CN109937211A - 用于有效的肿瘤抑制的抗c-MET抗体及其抗体药物偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗体和异二聚体免疫球蛋白分子，其以高亲和力结合cMET并可用于靶向表达cMET的肿瘤细胞。本发明还公开了使用本文中公开的本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子生成抗‑cMET抗体药物偶联物的方法。

Description

用于有效的肿瘤抑制的抗c-MET抗体及其抗体药物偶联物
发明领域
本发明涉及可用于治疗癌症的抗c-Met特异性抗体及其抗体药物偶联物。本发明进一步提供了制造本发明的抗体或其抗体药物偶联物的方法。
背景
肝细胞生长因子受体(HGFR)，也称为c-MET(对间充质-上皮转化而言)是一种I型跨膜蛋白RTK，其首先在化学转化的人骨肉瘤细胞中被确定为致癌的TRP-MET融合蛋白。c-MET的表达以及由间充质细胞分泌其配体——肝细胞生长因子(HGF或分散因子SF)参与细胞分化、增殖、存活、细胞骨架重排、细胞脱离、分散、游动性和侵染力(Birchmeier等人(2003)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4，915-925)。蛋白聚糖核心蛋白聚糖充当c-MET的配体(Goldoni等人(2009)J.Cell Biol.185，743-754)。在宏观细胞水平，c-MET具有多种功能，例如在胚胎发生、伤口愈合和器官再生中。肿瘤发生的特征在于癌细胞由上皮向间充质表型的形态变化，使得转移性细胞扩散。通常，与原发性肿瘤相比，在转移性病灶上发现更高的c-MET表达，凸显了c-MET参与转移(Cipriani等人(2009)Lung Cancer 63，169-179)。
c-MET是一种从单一前体蛋白上蛋白水解裂解的二硫键连接的α-链-β-链异二聚体。其由大的胞外域组成，所述胞外域由称为SEMA的七叶螺旋桨结构域、与丛蛋白、脑信号蛋白和整联蛋白相关的PSI结构域以及四个显示与免疫球蛋白、丛蛋白和转录因子同源的IPT结构域重复组成。α-与β-链之间的弗林蛋白酶切割位点位于桨叶4和5之间。单跨越跨膜结构域后接细胞内酪氨酸激酶结构域。与该受体结合的配体诱导其二聚化和酪氨酸残基1230、1235与1235的自磷酸化，导致酪氨酸1349和1356的转磷酸化，所述酪氨酸1349和1356是Src同源性2蛋白(SH2)的停泊位点(Birchmeier等人(2003)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4，915-925)。Src募集随后激活包括PI3K/AKT和Ras/MAPK途径的细胞内信号转导级联。
HGF是一种二硫键连接的α-链-β-链异二聚体，其由单一前体蛋白加工而成(Lokker等人(1992)EMBO J.11，2503-2510)。该HGF α-链由后接四个Kringle结构域的N端结构域组成，而HGF β-链仅由一个丝氨酸蛋白酶同源结构域(SPH)组成。HGF结合蛋白聚糖肝素并在溶液中形成HGF-同型二聚体。对于其与c-MET的相互作用，已经在2∶2c-MET∶HGF复合物中提出了配体诱导的二聚化(Niemann(2013)Biochim.Biophys.Acta 1834，2195-2204；Stamos等人(2004)EMBO J.23，2325-2335)。在c-MET上存在两种预测的HGF结合位点：提出了HGF β-链以低亲和力结合到SEMA结构域的第二和第三叶片上(Gherardi等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100，12039-12044；Stamos等人(2004)EMBO J.23，2325-2335)，而提出了两个结合位点可用于将HGF的α-链高亲和力结合到c-MET上。在第一种模型中，已经提出，缩短的N端HGF片段的IPT结构域3和4(称为NK1)充当高亲和力结合位点，而在提出的第二种模型中，NK1与SEMA结构域叶片5的结合构成了HGF的α-链与c-MET的高亲和力结合位点(Youles等人(2008)J.Mol.Biol.377，616-622)。
由于c-MET参与肿瘤发生与转移，近来已经开发了几种HGF和c-MET定向抗体，其中一部分已经在临床试验中进行了评估(Prat等人(2014)Biomedicines 2，359-383)。HGF-中和抗体，如利妥木单抗(rilotumumab)和菲克来妥珠单抗(ficlatuzumab)仅靶向配体，因此在具有组成型c-MET活化的癌症中是无效的。此外，HGF以未加工的前体蛋白形式以高丰度储存在组织的细胞外基质中，阻碍了抗-HGF抗体的效率。关于c-MET，已经针对该受体的几个表位开发了抗体：奥纳妥珠单抗(Onartuzumab)(oa 5D5，MetMAb，RO5490258)和艾米贝妥珠单抗(emibetuzumab)(LY2875358)分别是III期和II期试验临床开发中最先进的。即使两种抗体的结合表位位于c-MET SEMA结构域中，单价的奥纳妥珠单抗主要经由HGF竞争起作用(Merchant等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 110，E2987-E2996)，而二价的艾米贝妥珠单抗除了阻断配体结合之外还诱导受体降解(Liu等人(2014)Clin.Cancer Res.20，6059-6070)。目前在1期临床阶段评估了三种附加的抗c-MET抗体：二价的ABT-700(h224G11)，ADDC-增强的ARGX-111(WT52-E)(Basilico等人f2014)J.Clin.Invest 124，3172-3186；Hultberg等人(2015)Cancer Res.75，3373-3383)，以及二价的c-MET降解抗体SAIT301(Oh等人(2012)Mol.Cells 34，523-529)。虽然ARGX-111和emibetuzumab占据重叠表位，SAIT301的确切结合位点未知。后者经由LRIG介导的溶酶体途径诱导c-MET降解(Lee等人(2014)Oncogene 33，34-43)。这可能与LMH 87在叶片3和4上结合到SEMA螺旋桨顶部具有相同的作用模式(Greenall等人(2012)PLoS.One.7，e34658；Prat等人(2014)Biomedicines 2，359-383)。但是，SAIT301和LMH 87不共享重叠表位。另一种c-MET降解抗体是DN30，其结合到前IPT结构域上，经由金属蛋白酶ADAM-10诱导降解，并且不与配体结合竞争(Vigna等人(2015)Mol.Oncol.9，1760-1772)。一些二价的抗c-MET抗体易于触发部分或完全激动，需要部分单价形式用于治疗应用。c-MET靶向抗体(例如onartuzumab)的不良事件主要是水肿和血栓形成事件，其与调节上皮完整性和伤口愈合的c-MET/HGF轴的阻断有关。
因此一直需要扩展用于治疗癌症的高亲和力抗c-MET抗体和相应的抗体-药物偶联物的清单，其克服了现有技术中可用的抗c-MET抗体的限制。
发明概述
本发明人已经令人惊讶地发现了抗c-MET抗体或其抗原结合片段，其以高亲和力结合c-MET并可用于有效抑制表达c-MET的肿瘤。
在第一实施方案中，本发明提供了抗c-MET抗体或其抗原结合片段，其以至少10-8M的亲和力结合到人c-MET上。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或抗原结合片段结合到人c-MET变体N375S上。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段结合到包含在人c-MET的SEMA结构域中的表位上并抑制c-MET信号传导。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或抗原结合片段结合到包含在人c-MET的IPT结构域1-4中的表位上并抑制c-MET信号传导。
在一个实施方案中，以固相使用HGF的酶联免疫吸附测定法中，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段在0.88×10-9M或更低的浓度下将重组人HGF与人c-MET ECD的结合抑制50％。
根据一个实施方案，本发明的抗体的抗原结合片段是Fab或F(ab’)2、scFv。
在一个实施方案中，本发明的抗体是IgG型抗体。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的序列的至少一种。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的重链和轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步偶联到诊断剂或治疗剂上。
在一个实施方案中，本发明提供了异二聚体免疫球蛋白分子，其包含：
(i)特异性结合到人c-MET上的第一和/或第二Fab或scFv片段，和
(ii)包含杂合蛋白质-蛋白质相互作用界面结构域的抗体铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域，其中所述相互作用界面结构域由第一成员的CH3结构域的氨基酸区段和所述第二成员的CH3结构域的氨基酸区段形成，其中所述第一链的蛋白质-蛋白质界面结构域通过所述相互作用结构域中免疫球蛋白超家族的相同成员的相应氨基酸区段的同二聚化与第二链的蛋白质-蛋白质界面相互作用，
其中第一改造的免疫球蛋白链具有以下多肽序列(“AG-SEED”)：GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL，且第二改造的免疫球蛋白链具有以下多肽序列(“GA-SEED”)：GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR，并且其中该第一和/或第二Fab或scFv片段包含根据SEQ IDNO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的至少两种。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体免疫球蛋白分子进一步偶联到诊断剂或治疗剂上。
根据一个实施方案，本发明的异二聚体免疫球蛋白分子偶联到细胞毒素上。
在一个实施方案中，本发明的异二聚体免疫球蛋白分子是非岩藻糖基化的。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子可用于治疗癌症。
附图简述
图1：本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子的表位分箱(Epitope binning)
