ES2689328T3 - Anticuerpo monoclonal M-CSF-específico y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 116; y (ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 53, y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición es un polvo adecuado para su reconstitución con una solución apropiada.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpo monoclonal M-CSF-específico y usos del mismo CAMPO TECNICO
Esta invención se refiere a una composición farmacéutica y un artículo de fabricación que comprende un anticuerpo útil para prevenir y tratar osteolisis, metástasis de cáncer y pérdida ósea asociada con metástasis de cáncer en un sujeto.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La metástasis del cáncer es la causa principal de la reaparición después de la operación y después de la terapia en pacientes con cáncer. A pesar de los esfuerzos intensivos para desarrollar tratamientos, la metástasis del cáncer permanece sustancialmente refractaria a la terapia. El hueso es uno de los sitios más comunes de metástasis de varios tipos de cánceres humanos (por ejemplo cánceres de mama, pulmón, próstata y tiroides). La aparición de metástasis óseas osteolíticas provoca morbilidad grave debido a dolor intratable, alta susceptibilidad a fracturas, compresión nerviosa e hipercalcemia. A pesar de la importancia de estos problemas clínicos, hay pocos tratamientos disponibles para la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer.
Reabsorción ósea mediada por osteoclastos. Los osteoclastos son células multinucleadas que se diferencian de las células hematopoyéticas. Se acepta generalmente que los osteoclastos se forman por la fusión de precursores mononucleares derivados de células madre hematopoyéticas en la médula ósea, en lugar de divisiones celulares incompletas (Chambers, Bone y Mineral Research, 6: 1-25, 1989; Gothling et al., Clin Orthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn et al., Nature 258: 325-327, 1975, Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Walker, Science 180: 875, 1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190: 784-785, 1975). Comparten una célula madre común con las células del linaje de monocitos-macrófagos (Ash et al., Nature 283: 669-670, 1980, Kerby et al., J. Bone Miner Res 7: 353-62, 1992). La diferenciación de precursores de osteoclastos en osteoclastos multinucleados maduros requiere de diferentes factores incluyendo estímulos hormonales y locales (Athanasou et al., Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman et al., Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 190: 784785, 1975; Zheng et al., Histochem J 23: 180-188, 1991) y se ha demostrado que el hueso vivo y las células óseas juegan un papel crítico en el desarrollo de osteoclastos (Hagenaars et al., Bone Miner 6: 179-189, 1989). Las células osteoblásticas o estromales de médula ósea también se requieren para la diferenciación de osteoclastos. Uno de los factores producidos por estas células que sustenta la formación de osteoclastos es el factor es el factor estimulante de colonias de macrófagos, M-CSF (Wiktor-Jedrzejczak et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida et al., Nature 345: 442-444, 1990). El activador del receptor para el ligando NF-k (RANKL, también conocido como TRANCE, ODF y OPGL) es otra señal (Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992) a través de la que las células osteoblásticas/estromales estimulan la formación de osteoclastos y la resorción a través de un receptor, RANK (TRANCER), localizados en osteoclastos y precursores de osteoclastos (Lacey et al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et al., Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997; Wong et al., J Exp Med 186: 2075-2080, 1997; Wong et al., J Biol. Chem 272: 25190-25194, 1997; Yasuda et al., Endocrinology 139: 1329-1337, 1998; Yasuda et al., Proc Natl Acad Sci US 95: 3597-3602, 1998). Los osteoblastos también segregan una proteína que inhibe fuertemente la formación de osteoclastos llamada osteoprotegerina (OPG, también conocida como oClF), que actúa como un receptor señuelo para el RANKL inhibiendo así la señal positiva entre los osteoclastos y los osteoblastos a través del RANK y el RANKL.
Los osteoclastos son responsables de disolver tanto la matriz ósea mineral como la orgánica (Blair et al., J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986). Los osteoclastos representan células terminalmente diferenciadas que expresan una morfología polarizada única con áreas de membrana especializadas y varios marcadores de membrana y citoplásmicos, fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) (Anderson et al. 1979), anhidrasa carbónica II (Vaananen et al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), receptor de calcitonina (Warshafsky et al., Bone 6: 179-185, 1985) y receptor de vitronectina (Davies et al., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989). Los osteoclastos multinucleados habitualmente contienen menos de 10 núcleos, pero pueden contener hasta 100 núcleos siendo de entre 10 y 100 |jm de diámetro (Gothling et al., Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976). Esto los hace relativamente fácil de identificar por microscopía de luz. Son muy vacuolados cuando están en estado activo, y también contienen muchas mitocondrias, indicativo de una tasa metabólica alta (Mundy, in Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, páginas 18-22, 1990). Como los osteoclastos juegan un papel principal en las metástasis óseas osteolíticas, hay una necesidad en la técnica para nuevos agentes y métodos para evitar la estimulación y función de los osteoclastos.
Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica para identificar nuevos agentes y métodos para evitar o tratar osteolisis o metástasis del cáncer, incluyendo metástasis de hueso osteolítica.
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SUMARIO DE LA INVENCION
Los materiales y métodos de la presente invención cumplen las necesidades anteriormente mencionadas y otras relacionadas en la técnica. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que comprende
(i) una cadena pesada que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:116, y
(ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera expuesta en la
SEQ ID NO: 53.
y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente adecuado, en done la composición es un polvo adecuado para su reconstitución con una solución apropiada.
La invención también proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta, en donde el recipiente se selecciona de una botella, vial, jeringuilla y tubo de ensasyo y el recipiente contiene una composición que comprende un anticuerpo que comprende
(i) una cadena pesada que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:116, y
(ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera expuesta en la
SEQ ID NO: 53.
La invención también proporciona una composición farmacéutica o un artículo de fabricación de la invención, para su uso en terapia.
En la presente se divulga un anticuerpo monoclonal no murino, incluyendo el fragmento funcional, que enlaza específicamente con el mismo epítopo de M-CSF que cualquiera de los anticuerpos monoclonales murinos RX1, MC1 o MC3 que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las Figuras 4, 14 y 15, respectivamente. Se divulga un anticuerpo anteriormente mencionado en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal incluyendo un anticuerpo Human Engineered™; un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2; Fv; Sc Fv o SCA; un diacuerpo; anticuerpo lineal; o una muteína de cualquiera de estos anticuerpos, que preferiblemente retienen una afinidad de enlace de por lo menos 10-7, 10-8 o 10-9 o más alta. También se contempla un anticuerpo monoclonal no murino, incluyendo el fragmento funcional, que compite con el anticuerpo monoclonal RX1, MC1 y/o MC3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4 para enlazar con M-CSF por más del 75%.
Se divulga un anticuerpo monoclonal no murino, incluyendo el fragmento funcional, en donde dicho anticuerpo monoclonal no murino o fragmento funcional del mismo enlaza con un epítopo de M-CSF que incluye al menos 4, 5, 6, 7 u 8 residuos contiguos de los aminoácidos 98-105 de la Figura 12.
También se divulga en la presente un anticuerpo monoclonal no murino, incluyendo el fragmento funcional, en donde dicho anticuerpo monoclonal no murino o fragmento funcional del mismo enlaza con un epítopo de M-CSF que incluye al menos 4, 5, 6, 7 u 8 residuos contiguos de los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (correspondientes a los epítopos de M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3).
Se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado o fragmento que enlaza con un epítopo de M-CSF que incluye los aminoácidos 98-105 de la Figura 12. También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado que comprende el CDR3 de la Figura 4A. El anticuerpo puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDRs de anticuerpo murino RX1 expuesto en la Figura 4A. Dicho anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDRs de anticuerpo murino RX1 puede comprender también al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 CDRs de los CDRs del anticuerpo 5H4 expuesto en la Figura 16A-B. Alternativamente, el anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 CDRs del anticuerpo murino RX1 puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 CDRs de cualquiera de los 6 CDRs del anticuerpo MC1 expuesto en la Figura 16A-B. El anticuerpo que comprende al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 CDRs del anticuerpo murino RX1 puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 CDRs de los CDRs de consenso expuestos en la Figura 16A-B. En el anticuerpo anteriormente mencionado uno o más residuos de los CDR(s) de consenso puede ser sustituido por el residuo correspondiente de cualquiera de los CDRs del anticuerpo murino RX1, 5H4, MC1 o MC3. La afinidad de enlace deseada puede retenerse aunque uno o más de los aminoácidos en el anticuerpo haya mutado, por ejemplo, por sustituciones conservadoras en los CDRs, y/o cambios conservadores o no conservadores en los residuos de riesgo bajo y moderado.
También se divulgan en la presente variantes del anticuerpo anteriormente mencionado, que comprenden una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% homóloga con la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 4a, 13, 14 ó 15. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% homóloga con la secuencia de aminoácidos expuesta en las Figuras 4A, 13, 14 ó 15.
El anticuerpo puede comprender una región constante y una o más regiones marco variables de la cadena
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pesada y ligera de una secuencia de anticuerpos humana. El anticuerpo puede comprender una región constante modificada o no modificada de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. Preferiblemente, la región constante es IgG1 o IgG4 humana, que puede opcionalmente ser modificada para aumentar o disminuir ciertas propiedades. En el caso de la IgG1, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra o CH2, pueden aumentar o disminuir la función efectora, incluyendo la actividad de ADCC y/o CDC. Una región constante de IgG2 puede modificarse para disminuir la formación de agregados anticuerpo-antígeno. En el caso de la IgG4, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra, pueden reducir la formación de anticuerpos medios.
El anticuerpo anteriormente mencionado puede derivarse de, basarse en o contener parte de una secuencia de consenso humana, secuencia germinal humana, secuencia germinal de consenso humana o cualquiera de las secuencias de anticuerpos humanas en Kabat, NCBI Ig Blast,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi, Kabat Database
http://www.bioinf. org.uk/abs/seqtest.html, FTP site for Kabat Release 5.0 (1992)
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier Francia)
http://imgt.cnusc.fr:8104/, V-Base
http://www.mrccpe. cam.ac.uk/LIST.php?menu=901, Zurich University
http://www.unizh.ch/~antibody/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP)
http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains
http://how.to/AnalyseAntibodies/, Humanization by design
http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/, Antibody Resources
http://www.antibodyresource.com/educational.html, Antibody Engineering (by TT Wu), Humana Press.
En un aspecto preferido de la invención, el anticuerpo anteriormente mencionado es un anticuerpo Human Engineered™. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpos Human Engineered™ es cualquiera de las secuencias expuestas en las figuras 23-24. Se contemplan otros anticuerpos Human Engineered™ o variantes de los mismos.
Por ejemplo, se divulga el anticuerpo basado en RX1 anteriormente mencionado, en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos X1VX2LX3EX4GX5X6X7X8X9X10X11X12X13LX14LX15CX16VX17DYSITSDYAWNWIX18QX19X20X21X22X23LX24WMGYISYSG STSX25NX26X27LX28X29X30IX31IX32RX33X34X35X36X37X38FX39LX40LX41X42VX43X44X45DX46AX47YYCASFDYAHAMDYW GX48GTX49VX50VX51 X52 (SEQ ID NO: 124), en el que X es cualquier aminoácido. Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos DVX1LX2EX3GPX4X5VX6PX7X8X9LX10LX11CX12VTDYSITSDYAWNWIRQX13PX14X15KLEWMGYISYSGSTSYNPSLKX 16RIX17IX18RX19TX20X21NX22FX23LX24LX25X26VX27X28X29DX30ATYYCASFDYAHAMDYWGX31GTX32VX33-VX34X35 (SEQ ID NO: 125), en el que X es cualquier aminoácido.
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado, en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos
X1VQLQESGPGLVKPSQX2LSLTCTVX3DYSITSDYAWNWIRQFPGX4X5LEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRIX6IX7RDT SKNQFX8LQLNSVTX9X10DTAX11YYCASFDYAHAMDY WGQGTX12VTVSS (SEQ ID NO: 126), en el que X es cualquier aminoácido. Se divulga el anticuerpo, en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos DVQLQESGPGLVKPSQX1LSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGX2KLEWMGYISYSG STSYNPSLKSRIX3IX4RDTSKNQFX5LQLNSVTX6X7DTATYYCASFDYAHAMDYWGQ GTX8VTVSS (SEQ ID NO:
127), en la que X es cualquier aminoácido. Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQ FSLQLNSVTAADTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTTV TVSS (SEQ ID NO: 41). La cadena pesada del anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDYSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQ FSLQLNSVTAADTAVYYCASFDYAHAMDYWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO: 43).
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos
X1IX2LX3QX4X5X6X7X8X9VX10X11X12X13X14VX15FX16CX17AX18QSIGTSIHWYX19QX20X21X22X23X24PX25LUKYASEX26X2 7X28X29IX30X31X32FX33GX34GX35GX36X37FX38LX39IX40X41VX42X43X44DX45ADYYCQQINSWPTTFGX46GTX47LX48X49X50 X51X52 (SEQ ID NO: 128), en la que X es cualquier aminoácido. Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos X1X2LX3QX4PX5X6LX7VX8- PX9X10X11VX12FX13CX14ASQSIGTSIHWYQQX15TX16X17SPRLLIKYASEX18ISX19IPX20RFX21GX22GX23GX24X25FX26LX 27IX28X29VX30X31X32DX33ADYYCQQINSWPTTFGX34GTX35LX36X37X38X39X40 (SEQ ID NO: 129), en la que X es cualquier aminoácido. Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos X1IX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8X9PRLLIKYASEX 10X11X12GIPX13RFSGSGSGTDFTLX14IX15X16VESEDX17ADYYCQQINSWPTTFGX18GT KLEIKRX19 (SEQ ID NO:
130), en la que X es cualquier aminoácido.
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos
X1IX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8SPRLLIKYASEX9ISGIPX10RFSGSGSGTDFTLX
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11IX12X13VESEDX14ADYYCQQINSWPTTFGX15GTKLEIKRX16 (SEQ ID NO: 131), en la que X es cualquier secuencia de aminoácidos. Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos X1IX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8X9PRLLIKYASESI SGIPX10RFSGSGSGTDFTLX11X12X13VESEDX14ADYYCQQINSWPTTFGX15GTKLEIK RX16 (SEQ ID NO: 132), en la que X es cualquier aminoácido. Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASESISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 45).
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos
EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASERATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVE SEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 47). Se divulga el anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos
EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQSPRLLIKYASERISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVES EDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO: 48).
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado en el que al menos una X es un aminoácido correspondiente dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A. Se divulga el anticuerpo en el que al menos una X es una sustitución conservadora (de acuerdo con la Tabla 1) de un aminoácido correspondiente dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A. También se divulga en la presente el anticuerpo en el que al menos una X es una sustitución no conservadora (de acuerdo con la Tabla 1) de un aminoácido correspondiente dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A. También se divulga en la presente el anticuerpo en el que al menos una X es un aminoácido correspondiente dentro de una secuencia de anticuerpos humana.
El anticuerpo Human Engineered™ anteriormente mencionado se deriva de, se basa en o contiene parte de la secuencia de consenso de anticuerpos humana, secuencia germinal humana, secuencia germinal de consenso humana o cualquiera de las secuencias de anticuerpos humanas en Kabat, NCBI Ig Blast,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi, Kabat Database
http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html, FTP site for Kabat Release 5.0 (1992)
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier France)
http://imgt.cnusc.fr:8104/, V-Base
http://www.mrccpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=901, Zurich University
http://www.unizh.ch/~antibody/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP)
http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains
http://how.to/AnalyseAntibodies/, Humanization by design
http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/, Antibody Resources
http://www.antibodyresource. com/educational.html, Antibody Engineering (by TT Wu), Humana Press.
