KR20180136327A - G 단백질 연결 수용체의 활성 조절 인간 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엔토텔린 수용체 A의 세포외 부위를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 GPCR의 세포외 부위를 항원으로 인식하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스크리닝 방법은 GPCR의 세포외부위에 특이적으로 결합하는 항체발굴에 활용할 수 있으며, 이 방법을 통해 발굴한 항체는 엔토텔린 수용체 A와 관련된 고혈압이나 암에 대한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

G 단백질 연결 수용체의 활성 조절 인간 항체{Human antibodies regulating functions of a G-protein coupled receptor}
본 발명은 인간 GPCR의 신호전달기능 억제 활성을 갖는 항체 및 GPCR의 세포외부위 특이적 항체 선별 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명의 항체는 ETA의 신호전달기능을 억제시킴으로써 암질환 또는 고혈압의 치료용도로 사용될 수 있다.
GPCR(G-protein coupled receptor)은 7개의 막 투과부위를 갖는 다중 막 투과 단백질로서, 세포 밖의 신호를 세포 내로 전달함으로써 G-단백질 이형삼량체를 활성화하여 신호전달물질에 대한 반응뿐만 아니라 감각 등의 생리학상의 필수적인 역할을 수행한다. 또한 GPCR은 세포의 성장, 증식, 이동, 집단화, 사멸 등 주요 생물학적 현상을 가장 상위 단계에서 직접적으로 조절할 뿐 아니라, 암, 심혈관 질환등과 같은 질병과도 직접적으로 연관되어 있으므로 주요 약물 표적물질로 각광받고 있다.
ETA(endothelin receptor type A)는 정상인에서 주로 혈관평활근에 발현되어 리간드인 ET-1(endothelin-1)의 결합에 의한 세포내 신호전달과정을 통해 혈관수축작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 엔도텔린 수용체 길항제(endothelin receptor antagonist)인 보센탄(Bosentan)과 같은 약물들은 고혈압치료제로 사용되어져 왔다(Nature reviews drug discovery, 2011, Vol. 10, 47). 최근 많은 기초생물학 및 임상학적 연구들에 의해 ETA가 방광암, 폐암, 난소암, 신장암, 대장암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 횡문근육종, 교모세포종 등의 다양한 암에서 과발현되어 암세포의 증식, 이동, 침투, 전이, 혈관신생성 등의 주요 암 진행과정에 직접적으로 관여하여 환자의 생존율을 낮추는 것으로 보고되어 주요 항암 표적물질로 각광받고 있다(Nature review cancer, 2013, Vol. 13, 637).
항체 약물은 저분자 합성 의약품에 비해 높은 특이성, 낮은 부작용, 높은 혈중 반감기, Fc 영역에 의한 결함세포 사멸 작용기작(ADCC, ADCP, CDC) 등의 장점에도 불구하고 기존에 ETA를 표적하는 약물들은 Bosentan, Zibotentan, Atrasentan 등의 저분자 화합물로서 아직 항체약물은 보고된 바 없으며, GPCR 전체로 확대하여도 판매 허가된 항체 약물은 CCR4를 표적하는 Kyowa Hakko Kirin사의 Poteligeo(Mogamulizumab)이 유일하다. 따라서 ETA에 특이적으로 결합하고 이의 활성을 조절하는 신규 항체의 발굴의 필요성이 대두되었다. 또한 GPCR 표적의 신규 항체 약물을 개발하기 위해서는 우선 항원의 세포외 부위(extracellular domain, ECD)에 특이적으로 결합해야하는데, GPCR의 전체 표면적 중에서 세포외부위가 차지하는 비율은 약 10% 내외로 매우 제한적이기 때문에 기존에 사용해오던 항체 발굴전략으로는 한계가 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 GPCR에 특이적으로 결합하여 신호전달과정을 저해하는 신규항체를 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, MSP 단백질을 활용한 지질이중층인 나노디스크와 GPCR을 활용한 세포외부위 특이적 항체 스크리닝 전략을 고안하였고, 이를 이용하여 ETA가 안정 발현된 세포주에서의 ET-1 신호전달 억제기작을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 GPCR(G-protein coupled receptor)의 세포외 부위(Extracellular domain)를 항원으로 인식하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대한 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 세포외 부위(Extracellular domain)를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 GPCR(G-protein coupled receptor)의 세포외 부위(Extracellular domain)를 항원으로 인식하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명자들은 GPCR에 특이적으로 결합하여 신호전달과정을 저해하는 신규항체를 발굴하고자 노력한 결과, MSP 단백질을 이용한 디스크 형태의 지질이중층인 나노디스크와 GPCR의 결합파트너 G-단백질을 이용하여 방향성이 조절된 GPCR의 세포외 부위를 항원으로 한 바이오패닝 방법을 통하여 스크리닝된 항체가 GPCR의 신호전달 기능을 효과적으로 억제함을 확인하였다.
