ES2287948T3

ES2287948T3 - Ligando apo-2.

Info

Publication number: ES2287948T3
Application number: ES97903760T
Authority: ES
Inventors: Avi J. Ashkenazi; Anan Chuntharapai; Kyung Jin Kim
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-01-09
Filing date: 1997-01-08
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2017-01-08
Also published as: EP0873407B1; IL125168A0; EP1734122A3; JP2007169280A; EP0873407A1; JP2005237370A; HK1018961A1; IL193752A0; IL125168A; US6030945A; CA2241572A1; WO1997025428A1; AU1824897A; DE69737747D1; EP1734122A2; JP2008308502A; EP1889915A1; CA2666263A1; JP2001510321A; PT873407E

Abstract

SE DESCRIBE UNA CITOCINA, DENOMINADA LIGANDO APO - 2, QUE INDUCE LA APOPTOSIS DE CELULAS DE MAMIFERO. SE CREE QUE EL LIGANDO APO - 2 ES UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE CITOCINAS TNF. TAMBIEN SE DESCRIBEN COMPOSICIONES QUE INCLUYEN QUIMERAS DE LIGANDOS APO - 2, ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN EL LIGANDO APO 2, Y ANTICUERPOS FRENTE AL LIGANDO APO - 2. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR EL LIGANDO APO - 2 PARA INDUCIR LA APOPTOSIS Y PARA TRATAR TRASTORNOS PATOLOGICOS TALES COMO EL CANCER.

Description

Ligando Apo-2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a procedimientos y usos médicos de citocina, designada en la presente como "ligando de Apo-2", que induce apoptosis celular en mamíferos, y que puede utilizarse para tratar el cáncer.

Antecedentes de la invención

Se cree que el control del número de células en mamíferos viene determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, a la que a veces se hace referencia como muerte celular necrótica, se caracteriza habitualmente como forma patológica de muerte celular causada por algún traumatismo o lesión celular. En cambio, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que habitualmente procede de una forma ordenada o controlada. A menudo se hace referencia a esta forma de muerte celular ordenada o controlada como "apoptosis" [véase, por ejemplo, Barr y otros, Bio/Technology, 12: 487-493 (1994)]. La muerte celular apoptósica tiene lugar de forma natural en varios procesos fisiológicos, tales como el desarrollo embrionario y la selección clonal en el sistema inmunitario [Itoh y otros, Cell, 66: 233-243 (1991)]. No obstante, el índice reducido de muerte celular apoptósica se ha asociado con una variedad de estados patológicos, tales como cáncer, lupus e infección con virus del herpes [Thompson, Science, 267: 1.456-1.462 (1995)].

La muerte celular apoptósica habitualmente se acompaña de uno o más cambios morfológicos y bioquímicos característicos en células, tales como condensación de citoplasma, pérdida de microvellosidades en la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Se cree que hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que desencadenan o inducen tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos (Raff, Nature, 356: 397-400 (1992); Steller, Science, 267: 1.445-1.449 (1995); Sachs y otros, Blood, 82: 15 (1993)]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como eliminación de determinados factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga y otros, Nature, 356: 314-317 (1992)]. Asimismo, se ha observado cierta participación de algunos de los oncogenes identificados tales como myc, rel y EIA, y de supresores tumorales, como p53, en la inducción de la apoptosis. Se ha observado que algunos fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación tienen asimismo actividad inductora de apoptosis [Thompson, supra].

Varias moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral \alpha ("TNF-\alpha"), el factor de necrosis tumoral \beta ("TNF-\beta" o "linfotoxina"), el ligando CD30 , el ligando CD27 , el ligando CD40, el ligando OX-4o, el ligando 4-1BB y el ligando Apo-1 (al que también se hace referencia como ligando Fas o ligando CD95) se han identificado como miembros de la familia de las citocinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [véase, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85: 3.378-3.404 (1995)]. Entre estas moléculas, se ha observado que el TNF-\alpha, el TNF-\beta, el ligando CD30, el ligando 4-IBB y el ligando Apo-1 participan en la muerte celular apoptósica. Se ha constatado que tanto el TNF-\alpha como el TNF-\beta inducen muerte apoptósica en células tumorales sensibles [Schmid y otros, Proc. Natl. Acad, Sci., 83: 1981 (1986); Dealtry y otros, Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)]. Zheng y otros han notificado que el TNF-\alpha participa en la apoptosis posterior a la estimulación de células T CD8-positivas [Zheng y otros, Nature, 377: 348-351 (1995)]. Otros investigadores han observado que el ligando CD30 puede intervenir en la deleción de células T autorreactivas en el timo [Amakawa y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. N.º 10, (1995)].

Las mutaciones en el receptor murino Fas/Apo-1 o en los genes del ligando (denominados lpr y gld, respectivamente) se han relacionado con algunos trastornos autoinmunitarios, lo que indica que el ligando Apo-1 puede desempeñar algún papel en la regulación de la deleción clonal de linfocitos autorreactivos en la periferia [Krammer y otros, Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata y otros, Science, 267: 1.449-1.456 (1995)]. También se ha observado que el ligando Apo-1 induce apoptosis posterior a la estimulación en linfocitos T CD4-positivos y en linfocitos B, y puede participar en la eliminación de linfocitos activados cuando ya no son necesarios [Krammer y otros, supra; Nagata y otros, supra]. Se ha observado que los anticuerpos monoclonales murinos agonistas que se unen específicamente al receptor Apo-1 muestran actividad citotóxica que es comparable o similar a la del TNF-\alpha [Yonehara y otros, J. Exp. Med., 169: 1.747-1.756 (1989)].

Se cree que la inducción de las diversas respuestas celulares mediadas por tales citocinas de la familia del TNF es iniciada por su unión con receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNF-R1) y 75 kDa (TNFR2) [Hohman y otros, J. Biol. Chem., 264: 14.927-14.934 (1989); Brockhaus y otros Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3.127-3.131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991, y se han aislado y caracterizado los ADNc humanos y murinos correspondientes a ambos tipos de receptores [Loetscher y otros, Cell, 61: 351 (1990); Schall y otros, Cell, 61: 361 (1990); Smith y otros, Science, 248: 1.019-1.023 (1990); Lewis
y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2.830-2.834 (1991); Goodwin y otros, Mol. Cell, Biol., 11: 3.020-3.026 (1991)].

Itoh y otros describen que el receptor Apo-1 puede indicar una muerte celular apoptósica similar a la indicada por el TNF-R1 de 55 kDa [Itoh y otros, supra]. También se ha notificado que la expresión del antígeno Apo-1 se regula por disminución junto con la de TNF-R1 cuando las células son tratadas bien con TNF-\alpha o con un anticuerpo monoclonal murino anti-Apo-1 [Krammer y otros, supra; Nagata y otros, supra]. Por lo tanto, algunos investigadores han establecido la hipótesis de que las estirpes celulares que expresan simultáneamente receptores Apo-1 y TNF-R1 pueden intervenir en la muerte celular a través de las vías de señalización habituales [Id.].

En Pitti y otros, (J. Bio L. Chem., 22: 12.687-12.690, 1996), publicada el 31 de mayo de 1996, se describe la inducción de apoptosis causada por el ligando Apo-2.

Wiley y otros, (Immunity, 3: 673-682, 1995) describen un miembro de la familia de ligandos del TNF denominado TRAIL y la inducción de apoptosis que causa en las estirpes celulares linfocíticas.

Los ligandos de la familia del TNF identificados hasta la fecha, a excepción de la linfotoxina-\alpha, son proteínas transmembrana de tipo II, cuyo extremo C es extracelular. En cambio, los receptores de la familia de receptores del TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son proteínas transmembrana de tipo I. No obstante, en ambas familias de ligandos y receptores la homología identificada entre los miembros de una familia se ha hallado principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Varias de las citocinas de la familia del TNF, tales como el TNF-\alpha, el ligando Apo-1 y el ligando CD40, son escindidas proteolíticamente en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso forma habitualmente una molécula homotrimérica que actúa como una citocina soluble. Las proteínas de la familia de receptores del TNF habitualmente también son escindidas proteolíticamente para liberar los ECD del receptor soluble que pueden actuar como inhibidores de las citocinas análogas. Para una revisión de la familia de citocinas del TNF y sus receptores, véase Gruss y Dower, supra.

Descripción resumida de la invención

Los solicitantes han identificado clones de ADNc que codifican una nueva citocina, designada "ligando Apo-2". Actualmente se cree que el ligando Apo-2 es un miembro de la familia de las citocinas del TNF; el ligando Apo-2 está relacionado en la secuencia de aminoácidos con algunas proteínas conocidas relacionadas con el TNF, tales como el ligando Apo-1. No obstante, los solicitantes observaron que el ligando Apo-2 no es inhibido de manera apreciable por receptores solubles conocidos del Apo-1 o el TNF, tales como el Fas/Apo-1, el TNF-R1, o los receptores TNF-R2.

En una realización, la presente invención proporciona el uso de un ligando Apo-2 para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer, en el que el ligando Apo-2 es:

(a) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 41-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1);

(b) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 114-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1);

(c) un polipéptido que consta de los residuos de aminoácidos 114-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1);

(d) un polipéptido que consta de los residuos de aminoácidos 1-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1); y

(e) un polipéptido que es un fragmento de (a), (b), (c), o (d); y

en el que el cáncer es un carcinoma de células escamosas, un carcinoma microcítico de pulmón, un carcinoma no microcítico de pulmón, un neuroblastoma, un cáncer de páncreas, un glioblastoma multiforme, un cáncer cervical, un cáncer de estómago, un cáncer de vejiga urinaria, un hepatoma, un cáncer de mama, un cáncer de colon, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de próstata o un cáncer de ovario y el ligando Apo-2 induce apoptosis en las células cancerosas.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro o ex vivo para inducir apoptosis en células cancerosas de mamíferos que comprenden células cancerosas de mamífero expuestas a una cantidad efectiva de ligando Apo-2 para inducir apoptosis en dichas células, en las que el ligando Apo-2 es un polipéptido seleccionado del grupo que consta de:

(c) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 114-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1);

(d) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 1-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1); y

(e) un polipéptido que es un fragmento de (a), (b), (c), o (d); y

en el que las células cancerosas de mamífero son células de carcinoma de células escamosas, células de carcinoma microcítico de pulmón, células de carcinoma no microcítico de pulmón, células de neuroblastoma, células de cáncer de páncreas, células multiformes de glioblastoma, células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer de estómago, células de cáncer de vejiga urinaria, células de hepatoma, células de cáncer de mama, células de cáncer de colon, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer de próstata o células de cáncer de ovario, y el ligando Apo-2 induce apoptosis en las células cancerosas. El ligando Apo-2 también puede administrarse al mamífero junto con uno o más tratamientos, tales como quimioterapia, radioterapia u otros agentes capaces de ejercer actividad antitumoral.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Apo-2 humano y la secuencia de aminoácidos derivada del mismo.

La figura 1B muestra una alineación de la región del extremo terminal C del ligando Apo-2 humano con la correspondiente región de miembros conocidos de la familia de las citocinas del TNF humano, 4-1BBL, OX40L, CD27L, CD30L, TNF-\alpha, LT-\beta, LT-\alpha, CD40L y Apo-1L.

Las figuras 1C-1E muestran: (C) la topología celular del ligando Apo-2 recombinante, en toda su longitud, etiquetado con un epítopo myc en el extremo terminal C, expresado en células 293 humanas, tal como se ha determinado mediante análisis FACS utilizando anticuerpo anti-epítopo myc; (D) el tamaño y la estructura de la subunidad del Apo-2 recombinante soluble, etiquetado (tagged) con epítopo His_{10} expresado en células de insecto infectadas con baculovirus recombinante y purificadas mediante cromatografía de afinidad de quelatos Ni24, tal como se ha determinado con entrecruzamiento químico (columnas 2, 3) o sin él (columna 1) seguido de SDS-PAGE y tinción de plata; (E) el tamaño y la estructura de la subunidad del ligando Apo-2 recombinante soluble, etiquetado (tagged) con epítopo gD, expresado en células humanas 293 marcadas metabólicamente, tal como se ha determinado mediante inmunoprecipitación con anticuerpo anti-epítopo gD, seguido de SDS-PAGE y autorradiografía.

Las figuras 2A-2E muestran la inducción de apoptosis en estirpes celulares de linfocitos B y T mediante ligando Apo-2. Las células apoptósicas se identificaron por cambios morfológicos característicos (A); mediante fluorescencia positiva en la tinción con yoduro de propidio (PI) y con anexina V conjugada con FITC, determinada mediante citometría de flujo (B-D); y mediante análisis de fragmentación internucleosómica de ADN (E).

Las figuras 3A-3C muestran la evolución en el tiempo y la dependencia de la dosis de la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 y la ausencia de inhibición de la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 por parte de proteínas de fusión IgG, receptores solubles, basadas en el receptor Fas/Apo-1, el receptor TNF-R1, o el receptor TNF-R2.

La figura 4 muestra la expresión de ARNm del ligando Apo-2 en tejidos humanos fetales y de adulto, tal como se ha determinado mediante transferencia de tipo Northern.

La figura 5 muestra el efecto in vivo del ligando Apo-2, administrado mediante inyección intratumoral, solo o en combinación con doxorrubicina, en el peso de tumores humanos MDA231 basados en el cáncer de mama desarrollado en ratones desnudos.

La figura 6 muestra el efecto in vivo del ligando Apo-2, administrado mediante inyección intratumoral, solo o en combinación con 5-FU, el peso de los tumores humanos HCT116 basados en el cáncer de colon desarrollado en ratones desnudos.

La figura 7 muestra el efecto in vivo del ligando Apo-2, administrado mediante inyección intraperitoneal, solo o en combinación con 5-FU, en el tamaño de los tumores humanos HCT116 basados en el cáncer de colon desarrollado en ratones desnudos.

La figura 8 muestra el efecto in vivo del ligando Apo-2, administrado mediante inyección intraperitoneal, solo o en combinación con 5-FU, en el peso de los tumores humanos HCT116 basados en el cáncer de colon desarrollado en ratones desnudos.

La figura 9 es un diagrama de barras que ilustra que la CrmA pero no la FADD dominante negativa bloquea la apoptosis inducida por el ligando Apo-2 en células HeLa-S3.

La figura 10 muestra análisis FACS de la apoptosis inducida mediante ligando Apo-2 y el efecto de cuatro anticuerpos anti-ligando Apo-2: ID1, 2G6, 2E11 y 5C2 (células apoptósicas 9D detectadas utilizando anexina V conjugada con FITC, línea gruesa; células vivas sin teñir, línea fina).

La figura 11 es un diagrama de barras que ilustra la especificidad antigénica de los anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2.

La figura 12 es un diagrama de barras que ilustra los resultados de un análisis de mapeo de epítopos de los anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y SC2.

La figura 13 es un diagrama de barras que ilustra los resultados de un análisis que comprueba la capacidad del anticuerpo monoclonal 1D1 para unirse a varios péptidos sintéticos distintos que constan de regiones de aminoácidos específicas del ligando Apo-2.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "ligando Apo-2" y "Apo-2L" se utilizan en la presente para referirse a una secuencia polipeptídica que incluye los residuos aminoácidos 114-281, ambos incluidos, los residuos 41-281, ambos incluidos, los residuos de 15-281, ambos incluidos, o los residuos 1-281, ambos incluidos, de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 1A, así como variantes de deleción, inserción o sustitución biológicamente activas de las secuencias anteriores. En una realización preferida, la secuencia de polipéptidos tiene por lo menos los residuos 114-281 de la figura 1A. En otra realización preferida, las variantes biológicamente activas tienen por lo menos aproximadamente un 80% de identidad de la secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de la secuencia, e incluso más preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de la secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores. La definición incluye el ligando Apo-2 aislado de una fuente de ligandos Apo-2, tal como de los tipos de tejido humano descritos en la presente (véase ejemplo 8) o de otra fuente, o preparado mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. La actual definición de ligando Apo-2 excluye secuencias EST conocidas, tales como GenBank HHEA47M, T90422, R31020, H43566, H44565, H44567, H54628, H44772, H54629, T82085 y T10524.