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado en donde la secuencia del anticuerpo Human Engineered™ es una de las secuencias expuestas en las Figuras 23-24 ó 29-30. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada expuestas en la Figura 19B. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera expuestas en cualquiera de las Figuras 20B-22B.
El anticuerpo anteriormente mencionado, como el anticuerpo 5H4, MC1 o MC3 con las secuencias expuestas en una de las Figuras 24C-24E puede ser Human Engineered de acuerdo con los métodos expuestos en Studnicka et al., Patente U.S: N° 5.766.886 y el Ejemplo 4A en la presente, usando la numeración de Kabat expuesta en las Figuras 24C-224E para identificar residuos de riesgo bajo, moderado y alto. Se divulga el anticuerpo anteriormente mencionado en el que todos los residuos de riesgo bajo de o su cadena pesada o ligera o ambos son modificados, donde sea necesario, para ser los mismos residuos que los de una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana. También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado en el que todos los residuos de riesgo bajo + moderado de o la cadena pesada o la ligera o ambos son modificados, donde sea necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana. Una cadena pesada en la que todos los residuos de riesgo bajo han sido modificados puede combinarse con una cadena ligera en la que todos los residuos de riesgo bajo y moderado han sido modificados y viceversa. DE manera similar una cadena ligera o pesada Human Engineered™ anteriormente mencionada puede combinarse con una cadena ligera o pesada de un anticuerpo humanizado o quimérico.
EL anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% idéntica a una de las secuencias de
aminoácidos de la cadena pesada Human Engineered™ descrita inmediatamente antes de acuerdo con el método
de Studnicka. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% idéntica a una de las secuencias de
aminoácidos de la cadena ligera Human Engineered™ descritas inmediatamente antes de acuerdo con el método de
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Studnicka.
También se divulga en la presente un anticuerpo que comprende una cadena pesada como se expone con anterioridad y una cadena ligera como se expone con anterioridad.
El anticuerpo anteriormente mencionado puede tener una afinidad Kd de al menso 10[-7]. El anticuerpo puede tener una afinidad Kd de al menos 10[-9].
También se divulga en la presente el anticuerpo anteriormente mencionado que es un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal que incluye un anticuerpo Human Engineered™; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; fragmento de anticuerpo Fab, (Fab')2, Fv, ScFv o SCA; un diacuerpo; un anticuerpo lineal; o una muteína de cualquiera de estos anticuerpos. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo aislado.
También se divulga en la presente un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una cadena ligera del anticuerpo anteriormente mencionado. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos de la cadena pesada que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada expuesta en las Figuras 4A, 13, 14 ó 15. El ácido nucleico aislado puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos de la cadena ligera que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera expuesta en las Figuras 4A, 13, 14 ó 15.
También se divulga un vector que comprende el ácido nucleico aislado anteriormente mencionado. También se divulga en la presente el vector anteriormente mencionado en el que el ácido nucleico aislado está ligado operativamente a una secuencia de control reguladora. También se divulga en la presente una célula huésped que comprende el vector anteriormente mencionado.
Se contemplan numerosos métodos. Por ejemplo, se divulga un método para producir un anticuerpo anteriormente mencionado que comprende cultivar la célula huésped anteriormente mencionada de tal manera que se expresa el ácido nucleico aislado para producir el anticuerpo. El método puede comprender adicionalmente el paso de recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped. Se divulga un anticuerpo aislado producido por el método anteriormente mencionado.
También se divulga en la presente un hibridoma que secreta un anticuerpo anteriormente mencionado. Adicionalmente, se divulga un anticuerpo anteriormente mencionado que está conjugado con una toxina.
También se divulga en la presente una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un segundo agente terapéutico. También se divulga en la presente una composición farmacéutica en la que el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico del cáncer. También se divulga en la presente una composición farmacéutica en la que el segundo agente terapéutico es un bifosfonato. El segundo agente terapéutico puede ser otro anticuerpo.
La invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en aplicaciones terapéuticas que implican la administración in vivo a un humano.
Se contempla que los anticuerpos de la presente invención tengan numerosas características deseables para el tratamiento de enfermedades o trastornos. También se proporcionan los anticuerpos de la invención para su uso en la prevención de un sujeto afectado con una enfermedad que cause o contribuya a la osteolisis, en los que el anticuerpo reduce efectivamente la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad. De manera similar, también se proporcionan en la presente los anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto afectado con una enfermedad que cause o contribuya a la osteolisis, en el que dicho anticuerpo reduce efectivamente la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad.
Se contempla que numerosas enfermedades y trastornos sean sensibles al tratamiento basado en anticuerpos en la presente invención. Se puede proporcionar el anticuerpo de la invención en el que dicha enfermedad se selecciona del grupo consistente de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad de los osteoclastos relativamente aumentada, incluyendo endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (raquitismo/osteomalacia, escorbuto, malnutrición), enfermedades crónicas (síndromes de malabsorción, insuficiencia renal crónica (osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (osteodistrofia hepática)), fármacos (glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol), y enfermedades hereditarias (osteogénesis imperfecta, homocistinuria), cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con la artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa, y/o enfermedad de Paget.
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Se proporciona la composición farmacéutica o artículo de fabricación de la invención para su uso en prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso, en el que el cáncer metastásico es cáncer de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, tumores malignos de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer del conducto biliar o la vesícula biliar; tumores malignos del tracto genital femenino, incluyendo el carcinoma de ovario, cáncer de endometrio uterino, cáncer vaginal, y el cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas.
También se divulga en la presente un método para cribar un anticuerpo específico de M-CSF que comprende los pasos de poner en contacto un medio de células tumorales metastásicas, osteoclastos y un anticuerpo candidato; detectar la formación, proliferación y/o diferenciación de osteoclastos; e identificar dicho anticuerpo candidato como un anticuerpo específico de M-CSF si se detecta una disminución en la formación, proliferación y/o diferenciación de osteoclastos. De manera similar, se divulga el método anteriormente mencionado en el que dicho medio de células tumorales metastásicas incluye células tumorales.
Se divulga el método anteriormente mencionado en el que el paso de contacto (a) tiene lugar en vivo, dicho paso de detección (b) comprende detectar el tamaño y/o número de metástasis óseas, y el anticuerpo candidato se identifica como un anticuerpo específico de M-CSF si se detecta una disminución en el tamaño y/o número de metástasis óseas. También se divulga en la presente el método anteriormente mencionado que comprende además el paso de determinar si el anticuerpo candidato enlaza con el M-CSF. De manera similar, también se divulga en la presente el método anteriormente mencionado que comprende además el paso de determinar si el anticuerpo candidato inhibe la interacción entre el M-CSF y su receptor M-CSFR.
También se divulga en la presente un método para identificar un anticuerpo específico de M-CSF que puede prevenir o tratar el cáncer metastásico al hueso, que comprende los pasos de: (a) detectar el enlace de un anticuerpo candidato a un epítopo de M-CSF que incluye al menos 4 residuos contiguos de los aminoácidos 98-105 de la Figura 12; y (b) ensayar la capacidad de dicho anticuerpo candidato para prevenir o tratar el cáncer metastásico al hueso in vitro o in vivo.
También se divulga en la presente un método para identificar un anticuerpo específico de M-CSF que puede prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso, que comprende los pasos de: (a) detectar el enlace de un anticuerpo candidato a un epítopo de M-CSF que incluye al menos 4 residuos contiguos de los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (correspondientes a los epítopos M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3); y (b) ensayar la capacidad de dicho anticuerpo candidato para prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso in vitro o in vivo.
También se divulga en la presente un método para alterar un CDR de un anticuerpo que enlaza con un epítopo de M-CSF que incluye los aminoácidos 98-105 de la Figura 12 que comprende alterar un aminoácido dentro de un CDR de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4A y seleccionar un anticuerpo que enlace con M- CSF con una afinidad Ka de al menos 10[-7]. Se divulga un método para alterar sistemáticamente hasta el 60% de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada expuesta en la Figura 4A que comprende alterar cualquiera de X1- X52 en la secuencia de aminoácidos X1VX2LX3EX4GX5X6X7X8X9X10X11X12X13LX14LX15CX16VX17-
DYSITSDYAWNWIX18QX19X20X21X22X23LX24WMGYISYSGSTSX25NX26X27LX28X29X30IX31IX32RX33X34X35X36X37X38FX3 9LX40LX41X42VX43-X44X45DX46AX47YYCASFDYAHAMDYWGX48GTX49VX50VX51 X52 (SEQ ID NO: 133), y probar un anticuerpo que comprenda la secuencia de aminoácidos alterada para el enlace con un epítopo de M-CSF que incluya los aminoácidos 98-105 de la Figura 12.
Se divulga un método para alterar sistemáticamente hasta un 60% de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera expuesta en la Figura 4A que comprende alterar cualquiera de X1-X52 en la secuencia de aminoácidos X1IX2LX3QX4X5X6X7X8X9VX10X11X12-X13X14VX15FX16CX17AX18QSIGTSIHWYX19QX20X
21X22X23X24PX25LLIKYASEX26X27X28X29IX30X31X32FX33GX34-GX35GX36X37FX38LX39X40X41VX42X43X44DX45 ADYYCQQINSWPTTFGX46GTX47LX48X49X50X51X52 (SEQ ID NO: 134), y probar un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos alterada para el enlace con un epítopo de M-CSF que incluya las secuencias de aminoácidos 98-105 de la Figura 12.
También se divulga en la presente un método para alterar un CDR de un anticuerpo que enlace con un epítopo de M-CSF que incluye los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (correspondientes a epítopos de M- CSF reconocidos por 5H4 y MC3) que comprende alterar un aminoácido dentro de un CDR de la secuencia de aminoácidos expuesta en una de las Figuras 13, 14 y 15 y seleccionar un anticuerpo que enlace con M-CSF con una afinidad Ka de al menos 10[-7]. Se divulga un método para alterar sistemáticamente hasta un 60% de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada expuesta en una de las Figuras 13, 14 y 15, que comprende alterar las secuencias anteriormente mencionadas de acuerdo con los métodos expuestos en Studnicka et al., Patente U.S. N° 5.766.886 y el Ejemplo 4A en la presente, y de acuerdo con la numeración de Kabal expuesta en las Figuras 24C- 24E, y probar un anticuerpo que comprenda la secuencia de aminoácidos alterada para su enlace con un epítopo de
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M-CSF que incluya los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (correspondientes a los epítopos de M-CSF reconocidos por 5H4 y MC3). Se pueden modificar todos los residuos de riesgo bajo. De manera similar, pueden modificarse todos los residuos de riesgo bajo y moderado, o se pueden modificar todos los residuos de riesgo bajo y moderado excluyendo las prolinas.
También se divulga en la presente un método para expresar un anticuerpo que tiene CDRs diseñados por el proceso anteriormente mencionado. Se divulga una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que enlaza con MCSF en la que dicho anticuerpo se hace usando el método anteriormente mencionado.
También se divulga en la presente un método para prevenir o reducir la pérdida ósea que comprende administrar a un sujeto afectado con una enfermedad que causa o contribuye a la osteolisis una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados, previniendo o reduciendo de esta manera la pérdida ósea asociada con la enfermedad. La invención proporciona la composición farmacéutica o el artículo de fabricación de la invención para su uso para prevenir o tratar a un sujeto afectado con una enfermedad que causa o contribuye a la osteolisis, en el que dicho anticuerpo reduce efectivamente la severidad de la pérdida ósea asociada con la enfermedad.
Se proporciona el uso anteriormente mencionado en el que dicha enfermedad se selecciona de enfermedades metabólicas asociadas con actividad de osteoclastos relativamente aumentada, incluyendo endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (raquitismo/osteomalacia, escorbuto, malnutrición), enfermedades crónicas (síndromes de malabsorción, insuficiencia renal crónica (osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (osteodistrofia hepática)), fármacos (glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol), y enfermedades hereditarias (osteogénesis imperfecta, homocistinuria), cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con la artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa, y/o enfermedad de Paget.
La invención proporciona una composición farmacéutica o artículo de fabricación de la invención para su uso en prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados a un sujeto afectado con cáncer metastásico. El cáncer metastásico puede ser de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, tumores malignos de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer del conducto biliar o la vesícula biliar; tumores malignos del tracto genital femenino, incluyendo el carcinoma de ovario, cáncer de endometrio uterino, cáncer vaginal, y el cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas.
Se divulga un método para prevenir la pérdida ósea y el crecimiento tumoral que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo cantidades terapéuticamente efectivas de cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados. El método puede además comprender administrar un segundo agente terapéutico. También se divulga en la presente el método en el que el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico del cáncer. También se divulga en la presente el método en el que el bifosfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato. También se divulgan en la presente los métodos anteriormente mencionados en los que el agente terapéutico es un agente terapéutico citotóxico. También se divulga en la presente el método anteriormente mencionado en el que el sujeto está imposibilitado para recibir tratamiento de bifosfonato.
Se divulga el método anteriormente mencionado en el que el anticuerpo es efectivo para reducir la dosificación del segundo agente terapéutico requerido para lograr un efecto terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser un factor de estimulación de colonias no M-CSF, por ejemplo G-CSF, o anticuerpo anti- RANKL, o receptor de RANKL soluble.
También se divulgan en la presente los métodos anteriormente mencionados en los que el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un humano.
Se divulgan en la presente los métodos anteriormente mencionados en los que el anticuerpo inhibe la interacción entre el M-CSF y su receptor (M-CSFR). El anticuerpo puede inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células tumorales. se divulgan los métodos anteriormente mencionados en los que el anticuerpo se administra a una dosis de entre alrededor de 2 pg/kg a 30 mg/kg, 0,1 mg/kg a 30 mg/kg o 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
Se contempla el uso de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la pérdida ósea en un paciente que muestra síntomas de osteolisis, y en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente afectado con una enfermedad que causa o contribuye a la osteolisis. Se contempla además
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el uso anteriormente mencionado en el que la enfermedad es seleccionada del grupo consistente de enfermedades metabólicas asociadas con actividad de osteoclastos relativamente aumentada, incluyendo endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismo/osteomalacia, escorbuto, malnutrición), enfermedades crónicas (incluyendo síndromes de malabsorción, insuficiencia renal crónica (osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática)), fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol), y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria), cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con la artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa, y/o enfermedad de Paget.
Se contempla el uso de un anticuerpo divulgado en la presente en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso en un paciente que sufre de cáncer metastásico. El cáncer metastásico puede ser de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, tumores malignos de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer del conducto biliar o la vesícula biliar; tumores malignos del tracto genital femenino, incluyendo el carcinoma de ovario, cáncer de endometrio uterino, cáncer vaginal, y el cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas.
Se contempla el uso de un anticuerpo divulgado en la presente en la fabricación de un medicamento para tratar un paciente que tiene cáncer.
En cualquiera de los usos anteriormente mencionados, el medicamento puede coordinarse con tratamiento que usa un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico del cáncer. El segundo agente terapéutico puede ser un factor de estimulación de colonias no M-CSF, o anticuerpo anti- RANKL o receptor de RANKL soluble, o un bifosfonato. El bifonato puede ser zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato.
