CN117440973A

CN117440973A - 与ror1结合的抗原结合蛋白

Info

Publication number: CN117440973A
Application number: CN202280040946.3A
Authority: CN
Inventors: 周贺钺; 曹霞; L·陆
Original assignee: Sorento Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Sorento Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2024-01-23
Also published as: TW202305001A; CA3214653A1; JP2024513239A; EP4320165A1; WO2022217054A1

Abstract

本公开提供了与ROR1特异性结合的ROR1结合蛋白(特别提供了抗ROR1抗体或其抗原结合部分)以及其用途。所述抗ROR1抗体的各个方面涉及抗体片段、单链抗体、药物组合物、核酸、重组表达载体、宿主细胞以及用于制备和使用此类抗ROR1抗体的方法。使用所述抗ROR1抗体的方法包括用于与ROR1结合、检测ROR1并治疗与ROR1表达相关的疾病的体外和体内方法。

Description

与ROR1结合的抗原结合蛋白

本申请根据35U.S.C.§119要求于2021年4月9日提交的美国临时申请第63/173,150号的优先权权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用整体并入。

序列表

本申请与序列表一起以电子格式提交。序列表以创建于2022年4月1日的标题为“2022-04-01_01223-0097-00PCT_Seq_List_ST25.txt”的文件的形式提供，所述文件大小为6,160字节。序列表的电子格式的信息通过引用整体并入本文。

在整个本申请中，引用了各种公开、专利和/或专利申请。所述公开、专利和/或专利申请的公开内容特此以全文引用的方式并入本申请中，以便更充分地描述本公开所涉及的领域的现状。

技术领域

本公开提供了与ROR1特异性结合的抗原结合蛋白和编码所述抗原结合蛋白的核酸、包括所述核酸的载体、携带所述载体的宿主细胞和其使用方法。

背景技术

受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)属于高度保守的受体酪氨酸激酶家族，其由两个家族成员ROR1和ROR2组成，所述家族成员是I型跨膜受体酪氨酸激酶。ROR家族的成员是I型跨膜蛋白，其含有三个不同的细胞外结构域，一个Ig、一个Kringle和一个Frizzled结构域，然后是跨膜跨越区和细胞内部分。在细胞内部分，ROR1具有一个酪氨酸激酶结构域、两个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域和一个富含脯氨酸的结构域。

受体酪氨酸激酶(RTK)在致癌转化、生长和转移中起着关键作用。RTK调控细胞分化、增殖、迁移、血管生成和存活率。

此家族的细胞功能是调控细胞迁移、平面细胞极性(PCP)和顶端基底细胞极性以及发育过程中轴突的生长，包括骨骼和神经元发育。Wnt5a，作为一种对致癌作用至关重要的糖蛋白，已被鉴定为通过与ROR1和ROR2结合和激活来调控这些功能(Nishita等人,2010,《细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.)》,20(6),346-54)。Wnt5a与ROR2和其共受体Frizzled结构域结合，可以激活INK通路和细丝蛋白A以调控细胞迁移和侵袭，引起Racl和Rho A调控细胞极性，并诱导Src家族成员调节基质金属蛋白酶，如MMP 1、2、13的表达，并抑制典型的Wnt通路。

ROR1在与Wnt5a共表达时通过NF-kB促进细胞增殖(Fukuda等人,2008,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》105(8):3047-52)。功能数据表明，ROR1可能在非典型WNT信号传导中发挥作用，以促进恶性细胞的存活。

受体酪氨酸激酶孤儿受体-1和-2(ROR1和ROR2)已被描述为与特定癌症特异性相关(Rebagay等人,2012,《肿瘤学前沿(Front Oncol.)》,2(34))，而在健康组织上的表达基本上不存在，只有少数例外(Balakrishnan等人,2017,《临床癌症研究(Clin.CancerRes.)》,23(12),3061-3071)。由于ROR家族成员的肿瘤选择性表达，其代表了靶向癌症疗法的相关靶标。

ROR1在B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)中异常表达。受体酪氨酸激酶孤儿受体-1(ROR1)与慢性淋巴细胞白血病(CLL)表现出近100％的相关性(Cui等人.,2016,《血液(Blood)》,128(25),2931)，并且其也在某些实体瘤中表达，如肺和乳腺肿瘤(Balakrishnan等人,2017,《临床癌症研究》,23(12),3061-3071)。另外，ROR1已被确立为一些急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤和其它一些血液恶性肿瘤的标志物。ROR1重度参与许多实体瘤的进展，如神经母细胞瘤、肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、黑色素瘤和其它癌症。ROR1已被证明抑制细胞凋亡，增强EGFR信号传导，诱导上皮-间充质转化(EMT)，并有助于小窝的形成。

重要的是，ROR1主要在胚胎组织中可检测到，并且通常在成人组织中不存在，这使得所述蛋白质成为癌症疗法的理想药物靶标。如此，ROR1先前已被认为是开发ROR1特异性抗体的靶标。然而，由于ROR1在不同哺乳动物物种之间的高度同源性，在人与食蟹猴之间的氨基酸水平上是100％保守的，在人与小鼠之间是96.7％同源的，在人与兔之间是96.3％同源的，因此很难通过标准技术，如动物免疫产生针对此靶标的高亲和力抗体。

由于可用的ROR1特异性单克隆抗体的数量较低，本领域需要更好的抗ROR1抗体，其具有更高的亲和力或已知抗体克隆所不具备的其它功能特性。

因此，ROR1是用抗体靶向的有吸引力的抗原。本公开提供了与ROR1特异性结合的ROR1结合蛋白，具体地抗ROR1抗体或其抗原结合部分以及其用途。

发明内容

一方面，本文提供了一种抗ROR1抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段，所述抗ROR1抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包括重链互补决定区1(CDR1)、重链CDR2和重链CDR3，并且所述轻链可变区包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；并且(a)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQID NO:14的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(b)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ IDNO:27的氨基酸序列；(c)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ IDNO:44的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列；(e)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ IDNO:57的氨基酸序列；在实施方式中，所述重链可变区与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

一方面，本文提供了一种抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

一方面，本文提供了一种抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:10和11(例如，本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(例如，本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(例如，本文中称为RO6D8-O11)、SEQ ID NO:40和41(例如，本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(例如，本文中称为RO6A-a8gm)的氨基酸序列。

在实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab片段。在实施方式中，所述抗原结合片段包括单链抗体，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域用肽接头连接在一起。在实施方式中，所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种包括IgG抗体，所述IgG抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类抗体。在实施方式中，所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种包括所述IgG1或IgG4类抗体。在实施方式中，所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种包括IgG1类抗体。在实施方式中，所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种以10^-7M或更小的K_D与人ROR1蛋白结合。

一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。

一方面，本文提供了一种试剂盒，其包括所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种以及药学上可接受的赋形剂。

一方面，本文提供了一种核酸，其编码所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述重链可变区。

一方面，本文提供了一种核酸，其编码所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述轻链可变区。

一方面，本文提供了一种核酸，其编码(i)所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述重链可变区，以及(ii)所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述轻链可变区。

一方面，本文提供了一种载体，其包括所公开的核酸中的任一种。

一方面，本文提供了一种宿主细胞，其携带所公开的载体中的任一种。在实施方式中，所公开的载体包括表达载体，并且所述宿主细胞表达所述重链可变区。在实施方式中，所公开的载体包括表达载体，并且所述宿主细胞表达所述轻链可变区。

一方面，本文提供了一种宿主细胞，其携带第一载体和第二载体。在实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体，所述第二载体包括第二表达载体，并且所述宿主细胞表达所述重链可变区和所述轻链可变区。

一方面，本文提供了一种用于制备抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区的条件下培养所述宿主细胞的群体。在实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区。

一方面，本文提供了一种用于制备抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区的条件下培养所述宿主细胞的群体。在实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区。

一方面，本文提供了一种用于制备以下的方法：(i)抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区；以及(ii)抗原结合蛋白、抗体或抗体结合片段的轻链可变区，所述方法包括：在适于表达以下的条件下培养所述宿主细胞的群体：(i)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区；以及(ii)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区。在实施方式中，所述方法进一步包括从所述宿主细胞回收以下：(i)所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区；以及(ii)所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区。

一方面，本文提供了一种用于抑制表达ROR1的细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：在适于抑制所述表达ROR1的细胞的生长或增殖的条件下，在存在所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述人抗ROR1抗体的情况下，使效应细胞群体与表达ROR1的靶细胞群体接触。在实施方式中，所述效应细胞群体包括PBMC或NK细胞。在实施方式中，所述靶细胞群体包括表达ROR1的人癌细胞或表达ROR1的转基因细胞。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为5-10:1、10-20:1或20-30:1。

一方面，本文提供了一种用于杀伤表达ROR1的细胞的方法，所述方法包括：在适于抑制所述表达ROR1的细胞的生长或增殖的条件下，在存在所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的所述人抗ROR1抗体的情况下，使效应细胞群体与表达ROR1的靶细胞群体接触。在实施方式中，所述效应细胞群体包括PBMC或NK细胞。在实施方式中，所述靶细胞群体包括表达ROR1的人癌细胞或表达ROR1的转基因细胞。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。在实施方式中，所述效应细胞与所述靶细胞的比率为5-10:1、10-20:1或20-30:1。

一方面，本文提供了一种用于治疗患有与ROR1表达相关的疾病的对象的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的包括所公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中的任一种的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的治疗组合物。在实施方式中，与ROR1表达相关的疾病是癌症。在实施方式中，所述癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、乳腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、结肠癌、肾细胞癌或淋巴瘤。在实施方式中，所述癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系淋巴瘤(AML)、骨髓瘤、T细胞白血病(TCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、多发性骨髓瘤(MM)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、经历了里希特氏转化(Richter'stransformation)的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、胰腺癌、骨肉瘤、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)、淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘细胞B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、结直肠癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌或甲状腺癌。在实施方式中，癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。

附图说明

图1A示出了RO6D8wt抗体的结合动力学的SPR传感图。

图1B示出了RO6D8-s10抗体的结合动力学的SPR传感图。

图1C示出了RO6D8-jlv1011抗体的结合动力学的SPR传感图。

图1D示出了RO6D8-o11抗体的结合动力学的SPR传感图。

图1E示出了总结抗体RO6D8wt、RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011和RO6D8-o11与ROR1抗原的结合动力学的表，其从图1A-1D的SPR数据获得。

图2A是示出多种抗ROR1抗体与人和小鼠ROR1蛋白的交叉反应性的ELISA测定结果的条形图。

图2B示出RO6D8-s10和RO6D8-jlv1011的小鼠交叉反应性作为抗体浓度的函数的图。

图3A示出了抗ROR1抗体RO6D8wt与表达ROR1的细胞A549和ROR1阴性细胞Jurkat结合的细胞结合测定的图。

图3B示出了抗ROR1抗体RO6D8-s10与表达ROR1的细胞A549和ROR1阴性细胞Jurkat结合的细胞结合测定的图。

图3C示出了抗ROR1抗体RO6D8-jlv1011与表达ROR1的细胞A549和ROR1阴性细胞Jurkat结合的细胞结合测定的图。

图4A-E示出了抗ROR1抗体RO6D8-s10、RO6D8-Jlv1011、RO6A-a7gm和RO6A-a8gm与表达ROR1的细胞A549(图4A)、RAJI(图4B)和MCF7(图4C)以及ROR1阴性细胞A549 ROR1-KO(图4D)和LS174T(图4E)结合的细胞结合测定的图。