El término etiquetado con un "epítopo tagged" cuando se utiliza en la presente hace referencia a un polipéptido quimérico que comprende el ligando Apo-2, o una parte del mismo, fusionado a un "polipéptido tag". El polipéptido tag tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede sintetizarse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto de modo que no interfiera con la actividad del ligando Apo-2. El polipéptido tag es también preferiblemente totalmente único de modo que el anticuerpo no presenta sustancialmente reactividad cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos tag adecuados generalmente tienen por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 residuos).

"Aislada", cuando se utiliza para describir las diversas proteínas descritas en la presente, significa proteína que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que habitualmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos interna o del extremo terminal N utilizando un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Una proteína aislada incluye una proteína in situ dentro de células recombinantes, ya que por lo menos faltará un componente del entorno natural del ligando Apo-2. En general, no obstante, la preparación de una proteína aislada requerirá por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula "aislada" de ácidos nucleicos del ligando Apo-2 es una molécula de ácidos nucleicos que ha sido identificada y separada de por lo menos una molécula de ácidos nucleicos contaminantes con la que generalmente se relaciona en la fuente natural del ácido nucleico del ligando Apo-2. Una molécula "aislada" de ácidos nucleicos del ligando Apo-2 difiere en la forma o el contexto en el cual se halla en la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos del ligando Apo-2 se diferencian por lo tanto de la molécula de ácidos nucleicos del ligando Apo-2 tal como se encuentra en células naturales. No obstante, una molécula aislada de ácidos nucleicos del ligando Apo-2 incluye moléculas de ácidos nucleicos del ligando Apo-2 contenidas en células que generalmente expresan ligando Apo-2 en las que, por ejemplo, la molécula de ácidos nucleicos tiene una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

El término "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico se "une operativamente" cuando se establece una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o de una secuencia líder secretora se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une operativamente a una secuencia codificante si se coloca de modo que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan adaptadores o conectores sintéticos de oligonucleótidos según la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales anti-ligando Apo-2 únicos (incluidos anticuerpos agonistas y antagonistas) y compuestos de anticuerpos anti-ligando Apo-2 con especificidad poliepitópica.

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El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, cada uno de los anticuerpos que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de aparición natural que pueda haber en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, al contrario que en los preparados de anticuerpos convencionales (policlonales), que habitualmente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos mediante corte y empalme de un dominio variable (incluido hipervariable) de un anticuerpo anti-ligando Apo-2 con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o la designación de la clase o subclase de inmunoglobulina, así como los fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2} y Fv), con tal que muestren la actividad deseada. Véase, por ejemplo EP 4.816.567 y Mage y otros, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. págs. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987).

De este modo, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y su construcción no requiere la producción de anticuerpos mediante ningún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán según la presente invención pueden sintetizarse mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975), o pueden sintetizarse mediante procedimientos de ADN recombinante tales como los descritos en la patente de EE.UU. US 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de genotecas fágicas generadas utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas en McCafferty y otros, Nature, 348: 552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en las que residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo de donante) tal como un ratón, una rata o un conejo que presente la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos Fv de la región de entramado (framework region, FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la CDR importada o las secuencias de entramado. Estas modificaciones se realizan para mejorar y optimizar posteriormente la actividad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos, de por lo menos un dominio variable, y habitualmente dos, en el cual todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana.

"Biológicamente activo" para los propósitos de la presente invención de caracterizar un ligando Apo-2 significa que tiene la capacidad de inducir o estimular apoptosis in vivo o ex vivo en por lo menos un tipo de célula de mamífero.

Los términos "apoptosis" y "actividad apoptósica" se utilizan en un sentido general y hacen referencia a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que habitualmente se acompaña de uno o más cambios celulares característicos, entre los que se incluyen condensación de citoplasma, pérdida de microvellosidades en la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y cuantificarse, por ejemplo, mediante análisis de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de ADN.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a la enfermedad fisiológica en mamíferos, o la describen, que habitualmente se caracteriza por crecimiento celular descontrolado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no exclusivamente, carcinoma, linfoma, leucemia, blastoma y sarcoma. Ejemplos más particulares de las formas de cáncer establecidas en las reivindicaciones son el carcinoma de células escamosas, el cáncer microcítico de pulmón, el cáncer no microcítico de pulmón, el neuroblastoma, el cáncer de páncreas, el glioblastoma multiforme, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de estómago, el cáncer de vejiga urinaria, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon y el cáncer de cabeza y cuello. En una realización, el cáncer incluye linfoma folicular, carcinoma con mutaciones p53, o cáncer dependiente de las hormonas tal como cáncer de mama, cáncer de próstata, o cáncer de ovario.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" tal como se utilizan en la presente se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva.

El término "mamífero" tal como se utiliza en la presente se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluidos humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.

II. Ligando Apo-2

La presente invención proporciona una citocina relacionada con la familia de ligandos TNF, la citocina identificada en la presente como "ligando Apo-2". La secuencia de aminoácidos madura predicha de ligando Apo-2 humano consta de 281 aminoácidos y tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 32,5 kDa y un punto isoeléctrico de aproximadamente 7,63. No hay secuencia señal aparente en el extremo terminal N, aunque el análisis de hidropatía indica la presencia de una región hidrófoba entre los residuos 15 y 40. La ausencia de una secuencia señal y la presencia de una región hidrófoba interna indica que el ligando Apo-2 es una proteína transmembrana de tipo II. Se localiza un sitio de glucosilación unido al extremo N supuestamente existente en el residuo 109 de la región extracelular supuestamente existente. La región citoplasmática supuestamente existente comprende los residuos de aminoácidos 1-14, la región transmembrana comprende los residuos de aminoácidos 15-40 y la región extracelular comprende los residuos de aminoácidos 41-281, que se muestran en la figura 1A. En los ejemplos que aparecen a continuación también se describe el polipéptido del ligando Apo-2 que comprende los residuos de aminoácidos 114-281 de la región extracelular, que se muestra en la figura 1A.

A. Preparación de ligando Apo-2

La descripción que hay a continuación se refiere principalmente a la producción de ligando Apo-2 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico del ligando Apo-2 y recuperando el polipéptido del cultivo celular. Evidentemente, está contemplado el uso de procedimientos alternativos que son bien conocidos en el estado de la técnica para preparar ligando Apo-2.

1. Aislamiento del ADN que codifica el ligando Apo-2

El ADN que codifica el ligando Apo-2 puede obtenerse a partir de cualquier genoteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del ligando Apo-2 y expresarse a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del ligando Apo-2 humano puede obtenerse convenientemente de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejidos humanos, tales como la genoteca fágica de ADNc placentario humano descrita en el ejemplo 1. El gen que codifica el ligando Apo-2 también puede obtenerse de una genoteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Las genotecas pueden cribarse con sondas (tales como anticuerpos para el ligando Apo-2 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Se proporcionan ejemplos de sondas de oligonucleótidos en el ejemplo 1. El cribado del ADNc o de las genotecas genómicas con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos normales, tales como los que se describen en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el ligando Apo-2 es utilizar la metodología PCR [Sambrook y otros, supra; Dieffenbach y otros, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Un procedimiento de cribado preferido utiliza secuencias de oligonucleótidos seleccionadas para analizar genotecas de ADNc de diversos tejidos humanos. El ejemplo 1 que se ofrece a continuación describe técnicas de cribado para una genoteca de ADNc con dos sondas de oligonucleótidos distintas. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener suficiente longitud y ser nada ambiguas, de modo que se redujeran al mínimo los falsos positivos. Preferiblemente, se marca el oligonucleótido de modo que pueda detectarse en la hibridación de ADN en la genoteca sometida a cribado. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen el uso de marcadores radioactivos como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilización o el marcado enzimá-
tico.

El ácido nucleico que presenta toda la secuencia codificante de la proteína puede obtenerse mediante cribado de ADNc seleccionado o de genotecas genómicas seleccionadas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente, y, si es necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión del cebador como los descritos en Sambrook y otros, supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de un ARNm a partir del cual es posible que no se haya obtenido por transcripción inversa un ADNc.

Pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos del ligando Apo-2 introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del ligando Apo-2, o mediante síntesis del polipéptido deseado del ligando Apo-2. Tales variantes representan inserciones, sustituciones y/o deleciones de residuos dentro, o en uno o ambos extremos, de la región intracelular, la región transmembrana, o la región extracelular, o de la secuencia de aminoácidos que se muestra en toda su longitud para el ligando Apo-2 en la figura 1A. Puede hacerse cualquier combinación de inserción, sustitución y/o deleción para conseguir la construcción final, con tal que la construcción final posea la actividad apoptósica deseada tal como se define en la presente. En una realización preferida, las variantes tienen por lo menos aproximadamente un 80% de identidad de la secuencia, más preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de la secuencia, e incluso más preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de la secuencia con las secuencias identificadas en la presente para las regiones intracelular, transmembrana, o extracelular del ligando Apo-2, o para la secuencia en toda su longitud del ligando Apo-2. Los cambios en aminoácidos también pueden alterar procesos postraduccionales del ligando Apo-2, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje de la membrana.

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Las variaciones en la secuencia del ligando Apo-2 como las descritas anteriormente pueden realizarse utilizando cualquiera de las técnicas y recomendaciones para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas en la patente de EE.UU. US 5.364.934. Éstas incluyen mutagénesis mediada por oligonucleótidos (mutagénesis dirigida), análisis de alanina y mutagénesis PCR.

2. Inserción de un ácido nucleico en un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica un ligando Apo-2 nativo o una variante puede insertarse en un vector replicable para su posterior clonación (amplificación del ADN) o expresión. Varios vectores se hallan a disposición pública. Entre los componentes del vector generalmente se incluyen, pero no exclusivamente, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción, cada uno de los cuales se describe a continuación.

(i) El componente "secuencia señal"

El ligando Apo-2 puede producirse de manera recombinante no sólo directamente, sino también como polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio específico de escisión en el extremo terminal N de la proteína o el polipéptido maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede formar parte del ADN del ligando Apo-2 que se ha insertado en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o líderes estables al calor de la enterotoxina II. En el caso de la secreción de levaduras la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la líder de la invertasa de levadura, la líder del factor alfa (que incluye las líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la patente de EE.UU. US 5.010.182), o la líder de la fosfatasa ácida, la líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos la presecuencia nativa del ligando Apo-2 que normalmente dirige la inserción del ligando Apo-2 en la membrana celular de células humanas in vivo es satisfactoria, aunque pueden utilizarse otras secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie afín, así como las líderes de secreción vírica, por ejemplo, la señal de la glucoproteína D del herpes simple.

El ADN para tal región precursora se halla preferiblemente unido en el marco de lectura del ADN que codifica el ligando Apo-2.

(ii) El componente "origen de replicación"

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permiten al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para la levadura, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el componente "origen de replicación" no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (habitualmente puede utilizarse el origen SV40 porque contiene el promotor temprano).

La mayor parte de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en por lo menos una clase de organismos pero pueden ser transfectados a otro organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector es clonado en E. coli y a continuación el mismo vector es transfectado a células de levaduras o mamíferos para su expresión aunque éste no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El ADN también puede amplificarse mediante inserción en el genoma huésped. Esto se consigue fácilmente utilizando la especie Bacillus como huésped, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia hallada en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector produce recombinación homóloga con el genoma e inserción del ADN del ligando Apo-2. No obstante, la recuperación del ADN genómico que codifica el ligando Apo-2 es más compleja que la de un vector replicado de manera exógena porque se requiere digestión de las enzimas de restricción para escindir el ADN del ligando Apo-2.

(iii) El componente "gen de selección"

Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas y cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección habituales codifican proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina; (b) complementan insuficiencias auxotróficas; o (c) aportan nutrientes muy importantes no disponibles en los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para bacilos.

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Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y de este modo sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina [Southern y otros, J. Molec, Appl. Genet., 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan y otros, Science, 209: 1.422 (1980)] o higromicina [Sugden y otros, Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)]. Los tres ejemplos anteriores utilizan genes bacterianos bajo control eucariota para transferir resistencia a los fármacos G.418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico del ligando Apo-2, tal como DHFR o timidina quinasa. Los transformantes celulares de mamífero se colocan bajo condiciones de presión de selección a las que sólo los transformantes están adaptados a sobrevivir en virtud de haber incorporado el marcador. La presión de selección viene impuesta por cultivar los transformantes en condiciones en las que se modifica constantemente la concentración del agente de selección en el medio, lo que lleva a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica el ligando Apo-2. La amplificación es el proceso mediante el cual los genes más necesarios para la producción de una proteína importante para el crecimiento son repetidos en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. A partir del ADN amplificado se sintetizan cantidades mayores de ligando Apo-2. Otros ejemplos de genes amplificables son la metalotioneína I y II, la adenosina desaminasa y la ornitina descarboxilasa.

Las células transformadas con el gen de selección DHFR pueden identificarse cultivando en primer lugar todos los transformantes en un medio de cultivo que contenga metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza DHFR natural es la estirpe celular de ovario de hámster chino, que carece de actividad DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub y otros, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.216 (1980). Las células transformadas son expuestas a continuación a concentraciones más elevadas de metotrexato. Esto lleva a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR, y, al mismo tiempo, a múltiples copias de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica el ligando Apo-2. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier huésped adecuado, por ejemplo, ATCC N.º CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se utiliza un gen mutante DHFR que es muy resistente a Mtx (EP 117.060).

Por otro lado, las células huésped (en particular los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el ligando Apo-2, la proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable, tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo kanamicina, neomicina, o G418. Véase patente de EE.UU. US 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb y otros, Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y otros, Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y otros, Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.º 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. La presencia de la alteración trp1 en el genoma de la célula huésped de la levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación mediante cultivo en ausencia de triptófano. De un modo parecido, las cepas de levadura deficientes para Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) son complementadas con plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

Además, pueden utilizarse vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 \mum para la transformación de levaduras de Kluyveromyces [Bianchi y otros, Curr, Genet., 12: 185 (1987)]. Más recientemente, se ha informado de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis [Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990)]. También se han descrito múltiples copias estables de vectores de expresión para la secreción de albúmina sérica humana madura recombinante mediante cepas industriales de Kluyveromyces [Fleer y otros, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)].

(iv) El componente "promotor"

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es identificado por el organismo huésped y se halla unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos del ligando Apo-2. Los promotores son secuencias sin traducir que se localizan en dirección del codón de inicio (5') de un gen estructural (generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 a 1.000 pb) que controla la transcripción y traducción de una secuencia de ácidos nucleicos particular, tal como la secuencia de ácidos nucleicos del ligando Apo-2, a la que están unidos operativamente. Tales promotores habitualmente se clasifican en dos clases: inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician un mayor nivel de transcripción del ADN bajo su control como respuesta a algún cambio en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este momento son bien conocidos un gran número de promotores identificados por una variedad de posibles células huésped. Estos promotores se hallan unidos operativamente al ligando Apo-2 que codifica ADN eliminando el promotor de la fuente de ADN mediante digestión de enzimas de restricción e insertando la secuencia aislada del promotor en el vector. Para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN del ligando Apo-2 puede utilizarse tanto la secuencia nativa del promotor del ligando Apo-2 como varios de los promotores heterólogos.

Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa [Chang y otros, Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y otros, Nature, 281: 544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4.057 (1980); EP 36.776] y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, lo que permite a un trabajador competente unirlas operativamente al ADN que codifica el ligando Apo-2 [Siebenlist y otros, Cell, 20: 269 (1980)] utilizando conectores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores utilizados en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (SD) unida operativamente al ADN que codifica el ligando Apo-2.

Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Casi todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente entre 25 y 30 bases hacia el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada entre 70 y 80 bases en dirección al inicio de transcripción de varios genes es una región CXCAAT donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para añadir la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucariotas.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levaduras se incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y otros, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4.900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de que la transcripción es controlada por las condiciones del cultivo, son las regiones promotoras del alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, las enzimas degradadoras de la fosfatasa ácida asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen posteriormente en EP 73.657. Los potenciadores de levaduras también se utilizan ventajosamente con promotores de levaduras.

La transcripción del ligando Apo-2 a partir de vectores en células huésped de mamíferos es controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus, tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente del Reino Unido GB 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferiblemente el virus 40 de los simios (SV40), mediante promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor de inmunoglobulinas, mediante promotores del choque de calor y mediante el promotor normalmente asociado con la secuencia del ligando Apo-2, siempre que tales promotores sean compatibles con sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación vírico SV40 [Fiers y otros, Nature, 273: 113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209: 1.422-1.427 (1980); Pavlakis y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7.399-7.402 (1981)]. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E [Greenaway y otros, Gene, 18: 355-360 (1982)]. En la patente de EE.UU. US 4.419.446 se describe un sistema de expresión de ADN en huéspedes mamíferos que utiliza el virus del papiloma bovino como vector. Una modificación de este sistema es la que se describe en la patente de EE.UU. US 4.601.978 [véase también Gray y otros, Nature, 295: 503-508 (1982) relativa a la expresión de ADNc que codifica el interferón inmunitario en células de mono; Reyes y otros, Nature, 297: 598-601 (1982) relativa a la expresión de ADNc de interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5.166-5.170 (1982) relativa a la expresión del gen del interferón humano en cultivo de células de ratón y de conejo; y Gorman y otros, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 79: 6.777-6.781 (1982) relativa a la expresión de secuencias bacterianas CAT en células renales de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células ováricas de hámster chino, células HeLa y células murinas NIH-3T3 que utilizan como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous].

(v) El componente "elemento potenciador"

La transcripción de un ADN que codifica el ligando Apo-2 por parte de eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN de acción cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores tienen una orientación y posición relativamente independientes, habiéndose hallado en posición 5' [Laimins y otros, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 78: 993 (1981)] y 3' [Lusky y otros, Mol. Cell Bio., 3: 1.108 (1983)] respecto de la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji y otros, Cell, 33: 729 (1983)], así como dentro de la propia secuencia codificante [Osborne y otros, Mol. Cell Bio., 4: 1.293 (1984)]. Actualmente se conocen diversas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, no obstante, se utilizará un potenciador de un virus de una célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el extremo tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre potenciación de elementos para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede haber sido empalmado en el vector en la posición 5' o 3' respecto de la secuencia que codifica el ligando Apo-2, pero se localiza preferiblemente en el sitio 5' del promotor.

(vi) El componente "finalización de la transcripción"

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias se hallan habitualmente disponibles en las regiones sin traducir 5' y, ocasionalmente 3', de ADN eucariota o vírico o de ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte sin traducir del ARNm que codifica el ligando Apo-2.

(vii) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los componentes mencionados anteriormente utiliza técnicas de ligación normales. Para generar los plásmidos necesarios se escinden plásmidos aislados o fragmentos de ADN, se adaptan y vuelven a unirse en la forma deseada.

Para el análisis de confirmación de las secuencias correctas en plásmidos construidos, pueden utilizarse mezclas de unión para transformar la cepa 294 (ATCC 31.446) de E. coli K12 y los transformantes seleccionados de manera satisfactoria mediante resistencia a ampicilina o tetraciclina si es adecuado. Se preparan los plásmidos de los transformantes, se analizan mediante digestión de una endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing y otros, Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y otros, Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

(viii) Vectores de expresión transitoria

Pueden emplearse vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de ADN de mamíferos que codifican el ligando Apo-2. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicar eficazmente en una célula huésped, tal como la de la célula huésped que acumula varias copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza una concentración elevada de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión [Sambrook y otros, supra]. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión y una célula huésped adecuados, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados, así como el cribado rápido de tales polipéptidos en busca de las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta forma, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para los propósitos de identificar análogos y variantes de ligando Apo-2 que son ligando Apo-2 biológicamente
activos.

(ix) Ejemplos de vectores celulares vertebrados adecuados

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para su adaptación a la síntesis de ligando Apo-2 en cultivo recombinante de células de vertebrados se describen en Gething y otros, Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei y otros, Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión del ligando Apo-2 en cultivo de células de mamífero es el pRK5 [EP 307.247; que también se describe en el ejemplo 1] o el pSV16B [documento WO 91/08291 publicado el 13 de junio de 1991].

3. Selección y transformación de células huésped

Otras células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención son las células de procariotas, las levaduras, o las células de eucariotas superiores descritas anteriormente. Entre los procariotas adecuados para este propósito se incluyen pero no exclusivamente eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en la patente de DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar una cantidad mínima de enzimas proteolíticas.

Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican el ligando Apo-2. Entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores, Saccharomyces cerevisiae, o levadura común, es el que se utiliza con mayor frecuencia. No obstante, para la presente invención se hallan disponibles y son útiles numerosos otros géneros, especies y cepas.

Las células huésped adecuadas para la expresión del ligando Apo-2 glucosilado derivan de organismos pluricelulares. Tales células huésped son capaces de realizar actividades complejas de procesado y glucosilación. En principio, cualquier cultivo celular de eucariotas superiores sirve, independientemente de si procede de un cultivo de vertebrados o de invertebrados. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variedades de baculovirus y las correspondientes células huésped de insecto facultativas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca del vinagre) y Bombyx mori [véase, por ejemplo, Luckow y otros, Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); Miller y otros, en: Genetic Engineering, Setlow y otros, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), págs. 277-279; y Maeda y otros, Nature, 315: 592-594 (1985)]. Hay a disposición pública una variedad de cepas víricas para la transfección, por ejemplo, la variedad L-1 de un NPV de Autographa californica y cepa Bm-5 de un NVP de Bombyx mori, y tales virus pueden utilizarse como los virus de la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda ("Sf9"), descritas en el ejemplo 2.

Los cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Habitualmente, las células vegetales son transfectadas mediante incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual ha sido anteriormente manipulada para que contenga el ADN que codifica el ligando Apo-2. Durante la incubación del cultivo celular vegetal con A. tumefaciens, se transfiere el ADN que codifica el ligando Apo-2 al huésped celular vegetal de modo que éste último es transfectado, y, en las condiciones apropiadas, expresa el ADN que codifica el ligando Apo-2. Además, hay disponibles secuencias reguladoras y señal compatibles con células vegetales, tales como el promotor de la nopalina sintetasa y secuencias señal de poliadenilación [Depicker y otros, J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 (1982)]. Además, los segmentos de ADN aislados de la región en dirección 5' del ADN-T del gen 780 son capaces de activar o aumentar el nivel de transcripción de los genes expresables en vegetales en el tejido vegetal que contiene el ADN recombinante [EP 321.196 publicada el 21 de junio de 1989].

La propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo tisular) también es bien conocida en el estado de la técnica [véase, por ejemplo, Tissue Culture. Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)]. Entre los ejemplos de estirpes celulares de células huésped de mamíferos útiles se incluyen una línea CVI de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una estirpe de riñón embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y otros, J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino/DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células renales de mono (CV I ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO- 76, ATCC CRL-1587); células de cáncer de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MOCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario murino (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y otros, Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; y células FS4.

Las células huésped son transfectadas y preferiblemente transformadas con los vectores de expresión o clonación anteriormente mencionados para la producción de ligando Apo-2 y cultivadas en medios nutritivos convencionales modificados, cuando convenga, para inducir promotores, transformantes de selección o para amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la obtención de un vector de expresión mediante una célula huésped independientemente de que se exprese cualquier secuencia codificante. El experto en la materia conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Generalmente se sabe que la transfección es satisfactoria cuando cualquier indicación de la actividad de este vector tiene lugar dentro de la célula huésped.

Transformación significa introducir ADN en un organismo de modo que el ADN sea replicable, bien como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook y otros, supra, o electroporación es el que se utiliza generalmente para células procariotas u otras células que contienen sustanciales barreras en la pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, tal como se describe en Shaw y otros, Gene, 23: 315 (1983) y en el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden ser transfectadas utilizando un tratamiento de ultrasonidos tal como se describe en el documento WO 91/00358 publicado el 10 de junio de 1991.

En el caso de las células de mamífero, que carecen de tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de la transformación de un sistema de células huésped de mamífero se ha descrito en la patente de EE.UU. US 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se realizan habitualmente según el procedimiento de Van Solingen y otros, J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3.829 (1979). No obstante, para introducir ADN a células, también pueden utilizarse otros procedimientos tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos y células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamíferos, véase Keown y otros, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour y otros, Nature, 336: 348-352 (1988).

4. Cultivo de las células huésped

Las células procariotas utilizadas para producir ligando Apo-2 pueden cultivarse en medios adecuados tal como generalmente se describe en Sambrook y otros, supra.

Las células huésped de mamífero utilizadas para producir ligando Apo-2 pueden cultivarse en una variedad de medios. Entre los ejemplos de medios comercialmente disponibles se incluyen medio Ham F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ("MEM", Sigma), medio RPMI-1640 (Sigma) y medio modificado de Dulbecco ("DMEM", Sigma). Si es necesario puede complementarse cualquier medio de este tipo con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos que en las concentraciones finales suelen hallarse en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente equivalente de energía. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y normalmente serán evidentes para el experto.

En general, los principios, los protocolos y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares de mamíferos pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Las células huésped a las que se ha hecho referencia en esta descripción incluyen las células del cultivo, así como las células que están dentro de un animal huésped.

5. Detección de la amplificación/expresión génica

La amplificación y/o expresión génicas pueden determinarse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de tipo Southern, transferencia de tipo Northern para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5.201-5.205 (1980)], transferencia puntual (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente. Pueden utilizarse varios marcadores, con mayor frecuencia radioisótopos y en particular ^{32}P. No obstante, también pueden emplearse otras técnicas, tal como utilizar nucleótidos modificados con biotina para introducirlos en un polinucleótido. A continuación la biotina sirve como el sitio de unión a la avidina o a anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como radionucleótidos, fluorescentes o enzimas. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer duplicidades específicas, incluidas duplicidades de ADN, duplicidades de ARN, y duplicidades mixtas de ARN-ADN o duplicidades de proteína-ADN. A su vez, los anticuerpos pueden estar marcados y puede llevarse a cabo el análisis en el lugar donde la duplicidad está unida a la superficie, de modo que puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a la duplicidad en la superficie de la formación de la duplicidad.

Alternativamente, la expresión génica puede determinarse mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones tisulares y análisis de cultivo celular o líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de un producto génico. Con técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra celular, habitualmente mediante deshidratación y fijación, seguido de reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico acoplado, en la que los marcadores suelen ser visualmente detectables, como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes y similares.

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el análisis de líquidos de la muestra puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido nativo del ligando Apo-2 o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente o contra una secuencia exógena fusionada al ADN del ligando Apo-2 y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

6. Purificación del polipéptido del ligando Apo-2

El ligando Apo-2 se recupera preferiblemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse de lisados de células huésped cuando es producido directamente sin una señal secretora. Si el ligando Apo-2 está unido a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o puede liberarse su región extracelular mediante escisión enzimática.

Cuando el ligando Apo-2 es producido en una célula recombinante distinta de una célula de origen humano, el ligando Apo-2 carece de proteínas o polipéptidos de origen humano. No obstante, habitualmente es necesario purificar el ligando Apo-2 de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparados que son sustancialmente homogéneos en relación al ligando Apo-2. En una primera etapa, puede centrifugarse el medio de cultivo o lisado para eliminar residuos de partículas celulares. A continuación se purifica el ligando Apo-2 de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, y los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amoníaco; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas Sepharose de proteína A para eliminar contaminantes tales como IgG.

En una realización preferida, puede aislarse el ligando Apo-2 mediante cromatografía de afinidad, tal como se describe en el ejemplo 3.

Las variedades de ligando Apo-2 en las que se han eliminado, insertado o sustituido los residuos, se recuperan del mismo modo que el ligando Apo-2 nativo, teniendo en cuenta cualquier cambio sustancial de las propiedades ocasionado por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de ligando Apo-2 con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bacteriano o vírico, facilita la purificación; puede utilizarse una columna de inmunoafinidad que contiene anticuerpo contra el antígeno para adsorber el polipéptido de fusión. En una realización preferida, se fusiona una secuencia extracelular de ligando Apo-2 con un péptido His_{10} y se purifica mediante cromatografía de afinidad de quelatos Ni^{2+}.

Un inhibidor de la proteasa tal como el fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes fortuitos. Un experto en la materia sabrá apreciar que los procedimientos de purificación adecuados para el ligando Apo-2 nativo pueden requerir modificación para tener en cuenta cambios en el carácter del ligando Apo-2 o en sus variedades en la expresión en cultivo celular recombinante.

7. Modificaciones covalentes de los polipéptidos del ligando Apo-2

Las modificaciones covalentes del ligando Apo-2 se hallan dentro del alcance de la presente invención. Tanto el ligando Apo-2 nativo como las variantes en la secuencia de aminoácidos del ligando Apo-2 pueden modificarse covalentemente. Se introduce un tipo de modificación covalente del ligando Apo-2 en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos dirigidos del ligando Apo-2 con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o con los residuos terminales N o C del ligando Apo-2.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para entrecruzar el ligando Apo-2 con una matriz o superficie de apoyo insoluble en agua que se utilizará en el procedimiento de purificación de anticuerpos anti-ligando Apo-2, y viceversa. Los agentes de entrecruzamiento utilizados con mayor frecuencia son, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-ácido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluidos ésteres disuccinimidil tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar enlaces transversales en presencia de luz. Alternativamente, para inmovilizar las proteínas se utilizan matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de EE.UU. US 3.969.287; US 3.691.016; US 4.195.128; US 4.247.642; US 4.229.537, y US 4.330.440.

Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminil y asparaginil a los residuos correspondientes de glutamil y aspartil, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de seril o treonil, metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas secundarias de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)], acetilación de la amina del extremo terminal N, y amidación de cualquier grupo carboxílico del extremo terminal C. Las formas modificadas de los residuos están dentro del alcance de la presente invención.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido del ligando Apo-2 incluida dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón nativo de glucosilación del polipéptido. Para los propósitos de la presente, "alterar el patrón de glucosilación nativo" significa eliminar una o más partes de carbohidratos halladas en el ligando Apo-2 nativo y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el ligando Apo-2 nativo.

La glucosilación de polipéptidos se halla habitualmente unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión de la parte del carbohidrato a la cadena secundaria de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la parte del carbohidrato a la cadena secundaria de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. Glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxilamino, con mayor frecuencia serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5 hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al polipéptido del ligando Apo-2 puede llevarse a cabo alterando la secuencia de aminoácidos de tal modo que contenga uno o más de las secuencias tripéptidas mencionadas anteriormente (para sitios de glucosilación unida a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia nativa del ligando Apo-2 o sustituyendo con estos mismos residuos uno o más de los residuos de la secuencia nativa (para sitios de glucosilación unida a O). La secuencia de aminoácidos del ligando Apo-2 puede alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, en particular produciendo mutaciones en el ADN que codifica el polipéptido del ligando Apo-2 en bases preseleccionadas tales que generen codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados. Para producir una mutación o mutaciones en el ADN pueden utilizarse los procedimientos descritos anteriormente y en la patente de EE.UU. US 5.364.934, supra.