Se contempla cualquiera de los usos anteriormente mencionados en el que el paciente está imposibilitado para recibir tratamiento de bifosfonato, y/o en el que el paciente ha sido pretratado con el segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico del cáncer, un factor de estimulación de colonias no M-CSF, o anticuerpo anti-RANKL o receptor de RANKL soluble, o un bifosfonato. El bifonato puede ser zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato. El paciente puede estar imposibilitado para recibir tratamiento de bifosfonato.
También se contempla en la presente el uso de una combinación sinérgica de un anticuerpo de la invención para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que muestra síntomas de osteolisis en el que el medicamento se coordina con el tratamiento usando un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico del cáncer, un factor de estimulación de colonias no M-CSF, o anticuerpo anti-RANKL o receptor de RANKL soluble, o un bifosfonato. El bifonato puede ser zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato. El paciente puede estar imposibilitado para recibir tratamiento de bifosfonato.
Se contemplan los usos anteriormente mencionados en los que la cantidad de anticuerpo en el medicamento es a una dosis efectiva para reducir la dosificación del segundo agente terapéutico requerido para lograr un efecto terapéutico. En cualquiera de los usos anteriormente mencionados relativos a la pérdida ósea asociada con cáncer, la cantidad de anticuerpo en el medicamente es preferiblemente efectiva para inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células tumorales.
La cantidad de anticuerpo en cualquiera de los medicamentos anteriormente mencionados puede ser a una dosis de entre alrededor de 2 pg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. La cantidad de anticuerpo en el medicamento puede ser a una dosis de entre alrededor de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. La cantidad de anticuerpo en el medicamento puede ser a una dosis de entre alrededor de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
También se contemplan kits en esta divulgación. Se divulga un kit que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la divulgación, envasado en un contenedor, como un frasco o una botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el contenedor, la etiqueta describe los contenidos del contenedor y proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso de los contenidos del contenedor para prevenir o reducir la pérdida ósea.
Se divulga un kit que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la divulgación, envasado en un contenedor, como un frasco o una botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el contenedor, la etiqueta describe los contenidos del contenedor y proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso de los contenidos del contenedor a un paciente con una enfermedad que causa o
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contribuye a la osteolisis.
Se divulga el kit en el que dicha enfermedad es seleccionada del grupo consistente de enfermedades metabólicas óseas con actividad de osteoclastos relativamente aumentada, incluyendo endocrinopatías (hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismo/osteomalacia, escorbuto, malnutrición), enfermedades crónicas (incluyendo síndromes de malabsorción, insuficiencia renal crónica (osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (incluyendo osteodistrofia hepática)), fármacos (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol), y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria), cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de hueso asociada con la artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa, y/o enfermedad de Paget.
Se divulga un kit que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la divulgación, envasado en un contenedor, como un frasco o una botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el contenedor, la etiqueta describe los contenidos del contenedor y proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso de los contenidos del contenedor para prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso. El cáncer metastásico puede ser de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, tumores malignos de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer del conducto biliar o la vesícula biliar; tumores malignos del tracto genital femenino, incluyendo el carcinoma de ovario, cáncer de endometrio uterino, cáncer vaginal, y el cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas.
Se divulga un kit que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la divulgación, envasado en un contenedor, como un frasco o una botella, y que comprende además una etiqueta unida a o envasada con el contenedor, la etiqueta describe los contenidos del contenedor y proporciona indicaciones y/o instrucciones referentes al uso de los contenidos del contenedor para tratar cáncer.
El kit puede comprender además un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico del cáncer, un factor de estimulación de colonias no M-CSF, o anticuerpo anti-RANKL o receptor de RANKL soluble, o un bifosfonato. El bifonato puede ser zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato. El kit puede incluir instrucciones para tratar a un paciente imposibilitado de recibir tratamiento de bifosfonato.
El kit anteriormente mencionado puede comprender una dosis de un anticuerpo efectiva para reducir la dosificación del segundo agente terapéutico requerido para lograr un efecto terapéutico. el kit puede comprender una dosis sinérgica del anticuerpo. el kit puede comprender una dosis de anticuerpo efectiva para inhibir la proliferación y/o diferenciación de osteoclastos inducida por células tumorales.
El kit anteriormente mencionado puede comprender una dosis de anticuerpo de entre alrededor de 2 pg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. El kit puede comprender una dosis de anticuerpo de entre alrededor de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg de peso corporal. El kit puede comprender una dosis de anticuerpo de entre alrededor de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
En una realización, el artículo de fabricación de la invención comprende un envase, frasco o contenedor que comprende uno o más de los anticuerpos anteriormente mencionados e instrucciones de que el medicamento debe ser usado en combinación con cirugía o terapia de irradiación. Se divulga un método para prevenir o tratar cáncer metastásico al hueso que comprende los pasos de administrar cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados a un sujeto y tratar al sujeto con cirugía y terapia de irradiación. Se divulga un método de apuntar a una célula tumoral que expresa M-CSf enlazada a la membrana en su superficie que comprende el paso de administrar cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados, en donde el anticuerpo se conjuga con un radionucleido u otra toxina. Se divulga un método para tratar a un sujeto que sufre de un cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados.
También se divulga en la presente un método para prevenir la pérdida ósea que comprende administrar a un sujeto afectado con una enfermedad que causa o contribuye a la osteolisis en una cantidad efectiva para neutralizar el M-CSF producido por las células del sujeto, la cantidad siendo mayor que la cantidad efectiva para neutralizar el M-CSF producido por las células cancerosas. La invención también proporciona el uso del anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente afectado con una enfermedad que causa o contribuye a la osteolisis. Se puede administrar cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados a dicho sujeto en una cantidad efectiva para neutralizar el M-CSF producido por las células del sujeto, la cantidad siendo mayor que la cantidad efectiva para neutralizar el M-CSF producido por las células cancerosas.
También se divulga en la presente una composición farmacéutica que comprende anticuerpo RX1, 5H4,
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MC1 y/o MC3, o un anticuerpo derivado de RX1, 5H4, MC1 y/o MC3 no murino o un anticuerpo competidor de RX1, 5H4, MC1 y/o MC3, y un agente terapéutico del cáncer. También se divulga en la presente un envase, frasco o contenedor que comprende un medicamente que comprende anticuerpo RX1, 5H4, MC1 y/o MC3, o un anticuerpo derivado de RX1, 5H4, MC1 y/o MC3 no murino o un anticuerpo competidor de RX1, 5H4, MC1 y/o MC3, e instrucciones de que el medicamento debe ser usado en combinación con cirugía o terapia de irradiación.
También se divulga en la presente un método para tratar a un sujeto que padece de un cáncer, en el que las células que comprenden el cáncer no segregan M-cSf, que comprende el paso de administrar cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un diagrama de topología que muestra los enlaces de disulfido en M-CSF dimérico truncado.
La Figura 2 es un estérodiagrama del esqueleto de C-alfa de M-CSF con cada décimo residuo marcado y con el eje de simetría no cristalográfico indicado con una línea de puntos.
La Figura 3 es una comparación de la actividad inductora de osteoclastos entre M-CSF purificada y medio acondicionado (CM) de células MDA 231 y células MCF7.
La Figura 4A muestra la secuencia de aminoácidos del anticuerpo RX1 murino específico de M-CSF (SEQ ID NOs: 2 y 4) (codificada por el inserto de ADNc del plásmido depositado con la American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, bajo el número de depósito ATCC PTA-6113) y una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente (SEQ ID NOs: 1 y 3). Las regiones del CDR se numeran y muestran en negrita.
Las Figuras 4B y 4C muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera (SEQ ID NO: 5) y pesada (SEQ ID NO:6), respectivamente, del anticuerpo RX! murino específico de M-CSF, con residuos de riesgo alto (negrita), riesgo moderado (subrayado) y riesgo bajo identificados de acuerdo con Studnicka et al., WO93/11794.
La Figura 5A muestra que los anticuerpos RX1 y 5A1 de M-CSF son específicos de la especie. La Figura 5B muestra la actividad de neutralización del M-CSF de los anticuerpos MC1 y MC3.
La Figura 6 muestra que el anticuerpo RX1 inhibe efectivamente la osteolisis en un modelo de xenoinjerto humano a una concentración de 5 mg/kg.
La Figura 7 muestra que el número de metástasis se reduce cuando se administra el anticuerpo RX1 a un cáncer de mama humano MDA-MB-231 que llevan ratones desnudos a una concentración de 5mg/kg.
La figura 8A y 8B muestra que un anticuerpo específico de M-CSF enlaza con la línea celular del cáncer de mama MDA-MB-231 o a la línea celular de cáncer de mieloma múltiple ARH77.
La Figura 9 muestra que el M-CSF es prevalente en una variedad de superficies de células de cáncer.
La Figura 10 es la secuencia de aminoácidos de M-CSFa (SEQ ID NO: 7).
La Figura 11 es la secuencia de aminoácidos de M-CSFp (SEQ ID NO: 8).
La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos de M-CSFy (SEQ ID NO: 9). Una variedad de polimorfismos en
la secuencia de ADN pueden resultar en diferencias de aminoácidos. Por ejemplo, una polimorfismo común
proporciona un Ala en lugar de un Pro en la posición 104.
Las Figuras 13, 14 y 15 muestran las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos 5H4 murinos específicos de MCSF (SEQ ID NOs: 10 y 11), MC1 (SEQ ID NOs: 12 y 13) (producidos por el hibridoma depositado bajo el número de depósito de la AtCc PTA-6263 ) y MC3 (SEQ ID NOs: 14 y 15) (producidos por el hibridoma depositado bajo el número de depósito de la ATCC PTA-6264), respectivamente.
Las Figuras 16A y B son un alineamiento de regiones de CDR de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos RX1; 5H4; MC1; y MC3 (SEQ ID NOs: 16-38) murinos específicos de M-CSF humanos.
La Figura 17 muestra las actividades de neutralización de fragmentos intactos frente a Fab para RX1 frente a 5H4.
La Figura 18 muestra la estructura de M-CSF con epítopos de RX1, 5H4 y MC3 resaltados (SEQ ID NOs:
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120, 122 y 123).
La Figura 19A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena pesada de RX1 murina (H=riesgo alto, M= riesgo moderado, L=riesgo bajo), (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de RX1 (SEQ ID NO: 6), (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de consenso humana más cercana, consenso Vh2 de Kabat, alineada con RX1 (SEQ ID NO: 39) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias Human Engineered™ de ejemplo (SEQ ID NOs: 41 y 43). La Figura 19B muestra las secuencias de aminoácidos de las dos secuencias Human Engineered™ de la cadena pesada ejemplares (SEQ ID NOs: 41 y 43), designadas de "riesgo bajo" y "riesgo bajo+moderado" así como las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes (SEQ ID NOs: 40 y 42).
La Figura 20A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena ligera de RX1 murino (H=riesgo alto, M= riesgo moderado, L=riesgo bajo), (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de RX1 (SEQ ID NO:5), (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de consenso humana más cercana, consenso Vk3 de Kabat, alineada con RX1 (SEQ ID NO:49) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias Human Engineered™ de ejemplo (SEQ ID NOs: 45 y 47). La Figura 20B muestra las secuencias de aminoácidos de las dos secuencias Human Engineered™ de la cadena ligera de ejemplo (SEQ ID NOs: 45 y 47), designadas de "riesgo bajo" y "riesgo bajo+moderado" así como las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes (SEQ ID NOs: 44 y 46).
La Figura 21A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena ligera de RX1 murino (H=riesgo alto, M= riesgo moderado, L=riesgo bajo), (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de RX1 (SEQ ID NO:5), (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de consenso humana más cercana, consenso Vk3 de Kabat, alineada con RX1 (SEQ ID NO:49) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias Human Engineered™ de ejemplo en las que las posiciones 54-56 no se cambiaron (es decir, permaneció la secuencia murina) (SEQ ID NO: 48). La Figura 21B muestra las secuencias de aminoácidos de las dos secuencias Human Engineered™ de la cadena ligera de ejemplo alternativas (SEQ ID NOs: 48, 136), así como las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes (SEQ ID NOs: 137 y 135).
La Figura 22A muestra (a) la línea de riesgo para la cadena ligera de RX1 murino (H=riesgo alto, M= riesgo moderado, L=riesgo bajo), (b) la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de RX1 (SEQ ID NO:5), (c) la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la línea germinal de consenso humana más cercana, Vk6 Subgrupo 2-1(1) A14, alineada con RX1 (SEQ ID NO:50) y (d) cambios que se hicieron para producir dos secuencias Human Engineered™ de ejemplo (SEQ ID NOs: 51 y 53). La Figura 22B muestra las secuencias de aminoácidos de las dos secuencias Human Engineered™ de la cadena ligera de ejemplo (SEQ ID NOs: 51 y 53), designadas de "riesgo bajo" y "riesgo bajo+moderado" así como la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente (SEQ ID NO: 52).
Las Figuras 23A y 23B muestran el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Rx1 murino (SEQ ID NO: 54) con varias secuencias de consenso humanas y consenso de línea germinal humanas usando el sistema de numeración de Kabat (numeración de aminoácidos indicada en la línea designada "POS") (SEQ ID NOs: 55-82).
Las Figuras 24A y 24B muestran el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de RX1 murino (SEQ ID NO: 83) con varias secuencias de consenso humanas y de la línea germinal humanas usando el sistema de numeración de Kabat (numeración de aminoácidos indicada en la línea designada "POS") (SEQ ID NOs: 84-112). Las Figuras 24C-24E muestran como los residuos de aminoácidos de los anticuerpos 5H4, MC1 y MC3 se corresponden con el sistema de numeración de Kabat (SEQ ID NOs: 10 y 11; SEQ ID NOs: 12 y 13; SEQ ID NOs: 14 y 15, respectivamente).
La Figura 25 muestra la neutralización comparativa de MCSF humano recombinante por el anticuerpo de RX1 murino recombinante marcado como rmRX1, y tres versiones de anticuerpo EX1-1 Human Engineered™ (en los que se han hecho todos los cambios de riesgo bajo) que tiene cada uno una región constante diferente (IgG1, IgG2 o IgG4), marcados como heRX1-1.G1, heRX1-1.G2 y heRX1-1.G4.
La Figura 26 muestra la neutralización comparativa de suero humano por anticuerpo RX1 murino recombinante, marcado como rmRX1 y varias versiones diferentes del heRX1-1 (en los que se han hecho todos los cambios de riesgo bajo) que tienen cada uno una región constante diferente (IgG1, IgG2 o IgG4), etiquetados como RX2, RX1-1-IgG2, RX1-1-IgG1, RX1-1-IgG1, RX1-1-IgG4, RX1-a-IgG4.
La Figura 27 muestra la neutralización comparativa del medio MDA231 (línea celular del cáncer de mama) por el anticuerpo RX! murino recombinante, rmRX1 y varias versiones diferentes del heRX11-1 (en el que se han hecho todos los cambios de riesgo bajo) que tienen cada uno una región constante diferente (IgG1, IgG2 o IgG4), etiquetados como RX2, RX1-1-IgG2, RX1-1-IgG1, RX1-1-IgG1, RX1-1-IgG4, RX1-a-IgG4.
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La Figura 28 muestra el efecto en la osteoclastogénesis (medida por actividad de TRAP) del anticuerpo RX1 murino recombinante, el rmRX1, y dos versiones diferentes del heRX1-1 que tienen cada una, una región constante diferente (Ig1 o IgG2), etiquetadas heRX1-1.IgG1 y heRX1-1.IgG2.
