тйе Мо1еси1аг Вак® оГ Сапсег, Мепбе1коп апб 1кгае1, ебк., Сйар1ег 1, епйбеб Се11 сус1е геди1айоп, опсодепк, апб апйпеор1акйс бгадк Ьу Мигасат1 е! а1. (\¥В 8аипбегк: Рйбабе1рй1а, 1995), особенно с.13.
Термин цитокин означает родовой термин для белков, выделяемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. Цитокины включают гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, ^метионил - человеческий гормон роста, и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (Е8Н, ФСГ); тиреотропный гормон (Т8Н, ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЬН, ЛГ); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолевых клеток-α и -β; субстанцию, вызывающую регрессию мюллеровых протоков; пептид, ассоциированный с гонадотропином мыши; ингибин; активин; васкуляр
- 37 007984 но-эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервных клеток; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (ТОЕ, ТФР), такие как ТСЕ-α и ТОЕ-β; инсулиноподобный фактор роста -I и -II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β, и -гамма; колониестимулирующие факторы (С8Е), такие как макрофаг-С8Е (-С8Е); гранулоцит-макрофаг-С8Е (ОМ-С8Е); и гранулоцит-С8Е (О-С8Е); интерлейкины (Ш), такие как ГЬ-1, Ш-2, [Ш-3, [Ш-Ч [Ш-5, [Ш-6, Ш-7, [Ш-8, [Е-9, Ш-11, [Ш-12; и другие полипептидные факторы, включая ЫЕ и лиганд набора (КЬ). Применяемый в данном описании термин цитокин включает белки из природных источников или культуры рекомбинантных клеток и биологически активных эквивалентов цитокинов с нативной последовательностью.
[[. Методы и материалы
Настоящее изобретение охватывает только что идентифицированные и выделенные нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, называемые в данной заявке ТАСЕ и ВК3. В частности, заявители идентифицировали и выделили кДНК, кодирующую полипептиды ТАСН и кодирующую полипептиды ВК3, как подробнее описывается в нижеприведённых примерах.
A. Варианты полипептидов ТАС[к и ВК3
Помимо полноразмерных полипептидов ТАСН и полипептидов ВК3 с нативной последовательностью по данному описанию, рассматривается также, что можно получать соответствующие варианты полипептидов. Варианты полипептидов можно получать, вводя соответствующие нуклеотидные замены в ДНК, кодирующую полипептид ТАСН или полипептид ВК3, или синтезом заданного полипептида ТАСН или ВК3. Специалисты в данной области техники оценят, что аминокислотные замены могут изменять посттрансляционные процессы полипептидов, такие как изменение числа или положения сайтов гликозилирования или изменение характеристик прикрепления к мембране.
Вариации в нативной полноразмерной полипептидной последовательности или вариации в различных доменах полипептидов по данному описанию можно осуществить, например, используя любой из методов и принципов для консервативных и неконсервативных мутаций, представленных, например, в патенте США 5364934. Вариации могут представлять собой замену, делецию или инсерцию одного или более кодонов, кодирующих полипептиды ТАСН или ВК3, которые приводят к изменению аминокислотной последовательности полипептида ТАСЕ или ВК3 по сравнению с нативной последовательностью полипептида. Необязательно вариацию осуществляют заменой по меньшей мере одной аминокислоты на любую другую аминокислоту в одном или более доменов полипептида ТАСН или ВК3.
Сравнивая последовательность полипептида с гомологичной последовательностью известного белка и сводя к минимуму число изменений в аминокислотной последовательности в областях с высокой степенью гомологии, можно определить, какой аминокислотный остаток можно ввести, заменить или делетировать, не оказывая вредного воздействия на заданную активность. Аминокислотные замены могут быть результатом замены одной аминокислоты на другую аминокислоту со сходными структурными и/или химическими характеристиками, например, замена лейцина на серии, т.е. консервативные аминокислотные замены. Инсерции или делеции могут, необязательно, содержать в пределах 1-5 аминокислот. Разрешённую вариацию можно определить, систематически вводя в последовательность аминокислотные инсерции, делеции или замены и проверяя полученные в результате варианты на активность.
Вариации (изменения) можно осуществлять, используя известные в технике методы, такие как опосредованный нуклеотидами (сайт-направленный) мутагенез, мутагенез методом аланиновых замен и РСК мутагенез. Сайт-направленный мутагенез [Сагкег е1 а1., №с1. Ас14к Кек., 13:4331 (1986); 2о11ег е1 а1., №с1. Ас14к Кек., 10:6487 (1987)], кассетный мутагенез |Ае11к ек а1., Оепе, 34:315 (1985)], мутагенез методом рестрикции-селекции |Ае11к ек а1., РЫ1ок. Тгапк. К. 8ос. Ьоп4оп 8егА, 317: 415 (1986)] или другие известные методы можно использовать в отношении клонированной ДНК для получения варианта ДНК, кодирующего полипептид ТАС[к или полипептид ВК3.
Для идентификации одной или более аминокислот вдоль непрерывной последовательности можно использовать сканирование. Предпочтительными для сканирования аминокислотами являются относительно малые, нейтральные аминокислоты. Такие аминокислоты включают аланин, глицин, серии и цистеин. Среди этой группы предпочтительной для сканирования аминокислотой, как правило, является аланин, поскольку он элиминирует боковую цепь за (вне) бета-углеродным атомом и менее вероятно, что он изменяет конформацию основной цепи варианта. Аланин также, как правило, является предпочтительным, так как это наиболее часто встречающаяся аминокислота. Кроме того, она часто обнаруживается как в захороненных, так и в экспонируемых положениях [Сге1дйкоп, Тйе Ргокешк, (\ν.Η. Егеетап & Со., КУ.); СйокШа, 1. Мо1. Вю1., 150:1 (1976)]. Если замена на аланин не даёт адекватные количества варианта, можно использовать изостерическую аминокислоту.
B. Модификации полипептидов ТАС[к и ВК3
Ковалентные модификации полипептидов ТАС[к или полипептидов ВК3 входят в объём данного изобретения. Кконцевые метиониновые остатки могут присутствовать или отсутствовать в полипептидах по данному описанию. Один тип ковалентной модификации включает реакцию нацеленных аминокислотных остатков полипептида ТАС[к с органическим дериватизирующим агентом, который способен
- 38 007984 реагировать с выбранными остатками боковых цепей или Ν- или С-концевыми остатками полипептида ΤАСIз. Полипептид ВК3 можно модифицировать аналогичным образом по нацеленным аминокислотным остаткам, содержащим выбранные боковые цепи, или по их Ν- или С-концевым остаткам.
Дериватизация бифункциональными агентами применима, например, для перекрёстного связывания полипептида ΤАСIз с не растворимыми в воде матриксом или поверхностью носителя для применения в способе очистки антител против полипептида ΤАСIз, и наоборот. Такие биункциональные агенты также применимы для перекрёстного связывания полипептида ВК3 с не растворимыми в воде матриксом или поверхностью носителя для применения в способе очистки антител против полипептида ВК3, и наоборот. Применяемые обычно агенты для перекрёстного связывания включают, например, 1,1бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, эфиры Ν-гидроксисукцинимида, например, эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис-(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малеинимиды, такие как бис-М-малеинимидо-1,8-октан и агенты, такие как метил-3-[(р-азидофенил)-дитио]пропиоимидат.
Другие модификации включают деамидирование глутаминильного или аспарагинильного остатков до соответствующих глутамильного или аспарагильного остатков, соответственно, гидроксилирование пролина или лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильного или треонильного остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [Т.Е. Сге1§Н!оп, Рго!ешз: ЗйисШге апб Мо1еси1аг Ргорегйез, ν.Η. Егеетап & Со., 8ап Егапс1зсо, рр. 79-86)], ацетилирование Νконцевого амина и амидирование какой-либо С-концевой карбоксильной группы.
Другой тип ковалентной модификации полипептида ΤАСIз или полипептида ВК3, входящий в объём данного изобретения, представляет собой изменение нативного типа гликозилирования любого полипептида. Предполагается, что изменение нативного типа гликозилирования для целей по данному описанию означает делецию одного или более углеводных фрагментов нативной последовательности полипептида ΤАСIз, делецию одного или более углеводных фрагментов нативной последовательности полипептида ВК3, добавление одного или более сайтов гликозилирования, которых нет в полипептиде ΤАСIз с нативной последовательностью и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которых нет в полипептиде ВК3 с нативной последовательностью.
Добавление сайтов гликозилирования в полипептиды ΤАСIз или полипептиды ВК3 можно выполнять, изменяя их аминокислотные последовательности. Изменение можно осуществлять, например, с помощью добавления или замены одного или более остатков серина или треонина к полипептиду ΤАСIз с нативной последовательностью или одного или более остатков серина или треонина к полипептиду ВК3 с нативной последовательностью (для О-связанных сайтов гликозилирования). Аминокислотную последовательность полипептида ΤАСIз необязательно можно изменять путём изменений на уровне ДНК, в частности, с помощью мутаций в ДНК, кодирующей полипептид ΤАСIз, в предварительно выбранных основаниях, так что образуются кодоны, которые транслируются в заданные аминокислоты. Аналогично, аминокислотную последовательность полипептида ВК3 необязательно можно изменять путём изменений на уровне ДНК, в частности, с помощью мутаций в ДНК, кодирующей полипептид ВК3, в предварительно выбранных основаниях, так что образуются кодоны, которые транслируются в заданные аминокислоты.
Другие способы увеличения числа углеводных фрагментов в полипептиде ΤАСIз или полипептиде ВК3 представляют собой химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду. Такие методы описаны в технике, например, в Международной заявке νθ 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987 г., и в Ар1т апб V^^з!оп, СКС Сп1. Кеу. ВюсНет., рр. 259-306 (1981).
Удаление углеводных фрагментов из полипептида ΤАСIз или полипептида ВК3 можно осуществить химическими или ферментативными методами или с помощью мутационной замены кодонов, кодирующих аминокислотные остатки, которые служат мишенями для гликозилирования. Методы химического дегликозилирования известны в технике и описаны, например, в Найтиббт, е! а1., АгсН. ВюсНет. В1орНуз., 259:52 (1987) и в Ебде е! а1., Апа1. ВюсНет., 118:131 (1981). Ферментативное расщепление углеводных фрагментов в полипептиде можно осуществить, используя ряд эндо- и экзогликозидаз, как описано в ΤНо1аки^а е! а1., Ме111. Еп/утоЕ 138:350 (1987).
Другим типом ковалентной модификации полипептида ΤАСIз или полипептида ВК3 является связывание полипептида с одним из ряда небелковых полимеров, например, с полиэтиленгликолем, пропиленгликолем или полиоксиалкиленами, по способу, представленному в патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.
С. Получение полипептидов ΤАСIз и ВК3
Представленное ниже описание прежде всего относится к получению полипептида, такого как полипептид ΤАСIз, культивируя клетки, трансформированные или трансфецированные при использовании вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ΤАСIз. Естественно, принимается во внимание, что для получения полипептидов ΤАСIз можно использовать альтернативные методы, которые хорошо известны в технике. Например, последовательность полипептида ΤАСIз или её часть можно получать прямым синтезом, используя твердофазный метод [см., например, 81е\уаг1 е! а1., 8о11бРНазе Рерйбе 8уп!йез1з, ν.Η. Егеетап Со., 8ап Егапшзсо, СА (1969); Метйе1б, 1. Ат. СНет. 8ос.,
- 39 007984
85:2149-2154 (1963)]. Гп νίίτο синтез белка можно осуществлять вручную или автоматически. Автоматизированный синтез можно проводить, используя Аррйед Вющйетк Рср(1Нс ΞνηΐΗοδίζοΓ (ЕоЦег С11у, СА), выполняя инструкции производителя. Различные участки полипептидов ТАСЕ можно по отдельности синтезировать химическими методами и соединить, используя химические или ферментативные способы, получая полноразмерный полипептид ТАСЕ.
Приведённое далее описание также относится к получению полипептида ВК3, путём культивирования клеток, трансформированных или трансфецированных при использовании вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ВК3. Естественно, принимается во внимание, что для получения полипептидов ВК3 можно использовать альтернативные методы, которые хорошо известны в технике. Например, последовательность полипептида ВК3 или её часть можно получать прямым синтезом, используя твердофазный метод, как описано выше. Различные участки полипептидов ВК3 можно по отдельности синтезировать химическими методами и соединить, используя химические или ферментативные способы, получая полноразмерный полипептид ВК3.
1. Выделение ДНК, кодирующей полипептиды ТАСЕ или ВК3
ДНК, кодирующую полипептид ТАСЕ, можно получать при использовании библиотеки кДНК, созданной на основе тканей, которые, предположительно, содержат мРНК, кодирующую полипептид ТАСЕ, и экспрессирует на заметном уровне. Соответственно, ДНК, кодирующую человеческий полипептид ТАСГ, удобно получать, используя библиотеку кДНК, созданную на основе человеческих тканей. Ген, кодирующий полипептид ТАСЕ, можно также получать из геномной библиотеки или олигонуклеотидным синтезом.
Аналогично, ДНК, кодирующую полипептид ВК3, можно получать при использовании библиотеки кДНК, созданной на основе тканей, которые, предположительно, содержат мРНК, кодирующую полипептид ВК3, и экспрессирует на заметном уровне. Соответственно, ДНК, кодирующую человеческий полипептид ВК3, удобно получать, используя библиотеку кДНК, созданную на основе человеческих тканей. Ген, кодирующий полипептид ВК3, можно также получать из геномной библиотеки или олигонуклеотидным синтезом.
Скрининг библиотек можно проводить, используя зонды (такие как антитела к полипептиду ТАСЕ, антитела к полипептиду ВК3 или олигонуклеотиды, содержащие, по меньшей мере, около 20-80 оснований), предназначенные для идентификации представляющего интерес гена или кодируемого им белка. Скрининг кДНК-овой или геномной библиотеки с помощью выбранного зонда можно проводить обычными методами, такими, как описанные в 8атЬ^οοк е1 а1., ΜοΕοιιΕ-ιγ Οοηίη§: А ΡαόοηΙοίΎ Маииа1 (№\ν Υοιί<: Οο1ά 8ргтд ΗπγΕογ ΡηόοηΙοίΎ Ргеку 1989). Альтернативным способом выделения гена, кодирующего полипептид ТАСЕ, или гена, кодирующего полипептид ВК3, является методология РСК (ПЦР) [ ЗатЬгсюк е1 а1., см. выше; ^^еΓίсηЬас11 е1 а1., РСК Рптег: А ΡαόοπιΙοίΎ Магша1 (ί,’οΐά 8ргтд Нат^г ΡαόοηЮгу Рге88, 1995)].
В методах скрининга библиотеки кДНК требуется, чтобы выбираемые в качестве зондов олигонуклеотидные последовательности были достаточной длины и достаточно однозначны, так чтобы неверные позитивы были сведены к минимуму. Олигонуклеотид, предпочтительно, является меченым таким образом, что его можно обнаружить при гибридизации с ДНК при скрининге библиотеки. Методы введения метки хорошо известны в технике и включают применение радиоактивных меток, таких как 32Р-меченый АТР, биотинилирование или ферментное мечение. Условия гибридизации, включая не очень жёсткие (умеренные) и (очень) жёсткие условия гибридизации, описаны в 8ηιηόΐΌο1< е1 а1., см. выше, и определяются выше. Необязательно условия гибридизации являются очень жёсткими, как описано на с. 28, строчки 1-14.
Последовательности, идентифицируемые такими методами скрининга библиотек, можно сравнивать и совмещать с другими известными последовательностями, депонированными в общедоступных базах данных, таких как СеηБаηк или другие частные базы данных последовательностей. Идентичность последовательностей (на уровне аминокислоты или нуклеотида) в определяемых областях молекулы или по всей полноразмерной молекуле можно определить сравнительным анализом первичных структур, используя программное обеспечение компьютера, такое, как указано выше, и, необязательно, применяя вышеприведённую программу АЬЮ№2.
Нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, кодирующую белок, можно получить скринингом выбранной кДНК-овой или геномной библиотек, используя для первого раза выведенную аминокислотную последовательность по данному описанию и, если требуется, обычные методики удлинения праймера, описанные в 8ηιηόΐΌο1< е1 а1., см. выше, для детектирования предшественников и интермедиатов процессинга мРНК, которые не могут участвовать в реакции обратной транскрипции в кДНК.
2. Селекция и трансформация клеток-хозяев. Клетки-хозяева трансфецируют или трансформируют, используя экспрессирующие или клонирующие векторы по данному описанию, для продуцирования полипептида ТАСЕ. Или же клетки-хозяева трансфецируют или трансформируют, используя векторы экспрессии или клонирования по данному описанию, для продуцирования полипептида ТАСЕ. Клеткихозяева культивируют в обычных питательных средах, соответствующим образом модифицированных для индуцирования промоторов, отбирая трансформанты или амплифицируя гены, кодирующие задан- 40 007984 ные последовательности. Условия культивирования, такие как среды, температура, рН и т.п., без лишних экспериментов могут выбрать специалисты в данной области техники. Как правило, принципы, протоколы и практические методы повышения продуктивности клеточных культур можно найти в Маттайап Се11 В1о!есйпо1оду: а Ргас!1са1 Арргоасй, М. Ви(1ег, е4. (1КЬ Ргекк, 1991) и 8атЬгоок е! а1., см. выше.
Методы трансфекции известны рядовым специалистам в данной области техники, например, СаРО4 и электропорация. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию осуществляют стандартными методами, пригодными для таких клеток. Обработку кальцием с применением хлористого кальция, описанная в 8атЬгоок е! а1., см. выше, или электропорацию , как правило, применяют для клеток прокариот или других клеток, в которых имеются барьеры в виде плотных клеточных стенок. Инфицирование АдгоЬас!егшт !итеГас1епк применяют для трансформации некоторых растительных клеток, как описано 8йате е! а1., Оепе, 23:315 (1983) и в Международной заявке АО 89/05859, опубликованной 29 июня 1989 г. В случае клеток млекопитающих, не имеющих таких клеточных стенок, можно применять осаждение фосфатом кальция, предложенный Огайат ап4 νаη 4ег ЕЬ, Уйо1оду, 52:456-457 (1978). Основные аспекты трансформаций системы клеток-хозяев млекопитающих описаны в патенте США 4399216. Трансформации клеток дрожжей, как правило, проводят по методу Уап Бойпдеп е! а1., 1. Вас!, 130:946 (1977) и Нк1ао е! а1., Ргос. Аса4. 8ск (И8А), 76:3829 (1979). Однако можно также применять другие методы введения ДНК в клетки, такие как микроинъекция в ядро, электропорация, слияния бактериальных протопластов с интактными клетками, или поликатионы, например полибрен, полиорнитин. Различные методы трансформации клеток млекопитающих описаны в Кеота е! а1., Ме!йо4к ш ЕпхутоЕду, 185:527-537 (1990) и Мапкоиг е! а1., Νοίυιβ, 336:348- 352 (1988).
Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессирования ДНК в векторах по данному изобретению, включают клетки прокариот, клетки дрожжей или клетки высших эукариот. Пригодные прокариотные клетки включают, но без ограничения, эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например Еп!егоЬас!епасеае, такие как Е. сой. Различные штаммы Е. сой являются общедоступными, такие как штамм Е. сой К12 ММ294 (АТСС 31446); Е. сой Х1776 (АТСС 31537); штамм Е. сой А3110 (АТСС 27325) и К5 772 (АТСС 53635).
Помимо прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или векторов экспрессии, кодирующих полипептид ТАС1к или векторов, кодирующих полипептид ВК3, являются эукариотные микроорганизмы, такие как гифомицеты или дрожжи. В качестве низшего эукариотного микроорганизмахозяина обычно используют 8ассйаготусек сегеуыае.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного полипептида ТАС1к или гликозилированного полипептида ВК3 являются клетками многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых, таких как Игокорййа (дрозофила) 82 и 8ро4ор!ега 8Г9, а также растительные клетки. Примеры применимых клеточных линий хозяев-млекопитающих включают клетки яичников китайского хомячка (СНО) и СО8. Более конкретные примеры включают клеточную линию СУ1 почек Африканской зелёной мартышки, трансформированную при использовании 8У40 (СО8-7, АТСС СКЕ 1651); эмбриональная клеточная линия почек человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Огайат е! а1., 1. Оеп У1го1., 36:59 (1977)); клетки яичника китайского хомячка/ИНРК (СНО, Иг1аиЬ ап4 Сйакт, Ргос. Аса4. 8ск И8А, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Ма!йег, Вю1. Керго4., 23:243-251 (1980)); клетки лёгких человека (А138, АТСС ССЬ 75); клетки печени человека (Нер О2, НВ 8065); и опухолевые клетки мыши (ММТ 060562, АТСС ССБ51). Предполагается, что селекция подходящей клетки-хозяина в компетенции специалиста в данной области техники.
3. Селекция и применение реплицирующегося вектора
Нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномную ДНК), кодирующую заданный полипептид ТАС1к или кодирующую заданный полипептид ВК3, можно ввести в реплицирующийся вектор для клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. Различные векторы широко известны. Вектор может, например, быть в виде плазмиды, космиды, вирусной частицы или фага. Соответствующую нуклеотидную последовательность можно ввести в вектор различными методами. Как правило, ДНК вводят в соответствующие сайты, рестрикции эндонуклеазами, используя известные в технике методы. Компоненты векторы, как правило, включают, но без ограничения, одну или более сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более маркерный ген, энхансер, промотор и последовательность терминации транскрипции. Для конструкции подходящих векторов, содержащих один или более таких компонентов, используют обычные методы лигирования, которые известны специалистам в данной области техники.
Заданный полипептид ТАС1к или заданный полипептид ВК3 можно получать методом рекомбинантной ДНК не только непосредственно, но также в виде полипептида, слитого с гетерологичным полипептидом, который может представлять собой сигнальную последовательность или другой полипептид, содержащий специфический сайт расщепления на Ν-конце зрелого белка или полипептида. Как правило, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора, она может быть частью ДНК, кодирующей полипептид ТАС1к, которая встроена в вектор, или она может быть частью ДНК, кодирующей полипептид ВК3, которая встроена в вектор. Сигнальная последовательность может быть сигналь
- 41 007984 ной последовательностью прокариотных организмов, выбранной, например, из группы, щелочных фосфатаз, пенициллиназ, 1рр или термостойких лидерных последовательностей эндотоксина ΙΙ. В случае секреции дрожжей сигнальная последовательность может представлять собой, например, лидерную последовательность инвертазы дрожжей, лидерную последовательность альфа-фактора (включая лидерные последовательности α-факторов 8ассНаготусс5 и 1<1иу\'сготуес5. последние описаны в патенте США 5010182), или лидерную последовательность кислой фосфатазы, лидерную последовательность С. а1Ысап8 (Европейская заявка ЕР 362179, опубликованная 4 апреля 1990 г.), или сигнальную последовательность, описанную в Международной заявке XVО 90/13646, опубликованной 15 ноября 1990 г. При экспрессии в клетках млекопитающих можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих для того, чтобы направлять секрецию белка, такие как сигнальные последовательности секретируемых полипептидов того же самого или родственного вида, а также вирусные секреторные лидерные последовательности.
Как экспрессирующие, так и клонирующие векторы содержат нуклеотидную последовательность, которая позволяет вектору реплицировать в одной или более выбранных клеток-хозяев. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликации плазмиды рВК322 пригоден для большинства грам-отрицательных бактерий, ориджин репликации размером 2 мкм пригоден для дрожжей, а различные вирусные ориджины репликации (8У40, полиома, аденовирус, У8У или ВРУ) применимы для клонирующих векторов в клетках млекопитающих.
Экспрессирующие и клонирующие векторы, как правило, содержат ген селекции, также называемый селективный маркёр. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (б) компенсируют ауксотрофную недостаточность или (с) восполняют запас важных питательных веществ, не поступающих из комплексных сред, например гена, кодирующего Ό-аланинрацемазу для ВасШ1.
Примерами подходящих селективных маркёров для клеток млекопитающих являются такие селективные маркёры, которые позволяют идентифицировать компетентность клеток, их способность воспринимать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ТАСЕ, или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ВК3, такую как ΌΗΕΚ или тимидинкиназа. Соответствующей клеткой-хозяином, в случае применения ΌΗΕΚ дикого типа, является клеточная линия СНО, дефектная по ΌΗΕΚ активности, полученная и размноженная как описано иг1аиЬ с! а1., Ргос. №а11. Асаб. δα. И8А, 77:4216 (1980). Геном селекции, подходящим для применения в клетках дрожжей, является ген 1гр1, присутствующий в дрожжевой плазмиде УКр7 [8бпсЕсотЬ с! а1, №а!игс, 282:39 (1979); Ктдктап с! а1., Сспс, 7:141 (1979); ТхсНстрсг с! а1., Сспс, 10:157 (1980)]. Ген 1гр1 предоставляет селективный маркёр для мутантного штамма дрожжей, у которого отсутствует способность расти в триптофане, например, АТСС №о. 44076 или РЕР4-1 [1опс8, Оспсбск, 85:12 (1977)].