Otra forma de aumentar el número de partes de carbohidratos en el polipéptido del ligando Apo-2 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dependiendo de la modalidad de acoplamiento utilizada, el glúcido o glúcidos pueden unirse a: (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la fenilalanina, la tirosina, o el triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).

La eliminación de las partes carbohidrato presentes en el polipéptido del ligando Apo-2 puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. Por ejemplo, la desglucosilación química mediante exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente, puede producir la escisión de la mayor parte o de todos los glúcidos excepto el glúcido unido (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras el polipéptido permanece intacto. La desglucosilación química es descrita por Hakimuddin y otros, Arch, Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge y otros, Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de las partes de carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas tal como describen Thotakura y otros, Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).

La glucosilación en posibles sitios de glucosilación puede prevenirse utilizando el compuesto tunicamicina tal como describen Duskin y otros, J. Biol. Chem., 257: 3.105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de uniones proteína-N-glucósido.

Otro tipo de modificación covalente del ligando Apo-2 comprende unir el polipéptido del ligando Apo-2 a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera establecida anteriormente, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. US 4.640.835; US 4.496.689; US 4.301.144; US 4.670.417; US 4.791.192, o US 4.179.337.

8. Ligando Apo-2 etiquetado (tagged) con epítopo

La presente invención también incluye el uso de polipéptidos que comprenden el ligando Apo-2 fusionado con otro polipéptido heterólogo. En una realización, el polipéptido quimérico comprende una fusión del ligando Apo-2 con un polipéptido tag que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-tag. El epítopo tag generalmente se coloca en el extremo amino o carboxilo del ligando Apo-2. La presencia de tales formas etiquetadas (tagged) con epítopo del ligando Apo-2 pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido tag. Asimismo, la provisión del epítopo tag permite purificar fácilmente el ligando Apo-2 mediante purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-tag u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo tag.

Varios polipéptidos tag y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen el polipéptido tag de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field y otros, Mol. Cell. Biol., 8: 2.159-2.165 (1988)]; el tag c-myc y sus anticuerpos 8F9,3C7,6EI 0, G4, B7 y 9E10 [Evan y otros, Molecular and Cellular Biology, 5: 3.610-3.616 (1985)]; y el tag de la glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo [Paborsky y otros, Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos tag incluyen el péptido Flag [Hopp y otros, BioTechnology, 6: 1.204-1.210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin y otros, Science, 255: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de la \alpha-tubulina [Skinner y otros, J. Biol. Chem., 266: 15.163-15.166 (1991)], y el tag del péptido proteínico del gen 10 del T7 [Lutz-Freyermuth y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6.393-6.397 (1990)]. Una vez que se ha seleccionado el polipéptido tag, puede generarse su anticuerpo utilizando las técnicas descritas en la presente.

Generalmente, el ligando Apo-2 etiquetado (tagged) con epítopo puede construirse y producirse según los procedimientos descritos anteriormente para el ligando Apo-2 nativo y sus variantes. Las fusiones polipéptido tag-ligando Apo-2 se construyen preferiblemente fusionando la secuencia de ADNc que codifica la porción del ligando Apo-2 en marco con la secuencia de ADN del polipéptido tag y expresando la construcción de ADN resultante en células huésped apropiadas. Normalmente, cuando se preparan los híbridos polipéptido tag-ligando Apo-2 de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el ligando Apo-2 se fusionará en su extremo 3' con el ácido nucleico que codifica el extremo terminal N polipéptido tag, no obstante las fusiones 5' también son posibles. Ejemplos de ligando Apo-2 etiquetado (tagged) con epítopo se describen con mayor detalle en el ejemplo 2 que aparece a continuación.

El ligando Apo-2 etiquetado (tagged) con epítopo puede purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo anti-tag. La matriz a la cual se une el anticuerpo de afinidad puede ser, por ejemplo, agarosa, cristal de poro controlado o poli(estireno de vinilo)benceno). A continuación, puede eluirse el ligando Apo-2 etiquetado (tagged) con epítopo de la columna de afinidad utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica.

B. Usos terapéuticos del ligando Apo-2

El ligando Apo-2, tal como se describe en la presente memoria, puede utilizarse terapéuticamente para inducir apoptosis en células de mamífero para tratar el cáncer. Generalmente, los usos médicos que implican la inducción de apoptosis en células de mamífero comprenden exponer las células a una cantidad efectiva de ligando Apo-2. Esto puede realizarse in vivo o ex vivo según, por ejemplo, los procedimientos que se describen a continuación y en los ejemplos. Se contempla la posibilidad de que puedan utilizarse los procedimientos para inducir apoptosis en terapias para tratar el cáncer. La aplicación terapéutica del ligando Apo-2 en el tratamiento del cáncer se describe con mayor detalle a continuación.

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En los usos médicos para tratar el cáncer, se administra ligando Apo-2 a un mamífero al que se ha diagnosticado cáncer. Evidentemente se contempla la posibilidad de que el ligando Apo-2 pueda utilizarse combinado incluso con otros compuestos y técnicas terapéuticos, incluidos otros agentes inductores de apoptosis, quimioterapia, radioterapia y cirugía.

El ligando Apo-2 se administra preferiblemente al mamífero en un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.ª ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y otros. Habitualmente, en la formulación se utiliza una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para que la formulación sea isotónica. Entre los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,8. Para los expertos en la materia será evidente que determinados portadores pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración del ligando Apo-2 que se administra.

El ligando Apo-2 puede administrarse al mamífero mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular), o mediante otros procedimientos tales como infusión que asegura su eficaz administración al torrente circulatorio. También se contempla que el ligando Apo-2 pueda administrarse mediante terapia génica in vivo o ex vivo.

La pauta posológica efectiva para la administración de ligando Apo-2 puede determinarse empíricamente, y hacer tales determinaciones forma parte de la experiencia en la materia. Actualmente se cree que una dosis o cantidad eficaz de ligando Apo-2 que se administra sola puede oscilar entre aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más por día. La gradación de dosis en las distintas especies puede realizarse en un modo conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, tal como se describe en Mordenti y otros, Pharmaceut, Res., 8: 1.351 (1991). Los expertos en la materia comprenderán que la dosis de ligando Apo-2 que debe administrarse variará dependiendo, por ejemplo, del mamífero que recibirá el ligando Apo-2, la vía de administración y de los otros fármacos o terapias administrados al mamífero.

Entre las terapias administradas al mamífero pueden incluirse, pero no exclusivamente, quimioterapia y/o radioterapia, inmunoadyuvantes, citocinas y terapias basadas en anticuerpos. Entre los ejemplos se incluyen interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6), factor inhibidor de la leucemia, interferones, TGF-beta, eritropoyetina, trombopoyetina, anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo HER-2. También pueden utilizarse otros agentes que se sabe que inducen apoptosis en células de mamífero, y entre tales agentes se incluyen TNF-\alpha, TNF-\beta (linfotoxina-\alpha), ligando CD30, ligando 4-1BB y ligando Apo-1.

Entre las quimioterapias contempladas por la invención se incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en el estado de la técnica y que se hallan comercialmente disponibles, tales como doxorrubicina, 5-fluorouracilo ("5-FU"), etopósido, camptotecina, leucovorina, arabinósido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino. Para la preparación y dosificación de tal quimioterapia pueden seguirse las instrucciones de los fabricantes o tal como ha sido determinado empíricamente por el médico experto en la materia. La preparacion y dosificación de tal quimioterapia también se describe en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

La quimioterapia se administra preferiblemente en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como los que se han descrito anteriormente para el ligando Apo-2. El modo de administración de la quimioterapia puede ser el mismo que el utilizada para el ligando Apo-2 o ésta puede administrarse al mamífero de un modo distinto. Por ejemplo, el ligando Apo-2 puede inyectarse aunque la quimioterapia se administre oralmente al mamífero. Los modos de administrar quimioterapia en combinación con el ligando Apo-2 se describen con mayor detalle en los ejemplos 9-12 posteriores.

La radioterapia puede administrarse al mamífero según protocolos utilizados con frecuencia en la técnica y conocidos por el experto en la materia. Tal terapia puede incluir radiación de cesio, de iridio, de yodo, o de cobalto. La radioterapia puede ser irradiación completa del cuerpo, o puede dirigirse localmente a un sitio o tejido específico del cuerpo. Habitualmente, la radioterapia se administra en pulsos durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. No obstante, la radioterapia puede administrarse durante períodos de tiempo más largos. Opcionalmente, la radioterapia puede administrarse como una única dosis o como múltiples dosis secuenciales.

La administración al mamífero de ligando Apo-2 y de una o más terapias distintas puede ser simultánea o secuencial. Tras administrar al mamífero ligando Apo-2 y una o más terapias distintas, puede controlarse el cáncer y el estado fisiológico del mamífero de diversas maneras bien conocidas para el médico experto en la materia. Por ejemplo, puede observarse masa tumoral físicamente, mediante biopsia o mediante técnicas de rayos x normales.

Está contemplada la utilización de ligando Apo-2 para tratar células cancerosas ex vivo. Dicho tratamiento ex vivo puede ser de utilidad en el trasplante de médula ósea y en particular, en el trasplante autólogo de médula ósea. Por ejemplo, puede utilizarse el tratamiento de células, tejido o tejidos, que contengan células cancerosas con ligando Apo-2, y opcionalmente, con una o más terapias distintas, tal como se ha descrito anteriormente, para inducir apoptosis y reducir sustancialmente las células cancerosas antes del trasplante a un mamífero receptor.

Las células o el tejido o tejidos que contienen células cancerosas se obtienen en primer lugar de un mamífero donante. Las células o tejido o tejidos pueden obtenerse quirúrgicamente y, preferiblemente, se obtienen de manera aséptica. En el procedimiento de tratar médula ósea para trasplante, la médula ósea se obtiene del mamífero mediante aspiración con aguja. Las células o tejido o tejidos que contienen células cancerosas son tratadas a continuación con ligando Apo-2, y opcionalmente, con una o más terapias distintas, tales como las descritas anteriormente. La médula ósea se fracciona preferiblemente para obtener una fracción celular mononuclear (tal como mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll) antes del tratamiento con ligando Apo-2.

Las células o tejido o tejidos tratados pueden infundirse o trasplantarse a continuación a un mamífero receptor. El mamífero receptor puede ser el mismo sujeto que el mamífero donante o puede ser otro mamífero heterólogo. Para un trasplante autólogo de médula ósea, se trata al mamífero antes del trasplante con una dosis eficaz de radiación o quimioterapia tal como se conoce en el estado de la técnica y se describe por ejemplo en Autologous Bone Marrow Transplantation: Proceedings of the Third International Symposium, Dicke y otros, eds., University of Texas M.D. Anderson Hospital and Tumor Institute (1987).

C. Usos no terapéuticos del ligando Apo-2

El ligando Apo-2 también es útil para aplicaciones no terapéuticas. Pueden utilizarse las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el ligando Apo-2 como diagnóstico para la tipificación tisular específica. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos tales como la hibridación in situ, la transferencia Northern y la transferencia Southern, y el análisis PCR para determinar si el ADN y/o ARN que codifica el ligando Apo-2 está presente en el tipo, o tipos, celular evaluado. El ácido nucleico del ligando Apo-2 también será útil para la preparación de polipéptido Apo-2 mediante técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

Puede utilizarse el ligando Apo-2 aislado en análisis diagnósticos cuantitativos como control frente al cual pueden prepararse muestras que contengan cantidades desconocidas de ligando Apo-2. Los preparados de ligando Apo-2 también son útiles para generar anticuerpos, como referencias en análisis de ligando Apo-2 (por ejemplo, marcando ligando Apo-2 para utilizarlo como referencia en un radioinmunoanálisis, un análisis radiorreceptor, o en un enzimoinmunoanálisis), en técnicas de purificación por afinidad, por ejemplo, al identificar o aislar un receptor que se une al ligando Apo-2, y en análisis de unión de tipo competitivo al receptor cuando se ha marcado, por ejemplo, con yodo radioactivo, enzimas, o fluoróforos.

Los ácidos nucleicos que codifican el ligando Apo-2 también pueden utilizarse para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y el cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual transgén fue introducido en el animal o en un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que se halla integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se crea un animal transgénico. En una realización, puede utilizarse el ADNc que codifica el ligando Apo-2 o una secuencia apropiada del mismo para clonar ADN genómico que codifica ligando Apo-2 según las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contengan células que expresen ADN que codifica ligando Apo-2. Los procedimientos para generar animales transgénicos, en particular animales tales como ratones o ratas, han pasado a ser convencionales en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. US 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, se identificarían células particulares para la incorporación de un transgén de ligando Apo-2 con potenciadores tisulares específicos. Pueden utilizarse animales transgénicos, que incluyen una copia de un transgén que codifica ligando Apo-2 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria, para analizar el efecto del aumento en la expresión de ADN que codifica ligando Apo-2.

Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no humanos de ligando Apo-2 para construir un animal "knock out" para ligando Apo-2 que presenta un gen defectuoso o alterado que codifica ligando Apo-2 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el ligando Apo-2 y el ADN genómico alterado que codifica el ligando Apo-2 introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse el ADNc que codifica el ligando Apo-2 para clonar ADN genómico que codifica ligando Apo-2 según las técnicas establecidas. Puede eliminarse una parte del ADN genómico que codifica ligando Apo-2, o sustituirse por otro gen, tal como un gen que codifique un marcador seleccionable que pueda utilizarse para controlar la integración. Habitualmente, en el vector se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante sin alterar (ambos en los extremos 5' y 3') [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. Se introduce el vector en una estirpe de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [véase por ejemplo, Li y otros, Cell, 69: 915 (1992)]. A continuación, se inyectan las células seleccionadas en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152]. A continuación puede implantarse un embrión quimérico a una hembra de acogida seudopreñada adecuada y llevar el embrión a término para crear un animal "knock out". Puede identificarse la descendencia que contiene ADN recombinado homólogamente en sus células germinales mediante técnicas estándar y utilizadas para criar animales en los que todas las células del animal contengan el ADN recombinado homólogamente. Los animales knockout pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defensa ante determinadas enfermedades patológicas y por la aparición en los mismos de enfermedades patológicas debidas a la ausencia del polipéptido de ligando Apo-2.

D. Preparación de anticuerpos anti-ligando Apo-2

Pueden prepararse anticuerpos contra el ligando Apo-2 tal como sigue. Entre los anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos de ligando Apo-2 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden ser cultivados en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará al mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido del ligando Apo-2 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero al que se inmuniza. Entre los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas que pueden utilizarse se incluyen pero no exclusivamente hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soja. También puede utilizarse un agente agregante tal como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria del mamífero. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse se incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trealosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por cualquier experto en la materia. A continuación, puede sacarse sangre al mamífero y analizar el suero en busca de titulación de anticuerpos. Si se desea, puede volverse a inmunizar al mamífero hasta que aumente la titulación de anticuerpos o hasta que alcance una meseta.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos de ligando Apo-2 pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, habitualmente se inmuniza (tal como se ha descrito anteriormente) a un ratón, un hámster, u otro animal huésped apropiado, con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.