La Figura 29A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 114) y nucleótidos (SEQ ID NO: 113) para heRX1-1.IgG1 con cambios de aminoácidos de riesgo bajo. La Figura 29B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 116) y nucleótidos (SEQ ID nO: 115) para heRX1-10.IgG1 con cambios de aminoácidos de riesgo bajo + moderado.
La Figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 119) y nucleótidos (ADNc (SEQ ID NO: 118) y ADN genómico (SEQ ID NO: 117)) para heRX1-1.IgG4 con cambios de aminoácidos de riesgo bajo.
DESCRIPCION DETALLADA
La capacidad de hacer metástasis es una característica definitoria de un cáncer. La metástasis se refiere a la propagación de las células cancerosas a otras partes del cuerpo o a la condición producida por esta propagación. La metástasis es un proceso multi-etapa complejo que incluye cambios en el material genético de una célula, la proliferación descontrolada de la célula alterada para formar un tumor primario, el desarrollo de un nuevo suministro de sangre para el tumor primario, la invasión del sistema circulatorio por las células del tumor primario, la dispersión de pequeños grumos de células del tumor primario a otras partes del cuerpo y el crecimiento de tumores secundarios en esos sitios.
El hueso es uno de los sitios más comunes de metástasis en cánceres de mama, pulmón, próstata y tiroides humanos, así como otros cánceres, y en las autopsias se descubre tanto como el 60% de los pacientes con cáncer tienen metástasis ósea. La metástasis ósea osteolítica muestra un paso único de resorción ósea osteoclástica que no se ve en la metástasis a otros órganos. La pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer está mediada por los osteoclastos (células gigantes multinucleadas con la capacidad de reabsorber tejidos mineralizados), que parece se activan por productos del tumor.
Se ha descubierto que el factor de estimulación de colonias (CSF-1), también conocido como factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), es crucial para la formación de osteoclastos. Además, el M-CSF ha mostrado que modula las funciones osteoclásticas de los osteoclastos maduros, su migración y su supervivencia en cooperación con otros factores solubles e interacciones célula a célula proporcionadas por osteoblastos y fibroblastos (Fixe and Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin et al., Critical Rev. in Eukaryotic Gene Expression 8: 107-23 (1998)).
El ARNm de M-CSF humano de longitud completa codifica una proteína precursora de 554 aminoácidos. A través de empalme de ARNm alternativo y procesamiento proteolítico post-translacional diferencial, el M-CSF puede ser o secretado en la circulación como una glicoproteína o sulfato de condroitina que contiene proteoglicano o ser expresado como una glicoproteína que abarca la membrana en la superficie de células productoras de M-CSF. La estructura tridimensional de los 150 aminoácidos terminales amino expresados bacterialmente del M-CSF humano, la secuencia mínima requerida para la actividad biológica in vitro completa, indica que esta proteína es un dímero ligado a un disulfuro con cada monómero consistiendo de cuatro haces helicoidales alfa y una lámina beta antiparalela (Pandit et al., Science 258: 1358-62 (1992)). Se producen tres especies de M-CSF distintas a través de empalme de ARNm alternativo. Los tres precursores de polipéptidos son M-CFSa de 256 aminoácidos, M-CSFp de 554 aminoácidos, y M-CSFy de 438 aminoácidos. El M-CSFp es una proteína secretada que no tiene lugar en una forma enlazada a la membrana. El M-CFSa se expresa como una proteína de membrana integral que se libera lentamente por escisión proteolítica. El M-CFSa se escinde en los aminoácidos 191-197 de la secuencia expuesta en la Figura 10. La forma enlazada a la membrana del M-CSF puede interactuar con receptores o células cercanas y por lo tanto media los contactos célula a célula específicos. El término "M-CSF" puede también incluir los aminoácidos 36-438 de la Figura 12.
Varias formas de M-CSF funcionan enlazando con su receptor M-CSFR en células objetivo. El M-CSFR es una molécula que abarca la membrana con cinco dominios tipo inmunoglobulina extracelulares, un dominio de transmembrana y un dominio de tirosina quinasa relacionado con Src interrumpido extracelular. El M-CSFR está codificado por el proto-oncogén c-fms. El enlace del M-CSF con el dominio extracelular de M-CSFR lleva a la dimerización del receptor, que activa el dominio de quinasa citoplásmico, llevando a la autofosfotilación y la fosforilación de otras proteínas celulares (Hamilton J. A., J Leukoc Biol.,62(2):145-55 (1997); Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7): 313-7(1997).
Las proteínas celulares fosforiladas incluyen una cascada de eventos bioquímicos que llevan a respuestas celulares: mitosis, secreción de citoquinas, agitación de membrana y regulación de la transcripción de su propio receptor (Fixe and Praloran, Cytokine 10: 32-37 (1998)).
El M-CSF se expresa en células del estroma, osteoblastos y otros sitios. También se expresa en células de
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tumores de mama, uterino y de ovario. La extensión de la expresión en estos tumores se correlaciona con el grado alto y pronóstico pobre (Kacinski Ann. Med. 27: 79-85 (1995); Smith et al., Clin. Cancer Res. 1: 313-25 (1995)). En los carcinomas de mama, la expresión de M-CSF es prevalente en células tumorales invasivas en oposición al cáncer intraductal (pre-invasivo) (Scholl et al., J. Natl. Cancer Inst. 86: 120-6 (1994)). Además, se muestra que el M- CSF promueve la progresión de los tumores mamarios a tumores malignos (Lin et al., J. Exp. Med. 93: 727-39 (2001)). Para el cáncer de mama y ovarios, la producción de M-CSF parece ser responsable del reclutamiento de macrófagos al tumor.
Como se muestra en la presente, un anticuerpo específico de M-CSF como el anticuerpo RX1, 5H4, MC1 o MC3, neutraliza la inducción de osteoclastos por células cancerígenas metastásicas y/o reduce la metástasis al hueso en modelos animales de cáncer. Por lo tanto, se divulgan en la presente composiciones y métodos para tratar o prevenir cáncer, metástasis de cáncer y pérdida ósea asociadas con metástasis de cáncer.
Se modificó un anticuerpo murino RX1 anti-M-CSF preferido para ser menos inmunogénico en humanos en base al método Human Engineering™ de Studnicka et al. Preferiblemente, se modificaron de 8 a12 residuos de aminoácidos expuestos de superficie de la región variable de la cadena pesada y de 16 a 19 residuos expuestos de superficie en la región de la cadena ligera a residuos humanos en posiciones que se determinó que no era probable que afectaran adversamente o el enlace con antígenos o el plegado de proteínas, a la vez que reduce su inmunogenicidad respecto a un ambiente humano. Se construyeron genes sintéticos que contienen regiones variables de la cadena pesada y/o ligera modificadas y se ligaron a las regiones constantes y de la cadena pesada y/o kappa de la cadena ligera. Cualquier región constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana puede usarse en combinación con las regiones variables del anticuerpo Human Engineered™. Los genes de la cadena pesada y ligera humana se introdujeron en células mamíferas y se obtuvieron y caracterizaron los productos de inmunoglobulina recombinantes resultantes. Otros anticuerpos anti-M-CSF de ejemplo como el 5H4, MC1 o MC3 son de manera similar Human Engineered™.
El término "anticuerpo derivado de RX 1" incluye cualquiera de los siguientes:
1) una variante de aminoácidos del anticuerpo RX1 murino que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4, incluyendo variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% homóloga con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4, y/o que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% homóloga con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4, teniendo en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología;
2) Polipéptidos que enlazan con el M-CSF (excluyendo el anticuerpo RX1 murino) que comprenden una o más regiones determinantes complementarias (CDRs) del anticuerpo RX1 murino que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4, preferiblemente que comprende al menos el CDR3 de la cadena pesada de RX1, y preferiblemente que comprende dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más o las seis CDRs.
3) Anticuerpos Human Engineered™ que tienen las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera expuestas en las Figuras 19B a 22B o variantes de las mismas que comprende una cadena pesada o ligera que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con la cadena pesada o la ligera Human Engineered™ original de las Figuras 19B a 22B, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90% y lo más preferiblemente al menos un 95%, incluyendo, por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% idénticos.
4) Polipéptidos que enlazan con M-CSF (excluyendo el anticuerpo RX1 murino) que comprenden los residuos de riesgo alto de una o más CDRs de los anticuerpos Human Engineered™ de las Figuras 19B a 22B, y que comprenden preferiblemente residuos de riesgo alto de dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más o las seis CDRs.
5) Anticuerpos Human Engineered™ o variantes que mantienen los residuos de aminoácidos de riesgo alto expuestos en la Figura 4B, y que comprenden uno o más cambios en los residuos de riesgo bajo o moderado expuestos en la Figura 4B;
por ejemplo, que comprenden uno o más cambios en un residuo de riesgo bajo y sustituciones conservadoras en un residuo de riesgo bajo expuestos en la Figura 4B; o
por ejemplo, retener los residuos de aminoácidos de riesgo moderado y alto expuestos en la Figura 4B y que comprenden uno o más cambios en un residuo de riesgo bajo,
donde los cambios incluyen inserciones, deleciones o sustituciones y puede haber sustituciones conservadoras o pueden causar que el anticuerpo diseñado esté más cercano en secuencia a una secuencia de cadena ligera o
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cadena pesada humana, una secuencia de cadena ligera o cadena pesada de línea germinal humana, una secuencia de la cadena ligera o la cadena pesada humana de consenso, o una secuencia de la cadena ligera o la cadena pesada de la línea germinal humana de consenso.
que mantienen la capacidad de enlazar con el M-CSF. Dichos anticuerpos preferiblemente enlazan con el M-CSF con una afinidad de al menos 10-7, 10-8 ó 10-9 o más alta y preferiblemente neutralizan la osteoclastogénesis que induce la actividad del M-CSF.
De manera similar, el término "anticuerpo derivado de MC3" incluye cualquiera de los siguientes:
1) una variante de aminoácidos del anticuerpo MC3 murino que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 15, incluyendo variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% homóloga con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 15, y/o que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable que es al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% homóloga con la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 15, teniendo en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología;
2) Polipéptidos que enlazan con el M-CSF (excluyendo el anticuerpo MC3 murino) que comprenden una o más regiones determinantes complementarias (CDRs) del anticuerpo MC3 murino que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 15, preferiblemente que comprende al menos el CDR3 de la cadena pesada de MC3, y preferiblemente que comprende dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más o las seis CDRs.
3) Anticuerpos Human Engineered™ generados alternado la secuencia murina de acuerdo con los métodos
expuestos en Studnicka et al., Patente U.S. N° 5.766.886 y el Ejemplo 4A en la presente, usando la numeración de Kabat expuesta en las figuras 24C-24E para identificar residuos de riesgo bajo, moderado y alto; dichos anticuerpos comprenden al menos una de las siguientes cadenas pesadas y al menos una de las siguientes cadenas ligeras: (a) una cadena pesada en la que todos los residuos de riesgo bajo han sido
modificados, si es necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de
referencia humana o (b) una cadena pesada en la que todos los residuos de riesgo bajo y moderado han sido modificados, si es necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de
referencia humana, (c) una cadena ligera en la que todos los residuos de riesgo bajo han sido modificados, si
es necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana, o (b) una cadena ligera en la que todos los residuos de riesgo bajo y moderado han sido modificados, si es necesario, para ser los mismos residuos que una secuencia de inmunoglobulina de referencia humana.
4) variantes de los anticuerpos anteriormente mencionados en el párrafo anterior (3) que comprenden al menos un 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con la cadena pesada o la ligera Human Engineered™ original, más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90% y lo más preferiblemente al menos un 95%, incluyendo, por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% idénticos.
5) Polipéptidos que enlazan con M-CSF (excluyendo el anticuerpo MC3 murino) que comprenden los residuos de riesgo alto de una o más CDRs del anticuerpo MC3 murino de la Figura 15, y que comprenden preferiblemente residuos de riesgo alto de dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más o las seis CDRs.
6) Anticuerpos Human Engineered™ o variantes que mantienen los residuos de aminoácidos de riesgo alto del anticuerpo MC3 murino, y que comprenden uno o más cambios en los residuos de riesgo bajo o moderado;
por ejemplo, que comprenden uno o más cambios en un residuo de riesgo bajo y sustituciones conservadoras en un residuo de riesgo moderado; o
por ejemplo, retener los residuos de aminoácidos de riesgo moderado y alto y que comprenden uno o más cambios en un residuo de riesgo bajo,
donde los cambios incluyen inserciones, deleciones o sustituciones y puede haber sustituciones conservadoras o pueden causar que el anticuerpo diseñado esté más cercano en secuencia a una secuencia de cadena ligera o cadena pesada humana, una secuencia de cadena ligera o cadena pesada de línea germinal humana, una secuencia de la cadena ligera o la cadena pesada humana de consenso, o una secuencia de la cadena ligera o la cadena pesada de la línea germinal humana de consenso;
que mantienen la capacidad de enlazar con el M-CSF. Dichos anticuerpos preferiblemente enlazan con el M-CSF con una afinidad de al menos 10-7, 10-8 ó 10-9 o más alta y preferiblemente neutralizan la osteoclastogénesis que induce la actividad del M-CSF.
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El término "anticuerpo derivado de 5H4" o "anticuerpo derivado de MC1" se define de manera similar de acuerdo a la descripción anterior.
Como se describe con detalle en la presente los anticuerpos derivados de RX1, 5H4, MC1 o MC3, incluyendo los anticuerpos Human Engineered™ o variantes, pueden ser de isotipos diferentes, como IgG, IgA, IgM o IgE. Los anticuerpos de la clase IgG pueden incluir una región constante diferente, por ejemplo, un anticuerpo IgG2 puede modificarse para mostrar una región constante de IgG1 o IgG4. Se divulgan en la presente los anticuerpos Human Engineered™ o variantes que comprenden una región constante de IgG1 o IgG4. En el caso de IgG1, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra o CH2, pueden aumentar o reducir la función efectora, incluyendo la actividad ADCc y/o CDC. Una región constante de IgG2 puede modificarse para disminuir la formación de agregados anticuerpo-antígeno. En el caso de IgG4, las modificaciones a la región constante, particularmente la región bisagra, pueden reducir la formación de medio-anticuerpos. En un ejemplo específico, se divulga mutar la secuencia bisagra de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys a la secuencia bisagra de IgG1 Cys-Pro- Pro-Cys.
Se muestra en la presente que los anticuerpos Human Engineered™ que contienen regiones constantes de IgG1 o IgG4 tienen propiedades mejoradas en comparación con los anticuerpos Human Engineered™ que contienen regiones constantes de IgG2. La elección a de la región Fc de IgG1 o IgG4 mejoró la afinidad de enlace, la actividad de neutralización de MCSF y su actividad anti-osteoclastos. Además, la elección de la región Fc de IgG1 o IgG4 proporcionó complejos antígeno-anticuerpo que se asemejaban más a los formados por el anticuerpo murino padre.
La movilidad en la región bisagra por lo tanto parece que afecta marcadamente al enlace del anticuerpo con el antígeno MCSF dimérico así como a la actividad de neutralización del anticuerpo. Se contempla que la preparación de anticuerpos que contiene una cadena pesada que comprende una región constante de IgG1 o IgG4 modificada o no modificada, particularmente los dominios bisagra y CH2, o preferiblemente al menos los dominios bisagra, mejore la afinidad de enlace y/o ralentice la disociación del anticuerpo de antígenos diméricos.