Экспрессирующий и клонирующий векторы обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ТАСЕ или с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ВК3. Промотор направляет синтез мРНК. Промоторы, распознаваемые рядом потенциальных клеток-хозяев, хорошо известны. Промоторы, пригодные для применения с прокариотными хозяевами, включают промоторные системы бета-лактамазную и лактозную промоторные системы [Сйапд с! а1., №а!игс, 275:615 (1978); Сосббс1 с! а1., №а!игс, 281:544 (1979)], промоторную систему щелочной фосфатазы и триптофановую (!гр) промоторную систему [Сосббс1, №ис1ас Аабк Кс§., 8:4057 (1980); Европейская патентная заявка ЕР 36776] и гибридные промоторы, такие как промотор тас [бсВосг с! а1., Ргос. №а!1. Асаб. δα. И8А, 80:21-25 (1983)]. Промоторы для применения в бактериальных системах также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (8Ыпс-Эа1дагпо (δ.Ό.)), функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей полипептид.
Примеры промоторных последовательностей, подходящих для применения в клетках дрожжей в качестве клеток-хозяев, включают промоторы 3-фосфорглицерат-киназы [Нйхстап с! а1., 1. Вю1. Сйст., 255:2073 (1980)] или других гликолитических ферментов [Нс88 с! а1., 1. Абν. Епхутс Ксд., 7:149 (1968); Но11апб, ВюсйстЩгу, 17:4900 (1978)], таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, гексокиназа, пируват-декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.
Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцибельными промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции под контролем условий роста, представляют собой промоторные участки алкоголь-дегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, деградирующих ферментов, ассоциированных с азотистым обменом, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Векторы и промоторы, пригодные для применения с целью экспрессии в клетках дрожжей, дополнительно описаны в Европейской патентной заявке ЕР 73657.
Транскрипция полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3 при использовании векторов в клеткаххозяевах млекопитающих осуществляется под контролем, например, промоторов, получаемых из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы птиц (английский патент 2211504, опубликованный 5
- 42 007984 июля 1989 г.), аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус африканской зелёной мартышки 40 (8У40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например промотора актина или промотора иммуноглобулина, и промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системой клеткихозяина.
Транскрипцию клетками высших эукариот ДНК, кодирующей полипептид ТАС1к, или ДНК, кодирующей полипептид ВЮ, можно повысить, вводя в вектор энхансерную последовательность. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно содержащие около 10-300 п.о., которые воздействуют на промоторы, повышая их транскрипцию. В настоящее время известны многие энхансерные последовательности из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, а-фетопротеин и инсулин). Однако, как правило, используют энхансер вируса эукариотных клеток. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне ориджина репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации, энхансеры аденовируса. Энхансер можно ввести в процессе сплайсинга в вектор в положения 5' или 3' относительно последовательности, кодирующей полипептид ТАС1к, но, предпочтительно, он расположен в сайте 5' от промотора. Аналогично, энхансер можно ввести в процессе сплайсинга в вектор в положения 5' или 3' относительно последовательности, кодирующей полипептид ВЮ, но, предпочтительно, он расположен в сайте 5' от промотора.
Экспрессирующие векторы, применяемые в эукариотных клетках-хозяевах (клетки дрожжей, грибов, насекомых, растительные, животные, человеческие клетки или ядерные клетки других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно получают из 5' и, редко, из 3' нетранслируемых областей эукариотных или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов на нетранслируемом участке мРНК, кодирующей полипептид ТАС1к, или мРНК, кодирующей полипептид ВЯ3.
Другие методы, векторы и клетки-хозяева, пригодные для адаптации к синтезу полипептидов ТАС1к и/или полипептидов ВВ3 в рекомбинантных клеточных культурах беспозвоночных, как описано в 6е!Ыпд е! а1., №!иге, 293:620-625 (1981); Мап!е1 е! а1., №11иге. 281:40-46 (1979); Европейские патенты ЕР 117060; и ЕР 117058.
4. Обнаружение амплификации/экспрессии гена
Амплификацию и/или экспрессию гена можно измерять непосредственно в образце, применяя, например, обычный метод Саузерн-блоттинг, Нозерн-блоттинг, для количественного определения транскрипции мРНК [Тйотак, Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А, 77:5201-5205 (1980)], дот-блоттинг (анализ ДНК), или ш кйи гибридизацию, применяя соответствующим образом меченый зонд на основе последовательностей, предлагаемых в данном описании. Или же можно использовать антитела, которые могут распознавать специфические дуплексы, включая дуплексы ДНК, дуплексы РНК, гибридные дуплексы ДНКРНК или дуплексы ДНК-белок. Антитела, в свою очередь, могут быть мечеными и можно проводить анализ, при котором дуплекс связывается с поверхностью, так что при образовании дуплекса на поверхности можно обнаружить антитело, связанное с дуплексом.
Или же экспрессию гена можно измерять иммунологическими методами, такими как иммуногистохимическое окрашивание клеток или срезов тканей и анализ клеточной культуры или общей воды в организме, с целью непосредственного количественного определения экспрессии генного продукта. Антитела, пригодные для иммуногистохимического окрашивания и/или анализа жидкости в образце, могут быть либо моноклональными, либо поликлональными и могут быть получены в организме любого млекопитающего. Легко можно получить антитела против полипептида ТАС1к с нативной последовательностью, против полипептида ВВ3 с нативной последовательностью, против синтетического пептида на основе последовательностей ДНК по данному описанию, против экзогенной последовательности, слитой с ДНК, кодирующей полипептид ТАС1к, и кодирующей эпитоп специфического антитела, или против экзогенной последовательности, слитой с ДНК, кодирующей полипептид ВЮ, и кодирующей эпитоп специфического антитела.
5. Очистка полипептида
Формы полипептида ТАС1к и полипептида ВВ3 можно очистить от культуральной среды или от лизатов клеток-хозяев. Если они являются мембраносвязанными, их можно освободить от мембраны, используя раствор подходящего детергента (например, Тп!оп-Х100), или с помощью ферментативного расщепления. Клетки, используемые для экспрессии полипептидов ТАС1к или полипептидов ВЮ, можно разрушать различными физическими или химическими способами, такими как повторные циклы замораживания-оттаивания, разрушение ультразвуком, механическая дезинтеграция или агенты, вызывающие лизис клеток.
Может потребоваться очистить полипептид ТАС1к или полипептид ВВ3 от рекомбинантных клеточных белков или полипептидов. Нижеприведённые методы являются примерами подходящих способов очистки: фракционирование на колонке с ионообменной смолой; осаждение этанолом; обращённофазовая вЭжХ;
- 43 007984 хроматография на силикагеле или на катионообменной смоле, такой как ИЕАЕ; хроматофокусировка; 8Э8-РАСЕ; осаждение сульфатом аммония; гель-фильтрация с применением, например, 8срйабсх С75; колонки с протеином А на сефарозе для удаления примесей, таких как 1дС; и металл-хелатирующие колонки для связывания меченых эпитопом форм ТАСИ или полипептида ВК3. Можно применять различные методы очистки белков, и эти методы известны в технике и описаны, например, в Пси1сйсг, Мс111об§ ш Епгуто1оду, 182 (1990); 8сорс§, Рго1ст РипПсабоп: Рг1пс1р1с8 апб Ргасбсс, 8ргтдсг-Усг1ад, №\ν Уогк (1982). Выбор стадии(ий) очистки зависит, например, от характера применяемого процесса получения и конкретного получаемого полипептида ТАСИ или полипептида ВК3.
6. Применение для получения полипептида ТАСИ и полипептида ВК3
Нуклеотидные последовательности (или их комплементарные последовательности), кодирующие полипептиды ТАСИ, или нуклеотидные последовательности или их комплементарные последовательности, кодирующие полипептиды ВК3, находят различное применение в молекулярной биологии, включая применение в качестве гибридизационных зондов, в хромосомном и генном картировании и при получении антисмысловых РНК и ДНК. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ТАСИ, также может применяться для получения полипептидов ТАСИ методом рекомбинантной ДНК по данному описанию. Аналогично, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ВК3, также может применяться для получения полипептидов ВК3 методом рекомбинантной ДНК по данному описанию.
Нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид ТАОК полипептид ВК3 или любую из модифицированных форм этих полипептидов, можно также использовать для получения трансгенных животных или нокаутированных животных, которые, в свою очередь, пригодны для создания и скрининга терапевтически применимых реагентов. Трансгенное животное (например, мышь или крыса) представляет собой животное, имеющее клетки, содержащие трансген, этот трансген был введён в организм животного на пренатальной, например, эмбриональной, стадии. Трансген представляет собой ДНК, которая интегрируется в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное. В одном варианте изобретения кДНК, кодирующую полипептид ТАСИ, можно применять для клонирования геномной ДНК, кодирующей полипептид ТАСИ, в соответствии с признанными методами, и геномных последовательностей, применяемых для получения трансгенных животных, которые содержат клетки, экспрессирующие ДНК, кодирующую полипептид ТАСК В другом варианте изобретения кДНК, кодирующую полипептид ВК3, можно применять для клонирования геномной ДНК, кодирующей полипептид ВК3, в соответствии с признанными методами, и геномных последовательностей, применяемых для получения трансгенных животных, которые содержат клетки, экспрессирующие ДНК, кодирующую полипептид ВК3.
Способы получения трансгенных животных, в частности, таких животных, как мыши и крысы, стали доступными (удобными) в технике и описаны, например, в патентах США 4736866 и 4870009. Как правило, намечаются конкретные клетки для трансгенного введения полипептида ТАСИ и/или полипептида ВК3 с помощью тканеспецифических энхансеров. Трансгенные животные, которые включают копию трансгена, кодирующего полипептид ТАСИ, введённую в зародышевую линию животного на стадии эмбриона, можно использовать для изучения эффекта повышенной экспрессии ДНК, кодирующей полипептид ТАСК Или же трансгенные животные, которые включают копию трансгена, кодирующего полипептид ВК3, введённую в зародышевую линию животного на стадии эмбриона, можно использовать для изучения эффекта повышенной экспрессии ДНК, кодирующей полипептид ВК3. Таких животных можно использовать для испытания реагентов, которые, как полагают, предохраняют, например, от патологических состояний, обусловленных сверхэкспрессией. В соответствии с данным аспектом изобретения животному вводят реагент (обрабатывают реагентом), пониженная частота встречаемости патологического состояния по сравнению с необработанными животными, несущими трансген, указывает на потенциальное терапевтическое воздействие на патологическое состояние.
Или же не человеческие гомологичные последовательности полипептида ТАСИ можно применять для создания нокаутированных животных, клетки которых экспрессируют полипептид ТАСИ, содержащие дефектный или изменённый ген, кодирующий полипептид ТАСИ, в результате гомологичной рекомбинации между эндогенным геном, кодирующим полипептид ТАСИ и изменённой геномной ДНК, кодирующей полипептид ТАСИ, введённый в эмбриональную клетку животного. Например, кДНК, кодирующую полипептид ТАСИ, можно использовать для клонирования геномной ДНК, кодирующей полипептид ТАСИ по данному изобретению с помощью признанных методов. Участок геномной ДНК, кодирующей полипептид ТАСИ можно делегировать или заменить на другой ген, такой, например, как ген, кодирующий селективный маркёр, который можно использовать для мониторинга интеграции.
Аналогично, не человеческие гомологичные последовательности полипептида ВК3 можно применять для создания нокаутированных животных, клетки которых экспрессируют полипептид ВК3, содержащие дефектный или изменённый ген, кодирующий полипептид ВК3, в результате гомологичной рекомбинации между эндогенным геном, кодирующим полипептид ВК3 и изменённой геномной ДНК, кодирующей полипептид ВК3, введённый в эмбриональную клетку животного. Например, кДНК, кодирующую полипептид ВК3, можно использовать для клонирования геномной ДНК, кодирующей полипептид ВК3 по данному изобретению с помощью признанных методов. Участок геномной ДНК, кодирующей полипептид ВК3, можно делетировать или заменить на другой ген, такой, например, как ген,
- 44 007984 кодирующий селективный маркёр, который можно использовать для мониторинга интеграции.
Как правило, при создании нокаутированного животного несколько тысяч нуклеотидных оснований неизменённой фланкирующей ДНК (как на 5', так и на 3' конце) включают в вектор [см. описание гомологичной рекомбинации векторов, например, в Тйотаз апб СарессЫ, Се11, 51:503 (1987)]. Вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, электропорацией), и отбирают клетки, в которых введённая ДНК гомологично рекомбинирована при использовании эндогенной ДНК [см., например, Ь1 е! а1., Се11, 69:915 (1992)]. Отобранные клетки затем инъецируют в бластоцисту животного (например, мыши или крысы) с целью образования скоплений химер [см., например, Вгаб1еу, ίη ТегаЮсатсшотаз апб ЕтЬтуошс 8!ет Се11з: А Ргасбса1 ЛрргоасН, Ε. ί. ВоЬейзоп, еб. (1КЬ, ОхГогб, 1987) рр. 113-152]. Затем химерный эмбрион можно имплантировать для вскармливания в подходящую ложнобеременную самку животного и эмбрион используют для выращивания нокаутированного животного. Потомство, содержащее гомологично рекомбинированную ДНК в зародышевых клетках, можно идентифицировать стандартными методами и использовать для разведения животных, у которых все клетки содержат гомологично рекомбинированную ДНК. Нокаутированные животные можно охарактеризовать, например, по их способности защищаться против некоторых патологических состояний и по развитию в них патологических состояний вследствие отсутствия полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3.
Полипептид ТАСЕ или полипептид ВК3 по данному описанию можно применять по данному изобретению экспрессией таких полипептидов ίη у|уо, что часто называют генной терапией.
Существует два основных подхода к доставке нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента: ίη νί\Ό и ех у|уо. Для доставки ίη νί\Ό нуклеиновую кислоту инъецируют непосредственно в организм пациента, обычно в места (сайты), где требуется полипептид. Например, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ТЛС1з, инъецируют в сайт синтеза полипептида ТЛС1з, если он известен, или в сайт, где требуется биологическая активность полипептида ТАСЕ. Например, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ВК.3, инъецируют в сайт синтеза полипептида ВК3, если он известен, или в сайт, где требуется биологическая активность полипептида ВК3. В случае обработки ех νί\Ό клетки пациента выделяют, нуклеиновую кислоту вводят в эти выделенные клетки и модифицированные клетки вводят в организм пациента либо непосредственно, либо, например, в виде инкапсулированных в пористые мембраны, которые имплантируют в организм больного (см. патенты США 4892538 и 5283187).
Существует ряд методов, пригодных для введения нуклеиновых кислот в вариабельные клетки. Методы меняются в зависимости от того, переносится ли нуклеиновая кислота в культивированные клетки ίη У11го, или переносится ίη νί\Ό в клетках предполагаемого хозяина. Методы, применимые для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих ίη уйго, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, трансдукцию, слияние клеток, ΌΕΑΕ-декстран, метод осаждения фосфатом кальция и т.д. Трансдукция включает ассоциацию дефектной по трансдукции рекомбинантной вирусной (предпочтительно, ретровирусной) частицы с клеточным рецептором с последующим введением нуклеиновых кислот, содержащихся частицей, в клетку. Вектор, обычно применяемый для ех νί\Ό доставки гена, представляет собой ретровирус.
Предпочтительные в настоящее время ίη νί\Ό методы включают трансфецирование вирусными или невирусными векторами (такими как аденовирус, вирус герпеса I или адено-ассоциированный вирус (АЛУ) и системы на основе липидов (липидами, применяемыми для опосредуемого липидами переноса гена, являются, например, ЭОТМА, ΌΟΡΕ и ОС-СНок см., например, Тонктю!! е! а1., Сансег Шуезб^абощ 14(1):54-65 (1996). Наиболее предпочтительными векторами для применения в генной терапии являются вирусные векторы, наиболее предпочтительно векторы аденовирусов, АЛУ, лентивирусов или ретровирусов. Вирусный вектор, такой как вектор ретровируса, включает по меньшей мере один промотор-энхансер транскрипции или локус-определяющий(ие) элемент(ы), или другие элементы, которые контролируют экспрессию гена другими способами, такими как альтернативный сплайсинг, ядерный экспорт РНК или посттрансляционная модификация мРНК. Кроме того, вирусный вектор, такой как вектор ретровируса, включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая будучи транскрибируема в присутствии гена, кодирующего полипептид ТАСЕ, или гена, кодирующего полипептид ВК3, функционально связана с ним и ведёт себя как последовательность инициации трансляции. Такие векторные конструкции также включают сигнал упаковки, длинные концевые повторы (ЬТК, ДКП) или их участки и позитивные и негативные сайты связывания праймеров нитей, пригодные для используемого вируса (если они не присутствуют уже в вирусном векторе). Кроме того, такой вектор, как правило, включает сигнальную последовательность для секреции полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3 из клетки-хозяина, в которую он помещён.
Предпочтительно сигнальная последовательность для этой цели представляет собой сигнальную последовательность млекопитающих, наиболее предпочтительно нативную сигнальную последовательность полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3. Необязательно, векторная конструкция может также включать сигнальную последовательность, которая направляет полиаденилирование, а также один или более сайтов рестрикции и последовательность терминации транскрипции. Например, такие векторы, как правило, включают 5' ЬТК., сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, начало (ориджин) синтеза двухце
- 45 007984 почечной ДНК и 3' ЬТК или его часть. Можно использовать другие векторы, которые не являются вирусными, такие как катионные липиды, полилизины и дендримеры.
В некоторых ситуациях желательно снабдить источник нуклеиновой кислоты агентом, который нацелен на клетки-мишени, таким как антитело, специфичное к мембранному белку клеточной поверхности или к клетке-мишени, лиганд для рецептора на клетке-мишени и т.д. Если используют липосомы, белки, которые ассоциируются с эндоцитозом, можно применять для нацеливания и/или для облегчения поглощения, например, капсидные белки или их фрагменты, тропные в отношении конкретного типа клеток, антитела к белкам, которые претерпевают интернализацию при циклировании, и белки, которые нацелены на внутриклеточную локализацию и повышают внутриклеточный период полужизни. Метод опосредуемого рецептором эндоцитоза описан, например, νυ е! а1., I. Вю1. Сйет., 262: 4429-4432 (1987); и Vадηе^ е! а1., Ргос. Ν!1. Асаб. 8сЕ И8А, 87: 3410-3414 (1990). Обзор известных в настоящее время протоколов по маркировке генов и генной терапии см. Апбегкоп е! а1., Заепсе, 256: 808-813 (1992). См. также Международную заявку νθ 93/25673 и цитируемые в ней ссылки. Соответствующие методы генной терапии и методы получения ретровирусных частиц и структурных белков можно найти, например, в патенте США 5681746.
Кроме того, изобретение охватывает методы модуляции ТАЬЬ-1, АРКГЬ, ТАСГ, ВСМА, ТАСГк и/или ВК3 активности в клетках млекопитающих, которые заключаются в экспонировании клеток с заданным количеством антагониста или агониста, который влияет на взаимодействие ТАЬЬ-1 или АРКГЬ с ТАСГ, ВСМА, ТАСГк и ВК3. Предпочтительно, количество применяемого антагониста или агониста должно быть равно количеству, которое эффективно влияет на связывание и/или активность соответствующего лиганда или соответствующего рецептора, при этом достигается терапевтический эффект. Это может быть выполнено ш νί\Ό или ех νίνΌ, в соответствии, например, с методами, описанными ниже и в примерах. Примеры состояний или нарушений, которые следует лечить такими антагонистами ТАЬЬ-1 или антагонистами АРКГЬ, включают состояния млекопитающих, называемых в клинике аутоиммунными заболеваниями, включая, но без ограничения, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз и волчанку или другие патологические состояния, при которых аномально активируется В-клеточный(е) ответ(ы), таких, например, как рак. Примеры состояний или нарушений, которые надлежит лечить с помощью агонистов ТАСГк или агонистов ВК3, включают иммунодефицит и рак.
В данном описании также охватываются методы диагностики. Например, антагонисты или агонисты можно применять для обнаружения соответствующих лигандов (ТАЬЬ-1 или АРКГЬ) или рецепторов (ТАСГк или ВК3) у животных, определённо находящихся или предположительно находящихся в связанном с ТАЬЬ-1 патологическом состоянии или в связанном с АРКГЬ патологическом состоянии. Антагонист или агонист можно применять, например, в иммунологических анализах для обнаружения или количественного определения ТАЬЬ-1 или АРКГЬ в образце. Образец, например, клетки млекопитающего, можно инкубировать в присутствии меченой молекулы антагониста или агониста, и в образце детектируют меченый антагонист или агонист в связанном состоянии. Такие анализы, включая различные методики клинических анализов, известны в технике, например, они описаны в Уо11ег е! а1., Гттипоаккаук, Ьштегкйу Рагк, 1981.
Антагонисты и агонисты, которые можно применять в этих методах, включают, но без ограничения, растворимые формы рецепторов ТАСГк и ВК3, иммуноадгезины рецептора ТАСГк и иммуноадгезины рецептора ВК3, слитые белки, содержащие ТАСГк или ВК3, ковалентно модифицированные формы ТАСГк или ВК3, варианты рецептора ТАСГк и варианты рецептора ВК3, антитела к рецепторам ТАСГк или ВК3 и ТАЬЬ-1 или АРКГЬ антитела. В данном описании представлены различные методы, которые можно применять для получения антагонистов и агонистов. Например, выше описаны способы и оборудование для получения полипептидов ТАСГк и ВК3. Ниже представлены дополнительные модификации полипептидов и антител к ТАСГк и ВК3.
Растворимые формы рецепторов ТАСГк и рецепторов ВК3 можно применять в качестве антагонистов в способах по изобретению. Такие растворимые формы ТАСГк или ВК3 могут содержать внеклеточные домены соответствующего рецептора или состоять из них (и не содержать трансмембранные или внутриклеточные домены соответствующего рецептора). Сами последовательности внеклеточных доменов ТАСГк или ВК3 могут использоваться в качестве антагонистов или могут быть дополнительно модифицированы, как описано ниже (например, путём слияния с иммуноглобулином, эпитопной меткой или лейциновой застёжкой). Специалисты в данной области техники смогут выбрать, не проводя длительных экспериментов, заданную последовательность внеклеточного домена либо ТАСГк, либо ВК3 для применения в качестве антагониста.
Далее рассматриваются молекулы иммуноадгезинов для применения в способах по данному описанию. Иммуноадгезины рецептора ТАСГк могут содержать различные формы ТАСГк, такие как полноразмерный полипептид, а также растворимые формы рецептора, которые содержат последовательность внеклеточного домена (ЕСЬ) или фрагмент ЕСЬ последовательности. В одном варианте изобретения молекула может содержать слияние рецептора ТАСГк с иммуноглобулином или конкретной областью иммуноглобулина. В бивалентной форме иммуноадгезина такое слияние может быть с областью Ес молекулы ГдС. Слияния Гд, предпочтительно, включает замену растворимой (трансмембранный домен делегирован
- 46 007984 или инактивирован) формы рецепторного полипептида вместо по меньшей мере одну вариабельной области в молекуле 1д. В особенно предпочтительном варианте изобретения слияние иммуноглобулина включает шарнирную область, СН2 и СН3 или шарнирную область, области СН1, СН2 и СН3 молекулы 1дС. О получении слияний иммуноглобулина см. также патент США 5428130, выдан 27 июня 1995 г., и Сбнпом е! а1., ΤIВΤЕСН, 14: 52-60 (1996).
Наиболее простой и прямой путь создания иммуноадгезинов включает объединение связывающего (их) домена(ов) адгезина (например, внеклеточного домена (ЕСИ) рецептора) с областью Гс тяжёлой цепи иммуноглобулина. Обычно при получении иммуноадгезинов по данному изобретению нуклеиновая кислота, кодирующая связывающую область адгезина, сливается по С-концу с нуклеиновой кислотой, кодирующей Ν-конец последовательности константной области иммуноглобулина, однако, Ν-концевые слияния также возможны.
Как правило, в таких слияниях кодируемый химерный полипептид сохраняет, по меньшей мере, функционально активную шарнирную область, СН2 и СН3 домены константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина. Слияния также происходят по С-концу Гс участка константной области или непосредственно по Ν-концу к СН1 тяжёлой цепи или соответствующей области лёгкой цепи. Точный сайт, по которому происходит слияние, не является важным; конкретные сайты хорошо известны и могут выбираться с целью оптимизации характеристик иммуноадгезина: биологической активности, секреции или связывания.