具体实施方式

定义：

除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，适合于本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学、转基因细胞产生、蛋白质化学和核酸化学以及杂交的术语是本领域众所周知和常用的。除非另外说明，否则通常根据本领域众所周知的常规程序以及如本文中引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的执行本文所提供的方法和技术。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)(1989)以及Ausubel等人,《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(1992)。许多基础文本都描述了标准抗体产生过程，包括Borrebaeck(编辑)《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第2版纽约弗里曼公司(Freeman and Company,NY),1995；McCafferty等人,《抗体工程化实用方法(Antibody Engineering,A Practical Approach)》英国牛津牛津出版社(Oxford Press,Oxford,England)IRL,1996；以及Paul(1995)《抗体工程化方案(Antibody EngineeringProtocols)》新泽西托托瓦哈门那出版社(Humana Press,Towata,N.J.),1995；Paul(编辑),《基础免疫学(Fundamental Immunology)》,纽约瑞文出版社(Raven Press,N.Y),1993；Coligan(1991)《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》纽约威利/格林(Wiley/Greene,NY)；Harlow和Lane(1989)《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press,NY)；Stites等人,(编辑)《基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》(第4版)加利福尼亚州洛思阿图斯的朗格医学公开(Lange Medical Publications,Los Altos,Calif.)以及其中引用的参考文献；《编码单克隆抗体：原理与实践(Coding MonoclonalAntibodies:Principles and Practice)》(第2版)纽约州纽约市的学术出版社(AcademicPress,New York,N.Y.),1986，以及Kohler和Milstein《自然(Nature)》256:495-497,1975。本文中所引用的所有参考文献通过引用整体并入本文中。酶促反应和丰富/纯化技术也是众所周知的并且如本领域通常实现的或如本文所描述的根据制造商的说明书执行。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学结合使用的术语和实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及患者的治疗。

本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述方面可以通过整体参考本说明书来理解。

除非本文中上下文另外要求，否则单数术语应包括复数含义，并且复数术语应包括单数含义。除非明确地并且肯定地限于一个指示物，否则单数形式“一个/一种(a或an)”和“所述(the)”和任何词的单数用途包括多个指示物。

应理解，替代方案(例如“或”)在本文中的使用用于意指替代方案中的任一个或两个或其任何组合。

在本文中使用的术语“和/或”将被视为意指在有或没有另一者的情况下明确公开了指定特征或组分中的每个特征或组分。例如，本文中在如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)以及“B”(单独)。同样，在如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

如本文所使用的，如本文所用的术语“包括/包括(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”和“含有(containing)”以及其语法变体旨在是非限制的，使得列表中的一个项或多个项不排除可以被替代或添加到所列项的其它项。应理解的是，当在本文中无论何处用语言“包括”来描述方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似方面。

如本文所使用的，术语“约(about)”是指如由本领域普通技术人员所确定的在具体值或组合物的可接受的误差范围内的值或组合物，这将部分地取决于如何测量或确定值或组合物，即，测量系统的限制。例如，“约(about)”或“本质上包括(comprisingessentially of)”可以意指按照本领域的实践在一个或超过一个标准差内。可替代地，根据测量系统的限制，“约(about)”或“本质上包括(comprising essentially of)”可以意指至多10％(即，±10％)或更多的范围。例如，约5mg可以包括在4.5mg与5.5mg之间的任何数字。此外，具体地关于生物系统或过程，所述术语可以意指至多一个数量级或至多值的5倍。当在本公开中提供了特定值或组合物时，除非另外陈述，否则“约(about)”或“本质上包括(comprising essentially of)”的含义应被假定在该特定值或组合物的可接受误差范围之内。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”和本文所使用的其它相关术语可互换使用，且是指氨基酸的聚合物并且不限于任何特定长度。多肽可以包括天然和非天然氨基酸。多肽包括重组形式或化学合成形式。多肽还包括前体分子和成熟分子。前体分子包括尚未经受切割的前体分子，例如通过分泌信号肽进行的切割或通过某些氨基酸残基处的非酶促切割。多肽包括已经经受切割的成熟分子。这些术语涵盖天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(如突变蛋白、变体、嵌合蛋白和融合蛋白)以及翻译后或以其它方式共价或非共价修饰的蛋白质。本文描述了使用重组程序制备的包括与ROR1结合的结合蛋白(例如，抗ROR1抗体或其抗原结合部分)的氨基酸序列的多肽。

术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及本文中使用的其它相关术语可互换使用并且指代核苷酸的聚合物，并且不限于任何特定长度。核酸包括重组形式和化学合成形式。核酸包括DNA分子(cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA的类似物以及其杂交物。核酸分子可以是单链或双链的。在实施方式中，本公开的核酸分子包括编码抗体或其片段或scFv、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。在实施方式中，核酸包括一种类型的多核苷酸或两种或更多种不同类型的多核苷酸的混合物。本文描述了编码抗ROR1抗体或其抗原结合部分的核酸。

术语“回收(recover/recovery/recovering)”和其它相关术语是指从宿主细胞培养基或从宿主细胞裂解物或从宿主细胞膜中获得蛋白质(例如，抗体或其抗原结合部分)。在实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为融合到分泌信号肽序列的重组蛋白，所述分泌信号肽序列介导经表达蛋白质的分泌。分泌蛋白可以从宿主细胞培养基回收。在实施方式中，蛋白质由宿主细胞表达为缺乏分泌信号肽序列的重组蛋白，其可从宿主细胞切割物回收。在实施方式中，蛋白质由宿主细胞表达为膜结合蛋白，其可以使用清洁剂从宿主细胞膜释放表达的蛋白质来进行回收。在实施方式中，无关于用于回收蛋白质的方法，蛋白质可经历从回收的蛋白质中去除细胞碎片的程序。例如，回收的蛋白质可以经历色谱法、凝胶电泳和/或透析。在实施方式中，色谱法包括任何一个程序或两个或更多个程序的任何组合，包括亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和/或二氧化硅色谱法。在实施方式中，亲和色谱法包括蛋白A或G(来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁组分)。

术语“分离的”是指基本上不含其它细胞材料的蛋白质(例如，抗体或其抗原结合部分)或多核苷酸。蛋白质可以通过使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术进行分离，使其大体上不含天然相关组分(或与细胞表达系统或用于产生抗体的化学合成方法相关的组分)。在一些实施方式中，术语分离的还指代基本上不含相同物种的其它分子的蛋白质或多核苷酸，例如分别具有不同氨基酸或核苷酸序列的其它蛋白质或多核苷酸。期望分子的纯度或同质性可以使用本领域众所周知的技术测定，包括如凝胶电泳等低分辨率方法和如HPLC或质谱分析等高分辨率方法。在实施方式中，抗ROR1抗体或其抗原结合部分中的任何一种都是分离的。

本文中使用的“抗原结合蛋白”以及相关术语是指包括与抗原结合的部分的蛋白质以及任选地使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或框架部分。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包括例如具有移植CDR或CDR衍生物的替代性蛋白质支架或人工支架。此类支架包括但不限于包括例如引入突变以稳定抗原结合蛋白的三维结构的抗体源性支架以及包括例如生物相容性聚合物的完全合成支架。参见例如Korndorfer等人,2003,《蛋白质：结构、功能和生物信息学(Proteins:Structure,Function,andBioinformatics)》,第53卷,第1期:121-129；Roque等人,2004,《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20:639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于利用纤维蛋白连接素组分作为支架的抗体模拟物的支架。本文描述了与ROR1结合的抗原结合蛋白。

抗原结合蛋白可以具有例如免疫球蛋白的结构。在实施方式中，“免疫球蛋白”是指由两对相同的多肽链构成的四聚体分子，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为κ或λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个更多氨基酸的“D”区。通常参见《基础免疫学(FundamentalImmunology)》,第7章(Paul,W.编辑,第2版,纽约雷文出版社(Raven Press,N.Y.)(1989))(所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个抗原结合位点。在实施方式中，抗原结合蛋白可以是具有不同于四聚体免疫球蛋白分子但仍与靶抗原结合或与两个或更多个靶抗原结合的结构的合成分子。例如，合成抗原结合蛋白可以包括抗体片段、1-6个或更多个多肽链、多肽的非对称组合件或其它合成分子。本文描述了与ROR1特异性结合的具有免疫球蛋白样性质的抗原结合蛋白。

免疫球蛋白链的可变区展示出由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)(也称为互补性决定区或CDR)的相同一般结构。从N端到C端，轻链和重链都包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

可以将一个或多个CDR共价或非共价地并入分子中以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以将CDR作为较大多肽链的一部分并入，可以将CDR与另一多肽链共价连接或可以非共价地并入CDR。CDR允许抗原结合蛋白与相关特定抗原特异性结合。

将氨基酸分配给每个结构域将根据以下定义进行：Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,美国卫生和人类服务部(USDept.of Health and Human Services),公共卫生署(PHS),美国国立卫生研究院(NIH),NIH公开第91-3242,1991。免疫球蛋白链中氨基酸的其它编号系统包括IMGT.R^TM.(国际免疫遗传学信息系统(international ImMunoGeneTics informationsystem)；Lefranc等人,《发展竞争免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》29:185-203；2005)以及AHo(Honegger和Pluckthun,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》309(3):657-670；2001)；Chothia(Al-Lazikani等人,1997《分子生物学杂志》273:927-948)；以及Contact(Maccallum等人,1996《分子生物学杂志》262:732-745)。

本文中使用的“抗体(antibody/antibodies)”以及相关术语是指与抗原特异性结合的完整免疫球蛋白或其抗原结合部分(或其抗原结合片段)。抗原结合部分(或其抗原结合片段)可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分(或抗原结合片段)尤其包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及含有足以赋予与多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。

抗体包括重组产生的抗体和抗原结合部分。抗体包括非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。抗体包括单特异性、多特异性(例如，双特异性、三特异性和高阶特异性)。抗体包括四聚体抗体、轻链单体、重链单体、轻链二聚体、重链二聚体。抗体包括F(ab')₂片段、Fab'片段和Fab片段。抗体包括单结构域抗体、单价抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、驼峰化(camelized)抗体、亲和体、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型抗体(抗Id)、微型抗体。抗体包括单克隆群体和多克隆群体。本文描述了抗ROR1抗体。

“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”以及本文中使用的其它相关术语是指包括与抗原相互作用并且有利于抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于与其抗原特异性结合的抗体，所述术语将包括其CDR结构域中的至少一个结构域的至少部分。本文描述了来自抗ROR1抗体的抗原结合结构域。

如本文中在抗体或抗原结合蛋白或抗体片段的上下文中使用的术语“特异性结合(specific binding、specifically binds或specifically binding)”以及其它相关术语是指相对于其它分子或部分与抗原非共价或共价优选地结合(例如，抗体相对于其它可用抗原与具体抗原特异性结合)。在实施方式中，如果抗体以10^-5M或更小、或10^-6M或更小、或10^-7M或更小、或10^-8M或更小、或10^-9M或更小或10^-10M或更小的解离常数K_D与抗原结合，则所述抗体与靶抗原特异性结合。本文描述了与ROR1特异性结合的抗ROR1抗体。

在实施方式中，解离常数(K_D)可以使用BIACORE表面等离子体共振(SPR)测定来测量。表面等离子体共振是指允许通过例如使用BIACORE系统(GE医疗集团Biacore生命科学部，新泽西州皮斯卡(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ))检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象。

如本文中所使用的“表位”以及相关术语是指通过抗原结合蛋白(例如，通过抗体或其抗原结合部分)结合的抗原的一部分。表位可以包括通过抗原结合蛋白结合的两个或更多个抗原的一部分。表位可以包括一个抗原或两个或更多个抗原的非连续部分(例如，在抗原的初级序列中不连续但在抗原的三级和四级结构的上下文中彼此足够接近以通过抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。通常，抗体的可变区，具体地是CDR与表位相互作用。本文描述了与ROR1多肽的表位结合的抗ROR1抗体和其抗原结合蛋白。

关于抗体，术语“拮抗剂”和“拮抗性”是指结合其同源靶抗原并抑制或降低所结合的抗原的生物活性的阻断抗体。术语“激动剂”或“激动性”是指以模拟引起抗体介导的下游信号传导的生理配体结合的方式结合其同源靶抗原的抗体。

本文中使用的“抗体片段”、“抗体部分”、“抗体的抗原结合片段”或“抗体的抗原结合部分”以及其它相关术语是指除了完整抗体之外包括结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的部分的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；Fd；和Fv片段，以及dAb；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；包括足以赋予与多肽特异性抗原结合的抗体的至少一部分的多肽。抗体的抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及包括足以赋予抗体片段抗原结合特性的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。本文描述了抗ROR1抗体的抗原结合片段。