GPCR(G-protein coupled receptor)은 인간 게놈에 존재하는 막 단백질(membrane protein) 중 가장 큰 패밀리(800개 이상)를 형성하고 있으며, 7개의 막 투과 헬릭스(transmembrane helices)가 ECL(extracellular loops) 및 ICL(intracellular loops)에 연결되어 있다. GPCR은 세포 밖의 신호를 세포 내로 전달함으로써 G-단백질 이형삼량체를 활성화하여 신호전달물질에 대한 반응뿐만 아니라 감각 등의 생리학상의 필수적인 역할을 수행한다. 또한 GPCR은 세포의 성장, 증식, 이동, 집단화, 사멸 등 주요 생물학적 현상을 가장 상위 단계에서 직접적으로 조절할 뿐 아니라, 암, 심혈관 질환등과 같은 질병과도 직접적으로 연관되어 있으므로 주요 약물 표적물질로 각광받고 있다. GPCR의 세포외 부위(ECD, extracellular domain)는 3개의 ECL과 N-term을 포함하며, 세포내 부위(ICD, intracellular domain)는 3개의 ICL과 C-term을 포함한다(M Wheatley et al., Br J Pharmacol. 2012 Mar; 165(6): 16881703).
본 발명 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 GPCR의 세포내 부위가 아닌 세포외 부위를 항원(예를 들어, 에피토프(epitope))으로 하여 이에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 스크리닝 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) MSP(membrane scaffold protein), 지질 및 GPCR을 혼합하여 나노디스크를 제작하는 단계;
(b) 상기 나노디스크에 자성비드(magnetic bead)를 결합하는 단계;
(c) G-단백질이 고정된 플레이트에 상기 나노디스크에 포함된 GPCR의 세포내 부위(Intracellular domain)를 결합시켜 세포외 부위를 노출시키는 단계; 및
d) 상기 세포외 부위를 항원으로 하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 스크리닝하는 단계.
나노디스크(nanodisc)는 지질과 MSP(membrane scaffold protein)의 비공유 조립(non-covalent assembly)에 의해 형성된다. MSP는 MSP1 또는 MSP2일 수 있다.
본 발명은 GPCR 특이적 항체 약물을 개발함에 있어 세포외부위 특이적 항체 발굴 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 스크리닝 방법은 실시예 1 내지 3 및 도 3에 도식화한 MSP1 단백질을 이용한 디스크 형태의 지질이중층인 나노디스크와 사용 GPCR의 결합파트너 G-단백질을 이용하여 방향성이 조절된 GPCR의 세포외 부위를 항원으로 한 바이오패닝 방법일 수 있다. 상기 실시예에 따라 발굴한 항체에 Cκ를 결합하여 도 4에 도식화한 scAb 형태로 대장균에서 과발현하여 친화도 크로마토그래피로 정제하여 ETA 발현 동물세포(ETA expressed CHO-K1 stable cell line)에서 세포외부위 결합에 의한 기능조절능을 측정한 결과, 10 nM의 자연 리간드 하에서도 저해능 Ki가 56 nM로 우수한 기능조절능을 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리(FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기(Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO(Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 세포외 부위(Extracellular domain)를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공한다.