图2：HGF置换ELISA结果
图3：使用非共价偶联到细胞毒素duocarmycin SA(DMSA)的抗体药物偶联物的细胞毒性测定。结果表明细胞毒性效果依赖于受试的各细胞系的c-MET表达。
图4：使用非共价偶联到细胞毒素单甲基奥瑞他汀E(MMAE)的抗体药物偶联物的细胞毒性测定。结果表明细胞毒性效果依赖于受试的各细胞系的c-MET表达。
图5：通过c-MET特异性磷酸化测定法评估的本发明的抗体对c-MET信号传导的抑制。如所示那样，在本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子的167nM的浓度下评估了抑制。和艾米贝妥珠单抗代表对照物。
图6：抗体性质的总结。本发明的抗体对人c-MET ECD的大约KD(oa CS06：3×10- 10M，oa B10v5：4.17×10-10M，B10v5 IgG1：1.88×10-10M，CS06 IgG1：1.34×10-10M)。本发明的双互补位双特异性异二聚体免疫球蛋白分子包含Fab片段CS06和B10v5(“bp CS06×B10v5”：1.96×10-11M)。
图7：SEQ ID NO：1
图8：SEQ ID NO：2
图9：SEQ ID NO：3
图10：SEQ ID NO：4
图11：SEQ ID NO：5
图12：SEQ ID NO：6
图13：SEQ ID NO：7
图14：SEQ ID NO：8
图15：SEQ ID NO：9
图16：SEQ ID NO：10
序列表
SEQ ID NO：1 抗c-MET克隆B10轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：2 抗c-MET克隆B10重链氨基酸序列
SEQ ID NO：3 抗c-MET克隆F06轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：4 抗c-MET克隆F06重链氨基酸序列
SEQ ID NO：5 抗c-MET克隆B10v5轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：6 抗c-MET克隆B10v5重链氨基酸序列
SEQ ID NO：7 抗c-MET克隆CS06轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：8 抗c-MET克隆CS06重链氨基酸序列
SEQ ID NO：9 AG-SEED
SEQ ID NO：10 GA-SEED
SEQ ID NO：11 人MET(c-MET)
发明详述
尽管下文中详细描述了本发明，要理解的是，本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能改变。还要理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案，并非意在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另行定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解含义相同的含义。
在下文中将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列举，但是应当理解，它们可以以任意方式和以任意数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的公开的和/或优选的要素结合的实施方案。此外，除非上下文另行说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列与组合均应被认为被本申请的说明书公开。
在本说明书和随后的权利要求书通篇中，除非上下文另行要求，术语“包含(comprise)”及其变体例如包含(comprises和comprising)将被理解为暗示包括所述成员、整数或步骤，而不排除任何其它未描述的成员、整数或步骤。术语“由......组成”是术语“包含”的一种特定实施方案，其中排除任何其它未描述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由......组成”。
在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求的上下文中)所用的术语“一个”和“一种”和“该”以及类似参考应解释为覆盖单数和复数，除非本文中另行说明或明显与上下文相矛盾。本文中对数值范围的叙述仅意在用于独立提及落入该范围的各单独值的简写方法。除非本文中另行说明，各独立的值如其在本文中单独叙述那样并入本说明书中。说明书中的任何语言不应解释为指示对本发明的实施必不可少的任何未要求保护的要素。
在本说明书通篇中引用了数篇文献。本文中引用的各文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明等等)无论上文或下文均特此通过引用全文并入。本文中的任何内容不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些公开内容。
通过本发明，优选通过所附权利要求的主题来解决所述目的。
本发明人令人惊讶地发现，本发明的抗c-MET抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合到c-MET上并可用于有效抑制表达c-MET的肿瘤。
通过本发明的抗c-MET抗体或其抗原结合片段根据第一实施方案解决所述目的，本发明的抗c-MET抗体或其抗原结合片段以至少10-8M的亲和力结合到人c-MET上。例如，本发明的c-MET抗体或其抗原结合片段以至少10-8M，例如至少1×10-9M、2×10-9M、3×10-9M、4×10-9M、5×10-9M、6×10-9M、7×10-9M、8×10-9M、9×10-9M的亲和力，或以至少大约10-8M至大约10-10M的亲和力结合到c-MET上。如用于本发明的抗c-MET抗体，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语还指由两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链组成的抗体，或例如是指单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、人源化抗体。本发明中所用的术语“抗原结合片段”是指Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体(dAb)、双特异抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、双特异性抗体、其功能活性表位结合片段和单链(例如Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等人，Science 242，423-426(1988)，其经此引用并入本文)。(通常参见Hood等人，Immunology，Benjamin，N.Y.，第2版.(1984)，Harlow和Lane，Antibodies.A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1988)以及Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，其经此引用并入本文)。本文中所用的c-MET是指MET原癌基因，受体酪氨酸激酶(UniProtKB数据库条目P08581)，其也被称为肝细胞生长因子受体。
术语Fab片段是指本发明的抗体的抗原结合抗体片段，其可以例如通过IgG型免疫球蛋白的木瓜蛋白酶处理来获得，该处理获得两种Fab片段和一个Fc结构域。获得Fab片段的功能方面与方法描述在例如D.J.King的“Applications and Engineering ofMonoclonal Antibodies”，CRC Press，1998，第2.4.1章；Zaho等人，Protein Expressionand Purification 67(2009)182-189；S.M.Andrew，J.A.Titus，Fragmentation ofimmunoglobulin G，Curr.Protoc.Cell Biol.(2003)Unit 16.14(第16章)中。本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子例如还可以包含特异性结合EGFR的第一scFv片段。本文中所用的术语“scFv”是指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区；VH)和抗体轻链可变结构域(或区；VL)的分子，并缺少恒定结构域，例如，本发明的scFv片段可以例如包括由一个轻链可变结构域(VL)或其部分和一个重链可变结构域(VH)或其部分组成的结合分子，其中每个可变结构域(或其部分)衍生自相同或不同的抗体。scFv分子优选包含插在VH结构域与VL结构域之间的接头，其例如可以包括由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽序列。例如，该肽序列可以包含氨基酸序列(Gly4Ser)n，由此n是1-6的整数，例如n可以为1、2、3、4、5或6，优选n＝4。scFv分子及获得其的方法在本领域中是已知的，并例如描述在美国专利号5,892,019；Ho等人，1989，Gene 77：51；Bird等人，1988 Science242：423；Pantoliano等人，1991，Biochemistry 30：10117；Milenic等人，1991，Cancer Research 51：6363；Takkinen等人，1991.Protein Engineering 4：837中。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段例如结合到小鼠或人c-MET上，优选结合到具有根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列的人c-MET上，或包括全长c-MET和去除其信号肽(例如切除氨基酸1-24)的c-MET的人c-MET，包括c-MET变体N375S。例如，上文公开的本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合到c-MET变体N375S(rs33917957)上，但例如还可以结合c-MET变体如NatGenet.1997May；16(1)：68-73中公开的那些，例如切除信号肽(例如UniProtKB P08581的氨基酸1-24)的c-MET R970C(METR970C)、c-METT992I(METT992I)、METM1149T、METV1206L、METV1238I、METD1246N、METY1248C、METL1213V、METD1246H、METY1248H、METM1268T、META320V、METN375S。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段结合到包含在人c-MET的SEMA结构域中的表位上，并抑制c-MET信号传导。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以结合到成熟人c-MET(UniProtKB P08581)的氨基酸52-496中所包含的表位上，例如结合到人c-MET的氨基酸52-496中或例如氨基酸27-515中所包含的线性或构象表位上，由此抑制c-MET信号传导。本发明中使用的术语“表位”包括线性表位(在线性表位的情况下，连续的氨基酸被抗体识别)以及构象表位(其中抗体识别氨基酸以致它们在成熟和正确折叠的蛋白质中采用适当的构型或构象)。构象表位由蛋白质如人c-MET的三维结构及其一级氨基酸序列决定。表位典型地包括至少3个，更通常至少5个或8个、10个氨基酸，例如，表位可以包含3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。典型地，表位的长度还小于20个残基(例如氨基酸或核苷酸)，如小于15个残基或小于12个残基。