术语“Fab”、“Fab片段”以及其它相关术语是指包括可变轻链区(V_L)、恒定轻链区(C_L)、可变重链区(V_H)和第一恒定区(C_H1)的单价片段。Fab能够结合抗原。F(ab')₂片段是包括在铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。F(Ab')₂具有抗原结合能力。Fd片段包括V_H区和C_H1区。Fv片段包括V_L区和V_H区。Fv可以与抗原结合。dAb片段具有V_H结构域、V_L结构域或V_H或VL结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634和6,696,245；美国公开申请第2002/02512号、第2004/0202995号、第2004/0038291号、第2004/0009507号、第2003/0039958号；以及Ward等人,《自然》341:544-546,1989)。本文描述了包括来自抗ROR1抗体的抗原结合部分的Fab片段。

单链抗体(scFv)是VL和VH区通过接头(例如，氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白质链的抗体。优选地，接头足够长以允许蛋白质链自身折叠并且形成单价抗原结合位点(参见例如Bird等人,1988,《科学(Science)》242:423-26以及Huston等人,1988,《美国国家科学院院刊》85:5879-83)。本文描述了包括来自抗ROR1抗体的抗原结合部分的单链抗体。

双功能抗体是包括两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括由太短以致于不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头连接的V_H和V_L结构域，因此使得每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见例如Holliger等人,1993《美国国家科学院院刊》90:6444-48以及Poljak等人,1994,《结构(Structure)》2:1121-23)。如果双功能抗体的两条多肽链相同，那么由其配对产生的双功能抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有两个不同抗原结合位点的双功能抗体。类似地，三功能抗体和四功能抗体是分别包括三个和四个多肽链并且分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗体可以相同或不同。双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体构建体可以使用来自本文中描述的任何抗ROR1抗体的抗原结合部分制备。

术语“人抗体”是指具有源自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在实施方式中，所有可变结构域和恒定结构域都衍生自人免疫球蛋白序列(例如，全人抗体)。这些抗体可以通过各种方式制备，所述方式的实例如下描述，包括通过重组方法或通过用小鼠的所关注抗原进行免疫，所述所关注抗原经基因修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体。本文描述了全人抗ROR1抗体和抗原结合蛋白。

“人源化抗体”是指具有通过一种或多种氨基酸取代、缺失和/或添加而与源自非人物种的抗体的序列不同的序列的抗体，使得与非人物种抗体相比，在将人源化抗体施用于人对象时，所述人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导较不严重的免疫应答。在实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸发生突变以产生人源化抗体。在另一实施方式中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域与非人物种的一个或多个可变结构域融合。在另一个实施方式中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低在将非人抗体施用于人对象时所述非人抗体的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键性的，或者对氨基酸序列作出的改变是保守性改变，使得人源化抗体与抗原的结合并不比非人抗体与抗原的结合明显更差。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号中找到。

本文中使用的术语“嵌合抗体”以及相关术语是指含有来自第一抗体的一个或多个区和来自一个或多个其它抗体的一个或多个区的抗体。在实施方式中，一个或多个CDR衍生自人抗体。在另一个实施方式中，所有CDR衍生自人抗体。在另一实施方式中，来自多于一个人抗体的CDR在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可以包括来自第一人抗体的轻链的CDR1、来自第二人抗体的轻链的CDR2和CDR3以及来自第三抗体的重链的CDR。在另一个实例中，CDR来源于如人和小鼠、或人和兔、或人和山羊等不同物种。本领域的技术人员应理解，其它组合是可能的。

进一步地，框架区可以源自相同抗体之一、源自如人抗体等一个或多个不同抗体或源自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体相同、同源或源自所述抗体，而所述链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体相同、同源或源自所述抗体。还包括表现出期望的生物活性(即，与靶抗原特异性地结合的能力)的此类抗体的片段。嵌合抗体可以由本文所描述的抗ROR1抗体中的任一个的部分制备。

如本文所使用的，术语“变体”多肽和多肽的“变体”是指包括具有相对于参考多肽序列插入、缺失和/或取代到氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。多肽变体包括融合蛋白。以相同方式，变体多核苷酸包括具有相对于另一多核苷酸序列插入、缺失和/或取代到核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的核苷酸序列。多核苷酸变体包括融合多核苷酸。

如本文所使用的，术语多肽的“衍生物”是已经例如通过与如聚乙二醇、白蛋白(例如，人血清白蛋白)等另一个化学部分缀合、磷酸化和糖基化而化学修饰的多肽(例如，抗体)。除非另有指示，否则术语“抗体”包括除了包括两条全长重链和两条全长轻链的抗体以外的其衍生物、变体、片段以及突变蛋白，所述抗体的实例如下描述。

术语“铰链”是指通常在蛋白质的两个结构域之间发现并且可以允许结构域中的一个或两个结构域相对于彼此整体构建体和移动的灵活性的氨基酸区段。在结构上，铰链区包括约10个至约100个氨基酸，例如约15个至约75个氨基酸、约20个至约50个氨基酸或约30个至约60个氨基酸。在实施方式中，铰链区的长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。铰链区可以源自天然存在的蛋白质的铰链区(如CD8铰链区或其片段、CD8α铰链区或其片段)、抗体(例如，IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链区或连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链区。铰链区可以源自抗体并且可以或可以不包括抗体的一个或多个恒定区，或者铰链区包括抗体的铰链区和抗体的CH3恒定区，或者铰链区包括抗体的铰链区和抗体的CH2和CH3恒定区，或者铰链区是非天然存在的肽，或者铰链区安置在scFv的C末端与跨膜结构域的N末端之间。在实施方式中，铰链区包括以下任何一个区或两个或更多个区的任何组合，包括：来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白分子的上部铰链序列、核心铰链序列或下部铰链序列。在实施方式中，铰链区包括IgG1上部铰链序列EPKSCDKTHT。在实施方式中，铰链区包括IgG1核心铰链序列CPXCP，其中X为P、R或S。在实施方式中，铰链区包括下部铰链/CH2序列APELLGGP。在实施方式中，铰链与具有氨基酸序列SVFLFPPKPKDT的Fc区(CH2)连接。在实施方式中，铰链区包括上部铰链、核心铰链或下部铰链的氨基酸序列并且包括EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP。在实施方式中，铰链区包括可以形成至少一个、两个、三个或更多个链间二硫键的一个、两个、三个或更多个半胱氨酸。

如本文所使用的，术语“Fc”或“Fc区”是指在铰链区中开始或在铰链区之后开始并且在重链的C端结束的抗体重链恒定区的部分。Fc区包括CH2和CH3区的至少一部分，并且可以或可以不包括铰链区的一部分。两个各自携带半Fc区的多肽链可以二聚合以形成完整Fc结构域。Fc结构域可以结合Fc细胞表面受体以及免疫补体系统的一些蛋白质。Fc区可以结合补体组分C1q。Fc结构域展示出效应子功能，包括包含补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用(ADP)、调理作用和/或细胞结合中的任何一种活性或两种或更多种活性的任何组合。Fc结构域可以结合Fc受体，包括FcγRI(例如，CD64)、FcγRII(例如，CD32)和/或FcγRIII(例如，CD16a)。在实施方式中，Fc区可以包括增加或减少这些功能中的任何一种或任何组合的突变。

如本文所使用的术语“标记抗体”或相关术语是指未标记的或与用于检测的可检测标记或部分连接的抗体及其抗原结合部分，其中可检测标记或部分是放射性的、比色的、抗原性的、酶促的、可检测珠粒(如磁性或电子致密(例如，金)珠粒)、生物素、链霉亲和素或蛋白A。可以采用多种标记，包括但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。本文中所描述的任何抗ROR1抗体可以是未标记的或者可以与可检测标记或部分连接。

本文中使用的“同一性百分比”或“同源性百分比”以及相关术语是指两个多肽之间或两个多核苷酸序列之间相似性的定量测量。两个多肽序列之间的同一性百分比是在所述两个多肽序列之间共享的比对位置处的相同氨基酸的数量的函数，考虑了可能需要被引入以优化所述两个多肽序列的比对的空位的数量和每个空位的长度。以类似方式，两个多核苷酸序列之间的同一性百分比是在所述两个多核苷酸序列之间共享的比对位置处的相同核苷酸的数量的函数，考虑了可能需要被引入以优化所述两个多核苷酸序列的比对的空位的数量和每个空位的长度。序列比较和两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来实现。例如，两个多肽或两个多核苷酸序列的“同一性百分比”或“同源性百分比”可以通过使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package，10.3版本(加利福尼亚州圣地亚哥的Accelrys公司(Accelrys,San Diego,Calif.))使用其默认参数比较序列来确定。关于测试序列的如“包括与Y具有至少X％同一性的序列”的表达意指当如上描述与序列Y比对时，测试序列包括与Y的残基至少X％相同的残基。

在实施方式中，测试抗体的氨基酸序列可以与构成本文所描述的任何抗ROR1抗体或其抗原结合蛋白的多肽的任何氨基酸序列类似但不一定相同。测试抗体与多肽之间的相似性可以为至少95％，或与构成本文所描述的任何抗ROR1抗体或其抗原结合蛋白的任何多肽至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同。在实施方式中，类似多肽可以包括重链和/或轻链内的氨基酸取代。在实施方式中，氨基酸取代包括一个或多个保守的氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学性质(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以纠正取代的保守性质。用于作出此调整的方法是本领域的技术人员所熟知的。参见例如Pearson,(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331，所述文献通过引用整体并入本文。具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的实例包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。

抗体可以从如含有具有各种抗原特异性的免疫球蛋白的血清或血浆等来源获得。如果此类抗体经受亲和纯化，那么这些抗体可以被富集特定抗原特异性。此类富集抗体制剂通常由对于具体抗原具有特异性结合活性的少于约10％的抗体构成。使这些制剂经受若干轮亲和纯化可以增加对于抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以此方式制备的抗体通常被称为“单特异性的”。单特异性抗体制剂可以由对于具体抗原具有特异性结合活性的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的抗体构成。抗体可以使用如下文所描述的重组核酸技术产生。

本文中使用的术语“载体”以及相关术语是指可以可操作地与外部遗传物质(例如，核酸转基因)连接的核酸分子(例如，DNA或RNA)。载体可以用作媒剂以将外部遗传物质引入到细胞(例如，宿主细胞)中。载体可以包括至少一个限制性核酸内切酶识别序列以将转基因插入到载体中。载体可以包括赋予抗生素抗性或可选择的特性的至少一种基因序列，以帮助选择携带载体-转基因构建体的宿主细胞。载体可以是单链或双链的核酸分子。载体可以是线性或环状核酸分子。用于采用锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas的基因编辑方法的供体核酸可以是一种类型的载体。一种类型的载体是“质粒”，其是指线性或环状的双链染色体外DNA分子，其可以与转基因连接，并能够在宿主细胞中复制，且转录和/或翻译转基因。病毒载体通常包括可以与转基因连接的病毒RNA或DNA主链序列。病毒主链序列可以被修饰以停止感染但保留病毒主链和共连接转基因插入到宿主细胞基因组中。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体、杆状病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体和爱泼斯坦·巴尔病毒(Epstein Barrviral)载体。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，包括细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。

“表达载体”是一种可以包括如诱导型和/或组成型启动子和增强子等一个或多个调控序列的载体。表达载体可以包括核糖体结合位点和/或聚腺苷酸化位点。调控序列引导与转导到宿主细胞中的表达载体连接的转基因的转录或转录和翻译。调控序列可以控制转基因的表达水平、定时和/或位置。调控序列可以例如直接或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用向转基因施加其效应。调控序列可以是载体的一部分。在以下中描述了调控序列的另外的实例：例如Goeddel,1990,《基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)》185,加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社(Academic Press,San Diego,Calif.)以及Baron等人,1995,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》23:3605-3606。表达载体可以包括编码本文所描述的任何抗ROR1抗体的至少一部分的核酸。