В предпочтительном варианте изобретения последовательность адгезина сливается по Ν-концу Гс участка иммуноглобулина С1(1дС1). Возможно проведение слияние целой константной области тяжёлой цепи с последовательностью адгезина. Однако, более предпочтительно, когда последовательность начинается с шарнирного участка, непосредственно в обратном (3'-5') направлении (ирк!геат) от сайта расщепления папаином, который определяет Гс 1дС химически (т.е. остаток 216, при этом первым остатком константной области тяжёлой цепи является остаток 114), или в слияниях используют аналогичные сайты других иммуноглобулинов. В особенно предпочтительном варианте изобретения аминокислотная последовательность адгезина сливается с (а) шарнирной областью и СН2 и СН3 или (Ь) с СН1, шарнирной областью, СН2 и СН3 доменами тяжёлой цепи 1дС.
В случае биспецифических иммуноадгезинов иммуноадгезины собираются (упорядочиваются) в виде мультимеров и, особенно, в виде гетеродимеров или гетеротетрамеров. Как правило, эти упорядоченные (сборные) иммуноглобулины содержат известные структуры элементов. Основные четыре структурных элемента цепи находятся в форме, в которой существуют 1дС, 1дЭ и 1дЕ. Четыре элемента цепи повторяются в иммуноглобулинах с более высокой молекулярной массой; 1дМ, как правило, существует в виде пентамера из четырёх основных единиц, удерживаемых вместе дисульфидными связями. 1дА глобулин и, изредка, 1дС глобулин могут также существовать в сыворотке в мультимерной форме. В случае мультимера каждый из четырёх элементов может быть одинаковым или различным.
Различные примеры сборных иммуноглобулинов, входящих в объём данного изобретения, схематично представлены ниже:
(a) АСЪ-АСЪ;
(b) ?Сн-(АСн, АСь-АСн, АСь-УСн или Уъ-АСн);
(c) АСь-АСн- (АСь-АСн, АСь-УнСн, Уьс-АСн или УьСь-УнСн);
(б) АСь-УнСн-(АСНн, или АСь-УнСн, или Уьс-АСн);
(е) УьСь-АСн- (АСь-УнСн, или УьСь-АСн); и (ί) (А-З)и-(УьСъ-УнСн)2, где каждый из А обозначает идентичные или различные аминокислотные последовательности адгезина;
Уь обозначает вариабельную область (домен) лёгкой цепи иммуноглобулина;
УН обозначает вариабельную область (домен) тяжёлой цепи иммуноглобулина;
Сь обозначает константную область (домен) лёгкой цепи иммуноглобулина;
СН обозначает константную область (домен) тяжёлой цепи иммуноглобулина;
и обозначает целое число больше 1;
Υ обозначает остаток ковалентного перекрёстно связывающегося агента.
Для краткости вышеприведённые структуры показывают только ключевые особенности; они не указывают области соединения (1) или другие области иммуноглобулинов, на них также не показаны дисульфидные связи. Однако, в тех случаях, когда эти области требуются для активности связывания, их конструируют и они присутствуют в обычных местоположениях, которые они занимают в молекулах иммуноглобулина.
Или же последовательности адгезина можно вставить между последовательностями тяжёлой и лёгкой цепей иммуноглобулина, так что получается иммуноглобулин, содержащий химерную тяжёлую цепь. В этом варианте изобретения последовательности адгезина слиты в направлении 3' конца тяжёлой цепи иммуноглобулина в каждой ветви иммуноглобулина, или между шарниром и СН2 доменом, или между СН2 и СН3 доменами. Аналогичные конструкции сообщались в НоодеиЬо!!от е! а1., Мо1. 1ттиио1., 28: 1027-1037 (1991).
- 47 007984
Хотя присутствие лёгкой цепи иммуноглобулина не требуется в иммуноадгезинах по данному изобретению, лёгкая цепь иммуноглобулина может присутствовать либо в виде ковалентно связанной со слитым полипептидом адгезин-тяжёлая цепь иммуноглобулина, либо в виде цепи, непосредственно связанной с адгезином. В первом случае ДНК, кодирующая лёгкую цепь иммуноглобулина, как правило, коэкспрессируется с ДНК, кодирующей белок слияния адгезин-тяжёлая цепь иммуноглобулина. В процессе секреции гибридная тяжёлая цепь и лёгкая цепь могут ковалентно связываться, давая иммуноглобулин-подобную структуру, содержащую две пары тяжёлая цепь иммуноглобулина - лёгкая цепь иммуноглобулина, связанные дисульфидными связями. Методы, пригодные для получения таких структур, описаны, например, патенте США 4816567, выданном 28 марта 1989 г.
Наиболее часто иммуноадгезины создают слиянием последовательности кДНК, кодирующей участок адгезина в рамке считывания, с последовательностью кДНК, кодирующей цепи иммуноглобулина. Однако, можно также использовать слияние с геномными фрагментами иммуноглобулина (см., например, АгиГГо е! а1., Се11, 61:1303-1313 (1990); и §!атеикоу1с е! а1., Се11 66:1133-1144 (1991)). Последний тип слияния требует для экспрессии присутствия регуляторных последовательностей 1д. кДНК, кодирующие константные области тяжёлой цепи 1д6, можно выделить, основываясь на опубликованных последовательностях, из библиотек кДНК, полученных на основе лифоцитов селезёнки или периферической крови, методами гибридизации или полимеразной цепной реакции (РСК, ПЦР). кДНК, кодирующие части адгезина и иммуноглобулина в иммуноадгезине, встраивают последовательно (тандемное расположение) в плазмидный вектор, который направляет эффективную экспрессию в выбранной клетке-хозяине.
Примеры таких растворимых последовательностей ЕСЭ включают полипептиды, содержащие аминокислоты 1-119 последовательности ТАС1к, изображённой на фиг. 5В.
Иммуноадгезин рецептора ТАС1к можно создать в соответствии с любым из описанных в технике методов.
Аналогично можно сконструировать иммуноадгезин рецептора ВК3. Примеры растворимой последовательностей ЕСЭ для применения при конструкции ВК3 иммуноадгезинов могут включать полипептиды, содержащие аминокислоты 1-77 или 2-62 последовательности ВК3, изображённой на фиг. 6В.
В другом варианте изобретения рецептор ТАС1к или ВК3 можно ковалентно модифицировать, связывая рецепторный полипептид с одним из многих небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), пропиленгликолем или полиоксиалкиленами, таким образом, который описан в патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4178337. Такие пэгированные формы рецептора ТАС1к или ВК3 можно получать методами, известными из уровня техники.
Формы лейциновой застёжки этих молекул также рассматриваются в данном изобретении. Термин лейциновая застёжка (-молния) в технике используется для обозначения богатой лейцином последовательности, которая способствует димеризации или тримеризации партнёра по слиянию, промотирует или стимулирует димеризацию или тримеризацию этого партнёра (например, последовательности молекулы, с которой лейциновая застёжка слита или связана). Различные полипептиды - лейциновые застёжки описаны в технике. См., например, Ьаибксйик е! а1., 8с1еисе, 240:1759 (1988); патент США 5716805; Международная заявка \¥О 94/10308; Норре е! а1., РЕВ8 Ьейегк, 344:1991 (1994); Машайк е! а1., №!иге, 341:24 (1989). Специалисты в данной области техники поймут, что последовательность лейциновых застёжек можно слить либо по 5', либо по 3' концу молекулы рецептора ТАС1к или ВК3.
Полипептиды ТАС1к или ВК3 по данному изобретению можно также модифицировать таким образом, чтобы образовались химерные молекулы путём слияния полипептида рецептора с другим, гетерологичным полипептидом или с другой, гетерологичной аминокислотной последовательностью. Предпочтительно, такой гетерологичный полипептид или гетерологичная аминокислотная последовательность представляют собой полипептид или аминокислотную последовательность, которые приводят к олигомеризации химерной молекулы. В одном варианте изобретения такая химерная молекула представляет собой слияние полипептида рецептора ТАС1к или ВК3 с полипептидом-меткой, предоставляющим эпитоп, с которым может селективно связываться антитело против метки. Эпитопную метку обычно помещают на амино- или на карбоксильном конце полипептида рецептора. Присутствие таких меченых эпитопом форм рецептора можно обнаружить с помощью антитела против полипептида-метки. Также введение эпитопной метки позволяет легко очищать рецептор аффинным способом очистки, используя антитело против метки или другой тип аффинного матрикса, который связывается с эпитопной меткой. Различные полипептиды меток и соответствующие антитела к ним хорошо известны в технике. Примеры включают метки полигистидин (ро1у-Ык) или полигистидин-лизин (ро1у-1нк-д1у); полипептидную НА (гемагглютинин вируса гриппа) метку и антитело к ней 12СА5 [Р1е1б е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 8:2159-2165 (1988)]; метку с-тус и антитела к ней 8Р9, 3С7, 6Е10, 64, В7 и 9Е10 [Еуаи е! а1., Мо1еси1аг аиб Се11и1аг Вю1оду, 5:3610-3616 (1985)]; и гликопротеиновую Ό (дЭ) метку вируса герпеса и антитело к ней [РаЬогкку е! а1., Рго!еш Еидшеегшд, 3(6):547-553 (1990)]. Другие полипетиды-метки включают Р1ад-пептид [Норр е! а1. ВюТесйио1оду, 6:1204-1210 (1988)]; эпитопный пептид КТ3 [Майш е! а1., 8с1еисе, 255:192-194 (1992)]; эпитопный пептид α-тубулин [8кшиег е! а1., 1. Вю1. СНет., 266:15163-15166 (1991)]; и пептидную метку гена 10 бактериофага Т7 [ЬиТ-РгеуегтиШ е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сР И8А, 87:6393-6397 (1990)].
- 48 007984
Предполагается, что антитела против рецептора ΤΑΉ или антитела против рецептора ΒΡ3 можно также применять в предлагаемых в данном описании методах. Примеры таких молекул включают нейтрализующие или блокирующие антитела, которые, предпочтительно, могут ингибировать связывание ΤΑΕΕ-1 или ΑΡΒΙΩ с рецепторами ΤΑΉ и ΒΕ3. Антитела против ΤΑΉ или антитела против ΒΕ3 могут быть моноклональными антителами.
Моноклональные антитела можно получать, используя методы гибридом, например методы, описанные КоЫег апб М11з1ет, №1иге, 256:495 (1975). По методу гибридом мышь, хомяка или другое подходящее животное-хозяина, как правило, иммунизируют иммунизирующим агентом для выявления лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, специфически связывающиеся с иммунизирующим агентом. Или же лимфоциты можно иммунизировать ίη М11го.
Иммунизирующий агент, как правило, включает полипептид ΤΑΉ или полипептид ΒΕ3 (или ЕСЭ полипептида ΤΑΉ или ЕСЭ полипептида ΒΕ3) или его слитый белок, такой как слитый белок ΤΑ Εί.Ό-Ι§6. Или же иммунизирующий белок может содержать фрагмент или часть ΤΑ или 8^3, в которой имеется одна или более аминокислот, участвующих в связывании ΤΑΕΕ--1 или ΑΡΒΙΕ с ΤΑ или ΒΕ3. В предпочтительном варианте изобретения иммунизирующий агент содержит последовательность внеклеточного домена ΤΑ или 3^3, слитую с последовательностью ΙβΟ.
Как правило, либо используют лимфоциты периферической крови (ΡΒΕ), если требуются клетки человеческого происхождения, либо используют клетки селезёнки или лимфатических узлов, если требуются клетки млекопитающего нечеловеческого происхождения. Лимфоциты затем сливают с иммортализованной линией клеток, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, с образованием клетки гибридомы [Собшд, Мопос1опа1 Αпΐ^Ьοб^ез: Ргшс1р1ез апб Ргасйсе, Αсабет^с Ргезз, (1986), рр. 59-103]. Иммортализованная линия клеток обычно представляет собой трансформированные клетки млекопитающих, в особенности клетки миеломы грызунов, коров и человека. Обычно используют клеточные линии миеломы крыс и мышей. Клетки гибридомы можно культивировать в соответствующей культуральной среде, которая, предпочтительно, содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых иммортализованных клеток. Например, если в парентеральных клетках отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (НСΡКΤ или НРКЦ, культуральная среда для гибридом, как правило, включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ΗΑΤ), так как эти вещества предупреждают рост ΗСΡКΤ-дефектных клеток.
Предпочтительными линиями иммортализованных клеток являются такие клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антитела выбранными продуцирующими антитело клетками и чувствительны к среде, такой как среда ΗΑΤ. Более предпочтительными линиями иммортализованных клеток являются линии мышиной миеломы, которые можно получить, например, из 8а1к ЕчзШШе Се11 01з1г1Ьи(1оп СегИег 8ап П1едо, СаШогша и Американской коллекции типовых культур (Атепсап Τуре СиИиге Со11ес11оп, Мапаззаз, νίΓβίηίη). Также описано применение клеточных линий миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продуцирования человеческих моноклональньгх антител |КохЬог, 1. ^типоЕ, 133:3001 (1984); Бгобеиг е( а1., Мопос1опа1 Αпΐ^Ьοбу Ргобис1юп ΤесЬп^^иез апб Αрр1^саΐ^οпз, Магсе1 Эеккег Ечс. Νονν Υο^к, (1987) рр. 51-63].
Культуральную среду, в которой культивируют клетки гибридомы, затем можно анализировать на присутствие моноклональньгх антител против ΤΑ или ΒΕ3. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональньгх антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют иммунопреципитацией или ίη уйго анализом связывания, таким как радиоиммуноанализ (ΒΙΑ) или твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΟ8Α). Такие методы и анализы известны в технике. Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определить по диаграмме 8са1сйагб, см. Мипзоп апб Ро11агб, Αηο1. Βώς^, 107:220 (1980).
После того, как клетки заданной гибридомы идентифицированы, клоны можно субклонировать методами с ограничением разведения [Собшд, см. выше]. Соответствующие культуральные среды для этой цели включают, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла или среду КРМЫ640. Или же клетки гибридомы можно выращивать ίη νί\Ό в виде асцитов в организме млекопитающего.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно выделить или очистить от культуральной среды или асцитической жидкости обычными методами очистки иммуноглобулина, такими, например, как хроматография на протеин А-сефарозе, гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Моноклональные антитела можно также получать методами рекомбинантной ДНК, такими, которые описаны в патенте США 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко выделяется и секвенируется обычными методами (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжёлые и лёгкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат в качестве предпочтительного источника ДНК. Будучи выделена, ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфецируются в клетки-хозяева, такие как клетки Е. со11, клетки СО8 африканской зелёной мартышки, клетки яичников китайского хомячка или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, заме
- 49 007984 ной кодирующей последовательности - константные домены тяжёлой и лёгкой человеческих цепей вводят вместо гомологичных мышиных последовательностей, Моткоп, ек а1., Ргос. №11. Аса4. 8ск 81, 6851 (1984), или ковалентным связыванием с последовательностью, кодирующей иммуноглобулин, всей или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид.
Как правило, такие неиммуноглобулиновые полипептиды заменяются на константные домены антитела по изобретению, или они заменяются на вариабельные домены одного антиген-связывающего сайта антитела по изобретению для создания химерного бивалентного антитела, содержащего один антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к ТАС[к или ВК3, или другой антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью по отношению к другому антигену.
Химерные или гибридные антитела также можно получать ίη уйго методами, известными в области химического синтеза белков, включая методы с использованием перекрёстно связывающих агентов. Например, иммунотоксины можно конструировать, используя реакцию дисульфидного обмена, или с образованием тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реагентов включают иммунотиолят и метил-4-меркаптобутиримидат.
Также можно получать одноцепочечные Еу фрагменты, такие, которые описаны в Ша4ек ек а1., ЕЕВ8 Ьейегк, 409:437-441 (1997). Соединение таких одноцепочечных фрагментов с помощью различных линкеров описано в Когй ек а1., Ргокет Епдтееппд, 10:423-433 (1997). Ряд методов получения и обработки антител с помощью рекомбинантной ДНК хорошо известно в технике. Примеры, иллюстрирующие такие обычно применяемые методы, подробнее описаны ниже.
(ί) Гуманизированные антитела
Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, введённых в него из нечеловеческого источника. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют импортными остатками, которые, как правило, берут из импортного вариабельного домена. Гуманизацию в основном можно осуществлять по методу АйЛег ап4 со-^огкегк Цопек ек а1. №киге, 321:522-525 (1986); Шесйтапп ек а1., №киге, 332:323-327 (1988); Уегйоеуеп ек а1., 8с1епсе, 239:1534- 1536 (1988)] заменой СЭКк или СОВ последовательностей на соответствующие последовательности человеческого антитела.
Таким образом, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела, в которых существенно меньший, чем интактный человеческий вариабельный домен заменён на соответствующую последовательность нечеловеческого вида. Практически гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки СОК и, возможно, некоторые остатки ЕК (каркасной области) заменены на остатки из аналогичных сайтов антител грызунов.
Важно, чтобы антитела гуманизировались с сохранением высокой аффинности в отношении антигена и других предпочтительных биологических свойств. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела получают, анализируя исходные последовательности и различные концептуальные гуманизированные продукты с применением трёхмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трёхмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и знакомы специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и выявляют возможные трёхмерные конформационные структуры выбираемых иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Изучение этих визуальных представлений позволяет анализировать предполагаемую роль остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательности-кандидата, т.е. анализировать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. По этому способу остатки ЕК можно отобрать и отъединить от согласованной и импортной последовательности, так что получают заданную характеристику антитела, такую как повышенная аффинность по отношению к антигену(-ам)-мишени(-ям). Как правило, остатки СОК непосредственно и наиболее существенным образом влияют на связывание антигена.
(ίί) Человеческие антитела
Человеческие моноклональные антитела можно получать методом гибридом. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продукции человеческих моноклональных антител описаны, например, в КохЬог ί. [ттипоЬ 133:3001 (1984) и Вго4еиг ек а1., Мопос1опа1 АпйЬо4у Рго4исйоп Тесйпк.|иек ап4 Аррйсакюпк, рр. 51-63 (Магсе1 Эеккег [пс. №\ν Уогк, 1987).
В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации способны продуцировать набор человеческих антител в отсутствие продукции эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена соединяющей области тяжёлой цепи антитела (1н) в клетках химерных и гаметических мутантных мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенного антитела. Перенос зародышевого набора генов человеческого иммуноглобулина в таких гаметических мутантных мышей приводит к продуцированию человеческих антител после контрольного заражения антигеном. См., например, 1акоЬоуй/ ек а1., Ргос. №а1. Аса4. 8ск 90, 2551-255 (1993); ,1акоЬо\И/ ек а1., №киге, 362б 255-258 (1993).
Меп4ех ек а1. (№киге Сепейск 15: 146-156 [1997]) дополнительно усовершенствовали технологию и получили линию трансгенных мышей, обозначенную Хепотоике II, которая, после контрольного зара
- 50 007984 жения антигеном, вырабатывает полностью человеческие антитела с высокой аффинностью. Это достигается интеграцией локусов человеческой тяжёлой цепи и лёгкой цепи (размер определяется мегаоснованиями) в клетки мышей с делецией в эндогенном бц сегменте, как описано выше. Хепотоике ΙΙ укрывает локус человеческой тяжёлой цепи 1020 тыс. н.о., содержащий примерно 66 νΗ генов, целые ΌΗ и 6Η области и три различных константных области (μ, δ и χ), а также 800 тыс. н.о. человеческого локуса к, содержащего 32 гена νκ, бк сегменты и Ск гены. Антитела, вырабатываемые этими мышами, очень похожи на антитела, наблюдаемые у человека, во всех отношениях, включая реаранжировку генов, набор и репертуар. Экспрессия человеческих антител, предпочтительно, повышена по сравнению с эндогенными антителами вследствие делеции в эндогенном 6Η сегменте, который предупреждает реаранжировку гена в мышином локусе.
Или же можно применять метод фагового дисплея (МсСаГГеПу е1 а1, №1Шге 348, 552-553 [1990]) для получения человеческих антител и фрагментов антител ш убго, из набора генов вариабельной (V) области иммуноглобулина иммунизированных доноров. По этому методу гены домена V антитела клонируют в рамке считывания в ген либо основного, либо в минорного оболочечного белка нитевидного фага, такого как М13 или Гб, и выявляют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговых частиц. Так как нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекция на основе функциональных свойств антитела также приводит к отбору гена, кодирующего антитела, проявляющего такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах; обзор об этом см., например, бойикоп, Кеуш 8. апб СЫк^е11, Иау1б б., СиггеЩ Оршюп ш 81гис1ига1 Вю1оду 3, 564-571 (1993). Некоторые источники сегментов ν-гена можно использовать для фагового дисплея. С1асккоп е1 а1., №1Шге 352, 624-628 (1991) выделили обратный набор антител против оксазолона из малой случайной комбинаторной библиотеки ν генов из селезёнки иммунизированных мышей. Можно создать набор ν генов иммунизированных доноров-людей и можно выделить обратный набор антигенов (включая аутоантигены) в основном по методике, описанной Магкк е1 а1., б. Мо1. Вю1. 222, 581-597 (1991), или СпГШЬ е1 а1., ЕМВО б. 12, 725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антител аккумулируют мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). Некоторые из введённых изменений придают более высокую аффинность, а В-клетки, выявляющие иммуноглобулин с высокоафинной поверхностью, предпочтительно претерпевают репликацию и дифференцировку во время последующего контрольного заражения антигеном. Этот естественный процесс можно имитировать, применяя метод, известный как перестановка цепи (Магкк е1 а1., Вю/Тес11по1. 10, 779-783 [1992]). По этому методу аффинность первичных человеческих антител можно повысить путём последовательной замены генов V области тяжёлой и лёгкой цепей набором природных вариантов (репертуар) генов домена ν, полученных от иммунизированных доноров. Этот метод позволяет получать антитела и фрагменты антител с аффинностью в пределах нМ. Стратегия получения очень больших наборов фаговых антител (также известная как мать-всех-библиотек, 1йе-то1йег-оГ-а11 НЬгапек) описана Аа1ег1юике е1 а1., №с1. Αс^бκ Век. 21, 2265-2266 (1993). Перестановку генов можно также применять для получения человеческих антител из антител грызунов, при этом аффинность и специфичность человеческого антитела аналогичны аффинности и специфичности исходного антитела грызуна. По этому методу, который также называют эпитопный импринтинг, ген V домена лёгкой цепи антител грызуна, получаемый методом фагового дисплея, заменяют набором генов V домена человека, создавая химерные антитела грызуна-человека. Селекция на антиген приводит в результате к выделению вариабельной области, способной восстанавливать функциональный антиген-связывающий сайт, т. е. эпитоп диктует (управляет, отпечатывает) выбор партнёра. Когда процесс повторяют с целью замены оставшегося V домена грызуна, получают человеческое антитело (см. патентную заявку РСТ АО 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов методом СИВ трансплантации данный метод даёт полностью человеческие антитела, которые не содержат каркасных или СИВ остатков грызунов.
Как обсуждается ниже, антитела по изобретению могут необязательно представлять собой мономерные антитела, димерные антитела, а также поливалентные формы антител. Специалисты в данной области техники могут создать такие димерные или поливалентные формы методами, известными в технике. Методы получения одновалентных антител также хорошо известны в технике. Например, один метод включает рекомбинантную экспрессию лёгкой цепи и модифицированной тяжёлой цепи иммуноглобулина. Тяжёлую цепь усекают (срезают), как правило, в любой точке в области Ес таким образом, чтобы предупредить перекрёстное связывание тяжёлой цепи. Или же релевантные цистеиновые остатки заменяют на другой аминокислотный остаток или делетируют таким образом, чтобы предотвратить перекрёстное связывание.
(ΐϊϊ) Биспецифические антитела
Биспецифические антитела представляют собой моноклональные, предпочтительно, человеческие или гуманизированные антитела, которые обладают специфичностью связывания по отношению по меньшей мере к двум различным антигенам. В данном случае одна из характеристик специфичности связывания представляет собой специфичность в отношении рецептора ΤΑСIκ или ВВ3, другая в отношении
- 51 007984 любого другого антигена и, предпочтительно, в отношении другого рецептора или рецепторной субъединицы. Например, биспецифические антитела, специфически связывающиеся с рецептором ТАС1з или ВВ3 и другим рецептором апоптоза/передачи сигнала, входят в объём настоящего изобретения.
Методы получения биспецифических антител известны в технике. Традиционно рекомбинантное продуцирование биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжёлая цепь - лёгкая цепь иммуноглобулина, при которой две тяжёлых цепи обладают различной специфичностью (М111з!ет апб Сие11о, №11иге 305, 537-539 (1983)). Вследствие случайного набора тяжёлой и лёгкой цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) дают смесь молекул возможных 10 антител, из которых только одно имеет правильную (корректную) биспецифическую структуру. Очистка корректной молекулы, которую обычно проводят аффинной хроматографией (несколько стадий), достаточно громоздка и обременительна, а выходы продукта низки. Аналогичные методики описаны в патентной заявке РСТ АО 93/08829 (опубликованной 13 мая 1993 г.) и в Тгаипескег е! а1., ЕМВО 10, 3655-3659 (1991).