本发明的抗体例如可以以至少10-8M，例如以至少1×10-9M、2×10-9M、3×10-9M、4×10-9M、5×10-9M、6×10-9M、7×10-9M、8×10-9M、9×10-9M的亲和力结合到包含在SEMA结构域中的表位上。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段结合到包含在人c-MET的免疫球蛋白-丛蛋白-转录(IPT)结构域1-4中的表位上并抑制c-MET信号传导。例如，人c-MET(UniProtKBP08581)的IPT结构域包含氨基酸562-655(IPT结构域1)、656-739(IPT结构域2)、741-842(IPT结构域3)和氨基酸856-952(IPT结构域4)。本发明的抗体例如可以以上文公开的亲和力，例如以至少10-8M，例如以至少1×10-9M、2×10-9M、3×10-9M、4×10-9M、5×10-9M、6×10-9M、7×10-9M、8×10-9M、9×10-9M的亲和力结合到包含在结构域1、IPT结构域2、IPT结构域3或IPT结构域4中的表位上。在一方面，本发明的抗体或其抗原结合片段结合到IPT结构域1上并抑制c-Met信号传导。如果该表位是构象表位的话，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段例如还可以结合超过一个IPT结构域。例如，本发明的抗体或其抗结合片段可以结合到包含在IPT结构域1和2、或2和3、或3和4、或1和4、或1和3、或2和4中、或例如包含在IPT结构域1、2、3和4中的表位上。
根据一个实施方案，在以固相使用HGF的酶联免疫吸附测定法(ELISA)中，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段在0.9×10-9M或更低，例如大约0.1×10-9M或更低、0.2×10-9M或更低、0.3×10-9M或更低、0.5×10-9M或更低、0.75×10-9M或更低的浓度下将重组人HGF重组体与人c-MET胞外结构域(ECD)的结合抑制50％。例如，可以使用生物层干涉测量法来评估上文公开的本发明的抗体或抗原结合片段对HGF与人c-MET ECD的结合的抑制，其原理描述在Analytical Biochemistry 361(2007)1-6中。例如，可以采用不同的市售技术，如Biacore、2000、3000、T100、Flexchip、S51和A100或dotLab(Axela Biosensors)、MultiSPRinter(Toyobo)、Proteomic Processor(Lumera)、SPRi-Plex(GenOptics)、BIND(SRU Biosystems)、Epic(Coming)、ProteOn XPR(Bio-Rad)，其各自可以根据制造商的说明来使用。在一个实例中，可以使用配有Octet数据采集和分析软件的Octet Red96平台(ForteBio)。例如可以按照制造商的说明在30℃下采用1000rpm轨道传感器搅拌在200μl的体积中在黑色96孔微孔板中进行测量。例如，ELISA板可以在4℃下用大约1至大约1.5pmol重组HGF涂覆整夜，随后用PBS-T中1-5％的BSA(例如1％、2％、3％、4％、5％BSA)来封闭该板。浓度为大约0.1pmol至大约2pmol，例如大约0.125pmol、0.15pmol、0.175pmol、0.2pmol、0.25pmol、0.3pmol、0.4pmol、0.5pmol、0.6pmol、0.7pmol、0.8pmol、0.9pmol、1.0pmol至大约1.25pmol、1.5pmol、1.75pmol、2pmol的生物素化c METECD可以随后例如与浓度为大约0.2nM至大约200nM，例如大约0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.25nM、1.5nM、2nM、2.5nM、3nM、3.5nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM至大约15nM、17.5nM、20nM、25nM、30nM、32.5nM、35nM、40nM、42.5nM、45nM、47.5nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、125nM、150nM、175nM、200nM，或例如大约15nM、17.5nM、20nM、25nM、30nM、32.5nM、35nM、40nM、42.5nM、45nM、47.5nM、50nM至大约55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、125nM、150nM、175nM、200nM，或例如大约55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM至大约125nM、150nM、175nM、200nM的本发明的抗体或其抗原结合片段的连续稀释液一起温育。随后例如可以使用大约1∶100至大约1∶10,000，例如1∶250、1∶500、1∶1000、1∶1500、1∶2000、1∶2500、1∶3000、1∶4000、1∶4500、1∶5000、1∶7500、1∶8000、1∶9000稀释度下的HRP-缀合的抗生蛋白链菌素并随后例如添加UltraTMB ELISA底物溶液和硫酸来使生物素化c-MET ECD与固定化HGF的结合可视化。在未添加本发明的抗c-MET抗体或其抗原结合片段的情况下所获得的c-MET ECD与HGF结合的吸光度可以定义为100％HGF结合。例如，对照物可以包括浓度为大约0.2nM至大约200nM，例如0.25nM、5nM、10nM、50nM、75nM、100nM、125nM、150nM、175nM的抗-Hen Egg Lysozyme(HEL)SEED同种型对照抗体。数据可以绘制为％HGF结合对本发明的抗体或其抗原结合片段的浓度的对数。例如，上述测定法中使用的重组HGF可以获自商业来源，或例如可以如Biotechnol.Prog.2000，16，146-151中所述在昆虫细胞中制造。例如如上文公开的可用于ELISA测定法的c-MET ECD片段包含人c-MET的氨基酸24-963，或例如人c-MET的氨基酸52-952(例如缺少信号肽和跨膜结构域的c-MET，或例如市售的c-MET ECD-Fc蛋白)。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的抗体的抗原结合片段例如是Fab片段、或F(ab’)2片段、或scFv片段，其具有与上文公开的本发明的抗体相同的结合性质。本发明中使用的术语“抗原结合片段”还可以指由VH和CH1结构域组成的Fd片段，或由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、或dAb片段(参见例如Ward等人(1989)Nature 341 544-46)，其包含VH结构域，或例如包含在本发明的抗体的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的任一种中的轻链和重链的分离的互补决定区(CDR)。本发明中使用的术语“scFv”是指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区；VH)和抗体轻链可变结构域(或区；VL)的分子，并缺少恒定结构域，例如本发明的scFv片段可以例如包括由一个轻链可变结构域(VL)或其部分和一个重链可变结构域(VH)或其部分组成的结合分子，其中每个可变结构域(或其部分)衍生自相同或不同的抗体。scFv分子优选包含插在VH结构域与VL结构域之间的接头，其例如可以包括由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽序列。例如，该肽序列可以包含氨基酸序列(Gly4Ser)n，由此n是1-6的整数，例如n可以为1、2、3、4、5或6，优选n＝4。scFv分子及获得其的方法在本领域中是已知的，并例如描述在美国专利号5,892,019；Ho等人，1989.Gene 77：51；Bird等人，1988 Science 242：423；Pantoliano等人，1991.Biochemistry 30：10117；Milenic等人，1991.Cancer Research 51：6363；Takkinen等人，1991.Protein Engineering 4：837中。用于本发明的抗原结合片段的术语“di-scFv”是指经由接头彼此偶联的两个scFv片段，例如公开在Cancer Research 54，6176-618，1994年12月1日或Chem Commun(Camb).2007年2月21日；(7)：695-7中。本发明的抗体的抗原结合片段例如还可以包括双抗体，其中术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接到同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)上的重链可变结构域(VH)(VH-VL)。通过使用太短以至于不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如EP 0 404097 B1；WO 93/11161，和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))。例如，本发明的抗原结合片段可以通过用肽酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得：胃蛋白酶将导致二硫键下方的蛋白酶剪切，并产生F(ab’)2抗体片段，而通过木瓜蛋白酶的蛋白酶剪切(其在二硫键上方裂解)将产生两种Fab片段。因此，F(ab’)2片段是Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键连接到VH-CH1上的轻链。该F(ab’)2可以在温和条件下被还原以破坏铰链区中的二硫键，由此将F(ab)′2二聚体转化为Fab′单体。前述抗体片段根据用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶消化完整抗体来定义，但是，此类片段可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成。