当转基因与载体之间存在连接以允许载体中含有的转基因序列发挥功能或表达时，转基因“可操作地连接”到载体。在实施方式中，当调控序列影响到转基因的表达(例如，表达的水平、定时或位置)时，转基因与调控序列“可操作地连接”。

本文所使用的术语“经转染的”或者“经转化的”或“经转导的”或其它相关术语是指将外源核酸(例如，转基因)转移或引入到宿主细胞中的过程。“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”的宿主细胞是已经用外源核酸(转基因)转染、转化或转导的宿主细胞。宿主细胞包括原代对象细胞和其后代。编码本文中所描述的任何抗ROR1抗体的至少一部分的外源核酸可以被引入到宿主细胞中。包括本文中所描述的任何抗ROR1抗体的至少一部分的表达载体可以被引入到宿主细胞中，并且宿主细胞可以表达包括抗ROR1抗体的至少一部分的多肽。

如本文所使用的术语“宿主细胞”或“或宿主细胞群体”或相关术语是指其中已经引入外来(外源性或转基因)核酸的细胞(或其群体)。外部核酸可以包括与转基因可操作地连接的表达载体，并且宿主细胞可以用于表达由外部核酸(转基因)编码的核酸和/或多肽。宿主细胞(或其群体)可以是培养细胞或可以从对象萃取。在不考虑通路的数量的情况下，宿主细胞(或其群体)包括原代对象细胞和其后代。与亲本细胞相比，后代细胞可能携带或可能不携带相同的遗传物质。宿主细胞涵盖后代细胞。在实施方式中，宿主细胞描述已经以任何方式被修饰、转染、转导、转化和/或操纵以表达如本文所公开的抗体的任何细胞(包括其后代)。在一个实例中，宿主细胞(或其群体)可以引入有与编码本文所描述的所需抗体或其抗原结合部分的核酸可操作地连接的表达载体。宿主细胞和其群体可以携带稳定整合到宿主基因组中的表达载体或可以携带染色体外表达载体。在实施方式中，宿主细胞和其群体可以携带染色体外载体，所述染色体外载体在几次细胞分裂后存在，或暂时存在并在几次细胞分裂后消失。

宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或者可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。在实施方式中，宿主细胞可以引入与编码所需抗体的核酸可操作地连接的表达载体，由此产生转染的/转化的宿主细胞，其在适于通过转染的/转化的宿主细胞表达抗体的条件下进行培养，并任选地从转染的/转化的宿主细胞中回收抗体(例如，从宿主细胞切割物回收)或从培养基回收。在实施方式中，宿主细胞包括非人细胞，包括CHO、BHK、NS0、SP2/0和YB2/0。在其它实施方式中，宿主细胞包括包含HEK293、HT-1080、Huh-7和PER.C6的人细胞。宿主细胞的实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等人,1981,《细胞(Cell)》23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢CHO)细胞或其衍生物，如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系(参见Rasmussen等人,1998,《细胞技术学(Cytotechnology)》28:31)或在DHFR中缺乏的CHO菌株DX-B 11(参见Urlaub等人,1980,《美国国家科学院院刊》77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源自非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan等人,1991,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》10:2821)、如293、293EBNA或MSR 293等人胚胎肾细胞、人表皮A431细胞、人Colo 205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织体外培养的细胞菌株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。在实施方式中，宿主细胞包括如Y0、NS0或Sp20等淋巴细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，但不是人类宿主细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述编码多肽的核酸接着可以在宿主细胞中表达。短语“转基因宿主细胞”或“重组宿主细胞”可以用于表示已经用要表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包括核酸，但除非将调控序列引入宿主细胞，使其与核酸可操作地连接，否则不以所需的水平表达核酸的细胞。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定对象细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在如本文中所使用的术语的范围内。

本公开的多肽(例如，抗体和抗原结合蛋白)可以使用本领域已知的任何方法产生。在一个实例中，多肽通过将编码多肽的核酸序列(例如，DNA)插入到重组表达载体中而通过重组核酸方法产生，所述重组表达载体引入到宿主细胞中并且由宿主细胞在促进表达的条件下表达。

用于重组核酸操纵的通用技术例如在Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,第1-3卷,冷泉港实验室出版社,第2版,1989或F.Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(纽约格林出版社和威利国际科学出版社(Green Publishing and Wiley-Interscience:New York),1987)以及定期更新内容中描述，所述文献通过引用整体并入本文。编码多肽的核酸(例如，DNA)可操作地连接到携带源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的一个或多个合适的转录或翻译调控元件的表达载体。此类调控元件包括转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。表达载体可以包括在宿主细胞中赋予复制能力的复制起点。表达载体可以包括赋予选择以促进转基因宿主细胞(例如，转化体)识别的基因。

重组DNA还可以编码可以用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体可以在《克隆载体：实验室手册(Cloning Vectors:ALaboratory Manual)》,(纽约爱思唯尔公司(Elsevier,N.Y.),1985)中找到。

表达载体构建体可以使用适合于宿主细胞的方法引入到宿主细胞中。用于将核酸引入到宿主细胞中的各种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于：电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行的转染；病毒转染；非病毒转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(例如，其中载体是感染原)。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。

合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌(Bacillus spp.)。酵母，优选地来自酵母菌属(Saccharomyces)的多个种，如酿酒酵母(S.cerevisiae)，也可以用于多肽生产。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。Luckow和Summers,(《生物/技术(Bio/Technology)》,6:47,1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备纯化的多肽。对于许多应用，本文所公开的许多多肽的小尺寸将使得在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。接着从培养基或细胞提取物纯化蛋白质。任何抗ROR1抗体或其抗原结合蛋白都可以通过转基因宿主细胞表达。

本文中公开的抗体和抗原结合蛋白也可以使用细胞翻译系统产生。出于此目的，编码多肽的核酸必须被修饰以允许体外转录以产生mRNA并且允许对被使用的具体无细胞系统中的mRNA进行无细胞翻译(真核的，如无哺乳动物细胞或酵母细胞的翻译系统；或原核的，如无细菌细胞的翻译系统)。

编码本文中所公开的各种多肽中的任何一种的核酸可以被化学合成。可以选择密码子使用以改善细胞中的表达。此类密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其它细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用模式。参见例如：Mayfield等人,《美国国家科学院院刊》2003 100(2):438-42；Sinclair等人,《蛋白质表达与纯化(Protein Expr.Purif.)》2002(1):96-105；Connell ND.《现代生物技术评论(Curr.Opin.Biotechnol.)》2001 12(5):446-9；Makrides等人,《微生物学评论(Microbiol.Rev.)》1996 60(3):512-38；以及Sharp等人,《酵母(Yeast)》.19917(7):657-78。

本文中描述的抗体和抗原结合蛋白还可以通过化学合成(例如，通过《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》,第2版,1984,伊利诺州罗克福德皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)中描述的方法)产生。对蛋白质的修饰还可以通过化学合成来产生。

本文所描述的抗体和抗原结合蛋白可以通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化。非限制性实例包括提取、再结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布或这些的任何组合。纯化后，多肽可以交换到不同的缓冲液中和/或通过本领域已知的多种方法中的任一种进行浓缩，所述方法包括但不限于过滤和透析。

本文所描述的纯化的抗体和抗原结合蛋白的纯度为优选地至少65％、至少75％、至少85％、更优选地至少95％、并且最优选地至少98％。不管纯度的确切数值如何，多肽对于用作药物产物足够纯。本文中描述的任何抗ROR1抗体或其抗原结合抗体可以通过转基因宿主细胞表达并且然后使用本领域已知的任何方法纯化到约65-98％的纯度或高水平纯度。

在某些实施方式中，本文中的抗体和抗原结合蛋白可以进一步包括翻译后修饰。示例性翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、苏素化、生物素化或添加多肽侧链或疏水性基团。因此，经修饰的多肽可以包括非氨基酸元件，如脂质、多糖或单糖以及磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分与多肽结合。唾液酸部分改善了溶解度和血清半衰期，同时还降低了蛋白质的可能免疫原性。参见Raju等人,《生物化学(Biochemistry.)》2001 31；40(30):8868-76。

在实施方式中，本文所描述的抗体和抗原结合蛋白可以被修饰成可溶性多肽，所述可溶性多肽包括将抗体和抗原结合蛋白与非蛋白质聚合物连接。在实施方式中，非蛋白性聚合物包括聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，其方式如美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号中所示。

PEG是一种水溶性聚合物，其可商购或可以根据本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo,《聚合物合成(Polymer Synthesis)》,纽约学术出版社(Academic Press,New York),第3卷,第138-161页)。术语“PEG”被广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，不考虑大小或PEG末端的修饰，并且可以由下式表示：X—O(CH₂CH₂O)_n—CH₂CH₂OH(1)，其中n为20至2300并且X为H或端修饰，例如，C_1-4烷基。在实施方式中，PEG在一个末端以羟基或甲氧基终止，即X为H或CH₃(“甲氧基PEG”)。PEG可以包括结合反应所需的另外的化学基团；所述化学基团由分子的化学合成产生；或者所述化学基团是针对分子的部分的最佳距离的间隔子。另外，此类PEG可以由一个或多个PEG侧链组成，这些侧链连接在一起。具有超过一条PEG链的PEG被称为多臂或分支链PEG。分支链PEG可以例如通过将聚环氧乙烷添加包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇的各种多元醇来制备。例如，四臂分支链PEG可以由季戊四醇和环氧乙烷制备。支链PEG描述于例如EP-A0 473 084和美国专利第5,932,462号。PEG的一种形式包括通过赖氨酸的伯氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardini等人,《生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》6(1995)62-69)。

相对于未经修饰的抗体和抗原结合蛋白结合多肽的清除率，经PEG修饰的多肽的血清清除率可以被调节(例如，增加或减少)约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。经PEG修饰的抗体和抗原结合蛋白可以具有相对于未经修饰的多肽的半衰期增加的半衰期(t_1/2)。相对于未经修饰的抗体和抗原结合蛋白的半衰期，经PEG修饰的多肽的半衰期可以提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％或甚至1000％。在一些实施方式中，蛋白质半衰期在体外，如在缓冲盐水溶液中或在血清中确定。在其它实施方式中，蛋白质半衰期是体内半衰期，如蛋白质在动物的血清或其它体液中的半衰期。

本公开提供了治疗组合物，其包含本文所描述的任何抗ROR1抗体或其抗原结合蛋白与药学上可接受的赋形剂的混合物。赋形剂涵盖载剂、稳定剂和赋形剂。药学上可接受的赋形剂的赋形剂包括例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助滑剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。另外的实例包括缓冲剂、稳定剂、防腐剂、非离子型清洁剂、抗氧化剂和等渗剂。

治疗组合物以及用于制备治疗组合物的方法是本领域众所周知的并且在例如《雷明顿：药学技术与实践(“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”)》(第20版,A.R.Gennaro AR.编辑,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.))中找到。治疗组合物可以被调配用于肠胃外施用，可能并且可以例如包括赋形剂、无菌水、生理盐水、如聚乙二醇等聚亚烷基二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制本文所描述的抗体(或其抗原结合蛋白)的释放。纳米粒子调配物(例如，生物可降解的纳米粒子、固体脂质纳米粒子、脂质体)可以用于控制抗体(或其抗原结合蛋白)的生物分布。其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。调配物中抗体(或其抗原结合蛋白)的浓度取决于多种因素，包括要施用的药物剂量和施用途径而变化。

任何抗ROR1抗体(或其抗原结合部分)可以作为药学上可接受的盐，如通常用于制药业的无毒酸加成盐或金属络合物施用。酸加成盐的实例包括如乙酸、乳酸、双羟萘酸、顺丁烯二酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、丁二酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等有机酸；如鞣酸、羧甲基纤维素等聚合酸；以及如盐酸、氢溴酸、硫酸磷酸等无机酸。金属复合物包括锌、铁等。在一个实例中，抗体(或其抗原结合部分)在存在乙酸钠的情况下调配以增加热稳定性。