В соответствии с отличным от этого и более предпочтительным подходом вариабельные домены антитела с заданными специфичностями связывания (сайты соединения антитело-антиген) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Слияние, предпочтительно, осуществляют с константным доменом тяжёлой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, участки СН2 и СН3. Предпочтительно, чтобы первый константный участок тяжёлой цепи (СН1) содержал сайт, необходимый для связывания лёгкой цепи, присутствующего по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжёлой цепи иммуноглобулина и, если требуется, лёгкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфецируют в организм подходящего хозяина. Это обеспечивает большую гибкость при корректировке взаимных соотношений трёх фрагментов полипептида в вариантах изобретения, когда неравные соотношения трёх полипептидных цепей, используемых в конструкции, дают оптимальные выходы. Однако, можно вводить кодирующие последовательности для двух или всех трёх полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных отношениях высокие выходы или когда отношения не имеют особого значения. В предпочтительном варианте этого метода биспецифические антитела состоят из тяжёлой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания, с одной стороны, и пары тяжёлая цепь-лёгкая цепь гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания), с другой стороны. Найдено, что эта асимметричная структура облегчает отделение заданного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, так как присутствие лёгкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает простой способ отделения. Этот метод описан в публикации РСТ Международной патентной заявки АО 94/04690, опубликованной 3 марта 1994 г.
Более подробно получение биспецифических антител описано, например, в 8игезй е! а1., МеЙюбз ш Епхуто1оду 121,210(1986).
(ίν) Антитела - гетероконъюгаты
Антитела - гетероконъюгаты (гетероконъюгированные антитела) также входят в объём настоящего изобретения. Антитела - гетероконъюгаты состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие тела, например, были предложены, чтобы нацелить клетки иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (заявки РСТ АО 91/00360 и АО 92/200373; Европейский патент ЕР 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получать, используя обычные методы перекрёстного связывания. Соответствующие агенты для перекрёстного связывания хорошо известны в технике и наряду с несколькими методами перекрёстного связывания описаны в патенте США 4676980.
(ν) Фрагменты антител
В некоторых вариантах изобретения антитело против ТАС1з и против ВВ3 (включая мышиные, человеческие и гуманизированные антитела и варианты антител) представляет собой фрагмент антитела. Для получения фрагментов антитела созданы различные методы. Традиционно эти фрагменты получают протеолитическим расщеплением интактных антител (см., например, Мопто!о е! а1., 1. ВюсНет. Вюрйуз. МеФобз 24: 107-117 (1992) и Вгеппап е! а1., 8с1епсе 229:81 (1985)). Однако, в настоящее время эти фрагменты можно продуцировать непосредственно при использовании рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты ЕаЬ' можно прямо регенерировать из Е. сой и соединять химическими методами с образованием фрагментов Е(аЬ')2 (Сайег е! а1., Вю/Тесйпо1оду 10:163-167 (1992)). В другом варианте изобретения Е(аЬ')2 образуется с применением лейциновой застёжки-молнии ΟΓΝ4 для инициирования сборки молекулы Е(аЬ')2. Согласно другому методу фрагменты Γν, ЕаЬ или Е(аЬ')2 можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Некоторые методы получения фрагментов антитела очевиден для специалиста-практика. Например, можно проводить расщепление с применением папаина. Примеры гидролиза в присутствии папаина описаны в Международной заявке АО 94/29348, опубликованной 22/12 1994 г., и в патенте США 4342566. Гидролиз антител в присутствии папаина, как правило, даёт два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых ЕаЬ фрагменты, каждый содержит единственный антиген-связывающий сайт, и оставшийся Ес фрагмент. Обработка пепсином даёт фрагмент Е(аЬ')2, который содержит два антиген-связывающих сайта и ещё способен к перекрёстно
- 52 007984 му связыванию с антигеном.
Фрагменты ЕаЬ, образующиеся при гидролизе антитела, также содержат константные домены лёгкой цепи и первый константный домен (СНД тяжёлой цепи. Фрагмент ЕаЬ' отличается от фрагментов ЕаЬ добавлением нескольких остатков на карбоксиконце СН1 домена тяжёлой цепи, включая один или более цистеиновых остатков шарнирной области антитела. ЕаЬ'-8Н представляет собой принятое в данном описании обозначение ЕаЬ', в котором цистеиновый(е) остаток(ки) константных доменов несёт(ут) свободную тиольную группу. Фрагменты антитела Е(аЬ')2 первоначально получали в виде пар фрагментов, между которыми находятся цистеиновые остатки шарнирной области. Известны также другие химические соединения фрагментов антитела.
Антитела гликозилируют в консервативные положения в их константных областях (ЛеГГег1к апб Ьипб, СЬет. 1ттипо1. 65:111-128 [1997]; νή§1! апб Моткоп, Т1ЬТЕСН 15:26-32 [1997]). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на белковую функцию (Воуб е! а1., Мо1. 1ттипо1. 32:13111318 [1996]; \νίΙΙ\\Ό апб Но^агб, ВюсЬет. 29:4175-4180 [1990]) и на внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, которое может влиять на конформацию и имеющуюся трёхмерную поверхность гликопротеина (НеГГепк апб Ьипб, см. выше; Vукк апб Vадηе^, Сиггеп! Орш. Вю!есЬ. 7:409-416 [1996]). Олигосахариды могут также служить для нацеливания данного гликопротеина на определённые молекулы на основе структур специфического распознавания. Например, сообщалось, что в негалактозилированном (агалактазилированном) 1дС олигосахаридный фрагмент сбрасывается из меж-СН2 пространства и концевые остатки Ν-ацетилглюкозамина становятся доступными для связывания белка, связывающего маннозу (Ма1Ьо!га е! а1., №1Шге Меб. 1:237-243 [1995]). Удаление олигосахаридов из САМРАТН-1Н (рекомбинантное гуманизированное моноклональное 1дО1 антитело, которое распознаёт антиген ΕΌ\ν52 человеческих лимфоцитов) с помощью гликопептидазы в клетках яичников китайского хомячка (СНО) привело к полному сокращению лизиса, опосредованного комплементом (СМСЬ) (Воуб е! а1., Мо1. 1ттипо1. 32:1311-1318 [1996]), тогда как селективное удаление остатков сиаловых кислот с помощью нейраминидазы не привело к утрате ЭМСЕ. Сообщалось также, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС, А3КЦ). В частности сообщалось, что клетки СНО с регулируемой тетрациклином экспрессией β(1,4)-Ν- ацетилглюкозаминилтрансферазы III (ОпТШ), где гликозилтрансфераза катализирует разрезание 61сNΑс, повышает АЭСС (АЗКЦ) активность (Итапа е! а1., Ма!иге Вю!есЬ. 17:176-180 [1999]).
Варианты гликозилирования антител представляют собой варианты, в которых меняется тип (характер, структура) гликозилирования антитела. Под изменением понимается делеция одного или более углеводных фрагментов, обнаруживаемых в антителе, добавление одного или более углеводных фрагментов к антителу, изменение состава гликозилирования (тип гликозилирования), степени гликозилирования и т. д. Варианты гликозилирования можно получать, например, удаляя, заменяя и/или добавляя один или более сайтов гликозилирования в нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело.
Гликозилирование антител, как правило, бывает либо Ν-связанным, либо О-связанным. Νсвязанное гликозилирование относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X обозначает любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создаёт потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиламинокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя могут также использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования к антителу обычно выполняют, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы она содержала одну или более вышеописанных трипептидных последовательностей (для Ν-связанных сайтов гликозилирования). Изменение можно также делать, вводя, с помощью добавления или путём замены, один или более остатков серина или треонина в последовательность исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).
Гликозилирование (включая тип, структуру, характер гликозилирования) антител можно изменять, не изменяя основную нуклеотидную последовательность. Гликозилирование в большой степени зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Так как тип клеток, применяемых для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например антител, в качестве потенциальных терапевтических средств редко является нативной клеткой, можно ожидать значительных вариаций типа гликозилирования антител (см., например, Нке е! а1., 1. Вю1. СЬет. 272:9062-9070 [1997]). Помимо выбора клеткихозяина, факторы, которые влияют на гликозилирование в процессе рекомбинантного продуцирования антител, включают способ выращивания, состава среды, плотности культуры, окисления, рН, схем очистки и т. п. Различные методы были предложены для изменения типа гликозилирования, получаемого в конкретном организме-хозяине, включая введение или сверхэкспрессию некоторых ферментов, участвующих в продукции олигосахаридов (патенты США 5047335, 5510261 и 5278299). Гликозильный фрагмент, или некоторые типы гликозильных фрагментов) можно ферментативно удалить из гликопротеина, например, с помощью эндогликозидазы Н (Эндо Н). Кроме того, методом рекомбинантной ДНК можно
- 53 007984 получить рекомбинантную клетку-хозяина, например, сделать дефектной при процессировании некоторых типов олигосахаридов. Эти и аналогичные методы хорошо известны в технике.
Характер гликозилирования (структуру гликозильного фрагмента) антител можно легко проанализировать обычными методами анализа углеводов, включая хроматографию на лектинах, ЯМР, массспектрометрию, ВЭЖХ, ГПХ (СРС, гель проникающую хроматографию), анализ моносахаридного состава, последовательное ферментативное расщепление и НРАЕС-РАО, где используют анионообменную хроматографию с высоким значением рН для разделения олисахаридов в зависимости от заряда. Методы выделения олигосахаридов для аналитических целей также известны и включают, без ограничения, ферментативную обработку (обычно осуществляемую с использованием пептид-№гликозидаза Е/эндо-βгалактозидазы), элиминирование в сильнощелочной среде с выделением, в основном, О-связанных структур и химические методы в присутствии безводного гидразина с выделением как Ν-связанных, так и О-связанных олигосахаридов.
Триабоди (1г1аЬоб1с8) также входят в объём изобретения. Такие антитела описаны, например, в Шабск с! а1., см. выше, и Когй с! а1., см. выше.
Антитела по данному изобретению могут быть модифицированы конъюгацией антител с цитотоксическим агентом (подобным молекуле токсина) или активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см. Международную патентную заявку XVО 81/01145) в активное противораковое лекарственное соединение. См., например, Международную патентную заявку νθ 88/037378 и патент США 4975278. Эту технологию также называют Антителозависимая опосредованная ферментами пролекарственная терапия (АОЕРТ). Компонент фермента в иммуноконъюгате, применимый для АОЕРТ, включает любой фермент, способный действовать на пролекарство таким образом, чтобы превратить его в его более активную, цитотоксическую форму. Ферменты, которые применимы в этом методе по изобретению, включают, но без ограничения, щелочную фосфатазу для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные вещества; арилсульфатазу, применимую для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные вещества; цитозиндеаминазу для превращения нетоксического 5-фторцитозина в противораковое лекарственное соединение 5-фторурацил; протеазы, такие как протеиназа ксггаба, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и Ь), которые применимы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные лекарственные вещества; каспазы, такие как каспаза-3; Ό-аланилкарбоксипептидазы, применимые для превращения пролекарств, содержащих Όаминокислотные заместители; ферменты, расщепляющие углеводы, такие как бета-галактозидаза и нейраминидаза, применимые для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные вещества; бета-лактамазу, применимую для превращения лекарственных веществ, дериватизированных с помощью бета-лактамов, в свободные лекарственные вещества; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин V амидаза или пенициллин С амидаза, применимые для превращения лекарственных веществ, дериватизированных по атомам азота аминогрупп феноксиацетильной или фенилацетильной группами, соответственно, в свободные лекарственные вещества. Или же антитела с ферментативной активностью, также известные в технике как абзимы, можно применять для превращения пролекарств по изобретению в свободные активные лекарственные вещества (см., например, Макксу, №ш.1гс 328: 457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим можно получать, как указано в данном описании, для доставки абзима к популяции опухолевых клеток.
Ферменты можно связывать с антителами ковалентной связью методами, хорошо известными в технике, такими как связывание с применением гетеробифункциональных реагентов перекрёстного связывания. Или же, слитые белки, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающую область антитела по изобретению, связанную, по меньшей мере, с функционально активной частью фермента по изобретению, можно конструировать методом рекомбинантной ДНК, хорошо известным в технике (см., например, №иЬсгдсг с! а1., №!игс, 312: 604-608 (1984).
Рассматриваются дополнительные модификации антител. Так, антитело может быть связано с одним из ряда небелковых полимеров, например с полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Антитело можно также помещать в микрокапсулы, получаемые, например, методами коацервации или полимеризацией на границе раздела фаз (например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из полиметилметакрилата, соответственно), в коллоидные системы доставки лекарственных веществ (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсии. Такие методы описаны в Ксттд!оп'к Рйагтассийса1 8с1спсск, 164Ь сбйюп, Око1, А., Еб., (1980). Для увеличения времени полужизни антитела в кровяном русле можно ввести в антитело (особенно во фрагмент антитела) эпитоп, связывающий рецептор-мусорщик, как описано, например, в патенте США 5739277. Применяемый в данном описании термин эпитоп, связывающий рецептормусорщик (утилизатор), относится к эпитопу области Ес молекулы 1дС (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4), который отвечает за увеличение ш νί\Ό времени полужизни молекулы 1дС в кровяном русле.
Ό. Методы анализа
Изучение связывания лиганд/рецептор можно проводить любыми известными методами анализа,
- 54 007984 такими, как анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и методы иммунопреципитации. Клеточные анализы и животные модели можно использовать в качестве диагностических методов и для более глубокого понимания связи между взаимодействием лигандов и рецепторов по данному описанию и развитием и патогенезом состояний и заболеваний по данному описанию.
При одном подходе можно трансфецировать клетки млекопитающих с помощью лигандов или рецепторов по данному описанию и анализировать способность агонистов или антагонистов стимулировать или ингибировать связывание или активность. Можно трансфецировать соответствующие клетки при использовании заданного гена и проводить мониторинг активности. Такие трансфецированные клеточные линии можно затем использовать для испытания способности антагониста (ов) или агониста (ов) ингибировать или стимулировать, например, модулировать В-клеточную пролиферацию или 1д секрецию. Клетки, трансфецированные при использовании кодирующей последовательности генов, идентифицированных в данном описании, можно дополнительно использовать для идентификации лекарственных веществ - кандидатов для лечения иммунных заболеваний или рака.
Кроме того, первичные культуры, полученные от трансгенных животных, можно использовать в клеточных анализах. Методы получения непрерывных клеточных линий трансгенных животных хорошо известны в технике [см., например, 8та11 е! а1., Мо1. Се11. Вю1.. 5: 642-648 (1985)].
Один соответствующий клеточный анализ представляет собой добавление меченого эпитопом лиганда (например, АР или Е1ад) в клетки, которые содержат или экспрессируют соответствующий рецептор, и анализ связывания (в присутствии или в отсутствие предполагаемых антагонистов) окрашиванием ЕАС8 антителом против метки. В другом анализе анализируется способность антагониста ингибировать пролиферацию В-клеток, индуцируемую ТАйй-1 и АРК1Й. В-клетки или В-клеточные линии культивируют с ТАЙЙ-1 или АРКГЙ в присутствии или в отсутствие предполагаемых антагонистов, и пролиферацию В клеток можно измерять количеством введённого 3Н-тимидина или числом клеток.
Результаты ш νίΙΐΌ клеточных анализов можно дополнительно проверять, используя животные модели 1п у1уо. Ряд хорошо известных животных моделей можно использовать, чтобы глубже понять роль агонистов и антагонистов, идентифицированных в данном описании, в развитии и патогенезе, например, иммунного заболевания или рака и для испытания терапевтических агентов-кандидатов. 1п у1уо природа таких моделей делает особенно предсказуемыми ответы у пациентов-людей. Животные модели иммунных заболеваний включают как нерекомбинантных, так и рекомбинантных (трансгенных) животных. Нерекомбинантные животные модели включают, например, модели грызунов, например, мышиные модели. Такие модели можно получать, вводя клетки в сингенных мышей стандартными методами, например, подкожной инъекцией, инъекцией в хвостовую вену, имплантацией в селезёнку, внутрибрюшинной имплантацией и имплантацией в почечной капсуле.
Известны, например, животные модели гомологичной болезни. Гомологичная болезнь возникает, когда иммунокомпетентные клетки трансплантируют иммунодепрессивным или толерантным больным. Донорские клетки распознают антигены хозяина и отвечают на них. Ответ может меняться от угрожающего жизни тяжёлого воспаления до случаев умеренной диареи и потери веса. Модели гомологичной болезни дают способ оценки Т-клеточной реактивности против МНС антигенов и минорных антигенов трансплантата. Соответствующая методика подробно описана в Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду (Современные протоколы по иммунологии), раздел 4.3.
Животная модель отторжения аллотрансплантата - это способ испытания способности Т-клеток опосредовать ш у1уо повреждение тканей, которое является показателем и мерой их роли в антивирусном и противоопухолевом иммунитете. Наиболее общие и общепринятые модели используют трансплантаты кожи мышиного хвоста. Повторные эксперименты показали, что отторжение кожного аллотрансплантата опосредуется Т-клетками, хелперными Т-клетками и Т-клетками - киллерами-эффекторами, но не антителами [Лисй^ηс1о88, Н. 1г. апб 8асйк, И. Н., Еипбатеп!а1 1ттипо1оду, 2пб еб., ^.Е. Раи1 еб., Кауеп Ргекк, NΥ, 1989, 889-992]. Подходящая методика подробно описана в Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду (Современные протоколы по иммунологии), раздел 4.4. Другие модели отторжения трансплантата, которые можно использовать для испытания композиций по изобретению, являются моделями аллогенного трансплантата сердца, описанными ТапаЬе, М. е! а1., Тгапкр1ап1айоп, (1994) 58:23 и ТшиЬи, 8. А. е! а1., 1. 1ттипо1., (1994), 4330-4338.
Животные модели гиперчувствительности замедленного типа позволяют провести также анализ опосредуемой клеткой иммунной функции. Реакции гиперчувствительности замедленного типа представляют собой ш у1уо опосредуемый Т-клетками иммунный ответ, характеризующийся воспалением, которое достигает пика спустя некоторое время после заражения антигеном. Эти реакции также происходят при тканеспецифических аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (Μ8) и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ, модель М8). Соответствующая методика подробно описана в Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, раздел 4.5.
Животной моделью артрита является артрит, индуцированный коллагеном. Эта модель имеет общие клинические, гистологические и иммунологические характеристики с человеческим аутоиммунным ревматоидным артритом и является подходящей моделью человеческого аутоиммунного артрита. Мышиная и крысиная модели характеризуются бурситом, эрозией хряща и субхондральной кости. Соедине
- 55 007984 ния по изобретению можно тестировать на активность против иммунного артрита, используя протоколы, описанные в Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, см. выше, раздел 15.5. См. также 1ккеки1х, А. С. е! а1., 1ттипо1оду, (1996) 88:569.
Описана модель астмы, в которой антиген-индуцированная гиперреактивность дыхательных путей, лёгочная эозинофилия и воспаление индуцируются сенсибилизацией животного овальбумином и последующим заражением животного тем же белком, доставляемым с помощью аэрозоля. Некоторые животные модели (морские свинки, приматы, иные, нежели человек) проявляют симптомы, сходные с симптомами атопической бронхиальной астмы у людей при заражении антигенами в виде аэрозоля. Мышиные модели имеют многие особенности человеческой астмы. Соответствующие методики тестирования композиций по изобретению на активность и эффективность при лечении астмы описаны Ао1ушес, А.А. е! а1., Ат. 1. Кекрп. Се11 Мо1. Вю1., (1998) 18: 777 и цитируемые там ссылки.
Кроме того, на животных моделях можно проводить испытания композиций по изобретению на заболевания, подобные псориазу. Соединения по изобретению можно испытывать на кс14/кс14 мышиной модели, описанной 8сйоп, М. Р. е! а1., №11. Ме4., (1997) 3183, в которых мыши демонстрируют гистопатологические кожные поражения, напоминающие псориаз. Другая соответствующая модель - это химера человеческая (кожа) ккш/кс14 мыши, получаемая, как описано №ско1оГГ, В. 1., Ат. 1. Ра!й., (1995) 146:580.
Хорошо известны различные животные модели для испытания противораковой активности предполагаемой терапевтической композиции. Эти животные модели включают введение ксенотрансплантата опухоли в бестимусных голых мышей или кс14/кс14 мышей, или генетических мышиных моделей опухоли, таких как р53 нокаутированные мыши.
Рекомбинантные (трансгенные) животные модели можно получить, вводя кодирующий участок молекул, идентифицируемых в данном описании, в геном представляющих интерес животных стандартными методами получения трансгенных животных. Животные, которые могут служить в качестве мишени для трансгенной манипуляции, включают, без ограничения, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, овец, коз, свиней и приматов, отличных от человека, например павианов, шимпанзе и мартышек. Известные в технике методы введения трансгена в таких животных включают микроинъекцию в пронуклеус (Норре ап4 Аапдег, патент США 4873191); перенос генов в зародышевые линии, опосредованный ретровирусом (см., например, Уап 4ег Рийеп е! а1., Ргос. №111. Аса4. 8с1. И8А, 82, 6148-6150 [1985]); нацеливание генов в эмбриональных стволовых клетках (Тйотркоп е! а1., Се11, 56, 313-321 [1989]); электропорация эмбрионов (Ьо, Мо1. Се1. Вю1, 3, 1803-1814 [1983]); перенос генов опосредованный сперматозоидами (Ьауйгапо е! а1., Се11, 57, 717-73 [1989]). Обзор см., например, в патенте США 4736866.
Для целей настоящего изобретения трансгенные животные включают таких животных, которые несут трансген только в части своих клеток (мозаичные животные). Трансгены можно интегрировать либо в виде одиночного трансгена, либо в виде конкатемерных молекул, например, тандемов голова-кголове или голова-к-хвосту. Селективное введение трансгена в конкретный тип клеток возможно также по методу Ьакко е! а1., Ргос. №111. Аса4. 8ск И8А, 89, 6232-636 (1992).
Экспрессию трансгена в трансгенных животных можно контролировать стандартными методами. Например, для проверки интеграции трансгена можно применять методы Саузерн-блоттинга или ПЦР (РСК)-амплификации. Уровень экспрессии можно анализировать, используя такие методы, как гибридизация ш кйн, Нозерн-блоттинг, РСК (ПЦР) или иммуноцитохимия. Помимо этого, животных проверяют на признаки иммунной патологии, например, с помощью гистологического исследования с целью определить инфильтрацию иммунных клеток в специфические ткани или проверить наличие раковой или злокачественной ткани.
Или же можно создать нокаутированных животных, содержащих дефектный или изменённый ген, кодирующий полипептид, идентифицируемый в данном описании, в результате гомологичной рекомбинации между эндогенным геном, кодирующим полипептид, и изменённой геномной ДНК, кодирующей тот же самый полипептид, введённой в зародышевую клетку животного. Например, кДНК, кодирующую конкретный полипептид, можно использовать для клонирования геномной ДНК, кодирующей этот полипептид, в соответствии с принятыми методами. Участок геномной ДНК, кодирующей конкретный полипептид, можно делетировать или заменить на другой ген, такой как ген, кодирующий селективный маркёр, который можно использовать для мониторинга интеграции. Как правило, несколько тысяч нуклеотидных оснований неизменённой фланкирующей ДНК (как на 5', так и на 3' конце) вводят в вектор [см., например, в Тйотак ап4 СарессЫ, Се11, 51:503 (1987) описание векторов для гомологичной рекомбинации]. Вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, электропорацией) и отбирают клетки, в которых введённая ДНК гомологично рекомбинирована с эндогенной ДНК [см., например, Ь1 е! а1., Се11, 69:915 (1992)]. Затем отобранные клетки инъецируют в бластоцисту животного (например, мыши или крысы) с целью образования агрегаций химер [см., например, Вга41еу, ш Тега!осагстотак ап4 ЕтЬгуошс 8!ет Се11к: А Ргас!юа1 Арргоасй, Е. 1. КоЬейкоп, е4. (1КЬ, ОхГог4, 1987), рр. 113-152]. Затем химерный эмбрион можно имплантировать в подходящую ложнобеременную вынашивающую самку животного, и эмбрион развивается в нокаутированное животное. Потомство, укрывающее гомологично рекомбинированную ДНК в своей зародышевой линии, можно идентифицировать стандартными методами и использовать для разведения животных, у которых все клетки содержат гомологично реком
- 56 007984 бинированную ДНК. Нокаутированные животные могут характеризоваться, например, своей способностью сопротивляться некоторым патологическим состояниям и развитием патологических состояний в отсутствие полипептида.