El término "anticuerpo competidor de RX1" incluye
1) un anticuerpo monoclonal no de roedor o no murino que enlaza con el mismo epítopo de M-CSF que el RX1 murino que tiene las secuencias de la cadena ligera y pesada completas expuestas en la Figura 4;
2) un anticuerpo monoclonal no murino o no de roedor que enlaza con al menos 4 aminoácidos contiguos de los aminoácidos 98-105 del M-CSF de la Figura 12; y
3) un anticuerpo monoclonal no murino o no de roedor que compite con el anticuerpo RX1 murino que tiene la secuencia completa expuesta en la Figura 4 para enlazar con el M-CSF, por más del 75%, más del 80% o más del 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95%. Dichos anticuerpos enlazan preferiblemente con el M-CSF con una afinidad de al menos 10'7, 10'8 o 10'9 o más y preferiblemente neutralizan la actividad inductora de osteoclastogénesis del M-CSF.
El término "anticuerpo competidor de MC1" o "anticuerpo competidor de MC3" o "anticuerpo competidor de 5H4" se definen de manera similar con referencia a los anticuerpos 5H4, MC1 o MC3 murinos que tienen las secuencias de la cadena ligera y pesada completas expuestas en la Figura 13, 14 o 15, respectivamente, y con referencia al epítopo de M-CSF enlazado por el anticuerpo, por ejemplo, los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (correspondientes a los epítopos de M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3).
Opcionalmente, cualquier anticuerpo de M-CSF quimérico, humano o humanizado divulgado públicamente con anterioridad antes de la fecha de presentación de este documento, o divulgado en una solicitud presentada antes de la fecha de presentación de este documento, se excluye del ámbito de la invención.
El anticuerpo monoclonal "no de roedor" es cualquier anticuerpo, como se define de manera amplia en la presente, que no es un anticuerpo monoclonal de roedor intacto completo generado por un hibridoma de roedor. Por lo tanto, los anticuerpos no de roedor incluyen específicamente, pero no están limitados a, variantes de anticuerpos de roedor, fragmentos de anticuerpos de roedor, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos Human Engineered™ y anticuerpos humanos, incluyendo anticuerpos humanos producidos de animales transgénicos o por tecnología de presentación de fagos. De manera similar, los anticuerpos no murinos incluyen pero no están limitados a variantes de anticuerpos murinos, fragmentos de anticuerpos murinos, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, humanizados, Human Engineered™ y humanos.
"Tumor", como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligna o benigna, y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a,
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carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.
"Tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere a tanto el tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas. Los que están con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno así como en aquellos que se va a prevenir el trastorno. En tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de células tumorales, o vuelven a las células tumorales más susceptibles al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia. El tratamiento de pacientes que sufren de síntomas clínicos, bioquímicos, radiológicos o subjetivos de la enfermedad como osteolisis, puede incluir aliviar algunos o todos de tales síntomas o reducir la predisposición a la enfermedad. La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprenden el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citoquinas u otros productos de secreción a niveles anormales, supresión o agravación de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc. Por lo tanto, la mejora después del tratamiento puede manifestarse como tamaño tumoral disminuido, disminución en la tasa de crecimiento tumoral, destrucción de células tumorales o células metastásicas existentes y/o un reducción en el tamaño del número de metástasis.
"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, deporte o compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.
Como se usa en la presente, la frase "cáncer metastásico" se define como cánceres que tienen el potencial de propagarse a otras áreas del cuerpo, particularmente el hueso. Una variedad e cánceres pueden hacer metástasis al hueso, pero los cánceres que más comúnmente hacen metástasis son de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides y próstata. A modo de ejemplo, otros cánceres que tienen potencial para hacer metástasis al hueso incluyen, pero no están limitados a, adenocarcinoma, tumores malignos de células sanguíneas, incluyendo leucemia y linfoma; cánceres de cabeza y cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer del conducto biliar o la vesícula biliar; neoplasias del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma de ovario, cáncer de endometrio uterino, cáncer vaginal, y cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; y cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno y cáncer de células escamosas. La presente divulgación contempla específicamente la prevención y tratamiento de lesiones osteolíticas inducidas por tumores en el hueso.
Como se usa en la presente, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a que se entiende para referirse a una cantidad de anticuerpo de M-CSF terapéutico o profiláctico que sería apropiado, que provocará el efecto o respuesta terapéutica o profiláctica deseada cuando se administra de acuerdo con el régimen de tratamiento deseado.
El "M-CSF" humano como se usa en la presente se refiere a un polipéptido humano que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que los polipéptidos M-CSFa, M-CSFp, o M-CSFy humanos maduros descritos en in Kawasaki et al., Science 230:291 (1985), Cerretti et al., Molecular Immunology, 25:761 (1988), o Ladner et al., EMBO Journal 6:2693 (1987). Dicha terminología refleja la comprensión de que los tres M- CSFs maduros tienen diferentes secuencias de aminoácidos, como se ha descrito con anterioridad, y que la forma activa del M-CSF es un dímero enlazado de disulfuro; así, cuando el término "M-CSF" se refiere a la forma biológicamente activa, se pretende la forma dimérica. "Dímero de M-CSF" se refiere a dos monómeros de polipéptido de M-CSF que han dimerizado e incluye ambos homodímeros (que consisten de dos del mismo tipo de monómero de M-CSF) y heterodímeros (que consisten de dos monómeros diferentes), los monómeros de M-CSF pueden convertirse a dímeros de M-CSF in vitro como se describe en la Patente U.S. N° 4.929.700.
Anticuerpos Anti-MCSF
La presente divulgación incluye un anticuerpo específico de M-CSF, como el RX1, 5H4, MC1 y/o MC3, formulaciones farmacéuticas que incluyen el anticuerpo específico de M-CSF, como el RX1, 5H4, MC1 y/o MC3, métodos para preparar las formulaciones farmacéuticas, y métodos para tratar pacientes con las formulaciones y compuestos farmacéuticos. El término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos que pueden enlazar con el antígeno (por ejemplo Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena simple, diacuerpos), y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores siempre que muestren la actividad biológica deseada.
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El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por las mutaciones de origen natural posibles que puede haber presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante individual en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan por el cultivo homogéneo, no contaminado por otras inmunoglobulinas con diferentes especificidades y características.
El modificador "monoclonal- indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente divulgación pueden hacerse por el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 [19751, o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente U.S. N° 4.816.567). los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al.,Nature,352:624628[1991] end Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar inmunoglobulinas a clases diferentes. Hay cinco clases principales, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases o isotipos, por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Diferentes isotipos tiene diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 tienen actividad ADCC.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa intacto, preferiblemente la región variable o que enlaza con el antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995));moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos, cada uno con un sitio de enlace con el antígeno individual, y un fragmento "Fc2 residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar 35 fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "sFv" que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptidos individual. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un conector de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al Fv formar la estructura deseada para el enlace con el antígeno. Para una revisión de sFv ver, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
El término región "hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables del enlace con el antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una región determinante complementaria o CDR [es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como se describe por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] y/o aquellos residuos de un bucle hipervariable (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como se describe por [Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)].
Los residuos "Marco" o FR son aquellos residuos del dominio variable que son distintos que los residuos de la región hipervariable.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de enlace con antígenos, estos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH VL). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace con el antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y 30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Puede ser deseable generar anticuerpo monoclonal multiespecífico (por ejemplo biespecífico), incluyendo anticuerpos anti M-CSF monoclonales, humanos, humanizados, Human Engineered™ o variantes que tengan especificidades de enlace para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo pueden enlazar con dos epítopos diferentes de M-CSF. Alternativamente, un brazo anti-M-CSF puede combinarse con un brazo que enlaza con una molécula de activación en un leucocito como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3), o receptor Fc para IgG (FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD 16) para
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enfocar los mecanismos de defensa celular con la célula que expresa M-CSF. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expresan M-CSF. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace con M-CSF y un brazo que enlaza con el agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti interferón-60, vinca alcaloide, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radioactivo). Los anticuerpos específicos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos específicos de F(ab').sub.2).
De acuerdo con otro enfoque para hacer anticuerpos biespecíficos, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) más grande(s) se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados como homodímeros. Ver la WO96/27011 publicada el 6 de septiembre de 1996.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se divulgan en la Patente U.S. N° 4.676.980, junto con una variedad de técnicas de reticulación.
Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando ligamiento químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol arsenito sódico para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados son después convertidos en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB es después reconvertido al tiol Fab' o reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los fragmentos Fab'-SH recuperados directamente de E.coli pueden ser acoplados químicamente in vitro para formar anticuerpos biespecíficos. (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).
Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado separadamente de E.coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de enlazar con células que sobreexpresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como activar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos tumorales de mama humanos.
También se han descrito varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron con las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se re-oxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método puede ser también utilizado para la producción de homodímeros del anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos.
Los fragmentos comprenden una región variable de la cadena pesada (VH) conectada a una región variable de la cadena ligera (Vl) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por lo tanto, los dominios de Vh y Vl de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios de Vh y Vl complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de enlace con el antígeno. También se ha informado de otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros Fv (sFv) de cadena sencilla. Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede ser un "anticuerpo lineal" producido como se describe en Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh -Ch1-Vh -Ch1) que forman un par de regiones de enlace con el antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
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También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991))
El anticuerpo anti-M-CSF monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered™ o variante puede ser un fragmento de anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo de RX1, 5H4, MC1, o MC3. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, orimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por células huésped recombinantes. Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) divulgan la secreción de fragmentos de anticuerpos funcionales de bacterias (ver, por ejemplo Better et al., Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988)). Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E.coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). El F(ab')2 puede formarse usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamble de la molécula F(ab')2. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')2 pueden aislarse directamente a partir de cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el médico experto.
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con el diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. El anticuerpo puede purificarse (1) a más del 95% por peso del anticuerpo como se determina por el método Lowry, y más preferiblemente más del 99% por peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. el anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos un paso de purificación.
Para una descripción detallada de la estructura y generación de anticuerpos, ver Roth, D.B., y Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), y la Patente de Estados Unidos N° 6.255.458. Brevemente, el proceso para generar ADN que codifica los genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera tiene lugar primariamente al desarrollar células B. Antes de reordenar y unir varios segmentos de genes de inmunoglobulina, los segmentos de genes V, D, J y constante (C) se encuentran generalmente en una proximidad relativamente cercana en un cromosoma individual. Durante la diferenciación de células B, uno de cada uno de los miembros de la familia apropiados de los segmentos de genes V, D, J (o sólo V y J en el caso de genes de la cadena ligera) se recombinan para formar genes de inmunoglobulina pesados y ligeros funcionalmente reordenados. Este proceso de reordenamiento de segmentos de genes parece ser secuencial. Primero se hacen las uniones D a J de la cadena pesada, seguido por las uniones V a DJ de la cadena pesada y las uniones V a J de la cadena ligera.
La recombinación de los segmentos de genes de la región variable para formar regiones variables de la cadena pesada y ligera es mediada por secuencias señal de recombinación (RSS's) que flanquean los segmentos V, D y J recombinantemente competentes. Las RSS's son necesarias y suficientes para dirigir la recombinación, comprenden un heptámero diada-simétrico. Un nonámero rico en AT y una región espaciadora de intervención de 12 ó 13 pares de bases. Estas señales se conservan entre los diferentes loci y especies que llevan a cabo la recombinación de D-J (o V-J) y son funcionalmente intercambiables. Ver Oettinger, et al. (1990), Science, 248, 15171523 y las referencias citadas en la misma. El heptámero comprende la secuencia CACAGTG o su análoga seguido por un separador de secuencia no conservada y después un nonámero que tiene la secuencia ACAAAAACC o su análoga. Estas secuencias se encuentran en la J, o en el lado secuencia abajo, de cada segmento de gen V y D. Precediendo inmediatamente los segmentos D y J de la línea germinal hay de nuevo dos secuencias de señal de recombinación, primero el nonámero y después el heptámero separados de nuevo por una secuencia no conservada. Las secuencias heptaméricas y nonaméricas que siguen a un segmento Vl, Vh o D son complementarias a las que preceden a los segmentos Jl, D o Jh con las que recombinan. Los separadores entre las secuencias heptaméricas y nonaméricas son o de 12 pares de bases de longitud o de entre 22 y 24 pares de bases de longitud.
Además del reordenamiento de los segmentos V, D y J, se genera diversidad adicional en el repertorio primario de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina a modo de recombinación variable en las localizaciones donde los segmentos V y J en la cadena ligera se unen y donde los segmentos D y J de la cadena pesada se unen. Dicha variación en la cadena ligera tiene lugar típicamente dentro del último codón del segmento del gen V y el primer codón del segmento J. Una imprecisión similar en la unión tiene lugar en el cromosoma de la cadena pesada entre los segmentos D y Jh y puede extenderse sobre hasta tantos como 10 nucleótidos. Además, se pueden insertar varios nucleótidos entre D y Jh y entre los segmentos del gen Vh y D que no están codificados por ADN genómico. La adición de estos nucleótidos se conoce como diversidad de la región N.
El efecto neto de dichas reordenaciones en los segmentos de genes de la región variable y la
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recombinación variable que puede tener lugar durante dicha unión es la producción de un repertorio de anticuerpos primario.
"FV" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y enlace del antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que las tres CDRS de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace con el antígeno en la superficie del dímero VH VI. Colectivamente, las seis CDRs confieren especificidad de enlace con el antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable individual (o mitad de un FV que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar con el antígeno, aunque a una afinidad más baja que el sitio de enlace completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para el Fab' en el que el residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de los fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos.
Por "anticuerpo de neutralización" se entiende una molécula de anticuerpo que es capaz de eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno objetivo con el que enlaza. Por consiguiente, un anticuerpo anti-objetivo "de neutralización" es capaz de eliminar o reducir significativamente una función efectora, como una actividad de enzimas, enlace de ligandos, o señalización intracelular.
Las composiciones para y los métodos de tratar metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con una metástasis del cáncer pueden utilizar uno o más anticuerpos usados singularmente o en combinación con otros agentes terapéuticos para lograr los efectos deseados. Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden ser aislados a partir de un animal que produce el anticuerpo como resultado de o contacto directo con un antígeno ambiental o inmunización con el antígeno. Alternativamente, los anticuerpos pueden producirse por metodología de ADN recombinante usando uno de los sistemas de expresión de anticuerpos bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Dichos anticuerpos pueden incluir IgGs recombinantes, proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulina o anticuerpos Human Engineered™ que pueden ser usados todos para el tratamiento de metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer de acuerdo con la presente divulgación. Además, de moléculas de longitud completa, intactas, el término "anticuerpo" también se refiere a fragmentos de los mismos (como por ejemplo, fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'2) o multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos que enlazan con M-CSF (o M-CSFR). Estos fragmentos de anticuerpos enlazan con antígenos y pueden ser derivados para mostrar características estructurales que facilitan el depuración y la absorción, por ejemplo por la incorporación de residuos de galactosa.