任何抗ROR1抗体(或其抗原结合部分)可以调配用于口服使用，包括包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。用于口服使用的调配物也可以提供为咀嚼片剂，或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或提供为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合。

如本文所使用的，术语“对象”是指人和非人动物，包括脊椎动物、哺乳动物和非哺乳动物。在实施方式中，对象可以是人、非人灵长类动物、猿、类人猿、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、牛、猪、马、犬、猫科动物、山羊、狼、蛙科动物或鱼。

术语“施用(administering或administered)”以及语法变体是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入到对象。本文所公开的调配物的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的，短语“肠胃外施用”意指除了肠内施用和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。在一些实施方式中，调配物通过非肠胃途径(例如，口服)施用。其它非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如，经鼻内、经阴道、经直肠、舌下或局部。施用也可以进行例如一次、多次和/或历时一个或多个延长的时段。本文中描述的任何抗ROR1抗体(或其抗原结合蛋白)可以使用本领域已知的方法和递送途径施用于对象。

术语“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”或相关术语可以互换使用并且是指抗体或抗原结合蛋白(例如，本文中描述的任何抗ROR1抗体或其抗原结合蛋白)在施用于对象时足以影响与肿瘤或癌症抗原表达相关的疾病或病症的可测量的改善或预防的量。本文所提供的抗体的治疗有效量在单独使用或组合使用时将根据抗体和组合的相对活性(例如，在抑制细胞生长方面)以及根据所治疗的对象和疾病状况、对象的体重、年龄和性别、对象疾病状况的严重程度、施用方式等而变化，这些可以由本领域普通技术人员容易地确定。

在实施方式中，治疗有效量将取决于被治疗的对象和被治疗的病症的某些方面并且可以由本领域技术人员使用已知技术查明。通常，多肽以每天约0.01g/kg至约50mg/kg、优选地每天0.01mg/kg至约30mg/kg、最优选地每天0.1mg/kg至约20mg/kg施用。多肽可以每天(例如，每天一次、两次、三次或四次)或优选地以较低频率(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度)施用。另外，如本领域已知，可能需要根据年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病的严重程度进行调整。

本公开提供了用于治疗患有与ROR1的表达或过表达相关的疾病的对象的方法。疾病包括表达肿瘤相关抗原的癌症或肿瘤细胞。在实施方式中，癌症或肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、乳腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、结肠癌、肾细胞癌或淋巴瘤。

高比例的人类癌症表达ROR1。例如，Zhang等人显示，所检查的54％的卵巢癌、57％的结肠癌、77％的肺癌、90％的淋巴瘤、89％的皮肤癌、83％的胰腺癌、73％的睾丸癌、43％的膀胱癌、96％的子宫癌、90％的前列腺癌和83％的肾上腺癌具有抗ROR1抗体4A5的中等至强染色(Zhang等人,2012,《美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)》,181(6),1903-1910)。Daneshmanesh等人同样发现，ROR1在CLL和毛细胞白血病(HCL)中几乎普遍表达，并且在其它淋巴癌，如套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)/边缘区淋巴瘤(MZL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系淋巴瘤(AML)和骨髓瘤中也有不同程度的表达(Daneshmanesh等人,2013,《白血病和淋巴瘤(Leuk.Lymphoma)》54(4),843-850)。另外，相当大比例的患有肝细胞癌(HCC)或非小细胞肺癌(NSCLC)的患者为ROR1阳性的。进一步地，这已表明，ROR1在侵袭性癌症中的表达增加，并与不良预后相关。

在实施方式中，癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、T细胞白血病(TCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多发性骨髓瘤(MM)、边缘区淋巴瘤(MZL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)或经历了里希特氏转化的非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在实施方式中，癌症是非小细胞癌症(NSCLC)、肝细胞癌、胰腺癌、骨肉瘤、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)。在实施方式中，抗体用于治疗血液恶性肿瘤。在实施方式中，抗体用于治疗实体瘤。要治疗的癌症可以选自例如淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、边缘细胞B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、经历了里希特氏转化的非霍奇金淋巴瘤，、慢性淋巴细胞白血病、T细胞白血病、骨肉瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。在实施方式中，要治疗的癌症可以是对其它疗法(例如，三阴性乳腺癌)难治的癌症。在实施方式中，癌症可以是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。

本公开提供了与ROR1特异性结合的ROR1结合蛋白，具体地抗ROR1抗体或其抗原结合部分和其用途。在实施方式中，ROR1结合蛋白与ROR1的表位结合。酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1，也称为神经营养酪氨酸激酶，受体相关1(NTRKR1)(例如，UniProt Q01973-1)。

所述抗ROR1抗体的各个方面涉及抗体片段、单链抗体、药物组合物、核酸、重组表达载体、宿主细胞以及用于制备和使用此类抗ROR1抗体的方法。用于使用所述抗ROR1抗体的方法包括用于与ROR1结合、检测ROR1并治疗与ROR1表达相关的疾病的体外和体内方法。

本公开提供与ROR1多肽(例如，抗原靶标)或ROR1多肽的片段特异性结合的抗原结合蛋白。在实施方式中，ROR1靶抗原包括具有野生型或多态性或突变氨基酸序列的天然存在的多肽(例如，UniProt登录号Q01973-1)。ROR1靶抗原可以通过重组方法制备或可以化学合成。ROR1靶抗原可以是可溶性形式或膜结合形式(例如，由细胞或噬菌体表达)。

在实施方式中，ROR1靶抗原由细胞表达，例如癌细胞系或非癌细胞系，其自然表达ROR1或工程化以表达ROR1，如A549、U-2197、ASC TERT1、CACO-2或HHSteC。不表达ROR1的细胞系预期不会与抗ROR1抗体结合，例如Jurkat、Daudi或K562细胞系。ROR1靶抗原可以是融合蛋白或例如与如荧光团的可检测部分缀合。ROR1靶抗原可以是融合蛋白或与亲和标签，例如His标签缀合。在实施方式中，人ROR1靶抗原包括SEQ ID NO:1(例如，UniProt登录号Q01973-1)或SEQ ID NO:2(例如，来自Acro Biosystems目录号RO1-H522Y的重组his标记的人ROR1 ECD)的氨基酸序列。

本公开提供了一种与ROR1多肽结合的IgG类全人抗体。在实施方式中，抗ROR1抗体包括重链可变区，其与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列或其组合具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性；和/或抗ROR1抗体包括轻链可变区，其与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列或其组合具有95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性。在实施方式中，抗ROR1抗体包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类抗体。在实施方式中，抗ROR1抗体包括IgG1或IgG4类抗体。在实施方式中，抗ROR1抗体包括IgG1类抗体。

在实施方式中，抗ROR1抗体或其片段包括抗原结合部分，所述抗原结合部分以10^- ⁶M或更小、10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小或10^-10M或更小的结合亲和力(KD)与ROR1靶抗原的表位结合(参见图1A-E)。在实施方式中，ROR1抗原包括细胞表面ROR1抗原或可溶性ROR1抗原。在实施方式中，ROR1抗原包括细胞表面ROR1抗原的细胞外部分。在实施方式中，ROR1抗原包括人或非人ROR1抗原。在实施方式中，ROR1抗原由人或非人细胞表达。在实施方式中，抗ROR1抗体在胚胎发生期间由许多组织表达。在实施方式中，抗ROR1抗体由一些B细胞恶性肿瘤和各种癌症细胞系表达。在实施方式中，抗ROR1抗体通过一些白血病和淋巴瘤表达。在实施方式中，抗ROR1抗体与由腺癌性人肺泡基底上皮细胞(A549)表达的人ROR1结合。在实施方式中，抗ROR1抗体与由人慢性淋巴细胞白血病(CLL)B细胞表达的人ROR1结合。在实施方式中，可以使用表面等离子体共振、流式细胞术和/或ELISA来检测和测量抗ROR1抗体或其片段之间的结合。

如本文所使用的，术语“交叉反应”是指本文所描述的抗体与来自不同物种的ROR1结合的能力。本公开提供了一种抗ROR1抗体，其与来自人的ROR1表位结合，或者可以与来自任何一种或任何组合的非人动物，如小鼠、大鼠、山羊、兔子、仓鼠和/或猴子(例如，食蟹猴)的ROR1(例如，同源抗原)的表位结合(例如，交叉反应性)。在实施方式中，抗ROR1抗体或抗原结合片段以10^-5M或更小、或10^-6M或更小、或10^-7M或更小、或10^-8M或更小、或10^-9M或更小或10^-10M或更小的结合亲和力K_D与人ROR1(ECD)结合。在实施方式中，抗ROR1抗体或抗原结合片段以10^-5M或更小、或10^-6M或更小、或10^-7M或更小、或10^-8M或更小、或10^-9M或更小或10^-10M或更小的结合亲和力K_D与人ROR1 Ig样结构域结合。在实施方式中，抗ROR1抗体或抗原结合片段以10^-5M或更小、或10^-6M或更小、或10^-7M或更小、或10^-8M或更小、或10^-9M或更小或10^-10M或更小的结合亲和力K_D与小鼠ROR1结合。

在实施方式中，人ROR1(ECD)his可从Acro Biosystems(目录号RO1-H522Y)商购获得。在实施方式中，人ROR1 Ig样结构域C-his可从Acro Biosystems(目录号RO1-H5221)商购获得。在实施方式中，小鼠ROR1 his可从Acro Biosystems(目录号RO1-M5221)商购获得。

本公开提供了一种与ROR1结合的全人抗体，其中所述抗体包括重链和轻链两者，其中重链/轻链可变区氨基酸序列与以下氨基酸序列组中的任一者具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性：SEQ ID NO:10和11(本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(本文中称为RO6D8-O11)、SEQ ID NO:40和41(本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(本文中称为RO6A-a8gm)。

本公开提供了Fab全人抗体片段，所述片段包括来自重链的重可变区和来自轻链的可变区，其中来自重链的可变区的序列与SEQ ID NO:10、20、30或40或其组合的氨基酸序列至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同。来自轻链的可变区序列与SEQ ID NO:11、21、31、41或51或其组合的氨基酸序列至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同。

本公开提供了Fab全人抗体片段，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链/轻链可变区氨基酸序列与以下氨基酸序列组中的任一者至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同：SEQ ID NO：SEQ ID NO:10和11(本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(本文中称为RO6D8-O11)、SEQ ID NO:40和41(本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(本文中称为RO6A-a8gm)。

本公开提供了一种单链全人抗体，其包括具有来自完全人重链的可变区和来自完全人轻链的可变区的多肽链，以及连接可变重链区和可变轻链区的任选地接头，其中可变重链区包括与SEQ ID NO:10、20、30或40或其组合的氨基酸序列的至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性。可变轻链区包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51或其组合的氨基酸序列的至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％的序列同一性或至少99％序列同一性。

本公开提供了一种单链全人抗体，其包括具有重链可变区和轻链可变区的多肽链，其中所述重链/轻链可变区氨基酸序列组与以下氨基酸序列组中的任一者至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同：SEQ ID NO：SEQID NO:10和11(本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(本文中称为RO6D8-O11)、SEQ ID NO:40和41(本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(本文中称为RO6A-a8gm)。

本公开提供了药物组合物，其包含本文所描述的任何抗ROR1抗体或其抗原结合蛋白与药学上可接受的赋形剂的混合物。赋形剂涵盖载剂和稳定剂。在实施方式中，药物组合物包括抗ROR1抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链/轻链可变区氨基酸序列与以下氨基酸序列组中的任一者至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同：SEQ ID NO：SEQ ID NO：SEQ ID NO:10和11(本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(本文中称为RO6D8-O11)、SEQ ID NO:40和41(本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(本文中称为RO6A-a8gm)。

本公开提供了一种试剂盒，其包括本文所描述的抗ROR1抗体或其抗原结合片段中的两种或更多种的任一种或任何组合。在一个实施方式中，试剂盒包括两种或更多种抗ROR1抗体或其抗原结合片段中的任一种或任何组合，其包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链/轻链可变区氨基酸序列与以下氨基酸序列组中的任一者至少95％相同、或至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同：SEQ ID NO：SEQ ID NO：SEQ ID NO:10和11(本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(本文中称为RO6D8-O11)、SEQ ID NO:40和41(本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(本文中称为RO6A-a8gm)。

