ES2876151T3 - Anticuerpos anti-c-met y sus conjugados fármaco-anticuerpo para una inhibición tumoral eficiente - Google Patents

Anticuerpos anti-c-met y sus conjugados fármaco-anticuerpo para una inhibición tumoral eficiente Download PDF

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Abstract

Anticuerpo anti­c­MET o su fragmento de unión a antígeno, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une al c­MET humano con una afinidad de al menos 10­8 M, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de tipo IgG y en el que el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-c-met y sus conjugados fármaco-anticuerpo para una inhibición tumoral eficiente
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-c-MET y sus conjugados fármaco-anticuerpo que son útiles en el tratamiento del cáncer. La presente invención además proporciona un método para la producción del anticuerpo de la invención o sus conjugados fármaco-anticuerpo.
Antecedentes
El receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR), también conocido como c-MET (por las siglas en inglés de transición epitelio-mesenquimal), es una proteína transmembrana receptor tirosina quinasa (RTK) de tipo I que se identificó por primera vez como proteína de fusión oncogénica TRP-MET en células de osteosarcoma humano transformadas químicamente. La expresión de c-MET y la secreción de su li­ gando el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, o factor de dispersión, SF) por las células mesenquimales están implicadas en la diferenciación, proliferación y supervivencia celular, reordenamiento del citoesqueleto, desprendimiento, dispersión, movilidad e invasividad celular (Birchmeier y cols. (2003) Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 4, 915-925). El proteoglicano decorina sirve como ligando para c-MET (Goldoni y cols. [2009] J.Cell Biol. 185, 743-754). A nivel macrocelular, c-MET presenta diversas funciones como, por ejemplo, en la embriogénesis, curación de heridas y regeneración de órganos. La oncogénesis se caracte­ riza por cambios morfológicos de las células cancerosas de fenotipo epitelial a mesenquimal lo que facilita la propagación de las células metastásicas. En general, la expresión más elevada de c-MET se encuentra en las lesiones metastásicas en comparación con tumores primarios, lo que evidencia la implicación de c-MET en las metástasis (Cipriani y cols. [2009] Lung Cancer 63, 169-179).
c-MET es un heterodímero formado por una cadena a y una cadena p unidas mediante puentes disulfuro que se escinde proteolíticamente a partir de una única proteína precursora. Está formado por un dominio extracelular grande compuesto por un dominio en hélice beta con siete palas denominado SEMA, un domi­ nio PSI relacionado con plexinas, semaforinas e integrinas, así como cuatro dominios IPT repetidos que muestran homología con inmunoglobulinas, plexinas y factores de transcripción. El sitio de escisión para furina entre las cadenas a y p se localiza entre las palas 4 y 5. El único dominio transmembrana va seguido de un dominio tirosina quinasa intracelular. La unión del ligando al receptor induce su dimerización y la autofosforilación de los restos de tirosina 1230, 1235 y 1235 lo que lleva a una transfosforilación de las tirosinas 1349 y 1356 que son sitios de acoplamiento molecular o «docking» para proteínas de homología con el dominio 2 de Src (SH2). (Birchmeier y cols. [2003] Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 4, 915-925). A continuación, el reclutamiento de Src activa cascadas de señalización intracelular como las vías de PI3K/AKT y Ras/MAPK.
HGF es un heterodímero formado por una cadena a y una cadena p unidas mediante puentes disulfuro que se procesa a partir de una única proteína precursora (Lokker y cols. [1992] EMBO J. 11, 2503-2510). La cadena a del HGF se compone de un dominio N-terminal seguido de cuatro dominios en rosquilla o «kringle» mientras que la cadena p del HGF consta solo de un dominio que presenta homología con serina proteasa (SPH). El HGF se une al proteoglicano heparina y forma homodímeros de HGF en solución. Para su inter­ acción con c-MET se ha propuesto una dimerización inducida por ligando como un complejo c-MET:HGF 2:2 (Niemann [2013] Biochim.Biophys.Acta 1834, 2195-2204.; Stamos y cols. [2004] EMBO J. 23, 2325­ 2335). Se conocen dos sitios de unión previstos para HGF en c-MET: se ha propuesto que la cadena p de HGF se une con baja afinidad a las palas dos y tres del dominio SEMA (Gherardi y cols. [2003] Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100, 12039-12044; Stamos y cols. [2004] EMBO J. 23, 2325-2335), mientras que se han propuesto dos sitios para la unión de alta afinidad de la cadena a de HGF a c-MET. En un primer modelo se propuso que los dominios IPT 3 y 4 del fragmento N-terminal acortado de HGF, denominado NK1, sirven como el sitio de unión de alta afinidad, mientras que en un segundo modelo se propuso la unión de NK1 a la pala 5 del dominio SEMA, constituyendo el sitio de unión de alta afinidad de la cadena a de HGF a c-MET (Youles y cols. [2008] J.Mol.Biol. 377, 616-622).
Debido a la implicación de c-MET en la oncogénesis y la metástasis, se han desarrollado recientemente varios anticuerpos dirigidos frente a HGF y c-MET, algunos de los cuales se han evaluado en ensayos clínicos (Prat y cols. [2014] Biomedicines 2, 359-383). Los anticuerpos que neutralizan HGF, como por ejemplo rilotumumab y ficlatuzumab, solo van dirigidos al ligando y, por tanto, no son eficaces en el cáncer con activación constitutiva de c-MET. Adicionalmente, HGF se almacena abundantemente como proteína precursora no procesada en la matriz extracelular del tejido lo que afecta a la eficacia de los anticuerpos anti-HGF. Con respecto a c-MET, se han desarrollado anticuerpos frente a varios epítopos del receptor. Onartuzumab (oa 5d 5, MetMAb, RO5490258) y emibetuzumab (LY2875358) son los que están más avan­ zados en cuanto a desarrollo clínico con ensayos en fase III y II, respectivamente. Aunque el epítopo de unión de ambos anticuerpos se localiza dentro del dominio SEMA de c-MET, el anticuerpo onartuzumab monovalente actúa predominantemente mediante competición con HGF (Merchant y cois. [2013] Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 110, E2987-E2996), mientras que el anticuerpo bivalente emibetuzumab induce la degradación del receptor a pesar del bloqueo de unión al ligando (Liu y cols. [2014] Clin.Cancer Res. 20, 6059-6070.). En la actualidad se están evaluando tres anticuerpos anti-c-MET adicionales en ensayos clí­ nicos en fase I: el anticuerpo bivalente ABT-700 (h224G11), el anticuerpo ARGX-111 potenciador de la respuesta inmunitaria mediada por células (ADDC) (WT52-E) (Basilico y cols. [2014] J.Clin.Invest 124, 3172-3186; Hultberg y cols. [2015] Cancer Res. 75, 3373-3383) y el anticuerpo bivalente que degrada c-MET SAIT301 (Oh y cols. [2012] Mol.Cells 34, 523-529.). Mientras que ARGX-111 y emibetuzumab ocupan un epítopo solapante, se desconoce el sitio de unión exacto de SAIT301. Este último induce la degradación de c-MET a través de la vía lisosomal mediada por LRIG. (Lee y cols. [2014] Oncogene 33, 34-43). Presu­ miblemente este es el mismo modo de acción que el de la unión de LMH 87 a la parte superior de la hélice SEMA en las palas 3 y 4. (Greenall y cols. [2012] PLoS.One. 7, e34658; Prat y cols. [2014] Biomedicines 2, 359-383). No obstante, SAIT301 y LMH 87 no comparte un epítopo solapante. Otro anticuerpo que degrada c-MET es DN30 que se une al cuarto dominio IPT; este induce la degradación a través de la metaloproteasa ADAM-10 y no compite por la unión al ligando. (Vigna y cols. [2015] Mol. Oncol. 9, 1760-1772). Algunos anticuerpos bivalentes anti-c-MET son susceptibles de desencadenar un agonismo parcial o completo que requiere formatos monovalentes en parte para su aplicación terapéutica. Los acontecimientos adversos de los anticuerpos dirigidos frente a c-MET, por ejemplo, onartuzumab, son principalmente edema y aconteci­ mientos trombóticos asociados con el bloqueo del eje c-MET/HGF que regula la integridad epitelial y la curación de heridas.
Por tanto, existe una continua necesidad de ampliar el repertorio de anticuerpos anti-c-MET de alta afinidad y sus correspondientes conjugados fármaco-anticuerpo para su uso en el tratamiento del cáncer que su­ peren las limitaciones de los anticuerpos anti-c-MET disponibles en la técnica previa.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente anticuerpos anti-c-MET o sus fragmentos de unión a antígeno, que se unen a c-MET con alta afinidad y pueden utilizarse para inhibir de manera eficaz los tumores que expresan c-MET.
La presente invención proporciona anticuerpos anti-c-MET o sus fragmentos de unión a antígeno, que se unen al c-MET humano con una afinidad de al menos 10'8 M.
Según una realización, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno como se describe anteriormente se unen a la variante N375S del c-MET humano.
En una realización preferida los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno según se describe anteriormente se unen a un epítopo comprendido en el dominio SEMA del c-MET humano e inhibe la señalización de c-MET.
Según una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente se une a un epítopo que comprende los dominios IPT 1 a 4 del c-MET humano e inhibe la señalización de c-MET.
En una realización, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno según se describe anteriormente inhiben en un 50 % la unión del HGF humano recombinante al ECD de c-MET humano a una concentración de 0,88 * 10'9 M o menor en un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima utilizando HGF en fase sólida.
Según una realización, el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de la invención es un Fab, un F(ab')2 o un scFv.
El anticuerpo de la invención es un anticuerpo de tipo IgG.
Los anticuerpos de la invención según se describe a continuación comprenden secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
En una realización, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno están además acoplados a un agente diagnóstico o terapéutico.
En una realización, la presente invención proporciona una molécula de inmunoglobulina heterodimérica que comprende
(i) un primer y/o segundo fragmento Fab o scFv que específicamente se unen a c-MET humano y (ii) una región bisagra de anticuerpo, un dominio CH2 de anticuerpo y un dominio CH3 de anticuerpo que comprenden un dominio híbrido de interfase de interacción proteína-proteína en el que dicho dominio de interfase de interacción se forma mediante segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de un primer miembro y segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho segundo miem­ bro, en el que dicho dominio de interfase proteína-proteína de la primera cadena interacciona con la interfase proteína-proteína de la segunda cadena mediante la homodimerización de los corres­ pondientes segmentos de aminoácidos del mismo miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas dentro de dichos dominios de interacción,
en el que la primera cadena de inmunoglobulina genéticamente modificada tiene la secuencia polipeptídica («AG-SEED»):
GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL y la segunda cadena de inmunoglobulina genéticamente modificada tiene la secuencia polipeptídica («g A-SEED»):
GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDG SFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR y en el que el primer y/o el segundo fragmen­ tos Fab o scFv comprenden al menos dos de las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8.
En una realización, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención está además acoplada con un agente diagnóstico o terapéutico.
Según una realización, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según la invención está acoplada a una citotoxina.
En una realización, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención no está fucosilada.
En una realización, el anticuerpo de la invención, o la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se describe anteriormente, puede utilizarse en el tratamiento del cáncer.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: «Binning» (agrupación) de epítopos de los anticuerpos de la invención o de las moléculas de inmunoglobulina heterodiméricas
Figura 2: Resultados del ELISA de desplazamiento de HGF
Figura 3: Ensayo de citotoxicidad para conjugados fármaco-anticuerpo utilizando conjugados no aco­ plados covalentemente con la citotoxina duocarmicina SA (DMSA). Los resultados indican efectos citotóxicos dependientes de la expresión de c-MET según las respectivas líneas ce­ lulares analizadas.
Figura 4: Ensayo de citotoxicidad para conjugados fármaco-anticuerpo utilizando conjugados no aco­ plados covalentemente con la citotoxina monometil auristatina E (MMAE). Los resultados in­ dican efectos citotóxicos dependientes de la expresión de c-MET según las respectivas líneas celulares analizadas.
Figura 5: Inhibición de la señalización de c-MET mediante los anticuerpos de la invención evaluado mediante un ensayo de fosforilación específico de c-MET. La inhibición se evaluó a una con­ centración de 167 nM de los anticuerpos de la invención o de las moléculas de inmunoglobu­ lina heterodiméricas según se indica. MetMab© y emibetuzumab representan los controles.
Figura 6: Resumen de las propiedades de los anticuerpos. KD aproximadas de los anticuerpos de la invención frente al ECD del c-MET humano (oa CS06: 3 * 10'10 M, oa B10v5: 4,17 * 10'10 M, B10v5 IgG1: 1,88 * 10'10 M, CS06 IgG1: 1,34 * 10'10 M). Molécula de inmunoglobulina hete­ rodimérica biespecífica y biparatópica de la invención que comprende fragmentos Fab CS06 y B10v5 («bp CS06xB10v5»: 1,96 * 10'11 M).
Figura 7: SEQ ID NO: 1
Figura 8: SEQ ID NO: 2
Figura 9: SEQ ID NO: 3
Figura 10: SEQ ID NO: 4
Fig ura 11: SEQ ID NO: 5
Fig ura 12: SEQ ID NO: 6
Fig ura 13: SEQ ID NO: 7
Figura 14: SEQ ID NO: 8
Fig ura 15: SEQ ID NO: 9
Fig ura 16: SEQ ID NO: 10
Listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del clon B10 anti-c-MET SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del clon B10 anti-c-MET SEQ ID NO: 3 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del clon F06 anti-c-MET SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del clon F06 anti-c-MET SEQ ID NO: 5 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del clon B10v5 anti-c-MET SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del clon B10v5 anti-c-MET SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del clon CS06 anti-c-MET SEQ ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del clon CS06 anti-c-MET SEQ ID NO: 9 AG-SEED
SEQ ID NO: 10 GA-SEED
SEQ ID NO: 11 MET humano (c-MET)
Descripción detallada de la invención
Aunque la presente invención se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos en particular descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito únicamente de describir realizaciones en particular y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que normalmente entiende un experto en la materia.
A continuación se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. No debe interpretarse que los ejemplos y las realizaciones preferidas descritos de modo diverso limitan la presente invención solo a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción apoya y abarca realizaciones que combi­ nan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferi­ dos. Asimismo, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse revelada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique otra cosa.
A través de esta especificación y las reivindicaciones que le siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que el término «comprender», y variaciones como «comprende» y «comprendiendo», implica la inclusión de un miembro especificado, entero o en fases, pero no la exclusión de cualquier otro miembro no especificado, entero o en fases. El término «constar de» es una realización particular del tér­ mino «comprender», en el que se excluye cualquier otro miembro no especificado, entero o en fases. En el contexto de la presente invención, el término «comprender» abarca el término «constar de».
Se debe interpretar que los términos «un/una» y «el/la» y referencias similares usadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) cubren tanto el plural como el singular, a menos que se indique otra cosa en este documento o lo contradiga claramente el con­ texto. La relación de intervalos de valores en este documento pretende simplemente servir como un método abreviado de hacer referencia individualmente a cada valor independiente que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique otra cosa en este documento, cada valor individual se incorpora dentro de la especificación como si se enumerara individualmente en este documento. Ningún texto de la especi­ ficación debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.
A lo largo del texto de esta especificación se citan varios documentos. Cada uno de los documentos citados aquí (incluidas todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.) tanto anteriormente como a continuación, se incorporan por referencia en su totalidad. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a preceder a dicha memoria descriptiva en virtud de la invención previa.
El objetivo descrito se resuelve por la presente invención, específicamente por el contenido de las reivindi­ caciones adjuntas.
Los inventores han encontrado sorprendentemente que el anticuerpo anti-c-MET de la invención o su frag­ mento de unión a antígeno que se une a c-MET con alta afinidad pueden utilizarse para inhibir de manera eficaz los tumores que expresan c-MET.
Los objetivos descritos se resuelven según una primera realización mediante los anticuerpos anti-c-MET de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno, que se unen al c-MET humano con una afinidad de al menos 10'8 M. Por ejemplo, los anticuerpos anti-c-MET de la invención o sus fragmentos de unión a antí­ geno se unen a c-MEt con una afinidad de al menos 10'8 M, por ejemplo, con al menos 1 * 10'9 M, 2 * 10­ 9 M, 3 * 10-9, 4 * 10-9 M, 5 * 10-9 M, 6 * 10'9 M, 7 * 10'9 M, 8 * 10'9 M, 9 * 10'9 M, o con una afinidad de al menos aproximadamente 10'8 M a aproximadamente 10'10 M. Según se usa para el anticuerpo anti-c-MET de la invención, el término «anticuerpo» se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. El término también hace referencia a anticuer­ pos compuestos de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, o por ejemplo, a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado. El término «fragmento de unión a antígeno» según se utiliza en la presente inven­ ción se refiere a un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido mediante puentes disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio único (dAb), un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de especifi­ cidad doble, un anticuerpo biespecífico, un fragmento de unión a epítopo funcionalmente activo del mismo y cadenas sencillas (p. ej., Huston y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 [1988] y Bird y cols., Science 242, 423-426 [1988], que se incorporan a este documento por referencia). (Véase, en general, Hood y cols., Immunology, Benjamin, N.Y. 2.a ed. [1984], Harlow y Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory [1988] y Hunkapiller y Hood, Nature, 323, 15-16 [1986], que se incorporan a este documento por referencia). c-MEt según se usa en este documento se refiere al protooncogen MET, receptor tirosina quinasa (entrada P08581 de la base de datos UniProtKB), que también puede denominarse receptor del factor de crecimiento de hepatocitos.
El término fragmento Fab se refiere a un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del anticuerpo de la invención que puede, por ejemplo, obtenerse mediante tratamiento de las inmunoglobulinas de tipo IgG con papaína, lo que dará lugar a dos fragmentos Fab y un dominio Fc. Los aspectos funcionales y los métodos de obtención de los fragmentos Fab se describen por ejemplo en «Applications and Engineering of Mono­ clonal Antibodies» de D.J. King, CRC Press, 1998, capítulo 2.4.1; Zaho y cols. Protein Expression and Purification 67 (2009) 182-189; S.M. Andrew, J.A. Titus, Fragmentation of immunoglobulin G, Curr. Protoc. Cell Biol. (2003) Unidad 16.14 (Capítulo 16). La molécula de inmunoglobulina biespecífica heterodimérica de la invención puede comprender también, por ejemplo, un primer fragmento scFv que se une específica­ mente a EGFR. El término «scFv» según se usa en la presente invención se refiere a una molécula que comprende un dominio (o región) variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio (o región) variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) conectados mediante un enlazador, y carece de dominios constantes, por ejemplo, un fragmento scFv según la invención puede incluir, por ejemplo, moléculas de unión que constan de un dominio variable de cadena ligera (VL) o porción del mismo, y un dominio variable de cadena pesada (VH) o porción del mismo, donde cada dominio variable (o porción del mismo) deriva del mismo o diferentes anticuerpos. Las moléculas de scFv preferiblemente comprenden un enlazador inter­ puesto entre el dominio VH y el dominio VL, que puede por ejemplo, incluir una secuencia peptídica que comprenda los aminoácidos glicina y serina. Por ejemplo, la secuencia peptídica puede comprender la se­ cuencia de aminoácidos (Gly4Ser)n, donde n es un número entero entre 1 y 6, por ejemplo, n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente n = 4. Las moléculas scFv y sus métodos de obtención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 5892019; Ho y cols. 1989. Gene 77:51; Bird y cols. 1988 Science 242:423; Pantoliano y cols. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic y cols. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen y cols. 1991. Protein Engineering 4:837.
Según una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente se une, por ejemplo, a c-MET murino o humano, preferiblemente a c-MET humano que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 11, o c-MET humano, que incluye tanto c-MET de longitud completa como c-MET al que se ha eliminado el péptido señal, por ejemplo, con escisión de los aminoácidos 1-24, incluyendo la variante N375S de c-MET. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención según se describe anteriormente se une específicamente a la variante N375S de c-MET (rs33917957), aunque también puede unirse, por ejemplo, a variantes de c-MET como las que se describen en Nat Genet. 1997 mayo;16(1):68-73, por ejemplo, c-MET R970C (METR970C), c-MET T992I (METT99a), METM1149T, METV1206L, METV123SI, METD1246N, METY1248C, METL1213V, METD1246H, METY1248H, Me t M1268T, META320V, METN375S con escisión del péptido señal (p. ej., aminoácidos 1-24 de P08581 de Uni-ProtKB).
En una realización el anticuerpo de la invención según se describe anteriormente, o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo comprendido en el dominio SEMA del c-MET humano e inhibe la señaliza­ ción de c-MET. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención, o su fragmento de unión a antígeno, puede unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos 52 a 496 del c-MET humano maduro (P08581 de UniProtKB), por ejemplo, a un epítopo lineal o conformacional comprendido entre los aminoácidos 52 a 496, o por ejem­ plo, entre los aminoácidos 27 a 515 de c-MET humano, inhibiendo de este modo la señalización de c-MET. El término «epítopo» según se utiliza en la presente invención abarca tanto un epítopo lineal para el que, en el caso de un epítopo lineal, los aminoácidos consecutivos son reconocidos por el anticuerpo, como un epítopo conformacional para el que los anticuerpos reconocen aminoácidos hasta el grado en que adoptan una configuración o conformación adecuada dentro de la proteína madura y correctamente plegada. Los epítopos conformacionales vienen determinados tanto por la estructura tridimensional de una proteína, por ejemplo el c-MET humano, como por su secuencia primaria de aminoácidos. Un epítopo típicamente incluye al menos 3 y, más normalmente, al menos 5 u 8, 10 aminoácidos, por ejemplo, un epítopo puede compren­ der 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos. Típicamente, un epítopo también tiene una longitud de menos de 20 restos (p. ej., aminoácidos o nucleótidos), como por ejemplo, menos de 15 restos o menos de 12 restos.
El anticuerpo de la invención puede, por ejemplo, unirse a un epítopo contenido en el dominio SEMA con una afinidad de al menos 10'8 M, por ejemplo, con al menos 1 * 10'9 M, 2 * 10'9 M, 3 * 10'9 M, 4 * 10'9 M, 5 * 10-9 M, 6 * 10-9 M, 7 * 10-9 M, 8 * 10'9 M, 9 * 10'9 M.
Según una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente se une a un epítopo que comprende los dominios de inmunoglobulina-plexina-factor de trans­ cripción (IPT) 1 a 4 del c-MET humano e inhibe la señalización de c-MET. Por ejemplo, los dominios IPT del c-MET humano (P08581 de UniProtKB) comprenden los aminoácidos 562-655 (dominio IPT 1), 656-739 (dominio IPT 2), 741-842 (dominio IPT 3) y aminoácidos 856-952 (dominio IPT 4). El anticuerpo de la inven­ ción puede unirse, por ejemplo, a un epítopo contenido en el dominio IPT 1, dominio IPT 2, dominio IPT 3 o dominio IPT 4 con una afinidad como la descrita anteriormente, por ejemplo, con una afinidad de al menos 10-8 M, por ejemplo, con al menos 1 * 10'9 M, 2 * 10'9 M, 3 * 10'9 M, 4 * 10'9 M, 5 * 10'9 M, 6 * 10'9 M, 7 * 10'9 M, 8 * 10'9 M, 9 * 10'9 M. En un aspecto, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno se une al dominio IPT 1 e inhibe la señalización de c-MET. El anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente puede unirse también, por ejemplo, a más de un dominio IPT si el epítopo es un epítopo conformacional. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno puede unirse a un epítopo que está comprendido en los dominios IPT 1 y 2, o 2 y 3, o 3 y 4, o 1 y 4, o 1 y 3, o 2 y 4 o, por ejemplo, en los dominios IPT 1, 2, 3 y 4.
Según una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente inhibe en un 50 % la unión del HGF human recombinante al dominio extracelular del c-MET humano (ECD) a una concentración de 0,9 * 10'9 M o menos, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 x10-9 M o menos, 0,2 * 10'9 M o menos, 0,3 * 10'9 M o menos, 0,5 * 10'9 M o menos, 0,75 * 10'9 M o menos, en un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) utilizando HGF en fase sólida. Por ejemplo, la inhibición de la unión de HGF mediante el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente al ECD de c-MET puede valorarse utilizando los principios de interferometría de biocapa que se describen en Analytical Biochemistry 361 (2007) 1-6. Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes tecnologías comercializadas, como Biacore, 2000, 3000, T100, Flexchip, S51 y A100 o dotLab (Axela Biosensors), MultiSPRinter (Toyobo), Proteomic Processor (Lumera), SPRi-Plex (GenOptics), BIND (SRU Biosystems), Epic (Corning), ProteOn XPR (Bio-Rad) pudiéndose utilizar cada uno de ellos según las instrucciones del fabricante. En un ejemplo puede utilizarse una plataforma Octet Red96 (ForteBio) equi­ pada con Adquisición de datos Octet y software de análisis. Las mediciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo a 30 °C utilizando agitación con sensor orbital a 1000 rpm en un volumen de 200 |jl en microplacas negras de 96 pocillos siguiendo las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, las placas de ELISA Maxi-Sorp® pueden estar cubiertas con aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5 pmol de HGF recombinante durante toda la noche a 4 °C seguido de un bloqueo de las placas de Maxisorb® con BSA del 1 al 5 % (p. ej., BSA al 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %) en PBS-T. A continuación pueden incubarse, por ejemplo, con ECD de c-MET biotinilado a una concentración de aproximadamente 0,1 pmol a aproximadamente 2 pmol, por ejemplo, de aproximadamente 0,125 pmol, 0,15 pmol, 0,175 pmol, 0,2 pmol, 0,25 pmol, 0,3 pmol, 0,4 pmol, 0,5 pmol, 0,6 pmol, 0,7 pmol, 0,8 pmol, 0,9 pmol, 1,0 pmol a aproximadamente 1,25 pmol, 1,5 pmol, 1,75 pmol, 2 pmol, con diluciones seriadas de los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno a una concentración de aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 200 nM, por ejemplo, de aproximadamente 0,2 nM, 0,3 nM, 0,4 nM, 0,5 nM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8 nM, 0,9 nM, 1,0 nM, 1,25 nM, 1,5 nM, 2 nM, 2,5 nM, 3 nM, 3,5 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM a aproximadamente 15 nM, 17,5 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 32,5 nM, 35 nM, 40 nM, 42,5 nM, 45 nM, 47,5 nM, 50 nM, 55 nM, 60 nM, 65 nM, 70 nM, 75 nM, 80 nM, 85 nM, 90 nM, 95 nM, 100 nM, 125 nM 150 nM, 175 nM, 200 nM, o por ejemplo, de aproximadamente 15 nM, 17,5 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 32,5 nM, 35 nM, 40 nM, 42,5 nM, 45 nM, 47,5 nM, 50 nM a aproximadamente 55 nM, 60 nM, 65 nM, 70 nM, 75 nM, 80 nM, 85 nM, 90 nM, 95 nM, 100 nM, 125 nM 150 nM, 175 nM, 200 nM, o por ejemplo, de aproximadamente 55 nM, 60 nM, 65 nM, 70 nM, 75 nM, 80 nM, 85 nM, 90 nM, 95 nM, 100nM a aproximadamente 125 nM, 150 nM, 175 nM, 200 nM. A continuación, la unión del ECD de c-MET biotinilado al HGF inmovilizado puede, por ejemplo, visualizarse utilizando estreptavidina conjugada con HRP en una dilución de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10000, por ejemplo, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000, 1:4000, 1:4500, 1:5000, 1:7500, 1:8000, 1:9000, seguido, por ejemplo, de la adición de una solución sustrato de ELISA Ultra TMB y ácido sulfúrico. La absorbancia resultante de la unión del ECD de c-MET a HGF sin adición de los anticuerpos anti-c-MET de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno puede definirse como el 100 % de unión a HGF. Por ejemplo, entre los controles pueden incluirse anticuerpos control de isotipo SEED anti-lisozima de huevo de gallina (HEL) a una concentración de aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 200 nM, por ejemplo, 0,25 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 75 nM, 100 nM, 125 nM, 150 nM, 175 nM. Los datos pueden representarse como % de unión a HGF frente al logaritmo de la concentración de los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno. Por ejemplo, e1HGF recombinante utilizado en los ensayos anteriores puede obtenerse a partir de fuentes comerciales o, por ejemplo, fabri­ carse en células de insecto como se describe en Biotechnol. Prog. 2000, 16, 146-151. El fragmento ECD de c-MET que puede utilizarse, por ejemplo, en el ensayo de ELISA según se ha descrito anteriormente comprende los aminoácidos 24 a 963 del c-MET humano, o por ejemplo, los aminoácidos 52 a 952 del c-MET humano (p. ej., c-MET carente del péptido señal y del dominio transmembrana, o p. ej., proteína ECD-Fc de c-MET comercializada).
En una realización el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo de la invención según se describe anteriormente es, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, o un fragmento scFv que tiene las mismas propiedades de unión que el anticuerpo de la invención según se describe anteriormente. El término «fragmento de unión a antígeno» según se utiliza en la presente invención puede también referirse a un fragmento Fd compuesto de los dominios VH y CH1, o a un fragmento Fv compuesto de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo o un fragmento dAb (véase p. ej., Ward y cols. (1989) Nature 341, 544-46) que comprende un dominio VH o por ejemplo, una región determinante de complementariedad aislada (CDR) de las cadenas ligeras y pesadas comprendida en cualquier de las SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 8 de los anticuerpos de la invención. El término «scFv» según se usa en la presente invención se refiere a una molécula que comprende un dominio (o región) variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio (o región) variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) conectados mediante un enlazador, y carece de dominios constantes, por ejemplo, un fragmento scFv según la invención puede incluir, por ejemplo, moléculas de unión que constan de un dominio variable de cadena ligera (VL) o porción del mismo, y un dominio variable de cadena pesada (VH) o porción del mismo, donde cada dominio variable (o porción del mismo) deriva del mismo o diferentes anticuerpos. Las moléculas de scFv preferiblemente comprenden un enlazador interpuesto entre el dominio VH y el dominio VL, que puede por ejemplo, incluir una secuencia peptídica que comprenda los aminoácidos glicina y serina. Por ejemplo, la secuencia peptídica puede com­ prender la secuencia de aminoácidos (Gly4Ser)n, donde n es un número entero entre 1 y 6, por ejemplo, n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente n = 4. Las moléculas scFv y sus métodos de obtención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 5892019; Ho y cols.
1989. Gene 77:51; Bird y cols. 1988 Science 242:423; Pantoliano y cols. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic y cols. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen y cols. 1991. Protein Engineering 4:837. El tér­ mino «di-scFv» según se utiliza para los fragmentos de unión a antígeno de la invención se refiere a dos fragmentos scFv que están unidos entre sí a través de un enlazador, por ejemplo como se describe en Cancer Research 54, 6176-618, 1 diciembre, 1994, o Chem Commun (Camb), 21 feb 2007;(7):695-7. Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención pueden incluir también, por ejemplo, diacuerpos, donde el término «diacuerpos» se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo estos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conec­ tado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para que se apareen los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno (véanse p. ej., los documentos EP 0404097 B1, WO 93/11161 y Hollinger y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 [1993]). Por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno según la invención pueden obtenerse mediante digestión con peptidasas como pepsina, o papaína: la pepsina pro­ ducirá una digestión proteolítica por debajo de los puentes disulfuro que dará lugar a fragmentos de anti­ cuerpo F(ab')2, mientras que la digestión proteolítica con papaína, que corta por encima de los puentes disulfuro, dará lugar a dos fragmentos Fab. Por consiguiente, un fragmento F(ab')2 es un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a Vh-Ch1 mediante un puente disulfuro. El F(ab')2 puede redu­ cirse en condiciones suaves para romper el puente disulfuro de la región bisagra, convirtiéndose de este modo el dímero F(ab)'2 en monómeros Fab'. Los fragmentos de anticuerpo mencionados anteriormente se definen en términos de digestión de un anticuerpo intacto con pepsina y papaína, no obstante, estos fragmentos pueden sintetizarse de novo mediante procedimientos químicos o utilizando metodología de ADN recombinante.
El anticuerpo de la invención es un anticuerpo de tipo IgG. El término «anticuerpo de tipo IgG» según se usa para el anticuerpo de la invención se refiere a anticuerpos de clase IgG, que en humanos incluyen cuatro subclases (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). (Alberts, B. y cols., capítulo 23: The Immune System, In Mo­ lecular Biology of the Cell, 3.a edición, Garland Publishing, Inc., Nueva York, N.Y.). Por tanto, el anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de tipo IgG1. El anticuerpo de tipo IgG1 de la invención puede, por ejemplo, comprender además mutaciones en su región Fc, como las que se describen en Duncan y cols., Nature 332:563 (1988), Sondermann y cols., Nature 406:267 (2o0o); Wines y cols., J. Immunol. 164:5313 (2000); Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao y cols., J. Exp. Med. 178:661 (1993), por ejemplo, aminoácidos en las posiciones 330 y 331 del índice de la UE, o por ejemplo, sustituciones en las posiciones 234, 235 y 237 del índice de la UE para reducir las funciones efectoras mediadas por el Fc reduciendo la unión de FcyRI, FcgRIIa o FcglII y/o unión al C1q del complemento.
Según una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID n O: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, las cadenas ligeras del anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno comprenden al menos una de las se­ cuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 y la cadena pesada puede comprender al menos una de las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
El anticuerpo de la invención comprende cadenas ligeras y pesadas que contiene las secuencias de ami­ noácidos según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. Las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo de la invención según se describe anteriormente, puede por ejemplo también comprenden variantes cinéticas que contie­ nen una o más, por ejemplo, una, dos, tres o más de las siguientes mutaciones en su secuencia de ami­ noácidos respectiva según el índice de la UE (numeración de la UE): por ejemplo, las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno según se describe ante­ riormente pueden comprender mutaciones cinéticas que pueden, por ejemplo, alterar la velocidad de diso­ ciación del anticuerpo de la invención tras su unión a c-MET. Por ejemplo, la secuencia de la cadena ligera según la SEQ ID NO: 1 puede comprender una o más, por ejemplo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o todas las siguientes mutaciones: V3A, T11V, T14S, R18S, R43Q, L45P, E74D, T85N, S86T, A90T, T92S, G100A, donde la numeración se proporciona según el sistema de numeración IMGT. La secuencia de la cadena pesada según la SEQ ID NO: 2 puede comprender la mutación Q6E según el sistema de numeración IMGT, por ejemplo, la secuencia de la cadena ligera según la SEQ ID NO: 3 puede comprender una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o todas las mutaciones (según la nu­ meración IMGt ): Q1S, L2Y, S7P, K44Q, I51v , V71I, o por ejemplo, la secuencia de la cadena pesada según la SEQ ID NO: 4 puede comprender una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todas las mutaciones (según la numeración IMGT) Q5V, A19V, M115I, M115L, M115V, M115A, M115F o, por ejem­ plo, la secuencia de la cadena ligera según la SEQ ID NO: 5 puede comprender una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o todas las mutaciones (según la numeración IMGT) E1S, P2Y, E17Q, T20R, P22T, R45K, L51V, T85N, S93R, F103Y o, por ejemplo, la secuencia de la cadena pesada según la SEQ ID NO: 8 puede comprender una o más, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todas las mutaciones (según la numeración IMGT) Q3R, Y37N, N66I, Q110S, D111.1Y, Y11.2D, S126Y. Las secuencias de las cadenas ligeras y pesadas según se describe anteriormente pueden com­ prender ambas, por ejemplo, una o más de las mutaciones descritas anteriormente, o por ejemplo, solo las secuencias de las cadenas pesadas, o las cadenas ligeras según se describe anteriormente comprendidas en el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno puede comprender una o más, o todas las mutaciones descritas anteriormente. Por consiguiente, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente puede comprender secuencias de cadenas ligeras y pesadas que comprendan una o más (p. ej., una, dos, tres o cuatro) de las mutaciones descritas anterior­ mente.
En un ejemplo el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de tipo IgG y comprende las cadenas pesadas y ligeras que comprenden las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (CS06) o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (B10v5) como se describe anteriormente y se une a c-MET humano con una afinidad de al menos 10'9 M, por ejemplo, 3 * 10'10, 4 * 10'10 M, 5 * 10'10 M, 6 * 10'10 M, 7 * 10'10 M, 8 * 10'10 M, 9 * 10'10 M. En un ejemplo, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención es una molécula de inmunoglobulina heterodimérica biespecifica y biparatópica, que comprende un primer fragmento Fab o scFv que comprende la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y un segundo fragmento Fab o scFv que comprende la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, en la que el primer fragmento Fab o scFv puede estar fusionado con un AG-SEED y el segundo fragmento Fab o scFv puede estar fusionado con un GA-SEED, o por ejemplo, en la que el primer fragmento Fab o scFv puede estar fusionado con un GA-SEED y el segundo Fab o scFv puede estar fusionado con un AG-SEED. El término «SEED» según se usa para, o en el contexto de la molécula heterodimérica de la invención, se refiere a heterodímeros de dominios Ch3 modificados genéticamente por intercambio de cadena (SEED, por sus siglas en inglés) como se describe en el documento WO2007/110205 A2 y en Protein Engineering, Design & Selection vol. 23 N.° 4 pág. 195­ 202, 2010. Estas moléculas heterodiméricas derivan de los dominios CH3 de las IgG e IgA humanas y crean heterodímeros CH3 SEED humanos complementarios que están compuestos de segmentos alternos de secuencias Ch3 de IgA e IgG humanas. Los pares resultantes de dominios Ch3 SEED se asocian preferi­ blemente para formar heterodímeros en una relación 1:1 cuando se expresan en células de mamífero para formar «SEEDbodies» (Sb). Según este documento, el término «GA-SEED» indica que la molécula SEED empieza con una secuencia de IgG, seguida de una secuencia de IgA, mientras que «AG-SEED» se refiere al hecho de que la molécula SEED empieza con una secuencia derivada de IgA seguida de una secuencia derivada de IgG. Por ejemplo, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica biespecífica y biparatópica se une al c-MET humano con una afinidad de al menos 1 * 10'9 M, por ejemplo, con al menos 2 * 10-11, 3 * 10-11 M, 4 * 10-11 M, 5 * 10-11 M, 6 * 10'11 M, 7 * 10'11 M, 8 * 10'11 M, 9 * 10'11 M).
Según una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente está además conjugado con un agente diagnóstico o terapéutico. El término agente diagnós­ tico según se utiliza para el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno se refiere a una entidad que puede utilizarse para detectar el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a c-MET, preferiblemente al c-MET humano y/o a sus variantes según se des­ cribe anteriormente. Por ejemplo, el agente diagnóstico puede ser un isótopo radiactivo, sondas fluorescen­ tes, fluoróforo, compuestos quimioluminiscentes, enzimas, sustratos de enzima, cofactores de enzima, in­ hibidores de enzima, colorantes, iones metálicos o biotina, o estreptavidina, que permiten la detección del anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno unido a c-MET. El término «acoplado» según se usa para el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno se refiere al hecho de que el colorante, radioisótopo, sondas fluorescentes, fluoróforo, compuestos quimioluminiscentes, enzimas, sus­ tratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, colorantes, iones metálicos, biotina, o es­ treptavidina pueden, por ejemplo, estar unidos no covalentemente o ligados vía iónica, o mediante interac­ ciones hidrófobas o unidos covalentemente al anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antí­ geno. Por ejemplo, el acoplamiento de las etiquetas detectables según se describe anteriormente, como sondas fluorescentes, colorantes o enzimas, al anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antí­ geno según se describe anteriormente puede realizarse según los métodos conocidos en la técnica como los descritos en Methods Cell Biol. 2001;63:185-204; Methods Mol Biol. 2010;588:43-8; Curr Protoc Mol Biol. Mayo 2001; capítulo 11:unidad 11.1.
Entre los ejemplos de etiqueta detectable según la invención que pueden acoplarse al anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antígeno se incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano pi­ cante, beta-galactosidasa, endopeptidasa a de inclusión nuclear del virus del mosaico del tabaco («proteasa TEV»). Los fluoróforos que pueden, por ejemplo, acoplarse al anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente pueden ser uno de entre 1,8-ANS, 4-metilumbeliferona, 7-amino-4-metilcumarina, 7-hidroxi-4-metilcumarina, acridina, Alexa Fluor 350™, Alexa Fluor 405™, AMCA, AMCA-X, ATTO Rho6G, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Rho13, ATTO Rho14, ATTO Rho101, Pacific Blue, Alexa Fluor 430™, Alexa Fluor 480™, Alexa Fluor 488™, BODIPY 492/515, Alexa Fluor 532™, Alexa Fluor 546™, Alexa Fluor 555™, Alexa Fluor 594™, BODIPY 505/515, Cy2, cyQUANT GR, FITC, Fluo-3, Fluo-4, GFP (EGFP), mHoneydew, Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 514, EYFP, DsRed, DsRed2, dTomato, Cy3.5, ficoeritrina (PE), rojo rodamina, mTangerine, mStrawberry, mOrange, mBanana, tetrametilrodamina (TRITC), R-ficoeritrina, ROX, DyLight 594, Calcium Crimson, Alexa Fluor 594™, Alexa Fluor 610™, Texas Red, mCherry, mKate, Alexa Fluor 660™, Alexa Fluor 680™, aloficocianina, DRAQ-5, carboxinaftofluoresceína, C7, DyLight 750, Cellvue NIR780, DM-NERF, eosina, eritrosina, fluoresceína, FAM, hidroxicumarina, IRDyes (IRD40, IRD 700, IRD 800), JOE, rodamina B Lissamine, Marina Blue, metoxicumarina, naftofluoresceína, PyMPO, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxirodamina, 6-carboxirodamina, 6-carboxitetrametilamino, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5,6-FAM, cloruro de dansilo, HEX, 6-JOE, NBD (7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, violeta de cresilo rápido, violeta azul de cresilo, azul cresilo brillante, ácido para-aminobenzoico, eritrosina, ftalocianinas, azometinas, cianinas, xantinas, succinilfluoresceínas, criptatos de tierras raras, europio trisbipiridina diamina, criptato o quelato de europio, diamina, dicianinas o colorante La Jolla Blue.
Los fluoróforos que pueden, por ejemplo, estar acoplados al anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antígeno según se describe anteriormente pueden incluir también puntos cuánticos. El término «punto cuántico» como se usa en la presente invención se refiere a un nanocristal esférico único de material semiconductor en el que el radio del nanocristal es menor o igual al tamaño del radio del excitón de Bohr para ese material semiconductor (el valor del radio del excitón de Bohr puede calcularse a partir de los datos encontrados en manuales que contienen información sobre propiedades de semiconductores, como CRC Handbook of Chemistry and Physics, 83.a ed., Lide, David R. [Editor], CRC Press, Boca Raton, Fla. [2002]).
Los puntos cuánticos se conocen en la técnica, como se describen en referencias como Weller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 41-53 (1993), Alivisatos, J. Phys. Chem. 100: 13226-13239 (1996) y Alivisatos, Science 271: 933-937 (1996). Los puntos cuánticos pueden tener, por ejemplo, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm de diámetro, por ejemplo, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm o 500 nm, preferible­ mente al menos de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 50 nm, más preferiblemente los puntos cuánticos tienen al menos de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 20 nm de diámetro (por ejemplo aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nm). Los puntos cuánticos se caracterizan por su tamaño nanométrico sustancialmente uniforme, que tienen con frecuencia aproxima­ damente de un 10 % a un 15 % de polidispersión o rango de tamaño. Un punto cuántico es capaz de emitir radiación electromagnética tras su excitación (es decir, el punto cuántico es fotoluminiscente) e incluye un «núcleo» de uno o más materiales semiconductores primeros y puede estar rodeado por una «coraza» de una segundo material semiconductor. Un núcleo de punto cuántico rodeado por una coraza semiconductora se denomina punto cuántico de «núcleo/coraza». El material de la «coraza» circundante tendrá preferible­ mente una energía de hueco de banda que es mayor a la energía de hueco de banda del material del núcleo y puede elegirse que tenga una separación atómica próxima a la del sustrato del «núcleo». El núcleo y/o la coraza pueden ser un material semiconductor que incluye, pero sin limitaciones, los materiales del grupo II-VI (ZnS, ZnSe, ZnTe, US, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe y similares), III-V (GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb y similares) y IV (Ge, Si y similares), PbS, PbSe y una aleación o una mezcla de los mismos. Los materiales preferidos de la coraza incluyen ZnS. Los puntos cuánticos pueden, por ejemplo, estar acoplados al anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antígeno mediante cualquier método conocido en la técnica como los métodos descritos en Nanotechnology. 9 diciembre de 2011;22(49):494006; Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 84 (2011) 360-368.
En una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno puede, por ejemplo, estar acoplado a un radioisótopo como 47Ca, 14C, 137Cs, 157Cr, 57Co, 60Co, 67Cu, 67Ga, 123I, 125I, 129I, 131I, 32P, 75Se, 85Sr, 35S, 201Th o 3H, preferiblemente, los radioisótopos se incorporan en una molécula adicional, como por ejemplo, un quelante. Los quelantes típicos que pueden usarse por ejemplo como una molécula adicio­ nal unida covalentemente al sustrato que comprende el donante de amino de la invención son DPTA, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), e Gt A (ácido etilenglicol-O,O'-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético), NTA (ácido nitrilotriacético), h Ed TA (N-(2-hidroxietil)-etilendiamino-N,N',N'-triacético), DTPA (ácido 2-[Bis[2-[bis(carboximetil)amino]-etil]amino]acético) o DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecano-1,4,7,10-tetraacético).
En una realización, el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno puede estar acoplado a un agente terapéutico. El término «agente terapéutico» según la invención, por ejemplo según se usa para el anticuerpo de la invención y su fragmento de unión a antígeno, se refiere a cualquier compuesto útil con fines terapéuticos. Por ejemplo, un compuesto o agente terapéutico de la invención puede ser cualquier compuesto que se administre a un paciente para el tratamiento de una neoplasia maligna, como por ejem­ plo, el cáncer. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero sin limitaciones, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), mesotelioma, mesotelioma irresecable, cáncer de mama, adenocarcinoma de estómago o de la unión gastroesofágica (GEJ), gástrico, timoma, cáncer de ovario, carcinoma cístico adenoide, carci­ noma cístico adenoide metastásico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón de células claras, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, carcinoma epidermoide de pulmón, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de células renales, cáncer de pulmón microcítico (CPM) o cáncer de mama triple negativo, trastornos linfoproliferativos, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónico (LMC), linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), LDCBG positivo para EBV, linfoma primario mediastínico de células B grandes, linfoma de células T/células B grandes ricas en histiocitos, linfoma folicular, linfoma de Hodgkin (LH), linfoma de células del manto (LCM), mieloma múltiple (MM), proteína de leucemia de células mieloides 1 (Mcl-1), sín­ drome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o linfoma linfocítico de células pequeñas (LLP), carcinoma de células de Merkel (CCM) o cáncer escamoso de cabeza y cuello (CECC).
Entre los agentes terapéuticos se incluyen, pero sin limitaciones, compuestos hidrófilos e hidrófobos. Por consiguiente, los agentes terapéuticos puede incluir, por ejemplo, moléculas similares a fármacos, proteí­ nas, péptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, aptámeros y moléculas pequeñas. Los agentes tera­ péuticos proteínas incluyen, por ejemplo, péptidos, enzimas, proteínas estructurales, receptores y otras proteínas celulares o en circulación, así como sus fragmentos y derivados, cuya expresión aberrante da lugar a uno o más trastornos. Por ejemplo, los agentes terapéuticos según la invención también incluyen, como una realización específica, agentes quimioterapéuticos, citostáticos y agentes citotóxicos. Por ejem­ plo, los agentes citostáticos que pueden acoplarse al anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno son uno de entre agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos, inhibidores de la mitosis, hor­ monas o antagonistas de hormonas. Los agentes alquilantes pueden incluir, por ejemplo, busulfano (Myleran), carboplatino (Paraplatin), clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida (Cytoxan), dacarbazina (DTIC-Dome), fosfato de estramustina, ifosfamida, mecloretamina (mostaza nitrogenada), melfalán (mostaza de fenilalanina), procarbazina, tiotepa, mostaza de uracilo; los antimetabolitos pueden incluir, por ejemplo, cladribina, citarabina (arabinósido de citosina), floxuridina (FUDR, 5-fluorodeoxiuridina), fludarabina, 5-fluorouracilo (5FU), gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina (6MP), metotrexato (ametopterina), 6-tioguanina, pentostatina, pibobroman, tegafur, trimetrexato, glucuronato; los antibióticos pueden incluir, por ejemplo, aclarubicina, bleomicina, dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), epirubicina, idarubicina, mitomicina C, mitoxantrona, plicamicina (mitramicina); o los inhibidores mitóticos pueden incluir, por ejemplo, etopósido (VP-16, VePesid), tenipósido (VM-26, Vumon), vinblastina, vincristina, vindesina, hormonas, o los antagonistas de hormonas que se puede usar incluyen, por ejemplo, buserelina, estrógeno equino conjugado (Premarin), cortisona, clorotrianseno (tace), dexametasona (Decadron), dietilestilbestrol (DES), etinilestradiol (Estinyl), fluoximesterona (Halotestin), flutamida, acetato de goserelina (Zoladex), caproato de hidroxiprogesterona (Delalutin), leuprolida, acetato de medroxiprogesterona (Provera), acetato de megestrol (Megace), prednisona, tamoxifeno (Nolvadex), testolactona (Teslac), testosterona. Se conocen en la técnica previa compuestos citostáticos o antineoplásicos como los descritos anteriormente y pueden encontrarse, por ejemplo, en D. S. Fischer & T. M. Knobf (1989), The cancer chemotherapy handbook (3.a ed.). Chicago: Year Book Medical and Association of Community Cancer Centers (Spring, 1992), Compendia-based drug bulletin, Rockville, MD. El agente diagnóstico o terapéutico según se describe an­ teriormente, por ejemplo, la etiqueta detectable según se describe anteriormente, o el agente terapéutico según se describe anteriormente, puede por ejemplo estar acoplado a al menos una cadena ligera del anticuerpo de la invención, o a al menos una cadena pesada del anticuerpo de la invención. Por ejemplo, el agente diagnóstico o terapéutico según se describe anteriormente puede estar unido a una cadena ligera, a cada una de las cadenas ligeras del anticuerpo de la invención o, por ejemplo, a una cadena pesada, o a cada una de las cadenas pesadas del anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antígeno.
En un aspecto, el agente diagnóstico o terapéutico puede estar unido covalentemente al anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antígeno mediante por ejemplo modificación química selectiva de restos de cisteína o histidina en el anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antígeno. Por ejemplo, los puentes disulfuro de la región bisagra del anticuerpo de la invención pueden reducirse selecti­ vamente para hacer que los grupos sulfhidrilo libres estén disponibles para el marcaje dirigido. Por ejemplo, puede realizarse una reducción con mercaptoetilamina (MEA) específica de sitio como se describe en J. Biolog. Chemistry Vol. 275, N.° 39, número del 29 de septiembre, pág. 30445-30450, 2000. Por ejemplo, puede disolverse la MEA (Pierce) en fosfato sódico 0,1 M, pH 6,0, DTPA 5 mM a una concentración de 50 mM y, a continuación, añadirse a una solución en un exceso de 10 veces con respecto a la concentración del anticuerpo de la invención (p. ej., 300 |j M). A continuación puede dejarse que se reduzca a temperatura ambiente por ejemplo durante 60 min. Tras la reducción, la solución de anticuerpo de la invención puede hacerse pasar a través de una columna Bio-Spin 30 que puede estar previamente equilibrado en TMAP 0,1 M, pH 8,2, DTPA 25 j M durante 2 min a 150 * g. La conjugación del agente terapéutico o diagnóstico según se describe anteriormente puede, a continuación, realizarse en una reacción de reducción utilizando mercaptoetilamina en, por ejemplo, fosfato tetrametilamonio 0,1 M, pH 8,5 sin presencia de ácido dietilentriaminopentaacético a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. El anticuerpo de la invención puede por ejemplo estar presente en un exceso de 10 veces con respecto al agente terapéutico o diagnóstico como se describe anteriormente, por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede estar pre­ senten a una concentración de aproximadamente 200 |jM. Los reactivos que no hayan reaccionado pueden eliminarse, por ejemplo, mediante centrifugación utilizando columnas Bio-Spin 30 previamente equilibradas con acetato de amonio 0,1 M, pH 6,5, durante 2 minutos a 150 * g, donde la centrifugación puede repetirse hasta que se eliminen todo el material de pequeño peso molecular. Alternativamente, la conjugación espe­ cífica de sitio según se describe en Methods Mol Biol. 2013;1045:189-203 utilizando enlazadores que reac­ cionan con grupos tioles puede utilizarse para la conjugación del agente diagnóstico o terapéutico según se describe anteriormente a los anticuerpos de la invención y/o a sus fragmentos de unión a antígeno como se describe anteriormente. En un aspecto, los agentes diagnósticos o terapéuticos según se describe an­ teriormente pueden acoplarse, por ejemplo, al anticuerpo de la invención o su fragmento de unión a antí­ geno usando bioconjugación mediada por enzimas. Por ejemplo, pueden usarse bioconjugaciones acopla­ das mediante sortasa A (srtA) o transglutaminasas (TGasa) para acoplar el agente diagnóstico o terapéutico al anticuerpo de la invención o a su fragmento de unión a antígeno (véase p. ej., Biomolecules 2013, 3, 870­ 888; documentos WO2012059882 A1, WO2014145441 A1). Los SEEDbodies pueden por ejemplo también modificarse de manera análoga usando las técnicas descritas anteriormente.
Según una realización, una molécula de inmunoglobulina heterodimérica comprende un primer y/o segundo fragmento Fab o scFv que se une específicamente a c-MET humano según se describe anteriormente, y una región bisagra de anticuerpo, un dominio Ch2 de anticuerpo y un dominio Ch3 de anticuerpo que com­ prende un dominio híbrido de interfase de interacción proteína-proteína en el que cada uno de dichos do­ minios de interfase de interacción se forma mediante segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de un primer miembro y segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho segundo miembro, en el que dicho dominio de interfase proteína-proteína de la primera cadena interacciona con la interfase proteína-proteína de la segunda cadena mediante homodimerización de los correspondientes segmentos de aminoácidos del mismo miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas dentro de dichos dominios de interacción, donde la primera cadena o miembro de la inmunoglobulina genéticamente modificada comprende la secuencia polipeptídica («AG-SEED»):
GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAV TSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL y en el que la segunda cadena o miembro de in­ munoglobulina genéticamente modificada comprende la secuencia polipeptídica («GA-SEED»):
GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDGSFFLYS ILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR y en el que el primer y/o el segundo fragmento Fab o scFv comprende al menos dos de las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.
Por ejemplo, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica puede comprender un Fab, o un fragmento scFv que comprende la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o por ejemplo Se Q ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o por ejemplo SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o por ejemplo SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 como se describe anteriormente. La molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se describe anteriormente puede por ejemplo comprender dos Fab, o dos scFv, o un Fab y un scFv, cada uno de los cuales puede comprender la SEQ ID n O: 1 y SEQ ID NO: 2, o por ejemplo SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o por ejemplo SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o por ejemplo s Eq iD n O: 7 y SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, el primer Fab puede com­ prender la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y el segundo Fab puede comprender la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o por ejemplo, el primer Fab puede comprender la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 y el segundo Fab puede comprender la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o por ejemplo SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, por ejemplo el primer Fab puede comprender la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y el segundo Fab puede por ejemplo comprender la secuencia de aminoácidos según la s Eq ID NO: 1 y s Eq ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 y s Eq ID n O: 4, o por ejemplo SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o en un ejemplo el primer Fab puede comprender las secuencias de las cadenas ligera y pesada según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o por ejemplo SEQ iD NO: 5 y SEQ ID NO: 6 y el segundo Fab puede comprender las secuencias de las cadenas pesada y ligera según la SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. En un ejemplo, la molécula de inmunoglobulina heterodi­ mérica según la invención como se describe anteriormente comprende solo un Fab, o scFv, por ejemplo, puede comprender un Fab-GA-SEED y un AG-SEED desprovisto de Fab o scFv, o por ejemplo, un scFv-GA-SEED y un AG-SEED desprovisto de Fab o scFv, o por ejemplo un GA-SEED desprovisto de Fab o scFv o un Fab-AG-SEED, o por ejemplo, GA-SEED desprovisto de un Fab o scFv y un scFv-AG-SEED, donde los fragmentos Fab o scFv comprenden los siguientes pares de cadenas ligeras y pesadas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o por ejemplo SEQ ID NO: 3 y SEQ iD NO: 4, o por ejemplo SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o por ejemplo SEQ iD NO: 7 y SEQ ID NO: 8, que puede además incluir las mutaciones según se describe anteriormente. En una realización, los fragmentos de unión a antígeno de la invención según se describe anteriormente pueden por ejemplo fusionarse adicionalmente a un GA-SEED o AG-SEED para formar un SEEDbody tras la heterodimerización, que comprende, por ejemplo, dos fragmentos de unión a antígeno de la invención como se describe anteriormente. Por ejemplo, un Fab o scFv de la invención puede fusionarse covalentemente a un GA-SEED, o alternativamente a una AG-SEED a través de un enlace peptídico a un enlazador peptídico como se describe en este documento, donde el Fab o scFv comprende las secuencias de la cadena ligera y la cadena pesada de la invención según se describe anteriormente, por ejemplo, el Fab o el scFv puede comprender una de las siguientes combinaciones de cadena ligera y ca­ dena pesada de SED ID N.° 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8. Un SEEDbody de la invención puede comprender, por ejemplo, un GA-SEED fusionado al clon B10 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 1, 2) y un AG-SEED fusionado al clon F06 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 3, 4), o por ejemplo, puede comprender un GA-SEED fusionado al clon B10v5 antic-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 5, 6) y un AG-SEED fusionado al clon CS06 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 7, 8) o por ejemplo un AG-SEED fusionado al clon B10 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos se­ gún las SEQ ID NO: 1, 2) y un GA-SEED fusionado al clon F06 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 3, 4), o por ejemplo comprende un AG-SEED fusionado al clon B10v5 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 5, 6) y un GA-SEED fusionado al clon CS06 anti-c-MET (que comprende la secuencia de aminoácidos según las SEQ ID NO: 7, 8), en el que las cadenas ligeras y pesadas de los SEEDbodies pueden estar unidas a un agente diagnóstico o terapéutico según se describe anteriormente. Por ejemplo, el SEEDbody de la invención puede comprender uno, dos, tres o cuatro cadenas ligeras acopladas o unidas a un agente terapéutico o diagnóstico según se describe anteriormente y/o uno, dos, tres o cuatro cadenas pesadas acopladas o unidas a un agente terapéutico o diagnóstico como se describe anteriormente. Los SEEDbodies según se describe anteriormente pueden, por ejemplo, según una realización abarcar variantes cinéticas como se describe anteriormente, comprendiendo una o más, por ejemplo, una, dos, tres o más de las mutaciones descritas anteriormente en sus respectivas secuencias de aminoácidos.
En una realización, el anticuerpo de la invención según se describe anteriormente, o la molécula de inmu­ noglobulina heterodimérica según se describe anteriormente está acoplado a una citotoxina. Por ejemplo, las citotoxinas acopladas al anticuerpo de la invención o a una molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se describe anteriormente pueden denominarse también, por ejemplo, «cargas activas». Las citoto­ xinas que pueden utilizarse, por ejemplo, según la invención pueden agruparse en dos clases principales: la primera clase incluye citotoxinas que rompen el ensamblaje de microtúbulos y la segunda clase son citotoxinas dirigidas a la estructura del ADN. Típicamente, las citotoxinas se acoplarán al anticuerpo de la invención, su fragmento de unión a antígeno o a la molécula de inmunoglobulina heterodimérica como se describe anteriormente mediante un enlazador. El término «enlazador» o «péptido enlazador» se refiere a una secuencia de aminoácidos sintético o artificial que conecta o enlaza dos moléculas, como por ejemplo, dos secuencias polipeptídicas que enlazan dos dominios polipeptídicos o, por ejemplo, una proteína y un fármaco citostático o toxina. El término «sintético» o «artificial» como se usa en la presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que no son naturales. Por ejemplo, un enlazador que puede unirse covalentemente a la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención o el anticuerpo de la in­ vención como se describe anteriormente puede ser escindible o no escindible. El término «escindible» como se usa en la presente invención se refiere a enlazadores que pueden ser escindidos por proteasas, ácidos o mediante reducción de un enlace disulfuro (p. ej., mediada por glutatión o sensible a glutatión). Por ejem­ plo, los enlazadores escindibles pueden comprender enlazadores valina-citrulina, enlazadores hidrazona o enlazadores disulfuro. Los enlazadores no escindibles que pueden, por ejemplo, unirse covalentemente al sustrato que comprende el donante de amino de la invención comprende el enlazador maleimidocaproílo a MMAF (mc-MMAF), N-maleimidometilciclohexano-1-carboxilato (MCC) o enlazadores mercapto-acetamidocaproílo. Por ejemplo, los enlazadores que se acoplan covalentemente a la molécula de inmunoglobulina biespecífica heterodimérica de la invención pueden también incluir enlazadores como los descritos en el documento WO 2010/138719, o por ejemplo, aquellos descritos en el documento WO 2014/093379. En consecuencia, las citotoxinas que pueden, por ejemplo, estar unidas covalentemente al enlazador según la invención incluyen doxorubicina, calicheamicina, auristatina, maitansina, duoarmicina y sus análogos, aamaitina, tubulisina y sus análogos. Se conocen en la técnica métodos para unir covalentemente citotoxinas a enlazadores y pueden, por ejemplo, realizarse según el método descrito en Mol. Pharmaceutics 2015, 12, 1813-1835. Las citotoxinas pueden acoplarse también, por ejemplo, con el anticuerpo de la invención que comprende un resto de IgG humana no unido covalentemente mediante el uso de fragmentos Fab anti-Fc humano conjugados con una citotoxina mediante un enlazador no escindible. Por ejemplo, pueden usarse preparaciones comerciales de estos conjugados Fab anti-Fc humano-citotoxina que comprenden la citoto­ xina a-amantina (por ejemplo, Fab anti-Fc-NC-AAMT fabricado por Moradec). Los principios de uso y eva­ luación de estos conjugados fármaco-anticuerpo pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 24 de mayo de 2016.
Según una realización, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se describe anteriormente no está fucosilada. El término «no fucosilado» según se usó para la molécula de inmunoglobulina heterodimé­ rica según la invención se refieren a una molécula de inmunoglobulina heterodimérica que carece del azúcar fucosa, o que, por ejemplo, tiene solo cantidades menores de fucosa en su estructura N-glicano, por ejem­ plo, menos del 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o menos del 1 % de los N-glicanos fucosilados en cualquier preparación de la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según la invención según se describe anteriormente. En un aspecto, el anticuerpo de la invención como se describe anteriormente puede estar no fucosilado. Típi­ camente, el N-glicano unido a Asn297 de la IgG1 humana, por ejemplo, del anticuerpo de la invención según se describe anteriormente, potencia significativamente su unión al FcYRIIIa mejorando de este modo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés). Las moléculas de inmunoglobulinas heterodiméricas no fucosiladas según la invención como se describe anteriormente pueden, por ejemplo, obtenerse mediante el uso de líneas celulares para su producción que carecen del transporta­ dor de GDP-fucosa SLC35C1, como se describe en Glycobiology. 2012;22:897-911, como las células CHO-gmt5. Alternativamente, puede utilizarse la coexpresión de GDP-6-desoxi-D-lixo-hexulosa reductasa como se describe en Glycobiology. Dic. 2010; 20(12):1607-18 para fabricar moléculas de inmunoglobulina hete­ rodimérica no fucosiladas, o el anticuerpo de la invención y/o sus fragmentos de unión a antígeno como se describe anteriormente.
En un aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona polinucleótidos aislados que codifican los an­ ticuerpos de la invención según se describe anteriormente, comprendiendo las secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, o cualquiera de sus respectivas variantes cinéticas como se describe anterior­ mente. El término «aislado» como se usa con los polinucleótidos según la memoria descriptiva se refiere a polinucleótidos que están separados de, por ejemplo, constituyentes, material celular y de otro tipo, con los que el polinucleótido normalmente está asociado en la naturaleza, por ejemplo, el polinucleótido aislado está al menos el 80 %, 90 %, 95 % puro en peso, es decir, carece de constituyentes contaminantes. Por ejemplo, los polinucleótidos aislados de la memoria descriptiva pueden referirse a una molécula de ADN que está separada de las secuencias inmediatamente contiguas (en las direcciones 5' y 3') del genoma según se encuentra en la naturaleza del organismo del cual deriva. Por ejemplo, el «polinucleótido aislado» puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, como un plásmido, plásmido de expresión o vector vírico, o integrada en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva también proporciona vectores de expresión que comprenden al menos un polinucleótido de la invención. En un aspecto, la presente memoria descriptiva también se refiere al uso de dichos polinucleótidos en la fabricación del anticuerpo de la invención o molécula de inmunoglobulina heterodimérica como se describe anteriormente. En un aspecto, la presente memoria descriptiva también se refiere a la fabricación del anticuerpo de la invención o molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se des­ cribe anteriormente mediante la expresión en líneas celulares heterólogas. Por ejemplo, los plásmidos de expresión que pueden usarse para la expresión del anticuerpo de la invención o sus fragmentos de unión a antígeno, o de la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se describe anteriormente pueden comprender, por ejemplo, pCMV, pcDNA, p4X3, p4X4, p4X5, p4X6, pVL1392, pVL1393, pACYC177, PRS420, o si se van a utilizar sistemas de vectores víricos, por ejemplo, vectores derivados de pBABEpuro, pWPXL, pXP, pueden comprender, por ejemplo, pCMV, pcDNA, p4X3, p4X4, p4X5, p4X6, pVL1392, pVL1393, pACYC177, PRS420, o si se van a utilizar sistemas de vectores víricos, por ejemplo, vectores derivados de pBABEpuro, pWPXL, pXP.
En un aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona al menos una célula huésped que comprende al menos un polinucleótidos de la invención según se describe anteriormente, por ejemplo, un polinucleótido o vector o vector de expresión que codifica al menos una de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y su uso en la fabricación del anticuerpo de la invención o molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se des­ cribe anteriormente. Por ejemplo, una célula huésped para su uso según la memoria descriptiva puede ser una célula de levadura, célula de insecto o célula de mamífero. Por ejemplo, la célula huésped de la me­ moria descriptiva puede ser una célula de insecto seleccionada a partir de células Sf9, Sf21, S2, Hi5 o BTI-TN-5B1-4, o por ejemplo, la célula huésped de la memoria descriptiva puede ser una célula de levadura seleccionada a partir de Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Kluyveromyceslactis, Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris o, por ejemplo, la célula huésped de la memoria descriptiva puede ser una célula de mamífero seleccionada entre HEK293, HEK293T, HEK293E, HEK 293F, NS0, per.C6, MCF-7, HeLa, Cos-1, Cos-7, PC-12, 3T3, Vero, vero-76, PC3, U87, SAOS-2, LNCAP, DU145, A431, A549, B35, H1299, HUVEC, Jurkat, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, Caco-2, CHO, CHO-K1, CHO-B11, CHO-DG44, BHK, AGE1.HN, Namalwa, WI-38, MRC-5, HepG2, L-929, RAB-9, SIRC, RK13, 11B11, 1D3, 2.4G2, A-10, B-35, C-6, F4/80, IEC-18, L2, MH1C1, NRK, NRK-49F, NRK-52E, RMC, CV-1, BT, MDBK, CPAE, MDCK.1, MDCK.2 y D-17.
Según una realización, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según se describe anteriormente, o el anticuerpo de la invención según se describe anteriormente puede utilizarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica anticuerpo de la invención acoplada con una citotoxina según se describe anteriormente puede formularse en una composición farmacéutica para su administración a un paciente que lo necesite que padezca cáncer. Una composición farmacéutica según la memoria descriptiva puede comprender, por ejemplo, la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención acoplada a una citotoxina según se describe anterior­ mente, o el conjugado fármaco-anticuerpo según se describe anteriormente (p. ej., el anticuerpo de la in­ vención acoplado con una citotoxina según se describe anteriormente) a una concentración de aproxima­ damente 10 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml a aproximadamente 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 112 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml o, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml a aproxima­ damente 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 112 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml o, por ejemplo, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml a aproximadamente 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 112 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml.
La composición farmacéutica de la presente memoria descriptiva puede comprender además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables para las dife­ rentes formas farmacéuticas son bien conocidos en la técnica e incluye vehículos, diluyentes, cargas, aglu­ tinantes, lubricantes, disgregantes, deslizantes, colorantes, pigmentos, enmascaradores del sabor, edulco­ rantes, saborizantes, plastificadores y cualquier sustancia auxiliar aceptable como potenciaciones de la ab­ sorción, potenciadores de la penetración, tensioactivos, cotensioactivos y aceites especializados. Los exci­ pientes adecuados pueden seleccionarse, por ejemplo, basándose en la forma farmacéutica, el modo de administración pretendido, la velocidad de liberación pretendida y la fiabilidad de fabricación. Entre los ejem­ plos de tipos de excipientes comunes se incluye diversos polímeros, ceras, fosfatos de calcio, azúcares y similares.
En un aspecto, la memoria descriptiva también proporciona un método de tratamiento que comprende ad­ ministrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica según se des­ cribe anteriormente. Por ejemplo, el método de tratamiento de la invención puede comprender administrar a una persona que lo necesite que padezca cáncer de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de la composición farmacéutica de la invención, o de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, o de apro­ ximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg,1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 12,5 mg/kg, 15 mg/kg, 17,5 mg/kg, 20 mg/kg, 22,5 mg/kg, 25 mg/kg a aproximadamente 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 32,5 mg/kg, 35 mg/kg, 37,5 mg/kg, 40 mg/kg, 42,5 mg/kg, 45 mg/kg. Según se utiliza el término «mg/kg» se refiere a mg de la composición farmacéutica de la invención/kg de peso corporal en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención a un individuo que padece cáncer. La cantidad farmacéuticamente efectiva depende del individuo, el tipo de cáncer que se va a tratar, el peso corporal y la edad del individuo, el nivel de la enfermedad o la vía de administración, por ejemplo, intravenosa (i.v.) o subcutánea. En un aspecto, la presente memoria descriptiva también propor­ ciona un método para el tratamiento de un paciente que padece cáncer con el anticuerpo de la invención como se describe anteriormente, o con la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención como se describe anteriormente. Por ejemplo, el método puede comprender la administración a un paciente que 10 necesita (p. ej., un paciente oncológico) una composición farmacéutica que comprenda el anticuerpo de la invención en una concentración y dosis según se describe anteriormente. Por ejemplo, en un aspecto, la composición farmacéutica de la invención puede utilizarse en pacientes que padecen un tumor que expresa niveles elevados de c-MET o, por ejemplo, cualquiera de las variantes de c-MET descritas en este docu­ mento. El término «niveles elevados» según se usa en el método de tratamiento de la invención se refiere a niveles de expresión de c-MET que son al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50 veces más altos que en un tejido control (p. ej., tejido obtenido de un individuo sano, o p. ej., una línea celular que no expresa c-MET deter­ minado mediante qPCR, inmunostransferencia o inmunohistoquímica). Por ejemplo, la expresión de c-MET en el tumor de un paciente puede evaluarse en el tejido tumoral que puede obtenerse mediante aspiración con aguja o biopsia quirúrgica mediante inmunohistoquímica, o puede utilizarse el ADN tumoral circulante (ADNtc) en la sangre del paciente para evaluar las amplificaciones de c-MET que se correlacionan con una expresión elevada de c-MET, como por ejemplo se describe en Mol Cancer Res. 2016 Jun;14(6):539-47. La obtención de la muestra de tejido tumoral, o de una muestra de sangre de los individuos que padecen cáncer no forma parte de la presente invención.
En un aspecto, los anticuerpos de la invención, sus fragmentos de unión a antígeno o los SEEDbodies según se describe anteriormente pueden utilizarse, por ejemplo, con fines diagnósticos para detectar la expresión de c-MET en una muestra. El término «muestra» según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a muestras de tejido obtenidas o derivadas de tejido tumoral o tejido control de un donante sano, por ejemplo, un sujeto humano que no padece cáncer. La muestra también puede derivar de primates no humanos, o puede ser de origen mamífero, como por ejemplo de origen murino o de rata. El término «mues­ tra» también puede referirse a células única o individualizadas obtenidas a partir de una muestra de tejido, por ejemplo, mediante una biopsia con aguja, donde la obtención de la muestra de un sujeto humano no forma parte de esta invención. La muestra puede estar compuesta de células viables no fijadas o puede comprender tejido o células fijadas, como tejido o células fijados en formol e incluidos en parafina. El término muestra según la invención puede por ejemplo también referirse a células de líneas celulares tumorales, como KP-4, U87MG, A549, NCI-H441, MKN-45 o EBC-1 y similares que puede obtenerse, por ejemplo de la ATCC. La detección de la expresión de c-MET en una muestra comprende poner en contacto la muestra con los anticuerpos de la invención, o sus fragmentos de unión a antígeno, o SEEDbodies como los descri­ tos anteriormente en condiciones que permitan la unión específica a c-MET y, posteriormente, detectar el anticuerpo de la invención, o su fragmento de unión; o el SEEDbody de la invención como se describe anteriormente, preferiblemente mediante la detección de la etiqueta detectable acoplada como se describe anteriormente.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente la invención.
Ejemplo 1: ELISA competitivo de HGF: desplazamiento por los anticuerpos de la invención
La competencia entre el HGF humano recombinante y los anticuerpos de la invención por la unión al ECD del c-MET humano recombinante se detectó mediante ELISA utilizando HGF en fase sólida. Para ello, se inmovilizaron 1,25 pmol de HGF en platas MaxiSorp® de 96 pocillos durante toda la noche a 4 °C. Tras bloquear las placas con BSA al 2 % en PBS-T, se añadieron a las placas 1,13 pmol de ECD de c-MET biotinilado previamente incubado con diluciones seriadas de anticuerpos (0,2-200 nM). La unión se reveló utilizando estreptavidina conjugada con HRP seguido de la adición de solución de sustrato de ELISA Ultra TMB en un paso y ácido sulfúrico. La absorbancia resultante de la unión del ECD de c-MET a HGF sin adición de anticuerpo anti-c-MET se definió como el 100 % de unión a HGF. Se utilizó SEED anti-HEL como anticuerpo control de isotipo no relacionado. Los datos se representaron como % de unión a HGF frente al logaritmo de la concentración de anticuerpo y se ajustaron a una curva dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable (4PL) utilizando GraphPad Prism 5®.
Ejemplo 2: Ensayo de fosforilación del receptor: inhibición de la señalización de c-MET
Para evaluar el efecto de la unión del anticuerpo de la invención y la molécula de inmunoglobulina heterodimérica de la invención sobre la fosforilación en la señalización mediada por c-MET, se determinaron los niveles de c-MET mediante ELISA de electroquimioluminiscencia (ECL) de captura de c-MET (ensayo MSD). Todos los reactivos se obtuvieron de Meso Scale Discovery y se prepararon según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se dispusieron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Sigma-Aldrich) un día antes del tratamiento, se dejaron sin suero y se trataron con diluciones seriadas de los anticuerpos (0-167 nM en medio de privación) durante 1 h a 37 °C, CO2 al 5 %. Tras la estimulación con 100 ng/ml de HGF (R&D Systems) durante 5 min a 37 °C, las células se lisaron con tampón de lisis enfriado en hielo suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas (Calbiochem). Se recubrieron placas de 96 pocillos de alta unión que incluyen electrodos (Meso Scale Discovery) con anticuerpo de captura anti-c-MET total (Cell Signaling Technologies) (Abcam) seguido del bloqueo con Bloqueo A al 3 % en PBS suplementado con Tween®20 al 0,05 %. Tras la incubación con lisados celulares, la detección se llevó a cabo con anti-fosfo-c-MET (Cell Signaling Technologies), anticuerpos anti-fosfo-tirosina (R&D Systems) y me­ diante la detección de sustancias recomendada por el proveedor. Las mediciones se realizaron con SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Para la cuantificación de los niveles de fosfo-AKT, se utilizó el kit Phospho(Ser473)/Total AKT Assay Whole Cell Lyate (Meso Scale Discovery). Las curvas de dosis respuesta se representaron como el logaritmo de la concentración de anticuerpo frente a la señal de ECL. Los valores de IC50 se calcularon mediante un modelo de ajuste 3PL usando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.), véanse por ejemplo los datos proporcionados en la figura 5.
Ejemplo 3: «Binning» (agrupación) de epítopos de anticuerpos anti-c-MET usando interferometría de bicapa (BLI)
Se llevó a cabo un experimento de «binning» de epítopos con los anticuerpos anti-c-MET que se utilizaron en los anticuerpos biespecíficos y se compararon con los anticuerpos de referencia de la literatura (MetMAb, emibetuzumab, h224G11). Se realizaron experimentos con biosensores utilizando interferometría de bicapa en una plataforma Octet Red (Forté Bio) equipado con puntas de biosensores (Forté Bio) anti-Fc humano (AHC). Todos los datos se recopilaron a 30 °C en tampón de cinética (PBS pH 7,4, BSA al 0,1 %, Tween-20 al 0,02 %). Se produjo ECD-His de c-MET humano (HGFR, dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) y se purificó en el laboratorio. Las puntas de los biosensores se equilibraron 30 segundos en PBS. A continuación, se inmovilizaron 25 nM para IgG bivalentes y 50 nM para anticuerpos monovalentes de un solo brazo en PBS en puntas de los biosensores durante 200 s como anticuerpo pri­ mario. Las puntas se inactivaron con 400 nM de un anticuerpo control no relacionado (anti-lisozima de huevo de gallina, anti-HEL SEED, diluido en PBS) para minimizar la unión posterior de los anticuerpos secundarios a las puntas de los biosensores. Tras la adquisición de un valor basal en tampón de cinética durante 60 s, el e Cd del c-MET humano se sometió a anticuerpos primarios inmovilizados durante 600 s. A continuación, las interacciones entre los anticuerpos anti-c-MET secundarios y ECD de c-MET unido a los anticuerpos primarios inmovilizados se analizaron durante 600 s. El análisis de la unión del anticuerpo secundario se realizó visualmente diferenciando la unión simultánea caracterizada por una alta velocidad de unión [nM] en comparación con un control de isotipo no relacionado (anti-HEL SEED).
Ejemplo 4: Ensayos de citotoxicidad
Para evaluar la citotoxicidad de los conjugados fármaco-anticuerpo de la invención que eran conjugados no covalentes de la citotoxina con la porción Fc del anticuerpo de la invención a través de conjugados Fab anti-Fc humano-toxina (MORADEC, número de catálogo AH205-AM).
La viabilidad celular se cuantificó utilizando el ensayo CellTiter-Glo® (Promega) que se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se despegaron las células y se sembraron en los pocillos interiores de placas de cultivo celular de 96 pocillos tratadas blancas opacas. El número de células sem­ bradas oscilaba de 8000 a 15000 células viables por pocillo dependiendo de la línea celular en 80 |jl de medio específico de la línea celular. Se dejó que las células se adhirieran durante al menos 3 h en una cámara humidificada a 37 °C, CO2 al 5 % antes del tratamiento con ADC (oscilando de 50 a 0,01 nM final) por duplicado en medio específico de la línea celular. Después de 72 h, se detectó la viabilidad celular añadiendo 100 j l de reactivo CellTiter-Glo® por pocillo con el posterior mezclado en un agitador de placas durante 2 min a 350 rpm y 10 min de incubación en oscuridad a temperatura ambiente. La luminiscencia se midió en un lector de placas Synergy 4 (capítulo 3.9 y 3.10) con un tiempo de lectura de 0,5 segundos por pocillo (sensibilidad: 170). Se restó la luminiscencia de fondo de pocillos que tenían solo el medio más el reactivo CellTiter-Glo®. Los datos se representaron como porcentaje de viabilidad de las células no tratadas frente al logaritmo de la concentración de anticuerpo y se ajustó con un modelo 3PL utilizando GraphPad Prism 5 (capítulo 3.10). Se utilizaron los datos de al menos tres experimentos independientes con duplica­ dos para calcular la IC50 media.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo anti-c-MET o su fragmento de unión a antígeno, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une al c-MET humano con una afinidad de al menos 10-8 M, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de tipo IgG y en el que el anticuerpo comprende secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras según la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID No : 2, o SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
2. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión se une a la variante N375S de c-MET humano.
3. Anticuerpo o fragmento de unión de antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo comprendido en el dominio SEMA del c-MET humano e inhibe la señalización de c-MET.
4. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo que comprende los dominios IPT 1 a 4 del c-MET humano e inhibe la señalización de c-MET.
5. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno inhibe al 50 % la unión de1HGF humano recom­ binante al ECD de c-MET humano a una concentración de 0,9 * 10'9 M o menos en un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima utilizando HGF en fase sólida.
6. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno es un Fab.
7. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno es un F(ab')2.
8. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno es un scFv.
9. Anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno está acoplado adicionalmente a un agente diagnóstico o terapéutico.
10. Molécula de inmunoglobulina heterodimérica que comprende
(i) un primer y segundo fragmento Fab o scFv que se unen específicamente a c-MET humano y (ii) una región bisagra de anticuerpo, un dominio CH2 de anticuerpo y un dominio CH3 de anti­ cuerpo que comprenden un dominio híbrido de interfase de interacción proteína-proteína en el que dicho dominio de interfase de interacción se forma mediante segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de un primer miembro y segmentos de aminoácidos del dominio CH3 de dicho segundo miembro, en el que dicho dominio de interfase proteína-proteína de la primera cadena interacciona con la interfase proteína-proteína de la segunda cadena mediante la homodimerización de los correspondientes segmentos de aminoácidos del mismo miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas dentro de dichos dominios de interacción,
en el que la primera cadena de inmunoglobulina genéticamente modificada tiene la secuencia polipeptídica («Ag -SEED»):
GQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTT
TFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISL y la segunda cadena de inmunoglobu­ lina genéticamente modificada tiene la secuencia polipeptídica («GA-SEED»):
GQPREPQVYTLPPPSEELALNELVTLTCLVKGFYPSDIAVEWLQGSQELPREKYLTWAPVLDSDG
SFFLYSILRVAAEDWKKGDTFSCSVMHEALHNHYTQKSLDR y en el que el primer y/o el segundo fragmentos Fab o scFv comprenden al menos dos de las secuencias de aminoácidos según la SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 8.
11. Molécula de inmunoglobulina heterodimérica según la reivindicación 10, en la que la molécula de in­ munoglobulina heterodimérica está acoplada adicionalmente a un agente diagnóstico o terapéutico.
12. Anticuerpo según la reivindicación 9, o la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según la reivin­ dicación 11, en el que el agente terapéutico es una citotoxina.
13. Molécula de inmunoglobulina heterodimérica según la reivindicación 12, en el que la molécula de inmunoglobulina heterodimérica no está fucosilada.
14. Anticuerpo según la reivindicación 12 o la molécula de inmunoglobulina heterodimérica según la reivindicación 12 o la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento del cáncer.
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