Los anticuerpos monoclonales de M-CSF pueden prepararse esencialmente como se describe en Halenbeck et al. Patente U.S. N° 5.491.065 (1997). Los anticuerpos monoclonales de M-CSF de ejemplo incluyen aquellos que enlazan con un epítopo conformacional aparente asociado con M-CSF dimérico nativo o recombinante con neutralización concomitante de la actividad biológica. Estos anticuerpos son sustancialmente no reactivos con formas biológicamente inactivas de M-CSF incluyendo M-CSF dimérico químicamente derivado y monomérico.
Se divulgan en la presente anticuerpos monoclonales anti-M-CSF Human Engineered™. La frase "anticuerpo Human Engineered™" se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo monoclonal de ratón. Alternativamente, un anticuerpo Human Engineered™ puede derivarse de un anticuerpo quimérico que mantiene o sustancialmente mantiene las propiedades de enlace con el antígeno del anticuerpo no humano parental pero que muestra inmunogenicidad disminuida en comparación con el anticuerpo parental cuando se administra a humanos. La frase "anticuerpo quimérico", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que contiene la secuencia derivada de dos anticuerpos diferentes (ver por ejemplo Patente U.S: N° 4.816.567) que se originan típicamente de dos especies diferentes. Más típicamente, los anticuerpos quiméricos comprende fragmentos de anticuerpos humanos y murinos, generalmente regiones variables de ratón y constantes humanas.
La frase "región determinante complementaria" del término "CDR" se refiere a secuencias de aminoácidos que definen juntas la afinidad y especificidad de enlace de la región Fv natural de un sitio de enlace de inmunoglobulina nativo (Ver por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication No. 91 3242 (1991)). La frase "región constante" se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. En la presente divulgación, las regiones constantes de ratón se sustituyen preferiblemente por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos sujeto se derivan de inmunoglobulinas humanas. La región constante de la cadena pesada puede seleccionarse de cualquiera de los cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gamma o mu.
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Se dice que los anticuerpos de la presente divulgación son inmunoespecíficos o enlazan específicamente si enlazan con el antígeno con una Ka de más de o igual a alrededor de 106M-1 preferiblemente más de o igual a alrededor de 107M-1, más preferiblemente más de o igual de alrededor de 108M-1, y lo más preferiblemente de más de o igual a alrededor de 109M-1, 1010M-1, 1011M-1 o 1012M-1. Los anticuerpos anti-M-CSF pueden enlazar con formas de origen natural diferentes de M-CSF, incluyendo aquellas expresadas por los tejidos del huésped/sujeto así como las expresadas por el tumor. Los anticuerpos monoclonales divulgados en la presente como el anticuerpoRX1, 5H4, MC1, o MC3, tienen afinidad para el M-CSF y están caracterizados por una constante de equilibrio de disociación (Kd) de al menos 10-4 M, preferiblemente al menos de alrededor de 10-7 M a 10-8 M, más preferiblemente al menos alrededor de 10-8 M, 10'1°M, 10-11M o 10-12M. Dichas afinidades pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, como por diálisis de equilibrio; usando el instrumento BIAcore2000, usando procedimientos generales indicados por el fabricante; por radioinmunoensayo usando M-CSF etiquetado con 121I; o por otro método conocido por el experto en la técnica. Se pueden analizar los datos de afinidad, por ejemplo, por el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949). Así, será aparente que los anticuerpos de M-CSF preferidos mostrarán un alto grado de especificidad para M-CSF y enlazarán con sustancialmente menor afinidad con otras moléculas. Los anticuerpos preferidos enlazan con M-CSf con una afinidad similar con la que el RX1 murino de la Figura 4 enlaza con M-CSF, muestran inmunogenicidad baja, e inhiben la metástasis de células cancerosas cuando se prueban en modelos animales de enfermedad metastásica. Otros anticuerpos de ejemplo enlazan con M-CSF con una afinidad similar con la que los 5H4, MC1 o MC3 murinos de la Figura 13, 14 ó 15, respectivamente, enlazan con M-CSF.
El antígeno a ser usado para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, M-CSF intacto o un fragmento de M-CSF que mantiene el epítopo deseado, opcionalmente fusionado con otro epítopo que permita al epítopo ser mostrado en su conformación nativa. Alternativamente, las células que expresan M-CSF en su superficie celular pueden usarse para generar anticuerpos. Dichas células pueden transformarse para expresar M-CSF o pueden ser otras células de origen natural que expresan M-CSF. Otras formas de M-CSF útiles para generar anticuerpos serán aparentes para los expertos en la técnica.
Anticuerpos Policlonales
Los anticuerpos policlonales se desarrollan preferiblemente en animales por inyecciones intraperitoneales (ip) o subcutáneas (sc) múltiples del antígeno relevante y un adyuvante. Se puede obtener una respuesta del anticuerpo mejorada conjugando el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especia ser inmunizada, por ejemplo hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo 100 |jg o 5 |jg de la proteína o conjugando (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con de 1/5 a (fracción (1/10)} de la cantidad original de péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. A los 7-14 días después de la inyección de refuerzo, se sangra a los animales y se ensaya el suero para el título de anticuerpos. Se refuerza a los animales hasta que el título se allana. Preferiblemente se refuerza al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulado diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, se usa el agregar agentes como alumbre para potenciar la respuesta inmune.
Anticuerpos Monoclonales
Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se puede hacer por métodos de ADN recombinante.
En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se describe en la presente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que enlazarán específicamente con la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos son después fusionados con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma no fusionadas, parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), estar sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes
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Las células de mieloma preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles al medio. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984) ;Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Las líneas de mieloma murino de ejemplo incluyen las derivadas de tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA.
El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro, como un radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por análisis Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).
Después de que se han identificado las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y cultivándolos por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI- 1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Producción Recombinante de Anticuerpos
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse a partir de células de hibridoma usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazar específicamente con genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). La determinación de la secuencia requerirá generalmente el asilamiento de al menos una porción del gen o ADNc de interés. Habitualmente esto requiere clonar el ADN o, preferiblemente, el ARNm (es decir, ADNc) que codifica los anticuerpos monoclonales. La clonación se lleva a cabo usando técnicas estándar (ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo, puede construirse una biblioteca de ADNC por transcripción inversa de polyA+ARNm, preferiblemente ARNm asociado a la membrana, y cribarse la biblioteca usando sondas específicas para las secuencias de de genes de polipéptidos de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, sin embargo, se usa la reacción de cadena de polimerasa (PCR) para amplificar ADNcs (o porciones de ADNcs de longitud completa) que codifican un segmento de gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de la cadena ligera). Las secuencias amplificadas pueden ser clonadas fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores minigén, o vectores de expresión en fagos. Se apreciará que el método particular de clonación usado no es crítico, siempre que sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés. Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "aislada" o secuencia de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que o (1) se identifica o separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico o (2) se clona, amplifica, marca o se distingue de otra manera de los ácidos nucleicos de fondo de tal manera que la secuencia de ácidos nucleicos de interés puede determinarse, se considera aislada. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas por lo tanto se distinguen de las moléculas de ácidos nucleicos ya que existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
Una fuente de ARN usada para clonar y secuenciar es un hibridoma producido obteniendo una célula B de un ratón transgénico y fusionar la célula B con una célula inmortal. Una ventaja de usar hibridomas es que pueden ser cribados fácilmente, y seleccionarse un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano de interés. Alternativamente, el ARN puede ser aislado de células B (o bazo completo) del animal inmunizado. Cuando se usan fuentes distintas de hibridomas, puede ser deseable cribar para secuencias que codifican inmunoglobulinas o polipéptidos de inmunoglobulinas con características de enlace específicas. Un método de dicho cribado es el uso de tecnología de presentación en fagos. La presentación en fagos se describe en, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, y Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990). Usando tecnología de presentación en fagos, puede asilarse el ADNc de un ratón transgénico inmunizado (por ejemplo, ADNc del bazo total) , se puede usar la reacción de cadena de polimerasa para amplificar una
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secuencia de ADNc que codifica una porción de un polipéptido de inmunoglobulina, por ejemplo regiones DRS, y las secuencias amplificadas se insertan en un vector del fago. Los ADNcs que codifican polipéptidos de interés, por ejemplo, péptidos de la región variable con características de enlace deseadas, se identifican con técnicas estándar como el panning.
La secuencia del ácido nucleico amplificado o clonado es entonces determinada. Típicamente se determina la secuencia que codifica una región variable completa de un polipéptido de inmunoglobulina, sin embargo, será algunas veces adecuado secuenciar sólo una porción de una región variable, por ejemplo, la porción que codifica a la CDR. Típicamente, la porción secuenciada será al menos de 30 bases de longitud, más a menudo se secuenciará la codificación basada para al menos alrededor de un tercio o al menos alrededor de la mitad de la longitud de la región variable.
La secuenciación se puede llevar a cabo en clones aislados de una biblioteca de ADNC, o cuando se usa PCR, después de subclonar la secuencia amplificada o por secuenciación de PCR directa del segmento amplificado. La secuenciación se lleva a cabo usando técnicas estándar (ver por ejemplo Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, y Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Comparando la secuencia del ácido nucleico clonado con secuencias publicadas de genes y ADNcs de inmunoglobulina humana , alguien experto será capaz fácilmente de determinar, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso del segmento de la línea germinal del polipéptido de inmunoglobulina del hibridoma (incluyendo el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de la cadena pesada y ligera, incluyendo las secuencias resultantes de la adición de la región N y el proceso de mutación somática. Una fuente de información de secuencias de genes de inmunoglobulina es el National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que son después transfectados en células huésped como células de E.coli, células COS de simio, células 293 de riñón embrionario humano (por ejemplo células 293E), células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma que de otra forma no producen la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en la técnica.
Las secuencias de control de la expresión se refieren a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante ligada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace del ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico está operativamente ligado cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está operativamente ligado con un ADN par aun polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace del ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traslación. Generalmente, ligado operativamente significa que las secuencias de ADN que están ligadas con son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en una fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El ligamiento se consigue por la ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la práctica convencional.
Célula, línea celular y cultivo celular se usan a menudo de manera intercambiable y todas dichas designaciones incluyen en la presente la progenie. Células transformantes y transformadas incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la células transformada originalmente está incluida. Cuando se pretendan designaciones diferentes, quedará claro a partir del contexto.
La secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina de interés puede determinarse por secuenciación de proteína directa. Las secuencias que codifican nucleótidos adecuadas pueden designarse de acuerdo a una tabla de codones universal.
Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo deseado pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótido apropiados en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de los anticuerpos. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para que llegue al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseada. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traslacionales del anticuerpo monoclonal, humano,
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humanizado, Human Engineered™ o variante, como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada anterior o una versión no variante del anticuerpo.
También se divulgan en la presente ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la divulgación, opcionalmente ligados operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped, vectores y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos, que pueden comprender cultivar la célula huésped de tal manera que el ácidos nucleico se exprese y, opcionalmente, recuperando el anticuerpo del cultivo de células huésped o el medio de cultivo.
Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla e inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal es aislado y secuenciado fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazar específicamente con genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
(1) Componente de secuencia señal
El anticuerpo de la divulgación puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que se preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el término N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal seleccionada preferiblemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. Si las células huésped procariotas no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo nativa, la secuencia señal puede sustituirse por una secuencia señal seleccionada, por ejemplo, del grupo de pectato liasa (por ejemplo, pelB) fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes de la enterotoxina II termoestables. Para la secreción de levadura la secuencia señal nativa puede sustituirse por, por ejemplo un líder de invertasa de levadura, líder del factor a (incluyendo líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) o líder de la fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en la WO90/13646. En la expresión celular mamífera, están disponibles las secuencias de señal mamíferas así como los líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.
El ADN para tal región precursoea está ligado en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo.
(2) Componente del origen de replicación
Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicarse una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, al clonar vectores está secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuada para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2 p es adecuado para la levadura , y varios orígenes víricos son útiles para clonar vectores en células mamíferas. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión mamíferos (el origen de SV40 puede usarse típicamente sólo porque contiene el promotor temprano).
(3) Componente de marcador selectivo
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen selectivo, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol, o ácido micofenólico (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes clínicos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para retener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina.
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Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico que codifica al anticuerpo, como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR son identificadas primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR del tipo salvaje es la línea celular del ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.
Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes del tipo salvaje que contiene DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpos de la divulgación, proteína de DHFR del tipo salvaje, y otros marcadores seleccionables como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Ver la Patente U.S. N° 4.965.199.
Un gen de selección adecuado para el uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44076 or PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levaduras deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan con plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2. Las cepas de levadura deficientes en Ura3 se complementan con plásmidos que llevan el gen ura3.
Además, los vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 pm pueden usarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se informó de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante por K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135
(1990) . También se han divulgado los vectores de expresión multi-copia estables para la secreción de albúmina de suero human recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces Fleer et al, Bio/Technology, 9: 968-975
(1991) .
(4) Componente promotor
Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está ligado operativamente al ácido nucleico que codifica al anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen promotor de arabinosa (por ejemplo, araB), promotor phoA, sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) ligada operativamente con el ADN que codifica el anticuerpo de la divulgación.
Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases hacia arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases hacia arriba desde el comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias son insertadas adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huésped de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoclicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, isomerasa de glucosa-6-fosfato, 3- fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en expresión de levaduras se describen adicionalmente en la EP 73657. Los potenciadores de levaduras también se usan ventajosamente con promotores de levaduras.
La transcripción de anticuerpos a partir de vectores en células huésped mamíferas se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus de leucemia Abelson, virus del polioma, virus de la
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viruela aviar, adenovirus (como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, más preferiblemente citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B, virus de simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.
Los promotores tempranos y tardíos del virus de SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que contiene también el origen vírico de SV40 de replicación. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. En la Patente U.S. N° 4.419.446 se divulga un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector. Una modificación de este sistema se describe en la Patente U.S. N° 4.601.978. Ver también Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) en la expresión del ADNc de p-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus de herpes simple. Alternativamente, se puede usar como promotor la repetición terminal larga del sarcoma de rous.
(5) Componente del elemento potenciador
La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo por eucariotas superiores se aumenta a menudo insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación, y potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) en elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede ser empalmado en el vector en una posición 5' ó 3' a la secuencia que codifica el anticuerpo, pero se localiza preferiblemente en un sitio 5' del promotor.
(6) Componente de terminación de la transcripción
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongos, insecto, planta, animales o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADNs o ADNcs eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un compoennte de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver la WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en la presente. Otro es el terminador de la transcripción de la cadena ligera de inmunoglobulina de ratón.
(7) Selección y transformación de células huésped
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente son las células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo Enterobacteriaceae como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P divulgada en DD 266,710 publicada el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, y Streptomyces. Una célula de clonación de E.coli preferida es la E.coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitativos.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas como las levaduras u hongos filamentosos son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos. La Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es la más comúnmente usada entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, hay disponible comúnmente y útiles en la presente una variedad de géneros, especies y cepas, como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans y A. niger.
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), y Bombyx mori. Una variedad de cepas víricas para la transfección están disponibles públicamente,
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por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden usarse como el virus en la presente de acuerdo con la presente divulgación, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, tabaco, lemna y otras células vegetales pueden ser utilizadas también como huéspedes.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en el cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares huésped mamíferas útiles son células de ovario de hámster chino, incluyendo células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB- 11, Dg-44, y células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionaria humana (293 ó 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol Reprod 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MdCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, AtCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); Células TRI (Mather et al, Annals NY Acad Sci 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman o transfectan con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción de anticuerpos y se cultivan en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Además, los vectores nuevos y las líneas celulares transfectadas con copias múltiples de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles y se prefieren para la expresión de anticuerpos que apuntan al M-CSF.