试剂盒可以用于检测ROR1抗原是否存在于例如生物样品中。试剂盒可以用于进行体外反应，如ELISA、流式细胞术或表面等离子体共振形式的抗原结合测定；体外细胞激活测定；萤光素酶报告基因测定；蛋白质印迹和检测；以及其它此类体外测定。试剂盒可以用于治疗患有ROR1相关疾病或病状，如B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)的对象。

本公开提供了编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体重链可变区。

本公开提供了编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-s10)重链可变区：具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3区。

本公开提供了编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-jlv1011)重链可变区：具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链CDR3区。

本公开提供了编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-O11)重链可变区：具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR3区。

本公开提供了编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a7gm)重链可变区：具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链CDR3区。

本公开提供了编码第一多肽的第一核酸，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a8gm)重链可变区：具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链CDR3区。

本公开提供了第一载体，所述第一载体与编码第一多肽的第一核酸可操作地连接，所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体重链可变区。在一个实施方式中，所述第一载体包括表达载体。在一个实施方式中，所述第一载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了第一载体，所述第一载体与编码第一多肽的第一核酸可操作地连接，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-s10)重链可变区：具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3区。在一个实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体。在一个实施方式中，所述第一载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了第一载体，所述第一载体与编码第一多肽的第一核酸可操作地连接，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-jlv1011)重链可变区：具有SEQID NO:22的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链CDR3区。在一个实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体。在一个实施方式中，所述第一载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了第一载体，所述第一载体与编码第一多肽的第一核酸可操作地连接，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-O11)重链可变区：具有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR3区。在一个实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体。在一个实施方式中，所述第一载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了第一载体，所述第一载体与编码第一多肽的第一核酸可操作地连接，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a7gm)重链可变区：具有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链CDR3区。在一个实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体。在一个实施方式中，所述第一载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了第一载体，所述第一载体与编码第一多肽的第一核酸可操作地连接，所述第一多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a8gm)重链可变区：具有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链CDR2区以及具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链CDR3区。在一个实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体。在一个实施方式中，所述第一载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第一宿主细胞，所述第一宿主细胞携带与第一核酸可操作地连接的第一载体，所述第一核酸编码与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体重链可变区。在一个实施方式中，所述第一载体包括第一表达载体。在一个实施方式中，第一宿主细胞表达第一多肽，所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变区。

本公开提供了一种用于制备具有抗体重链可变区的第一多肽的方法，所述方法包括：在适于表达具有与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变区的第一多肽的条件下培养携带第一表达载体的第一宿主细胞群体(例如，多个第一宿主细胞)。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：从第一宿主细胞群体中回收所表达的的与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的第一多肽。

本公开提供了编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体轻链可变区。

本公开提供了编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-s10)轻链可变区：具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR3区。

本公开提供了编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-jlv1011)轻链可变区：具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链CDR3区。

本公开提供了编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-O11)轻链可变区：具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链CDR3区。

本公开提供了编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a7gm)轻链可变区：具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链CDR3区。

本公开提供了编码第二多肽的第二核酸，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a8gm)轻链可变区：具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链CDR3区。

本公开提供了第二载体，所述第二载体与编码第二多肽的第二核酸可操作地连接，所述第二多肽包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体轻链可变区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第二载体，所述第二载体与第二核酸可操作地连接，所述第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-s10)轻链可变区：具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第二载体，所述第二载体与第二核酸可操作地连接，所述第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-jlv1011)轻链可变区：具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第二载体，所述第二载体与第二核酸可操作地连接，所述第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6D8-O11)轻链可变区：具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第二载体，所述第二载体与第二核酸可操作地连接，所述第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a7gm)轻链可变区：具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第二载体，所述第二载体与第二核酸可操作地连接，所述第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括具有以下的抗ROR1抗体(例如，RO6A-a8gm)轻链可变区：具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR1)、具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链CDR2区以及具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的启动子。

本公开提供了一种第二宿主细胞，所述第二宿主细胞携带与第二核酸可操作地连接的第二载体，所述第二核酸编码与SEQ ID NO:11、21、31、41或51具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体轻链可变区。在一个实施方式中，第二载体包括第二表达载体。在一个实施方式中，第二宿主细胞表达第二多肽，所述第二多肽包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变区。

本公开提供了一种用于制备具有抗体轻链可变区的第二多肽的方法，所述方法包括：在适于表达具有与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变区的第二多肽的条件下培养携带第二表达载体的第二宿主细胞群体(例如，多个第二宿主细胞)。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：从第二宿主细胞群体中回收所表达的与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的第二多肽。

本公开提供了第一核酸和第二核酸，其中第一核酸编码第一多肽和第二多肽，(a)所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体重链可变区，(b)所述第二多肽包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体轻链可变区。

本公开提供了一种载体，所述载体与第一核酸和第二核酸可操作地连接，其中第一核酸编码第一多肽和第二多肽，(a)所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体重链可变区，(b)所述第二多肽包括与SEQ IDNO:11、21、31、41或51具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体轻链可变区。在一个实施方式中，载体包括表达载体。在一个实施方式中，载体包括至少一个与第一核酸可操作地连接的第一启动子。在一个实施方式中，载体包括至少一个与第二核酸可操作地连接的第二启动子。

本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带载体，所述载体与第一核酸和第二核酸可操作地连接，其中(a)第一核酸编码第一多肽，所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体重链可变区，并且(b)第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51具有至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的抗ROR1抗体轻链可变区。在一个实施方式中，载体包括表达载体。在一个实施方式中，宿主细胞表达以下：(a)第一多肽，所述第一多肽包括与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变区，以及(b)第二多肽，所述第二多肽包括与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变区。

本公开提供了一种用于制备具有抗体重链可变区的第一多肽和具有抗体轻链可变区的第二多肽的方法，所述方法包括：培养宿主细胞群体(例如，多个宿主细胞)，所述宿主细胞群体携带表达载体，所述表达载体分别与编码第一多肽和第二多肽的第一核酸和第二核酸可操作地连接。在一个实施方式中，培养在适于表达以下的条件下进行：(a)第一多肽，所述第一多肽具有与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变区，以及(b)第二多肽，所述第二多肽具有与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体轻链可变区。在一个实施方式中，所述方法进一步包括：从宿主细胞群体中回收所表达的第一多肽和所表达的第二多肽，所述第一多肽具有与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的抗体重链可变区，所述第二多肽与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

在一个实施方式中，宿主细胞或宿主细胞群体携带可以引导转基因瞬时引入到宿主细胞中或将转基因稳定插入到宿主细胞的基因组中的一个或多个表达载体，其中转基因包括编码本文中描述的第一多肽和/或第二多肽中的任何一种的核酸。表达载体可以引导宿主细胞中转基因的转录和/或翻译。表达载体可以包括一个或多个调控序列，如诱导型和/或组成型启动子和增强子。表达载体可以包括核糖体结合位点和/或聚腺苷酸化位点。在一个实施方式中，与编码第一和/或第二多肽的核酸可操作地连接的表达载体可以引导第一和/或第二多肽产生，所述第一和/或第二多肽可以展示于转基因宿主细胞的表面上，或者第一和/或第二多肽可以分泌到细胞培养基中。

本公开提供了用于抑制靶细胞生长或增殖的方法，或用于杀伤靶细胞的方法，所述方法包括：在适于杀伤靶细胞的条件下，在存在抗ROR1抗体(或其抗体片段)的情况下使效应细胞群体与靶细胞群体(例如，表达ROR1的靶细胞)接触。在实施方式中，效应细胞群体包括外周血单核细胞(PBMC)或自然杀伤(NK)细胞。PBMC可以包括淋巴细胞，包括T细胞、B细胞和/或NK细胞。在实施方式中，靶细胞群体包括自然表达ROR1的细胞，包括套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞或来自患有与ROR1表达相关的癌症的对象的实体瘤细胞的任何类型。在实施方式中，靶细胞群体是被工程化以表达ROR1的任何类型的转基因细胞。在实施方式中，效应细胞与靶细胞的比率可以是约1:1、或约2:1、或约3:1、或约4:1、或约5:1、或约5-10:1、或约10-20:1或约20-30:1。

本公开提供了用于治疗患有与ROR1表达相关的疾病的对象的方法，所述方法包括：向对象施用有效量的包括选自由以下组成的组的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的治疗组合物：本文所描述的任何全人抗ROR1抗体、本文所描述的任何Fab全人抗ROR1抗体以及本文所描述的任何单链人抗ROR1抗体。在实施方式中，与ROR1表达相关的疾病是癌症。在实施方式中，与ROR1表达相关的疾病包括：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、乳腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、结肠癌、肾细胞癌或淋巴瘤。

在实施方式中，与ROR1表达相关的疾病是癌症，包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系淋巴瘤(AML)、骨髓瘤、T细胞白血病(TCL)、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、经历了里希特氏转化的非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、胰腺癌、骨肉瘤、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)、淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘细胞B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、结直肠癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌。

在实施方式中，癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。

可以单独使用抗ROR1抗体以抑制癌肿瘤的生长。在实施方式中，抗ROR1抗体可以与另一种试剂，例如其它免疫原性试剂、标准癌症治疗或其它抗体结合使用，以用于治疗与ROR1表达(或升高的ROR1表达)相关的疾病。

在实施方式中，与ROR1表达相关的疾病是癌症。在实施方式中，用于治疗患有表达ROR1的癌症的对象的方法，所述方法包括：向对象施用有效量的包括选自由以下组成的组的抗ROR1抗体或其抗原结合片段的治疗组合物：本文所描述的任何全人抗ROR1抗体、本文所描述的任何Fab全人抗ROR1抗体以及本文所描述的任何单链人抗ROR1抗体。所述方法进一步包括适于治疗癌症的细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂的共施用。如果癌症是B细胞恶性肿瘤，则所述方法可以进一步包括例如利妥昔单抗(rituximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)或CHOP化疗方案的共施用。

序列表：

人ROR1蛋白(UniProt Q01973-1)SEQ ID NO:1：

/>

重组截短的人his-标签ROR1细胞外结构域蛋白(SEQ ID NO:1的具有羧基末端多组氨酸标签的氨基酸30-403)SEQ ID NO:2：

重组截短的人his-标签ROR1 Ig样结构域(

SEQ ID NO:1的具有羧基末端多组氨酸标签的氨基酸39-151)SEQ ID NO:3：

表1：

/>

实施例

以下实施例旨在是说明性并且可以用于进一步理解本公开的实施方式并且不应被解释为以任何方式限制本发明教导的范围。

实施例1：使用表面等离子体共振测量结合亲和力。

使用表面等离子体共振(SPR)测量抗ROR1抗体与his标记的ROR1蛋白的结合动力学。所测试的抗ROR1抗体包括专有抗体RO6D8wt、RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011和RO6D8-O11。使用标准的N-羟基琥珀酰亚胺/N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(NHS/EDC)偶联方法，将抗人片段结晶区(Fc区)抗体固定在CM5传感器芯片上至大约8,000RU。以10μL/分钟的流速捕获抗ROR1抗体(1-2μg/mL)，持续60秒。his标记的ROR1蛋白包括SEQ IDNO:1(Acro Biosystems；目录号RO1-H522Y)的氨基酸30至氨基酸403(即SEQ ID NO:2)。将此多肽在0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20(HBS-EP+)的运行缓冲液中连续稀释，并以6种不同的稀释度运行。所有测量均在30μL/分钟的流速下在HBS-EP+缓冲液中进行。使用1:1(Langmuir)结合模型来拟合数据。所有BIACORE测定均在室温下使用BIACORE T200表面等离子体共振(通用电气医疗集团(GE Healthcare))进行。

