ES2331900T3

ES2331900T3 - Receptor rtd.

Info

Publication number: ES2331900T3
Application number: ES98935654T
Authority: ES
Inventors: Avi J. Ashkenazi; Austin Gurney
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2010-01-19
Anticipated expiration: 2018-07-14
Also published as: EP1009817B1; ATE443761T1; DE69841176D1; WO1999010484A1; DK1009817T3; CA2301847A1; AU8485098A; IL134577A0; PT1009817E; US20050287635A1; JP2001513994A; EP1009817A1

Abstract

Polipéptido RTD aislado que tiene al menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia nativa del polipéptido RTD que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1), en el que dicho polipéptido RTD aislado inhibe la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 en una célula de mamífero o se une al ligando Apo-2.

Description

Receptor RTD.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación, aislamiento, y producción recombinante de polipéptidos novedosos, designados en el presente documento como "RTD" y a anticuerpos anti-RTD.

Antecedentes de la invención Apoptosis o "muerte celular programada"

Se cree que el control del número de células en los mamíferos se va a determinar, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, denominada algunas veces como muerte celular necrótica, se caracteriza normalmente como una forma patológica de muerte celular que es el resultado de algún trauma o lesión celular. Por el contrario, existe otra forma "fisiológica" de muerte celular que procede de una manera ordenada o controlada. Esta forma ordenada o controlada de muerte celular se denomina a menudo como "apoptosis" (véanse, por ejemplo, Barr y col., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller y col., Science, 267:1443-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica se produce naturalmente en muchos procesos fisiológicos, que incluyen el desarrollo embriónico y la selección clonal en el sistema inmune [Itoh y col:, Cell, 66:233-243 (199))]. La disminución en los niveles de muerte celular apoptótica se ha asociado con una variedad de dolencias patológicas, que incluyen cáncer, lupus, e infección por el virus del herpes [Thompson, Science, 267:1456-1462 (1995)]. El aumento en los niveles de muerte celular apoptótica puede estar asociado con otra variedad de dolencias patológicas, que incluyen SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, retinitis pigmentaria, degeneración cerebelosa, anemia aplásica, infarto de miocardio, apoplejía, lesión por revascularización, y enfermedad hepática inducida por toxina [véase, Thompson, más arriba].

La muerte celular apoptótica está acompañada normalmente por uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en las células, tales como la condensación del citoplasma, la pérdida de las microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Se cree que una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas desencadenan o inducen dichos cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356:397-400 (1992); Steller, supra; Sachs y col., Blood, 82:15 (1993)]. Éstas se pueden estimular, por ejemplo, mediante estímulos hormonales, tales como las hormonas glucocorticoides en timocitos inmaduros, así como la retirada de algunos factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga y col., Nature, 356:314:317 (1992)]. Se ha informado también de que algunos oncogenes identificados tales como myc, rel, y EIA, y supresores tumorales, del tipo p53, tienen un papel en la inducción de la apoptosis. Se ha observado igualmente que algunos fármacos de quimioterapia y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de la apoptosis [Thompson, más arriba]

Familia de citocinas TNF

Se han identificado diversas moléculas, tales como el factor \alpha de necrosis tumoral ("TNF-\alpha"), factor \beta de necrosis tumoral ("TNF-\beta" o "linfotoxina"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1 BB, ligando Apo-1 (denominado también como ligando FAS o ligando CD95), y el ligando Apo-2 (denominado también como TRAIL) como miembros de la familia de citocinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [Véanse, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)]. Entre estas moléculas, se ha informado de que TNF-\alpha, TNF-\beta, ligando CD30, ligando 1-IBB, ligando Apo-I, y ligando Apo-2 (TRAIL) están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha informado de que TNF-\alpha y TNF-\beta inducen la muerte apoptótica en células tumorales susceptibles [Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry y col., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]. Zheng y col., han informado de que TNF-\alpha está implicado en la apoptosis tras la estimulación de células T CD8 positivas [Zheng y col., Nature. 377:348-351 (1995)]. Otros investigadores han informado de que el ligando CD30 puede estar implicado en la deleción de células T autorreactivas en el timo (Amakawa y col., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Resumen Nº. 10, (1995)].

Las mutaciones en los genes del ligando o el receptor Fas/Apo-I de ratón (denominados Ipr y gld, respectivamente) se han asociado con algunos trastornos autoinmunes, los que indica que el ligando Apo-I puede jugar un papel en la regulación de la deleción clonal de linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammer y col., Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata y col., Science, 267:1449-1456 (1995)]. Se ha informado también de que el ligando Apo-I induce la apoptosis tras estimulación en linfocitos T CD4 positivos y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de los linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer y col., más arriba; Nagata y col., más arriba]. Se ha informado de anticuerpos monoclonales agonistas de ratón que se unen específicamente al receptor Apo-1 que presentan una actividad de muerte celular que es comparable o similar a la de TNF-\alpha [Yonehara y col., L Exp. Med., 169:1747-1756 (1989)].

Familia de receptores TNF

Se cree que la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por dicha familia TNF de citocinas se va a iniciar mediante su unión a receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); documento EP 417.563, publicado el 20 de marzo de 1991] y se han aislado y caracterizado los ADNc humano y de ratón que corresponden a ambos tipos de receptores [Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990); Schall y col., Cell, 61:361 (1990); Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Se han asociado extensos polimorfismos con ambos genes del receptor TNF [véase, por ejemplo, Takao y col., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)]. Ambos TNFR comparten la estructura típica de los receptores superficiales celulares incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las porciones extracelulares de ambos receptores se encuentran naturalmente también como proteínas de unión a TNF solubles [Nophar, Y. y col., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:8331 (1990)]. Más recientemente, Hale y col. [J. Cell. Biochem.
Suplemento 15F, 1991, p. 113 (P424)]. informaron de la clonación de receptores TNF solubles recombinantes.

La porción extracelular de los TNFR de tipo I y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un modelo repetitivo de secuencia de aminoácidos de las cuatro regiones ricas en cisteína (CRD) designadas I a 4, comenzando desde el término NH_{2}. Cada CRD tiene aproximadamente 40 aminoácidos de longitud y contiene de 4 a 6 restos de cisteína en posiciones que están bien conservadas [Schall y col., más arriba; Loetscher y col., más arriba; Smith y col., más arriba; Nophar y col., más arriba; Kohno y col., más arriba]. En TNFR1, los límites aproximados de las cuatro CRD son como sigue: CRD1- aminoácidos 14 a aproximadamente 53; CRD2-aminoácidos desde aproximadamente 54 a aproximadamente 97; CRD3-aminoácidos desde aproximadamente 98 a aproximadamente 138; CRD4-aminoácidos desde aproximadamente 139 a aproximadamente 167. En TNFR2, CRD1 incluye los aminoácidos 17 a aproximadamente 54; CRD2-aminoácidos desde aproximadamente 55 a aproximadamente 97; CRD3-aminoácidos desde aproximadamente 98 a aproximadamente 140; y CRD4-aminoácidos desde aproximadamente 141 a aproximadamente 179 [Banner y col., Cell, 73:
431-435 (1993)]. Banner y col., más arriba, describen también el papel potencial de las CRD en la unión del ligando.

Existe un modelo repetitivo similar de las CRD en otras diversas proteínas superficiales celulares, que incluyen el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (NGFR) [Johnson y col., Cell, 47:545 (1986); Radeke y col., Nature, 325:593 (1987)], el antígeno CD40 de las células B [Stamenkovic y col., EMBO J., 8:1403 (1989)], el antígeno OX40 de las células T (Mallet y col., EMBO J., 9:1063 (1990)] y el antígeno FAS [Yonehara y col., más arriba e Itoh y col., más arriba]. Las CRD se encuentran también en las proteínas T2 de tipo TNFR solubles (TNFRs) de los poxvirus Shope y mixoma [Upton y col., Virology, 160:20-29 (1987); Smith y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton y col., Virology, 184:370 (1991)]. La alineación óptima de estas secuencias indica que las posiciones de los restos de cisteína están bien conservadas. Estos receptores se denominan algunas veces colectivamente como miembros de la superfamilia de receptor TNF/NGF. Recientes estudios sobre p75NGFR demostraron que la deleción de CRD1 (Welcher, A.A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88:159-163 (1991)] o una inserción en el aminoácido 5 de esta región [Yan, H. y Chao, M.V., J. Biol. Chem., 266:12099-12104 (1991)] tuvieron poco o ningún efecto sobre la unión de NGF [Yan, H. y Chao, M. V., más arriba.]. p75 NG FR contiene un tramo rico en prolina de aproximadamente 60 aminoácidos, entre su CRD4 y la región transmembrana, que no está implicado en la unión de NGF [Peetre, C. y col., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988); Seckinger, P. y col., J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989); Yan, H. y Chao, M.V., más arriba]. Una región similar rica en prolina se encuentra en TNFR2, pero no en TNFR1.

Itoh y col. desvelan que el receptor Apo-1 puede señalar una muerte celular apoptótica similar a la señalada por el TNFR1 de 55 kDa [Itoh y col., más arriba]. Se ha informado también de que la expresión del antígeno Apo-I está infrarregulada junto con la de TNFR1 cuando las células se tratan tanto con TNF-\alpha como con anticuerpo monoclonal anti-Apo-1 de ratón [Krammer y col., más arriba; Nagata y col., más arriba]. Según esto, algunos investigadores han teorizado que las líneas celulares que expresan simultáneamente los receptores Apo-I y TNFR1 pueden mediar en la muerte celular a través de rutas de señalización comunes [Id].

Los ligandos de la familia TNF identificados hasta la fecha, con la excepción de linfotoxina-\alpha, son proteínas transmembrana de tipo II, cuyo término C es extracelular. Por el contrario, los receptores de la familia del receptor TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son proteínas transmembrana de tipo I. En ambas familias de ligando y receptor TNF, sin embargo, la homología identificada entre los miembros de la familia se ha encontrado principalmente en la región extracelular ("ECD"). Algunas de las citocinas de la familia TNF, incluyendo TNF-\alpha, el ligando Apo-I y el ligando CD40, se rompen proteolíticamente en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma normalmente una molécula homotrimérica que funciona como una citocina soluble. Las proteínas de la familia del receptor TNF se rompen también normalmente de manera proteolítica para liberar las ECD del receptor soluble que pueden funcionar como inhibidores de las citocinas análogas.

Recientemente se han identificado otros miembros de la familia TNFR. En Marsters y coll., Curr. Biol. 6:750 (1996), los investigadores describieron una secuencia natural de longitud completa de polipéptido humano, denominada Apo-3, que presenta similitud con la familia TNFR en sus repeticiones extracelulares ricas en cisteína y se parece a THFR1 y CD95 en que contiene una secuencia de la región de muerte citoplásmica [véase también Marsters y col., Curr. Biol., 6:1669 (1996)]. Otros investigadores han denominado también Apo-3 como DR3, ws1-1 y TRAMP [Chinnaiyan y col., Science, 274:990 (1996); Kitson y col., Nature, 384:372 (1996); Bodmer y col., Immunity, 6:79 (1997)].

Pan y col. han desvelado otro miembro de la familia del receptor TNF denominado como "DR4" [Pan y col., Science, 276:111-113 (1997)]. Se informó de que DR4 contenía una región de muerte citoplásmica capaz de engranar el aparato suicida de la célula. Pan y col. Desvelan que se cree que DR4 es un receptor del ligando conocido como ligando Apo-2 o TRAIL.

En Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997) y en Pan y col., Science, 277:815-818 (1997), se describe otra molécula que se cree que es un receptor del ligando Apo-2 (TRAIL). Esta molécula se denomina como DR5 (se ha denominado también alternativamente como Apo-2). Como DR4, se informa de que DR5 contiene una región de muerte citoplásmica y es capaz de señalizar la apoptosis.

En Sheridan y col., más arriba, se desvela un receptor denominado DcR1 (o alternativamente, Apo-2DcR) como un receptor señuelo potencial del ligando Apo-2 (TRAIL). Sheridan y col. informan que DeRI puede inhibir la función del ligando Apo-2 in vitro. Véase también, Pan y col., más arriba, para la descripción del receptor señuelo denominado como TRID.