Е. Рецептуры (препараты)
Молекулы ΤАСIз или ВК3, или антагонисты или агонисты по данному описанию, необязательно применяют в носителе. Подходящие носители и их рецептуры описаны в Кетшд!оп'з РНагтасеи!1са1 8с1епсез, 16'1' еб. 1980, Маск РиЬЬзЫпд Со., ебйеб Ьу Озо1 е! а1. Как правило, для того, чтобы сделать состав изотоническим, в носителе используют соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли. Примеры носителей включают физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН носителя составляет, предпочтительно, около 5-8, и, более предпочтительно, около 7,4-7,8. Специалистам в данной области техники очевидно, что некоторые носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от способа введения и концентрации вводимого активного агента. Носитель может быть в форме лиофилизированного препарата или водного раствора.
Подходящие носители, эксципиенты или стабилизаторы, предпочтительно, являются нетоксическими для клеток и/или реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее, примерно, 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как Е^ΤА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ион натрия; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ΤVЕЕNΤМ, РШгошсз™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕС).
Препарат может также содержать более одного активного соединения, если необходимо по конкретным показаниям, предпочтительно, активные соединения с комплементарными активностями, которые не оказывают вредного действия друг на друга.
ΤАСIз, или ВК3, или антагонисты, или агонисты по данному описанию можно также помещать в микрокапсулы, получаемые, например, методами коацервации или полимеризацией на границе раздела фаз, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных веществ (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсии. Такие методы описаны в Кет1пд!оп'з Р11агтасеиЬса1 8с1епсез, 16'1' ебйюп, Озо1, А., Еб., (1980).
Препараты для применения ш у1уо должны быть стерильными. Этого легко достичь с помощью стерильных фильтрационных мембран.
Можно приготовить препараты пролонгированного действия. Соответствующие примеры препаратов пролонгированного действия включают полупроницаемые матриксы (подложки, носители) из твёрдых гидрофобных полимеров, содержащих активный агент, причём эти матриксы находятся в виде имеющих форму предметов, например, плёнок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного действия включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт, полилактиды (патент США 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и γ-этил-Ьглутамата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как ШРКОМ ЭЕРОЕ™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата) и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляная кислота. В то время как полимеры, такие как сополимеры этилена-винилацетата и молочной кислоты-гликолевой кислоты способны высвобождать молекулы в течение 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени.
Е. Способы терапии
Молекулы по данному описанию применимы для лечения различных патологических состояний, таких как иммунные заболевания или рак. Эти состояния можно лечить, стимулируя или ингибируя выбранную активность, ассоциируемую с ^^-1, АРШЬ, ΤАСI, ВСМА, ΤАСIз или ВК3 у млекопитающих, например, введением одного или более антагонистов или агонистов по данному описанию.
Диагностику у млекопитающих различных патологических состояний по данному описанию могут осуществлять опытные практики. Диагностические методы доступны в практике и позволяют, например, диагностировать или детектировать рак или иммунное заболевание у млекопитающих. Например, рак можно идентифицировать методами, включающими, но без ограничения, пальпацию, анализ крови, рентгеновское излучение, ЯМР и т.п. Иммунные заболевания также можно легко идентифицировать. При системной красной волчанке главным медиатором заболевания является продукция аутоантител к собственным белкам/тканям и последующее развитие иммунноопосредованного воспаления. Затрагивается клиника многих органов и систем, включая почки, лёгкие, скелетно-мышечную систему, кожно
- 57 007984 слизистые ткани, глаза, центральную нервную систему, сердечно-сосудистую систему, желудочнокишечный тракт, костный мозг и кровь.
Ревматоидный артрит (КА) представляет собой хроническое системное аутоиммунное воспалительное заболевание, которое, главным образом, затрагивает синовиальную мембрану многих суставов, в конечном итоге поражается суставной хрящ. Патогенез зависит от Т-лимфоцитов и его связывают с продуцированием ревматоидных факторов, аутоантител против собственного ГдС, в результате чего образуются иммунные комплексы, которые достигают высоких уровней в синовиальной жидкости и в крови. Эти комплексы в суставах могут вызывать заметное проникновение лимфоцитов и моноцитов в синовиальную оболочку и последующие заметные синовиальные изменения; в синовиальное пространство/синовиальную жидкость проникают те же клетки с добавлением множества нейтрофилов. Ткани, которые поражаются прежде всего, это суставы, часто характер поражения симметричен. Однако, также проявляется внесуставное заболевание в двух основных формах. Одна форма - это развитие внесуставных поражений наряду с непрерывно прогрессирующим заболеванием суставов и поражения, типичные для пневмосклероза, васкулит и кожные язвы. Вторая форма внесуставного заболевания - это так называемый синдром Фелти, который появляется позже в ходе заболевания КА (ревматоидным артритом), иногда после того, как заболевание суставов становится бессимптомным и включает нейтропению, тромбоцитопению и спленомегалию. Это может сопровождаться васкулитом во многих органах с появлением инфарктов (участков некрозной ткани), кожных язв и гангрены. У больных также часто появляются ревматоидные узелки в подкожной ткани над поражёнными суставами; узелки на последней стадии имеют некротические центры, окружённые инфильтратом из смешанных воспалительных клеток. Другие проявления, которые могут наблюдаться при КА , включают перикардит, плеврит, коронарный артериит, интестициальный пневмонит с пневмосклерозом, сухой кератоконъюнктивит и ревматоидные узелки.
Ювенильный хронический артрит представляет собой хроническое идиопатическое воспалительное заболевание, которое часто начинается ранее 16-летнего возраста. Его фенотип имеет сходство с КА; некоторые пациенты, являющиеся позитивными по ревматоидному фактору, классифицируются как больные ювенильным ревматоидным артритом. Заболевание подразделяется на три основных категории: затрагивающее немного суставов (малосуставное), полисуставное и системное. Артрит может быть тяжёлым и, как правило, разрушительным и приводит к внутрисуставному анкилозу и замедленному росту. Другие проявления могут включать хронический передний увеит и системный амилоидоз.
Спондилоартропатии представляют собой группу расстройств с некоторыми общими клиническими особенностями и общей связью с экспрессией НБА-В27 генного продукта. Расстройства включают анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера (реактивный артрит), артрит, обусловленный псориазом, ювенильную спондилоартропатию и недифференцированную спондилоартропатию. Отличительные особенности включают сакроилеит со спондилитом или без него; воспалительный асимметрический артрит; ассоциацию с НБА-В27 (серологически определяемый аллель локуса НЬА-В класса Г МНС); воспаление глаз и отсутствие аутоантител, обусловленных другим ревматоидным заболеванием. Клеткой, наиболее активной, ключевой в индукции заболевания, является СЭ8+ Т-лимфоцит, клетка, которая нацелена на антиген, презентированный молекулами МНС класса Г. Т-клетки СЭ8+ могут реагировать против аллеля НБА-В27 МНС класса Г как если бы он был чужеродным пептидом, экспрессируемым молекулами МНС класса Г. Была высказана гипотеза, что эпитоп НБА-В27 может имитировать бактериальный или другой микробный антигенный эпитоп и таким образом индуцировать СЭ8+ Т-клеточный ответ.
Системный склероз (склеродермия) имеет неизвестную этиологию. Критерием заболевания является кожное уплотнение; по-видимому, оно индуцировано активным воспалительным процессом. Склеродермия может быть локализованной или системной; сосудистые поражения являются обычными, а эндотелиальное клеточное поражение в микроциркуляторной части сосудистого русла является ранним и важным событием в развитии системного склероза; сосудистое поражение может быть иммуноопосредованным. Иммунологическая основа подразумевается присутствием инфильтратов мононуклеарных клеток в кожных поражениях и присутствием антинуклеарных антител у многих пациентов. ГСАМ-1 часто позитивно регулируется на клеточной поверхности фибробластов в повреждениях кожи, что наводит на мысль, что Т-клеточное взаимодействие с этими клетками может играть роль в патогенезе заболевания. Другие затронутые органы включают желудочно-кишечный тракт: атрофия гладких мускулов и фиброз в результате аномальной перистальтики/сократительной способности; почки: концентрическая пролиферация субэндотелиальных интимальных клеток, влияющая на малую дугообразную и междольковые артерии, что приводит к пониженному почечному кортикальному кровотоку, и, в результате, к протеинурии, азотемии и гипертензии; скелетные мышцы: атрофия, интерстициальный фиброз; воспаление; лёгкие: интерстициальный пневмонит и интерстициальный фиброз; и сердце: некроз сокращающегося предсердно-желудочкового пучка, рубцевание/фиброз.
Идиопатические воспалительные миопатии, включая дерматомиозит, полимиозит и прочее, являются нарушениями, хроническим мышечным воспалением неизвестной этиологии, приводящим в результате к мышечной слабости. Поражение мышц/воспаление часто бывает симметричным и прогрессирующим.
Аутоантитела ассоциированы с большинством форм. Эти миозит-специфические аутоантитела на
- 58 007984 правлены против и ингибируют функцию компонентов, белков и РНК, участвующих в синтезе белка.
Синдром Шегрена вызван иммуноопосредованным воспалением и последующей функциональной деструкцией слёзных желёз и слюнных желёз. Заболевание может ассоциироваться с или сопровождаться воспалительными заболеваниями соединительной ткани. Заболевание обусловлено выработкой антител против антигенов Ко и Ьа, каждый из которых является комплексом малая РНК-белок. Поражения приводят к сухому кератоконъюнктивиту, ксеростомии с другими проявлениями или ассоциациями, включая билиарный цирроз печени, периферическую или сенсорную невропатию и пальпируемую пурпуру.
Системный васкулит представляет собой группу заболеваний, при которых первичным поражением является воспаление и последующее повреждение кровеносных сосудов, приводящее к ишемии/некрозу/дегенерации тканей, питаемых повреждёнными сосудами, и, в некоторых случаях, к возможному концу - дисфункции органа. Васкулиты могут также возникать как вторичные поражения или осложнения других иммунно-воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системный склероз и т.д., в частности, при заболеваниях, также обусловленных образованием иммунных комплексов. Заболевания, составляющие группу первичного системного васкулита, включают системный некротический васкулит; полиартериит нодоза, аллергический ангиит и гранулёматоз, полиангиит; гранулёматоз Вегенера; лимфоматоидный гранулёматоз; и гигантоклеточный артериит. Смешанные васкулиты включают синдром кожно-слизистых лимфоузлов (МЬ№ или синдром Кавасаки), изолированный васкулит ЦНС, болезнь Бехета (Бехчета?), облитерирующий тромбангиит (болезнь Бюргера) и кожный некротический венулит. Полагают, что механизм патогенеза большинства перечисленных типов васкулита заключается в первичном отложении комплексов иммуноглобулина на стенке сосуда и последующей индукции воспалительного ответа либо с помощью АОСС, либо активацией комплемента, либо при участии той и другой.
Саркоидоз представляет собой состояние неизвестной этиологии, которое характеризуется присутствием эпителиоидных гранулём почти в любой ткани организма; лёгкие затрагиваются чаще всего. Патогенез включает устойчивость активированных макрофагов и лимфоидных клеток в местах заболевания с последующим хроническим осложнением в результате локального или системного выделения активных продуктов, высвобождаемых этими типами клеток.
Аутоиммунная гемолитическая анемия, включающая аутоиммунную гемолитическую анемию, иммунную панцитопению и пароксизмальную ночную гемоглобинурию, является результатом продукции антител, которые реагируют с антигенами, экспрессируемыми на поверхности эритроцитов (и, в некоторых случаях, других гемоцитах, включая также тромбоциты), и отражает удаление этих покрытых антителами клеток по механизму лизиса, опосредуемого комплементом и/или АОСС/Бс-рецептором.
При аутоиммунной тромбоцитопении, включая тромбоцитопеническую пурпуру и иммуноопосредованную тромбоцитопению в других клинических проявлениях, деструкция/удаление тромбоцитов происходит в результате присоединения (прикрепления) к тромбоциту либо антитела, либо комплемента и последующего удаления по механизму лизиса, опосредуемого комплементом, АОСС или Бсрецептором.
Тиреоидит, включая болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит и атрофический тиреоидит, является результатом аутоиммунного ответа на тиреоидные антигены с продукцией антител, которые реагируют с белками, присутствующими в щитовидной железе и часто являющимися специфическими для щитовидной железы. Существуют опытные модели, включая спонтанные модели: крысы (крысы ВИБ и ВВ) и цыплята (штамм жирных цыплят); индуцибельные модели: иммунизация животных любым тиреоглобулином, тиреоидным микросомным антигеном (тиреоидная пероксидаза).
Сахарный диабет типа Г, или инсулинзависимый диабет, представляет собой аутоиммунное разрушение островковых β-клеток поджелудочной железы; это разрушение опосредуется аутоантителами и аутореактивными Т-клетками. Антитела к инсулину или рецептор инсулина могут также вырабатывать фенотип неотвечаемости-на-инсулин.
Иммуноопосредованные заболевания почек, включая гломерулонефрит и канальцевоинтерстициальный нефрит, являются следствием опосредованного антителом или Т-лимфоцитом поражения почечной ткани либо прямо (непосредственно) в результате продукции аутореактивных антител или Т-клеток против почечных антигенов, либо опосредованно, в результате отложения в почках антител и/или иммунных комплексов, реактивных против других, не почечных антигенов. Так, другие иммуноопосредованные заболевания, которые приводят к образованию иммунных комплексов, могут также индуцировать иммуноопосредованное почечное заболевание как непрямое осложнение. Как прямой, так и непрямой иммунные механизмы приводят в результате к воспалительному ответу, который продуцирует/индуцирует развитие поражения (повреждения) в почечных тканях, в конечном счёте с ухудшением функции органа и, в некоторых случаях, с развитием почечной недостаточности. Как гуморальный, так и клеточный механизмы иммунного ответа могут принимать участие в патогенезе поражений.
Полагают, что демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, включая рассеянный склероз (М3); идиопатическую демиелинизирующую полиневропатию, или син
- 59 007984 дром Гийена-Барре; и хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, имеют аутоиммунную основу и приводят к демиелинизации в результате поражения, наносимого олигодендроцитам или непосредственно миелину. В случае М8 существует данные, говорящие о том, что индукция и прогрессирование заболевания зависят от Т-лимфоцитов. Рассеянный склероз представляет собой демиелинизирующее заболевание, которое является Т-лимфоцитозависимым и имеет либо рецидивирующее-затихающее (ремиссии) течение, либо хроническое прогрессирующее течение. Этиология неизвестна; однако, вирусные инфекции, генетическая предрасположенность, окружающая среда и аутоиммунитет - все вносят свой вклад. Патологические изменения содержат инфильтраты, преимущественно опосредуемые Т-лимфоцитами, микроглию и инфильтрационные макрофаги; предпочтительным типом клеток в патологических изменениях являются СЭ4+ Т-лимфоциты. Механизм гибели олигодендроцитов и последующей демиелинизации неизвестен, но, по-видимому, приводится в действие Т-лимфоцитами.
Воспалительное и фиброзное заболевание лёгких, включая эозинофильные пневмонии; идиопатический пневмосклероз и пневмонит у сверхчувствительных индивидуумов, могут включать несогласованную иммунно-воспалительную реакцию. Ингибирование этой реакции было бы терапевтически предпочтительно.
Аутоиммунное или иммуноопосредованное кожное заболевание, включая буллёзные кожные заболевания, полиморфную эритему и контактный дерматит, опосредованы аутоантителами, происхождение которого зависит от Т-лимфоцитов.
Псориаз является опосредованным Т-лимфоцитами воспалительным заболеванием. Патологические изменения содержат инфильтраты Т-лимфоцитов, макрофагов и антигенпроцессирующих клеток и некоторые нейтрофилы.
Аллергические заболевания, включая астму; аллергический ринит; диффузный нейродермит; пищевая гиперчувствительность; и крапивница являются Т-лимфоцитзависимыми. Эти заболевания, преимущественно, обусловлены индуцированным Т-лимфоцитами воспалением, 1дЕ - опосредованным воспалением или их комбинацией.
Заболевания, обусловленные трансплантацией, включая отторжение трансплантата и гомологичную болезнь (ΟνΗΌ), являются Т-лимфоцитзависимыми; ингибирование Т-лимфоцитной функции оказывает положительное действие (улучшает состояние).
Другие заболевания, при которых вмешательство иммунного и/или воспалительного ответа оказывает благотворное действие, представляют собой инфекционное заболевание, включая, но без ограничения, вирусную инфекцию (включая, но без ограничения, СПИД, гепатит А, В, С, Ό, Е), бактериальную инфекцию, грибковые инфекции и протозойные и паразитические инфекции (молекулы (или производные/агонисты), которые стимулируют МЬК, могут иметь применение в терапии для повышения иммунного ответа на инфекционные агенты), заболевания, вызванные иммунодефицитом (молекулы(/производные/агонисты), которые стимулируют МЬК, могут иметь применение в терапии для повышения иммунного ответа на состояния врождённого, приобретённого, индуцированного инфекцией (как при ВИЧ-инфекции), или ятрогенного (т.е. в результате химиотерапии) иммунодефицита) и неоплазию.
Антагонист(ы) или агонист(ы) можно вводить в соответствии с хорошо известными методами, такими как внутривенное введение в виде болюса или с помощью непрерывного вливания в течение некоторого времени, внутримышечное, внутрибрюшинное, интрацереброспинальное (инъекция в спинной мозг), подкожное, внутрисуставное, подоболочечное, (пер)оральное, местное введение и введение с помощью ингаляции. Необязательно, введение можно осуществлять инфузией (вливанием) с помощью мининасоса, применяя различные промышленные устройства. Антагонисты или агонисты можно также применять, используя методы генной терапии, известные из уровня техники.
Эффективные дозировки и схемы введения антагонистов или агонистов можно определить эмпирически, и проведение таких определений находится в компетенции специалистов в данной области техники. Можно применять однократные или многократные дозы. В настоящее время считают, что эффективная доза или количество антагониста или агониста, применяемого самостоятельно, может быть в пределах около 1 мкг/кг-100 мг/кг веса тела или более в день. Расчёт доз в зависимости от вида можно осуществлять известным в технике методом, см., например, в Могбеиб е! а1., РЛагтасеи!. Кек., 8:1351 (1991).
Если применяют введение 1и у1уо агониста или его антагониста, нормальные дозы могут варьироваться, примерно, от 10 нг/кг вплоть до 100 мг/кг веса тела млекопитающего или более в день, предпочтительно около 1 мкг/кг/день-10 мг/кг/день, в зависимости от способа введения. Указания по конкретным дозам и методам доставки приводятся в литературе; см., например, патенты США 4657760; 5206344 или 5225212. Прогнозируется, что для различных лекарственных веществ и в случае различных нарушений эффективны различные рецептуры, что нацеливание на один орган или одну ткань, например, может сделать необходимым иной способ доставки, чем доставка в другой орган или в другую ткань. Специалисты в данной области техники понимают, что доза антагониста или агониста, которую следует вводить, меняется в зависимости, например, от млекопитающего, которое получает этот агонист или антагонист, способа введения и других лекарственных веществ или другого получаемого млекопитающим лечения.
В зависимости от типа клетки и/или тяжести заболевания в качестве начальной дозы для введения
- 60 007984 антитела антагониста или антитела агониста предполагается примерно 1 мкг/кг-15 мг/кг (например, 0,120 мг/кг), например, в виде одного или более раздельных приёмов или в виде непрерывного вливания. Типичная дневная доза может быть в пределах около 1 мкг/кг-100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. Что касается повторных введений через несколько дней или позднее, в зависимости от состояния, лечение продолжают (поддерживают), пока не появится заданное ослабление симптомов заболевания. Однако могут применяться другие схемы приёма лекарственного средства.
Необязательно, перед приёмом любого антагониста или агониста млекопитающего или пациента проверяют, определяя уровни или активность ^66-1, АРШБ, ΤАСI, ВСМА, ΤАСIк или ΕΚ3. Такие определения (испытания) можно проводить, анализируя методами ЕЬ18А или РАС8 образцы сыворотки или лейкоциты периферической крови.
В способах по изобретению можно использовать один тип антагониста или агониста. Например, можно вводить антагонист ΤΆ^^-1, такой как молекула иммуноадгезина рецептора ΤАСIк. Или же опытный специалист-практик может предпочесть применение комбинации антагонистов или агонистов в этих методах, например, комбинацию иммуноадгезина рецептора ΤАСIк и антитело против АРГОВ. Кроме того, может быть желательным применять двойной антагонист, т. е. антагонист, который действует, блокируя или ингибируя как ΤΆ^^-1, так и АРГОВ. Молекула такого антагониста может, например, связываться с эпитопами, консервативные в ΤΆ^^-1 и АРШБ, или в ΤАСI, ΤАСIк, ΕΚ3 и ВСМА.
Рассматривается, что в способах по изобретению может применяться и дополнительное лечение. Один или более других способов лечения могут включать, но без ограничения, облучение, цитокин(ы), агент(ы), ингибирующий(е) рост, химиотерапевтический(е) агент(ы), цитотоксический(е) агент(ы), ингибиторы тирозинкиназы, гак ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы ангиогенеза и ингибиторы циклинзависимой киназы, которые известны в технике и конкретно определяются дополнительно выше, в разделе I. Кроме того, может применяться терапия на основе терапевтических антител, которые нацелены на опухолевые антигены, такие как ΚιΙηχ^'™ или Негсерйи™, а также антиангиогенные антитела, такие как анти-УЕСк.
Препарат и схемы приёма химиотерапевтических агентов можно осуществлять в соответствии с инструкциями производителя или они определяются эмпирически опытным специалистом-практиком. Препарат и схемы такой химиотерапии также описаны в СЬето!бегару 8егисе Еб., М.С. Репу, νίΒία!'^ & νίΜ^, ВаШтоге, МИ (1992). Введение химиотерапевтического агента может предшествовать введению или следовать за введением, например, антагониста или может быть одновременным. Антагонист, например, может также соединяться с антиэстрогеном, таким как тамоксифен, или антипрогестероном, таким как онапристон (см. Европейский патент ЕР 616812), в дозах, известных для таких молекул.
Может быть желательным вводить также антитела против других антигенов, такие как антитела, которые связываются с СИ20, СИ11а, СИ18, СИ40, ЕгЬВ2, ЕСТЮ ЕгЬВ3, ЕгЬВ4, васкулярным эндотелиальным фактором (УЕСР) или другими представителями семейства ΤΝΕΚ (такими как ΌΚ4, ΌΚ5, ОРС, ΤΝΕΚ1, ΤΝΕΚ2). Или же, или в дополнение к этому, два или более антител, связывающих антигены по данному описанию, могут совместно вводиться пациенту. Иногда может быть полезно вводить больному один или более цитокинов. В одном варианте изобретения антагонисты по данному описанию вводят совместно с агентом, ингибирующим рост. Например, агент ингибитор роста можно вводить сначала, а затем антагонист по данному изобретению.
Антагонист или агонист (и одно или более других лекарственных веществ) можно вводить одновременно или последовательно. После введения антагониста или агониста обработанные 1и Х11го клетки можно анализировать. Если обработку осуществляют 1и νίνΌ, мониторинг обработанного (пролеченного) млекопитающего осуществляют различными способами, известными опытным специалистам-практикам. Например, можно анализировать маркёры В-клеточной активности, такие как продукция (неспецифическая или антиген-специфическая).
С. Способы скрининга
Изобретение также охватывает способы скрининга молекул с целью идентификации тех из них, которые могут вести себя как агонисты или антагонисты взаимодействия ΆРΚI^/ΤАСIк или взаимодействия ΤА^^-1/ΤАСIк/ВΚ3. Такие молекулы могут представлять собой низкомолекулярные соединения или полипептиды, включая антитела. Примеры малых молекул включают, но без ограничения, малые пептиды или пептидоподобные молекулы, предпочтительно растворимые пептиды, и синтетические непептидильные органические или неорганические соединения. Анализы по скринингу на лекарственные вещества-кандидаты предназначены для идентификации молекул, которые связываются или образуют комплекс с лигандами-полипептидами или рецепторными полипептидами по данному описанию, или иным образом участвуют во взаимодействии этих полипептидов с другими клеточными белками. Такие методы скрининга включают анализы, позволяющие с высокой производительностью проводить скрининг химических библиотек, что делает их особенно пригодными для идентификации низкомолекулярных лекарственных веществ-кандидатов.
Анализы можно проводить в различных форматах, включая анализы белок-белкового связывания, биохимические методы скрининга, иммуноанализы и клеточные анализы, которые хорошо описаны в технике.
- 61 007984
Общим для анализов на антагонисты является, например, то, что они требуют контактирования лекарственного вещества-кандидата с полипептидным лигандом или рецептором по данному описанию в условиях и в течение времени, достаточных для взаимодействия этих двух компонентов.