상기 엔토텔린 수용체 A는 리간드인 ET-1(endothelin-1)의 결합에 의한 세포내 신호전달과정을 담당하며, 고혈압 치료제 및 주요 항암 표적물질로 각광을 받고 있으나, 기존에 ETA를 표적하는 약물들은 보센탄(Bosentan), 지보텐탄(Zibotentan), 아트라센탄(Atrasentan) 등의 저분자 화합물로서, 아직까지 엔토텔린 수용체 A의 세포외 부위를 항원으로 인식하는 단일클론항체 약물은 보고된 바 없다. 상기 엔토텔린 수용체 A는 바람직하게는 서열목록 제1서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포외 부위는 서열목록 제2서열의 N-term 부위, 서열목록 제3서열의 ECL1, 서열목록 제4서열의 ECL2 및 서열목록 제5서열의 ECL3로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 부위인 것이다.
본 명세서에서, 용어 “에피토프”라 함은 항체 또는 이의 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된(localized) 부위를 의미한다. 예를 들어, 항원인 폴리펩타이드 중 연속적인 아미노산이 에피토프가 될 수 있으며, 폴리펩타이드에서 3차 구조상 접힘(folding)에 의해 비연속적인 2 또는 그 이상의 부위가 함께 에피토프가 될 수 있다. 에피토프는 항원의 독특한 3차원 구조에서, 연속 또는 비연속의 아미노산을 최소 2개 이상, 최소 3개 이상, 최소 4개 이상, 최소 5개 이상, 최소 6개 이상, 최소 7개 이상, 최소 8개 이상, 최소 9개 이상, 최소 10개 이상, 최소 11개 이상, 최소 12개 이상, 최소 13개 이상, 최소 14개 이상 또는 최소 15개 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 GPCR(예를 들어, 엔토텔린 수용체 A)의 세포외 부위를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는데, GPCR의 세포외 부위는 1개의 N-term과 3개의 ECL(ECL1, ECL2 및 ECL3)을 포함하는 바, 상기 N-term, ECL1, ECL2 및 ECL3로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 세포외 부위를 에피토프로 하여 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 에피토프는 1 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
주어진 항체가 결합하는 에피토프를 결정하는 방법(예를 들어, 에피토프 맵핑)은 항체에 대한 반응성 테스트를 통한 면역블로팅(immunoblotting) 및 면역침강(immunoprecipitation) 시험 등 다양한 방법이 있다. 에피토프의 3차원 공간 구조를 결정하는 방법은 x-레이 결정학(x-ray crystallography), 2차원 핵자기 공명법(2-dimensional nuclear magnetic resonance) 및 HDX-MS 등 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 에피토프는 NMR 분광학, X-ray 회절 결정학, ELISA 분석, HDX-MS(hydrogen/deuterium exchange coupled with mass spectrometry), 어레이 기반 올리고-펩타이드 스캐닝(array-based oligo-peptide scanning assays), 및/또는 돌연변이 유발 맵핑(mutagenesis mapping)을 통해 결정될 수 있다(Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251 : 6300-6303).
본 명세서에서, 용어 “항체”는 면역글로불린 분자 중 어느 유형의 항체(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY)일 수 있으며, 어느 하위 유형의 항체(예를 들어, 인간에 있어서 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; 및 마우스에 있어서 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3)일 수 있다. 면역글로불린(예를 들어, IgG1)은 다양한 알로타입(allotype)이 존재할 수 있으며, 본 명세서에서 용어 “항체”는 일반적으로 알려진 아이소타입(isotype) 및 알로타입(allotype)을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 용어 “항체”는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이거나, 이의 하이브리드(hybrid) 유형일 수 있다(예를 들어, IgG2 및 IgG4의 하이브리드).
본 명세서에서 용어 “단일글론항체”또는 “monoclonal antibody”는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성(single binding specificity) 및 친화도(affinity)를 나타내는 항체를 의미한다.
본 명세서에서 상기 단일클론항체는 이의 단편을 포함하는 의미로 사용되며, 상기 단편은 바람직하게는 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 의미한다. 상기 단편은 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 파파인 (Fab 단편의 생산) 또는 펩신(F(ab')2)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해성 절단(proteolytic cleavage)을 통하여, Fab 및 F(ab')2 단편을 제조할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “단편”은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFV(single chain Fv), 또는 모노머의 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 sdAb일 수 있으며, 상기 단편에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 단일클론항체 또는 이의 단편은 바람직하게는 서열목록 제6서열의 CDR1, 서열목록 제7서열의 CDR2 및 서열목록 제8서열의 CDR3로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제6서열의 CDR1, 서열목록 제7서열의 CDR2 및 서열목록 제8서열의 CDR3을 포함한다.
본 발명의 단일클론항체 또는 이의 단편은 바람직하게는 서열목록 제9서열의 CDR1, 서열목록 제10서열의 CDR2 및 서열목록 제11서열의 CDR3로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제9서열의 CDR1, 서열목록 제10서열의 CDR2 및 서열목록 제11서열의 CDR3을 포함한다.
VH 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 CDR은 중쇄(heavy chain)를 형성하기 위하여 불변 도메인에 연결될 수 있다. 또한, VL 도메인, 또는 하나 또는 그 이상의 CDR은 경쇄(light chain)를 형성하기 위하여 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장(full length) 중쇄 및 전장 경쇄가 결합하여 전장 항체를 구성한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 서열목록 제12서열의 중쇄 가변영역 및 서열목록 제13서열의 경쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. 단리된 핵산은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어 벡터는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어 발현 벡터는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 숙주세포는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편, 상기 핵산분자 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 고혈압 또는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 항체 또는 이의 단편, 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 고혈압 또는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 교모세포종(glioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근육종 (Rhabdomyosarcoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단일클론항체 또는 이의 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 정량 방법을 제공한다.
상기 정량방법에 대한 설명 중 상술한 본 발명의 스크리닝 방법에 대한 설명과 동일한 부분은 그 부분을 참고하기로 한다.
본 발명의 단일클론항체 또는 이의 단편은 엔토텔린 수용체 A에 특이적으로 결합하기 때문에 이를 이용하면 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 양을 정확하게 측정 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기의 단계를 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
(b) 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 상기 샘플에 처리하는 단계; 및
(c) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양 보다 높은지 여부를 확인하는 단계.
상기 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 설명 중 상술한 본 발명의 스크리닝 방법에 대한 설명과 동일한 부분은 그 부분을 참고하기로 한다.
엔토텔린 수용체 A는 리간드인 ET-1의 결합에 의해 혈관수축작용을 하며(Nature reviews drug discovery, 2011, Vol. 10, 47); 방광암, 폐암, 난소암, 신장암, 대장암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 횡문근육종, 교모세포종 등의 다양한 암에서 과발현되어 암세포의 증식, 이동, 침투, 전이, 혈관신생성 등의 주요 암진행 과정에 직접적으로 관여(Nature review cancer, 2013, Vol. 13, 637)하기 때문에, 상기 엔토텔린 수용체 A의 발현량을 정상인과 비교함으로써, 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환은 암 또는 고혈압이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 단편을 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A) 정량 키트을 제공한다.
본 발명의 정량 키트는 항원항체 결합반응을 통하여 상기 항체에 대한 항원을 분석함으로써 엔토텔린 수용체 A 양을 정량할 수 있으며, 상기 항원항체 결합반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 엔토텔린 수용체 A의 세포외 부위를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 GPCR의 세포외 부위를 항원으로 인식하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 스크리닝 방법은 GPCR의 세포외부위에 특이적으로 결합하는 항체발굴에 활용할 수 있으며, 이 방법을 통해 발굴한 항체는 엔토텔린 수용체 A의 신호전달과정을 억제하는 기능을 보이며 이 기능을 이용하여 엔토텔린 수용체 A가 관여하는 고혈압이나 암에 대한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 대장균에서의 ETA의 발현과 Ni-NTA를 이용한 정제 결과를 나타낸다.
도 2는 MSP-1의 정제 및 나노디스크 제작 결과를 나타낸다.
도 3은 GPCR의 방향성 조절을 통한 세포외부위 특이적 항체 발굴전략을 나타낸다.
도 4는 대장균에서의 발현, 정제의 편의와 항체의 안정성을 위해 본원발명의 항체에 Cκ를 융합한 형태를 나타낸다.
도 5는 도 4 형태의 정제된 항체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 6은 도 5에서 보여준 정제된 항체의 농도에 따른 ETA발현 동물세포(ETA expressed CHO-K1 stable cell line)의10 nM의 ET-1에 의해 유발된 신호전달의 저해능을 나타내는 그래프이다.
도 7는 도 5에서 보여준 정제된 항체의 농도에 따른 ETA가 과발현 되는 것으로 알려진 대장암세포 (HT-29)의 10 nM의 ET-1에 의해 유발된 신호전달의 저해능을 나타내는 그래프이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 1> 대장균을 이용한 ET A 의 과발현 및 정제
항체 발굴에 필요한 ETA 단백질(서열목록 제1서열)의 발현과 정제는 이광규 논문(Kwangkyu Lee, et al., Purification and characterization of recombinant human endothelin receptor type A, Protein expression and purification 2012; 84(1): 14-18)을 참고로 하였다. 보다 자세하게는 pP9-ETA발현벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 LB 배지에서 37℃에서 optical density at 600nm(OD600nm)가 0.6이 될 때까지 배양한 후, isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 0.5 mM이 되도록 첨가해주어 단백질의 발현을 유도한다. 이후, 25℃에서 4시간동안 배양해준 후에 원심분리기를 이용하여 대장균을 수확한다. 고압세포균질기를 이용하여 파쇄하여 얻은 파쇄액은 고속원심분리기를 이용하여 세포찌꺼기를 제거하고, 이후 상층액을 다시 중력가속도의 100,000배로 1시간 동안 초고속원심분리하여 대장균의 세포막을 얻는다. 대장균의 세포막은 0.5% sarkosyl 계면활성제를 이용하여 균질화하고 불용성 부분은 원심분리로 제거한다. 상층액을 Ni-NTA(Qiagen, USA)가 충진된 컬럼을 이용해 정제한다. 컬럼 세척은 20 mM imidazole로 하고 이후 300 mM imidazole로 용출한다. 용출액은 PD-10 desalting column(GE, USA)을 이용해 imidazole을 제거하고 10% glycerol을 섞어 사용 시까지 80℃에 보관한다. ETA의 발현 및 정제 결과는 도 1에 나타내었다.
<실시예 2> 나노디스크의 제작
나노디스크 제조에 필요한 MSP1 단백질의 발현, 정제, 나노디스크의 제조는 Timothy H. Bayburt 논문(Timothy H. Bayburt, et al., Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins, Nano letters 2002; 2(8): 853-856)을 참고로 하였다. 보다 자세하게는 pET28a-MSP1 발현벡터로 형질전환된 대장균 Rosetta(DE3)를 LB 배지에서 37℃에서 OD600nm에서 0.9가 될 때까지 배양하고, IPTG를 1 mM이 되도록 넣어준 후 4시간동안 추가 배양한다. 원심분리기를 이용해 대장균을 수확한 후 고압세포균질기를 이용하여 파쇄하고, 파쇄액의 고속원심분리를 통해 봉입체(inclusion body)를 얻는다. 봉입체는 완충용액을 이용하여 세척해주고 8 M Urea를 이용해 상온에서 3시간동안 수용화한다. 불용성 부분은 원심분리기를 이용해 제거하고 상층액은 Ni-NTA가 충진된 컬럼으로 정제한다. 세척은 20 mM imidazole을 이용해 해주고, 용출은 100 mM-500 mM imidazole을 이용한다. 용출액은 재접힘(refolding)을 위해 3 M urea와 urea 미포함 완충용액에 순차적으로 투석(dialysis) 해준다. 정제결과는 도 3에 나타내었다.
나노디스크를 만들기 위해 정제된 MSP1, 지질인 POPC(Avanti Polar Lipid, USA)와 정제된 ETA를 1 : 60 : 0.1의 몰비(molar ratio)로 섞어주고, POPC가 모두 용해될 때까지 Na-cholate 계면활성제를 첨가한다. 이 후, 계면활성제 제거를 위해 바이오비드(Bio-bead SM-2, Bio-rad, USA)를 섞어 4℃에서 2시간 반응한 후 원심분리를 하여 상층액을 얻는다. 상층액은 다시 계면활성제가 없는 과량의 버퍼를 이용하여 투석한다. 투석 후 겔-여과 크로마토그래피를 이용해 ETA와 MSP-1 단백질 밴드가 동시에 관측되는 분획만을 얻는다. 얻어진 나노디스크는 dynamic light scattering(DLS)을 이용해 크기를 측정하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
<실시예 3> ET A 의 세포외부위 특이적 항체의 발굴
항체 발굴에 필요한 G-단백질의 발현과 정제는 Krishna Moorthy Vukoti 논문(Krishna Moorthy Vukoti, et al., Molecular dissection of the interaction between hBLT2 and the G protein alpha subunits, Bulletin of the Korean chemical society 2007; 28(6): 1005-1009)을 참고로 하였다. 각 단백질들은 발현벡터를 대장균에 형질 전환시킨 후 이를 배양 후 Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 순수 정제하여 사용하였다.
자성을 이용한 바이오패닝 기법을 이용하기 위하여 가루형태의 에폭시 자성비드(Dynabeads M-270 Epoxy beads, Invitrogen, USA)에 dimethylformamide(DMF)를 첨가하여 자성비드의 개수를 밀리리터 당 2 x 109개로 희석하여 보관 처리 후, MSP-1과 P9 단백질 및 지질이중층으로 구성된 나노디스크 형태의 단백질 12 μg과 0.1 M sodium phosphate 및 3 M ammonium sulfate로 에폭시 작용기가 활성화 된 자성비드 2.5 x 107개와 상온에서 16시간 반응시켜 결합하였다. 이후 미결합 나노디스크 단백질을 제거하기 위하여 자성체를 이용해 고정화하고 PBS(phosphate buffered saline)에 수용화된 0.5% BSA(Bovine serum albumin)로 세척 후 에폭시 자성비드와 나노디스크의 결합체를 완성하였다.
인간 단일사슬항체가 표면발현된 M13 파아지 라이브러리 중 ETA의 N-말단에 융합되어 있는 P9과 나노디스크에 결합하는 클론을 제거하기 위하여 에폭시가 활성화된 자성비드에 P9이 삽입된 나노디스크를 공유결합으로 결합시킨 후 1012개의 파아지 라이브러리를 상온에서 반응한 후 자성체를 이용하여 자성비드를 고정시키고 상층액을 취하는 방법으로 바이오패닝의 매 회차별로 음성 분리(negative sorting)를 진행하였다. 음성 분리후의 상층액은 G-단백질이 고정화된 ELISA 플레이트(Corning, USA)에 앞서 기술된 나노디스크의 제작기술을 이용하여 MSP-1, ETA, 지질이중층으로 구성된 나노디스크를 G-단백질과 ETA 세포내부위의 특이적 반응을 이용하여 선택적으로 세포외부위가 노출되도록 고정화하고 노출된 ETA의 세포외부위(서열목록 제2서열 내지 제5서열)를 항원으로 하여 바이오패닝을 진행하였다. 상온에서 1시간 반응 후 상층액은 제거하고, PBS로 세척과정을 거친 후에 낮은 pH의 용출 완충용액(glycine-HCl pH2.2)로 결합 파아지를 용출한 후 pH를 중성화하였다. 용출된 파아지는 VCS M13 헬퍼 파아지와 ER2738 대장균을 이용해 증폭하였고, 증폭된 파아지는 매 회차 세척횟수를 증가시켜 상기된 바이오패닝을 반복 수행하였다(도 3). 상기의 과정을 통해 총 5회의 바이오패닝 과정을 거쳤으며 각 회차별 titer 결과는 표 1과 같다.
[표 1]
Figure pat00001
5회차 후의 용출 파아지 중 400종의 클론에 대한 파아지 ELISA를 수행하여 ETA에 대해 가장 높은 결합력을 보이는 10가지의 클론을 서열 분석해 본 결과 이중 5가지의 클론이 서열목록 제12서열의 중쇄 가변영역 및 서열목록 제13서열의 경쇄 가변영역을 포함하여 서로 동일함을 확인하였다(중쇄 가변영역에 서열목록 제6서열의 CDR1, 서열목록 제7서열의 CDR2 및 서열목록 제8서열의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열목록 제9서열의 CDR1, 서열목록 제10서열의 CDR2 및 서열목록 제11서열의 CDR3을 포함).
<실시예 4> 발굴항체의 ET A 의 세포외부위 결합에 의한 신호전달과정 저해능 확인
발굴항체의 대장균발현, 정제 및 안정화를 위한 Cκ융합법은 Andrew Hayhurst 논문(Andrew Hayhurst, et al., Isolation and expression of recombinant antibody fragments to the biological warfare pathogen Brucella melitensis, Journal of immunological methods 2003; 276(1-2): 185-196)을 참고하여 발현벡터를 준비하고 대장균 내에서 발현 및 정제하였다. 이때 형성된 항체의 구조는 도 4에 나타내었다. 대장균에서 발현하고 친화도 크로마토그래피를 이용하여 고순도로 정제한 단백질의 SDS-PAGE 결과는 도 5에 나타내었다.
Fura-2-AM 형광염료(ThermoFisher, USA)를 이용해 세포질내 Ca2 +농도 측정을 통한 ETA의 ET-1에 의한 신호전달과정 측정은 박수진 논문(Soo-Jin Park, et al., Lysophosphatidylethanolamine utilize LPA1 and CD97 in MDA-MB-231 breast cancer cells, Cellular signaling 2013; 25(11): 2147-2154)을 참고하였다. 105개의 ETA발현 동물세포주(ETA expressed CHO-K1 stable cell line, GenScript, USA)에 5 μM의 Fura-2-AM 형광염료와 도 5에서 정제된 항체를 농도별로 처리한 후, 10 nM의 ET-1으로 신호전달과정을 유발하여 형광분광광도계(Scinco, USA)를 이용해 여기파장 340 nm, 380 nm에 의한 510 nm에서의 방출 형광의 비(Emission by 340nm excitation/Emission by 380nm excitation)를 측정함으로써 세포질 내 Ca2 +농도를 측정하여 발굴항체가 ETA의 세포외부위에 결합하여 ETA의 신호전달과정 조절 기능을 갖는지 여부를 확인하여 도 6과 같은 결과를 도출하였다.
도 6에서 보는 바와 같이, 상기 본원발명의 항체는 ETA의 세포외부위에 결합하여 ET-1에 의한 ETA의 신호전달과정을 저해하는 antagonism 효과를 보이며, 10 nM의 ET-1이 존재하는 하에서도 Ki값이 56 nM로 매우 효과적인 저해능을 나타내고 있다. 상기 결과를 통해 본 발명의 항체 발굴전략은 GPCR의 세포외부위 특이적 항체 발굴에 효과적임을 확인하였고, 이를 통해 발굴한 항체는 ETA의 신호전달과정을 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 확인하였다.
<실시예 5> 발굴항체의 대장암세포에서의 ET A 신호전달과정 저해능 확인
ETA의 HT-29 대장암 세포주에서의 과발현은 Paraskevi Liakou 논문 (Paraskevi Liakou, et al., Expression patterns of endothelin-1 and its receptors in colorectal cancer, Journal of surgical oncology2012;105(7):643-649)에서 확인하였으며, HT-29 대장암 세포주는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 발굴항체의 HT-29 대장암 세포에서의 ETA 신호전달과정 저해능 확인은 실시예 4와 같은 방법을 사용하였고 도 7과 같은 결과를 도출하였다.
도 8에서 보는 바와 같이, 본원발명의 항체는 HT-29 대장암 세포주에서 ET-1에 의한 ETA의 신호전달과정을 저해하는 antagonism 효과를 보이며, 10 nM의 ET-1이 존재하는 하에서도 Ki값이 51 nM로 매우 효과적인 저해능을 나타내고 있다. 상기 결과를 통해 본원발명의 항체는 암세포에서 ETA의 신호전달과정을 효과적으로 억제하는 활성이 있어 치료제로서 효능이 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Leu Gln Lys Ser Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Asn Leu 165 170 175 Cys Ala Leu Ser Val Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg 180 185 190 Val Gln Gly Ile Gly Ile Pro Leu Val Thr Ala Ile Glu Ile Val Ser 195 200 205 Ile Trp Ile Leu Ser Phe Ile Leu Ala Ile Pro Glu Ala Ile Gly Phe 210 215 220 Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys Met 225 230 235 240 Leu Asn Ala Thr Ser Lys Phe Met Glu Phe Tyr Gln Asp Val Lys Asp 245 250 255 Trp Trp Leu Phe Gly Phe Tyr Phe Cys Met Pro Leu Val Cys Thr Ala 260 265 270 Ile Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met Leu Asn Arg Arg Asn Gly 275 280 285 Ser Leu Arg Ile Ala Leu Ser Glu His Leu Lys Gln Arg Arg Glu Val 290 295 300 Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Val Ile Phe Ala Leu Cys Trp Phe 305 310 315 320 Pro Val His Leu Ser Arg Ile Leu Lys Lys Thr Val Tyr Asn Glu Met 325 330 335 Asp Lys Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Met Asp Tyr 340 345 350 Ile Gly Ile Asn Leu Ala Thr Met Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ala 355 360 365 Leu Tyr Phe Val Ser Lys Lys Phe Lys Asn Cys Phe Gln Ser Cys Leu 370 375 380 Cys Cys Cys Cys Tyr Gln Ser Lys Ser Leu Met Thr Ser Val Pro Met 385 390 395 400 Asn Gly Thr Ser Ile Gln Trp Lys Asp His Asp Gln Asn Asn His Asn 405 410 415 Thr Asp Arg Ser Ser His Lys Asp Ser Met Asn 420 425 <210> 2 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Thr Leu Cys Leu Arg Ala Ser Phe Trp Leu Ala Leu Val Gly 1 5 10 15 Cys Val Ile Ser Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Ser Thr Asn Leu Ser Asn 20 25 30 His Val Asp Asp Phe Thr Thr Phe Arg Gly Thr Glu Leu Ser Phe Leu 35 40 45 Val Thr Thr His Gln Pro Thr Asn Leu Val Leu Pro Ser Asn Gly Ser 50 55 60 Met His Asn Tyr Cys 65 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Arg Trp Pro 1 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys Met 1 5 10 15 Leu Asn Ala Thr Ser 20 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Glu Met Asp Lys 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 7 Met Asn Pro Lys Asn Gly Asn 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 8 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 9 Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 10 Leu Gln Ser 1 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 11 Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Met Asn Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Ser Met Thr Arg Asp Ser Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Arg Leu Met 35 40 45 Asp Val Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ETA-scFV(AG8) <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Met Asn Pro Lys Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Ser Met Thr Arg Asp Ser Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 130 135 140 Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly Asp 145 150 155 160 Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu 165 170 175 Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Arg Leu Met Asp 180 185 190 Val Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Arg Gly Arg 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 210 215 220 Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Leu Thr 225 230 235 240 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245 250

Claims (16)

  1. 서열목록 제1서열의 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 세포외 부위(Extracellular domain)를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 부위는 서열목록 제2서열의 N-term 부위, 서열목록 제3서열의 ECL1, 서열목록 제4서열의 ECL2 및 서열목록 제5서열의 ECL3로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 부위인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 서열목록 제6서열의 CDR1, 서열목록 제7서열의 CDR2 및 서열목록 제8서열의 CDR3로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 서열목록 제9서열의 CDR1, 서열목록 제10서열의 CDR2 및 서열목록 제11서열의 CDR3로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변영역에 서열목록 제6서열의 CDR1, 서열목록 제7서열의 CDR2 및 서열목록 제8서열의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열목록 제9서열의 CDR1, 서열목록 제10서열의 CDR2 및 서열목록 제11서열의 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단일클론항체 또는 이의 단편은 서열목록 제12서열의 중쇄 가변영역 및 서열목록 제13서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  7. 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산분자.
  8. 제 7 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  9. 제 8 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편, 제 7 항의 핵산분자 또는 제 8 하의 벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편, 제 7 항의 핵산분자 또는 제 8 하의 벡터를 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 정량 방법.
  13. 하기의 단계를 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
    (b) 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 상기 샘플에 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양 보다 높은지 여부를 확인하는 단계.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환은 암 또는 고혈압인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A) 정량 키트.
  16. 하기의 단계를 포함하는 GPCR(G-protein coupled receptor)의 세포외 부위(Extracellular domain)를 항원으로 인식하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 대한 스크리닝 방법:
    (a) MSP(membrane scaffold protein), 지질 및 GPCR을 혼합하여 나노디스크를 제작하는 단계;
    (b) 상기 나노디스크에 자성비드(magnetic bead)를 결합하는 단계;
    (c) G-단백질이 고정된 플레이트에 상기 나노디스크에 포함된 GPCR의 세포내 부위(Intracellular domain)를 결합시켜 세포외 부위를 노출시키는 단계; 및
    d) 상기 세포외 부위를 항원으로 하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 스크리닝하는 단계.
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