CN108350078A - 用于提高肿瘤选择性和抑制的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供双特异性抗‑EGFR x c‑MET链交换改造结构域CH3异二聚体抗体(SEED‑体)、其生产方法。还公开了包含本发明的抗‑EGFR x c‑MET异二聚体双特异性免疫球蛋白分子(SEED‑体)的抗体‑药物缀合物、其制造方法和其在癌症疗法中的用途。

Description

用于提高肿瘤选择性和抑制的双特异性抗体及其用途
发明领域
本发明涉及用于提高肿瘤选择性和抑制的双特异性抗体，特别是EGFR x c-MET双特异性抗体，它们在治疗癌症中的用途和其生产方法。
发明背景
癌症细胞通常特征为细胞表面分子，例如受体酪氨酸激酶(其之一是表皮生长因子受体(EGFR))的异常表达。EGFR在结合至表皮生长因子(EGF)和其它生长因子配体，例如TGF-α、双调蛋白(AR)、外调蛋白(EP)、β细胞调节素(betacelluin, BC)或HB-EGF时被激活(Normanno等，Gene 366 (2006) 2–16)。在配体-诱导的二聚化和活化时，数个下游信号传导途径被触发，包括RAS/MAPK、PI3K/Akt和STAT，其调节不同的细胞过程，包括DNA合成和增殖。通常发现EGFR信号传导在癌症中通过不同的机制失调，包括受体的遗传突变。另外，突变体形式的EGFR的信号传导性质还显示与野生型EGFR相比细胞运输改变，因为一些平衡EGFR途径的调节蛋白呈现在癌症中改变的表达。突变的EGFR例如存在于非小细胞肺癌(NSCLC)中，和60-80%的结肠直肠癌表达突变的EGFR。
在基于抗-EGFR的癌症疗法出现时，假定EGFR靶向疗法在过表达该蛋白的肿瘤中将是最有效的，然而研究快速揭示了EGFR表达水平与对抗-EGFR抗体、例如西妥昔单抗的响应不相关(Liska Clin Cancer Res 17(3) Feb，2011)。EGFR基因拷贝数的增加、EGFR配体的过表达和TP53突变显示在CRC中与对EGFR抑制剂的响应有关(Khambata-Ford等, J ClinOncol 2007;25:3230–7; Moroni等, Lancet Oncol 2005;6:279–86; Oden-Gangloff等BrJ Cancer 2009;100:1330–5; Tabernero J, J Clin Oncol. 2010 Mar 1;28(7):1181-9)。
靶向过表达EGFR的细胞的当前EGFR靶向疗法的副作用遭受由于在非肿瘤组织中EGFR的基础表达导致的毒性。例如，作为针对EGFR的嵌合人-鼠单克隆抗体的西妥昔单抗通常导致皮肤毒性，这是一种在用吉非替尼的EGFR疗法中也观察到的现象(J Eur AcadDermatol Venereol. 2010 Apr;24(4):453-9); SpringerPlus 2013, 2:22)。
在功能上，受体酪氨酸激酶通常也显示过剩，其将补偿一个家族成员的损失。一个实例是持续的ERBB3信号传导，其在用吉非替尼治疗的EGFR突变体肿瘤的一些病例中观察到(Science Vol. 316, 18 May 2007: p. 1039-1043)。这种功能过剩可最终导致对一个家族成员的治疗阻断的获得性肿瘤抵抗(Engelmann等 Science 316, 1039 (2007))。获得性肿瘤抵抗通常导致在RTK抑制剂单一疗法期间的复发。
研究揭示对EGFR靶向疗法的固有抵抗可能是下游效应分子活化的结果，例如KRAS，其在35%–40%的CRC中见到(Knickelbein等Genes Dis. 2015 Mar;2(1):4-12)。多项研究已表明，在CRC中KRAS突变赋予对西妥昔单抗的抗性，因此提议将西妥昔单抗疗法限于具有野生型KRAS肿瘤的患者。然而，约25%的对于KRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN是野生型的结肠直肠癌(CRC)患者对用EGFR抑制剂治疗没有响应(J Clin Oncol. 2010 Mar 1;28(7):1254-61)。通过BEAMing进行对治疗没有响应的患者的分子分析揭示治疗后在这些患者中MET基因的扩增(Bardelli等 Cancer Discov; 3(6); 658–73)。肝细胞生长因子受体(HGFR、c-MET)表达和其配体HGF的上调显示是在EGFR靶向单一疗法期间肿瘤的主要逃逸途径之一。这还通常伴有编码c-MET的基因的扩增(Engelmann等 Science 316, 1039(2007); Clin Cancer Res 2011;17:472-482)。用吉非替尼治疗的HCC827细胞的体外实验揭示5-10倍的c-MET扩增(Engelmann等 Science 316, 1039 (2007))。
MET基因编码肝细胞生长因子受体(HGFR、c-MET)，其是异二聚体跨膜受体酪氨酸激酶，由通过二硫键连接的细胞外α-链和跨膜β-链组成，并且其具有单一配体HGF，亦称为分散因子。在结构上，c-MET包含数个保守蛋白结构域，包括sema、PSI (在丛蛋白、信号素、整联蛋白中)、4 IPT重复序列(在免疫球蛋白、丛蛋白、转录因子中)、TM (跨膜)、JM (膜附近)和TK (酪氨酸激酶)结构域。HGF与MET的结合触发受体二聚化和转磷酸作用，导致MET的构象变化，其激活TK结构域。C-MET介导下游信号传导途径的活化，包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT、Ras-Rac/Rho、分裂素-活化的蛋白激酶和磷脂酶C，其刺激形态发生、增殖和抗凋亡活性以及刺激涉及细胞脱离、运动性和侵袭性的途径。
与c-MET在细胞运动性和形态发生中的作用一致，转移损伤通常显示比原发性肿瘤更高的MET表达水平(Cipriani等 Lung Cancer 2009, 63:169-179)。已实施数种方法来抑制配体HBF或受体以抑制c-MET信号传导。例如，AMG102/Rilotumumab优先结合成熟的生物学活性形式的HGF，与β-链的氨基末端部分相互作用，从而抑制HGF结合。研究抑制HGF活性的另一种单克隆抗体(mAb)是Ficlatuzumab。Ficlatuzumab是人源化的IgG1抗体，其以高亲和力和特异性结合HGF配体，从而抑制c-MET/HGF生物学活性。
Rilotumumab已作为单一疗法在带有复发性成胶质细胞瘤、转移性肾癌或卵巢癌的患者中测试，和在前列腺癌中与化学疗法组合或在晚期实体瘤中与抗血管形成剂组合测试。Ficlatuzumab作为单一疗法和与EGFR抑制剂联合在NSCLC中测试(Biologics 2013；7:61–68)。然而，用ficlatuzumab的II期试验没有达到其主要终点。
因此，尽管在开发抗-EGFR和抗-c-MET疗法二者(作为单一疗法或组合)中已取得进展的事实，但对于改进的抗-EGFR癌症疗法仍存在持续的需要，其克服基于抗-EGFR的疗法的当前局限性和阻止c-MET驱动的肿瘤抵抗。
发明简述
本发明人已令人惊讶地发现，结合EGFR和c-MET二者的双特异性异二聚体免疫球蛋白分子在治疗表达EGFR和c-MET的肿瘤中是有效的。
在第一实施方案中本发明提供了异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其包含
(i) 特异性结合至EGFR的第一Fab或scFv片段，和
(ii)特异性结合至c-MET的第二Fab或scFv片段，和
(iii)抗体铰链区、抗体CH2结构域和包含杂合蛋白-蛋白相互作用界面结构域的抗体CH3结构域，其中每个所述相互作用界面结构域通过第一成员的CH3结构域的氨基酸区段和所述第二成员的CH3结构域的氨基酸区段形成，其中通过在所述相互作用结构域内免疫球蛋白超家族的相同成员的相应氨基酸区段的同二聚化，第一链的所述蛋白-蛋白界面结构域与第二链的蛋白-蛋白界面相互作用，
其中第一或第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("AG-SEED"): GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPX1DIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTX2DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKX3ISL (SEQ ID NO:1)，其中X1、X2和X3可以是任何氨基酸。
在一个实施方案中，在本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子中免疫球蛋白超家族的第一成员是IgG和第二成员是IgA。
在一个实施方案中，在上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子中X1是K或S，X2是V或T，和X3是T或S。
在一个实施方案中，根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一或第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("GA-SEED"): GQPREPQVYTLPPPSEELALNEX1VTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWX2PVX3DSD GSX4FLYSILRVX5AX6DWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6可以是任何氨基酸。
根据一个实施方案，在本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子中X1是L或Q，X2是A或T，X3是L、V、D或T；X4是F、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或T；X5是A或T，和X6是E或D。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一改造免疫球蛋白链包含多肽序列("AG-SEED"): GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL和本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二改造免疫球蛋白链包含多肽序列("GA-SEED"):GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一改造免疫球蛋白链具有多肽序列("AG-SEED"): GQPFEPEVHTLPPSREEMTKNQVSLTCLVRGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRLEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL和上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("GA-SEED"): GQPREPQVYTLPPPSEELALNNQVTLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEPREKYLTWAPVLDSDG SFFLYSILRVDASRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段以至少5x10-8 M的KD结合EGFR。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二Fab或scFv片段以至少5x10-8 M的KD结合c-MET。
根据一个实施方案，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段衍生自西妥昔单抗(C225)。
在优选的实施方案中，第一Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQID NO: 46的VL和VH序列。
在优选的实施方案中，其中第二Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ IDNO: 51的VL序列。
在优选的实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段的VL序列被选择，所述第二Fab片段的VH序列选自SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO:52。
根据更优选的实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一和第二Fab或scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQID NO: 31、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52。
根据更优选的实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一和第二Fab或scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52，或SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50。
在一个实施方案中，根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fc结构域与FcRn相互作用。
在一个实施方案中，与FcRn相互作用的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的氨基酸衍生自人IgG1。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子介导抗体依赖性细胞毒性。
在一个实施方案中，本发明提供了编码上文公开的任何氨基酸序列的分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。
根据一个实施方案，本发明提供了宿主细胞，其包含根据本发明的至少一种多核苷酸，或其包含根据本发明的至少一种载体。
在一个实施方案中，本发明提供了生产上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的方法，其中本发明的方法包括：
-在足以异源表达所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的条件下培养根据本发明的宿主细胞，
-纯化所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其可通过上文公开的本发明的方法获得。
根据一个实施方案，上文公开的根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子与至少一个接头共价偶联。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的接头偶联至染料、放射性同位素或细胞毒素。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的至少一个Fab或scFv轻链偶联至染料、放射性同位素或细胞毒素。
在一个实施方案中，上文公开的至少一个接头共价偶联至上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的至少一个Fab或scFv轻链。
根据一个实施方案，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含共价偶联至异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fab或scFv轻链的两个接头。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fab或scFv轻链和/或CH3结构域和/或CH2结构域偶联至接头，由此所述接头共价偶联至染料、放射性同位素或细胞毒素。