В анализе связывания взаимодействие представляет собой связывание, и образовавшийся комплекс можно выделить или детектировать в реакционной смеси. В конкретном варианте изобретения лигандили рецептор-полипептид по данному описанию или лекарственное вещество-кандидат иммобилизуют на твёрдой фазе, например, на титрационном микропланшете, с помощью ковалентного или нековалентного присоединения. Нековалентное соединение, как правило, выполняют, покрывая твёрдую поверхность раствором полипептидного лиганда или рецептора с последующей сушкой. Или же иммобилизованное антитело, например, моноклональное антитело, специфическое в отношении лиганда или рецепторного полипептида, который должен быть иммобилизован, можно использовать для прикрепления его к твёрдой поверхности. Анализ проводят, добавляя неиммобилизованный компонент, который может быть мечен детектируемой меткой, к иммобилизованному компоненту, например, к покрытой поверхности, содержащей прикреплённый компонент. По завершении реакции непрореагировавшие компоненты удаляют, например, отмывают, и комплексы, прикреплённые к твёрдой поверхности, обнаруживают. Если первоначально неиммобилизованный компонент несёт обнаруживаемую метку, детектирование метки, иммобилизованной на поверхности, показывает, что комплексообразование произошло. Если первоначально неиммобилизованный компонент не несёт метку, комплексообразование можно обнаружить, например, используя меченое антитело, специфически связывающееся с иммобилизованным комплексом. Если соединение-кандидат взаимодействует, но не связывается с конкретным лигандомполипептидом или рецепторным полипептидом по данному описанию, его взаимодействие с полипептидом можно проанализировать хорошо известными методами обнаружения белок-белковых взаимодействий. Такие анализы включают традиционные подходы, такие, например, как перекрёстное (кросс) связывание, совместная иммунопреципитация и совместная очистка на градиентной или хроматографической колонке. Кроме того, белок-белковое взаимодействие можно контролировать, используя генетическую систему дрожжей, описанную Ие1бз аиб со-^откетз (Ие1бз аиб 8оп§, Ыа!иге (Ъоп6оп), 340:245-246 (1989); СЫеη е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8Л, 88:9578-9582 (1991)), и раскрытую СЬеутау аиб НаИаш, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8Л, 89:5789-5793 (1991). Многие активаторы транскрипции, такие как 6АЬ4 активатор транскрипции дрожжей, состоят из двух физически дискретных модулярных доменов, один действует как ДНК-связывающий домен, второй действует как домен активации транскрипции.
Система экспрессии дрожжей, описанная в предыдущих публикациях (в целом называемая двухгибридная система), использует это свойство и применяет два гибридных белка, один из которых, белок-мишень, слит с ДНК-связывающим доменом САЬ4, а второй, по которому кандидаты-активирующие белки слиты с активирующим доменом. Экспрессия репортёрного гена САЬ1-1ас2 под контролем САЬ4активированного промотора зависит от восстановления САЬ4 активности с помощью белок-белкового взаимодействия. Колонии, содержащие взаимодействующие полипептиды, детектируют хромогеном на β-галактозидазу. Полный набор (МЛТСНМАКЕК™) для идентификации белок-белковых взаимодействий между двумя специфическими белками с применением двухгибридного метода, выпускается С1оп1ес11. Эта система может также распространяться на картирование белковых доменов, участвующих во взаимодействиях специфических белков, а также для точного определения аминокислотных остатков, которые являются ключевыми для этих взаимодействий.
Соединения или молекулы, которые участвуют во взаимодействии лиганда-полипептида или рецепторного полипептида по данному описанию с другими внутри- или внеклеточными компонентами, можно анализировать следующим образом: обычно готовят реакционную смесь, содержащую продукт взаимодействия гена и внутри- или внеклеточного компонента в условиях и в течение времени, позволяющих взаимодействие и связывание двух продуктов. Для анализа способности соединения-кандидата ингибировать связывание проводят реакцию в отсутствие и в присутствии испытуемого соединения. Кроме того, к третьей реакционной смеси можно добавлять плацебо в качестве позитивного контроля. Связывание (образование комплекса) между испытуемым соединением и внутри- или внеклеточным компонентом, присутствующим в смеси, контролируют, как описано выше. Образование комплекса в контрольной(ых) реакции(ях), но не в реакционной смеси, содержащей испытуемое соединение, указывает, что испытуемое соединение участвует во взаимодействии испытуемого соединения и его реакционного партнёра.
Для анализа на антагонисты лиганд-полипептид или рецепторный полипептид можно добавлять в клетку наряду с соединением, подвергаемым скринингу на конкретную активность, и способность соединения ингибировать интересующую экспериментатора активность в присутствии полипептидного лиганда или рецепторного полипептида показывает, что соединение является антагонистом лигандаполипептида или рецепторного полипептида. Или же антагонисты можно обнаруживать, объединяя полипептидный лиганд или рецепторный полипептид и потенциальный антагонист с мембраносвязанными полипептидными рецепторами или рекомбинантными рецепторами в соответствующих условиях для проведения анализа методом конкурентного ингибирования. Полипептидньш лиганд или рецептор может быть меченым, например, радиоактивным атомом, так что число полипептидных молекул, связанных с рецептором, можно использовать для определения эффективности потенциального антагониста. Ген,
- 62 007984 кодирующий рецептор, можно идентифицировать многими методами, известными специалистам в данной области техники, например, пэннингом лигандов и сортировкой с помощью ΕАСδ. СоИдап с! а1., Сиггеп! Рго!осо1§ ш 1ттип., 1(2): СЬар!сг 5 (1991). Предпочтительно используют экспрессирующее клонирование, при котором полиаденилированную РНК получают при использовании клетки, (иммунно) отвечающей на полипептидньш лиганд или рецептор, а библиотеку кДНК, созданную при использовании РНК, делят на пулы и используют для трансфецирования СОδ клетки или другие клетки, которые (иммунно) не отвечают на полипептидный лиганд или рецептор. Трансфецированные клетки, которые выращивают на предметных стёклах, экспонируют с меченым полипептидным лигандом или рецептором. Полипептидный лиганд или рецептор можно метить различными методами, включая йодирование или включение сайта распознавания сайт-специфической протеинкиназы. После фиксации и инкубации предметные стёкла подвергают ауторадиографическому исследованию. Позитивные пулы идентифицируют и подпулы готовят и повторно трансфецируют, используя интерактивный процесс получения субпулов и повторного скрининга, в конце концов, получая единственный клон, который кодирует возможный рецептор.
В качестве альтернативного подхода меченый полипептидный лиганд можно связать методом фотоафинности с клеточной мембраной или экстрактами препаратов, которые экспрессируют рецепторную молекулу. Перекрёстно связанный материал разрешают методом РАСс и экспонируют с рентгеновской плёнкой. Меченый комплекс, содержащий рецептор, можно подвергнуть эксцизии, разложить на пептидные фрагменты и провести микросеквенирование белка. Аминокислотную последовательность, полученную в результате микросеквенирования, используют для создания вырожденных олигонуклеотидных зондов для скрининга библиотеки кДНК с целью идентификации гена, кодирующего возможный (предполагаемый) рецептор.
Н. Промышленные изделия
В другом варианте изобретения предлагается промышленное изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения нарушений, описанных выше. Промышленное изделие представляет собой контейнер и метку. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая эффективна для лечения состояния и может иметь стерильный доступ (например, контейнер может представлять собой пакет (мешочек) или ампулу для внутривенного раствора с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Активные агенты в композиции могут представлять собой антагонист(ы) или агонист(ы). Метка на контейнере или связанная с контейнером указывает, что промышленное изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать другие материалы, желательные с точки зрения производителя или пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
Нижеследующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но ни в коей мере не в качестве ограничения. Раскрытие всех цитированных источников в перечне недвусмысленно вводится в данное описание в качестве ссылки.
Пример 1. Идентификация и экспрессирующее клонирование ТАСИ и ВК3
Химерный белок, называемый АР-ТАЬЬ-1, получают, используя щелочную фосфатазу (АР) человеческой плаценты, слитую с Ν-концом полипептида ТАЬЬ-1, состоящего из аминокислот 136-285, показанных на фиг. 3. АР получен ПЦР амплификацией с применением рАР!ад-5 (СспсЬип!сг Согрогабоп) в качестве матрицы, сливают и клонируют в экспрессирующий вектор, рСМУ-1 Е1ад ^1дта), с АР на Νконце ТАЬЬ-1. АР-ТАЬЬ-1 транзиторно трансфецируют (используя реагент липофектамин; С1Ьсо-ВКЬ) и экспрессируют в эмбриональных клетках 293 почек человека 293 (АТСС). Кондиционированную среду от трансфецированньгх клеток 293 отфильтровывают (0,45 мкм), хранят при 4°С в буфере, содержащем 20 мМ Нсрск (рН 7,0) и 1 мМ азида натрия, и используют для последующего окрашивания клеток.
Для идентификации рецептора к ТАЬЬ-1, в векторе рКК5 (Европейская патентная заявка ЕР 307247, опубликованная 15 марта 1989 г.) создают библиотеку экспрессии кДНК, используя мРНК Ро1уА+селезёнки человека и клетки ΙΜ-9 [Иападап с! а1., Сс11, 63:185 (1990); ТаПадНа с! а1, Сс11, 83:12631271 (1995)]. Пулы из ~ 1000 клонов кДНК (Минипрепарат ДНК (О1адсп)) из библиотеки трансфецируют (с использованием липофектамина) в клетки С0δ7 (АТСС) в 12-луночных планшетах с использованием Еидспс 6 (КосЬс Мо1сси1аг ВюсЬсткаЕ), которые через 36-48 ч инкубируют с АР-ТАЬЬ-1 кондиционированной средой, отмывают и окрашивают на АР активность ш δίΐιι. [Уап с! а1., см. выше, (2000)]. Позитивный пул разделяют на пулы последовательно меньшего размера, которые не содержат ни ТАС1, ни ВСМА. После нескольких циклов скрининга идентифицируют кДНК, кодирующую АР-ТАЬЬ-1 связывающую активность. Секвенирование инсерта кДНК выявляет единственную открытую рамку считывания, по предварительным данным кодирующую белок с единственной прогнозируемой трансмембранной областью. Этот полипептид (аминокислотные остатки 1-184 на фиг. 6В) назван ВК3 (другая
- 63 007984 кДНК, кодирующая АР-ТЛЬЬ-1 и АР - АРВ1Ь связывающую активность, также идентифицирована, и эту молекула идентифицирована как ТАС1з и описана дополнительно ниже).
Сравнительный анализ первичной структуры последовательностей показывает, что молекула ВВ3, по-видимому, не является членом суперсемейства ΊΝΕ-рецепторов, это суперсемейство, как правило, определяется присутствием характеристических множественных богатых цистеином повторов во внеклеточном связывающем лиганд домене. Эти аминокислотные псевдоповторы, как правило, определяются тремя внутримолекулярными дисульфидными мостиками, образованными шестью высококонсервативными цистеиновыми остатками [Ьоскз1еу е! а1., Се11, 104:487-501 (2001)]. Кроме того, внеклеточный домен ВВ3 не показывает гомологии с каким-либо представителем Т№-рецепторного семейства. Далее, ВВ3 содержит только четыре цистеиновых остатка в своём эктодомене. Поиск в базе данных выявил возможный мышиный ортолог ВВ3 (инвентарный номер АК008142 в СепВапк). Аналогично человеческому ВВ3, идентифицированному выше, мышиный ВВ3 (тВВ3) содержит только четыре цистеиновых остатка. Полные (от начала до конца) НВВ3 и тВВ3 показывают идентичность 56%. Как в НВВ3, так и в тВВ3 отсутствует Ν^-концевой сигнальный пептид, указывая на то, что они являются трансмембранными белками типа III [Айзоп - ВаМз е! а1., У1го1оду, 201:66-76 (1994)]. По-видимому, внутриклеточный домен ВВ3 является высококонсервативным в НВВ3 и в тВВ3.
Анализ методом Нозерн-блоттинга осуществляют по обычным методикам, известным специалистам в данной области техники. Коротко говоря, блоты человеческих и мышиных полиА+ РНК нормальных тканей (С1оп!есН) гибридизуют в соответствии с инструкциями производителя. Меченые 32Р зонды получают, используя фрагменты ДНК, соответствующие нуклеотиду, кодирующему область человеческого или мышиного ВВ3. Как показано на фиг. 9В, относительно высокие уровни экспрессии обнаруживаются в тканях селезёнки человека или мыши и в мышиных яичках.
Помимо этого, ПЦР (РСВ) анализ панели человеческой кДНК показывает наиболее высокую экспрессию человеческого ВВ3 в покоящихся СЭ19+ В-клетках (фиг. 9С), это согласуется с тем, что ВВ3 является рецептором для ТАНИ или В-клеток. Таким образом характер (тип) экспрессии человеческого ВВ3 отличен от типа экспрессии ТАС1 и ВСМА. В то время, как ВСМА, по-видимому, является специфическим в отношении В-клеток, а ТАС1 экспрессируется как В-клетками, так и активированными Тклетками [ЬааЫ е! а1., 8с1епсе, 289:883-884 (2000); Стаз е! а1., 1п!. 1ттипо1., 7:1093-1106 (1995); νоη Ви1оте е! а1., 8с1епсе, 278:138-141 (1997); Кйаге е! а1., Тгепбз 1ттипо1., 22:61-63 (2001)], наблюдается высокий уровень экспрессии ВВ3 покоящимися В-клетками и обнаруживается также в покоящихся Т-клетках. Сообщалось, что ген мышиного ВВ3 транскрипционно активируется в одном из четырёх АКХО штаммов мышей, восприимчивых к В-клеточному лейкозу и к В-клеточной лимфоме [Напзеп е! а1., Сепоте Вез., 10:237-243 (2000)].
Лиганды, меченые Е1ад, получают следующим образом. Аминокислоты 105-250 последовательности АРВ1Ь (см. фиг. 4) клонируют в вектор рСМУ-1 Е1ад (81дта) в сайт НшбШ, что приводит в результате к слиянию с аминокислотами 1-24 сигнальной последовательности Е1ад и последовательности метки. Аминокислоты 124-285 ТАРЬИ (см. фиг. 3) сливают с аминокислотами 1-27 сигнальной последовательности Е1ад и последовательности метки, как описано для Над-АРВЩ за исключением того, что используют сайт Νθί1. АР-АРВШ получают, клонируя аминокислоты 105-250 последовательности АРВГЬ (см. фиг. 4) в вектор рСМУ-1 Е1ад, кодирующий щелочную фосфатазу человеческой плаценты, таким образом, что последовательность, кодирующая АРВЩ сливается по С-концу с АР, тогда как АР сливается по С-концу с Е1ад. АР-ТАНЬИ получают, клонируя аминокислоты 136-285 последовательности ТАНЬИ (см. фиг. 3) в рСМУ-1 Е1ад, АР вектор, как описано выше для АР- АРВГЬ. Затем соответствующие меченые белки экспрессируют в клетках 293 или клетках СНО и очищают на смоле М2 анти-Над (81дта).
мкг очищенного Иад-АРВШ или Над-ТАНЬИ инкубируют с 1 мкг очищенного человеческого иммуноадгезина, содержащего слияние 1дС1-Ес ЕСЭ (внеклеточного домена) ВВ3 или ТАС1, в течение ночи при 4°С. Иммуноадгезины ТАСЬЕСО.ЬЕс получают методами, описанными Азйкепа71 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сй, 88:10535-10539 (1991). Конструкция иммуноадгезина состоит из аминокислот 2-166 человеческого полипептида ТАС1 (см. фиг. 1). Конструкции ТАС1-ЕСЭ экспрессируют в клетках СНО, используя гетерологичную сигнальную последовательность (пре-про-трипсиновые аминокислоты 1-17 рСМУ-1 Е1ад (81дта)) и кодирующую человеческий 1дС1 Ес область в 5'-3' направлении от последовательности ТАС1, а затем очищают аффинной хроматографией с протеином А. Иммуноадгезины ВВ3ЕСЭ получают по методу, описанному АзНкепа71 е! а1., цитированному выше. Конструкции иммуноадгезинов состоят из аминокислот 2-62 человеческого полипептида ВВ3 (см. фиг. 6В). Конструкции ВВ3ЕСЭ экспрессируют в клетках СНО, используя гетерологичную сигнальную последовательность (препро-трипсиновые аминокислоты 1-17 вектора рСМУ-1 Е1ад (81дта)) и кодирующую человеческий 1дС1 Ес область в 5'-3' направлении от последовательности ВСМА, а затем очищают аффинной хроматографией с протеином А.
Смесь подвергают иммунопреципитации с помощью рецептор-иммуноадгезина с протеин Аагарозой (Верйдеп). Затем иммунопреципитаты анализируют методом Вестерн-блоттинга с конъюгированным с пероксидазой хрена М2 тАЬ против Е1ад (81дта) для обнаружения лигандов, меченых Е1ад. Над-ТАГЬИ, но не Е1ад-АРШЬ, легко обнаруживается в комплексе с НВВ3-НЕс, тогда как ТАС1-НЕс свя
- 64 007984 зывает как Е1ад-ТАЬЬ-1, так и Пад-АРКЬ. Эти результаты показывают, что в отличие от ТАС[ и ВСМА, ВК3 специфически связывается с ТАЬЬ-, но не с АРК1Ь.
В ш У1кго анализе клетки С087 (АТСС) засевают в 12-луночные планшеты за 24 ч перед трансфекцией. Затем клетки трансфецируют с 1 мкг ТАС[ (форму из 265 аминокислот человеческого ТАС[, описанного выше, клонируют в вектор рКК5В, см. ниже) или одним плазмидным вектором (рКК5В). Через 18-24 ч после трансфекции клетки инкубируют с кондиционированной средой, содержащей АР-ТАЬЬ-1 или АР-АРКЬЬ, в течение 1 ч при комнатной температуре и окрашивают на АР активность ш к1ки, как описано в Тайадйа ек а1., Се11, 83:1263-1271 (1995).
Трансфекция экспрессирующей конструкции 11ВК3 или тВК3 в клетки С087 придаёт свойство прочного связывания с АР-ТАЬЬ-1, но не с АР-АРКГЬ (фиг. 10 и не приведённые данные). Напротив, как АР-ТАЬЬ-1, так и АР- АРКГЬ связаны с ТАСЬтрансфецированными клетками. Слитый белок человеческого Ес, содержащий эктодомен 11ВК3 (йВКЗ-№с), связанный с клетками С087, трансфецированными экспрессирующей конструкцией, кодирующей полноразмерную трансмембранную форму ТАЬЬ-1, но не с клетками, экспрессирующими АРШЬ.
Человеческий Т№-альфа клонируют в вектор рКК5В (рКК5В является предшественником рКК5О, который не содержит сайт 8ГИ; см. Но1тек ек а1., 8с1епсе, 253:1278-1280 (1991)). Для обнаружения экспрессии ТЫЕ-альфа на клеточной поверхности, метку Е1ад встраивают между аминокислотой 70 и аминокислотой 71 (применяют нумерацию в соответствии с последовательностью в Рептса ек а1., см. выше). Внеклеточную область ТАЬЬ-1 (аа 75-285; см. фиг. 3), 4-1ВВЬ (аа 59-254; Соо4\\'ш ек а1., Еиг. I. [ттипоЬ 23:2631 - 2641 (1993)), лиганд С1)27 (аа 40-193; СоосЫп ек а1., Се11, 73:447-456 (1993)), СП30 11дап4 (аа 61-234; 8ιηί11ι ек а1., Се11, 73:1349-1360 (1993)), РАККЬ (аа 71-317; см. Международную патентную заявку ν0 98/28426), лиганд Аро-2 (аа 40-281; см. Международную патентную заявку ν0 97/25428) или Аро3Ь (аа 46-249; см. Международную патентную заявку ν0 99/19490) по отдельности клонируют в сайт Ватн[. В результате этого получают химерный лиганд с внутриклеточной и трансмембранной областями Т№-альфа и внеклеточной областью различных лигандов. Для АРЩЬ (см. фиг. 4) и Е^Л-Л1. ЕЬАА2 (8пуаккауа ек а1., см. выше) используют клоны полноразмерной кДНК без метки Е1ад.
Трансфецированные клетки С08 7 последовательно инкубируют с иммуноадгезином ТЛС[.ЕС^.йЕС. 11Вг3-11Ес или тВК3-йЕс (полученны, как описано выше). Клетки инкубируют с ТАС[ ЕСЬ-[дС (или конструкцией ТНРКЫдб, полученной как описано в АкНЕема/! ек а1. Ргос. №к1. Аса4. 8сЕ, 88:10535-10539 (1991)), при плотности1 мкг/мл в течение 1 ч в РВ8. Клетки последовательно отмывают три раза РВ8 и фиксируют 4% параформальдегидом в РВ8. Окрашивание клеток визуализируют инкубацией с биотинилированным антителом козы против человеческого иммуноглобулина (Иасккоп ЬаЬк, при разведении 1:200), а затем Су3-стрептавидином (Иасккоп ЬаЬк, при разведении 1:200). Мышиный ВКЗ-Ес, подобно йВКЗ-№с, тоже связывается только с ТАЬЬ-1-трансфецированными, но не АРКГЬ-трансфецированными клетками С087 (данные не показаны). Кроме того, йВК3-йЕс не удаётся связать с клетками, экспрессирующими некоторых других представителей семейства Т№, включая СО27Ь, СО30Ь, СО40Ь, Е^Л-Л1. ЕОА-АЗ, 4-1ВВЬ, ЕакЬ, Лро2^/ТКЛI^, Аро3Ь/Т№ЕАК, 0Х-40Ь, или СИТКЕ (данные не показаны). Напротив, слитый белок ТАС[-1Ес связывается с клетками, трансфецированными либо ТАЬЬ-1, либо АРШЬ (фиг. 10).
В анализе №-кВ клетки 293 (АТСС) засевают за 24 ч перед тем, как их трансфецируют при плотности 1х10 клеток/лунка в 12-луночные планшеты и трансфецируют с 0,25 мкг ЕЬАМ-плазмида, несущая репортёрный ген люциферазы, 25 нг рКЬ-ТК (Рготеда) и указанные количества каждой экспрессирующей конструкции (см. фиг. 10). Общее количество трансфецированной ДНК поддерживают постоянным, 1 мг, добавляя пустой вектор рКК5В. Клетки собирают через 20-24 ч после трансфекции и определяют активность репортёрного гена, используя двойную люциферазную репортёрную аналитическую систему (Пиа1-ЬисИегаке Керойег Аккау 8уккеш (Рготеда)).
При трансфекции в клетки 293 как ТАСТ так и ВСМА индуцируют абсолютную активацию НЕ-кВ в зависимости от дозы, как определено анализом активации репортёрного гена. В аналогичных условиях ни 1ВК3, ни тВК3 не стимулируют заметную активацию ХЕ-кВ (фиг. 10). Вряд ли неспособность ВК3 активировать №-кВ в этом анализе вызвана слабой экспрессией ВК3, так как уровень связывания ВК3трансфецированных клеток с литандом (АР-ТАЬЬ-1) эквивалентен уровню связывания ТАС[ или ВСМАтрансфецированных клеток (фиг. 10 и неприведённые данные).
Несмотря на то, что характерная экспрессия ВК3 в селезёнке и, в частности, В-клетками, согласуется с тем, что он является функциональным рецептором для ТАЬЬ-1, характер (тип) его экспрессии отличен от типа экспрессии ТАС[ и ВСМА. ВСМА специфичен в отношении В-клеток, а ТАС[ экспрессируется как В-клетками, так и активированными Т-клетками [ЬааЫ ек а1., 8с1епсе, 289:883-884 (2000); Сгак ек а1., [пк ^типок, 7:1093-1106 (1995); уоп Ви1о\у ек а1., 8с1епсе, 278:138-141 (1997); Кйаге ек а1., Тгеп4к Iтшиηо1., 22:61-63 (2001)]. Напротив, ВК3 на высоком уровне экспрессируется покоящимися В-клетками и в заметной степени покоящимися Т-клетками. По-видимому, он негативно регулируется при активации. Интересно, что, как сообщалось, ген тВК3 транскрипционно активируется в одном из четырёх АКХЭ мышиных штаммов, чувствительных к В-клеточной лейкемии и лимфоме [Напкеп ек а1., Сепоте Кек., 10:237-243 (2000)]. Полагают, что ВК3 может являться важным рецептором при В-клеточном го
- 65 007984 меостазе и нарушение его регуляции может играть роль в развитии В-клеточных опухолей.