El agente inmunizante habitualmente incluirá el polipéptido del ligando Apo-2 o una proteína de fusión del mismo. También puede utilizarse una célula que exprese el ligando Apo-2 en su superficie. Generalmente, se utilizan bien linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o células del bazo o células de los nódulos linfáticos si se desean fuentes mamíferas no humanas. A continuación se fusionan los linfocitos con una estirpe celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Anticuerpos: Principles and Practice, Academi Press, (1986) págs. 59-103]. Las estirpes celulares inmortalizadas suelen transformarse en células de mamífero, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Normalmente, se utilizan estirpes celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), las cuales sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las estirpes celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, mantienen un nivel elevado y estable de expresión de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Son estirpes celulares inmortalizadas más preferidas las estirpes de mieloma murino, que pueden adquirirse, por ejemplo, en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito estirpes celulares de heteromieloma ratón-humano y de mieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Imnnunol., 133: 3.001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) págs. 51-63].

A continuación puede analizarse el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma en busca de la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el ligando Apo-2. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma se determina preferiblemente mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA), separación de células activadas con fluoresceína (FACS) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Tales técnicas y análisis son conocidos en el estado de la técnica, y además se describen en los ejemplos que aparecen a continuación. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Rodbard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Una vez identificadas las células deseadas del hibridoma, pueden subclonarse los clones limitando el procedimiento de dilución y crecimiento mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo, medio modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados del medio de cultivo o líquido ascítico mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, Sepharose de proteína A, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden crearse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de EE.UU. US 4.816.567. Puede aislarse y secuenciarse fácilmente el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, puede colocarse el ADN en vectores de expresión, que a continuación son transfectados a células huésped tales como células COS de simio, células ováricas de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. También puede modificarse el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [patente de EE.UU. US 4.816.567; Morrison y otros, supra] o mediante la unión covalente de toda la secuencia codificante de la inmunoglobulina o de parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto de la inmunoglobulina. Dicho polipéptido distinto de la inmunoglobulina puede ser sustituido en los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido en los dominios variables de un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada generalmente está truncada en cualquier punto de la región Fc para evitar la formación de enlaces transversales entre las cadenas. Alternativamente, los residuos relevantes de cisteína son sustituidos por otro residuo de aminoácido o son eliminados para evitar la formación de enlaces transversales.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede llevarse a cabo utilizando técnicas habituales conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, la digestión puede realizarse utilizando papaína. Se describen ejemplos de digestión papaínica en el documento WO 94/29348 publicado el 22/12/94 y la patente de EE.UU. US 4.342.566. La digestión papaínica de anticuerpos habitualmente produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de fusión al antígeno y que aún es capaz de formar enlaces transversales con el antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada entre los que se incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para un Fab' en el que el residuo de cisteína o cisteínas de los dominios constantes lleva un grupo tiol libre. Los fragmentos
F(ab')_{2} de los anticuerpos originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

3. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos de ligando Apo-2 de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F (ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo de donante) tal como un ratón, una rata o un conejo que presenta la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de entramado Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias de entramado. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo el contenido de por lo menos un dominio variable, y habitualmente de dos, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima por lo menos una parte de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones y otros, Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann y otros, Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el estado de la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado contiene uno o más residuos de aminoácidos procedentes de una fuente que no es humana. A menudo se hace referencia a estos residuos de aminoácidos no humanos como residuos de "importación", que habitualmente se obtienen de un dominio variable "de importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y otros, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239: 1.534-1.536 (1988)] y el procedimiento de Queen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 10.029-10.033 (1989) utilizando modelado informático, sustituyendo las CDR de roedor o las secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por lo tanto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. US 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano e intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. A la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizarlos en la síntesis de anticuerpos humanizados es importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento "mejor ajustado", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda una genoteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. A continuación se acepta la secuencia humana más cercana a la de un roedor como la región de entramado (FR) humana para el anticuerpo humanizado [Sims y otros, J. Immunol., 151: 2.296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. Otro procedimiento utiliza una región de entramado particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse la misma región de entramado para distintos anticuerpos humanizados [Carter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4.285 (1992); Presta y otros, J. Immunol., 151: 2.623 (1993)].

Además es importante que los anticuerpos se humanicen conservando una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y de varios productos conceptuales humanizados que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina se hallan con frecuencia disponibles y son conocidos por los expertos en la materia. Hay disponibilidad de programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas seleccionadas de interés. La exploración de estas estructuras permite analizar el probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de interés de la inmunoglobulina, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina de interés para unirse a su antígeno. De este modo, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de la secuencia consenso y la secuencia de importación de modo que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como un aumento de la afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos CDR se hallan implicados directamente y más sustancial-
mente en cómo influyen en la unión al antígeno [véase, documento WO 94/04679 publicado el 3 de marzo de 1994].

Pueden utilizarse animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un amplio repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (J_{H}) del anticuerpo en ratones quiméricos y con mutaciones germinales es causa de una inhibición total de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la serie de genes de la inmunoglobulina germinal humana en tales ratones con mutaciones germinales dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígenos [véase, por ejemplo, Jakobovits y otros, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 90: 2.551-255 (1993); Jakobovits y otros, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immuno., 7: 33 (1993)]. También pueden producirse anticuerpos humanos en genotecas fágicas [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cote y otros y Boerner y otros también se hallan disponibles para la preparación de anticuerpos humanos monoclonales (Cote y otros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner y otros, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidad para unirse por lo menos a dos antígenos distintos. En el caso presente, hay especificidad de unión por el ligando Apo-2 y por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína de la superficie celular, por un receptor o por una subunidad de un receptor.

Los procedimientos para sintetizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en el estado de la técnica. Tradicionalmente, la producción de anticuerpos biespecíficos recombinantes se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas ligeras/cadenas pesadas de la inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades distintas [Millstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. A causa de la distribución aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla posible de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta normalmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y otros, EMBO J., 10: 3.655-3.659 (1991).

Según una estrategia distinta y más preferida, los dominios variables del anticuerpo con la especificidad de unión deseada (sitios de unión anticuerpo-antígeno) son fusionados a secuencias de los dominios constantes de la inmunoglobulina. La unión tiene lugar, preferiblemente, con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, y las regiones CH2 y CH3. Se prefiere que tenga la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para unirse a la cadena ligera en por lo menos una de las uniones. Los ADN que codifican las uniones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de la inmunoglobulina, están insertados en vectores de expresión separados, y son cotransfectados a un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan la producción óptima. No obstante, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado una producción elevada o cuando las proporciones no tienen una significancia particular. En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena pesada/cadena ligera de una inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones no deseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690 publicado el 3 de marzo de 1994. Para más detalles sobre cómo generar anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y otros, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se hallan dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos para dirigir células del sistema inmunitario contra células no deseadas [patente de EE.UU. US 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [documento WO 91/00360; documento WO 92/200373; EP 03089]. Está contemplado preparar los anticuerpos in vitro utilizando procedimientos en química de síntesis de proteínas, incluidos aquellos que implican agentes entrecruzadores. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. US 4.676.980.

E. Usos de los anticuerpos de ligando Apo-2

Los anticuerpos de ligando Apo-2 pueden utilizarse en análisis diagnósticos para el ligando Apo-2, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Pueden utilizarse diversas técnicas de análisis diagnósticos conocidas en el estado de la técnica, tales como análisis de unión competitiva, análisis "sándwich" directos o indirectos y análisis de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas o en fases homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) págs. 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los análisis diagnósticos pueden estar marcados con una parte detectable. La parte detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la parte detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Para conjugar el anticuerpo con la parte detectable, puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica, incluidos aquellos procedimientos descritos por Hunter y otros, Nature, 144: 945 (1962); David y otros, Biochemistry, 13: 1.014 (1974); Pain y otros, J. Immunol, Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982).

Los anticuerpos de ligando Apo-2 también son útiles para la purificación mediante afinidad de ligando Apo-2 de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este proceso, se inmovilizan los anticuerpos contra ligando Apo-2 en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o un papel de filtro, utilizando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. A continuación se pone el anticuerpo inmovilizado en contacto con una muestra que contiene el ligando Apo-2 que hay que purificar, y después se limpia el soporte con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto el ligando Apo-2, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Por último, se lava el soporte con otro solvente adecuado que liberará el ligando Apo-2 del anticuerpo. Los anticuerpos de ligando Apo-2 también son útiles para la purificación mediante afinidad de un receptor Apo-2 solubilizado o para la expresión de clonación de un receptor Apo-2.

Los anticuerpos descritos en la presente invención también pueden utilizarse como tratamiento. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos anti-ligando Apo-2 que bloqueen la actividad del ligando Apo-2 (como la apoptosis inducida por ligando Apo-2) para tratar enfermedades patológicas o enfermedades asociadas con una mayor apoptosis [véase, Thompson, supra].

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos y no pretenden de ningún modo limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos

Todas las enzimas de restricción a las que se hace referencia en los ejemplos se obtuvieron en New England Biolabs y se utilizaron según las instrucciones del fabricante. Todos los demás reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del fabricante a no ser que se indicara de otro modo. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria, por números de adquisición ATCC es la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc que codifica ligando Apo-2 humano

Para aislar un ADNc en toda su longitud para ligando Apo-2, se cribó una genoteca de fago lambda gtl I de ADNc de placenta humana (aproximadamente 1 x 10^{6} clones) (HL 10756, comercialmente disponible en Clontech) mediante hibridación con sondas sintéticas de oligonucleótidos basadas en una secuencia EST (GenBank locus HHEA47M), que mostraban cierto grado de homología con el ligando Fas/Apo-1 humano. La secuencia EST de HHEA47M consta de 390 pb y cuando se traduce en su marco +3, muestra 16 identidades hasta una región de 34 aminoácidos de ligando Apo-1 humano. La secuencia de HHEA47M es la siguiente:

1

En el cribado, se utilizó una sonda de oligonucleótidos de 60 pb con la siguiente secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

TGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGT

\;

SEC ID N.º: 4

\vskip1.000000\baselineskip

La hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a temperatura ambiente en un tampón que contenía formamida al 20%, 5X SSC, sulfato de dextrano al 10%, NaPiPO_{4} al 0,1%, NaPO_{4} 0,05 M, 0,05 mg de ADN de esperma de salmón y sodio dodecilo sulfato al 0,1 %, seguido de varios lavados a 42ºC en 5X SSC, y a continuación en 2X SSC. En la genoteca de ADNc, se identificaron doce clones positivos y los clones positivos se volvieron a cribar mediante hibridación con una segunda sonda de oligonucleótidos de 60 pb (sin superponerse a la primera sonda) que tenía la siguiente secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

GGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGA

\;

SEC ID N.º: 5

\vskip1.000000\baselineskip

La hibridación se realizó como se ha descrito anteriormente.

Se identificaron cuatro clones positivos y se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PRC) utilizando un cebador basado en la secuencia del vector contiguo a 5' y añadiendo un sitio externo de restricción ClaI y un cebador basado en la secuencia del vector contiguo a 3' y añadiendo un sitio externo de restricción HindIII. Los productos PCR fueron purificados en gel y subclonados en pGEM-T (comercialmente disponible en Promega) mediante ligación T-A. A continuación se sometieron tres clones independientes de distintas PCR a secuenciación didesoxi-ADN. El análisis de secuencia de ADN de estos clones demostró que éstos eran esencialmente idénticos, con alguna variación de longitud en la región 5'.

La secuencia de nucleótidos de la región codificante del ligando Apo-2 se muestra en la figura 1A. La secuenciación de la región situada después del extremo 3' de uno de los clones reveló un sitio de poliadenilación característico (datos no representados). El ADNc contenía un largo marco abierto de lectura con un sitio de iniciación asignado al codón ATG en las posiciones 91-93 de los nucleótidos. La secuencia circundante a este sitio coincide de manera razonable con la secuencia consenso propuesta para los sitios de iniciación [Kozak, J. Cell. Biol., 115: 887-903 (1991)]. El marco abierto de lectura termina en el codón de finalización TAA en las posiciones 934-936 de los nucleótidos.

La secuencia de aminoácidos madura predicha del ligando Apo-2 humano contiene 281 aminoácidos y tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 32,5 kDa y un punto isoeléctrico de aproximadamente 7,63. No hay secuencia señal aparente en el extremo terminal N, aunque el análisis de hidropatía (datos no representados) indicaba la presencia de una región hidrófoba entre los residuos 15 y 40. La ausencia de una secuencia señal y la presencia de una región hidrófoba interna sugiere que el ligando Apo-2 es una proteína transmembrana de tipo II. Las regiones citoplasmática, transmembrana y extracelular supuestamente existentes son de 14, 26 y 241 aminoácidos de longitud, respectivamente. La región transmembrana supuestamente existente aparece subrayada en la figura 1A. Un posible sitio de glucosilación unido a N se localiza en el residuo 109 en el dominio extracelular supuestamente existente.

Una alineación (utilizando el programa informático Align^{TM}) de la secuencia de aminoácidos de la región terminal C del ligando Apo-2 con otros miembros conocidos de la familia de las citocinas TNF mostró que, dentro de la región terminal C, el ligando Apo-2 muestra un 23,2% de identidad con el ligando Apo-1 (figura 1B). El análisis de alineación mostró un menor grado de identidad con otros miembros de la familia del TNF: CD40L (20,8%), LT-\alpha (20,2%), LT-\beta (19,6%), TNF-\alpha (19,0%), CD30L y CD27L (15,5%), OX-40L (14,3%) y 4-1BBL (13,7%). En la familia del TNF de las citocinas, los residuos dentro de las regiones que se ha pronosticado que formarán cadenas \beta, basadas en las estructuras cristalinas del TNF-\alpha y LT-\alpha [Eck y otros, J. Bio. Chem., 264: 17.595-17.605 (1989); Eck y otros, J. Bio. Chem., 267: 2.119-2.122 (1992)], tienden a estar mucho más preservados con otros miembros de la familia del TNF que los residuos de las asas de conexión predichos. Se observó que el ligando Apo-2 muestra mayor homología con otros miembros de la familia del TNF en la regiones supuestamente existentes de la cadena \beta, comparado con la homología en las asas de conexión predichas. Asimismo, el asa que conecta las cadenas \beta, B y B', supuestamente existentes, es notablemente mayor en el ligando Apo-2.

Ejemplo 2 Expresión de ligando Apo-2 humano A. Construcción de fusión de un ADNc en toda su longitud

Se construyó el ADNc del ligando Apo-2 en toda su longitud fusionado a un epítopo tag myc tal como sigue. El inserto de ADNc del ligando Apo-2 fue escindido del plásmido del ligando Apo-2 paterno pGEM-T (descrito en el ejemplo 1) mediante digestión con Clal y HindIII, y se insertó en un plásmido pRK5 de expresión en mamíferos [Schall y otros, Cell, 61: 361-370 (1990); Suva y otros, Science, 237: 893-896 (1987)], que se digirió con las mismas enzimas de restricción. A continuación se insertó una secuencia codificante de un epítopo tag myc de 13 aminoácidos: Ser Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn SEC ID N.º: 6, [Evan y otros, Mol. Cell. Biol., 5: 3.610-3.616 (1985)] entre el codón 281 y el codón de terminación (codón 282) en el extremo 3' de la secuencia que codifica el ligando Apo-2 mediante mutagénesis dirigida contra oligonucleótidos [Zoller y otros, Nucleic Acids Res., 10: 6.487-6.496 (1982)] para proporcionar un plásmido pRK5-ligando Apo-2 myc.