根据一个实施方案，本发明的抗体是IgG型抗体。用于本发明的抗体的术语“IgG型抗体”是指IgG类抗体，其在人体内包括四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)(Alberts，B.等人，第23章：The Immune System，In Molecular Biology of the Cell，第3版，GarlandPublishing，Inc.，New York，N.Y.)。本发明的抗体由此可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型抗体，优选本发明的抗体是IgG1型抗体。本发明的IgG1型抗体例如可以在其Fc区中进一步包含突变，如Duncan等人，Nature 332：563(1988)；Sondermann等人，Nature 406：267(2000)；Wines等人，J.Immunol.164：5313(2000)；Canfield和Morrison，J.Exp.Med.173：1483(1991)；Tao等人，J.Exp.Med.178：661(1993)中所公开的那些，例如在EU索引位置330和331处的氨基酸，或例如在EU索引位置234、235和237处的取代，以便通过减少FcγRI、FcgRIIa或FcgIII结合和/或补体C1q结合来减少Fc介导的效应子功能。
根据一个实施方案，本发明的抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8的氨基酸序列的至少一种。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可以包含根据SEQ ID NO：l、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的至少一种，且重链可以包含根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的至少一种。
根据一个优选实施方案，本发明的抗体或其抗原结合片段包含含有根据SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、或SEQID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链和重链。上文公开的本发明的抗体的轻链和重链还可以例如包含动力学变体，其根据EU索引(EU编号)在它们各自的氨基酸序列中包含一个或更多个，例如一个、两个、三个或更多个以下突变：例如，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链和重链可以包含动力学突变，其例如可以改变本发明的抗体在结合到c-MET上时的解离速率。例如，根据SEQ ID NO：1的轻链序列可以包含以下突变中的一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或全部：V3A、T11V、T14S、R18S、R43Q、L45P、E74D、T85N、S86T、A90T、T92S、G100A，其中根据IMGT编号方式来提供编号。根据SEQ ID NO：2的重链序列可以包含根据IMGT编号的突变Q6E，例如根据SEQID NO：3的轻链序列可以包含以下突变(以IMGT编号)的一个或更多个，例如一个、两个、三个、四个或全部：Q1S、L2Y、S7P、K44Q、I51V、V71I，或者例如根据SEQ ID NO：4的重链序列可以包含以下突变(以IMGT编号)的一个或更多个，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部：Q5V、A19V、M115I、M115L、M115V、M115A、M115F，或者例如根据SEQ ID NO：5的轻链序列可以包含以下突变(以IMGT编号)的一个或更多个，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部：E1S、P2Y、E17Q、T20R、P22T、R45K、L51V、T85N、S93R、F103Y，或者例如根据SEQ ID NO：8的重链序列可以包含以下突变(以IMGT编号)的一个或更多个，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部：Q3R、Y37N、N66I、Q110S、D111.1Y、Y11.2D、S126Y。上文公开的轻链和重链序列例如可以均包含一个或更多个上文公开的突变，或例如仅包含在本发明的抗体或其抗原结合片段中的上文公开的重链或轻链序列可以包含上文公开的突变的一个或更多个或全部。因此，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含含有一个或更多个(例如一个、两个、三个或四个)上文公开的突变的轻链和重链序列。
在一个实例中，本发明的抗体是IgG型抗体，并包含含有根据上文公开的SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8(CS06)、或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(B10v5)的氨基酸序列的轻链和重链，并以至少10-9M，例如3×10-10M、4×10-10M、5×10-10M、6×10-10M、7×10-10M、8×10-10M、9×10-10M的亲和力结合到人c-MET上。在一个实例中，本发明的异二聚体免疫球蛋白分子是双互补位双特异性异二聚体免疫球蛋白分子，其包含含有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的第一Fab或scFv片段和含有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的第二Fab或scFv片段，其中第一Fab或scFv片段可以融合到AG-SEED上，且第二Fab或scFv片段可以融合到GA-SEED上，或者例如其中第一Fab或scFv片段可以融合到GA-SEED上，且第二Fab或scFv可以融合到AG-SEED上。用于本发明的异二聚体分子或在本发明的异二聚体分子的上下文中使用的术语“SEED”是指WO2007/110205 A2、Protein Engineering，Design&Selection第23卷第4期，第195-202页，2010中公开的链交换改造的结构域(SEED)CH3异二聚体。这些异二聚体分子是人IgG和IgA CH3结构域的衍生物，并产生由人IgA和IgG CH3序列的交替链段组成的互补人SEEDCH3异二聚体。当在哺乳动物细胞中表达以形成“SEEDbody”(Sb)时，所得SEED CH3结构域的对优先缔合以便以1∶1的比形成异二聚体。术语“GA-SEED”由此表示SEED分子开始于IgG序列，随后是IgA序列，而“AG-SEED”是指SEED分子开始于IgA衍生的序列并后接IgG衍生的序列的事实。例如，该双互补位双特异性异二聚体免疫球蛋白分子以至少1×10-9M，例如以至少2×10-11M、3×10-11M、4×10-11M、5×10-11M、6×10-11M、7×10-11M、8×10-11M、9×10-11M的亲和力结合到人c-MET上。
根据一个实施方案，上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段进一步与诊断或治疗剂偶联。用于本发明的抗体或其抗原结合片段的术语诊断剂是指可用于检测特异性结合到c-MET、优选上文公开的人c-MET和/或c-MET变体上的本发明的抗体或其抗原结合片段的实体。例如，该诊断剂可以是放射性同位素、荧光探针、荧光团、化学发光剂(chemiluminescere)、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子或生物素，或抗生蛋白链菌素，其允许检测结合到c-MET上的本发明的抗体或其抗原结合片段。用于本发明的抗体或其抗原结合片段的术语“偶联”是指如下事实：染料、放射性同位素、荧光探针、荧光团、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、生物素或抗生蛋白链菌素可以例如经由离子或疏水性相互作用非共价连接或结合，或共价连接到本发明的抗体或其抗原结合片段上。例如，上文公开的可检测标记如荧光探针、染料或酶与上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段的偶联可以根据本领域中已知的方法来实现，如Methods CellBiol.2001；63：185-204；Methods Mol Biol.2010；588：43-8；Curr Protoc Mol Biol.2001年5月；第11章：11.1单元中公开的那些方法。