Как ΑΡΡΙΕ так и ΤΑ^^-1 связываются с ΤΑСI и с ВСМА; однако некоторое предпочтение в связывании наблюдается с ΤΑСI-ΤΑ^^-1 и ВСМА-ΑРВI^, являющимися предпочтительными партнёрами [Магк1егк е! а1., см. выше (2000)]. Напротив, эксперименты по данному описанию показывают, что ВВ3 связывается с ΤΑ^^-1, но не с ΑΡΡΙΕ Несмотря на то, что показано, что ΑΡΡΙΕ первоначально идентифицированный как фактор роста опухолевых клеток, связывается как с ΤΑСI, так и с ВСМА [Матйегк е! а1., см. выше (2000); Аи е! а1., б. Вю1. Сйет.. 275 :35478 (2000); Υυ е! а1., ΝΛ. Iттииο1., 1 :252-256 (2000)], его физиологическая роль в В-клеточной функции не выяснена полностью. Так как ВВ3 специфичен в отношении ΤΑ^^-1, полагают, что введение ВВ3-Рс (такое как введение иммуноадгезина мышам) должно блокировать индуцируемую ΤΑ^^-1, но не ΑΡΡΙΡ активацию ΤΑСI и ВСМА.
Изучение мышей Α/Αν8ΐ'ΐ6 с В-клеточной недостаточностью, которые, в отличие от родственного Α/б штамма, имеют единственный аутосомный кодоминантный локус, названный Встб (вследствие дефекта созревания В-клеток), который отвечает за абсолютный дефицит в периферических В-клетках, описано в ЬепЦ е! а1., б. Iттииο1., 157:598-606 (1996); Беп!/ е! а1, б. Iттииο1.. 160:3743- 3747 (1998); ^ад е! а1, Iттииοдеиейсκ, 51:924-929 (2000)]. Локус Встб картирован в средней области 15 хромосомы мыши, расположенной там, где ВВ3 картирован на человеческой хромосоме Ν22. Сообщалось, что В-клетки селезёнки мышей Α/Αу8п^ не дают пролиферативного ответа на рекомбинантный ΤΑ^^-1 ни ш νίΙΐΌ, ни ш у1уо. В настоящее время полагают, что генный дефект в таких Α/Αу8η^ мышах, определяемый генетически локусом Встб, находится в гене, кодирующем ВВ3. В экспериментах заявителя ВТ-РСВ-анализом не удаётся выявить присутствие ВВ3 транскрипта ни в РНК, выделенной из селезёнки, ни в В-клеточной РНК мышей Α/Αν8ι·ι6 (полученных от доктора Мюйае1 Сапсго, ишуегкйу оГ Реппкубуапба, Рййабе1рЫа, РΑ), тогда Гог транскрипт на ΤΑСI контроль легко обнаруживается в некоторых образцах. Напротив, полный ген, кодирующий ВВ3, легко обнаруживается в мышах АД. Эти данные согласуются с инактивацией ВВ3 при делении гена, как ответственной за отсутствие периферических В-клеток, наблюдаемое у Α/Αν8ΐ'ΐ6 мышей. В настоящее время полагают, что сигнальный путь, занятый ВВ3, может отвечать за В-клеточные пролиферативные эффекты ΤΑ^^-1 и за то, что в отсутствие ВВ3 В-клеточный гомеостаз может быть поставлен под угрозу.
Было найдено, что молекула ΤΑСIκ, описанная выше, определяемая скринингом, кодирует полипептид, содержащий аминокислоты с 1 до 246 на фиг. 5В. Аналогично ВВ3 полипептид, по-видимому, включает единственный богатый цистеином домен. Предполагаемый ЕСЭ содержит аминокислотные остатки с 1 до 119 на фиг. 5В. В ш уйго анализах связывания (проводимых, как описано выше, с целью обнаружения окрашивания ΑΕ^ΑΕ-ΕΠ и окрашивания АР-ΑРВI^) обнаружено, что ΤΑСIκ связывается как с ΤΑ^^-1, так и с ΑРВI^ (данные не показаны).
Пример 2. Экспрессия полипептидов ΤΑСIκ или полипептидов ВВ3 в Е. сой
Этот пример иллюстрирует получение форм полипептидов ΤΑСIκ и форм полипептидов ВВ3 методом экспрессии рекомбинантного белка в Е. сой.
Для экспрессии полипептида ΤΑСIκ последовательность ДНК, кодирующую полноразмерный полипептид ΤΑСIκ или его фрагмент или вариант, сначала амплифицируют, используя выбранные РСВ праймеры. Для экспрессии полипептида ВВ3 последовательность ДНК, кодирующую полноразмерный полипептид ВВ3 или его фрагмент или вариант, сначала амплифицируют, используя выбранные РСВ праймеры.
Примеры должны содержать сайты рестриктаз, которые соответствуют сайтам рестриктаз на выбранном экспрессирующем векторе. Примером подходящего вектора является рВВ322 (из Е. сой; см. Войуаг е! а1., Οеие, 2:95 (1977)), который содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Вектор расщепляют рестриктазой и дефосфорилируют. Затем амплифицированные методом РСВ последовательности лигируют в вектор. Вектор, предпочтительно, включает последовательности, которые кодируют ген устойчивости к антибиотикам, промотор 1гр, лидер полигистидина (ро1у-Шк) (включая первые шесть кодонов 8ТП, последовательность полигистидина (ро1у-Шк) и сайт расщепления энтерокиназой), область, кодирующую полипептид ΤΑСIκ, или область, кодирующую полипептид ВВ3, терминатор транскрипции фага лямбда и ген агди.
Затем смесь для лигирования используют для трансформации выбранного штамма Е. сой по методам, описанным в 8атЬгоок е! а1., см. выше. Трансформанты идентифицируют по их способности расти в чашках ЬВ, а затем выбирают колонии, устойчивые к антибиотикам. Можно выделить плазмидную ДНК и подтвердить строение рестрикционным анализом и секвенированием ДНК.
Отобранные клоны можно выращивать в течение ночи в жидкой культуральной среде, такой как бульон ЬВ, дополненный антибиотиками. Культуру, стоявшую в течение ночи, можно затем использовать для инокуляции культуры в больших масштабах. Затем клетки выращивают до заданной оптической плотности, при этом промотор экспрессии обращается.
После культивирования клеток ещё в течение нескольких часов клетки можно собирать центрифугированием. Дебрис, полученный при центрифугировании, можно солюбилизировать, используя различные реагенты, известные в технике, а затем солюбилизированный полипептид ΤΑСIκ или солюбилизированный полипептид ВВ3 можно очистить, используя колонку для хелатирования металла в условиях,
- 66 007984 позволяющих тесное связывание полипептида.
Пример 3. Экспрессия полипептидов ТАС1к или полипептидов ВК3 в клетках млекопитающих
Этот пример иллюстрирует получение форм полипептидов ТАС1к или полипептидов ВК3 методом экспрессии рекомбинантного белка в клетках млекопитающих.
Вектор рКК5 (см. Европейскую патентную заявку ЕР 307247, опубликованную 15 марта 1989 г.) используют в качестве экспрессирующего вектора. Необязательно, ДНК, кодирующую полипептид ТАС1к, лигируют в рКК5 при использовании выбранных рестриктаз, позволяющих инсерцию ДНК, кодирующей полипептид ТАС1к, методами лигирования, такими, которые описаны в 8атЬгоок с! а1., см. выше. Полученный вектор назван рКК5-ТАС1к полипептид. Необязательно, ДНК, кодирующую полипептид ВК3, лигируют в рКК5 при использовании выбранных рестриктаз, позволяющих инсерцию ДНК, кодирующей полипептид ВК3, методами лигирования, такими, которые описаны в 8атЬгоок с! а1., см. выше. Полученный вектор назван рКК5-ВК3 полипептид.
В одном варианте изобретения выбранные клетки-хозяева могут быть клетками 293. Человеческие клетки 293 (АТСС ССЬ 1573) выращивают до состояния монослоя в плашках для клеточных культур в среде, такой как ЭМЕМ, дополненной фетальной телячьей сывороткой и, необязательно, питательными компонентами и/или антибиотиками. Около 10 мкг ДНК вектора рКК5-ТАС1к полипептид смешивают, примерно, с 1 мк ДНК, кодирующей ген VА КNА [ТЫттаррауа с! а1., Сс11, 31:543 (1982)], и растворяют в 500 мкл 1 мМ (ммоля) Тпк-НС1, 0,1 мМ(ммоля) ЕЭТА, 0,227 М СаС12. Или же 10 мкг ДНК вектора рКК5-ВК3 полипептид смешивают примерно с 1 мкг ДНК, кодирующей ген VА КNА [ТЫттаррауа с! а1., Сс11 31:543 (1982)], и растворяют в 500 мкл 1 мМ (ммоля) Тпк-НС1, 0,1 мМ (ммоля) ЕЭТА, 0.227 М СаС12. К векторной смеси по каплям прибавляют 500 мкл оГ 50 мМ НЕРЕ8 (рН 7.35), 280 мМ №С1, 1,5 мМ NаРО4, и в течение 10 мин при 25°С выпадает осадок. Осадок суспендируют, добавляют к клеткам 293 и осаждают в течение примерно 4 ч при 37°С. Культуральную среду отсасывают, добавляют на 30 с 2 мл 20% глицерина в РВ8. Затем клетки 293 отмывают бессывороточной средой, добавляют свежую сыворотку и клетки инкубируют примерно в течение 5 дней.
Примерно через 24 ч после трансфекции культуральную среду удаляют и заменяют культуральной средой (только) или культуральной средой, содержащей 200 мкКи/мл 358-цистеина и 200 мкКи/мл 358метионина. После инкубации в течение 12 ч кондиционированную среду собирают, упаривают на роторном фильтре и загружают на 15% 8Ό8 гель. Процессированный гель можно высушить и экспонировать с плёнкой в течение выбранного периода времени для выявления присутствия полипептида ТАС1к или полипептида ВК3. Культуры, содержащие трансфецированные клетки, можно дополнительно инкубировать (в бессывороточной среде) и среду исследовать выбранными методами биоанализа.
В соответствии с альтернативной методикой ДНК, кодирующую полипептид ТАС1к или полипептид ВК3, можно транзиторно вводить в клетки 293 по методу, использующему сульфат декстрана, описанному 8отрагугас с! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сЦ 12:7575 (1981). Клетки 293 выращивают до максимальной плотности в центрифужных пробирках колбе, а затем добавляют 700 мкг ДНК вектора рКК5-ТАС1к полипептид или 700 мкг ДНК, кодирующей полипептид ВК3. Клетки в центрифужных пробирках концентрируют на центрифуге и отмывают с помощью РВ8. Преципитат ДНК-декстран инкубируют на клеточном дебрисе в течение 4 ч. Клетки обрабатывают 20% глицерином в течение 90 с, отмывают средой с тканевой культурой и снова вносят в центрифужную пробирку, содержащую среду с тканевой культурой, 5 мкг/мл бычьего инсулина и 0,1 мкг/мл бычьего трансферрина. Примерно через 4 дня кондиционированную среду центрифугируют и фильтруют, удаляя клетки и дебрис. Образец, содержащий экспрессируемый полипептид ТАС1к или экспрессируемый полипептид ВК3, можно затем концентрировать и очистить любым выбранным методом, таким как диализ и/или колоночная хроматография.
В другом варианте изобретения полипептид ТАС1к или полипептид ВК3 можно экспрессировать в клетках СНО. Полипептидный вектор рКК5-ТАС1к или полипептидный вектор рКК5-ВК3 можно трансфецировать в клетки СНО, используя известные реагенты, такие как СаРО4 или ЭЕАЕ-декстран. Как описано выше, клеточные культуры можно инкубировать и среду заменить культуральной средой (одной) или средой, содержащей радиоактивную метку, такую как 358-метионин. После определения присутствия заданного полипептида культуральную среду можно заменить бессывороточной средой. Предпочтительно, культуры инкубируют примерно в течение 6 дней, а затем кондиционированную среду собирают. Среду, содержащую экспрессируемый полипептид ТАС1к или экспрессируемый полипептид ВК3, можно затем концентрировать и очистить любым выбранным методом.
Меченый эпитопом полипептид ТАС1к или меченый эпитопом полипептид ВК3 можно также экспрессировать в клетках-хозяевах СНО. ДНК, кодирующую полипептид ТАС1к или ДНК, кодирующую полипептид ВК3, можно субклонировать вне вектора рРК5. Инсерт субклона можно подвергать РСК (ПЦР), сливая в рамке считывания с выбранной эпитопной меткой, такой как полигистидин (ро1у-Н1к), в экспрессирующий вектор бакуловируса. Инсерт ДНК, кодирующей меченый полигистидином (ро1у-Н1к) полипептид ТАС1к, или инсерт ДНК, кодирующей меченый полигистидином (ро1у-Н1к) полипептид ВК3, можно затем субклонировать в вектор на основе вируса 8ν40, содержащий селективный маркёр, такой как ОНЕК, для селекции стабильных клонов. Наконец, клетки СНО можно трансфецировать (как описано выше) при использовании вектора на основе вируса 8ν40. Для контроля за экспрессией можно ввести
- 67 007984 метку, как описано выше. Культуральную среду, содержащую экспрессируемый полипептид ВК3, меченый рο1у-Н^8, можно затем концентрировать и очищать любым выбранным методом, таким как аффинная хроматография на №2+-хелатном сорбенте.
Пример 4. Экспрессия полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3 в дрожжах
Нижеприведённый метод описывает экспрессию рекомбинантных полипептидов ТАСЕ и рекомбинантных полипептидов ВК3 в дрожжах.
Сначала конструируют дрожжевые векторы экспрессии для внутриклеточной продукции или секреции полипептида ТАСЕ при использовании промотора АЭН2/САРОН. ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид ТАСЕ, выбранный сигнальный пептид и промотор вводят в соответствующие сайты рестриктаз в выбранной плазмиде с целью направлять внутриклеточную экспрессию полипептида ТАСЕ. Для секреции ДНК, кодирующую полипептид ТАСЕ, можно клонировать в выбранную плазмиду вместе с ДНК, кодирующей промотор АОН2/САРОН, секреторную сигнальную/лидерную последовательность альфа-фактора дрожжей и линкерные последовательности (если требуется) для экспрессии полипептида ТАСЕ.
Или же конструируют дрожжевые векторы экспрессии для внутриклеточной продукции или секреции полипептида ВК3 при использовании промотора АЭН2/САРОН. ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид ВК3, выбранный сигнальный пептид и промотор вводят в соответствующие сайты рестриктаз в выбранной плазмиде с целью направлять внутриклеточную экспрессию полипептида ВК3. Для секреции ДНК, кодирующую полипептид ВК3, можно клонировать в выбранную плазмиду вместе с ДНК, кодирующей промотор АОН2/САРОН, секреторную сигнальную/лидерную последовательность альфа-фактора дрожжей и линкерные последовательности (если требуется) для экспрессии полипептида ВК3.
Клетки дрожжей, такие как штамм дрожжей АВ110, можно затем трансформировать при использовании плазмид экспрессии, описанных выше, и культивировать в выбранных ферментационных средах. Супернатанты трансформированных дрожжей можно анализировать преципитацией 10% трихлоруксусной кислотой и разделением методом БОЗ-РАСЕ с последующим окрашиванием гелей кумасси голубым.
Рекомбинантный полипептид ТАСЕ или рекомбинантный полипептид ВК3 можно последовательно выделять и очищать, удаляя клетки дрожжей из ферментационной среды центрифугированием, а затем концентрируя среду с использованием выбранных патронных фильтров. Концентрат, содержащий полипептид ТАСЕ или полипептид ВК3, можно дополнительно очищать колоночной хроматографией на полимерах.
Пример 5. Экспрессия полипептида ТАСЕ или полипептида ВК3 в инфицированных бакуловирусами клетках насекомых
В нижеприведённом примере иллюстрируется экспрессия рекомбинантных полипептидов ТАСЕ и рекомбинантных полипептидов ВК3 в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусами.
ДНК, кодирующую полипептид ТАСЕ или полипептид ВК3, сливают в направлении 3'-5' (иркйеат) от эпитопной метки, содержащейся в векторе экспрессии бакуловирусов. Такие эпитопные метки включают полигистидиновые метки и иммуноглобулиновые метки (подобно областям Рс ГдС). Можно использовать ряд плазмид, включая плазмиды на основе промышленно выпускаемых плазмид, таких как рУЬ1393 (Nονадеη). Коротко говоря, ДНК, кодирующую полипептид ТАСЕ, или ДНК, кодирующую заданную часть полипептида ТАСЕ (такую как последовательность, кодирующую внеклеточный домен трансмембранного белка), амплифицируют методом РСК с праймерами, комплементарными областям 5' и 3'. Или же ДНК, кодирующую полипептид ВК3, или ДНК, кодирующую заданную часть полипептида ВК3 (такую как последовательность, кодирующую внеклеточный домен трансмембранного белка), амплифицируют методом РСК с праймерами, комплементарными областям 5' и 3'. Можно встроить праймер 5', фланкирующий (выбранные) сайты рестриктаз. Затем продукт расщепляют этими выбранными рестриктазами и субклонируют в экспрессирующий вектор.
Рекомбинантный бакуловирус получают котрансфекцией вышеуказанной плазмиды с ДНК вируса Васи1οСο1ά™ (Рйагттдеи) в клетки 8рοάοрΐе^а 1гид1регда (819) (АТСС СКЬ1711), используя липофектин (поставляемый СГВС0-ВКЬ). После 4-5 дней инкубации при 28°С выделенные вирусы собирают и используют для последующих амплификации. Инфицирование вирусом и экспрессию белка осуществляют как описано 0'КеШеу е1 а1., Васи^1гик схргсккюп уесЮгк: А 1·ιΗοηΙοΐΎ Мата^ 0χ1οιύ: 0χ1ογ4 Ишуегкйу Ргекк (1994).
Экспрессируемый меченый полигистидином полипептид ТАСЕ или экспрессируемый меченый полигистидином полипептид ВК3 можно затем очистить, например, аффинной хроматографией на №2+хелатном сорбенте следующим образом. Готовят экстракты из инфицированных рекомбинантным вирусом клеток 819 как описано Кирей е1 а1., №Шге, 362:175-179 (1993). Коротко говоря, клетки 819 отмывают, снова суспендируют в буфере для ультразвуковой обработки (25 мл Нерек, рН 7,9; 12.5 мМ МдС12; 0,1 мМ ЕОТА; 10% глицерин; 0,1% №-40; 0,4 М КС1) и при охлаждении льдом дважды по 20 с подвергают воздействию ультразвука. Гомогенаты, полученные под воздействием ультразвука, осветляют центрифугированием и супернатант разводят в 50 раз буфером для нанесения образца (50 мМ фосфата, 300 мМ №С1, 10% глицерина, рН 7,8) и фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Готовят колонку с №2+-ЫТА ага
- 68 007984 розой (выпускаемую О1адеп) с объёмом носителя 5 мл, промывают 25 мл воды и уравновешивают 25 мл буфера для нанесения образца. Отфильтрованный клеточный экстракт нагружают на колонку со скоростью 0,5 мл/мин. Колонку промывают буфером для нанесения до базовой линии (линии развёртки) А280, когда начинают отбирать фракции. Затем колонку промывают вторичным буфером для промывания (50 мМ фосфата; 300 мМ №С1, 10% глицерина, рН 6,0), который элюирует неспецифически связанный белок. При повторном достижении базовой линии А280 колонку обрабатывают в градиенте 0-500 мМ имидазола во вторичном буфере для промывания. Собирают фракции по одному миллилитру и анализируют методом 303-РАСЕ и окрашиванием серебром или Вестерн-блоттингом с хелатом №2+-№ГА- конъюгированным со щелочной фосфатазой (01адеп). Фракции, содержащие элюируемый Н1К10-меченый полипептид ТАСГк или элюируемый Н1К10-меченый полипептид ВК3, собирают и подвергают диализу против буфера для нанесения образца.
Или же очистку меченого с помощью ГдС (или меченого с помощью Бс) полипептида ТАСГк или меченого с помощью ГдС (или меченого с помощью Бс) полипептида ВК3 можно проводить, применяя известные методы хроматографии, включая, например, колоночную хроматографию с использованием протеина А или протеина С.
Пример 6. Получение антител, которые связываются с полипептидами ТАСГк и/или с полипептидами ВК3
Данный пример иллюстрирует получение моноклональных антител, которые могут специфически связываться с полипептидами ТАСГк и/или полипептидами ВК3.
Методы продукции моноклональных антител известны в технике и описаны, например, в Собтд, см. выше. Иммуногены, которые могут быть использованы, включают очищенный полипептид ТАСГк, очищенный полипептид ВК3, слитые белки, содержащие полипептид ТАСГк, слитые белки, содержащие полипептид ВК3, клетки, экспрессирующие рекомбинантный полипептид ТАСГк на клеточной поверхности, и клетки, экспрессирующие рекомбинантный полипептид ВК3 на клеточной поверхности. Селекцию иммуногена могут осуществлять опытные специалисты в данной области техники без утомительных экспериментов.
Мышей, таких как Ва1Ь/с, иммунизируют ТАСГк-полипептидным иммуногеном или ВК3- полипептидным иммуногеном, эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда, и инъецируют подкожно или интраперитонеально в количестве 1-100 мкг. Или же иммуноген эмульгируют в адъюванте МРЬ-ТОМ (К1Ь1 Гттипосйет1са1 Кекеагсй, НатШоп, МТ) и инъецируют в подушечки задних лап. Через 10-12 дней иммунизированным мышам делают бустер-инъекцию иммуногена в выбранном адъюванте. Затем, в течение нескольких недель, мышей также иммунизируют с помощью дополнительных бустерных инъекций. Образцы сыворотки можно периодически получать из пробы крови мышей (ретро-орбитальной) для исследования методами ЕЬГЗА с целью обнаружения антител против полипептида ТАСГк или антител против полипептида ВК3.
После определения титра соответствующих антител животным, позитивным в отношении антител, можно ввести последнюю внутривенную инъекцию полипептида ТАСГк или полипептида ВК3. Через 3-4 дня мышей умерщвляют и собирают клетки селезёнки. Затем клетки селезёнки сливают (используя 35% полиэтиленгликоль) с выбранной клеточной линией мышиной миеломы, такой как Р3Х63АдИ.1, полученной из АТСС, N СКЬ 1597. При слиянии получают клетки гибридомы, которые можно поместить в 96-луночные планшеты для тканевых культур, содержащие среду НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) с целью ингибировать пролиферацию неслитых клеток, гибридов миеломы и гибридов клеток селезёнки.
Клетки гибридомы подвергают скринингу методом ЕЬГЗА на реактивность против полипептида ТАСГк или на реактивность против полипептида ВК3. Определение позитивных клеток гибридомы, секретирующих заданные моноклональные антитела против полипептида ТАСГк или полипептида ВК3, находится в компетенции специалистов в данной области техники.
Позитивные клетки гибридомы можно инъецировать интраперитонеально в сингенных мышей Ва1Ь/с с целью получения асцита, содержащего моноклональные антитела против ТАСГк или моноклональные антитела против полипептида ВК3. Или же клетки гибридомы можно выращивать в матрасах для тканевых культур или в роллер-флаконах. Очистку моноклональных антител, продуцируемых в асците, можно выполнять, используя преципитацию с помощью сульфата аммония с последующей эксклюзионной гель-хроматографией. Или же можно применять аффинную хроматографию, основанную на связывании антитела с протеином А или протеином С.
Пример 7. Действие полипептидов ВК3-Бс на ш νί\Ό модель волчанки
Действие полипептидов иммуноадгезинов ВК3-Бс изучают на ш νί\Ό мышиной модели системной красной волчанки (ЗЬЕ или волчанка).
Мышиный ВК3-Бс (иммуноадгезин, полученный как описано в примере 1) инъецируют интраперитонеально (внутрибрюшинно) 6-месячным мышам NΖΒxNΖV (Б1) (по 12 мышей в группе) в течение 5 недель (три раза в неделю при дозе 100 мкг белка). Мышей NΖΒxNΖV (Б1) получают из .Гасккоп ЬаЬк и устанавливают животную модель ранней стадии волчанки (см., Ке1етапсе о£ куМепйс 1ирик егу!йета!окик перйпйк атта1 тобе1к !о йитап б1кеаке, Бок!ег МН, Зет. №рйго1, 19:12-24 (Зап. 1999)). Контрольных жи
- 69 007984 вотных аналогично инъецируют физиологическим раствором.