(8) Cultivar las células huésped
Las células huésped usadas para producir el anticuerpo se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI- 1640 (Sigma), y Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) son adecuados par acultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes U.S. N° 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; o Registro de Patente U.S. N° 30,985 también pueden usarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina ™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente a concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a concentraciones apropiadas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la células huésped seleccionada para la expresión, y será aparente para alguien experto en la técnica.
(9) Purificación del anticuerpo
Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretado directamente al medio, incluyendo a partir de cultivos microbianos. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, el desecho de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se elimina, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Better et al. Science 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10: 105 (1990); y Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 457-461 (1993) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico del E.coli (Ver también, [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)].
La composición de anticuerpo preparada a partir de células microbianas o mamíferas puede purificarse usando, por ejemplo cación de cromatografía con hidroxiapatita o cromatografía de intercambio aviar, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas y1, y2, o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la que el ligando de afinidad está unido es más a menudo agarosa, peros hay disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno
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permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio Ch3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas como fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™ cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado.
Anticuerpos quiméricos y humanizados
Como los anticuerpos quiméricos o humanizados son menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos monoclonales de ratón parentales, pueden usarse para el tratamiento de humanos con mucho menos riesgo de anafilaxia. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden preferirse en aplicaciones terapéuticas que implican la administración in vivo a un humano.
Los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los que los dominios de Ig variables de un anticuerpo monoclonal de ratón se fusionan con dominios de Ig constantes humanos, pueden generarse usando procedimientos estándar conocidos en la técnica (ver Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; and, Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646. (1984)). Aunque algunos anticuerpos monoclonales quiméricos han demostrado ser menos inmunogénicos en humanos, los dominios de Ig variables de ratón pueden todavía llevar a una respuesta anti-ratón humana significativa.
Los anticuerpos humanizados pueden conseguirse por una variedad de métodos incluyendo, por ejemplo:
(1) injertar las regiones determinantes complementarios (CDRs) no humanas en un marco humano y región constante (un proceso referido en la técnica como "humanización a través de "injerto de CDR""), o alternativamente
(2) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "enmascararlos" con una superficie tipo humana por el reemplazo de residuos de superficie (un proceso referido en la técnica como "chapado"). En la presente invención, los anticuerpos humanizados incluirán tanto los anticuerpos "humanizados" como los "chapados". Estos métodos se divulgan en, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); y Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991).
En particular, un anticuerpo de roedor en administración in vivo repetida ya sea solo o como un conjugado producirá una respuesta inmune en el recipiente contra el anticuerpo de roedor; la denominada respuesta HAMA (Anticuerpo Anti Ratón Humano). La respuesta HAMA puede limitar la eficacia del agente farmacéutico si se requiere repetición de dosis. La inmunogenicidad del anticuerpo puede reducirse por modificación química del anticuerpo con un polímero hidrofílico como el polietilenglicol o usando los métodos de ingeniería genética para hacer la estructura de enlace del anticuerpo más similar a la humana. Por ejemplo las secuencias de genes para los dominios variables del anticuerpo de roedor que enlaza con CEA se pueden sustituir por los dominios variables de un proteína de mieloma humano, produciendo de esta manera un anticuerpo quimérico recombinante. Estos procedimientos se detallan en la EP194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 y WO 86/01533. Alternativamente las secuencias de genes de las CDRs del anticuerpo de roedor pueden aislarse o sintetizarse y sustituirse para las regiones de la secuencia correspondientes de un gen de anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo con la especificidad del anticuerpo de roedor original. Estos procedimientos se describen en la EP 023940, WO 90/07861 y WO91/09967. Alternativamente, un gran número de los residuos de superficie del dominio variable del anticuerpo de roedor pueden cambiarse a esos residuos encontrados normalmente en un anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo de roedor que tiene una "chapa" de superficie de residuos y que será por lo tanto reconocida como propia por el cuerpo humano. Este enfoque ha sido demostrado por Padlan et.al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489.
El injerto de CDR implica introducir una o más de las seis CDRs de los dominios de Ig variables de la cadena ligera y pesada de ratón en las cuatro regiones marco apropiadas de dominios de Ig variables humanos también se conoce como injerto de CDR. Esta técnica (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323 (1988)), utiliza las regiones marco conservadas (FR1-FR4) como un andamiaje para soportar los bucles de CDR que son los contactos principales con el antígeno. Una desventaja del injerto de CDR, sin embargo, es que puede resultar en un anticuerpo humanizado que tenga una afinidad de enlace sustancialmente inferior que el anticuerpo de ratón original, ya que los aminoácidos de las regiones marco pueden contribuir al enlace del antígeno, y debido a que los aminoácidos de los bucles de CDR pueden influir en la asociación de los dos dominios de Ig variables. Para mantener la afinidad del anticuerpo clonal humanizado, la técnica de injerto de CDR puede mejorarse eligiendo regiones marco humanas que se asemejen más estrechamente a las regiones marco del anticuerpo de ratón original, y por mutagénesis dirigida al sitio de los aminoácidos individuales dentro del marco o CDRS ayudados por un modelo informático del sitio de enlace del antígeno (por ejemplo, Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976).
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Un método para humanizar anticuerpos comprende alinear las secuencias de la cadena pesada y ligera no humanas con las secuencias de la cadena pesada y ligera humanas, seleccionar y reemplazar el marco no humano con un marco humano en base a dicho alineamiento, modelado molecular para predecir la conformación de la secuencia humanizada y compararla con la conformación del anticuerpo parental. Este proceso se sigue por retromutación repetida de residuos en la región de la CDR que perturban la estructura de las CDRs hasta que la conformación predicha del modelo de secuencia humanizado se aproxima estrechamente a la conformación de las CDRs no humanas del anticuerpo no humano parental. Dichos anticuerpos humanizados pueden ser derivados adicionalmente para facilitar la absorción y la depuración, por ejemplo por receptores de Ashwell (Ver, por ejemplo, Patentes U.S. N° 5.530.101 y 5.585.089).
Se ha informado de una variedad de humanizaciones de anticuerpos monoclonales de ratón por diseño racional (Ver, por ejemplo, 20020091240 publicada el 11 de julio de 2002, la WO 92/11018 y la Patente de U.S. N° 5.693.762, Patente de U.S. No. 5.766.866.
Variantes de secuencias de aminoácidos
Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifican un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo residuos cargados como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido cargado neutral o negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son después refinadas introduciendo otras variantes o variantes adicionales en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza escaneado ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y las variantes del anticuerpo expresadas son cribadas para la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxi- terminales que varían de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como inserciones intra- secuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionil N-terminal o el anticuerpo (incluyendo el fragmento del anticuerpo) fusionado con una etiqueta de epítopo o un epítopo receptor de recuperación. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión a un polipéptido lo que aumenta la vida media del suero del anticuerpo, por ejemplo en el término N o el término C.
El "término epítopo etiquetado" se refiere al anticuerpo fusionado con una etiqueta de epítopo. El polipéptido de la etiqueta de epítopo tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que se puede hacer un anticuerpo, y es lo suficientemente corto todavía para no interferir con la actividad del anticuerpo. La etiqueta de epítopo es preferiblemente lo suficientemente única para que el anticuerpo en ella no reaccione de manera cruzada sustancialmente con otros epítopos. Los polipéptidos marcadores adecuados tienen generalmente al menos 6 residuos de aminoácidos y habitualmente entre alrededor de 8-50 residuos de aminoácidos (preferiblemente entre alrededor de 9-30 residuos). Los ejemplos incluyen el polipéptido marcador HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; el marcador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; y el marcador de la glicoproteína D (gD) del virus del virus de Herpes Simple y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]. Otras etiquetas de ejemplo son una secuencia de poli-histidina, generalmente de alrededor de seis residuos de histidina, que permite el aislamiento de un compuesto así etiquetado usando quelación de níquel. En la presente se divulgan otras etiquetas y marcas, como el marcador FLAG® Eastman Kodak, Rochester, NY), bien conocidas y usadas rutinariamente en la técnica.
Como se usa en la presente, el término "epítopo de enlace con el receptor de recuperación" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media del suero in vivo de la molécula de IgG.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminada y un residuo diferente insertado en su lugar. Se contempla la mutagénesis de sustitución dentro de cualquiera de las regiones hipervariables o CDR o regiones marco. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1. La sustitución más conservadora se encuentra bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones no resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y cribarse los productos.
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Original
TABLA 1 Ejemplar Sustituciones de Residuos Preferidas
Ala (A)
val; leu; ile val
Arg (R)
lys; gln; asn lys
Asn(N)
gln; his; asp, lys; gln arg
Asp(D)
glu; asn glu
Cys (C)
ser; ala ser
Gln (Q)
asn; gln asn
Glu (E)
asp; gln asp
Gly (G)
ala
His (H)
asn; gln; lys; arg
Ile (I)
leu; val; met; ala; phe; leu norleucina
Leu (L)
norleucina; ile; val; met; ala; phe Ile
Lys (K)
arg; gln; asn arg
Met (M)
leu; phe; ile leu
Phe (F)
leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P)
ala
Ser (S)
thr
Thr (T)
ser ser
Trp (W)
tyr; phe tyr
Tyr (Y)
trp; phe; thr; ser phe
Val (V)
ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el grueso de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades de la cadena lateral comunes:
(1) hidrófobo: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr;
(3) ácido: asp, glu;
(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromático: trp, tyr, phe.
Las sustituciones conservadores implican reemplazar un aminoácido con otro miembro de su clase. Las sustituciones no conservadoras implican reemplazar un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase.
Puede sustituirse también cualquier residuo cristalino no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, Human Engineered™ o variante, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidante de la molécula y evitar reticulación aberrante. Por el contrario, se pueden añadir enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv).
La maduración por afinidad implica preparar y cribar variantes de anticuerpos que tienen sustituciones dentro de las CDRs de un anticuerpo parental y seleccionar las variantes que tienen propiedades biológicas mejoradas como afinidad de enlace en relación con el anticuerpo parental. Un modo conveniente de generar dichas variantes de sustitución es la maduración por afinidad usando presentación de fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes del anticuerpo así generadas se muestran de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 envasado con cada partícula. Las variantes mostradas en fago son después cribadas para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace).
Puede realizarse mutagénesis de barrido de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente al enlace con el antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contracto entre el anticuerpo y
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el antígeno. Dichos residuos del contacto y residuos limítrofes son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para desarrollo adicional.
También pueden producirse variantes de anticuerpo que tengan un patrón de glicosilación modificado en relación al anticuerpo parental, por ejemplo, eliminando uno o más restos de carbohidratos encontrados en el anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de anticuerpos es típicamente o N-ligado u O-ligada. N-ligada se refiere a la unión del resto de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X- Serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidratos con la cadena lateral de asparagina. La presencia de o estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Por lo tanto, los sitios de glicosilación N-ligados pueden añadirse a un anticuerpo alternado la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de estas secuencias de tripéptidos. La glicosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Los sitios de glicosilación O-ligada pueden añadirse a un anticuerpo insertando o sustituyendo uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original. A modo de ejemplo, los aminoácidos de RX1 en las posiciones 41-43 de la Figura 4A (NGS) pueden mantenerse. Alternativamente, se pueden mantener sólo los aminoácidos 41 y 42 (NG).
Ordinariamente, las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo Human Engineered™ tendrán una secuencia de aminoácidos de al menos un 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo Human Engineered™ original de o la cadena pesada o la ligera (por ejemplo, como en cualquiera de las Figuras 19B a 22B) más preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un 95%, incluyendo por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos Human Engineered™, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservadora (como se define en la Tabla 1 anterior) como parte de la identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones N-terminal, C-terminal o interna, deleciones o inserciones en la secuencia del anticuerpo se considerará que afecta a la identidad de secuencia u homología. Por lo tanto, la identidad de secuencia puede determinarse por métodos estándar que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa informático como BLAST o FASTA, se alinean dos polipéptidos para la concordancia máxima de sus aminoácidos respectivos (ya sea a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias). Los programas proporcionan una penalización de apertura por defecto y una penalización de espacio por defecto, y se puede usar una matriz de puntuación como la PAM 250 [una matriz de puntuación estándar; ver Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] en conjunción con el programa informático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad puede entonces calcularse como: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y después dividido por la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del lapso emparejado y el número de espacios introducidos en las secuencias más largas para alinear las dos secuencias.
Se con templan otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, para potenciar la efectividad del anticuerpo al tratar el cáncer, por ejemplo. Por ejemplo se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces de disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o muerte de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) aumentadas. Ver Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor potenciada también pueden prepararse usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y puede tener de esta manera lisis complementaria potenciada y capacidades ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). Además, se ha mostrado que las secuencias dentro de la CDR provocan que un anticuerpo enlace con MHC Clase II y active una respuesta de células T auxiliares no deseada. Una sustitución conservadora puede permitir que el anticuerpo mantenga la actividad de enlace y todavía pierda su capacidad de activar una respuesta de células T no deseada. Ver también Steplewski et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1988;85(13):4852-6, que describe anticuerpos quiméricos en los que una región variable murina se unió con regiones constantes gamma 1, gamma 2, gamma 3 y gamma 4 humanas.
Puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración tumoral, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para
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aumentar su vida medio sérica, por ejemplo, añadiendo moléculas como PEG u otros polímeros solubles en agua, incluyendo polímeros de polisacáridos, a fragmentos de anticuerpos para aumentar su vida media. Esto también puede conseguirse, por ejemplo, por la incorporación de un receptor de recuperación que enlaza con el epítopo en el fragmento de anticuerpos (por ejemplo, por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en un péptido marcador que es después fusionado con el fragmento de anticuerpo en o el extremo o en el medio, por ejemplo , por síntesis de ADN o péptido) (ver, por ejemplo, WO96/32478).
El receptor de recuperación que enlaza con el epítopo preferiblemente constituye una región en la que cualquier o más residuos de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Incluso más preferiblemente, se transfieren tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio Fc. Todavía más preferiblemente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región FC (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o vH, o más de una de dichas regiones, del anticuerpo. Alternativamente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región C.sub.L o la región V.sub.L., o ambas, del fragmento del anticuerpo. Ver también las solicitudes internacionales WO 97/34631 y WO 96/32478 que describen variantes Fc y su interacción con el receptor de recuperación.
Por lo tanto, los anticuerpos pueden comprender una porción de Fc humana, una porción de Fc de consenso humana, o una variante de las mismas que mantiene la capacidad de interactuar con el receptor de recuperación de Fc, incluyendo variantes en la que las cisteínas implicadas en el enlace de disulfuros se modifican o elimina, y/o en las que se añade un met en el término N y/o uno o más de los 20 aminoácidos terminales se eliminan, y/o regiones que interactúan con el complemento, como el sitio de enlace C1q, se eliminan, y/o se elimina el sitio ADCC [Ver por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)].