根据一个实施方案，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子用于治疗癌症。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子用于治疗癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种其它成分。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含上述本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种其它成分，或上文公开的本发明的组合物。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗罹患癌症的有需要的受试者的方法，其中治疗包括给予所述受试者治疗有效量的上文公开的本发明的药物组合物。
附图简述
图1: 描述了本发明的两种异二聚体双特异性免疫球蛋白分子(B10v5x225-H；CS06x225-H)和“单臂” (oa)异二聚体免疫球蛋白分子对NCI-H441细胞的细胞结合。抗-HEL：抗-鸡蛋溶菌酶(同种型对照)。
图2: (A) 表位框并(epitope bining)结果，(B) 使用生物层干涉测定法的生物传感器实验(参考实施例3)。
图3: HGF置换结果。
图4: 使用所示抗体对A431细胞的ADCC实验。
图5: 单臂异二聚体免疫球蛋白分子变体(Fab或scFv)的八分象限分析。“225-L”、“225-H”、“225-H”表示人源化的西妥昔单抗(hu225)的动力学变体，“425”表示Matuzumab。
图6: 在(A) NCI-H596细胞、(B)A549细胞中c-MET磷酸化的抑制。
图7: (A) NCI-H596细胞、(B) A549细胞的c-MET磷酸化抑制的定量概述。
图8: (A) 在MKN-45细胞中使用所示的免疫球蛋白分子的c-MET磷酸化的抑制，(B) 在NCI-H596细胞中使用所示的免疫球蛋白分子的EGFR磷酸化的抑制。
图9: 对A549细胞的细胞毒性测定。(A) 没有缀合的毒素的对照，(B) 使用所示的Fab-MMAE-CL偶联抗体的测定，MMAE：单甲基阿里他汀E。
图10:对(A)EBC-1细胞、(B)NCI-H441细胞的细胞毒性测定。
图11:对表达高水平的c-Met和中等水平的EGFR的MKN-45细胞的细胞毒性测定。
图12:描述了在HGF依赖性癌症细胞系中c-MET磷酸化的抑制提高：(A)NCI-H596、(B) KP-4。
图13:在用本发明的B10v5x225-H分子过夜处理后c-MET的降解提高。
图14:使用所示的抗体和对照对NCI-H441细胞的内化测定，以评价各个构建体对其用作ADC的适合性。
图15:描述了使用所示的抗体和免疫球蛋白分子的细胞结合测定的结果。
图16:C225的计算机设计的点突变体的实验和计算的结合亲和力。上标字母表示以下：a-野生型(C225)和突变体mAb的KD(nM)通过表面等离子体共振(SPR)测定。在n>1时，给出标准偏差。提高亲和力的突变(p < 0.01)以粗体表示。b - 相对于野生型的实验结合亲和力(kcal/mol)。c – 使用Rosetta，相对于野生型的预测结合亲和力。d – 跨界面的Rosetta对能量的预测变化。e – 跨界面的氢键能量的预测变化。f – 突变的残基侧链的计算氢键能量。g – 分离的抗体的折叠能量的预测变化。NQ：不可量化的非常弱的结合。
图17:与MET x EGFR bsAb与可溶性c-MET和EGFR细胞外结构域的结合相比，单价母体SEED抗体的动力学参数。测定西妥昔单抗和马妥珠单抗的动力学常数作为参考。抗体被抗-人Fc八分象限生物传感器捕获，和以指定的分析物浓度(25-0.8 nM，或者50-3.1 nM)分析结合动力学。解链温度(Tm)通过热转移测定法测定。图例：n.d. = 未测定；KD = 亲和常数，ka = 缔合常数；kd = 离解常数；Tm = 解链温度；oa = 单臂。
图18:在来自各种适应症的数种肿瘤细胞系上的人c-MET和EGFR的细胞表面受体密度。角质化细胞(NHEK.f-c.)用于评价EGFR-相关的皮肤毒性和肝细胞系HepG2用于评价c-MET介导的肝毒性。密度值作为一式三份的平均分子/细胞提供，标准偏差以百分比给出。图例：ACA = 腺癌，CA = 癌。
图19:c-MET x EGFR bsAb抑制c-MET和EGFR磷酸化。使用GraphPad Prism，根据剂量反应曲线的3PL拟合，计算IC50值。对于一式两份进行的至少两次独立的实验，计算标准偏差(s.d.)。n = 独立实验的次数。
图20:在配体刺激期间c-MET x EGFR bsAb抑制c-MET和EGFR磷酸化。磷酸化的c-MET (A)和磷酸化的EGFR (B)在A549、A431和原代角质化细胞(NHEK)中使用电化学发光测定法(ECL)定量。细胞用各种浓度的bsAb和不相关的同种型SEED对照处理，随后用100 ng/ml HGF (A)或100 ng/ml EGF (B)刺激。三角形表示刺激(向上三角形)和未刺激的细胞(倒三角形)的各自的受体磷酸化水平。剂量反应曲线在GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware，Inc)中使用3PL模型拟合。
图21:与西妥昔单抗相比，c-MET x EGFR bsAb的体外选择性。(A) 作为肿瘤模型细胞系的具有高至中等c-MET和EGFR表达的EBC-1和作为上皮模型细胞系的具有低EGFR表达和无c-MET表达的T47D以1:30的比率混合。为了区分两个细胞系，EBC-1细胞用绿色膜染料PKH2染色。细胞混合物用300 nM的bsAb和西妥昔单抗孵育，和进行流式细胞术分析。抗体结合通过FITC-标记的抗-hu Fc第二抗体测定。显示了对于绿色对比黄色荧光的代表性的点图。(B) 体外选择性被定义为EBC-1和T47D细胞群的平均荧光强度的比率。
图22:与作为ADC的西妥昔单抗和作为相应参考构建体的抗-鸡蛋溶菌酶(HEL)ADC比较，通过将微管蛋白抑制剂MMAE共价定点缀合两条重链C-末端产生的c-MET x EGFR双特异性SEED抗体-药物缀合物的细胞毒性。细胞毒性在过表达EGFR的肿瘤细胞A431 (A)和MDA-MB-468 (B)、作为正常上皮细胞系的原代角质化细胞(NHEK.f-c.，C)、过表达c-MET的细胞MKN45 (D)和EBC-1 (E)以及作为肝细胞系的HepG2 (F)上评价。在三个独立的实验中一式两份进行测定，和使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software，Inc)，通过S形曲线拟合，将曲线拟合。
图23:双特异性c-MET x EGFR ADC对肿瘤细胞系A431和角质化细胞的细胞毒性。A431细胞的EC50值和角质化细胞(NHEK.f-c.)的IC50值使用GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware，Inc)，通过S形曲线拟合计算。星号表示差的拟合结果，因为在最高浓度(*)下曲线未达到饱和平台。ED80表示与未处理的细胞比较在A431细胞中80%的细胞被杀死的ADC浓度，TD20表示角质化细胞的细胞成活力降低20%的剂量。对于体外转换治疗指数或治疗窗计算两个定义：IC50和EC50的差异以及TD20与ED80的比率。
图24:分析型SE-HPLC指示在纯化后四种示例性的双特异性抗体(bsAb)的纯度>95%：(A) B10v5x225-M、(B) B10v5x225-H、(C) CS06x225-M和(D) CS06x225-H。
图25:CS06x225-H对于抑制c-MET、EGFR和AKT磷酸化的协同效果。(A) A549细胞用300 nM的所示的相应mAb孵育3 h和用HGF和EGF刺激。对细胞裂解物进行蛋白质印迹，和检测磷酸化的和总的EGFR、c-MET和AKT。GAPDH用作上样对照。(B) 用500 nM mAb以及对照mAb的组合(各自500 nM)处理和用HGF和EGF刺激后，在A549细胞中磷酸-AKT水平的量化。对细胞裂解物进行电化学发光(ECL) ELISA。(C) 与oa CS06和oa 225-H的组合比较，mAb处理和HGF-刺激的A549细胞裂解物对于磷酸化的c-MET的ECL ELISA指示CS06x225-H的效能增加。(D) A549细胞用各种浓度的mAb处理，不进行刺激，和对裂解物进行ECL ELISA，检测磷酸化的c-MET水平。B10v5x225-M和B10v5x225-H证实了对LY2875358相当的部分激动作用。
图26:通过流式细胞术和共焦荧光显微术测定的双特异性抗体(bsAb)的内化。(A)与在4℃孵育的细胞比较，利用在37℃用抗-人Fc-AlexaFluor488缀合物检测1 h的100 nMbsAb，通过流式细胞术分析定量内化。残留的细胞表面结合通过抗-AlexaFluor488抗体淬灭。(B) EBC-1细胞用100 nM CS06x225-H孵育和用抗-人Fc-AlexaFluor488缀合物在37℃或4℃检测。表面染色通过酸性洗涤除去。
图27:6天后双特异性ADC和bsAb对NHEK的细胞毒性。为了排除与肿瘤细胞比较，角质化细胞的缓慢分裂速率影响微管蛋白抑制剂MMAE的细胞毒性，原代角质化细胞(NHEK)用各种浓度的双特异性ADC或者用bsAb孵育6天。曲线在GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware，Inc.)中使用3PL拟合作图。
序列表
SEQ ID NO: 1 AG-SEED
SEQ ID NO: 2 AG-SEED
SEQ ID NO: 3 GA-SEED
SEQ ID NO: 4 GA-SEED
SEQ ID NO: 5 AG -SEED
SEQ ID NO: 6 GA-SEED
SEQ ID NO: 7 AG-SEED
SEQ ID NO: 8 GA-SEED
SEQ ID NO: 9 人源化的C225 VL序列
SEQ ID NO: 10 人源化的C225 VL动力学变体
SEQ ID NO: 11 人源化的C225 VH序列
SEQ ID NO: 12 人源化的C225 VH动力学变体
SEQ ID NO: 13 人源化的C425 VL序列
SEQ ID NO: 14 人源化的C425 VH序列
SEQ ID NO: 15 c-MET结合剂A12 VL序列
SEQ ID NO: 16 c-MET结合剂A12 VH序列
SEQ ID NO: 17 c-Met结合剂B10 VL序列
SEQ ID NO: 18 c-MET结合剂B10 VH序列
SEQ ID NO: 19 c-MET结合剂C10 VL序列
SEQ ID NO: 20 c-MET结合剂C10 VH序列
SEQ ID NO: 21 c-MET结合剂E07 VL序列
SEQ ID NO: 22 c-MET结合剂E07 VH序列
SEQ ID NO: 23 c-MET结合剂G02 VL序列
SEQ ID NO: 24 c-MET结合剂G02 VH序列
SEQ ID NO: 25 c-MET结合剂H06 VL序列
SEQ ID NO: 26 c-MET结合剂H06 VH序列
SEQ ID NO: 27 c-MET结合剂F03 VL序列
SEQ ID NO: 28 c-MET结合剂F03 VH序列
SEQ ID NO: 29 c-MET结合剂F06 VL序列
SEQ ID NO: 30 c-MET结合剂F06 VH序列
SEQ ID NO: 31 c-MET结合剂B10v5 VL序列
SEQ ID NO: 32 c-MET结合剂B10v5 VH序列
SEQ ID NO: 33 c-MET结合剂CS06 VL序列
SEQ ID NO: 34 c-MET结合剂CS06 VH序列
SEQ ID NO: 35 甘氨酸-丝氨酸接头
SEQ ID NO: 36 铰链1
SEQ ID NO: 37 铰链2
SEQ ID NO: 38 CL序列
SEQ ID NO: 39 CH1序列
SEQ ID NO: 40 CH2结构域
SEQ ID NO: 41 CH3结构域(AG)
SEQ ID NO: 42 CH3结构域(GA)
SEQ ID NO: 43 人源化的C225 VH S58R动力学变体(hu225-L)
SEQ ID NO: 44 人源化的C225 VL N108Y动力学变体(hu225-M)
SEQ ID NO: 45 人源化的C225 VH T109D动力学变体(hu225-H)
SEQ ID NO 46 人源化的C225 VL N109E、T116N动力学变体(hu225-H)
SEQ ID NO: 47 包含单个或多个氨基酸取代的c-Met结合剂B10 VL变体
SEQ ID NO: 48 c-MET结合剂B10 VH动力学变体Q6E (IMGT编号)
SEQ ID NO: 49 包含单个或多个氨基酸取代的c-Met结合剂F06 VL序列变体
SEQ ID NO: 50 包含单个或多个氨基酸取代的c-Met结合剂F06 VL变体
SEQ ID NO: 51 包含单个或多个氨基酸取代的c-Met结合剂B10v5 VL变体
SEQ ID NO: 52 c-Met结合剂CS06 VH动力学变体
发明详述
尽管下文详细地描述了本发明，应理解本发明不限于本文所述的特定的方法、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文所述的术语仅为描述特定实施方案的目的，和不意图限制本发明的范围，其仅由随附的权利要求书限定。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
在后文中，将描述本发明的要素。这些要素用特定的实施方案列出，然而应理解，它们可以任何方式和以任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实例和优选的实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本描述应理解为支持和包括以任何数量的公开和/或优选的要素组合了明确描述的实施方案的实施方案。此外，在本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应视为被本申请的说明书公开，除非上下文另外指示。
在整个说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另外要求，术语"包含(comprise)"和变型例如"包含(comprises)"和"包含(comprising)"应理解为意指包含陈述的成员、整数或步骤，但不排除任何其它未陈述的成员、整数或步骤。术语"由……组成"是术语"包含"的特定实施方案，其中排除了任何其它未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的情况下，术语"包含"涵盖术语"由……组成"。
在描述本发明的情况下(特别是在权利要求的情况下)使用的术语"一个"和"一种"和"所述"和类似提及应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指明或上下文明确矛盾。在本文中值的范围的描述仅意图用作分别提及落入范围内的各个单独值的速记方法。除非本文另外指明，每个单独的值包括在说明书中，如同在本文分别描述一样。说明书中不应有语言被解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实施是必要的。
本说明书的整个文本中引用数个文献。本文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等)，无论是在前还是在后，均通过引用以其整体并入本文。本文绝不应解释为承认本发明没有资格由于在先发明而早于这样的公开内容。
所述目标通过本发明，优选地通过随附权利要求的主题得到解决。发明人令人惊讶地发现，根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可用于克服对EGFR或c-MET靶向单一疗法的抗性。此外令人惊讶地发现，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子以高选择性结合以较低的丰度表达EGFR或c-MET之一的细胞。
所述目标根据第一实施方案通过本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子得到解决，所述分子包含
(i) 特异性结合至EGFR的第一Fab或scFv片段，和
(ii)特异性结合至c-MET的第二Fab或scFv片段，和
(iii)抗体铰链区、抗体CH2结构域和包含杂合蛋白-蛋白相互作用界面结构域的抗体CH3结构域，其中每个所述相互作用界面结构域由第一成员的CH3结构域的氨基酸区段和所述第二成员的CH3结构域的氨基酸区段形成，其中通过在所述相互作用结构域内免疫球蛋白超家族的相同成员的相应氨基酸区段的同二聚化，第一链的所述蛋白-蛋白界面结构域与第二链的蛋白-蛋白界面相互作用，
其中第一或第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("AG-SEED"): GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPX1DIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTX2DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKX3ISL (SEQ ID NO:1)，其中X1、X2和X3可以是任何氨基酸。例如，由X1、X2和X3表示的氨基酸可各自彼此独立地选自天然存在的氨基酸。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含的改造免疫球蛋白链和其相应的序列已描述于WO 2007/110205。在本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子中术语异二聚体。
根据本发明的"异多聚体蛋白"是至少包含第一亚基和第二亚基的蛋白分子，其中每个亚基包含不相同的结构域。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含两个不相同的蛋白结构域，例如“AG-SEED”和“GA-SEED”，其导致比率1:1的不相同的蛋白结构域的异二聚化。根据第一实施方案，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含特异性结合至EGFR的第一Fab或scFv片段。术语Fab片段是指结合抗原的抗体片段，其可例如通过木瓜蛋白酶处理IgG类型的免疫球蛋白获得，这将产生两个Fab片段和Fc结构域。功能方面和获得Fab片段的方法描述于例如，“Applications and Engineering of MonoclonalAntibodies” by D.J. King, CRC Press, 1998, chapter 2.4.1; Zaho et al. ProteinExpression and Purification 67 (2009) 182–189; S.M. Andrew, J.A. Titus,Fragmentation of immunoglobulin G, Curr. Protoc. Cell Biol. (2003) Unit 16.14(Chapter 16)。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可例如还包含特异性结合至EGFR的第一scFv片段。本发明使用的术语"scFv"是指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子，并且缺少恒定结构域，例如根据本发明的scFv片段可例如包括由一个轻链可变结构域(VL)或其部分和一个重链可变结构域(VH)或其部分组成的结合分子，其中每个可变结构域(或其部分)衍生自相同或不同的抗体。scFv分子优选地包含在VH结构域和VL结构域之间插入的接头，其可例如包括包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸的肽序列。例如，肽序列可包含氨基酸序列(Gly4 Ser)n，其中n是1-6的整数，例如n可以是1、2、3、4、5或6，优选地n=4。scFv分子和获得它们的方法是本领域已知的，和描述于例如，美国专利号5,892,019, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al.1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenicet al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. ProteinEngineering 4:837。
本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段特异性结合至人表皮生长因子受体(EGFR)。特异性结合或其任何语法变型，是指第一Fab或scFv片段以至少1 x 10-6 M、例如1 x 10-6 M、1 x 10-7 M、1 x 10-8 M、1 x 10-9 M、1 x 10-10 M、1 x 10- 11M、1 x 10-12的Kd与EGFR结合。根据本发明的EGFR是指具有UniProtKB数据库登录号P00533提供的序列的EGFR，包括所有其同种型和序列变体(UniProtKB数据库登录号P00533-1、P00533-2、P00533-3、P00533-4)，或描述于Cai等，PLoS ONE 9(4): e95228中的任何突变，例如c.2126A>C、c.2155G>T、c.2156G>C、c.2235_2249del15、c.2236_2250del15、c.2237_2251del、c.2239_2248ATTAAGAGGAG>C、c.2240_2257del18、c2248G>C、c.2303G>T、c.2573T>G、c.2582T>A、p745del_frameshift、p.L858R、p.S768I。
本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子进一步包含特异性结合至c-MET的第二Fab或scFv片段。如本文使用的c-MET是指MET原癌基因，受体酪氨酸激酶(UniProtKB数据库登录号P08581)，其也称为肝细胞生长因子受体。例如，c-MET还包括序列变体，例如公开于Nat Genet. 1997 May;16(1):68-73中那些，例如c-MET R970C (METR970C)、c-MET T992I(METT992I)、METM1149T、METV1206L、METV1238I、METD1246N、METY1248C、METL1213V、METD1246H、METY1248H、METM1268T、META320V、METN375S。第二Fab或scFv片段与c-MET的特异性结合是指第二Fab或scFv片段以至少1 x 10-6 M，例如1 x 10-6 M、1 x 10-7 M、1 x 10-8 M、1 x 10-9 M、1 x 10-10 M、1 x 10-11M、1 x 10-12的Kd与c-MET结合。
根据本发明的第一实施方案，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子进一步包含抗体铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3。例如，存在5类免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，其全部包含铰链区，并且其可包含在本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子中。另外，这些类型的免疫球蛋白中的一些具有亚类，例如，IgG具有四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。(Alberts, B. et al., Chapter 23: The Immune System, In MolecularBiology of the Cell, 3d Edition, Garland Publishing, Inc., New York, N.Y.)，其铰链区也可包含在本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子中。铰链区可例如分成三个区域：上、中和下铰链。上铰链定义为在重链(CH1)的第一结构域的末端和形成重链间二硫桥的第一半胱氨酸之间的氨基酸的数量。中铰链富含脯氨酸和包含重链间半胱氨酸二硫桥。下铰链连接中铰链与CH2结构域(参见例如Sandlie, I.和Michaelsen, T., Chapter3: Engineering the Hinge Region to Optimize Complement-induced Cytolysis, InAntibody Engineering: A Practical Guide, W. H. Freeman and Co., New York,N.Y.; Hamers-Casterman, C., Naturally Occurring Antibodies Devoid of LightChains, 363 Nature 446 (1993)和Terskikh, A. V., "Peptabody ": A New Type ofHigh Avidity Binding Protein, 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1663 (1997))。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的铰链区可例如还包含公开于J. of BiologicalChem. VOL. 280, NO. 50, pp. 41494 –41503, December 16, 2005的铰链区的任何氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含作为第一成员的免疫球蛋白超家族的IgG和作为第二成员的IgA。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可在一个实施方案中包含根据SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的铰链区。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可包含人IgG和IgA CH3结构域的衍生物，其产生互补人链交换改造结构域(SEED) CH3异二聚体，包含人IgA和IgG CH3序列的交替区段，如Protein Engineering, Design & Selection vol. 23 no. 4 pp.195–202, 2010；或WO 2007/110205 A1中所述。当在哺乳动物细胞中表达时，得到的SEEDCH3结构域对优先缔合形成异二聚体。SEED体(Sb)融合蛋白由[IgG1铰链]-CH2-[SEED CH3]组成。
在一个实施方案中上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含第一或第二改造免疫球蛋白链(“AG-SEED”)，其具有根据SEQ ID NO:2的多肽序列，其中X1是K或S，X2是V或T，和X3是T或S。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一或第二改造免疫球蛋白链可包含根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，其中X1是K，X2是V，和X3是S；X1是K，X2是V，和X3是T；X1是K，X2是T和X3是S；X1是K，X2是T，和X3是T；X1是S，X2是V，和X3是S；X1是S，X2是V，和X3是T；X1是S，X2是T，和X3是S；或X1是S，X2是T，和X3是T。
在一个实施方案中上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含第一或第二改造免疫球蛋白链，其具有根据SEQ ID NO: 3的多肽序列("GA-SEED")，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6可以是任何氨基酸，例如X1、X2、X3、X4、X5、X6可独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。根据一个实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一或第二改造免疫球蛋白链具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中X1是L或Q，X2是A或T，X3是L、V、D或T；X4是F、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或T；X5是A或T，和X6是E或D。在优选的实施方案中，第一改造免疫球蛋白链包含根据SEQ ID NO: 5的氨基酸序列(“AG-SEED”)和上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二改造免疫球蛋白链包含根据SEQID NO: 6的氨基酸序列(“GA-SEED”)。
在一个实施方案中本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子以对EGFR至少KD=5x10-8M、1 x 10-9 M、1 x 10-10 M、1 x 10-11M、1 x 10-12的亲和力结合至上文公开的EGFR。根据一个实施方案本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子以对c-MET至少KD=5x10-8M、1 x 10-9 M、1 x 10-10 M、1 x 10-11M、1 x 10-12的亲和力结合至上文公开的c-MET。例如，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子通过第一和第二Fab或scFv片段以KD=5x10-8M、1 x 10-9 M、1 x 10-10 M、1 x 10-11M、1 x 10-12 M的亲和力结合c-MET和EGFR。EGFR和c-Met可例如存在于单细胞上，例如癌细胞，或例如呈现至细胞，例如癌细胞，其可以是单细胞、多个细胞或表达c-MET和EGFR二者的肿瘤组织。细胞也可例如在悬浮液中，或从组织脱离，和可在患有癌症的个体、例如人的血流中循环。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一和第二Fab和/或scFv片段的亲和力可通过ELISA或表面等离子体共振测定，如描述于J. Biochem. Biophys. Methods 57 (2003) 213 – 236, CurrentProtocols in Protein Science (2006) 19.14.1-19.14.17。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段衍生自西妥昔单抗(C225)。例如，异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段可包含西妥昔单抗的VL和VH序列，或例如已被人源化的西妥昔单抗的VL和VH序列。例如，用于本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的人源化是指包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体或抗体片段。给定抗体序列的人源化将导致用于引入人的异种抗体，例如鼠抗体或已包含人序列的嵌合抗体的免疫原性降低，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，西妥昔单抗是包含对人EGFR的N-末端部分特异性的225鼠EGFR单克隆抗体的Fv (可变；抗原-结合)区与人IgG1重链和κ轻链恒定(框架)区的嵌合抗体。
人源化可例如包含CDR移植技术，其包括将例如，小鼠抗体的互补决定区置换为人框架结构域，例如，参见WO 92/22653。表面重建(resurfacing)抗体的策略和方法和在不同宿主内减少抗体的免疫原性的其它方法公开于美国专利5,639,641。抗体可使用各种其它技术人源化，包括CDR-移植(参见例如EP 0 239 400 B1；WO 91/09967；美国专利号5,530,101；5,585,089)、镶盖(veneering)或表面重建(参见例如EP 0 592 106 ; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka G. M.et al., 1994, Protein Engineering, 7(6): 805-814; Roguska M.A. et al., 1994,PNAS, 91: 969-973)、链替换(参见例如美国专利号5,565,332)和柔性残基的鉴定(参见例如WO2009032661)。人抗体可通过本领域已知的各种方法制备，包括噬菌体展示方法，例如美国专利号4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和国际专利申请公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 91/10741。因此，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段可包含根据SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46的任一个的VL和VH序列。例如，异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段的VL氨基酸序列可包含根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46的氨基酸序列和VH氨基酸序列选自SEQID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12。上文公开的第一Fab或scFv片段的VL和VH序列可例如包含SEQ ID NO:43和SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 9、或例如SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 9、或SEQ IDNO:45和SEQ ID NO: 9、或SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 11。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQID NO: 33、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51的VL序列。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQID NO:34、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52的VH序列。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一和第二Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 17、SEQ IDNO:18或SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48 (例如其可包含于本发明的分子“225-LxB10”)或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:32 (例如其可包含于本发明的分子“225-MxB10v5”)或SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50 (例如其可包含于本发明的分子“225-HxF06”)或SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:52 (例如其可包含于本发明的分子“225-HxCS06”)或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52 (例如其可包含于本发明的分子“225-MxCS06”)的氨基酸序列。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一和第二Fab或scFv片段包含根据SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 33、SEQ IDNO: 34、SEQ ID NO: 52 (例如对应于本发明的分子“225-MxCS06”)或SEQ ID NO:45、SEQID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50 (例如对应于本发明的分子“225-HxCS06”)的氨基酸序列。
在一个实施方案中本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fc结构域与新生Fc受体(FcRn)相互作用。FcRn是主要组织相容性复合物I类样异二聚体，由可溶性轻链β2-微球蛋白(β2m)和膜结合重链构成。晶体结构分析揭示，人FcRn (hFcRn)结合至IgG的Fc同二聚体的两条重链的CH2-CH3铰链区，导致2:1化学计量。在FcRn和Fc之间的相互作用主要通过在阴离子FcRn残基和IgG的组氨酸残基(其在酸性pH下质子化)之间的盐桥来稳定。FcRn/IgG Fc复合物的定点诱变研究和晶体结构分析显示在CH2结构域的位置252–256和CH3结构域的位置310、433、434和435的Fc氨基酸残基是FcRn相互作用位点的核心或紧密接近FcRn相互作用位点，和保守的组氨酸残基H310和可能H435负责pH依赖性(参见例如mAbs6:4, 928–942; July/August 2014; Nature Reviews Immunology 7, 715-725(September 2007))。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可与FcRn通过上文公开的盐桥相互作用，或可与FcRn通过包括AG-SEED和GA-SEED二者的其它氨基酸的盐桥相互作用，从而保护本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子免于降解，并延长其血清半寿期。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的延长的半寿期可例如用于使由高剂量的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子引起的不良反应最小化，如果给予个体，例如通过i.v.或i.m.施用，这还将例如导致注射本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的频率减少。这还将例如减少对可能需要用本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子治疗的个体的经济负担。例如，AG-SEED和GA-SEED的序列变体可用于减少本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子与FcRn的相互作用，从而缩短其血清半寿期。例如，序列变体包括上文公开的那些，AG-SEED，其中X1、X2和X3表示任何氨基酸；或例如优选地AG-SEED，其中X1是K或S，X2是V或T，和X3是T或S，或例如上文公开的GA-SEED，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6可以是任何氨基酸。可例如优选的是，在GA-SEED中X1是L或Q，X2是A或T，X3是L、V、D或T；X4是F、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或T；X5是A或T，和X6是E或D。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的与FcRn相互作用的氨基酸衍生自IgG1，优选地人IgG1。例如，与FcRn相互作用的氨基酸包含上文公开的野生型IgG1的那些，例如在CH2结构域的位置252–256和CH3结构域的310、433、434和435的Fc氨基酸残基是FcRn相互作用位点的核心或紧密接近FcRn相互作用位点，其中保守的组氨酸残基H310和可能H435可例如赋予在本发明的异二聚体免疫球蛋白分子和FcRn之间的相互作用的pH依赖性。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子介导抗体依赖性细胞毒性。例如，当结合至相同细胞的表面上表达的EGFR和c-MET时，或例如当结合至两个细胞(其中一个表达EGFR和第二个表达c-MET)时，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子诱导ADCC，其中例如EGFR和c-Met如上文所定义。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子与在相同细胞上或在两个单独细胞上，但优选地在相同细胞上存在的EGFR和c-Met的结合如上文公开的。用于本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的术语ADCC (抗体依赖性细胞毒性)是指细胞介导的免疫防御机制，其中免疫系统的效应细胞主动溶解膜表面抗原已被特异性抗体结合的靶细胞。ADCC通过例如在NK细胞上表达的CD16(FcγRIII)与抗体的Fc结构域的结合介导(参见例如Clynes等(2000) Nature Medicine6，443-446)。ADCC可例如通过在Fc结构域中影响Fc结构域与CD16的结合的氨基酸取代改进。例如，Shields等(J Biol Chem 9(2)，6591-6604 (2001))显示在Fc区的位置298、333和/或334 (EU编号的残基)的氨基酸取代改进ADCC。或者，Fc受体结合和效应功能的增加可例如通过改变Fc区的糖基化获得。连接至Fc结构域的Asn 297的两个复合二分支寡糖通常插入在CH2结构域之间，形成与多肽骨架的广泛接触，和它们的存在对于抗体介导效应功能包括ADCC是必需的(Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis etal., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright and Morrison, Trends Biotechnol15, 26-32 (1997))。例如β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III (GnTIII) (一种催化形成二分寡糖的糖基转移酶)的过表达显著增加抗体的体外ADCC活性。因此，在用于生产本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的细胞系中例如GnTIII的过表达可产生富含二分寡糖的本发明的融合蛋白，其通常也是非-岩藻糖基化的和可显示增加的ADCC。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ IDNO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ IDNO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:51、SEQID NO: 52的本发明的双特异性异二聚体免疫球蛋白分子的至少一个氨基酸序列。例如，本发明的分离的多核苷酸可编码至少1个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个上文公开的氨基酸序列。例如，在一个实施方案中，分离的多核苷酸包含编码根据SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 52的本发明的双特异性异二聚体免疫球蛋白分子的至少一个氨基酸序列的多核苷酸，例如本发明的分离的多核苷酸可包含编码根据(225M、CS06) SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 33、SEQ IDNO: 34、SEQ ID NO: 52，或(225H、CS06) SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的多核苷酸。例如，在一个实施方案中，根据本发明的分离的多核苷酸可例如包含编码根据SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，根据本发明的多核苷酸例如包含编码根据SEQ ID NO: 31、SEQ IDNO: 32、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46的氨基酸的多核苷酸。例如，在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码根据SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在一个实施方案中，根据本发明的多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO: 9、SEQ IDNO: 43、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18,或SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48 (例如其可包含于本发明的分子“225-LxB10”)，或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 31、SEQ IDNO: 51、SEQ ID NO:32 (例如其可包含于本发明的分子“225-MxB10v5”)，或SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50 (例如其可包含于本发明的分子“225-HxF06”)，或SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52 (例如其可包含于本发明的分子“225-HxCS06”)，或 SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52 (例如其可包含于本发明的分子“225-MxCS06”)，或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 33、SEQID NO: 34、SEQ ID NO: 52 (例如对应于本发明的分子“225-MxCS06”)，或SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50 (例如对应于本发明的分子“225-HxCS06”)，或(225M、CS06) SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52，或(225H、CS06) SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50，或(例如相应的本发明分子“225M、B10v5”) SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:32，或(例如相应的本发明分子“225H、CS06”) SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50的氨基酸序列的多核苷酸。例如，本发明的上述氨基酸序列的每一个的核苷酸序列可使用基于网络的工具，例如“Translate tool” (http://web.expasy.org/translate/)通过翻译获得，和可例如根据预期的表达系统或宿主，经密码子优化(参见例如Trends Mol Med. 2014 Nov;20(11):604-13；Genome Res. 2007 Apr;17(4):401-4)。例如，编码上文公开的氨基酸序列的多核苷酸可包含在单个多核苷酸中，其各自被视为根据本发明的多核苷酸，或例如根据本发明的多核苷酸可包含编码两个上文公开的氨基酸序列的多核苷酸，例如SEQ ID NO: 31、SEQID NO: 32，或SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34，或SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，或SEQ IDNO: 29、SEQ ID NO: 30，或SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 9，或SEQ ID NO 49、SEQ ID NO:50。上文公开的根据本发明的多核苷酸可例如用于生产本发明的双特异性异二聚体免疫球蛋白分子，例如通过在适合的宿主或宿主细胞中异源表达。
用于根据本发明的多核苷酸的术语“分离的”是指与例如多核苷酸在自然中与其正常相关的细胞和其它组分分开的多核苷酸，例如分离的多核苷酸是至少80%、90%、95%重量纯的，即不含污染的组分。例如，本发明的分离的多核苷酸可以指与在其所来源的生物的天然存在的基因组中与其直接相邻(在5′和3′方向)的序列分开的DNA分子。例如，“分离的多核苷酸”可包含插入至载体例如质粒或病毒载体，或整合至原核生物或真核生物的基因组DNA的DNA分子。
在一个实施方案中，本发明提供了包含上文公开的根据本发明的至少一种多核苷酸的载体。根据本发明的术语载体或表达载体是指能够染色体外复制的核酸分子。优选的载体是能够自主复制和表达它们连接的核酸的那些。能够指导它们可操作连接的基因的表达的载体在本文称为“表达载体”。总体上，用于重组DNA技术的表达载体通常为“质粒”的形式，其一般是指环状双链DNA环，其在载体形式时不结合至染色体。对于在真核细胞中表达异二聚体双特异性免疫球蛋白分子必需的核酸序列包含例如至少一个启动子、和增强子、终止和多腺苷酸化信号以及可选择标记、例如抗生素抗性。可用于表达本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的表达载体可例如包含pCMV、pcDNA、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6、pVL1392、pVL1393、pACYC177、PRS420，或如果使用基于病毒的载体系统，例如pBABEpuro、pWPXL、pXP-衍生的载体，可例如包含pCMV、pcDNA、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6、pVL1392、pVL1393、pACYC177、PRS420，或如果使用基于病毒的载体系统，例如pBABEpuro、pWPXL、pXP-衍生的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了包含上文公开的多核苷酸序列或载体的宿主细胞，例如包含上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的至少一个编码序列的多核苷酸或载体或表达载体。例如，用于本发明的宿主细胞可以是酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。例如，本发明的宿主细胞可以是选自Sf9、Sf21、S2、Hi5或BTI-TN-5B1-4细胞的昆虫细胞，或例如本发明的宿主细胞可以是选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的酵母细胞，或例如本发明的宿主细胞可以是选自HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK 293F、NS0、per.C6、MCF-7、HeLa、Cos-1、Cos-7、PC-12、3T3、Vero、vero-76、PC3、U87、SAOS-2、LNCAP、DU145、A431、A549、B35、H1299、HUVEC、Jurkat、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、Caco-2、CHO、CHO-K1、CHO-B11、CHO-DG44、BHK、AGE1.HN、Namalwa、WI-38、MRC-5、HepG2、L-929、RAB-9、SIRC、RK13、11B11、1D3、2.4G2、A-10、B-35、C-6、F4/80、IEC-18、L2、MH1C1、NRK、NRK-49F、NRK-52E、RMC、CV-1、BT、MDBK、CPAE、MDCK.1、MDCK.2和D-17的哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了生产上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的方法，其中本发明的方法包括在足以异源表达所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的条件下培养上文公开的根据本发明的宿主细胞和纯化所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的步骤。例如，可允许本发明的宿主细胞在含有10% FBS的DMEM中生长和在37 ℃在10% CO2中孵育，或例如在无蛋白培养基中生长以帮助后续分离和纯化，或例如在Grace昆虫培养基、express Five ® SFM (Life Technologies)或High Five ®培养基(Life Technologies)、YNM培养基、YPD肉汤或例如PichiaPink (Life technologies)中生长。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子在哺乳动物细胞中的表达可根据描述于Methods Mol Biol. 2012;907:341-58的方法进行。昆虫细胞也可例如用于表达本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，例如描述于Journal of Immunological Methods318 (2007) 37–46的果蝇S2细胞。酵母细胞例如也可用于表达本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，例如描述于Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Dec;98(24):10023-39或Biotechnol Lett. 2015 Jul;37(7):1347-54的巴斯德毕赤酵母。
可例如允许本发明的宿主细胞生长12-408h，例如约12-约400h、例如14h、16h、18h、20h、24h、36h、48h、72h、96h-约120h、144h、168h、192、216h、240h、264h、288h、312h、336h、360h、384h、408h。随后，本发明的vNAR或本发明的融合蛋白可被分离和纯化。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可通过色谱、例如离子交换色谱、大小排阻色谱、硫酸铵沉淀或超滤进行纯化和分离。例如，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子还可包含信号序列，其是指能够启动其可操作连接(例如通过肽键)的多肽进入宿主细胞的内质网(ER)的氨基酸序列。信号肽通常被内肽酶(例如特异性ER-定位信号肽酶)切除以释放(成熟)多肽。信号肽的长度范围通常是约10-约40个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明提供了上文公开的根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其可通过上文公开的本发明的方法获得。例如，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可通过上文公开的本发明的方法产生和分离。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子与至少一个接头共价偶联。术语“接头”或“接头肽”是指合成或人工氨基酸序列，其联接或连接两个分子，例如连接两个多肽结构域的两个多肽序列，或例如蛋白和细胞生长抑制药物，或毒素。用于本发明的术语“合成”或“人工”是指并非天然存在的氨基酸序列。共价连接至本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的接头是可裂解的或不可裂解的。用于本发明的术语“可裂解”是指可被蛋白酶、酸或通过还原二硫化物体(例如谷胱甘肽介导的或谷胱甘肽敏感性的)裂解的接头。例如，可裂解接头可包含缬氨酸-瓜氨酸接头、腙接头或二硫化物接头。可例如共价结合至本发明的包含氨基供体的底物的不可裂解的接头包含至MMAF的马来酰亚胺基己酰基接头(mc-MMAF)、N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-甲酸酯(MCC)或巯基-乙酰胺基己酰基接头。例如，共价偶联至本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的接头还可包括描述于WO 2010/138719的接头，或描述于WO 2014/093379的那些。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的接头偶联至染料、放射性同位素或细胞毒素。用于上文公开的接头的术语“偶联”是指染料、放射性同位素或细胞毒素可例如通过例如离子或疏水相互作用非共价或共价连接至上文公开的接头分子的事实。例如，接头可包含链霉亲和素并且染料、放射性同位素或细胞毒素可共价连接至生物素。例如，可共价连接或偶联至本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的染料也可以是荧光团，例如1,8-ANS、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素、吖啶、Alexa Fluor 350™、Alexa Fluor 405™、AMCA、AMCA-X、ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Rho13、ATTO Rho14、ATTO Rho101、Pacific Blue、AlexaFluor 430™、Alexa Fluor 480™、Alexa Fluor 488™、BODIPY 492/515、Alexa Fluor532™、Alexa Fluor 546™、Alexa Fluor 555™、Alexa Fluor 594™、BODIPY 505/515、Cy2、cyQUANT GR、FITC、Fluo-3、Fluo-4、GFP (EGFP)、mHoneydew、Oregon Green™ 488、Oregon Green™ 514、EYFP、DsRed、DsRed2、dTomato、Cy3.5、藻红蛋白(PE)、罗丹明红、mTangerine、mStrawberry、mOrange、mBanana、四甲基罗丹明(TRITC)、R-藻红蛋白、ROX、DyLight 594、Calcium Crimson、Alexa Fluor 594™、Alexa Fluor 610™、Texas Red、mCherry、mKate、Alexa Fluor 660™、Alexa Fluor 680™ 别藻蓝蛋白、DRAQ-5、羧基萘并荧光素、C7、DyLight 750、Cellvue NIR780、DM-NERF、伊红、藻红、荧光素、FAM、羟基香豆素、IR染料(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、甲氧基香豆素、萘并荧光素、PyMPO、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、丹磺酰氯、HEX、6-JOE、NBD (7-硝基苯并-2-氧杂-l,3-二唑)、OregonGreen 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、酞酸、对酞酸、异酞酸、甲酚基永久紫、甲酚基蓝紫、甲酚基亮蓝、对氨基苯甲酸、藻红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、铕三双吡啶二胺、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷或La Jolla蓝染料。可用于本发明的染料还可例如包括量子点。用于本发明的术语量子点是指半导体材料的单一球形纳米晶体，其中纳米晶体的半径小于或等于半导体材料的激子玻尔半径的大小(激子玻尔半径的值可根据含有关于半导体性质的信息的手册中发现的数据计算，例如CRC Handbook of Chemistry and Physics, 83rd ed., Lide,David R. (Editor), CRC Press, Boca Raton, Fla. (2002))。量子点是本领域已知的，因为它们描述于参考文献中，例如Weller，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 41-53(1993)，Alivisatos，J. Phys. Chem. 100: 13226-13239 (1996)，和Alivisatos，Science271: 933-937 (1996)。量子点可例如为约1 nm-约1000 nm直径，例如10nm、20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350nm、400 nm、450 nm或500 nm、优选地至少约2 nm-约50 nm，更优选地QD为至少约2 nm-约20nm直径(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 nm)。QD的特征为其基本上均匀的纳米大小，通常显示大约10%-15%多分散性或大小范围。QD在激发时能够发射电磁辐射(即，QD是光致发光的)和包括一种或多种第一半导体材料的"核心"，和可以被第二半导体材料的"外壳"围绕。被半导体外壳围绕的QD核心被称为"核心/外壳" QD。围绕的"外壳"材料优选地具有大于核心材料的带隙能量的带隙能量，和可经选择以具有靠近"核心"基质的原子间距。核心和/或外壳可以是半导体材料，包括但不限于II-VI族(ZnS、ZnSe、ZnTe、US、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe等)和III-V族(GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb等)和IV族(Ge、Si等)材料、PbS、PbSe和合金的那些或其混合物。优选的外壳材料包括ZnS。量子点可通过本领域已知的任何方法偶联至本发明的接头、酶或蛋白，例如公开于Nanotechnology.2011 Dec 9;22(49):494006; Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 84 (2011)360–368的方法。例如，上文公开的接头可共价结合或偶联至放射性同位素，例如47Ca、14C、137Cs、157Cr、57Co、60Co、67Cu、67Ga、123I、125I、129I、131I、32P、75Se、85Sr、35S、201Th、3H，优选地，放射性同位素掺入其它分子，例如螯合剂。可例如用作共价结合至本发明的含氨基供体底物的其它分子的典型的螯合剂是DPTA、EDTA (乙二胺四乙酸)、EGTA (乙二醇-O,O'-双(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸、NTA (氮川三乙酸)、HEDTA (N-(2-羟基乙基)-乙二胺-N,N',N'-三乙酸)、DTPA (2-[双[2-[双(羧甲基)氨基]-乙基]氨基]乙酸)或DOTA (1,4,7,10-四氮杂环-十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
例如，接头可共价偶联至细胞毒素，其也可例如称为“有效负载” (参见例如Perezet al. Drug Discovery Today Vol 19 (7), July 2014)。例如适合共价连接至接头分子的细胞毒素可分为两大类：第一类包括破坏微管装配的细胞毒素和第二类包括靶向DNA结构的细胞毒素。因此，可例如共价偶联至上文公开的接头的细胞毒素包括多柔比星、卡奇霉素、阿里他汀、美登素、duoarmycin和其类似物、α-amaitin、tubulysin和其类似物。共价偶联或连接细胞毒素至接头的方法是本领域已知的，和可例如根据公开于Mol.Pharmaceutics 2015，12，1813−1835的方法进行。
在一个实施方案中，上文公开的至少一个接头共价偶联至本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的至少一个Fab或scFv轻链(VL)。因此，本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的至少一条轻链、例如一条或两条轻链可偶联至上文公开的接头。例如，共价偶联可通过主要在C-末端引入一个或多个、例如2、3或4、5或6个另外的半胱氨酸残基至scFv分子进行，其允许缀合至巯基反应性试剂，如公开于例如Merty et al. ProteinExpression and Purification 21, 156–164 (2001); Nataranja, A et al. .Bioconjugate Chem. 16, 113–121; Krimner et al. Protein Eng., Des. Sel. 19,461–470; Albrecht et al. Bioconjugate Chem. 15, 16–26)。半胱氨酸残基还可例如通过使它们与α-卤代酮或Michael受体例如马来酰亚胺衍生物反应被烷基化。或者，可例如利用赖氨酸残基的修饰，其是用于通过赖氨酸伯氨基标记蛋白的最古老和最直接的方法。在目的蛋白内的赖氨酸的ε-氨基可容易与活化酯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯反应，得到相应酰胺、磺酰胺、脲和硫脲(参见例如Takaoka等，Angew. Chem. Int. Ed. 2013，52，4088– 4106)。生物缀合的其它实例包括荧光蛋白、染料或系链(tethering)与功能分子例如PEG、卟啉、肽、肽核酸和药物的缀合(Takaoka等，Angew. Chem. Int. Ed. 2013，52，4088 –4106)。
例如，酶-介导的缀合还可应用于共价偶联上文公开的接头至本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子。例如，WO 2014/001325 A1公开了使用分选酶A来位点特异性生物缀合至抗体的Fc区。分选酶A (SrtA)是首先描述于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细菌整合膜蛋白。SrtA催化转肽反应，将蛋白锚定至细菌细胞壁。在识别分选信号LPXTG (X = D、E、A、N、Q或K)时，催化性半胱氨酸裂解残基T和G之间的肽键，导致形成硫代酰基中间体。该硫代酰基中间体随后可与作为亲核基团起作用的氨基末端甘氨酸反应。SrtA接受N末端(寡)甘氨酸作为亲核基团，在两个分子之间产生新肽键。SrtA在生理条件下起作用，和已用于生物缀合反应来用例如生物素标记蛋白，或用植物细胞毒素白树毒素(gelonin)将HER2-特异性的重组Fab官能化(参见例如Popp等(2011) Angew Chemie Int.Ed. 50: 5024-5032；Kornberger等(2014) mAbs 6 (2): 354-366)。通常，靶标蛋白例如上文公开的第一和/或第二Fab或scFv片段的VL和VH链在羧基端用LPXTG基序标记，接着被纯化标签标记，使得SrtA-介导的转肽作用除去纯化标签和产生标记的蛋白。
在一个实施方案中，上文公开的根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含共价偶联至所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fab或scFv轻链的两个接头。例如，接头可偶联至上文公开的特异性结合至EGFR的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一Fab或scFv片段的VL链(轻链)，和例如上文公开的特异性结合至c-MET的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第二Fab或scFv片段的VL链。
在一个实施方案中上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fab或scFv轻链和/或CH3结构域和/或CH2结构域共价偶联至接头，其中所述接头共价偶联至上文公开的染料、放射性同位素或细胞毒素。
例如，第一和第二Fab或scFv片段的VL链可共价偶联至上文公开的接头，其中接头进一步偶联至上文公开的染料、放射性同位素或细胞毒素，或上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的两个改造CH3结构域(“AG-SEED”、“GA-SEED”)可共价偶联至上文公开的接头，或例如上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的CH2结构域可各自共价偶联至上文公开的接头。用抗-CD30单克隆抗体– 阿里他汀E (MMAE)缀合物的研究表明，用抗体:药物化学计量1:2-1:4的ADC是最有效的，其中1:4的比率是最优选的(参见例如Hamblett et al. Clinical Cancer Research (2004) Vol. 10, 7063–7070)。因此，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子可例如包含2、3或4个接头分子，其共价偶联至本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中每个接头优选地偶联至上文公开的细胞毒素，例如本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的VL链和VH链可通过上文公开的接头偶联至细胞毒素。例如，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的VH链和CH3结构域可共价偶联至接头，其中每个接头进一步偶联至细胞毒素。或者，上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的第一和第二Fab或scFv片段的VL链和CH3或CH2结构域可共价偶联至接头，其进一步偶联至上文公开的细胞毒素。
在一个实施方案中，上文公开的根据本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子用于治疗癌症。用于本发明的术语"癌症"是指由细胞的异常的不受控制生长引起的各种病况，例如能够引起癌症的细胞，称为"癌细胞"，具有特征性性质例如不受控制的增殖、永生化、转移潜力、快速生长和增殖速率和/或某些典型的形态学特征。癌细胞可例如呈肿瘤的形式，但这样的细胞也可单独存在于受试者内，或可以是非致瘤性癌细胞。用于本发明的治疗方法的情况下的术语癌症可例如是指前列腺癌、乳腺癌、肾上腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨和结缔组织肉瘤、脑肿瘤、甲状腺癌、胰腺癌、脑垂体癌、眼癌、阴道癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、结肠癌,直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、睾丸癌、阴茎癌、口腔癌、皮肤癌、肾癌、维尔姆斯瘤和膀胱癌、转移(mCRC)、不可切除的肝转移、头和颈的鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、梅克尔细胞癌。
在一个实施方案中，本发明提供了包含上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种其它成分的组合物。例如，本发明的组合物可包含上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子以及水、缓冲液、稳定剂、盐、糖、防腐剂(例如苯扎氯铵)、脂质、抗氧化剂、羧酸、聚乙二醇(PEG)的一种或多种。例如，缓冲液或缓冲溶液可具有约5-约9的pH，例如约pH 5-约pH 6，或约pH 6-约pH 7，或约pH 8-约pH 9，或约5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5.、7.6、7.7、7.8-约8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9和可例如包含乙酸钠、组氨酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液。例如，乙酸钠、组氨酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐可以约10mM、15 mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM-约60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM的浓度存在于根据本发明的组合物中。例如，上文公开的缓冲溶液可与防腐剂例如苯扎氯铵组合，以稳定上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子。其它成分可例如包括具有200-4000道尔顿、例如300、400、500600、700、800、900、1000、1500、1750、2000、2250、2500、3000、3500道尔顿的平均分子量的聚乙二醇和其衍生物。也可例如使用聚乙二醇衍生物和可例如包括聚乙二醇单月桂酸酯、聚乙二醇单油酸酯和聚乙二醇单棕榈酸酯。例如，根据本发明的组合物可包含以水性或冻干形式的上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种另外的化学治疗剂，其中所述治疗剂选自卡培他滨、5-氟-2'-脱氧尿苷、伊立替康、6-巯嘌呤(6-MP)、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、博来霉素、紫杉醇、苯丁酸氮芥、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊苷、秋水仙胺、秋水仙碱、培美曲塞、喷司他丁、硫鸟嘌呤；亚叶酸、顺铂、卡铂、奥沙利铂、或5-FU、亚叶酸的组合、5-氟尿嘧啶/亚叶酸的组合(5-FU/FA)、5-氟尿嘧啶/亚叶酸(5-FU/FA)和奥沙利铂(FLOX)的组合、5-FU、亚叶酸、奥沙利铂的组合(FOLFOX)或5-FU、亚叶酸和伊立替康的组合(FOLFIRI)或亚叶酸、5-FU、奥沙利铂和伊立替康的组合(FOLFOXIRI)或卡培他滨和奥沙利铂的组合(CapeOx)。
在一个实施方案中，本发明提供了包含上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种其它成分，或包含上文公开的本发明的组合物的药物组合物。例如，本发明的药物组合物可包含浓度为约10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml-约70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、112mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、或例如约10 mg/ml-约20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml-约70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、112mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、或例如20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml-约70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、112mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml的上文公开的本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和例如上文公开的水性缓冲液。上文公开的本发明的药物组合物还可例如包含表面活性剂，例如阴离子表面活性剂，例如烷基硫酸钠的混合物；阳离子表面活性剂，例如季铵和吡啶鎓阳离子表面活性剂；或非离子表面活性剂，例如去水山梨糖醇酯、聚山梨酯例如Polysorbat 20 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇单月桂酸酯)、Polysorbat 21 (聚氧乙烯-(4)-去水山梨糖醇单月桂酸酯)、Polysorbat 40 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Polysorbat 60 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇-单硬脂酸酯)、Polysorbat 61 (聚氧乙烯-(4)-去水山梨糖醇单硬脂酸酯)、Polysorbat 65 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇三硬脂酸酯)、Polysorbat 80 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇单油酸酯)、Polysorbat 81(聚氧乙烯-(5)-去水山梨糖醇单油酸酯)、Polysorbat 85 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇三油酸酯)、Polysorbat 120 (聚氧乙烯-(20)-去水山梨糖醇单异硬脂酸酯)或泊洛沙姆例如泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆124、泊洛沙姆105苯甲酸脂。可包含在根据本发明的药物组合物中的防腐剂可以是浓度为0.004%-0.01%的苯扎氯铵。例如，本发明的药物组合物可通过使用常规技术，作为离散剂型例如胶囊、在水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油液体乳剂或油包水乳剂和作为大丸剂；连同适合的药学上可接受的载体一起配制。
在一个实施方案中上文公开的本发明的药物组合物用于治疗癌症。例如，用于治疗癌症的上文公开的本发明的药物组合物可给予患有癌症的人。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗方法，其包括给予受试者治疗有效量的上文公开的本发明的药物组合物。例如，本发明的治疗方法可包括给予患有上文公开的癌症的有需要的人约0.001 mg/kg-约50 mg/kg的本发明的药物组合物或约0.005 mg/kg-约45mg/kg或约0.01 mg/kg-约40 mg/kg或约0.05 mg/kg-约35 mg/kg或约0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg、1.5 mg/kg、2 mg/kg、2.5 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、12.5 mg/kg、15 mg/kg、17.5 mg/kg、20 mg/kg、22.5 mg/kg、25 mg/kg-约26 mg kg/、27 mg/kg、28 mg/kg、29 mg/kg、30 mg/kg、32.5mg/kg、35 mg/kg、37.5 mg/kg、40 mg/kg、42.5 mg/kg、45 mg/kg。在本发明中所用的术语“mg/kg”是指mg的本发明的药物组合物/kg体重。例如，药用有效量的本发明的药物组合物可给予患有癌症的个体。药用有效量取决于个体、待治疗的癌症类型、个体的体重和年龄、疾病的水平或给予途径。
实施例
实施例1：产生抗c-Met和抗-EGFR结合剂
产生c-MET结合剂
针对人c-MET的幼稚噬菌体展示抗体基因文库HAL7/8的淘选根据Hust和其同事36;37进行。简言之，在用淘选缓冲液(1%脱脂奶粉、1% BSA、0.05% Tween®20/PBS)在maxisorp96孔板(Nunc)中预选择后，scFv展示噬菌体在1 µg固定的c-MET-Fc (R&D Systems，358-MT/CF)或c-MET SEMA结构域(内部产生)上选择，和用胰蛋白酶洗脱。在2-3轮淘选后，富集c-MET特异性结合剂和通过产生的scFv的捕获c-MET ELISA筛选。
对于亲和力成熟，(a) 用于可变结构域的易错PCR使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(Agilent Technologies)根据生产商的说明书进行，(b) 重链的互补决定区3 (CDR-H3)的随机化应用节俭诱变策略70，通过GeneArt定制，和(c) 使用多样化的HAL7/8进行轻链替换。淘选使用分别对F06和B10的噬菌体展示和酵母展示进行。对于克隆F06，通过用100µl淘选缓冲液/孔严格洗涤(10次)以及加入可溶性c-MET用于竞争(在第二轮开始)应用解离速率筛选策略。CS06基于来自方法(a)和(b)的丰富突变的合理组合。B10v5得自使用酵母表面展示的方法(c)，如描述于例如Biotechnol.Bioeng. 2009；103: 1192-201；ProteinEng Des Sel 2010；23: 155-9。
产生抗-EGFR结合剂
结合至EGFR 42的细胞外结构域的C225的结构用Rosetta蛋白结构和设计程序(2.3.0版本)优化，使用固定骨架方案和侧链优化以使根据Rosetta能量函数的起始设计模型能量最小化。晶体结构中观察到的界面水分子在最小化期间保留，但在随后设计计算期间不保留。在抗体-抗原界面处或附近的37个残基被选择用于饱和、经计算机的点诱变。在每个这些残基中产生19个变体(野生型和18个突变，无半胱氨酸)，优化突变残基的旋转异构体同时保持骨架固定。使用这些初步模型，邻接残基鉴定为在设计残基上在5.5 Å的重原子内具有至少3个重原子的任何残基。突变残基的旋转异构体和其邻接残基使用标准Rosetta评分函数优化(各项的线性组合，包括Lennard-Jones势能、取向依赖性氢键合势能、隐式溶剂化模型和统计学项，其记录(capture)骨架依赖性氨基酸和旋转异构体偏好)。疏水取代将在其它地方描述。对仅在取向依赖性氢键合评分或对势(pair potential)方面相对于重装配的天然物具有至少0.5 Rosetta能量单位的改进的那些变体过滤极性取代，以选择改进的变体。三个亲和力增强的点取代组合成三重突变体，这通过Rosetta按上对于点突变体所述进行重装配和评分。选择的变体的亲和力通过表面等离子体共振体外测量。变体也转移至hu225 scFv和在此情况下的亲和力通过生物层干涉测定法验证。
实施例2：双特异性c-MET x EGFR SEED体的表达和纯化
本文公开的根据本发明的EGFR和c-MET抗体片段的数个组合使用SEED-技术接合成双特异性抗体。
双特异性c-MET x EGFR SEED体通过瞬时转染Expi293FTM细胞(人胚肾细胞)根据转染试剂盒的生产商的说明书(Invitrogen)表达。简言之，悬浮的Expi293FTM细胞在Expi293FTM表达培养基(Invitrogen)中在37℃、5% CO2和180 rpm下培养。在转染当天，以最终2x106个活细胞/ml的密度将细胞接种在新鲜培养基中。在Opti-MEM® I培养基(Invitrogen)中稀释的DNA-ExpiFectamineTM293试剂混合物加入至细胞。转染后16 h，加入ExpiFectamineTM293转染增强剂1和2。含有选择的抗体的细胞上清液在转染后5天通过4,300xg在4℃离心20 min和通过0.22 µm Stericup或Steriflip装置(Millipore)过滤收获。以体积25 ml进行小规模生产和根据生产商的说明书用PROSEP® A centrifugal蛋白A柱(Millipore、#P36486)进行纯化，接着使用Pur-A-LyzerTM透析试剂盒(Sigma-Aldrich)透析至PBS pH 7.4。
在表达体积200 ml中进行大规模生产。上清液在ÄKTA Explorer 100 (GEHealthcare)上通过亲和色谱(5 ml HiTrap MabSelect SuRe，GE Healthcare)，接着制备型大小排阻色谱(HiLoad 26/60Superdex 200 pg，GE Healthcare)纯化。蛋白浓度通过UVA280光谱法测定和纯度通过用4%/8% NuPAGE BisTris凝胶(Life technologies)的凝胶电泳和考马斯染色以及分析型大小排阻高效液相色谱(TSK Super SW3000，Tosoh)分析。内毒素水平通过Limulus amebocyte lysate Endosafe® PTS柱和Endosafe® PTS reader(Charles River)评价。
人源化oa 5D5 (MetMAb、onartuzumab)、LY2875358 (LA480_vC8H241、emibetuzumab)和h224G11 (ABT-700)的抗体VH和VL序列得自公开可得的信息(例如美国专利号US 6,214,344B1、US 8,398,974 B2、US 0,273,060A1)。将序列克隆至含有恒定IgG1轻链和重链片段的哺乳动物表达载体，除了应用oa 5D5 knob-into-hole技术的情况之外(例如公开于Protein Eng 1996；9: 617-21)。所有抗-c-MET参考抗体以及西妥昔单抗(C225，Erbitux)和马妥珠单抗在HEK293E细胞中用例如如上所述的标准转染和纯化程序经内部产生(Merck)。
实施例3：双特异性c-MET x EGFR抗体与细胞上的c-MET和EGFR的结合
测试双特异性c-MET x EGFR抗体、单臂(单价)对照抗体(抗-c-MET和抗-EGFR)以及不相关的同种型对照(抗-鸡蛋溶菌酶、抗-HEL)与表达c-MET和EGFR的NCI-H441细胞的结合(例如，显示在图1、图15中)。NCI-H441细胞用胰蛋白酶解离，以250xg在4℃离心10 min和重悬浮于FACS缓冲液(1%BSA/1xPBS)。细胞以密度1x105个细胞/孔在冰上转移至96孔圆底板。在冰上将纯化的c-MET x EGFR双特异性抗体(0.02 – 200 nM)一式三份加入FACS缓冲液达1h。细胞以1000xg在4℃离心5 min和用100 µl FACS缓冲液洗涤3次。细胞用在FACS缓冲液中稀释的500 ng/孔的荧光素(FITC)-缀合的山羊抗-人Fc γ片段IgG特异性抗体(JacksonImmunoResearch)在冰上孵育1 h。细胞再用100 µl FACS缓冲液洗涤3次。对于非存活细胞的复染，将离心的细胞重悬浮于在FACS缓冲液中稀释(1:200)的200 µl碘化丙啶溶液(Invitrogen)。在488 nm使用Guava easyCyte HT细胞计数仪(Millipore)分析细胞的荧光。数据作为平均荧光强度(减去背景(例如未染色的细胞对照)的原始荧光)针对双特异性抗体浓度的对数作图和使用GraphPad Prism 4 (GraphPad Software)拟合至具有可变斜率的S形剂量反应曲线。
实施例4：使用生物层干涉测定法(BLI)的c-MET结合剂的表位框并
表位框并实验用用于双特异性抗体的c-MET抗体进行，和与来自文献的参考抗体(MetMAb、Emibetuzumab、h224G11)比较。使用生物层干涉测定法的生物传感器实验在装配有抗-人Fc (AHC)生物传感器尖端(Forté Bio)的Octet Red平台(Forté Bio)上进行。所有数据在30 ℃在动力学缓冲液(PBS pH 7.4、0.1% BSA、0.02% Tween-20中收集。人c-METECD-His (HGFR、肝细胞生长因子受体细胞外结构域)内部产生和纯化。生物传感器尖端在PBS中平衡30 sec。然后，在PBS中25 nM的二价IgG和50 nM的单价单臂抗体作为第一抗体固定在生物传感器尖端上200 sec。尖端用400 nM的不相关对照抗体(抗-鸡蛋溶菌酶、抗-HELSEED，稀释在PBS中)淬灭，以使第二抗体与生物传感器尖端的后续结合最小化。在动力学缓冲液中60 sec获得基线后，人c-MET-ECD经历固定的第一抗体600 sec。之后，分析第二抗-c-MET抗体与结合至固定的第一抗体的c-MET-ECD的相互作用600 sec。通过区分特征为与不相关同种型对照(抗-HEL SEED)相比更高结合速率[nM]的同时结合，视觉分析第二抗体结合。表位框并的结果在图2A中描述。
实施例5：HGF竞争ELISA测定/通过单克隆抗体的HGF置换
重组人HGF (肝细胞生长因子，R&D Systems，294-HGN/CF)与结合至重组人c-MET ECD(HGFR细胞外结构域、肝细胞生长因子受体)的抗体的竞争通过ELISA使用HGF固相检测。重组人HGF (1.255 pmol)固定在96孔Maxisorp板(Thermo Scientific)上在4℃过夜。用2%BSA封闭板后，用连续稀释的抗体(200 nM-0.2 nM)预孵育的生物素化的重组人c-MET ECD(1.13 pmol)加入板中。使用HRP-缀合的链霉亲和素(Merck Millipore)和TMB底物和硫酸(1步骤Ultra TMB ELISA溶液)显示结合。对于不添加抗-c-MET定向抗体时c-MET ECD结合至HGF得到的吸光度定义为100% HGF结合。抗-HEL (鸡蛋溶菌酶)用作不相关同种型对照抗体。数据作为针对抗体浓度的对数的% HGF结合作图和使用GraphPad Prism 4 (GraphPadSoftware)拟合至具有可变斜率的S形剂量反应曲线。置换的结果在图3中描述。
实施例6：Cell Titer Glow测定
细胞成活力使用细胞效价发光测定(cell titer glow assay)(Promega)定量和根据生产商的说明书进行。简言之，细胞解离和接种在不透明白色组织培养处理96孔板(Perkin&Elmer)的内孔。接种的细胞数范围是8,000-15,000个活细胞/孔，取决于细胞系，80 µl/孔。允许细胞在潮湿室中在37℃、5% CO2中贴壁至少3小时。然后细胞一式三份用在细胞系特定培养基中稀释的抗体处理(最终范围60-0.01 nM)。根据测定法，Fab-毒素缀合物以三倍摩尔过量加入(Fab-毒素，来自Moradec，MMAE或DMSA)。72小时后细胞的成活力通过加入100 µl/孔的CellTiter-Glo®试剂(Promega)，随后在板振荡器上以350 rpm混合2分钟和在暗处在室温下孵育10 min检测。在Synergy 5 (Biotek)测量发光，读出时间为0.5秒/孔(敏感性：170)。减去仅具有培养基与CellTiter-Glo®试剂(Promega)的孔内的背景发光。数据作为未处理细胞成活力的百分比针对抗体浓度的对数作图，和使用GraphPadPrism 4 (GraphPad Software)拟合至具有可变斜率的S形剂量反应曲线。
实施例7：ADC产生和抗体依赖性细胞毒性
ADC产生
分选酶介导的缬氨酸-瓜氨酸(vc)-单甲基阿里他汀E (MMAE)至抗体Fc的定点缀合按其它地方所述进行(参见例如ACS Chem.Biol. 2015；10: 2158-65)。简言之，产生在两个重链的C末端带有酶识别位点的抗体或本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，转染和通过亲和色谱纯化。然后，1个当量的抗体用11个当量的底物-vc-MMAE缀合物在5 µM分选酶和5 mM CaCl2的存在下在反应缓冲液(50 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.5)中在22℃孵育30min。反应用10 mM EDTA作为钙离子螯合剂终止。得到的ADC通过大小排阻色谱纯化。
抗体依赖性细胞毒性
抗体诱导ADCC的能力使用ADCC Reporter Bioassay Core试剂盒(Promega)根据生产商的说明书评价。简言之，将靶细胞(A431细胞)解离和以12.500个活细胞/孔的细胞密度(100 µl)接种至不透明白色组织培养处理96孔板(Perkin&Elmer)的内孔。A431细胞在含有ADCC缓冲液的RPMI 1640培养基(Gibco)中培养，其补充有4%低IgG胎牛血清(FBS，Gibco)。允许细胞在潮湿室中在37℃、5% CO2中贴壁过夜。第二天，除去培养基，和细胞用在ADCC缓冲液中稀释的25 µl抗体/孔处理(终浓度范围5-0.0016 nM)。之后，加入重组Jurkat细胞(Promega)，其用作效应细胞(360 µl效应细胞，在3.6 ml ADCC缓冲液中稀释，25 µl/孔)。在潮湿室中在37℃、5% CO2中孵育6小时后，每孔加入在室温下平衡的75 µl的Bio GloLuciferase Substrate (Promega)。在室温下避光孵育10分钟后，在Synergy 5 (Biotek)测量发光，读出时间为0.5秒/孔(敏感性：170)。减去仅具有培养基的孔中的背景发光。相对发光单位针对抗体浓度的对数作图和使用GraphPad Prism 4 (GraphPad Software)拟合至具有可变斜率的S形剂量反应曲线。
实施例8：受体磷酸化测定
为了评价本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的结合对c-MET和EGFR二者的c-MET和EGFR-介导的信号传导磷酸化水平的影响，该磷酸化水平通过c-MET或EGFR捕获电化学发光(ECL) ELISA (MSD测定法)测定。所有试剂获自Meso Scale Discovery和根据生产商的说明书制备。简言之，在处理前一天将细胞接种至96-孔组织培养板(Sigma-Aldrich)，血清饥饿和用连续稀释的抗体(0 - 167 nM/饥饿培养基)在37℃、5% CO2中处理1 h。在37℃用100 ng/ml HGF和/或EGF (均R&D Systems)刺激5 min后，细胞用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Calbiochem)的冰冷的裂解缓冲液裂解。包括电极的高结合96-孔板(Meso ScaleDiscovery)用捕获抗-总c-MET (Cell Signaling Technologies)或抗-总EGFR抗体(Abcam)包被，接着用补充有0.05% Tween®20的3% Block A/PBS封闭。与细胞裂解物孵育后，用抗-磷酸c-MET (Cell Signaling Technologies)、抗-磷酸-酪氨酸抗体(R&DSystems)和通过供应商推荐的检测物质进行检测。用SECTOR® Imager 6000 (Meso ScaleDiscovery)进行测量。对于磷酸-AKT水平的量化，使用磷酸(Ser473)/总AKT测定全细胞裂解物试剂盒(Meso Scale Discovery)。剂量反应曲线作为抗体浓度的对数对ECL信号作图。IC50值通过3PL拟合模型，使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software，Inc.)计算。来自至少两个实验的数据用于计算平均IC50 ± 标准偏差(s.d.)，参见例如图20、图25 (A)。
实施例9：细胞表面受体密度的量化
选择的细胞系上的受体表面表达水平使用QFIKIT (Dako K0078)，利用流式细胞术测定，其结果显示在图18中。简言之，在表面上提供不同数量的小鼠mAb分子的5个群体校准珠用作校准标准。1.5 x 105个细胞/孔用第一小鼠抗-EGFR (ab187287，Abcam)和小鼠抗-c-MET抗体(MAB3582，R&D Systems)以饱和剂量(5 µg/ml)标记。然后，珠和细胞用第二山羊抗-小鼠Fc F(ab’)2 FITC缀合物(10 µg/ml，Jackson Immuno Research)染色和使用GuavaeasyCyte HT流式细胞仪(Millipore)进行流式细胞术测量。珠和细胞在同一天使用相同设置测量。基于对于珠的荧光对比珠表面密度的校准线，计算c-MET和EGFR的抗原细胞表面密度。
实施例10：内化测定
本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的内化通过流式细胞术，使用抗-AlexaFluor 488淬灭抗体或通过应用pH剥离(pH stripping)的共焦显微术测定。对于流式细胞术，细胞(1 x 105)用100 nM bsAb，接着Alexa Fluor 488缀合的抗人Fc (Fcγ特异性的，Jackson Immuno Research)孵育。在用FACS缓冲液洗涤后，细胞在37 ℃或4 ℃下孵育1 h，允许内化。之后，bsAb的残留表面结合通过抗-Alexa Fluor 488 IgG (LifeTechnologies)淬灭，和细胞用4% (w/v)甲醛(Calbiochem)固定和进行流式细胞术分析。如下计算内化：
对于荧光显微术，细胞(3 x 105)在置于6孔板中的玻璃盖玻片(Menzel Glaser)上生长。2天后，细胞保持在冰上，和用100 nM bsAb处理，接着用Alexa Fluor 488缀合的抗人FcFab片段检测。用1% BSA/PBS洗涤后，细胞在各自的培养基中在37 ℃或4 ℃孵育1 h，允许内化。通过加入冰冷的低pH缓冲液(50 mM甘氨酸、150 mM NaCl、用HCl调整至pH 2.7)，除去在细胞表面上残留的bsAb。最后，细胞用4% (w/v)甲醛固定和用ProLong DiamondAntifade Mountant(浸片剂)与DAPI (Life Technologies)置于载物玻片上。用配备有100x物镜的Leica TCS SPS共焦显微镜(Leica Microsystems)进行分析。
实施例11：细胞培养
根据本发明使用的人癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心(A431、A549、MDA-MB-468、NCI-H1975、NCI-H441、NCI-H596)、Riken生物资源中心细胞库(EBC-1、KP-4)、Lipha(HepG2)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(MKN45)和根据标准培养条件(37℃、5% CO2、95%湿度)使用推荐的培养基配方维持。A549和A431在含有10%胎牛血清(FBS，LifeTechnologies)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM，Life Technologies)中培养。MDA-MB-468、NCI-H1975、HepG2和MKN45在补充有10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠(均为Life Technologies)的RPMI-1640 (Life Technologies)中维持。NCI-H441、NCI-H596在含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、2.5 g/L D(+)-葡萄糖(Sigma-Aldrich)和10 mM HEPES (Life Technologies)的RPMI-1640中培养。KP-4细胞在含10%FBS的DMEM/F-12中培养。EBC-1细胞在含10% FBS和2 mM L-谷氨酰胺的最小基本培养基(MEM)中维持。NHEK.f.-c. (PromoCell、#C-12007)获自PromoCell和在含补充物的推荐的角质化细胞生长培养基(PromoCell、#C-20111)中增殖和用Detach试剂盒(PromoCell、#C-41210)使细胞解离。Expi293FTM细胞购自Life Technologies和在相应的Expi293表达培养基中培养。所有细胞系显示是无菌的，证实是无支原体的，和从未超过20代。
实施例12：表面等离子体共振
计算机设计的C225变体的亲和力和动力学参数通过表面等离子体共振验证。计算机指导的取代使用QuikchangeII试剂盒(Stratagene)用诱变引物引入野生型C225。变体抗体在HEK-293-6E细胞中表达。取出的上清液通过使用蛋白A的亲和色谱纯化。抗体浓度通过280nm吸光度测定，和纯度通过SDS-PAGE分析验证。表面等离子体共振在Biacore A-100 (GEHealthcare)上进行。CM5芯片与山羊抗-人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch，Inc.，109-005-098)偶联，和用于捕获野生型C225或设计的变体。人EGFR (细胞外结构域，R&DSystems，1095-ER)用作分析物。亲和力通过滴定0-40 nM的分析物测定和使用BiaEvaluation软件确定动力学速率常数，使用1:1 Langmuir结合模型拟合缔合和离解相。KD测定为动力学常数的比率。
实施例13：热转移测定
本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子以及对照(C225 (西妥昔单抗)、马妥珠单抗和“单臂” (oa)构建体)的热稳定性使用StepOnePlus实时PCR系统(LifeTechnologies)，根据生产商的说明书测量，其结果显示在图17和相应的描述中。简言之，1µM蛋白与20倍过量的SYPRO Orange (Life Technologies)在PBS pH 7.4中混合。记录从25℃至99℃的熔解曲线，增量为1℃/60 s。数据用Protein Thermal ShiftTM Software(Life technologies)，通过计算二阶导数曲线的最大值分析。

Claims (34)

1. 异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其包含
(i) 特异性结合至EGFR的第一Fab或scFv片段，和
(ii) 特异性结合至c-MET的第二Fab或scFv片段，和
(iii) 抗体铰链区、抗体CH2结构域和包含杂合蛋白-蛋白相互作用界面结构域的抗体CH3结构域，其中每一个所述相互作用界面结构域由第一成员的CH3结构域的氨基酸区段和所述第二成员的CH3结构域的氨基酸区段形成，其中通过在所述相互作用结构域内免疫球蛋白超家族的相同成员的相应氨基酸区段的同二聚化，第一链的所述蛋白-蛋白界面结构域与第二链的蛋白-蛋白界面相互作用，
其中第一或第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("AG-SEED")：GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPX1DIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTX2DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKX3ISL (SEQ ID NO:1)，其中X1、X2和X3可以是任何氨基酸。
2.权利要求1的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中免疫球蛋白超家族的第一成员是IgG和第二成员是IgA。
3.权利要求2的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中X1是K或S，X2是V或T，和X3是T或S。
4. 权利要求1-3中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一或第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("GA-SEED")：GQPREPQVYTLPPPSEELALNEX1VTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWX2PVX3DSD GSX4FLYSILRVX5AX6DWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6可以是任何氨基酸。
5.权利要求4的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中X1是L或Q，X2是A或T，X3是L、V、D或T；X4是F、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或T；X5是A或T，和X6是E或D。
6. 权利要求1-5中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一改造免疫球蛋白链具有多肽序列("AG-SEED")：GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL和第二改造免疫球蛋白链具有多肽序列("GA-SEED")：GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDG SFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR。
7. 权利要求1-6中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一改造免疫球蛋白链包含多肽序列("AG-SEED")：GQPFEPEVHTLPPSREEMTKNQVSLTCLVRGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRLEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL和第二改造免疫球蛋白链包含多肽序列("GA-SEED")：GQPREPQVYTLPPPSEELALNNQVTLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEPREKYLTWAPVLDSDG SFFLYSILRVDASRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL。
8. 权利要求1-7中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一Fab片段以至少5x10-8 M的KD结合EGFR。
9. 权利要求1-8中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第二Fab片段以至少5x10-8 M的KD结合c-MET。
10.权利要求9的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一Fab或scFv片段衍生自西妥昔单抗(C225)。
11. 权利要求10的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 43、SEQID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46的VL和VH序列。
12. 权利要求11的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第二Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51的VL序列。
13. 权利要求12的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中所述第二Fab片段的VH序列选自SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO: 48、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 52。
14. 权利要求13的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一和第二Fab或scFv片段包含选自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18，或SEQ ID NO:47、SEQ ID NO: 48(225L SEQ IDS、B10)，或(225M、B10v5) SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO:32，或(225H、F06) SEQ ID NO:45、SEQ IDNO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50，或(225H、CS06)SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 52，或(225M、CS06) SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ IDNO: 52的氨基酸序列。
15. 权利要求14的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中第一和第二Fab或scFv片段包含氨基酸序列(225M、CS06) SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 33、SEQ IDNO: 34、SEQ ID NO: 52或(225H、CS06) SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 50。
16.权利要求1-15中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中Fc结构域与FcRn相互作用。
17.权利要求1-16中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中与FcRn相互作用的氨基酸衍生自人IgG1。
18.权利要求1-17中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中双特异性免疫球蛋白介导抗体依赖性细胞毒性。
19. 分离的多核苷酸，其编码根据SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ IDNO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 52的至少一个氨基酸序列。
20.载体，其包含权利要求19的至少一种多核苷酸。
21.宿主细胞，其包含权利要求19的至少一种多核苷酸，或权利要求20的至少一种载体。
22.生产权利要求1-18中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的方法，包括：
- 在足以异源表达所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的条件下培养权利要求21的至少一种宿主细胞，
- 纯化所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子。
23.通过权利要求22的方法可获得的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子。
24.权利要求1-18或权利要求22中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子与至少一个接头共价偶联。
25.权利要求24的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的接头与染料、放射性同位素或细胞毒素偶联。
26.权利要求25的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中至少一个接头与所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的至少一个Fab或scFv轻链共价偶联。
27.权利要求26的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子包含与所述异二聚体双特异性免疫球蛋白分子的Fab或scFv轻链共价偶联的两个接头。
28.权利要求27的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中Fab或scFv轻链和/或CH3结构域和/或CH2结构域与接头共价偶联，由此所述接头与染料、放射性同位素或细胞毒素共价偶联。
29.权利要求1-18或23-28中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，用于治疗癌症。
30.权利要求29的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子，其中癌症是前列腺癌、乳腺癌、肾上腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨和结缔组织肉瘤、脑肿瘤、甲状腺癌、胰腺癌、脑垂体癌、眼癌、阴道癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、睾丸癌、阴茎癌、口腔癌、皮肤癌、肾癌、维尔姆斯瘤和膀胱癌、转移(mCRC)、不可切除的肝转移、头和颈的鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
31.组合物，其包含权利要求1-18或权利要求23-28中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种其它成分。
32.药物组合物，其包含权利要求1-18或权利要求23-28中任一项的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子和至少一种其它成分，或权利要求31的组合物。
33.权利要求32的药物组合物，用于治疗癌症。
34.治疗罹患癌症的有需要的受试者的方法，其中所述治疗包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求33的药物组合物。
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