El plásmido pRK5-ligando Apo-2 myc fue cotransfectado a células 293 humanas (ATCC CRL 1573) con un plásmido pRK5 portador de un gen de resistencia a neomicina, mediante precipitación de fosfato de calcio. Los clones estables que expresan myc del ligando Apo-2 fueron seleccionados por su capacidad de crecer en un medio 50% HAM F12/50% DMEM (GIBCO) en presencia del antibiótico G418 (0,5 mg/ml) (GIBCO).

Para investigar la topología del ligando Apo-2, se analizó un clon resistente a G418 mediante FACS después de teñir con anticuerpo monoclonal (mAb) anti-myc el clon 9E10 [Evan y otros, supra; comercialmente disponible en Oncogene Science) seguido de anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con ficoeritrina (PE) (comercialmente disponible en Jackson ImmunoResearch). El análisis FACS reveló un desplazamiento positivo específico en la tinción en el clon transfectado con ligando Apo-2-myc en comparación con células con transfección simulada (figura 1C), mostrando que el ligando Apo-2 se expresa en la superficie de las células, con el extremo carboxílico expuesto. Por lo tanto, se cree que el ligando Apo-2 es una proteína transmembrana de tipo II.

B. Construcciones de fusión de ECD

Se prepararon dos construcciones solubles de fusión del dominio extracelular ("ECD") del ligando Apo-2, en las que se fusionó otra secuencia en dirección 5' de la región del extremo terminal C del ligando Apo-2.

En una construcción, se fusionaron 27 aminoácidos del péptido señal de la glucoproteína D ("gD") del virus del herpes [descrito en Lasky y otros, ADN, 3: 23-29 (1984); Pennica y otros, Proc. Natl Acad. Sci., 92: 1.142-1.146 (1995); Paborsky y otros, Protein Engineering, 3: 547-553 (1990)] y una secuencia epítopo tag:

2

en dirección 5' a los codones 114-281 del ligando Apo-2 dentro de un plásmido pRK5 de expresión en mamíferos. En resumen, la secuencia gD se amplificó a partir de un plásmido paterno, pCHAD (Genentech, preparado sustancialmente tal como se describe en Lasky y otros, Science, 233: 209-212 (1986)), en una PCR en la que el cebador 3' era complementario a la región 3' de la secuencia gD así como a los codones 114-121 del ligando Apo-2. El producto se utilizó como cebador 5' junto con un cebador 3' complementario al extremo 3' de la región codificante del ligando Apo-2 en una PCR subsiguiente en la que se utilizó como patrón el plásmido pRK5 del ligando Apo-2. A continuación, se subclonó el producto resultante, que codifica la fusión ECD-ligando Apo-2-gD, en un plásmido pRK5 para proporcionar el plásmido pRK5-ECD ligando Apo-2-gD.

Las células renales embrionarias humanas 293 (ATCC CRL 1573) se transfectaron transitoriamente con el plásmido pRK5 ECD-ligando Apo-2-gD o con el pRK5, mediante precipitación con fosfato de calcio. La expresión de proteína soluble de ligando Apo-2-gD fue evaluada mediante marcado metabólico de las células transfectadas con ^{35}S-Cys y ^{35}S-Met. El sobrenadante celular se recogió a las 24 horas y se aclaró mediante centrifugación. Para la inmunoprecipitación, se incubaron 5 ml de sobrenadante con anticuerpo monoclonal anti-gD 5B6 (Genentech) a 1 \mug/ml durante toda la noche a 4ºC. A continuación, se añadieron 25 \mul de Pansorbin (Sigma) durante otra hora a 4ºC. Se sometieron los tubos a centrifugación, se lavó el sedimento celular con PBS y se hirvieron en tampón de muestra SDS durante 5 minutos. Las muestras hervidas volvieron a centrifugarse y el sobrenadante se sometió a SDS-PAGE y autorradiografía.

La inmunoprecipitación con anticuerpo anti-gD reveló tres bandas proteicas predominantes en los sobrenadantes de las células transfectadas con el plásmido ligando Apo-2-gD (figura 1E). Estas bandas migraron con masas moleculares relativas (Mr) de 23, 48 y 74 kDa. El peso molecular calculado del polipéptido maduro gD-Apo-2 es de aproximadamente 22,5 kDa; de ahí que las bandas observadas puedan representar formas monoméricas (23 kDa), diméricas (48 kDa) y triméricas (74 kDa) de la proteína de fusión, e indicar que el ligando Apo-2 puede expresarse como una proteína de fusión gD soluble secretada en células de mamífero.

En una segunda construcción, se fusionó una secuencia Met Gly His_{10} (derivada del plásmido pET19B, Novagen), seguida de un sitio de escisión de enteroquinasa de 12 aminoácidos:

\vskip1.000000\baselineskip

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met

\;

SEC ID N.º: 8

\vskip1.000000\baselineskip

en dirección 5' a los codones 114-281 del ligando Apo-2 dentro de un plásmido de expresión de baculovirus (pVL1392, Pharmingen). En resumen, se amplificó la región 114-281 del codón del ligando Apo-2 mediante PCR del plásmido pRK5 del ligando Apo-2 paterno (descrito en el ejemplo 1) con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3' que incorporan los sitios de restricción contiguos NdeI y BamHI respectivamente. El producto se subclonó en pGEM-T (Promega) mediante unión T-A, y se confirmó la secuencia de ADN. A continuación se escindió el inserto mediante digestión con NdeI y BamHI y se subclonó en el vector de expresión de baculovirus modificado pVL1392 (comercialmente disponible en Pharmingen) que contiene un tag aminoterminal Met Gly His_{10} y un sitio de escisión de la enteroquinasa.

El baculovirus recombinante se generó mediante cotransfección del plásmido ECD-Apo-2-His_{10} y ADN de virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible en GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de la incubación a 28ºC, se recogieron los virus liberados y se utilizaron para otras amplificaciones. La infección vírica y la expresión proteínica se realizaron tal como describieron O'Reilley y otros, Baculovirus expresión vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994). La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad con quelatos Ni^{2+}, tal como se describe en el ejemplo 3 que aparece a continuación.

Ejemplo 3 Purificación de ligando Apo-2 humano recombinante

Se prepararon extractos a partir de células Sf9 con transfección simulada e infectadas con virus recombinantes (véase ejemplo 2, apartado B anterior) tal como describieron Rupert y otros, Nature, 362: 175-179 (1993). En resumen, se lavaron las células Sf9, se resuspendieron en un tampón ultrasónico (25 ml Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se homogeneizaron con ultrasonidos dos veces durante 20 segundos en hielo. El homogeneizado se purificó mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluyó 50 veces en un tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se preparó una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible en Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lavó con 25 ml de agua y se equilibró con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se cargó en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lavó con tampón de carga hasta que se recuperó el estado inicial A_{280}, en cuyo momento se inició la obtención de fracciones. A continuación, se lavó la columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), el cual eluyó la proteína unida no específicamente. Después de alcanzar de nuevo el estado inicial A_{280}, se puso a punto la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogieron fracciones de un ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia de tipo western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían la proteína ligando Apo-2-His_{10} eluidas fueron agrupadas y dializadas frente al tampón de carga.

Se repitió un procedimiento idéntico con células Sf9 con transfección simulada como material de inicio y las mismas fracciones fueron agrupadas, dializadas y utilizadas como control para el Apo-2 humano purificado.

El análisis SDS-PAGE de la proteína purificada reveló una banda predominante Mr de 24 kDa, que se correspondía con el peso molecular calculado de 22,4 kDa para el monómero ligando Apo-2-His_{10} (figura 1D, columna 3); el microanálisis de la secuencia de proteínas (datos no representados) confirmó que la banda de 24 kDa representa el polipéptido del ligando Apo-2-His_{10}. También se observaron bandas menores de 48 kDa y 66 kDa, y probablemente representan homodímeros y homotrímeros solubles del ligando Apo-2. El entrecruzamiento químico del ligando Apo-2-His_{10} purificado mediante incubación con sulfo-NHS (5 mM) (Pierce Chemical) y EDC (Pierce Chemical) a 25 mM y 50 mM (figura 1D, columnas 1 y 2, respectivamente), desplazó la proteína principalmente a la banda de 66 kDa . Estos resultados indican que la forma predominante del ligando Apo-2 en disolución es homotrimérica y que estos trímeros se disocian en dímeros y monómeros en presencia de SDS.

Ejemplo 4 Actividad apoptósica de ligando Apo-2 en estirpes celulares linfocíticas humanas

La actividad apoptósica del ligando Apo-2 soluble y purificado (descrito en el ejemplo 3) fue analizada utilizando varias estirpes celulares linfocíticas humanas. En un primer estudio, se analizó el efecto del ligando Apo-2 en células 9D (Genentech, Inc.), derivadas de células B de sangre periférica humana transformada con virus de Epstein-Barr (EBV). Las células 9D (5 x 10^{4} células/pocillo en medio RPMI 1640 más suero fetal de ternera al 10%) se incubaron durante 24 horas bien en un medio de control, ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado como se describe en el ejemplo 3 anterior), o con anticuerpo monoclonal anti-Apo-1, CH11 (1 \mug/ml) [descrito por Yonehara y otros, J. Exp. Med., 169: 1.747-1.756 (1989); comercialmente disponible en Medical and Biological Laboratories Co.]. El anticuerpo CH11 anti-Apo-1 es un anticuerpo agonista que emula la actividad de Fas/ligando Apo-1.

Tras la incubación, se recogieron las células en citospin sobre un portaobjetos de cristal, y se fotografiaron bajo un microscopio de luz invertida. Tanto el ligando Apo-2 como el anticuerpo monoclonal anti-Apo indujeron un efecto apoptósico similar, caracterizado por condensación citoplasmática y reducción del número de células (véase figura 2A).

Además, se analizaron mediante FACS los efectos del ligando Apo-2 sobre células 9D, así como sobre células Raji (estirpe celular B del linfoma de Burkitt humano, ATCC CCL 86) y células Jurkat (estirpe celular de la leucemia aguda de células T humana, ATCC TIB 152). El análisis FACS se llevó a cabo utilizando criterios establecidos para la muerte celular apoptósica, es decir, en relación con la tinción de fluorescencia de las células con dos marcadores: (a) colorante de yoduro de propidio ("PI"), que tiñe las células apoptósicas pero no las células vivas, y (b) un derivado fluorescente de la proteína, anexina V, que se une a la fosfatidilserina humana hallada en la superficie de las células apoptósicas, pero no en células vivas [Darzynkiewicz y otros, Methods in Cell Biol., 41: 15-38 (1994); Fadok y otros, J. Immunol., 148: 2.207-2.214 (1992); Koopman y otros, Blood, 84: 1.415-1.420 (1994)].

Las células 9D (figura 2B), las células Raji (figura 2C) y las células Jurkat (figura 2D) se incubaron (1 x 10^{6} células/pocillo) durante 24 horas en un medio de control (cuadros de la izquierda), en un medio con ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se describe en el ejemplo 3) (cuadros centrales), o en un medio con anticuerpo CH11 anti-ligando Apo-1 (1 \mug/ml) (cuadros de la derecha). A continuación se lavaron las células, se tiñeron con PI y con anexina V conjugada con tiocianato de fluoresceína (FITC) (adquirida en Brand Applications) y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células que dieron negativo tanto en la tinción con PI como en la tinción con anexina V (cuadrante 3) representan células vivas; las células que en la tinción dieron negativo para PI y positivo para anexina V (cuadrante 4) representan las primeras células apoptósicas; las células que en la tinción dieron positivo para PI y positivo para anexina V (cuadrante 2) representan principalmente células de las últimas etapas de apoptosis.

Las células 9D tratadas con ligando Apo-2 mostraron unión elevada a la anexina V extracelular, así como un aumento notable de la recaptación de PI (figura 2B), lo que indica que el ligando Apo-2 indujo apoptosis en las células. Se obtuvieron resultados comparables con anticuerpo CH11 anti-Apo-1 (figura 2B). El ligando Apo-2 indujo una respuesta similar en las células Raji y Jurkat, igual que el anticuerpo anti-Apo-1 (véase figuras 2C y 2D). En la tabla 1 que aparece a continuación también se muestra la inducción de apoptosis por parte del ligando Apo-2 (cuantificada como el porcentaje de células apoptósicas), comparado con el control y el anticuerpo anti-Apo-1, en estas estirpes celulares.

También se analizó la activación de fragmentación internucleosómica de ADN por parte del ligando Apo-2. Las células Jurkat (columnas de la izquierda) y las células 9D (columnas de la derecha) se incubaron (2 x 10^{6} células/pocillo) durante 6 horas con un medio de control o con un medio con ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se describe en el ejemplo 3). A continuación se extrajo el ADN de las células y se marcó con ^{32}P-ddATP utilizando transferasa terminal. Las muestras de ADN marcadas fueron sometidas a electroforesis sobre geles de agarosa al 2% y posteriormente se analizaron mediante autorradiografía [Moore y otros, Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)]. El ligando Apo-2 indujo fragmentación internucleosómica de ADN tanto en las células Jurkat como en las células 9D (figura 2E). Dicha fragmentación de ADN es característica de la apoptosis [Cohen, Advances in Immunol., 50: 55-85 (1991)].

\newpage

Para examinar la evolución en el tiempo de la actividad apoptósica del ligando Apo-2, se incubaron células 9D en platos de microtitulación (5 x 10^{4} células/pocillo) con un medio de control o con ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se describe en el ejemplo 3) durante un período de tiempo que osciló entre 0 y 50 horas. Tras la incubación, se cuantificó el número de células vivas y muertas mediante examen al microscopio utilizando un hemocitómetro.

Tal como se muestra en la figura 3A, los niveles máximos de muerte celular se indujeron en células 9D a las 24 horas.

Para determinar la dependencia de la dosis de la muerte celular inducida por ligando Apo-2, se incubaron células 9D (5 x 10^{4} células/pocillo) durante 24 horas con diluciones seriadas de medio de control o con ligando Apo-2 (preparado tal como se describe en el ejemplo 3). El número de células vivas y muertas posterior a la incubación se cuantificó tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se ilustran en la figura 3B. La apoptosis específica se determinó restando el porcentaje de apoptosis de las células tratadas con control del porcentaje de apoptosis de las células tratadas con ligando Apo-2. La mitad de la activación máxima de apoptosis tuvo lugar a aproximadamente 0,1 \mug/ml (aproximadamente 1 nM) y la inducción máxima tuvo lugar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 \mug/ml (aproximadamente entre 10 y 30 nM).

Ejemplo 5 Actividad apoptósica del ligando Apo-2 en estirpes celulares tumorales no linfocíticas humanas

El efecto del ligando Apo-2 en estirpes celulares tumorales no linfocíticas humanas se analizó utilizando las siguientes estirpes celulares: HeLa (derivada de cáncer de cuello uterino humano, ATCC CCL 22); ME-180 (derivada de cáncer de cuello uterino humano, ATCC HTB 33); MCF7 (derivada de cáncer de mama humano, ATCC HTB 22); U-937 (derivada de linfoma histiocítico humano, ATCC CRL 1593); A549 (derivada de cáncer de pulmón humano, ATCC CCL 185); y 293 (derivada de células renales embrionarias humanas transformadas por adenovirus, ATCC CCL 1573). En el análisis, se incubaron 1 x 10^{6} células de cada estirpe celular durante 24 horas con medio de control, con ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se describe en el ejemplo 3), o con anticuerpo CH11 monoclonal anti-Apo-1, (1 \mug/ml). Tras la incubación, se cuantificó la apoptosis mediante análisis FACS, tal como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 1.

TABLA 1

3

Las células HeLa y las células MCF7 eran igual de sensibles a la inducción de apoptosis por el ligando Apo-2 comparadas con el anticuerpo CH11 anti-Apo-1. En cambio, las células U-937 y las células A549 eran notablemente más sensibles a la inducción de apoptosis por el ligando Apo-2. Las células ME-180 eran bastante sensibles al ligando Apo-2, pero eran relativamente resistentes al anticuerpo anti-apo-1. Las células 293 eran resistentes al ligando Apo-2 y débilmente sensibles al anticuerpo anti-Apo-1.

De este modo, el ligando Apo-2 es capaz de inducir apoptosis en células de origen no linfocítico, así como en células de origen linfocítico (véase ejemplo 4). Asimismo, aunque sin comprenderlo por completo y sin ningún deseo de adherirse a ninguna teoría en particular, actualmente los solicitantes creen que el ligando Apo-2 actúa a través de un receptor que es distinto del Apo-1. Esta creencia cuenta con el respaldo de los datos de la presente invención que muestran que las estirpes celulares descritas anteriormente muestran patrones de sensibilidad diferencial al ligando Apo-2 y al anticuerpo anti-Apo-1 (véase también, posterior ejemplo 7).

Ejemplo 6 Efecto del ligando Apo-2 en monocitos de sangre periférica humana

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica ("PBMC") de la sangre de donantes humanos mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll utilizando un medio de separación de linfocitos (LSM®, Organon Teknika). Se preparó una población aislada de células T a partir de PBMC mediante eliminación de las células B mediante unión de la Ig de la superficie con una columna anti-Ig y la eliminación de monocitos mediante unión del receptor Fc a una columna Ig (R & D Systems). Se preparó una población aislada de células B a partir de PBMC mediante eliminación mediada por el complemento de células T que se hicieron reaccionar con el anticuerpo anti-CD3 producido por el mieloma OKT3 (ATCC, CRL 8001) y de monocitos que se hicieron reaccionar con un anticuerpo específico contra monocitos producido por el hibridoma 4F2C 13 (ATCC, HB 22). Se consiguió la eliminación adicional de monocitos mediante adherencia a plástico.

Las células B o T recién aisladas de sangre periférica (1 x 10^{6} células/pocillo) se cultivaron durante 3 días en presencia de un medio de control o de ligando Apo-2 (3 \mug/ml, preparado tal como se describe en el ejemplo 3). Para la activación, se trataron simultáneamente las células B con lipopolisacárido ("LPS", 1 \mug/ml) y se trataron las células T con forbol miristato acetato ("PMA", 10 ng/ml) más ionomicina (1 \mug/ml) (Sigma). Para el pretratamiento con interleucina-2 ("IL-2"), se cultivaron células T durante 3-5 días en presencia de IL-2 (50 U/ml) (Genzyme) antes de exponerlas a ligando Apo-2. La apoptosis se determinó utilizando análisis FACS básicamente como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 4. No obstante, las células B fueron agrupadas por anticuerpos anti-CD19/CD20 (Jackson Immunoresearch) y las células T fueron agrupadas por anticuerpos anti-CD4/CD8 (Jackson Immunoresearch). Los resultados se muestran en la tabla 2 que aparece a continuación, que representa medias \pm EE de experimentos independientes [linfocitos B - 9 experimentos; linfocitos T - 8 experimentos; linfocitos T más IL-2 - 5 experimentos], en los que se analizaron 50.000 células per data point. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de la t de Student. En la tabla 2, a= p<0,05 y b =p<0,02 en relación con el control respectivo.

TABLA 2

4

El ligando Apo-2 indujo apoptosis significativa en células B no estimuladas, en células B activadas por LPS y en células T activadas con PMA y ionomicina. Anteriormente se notificó que las células T periféricas pueden mostrar predisposición a la apoptosis cultivando las células en presencia de IL-2 [Lenardo y otros, Nature, 353: 858-861 (1991)]. El presente estudio mostró que el pretratamiento con IL-2 sensibilizaba las células T periféricas a la muerte celular inducida por ligando Apo-2.

Ejemplo 7 Análisis de inhibición utilizando receptores de Fas/Apo-1 y de TNF

Se realizó un análisis para determinar si el receptor de Fas/Apo-I, así como los receptores de TNF de tipo I y de tipo 2 (TNF-R1 y TNF-R2), actuaban como mediadores de la actividad apoptósica del ligando Apo-2 comprobando si formas solubles de estos receptores son capaces de inhibir la actividad apoptósica del ligando Apo-2 soluble y purificado (descrito en el ejemplo 3).

Se incubaron células 9D (5 x 10^{4} células/pocillo) durante 24 horas en un medio de control o en un medio con ligando Apo-2 (0,3 \mug/ml, preparado tal como se ha descrito en el ejemplo 3) en presencia de control tampón, control CD4-IgG (25 \mug/ml), Apo-1-IgG soluble (25 \mug/ml), TNFRI-IgG soluble (25 \mug/ml) o proteína de fusión TNFR2-IgG soluble (25 \mug/ml). Los derivados solubles de los receptores Fas/Apo-1, TNF-R1 y TNF-R2 se produjeron como proteínas de fusión IgG tal como se describe en Ashkenazi y otros, Methods, 8: 104-115 (1995). La CD4-IgG se produjo como una proteína de fusión IgG tal como se describe en Byrn y otros, Nature, 344: 667-670 (1990) y se utilizó como control.

Tal como se muestra en la figura 3C, ninguna de las moléculas unidas al receptor inhibió la actividad apoptósica del ligando Apo-2 sobre las células 9D. Estos resultados indican que la actividad apoptósica del ligando Apo-2 es independiente de Fas/Apo-1 y de TNF-R1 y TNF-R2.

Ejemplo 8 Expresión de ARNm de ligando Apo-2 en tejidos de mamíferos

La expresión de ARNm de ligando Apo-2 en tejidos humanos se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Northern (figura 4). Las inmunotransferencias de ARN humano se hibridaron con una sonda de ADN marcada con ^{32}P basada en el ADNc del ligando Apo-2 en toda su longitud, o con una sonda de ARN marcada con ^{32}P basada en la secuencia EST GenBank, HHEA47M (véase ejemplo 1). La inmunotransferencia de ARN fetal humano MTN (Clontech) y la inmunotransferencia de ARN humano de adulto MTN-II (Clontech) se incubaron con una sonda de ADN, mientras que la inmunotransferencia de ARN humano de adulto MTN-I (Clontech) se incubó con la sonda de ARN. Las inmunotransferencias se incubaron con las sondas en tampón de hibridación (5 x SSPE; 2 x solución de Denhardt; 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y escindido; formamida al 50%; SDS al 2%) durante 16 horas a 42ºC. Se lavaron varias veces las inmunotransferencias en I x SSPE; SDS al 2% durante 1 hora a 65ºC y formamida recién desionizada al 50%; 1 x SSPE; SDS al 0,2% durante 30 minutos a 65ºC. Las inmunotransferencias se desarrollaron tras exposición durante toda la noche, utilizando un fosforimager (Fuji).

Los resultados se muestran en la figura 4. En tejidos humanos fetales, se detectó expresión de ARNm del ligando Apo-2 en pulmón, hígado y riñón, pero no en tejido cerebral. En tejidos humanos adultos, se detectó expresión de ARNm del ligando Apo-2 en bazo, timo, próstata, ovario, intestino delgado, linfocitos de sangre periférica, corazón, placenta, pulmón y riñón. No se detectó expresión o poca en testículo, cerebro, músculo esquelético y páncreas. El perfil de expresión observado para el ligando Apo-2, tal como se describe anteriormente, no es idéntico al del ligando Apo-1, que se expresa principalmente en células T y testículo [Nagata y otros, supra].

Ejemplo 9 Actividad apoptósica del ligando Apo-2 en estirpes celulares tumorales humanas

Se analizó además la actividad apoptósica del ligando Apo-2 (descrita en el ejemplo 3) en estirpes celulares tumorales humanas, en presencia o ausencia de uno de varios agentes quimioterapéuticos.

Se analizaron las siguientes estirpes celulares tumorales humanas: A549 (cáncer de pulmón, ATCC CCL 185); HCT116 (cáncer de colon, ATCC CCL 247); SW480 (adenocarcinoma de colon, ATCC CCL 228); MDA231 (adenocarcinoma de mama, ATCC HTB 26); HeLa (cáncer de cuello uterino, ATCC CCL 22); ME-180 (cáncer de cuello uterino, ATCC HTB 33); T24 (cáncer de vejiga urinaria, ATCC HTB 4); SK-N-AS (neuroblastoma, White y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5.520-5.524 (1995)). Varias de estas estirpes celulares expresan el p53 natural mientras que las otras no debido a mutaciones, tal como se muestra en la tabla 3 que aparece a continuación. Las células se colocaron en placas de cultivo a 2,5 x 10^{5} células/ml en placas de 96 pocillos y se incubaron durante toda la noche. Las células se cultivaron en presencia de diluciones dobles de ligando Apo-2 (de 100 ng/ml a 0,01 ng/ml). En algunos de los cultivos, también se añadió un agente quimioterapéutico durante 24 horas: ciclohexamida ("CHX") (50 \mug/ml; Sigma Chemicals), doxorrubicina (10-100 \mug/ml; Pharmacia), o 5-FU (6 mg/ml; Roche).

Tras 24 horas de incubación, se tiñeron las células con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20%. La viabilidad celular se determinó eluyendo el colorante de las células teñidas con citrato de sodio 0,1 M (ácido cítrico 0,1 M en metanol al 50%), y se cuantificó la absorbancia a 540 nm.

Los resultados se muestran en la siguiente tabla.

TABLA 3

5

Estos resultados muestran que el ligando Apo-2 indujo muerte celular en estirpes celulares tumorales derivadas de varios tipos de tumor y que el ligando Apo-2 indujo muerte celular independientemente de la situación p53 de las células tumorales. Estos resultados también muestran que la muerte celular inducida por ligando Apo-2 aumentó con la adición de varios fármacos quimioterapéuticos distintos.

Ejemplo 10 Actividad apoptósica del ligando Apo-2 in vivo

Los efectos del ligando Apo-2 se analizaron en ratones desnudos portadores de tumor. Los ratones desnudos (5-10 ratones por grupo) (adquiridos en Harlan Sprague Dawley) recibieron una inyección (día 0) por vía subcutánea con células humanas MDA231 de cáncer de mama (ATCC HTB 26) (2 x 10^{6} células/ratón). Se dejó que los tumores crecieran durante 14 días. Los días 14 y 15, se inyectaron 2 \mug/0,05 ml/ratón de ligando Apo-2 (ejemplo 3) y/o 10 \mug/0,05 ml/ratón de doxorrubicina (Pharmacia) en el sitio del tumor. Los animales control también recibieron una inyección de 0,05 ml de PBS. El día 21, los animales fueron sacrificados y se extrajeron los tumores y se pesaron (gramos).

Los resultados se muestran en la figura 5. Los datos muestran que el tratamiento con ligando Apo-2 inhibió por sí mismo el crecimiento del tumor y que el ligando Apo-2 potenció los efectos inhibidores de la doxorrubicina en el crecimiento del tumor.

Ejemplo 11 Actividad apoptósica del ligando Apo-2 in vivo

Los efectos antitumorales del ligando Apo-2 también se analizaron en ratones desnudos portadores de tumor, tal como se ha descrito en el ejemplo 10, excepto que el día 0 los ratones recibieron una inyección por vía subcutánea con células humanas HCT116 de cáncer de colon (ATCC CCL 247) (2 x 10^{6} células/ratón). A continuación se dejó que los tumores crecieran durante 14 días. Los días 14 y 15, se inyectaron 2 \mug/0,05 ml/ratón de ligando Apo-2 y/o 10 \mug/0,05 ml/ratón de 5-FU (Roche) en el sitio del tumor. Los animales control también recibieron una inyección con 0,05 ml de PBS. El día 21, los animales fueron sacrificados y se extrajeron los tumores y se pesaron (gramos).

Los resultados se muestran en la figura 6. Estos resultados muestran que el tratamiento con ligando Apo-2 inhibió por sí mismo el crecimiento del tumor y que el ligando Apo-2 potenció los efectos inhibidores de 5-FU en el crecimiento del tumor.

Ejemplo 12 Actividad apoptósica del ligando Apo-2 in vivo

Los efectos antitumorales del ligando Apo-2 se analizaron en ratones desnudos portadores de tumor, tal como se ha descrito en el ejemplo 11, excepto que los días 1 y 2 se inyectaron por vía peritoneal 10 \mug/0,05 ml/ratón de ligando Apo-2 y/o 100 \mug/0,05 ml/ratón de 5-FU. Los animales control también recibieron una inyección con PBS. A continuación se midió el tamaño del tumor (mm^{2}) los días 5, 9 y 15. El día 15, se sacrificaron los animales y se extrajeron los tumores y se pesaron (gramos).

Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8. Estos resultados muestran que el ligando Apo-2 es capaz de alcanzar el sitio subcutáneo del tumor y ejercer un efecto antitumoral incluso cuando se administra mediante inyección intraperitoneal. Asimismo, estos resultados confirman la capacidad del tratamiento con ligando Apo-2 para inhibir por sí mismo el crecimiento del tumor y potenciar los efectos inhibidores de 5-FU sobre el crecimiento del tumor.

Ejemplo 13 Análisis de inhibición utilizando CrmA

Estudiar si proteasas tales como ICE y CPP32/Yama desempeñan algún papel en la inducción de apoptosis por parte del ligando Apo-2; se realizó un análisis para determinar si el CrmA bloquea la apoptosis inducida por ligando Apo-2 [Marsters y otros, Current Biology, 6: 750-752 (1996)]. El CrmA es un inhibidor, derivado del virus de la viruela, de las proteasas apoptósicas ICE y CPP32/Yama y bloquea la señalización apoptósica de TNFR1 y Fas/Apo-1. Además, para estudiar si el "dominio apoptósico" que contiene proteína adaptadora FADD, que participa como mediadora en la inducción de apoptosis por parte del ligando Apo-1 y de TNF [Chinnaiyan y otros, Cell, 81: 505-512 (1995); Hsu y otros, Cell, 84: 299-308 (1996)], está implicado en la apoptosis inducida por ligando Apo-2, se realizó un análisis para determinar si una forma mutante dominante negativa de FADD, (FADD-DN) [Hsu y otros, supra] inhibe la función del ligando Apo-2 [Marsters y otros, Current Biology, 6: 750-752 (1996)].

Se transfectaron células HeLa-S3 (ATCC CCL 22) con un plásmido de expresión pRK5-CrmA (secuencia de CrmA notificada en Ray y otros, supra) o un plásmido de expresión pRK-5-FADD-DN (Hsu y otros, Cell, 84: 299-308 (1996)). El pRK5 se utilizó como control. Las células fueron cotransfectadas con pRK5-CD4 (Smith y otros, Science, 328: 1.704-1.707 (1988)) como marcador de la recaptación de ADN de plásmido. Las células transfectadas se identificaron mediante tinción con anticuerpo anti-CD4 conjugado con ficoeritrina (Jackson Immunoresearch) y se analizó la apoptosis mediante FACS básicamente como se describió anteriormente en el ejemplo 4.

Los resultados se muestran en la figura 9. El CrmA bloqueó la apoptosis inducida por ligando Apo-2, así como la apoptosis inducida por anticuerpo anti-Apo-1. En cambio, la FADD-DN tuvo poco efecto sobre la apoptosis inducida por ligando Apo-2 pero bloqueó sustancialmente la inducción de apoptosis por parte del anticuerpo anti-Apo-1. Por lo tanto, los resultados del análisis indican que el ligando Apo-2, el TNFR1 y Fas/Apo-1 pueden comprometer una vía de señalización distal común para activar la muerte celular apoptósica. En particular, los resultados indican que pueden ser necesarias proteasas tales como ICE y CPP32/Yama para la apoptosis inducida por ligando Apo-2. En cambio, se requiere FADD para la inducción de muerte celular por parte de TNFR1 y Fas/Apo-1, pero no por parte del ligando Apo-2.

Ejemplo 14 A. Preparación de anticuerpos anti-ligando Apo-2

Se inmunizaron ratones Balb/c (adquiridos en los Charles River Laboratories) inyectándoles diez veces 1 \mug de ligando Apo-2 (preparado tal como se describió en el ejemplo 3 y diluido en adyuvante MPL-TDM, adquirido en Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) en la almohadilla de la pata trasera a intervalos de 1 semana. Tres días después de la última inyección de refuerzo, se eliminaron los nódulos linfáticos poplíteos de los ratones y se preparó una única suspensión de células en medios DMEM (obtenidos en Biowhitakker Corp.) enriquecidos con penicilina-estreptomicina al 1%. A continuación se fusionaron las células de los nódulos linfáticos con células P3X63AgU.1 de mieloma murino (ATCC CRL 1597) utilizando polietilenglicol al 35% [Laskor y otros, Cell. Immunol., 55: 251 (1980)] y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos. Se seleccionaron los hibridomas resultantes de la fusión en medio HAT. Diez días después de la fusión, se cribaron los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma mediante ELISA [Kim y otros, J. Immunol. Meth., 156: 9-17 (1992)] para verificar la presencia de anticuerpos monoclonales unidos a la proteína de ligando Apo-2.

En el ELISA, se cubrieron las placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) añadiendo a cada pocillo 50 \mul de 0,5 \mug/ml de ligando Apo-2 (véase ejemplo 3) en PBS e incubando a 4ºC durante toda la noche. A continuación se lavaron las placas tres veces con tampón (PBS más Tween 20 al 0,05%). A continuación se bloquearon los pocillos de las placas de microtitulación con 200 \mul de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y se incubaron a temperatura ambiente durante I hora. A continuación volvieron a lavarse las placas tres veces con tampón de lavado.

Tras la etapa de lavado, se añadió a los pocillos designados 50 \mul de 2 \mug/ml de anticuerpos de ligando Apo-2 o 100 \mul de sobrenadante del cultivo de hibridoma. Se añadieron 100 \mul de medio condicionado con células de mieloma P3X63AgU.1 a otros pocillos designados como controles. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador y a continuación se lavaron tres veces con tampón de lavado.

A continuación, se añadió a cada pocillo 50 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (adquirida en los Cappel Laboratories), dilución 1:1.000 en un tampón de análisis (albúmina sérica bovina al 0,5%, Tween-20 al 0,05%, timersol al 0,01% en PBS), y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. Se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado, a continuación se añadieron 50 \mul de sustrato (TMB, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin; obtenido en Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 50 \mul de disolución de paro (Kirkegaard & Perry) a cada pocillo, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector automático de placas de microtitulación.

Se comprobó la existencia de actividad bloqueante de la apoptosis de células 9D inducida por ligando Apo-2 de los sobrenadantes de hibridoma (99 seleccionados). Inicialmente la actividad se determinó analizando el porcentaje de viabilidad de las células 9D tratadas utilizando exclusión de colorante azul tripán.

La actividad bloqueante también se confirmó mediante análisis FACS. Las células 9D (5 x 10^{5} células/0,5 ml) se suspendieron en medios RPMI completos (RPMI más FCS al 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina, piruvato de sodio) y se colocaron en placas de macrotitulación de 24 pocillos. Se suspendieron 0,5 ml de ligando Apo-2 (1 \mug/ml) (preparado como se ha descrito en el ejemplo 3) en medios RPMI completos, se preincubaron con 10 \mug de anticuerpos monoclonales purificados o con 100 \mul de sobrenadante del cultivo, y a continuación se añadieron a los 24 pocillos de macrotitulación que contenían células 9D. Las placas de macrotitulación se incubaron durante toda la noche a 37ºC y en presencia de CO_{2} al 7%. A continuación se recogieron las células incubadas y se lavaron una vez con PBS. La viabilidad de las células se determinó mediante tinción de anexina V conjugada con FITC unida a fosfatidilserina según las recomendaciones del fabricante (Clontech). Se lavaron las células en PBS y se resuspendieron en 200 \mul de tampón de unión. Se añadieron 10 \mul de anexina V conjugada con FITC (1 \mug/ml) y 10 \mul de yoduro de propidio a las células. Tras un período de incubación de 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células 9D mediante FACS.

Se identificaron 8 posibles hibridomas secretores de anticuerpos bloqueantes y 4 posibles hibridomas secretores de anticuerpos no bloqueantes y además se clonaron (dos veces) mediante técnicas de dilución limitante.

El análisis FACS de cuatro anticuerpos, a los que se hace referencia como anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2, se ilustra en la figura 10 (tal como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 son producidos por los hibridomas 1D1.12.4, 2G6.3.4, 2E11.5.5 y 5C2.4.9, respectivamente, todos los cuales han sido depositados junto con la ATCC). Las células 9D tratadas con ligando Apo-2 (parte superior izquierda de la figura) mostraron un 50% más de células apoptósicas que las células control sin tratar (parte superior derecha de la figura). Las células 9D tratadas con ligando Apo-2 más los anticuerpos 2E11, 5C2, 2G6, o 1D1 mostraron un 0%, 6%, 26% y 48% más de células apoptósicas que el control sin tratar, respectivamente. Estos resultados muestran que los anticuerpos SC2, 2E11 y 2G6 son anticuerpos bloqueantes mientras que el anticuerpo 1D1 es un anticuerpo no bloqueante. La actividad bloqueante más potente se observó en el anticuerpo 5C2.

Las especificidades antigénicas de los cuatro anticuerpos también se verificaron en un ELISA. Se cubrieron los pocillos de microtitulación con 2 \mug/ml de linfotoxina (Genentech, Inc., véase también, EP 164.965., Gray y otros, Nature, 312: 721-724 (1984)), TNF-alfa (Genentech, Inc., véase también, Pennica y otros, Nature, 312: 724-729 (1984); Aggarwal y otros, J. Biol. Chem., 260: 2.345-2.354 (1985)), o ligando Apo-2 (véase ejemplo 3). Los anticuerpos monoclonales 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 se analizaron a una concentración de 10 \mug/ml.

Los resultados del análisis se muestran en la figura 11. Los datos de la figura 11 muestran que los anticuerpos monoclonales 2G6, 2E11 y 5C2 son específicos del ligando Apo-2, mientras que el anticuerpo monoclonal 1D1 mostró unión de reactividad cruzada débil con la linfotoxina y el TNF-alfa.

B. Isotipado

Los isotipos de los anticuerpos 1D1, 2G6, 2E11 y 5C2 (descritos en el apartado A anterior) se determinaron cubriendo las placas de microtitulación con Ig de cabra anti-ratón específica para el isotipo (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) durante toda la noche a 4ºC. A continuación se lavaron las placas con tampón de lavado tal como se ha descrito anteriormente. A continuación se bloquearon los pocillos de las placas de microtitulación con 200 \mul de albúmina sérica bovina al 2% y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se lavaron de nuevo las placas tres veces con tampón de lavado.

A continuación, se añadieron 100 \mul de 5 \mug/ml de anticuerpos de ligando Apo-2 purificados o 100 \mul del sobrenadante del cultivo de hibridoma a los pocillos designados. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se añadieron 50 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (tal como se ha descrito anteriormente) a cada pocillo. Se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente. La cantidad de HRP unido a la placa se detectó utilizando sustrato HRP tal como se ha descrito anteriormente.

El análisis de isotipado mostró que los anticuerpos 1D1 y 2G6 son anticuerpos IgG2b, y los anticuerpos 2E11 y 5C2 son anticuerpos IgG2a.

C. Mapeo de epítopos

Se realizó el mapeo de epítopos utilizando un ELISA de unión competitiva tal como se describe en Kim y otros, supra, utilizando anticuerpos monoclonales biotinilados. Los anticuerpos monoclonales seleccionados fueron biotinilados utilizando N-hidroxilsuccinimida tal como se describe en Antibodies, A laboratory Manual, Eds. E. Harlow and D. Lane, pág. 342. Los pocillos de las placas se cubrieron con 50 \mul de ligando Apo-2 (véase ejemplo 3,0-1 \mug/ml) y se dejaron toda la noche a 4ºC, y a continuación se bloquearon con BSA 296 durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar los pocillos de microtitulación, se añadió a cada pocillo una mezcla de una concentración óptima predeterminada de anticuerpos biotinilados y una cantidad mil veces superior de anticuerpo no marcado. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas y se detecto la cantidad de anticuerpo biotinilado mediante la adición de HRP-estreptavidina. Después de lavar los pocillos de microtitulación, se detectó la enzima unida mediante la adición del sustrato (TMB), y se leyeron las placas a 490 nm con un lector de placas ELISA.

Los resultados se muestran en la figura 12. Los resultados muestran que la unión de los anticuerpos conjugados con HRP fue eficazmente inhibida por la cantidad excesiva de sus propios anticuerpos pero no por los otros anticuerpos del análisis.

Las regiones del ligando Apo-2 identificadas por los anticuerpos monoclonales se determinaron utilizando péptidos sintéticos [aa 128-143 (péptido "APO 14"); aa 144-159 (péptido "APO 15"); aa 192-204 (péptido "APO 17"); aa 230-238 (péptido "APO 18"); aa 261-272 (péptido "APO 19") de la secuencia del ligando Apo-2 tal como se muestra en la figura 1A] en ELISA tal como se describe en Chuntharapai y otros, J. Immunol., 152: 1.783-1.789 (1994). Los resultados se muestran en la figura 13. Los anticuerpos 1D1 mostraron unión al péptido APO 17 que comprende los residuos de aminoácidos 192-204 del ligando Apo-2.

Depósito del material

Las siguientes estirpes celulares han sido depositadas junto con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. USA (ATCC):

6

Este depósito se llevó a cabo bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y sus regulaciones (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y estará sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc.. y ATCC, que garantizan la disponibilidad pública permanente e ilimitada de la descendencia del cultivo del depósito desde la publicación de la patente de EE.UU. pertinente o desde la presentación pública de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o del extranjero, la que llegue primero, y garantiza la disponibilidad de la descendencia a uno determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas de EE.UU. a ser autorizado a eso de acuerdo con 35 U.S.C. \NAK 122 y las reglas del Comisionado conforme a eso (incluida 37 CFR \NAK 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

\newpage

El cesionario de la presente solicitud de patente ha acordado que si un cultivo de materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera habiendo sido cultivado en condiciones adecuadas, la estirpe celular será remplazada de inmediato tras notificación por otra del mismo plásmido. La disponibilidad de la estirpe celular depositada no tiene que entenderse como una autorización para poner en práctica la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes en materia de patentes.

La anterior memoria escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la materia poner en práctica la invención. El alcance de la presente invención no se ve limitado por la construcción presentada, ya que la realización presentada se considera una simple ilustración de algunos aspectos de la invención y otras construcciones que son funcionalmente equivalentes se hallan dentro del alcance de esta invención. El depósito del material de la presente no es una aceptación de que la descripción escrita contenida en la presente sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluida la mejor manera de la misma, ni pretende su construcción limitar el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. En realidad, son varias las modificaciones de la invención que además de las representadas y descritas en la presente serán claras para los expertos en la materia a partir de la descripción precedente y que se hallan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ligando Apo-2

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): EMPRESA: Genentech, Inc.

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(B): CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

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(C): CIUDAD: South San Francisco

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v): PRESENTACIÓN INFORMÁTICA:

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(A): MEDIO: disco flexible de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: WinPatin (Genentech)

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(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA ANTERIOR SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/584031

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(B): FECHA: 09- ENERO- 1996

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(viii): INFORMACIÓN RELATIVA AL REPRESENTANTE LEGAL:

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(A): NOMBRE: Marschang, Diane L.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.600

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA: P0978P1PCT

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(ix): INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A): TELÉFONO: 415/225-5416

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(B): TELEFAX: 415/952-9881

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(C): TELEX: 910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID N.º: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 281 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 1:

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1.042 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

9

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10

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 390 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 3:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 60 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 4:

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12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 60 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 5:

13

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 6:

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14

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 7:

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15

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º: 8:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º: 8:

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16

Claims

1. Uso de un ligando Apo-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que el ligando Apo-2 es:

(e) un polipéptido que es un fragmento de (a), (b), (c), o (d); y

en el que el cáncer es un carcinoma de células escamosas, un carcinoma microcíticos de pulmón, un carcinoma no microcítico de pulmón, un neuroblastoma, un cáncer de páncreas, un glioblastoma multiforme, un cáncer de cuello uterino, un cáncer de estómago, un cáncer de vejiga urinaria, un hepatoma, un cáncer de mama, un carcinoma de colon, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de próstata o un cáncer ovárico y el ligando Apo-2 induce apoptosis en las células cancerosas.

2. Uso de la reivindicación 1 en la que dicho polipéptido de ligando Apo-2 consta de los residuos de aminoácidos 114-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1).

3. Uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que dicho medicamento debe administrarse junto con radioterapia o quimioterapia.

4. Uso de la reivindicación 3 en el que la quimioterapia se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino.

5. Uso de la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en el que el medicamento que contiene ligando Apo-2 se administra secuencialmente junto con dicha radioterapia o quimioterapia.

6. Uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la que dicho polipéptido de ligando Apo-2 está unido a uno o más polímeros no proteínicos seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol y polioxialquileno.

7. Uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la que dicho polipéptido de ligando Apo-2 está desglucosila-
do.

8. Uso de la reivindicación 7 en el que dicho polipéptido de ligando Apo-2 se produce en E. coli.

9. Procedimiento in vitro o ex vivo para inducir apoptosis en células cancerosas de mamífero que comprende exponer células cancerosas de mamífero a una cantidad eficaz de ligando Apo-2 para inducir apoptosis en dichas células, en el que el ligando Apo-2 es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(c) un polipéptido que consiste en los residuos de aminoácidos 114-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1);

(d) un polipéptido que consiste en los residuos de aminoácidos 1-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1); y

(e) un polipéptido que es un fragmento de (a), (b), (c), o (d); y

en el que las células cancerosas de mamífero son células de carcinoma de células escamosas, células de carcinoma microcítico de carcinoma de pulmón, células de carcinoma no microcítico de pulmón, células de neuroblastoma, células de cáncer de páncreas, células multiformes de glioblastoma, células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer de estómago, células de cáncer de vejiga urinaria, células de hepatoma, células de cáncer de mama, células de cáncer de colon, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer de próstata o células de cáncer de ovario, y el ligando Apo-2 induce apoptosis en las células cancerosas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 en el que dicho polipéptido de ligando Apo-2 consiste en los residuos de aminoácidos 114-281 de la figura 1A (SEC ID N.º: 1).

11. Procedimiento según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en el que dichas células cancerosas de mamífero también se exponen a radioterapia o quimioterapia.

12. Procedimiento según la reivindicación 11 en el que la quimioterapia se selecciona del grupo que consiste en doxorrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino.

13. Procedimiento según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 en el que dichas células se exponen secuencialmente a dicha radioterapia o quimioterapia y dicho ligando Apo-2.

14. Procedimiento según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en el que dicho polipéptido de ligando Apo-2 está unido a uno o más polímeros no proteínicos seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol y polioxialquileno.

15. Procedimiento según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en el que dicho polipéptido de ligando Apo-2 está desglucosilado.

16. Procedimiento según la reivindicación 15 en el que dicho polipéptido de ligando Apo-2 se produce en E. coli.