Complejo de señalización que induce la apoptosis

Tal como se entiende actualmente, el programa de muerte celular contiene al menos tres elementos importantes - activadores, inhibidores, y efectores; en C. elegans, estos elementos están codificados respectivamente por tres genes, Ced-4, Ced-9 y Ced-3 [Steller, Science, 267:1445 (1995); Chinnaiyan y col., Science, 275:1122-1126 (1997); Wang y col., Cell, 90:1-20 (1997)]. Dos de los miembros de la familia TNFR, TNFR1 y Fas/ApoI (CD95), pueden activar la muerte celular apoptótica [Chinnaiyan y Dixit, Current Biology, 6:555-562 (1996); Fraser y Evan, Cell; 85:781-784 (1996)]. Se sabe también que TNFR1 media en la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB [Tartaglia y col., Cell, 74:845-853 (1993); Hsu y col., Cell, 84:299.308 (1996)]. Además de alguna homología con la ECD, estos dos receptores comparten homología en su región intracelular (ICD) en una interfase de oligomerización conocida como región de muerte [Tartaglia y col., más arriba; Nagata, Cell, 88:355 (1997)]. Se encuentran también regiones de muerte en diversas proteínas de metazoos que regulan la apoptosis, concretamente, la proteína de Drosophila, Reaper, y las proteínas de mamíferos denominadas como FADD/MORTI, TRADD, y RIP [Cleaveland e Ihle, Cell, 81:479-482 (1995)). Usando el sistema doble híbrido en levaduras, Raven y col. informaron de la identificación de la proteína wsl-1, que se une a la región de muerte de TNFR1 [Raven y col., Programmed Cell Death Meeting, 20-24 de septiembre de 1995, Resumen en la página 127; Raven y col., European Cytokine Network, 7: Resumen 82 a la página 210 (abril-junio de 1996); véase también, Kitson y col., Nature, 384:372-375 (1996)]. Se describe la proteína ws1-1 como homóloga de TNFR1 (identidad del 48%) y teniendo una distribución tisular restringida. Según Raven y col.; la distribución tisular de wsl-1 es significativamente diferente de la de la proteína de unión con RNFR1, TRADD.

Tras la unión del ligando y el agrupamiento del receptor se cree que TNFR 1 y CD96 alistan FADD en un complejo de señalización que induce la muerte. CD95 se une supuestamente a FADD directamente, mientras que TNFR1 se une a FADD indirectamente mediante TRADD [Chinnaiyan y col., Cell, 81:505-512 (1995); Boldin y col., J. Biol. Chem., 270:387-391 (1995); Hsu y col., más arriba; Chinnaiyan y col., J. Biol. Chem., 271:4961-4965 (1996)]. Se ha informado de que FADD sirve como una proteína adaptadora que alista la proteasa relacionada con Ced-3, MAHC\alpha/FLICE (caspasa 8), en el complejo de señalización de muerte [Boldin y col., Cell, 85:803-815 (1996); Muzio y col., Cell, 85:817-827 (1996)]. MAHC\alpha/FLICE parece ser el desencadenante que desconecta una cascada de proteasas apoptóticas, que incluyen la enzima que convierte la interleucina-1\beta (ICE) y CPP32/Yama, que puede ejecutar algunos aspectos críticos del programa de muerte celular (Fraser y Evan, más arriba).

Se dio a conocer recientemente que la muerte celular programada implica la actividad de una familia de cisteína-proteasas relacionadas con el gen de la muerte celular de C. elegans, ced-3, y con la enzima que convierte IL-1 de mamíferos, ICE. Se puede inhibir la actividad de la ICE y de las CPP32/Yama proteasas por el producto génico del virus de la viruela bovina, crmA [Ray y col., Cell, 69:597-604 (1992); Tewari y col., Cell, 81:801-809 (1995)]. Recientes estudios muestran que CnnA puede inhibir la muerte celular inducida por TNFP1 y CD95 (Enarl y col., Nature. 375:78-81 (1995); Tewari y col., J. Biol. Chem., 70:3255-3260 (1995)].

Según se ha revisado recientemente por Tewari y col., TNFR1, TNFR2 y CD40 modulan la expresión de las citocinas proinflamatorias y coestimuladoras, los receptores de las citocinas, y las moléculas de adhesión celular mediante la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB (Tewari y col., Curr. Op. Genet. Develop., 6:39-44 (1996)]. NF-\kappaB es el prototipo de una familia de factores de transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones ReI conservadas [Verma y col., Genes Develop., 9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649-681 (1996)]. En su forma latente, NF-\kappaB está complejado con miembros de la familia del inhibidor I\kappaB; tras la inactivación de I\kappaB en respuesta a algunos estímulos, el NF-\kappaB liberado se transloca en el núcleo cuando se une a las secuencias específicas de ADN y activa la transcripción génica.

Para una revisión de la familia TNF de citocinas y sus receptores, véase Gruss y Dower, más arriba.

Resumen de la invención

Los solicitantes han identificado clones de ADNc que codifican polipéptidos novedosos, designados en la presente solicitud como "RTD". Se cree que RTD es un miembro de la familia TNFR; la secuencia natural de longitud completa del polipéptido RTD humano presenta similitud con la familia TNFR en sus repeticiones extracelulares ricas en cisteína. Los solicitantes encontraron que RTD puede unirse al ligando Apo-2 (Apo-2L) y bloquear la apoptosis inducida por Apo-2L. Se cree actualmente que RTD puede funcionar como un receptor Apo-2L inhibidor.

En una realización, la invención proporciona el polipéptido RTD aislado. En particular, la invención proporciona la secuencia natural aislada del polipéptido RTD, que en una realización incluye la secuencia de aminoácidos que comprende los restos 1 a 386 de la Figura 1A (SEC DE ID Nº: 1). En otras realizaciones, el polipéptido RTD aislado comprende al menos una identidad del 95% de la secuencia de aminoácidos con la secuencia natural del polipéptido RTD que comprende los restos 1 a 386 de la Figura 1A (SEC DE ID Nº: 1). El polipéptido RTD aislado comprende un polipéptido que carece de una secuencia señal. Opcionalmente, dicho polipéptido puede comprender los restos 56 a 386 de la Figura 1A (SEC DE ID Nº: 1).

En otra realización, la invención proporciona la secuencia de una región extracelular aislada (ECD) de RTD. Opcionalmente, la secuencia de la región extracelular aislada comprende los restos de aminoácidos 56 a 212 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1). El polipéptido aislado de la ECD de RTD puede comprender un polipéptido que contiene una o más regiones ricas en cisteína. En una realización tal, el polipéptido comprende una o ambas regiones ricas en cisteína identificadas en la Figura 1B como los restos 99 a 139 y 141 a 180, respectivamente, de la SEC DE ID Nº: 1.

En otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden el polipéptido RTD fusionado con un polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga. Un ejemplo de dicha molécula quimérica comprende un RTD fusionado con una secuencia de inmunoglobulina. Otro ejemplo comprende una secuencia de la región extracelular de RTD fusionada con un polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga, tal como una secuencia de inmunoglobulina.

En otra realización, la invención proporciona una molécula de ADN aislado que codifica un polipéptido RTD. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico es ARN o ADN que codifica un polipéptido RTD o una región concreta de RTD, o es complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico codificante, y permanece unida de manera estable con ésta en condiciones al menos moderadas, y opcionalmente, de restricción elevada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico se selecciona entre:

(a): la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1A (SEC DE ID Nº:2) que codifica del restos 1 al restos 386 (es decir, los nucleótidos 157-159 a 1312-1314), inclusive;

(b): la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1A (SEC DE ID Nº:2) que codifica del restos 56 al restos 212 (es decir, los nucleótidos 321-323 a 789-791), inclusive; o

(c): una secuencia que corresponde a la secuencia de (a) o (b) comprendida en el ámbito de la degeneración del código genético.

En una realización adicional, la invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido RTD o una región concreta de RTD. Se proporciona también una célula huésped que comprende el vector de la molécula de ácido nucleico. Se proporciona además un procedimiento para producir RTD.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a RTD. El anticuerpo puede ser un anticuerpo agonístico, antagonístico o neutralizante.

En otra realización, la invención proporciona animales no humanos, transgénicos o genomanipulados.

Una realización adicional de la invención proporciona artículos de fabricación y kits que incluyen RTD o anticuerpos RTD.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A. Muestra la secuencia de nucleótidos de una secuencia natural del ADNc de RTD humano y su secuencia de aminoácidos derivada. En la Figura 1A, la secuencia señal (restos 1-55) y la secuencia transmembrana (restos 213-232) están subrayadas. Los emplazamientos potenciales de glicosilación unidos a N (restos 127,171, y 182) están también subrayados.

Figura 1B. Muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la ECD de RTD alineada con las ECD de DR4, DR5, y DcR1. Las regiones ricas en cisteína se identifican como CRDI y CCRD2.

Figura 1C. Muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la región intracelular de RTD humano alineada con las regiones intracelulares correspondientes de DR4 y DR5. La región de muerte se identifica como DD.

Figura 1D. Es un diagrama esquemático de la presunta organización de la región de RTD, DR4, DR5, y DcR1 y que muestra la región extracelular [incluyendo las regiones señal (S) y ricas en cisteína (CRD1 y CRD2), la región transmembrana (TM) y a región truncada de muerte (TD) o la región de muerte (DD). En DcR1, 1-5 indica pseudorepeticiones de 15 aminoácidos.

Figura 2A. Muestra la unión de Apo-2L radioyodado con la inmunoadhesina purificada de la ECD de RTD según se mide en un ensayo de precipitación simultánea.

Figura 2B. Muestra la inhibición de la inducción de la apoptosis por Apo-2L mediante la inmunoadhesina de la ECD de RTD en un cultivo de células HeLa.

Figura 3A. Muestra la inducción de la apoptosis en células HeLa transfectadas con DR4 o DR5; las células HeLa transfectadas con RTD de longitud completa (clon de ADN35663 o clon de ADN35664) no dieron como resultado ninguna diferencia en la apoptosis en comparación con las células control transfectadas.

Figura 3B. Muestra los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética ensayado para la activación de NF-\kappaB. Se transfectaron células 293 con el vector solo, RTD (clon de ADN35663 o clon de ADN35664) o DR4 o DR5. La transfección de RTD no da como resultado un aumento en la actividad de NF-\kappaB.

Figura 3C. Muestra el bloqueo de la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 en células 293 transfectadas con RTD (clon de ADN35663 o clon de ADN35664).

Figura 4. Muestra la expresión del ARNm de RTD en tejidos humanos según se analizó mediante hibridación por transferencia Northern. Los tamaños de los patrones de pesos moleculares se muestran en la derecha en kb.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas 1. Definiciones

Los términos "polipéptido RTD" y "RTD", cuando se usan en el presente documento abarcan la secuencia natural de RTD y las variantes de RTD (que se definen adicionalmente en el presente documento). Estos términos abarcan los RTD de una variedad de mamíferos, que incluyen los seres humanos. Se puede aislar el RTD de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o preparase mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Una "secuencia natural de RTD" comprende el polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un RTD derivado de la naturaleza. De esta manera, una secuencia natural de RTD puede tener la secuencia de aminoácidos del RTD que se produce de manera natural procedente de cualquier mamífero. Dicha secuencia natural de RTD se puede aislar de la naturaleza o se puede producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "secuencia natural de RTD" abarca específicamente las formas truncadas o segregadas que se producen naturalmente del RTD (por ejemplo, una secuencia de la región extracelular), las formas variantes que se producen naturalmente (por ejemplo, las formas cortadas y empalmadas alternativamente), y las variantes alélicas que se producen naturalmente del RTD. Una forma variante que se produce naturalmente del RTD incluye un RTD que tiene una sustitución de aminoácidos que se muestra en la Fig. 1A (SEC DE ID Nº-1). En una realización de dicha forma variante que se produce naturalmente, el resto de serina en la posición 310 está sustituido por un resto de leucina. En la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1) el resto de aminoácido en la posición 310 se identifica como "Xaa" para indicar que el aminoácido puede, opcionalmente, ser tanto serina como leucina. En la Fig. 1A (SEC DE ID Nº:2), el nucleótido en la posición 1085 se identifica como "Y" para indicar que el nucleótido puede ser tanto citosina (C) como timina (T) o uracilo (U). En una realización de la invención, la secuencia natural de RTD es una secuencia natural madura o de longitud completa de RTD que comprende los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1). Opcionalmente, el RTD es uno que carece de una secuencia señal, y puede comprender los restos 56 a 386 de la Figura 1A (SEC DE ID Nº: 1).

La "región extracelular de RTD" o "ECD de RTD" se refiere a una forma de RTD que está esencialmente libre de las regiones transmembrana y citoplásmica. Ordinariamente, la ECD de RTD puede tener menos de un 1% de dichas regiones transmembrana y citoplásmica y preferiblemente, tendrá menos de un 0,5% de dichas regiones. Opcionalmente, la ECD de RTD comprenderá los restos de aminoácidos 56 a 212 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1). La ECD de RTD puede comprender también un polipéptido que contiene una o más regiones ricas en cisteína, y puede comprender un polipéptido que incluya una o ambas regiones ricas en cisteína identificadas como los restos 99 a 139 y 141 a 180, respectivamente, de la Figura 1A (SEC DE ID Nº: 1). La invención proporciona además fragmentos de dichas moléculas solubles de la ECD de RTD. Preferiblemente, los fragmentos de la ECD retienen la actividad biológica y/o las propiedades del RTD de longitud completa o de la ECD identificada en el presente documento como teniendo los restos de aminoácidos 56 a 212 de la Figura 1A (SEC DE ID Nº: 1).

"Variante de RTD" significa un RTD biológicamente activo según se define a continuación que tiene al menos un 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el RTD que tiene la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1) para una secuencia natural de longitud completa del RTD humano. Dichas variantes del RTD incluyen, por ejemplo, los polipéptidos RTD a los que se añaden uno o más restos de aminoácidos, o se eliminan, en el término N o el C de la secuencia de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

Se define el "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de RTD identificadas en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de RTD, tras la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación con objeto de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diversas maneras que están comprendidas dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos de distribución libre tales como los programas informáticos ALIGN o Megalign (DNASTAR). Las personas expertas en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, que incluyen cualquier algoritmo necesario para conseguir la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando.

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El término "epitopo etiquetado" cuando se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido quimérico que comprende el RTD, o una secuencia de la región del mismo, fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes restos para proporcionar un epitopo contra el cual se puede preparar un anticuerpo, todavía suficientemente corto de tal manera que no interfiera con la actividad del RTD. El polipéptido etiqueta es también preferiblemente verdaderamente único de tal manera que el anticuerpo no reacciona en cruzado con otros epitopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente al menos seis restos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 restos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 restos).

"Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos que se dan a conocer en el presente documento, significa el polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente podrían interferir con el diagnóstico o los usos terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en el interior de células recombinantes, debido a que al menos un componente en el entorno natural del RTD no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, se preparará el polipéptido aislado mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico del RTD es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa a partir de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del RTD. Una molécula aislada de ácido nucleico de RTD es diferente en forma y manera de la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido nucleico de RTD se distinguen por tanto de la molécula de ácido nucleico de RTD ya que existen en células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico de RTD incluye moléculas de ácido nucleico de RTD contenidas en células que expresan ordinariamente RTD, en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de manera operable en un organismo hospedador concreto. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un emplazamiento de unión con el ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Un ácido nucleico se "une de manera operable" cuando se coloca en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor se une de manera operable al ADN de un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une de manera operable a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un emplazamiento de unión al ribosoma se une de manera operable a una secuencia de codificación si se sitúa de tal manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido de manera operable" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligadura en emplazamientos de restricción convenientes. Si dichos emplazamientos no existen, se usan adaptadores o ligantes de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se usa en sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales anti-RTD únicos (que incluyen los anticuerpos agonistas, antagonistas, y neutralizantes) y las composiciones de anticuerpo anti-RTD con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" según se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un emplazamiento antigénico único. Además, por el contrario con las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonal) que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos mediante corte y empalme de una región variable (incluyendo la hipervariable) de un anticuerpo anti-RTD con una región constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, con respecto a la designación de especies de origen o del tipo o subtipo inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2} y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada. Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567 y Mage y col., en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987).

De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se construye a medida que se requiere la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar según la presente invención se pueden preparar en primer lugar mediante el procedimiento del hibridoma descrito por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante tales como los descritos de la Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567. Se pueden aislar también los "anticuerpos monoclonales" a partir de bibliotecas de fagos generadas usando, por ejemplo, las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos del huésped) en las que los restos de una región determinante complementaria (CDR) del huésped se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpos del donante) tales como de ratón, rata, o conejo que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los restos de la región del armazón de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender los restos que no se encuentra ni en el anticuerpo del huésped ni en la CDR importada o las secuencias del armazón. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todas de al menos una, y normalmente dos regiones variables, en las que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante o región de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana.

"Biológicamente activo" y "actividad biológica deseada", a los objetos del presente documento significan (1) que tiene la capacidad de modular la apoptosis (tanto de manera agonística como estimulante o tanto de manera antagonística como bloqueante) en al menos un tipo de célula de mamífero in vivo o ex vivo; (2) que tiene la capacidad de unirse al ligando Apo-2; ó (3) que tiene la capacidad de modular la actividad del ligando Apo-2.

Los términos "apoptosis" y "actividad apoptótica" se usan en sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que normalmente se acompaña por uno o más cambios celulares característicos, que incluyen la condensación del citoplasma, la pérdida de las microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Se puede determinar y medir esta actividad, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de ADN, todos los cuales son conocidos en la técnica.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la dolencia fisiológica que en mamíferos se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más concretos de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de páncreas, glioblastoma, neuroblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Los términos "que trata", "tratamiento", y "terapia", según se usan en el presente documento se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica, y terapia preventiva.

El término "mamífero", según se usa en el presente documento se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En la realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano.

II. Composiciones y procedimientos de la invención

La presente invención proporciona polipéptidos RTD recientemente identificados y aislados. En concreto, los Solicitantes han identificado y aislado diversos polipéptidos RTD humanos. Las propiedades y características de algunos de estos polipéptidos RTD se describen con mayor detalle en los Ejemplos siguientes. Basándose en las propiedades y características de los polipéptidos RTD que se dan a conocer en el presente documento, los Solicitantes creen en la actualidad que RTD es un miembro de la familia TNFR, y concretamente, es un receptor del ligando Apo-2.

Sigue una descripción sobre cómo se puede preparar RTD, así como moléculas quiméricas de RTD y anticuerpos anti-RTD.

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Preparación de RTD

La memoria descriptiva se refiere a continuación principalmente a la producción de RTD mediante cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de RTD. Se contempla, por supuesto, que se puedan emplear procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar RTD.

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Aislamiento del ARN que codifica RTD

Se puede obtener el ADN que codifica RTD a partir de cualquier biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se crea que posee el ARNm de RTD y exprese éste a un nivel detectable. Según esto, se puede obtener convenientemente el ADN de RTD a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejidos humanos, tales como las bibliotecas de ADN humano descritas en el Ejemplo 1. Se puede obtener también el gen que codifica RTD a partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Se pueden rastrear las bibliotecas con sondas (tales como anticuerpos para el RTD u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Se puede llevar a cabo el rastreo del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada usando procedimientos normalizados, tales como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Nueva York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio para aislar el gen que codifica RTD es usar la metodología de la PCR [Sambrook y col., más arriba; Dieffenbach y col.; PCR Primer: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Un procedimiento de rastreo emplea secuencias de oligonucleótidos seleccionadas para rastrear bibliotecas de ADNc procedentes de diversos tejidos humanos. El Ejemplo I a continuación describe las técnicas para rastrear una biblioteca de ADN. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y sin ambigüedad suficiente para minimizar los falsos positivos. Se marca el oligonucleótido preferiblemente de tal manera que se pueda detectar tras la hibridación del ADN en la biblioteca que se está rastreando. Se conocen bien en la técnica los procedimientos de marcado, e incluyen el uso de radiomarcas del tipo ATP marcado con ^{32}P, marcado por biotinilación o por enzima. En Sambrook y col., más arriba, se proporcionan las condiciones de hibridación, que incluyen restricción moderada y restricción elevada.

Se puede obtener el ácido nucleico que tiene todas las secuencias que codifican la proteína mediante rastreo del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas usando la secuencia de aminoácidos deducida que se da a conocer en el presente documento por primera vez, y, si es necesario, usando los procedimientos convencionales de extensión del cebador según se describen en Sambrook y col., más arriba, para detectar lo precursores y los intermedios de procesamiento del ARNm que puede no haberse transcrito de manera inversa en el ADNc.

Se pueden preparar variantes de RTD introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de RTD, o mediante síntesis del polipéptido RTD deseado. Las personas expertas en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales del RTD, tales como cambiando el número o la posición de los emplazamientos de glicosilación o alterando las características de anclado de la membrana.

Se pueden llevar a cabo variaciones en la secuencia natural de longitud completa de RTD o en diversas regiones del RTD descritas en el presente documento, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para las mutaciones conservativas y no conservativas que se muestran, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el RTD lo que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos del RTD en comparación con la secuencia de RTD natural. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en una o más de las regiones de la molécula de RTD. Se pueden llevar a cabo variaciones usando los procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al emplazamiento), el escaneo de la alanina, y la mutagénesis mediante la PCR. Se puede llevar a cabo la mutagénesis dirigida al emplazamiento [Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis del casete [Wells y col., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis con selección de la restricción [Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas sobre el ADN clonado para producir la variante de ADN de RTD.

Se puede emplear también el análisis de escaneo del aminoácido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que está implicada en la interacción con un ligando o receptor concreto. Entre los aminoácidos de escaneo preferido se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es el aminoácido de escaneo preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena secundaria más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. Se prefiere también la alanina debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones soterradas y expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de la alanina no da como resultados cantidades adecuadas de la variante, se puede usar un aminoácido isotérico.

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Una vez que se han producido las variantes de RTD seleccionadas, se pueden poner en contacto con, por ejemplo, Apo-2L, y se puede determinar, si es que existe, la interacción. Se puede medir la interacción entre la variante de RTD y Apo-2L mediante un ensayo in vitro, según se describe en los Ejemplos siguientes. Aunque se pueden usar cualquier número de medidas analíticas para comparar las actividades y las propiedades entre una secuencia natural de RTD y una variante de RTD, una conveniente para la unión es la constante de disociación K_{d} del complejo formado entre la variante de RTD y Apo-2L en comparación con la K_{d} de la secuencia natural de RTD. Generalmente, un aumento o disminución \geq 3 veces en la K_{d} por resto sustituido indica que el(los) resto(s) sustituido(s) es(son) activo(s)
en la interacción de la secuencia natural de RTD con el Apo-2L. se pueden analizar también las variantes de RTD seleccionadas para la actividad biológica, tal como la capacidad para modular la apoptosis, en los ensayos in vitro descritos en los Ejemplos.

Opcionalmente, los emplazamientos representativos en la secuencia de RTD adecuados para la mutagénesis incluirían los emplazamientos en el interior de la región extracelular, y particularmente, en el interior de una o más regiones ricas en cisteína. Se pueden llevar a cabo dichas variaciones usando los procedimientos descritos anteriormente. Están abarcadas por la invención, las variantes delecionales de la ECD, tales como los fragmentos resultantes de la deleción de uno o más aminoácidos. Preferiblemente, dichas variantes o fragmentos delecionales retienen al menos una actividad o propiedad biológica de la longitud completa o de las formas solubles de RTD.

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2. Inserción de ácido nucleico en un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, el ADNc o el ADN genómico) que codifica RTD se puede insertar en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. Están públicamente disponibles diversos vectores. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, cada una de las cuales se describe a continuación.

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(i) Componentes de la secuencia señal

Se puede producir el RTD de manera recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un emplazamiento de rotura específico en el término N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de RTD que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que es reconocida y procesada (es decir, rota por una peptidasa señal) por la célula huésped. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o las líderes de la enterotoxina II térmicamente estables. Para la secreción de levaduras la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (que incluye las líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la Patente de los Estados Unidos nº 5.010.182), o la líder de la fosfatasa ácida, la líder de la glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión celular en mamíferos la presecuencia natural de RTD que dirige normalmente la inserción de RTD en la membrana celular de las células humanas in vivo es satisfactoria, aunque se pueden usar otras secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tales como las secuencias señal de los polipéptidos segregados de la misma o especies relacionadas, así como las líderes secretoras víricas, por ejemplo, la señal D de la glicoproteína del herpes simple.

El ADN de dicha región precursora se liga preferiblemente en el marco de lectura con el ADN que codifica RTD.

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(ii) Origen del componente de la replicación

Los vectores de expresión y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye los orígenes de la replicación o las secuencias que se replican autónomamente. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2\mu es adecuado para las levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el origen del componente de la replicación no se necesita para los vectores de expresión en mamíferos (se puede usar normalmente el origen de SV40 debido a que contiene el promotor temprano).

La mayor parte de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de la replicación en al menos un tipo de organismo pero se pueden transfectar a otro organismo para la expresión. Por ejemplo, se clona un vector en E. coli y a continuación el mismo vector se transfecta en células de levaduras o mamíferos para la expresión incluso aunque no sea capaz de la replicación independientemente del cromosoma de la célula huésped.

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Se puede amplificar también el ADN mediante inserción en el genoma del huésped. Esto se lleva a cabo fácilmente usando como huéspedes especies de Bacillus, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que sea complementaria de una secuencia encontrada en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del ADN de RTD. Sin embargo, la recuperación del ADN genómico que codifica RTD es más compleja que la de un vector replicado de manera exógena debido a que se requiere la digestión del enzima de restricción para escindir el ADN de RTD.

(iii) Selección del componente génico

Los vectores de expresión y de clonación contienen normalmente un gen de selección, denominado también marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células huésped transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y de esta manera sobrevive el régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina [Southern y col., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982)], ácido micofenólico (Mulligan y col., Science, 209:1422 (1980)] o higromicina [Sugden y col., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)]. Los tres ejemplos proporcionados anteriormente emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para transmitir resistencia al fármaco G418 apropiado o a la neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados de células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para capturar el ácido nucleico de RTD, tales como DHFR o timidina quinasa. Los marcadores de células de mamíferos se colocan a presión de selección de manera que sólo los transformantes están únicamente adaptados para sobrevivir en virtud de haber capturado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo por tanto a la amplificación del gen de selección y del ADN que codifica RTD. La amplificación es el procedimiento por el cual los genes con mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem con los cromosomas de las generaciones sucesivas de células recombinantes. Se sintetizan cantidades crecientes de RTD a partir del ADN amplificado. Otros ejemplos de genes amplificables incluyen metalotioneína-I y 11, adenosina desaminasa, y ornitina decarboxilasa.

Las células transformadas con el gen de selección DHFR se pueden identificar en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo no alterado genéticamente es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada según se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:4216 (1980). A continuación se exponen las células transformadas a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR, y, concomitantemente, múltiples copias de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica RTD. Se puede usar esta técnica de amplificación con cualquier huésped adecuado de otra manera, por ejemplo, CHO-K1 de la ATCC con Nº CCL61, a pesar de la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se emplea un gen DHFR mutante que sea muy resistente a Mtx (documento EP 117.060).

Alternativamente, se pueden seleccionar células huésped (particularmente huéspedes de tipo no alterado genéticamente que contengan DHFR endógeno) transformadas o transformadas simultáneamente con secuencias de ADN que codifican RTD, proteína DHFR de tipo no alterado genéticamente, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) mediante crecimiento celular en medio que contenga un agente de selección del marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase la Patentes de los Estados Unidos Nº 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido YRp7 de levadura [Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7:141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección de una cepa mutante que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona a continuación un entorno efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. Similarmente, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos que soportan el gen Leu2.

Adicionalmente, se pueden usar vectores derivados del plásmido circular de 1,6 \mum pKD1 para la transformación de las levaduras Kluyveromyces [Bianchi y col., Curr. Genet., 12:185 (1987)]. Más recientemente, se informó de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina recombinante de ternero para K. lactis [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. Se han dado a conocer también vectores de expresión de copias múltiples para la secreción de albúmina de suero humano recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces [Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].

(iv) Componente del promotor

Los vectores de expresión y de clonación contienen normalmente un promotor que el organismo huésped reconoce y que se une de manera operable con la secuencia del ácido nucleico de RTD, Los promotores son secuencias no traducidas localizadas en la dirección 5' (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente comprendido dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y la traducción de la secuencia de ácido nucleico concreta, tal como la secuencia de ácido nucleico de RTD, a la cual se une de manera operable. Dichos promotores se dividen normalmente en dos tipos, inducible y constitutivo. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles crecientes de la transcripción desde el ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este momento, se conocen bien un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Estos promotores se unen de manera operable al ADN que codifica RTD eliminando el promotor de la fuente de ADN mediante digestión del enzima de restricción y se insertan en la secuencia aislada del promotor en el vector. Se pueden usar la secuencia natural del promotor de RTD y muchos promotores heterólogos para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN de RTD.

Los promotores adecuados para uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas de la \beta-lactamasa y la lactosa [Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); documento EP 36.776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80:21-25 (1983)]. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, permitiendo por tanto a un operario experto unirlos de manera operable con el ADN que codifica RTD [Siebenlist y col., Cell, 20:269 (1980)] usando ligantes o adaptadores para suministrar cualquier emplazamiento de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos contendrán también una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) unida de manera operable con el ADN que codifica RTD.

Se conocen las secuencias promotoras de los eucariotas. Virtualmente, todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en la dirección 5' del emplazamiento en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases en la dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es la región CXCAAT en la que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en los vectores de expresión eucarióticos.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glicolíticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fofoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de tener la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, y los enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Se describen adicionalmente en el documento EP 73.657 los vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras. Se usan también ventajosamente los potenciadores de las levaduras con los promotores de las levaduras.

La transcripción de RTD desde vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), los adenovirus (tales como Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y lo más preferible el Virus 40 de Simios (SV40), procedente de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de la inmunoglobulina, procedentes de promotores del choque térmico, y procedentes del promotor asociado normalmente con la secuencia de RTD, proporcionando que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente en forma de fragmento de restricción de SV40 que contiene también el origen vírico de la replicación de SV40 [Fiers y col., Nature, 273:113 (1978); Mulligan y Berg, Science; 209 (1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 78:7398-7402 (1981)]. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción E de HindIII [Greenaway y col., Gene, 18:355-360 (1982)]. Se da a conocer un sistema para expresar el ADN en mamíferos huéspedes que usa el virus del papiloma bovino como un vector, en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.419.446. Se describe una modificación de este sistema en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.601.978 [Véanse también Gray y col., Nature, 295:503-508 (1982) en la expresión del ADNc que codifica el interferón inmune en células de mono; Reyes y col., Nature, 297:598-601 (1982) en la expresión del ADNc del interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa procedente del virus del herpes simple; Canaan i y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 79:5166-5170 (1982) en la expresión del gen del interferón \beta1 humano en cultivos celulares de ratón y conejo; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 79:6777-6781 (1982) en la expresión de secuencias CAT bacterianas en células CV-1 de riñón de mono, fibroblastos embriónicos de gallina, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células NIH-3T3 de ratón, que usan la repetición de longitud terminal del virus del sarcoma de Rous como promotor].

(v) Componente del elemento potenciador

Se puede aumentar la transcripción de un ADN que codifica el RTD de esta invención mediante eucariotas superiores insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos cis actuantes del ADN, normalmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado 5' [Laimins y col., Proc. Natl. Acad, Sci. EE.UU., 78:993 (1981]) y 3' [Lusky y col., Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983]) en la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji y col., Cell, 33:729 (1983)], así como dentro de la propia secuencia de codificación [Osborne y col., Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)]. Se conocen ahora muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Normalmente, sin embargo, se usaría un potenciador procedente de un virus de una célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el último lado del origen de replicación 100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el último lado del origen de replicación, y los potenciadores de los adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) o los elementos potenciadores de la activación de los promotores eucarióticos. Se puede cortar y empalmar el potenciador en el vector en una posición 5' ó 3' en la secuencia de codificación de RTD, pero se localiza preferiblemente en el emplazamiento 5' del promotor.

(vi) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en las células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones 5' no traducidas y, ocasionalmente las 3' de los ADN o ADNc eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen los segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica RTD.

(vii) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente relacionados emplea técnicas de ligadura normalizadas. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se escinden, se hacen a medida, y se vuelven a unir en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los en los plásmidos construidos se pueden usar mezclas de ligadura para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y los transformantes satisfactorios seleccionados por la resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Se preparan los plásmidos de los transformantes, se analizan mediante la digestión de la endonucleasa de restricción, y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

(viii) Vectores de expresión transitoria

Se pueden emplear vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria del ADN que codifica RTD en células de mamíferos. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que sea capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal manera que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a la vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión [Sambrook y col., más arriba]. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como el rastreo rápido de dichos polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención al objeto de identificar las variantes de RTD.

(ix) Vectores de células de vertebrados adecuados a modo de ejemplo

Se describen en Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); documento EP 117.060; y documento EP 117.058 otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de RTD en cultivos celulares recombinantes de vertebrados.

3. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión del ADN en los vectores en el presente documento son las células procariotas, de levaduras, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados a este objeto incluyen, pero no se limitan a eubacterias tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como los Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P dado a conocer en el documento DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Preferiblemente, la célula huésped debería segregar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos.

Además de los procariotas, para la clonación o la expresión en los huéspedes de los vectores que codifican RTD son adecuados microbios eucarióticos tales como hogos o levaduras filamentosas. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadería común, es la más comúnmente usada entre los microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores. Sin embargo, están disponibles y son útiles en el presente documento otros numerosos géneros, especies, y cepas.

Las células huésped adecuadas para la expresión del RTD glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de procesamiento y actividades de glicosilación complejas. En principio, es trabajable cualquier cultivo de células eucarióticas superiores, sea de cultivo de vertebrado o de invertebrado. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y que corresponden a células huésped permisivas de insectos procedentes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori [Véanse, por ejemplo Luckow y col., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller y col., en Genetic Engineering, Setlow y col., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda y col., Nature, 315:92-594 (1985)].Están públicamente disponibles para la transfección una variedad de cepas víricas, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori.

Se pueden utilizar como huéspedes cultivos celulares de las plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, y tabaco. Normalmente, las células de las plantas se transfectan mediante incubación con algunas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Durante la incubación del cultivo de células de la planta con A. tumefaciens se puede transferir el ADN que codifica el RTD a la célula huésped de la planta de tal manera que éste se transfecta, y expresará, en la condiciones apropiadas, el ADN que codifica el RTD. Además, están disponibles las secuencias reguladoras y señal compatibles con las células de las plantas, tales como el promotor de la nopalina sintasa, y las secuencias señal de la poliadenilación [Depicker y col., J Mol.Appl.Gen., 1:561 (1982)]. Además, los segmentos de ADN aislados de la región en la dirección 5' del gen 780 del ADN-T son capaces de activar o aumentar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en el tejido de la planta que contiene el ADN recombinante [documento EP 321.196 publicado el 21 de junio de 1989].

Se conoce bien en la técnica la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) [Véase, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)]. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos son la línea CV de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol.; 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243.251 (1980)); células de riñón de mono (CV I ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; y células FS4.

Las células huésped se transfectan y transforman preferiblemente con los vectores de expresión o de clonación anteriormente descritos para la producción de RTD y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la captura de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de si cualquier secuencia de codificación se expresa o no de hecho. La persona normalmente experta en la técnica conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo CaPO_{4} y electroporación. Se reconoce generalmente una transfección satisfactoria cuando se produce cualquier indicación de la operación de este vector en el interior de la célula huésped.

Transformación significa introducir ADN en un organismo de tal manera que el ADN sea replicable, bien como un elemento cromosómico o como un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se lleva a cabo usando técnicas normalizadas apropiadas en dichas células. Se usa en general el tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, según se describe en Sambrook y col, más arriba, o la electroporación para procariotas u otras células que contengan barreras de pared celular sustanciales. Se usa la infección con Agrobacterium tumefaciens para la transformación de algunas células de plantas, según se describe por Shaw y col., Gene. 23:315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de Junio de 1989. Además, se pueden transfectar plantas usando el tratamiento con ultrasonidos según se describe en el documento WO 91/00358 publicado el 10 de enero de 1991.

Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones en sistemas de células huésped en mamíferos se han descrito en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo normalmente según el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 76:3829 (1979). Sin embargo, se pueden usar también otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección, electroporación, fusión protoplástica bacteriana con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas de transformación en células de mamíferos, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185:27-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336:348-352 (1988).

4. Cultivo de las células huésped

Las células procariotas usadas para producir RTD se pueden cultivar en medios adecuados según se describe generalmente en Sambrook y col., más arriba.

Las células huésped de mamíferos usadas para producir RTD se pueden cultivar en una variedad de medios. Los ejemplos de medios comercialmente disponibles incluyen F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ("MEM", Sigma, RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle Modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Cualquiera de dichos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar); y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se puede incluir también cualquier otro suplemento necesario a las concentraciones apropiadas que conocerían las personas expertas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y similares; son las usadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán aparentes para una persona normalmente experta en la técnica.

En general, se pueden encontrar los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células de mamíferos en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Las células huésped a las que hace referencia esta memoria descriptiva abarcan las células en cultivo así como las células que están en el interior de un animal huésped.

5. Detección de la amplificación/expresión génica

Se puede medir la amplificación y/o la expresión génica en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern o cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:5201-5205 (1980)], transferencia en mancha (análisis del ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Se pueden emplear diversas marcas, más comúnmente radioisótopos, y particularmente ^{32}P. Sin embargo, se pueden emplear también otras técnicas, tales como las que usan nucleótidos modificados con biotina para la introducción en polinucleótidos. A continuación, la biotina sirve como el emplazamiento de unión de la avidina o los anticuerpos, que se pueden marcar con una amplia variedad de marcas, tales como radionucleótidos, sustancias fluorescentes o enzimas. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Se pueden marcar, a la vez, los anticuerpos, y se puede llevar a cabo el ensayo cuando el dúplex se encuentra en una superficie, de tal manera que tras la formación del dúplex sobre la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

Se puede medir, alternativamente, la expresión génica mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo del cultivo celular o los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, normalmente mediante deshidratación y fijación, seguido por reacción con anticuerpos marcados específicos del producto génico acoplado, en el que las marcas son normalmente detectables visualmente, tales como marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, o marcas luminiscentes.

Los anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras de fluidos pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, se pueden preparar los anticuerpos contra una secuencia natural del polipéptido RTD o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento o contra la secuencia exógena fusionada con el ADN de RTD y que codifica un epitopo del anticuerpo específico.

6. Purificación del polipéptido RTD

Las formas de RTD se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de la célula huésped. Si el RTD está unido a membrana, se puede liberar de la membrana usando una disolución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o se puede liberar su región extracelular mediante rotura enzimática. Se puede liberar también el RTD de la superficie celular mediante rotura enzimática de su anclaje glicofosfolipídico a la membrana.

Cuando se produce RTD en otra célula recombinante diferente de una de origen humano, el RTD está libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, se puede desear purificar el RTD de las proteínas o los polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas tal como para RTD. Como primera etapa, el medio o lisado de cultivo se puede centrifugar para eliminar los desechos celulares particulados. Después de lo anterior, RTD se purifica de las proteínas y los polipéptidos solubles contaminantes, siendo los siguientes procedimientos ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en gel de sílice o en resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, columnas de Sephadex G-75 y Sefarosa proteína A para eliminar contaminantes tales como IgG.

Se pueden recuperar variantes de RTD en las que se han eliminado, insertado, o sustituido restos de la misma manera que la secuencia natural de RTD, teniendo en cuenta los cambios en las propiedades ocasionados por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de RTD con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bacteriano o vírico, la secuencia de inmunoglobulina, o la secuencia receptora, puede facilitar la purificación; una columna de inmunoafinidad que contiene el anticuerpo de la secuencia que se va a usar para adsorber el polipéptido de fusión. Se pueden usar también otros tipos de matrices de afinidad.

Puede ser también útil un inhibidor de la proteasa tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes ocasionales. Una persona experta en la técnica apreciará que los procedimientos de purificación adecuados para la secuencia natural de RTD pueden requerir modificaciones para tener en cuenta los cambios en el carácter de RTD o sus variantes tras la expresión en el cultivo celular recombinante.

7. Modificaciones covalentes de los polipéptidos RTD

Se incluyen dentro del alcance de esta invención las modificaciones covalentes. Un tipo de modificación covalente del RTD se introduce en la molécula haciendo reaccionar los restos de aminoácidos dianas del RTD con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o los restos No C terminales del RTD.

La derivatización con agentes funcionales es útil para reticular el RTD en una matriz o superficie soporte insoluble en agua para uso en el procedimiento de purificación de los anticuerpos anti-RTD, y viceversa. La derivatización con uno o más agentes bifuncionales sería también útil para reticular moléculas de RTD para generar dímeros de RTD. Dichos dímeros pueden aumentar la avidez por la unión y extender la semivida de la molécula in vivo. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil-2-feniletanoglutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato dan como resultado intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulados en presencia de luz. Alternativamente, se emplean matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se emplean para la inmovilización de las proteínas.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de restos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes restos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de restos de serilo y treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas secundarias de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C terminal. Las formas modificadas de los restos están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido RTD incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar el modelo natural de glicosilación del polipéptido. "Alterar el modelo natural de glicosilación" se entiende a objeto del presente documento que signifique eliminar uno o más restos de carbohidratos que se encuentran en la secuencia natural de RTD, y/o añadir uno o más emplazamientos de glicosilación que no están presentes en la secuencia natural de RTD.

La glicosilación de los polipéptidos está normalmente tanto unida a N como unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena secundaria de un resto de asparagina. Las secuencias de los tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato con la cadena secundaria de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un emplazamiento potencial de glicosilación. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxilaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque se puede usar también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

Se puede llevar a cabo la adición de emplazamientos de glicosilación al polipéptido RTD alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que ésta contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los emplazamientos de glicosilación unidos a N). Se puede realizar la alteración mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia natural de RTD (para emplazamientos de glicosilación unidos a O). Se puede alterar opcionalmente la secuencia de aminoácidos de RTD mediante cambios a nivel del ADN, particularmente, mediante mutación del ADN que codifica el polipéptido RTD en bases preseleccionadas tales como los codones que se generan que se traducirán en los aminoácidos deseados. Se puede llevar a cabo la(s) mutación(es) del ADN usando los procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.364.934, más arriba.

Otro medio para aumentar el número de restos de carbohidrato en el polipéptido RTD es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos con el polipéptido. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, se puede(n) unir el(los) azúcar(es) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Se describen estos procedimientos en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La eliminación de los restos de carbohidrato presentes en el polipéptido RTD se puede llevar a cabo química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de los codones que codifican los restos de aminoácidos que sirven como dianas para la glicosilación. Por ejemplo, la desglicosilación química exponiendo el polipéptido al compuesto del ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente puede dar como resultado la rotura de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina, dejando a la vez el polipéptido intacto. Se describe la desglicosilación química por Hakimuddin, y col., Arch, Biochem, Biophys., 259:52 (1987) y por Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Se puede conseguir la rotura enzimática de los restos de carbohidrato en los polipéptidos mediante el uso de una variedad de endo y exoglicosidasas tales como las que describen Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Se puede evitar la glicosilación en emplazamientos potenciales de glicosilación mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como describen Duskin y col., J. Biol. Chem., 257:3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de las uniones proteína-N-glicósido.

Otro tipo de modificación covalente de RTD comprende la unión del polipéptido RTD con uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, o polioxialquilenos, en la manera que se muestra en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

8. RTD quimeras

La presente invención proporciona también moléculas quiméricas que comprenden el RTD fusionado con otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos.

En una realización, la molécula quimérica comprende una fusión del RTD con un polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo al cual se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El epitopo etiqueta se sitúa generalmente en el extremo amino o carboxilo del RTD. Se puede detectar la presencia de dichas formas del RTD etiquetado con el epitopo usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. También, con la condición de que el epitopo etiqueta permita purificar fácilmente el RTD mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epitopo etiqueta.

Se conocen bien en la técnica diversos polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen la etiqueta poli his, el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la anterior [Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de la glicoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering, 3 (6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y col., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epitopo KT3 [Martin y col., Science, 255:192-194 (1992)]; y el péptido del epitopo de la tubulina \alpha [Skinner y col., J.Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y el péptido etiqueta de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:6393.6397 (1990)]. Una vez que se ha seleccionado el polipéptido etiqueta, se puede generar un anticuerpo del anterior usando las técnicas que se dan a conocer en el presente documento.

En general el RTD etiquetado con el epitopo se puede construir y producir según los procedimientos descritos anteriormente. Las fusiones RTD-polipéptido etiqueta se construyen preferiblemente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción RTD en el marco con la secuencia de ADN del polipéptido etiqueta y expresando el constructo de la fusión del ADN resultante en las células huésped adecuadas. Ordinariamente, cuando se preparan quimeras del RTD-polipéptido etiqueta de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el RTD se fusionará en su extremo 3' con el ácido nucleico que codifica el término N del polipéptido etiqueta, sin embargo, son también posibles las fusiones 5'. Se puede fusionar, por ejemplo, una secuencia de polihistidina de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 restos de histidina en el término N o el término C y usarse como control de la purificación en la cromatografía de afinidad.

Se puede purificar el RTD etiquetado con el epitopo mediante cromatografía de afinidad usando el anticuerpo anti-etiqueta. La matriz a la cual se une el anticuerpo de afinidad puede incluir, por ejemplo, agarosa, vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinilo)benceno. A continuación se puede eluir el RTD etiquetado con el epitopo desde la columna de afinidad usando las técnicas conocidas en la técnica.

En otra realización, la molécula quimérica comprende un polipéptido RTD fusionado con una secuencia de inmunoglobulina. La molécula quimérica puede comprender también una secuencia de la región concreta de RTD, tal como la secuencia de la región extracelular del RTD natural fusionado con una secuencia de inmunoglobulina. Esto incluye quimeras en formas monomérica, homo o heteromultimérica, y particularmente homo o heterodimérica, o tetramérica; opcionalmente, las quimeras pueden estar en formas diméricas o formas homodiméricas de cadena pesada. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas como las representadas por los siguientes diagramas:

X o A

C_{H} o C_{L}

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X o A

C_{H} o C_{L}

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Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en la que existen IgG, IgD, e IgE. Se repite una unidad de cuatro cadenas en las inmunoglobulinas con mayores pesos moleculares; IgM existe generalmente en forma de un pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, pueden existir también en una forma multimérica en suero. En el caso de los multímeros, cada unidad de cuatro cadenas puede ser igual o diferente.

Los siguientes diagramas representan gráficamente algunas estructuras monomérica, homo y heterodimérica y homo y heteromultímera a modo de ejemplo. Estos diagramas son meramente ilustrativos, y se cree que las cadenas de multímeros están unidas mediante enlaces de disulfuro de la misma manera que las inmunoglobulinas naturales.

monómero:

C_{L} o C_{H}

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homodímero:

C_{L} o C_{H}

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heterodímero:

C_{L} o C_{H}

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Homotetrámero

C_{L} o C_{H}

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heterotetrámero:

C_{L} o C_{H}

y

C_{L} o C_{H}

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En los diagramas anteriores, "A" significa una secuencia de RTD o una secuencia de RTD fusionada con una secuencia heteróloga; X es un agente adicional, que puede ser igual que A o diferente, una porción de un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina tal como una región variable o una región similar a una región variable, que incluye una región variable de la inmunoglobulina natural o quimérica, una toxina tal como la exotoxina o la ricina de Pseudomonas, o una secuencia funcionalmente unida a otra proteína, tal como otras citocinas (es decir, IL-1, interferón-\gamma) o moléculas superficiales celulares (es decir, NGFR, CD40, OX40, antígeno Fas, proteínas T2 de Shope y poxvirus del mixoma), o un agente terapéutico del polipéptido no asociado normalmente de otra manera con una región constante; Y es un ligante u otra secuencia receptora; y V_{L}, V_{H}, C_{L} y C_{H} representan las regiones variables o constantes de cadena ligera o pesad de una inmunoglobulina. Se incluyen específicamente las estructuras que comprenden al menos una CRD de una secuencia de RTD como "A" y otra proteína superficial celular que tenga un modelo repetitivo de las CRD (tal como TNFR) como "X".

Deberá entenderse que los anteriores diagramas son meramente a modo de ejemplo de las posibles estructuras de las quimeras de la presente invención y no abarcan todas las posibilidades. Por ejemplo, pueden ser deseables diversos "A", "X", o "Y" diferentes en cualquiera de estos constructos. También, las regiones constantes de cadena pesada o ligera se pueden originar de inmunoglobulinas iguales o diferentes. Todas las posibles permutaciones de las estructuras ilustradas y similares están comprendidas dentro del alcance de la invención en el presente documento.

En general, se pueden construir las moléculas quiméricas de una manera similar a los anticuerpos quiméricos en los que la región variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por la región variable de otra especie. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 125 023; EP 173,494; Munro, Nature, 312:597 (13 de Diciembre de 1984); Neuberger y col., Nature, 312:604-608 (13 de Diciembre de 1984); Sharon y col., Nature, 309:364.367 (24 de Mayo de 1984); Morrison col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 81:6851-6855 (1984); Morrison y col., Science, 229:1202-1207 (1985); Boulianne y col., Nature, 312:643-646 (13 de Diciembre de 1984); Capon y col., Nature, 337:525-531 (1989); Traunecker y col., Nature, 339:68-70 (1989).

Alternativamente, se pueden construir las moléculas quiméricas como sigue. El ADN que incluye una región que codifica la secuencia deseada, tal como una secuencia de RTD y/o TNFR, se rompe mediante un enzima de restricción en o próximo al extremo 3' del ADN que codifica la(s) región(es) similar(es) a la inmunoglobulina y en un punto en o próximo al ADN que codifica el extremo N terminal del polipéptido RTD o el TNFR (cuando se contempla usar un líder diferente) o en o próximo a la región de codificación N terminal del TNFR (cuando se emplea la señal natural). A continuación, éste fragmento de ADN se inserta fácilmente próximo al ADN que codifica una región constante de cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina y, si es necesario, se hace a medida el constructo resultante mediante mutagénesis delecional. Preferiblemente, la Ig es una inmunoglobulina humana cuando se pretende que la molécula quimérica para terapia in vivo de seres humanos. Se conoce el ADN que codifica las regiones constantes de cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina o está fácilmente disponible a partir de bibliotecas de ADN o se sintetiza. Véanse por ejemplo, Adams y col., Biochemistry, 19:2711-2719 (1980); Gough y col., Biochemistry, 19:2702-2710 (1980); Dolby y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:6027-6031 (1980); Rice y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 79:7862-7865 (1982); Falkner y col., Nature, 298:286-288 (1982); y Morrison y col., Ann. Rev. Immunol., 2:239-256 (1984).

Se encuentran detalles adicionales sobre cómo preparar dichas fusiones en publicaciones que se refieren a la preparación de inmunoadhesinas. Las inmunoadhesinas en general, y las moléculas de fusión CD4-Ig específicamente, se dan a conocer en el documento WO 89/02922, publicado el 6 de Abril de 1989). Se conocen en la técnica moléculas que comprenden la porción extracelular de CD4, el receptor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), unidas a la región constante de cadena pesada de IgG y se ha encontrado que tienen una semivida marcadamente más larga y un aclaramiento inferior al de la porción extracelular soluble de CD4 [Capon y col., supra; Byrn y col., Nature, 344:667 (1990)]. Se describe también en Ashkenazi y col. Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991); Lesslauer y col. [J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 115 (P 432)]; y Peppel y Beutler, J. Cell, Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 118 (P 439)] la construcción de moléculas TNFR-IgG quiméricas específicas.

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B. Usos terapéuticos y no terapéuticos de RTD

RTD, según se da a conocer en la presente memoria descriptiva, se puede emplear terapéuticamente para modular la apoptosis y o la activación de NF-\kappaB por Apo-2L o por otro ligando que se una a RTD en células de mamíferos. Se puede llevar a cabo esta terapia usando, por ejemplo, técnicas de terapia génica in vivo o ex vivo. Se pueden emplear también moléculas quiméricas de RTD (incluyendo las moléculas quiméricas que contienen una secuencia de la región extracelular de RTD) que comprenden secuencias de inmunoglobulina para inhibir las actividades de Apo-2L, por ejemplo, la apoptosis o la inducción de NF-\kappaB o la actividad de otro ligando que se una a RTD.

Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y col. Normalmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para volver la formulación isotónica. Los ejemplos del vehículo incluyen tampones tales como disolución salina, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. El pH de la disolución está preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, y más preferiblemente entre aproximadamente 7,4 y aproximadamente 7,8. Será evidente para las personas expertas en la técnica que pueden ser más preferibles algunos vehículos dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración.

Se puede llevar a cabo la administración a un mamífero mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal subcutánea, intramuscular) o mediante otros procedimientos tales como infusión que asegura la dosificación en el torrente sanguíneo en una forma efectiva. Se pueden determinar empíricamente las dosificaciones efectivas y los calendarios de administración, y llevar a cabo dichas determinaciones está dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica.

Se contempla que se puedan administrar otras terapias adicionales al mamífero, y las mencionadas incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia y terapia de radiación, inmunoadyuvantes, citocinas, y terapias basadas en anticuerpos. Los ejemplos incluyen interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6), factor inhibidor de la leucemia, interferones, TGF-beta, eritropoyetina, trombopoyetina, y anticuerpo HER-2. Se pueden emplear también otros agentes, y dichos agentes incluyen TNF-\alpha, TNF-\beta (linfotoxina-\alpha), ligando CD30, ligando 4-IBB, y ligando Apo-I.

Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o fármacos que se conocen en la técnica y están comercialmente disponibles, tales como Doxorubicina, 5-Fluorouracilo, Citosina arabinosido ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatino, Melfalan, Vinblastina y Carboplatino. Se pueden usar la preparación y los calendarios de dosificación de dicha quimioterapia según las instrucciones del fabricante o determinarse empíricamente por el médico experto. Se describen también la preparación y los calendarios de dosificación en el Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). La quimioterapia se administra preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como los descritos anteriormente.

El RTD de la invención tiene también utilidad en aplicaciones no terapéuticas Se pueden usar las secuencias de ácido nucleico que codifican el RTD como diagnóstico para la tipificación específica del tejido. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos de hibridación in situ del mismo tipo, transferencia Northern y Southern, y el análisis de la PCR para determinar si el ADN y/o el ARN que codifica el RTD está presente en el(los) tipo(s) celular(es) que se está(n) evaluando. El ácido nucleico de RTD será útil también para la preparación del RTD mediante las técnicas recombinantes descritas en el presente documento.

Se puede usar el RTD aislado en ensayos de diagnóstico cuantitativos como control frente al cual se pueden preparar muestras que contengan cantidades desconocidas de RTD. Las preparaciones de RTD son útiles también en la generación de anticuerpo, así como en ensayos normalizados de RTD (por ejemplo, marcando el RTD para uso como patrón en radioinmunoensayos, ensayo de radioreceptores, o inmunoensayo unido a enzimas), en técnicas de purificación por afinidad, y en ensayos de unión al receptor de tipo competitivo cuando se marca con, por ejemplo, radioyodo, enzimas, o fluoróforos.

Se pueden emplear las formas naturales aisladas de RTD, según se describen en los Ejemplos, para identificar formas alternativas de RTD, por ejemplo, formas que posean la(s) región(es) citoplásmica(s) que puedan estar implicadas en la ruta(s) de señalización. Se pueden usar formas modificadas del RTD, tales como las moléculas quiméricas RTD-IgG (inmunoadhesinas) descritas anteriormente, como inmunógenos en la producción de anticuerpos anti-RTD.

Se pueden usar también los ácidos nucleicos que codifican RTD o sus formas modificadas para generar tanto animales transgénicos como animales "genomanipulados" que, a la vez, son útiles en el desarrollo y la selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, cuyo transgén se introduce en el animal o en un antepasado del animal en una etapa prenatal, por ejemplo una embriónica. Un transgén es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, se puede usar el ADNc que codifica RTD o una secuencia apropiada del mismo (tal como RTD-IgG) para clonar el ADN genómico que codifica RTD según con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica RTD. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, han llegado a ser convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.736.866 y 4.870.009. Normalmente, se podría hacer diana en células concretas para la incorporación del transgén de RTD con potenciadores específicos de tejido. Se pueden usar animales transgénicos que incluyan una copia de un transgén que codifica el RTD introducido en la línea germinal del animal en una etapa embriónica para examinar el efecto de la expresión creciente del ADN que codifica RTD. Se piensa que se pueden usar dichos animales como animales de muestra para los reactivos para conferir protección de, por ejemplo, dolencias patológicas asociadas con apoptosis excesiva. En dichos experimentos, se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la dolencia patológica, en comparación con los animales no tratados que soportan el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial de la dolencia patológica. Se podrían construir animales transgénicos que transportaran un forma soluble de RTD tal como la ECD de RTD o una quimera de inmunoglobulina de dicha forma para ensayar el efecto de la neutralización crónica de Apo-2L, un ligando de RTD.

Alternativamente, se pueden usar homólogos no humanos de RTD para construir un animal RTD "genomanipulado" que tenga un gen defectivo o alterado que codifique RTD como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica RTD y el ADN genómico alterado que codifica el RTD introducido en una célula embriónica del animal. Se puede usar, por ejemplo, el ADNc que codifica RTD para clonar el ADN genómico que codifica RTD según las técnicas establecidas. Se puede eliminar o sustituir una porción del ADN genómico que codifica RTD con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede usar para vigilar la integración. Normalmente se incluyen en el vector diversas kilobases del ADN de flanqueo no alterado (en los extremos 5' y 3') [véase por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homóloga). El vector se introduce en una línea celular troncal embriónica (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que se el ADN introducido se ha recombinado de manera homóloga con el ADN endógeno [véase por ejemplo., Li y col., Cell, 69:915 (1992)]. A continuación se inyectan las células seleccionadas en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar las quimeras de agregación [véase por ejemplo., Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 1113.152]. A continuación se puede implantar un embrión quimérico en un animal de acogida hembra seudoembarazado y se lleva a término el embrión para crear un animal "genomanipulado". Se puede identificar la progenie que hospeda el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales mediante las técnicas normalizadas y usadas en variedades de animales en las que todas las células del animal contienen ADN recombinado homólogamente. Se pueden caracterizar los animales genomanipulados por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra algunas dolencias patológicas y por su desarrollo de dolencias patológicas debido a la ausencia del polipéptido RTD, incluyendo por ejemplo, el desarrollo de tumores.

C. Preparación del anticuerpo anti-RTD

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-RTD. Se pueden preparar anticuerpos contra RTD como sigue. Los anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos RTD pueden comprender anticuerpos policlonales. Los técnicos expertos conocen los procedimientos de preparación de los anticuerpos policlonales. Se pueden acrecentar los anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido RTD o una proteína de fusión del mismo. Un ejemplo de agente inmunizante adecuado es la proteína de fusión RTD-IgG o la molécula quimérica (que incluye una proteína de fusión de la ECD DE RTD-IgG). Se pueden emplear también células que expresan RTD en su superficie. Esto puede ser útil para conjugar el agente inmunizante de una proteína conocida por ser inmunógeno en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a la hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de la tripsina de soja. Se puede emplear también un agente de agregación tal como alum para potenciar la respuesta inmune del mamífero. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen el adyuvante de Freund completo y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintética). Una persona experta en la técnica puede seleccionar el protocolo de inmunización sin experimentación indebida. A continuación se puede sangrar el mamífero, y se puede evaluar el suero para el título del anticuerpo. Si se desea, se puede estimular al mamífero hasta que el título del anticuerpo aumenta o se estabiliza.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos RTD pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando los procedimientos del hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, más arriba. En tal procedimiento del hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado, se inmuniza normalmente (según se describe anteriormente) con un agente inmunizante para estimular los linfocitos a que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente con el agente inmunizante. Alternativamente, se pueden inmunizar los linfocitos in vitro.

El agente inmunizante incluirá normalmente el polipéptido RTD o una proteína de fusión del mismo. Un ejemplo de un agente inmunizante adecuado es una proteína de fusión RTD-IgG o la molécula quimérica. Se pueden emplear también células que expresan RTD en su superficie. Generalmente, se usan bien linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desea que las células sean de origen humano, o bien se usan células de bazo o células de los nódulos linfáticos si se desea que las fuentes sean de mamíferos no humanos. A continuación los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada que usa un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son células de mamíferos normalmente transformadas, particularmente células de mieloma de de origen roedor, bovino y humano. Normalmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Se pueden cultivar las células de hibridoma en un medio de cultivo adecuado que contenga preferiblemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para el hibridoma incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT") cuyas sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquella que se fusionan eficazmente, soportan de manera estable un elevado nivel de expresión del anticuerpo mediante células seleccionadas que producen el anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:300 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-63].

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se puede evaluar a continuación para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra RTD. Preferiblemente, se determina la especificidad de la unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA), o un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Se conocen en la técnica dichas técnica y ensayos. Se puede determinar, por ejemplo, la afinidad por la unión del anticuerpo monoclonal mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después que se identifican las células del hibridoma deseadas, se pueden subclonar los clones limitando los procedimientos de dilución y haciéndolos crecer mediante procedimientos normalizados [Gooding, más arriba]. Los medios adecuados a este objeto incluyen, por ejemplo, el Medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, se pueden hacer crecer las células del hibridoma in vivo como ascites en un mamífero.

Se pueden aislar los anticuerpos monoclonales segregados por lo subclones o purificarse a partir del medio de cultivo o fluido de ascites mediante los procedimiento convencionales de purificación de la inmunoglobulina tales como, por ejemplo, Sefarosa-proteína A, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Se pueden preparar también los anticuerpos monoclonales mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567. Se puede aislar fácilmente el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención y secuenciarse usando los procedimientos convencionales (usando, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de murino). Las células del hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión, que se transfectan a continuación en las células huésped tales como las células COS de simios, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que no producen de otra manera la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Se puede modificar también el ADN, sustituyendo, por ejemplo, la secuencia de codificación de las regiones constantes de la cadena pesada y la ligera en lugar de las secuencias homólogas de murino [patente de los Estados Unidos Nº 4.816,567; Morrison y col., más arriba] o mediante enlace covalente de toda la secuencia de codificación de la inmunoglobulina o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido no inmunoglobulina. Se puede sustituir dicho polipéptido no inmunoglobulina para las regiones constantes de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes. Un procedimiento implica, por ejemplo, la expresión recombinante de la cadena ligera y de la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc con el fin de evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, se sustituyen los restos de cisteína relevantes con otro resto de aminoácido o se eliminan con el fin de evitar la reticulación.

Son también adecuados procedimientos in vitro para preparar anticuerpos monovalentes. Se puede llevar a cabo la digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, los fragmentos Fab, usando técnicas rutinarias conocidas en la técnica. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, la digestión, usando papaína. Se describen ejemplos de digestión con papaína en el documento WO 94/29348 publicado el 22/12/94 y la Patente de los Estados Unidos Nº 4.342.566. La digestión de anticuerpos con papaína produce normalmente dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un emplazamiento de unión a antígeno único, y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos emplazamientos que combinan con el antígeno, y es capaz todavía de la reticulación del antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo contienen también las regiones constantes de la cadena ligera y la primera región constante (CH_{1}) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el término carboxilo de la región de la cadena pesada CH_{1} que incluyen una o más cisteínas procedentes de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación de Fab' en el presente documento en la que el(los) resto(s) de cisteína de las regiones constantes soportan un grupo tiol libre. Se produjeron originalmente fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} como parejas de fragmentos Fab' que tienen las cisteínas bisagra entre ellas. Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

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3. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos RTD de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígenos de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpos del receptor) en las que los restos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpos del donante) tal como de ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los restos del marco de trabajo Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también restos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la CDR importada o las secuencias del marco de trabajo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todas de al menos una, y normalmente dos, regiones variables, en las que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature. 332:323.329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)].

Se conocen bien en la técnica los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en éste desde una fuente que es no humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo como restos "importados", que se capturan normalmente de una región variable "importada". Se puede llevar a cabo la humanización esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323.327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 232:1534-1536 (1988)], sustituyendo las CDR o las secuencias de CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Según esto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos Nº 4.816.567), en la que se ha sustituido sustancialmente menos de una región variable humana intacta por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos CDR y posiblemente algunos restos FR se sustituyen por restos de emplazamientos análogos en los anticuerpos de roedor.

La elección de ambas regiones variables humanas, la ligera y la pesada que se va a usar en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante con el fin de reducir la antigenia Según el procedimiento de "ajuste óptimo", se rastrea la secuencia de la región variable de un anticuerpo de roedor frente a la biblioteca completa de secuencia conocidas de la región variable humana. A continuación se acepta la secuencia humana más cercana a la del roedor como marco de trabajo humano (FR) del anticuerpo humanizado [Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol Biol., 196:901 (1987)]. Otro procedimiento usa un marco de trabajo particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. Se puede usar el mismo marco de trabajo para diversos anticuerpos humanizados diferentes [Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)].

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de la elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir esta meta, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizada. Están disponibles modelos tridimensionales de la inmunoglobulina y son familiares para las personas expertas en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de esta muestra permite el análisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar restos FR y combinarse a partir de la secuencia consenso y la importada de tal manera que se consigue la característica deseada del anticuerpo tal como una afinidad creciente por el(los) antígeno(s) diana. En general, los restos de la CDR son directamente y los más sustancialmente implicados en influenciar la unión del antígeno [véase, documento WO 94/04679 publicado el 3 de Marzo de 1994].

Se pueden emplear animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Se ha descrito, por ejemplo, que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratón de línea germinal mutante y quimérica da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transmisión de la matriz del gen de la línea germinal humana en dicho ratón con línea germinal mutante dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el estímulo del antígeno [véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc, Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:2551-255 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993)]. Se pueden producir anticuerpos humanos en bibliotecas de presentación de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Están también disponibles las técnicas de Coles y col. y Boerner y col. para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. immunol., 147 (1):86-95 (1991)].

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4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos diferentes antígenos. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el RTD, la otra es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína o receptor superficial celular de la subunidad receptora.

Se conocen en la técnica los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la expresión simultánea de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la mezcla aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen a menudo una mezcla potencial de diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se lleva a cabo normalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento WO 93/08820, publicado el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Según una solución diferente y más preferida, las regiones variables del anticuerpo con especificidades de unión deseadas (emplazamientos que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de la región constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contenga el emplazamiento necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan simultáneamente en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en las realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible, insertar las secuencias de codificación de dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las relaciones no son de particular significación. En una realización preferida de esta solución, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una inmunoglobulina híbrida, la pareja de cadena pesada/cadena ligera (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones no deseadas de la cadena de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente la mitad de la molécula biespecífica proporciona un medio fácil de separación. Se da a conocer esta solución en el documento WO 94/04690 publicado el 3 de Marzo de 1994. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se han propuesto dichos anticuerpos, por ejemplo, como células diana del sistema inmune para células no deseadas [Patente de los Estados Unidos nº 4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [Documentos WO 91/00360; WO 92/2003-73; BP 03089]. Se contempla que se puedan preparar los anticuerpos in vitro usando los procedimientos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes reticulantes. Se pueden construir, por ejemplo, inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados a este objeto incluyen Iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los que se dan a conocer, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.676.980.

D. Usos terapéuticos y no terapéuticos de los anticuerpos RTD

Los anticuerpos RTD de la invención tienen utilidad terapéutica. Se pueden usar, por ejemplo, anticuerpos antagonísticos para sensibilizar células a la apoptosis inducida por el ligando Apo-2.

Se pueden usar además anticuerpos RTD en ensayos diagnósticos de RTD, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Se pueden usar diversas técnicas de ensayo diagnóstico conocidas en la técnica, tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos sándwich directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación llevados a cabo en fases tanto heterogéneas como homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Se pueden marcar los anticuerpos usados en los ensayos diagnósticos con un resto detectable. El resto detectable debería ser capaz de producir tanto directa como indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con el resto detectable, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter y col., Nature. 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol, Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos RTD son útiles también para la purificación por afinidad del RTD procedente del cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este procedimiento, los anticuerpos contra RTD se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. A continuación se pone en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra que contiene el RTD que se va a purificar, y después de eso se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el RTD, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado que liberará el RTD del anticuerpo.

Se ofrecen los siguientes ejemplos únicamente a efectos ilustrativos, y no se pretende que limiten de ninguna manera el alcance de la presente invención.

Todas las referencias de patentes y la bibliografía citada en la presente memoria se incorporan por la presente por referencia en su totalidad.

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Ejemplos

Todas las enzimas de restricción a las que se hace referencia en los ejemplos se adquirieron de New England Biolabs y se usaron según las instrucciones del fabricante. Todos los reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante a no ser que se indique otra cosa. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria descriptiva, pos sus números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

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Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc Que codifican el RTD humano

Se usó una sonda sintética basada en la secuencia que codificaba la ECD de DcR1 [Sheridan y col., más arriba] y que tenía la siguiente secuencia: CATAAAAGTTCCTGCACCATGACCAGAGACACAGTGTGTCAGTGTAAAGA
(SEC DE ID Nº:3) para rastrear una biblioteca de ADNc de pulmón fetal humano. Para preparar la biblioteca de ADNc, se aisló el ARNm de tejido de pulmón fetal humano usando los reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). Se usó este ARN para generar una biblioteca de ADNc cebado con oligo dT en el vector pRK5D usando los reactivos y protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System): En este procedimiento, se dimensionó el ADNc de doble cadena para que fuera mayor de 1000 pb y el ADNc unido a SaII/NotI se clonó en el vector escindido XhoI/NotI, pRK5D es un vector de clonación que tiene un emplazamiento sp6 de iniciación de la transcripción seguido por un emplazamiento Sfil del enzima de restricción anterior a los emplazamientos XhoI/NotI de clonación del ADN.

Se identificaron dos clones de longitud completa (ADN35663 y ADN35664) que contenían un marco de lectura abierto único con un emplazamiento de iniciación traduccional aparente en los nucleótidos de las posiciones 157-159 [Kozak y col., más arriba] y finalizando en el codón de detención que se encuentra en los nucleótidos de las posiciones 1315-1317 (Fig. 1A; SEC DE ID Nº:2), existe una única base de diferencia entre los dos clones en la posición 1085 del nucleótido (tanto C como T), dando como resultado un codón de serina (TCG) (clon ADN35663) o un codón de leucina (TTG) (clon ADN35664) en el aminoácido de la posición 310 (Fig. 1A). Estos clones se denominaron como pRKS-35663 y pRKS-35664 y se depositaron con los números de la ATCC 209201 y 209202, respectivamente.

El precursor predicho del polipéptido tiene 386 aminoácidos de longitud y tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 41,8 kDA, El análisis de la secuencia indicó un péptido señal N terminal (aminoácidos 1-55), seguido por una ECD (aminoácidos 56-212), la región transmembrana (aminoácidos 213-232) y la región intracelular (aminoácido 233-386). (Figura 1A). El emplazamiento de rotura del péptido señal se confirmó mediante secuenciación de la proteína N terminal de una inmunoadhesina de la ECD de RTD (no se muestra). Esta estructura sugiere que RTD es una proteína transmembrana de tipo I. RTD contiene 3 emplazamientos de glicosilación unidos a N potenciales, en los aminoácidos en las posiciones 127, 171 y 182. (Fig. 1A). Los polipéptidos RTD se obtuvieron o son obtenibles mediante la expresión del polipéptido codificado por el inserto de ADNc de los vectores depositados como ATCC 209201 o ATCC 209202.

Las proteínas de la familia del receptor TNF se caracterizan normalmente por la presencia de múltiples regiones ricas en cisteína (usualmente cuatro) en sus regiones extracelulares teniendo cada región rica en cisteína aproximadamente 45 aminoácidos de longitud y conteniendo aproximadamente 6 restos de cisteína regularmente espaciados. Basándose en la estructura cristalina del receptor TNF de tipo 1, las cisteínas en cada región forman normalmente tres enlaces disulfuro en los que las cisteínas 1 y 2, 3 y 5, y 4 y 6 se emparejan conjuntamente de manera usual. Los RTD de tipo DR4, DR5, y DcR1, contienen dos pseudorrepeticiones extracelulares ricas en cisteína (Fig. 1D), mientras que otros miembros identificados de la familia TNFR de mamíferos contienen tres o más de dichas regiones [Smith y col., Cell, 76:959 (1994)].

Basándose en el análisis de la alineación de la secuencia ECD que se muestra en la Figura 1B (SEC DE ID Nº: 1), RTD muestra más identidad de la secuencia con la ECD de DR4 (55%), DR5 (56%), o DcR1 (67%) que los otros receptores unidos a la apoptosis, tales como TNFR1 (26%), FAS/Apo-1 (27%) o DR3 (19%). La secuencia intracelular predicha de RTD muestra también más homología con la región correspondiente de DR4 (64%) o DR5 (49%) en comparación con TNFR1 (18%), Fas (14%) o DR3 (10%). (Fig. 1C). La región intracelular de RTD tiene aproximadamente 50 restos más cortos que las regiones intracelulares identificadas para DR4 o DR5. Se cree actualmente que RTD puede contener una región truncada de muerte (aminoácidos 340-364; Fig. 1D), que corresponde a la porción carboxi terminal de las secuencias de la región de muerte de DR4 y DR5. Cinco de seis aminoácidos que son esenciales para la señalización por TNFR1 [Tartaglia y col., más arriba] y que se conservan o semiconservan en DR4 y DR5, están ausentes en RTD. (Figura 1C).

Ejemplo 2 A. Expresión de la ECD de RTD como una inmunoadhesina

Se construyó una inmunoadhesina de la ECD de RTD fusionando una secuencia de ADNc que codificaba la región extracelular de RTD (aminoácidos 1-212; véase la Fig. 1A) par un ADNc que codificaba las regiones bisagra CH2 y CH3 de la IgG1 humana, según se describe en Ashkenazi y col, más arriba. Se construyeron de manera similar las inmunoadhesinas basadas en la región extracelular de DR5 [Sheridan y col., más arriba; Pan y col., más arriba]. Las inmunoadhesinas se expresaron como proteínas recombinantes transfectando células Sf9 (ATCC CRL 1711) y purificándola mediante cromatografía de afinidad de la proteína A.

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B. Ensayo que demuestra la inmunoprecipitación Interacción de unión entre la ECD de RTD y el ligando Apo-2

Se incubaron las inmunoadhesinas de RTD, DR5 o TNFR1 (2,5 \mug) con el ligando Apo-2 soluble marcado con ^{125}I [Pitti y col., más arriba] (1 ng, actividad específica 10,7 \muCi/\mug) en ausencia o presencia de 1 \mug de ligando Apo-2 no marcado durante 1 hora a temperatura ambiente. Se precipitaron los complejos mediante sefarosa proteína A, y se resolvieron mediante electroforesis en un gradiente de 4-20% en gel de SDS poliacrilamida (Novex) en condiciones de reducción. Se secó el gel y se sometió a análisis automatizado de imágenes mediante phosphorimager en un sistema BAS2000 (Fuji).

En la Figura 2A se muestran los resultados. Las inmunoadhesinas RTD y DR5, pero no la inmunoadhesina TNFR1, precipitaron simultáneamente el ligando Apo-2 marcado. Esta precipitación simultánea se bloqueó mediante ligando Apo-2 no marcado en exceso. Se analizó además la interacción de unión en un equipo BIACORE^{TM}. El análisis BIACORE^{TM} demostró que la inmunoadhesina RTD se unió al ligando Apo-2, pero no a otros miembros de la familia que inducen la apoptosis, concretamente, TNF-alfa, linfotoxina-alfa o ligando Fas (no se muestran los datos). Estos resultados demuestran que la región extracelular de RTD se une específicamente al ligando Apo-2, apoyando la opinión de que RTD es un receptor del ligando Apo-2.

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Ejemplo 3 Inhibición de la función del ligando Apo-2 por la ECD de RTD

Se incubaron células HeLa S3 (ATCC CCL 2.2) con tampón PBS o ligando Apo-2 (Pitti y col., más arriba; 125 ng/ml) en presencia de las inmunoadhesinas RTD o TNFR1 (descritas en el Ejemplo 2 anterior; 10 \mug/ml) durante 5 horas, y se analizaron para la apoptosis mediante la unión de anexina V según se describe en Marsters y col., más arriba. Los datos, que se muestran en la Figura 2B, son los promedios \pm SE de la determinaciones por triplicado.

La inmunoadhesina RTD, pero no la inmunoadhesina TNFR1, bloqueó la capacidad del ligando Apo-2 de inducir la apoptosis en las células HeLa (Figura 2B), soportando además la capacidad de la ECD de RTD de unirse al aligando Apo-2, y demostrando que la inmunoadhesina RTD es capaz de neutralizar el ligando Apo-2.

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Ejemplo 4 Inhibición de la función del ligando Apo-2 por el RTD De longitud completa

Debido a que las regiones de muerte pueden funcionar como interfaces de oligomerización, la sobreexpresión de los receptores que contienen dichas regiones puede conducir a la activación de la señalización en ausencia del ligando [véase, Nagata, Cell, 88:355-365 (1997)]. Se ha informado que la sobreexpresión de DR4 o DR5 puede conducir a la activación de la apoptosis y de NF-\kappaB [Sheridan y col., más arriba; Pan y col., más arriba]. Para investigar si RTD puede activar la apoptosis, se transfectaron simultáneamente células HeLa S3 con un plásmido de expresión basado en pRK5 que codifica el RTD de longitud completa, junto con un plásmido que codifica el CD4 humano como marcador para la transfección.

Se transfectaron células HeLa S3 humanas (1 x 10^{6} por ensayo) mediante electroporación con pRK5 [Schall y col., Cell, 61:361-370 (1990); Suva, Science, 237:893-896 (1987)], o con plásmidos basados en pRK5 que codifican RTD (clon ADN35663 o clon ADN35664), DR4 o DR5 (16 \mug), junto con pRK5 que codifica CD4 (4 \mug) como marcador de la transfección. Se evaluó el nivel de apoptosis en las células que expresaban CD4 24 horas más tarde, mediante el análisis FACS de unión a la anexina V, según se describe en Marsters y col., más arriba.

Según se muestra en la Figura 3A (los datos representados son promedios \pm SE de las determinaciones por triplicado), las células transfectadas con RTD no mostraron diferencias en el nivel de la apoptosis en comparación con las células transfectadas con pRK5 (control), mientras que las células transfectadas mediante DR4 o DR5 mostraron un aumento marcado en la apoptosis.

En otro experimento, se transfectaron células 293 humanas (ATCC CRL 1573) (5 x 10^{6} por ensayo) en placas de 10n cm mediante precipitación con fosfato de calcio con plásmidos pRK5 o basados en pRK5 que codificaban RTD (clon ADN35663 o clon ADN35664) o DR5 (20 \mug). Se analizaron las células 24 horas más tarde para la activación de NF-\kappaB mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética, según se describe por Marsters y col., más arriba. Los resultados, que se muestran en la Figura 3B, revelan que la transfección de las células 293 mediante RTD no produjo un aumento en la actividad de NF-\kappaB, mientras que la transfección mediante DR5 produjo la activación de NF-\kappaB. de esta manera, a diferencia de DR4 y DR5, RTD no parece señalar la apoptosis o la activación de NF-\kappaB tras la sobre expresión. Esto sugiere que la región truncada de muerte de RTD no es capaz de desencadenar dichas respuestas.

En otro experimento, se transfectaron células 293 (1 x 10^{6}) en placas de 6 cm mediante plásmidos pRK5 o basados en pPK5 que codificaban RTD (clon ADN35663 o clon ADN35664) (4 \mug), junto con en pRK5 que codificaba la proteína fluorescente verde (GFP; disponible de Clontech) (1 \mug). Se trataron las células 24 horas más tarde con el ligando Apo-2 (Pitti y col., más arriba; 0.5 \mug/ml), teñidas con colorante Hoescht 33342 (10 \mug/ml) y se puntuaron las células doble positivas para la morfología apoptótica en un microscopio de fluorescencia (Leica) equipado con óptica Hoffman.

Se ilustran en la Figura 3C los resultados, que se muestran como promedios \pm SE de las determinaciones por triplicado. Las células transfectadas mediante cualquiera de uno de los clones de ADNc de RTD fueron significativamente menos sensibles a la apoptosis inducida por el ligando Apo-2. Se obtuvieron resultados similares con las células HeLa (no se muestran los datos). Estos resultados sugieren que RTD no señala la muerte celular y demuestran que RTD puede inhibir la función del ligando Apo-2 cuando se expresa a niveles elevados.

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Ejemplo 5 Análisis de transferencia northern

Se examinó la expresión del ARNm de RTD en tejidos humanos mediante análisis de transferencia Northern. Las manchas de ARN humano se hibridaron con una sonda de ADN marcada con ^{32}P de 200 pb basada en la región 3' no traducida del RTD Se generó la sonda mediante la PCR con los siguientes cebadores de oligonucleótidos CTT
CAGGAAACCAGAGCTTCCCTC (SEC DE ID Nº:4); TTCTCCCGTTTGCTTATCACACGC (SEC DE ID Nº:5). Se usaron como controles sondas específicas para la beta actina. Se incubaron MTN (Clontech) de la mancha del ARN fetal humano y MTN-It (Clontech) de la mancha del ARN de adulto humano con las sondas de ADN. Se incubaron las manchas con las sondas en tampón de hibridación (5X SSPE; 2X disolución de Denhardt; 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón separado desnaturalizado; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 60 horas a 42ºC. Se lavaron las manchas varias veces en 2X SSC; SDS al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por un lavado de 30 minutos en 0,1X SSC; SDS al 0,1% a 50ºC. Se desarrollaron las manchas tras exposición durante la noche mediante el análisis automático de imágenes mediante phosphorimager (Fuji).

Según se muestra en la Fig. 4, se detectó un único transcripto del ARNm de RTD de aproximadamente 4 kb. Se expresó este transcripto en riñón, hígado y pulmón fetal, y en múltiples tejidos de adultos, concretamente en testículo y riñón. Este modelo de expresión del ARNm difiere del de DR4, DR5 y DcR1. DR4 y DcR1 son particularmente abundantes en leucocitos de sangre periférica y bazo, y DR5 es más abundante en ovario, hígado y pulmón.

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Ejemplo 6 Localización cromosómica de los genes RTD, DR5, DR4 y DcR1

Se examinó la localización cromosómica de estos genes humanos mediante el análisis del panel de híbridos de radiación (RH). Se llevó a cabo el mapeado RH mediante la PCR usando el panel de híbridos de radiación de células humanas-ratón (Research Genetics) y los cebadores basados en la región de codificación del ADNc de DR5 [Gelb y col., Hum, Genet., 98:141 (1996)]. El análisis de os datos de la PCR usando la Base de Datos del Stanford Human Genome Center y del Whitehead Institute for Biomedical Research/MIT Center for Genome Research indicó que DR5 se unió al marcador D8S481, con un LOD de 11,05; D8S481 se unió a la vez a D8S2055, que mapea el cromosoma humano 8p21. Un análisis similar de DR4 mostró que DR4 se unió al marcador D8S2127 (con un LOD de 13,00), que también mapea el cromosoma humano 8p21. El análisis de DcR1 usando el examen del panel de híbridos de radiación mostró que el gen DcR1 se unió al marcador WI-6536, que a su vez se unió a D8S298, que también mapea el cromosoma 8p21 y se anidó entre D8S2005 y D8S2127.

Usando un cebador basado en la región 3' no traducida del ADNc de RTD, un análisis reveló que RTD se unió al marcador SHGC-33989 (LOD de 7,2). El marcador SHGC-33989 se unió a D852055, que mapea el cromosoma humano 8p21. De esta manera, todos los genes humanos RTD, DR5, DcR1 y DR4, mapean el cromosoma 8p21.

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Depósito de material

Se han depositado los siguientes materiales con la American Type Culture Collection. 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, EE.UU. (ATCC):

1

Este depósito se realizó bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y la Normativa relacionada (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. La ATCC hará el depósito disponible bajo los términos del Tratado de Budapest, sujeto al acuerdo entre Genentech Inc, y la ATCC, lo que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la emisión de la patente de los Estados Unidos pertinente o tras la presentación libre al público de cualquier documento o solicitud de patente de los Estados Unidos o extranjera, la que que se produzca primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a aquel cuya titularidad sea determinada por el Comisario de Patentes y Marcas de Estados Unidos según la regulación 35 USC.122 y los protocolos del Comisionado de acuerdo con lo anterior (incluyendo la regulación 37 CFR.1.14 con referencia particular a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha convenido que si un cultivo de los materiales en depósito debiera eliminarse o se perdiera o destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales se sustituirán con prontitud con otros del mismo. No se debe instituir la disponibilidad del material depositado como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados por la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.

La anterior memoria descriptiva redactada se considera suficiente para permitir a un experto en la materia practicar la invención. La presente invención no se considera limitada en su alcance por el constructo depositado, ya que se pretende que la realización depositada sea una mera ilustración de algunos aspectos de la invención y cualquier constructo que sea funcionalmente equivalente está comprendido dentro del alcance de esta invención. El depósito del material en el presente documento no constituye un reconocimiento de que la memoria descriptiva redactada contenida en el presente documento sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se constituye como limitante del alcance de las reivindicaciones en referencia a las ilustraciones específicas que éstas representan. En vez de esto, serán evidentes para las personas expertas en la técnica diversas modificaciones de la invención además de las que se muestran y describen en el presente documento a partir de la memoria descriptiva anterior y que están comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor RTD

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1 DNA Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: 3,5 pulgadas, disco flexible de 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-Julio-1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/918874

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-Agosto-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Marschang, Diane L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.600

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/RESGUARDO: P1129R1PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 650/225-5416

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 386 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 1:

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2082 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº:2

5

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA DE IDENTIDAD Nº:3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATAAAAGTT CCTGCACCAT GACCAGAGAC ACAGTGTGTC AGTGTAAAGA

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCAGGAAA CCAGAGCTTC CCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: Único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTCCCGTT TGCTTATCAC ACGC

\hfill

24

Claims

1. Polipéptido RTD aislado que tiene al menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia nativa del polipéptido RTD que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1), en el que dicho polipéptido RTD aislado inhibe la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 en una célula de mamífero o se une al ligando Apo-2.

2. Polipéptido RTD según la reivindicación 1 que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

3. Polipéptido RTD según la reivindicación 1 que comprende los residuos de los aminoácidos 56 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

4. Secuencia del dominio extracelular aislada del polipéptido RTD que comprende (a) los residuos de los aminoácidos 1 a 212 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1); o (b) un fragmento de las secuencias de (a) que retiene la capacidad de unirse al ligando Apo-2.

5. Secuencia del dominio extracelular según la reivindicación 4 que comprende los residuos de los aminoácidos 56 a 212 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

6. Molécula quimérica que comprende un polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga.

7. Molécula quimérica según la reivindicación 6 en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia del epítopo etiqueta.

8. Molécula quimérica según la reivindicación 6 en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de inmunoglobulina.

9. Molécula quimérica según la reivindicación 6 en la que dicha secuencia de inmunoglobulina es una IgG.

10. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

12. Anticuerpo según la reivindicación 10 que es un anticuerpo quimérico.

13. Anticuerpo según la reivindicación 10 que es un anticuerpo humanizado.

14. Anticuerpo según la reivindicación 10 que es un anticuerpo humano.

15. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido RTD según la reivindicación 1 o la secuencia del dominio extracelular según la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

16. Ácido nucleico según la reivindicación 15 en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica la secuencia nativa del polipéptido RTD que comprende los residuos de los aminoácidos 1 a 386 de la Fig. 1A (SEC DE ID Nº: 1).

17. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16.

18. Vector según la reivindicación 17 unido de manera operativa a las secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

19. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 17.

20. Célula huésped según la reivindicación 19 que es una célula de mamífero.

21. Célula huésped según la reivindicación 19 que es una célula de levadura.

22. Célula huésped según la reivindicación 19 que es E. coli.

23. Procedimiento para usar una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para realizar la producción del polipéptido RTD que comprende cultivar la célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22.

\newpage

24. Composición que comprende el polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo.

25. Polipéptido RTD o secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para uso en terapia.

26. Composición que comprende el polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo.

27. Procedimiento para modular la apoptosis in vitro en células de mamíferos que comprende exponer dichas células al polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

28. Procedimiento según la reivindicación 27 en el que dichas células se exponen también al ligando Apo-2.

29. Polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16 para uso en terapia.

30. Uso de un polipéptido RTD o la secuencia del dominio extracelular del mismo según se define en una cualquiera de la reivindicación 1 a 5, o un ácido nucleico según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en la preparación de un medicamento para modular la apoptosis en células de mamíferos.