Каждые две недели проводят исследование на животных по следующим показателям: выживание; вес тела; титр антитела с бз(двухцепочечной)ДНК; и определение протеинурии. Уровни протеинурии определяют в свежих образцах мочи обработанных и контрольных животных, используя полоски с реагентом МиШзйх™ (Вауег). Уровни антител с бзДНК у обработанных и необработанных животных измеряют следующим образом. Сыворотку отбирают в возрасте 6, 8 и 9 месяцев и помещают в аналитические планшеты в соответствии со следующим протоколом. 96-луночные планшеты (Ыа1депе ЫиМС-1ттипо Мах18огр) покрывают 100 мкл раствора 50 мкг поли-Ь-лизина (0,01% раствор, 81§та) (разбавленного 0,1М Τπ3, рН 7,5) на 4 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды отмывают 200 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8), дополненного 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (С1Ьсо). Затем планшеты покрывают 100 мкл о£ 20 мкг/мл поли(дезоксиадениадениловой-тимидиловой) кислоты (81§та) (разведённой 0,1М Τή3, рН 7,5) в течение ночи при 4°С. Планшеты три раза отмывают 200 мкл РВ8, дополненного 10% фетальной бычьей сывороткой (С1Ьсо). Планшеты последовательно блокируют 100 мкл РВ8, дополненного 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (С1Ьсо) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды отмывают 200 мкл РВ8, дополненного 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (С1Ьсо). Затем планшеты инкубируют со 100 мкл сывороточного образца, разведённого 1:100 в РВ8, дополненном 10% термоинактивированной бычьей сывороткой, в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды отмывают 200 мкл РВ8, дополненного 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем планшеты инкубируют с 100 мкл НКР-конъюгированного антитела козы к мышиному 1дС1 (Са1!ад ЬаЬз), разведённого 1:2000 в РВ8, дополненном 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой, в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты пять раз отмывают 200 мкл РВ8, дополненного 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем планшеты инкубируют со 100 мкл обрабатывающего агента (смесь 1:1 реагентов субстрата А апб В, ВО РНагтшдеп) в течение 10 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливают, прибавляя 50 мкл 4,5 Ν серной кислоты, и измеряют оптическую плотность при 450 нм с помощью ридера планшетов 8рес!гатах 340.
Результаты показаны на фиг. 11А-1Ю. На фиг. 11А и 11В показано, что у животных, обработанных ВК3-Ес, не наблюдается протеинурии. У мыши NΖВ х ΝΖν (Е1), типичного (необработанного) животного, в возрасте 6 месяцев уровни протеинурии составляют около 0-30 мг/дл, тогда как в возрасте 12, как правило, уровни протеинурии у животного составляют > 300 мг/дл, приводя к смерти, примерно в 80% случаев. Данные говорят о том, что у животных, обработанных ВКЗ-Ес, ВК3-Ес способен блокировать протеинурию при волчанке и защищает против поражения почек.
Животные, обработанные ВК3-Ес, также показывают повышенную продолжительность жизни. Как показано на фиг. 11С, введение ВК3-Ес повышает продолжительность жизни животных. В то время как выживаемость в контрольной группе падает до 75% в возрасте 40 недель, 100% животных в группе, обработанной ВК3-Ес, остались живы. Уровни антител против бзДНК также значительно ниже у животных, обработанных ВК3-Ес, в 9-месячном возрасте по сравнению с контрольной группой (фиг. 11Ό). Эти данные говорят о том, что обработка ВК3-Ес блокирует продукцию аутоантител В-клетками у мышей, больных волчанкой, и повышает продолжительность жизни за счёт блокирования функции ΤА^^-1 ш у1уо.

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная нуклеиновая кислота, представляющая собой (а) ДНК, кодирующую полипептид ΤАСIз, содержащий последовательность аминокислотных остатков 1-246 8ЕО ΙΌ ΝΌ:14, или (б) комплемент молекулы ДНК по п. а).
  2. 2. Нуклеиновая кислота по п.1, содержащая кодирующую нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ ЫО:13.
  3. 3. Нуклеиновая кислота по п.1, состоящая из кодирующей нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Ν0:13.
  4. 4. Выделенная нуклеиновая кислота, представляющая собой ДНК, которая (а) имеет последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную кодирующей последовательности нуклеотидов 8ЕО ΙΌ ЫО:13, и (б) кодирует полипептид ΤАСIз.
  5. 5. Выделенная нуклеиновая кислота, представляющая собой ДНК, выбранную из группы, состоящей из:
    а) ДНК, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности ДНК, кодирующей полипептид ΤАСIз, содержащий аминокислотные остатки 1-246 8ЕО ΙΌ ΝΌ:14.
    б) ДНК, последовательность которой в жёстких условиях гибридизуется с ДНК по п.а);
    в) ДНК, последовательность которой вследствие вырожденности генетического кода кодирует полипептид ΤАСIз по п.а); и
    г) ДНК, полностью комплементарной ДНК по пп.а), б) или в).
  6. 6. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1 или 5.
    - 70 007984
  7. 7. Вектор по п.6, функционально связанный с регуляторными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной при использовании вектора.
  8. 8. Клетка-хозяин, которая включает вектор по п.6.
  9. 9. Клетка-хозяин по п.8, представляющая собой клетку СНО.
  10. 10. Клетка-хозяин по п.8, представляющая собой клетку Е. сой.
  11. 11. Клетка-хозяин по п.8, представляющая собой клетку дрожжей.
  12. 12. Способ получения полипептида ТАС1к, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п.8 в условиях, пригодных для экспрессии указанного полипептида ТАС1к, и регенерации указанного полипептида ТАС1к из клеточной культуры.
  13. 13. Выделенный полипептид ТАС1к, содержащий аминокислотные остатки 1-246 8ЕО ΙΌ N0:14.
  14. 14. Выделенный полипептид ТАСЕ, содержащий непрерывную последовательность прилегающих аминокислотных остатков 1-246 8Е0 ΙΌ N0:14.
  15. 15. Выделенный растворимый полипептид ТАСЕ, содержащий аминокислотные остатки 1-119 8Е0 ΙΌ N0:14.
  16. 16. Выделенный полипептид ТАСЕ, представляющий собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
    а) полипептида ТАСЕ, содержащего аминокислотные остатки 1-246 или 1-119 8Е0 ΙΌ N0:14 и
    б) фрагмента а), отличающегося тем, что он является биологически активным полипептидом.
  17. 17. Химерная молекула, содержащая полипептид ТАСЕ по пп.13, 14 или 15, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью.
  18. 18. Химерная молекула по п.17, у которой указанная гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность эпитопной метки.
  19. 19. Химерная молекула по п.17, у которой указанная гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой область Рс иммуноглобулина.
  20. 20. Выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом ТАСЕ по пп.13, 14 или 15.
  21. 21. Композиция, содержащая полипептид ТАСЕ по пп.13, 14 или 15 и носитель.
  22. 22. Композиция по п.21, у которой указанный носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель.
  23. 23 Способ ингибирования и нейтрализации биологической активности полипептида ТАЬЬ-1 в клетках млекопитающих, заключающийся в экспонировании указанных клеток млекопитающих с эффективным количеством антагониста полипептида ТАЬЬ-1, при этом антагонист полипептида ТАЬЬ-1 выбирают из группы, состоящей из:
    а) иммуноадгезина рецептора ТАСЕ;
    б) рецептора ТАСЕ, связанного с небелковым полимером, выбираемым из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и полиоксиалкилена;
    в) антитела рецептора ТАСЕ.
  24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный иммуноадгезин рецептора ТАСЕ содержит последовательность внеклеточного домена ТАСЕ, слитую с Рс областью иммуноглобулина.
  25. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный антагонист полипептида ТАЬЬ-1 содержит молекулу антагониста, которая ингибирует или нейтрализует в клетках млекопитающих биологическую активность как полипептида ТАЬЬ-1, так и полипептида АРШЬ.
  26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанные клетки млекопитающих представляют собой лейкоциты.
  27. 27. Способ ингибирования и нейтрализации биологической активности полипептида АРШЬ в клетках млекопитающих, заключающийся в экспонировании указанных клеток млекопитающих с эффективным количеством антагониста полипептида АРШЬ, при этом антагонист полипептида АРКГБ выбирают из группы, состоящей из:
    а) иммуноадгезина рецептора ТАСЕ;
    б) рецептора ТАСЕ, связанного с небелковым полимером, выбираемым из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и полиоксиалкилена;
    в) антитела рецептора ТАСЕ.
  28. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный иммуноадгезин рецептора ТАСЕ содержит последовательность внеклеточного домена ТАСЕ, слитую с Рс областью иммуноглобулина.
  29. 29. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный антагонист полипептида АРШЬ содержит молекулу антагониста, которая ингибирует или нейтрализует в клетках млекопитающих биологическую активность как полипептида ТАЬЬ-1, так и полипептида АРШЬ.
  30. 30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанные клетки млекопитающих представляют собой лейкоциты.
  31. 31. Способ повышения или стимуляции активности полипептида ТАС.Ч в клетках млекопитающих, заключающийся в экспонировании указанных клеток млекопитающих с эффективным количеством агониста полипептида ТАСЕ, причём указанный агонист полипептида ТАСЕ содержит антитело против
    - 71 007984
    ТАСЕ агониста.
  32. 32. Способ проведения скрининга для идентификации молекулы-кандидата, которая ведёт себя как антагонист или агонист ТЛ^^-1. ТАС1, ТАСЕ, ВСМА, заключающийся в анализе с применением ДНК или полипептида ТАСЕ по п.5 или 16.
EA200400262A 2001-08-03 2002-07-24 ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ EA007984B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31011401P 2001-08-03 2001-08-03
US37717102P 2002-04-30 2002-04-30
PCT/US2002/023487 WO2003014294A2 (en) 2001-08-03 2002-07-24 Tacis and br3 polypeptides and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400262A1 EA200400262A1 (ru) 2005-08-25
EA007984B1 true EA007984B1 (ru) 2007-02-27

Family

ID=26977217

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400262A EA007984B1 (ru) 2001-08-03 2002-07-24 ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA200601861A EA200601861A1 (ru) 2001-08-03 2002-07-24 ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601861A EA200601861A1 (ru) 2001-08-03 2002-07-24 ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20050070689A1 (ru)
EP (1) EP1572881A4 (ru)
JP (1) JP2005510208A (ru)
KR (1) KR20040019105A (ru)
CN (1) CN1636067A (ru)
BR (1) BR0211614A (ru)
CA (1) CA2453995A1 (ru)
EA (2) EA007984B1 (ru)
HU (1) HUP0500992A3 (ru)
IL (1) IL160127A0 (ru)
IS (1) IS7115A (ru)
MX (1) MXPA04001050A (ru)
NO (1) NO20040246L (ru)
PL (1) PL377119A1 (ru)
WO (1) WO2003014294A2 (ru)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
DE60028830T2 (de) * 2000-02-16 2007-01-18 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-april antikörper und hybridomazellen
UA83458C2 (ru) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
WO2002072827A1 (fr) * 2001-02-28 2002-09-19 Riken Recepteur specifique de cellule b se liant a traf3
EP1401870A4 (en) 2001-05-24 2006-04-19 Human Genome Sciences ANTIBODIES AGAINST TUMOR NECROSIS FACTOR DELTA (APRIL)
US7112410B1 (en) 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
JP2005533863A (ja) * 2002-07-25 2005-11-10 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｔａｃｉ抗体とその用途
WO2004094620A2 (en) 2003-03-28 2004-11-04 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
KR20060027801A (ko) 2003-06-05 2006-03-28 제넨테크, 인크. Ｂ 세포 장애에 대한 조합 요법
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
CA2554526A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
KR101200133B1 (ko) 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
CA2573359A1 (en) * 2004-07-22 2006-02-02 Genentech, Inc. Method of treating sjogren's syndrome
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2005323025A1 (en) * 2004-12-31 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Polypeptides that bind BR3 and uses thereof
AR059945A1 (es) 2005-08-09 2008-05-14 Zymogenetics Inc Metodos para tratar afecciones malignas de celulas b que utilizan una molecula de fusion taci-ig
JP5118037B2 (ja) 2005-08-09 2013-01-16 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｔａｃｉ融合分子を用いた異常細胞増殖の処置及び予防のための方法
AU2006344395B2 (en) 2005-10-13 2013-05-02 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive diseases
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
AU2006318539B2 (en) 2005-11-23 2012-09-13 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
UA98462C2 (ru) * 2006-05-15 2012-05-25 Арес Трейдинг С.А. Способы лечения аутоиммунных заболеваний с использованием слитой молекулы taci-ig
WO2008119042A2 (en) 2007-03-27 2008-10-02 Zymogenetics, Inc. Combination of blys inhibition and/or april inhibition and immunnosuppressants for treatment of autoimmune disease
AU2008312406B2 (en) 2007-10-16 2014-03-06 Ares Trading S.A. Combination of BLyS inhibition and anti-CD 20 agents for treatment of autoimmune disease
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
WO2010100056A2 (en) * 2009-03-02 2010-09-10 Stichting Top Institute Pharma Antibodies against a proliferating inducing ligand (april)
SG178358A1 (en) 2009-08-11 2012-03-29 Genentech Inc Production of proteins in glutamine-free cell culture media
MX2012002766A (es) 2009-09-03 2012-04-02 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
IN2012DN03025A (ru) 2009-09-09 2015-07-31 Ct Se Llc
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
BR112012026213B1 (pt) 2010-04-15 2021-12-28 Medimmune Limited Compostos de pirrolobenzodiazepinas, conjugado das mesmas, composição farmacêutica compreendendo o conjugado e uso do mesmo para o tratamento de uma doença proliferativa
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
CA2799540A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2011160086A2 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 Human Genome Sciences, Inc. Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to treat asthma and other allergic and inflammatory conditions of the respiratory system
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
CA2827859A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Genentech, Inc. Biological markers and methods for predicting response to b-cell antagonists
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
KR101877598B1 (ko) 2011-10-14 2018-07-11 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
KR20140119777A (ko) 2012-01-31 2014-10-10 제넨테크, 인크. 항-ig-e m1'' 항체 및 그의 사용 방법
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
PT2839860T (pt) 2012-10-12 2019-07-29 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
ES2703151T3 (es) 2012-10-12 2019-03-07 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos de pirrolobenzodiazepinas
HUE035694T2 (en) 2012-10-12 2018-05-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepine anti-CD22 antibody conjugates
NZ707486A (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine - anti-psma antibody conjugates
SI2906296T1 (en) 2012-10-12 2018-06-29 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EA031585B1 (ru) 2012-12-21 2019-01-31 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CN105142674B (zh) 2013-03-13 2018-11-13 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
NZ710745A (en) 2013-03-13 2019-03-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2014307080B2 (en) 2013-08-12 2018-06-07 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo(E)indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
NL2011406C2 (en) 2013-09-06 2015-03-10 Bionovion Holding B V Method for obtaining april-binding peptides, process for producing the peptides, april-binding peptides obtainable with said method/process and use of the april-binding peptides.
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA2928952A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
JP6895254B2 (ja) 2013-12-16 2021-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
CA2929565A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10077318B2 (en) 2014-09-12 2018-09-18 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP3191134B1 (en) 2014-09-12 2019-11-20 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MA40575A (fr) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazépines et conjugués à base de disulfure d'anticorps associés
AU2015352545B2 (en) 2014-11-25 2020-10-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2016090050A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP2019522633A (ja) 2016-05-20 2019-08-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｒｏｔａｃ抗体コンジュゲート及び使用方法
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
EP3496763A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
RS61795B1 (sr) 2017-02-08 2021-06-30 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin antitela
WO2018192944A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3612234B1 (en) 2017-04-20 2024-03-13 ADC Therapeutics SA Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
CN117683836A (zh) 2017-05-09 2024-03-12 辛利斯生物制药有限责任公司 用于修饰微囊藻毒素和节球藻毒素的方法
JP7265788B2 (ja) 2017-05-09 2023-04-27 シアノ バイオテック ゲーエムベーハー 修飾ミクロシスチンおよびノジュラリン
MX2019015042A (es) 2017-06-14 2020-08-06 Adc Therapeutics Sa Regimen de dosificacion.
AU2018316532B2 (en) 2017-08-18 2022-11-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine conjugates
IL273387B2 (en) 2017-09-20 2023-10-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2020006298A2 (en) * 2018-06-28 2020-01-02 University Of Southern California Cyclotide-based polypeptides for therapeutic targeting of baff receptors in sle
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
JP2022505450A (ja) 2018-10-24 2022-01-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
JP2023525032A (ja) 2020-05-08 2023-06-14 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｔ細胞阻害タンパク質を伴うおよび伴わない、ａｐｒｉｌおよびｂａｆｆ阻害免疫調節タンパク質、ならびにその使用方法
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039361A1 (en) * 1997-03-03 1998-09-11 St. Jude Children's Research Hospital A lymphocyte surface receptor that binds caml, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
WO2000067034A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Immunex Corporation Methods of use of the taci/taci-l interaction

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3675588D1 (de) * 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5182196A (en) * 1985-10-09 1993-01-26 Biogen, Inc. Expression systems for overproduction of desired proteins
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US6893625B1 (en) * 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4861579A (en) * 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
WO1990003395A1 (en) * 1988-09-22 1990-04-05 Teijin Limited Novel physiologically active polypeptide, recombinant plasmid, recombinant microbial cells, medicinal composition, and process for recovering purified polypeptide
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
EP0417563B1 (de) * 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5519119A (en) * 1990-09-21 1996-05-21 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd. Muteins of TNF pharmaceutical compositions and a method of making
CA2055168A1 (en) * 1990-11-21 1992-05-22 Walter Fiers Tnf-muteins
EP1400536A1 (en) * 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
SK376492A3 (en) * 1992-04-02 1995-06-07 Hoffmann La Roche Tnf - muteins and method of their production
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP0752248B1 (en) * 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US7744877B2 (en) * 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US5595721A (en) * 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
US6509170B1 (en) * 1996-03-14 2003-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human tumor necrosis factor delta
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6171586B1 (en) * 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6171787B1 (en) * 1997-06-26 2001-01-09 Abbott Laboratories Member of the TNF family useful for treatment and diagnosis of disease
WO1999002567A2 (en) * 1997-07-08 1999-01-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for producing homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US6440694B1 (en) * 1997-09-30 2002-08-27 Pharmacia & Upjohn Company TNF-related death ligand
US6297022B1 (en) * 1997-10-08 2001-10-02 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US6242195B1 (en) * 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6355782B1 (en) * 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
CN1689646A (zh) * 1998-08-11 2005-11-02 拜奥根Idec公司 包括施用抗－cd20抗体的b－细胞淋巴瘤联合疗法
US6224866B1 (en) * 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
ES2329254T3 (es) * 1999-01-07 2009-11-24 Zymogenetics, Inc. Usos terapeuticos de receptores solubles de br43x2.
CN100340292C (zh) * 1999-01-25 2007-10-03 比奥根艾迪克Ma公司 Baff,其封闭剂以及它们在b细胞应答的调节中的应用
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
US6383276B1 (en) * 1999-03-12 2002-05-07 Fuji Photo Film Co., Ltd. Azomethine compound and oily magenta ink
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
US7074403B1 (en) * 1999-06-09 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
DE19930748C2 (de) * 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
EP2314694A3 (en) * 1999-08-17 2013-12-11 Biogen Idec MA Inc. BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent
UA74798C2 (ru) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
CN1407901A (zh) * 1999-11-08 2003-04-02 Idec药物公司 使用抗cd40l抗体并联合抗cd20抗体和/或化疗剂和放疗治疗b细胞恶性瘤
US20020006404A1 (en) * 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
WO2001058949A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
US20020009427A1 (en) * 2000-03-24 2002-01-24 Wolin Maurice J. Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
US20030185796A1 (en) * 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
JP2004500412A (ja) * 2000-03-31 2004-01-08 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のための抗サイトカイン抗体またはアンタゴニストおよび抗ｃｄ２０の併用
NZ521540A (en) * 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
US20020009444A1 (en) * 2000-04-25 2002-01-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
CA2408617A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
DE60139689D1 (de) * 2000-06-22 2009-10-08 Univ Iowa Res Found Kombination von CpG und Antikörpern gegen CD19,CD20,CD22 oder CD40 zur Prävention oder Behandlung von Krebs.
CA2418006A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 Dyax Corp. Binding polypeptides for b lymphocyte stimulator protein (blys)
US20020058029A1 (en) * 2000-09-18 2002-05-16 Nabil Hanna Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using B cell depleting/immunoregulatory antibody combination
UA83458C2 (ru) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
ES2329012T3 (es) * 2000-11-07 2009-11-20 Zymogenetics, Inc. Receptor del factor de necrosis tumoral humano.
IL156618A0 (en) * 2000-12-28 2004-01-04 Altus Biologics Inc Crystals of whole antibodies and fragments thereof, methods for the preparation thereof and diagnostic kits utilizing the same
US20030103971A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
JP2004533997A (ja) * 2001-02-20 2004-11-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド Ｂｃｍａ及びｔａｃｉの両者を結合する抗体
DK2116259T3 (da) * 2001-05-24 2012-05-21 Zymogenetics Inc TACI-immunoglobulinfusionsproteiner
ATE443259T1 (de) * 2001-09-20 2009-10-15 Univ Texas Bestimmung der zirkulierenden therapeutischen antikörper, antigene sowie antigen-antikörper- komplexe mit elisa-tests
WO2003024991A2 (en) * 2001-09-21 2003-03-27 Amgen Inc. Tall-1 receptor molecules and uses thereof
AU2002337935B2 (en) * 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20060089311A1 (en) * 2001-11-28 2006-04-27 Deno Dialvnas Agonists and antagonists of ryzn for the treatment of metabolic disorders
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1519959B1 (en) * 2002-02-14 2014-04-02 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20030180292A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20030219818A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
US7150003B2 (en) * 2002-11-25 2006-12-12 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Class coalescence for obfuscation of object-oriented software

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039361A1 (en) * 1997-03-03 1998-09-11 St. Jude Children's Research Hospital A lymphocyte surface receptor that binds caml, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
WO2000067034A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Immunex Corporation Methods of use of the taci/taci-l interaction

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GROSS J.A. et al.: "TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease", NATURE, 2000 APR. 27, 404 (6781): 995-9, referat *
http://www. ncbi, nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi? db=protein&ival= 15208475, posledovatel'nost' REFERENCE 2, 25-APR-2001 *
RENNERT P. et al.: "A soluble form of B cell maturation antigen, a receptor for the tumor necrosis factor family member APRIL.inhibits tumor cell growth", J EXP MED. 2000 Dec. 4, 192 (11), c. 1677-84, referat *
WU Y. et al.: "Tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member TACI is a high affinity receptor for TNF family memberes APRIL and BLyS", J. BIOL. CHEM. 2000 Nov. 10, 275 (45): 35478-85, referat *
YU G. et al.: "APRIL and TALL-I and receptors BCMA and TACI: system for regulating humoral immunity", NAT IMMUNOL, 2000 Sep: 1(3):252-6, referat *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1572881A4 (en) 2007-06-13
EA200400262A1 (ru) 2005-08-25
NO20040246L (no) 2004-04-01
KR20040019105A (ko) 2004-03-04
EP1572881A2 (en) 2005-09-14
HUP0500992A2 (en) 2007-07-30
CN1636067A (zh) 2005-07-06
US20050070689A1 (en) 2005-03-31
IS7115A (is) 2004-01-15
WO2003014294A3 (en) 2006-03-30
BR0211614A (pt) 2006-10-31
PL377119A1 (pl) 2006-01-23
IL160127A0 (en) 2004-06-20
JP2005510208A (ja) 2005-04-21
EA200601861A1 (ru) 2007-02-27
MXPA04001050A (es) 2004-07-08
WO2003014294A2 (en) 2003-02-20
CA2453995A1 (en) 2003-02-20
HUP0500992A3 (en) 2007-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007984B1 (ru) ПОЛИПЕПТИДЫ TACIs И BR3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ES2327785T3 (es) Procedimientos y compuestos para inhibir el crecimiento de celulas neoplasticas.
ES2287020T3 (es) Procedimiento y composiciones para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas.
ES2458349T3 (es) Polipéptidos homólogos IL-17 y usos terapéuticos de los mismos
US8163520B2 (en) Nucleic acids encoding a chimeric polypeptide comprising IL-7 and HGF-beta chain and methods of use
US20120178163A1 (en) Novel tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acids encoding the same
UA119673C2 (uk) Біспецифічне fc-діатіло, здатне імуноспецифічно зв&#39;язуватися з епітопом pd-1 і з епітопом lag-3, та його застосування
PL211786B1 (pl) Zastosowanie przeciwciała oraz polipeptydu
PT1255558E (pt) Anticorpos anti-april e células hibridoma
WO1999040196A1 (en) Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
ES2320285T3 (es) Polipeptido dna19355, un homologo del factor de necrosis tumoral.
ES2291198T3 (es) Composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunologico.
ES2331900T3 (es) Receptor rtd.
ES2258838T3 (es) Moduladores de la funcion de los receptores de la familia de receptores de tnf/ngf.
JP4280444B2 (ja) 腫瘍性細胞成長阻害のための組成物及び方法
ES2274649T3 (es) Influencia sobre la angiogenesis mediante cd66a.
ES2268901T3 (es) Procedimientos y composiciones para la inhibicion del crecimiento celular neoplastico.
ES2317847T3 (es) Composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunologico.
ES2370423T3 (es) Polipéptidos homólogos il-17 y sus utilizaciones terapéuticas.
JP2007238619A (ja) 腫瘍性細胞成長阻害のための組成物及び方法
AU2007202521A1 (en) Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
AU2002322616A1 (en) Tacis and BR3 polypeptides and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU