KR20200138013A

KR20200138013A - 엔도텔린 수용체 a 결합력이 향상된 항체

Info

Publication number: KR20200138013A
Application number: KR1020200060976A
Authority: KR
Inventors: 정상택; 김연재; 안혜미; 고병준; 이원규; 나정현
Original assignee: 고려대학교 산학협력단; 국립암센터; 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-12-09
Also published as: KR102335802B1

Abstract

본 발명은 엔토텔린 수용체 A에 대한 결합력이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생산성이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴한 항체는 종래의 항체와 비교하여 항원에 대한 결합력 및 생산성이 획기적으로 개선되어 엔도텔린 수용체 A 관련 질환의 치료 및 진단용 항체로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

엔도텔린 수용체 A 결합력이 향상된 항체{Antibody with enhanced binding to endothelin receptor type A}

본 발명은 항체 의약에 관한 것이며, 인간 엔도텔린 수용체 활성 제어 항체에 관한 것이다.

GPCR(G-protein coupled receptor)은 7개의 막투과부위(transmembrane)를 갖는 막단백질로써, 세포 밖 리간드 결합을 통해 G-단백질의 결합이 해리되고, 이를 통해 세포내 신호 전달 과정을 활성화시키고 신호 전달 물질에 대한 반응 뿐만 아니라 인지와 감각 등의 생리학적으로 매우 중요한 역할을 수행한다. GPCR은 세포의 성장, 증식, 이동, 사멸 등을 조절할 뿐 아니라, 암, 심혈관 질환 등의 수많은 질병과도 직접적으로 연관되어 있어 주요 약물 표적물질로 각광받고 있으며, 현재 시판중인 신약 표적 생체 물질 중 30 ~ 50%를 차지하고 있다.

ET_A(endothelin receptor type A)는 정상인에서 주로 혈관평활근에 발현되어 리간드인 ET-1(endothelin-1)의 결합에 의한 세포내 신호전달과정을 통해 혈관수축작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 엔도텔린 수용체 길항제(endothelin receptor antagonist)인 보센탄(Bosentan)과 같은 약물들은 고혈압치료제로 사용되어져 왔다(Nature reviews drug discovery, 2011, Vol. 10, 47). 최근 많은 기초생물학 및 임상학적 연구들에 의해 ET_A가 방광암, 폐암, 난소암, 신장암, 대장암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 횡문근육종, 교모세포종 등의 다양한 암에서 과발현되어 암세포의 증식, 이동, 침투, 전이, 혈관신생성 등의 주요 암 진행과정에 직접적으로 관여하여 환자의 생존율을 낮추는 것으로 보고되어 주요 항암 표적물질로 각광받고 있다(Nature review cancer, 2013, Vol. 13, 637).

항체 약물은 저분자 합성 의약품에 비해 높은 특이성, 낮은 부작용, 높은 혈중 반감기, Fc 영역에 의한 결함세포 사멸 작용기작(ADCC, ADCP, CDC) 등의 장점에도 불구하고 기존에 ET_A를 표적하는 약물들은 Bosentan, Zibotentan, Atrasentan 등의 저분자 화합물로서 아직 항체약물은 보고된 바 없으며, GPCR 전체로 확대하여도 판매 허가된 항체 약물은 매우 드물며, CCR4를 표적하는 Kyowa Hakko Kirin사의 Poteligeo(Mogamulizumab)이 일본에 승인받았으며 2018년 5월 Amgen에서 개발된 CGRP 수용체를 표적으로 하는 Aimovig(Erenumab)이 GPCR 표적항체로는 처음으로 US FDA 승인을 받았다. 따라서 ET_A에 특이적으로 결합하고 이의 활성을 조절하는 신규 항체의 발굴의 필요성이 대두되었다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 기존에 발굴한 엔도텔린 수용체 A에 특이적 결합력을 갖는 항체의 항원 결합 부위 서열은 유지하면서 프레임워크 영역 엔지니어링을 통해 친화도와 생산성이 월등히 개선된 항체를 개발하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 ET_A가 안정 발현된 세포주에서의 ET-1 신호전달을 효율적으로 억제하는 항체를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는, 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는, 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

상기 엔토텔린 수용체 A는 리간드인 ET-1(endothelin-1)의 결합에 의한 세포내 신호전달과정을 담당하며, 고혈압 치료제 및 주요 항암제의 표적물질로 각광을 받고 있으나, 기존에 ET_A를 표적하는 약물들은 보센탄(Bosentan), 지보텐탄(Zibotentan), 아트라센탄(Atrasentan) 등의 저분자 화합물로서, 아직까지 엔토텔린 수용체 A 또는 이의 세포외 부위를 항원으로 인식하는 단일클론항체 약물은 보고된 바 없다.

본 명세서에서, 용어 “에피토프”라 함은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된(localized) 부위를 의미한다. 예를 들어, 항원인 폴리펩타이드 중 연속적인 아미노산이 에피토프가 될 수 있으며, 폴리펩타이드에서 3차 구조상 접힘(folding)에 의해 비연속적인 2 또는 그 이상의 부위가 함께 에피토프가 될 수 있다. 에피토프는 항원의 독특한 3차원 구조에서, 연속 또는 비연속의 아미노산을 최소 2개 이상, 최소 3개 이상, 최소 4개 이상, 최소 5개 이상, 최소 6개 이상, 최소 7개 이상, 최소 8개 이상, 최소 9개 이상, 최소 10개 이상, 최소 11개 이상, 최소 12개 이상, 최소 13개 이상, 최소 14개 이상 또는 최소 15개 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GPCR(예를 들어, 엔토텔린 수용체 A) 또는 이의 세포외 부위를 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는데, GPCR의 세포외 부위는 1개의 N-term과 3개의 ECL(ECL1, ECL2 및 ECL3)을 포함하는 바, 상기 N-term, ECL1, ECL2 및 ECL3로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 세포외 부위를 에피토프로 하여 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 에피토프는 1 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

주어진 항체가 결합하는 에피토프를 결정하는 방법(예를 들어, 에피토프 맵핑)은 항체에 대한 반응성 테스트를 통한 면역블로팅(immunoblotting) 및 면역침강(immunoprecipitation) 시험 등 다양한 방법이 있다. 에피토프의 3차원 공간 구조를 결정하는 방법은 x-레이 결정학(x-ray crystallography), 2차원 핵자기 공명법(2-dimensional nuclear magnetic resonance) 및 HDX-MS 등 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 결합할 수 있는 에피토프는 NMR 분광학, X-ray 회절 결정학, ELISA 분석, HDX-MS(hydrogen/deuterium exchange coupled with mass spectrometry), 어레이 기반 올리고-펩타이드 스캐닝(array-based oligo-peptide scanning assays), 및/또는 돌연변이 유발 맵핑(mutagenesis mapping)을 통해 결정될 수 있다(Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251 : 6300-6303).

본 명세서에서, 용어 “항체”는 면역글로불린 분자 중 어느 유형의 항체(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY)일 수 있으며, 어느 하위 유형의 항체(예를 들어, 인간에 있어서 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; 및 마우스에 있어서 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3)일 수 있다. 면역글로불린(예를 들어, IgG1)은 다양한 알로타입(allotype)이 존재할 수 있으며, 본 명세서에서 용어 “항체”는 일반적으로 알려진 아이소타입(isotype) 및 알로타입(allotype)을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 용어 “항체”는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이거나, 이의 하이브리드(hybrid) 유형일 수 있다(예를 들어, IgG2 및 IgG4의 하이브리드).

본 명세서에서 용어 “단일클론항체”또는 “monoclonal antibody”는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성(single binding specificity) 및 친화도(affinity)를 나타내는 항체를 의미한다.

본 명세서에서 상기 단일클론항체는 이의 단편을 포함하는 의미로 사용되며, 상기 단편은 바람직하게는 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 의미한다. 상기 단편은 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 파파인 (Fab 단편의 생산) 또는 펩신(F(ab')2)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해성 절단(proteolytic cleavage)을 통하여, Fab 및 F(ab')2 단편을 제조할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “단편”은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain Fv), 또는 모노머의 VH(heavy chain variable region) 또는 VL(light chain variable region)를 포함하는 sdAb일 수 있으며, 상기 단편에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

VH 영역, 또는 하나 또는 그 이상의 CDR(complementarity-determining region)은 중쇄(heavy chain)를 형성하기 위하여 불변 도메인에 연결될 수 있다. 또한, VL 영역, 또는 하나 또는 그 이상의 CDR은 경쇄(light chain)를 형성하기 위하여 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장(full length) 중쇄 및 전장 경쇄가 결합하여 전장 항체를 구성한다.

본 명세서에서 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함하며, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말인 동물(예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합방식 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열과 다른 DNA 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체가 있다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 영역을 포함하며, 이들은 점라인 유전자에 의해 암호화된 특정한 인간 점라인 면역글로불린 서열을 이용하지만, 예를 들어 항체 성숙화 동안 일어나는, 후속 재배열 및 돌연변이를 포함한다. 당업계에 공지된 대로(예를 들어, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125 참조), 가변 영역은 항원 결합 도메인을 함유하고, 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하도록 재배열한 다양한 유전자에 의해 암호화된다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 다수의 단일 아미노산 치환에 의해 더 변형될 수 있다. 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 모 핵산 분자와 서열 동일성을 가질 수는 없지만, 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉, 적어도 80% 동일성을 가진다).

"인간" 항체(HuMAb)는 프레임워크 영역과 CDR 영역이 둘 다 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 말한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역도 역시 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 명세서에 개시된 항체는 인간 점라인 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본 명세서에 개시된 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 점라인으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위에 그래프팅된 항체를 포함하지는 않는다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로서 사용된다.

"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 바깥에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 치환된 항체를 말한다. 항체의 인간화 형태의 한 구체예에서, CDR 도메인의 바깥에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터의 아미노산으로 치환되었고, 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 그대로 유지된다. 아미노산의 작은 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 항체가 특정 항원에 결합하는 능력을 없애지 않는 한 허용될 수 있다. "인간화" 항체는 모 항체와 유사한 항원 특이성을 보유한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 3개의 CDR(complementarity-determining region: VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열목록 제25서열의 VH-CDR1 및 서열목록 제26서열의 VH-CDR2를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열목록 제30서열의 VH-CDR3 또는 서열목록 제30서열에서 4번째, 7번째, 9번째 및 12번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 돌연변이를 포함하는 서열의 VH-CDR3을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-CDR3은 서열목록 제30서열에서 4번째 아미노산이 P(프롤린)로; 7번째 아미노산이 L(류신)로; 9번째 아미노산이 V(발린)로; 또는 12번째 아미노산이 E(글루타메이트)로; 치환된 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-CDR3은 서열목록 제30서열, 서열목록 제31서열, 서열목록 제32서열, 서열목록 제33서열 및 서열목록 제34서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 3개의 CDR(complementarity-determining region: VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열목록 제27서열의 VL-CDR1, 서열목록 제28서열의 VL-CDR2 및 서열목록 제29서열의 VL-CDR3을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 4개의 프레임워크 영역(framework region: VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 및 VH-FR4)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역 내 프레임워크 영역 및 CDR의 배열은 VH-FR1/VH-CDR1/VH-FR2/VH-CDR2/VH-FR3/VH-CDR3/VH-FR4인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열목록 제1서열; 또는 서열목록 제1서열에서 16번째 및 24번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역1(VH-FR1)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-FR1은 서열목록 제1서열에서 16번째 아미노산이 R(아르기닌)로; 또는 24번째 아미노산이 V(발린);로 치환된 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-FR1은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열목록 제4서열; 또는 서열목록 제4서열에서 1번째, 2번째, 4번째, 16번째 및 17번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역2(VH-FR2)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-FR2는 서열목록 제4서열에서 1번째 아미노산이 M(메티오닌)으로; 2번째 아미노산이 N(아스파라진)으로; 4번째 아미노산이 I(이소류신)로; 16번째 아미노산이 S(세린) 또는 G(글라이신)로; 및 17번째 아미노산이 A(알라닌), W(트립토판) 또는 S(세린)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-FR2는 서열목록 제4서열, 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열목록 제8서열; 또는 서열목록 제8서열에서 1번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 12번째, 14번째, 16번째, 17번째, 19번째, 20번째 및 21번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역3(VH-FR3)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-FR3은 서열목록 제8서열에서 1번째 아미노산이 D(아스파테이트), T(트레오닌) 또는 N(아스파라진)으로; 4번째 아미노산이 A(알라닌)로; 5번째 아미노산이 D(아스파테이트)로; 6번째 아미노산이 F(페닐알라닌)로; 7번째 아미노산이 E(글루타메이트)로; 8번째 아미노산이 R(아르기닌)로; 12번째 아미노산이 F(페닐알라닌)로; 14번째 아미노산이 R(아르기닌) 또는 L(류신)로; 16번째 아미노산이 N(아스파라진) 또는 D(아스파테이트)로; 17번째 아미노산이 A(알라닌)로; 19번째 아미노산이 S(세린)로, 20번째 아미노산이 S(세린)로; 및 21번째 이마노산이 L(류신) 또는 F(페닐알라닌)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역의 VH-FR3은 서열목록 제8서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열목록 제12서열의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역4(VH-FR4)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 4개의 프레임워크 영역(framework region: VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3 및 VL-FR4)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역 내 프레임워크 영역 및 CDR의 배열은 VL-FR1/VL-CDR1/VL-FR2/VL-CDR2/VL-FR3/VL-CDR3/VL-FR4인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열목록 제13서열; 또는 서열목록 제13서열에서 4번째 및 24번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역1(VL-FR1)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역의 VL-FR1은 서열목록 제13서열에서 4번째 아미노산이 L(류신)로; 또는 24번째 아미노산이 S(세린)로; 치환된 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역의 VL-FR1은 서열목록 제13서열, 서열목록 제14서열 및 서열목록 제15서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열목록 제16서열; 또는 서열목록 제16서열에서 1번째, 2번째 및 14번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역2(VL-FR2)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역의 VL-FR2는 서열목록 제16서열에서 1번째 아미노산이 L(류신) 또는 M(메티오닌)으로; 2번째 아미노산이 N(아스파라진)으로; 및 14번째 아미노산이 V(발린)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역의 VL-FR2는 서열목록 제16서열, 서열목록 제17서열, 서열목록 제18서열 및 서열목록 제19서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열목록 제20서열; 또는 서열목록 제20서열에서 1번째, 3번째, 14번째 및 31번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역3(VL-FR3)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역의 VL-FR3은 서열목록 제20서열에서 1번째 아미노산이 T(트레오닌), S(세린) 또는 Y(티로신)로; 3번째 아미노산이 Q(글루타민), H(히스티딘) 또는 E(글루타메이트)로; 14번째 아미노산이 G(글리아신)로; 및 31번째 아미노산이 V(발린)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역의 VL-FR3은 서열목록 제20서열, 서열목록 제21서열, 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열목록 제24서열의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역4(VL-FR4)를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).

본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.

본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 핵산분자 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 고혈압 또는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 고혈압 또는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 교모세포종(glioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근육종 (Rhabdomyosarcoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 대장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 정량 방법을 제공한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 엔토텔린 수용체 A에 특이적으로 결합하기 때문에 이를 이용하면 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 양을 정확하게 측정 가능하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기의 단계를 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(a) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;

(b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 샘플에 처리하는 단계; 및

(c) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양 보다 높은지 여부를 확인하는 단계.

엔토텔린 수용체 A는 리간드인 ET-1의 결합에 의해 혈관수축작용을 하며(Nature reviews drug discovery, 2011, Vol. 10, 47); 방광암, 폐암, 난소암, 신장암, 대장암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 횡문근육종, 교모세포종 등의 다양한 암에서 과발현되어 암세포의 증식, 이동, 침투, 전이, 혈관신생성 등의 주요 암진행 과정에 직접적으로 관여(Nature review cancer, 2013, Vol. 13, 637)하기 때문에, 상기 엔토텔린 수용체 A의 발현량을 정상인과 비교함으로써, 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환은 암 또는 고혈압이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A) 정량 키트를 제공한다.

본 발명의 정량 키트는 항원항체 결합반응을 통하여 상기 항체에 대한 항원을 분석함으로써 엔토텔린 수용체 A 양을 정량할 수 있으며, 상기 항원항체 결합반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.

상기 2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 엔토텔린 수용체 A에 대한 결합력이 향상된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 생산성이 향상된 엔토텔린 수용체 A에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명에서 발굴한 항체는 종래의 항체와 비교하여 항원에 대한 결합력 및 생산성이 획기적으로 개선되어 엔도텔린 수용체 A 관련 질환의 치료 및 진단용 항체로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 도면 1은 제작된 동물세포용 발현 벡터를 나타낸다.
도 2는 프레임워크 영역 엔지니어링을 통해 제작된 4종 항체의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 프레임워크 영역 엔지니어링을 통해 제작된 4종 항체의 동물 세포에서의 정제 분석결과를 나타낸다.
도 4는 프레임워크 영역 엔지니어링을 통해 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 엔도텔린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 MJ-F1 항체에 대해 동물 세포에서의 항체 생산 수율 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 인간 엔도테린 수용체 A에 대한 프레임워크 영역 엔지니어링을 통해 제작된 4종 항체들의 항체의 항원-항체간 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 프레임워크 영역 엔지니어링을 통해 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 5종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체에 대해 동물 세포에서의 항체 생산 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 5종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체들의 항원-항체간 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 5종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 이용한 pH-의존적 인간 FcRn과의 ELISA 분석 결과를 나타낸다(도 8a: pH 7.4, 도 8b: pH 6.0).
도 9는 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 5종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 이용한 인간 FcγRIIa 변이체들과의 ELISA 분석 결과를 나타낸다(도 9a: FcγRIIa-131R, 도 9b: FcγRIIa-131H, 도 9c: FcγRIIa-158V, 도 9d: FcγRIIa-158F).
도 10은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 5종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 이용한 인간 C1q와의 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 이용한 대장암세포주 HT-29(도 11a), HCT-116(도 11b)에 대한 세포증식 억제 효능 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 대장암 이종이식 모델에 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 투여한 항암 유효성 분석 결과(도 12a), 투여된 대장암 이종이식 모델에서 적출한 대장암 조직분석 결과를 나타낸다(도 12b).
도 13은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 이용한 췌장암세포주 AsPC-1(도 13a), Panc-1(도 13b)에 대한 세포증식 억제 효능 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체를 이용한 위암세포주 SNU-216(도 14a), SNU-668(도 14b)에 대한 세포증식 억제 효능 분석 결과를 나타낸다.
도 15는 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체들의 SEC-HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체들의 당쇄 구조 분석 결과를 나타낸다.
도 17은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체들의 RP-HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 Trastzumab 프레임워크 서열을 가지는 4종의 인간 엔도테린 수용체 A에 선택적 결합을 하는 항체들의 열적 안정성 시험 분석 결과를 나타낸다(도 18a: MJ-F1-WT, 도 18b: MJ-F1-pFc29, 도 18c: GG12-pFc29, 도 18d: FG12-pFc29).
도 19는 대한민국 특허출원번호 제10-2017-0075129호에 기재된 항체의 200 nM 농도에서 ET_A가 과발현된 대장암세포주인 HT-29 세포에 10 nM의 ET-1에 의해 유발된 신호전달의 저해능을 나타내는 그래프이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

<실시예 1> 엔도텔린 수용체 A에 특이적 결합 항체의 CDRs(complementarity-determining regions) 서열을 이용한 항체 프레임워크 영역 엔지니어링

앞서 특허 출원(출원번호 : 제10-2017-0075129호)한 ET_A 특이적 결합 항체 (AG8, EF12, GG12, FG12, AB9)(도 19)의 서열을 기반으로 항체 안정성 및 생산성 향상을 위해 다양한 항체 의약품 프레임워크 영역 서열들과 상기 항체 CDR 서열들과의 최적 조합으로 구성된 항체를 제작하고자 하였다. 이를 위해 항원-항체 결합에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 상기 항체의 가변영역 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 CDRs(Complementarity-determining regions)에 4종의 치료용 항체(trastuzumab, bevacizumab, omalizumab, adalimumab)의 프레임워크 영역을 PCR 기법으로 overlapping 하였다. 증폭된 4종의 가변영역 중쇄와 4종의 가변영역 경쇄 유전자를 XbaI/BssHII 제한효소 처리하고, 동일한 제한효소로 절단된 동물세포용 발현 벡터(pMAZ)에 삽입하였다(도 1). 접합된 항체 발현 벡터를 대장균 Jude1(F- mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC)

80lacZ△M15 △lacX74 recA1 endA1 araD139 △(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG)에 형질전환 하였고 Sanger sequencing을 이용하여 제작된 발현 벡터의 DNA 서열을 검증하였다. 제작된 4종의 항체(MJ-F1, MJ-F2, MJ-F3, MJ-F4)서열은 도 2에 나타내었다.

<실시예 2> 프레임워크 영역 엔지니어링이 완료된 4종의 항체의 동물세포에서 발현 및 정제

대장균 형질전환을 통해 증폭하여 회수한 발현 벡터를 polyethylenimine(PEI, Polysciences, 미국)이 포함된 150 mM NaCl 용액을 이용하여 Expi293 세포에서 임시발현(transient transfection)을 위해 유전자 이입(transfection)시키고 Freestyle293 발현 배지(Life Technologies, 미국)에서 37℃의 온도로 7일간 배양하였다. 발현된 세포 배양액을 6,000 rpm, 20분간 원심분리한 후, 상등액을 취해 0.22 μm filter를 통해 필터하였다. 걸러진 상등액은 4℃에서 16시간 동안 protein A(Amicogen, 한국) 레진 1 ml에 결합 유도하였다. 결합된 resin은 10 CV(column volume)의 PBS 용액으로 세척 후, 100 mM glycine(pH 2.7) 용액으로 용출한 후 1 M Tris-HCl(pH 8.0)으로 중화시켰다. PBS로 buffer change 진행 후 SDS-PAGE를 통해 환원조건과 비환원 조건에서 각각 정제된 4종 항체의 경쇄와 중쇄의 크기와 순도를 분석하였다(도 3). AG8과 4종의 제조된 항체(MJ-F1, MJ-F2, MJ-F3, MJ-F4)의 정제 후 항체 수율을 비교 분석하였으며, 그중 MJ-F1의 경우 AG8 항체에 비해 15배 증가된 수율을 얻을 수 있었다(도 4).

<실시예 3> 세포 외부 영역으로 노출된 엔도텔린 수용체 A 항원 영역과 제조된 항체들의 결합력 분석

AG8 항체와 제조된 4종의 항체(MJ-F1, MJ-F2, MJ-F3, MJ-F4)의 엔도텔린 수용체 결합력은 ELISA를 통해 분석하였다. 인간 G_αi3를 0.05 M Na₂CO₃(pH9.6) 버퍼용액으로 희석하여 5 μg/well의 농도로 96 well plate(Costar)에 4℃에서 16시간 결합시켰다. 4% skim milk가 포함된 PBST(0.05% Tween-20가 포함된 PBS) 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate를 1시간동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well씩 tween 20 0.05% 포함된 PBS 용액으로 4번 세척한 후 대장균에서 발현 정제하고 Sarkosyl로 reconstitution된 엔도텔린 수용체를 5 μg/ml을 결합시킴으로써 세포 외부 영역이 선택적으로 노출되도록 항원을 고정화 시켰다. 동물세포에서 발현 정제된 AG8과 4종의 제조된 항체(MJ-F1, MJ-F2, MJ-F3, MJ-F4)를 4배 serial dilution 하여 50 μl/well 씩 96 well plate에 1시간동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 150 μl/well 씩 PBST 0.05% 용액으로 4번 세척한 후 인간 IgG(H+L)-HRP conjugate를 PBS에 1:5,000 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well 씩 PBST 0.05% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl/well 씩 TMB(Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며, 20분 후 4 N H₂SO₄로 반응 종결시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 시그널 분석 결과, 대조군인 trastuzumab 항체, MJ-F3, MJ-F4의 결합력은 매우 낮아 측정이 되지 않았으며, 반면 MJ-F2는 132.8 nM, MJ-F1의 가시적인 평형해리상수는 1.41 nM로 선행 특허에서 발굴된 AG8항체에 비해 약 19배(26.1/1.41) 향상된 결과를 나타내었다(도 5, 표 1).

	MJ-F1	MJ-F2	AG8	MJ-F3	MJ-F4	Herceptin
K_D(nM)	1.41	132.8	26.1	n.d.	n.d.	n.d.

인간 엔도텔린 수용체 A에 대한 제작된 4종의 항체의 항원-항체간 ELISA 분석에서의 항원-항체의 계산된 평형해리상수

<실시예 4> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들의 동물세포에서 발현 및 정제

대장균 형질전환을 통해 증폭하여 회수한 발현 벡터를 polyethylenimine (PEI, Polysciences, 미국)이 포함된 150 mM NaCl 용액을 이용하여 Expi293 세포에서 임시발현 (transient transfection)을 위해 유전자 이입 (transfection) 시키고 Freestyle293 발현 배지 (Life Technologies, 미국)에서 37℃의 온도로 7일간 배양하였다. 발현된 세포 배양액을 6,000 rpm, 20분간 원심분리한 후, 상등액을 취해 0.22 μm filter를 통해 필터하였다. 걸러진 상등액은 4°C에서 16시간 동안 protein A (Amicogen, 한국) 레진 1 ml에 결합 유도하였다. 결합된 resin은 10 CV (column volume)의 PBS 용액으로 세척 후, 100 mM glycine (pH 2.7)용액으로 용출한 후 1 M Tris-HCl (pH 8.0)으로 중화시켰다. PBS로 buffer change 진행 후 SDS-PAGE를 통해 환원조건과 비환원 조건에서 각각 정제된 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET_A 항체들 (Fc 영역은 야생형 또는 서열목록 제35서열의 Fc 변이체인 PFc29 이용) (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)의 경쇄와 중쇄의 크기와 순도를 분석하였다. Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET_A 항체들 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)은 정제 후 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다(도 6).

<실시예 5> 엔도텔린 수용체 A 항원 영역과 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들의 결합력 분석

실시예 1로부터 선정된 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 5종의 항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29, EF12-pFc29)의 엔도텔린 수용체 결합력은 ELISA를 통해 분석하였다. 인간 G_αi3를 0.05 M Na₂CO₃ (pH9.6) 버퍼용액으로 희석하여 5 μg/well 의 농도로 96 well plate (Costar)에 4℃에서 16시간 결합시켰다. 4% skim milk가 포함된 PBS 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate를 1시간 동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well씩 PBST (0.5% Tween-20가 포함된 PBS) 용액으로 4번 세척한 후 대장균에서 발현 정제하고 Sarkosyl로 reconstitution된 엔도텔린 수용체를 5 μg/ml을 결합시킴으로써 세포 외부 영역이 선택적으로 노출되도록 항원을 고정화 시켰다. 동물세포에서 발현 정제된 5종의 항체를 4배 serial dilution하여 50 μl/well 씩 96 well plate에 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 세척한 후 인간 IgG (H+L)-HRP conjugate를 PBS에 1:5,000 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간 동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl/well씩 TMB (Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며, 20분 후 4 N H₂SO₄로 반응 종결시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 시그널 분석 결과, 대조군인 Trastuzumab 항체의 결합력은 매우 낮아 측정이 되지 않았으며, 반면 MJF1-WT는 0.4873 nM, MJF1-pFc29는 0.3637 nM AB9-pFc29는 0.7706 nM, FG12-pFc29는 0.4809 nM, EF12-pFc29는 0.6044 nM, GG12-pFc29는 0.2875 nM로 측정되었다 (도 7, 표 2).

	MJF1-WT	MJF1- pFc29	AB9- pFc29	FG12- pFc29	EF12- pFc29	GG12- pFc29	Trastzumab
K_D(nM)	0.4873	0.3637	0.7706	0.4809	0.6044	0.2875	n.d.

상기 프레임워크 서열을 가지는 6종의 ELISA 분석에서 엔도테린 수용체 A 항원-항체간 계산된 평형해리상수

<실시예 6> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들과 pH-의존적 FcRn의 결합력 분석

실시예 1로부터 선정된 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 5종의 항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29, EF12-pFc29)의 인간 FcRn에 대한 결합력은 ELISA를 통해 분석하였다. Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 5종의 항체를 0.05 M Na₂CO₃ (pH9.6) 버퍼용액으로 희석하여 4 μg/well의 농도로 96 well plate (Costar)에 4℃에서 16시간 결합시켰다. 4% skim milk가 포함된 PBS 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate를 1시간 동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well씩 PBST (0.5% Tween-20가 포함된 PBS) 용액으로 4번 세척한 후, 인간 FcRn과 Glutathione (GST)이 융합된 단백질을 4배 serial dilution 하여 50 μl/well 씩 96 well plate에 각각 pH 7.4와 pH 6.0 조건에서 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 세척한 후 항 Glutathion-HRP conjugate를 PBST에 1:5,000 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간 동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl/well 씩 TMB (Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며, 20분 후 4 N H₂SO₄로 반응 종결시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 도 8과 같은 결과를 얻었다. ELISA 시그널 분석 결과, 동물세포에서 발현 정제된 5종의 항체는 혈중 반감기에서 우수한 Trastuzumab 대조군 항체와 pH-의존적 인간 FcRn 결합이 매우 유사함을 확인하였다(도 8).

<실시예 7> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들과 인간 FcγRIIa 변이체들 간의 결합력 분석

실시예 1로부터 선정된 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 4종의 항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)와 인간 FcγRIIa 변이체(FcγRIIa-131R, FcγRIIa-131H, FcγRIIa-158V, FcγRIIa-158F)들 간의 결합력은 ELISA를 통해 분석하였다. Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 4종의 항체를 0.05 M Na₂CO₃ (pH 9.6) 버퍼용액으로 희석하여 4 μg/well의 농도로 96 well plate (Costar)에 4℃에서 16시간 결합시켰다. 4% skim milk가 포함된 PBS 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate를 1시간 동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well씩 PBST (0.5% Tween-20가 포함된 PBS) 용액으로 4번 세척한 후, 인간 FcγRIIa 변이체가 융합된 GST 단백질들을 4배 serial dilution 하여 50 μl/well 씩 96 well plate에 조건에서 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 세척한 후 anti-GST-HRP conjugate를 PBST에 1:5,000 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간 동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl/well씩 TMB (Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며, 20분 후 4 N H₂SO₄로 반응 종결시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 도 9와 같은 결과를 얻었다. ELISA 시그널 분석 결과, 동물세포에서 발현 정제된 4종의 항체는 Trastuzumab 대조군 항체와 인간 FcγRIIa 변이체들 간의 결합이 매우 유사함을 확인하였다 (도 9).

<실시예 8> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들과 인간 C1q와의 결합력 분석

실시예 1로부터 선정된 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 4종의 항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)와 인간 C1q 간의 결합력은 ELISA를 통해 분석하였다. Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링을 거쳐 제조된 4종의 항체를 0.05 M Na₂CO₃ (pH 9.6) 버퍼용액으로 희석하여 4 μg/well 의 농도로 96 well plate (Costar)에 4℃에서 16시간 결합시켰다. 4% skim milk가 포함된 PBS 용액에 w/v 5%가 되게 넣은 후 각각의 96 well plate을 1시간 동안 상온에서 blocking 하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well 씩 PBST (0.5% Tween-20가 포함된 PBS) 용액으로 4번 세척한 후, 인간 C1q를 4배 serial dilution 하여 50 μl/well 씩 96 well plate에 조건에서 1시간 동안 상온에서 결합시켰다. 그 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 세척한 후 anti-human C1q-HRP conjugate를 PBST에 1:400 비율로 희석하여 각각의 96 well plate에 1시간 동안 상온에서 결합하였다. 위의 용액을 버린 후 150 μl/well 씩 PBST 0.5% 용액으로 4번 씻어준 후 50 μl/well 씩 TMB (Thermo Scientific)로 반응을 진행하였으며, 20분 후 4 N H₂SO₄로 반응 종결시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 도면 10와 같은 결과를 얻었다. ELISA 시그널 분석 결과, 동물세포에서 발현 정제된 4종의 항체는 Trastuzumab 대조군 항체와 인간 C1q 간의 결합이 매우 유사함을 확인하였다(도 10).

<실시예 9> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들의 대장암 세포에서의 증식 억제 효능 확인

대장암 세포 연구에서 많이 사용되고 있는 HT-29와 HCT-116 세포주에서 프레임워크 영역 엔지니어링 된 항 ET_A항체의 대장암세포 증식력 억제 효능이 있는지 확인하였다. CyQUANT NF 형광 염료(Invitrogen, USA)를 이용해 세포 내 DNA 양 측정을 통해, 세포의 증식도를 확인하였다.

HT-29와 HCT-116 세포주에 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링 된 항 ET_A4종의 항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)를 각각 처리하고 37℃ 세포 배양기에서 1시간 동안 함께 배양시킨 후, 접종하고 72시간 후에 CyQUANT NF 형광 염료를 처리하여 형광 분광광도계(TECAN, Switzerland)를 이용해 세포 내 존재하는 DNA 수준에 따른 여기 파장 485 nm에 의한 방출 형광의 비(Emission by 485 nm excitation)를 측정함으로써 프레임워크 영역 엔지니어링된 항 ET_A항체가 대장암 세포의 증식력을 억제함을 확인하였다 (도 11). 도 11에서 보는 바와 같이, 본원발명의 항체는 HT-29와 HCT-116 대장암 세포주의 증식을 효과적으로 저해하는 효과를 확인하였다.

<실시예 10> 대장암 동물 모델에서 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들의 항암 유효성 확인

BALB/c nude mouse를 이용하여 flanks region에 대장암 HT-29 세포주를 마리당 2x10⁶ 세포 수가 되도록 PBS 100 μl 양에 맞춰서 피하에 주사한 (subcutaneous injection) 이종이식(xenograft) 모델을 만들고, 주사한 지 5일 후부터 본원발명의 발굴 항체를 200 μg 농도로 2일 간격으로 생성된 대장암 조직에 직접 주사하여 항암 유효성 검증을 위한 실험을 진행하였고 주사한지 21일 후에 대장암 조직을 떼어내어 대장암 조직을 떼어내어 도 12와 같은 결과를 도출하였다. Vehicle 대조군 그룹은 PBS 단독으로 항체의 양과 동일하게 주사한 그룹이다.

도 12에서 보는 바와 같이, 본원발명의 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET_A 4종의 항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)는 HT-29 대장암 세포주의 이종이식(xenograft) 모델에서 대장암의 성장을 저해하는 효과를 확인하였다. 상기 결과를 통해 본원발명의 Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET_A 4종의 항체는 동물 모델에서도 대장암세포의 증식을 효과적으로 저해하는 활성을 확인하였고, 치료제로서 효능이 있음을 확인하였다.

<실시예 11> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들의 췌장암 세포에서의 증식 억제 효능 확인

췌장암 세포 연구에서 많이 사용되고 있는 AsPC-1와 Panc-1 세포주에서 프레임워크 영역 엔지니어링된 항 ET_A항체(MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)들의 암세포 증식 억제 효능을 확인하기 위해 실시예 9와 같은 방법을 사용하여, 도 13과 같은 결과를 도출하였다.

도 13에서 보는 바와 같이, 본원발명의 프레임워크 영역 엔지니어링된 항 ET_A항체 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)들은 췌장암 세포주에서도 암세포의 증식을 효과적으로 저해하는 효과를 확인하였다. 상기 결과를 통해 본원발명의 프레임워크 영역 엔지니어링 된 항 ET_A항체 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)들은 췌장암 세포의 증식을 효과적으로 저해하는 활성이 있음을 확인하였다.

<실시예 12> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링된 항 ET _A 항체들의 위암 세포에서의 증식 억제 효능 확인

위암 세포 연구에서 많이 사용되고 있는 SNU-216과 SNU-668 세포주에서 프레임워크 영역 엔지니어링된 항 ET_A항체 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)들의 암세포 증식 억제 효능을 확인하기 위해 실시예 9와 같은 방법을 사용하여, 도 14와 같은 결과를 도출하였다.

도 14에서 보는 바와 같이, 본원발명의 프레임워크 영역 엔지니어링된 항 ET_A항체 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)들은 위암 세포주에서도 암세포의 증식을 효과적으로 저해하는 효과를 확인하였다. 상기 결과를 통해 본원발명의 프레임워크 영역 엔지니어링된 항 ET_A항체 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, FG12-pFc29, GG12-pFc29)들은 위암 세포의 증식을 효과적으로 저해하는 활성이 있음을 확인하였다.

<실시예 13> Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링 된 항 ET _A 항체들의 물성 및 특성 확인

Trastzumab 프레임워크 영역으로 엔지니어링 된 항 ET_A 항체들 (MJF1-WT, MJF1-pFc29, GG12-pFc29, FG12-pFc29) 및 대조군 항체 Trastzumab을 SEC-HPLC를 통해 분리한 결과 도 15와 같이 응집된 %가 10% 이하로 나타난 것을 확인하였다. 도 16에 보이는 바와 같이 당쇄의 구조를 분석한 결과 발굴된 항체의 당쇄 구조는 Human IgG standard와 크게 차이를 보이지 않았다. 도 17은 RP-HPLC를 통한 불순물의 여부를 판단한 결과로, 3종의 항체에서 불순물이 8% 이하로 나타났다. 발굴된 항체의 열적 안정성 시험 (nanoDSC)에서는 항체의 Tm 값이 70℃ 이상임을 확인하였다(도 18).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Antibody with enhanced binding to endothelin receptor type A <130> HP9290 <150> KR 10-2019-0063174 <151> 2019-05-29 <160> 35 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR1 No.1 or 3 <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR1 No.2 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR1 No.4 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser 20 25 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR2 No.1 <400> 4 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 15 Arg <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR2 No.2 <400> 5 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 15 Ala <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR2 No.3 <400> 6 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 15 Trp <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR2 No.4 <400> 7 Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 15 Ser <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 No.1 <400> 8 Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 No.2 <400> 9 Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 No.3 <400> 10 Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr 1 5 10 15 Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 No.4 <400> 11 Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR4 No.1, 2, 3 or 4 <400> 12 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR1 No.1 or 2 <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 14 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR1 No.3 <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 20 25 <210> 15 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR1 No.4 <400> 15 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR2 No.1 <400> 16 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR2 No.2 <400> 17 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR2 No.3 <400> 18 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR2 No.4 <400> 19 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 No.1 <400> 20 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 21 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 No.2 <400> 21 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 22 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 No.3 <400> 22 Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 23 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 No.4 <400> 23 Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR4 No.1, 2, 3 or 4 <400> 24 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 <400> 25 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Asp 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 <400> 26 Met Asn Pro Lys Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 <400> 27 Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 28 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 <400> 28 Val Gly Ser 1 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 <400> 29 Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3-AG8 <400> 30 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3-EF12 <400> 31 Ala Lys Asp Pro Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3-GG12 <400> 32 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Val Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3-FG12 <400> 33 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Leu Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3-AB9 <400> 34 Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Glu Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 35 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PFc29 <400> 35 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims

중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는, 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
(a) 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제25서열의 VH-CDR1 및 서열목록 제26서열의 VH-CDR2를 포함;
(b) 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제27서열의 VL-CDR1, 서열목록 제28서열의 VL-CDR2 및 서열목록 제29서열의 VL-CDR3을 포함; 및
(c) 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제30서열의 VH-CDR3 또는 서열목록 제30서열에서 4번째, 7번째, 9번째 및 12번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 돌연변이를 포함하는 서열의 VH-CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-CDR3은 서열목록 제30서열에서 4번째 아미노산이 P(프롤린)로; 7번째 아미노산이 L(류신)로; 9번째 아미노산이 V(발린)로; 또는 12번째 아미노산이 E(글루타메이트)로; 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-CDR3은 서열목록 제30서열, 서열목록 제31서열, 서열목록 제32서열, 서열목록 제33서열 및 서열목록 제34서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제1서열; 또는 서열목록 제1서열에서 16번째 및 24번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역1(VH-FR1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-FR1은 서열목록 제1서열에서 16번째 아미노산이 R(아르기닌)로; 또는 24번째 아미노산이 V(발린);로 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 4 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-FR1은 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열 및 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제4서열; 또는 서열목록 제4서열에서 1번째, 2번째, 4번째, 16번째 및 17번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역2(VH-FR2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 7 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-FR2는 서열목록 제4서열에서 1번째 아미노산이 M(메티오닌)으로; 2번째 아미노산이 N(아스파라진)으로; 4번째 아미노산이 I(이소류신)로; 16번째 아미노산이 S(세린) 또는 G(글라이신)로; 및 17번째 아미노산이 A(알라닌), W(트립토판) 또는 S(세린)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 7 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-FR2는 서열목록 제4서열, 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제8서열; 또는 서열목록 제8서열에서 1번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 12번째, 14번째, 16번째, 17번째, 19번째, 20번째 및 21번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역3(VH-FR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-FR3은 서열목록 제8서열에서 1번째 아미노산이 D(아스파테이트), T(트레오닌) 또는 N(아스파라진)으로; 4번째 아미노산이 A(알라닌)로; 5번째 아미노산이 D(아스파테이트)로; 6번째 아미노산이 F(페닐알라닌)로; 7번째 아미노산이 E(글루타메이트)로; 8번째 아미노산이 R(아르기닌)로; 12번째 아미노산이 F(페닐알라닌)로; 14번째 아미노산이 R(아르기닌) 또는 L(류신)로; 16번째 아미노산이 N(아스파라진) 또는 D(아스파테이트)로; 17번째 아미노산이 A(알라닌)로; 19번째 아미노산이 S(세린)로, 20번째 아미노산이 S(세린)로; 및 21번째 이마노산이 L(류신) 또는 F(페닐알라닌)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역의 VH-FR3은 서열목록 제8서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제12서열의 중쇄 가변영역 프레임워크 영역4(VH-FR4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제13서열; 또는 서열목록 제13서열에서 4번째 및 24번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역1(VL-FR1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 14 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 VL-FR1은 서열목록 제13서열에서 4번째 아미노산이 L(류신)로; 또는 24번째 아미노산이 S(세린)로; 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 14 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 VL-FR1은 서열목록 제13서열, 서열목록 제14서열 및 서열목록 제15서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제16서열; 또는 서열목록 제16서열에서 1번째, 2번째 및 14번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역2(VL-FR2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 17 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 VL-FR2는 서열목록 제16서열에서 1번째 아미노산이 L(류신) 또는 M(메티오닌)으로; 2번째 아미노산이 N(아스파라진)으로; 및 14번째 아미노산이 V(발린)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 17 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 VL-FR2는 서열목록 제16서열, 서열목록 제17서열, 서열목록 제18서열 및 서열목록 제19서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제20서열; 또는 서열목록 제20서열에서 1번째, 3번째, 14번째 및 31번째 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 서열;의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역3(VL-FR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 20 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 VL-FR3은 서열목록 제20서열에서 1번째 아미노산이 T(트레오닌), S(세린) 또는 Y(티로신)로; 3번째 아미노산이 Q(글루타민), H(히스티딘) 또는 E(글루타메이트)로; 14번째 아미노산이 G(글리아신)로; 및 31번째 아미노산이 V(발린)로; 치환된 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 20 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 VL-FR3은 서열목록 제20서열, 서열목록 제21서열, 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제24서열의 경쇄 가변영역 프레임워크 영역4(VL-FR4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자.
제 24 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
제 25 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제 24 항의 핵산분자 또는 제 25 항의 벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제 24 항의 핵산분자 또는 제 25 항의 벡터를 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 정량 방법.
하기의 단계를 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A)의 과발현에 의한 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
(a) 피검자로부터 체외로 분리된 샘플을 취득하는 단계;
(b) 제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 상기 샘플에 처리하는 단계; 및
(c) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 엔토텔린 수용체 A의 발현양 보다 높은지 여부를 확인하는 단계.
제 30 항에 있어서, 상기 엔토텔린 수용체 A의 과발현에 의한 질환은 암 또는 고혈압인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 엔토텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A) 정량 키트.