抗ROR1抗体RO6D8wt、RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011和RO6D8-O11的SPR传感图分别如图1A-1D所示，并且其对应结合动力学列出在图1E所示的表中。抗人ROR1抗体RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011和RO6D8-O11显示出在nM范围内针对其同源抗原的亲和力。

实施例2：ELISA交叉反应性。

通过ELISA测定分析了抗人ROR1抗体与来自人和小鼠的his标记的ROR1重组蛋白的交叉反应性。将5μg/mL抗体(RO6D8wt、RO6D8-s10、RO6D8-glv1011、RO6D8-jlv1011、RO6D8-lv1011)用PBS缓冲液，并以50μL/孔涂覆在板上，或用对照缓冲液稀释，以50μL/孔涂覆在板上。将平板用150μL/孔的PBS-T(补充有0.05％Tween 20的PBS1X)洗涤三次。随后，在室温下将板用100μL/孔封闭缓冲液(来自Bioworld的含有阻断剂酪蛋白的PBS，目录号40320020-2)封闭，持续1小时。封闭后，将板用150μL/孔PBS-T洗涤3次。重组小鼠his-标签ROR1，2μg/ml(Acro Biosystems目录号RO1-M5221，批号：1201-48ESI-65)；人his标签ROR1细胞外结构域(SEQ ID NO:2)，1μg/ml(Acro Biosystems目录号RO1-H522Y，批号：C81-76KF1-FR)；人his标签ROR1 Ig样结构域C-his，2μg/ml(Acro Biosystems目录号RO1-H5221，批号：B311-59SSI-CA)；人his标签CD138，2μg/ml(Sino目录号11429-H08H，批号：LCL07NO0412)(阴性对照抗体)和酪蛋白/PBS缓冲液(对照)。以每孔30μl his标记的ROR1抗原、his标记的CD138或酪蛋白/PBS缓冲液添加到板中，并在室温下温育1小时。将板用150μL/孔的PBS-T洗涤三次，并将抗6x-his(SEQ ID NO:58)标签抗体HRP(艾博抗公司(Abcam)；目录号Ab1187)以1:5,000，30μL/孔稀释液在室温下温育1小时。随后，将板用150μL/孔PBS-T洗涤三次，并通过施用30μL/孔SureBlue^TM TMB-1组分微孔过氧化物酶底物(赛默飞世尔科技公司；目录号34028)揭示结合。通过使用15μL/孔的2N硫酸(H₂SO₄)停止溶液将信号停止在期望的饱和点处，并在读板仪上在450nm处读取。

图2A示出了抗人ROR1抗体RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011和RO6D8wt与人ROR1 ECD(细胞外结构域)、人ROR1 Ig样结构域和小鼠ROR1蛋白结合。

在另一个实验中，使用ELISA测定分析不同浓度的抗人ROR1抗体的交叉反应性。第0天：以2μg/mL用50μL/孔的重组小鼠ROR1小鼠IgG₂-Fc融合蛋白涂覆96孔板(康宁公司(Corning)；目录号3690，批号34117018)(R&D系统公司(R&D Systems)；目录号9910-RO-050，批号DIWM0120121)，将板密封并在4℃下温育过夜。

第1天：将板用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤(含0.05％V/V Tween20的DPBS1X)。通过使用封闭缓冲液(80μL/孔，具有2％BSA的DPBS1X(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录号AB412，批号SLBT5979)+0.05％Tween20(西格玛奥德里奇公司；目录号P9416-50mL，批号SLBW5532)封闭非特异性结合，并将板在37℃下温育1小时。接下来，将板用洗涤缓冲液洗涤两次。将人抗ROR1抗体(RO6D8-jlv1011、RO6D8-s10)在封闭缓冲液中以1.0E+00至1.7E-06μg/mL(3倍稀释度)的浓度温育(80μL/孔)。两个孔未与任何抗ROR1抗体温育，并且仅用于次级抗体对照(阴性对照)。将板在振荡器上在室温下温育2小时。然后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次。随后，将第二山羊抗人IgG Fc、小鼠/牛/马SP ads HRP(南方生物技术公司(Southern Biotech)；目录号2081-05；批号L5311-TE40)以1:2,000在封闭缓冲液中稀释，并以80μL/孔添加到孔中。将板在黑暗中在37℃下温育1小时。在用洗涤缓冲液洗涤三次后，将80μL/孔的SureBlue Reserve TMB 1-组分微孔过氧化物酶底物溶液(SeraCare；目录号5120-0082)添加到每个孔中，并将板在黑暗中在室温下温育10-12分钟(密切监测板，并根据显色减少或延长温育时间)。通过添加50μL/孔TMB Blue STOP溶液(Seracare；目录号5150-0022)停止显色，并使用Tecan Spark在450nm处读取吸光度。

图2B示出了抗人ROR1抗体RO6D8-s10和RO6D8-jlv1011与小鼠ROR1蛋白结合。

实施例3：流式细胞术的细胞结合测定。

使用流式细胞术对多种抗ROR1抗体，测试抗体与腺癌性人肺泡基底上皮细胞系A549(ROR1+)和人T淋巴细胞系Jurkat(ROR1阴性)永生化细胞系的结合。在FACS缓冲液(PBS，2％FBS和0.05％叠氮化物)中以1x 10⁶/ml的浓度制备细胞。将细胞以30μl/孔平板接种在V型底96孔板中。将抗ROR1抗体(使用RO6D8wt作为对照)在FACS缓冲液中稀释(从50μg/ml开始的5X连续稀释)，并在冰上用A549或Jurkat细胞将30μl添加到每个孔中，持续60分钟。在温育后，将细胞以2000rpm离心5分钟，翻转出上清液。在用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤1次后，以50μL/孔将细胞与AF647山羊抗人Fab2抗体(Jackson ImmunoResearch；目录号109-606-088)(在FACS缓冲溶液中以1:2000稀释度)在冰上温育40分钟。在温育后，将细胞以2000rpm离心5分钟，翻转出上清液。在用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤1次后，将细胞重悬于30μL的FACS缓冲液中，并通过使用IntelliCyt读数的流式细胞术获得。

图3A示出了野生型抗人ROR1抗体与表达ROR1的A549细胞和ROR1阴性的Jurkat细胞结合。图3B和3C示出了抗人ROR1抗体RO6D8-s10和RO6D8-jlv1011分别与表达ROR1的A549细胞和ROR1阴性的Jurkat细胞结合。抗人ROR1抗体RO6D8-s10和RO6D8-jlv1011显示出与在A549细胞表面处表达的同源抗原的剂量依赖性结合，并且没有与ROR1阴性的Jurkat细胞结合。与野生型抗人ROR1抗体相比，抗人ROR1抗体RO6D8-s10和RO6D8-jlv1011表现出更强的结合能力、改进的亲和力和特异性。

实施例4：流式细胞术的细胞结合测定。

用流式细胞术测试抗体与腺癌性人肺泡基底上皮细胞系A549(ROR1+)、伯基特氏淋巴瘤细胞系RAJI(ROR1+)、乳腺癌细胞系(ROR1+)、ROR1阴性的A549 ROR1-KO细胞系(ROR1敲除)和杜克氏B型腺癌细胞系(Duke's type B adenocarcinoma cell line)LS174T(ROR1阴性)的结合。

将30,000个细胞转移到V型底96孔板中。将细胞以1,900rpm旋转减慢，持续3分钟。

将细胞用冷的FACS缓冲液(PBS1X+2％FCS+2mM EDTA)洗涤两次。将细胞以1,900rpm旋转减慢，持续2分钟，并通过快速轻弹板去除上清液。

另一个96孔板(圆底，超低附着，目录号3474，康宁公司)用于抗体稀释。所有抗体(RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011、RO6A-a7gm、RO6A-a8gm和同种型对照IgG1)在FACS缓冲液(PBS+2％FCS+2mM EDTA)中从10μg/mL(10-0.0006μg/mL)的最高浓度连续稀释4倍。

将细胞重新悬浮于含有不同浓度的抗ROR1抗体和同种型对照IgG1的100μL/孔的FACS缓冲液中，并在4℃下温育30分钟。

将细胞以1,900rpm离心沉降，持续2分钟，并通过快速轻弹板去除上清液。

将细胞用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤。将细胞以1,900rpm离心沉降，持续2分钟，并通过快速轻弹板去除上清液。将洗涤步骤重复两次。

将细胞重新悬浮于含有山羊抗人IgG AF647(1:2,000，南方生物技术公司，目录号2040-31，批号D1817-T817C)的120μL/孔的FACS缓冲液中，并将板在黑暗中在4℃下温育20分钟。

将细胞重新悬浮于120μL/孔的FACS缓冲液中，并通过流式细胞术在Attune NxT上获得80μL，并使用FlowJo分析数据。

图4A-E示出了抗人ROR1抗体RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011、RO6A-a7gm和RO6A-a8gm与表达ROR1的细胞A549(图4A)、Raji(图4B)和MCF7(图4C)细胞；和ROR1阴性A549 ROR1-KO(图4D)和LS174T(图4E)细胞的结合。抗人ROR1抗体RO6D8-s10、RO6D8-jlv1011、RO6A-a7gm和RO6A-a8gm显示出与其在A549、Raji和MCF7细胞表面处表达的同源抗原的剂量依赖性结合；并且不与ROR1阴性的A549ROR1-KO和LS174T细胞结合。

序列表

<110> 索伦托药业有限公司（SORRENTO THERAPEUTICS, INC.）

<120> 与ROR1结合的抗原结合蛋白

<130> 01223-0097-00PCT

<150> US 63/173,150

<151> 2021-04-09

<160> 58

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 937

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Ala Gln Glu Thr

20 25 30

Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile

35 40 45

Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met

50 55 60

Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu His Cys Lys

65 70 75 80

Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys Asn Asp Ala

85 90 95

Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser Thr Ile Tyr

100 105 110

Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp Thr Gly Tyr

115 120 125

Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser Ser Thr Gly

130 135 140

Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser Pro Gly Tyr

145 150 155 160

Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr Arg Gly Ile

165 170 175

Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met Glu Ser Leu

180 185 190

His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala Phe Thr Met

195 200 205

Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln Phe Ala Ile

210 215 220

Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr Ser Ser

225 230 235 240

Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu Ile Leu Glu

245 250 255

Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser Asn Pro Met

260 265 270

Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro Gln Pro

275 280 285

Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile Pro Met Ala

290 295 300

Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr Gly Val Asp

305 310 315 320

Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln Cys Gln Pro

325 330 335

Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala Leu Arg Phe

340 345 350

Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro Gly Asn Gln

355 360 365

Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe Lys Ser Asp

370 375 380

Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys Glu Lys Asn

385 390 395 400

Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val Pro Ser Val Ala Ile Pro Leu

405 410 415

Ala Ile Ala Leu Leu Phe Phe Phe Ile Cys Val Cys Arg Asn Asn Gln

420 425 430

Lys Ser Ser Ser Ala Pro Val Gln Arg Gln Pro Lys His Val Arg Gly

435 440 445

Gln Asn Val Glu Met Ser Met Leu Asn Ala Tyr Lys Pro Lys Ser Lys

450 455 460

Ala Lys Glu Leu Pro Leu Ser Ala Val Arg Phe Met Glu Glu Leu Gly

465 470 475 480

Glu Cys Ala Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr Leu Pro Gly

485 490 495

Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Asp Tyr Asn

500 505 510

Asn Pro Gln Gln Trp Thr Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser Leu Met Ala

515 520 525

Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala Val Thr Gln

530 535 540

Glu Gln Pro Val Cys Met Leu Phe Glu Tyr Ile Asn Gln Gly Asp Leu

545 550 555 560

His Glu Phe Leu Ile Met Arg Ser Pro His Ser Asp Val Gly Cys Ser

565 570 575

Ser Asp Glu Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Leu Asp His Gly Asp Phe

580 585 590

Leu His Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ala Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser

595 600 605

His Phe Phe Val His Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Ile Gly

610 615 620

Glu Gln Leu His Val Lys Ile Ser Asp Leu Gly Leu Ser Arg Glu Ile

625 630 635 640

Tyr Ser Ala Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Ser Lys Ser Leu Leu Pro Ile

645 650 655

Arg Trp Met Pro Pro Glu Ala Ile Met Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Asp

660 665 670

Ser Asp Ile Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Ser Phe

675 680 685

Gly Leu Gln Pro Tyr Tyr Gly Phe Ser Asn Gln Glu Val Ile Glu Met

690 695 700

Val Arg Lys Arg Gln Leu Leu Pro Cys Ser Glu Asp Cys Pro Pro Arg

705 710 715 720

Met Tyr Ser Leu Met Thr Glu Cys Trp Asn Glu Ile Pro Ser Arg Arg

725 730 735

Pro Arg Phe Lys Asp Ile His Val Arg Leu Arg Ser Trp Glu Gly Leu

740 745 750

Ser Ser His Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn Ala Thr Thr

755 760 765

Gln Thr Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Ser Asn Leu Ser Asn Pro

770 775 780

Arg Tyr Pro Asn Tyr Met Phe Pro Ser Gln Gly Ile Thr Pro Gln Gly

785 790 795 800

Gln Ile Ala Gly Phe Ile Gly Pro Pro Ile Pro Gln Asn Gln Arg Phe

805 810 815

Ile Pro Ile Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Pro Gly Tyr Ala Ala Phe Pro

820 825 830

Ala Ala His Tyr Gln Pro Thr Gly Pro Pro Arg Val Ile Gln His Cys

835 840 845

Pro Pro Pro Lys Ser Arg Ser Pro Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ser

850 855 860

Thr Gly His Val Thr Ser Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Gln Glu Ala

865 870 875 880

Asn Ile Pro Leu Leu Pro His Met Ser Ile Pro Asn His Pro Gly Gly

885 890 895

Met Gly Ile Thr Val Phe Gly Asn Lys Ser Gln Lys Pro Tyr Lys Ile

900 905 910

Asp Ser Lys Gln Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Asn Ile His Gly His

915 920 925

Thr Glu Ser Met Ile Ser Ala Glu Leu

930 935

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组截短的人his-标签ROR1细胞外结构域蛋白（SEQ ID NO: 1的

具有羧基末端多组氨酸标签的氨基酸30-403）

<400> 2

Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser

1 5 10 15

Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp

20 25 30

Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu

35 40 45

His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys

50 55 60

Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser

65 70 75 80

Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp

85 90 95

Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser

100 105 110

Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser

115 120 125

Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr

130 135 140

Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met

145 150 155 160

Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala

165 170 175

Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln

180 185 190

Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu

195 200 205

Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu

210 215 220

Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser

225 230 235 240

Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu

245 250 255

Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile

260 265 270

Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr

275 280 285

Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln

290 295 300

Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala

305 310 315 320

Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro

325 330 335

Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe

340 345 350

Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys

355 360 365

Glu Lys Asn Lys Met Glu His His His His His His

370 375 380

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组截短的人his-标签ROR1 Ig样结构域（SEQ ID NO: 1的

具有羧基末端多组氨酸标签的氨基酸39-151）

<400> 3

Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys

1 5 10 15

Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser

20 25 30

Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro

35 40 45

Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro

50 55 60

Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile

65 70 75 80

Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Val Val Ser Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe

100 105 110

Gly His His His His His His

115

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8wt重链可变结构域

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8wt轻链可变结构域

<400> 5

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Arg Ala His

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<400> 6

000

<210> 7

<400> 7

000

<210> 8

<400> 8

000

<210> 9

<400> 9

000

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10重链可变结构域

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Leu Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10轻链可变结构域

<400> 11

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10 HC CDR1

<400> 12

Asn Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10 HC CDR2

<400> 13

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10 HC CDR3

<400> 14

Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10 LC CDR1

<400> 15

Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu Ile Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10 LC CDR2

<400> 16

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-s10 LC CDR3

<400> 17

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile Thr

1 5

<210> 18

<400> 18

000

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011重链可变结构域

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Lys

20 25 30

Tyr Tyr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011轻链可变结构域

<400> 21

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011 HC CDR1

<400> 22

Ser Lys Tyr Tyr His

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011 HC CDR2

<400> 23

Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011 HC CDR3

<400> 24

Asp Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011 LC CDR1

<400> 25

Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu Ile Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011 LC CDR2

<400> 26

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-jlv1011 LC CDR3

<400> 27

Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala

1 5

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11重链可变结构域

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11轻链可变结构域

<400> 31

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Asp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile

85 90 95

Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11 HC CDR1

<400> 32

Asn Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11 HC CDR2

<400> 33

Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11 HC CDR3

<400> 34

Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11 LC CDR1

<400> 35

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11 LC CDR2

<400> 36

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6D8-O11 LC CDR3

<400> 37

Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala

1 5

<210> 38

<400> 38

000

<210> 39

<400> 39

000

<210> 40

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm/RO6A-a8gm重链可变结构域

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm轻链可变结构域

<400> 41

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Val Ser Trp Tyr Gln

20 25 30

Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys

35 40 45

Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn

50 55 60

Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp

65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ile Asn Asp Ala Val Phe Phe Gly Gly Gly

85 90 95

Thr Lys Leu Thr Val Leu

100

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm / RO6A-a8gm HC CDR1

<400> 42

Asp Tyr Tyr Met Thr

1 5

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm / RO6A-a8gm HC CDR2

<400> 43

Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm / RO6A-a8gm HC CDR3

<400> 44

Asp Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Asp

1 5 10

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm LC CDR1

<400> 45

Thr Gly Thr Ser Ser

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm LC CDR2

<400> 46

Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a7gm LC CDR3

<400> 47

Ser Ser Tyr Ile Asn Asp Ala Val Phe

1 5

<210> 48

<400> 48

000

<210> 49

<400> 49

000

<210> 50

<400> 50

000

<210> 51

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a8gm轻链可变结构域

<400> 51

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Gly Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Asp

85 90 95

Val Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 52

<400> 52

000

<210> 53

<400> 53

000

<210> 54

<400> 54

000

<210> 55

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a8gm LC CDR1

<400> 55

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Asp Ser Val Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a8gm LC CDR2

<400> 56

Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RO6A-a8gm LC CDR3

<400> 57

Ser Ser Phe Thr Ser Asp Val Met Val

1 5

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6x His标签

<400> 58

His His His His His His

1 5

Claims

1.一种抗ROR1抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段，所述抗ROR1抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，

其中所述重链可变区包括重链互补决定区1(CDR1)、重链CDR2和重链CDR3，并且所述轻链可变区包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；并且

(a)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(b)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(c)所述重链CDR1具有SEQ IDNO:32的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(d)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ IDNO:45的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列；(e)所述重链CDR1具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，所述重链CDR2具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述重链CDR3具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列，所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列，并且所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区与SEQ ID NO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且所述轻链可变区与SEQ ID NO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

3.一种抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区与SEQ IDNO:10、20、30或40的氨基酸序列具有至少95％序列同一性，并且所述轻链可变区与SEQ IDNO:11、21、31、41或51的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

4.一种抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合蛋白或全人抗ROR1抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:10和11(例如，本文中称为RO6D8-s10)、SEQ ID NO:20和21(例如，本文中称为RO6D8-jlv1011)、SEQ ID NO:30和31(例如，本文中称为RO6D8-O11)、SEQID NO:40和41(例如，本文中称为RO6A-a7gm)或SEQ ID NO:40和51(例如，本文中称为RO6A-a8gm)的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原结合片段，其包括Fab片段。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原结合片段，其包括单链抗体，其中所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域用肽接头连接在一起。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段，其包括IgG抗体，所述IgG抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类抗体。

8.根据权利要求7所述的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段，其包括所述IgG1或IgG4类抗体。

9.根据权利要求7所述的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段，其包括所述IgG1类抗体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合蛋白、抗体或其抗体结合片段以10^-7M或更小的K_D与人ROR1蛋白结合。

11.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂。

12.一种试剂盒，其包括根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段以及权利要求1至10中任一项的药学上可接受的赋形剂。

13.一种核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区。

14.一种核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区。

15.一种核酸，其编码(i)根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区，以及(ii)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区。

16.一种载体，其包括根据权利要求13所述的核酸。

17.一种载体，其包括根据权利要求14所述的核酸。

18.一种载体，其包括根据权利要求15所述的核酸。

19.一种宿主细胞，其携带根据权利要求16所述的载体。

20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述载体包括表达载体，并且其中所述宿主细胞表达所述重链可变区。

21.一种宿主细胞，其携带根据权利要求17所述的载体。

22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述载体包括表达载体，并且其中所述宿主细胞表达所述轻链可变区。

23.一种宿主细胞，其携带包括根据权利要求16所述的载体的第一载体和包括根据权利要求17所述的载体的第二载体。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中所述第一载体包括第一表达载体，其中所述第二载体包括第二表达载体，并且其中所述宿主细胞表达所述重链可变区和所述轻链可变区。

25.一种宿主细胞，其携带根据权利要求18所述的载体。

26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述载体包括表达载体，并且其中所述宿主细胞表达所述重链可变区和所述轻链可变区。

27.一种用于制备抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区的条件下培养根据权利要求20所述的宿主细胞的群体。

28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括：从所述宿主细胞回收所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区。

29.一种用于制备抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区的条件下培养根据权利要求22所述的宿主细胞的群体。

30.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括：从所述宿主细胞回收所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区。

31.一种用于制备以下的方法：(i)抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区；以及(ii)抗原结合蛋白、抗体或抗体结合片段的轻链可变区，所述方法包括：在适于表达以下的条件下培养根据权利要求24所述的宿主细胞的群体：(i)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区；以及(ii)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区。

32.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：从所述宿主细胞回收以下：(i)所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区；以及(ii)所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区。

33.一种用于制备以下的方法：(i)抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区；以及(ii)抗原结合蛋白、抗体或抗体结合片段的轻链可变区，所述方法包括：在适于表达以下的条件下培养根据权利要求26所述的宿主细胞的群体：(i)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述重链可变区；以及(ii)所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的所述轻链可变区。

34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括：从所述宿主细胞回收以下：(i)所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的重链可变区；以及(ii)所表达的所述抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的轻链可变区。

35.一种用于抑制表达ROR1的细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：在适于抑制所述表达ROR1的细胞的生长或增殖的条件下，(iii)在存在根据权利要求1至10中任一项所述的人抗ROR1抗体的情况下，使(i)效应细胞群体与(ii)表达ROR1的靶细胞群体接触。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述效应细胞群体包括PBMC或NK细胞。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述靶细胞群体包括表达ROR1的人癌细胞或表达ROR1的转基因细胞。

38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述效应细胞与所述靶细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。

39.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述效应细胞与所述靶细胞的比率为5-10:1、10-20:1或20-30:1。

40.一种用于杀伤表达ROR1的细胞的方法，所述方法包括：在适于抑制所述表达ROR1的细胞的生长或增殖的条件下，(iii)在存在根据权利要求1至10中任一项所述的人抗ROR1抗体的情况下，使(i)效应细胞群体与(ii)表达ROR1的靶细胞群体接触。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述效应细胞群体包括PBMC或NK细胞。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述靶细胞群体包括表达ROR1的人癌细胞或表达ROR1的转基因细胞。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述效应细胞与所述靶细胞的比率为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。

44.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述效应细胞与所述靶细胞的比率为5-10:1、10-20:1或20-30:1。

45.一种用于治疗患有与ROR1表达相关的疾病的对象的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段的治疗组合物。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述与ROR1表达相关的疾病是癌症。

47.根据权利要求46所述的方法，其中癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、乳腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、结肠癌、肾细胞癌或淋巴瘤。

48.根据权利要求46所述的方法，其中癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系淋巴瘤(AML)、骨髓瘤、T细胞白血病(TCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多发性骨髓瘤(MM)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、经历里希特氏转化(Richter's transformation)的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、胰腺癌、骨肉瘤、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌或三阴性乳腺癌(TNBC)、淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘细胞B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、结肠癌、结直肠癌、上皮鳞状细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌或甲状腺癌。

49.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。

50.根据权利要求1至10中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或抗原结合片段，其用于根据权利要求27至49中任一项所述的方法中。