可以偶联到本发明的抗体或其抗原结合片段上的本发明的可检测标记的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、烟草蚀纹病毒核内包含体内肽酶(“TEV蛋白酶”)。可以例如与上文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段偶联的荧光团可以是以下的一种：1，8-ANS、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素、吖啶、Alexa Fluor 350TM、Alexa Fluor 405TM、AMCA、AMCA-X、ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTORho12、ATTO Rho13、ATTO Rho14、ATTO Rho101、Pacific Blue、Alexa Fluor 430TM、AlexaFluor 480TM、Alexa Fluor 488TM、BODIPY 492/515、Alexa Fluor 532TM、Alexa Fluor546TM、Alexa Fluor 555TM、Alexa Fluor 594TM、BODIPY 505/515、Cy2、cyQUANT GR、FITC、Fluo-3、Fluo-4、GFP(EGFP)、mHoneydew、Oregon GreenTM 488、Oregon GreenTM 514、EYFP、DsRed、DsRed2、dTomato、Cy3.5、藻红蛋白(PE)、若丹明红、mTangerine、mStrawberry、mOrange、mBanana、四甲基若丹明(TRITC)、R-藻红蛋白、ROX、DyLight 594、钙红(CalciumCrimson)、Alexa Fluor 594TM、Alexa Fluor 610TM、德克萨斯红(Texas Red)、mCherry、mKate、Alexa Fluor 660TM、Alexa Fluor 680TM别藻蓝蛋白、DRAQ-5、羧基萘并荧光黄、C7、DyLight750、Cellvue NIR780、DM-NERF、曙红、赤藓红、荧光黄、FAM、羟基香豆素、IRDye(IRD40、IRD 700、IRD 800)、JOE，丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、甲氧基香豆素、萘并荧光黄、PyMPO、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光黄、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光黄、5-羧基荧光黄、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基、Caseade Blue、Cy2、Cy3、Cy5，6-FAM、丹磺酰氯、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯-2-并-1，3-二唑)、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫(cresyl fast violet)、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、甲亚胺、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光黄、稀土金属穴状化合物、三双吡啶二胺铕、铕的穴状化合物或螯合物、二胺、双花青或La Jolla蓝染料。
可以例如与上文公开的本发明的抗体或抗原结合片段偶联的荧光团还可以包括量子点。用于本发明的术语量子点是指半导体材料的单个球形纳米晶体，其中该纳米晶体的半径小于或等于该半导体材料的激子玻尔半径的尺寸(激子玻尔半径的值可以由包含半导体性质的信息的手册中找到的数据来计算，如CRC Handbook of Chemistry andPhysics，第83版，Lide，David R.(Editor)，CRC Press，Boca Raton，Fla.(2002))。量子点在本领域是已知的，因为它们描述在参考文献中，如Weller，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：41-53(1993)，Alivisatos，J.Phys.Chem.100：13226-13239(1996)和Alivisatos，Science271：933-937(1996)。量子点可以例如为大约1nm至大约1000nm直径，例如10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm，优选至少大约2nm至大约50nm，更优选QD的直径为至少大约2nm至大约20nm(例如大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm)。QD的特征在于它们基本均匀的纳米尺寸，通常表现出大约10％至15％的多分散性或尺寸范围。QD能够在激发时发出电磁辐射(即QD是光致发光的)并包括一种或更多种第一半导体材料的“核”，并可能被第二半导体材料的“壳”包围。被半导体壳包围的QD核被称为“核/壳”QD。周围的“壳”材料将优选具有大于核材料的带隙能量的带隙能量，并可以被选择以具有接近于“核”基底的原子间距。该核和/或该壳可以是半导体材料，包括但不限于第II-VI族(ZnS、ZnSe、ZnTe、US、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe等等)和第III-V族(GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb等等)和第IV族(Ge、Si等等)材料的那些、PbS、PbSe及其合金或混合物。优选的壳材料包括ZnS。量子点可以例如通过本领域中已知的任何方法与本发明的抗体或其抗原结合片段偶联，所述方法例如公开在Nanotechnology.2011年12月9日；22(49)：494006；Colloids and Surfaces B：Biointerfaces 84(2011)360-368中的方法。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以例如与放射性同位素偶联，所述放射性同位素例如47Ca、14C、137Cs、157Cr、57Co、60Co、67Cu、67Ga、123I、125I、129I、131T、32P、75Se、85Sr、35S、201Th或3H，优选该放射性同位素混入另一分子，如螯合剂中。可以用作共价连接到本发明的含氨基供体底物的另一分子的典型螯合剂是DPTA、EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-O，O′-双(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、HEDTA(N-(2-羟乙基)-乙二胺-N，N′，N′-三乙酸)、DTPA(2-[双[2-[双(羧甲基)氨基]-乙基]氨基]乙酸)或DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以与治疗剂偶联。根据本发明的术语“治疗剂”，例如用于本发明的抗体或其抗原结合片段，指可用于治疗目的的任何化合物。例如，本发明的治疗剂或化合物可以是施用于患者以治疗恶性肿瘤的任何化合物，所述恶性肿瘤例如癌症。癌症的实例包括但不限于非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、不可切除的间皮瘤、乳腺癌、胃或GEJ的肾上腺癌、胃癌、胸腺瘤、卵巢癌、腺样囊性癌、转移性腺样囊性癌、膀胱癌、透明细胞肾癌、头/颈部鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)或三阴性乳腺癌、淋巴增生性疾病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、EBV阳性DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富T细胞/组织细胞大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、梅克尔细胞癌(MCC)或鳞状头脖癌(SHNC)。
治疗剂包括但不限于亲水和疏水化合物。因此，治疗剂可以例如包括药物样分子、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、适体和小分子。蛋白质治疗剂包括例如肽、酶、结构蛋白、受体和其它细胞内蛋白或循环蛋白，以及其片段和衍生物，其异常表达引发一种或多种疾病。例如，作为一个具体实施方案，本发明的治疗剂还包括化疗剂、细胞生长抑制剂或细胞毒性剂。例如，可以与本发明的抗体或其抗原结合片段偶联的细胞生长抑制剂是烷化剂、抗代谢物、抗生素、有丝分裂抑制剂、激素或激素拮抗剂中的一种。烷化剂例如可以包括白消安(Myleran)、卡铂(Paraplatin)、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪(DTIC-Dome)、磷酸雌二醇氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(氮芥)、美法仑(苯丙氨酸氮芥)、甲基苄肼、噻替哌、尿嘧啶氮芥，抗代谢物可以例如包括克拉屈滨、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、氟尿苷(FUDR，5-氟脱氧尿苷)、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶(5FU)、吉西他滨、羟基脲、6-巯基嘌呤(6MP)、甲氨蝶呤(Amethopterin)、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、Pibobroman、喃氟啶、曲美沙特、葡糖醛酸酯，抗生素可以例如包括阿柔比星、博来霉素、更生霉素(放线菌素D)、道诺霉素、阿霉素(亚德里亚霉素)、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、米托蒽醌、普卡霉素(光神霉素)，或者有丝分裂抑制剂可以例如包括依托泊苷(VP-16，凡毕士)、替尼泊苷(VM-26，威猛)、长春碱、长春新碱、长春地辛，例如可以使用的激素或激素拮抗剂包括布含瑞林、共轭马雌激素(普雷马林)、可的松、氯烯雌醚(三对甲氧苯氯乙烯)、地塞米松(Decadron)、二乙基己烯雌酚(DES)、乙炔雌二醇(炔雌醇)、氟甲睾酮(氟羟甲睾酮)、氟他胺、醋酸性瑞林(诺雷德)、己酸羟孕酮(乙酸孕酮)、亮丙瑞林、醋酸甲羟孕酮(普维拉)、醋酸甲地孕酮(梅格施)、强的松、他莫西芬(诺瓦得士)、睾内酯(Teslac)、睾酮。细胞生长抑制化合物或抗肿瘤化合物，如上文公开的那些，在本领域中是已知的，并例如可以在D.S.Fischer&T.M.Knobf(1989)，The cancer chemotherapy handbook (第3版).Chicago：Year Book Medical andAssociation of Community Cancer Centers(Spring，1992)，Compendia-based drugbulletin，Rockville，MD中找到。上文公开的诊断剂或治疗剂，例如上文公开的可检测标记，或上文公开的治疗剂，可以例如与本发明的抗体的至少一个轻链偶联，或与本发明的抗体的至少一个重链偶联。例如，上文公开的诊断剂或治疗剂可以连接到本发明的抗体的一个轻链或每个轻链上，或例如连接到本发明的抗体、其抗原结合片段的一个重链或每个重链上。
在一方面，该诊断剂或治疗剂可以通过例如本发明的抗体或其抗原结合片段中半胱氨酸或组氨酸残基的选择性化学修饰共价连接到本发明的抗体或其抗原结合片段上。例如，可以选择性还原本发明的抗体的铰链区二硫化物以制造可用于靶向标记的游离巯基。例如，可以如J.Biolg.Chemistry第275卷，第39期，9月29日发行，第30445-30450页，2000中所述用巯基乙胺(MEA)进行位点特异性还原。例如，MEA(Pierce)可以以50mM的浓度溶解在0.1M磷酸钠、pH 6.0、5mM DTPA中，并随后以超出本发明的抗体浓度10倍的量(例如300μM)添加到溶液中。随后可以允许还原在室温下进行例如60分钟。在还原后，本发明的抗体溶液可以穿过Bio-Spin 30柱，其可以在150×g下在0.1M TMAP、pH 8.2、25μM DTPA中预平衡2分钟。上文公开的治疗剂或诊断剂的偶联可以随后使用在例如0.1M四甲基磷酸铵(pH 8.5)中的巯基乙胺在不存在二亚乙基三胺五乙酸的情况下在室温下在还原反应中进行大约20分钟。本发明的抗体例如可以以对上文公开的治疗剂或诊断剂10倍过量存在，例如本发明的抗体可以以大约200μM的浓度存在。未反应的试剂例如可以通过使用预先用0.1M乙酸铵(pH6.5)平衡的Bio-Spin 30柱在150×g下离心2分钟来除去，由此可以重复该离心，直到除去所有小分子量材料。或者，如Methods Mol Biol.2013；1045：189-203中所述采用硫醇反应性接头的位点特异性缀合可用于将上文公开的诊断剂或治疗剂偶联到上文公开的本发明的抗体和/或其抗原结合片段上。在一方面，上文公开的诊断剂或治疗剂例如可以使用酶介导的生物缀合偶联到本发明的抗体或抗原结合片段上。例如，分选酶A(srtA)或转谷氨酰胺酶(TGase)-介导的偶联生物缀合可用于将诊断剂或治疗剂偶联到本发明的抗体或其抗原结合片段上(参见例如Biomolecules 2013，3，870-888；WO2012059882 A1、WO2014145441A1)。SEEDbody例如也可以使用上文公开的技术以类似方式进行修饰。
根据一个实施方案，异二聚体免疫球蛋白分子包含第一和/或第二Fab或scFv片段，如上文公开地，其特异性结合到人c-MET上，以及包含杂合蛋白质-蛋白质相互作用界面结构域的抗体铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域，其中每一个所述相互作用界面结构域由第一成员的CH3结构域的氨基酸链段和所述第二成员的CH3结构域的氨基酸链段形成，其中所述第一链的蛋白质-蛋白质界面结构域通过所述相互作用结构域中免疫球蛋白超家族的相同成员的相应氨基酸链段的同二聚化与第二链的蛋白质-蛋白质界面相互作用，其中第一改造的免疫球蛋白链或成员包含以下多肽序列(“AG-SEED”)：GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL，且第二改造的免疫球蛋白链或成员包含以下多肽序列(“GA-SEED”)：GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR，并且其中该第一和/或第二Fab或scFv片段包含根据SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的至少两种。
例如，该异二聚体免疫球蛋白分子可以包含一个Fab或scFv片段，其包含上文公开的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或例如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4，或例如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或例如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。上文公开的异二聚体免疫球蛋白分子可以例如包含两个Fab、或两个scFv、或一个Fab和一个scFv，其各自可以包含NO：1和SEQ IDNO：2，或例如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4，或例如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或例如SEQID NO：7和SEQ ID NO：8。例如，该第一Fab可以包含根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且该第二Fab可以包含根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或例如该第一Fab可以包含根据SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列，并且该第二Fab可以包含根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或例如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列，例如该第一Fab可以包含根据SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且该第二Fab可以例如包含根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或例如SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或者在一个实例中，该第一Fab可以包含根据SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或例如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的轻链和重链序列，并且该第二Fab包含根据SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的重链和轻链序列。在一个实例中，上文公开的本发明的异二聚体免疫球蛋白分子仅包含一个Fab或scFv，例如可以包含Fab-GA-SEED和缺少Fab或scFv的AG-SEED，或例如scFv-GA-SEED和缺少Fab或scFv的AG-SEED，或例如不含Fab或scFv的GA-SEED和Fab-AG-SEED，或例如不含Fab或scFv的GA-SEED和scFv-AG-SEED，由此该Fab或scFv片段包含以下轻链和重链对：SEQ ID NO：1和SEQID NO：2，或例如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4，或例如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或例如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，其可以进一步包含上文公开的突变。在一个实施方案中，上文公开的本发明的抗原结合片段例如可以进一步融合到GA-SEED或AG-SEED上以便在异二聚化时形成SEEDbody，其例如包含两个上文公开的本发明的抗原结合片段。例如，本发明的Fab或scFv可以如本文中公开的那样经由到肽接头上的肽键共价融合到GA-SEED上或融合到AG-SEED上，由此该Fab或scFv包含上文公开的本发明的轻链和重链序列，例如该Fab或scFv可以包含下列轻链和重链组合中的一种：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。本发明的SEEDbody可以例如包含融合到抗-cMET B10(包含根据SEQ ID NOs：1、2的氨基酸序列)上的GA-SEED和融合到抗-cMET克隆F06(包含根据SEQ ID NOs：3、4的氨基酸序列)上的AG-SEED，或例如包含融合到抗-cMET克隆B10v5(包含根据SEQ ID NOs：5、6的氨基酸序列)上的GA-SEED和融合到抗-cMET克隆CS06(包含根据SEQ ID NOs：7、8的氨基酸序列)上的AG-SEED，或例如融合到抗-cMET B10(包含根据SEQ ID NOs：1、2的氨基酸序列)上的AG-SEED和融合到抗-cMET克隆F06(包含根据SEQ ID NOs：3、4的氨基酸序列)上的GA-SEED，或例如包含融合到抗-cMET克隆B10v5(包含根据SEQ ID NOs：5、6的氨基酸序列)上的AG-SEED和融合到抗-cMET克隆CS06(包含根据SEQ ID NOs：7、8的氨基酸序列)上的GA-SEED，由此该SEEDbodies的轻链和重链可以连接到上文公开的诊断剂或治疗剂上。例如，本发明的SEEDbody可以包含一个、两个、三个或四个偶联或连接到上文公开的治疗剂或诊断剂上的轻链和/或一个、两个、三个或四个偶联或连接到上文公开的治疗剂或诊断剂上的重链。根据一个实施方案，上文公开的SEEDbody例如可以包括上文公开的动力学变体，其在它们相应的氨基酸序列中包含一个或更多个，例如一个、两个、三个或更多个上文公开的突变。
在一个实施方案中，上文公开的本发明的抗体或上文公开的异二聚体免疫球蛋白分子偶联到细胞毒素上。例如，偶联到上文公开的本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子上的细胞毒素例如也可以被称为“有效负荷”。例如根据本发明可以使用的细胞毒素可以分为两个大类：第一类包括破坏微管组装的细胞毒素，第二类细胞毒素靶向DNA结构。典型地，细胞毒素经由接头偶联到本发明的抗体、其抗原结合片段、或上文公开的异二聚体免疫球蛋白分子上。术语“接头”或“接头肽”是指连接或衔接两个分子，例如两个多肽序列(其连接两个多肽结构域)，或例如蛋白质和细胞生长抑制药物或毒素的合成或人工氨基酸序列。本发明中使用的术语“合成”或“人工”是指并非天然存在的氨基酸序列。例如，可以共价键合到本发明的异二聚体免疫球蛋白分子或上文公开的本发明的抗体上的接头是可剪切的或不可剪切的。本发明中使用的术语“可剪切”是指可以被蛋白酶、酸或通过二硫化物体的还原(例如谷胱甘肽介导的或谷胱甘肽敏感的)裂解的接头。例如，可剪切接头可以包含缬氨酸-瓜氨酸接头、腙接头或二硫化物接头。例如可以共价键合到本发明的含氨基供体的底物上的不可剪切的接头包含至MMAF的马来酰亚胺己酰基接头(mc-MMAF)、N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯(MCC)或巯基乙酰胺基己酰基接头。例如，共价偶联到本发明的异二聚体双特异性免疫球蛋白分子上的接头还可以包括WO 2010/138719中描述的接头，或例如WO2014/093379中描述的那些。因此，例如可以共价键合到本发明的接头上的细胞毒素包括阿霉素、加利车霉素、奥瑞斯他汀(auristatin)、美登素、倍癌霉素(duoarmycin)及其类似物，α-鹅膏毒环肽、tubulysin及其类似物。将细胞毒素共价连接到接头上的方法在本领域中是已知的，并例如可以根据Mol.Pharmaceutics 2015，12，1813-1835中公开的方法来实现。细胞毒素还可以例如通过使用经由不可剪切的接头缀合到细胞毒素上的Fab-抗-人Fc片段非共价地偶联到包含人IgG部分的本发明的抗体上。例如，可以使用此类Fab-抗-人Fc-细胞毒素偶联物的商业制剂，其包含细胞毒素α-鹅膏毒环肽(例如由Moradec制造的Fab-抗-人Fc-NC-AAMT)。使用和评估此类抗体药物偶联物的原则例如可以如J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci.2016年5月24日中所述。
根据一个实施方案，上文公开的异二聚体免疫球蛋白分子是非岩藻糖基化的。用于本发明的异二聚体免疫球蛋白分子的术语“非岩藻糖基化”是指在上文公开的本发明的异二聚体免疫球蛋白分子的任何制剂中不含糖类岩藻糖，或例如在其N-聚糖结构中仅具有少量岩藻糖，例如小于5％、4％、3％、2％或小于1％的岩藻糖基化N-聚糖的异二聚体免疫球蛋白分子。在一方面，上文公开的本发明的抗体可以是非岩藻糖基化的。典型地，连接到上文公开的本发明的抗体的例如人IgG1的Asn297上的N-聚糖显著增强了其与FcγRIIIa的结合，并由此改善了抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。例如可以通过使用如Glycobiology.2012；22：897-911中所述其生产过程不含GDP-岩藻糖转运蛋白SLC35C1的细胞系(如CHO-gmt5细胞)获得上文公开的本发明的非岩藻糖基化的异二聚体免疫球蛋白分子。或者，如Glycobiology.2010年12月；20(12)：1607-18中所述的GDP-6-脱氧-D-来苏-己酮糖还原酶的共表达可用于制造上文公开的非岩藻糖基化的异二聚体免疫球蛋白分子、或本发明的抗体和/或其抗原结合片段。
在一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码包含根据SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的氨基酸序列或上文公开的任何它们的相应动力学变体的上文公开的本发明的抗体。与本发明的多核苷酸一起使用的术语“分离的”是指与例如细胞成分等等分离的多核苷酸，其中多核苷酸通常在性质上相关，例如分离的多核苷酸按重量计为至少80％、90％、95％纯，即不含污染成分。例如，本发明的分离的多核苷酸可以是指与在得到它的生物体的天然存在的基因组中与其紧密邻接的序列(在5′和3′方向上)分离的DNA分子。例如，“分离的多核苷酸”可以包含插入到载体(如质粒、表达质粒或病毒载体)中或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。因此，本发明还提供了包含至少一种本发明的多核苷酸的表达载体。在一方面，本发明还涉及所述多核苷酸在制造上文公开的本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子中的用途。在一方面，本发明还涉及通过在异源细胞系中表达来制造上文公开的本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子。例如，可用于表达本发明的抗体、其抗原结合片段、或上文公开的异二聚体免疫球蛋白分子的表达质粒例如可以包含pCMV、pcDNA、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6、pVL1392、pVL1393、pACYC177、PRS420，或者如果要使用基于病毒的载体系统(例如pBABEpuro、pWPXL、pXP-衍生载体)的话，该表达质粒可以包含pCMV、pcDNA、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6、pVL1392、pVL1393、pACYC177、PRS420，或者如果要使用基于病毒的载体系统(例如pBABEpuro、pWPXL、pXP-衍生载体)的话。
在一方面，本发明提供了至少一种宿主细胞，其包含至少一种上文公开的本发明的多核苷酸，例如编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8中的至少一种的多核苷酸或载体或表达载体，及其在制造上文公开的本发明的抗体或异二聚体免疫球蛋白分子中的用途。例如，根据本发明使用的宿主细胞可以是酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。例如，本发明的宿主细胞可以是选自Sf9、Sf21、S2、Hi5或BTI-TN-5B1-4细胞的昆虫细胞，或例如本发明的宿主细胞可以是选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母、乳酸克鲁维斯酵母、解脂耶氏酵母和毕赤酵母的酵母细胞，或例如本发明的宿主细胞可以是选自HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK 293F、NS0、per.C6、MCF-7、HeLa、Cos-1、Cos-7、PC-12、3T3、Vero、vero-76、PC3、U87、SAOS-2、LNNCAP、DU145、A431、A549、B35、H1299、HUVEC、Jurkat、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、Caco-2、CHO、CHO-K1、CHO-B11、CHO-DG44、BHK、AGE1.HN、Namalwa、WI-38、MRC-5、HepG2、L-929、RAB-9、SIRC、RK13、11B11、1D3、2.4G2、A-10、B-35、C-6、F4/80、IEC-18、L2、MH1C1、NRK、NRK-49F、NRK-52E、RMC、CV-1、BT、MDBK、CPAE、MDCK.1、MDCK.2和D-17的哺乳动物细胞。
根据一个实施方案，上文公开的异二聚体免疫球蛋白分子或上文公开的本发明的抗体可用于制造用于治疗癌症的药物。例如，上文公开的偶联到细胞毒素上的本发明的抗体异二聚体免疫球蛋白分子可以配制成药物组合物，以便施用于患有癌症的有需要的患者。本发明的药物组合物例如可以以大约10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml至大约70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、112mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml，或例如大约10mg/ml至大约20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml至大约70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、112mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml，或例如20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml至大约70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、112mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml的浓度包含上文公开的偶联到细胞毒素上的本发明的异二聚体免疫球蛋白分子，或上文公开的抗体-药物偶联物(例如上文公开的偶联到细胞毒素上的本发明的抗体)。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或更多种可药用赋形剂。用于不同剂型的可药用赋形剂在本领域中是公知的，并包括载体、稀释剂、填料、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助流剂、着色剂、颜料、掩味剂、甜味剂、香料、增塑剂和任何可接受的辅助物质，如吸收促进剂、渗透促进剂、表面活性剂、辅助表面活性剂和专用油。可以根据剂型、预期的给药方式、预期的释放速率和制造可靠性来选择合适的赋形剂。常用类型的赋形剂的实例包括各种聚合物、蜡、磷酸钙、糖等等。
在一方面，本发明还提供了一种治疗方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的上文公开的药物组合物。例如，本发明的治疗方法可以包括向患有癌症的有需要的人施用大约0.001mg/kg至大约50mg/kg，或大约0.005mg/kg至大约45mg/kg、或大约0.01mg/kg至大约40mg/kg、或大约0.05mg/kg至大约35mg/kg，或大约0.1mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg、22.5mg/kg、25mg/kg至大约26mg kg/、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、32.5mg/kg、35mg/kg、37.5mg/kg、40mg/kg、42.5mg/kg、45mg/kg的本发明的药物组合物。所用术语“mg/kg”是指在本发明中本发明的药物组合物的毫克数/千克体重。例如，药物有效量的本发明的药物组合物可以施用于患有癌症的个体。药物有效量取决于该个体、要治疗的癌症的类型、该个体的体重和年龄、疾病水平或给药途径(例如静脉内或皮下)。在一方面，本发明还提供用上文公开的本发明的抗体或用上文公开的本发明的异二聚体免疫球蛋白分子治疗患有癌症的患者的方法。例如，该方法可以包括以上文公开的浓度和剂量向需要其的患者(例如癌症患者)施用包含本发明的抗体的药物组合物。例如，在一方面，本发明的药物组合物可用于罹患表达高水平的c-MET，或例如任何本文中公开的c-MET变体的肿瘤的患者。用于本发明的治疗方法的术语“高水平”是指c-MET表达水平是对照物组织(例如获自健康个体的组织，或例如通过qPCR、蛋白质印迹法、免疫组织化学评估为不表达c-MET的细胞系)中的至少2×、5×、10×、15×、20×、25×、50×。例如，可以在肿瘤组织上评估患者肿瘤中的c-Met表达，所述肿瘤组织可以借助免疫组织化学通过针吸或外科活检来获得，或者患者血液中的循环肿瘤DNA(ctDNA)可用于评估与高c-Met表达相关的c-MET扩增，例如描述在Mol Cancer Res.2016年6月；14(6)：539-47中。从患有癌症的个体获取肿瘤组织样品或血液样品不构成本发明的一部分。
在一方面，本发明的抗体、其抗原结合片段、或上文公开的SEEDbody例如可以用于诊断目的以检测样品中的c-MET表达。用于本发明的术语“样品”是指从肿瘤组织或来自健康供体(例如未患癌症的人类受试者)的对照组织获得或衍生的组织样品。该样品还可以衍生自非人灵长类，或可以具有哺乳动物来源，如小鼠或大鼠来源。术语样品还可以是指例如借助针吸活检获自组织样品的单个或个体化细胞，其中从人类受试者获得样品不构成本发明的一部分。该样品可以由未固定的活细胞组成，或者可以由固定的组织或细胞组成，如福尔马林固定的石蜡包埋的组织或细胞。本发明的术语样品也可以是指例如来自癌细胞系的细胞，如KP-4、U87MG、A549、NCI-H441、MKN-45或EBC-1等等，其例如可获自ATCC。检测样品中的c-MET表达包括在允许特异性结合到c-MET上的条件下使样品与本发明的抗体、其抗原结合片段或上文公开的SEEDbodies接触，并随后检测本发明的抗体、或其抗原结合片段、或上文公开的本发明的SEEDbody，优选通过检测上文公开的偶联的可检测标记。
实施例
以下实施例意在进一步说明本发明。它们并非意在限制本发明的主题或范围。
实施例1：HGF竞争ELISA-被本发明的抗体置换
通过以固相使用HGF的ELISA检测重组人HGF与本发明的抗体结合到重组人c-METECD上的竞争。为此，在4℃下将1.25pmol HGF固定在96孔板上整夜。在用PBS-T中的2％BSA封闭板后，向该板中添加用抗体的连续稀释液(0.2-200nM)预温育的1.13pmol生物素化c-MET ECD。使用HRP-缀合的抗生蛋白链菌素来显露结合并随后添加1步骤UltraTMB ELISA底物溶液和硫酸。在未添加抗c-MET定向的抗体的情况下所获得的c-MET ECD与HGF结合的吸光度定义为100％HGF结合。抗-HEL SEED用作不相关的同种型对照物抗体。数据绘制为％HGF结合对抗体浓度的对数，并使用GraphPad拟合成具有可变斜率(4PL)的S形剂量-响应曲线。
实施例2：受体磷酸化试验-c-MET信号传导的抑制
为了评估本发明的抗体和本发明的异二聚体免疫球蛋白分子的结合对c-MET-介导的信号传导磷酸化水平的影响，通过c-MET捕获电化学发光(ECL)ELISA(MSD试验)测定c-MET。所有试剂获自Meso Scale Discovery并根据制造商的说明书来准备。简而言之，在处理前一天将细胞接种在96孔组织培养板(Sigma-Aldrich)中，血清饥饿并用连续稀释的抗体(在饥饿培养基中0-167nM)在37℃、5％CO2下处理1小时。在用100ng/ml HGF(R&DSystems)在37℃下刺激5分钟后，用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Calbiochem)的冰冷的裂解缓冲液裂解细胞。将包括电极的高结合96孔板(Meso Scale Discovery)用捕获抗全c-MET(Cell Signaling Technologies)抗体(Abcam)涂布，随后用补充有0.05％20的PBS中的3％BlockA封闭。与细胞裂解物一起温育后，用抗磷酸c-MET(Cell SignalingTechnologies)、抗磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems)和供应商推荐的检测物质进行检测。使用Imager 6000(Meso ScaleDiscovery)进行测量。为了量化磷酸-AKT水平，使用Phospho(Ser473)/总AKT测定全细胞裂解试剂盒(Meso Scale Discovery)。剂量响应曲线绘制为抗体浓度的对数对ECL信号。使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software，Inc.)通过3PL拟合模型计算IC50值，参见例如图5中提供的数据。
实施例3：使用生物层干涉测量法(BLI)对c-MET结合子(binder)进行表位分箱
使用c-MET抗体进行表位分箱实验，其用于双特异性抗体并与来自文献(MetMAb，Emibetuzumab，h224G11)的参考抗体进行比较。在装备有抗人Fc(AHC)生物传感器尖端(FoftéBio)的Octet Red平台(FoftéBio)上进行使用生物层干涉测量法的生物传感器实验。所有数据均在30℃下在动力学缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.02％Tween-20)中收集。产生并内部纯化人c-MET ECD-His(HGFR，肝细胞生长因子受体胞外结构域)。在PBS中平衡生物传感器尖端30秒。随后将PBS中的25nM的二价IgG和50nM的单价单臂抗体固定在生物传感器尖端上200秒作为初级抗体。尖端用400nM的非相关对照抗体(抗鸡蛋溶菌酶、抗-HELSEED，在PBS中稀释)淬灭以最大程度减少次级抗体与生物传感器的后继结合。在动力学缓冲液中获得基线60秒后，对人c-MET-ECD施以固定化的初级抗体600秒。随后分析次级抗c-MET抗体对结合到固定的初级抗体上的c-MET-ECD的相互作用600秒。通过区分其特征在于与非相关的同种型对照(抗-HEL SEED)相比更高的结合率[nM]的同时结合来视觉分析次级抗体结合的分析。
实施例4：细胞毒性试验
经由抗-人Fc-Fab毒素偶联物(MORADEC，目录号AH205-AM)评估本发明的抗体药物偶联物的细胞毒性，本发明的抗体药物偶联物是细胞毒素与本发明的抗体的Fc部分的非共价偶联物。
使用则定法(Promega)量化细胞活力，并根据制造商的说明书进行。简而言之，将细胞分离并接种在不透明的白色组织培养基处理的96孔板的内孔中。接种细胞数范围为每孔8,000至15,000个活细胞，这取决于80μl细胞系特异性培养基中的细胞系。一式两份使细胞在ADC处理(最终50至0.01nM)之前在37℃、5％CO2的潮湿室中在细胞系特异性介质中附着至少3小时。在72小时后，通过每孔添加100μl的试剂并随后在平板振荡器上以350rpm混合2分钟并在室温下在黑暗中温育10分钟来检测细胞活力。在Synergy 4读板仪(第3.9和3.10章)上测量发光，每孔读数时间为0.5秒(灵敏度：170)。减去仅含有培养基加试剂的孔中的背景发光。将数据绘制为未处理的细胞活力百分比对抗体浓度的对数，并使用GraphPad Prism 5(第3.10章)与3PL模型进行拟合。来自至少三次具有重复的独立实验的数据用于计算平均IC50。

Claims (17)

1.抗c-Met抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以至少10-8M的亲和力结合到人c-MET上。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合到人c-MET变体N375S上。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合到包含在人c-MET的SEMA结构域中的表位上并抑制c-MET信号传导。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合到包含在人c-MET的IPT结构域1-4中的表位上并抑制c-MET信号传导。
5.如权利要求3或权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中在以固相使用HGF的酶联免疫吸附测定法中，所述抗体或其抗原结合片段在0.9×10-9M或更低的浓度下将重组人HGF重组体与人c-MET ECD的结合抑制50％。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是Fab。
7.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是F(ab’)2。
8.如权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是scFv。
9.如权利要求1-5任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG型抗体。
10.如权利要求6-9任一项所述的抗体，其中所述抗体或抗原结合片段包含根据SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的序列中的至少一种。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的重链和轻链氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步偶联到诊断剂或治疗剂上。
13.异二聚体免疫球蛋白分子，包含
(iii)特异性结合到人c-MET上的第一和/或第二Fab或scFv片段，和
(iv)包含杂合蛋白质-蛋白质相互作用界面结构域的抗体铰链区、抗体CH2结构域和抗体CH3结构域，其中所述相互作用界面结构域由第一成员的CH3结构域的氨基酸链段和所述第二成员的CH3结构域的氨基酸链段形成，其中所述第一链的蛋白质-蛋白质界面结构域通过所述相互作用结构域中免疫球蛋白超家族的相同成员的相应氨基酸链段的均二聚与第二链的蛋白质-蛋白质界面相互作用，
其中第一改造的免疫球蛋白链具有以下多肽序列(“AG-SEED”)：GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL，且第二改造的免疫球蛋白链具有以下多肽序列(“GA-SEED”)：GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR，并且其中所述第一和/或第二Fab或scFv片段包含根据SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8的氨基酸序列中的至少两种。
14.如权利要求13所述的异二聚体免疫球蛋白分子，其中所述异二聚体免疫球蛋白分子进一步偶联到诊断剂或治疗剂上。
15.如权利要求12所述的抗体，或如权利要求14所述的异二聚体免疫球蛋白分子，其中所述治疗剂是细胞毒素。
16.如权利要求15所述的异二聚体免疫球蛋白分子，其中所述异二聚体免疫球蛋白分子是非岩藻糖基化的。
17.如权利要求15所述的抗体，或如权利要求15或权利要求16所述的异二聚体免疫球蛋白分子，用于治疗癌症。
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