Estudios anteriores mapearon el sitio de enlace en IgG humana y murina para Fcr principalmente para la región bisagra inferior compuesta de los residuos de IgG 233-239. Otros estudios propusieron segmentos amplios adicionales, por ejemplo Gly316-Lys338 para el receptor I de Fc humano, Lys274-Arg301 y Tyr407-Arg416 para el receptor III de Fc humano, o encontraron unos pocos residuos específicos fuera de la bisagra inferior, por ejemplo Asn297 y Glu318 para la IgG2b murina que interactúa con el receptor II de Fc murino. El informe de la estructura cristalina 3.2-A del fragmento de Fc de IgG1 humano con el receptor IIIA de Fc humano delineó los residuos de IgG1 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, y Ala327-Ile332 como implicados en el enlace con el receptor IIIA de Fc. Se ha sugerido en base a la estructura cristalina que además de la bisagra inferior (Leu234-Gly237) los residuos en los bucles FG (residuos 326-330) y BC (residuos 265-271) del dominio CH2 de IgG pueden jugar un papel en el enlace con el receptor IIA de Fc. Ver Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001). La mutación de los residuos dentro de los sitios de enlace del receptor de FC puede resultar en una función efectora alterada, como actividad de ADCC o CDC alterada, o vida media alterada. Como se ha descrito anteriormente, las mutaciones potenciales incluyen inserción, deleción o sustitución de uno o más residuos, incluyendo la sustitución con alanina, una sustitución conservadora, una sustitución no conservadora, o reemplazo con un residuo de aminoácidos correspondiente en la misma posición de una subclase de IgG diferente (por ejemplo, reemplazando un residuo de IgG1 con un residuo de IgG2 correspondiente en esa posición).
Shields et al. informaron que los residuos de IgG1 implicados en el enlace con todos los receptores de Fc humanos están localizados en dominio CH2 próximo al bisagra y caen en dos categorías como sigue: 1) posiciones que pueden interactuar directamente con todos los FcR incluyen Leu234-Pro238, Ala327, y Pro329 (y posiblemente Asp265); 2) posiciones que influyen en la naturaleza o posición de carbohidratos incluyen Asp265 y Asn297. Los residuos de IgG1 adicionales que afectaron al enlace con el receptor II de FC fueron como sigue: (efecto mayor) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, y (efecto menor) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, y Lys414. Enlace reducido A327Q, A327S, P329A, D265A y D270A. Además de los residuos identificados anteriormente para toda la FcR, residuos de IgG1 adicionales que redujeron el enlace con el receptor IIIA de Fc por el 40% o más son como sigue: Ser239, Ser267 (Gly sólo), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, y Asp376. Las variantes que mejoraron el enlace con FcRIIIA incluyen T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, y A339T. El Lys414 mostro una reducción del 40% en el enlace para FcRIIA y FcRIIB, Arg416 y una reducción del 30% para FcRIIA y FcRIIIA,, Gln419 una reducción del 30% para el FcRIIA y una reducción del 40% para FcRIIB, y el LYS360 una mejora del 23% para FcRIIIA. Ver también Presta et al., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490.
Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.194.551 describe variantes con función efectora alterada que contienen mutaciones en la región Fc de IgG humana, en la posición del aminoácido 329, 331 ó 322 (usando la numeración de Kabat), algunas de las cuales muestran enlace C1q o actividad CDC reducidas. Como otro ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.737.056 describe variantes con efectora o enlace con Fc-gamma-receptor alteradas que contienen mutaciones en la región Fc de IgG humana, en la posición del aminoácido 238, 239, 248,
249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295,
296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340,
360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439 (usando la numeración de
Kabat), algunas de las cuales muestran perfiles de enlace con el receptor asociados con actividad de CDC o ADCC reducida. De estas, una mutación en la posición del aminoácido 238, 265, 269, 270, 327 ó 329 se manifiesta que
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reducen el enlace con FcRI, una mutación en la posición del aminoácido 238, 265, 269, 270,292, 294, 295, 298, 303,
324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ó 439 se manifiesta que reduce el enlace con FcRII, y una mutación en la posición del aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ó 437 se manifiesta que reduce el enlace con FcRIII.
La Patente de estados Unidos N° 5.624.821 informa que la actividad de enlace con C1q de un anticuerpo murino puede alterarse mutando el residuo del aminoácido 318, 320 ó 322 de la cadena pesada y que reemplazar el residuo 297 (Asn) resulta en la eliminación de la actividad lítica.
La Publicación de Patente de estados Unidos N° 20040132101 describe variantes con mutaciones en las posiciones del aminoácido 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ó 332 (usando la numeración de Kabat) o las posiciones 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ó 332 (usando la numeración de Kabat), de las cuales las mutaciones en las posiciones 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313,
325, 327, 328, 329, 330, ó 332 pueden reducir la actividad ADCC o reducir el enlace con un receptor gamma de Fc.
Chappel et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88(20):9036-40 informaron que la actividad citfílica de la IgG1 es una propiedad intrínseca de su dominio CH2 de la cadena pesada. Mutaciones puntuales individuales en cualquiera de los residuos de aminoácidos 234-237 de la IgG1 disminuyeron significativamente o eliminaron su actividad. Se requirió la sustitución de todos los residuos de la IgG1 234-237 (LLGG) en IgG2 e IgG4 para restaurar la actividad de enlace completa. Se observó que un anticuerpo de IgG2 que contiene la secuencia ELLGGP completa (residuos 233-238) es más activo que la IgG1 del tipo salvaje.
Isaacs et al., J Immunol. 1998;161(8):3862-9 informaron que las mutaciones dentro de un motivo crítico para el enlace de Fc gammaR (glutamato 233 a prolina, leucina/fenilalanina 234 a valina, y leucina 235 a alanina) evitó completamente la merma de las células objetivo. La mutación del glutamato 318 a alanina eliminó la función efectora de la IgG2b de ratón y también redujo la potencia de la IgG4 humana.
Armour et al., Mol Immunol. 2003;40(9):585-93 identificaron variantes de IgG1 que reaccionan con el receptor de activación, FcgammaRIIa, al menos 10 veces menos eficientemente que la IgG1 del tipo salvaje pero cuyo enlace con el receptor inhibidor, FcgammaRIIb, se reduce sólo cuatro veces. Las mutaciones se hicieron en la región de los aminoácidos 233-236 yo en las posiciones de los aminoácidos 327, 330 y 331. Ver también la WO 99/58572.
Xu et al., J Biol Chem. 1994;269(5):3469-74 informan que mutar la IgG1 Pro331 a Ser disminuyó marcadamente el enlace de C1q y eliminó virtualmente la actividad lítica. Por el contrario, la sustitución de Pro por Ser331 en IgG4 confirió actividad lítica parcial (40%) a la variante IgG4 Pro331.
Schuurman et al,. Mol Immunol. 2001;38(1):1-8 informan que mutar una de las cisteínas bisagra implicadas en la formación de enlaces entre cadenas pesadas, Cys226, a serina resultó en un ligamiento entre cadenas pesadas más estable. Mutar la secuencia bisagra de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys a la secuencia bisagra de IgG1 Cys-Pro- Pro-Cys también estabiliza marcadamente la interacción covalente entre las cadenas pesadas.
Angal et al., Mol Immunol. 1993;30(1):105-8 informan que mutar la serina en la posición de aminoácido 241 en la IgG4 a prolina (encontrada en la posición en IgG1 e IgG2) llevó a la producción de anticuerpos homogéneos, así como a extender la vida media sérica y mejorar la distribución del tejido en comparación con la IgG4 quimérica original.
Anticuerpos Humanos y Human Engineered™
Human Engineering™
El Human Engineering™ de los dominios variables de anticuerpos se ha descrito por Studnicka [Ver por ejemplo Studnicka et al. Patente U.S. N° 5.766.886; Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como un método para reducir la inmunogenicidad a la vez que se mantiene la actividad de enlace de las moléculas de anticuerpos. De acuerdo con el método, cada aminoácido de la región variable tiene asignado un riesgo de sustitución. Las sustituciones de aminoácidos se distinguen por de una a tres categorías de riesgo: (1) los cambios de riesgo bajo son aquellos que tienen el potencial más grande de reducir la inmunogenicidad con la menos probabilidad de interrumpir el enlace con el antígeno; (2) los cambios de riesgo moderado son aquellos que reducirían adicionalmente la inmunogenicidad, pero tienen una probabilidad mayor de afectar al enlace con el antígeno o plegado de la proteína; (3) los residuos de alto riesgo son aquellos que son importantes para enlazar o para mantener la estructura del anticuerpo y conllevan el riesgo más alto de que se afecte al enlace con el antígeno o el plegado de la proteína. Debido al papel estructural tridimensional de las prolinas, e consideran generalmente que las modificaciones en las prolinas son al menos cambios de riesgo moderado, incluso si la posición es
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típicamente una posición de riesgo bajo.
Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de roedor son Human Engineered™ como sigue para sustituir los aminoácidos humanos en las posiciones que se determina que es improbable que afecten adversamente o al enlace con el antígeno o el plegado de la proteína, pero probable que reduzcan la inmunogenicidad en un ambiente humano. Los residuos de aminoácidos que están en posiciones de "riesgo bajo" y que son candidatos para la modificación de acuerdo con el método se identifican alineando las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de roedor con una secuencia de la región variable humana. Se puede usar cualquier región variable humana, incluyendo una secuencia VH o VL individual o una secuencia VH o VL de consenso humana o una secuencia de la línea germinal humana individual o de consenso. Se pueden cambiar los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo, o en todas las posiciones de riesgo bajo. Por ejemplo, en cada posición de riesgo bajo donde difieren los residuos de aminoácidos murinos y humanos alineados, se introduce una modificación de aminoácidos que reemplaza el residuo de roedor con el residuo humano. Alternativamente, se pueden cambiar los residuos de aminoácidos en todas las posiciones de riesgo bajo y en cualquier número de posiciones de riesgo moderado. Idealmente, para conseguir la menor inmunogenicidad todas las posiciones de riesgo bajo y moderado se cambian de la secuencia de roedor a la humana.
Los genes sintéticos que contienen regiones variables de la cadena pesada y/o ligera modificadas se construyen y ligan a regiones constantes de la cadena ligera kappa y/o la cadena pesada y humanas. Se puede usar cualquier región constante de la cadena pesada y la cadena ligera humana en combinación con las regiones variables del anticuerpo Human Engineered™, incluyendo IgA (de cualquier subclase como IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (de cualquier subclase, como IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4), o IgM. Los genes de la cadena pesada y la cadena ligera humanos se introducen en células huésped, como células mamíferas, y se obtienen y caracterizan los productos de la inmunoglobulina recombinantes resultantes.
Anticuerpos humanos de animales transgénicos
Los anticuerpos humanos para M-CSF pueden producirse también usando animales transgénicos que no tienen producción de inmunoglobulina endógena y están diseñados para contener loci de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, la WO 98/24893 divulga animales transgénicos que tienen un locus de Ig humana en donde los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de los loci de las cadenas pesadas y ligeras endógenos. La WO 91/741 también divulga huéspedes mamíferos no primates transgénicos capaces de montar una respuesta inmune a un inmunógeno, en donde los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables de primate, y en donde las inmunoglobulinas endógenas que codifican los loci se sustituyen o inactivan. La WO 96/30498 divulga el uso de un sistema Cre/Lox para modificar los locus de inmunoglobulina en un mamífero, como reemplazar toda o una porción de la región constante o variable para formar una molécula de anticuerpo modificada. La WO 94/02602 divulga huéspedes mamíferos no humanos que tienen los loci de Ig endógena indicados y loci de Ig humana funcionales. La Patente U.S. N° 5.939.598 divulga métodos para hacer ratones transgénicos en los que los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan un locus de inmunoglobulina exógeno que comprende una o más regiones constantes xenogenéticas.
Usando un animal transgénico descrito anteriormente, se puede producir una respuesta inmune a una molécula antigénica seleccionada, y las células productoras de anticuerpos pueden ser eliminadas del animal y usadas para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos. Los protocolos de inmunización, adyuvantes y similares se conocen en la técnica, y se usan en la inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en la WO 96/33735. Esta publicación divulga anticuerpos monoclonales contra una variedad de moléculas antigénicas incluyendo IL 6, IL 8, TNFa, CD4 humana, L selectina, gp39, y la toxina del tétanos. Los anticuerpos monoclonales pueden probarse para su capacidad de inhibir o neutralizar la actividad biológica o el efecto fisiológico de la proteína correspondiente. La WO 96/33735 divulga que los anticuerpos monoclonales contra IL-8, derivados de células inmunes de ratones transgénicos inmunizados con IL-8, IL-8 bloqueadas indujeron funciones de neutrófilos. Los anticuerpos monoclonales humanos con especificidad para el antígeno usado para inmunizar animales transgénicos también se divulgan en la WO 96/34096 y la Solicitud de Patente U.S. N° 20030194404; y la solicitud de Patente U.S: N° 20030031667).
Ver también Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y la patente U.S. N° 5.591.669, la Patente U.S. N° 5.589.369, Patente U.S. N° 5.545.807; y Solicitud de Patente U.S. N° 20020199213. La solicitud de patente US N° 20030092125 describe métodos para sesgar la respuesta inmune de un animal para el epítopo deseado. Los anticuerpos humanos pueden también generarse por células B activadas in vitro (ver Patentes U.S. N° 5.567.610 y 5.229.275).
Anticuerpos humanos de tecnología de presentación en fagos
El desarrollo de tecnologías para hacer repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes, y la
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presentación de los fragmentos de anticuerpo codificados en la superficie de un bacteriófago filamentoso, ha proporcionado un medio para hacer anticuerpos humanos directamente. Los anticuerpos producidos por tecnología de fagos se producen como fragmentos que enlazan con el antígeno -habitualmente fragmentos Fc o Fab- en bacterias y por lo tanto carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras pueden introducirse por una de dos estrategias: Los fragmentos pueden ser diseñados ya sea en anticuerpos completos para la expresión en células mamíferas, o en fragmentos de anticuerpos biespecíficos con un segundo sitio de enlace capaz de activar una función efectora.
Típicamente, el fragmento Fd (Vh-Ch1) y la cadena ligera (Vl-Cl) de los anticuerpos se clonan separadamente por PCR y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de presentación en fagos combinacionales, que pueden ser después seleccionadas para el enlace con un antígeno particular. Los fragmentos Fab se expresan en la superficie del fago, es decir, ligados físicamente a los genes que los codifican. Así, la selección del Fab por el enlace del antígeno co-selecciona para las secuencias que codifican el Fab, que pueden amplificarse posteriormente. Con varias rondas de enlace con antígeno y re-amplificación, un procedimiento denominado panning, los específicos del Fab para el antígeno se enriquecen y finalmente se aíslan.
En 1994, se describió un enfoque para la humanización de anticuerpos ,denominado "selección guiada". La selección guiada utiliza la potencia de la técnica de presentación en fagos para la humanización de anticuerpo monoclonal de ratón (ver, Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón se puede presentar en combinación con una biblioteca de la cadena ligera humana, y la biblioteca de Fab híbrida resultante puede ser entonces seleccionada con el antígeno. El fragmento Fd de ratón proporciona de este modo una plantilla para guiar en la selección. Posteriormente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una biblioteca del fragmento Fd humano. La selección de la biblioteca resultante proporciona Fab completamente humano.
Se han descrito una variedad de procedimientos para derivar anticuerpos humanos de bibliotecas de presentación en fagos (ver por ejemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Patentes U.S. N° 5.565.332 y 5.573.905; Clackson, T., y Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). En particular, la selección in vitro y la evolución de los anticuerpos derivados de bibliotcas de presentación en fagos se ha vuelto una herramienta poderosa (ver Burton, D. R., y Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); y, Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); la solicitud de patente U.S. N° 20020004215 y la WO92//01047; la solicitud de patente U.S. N° 20030190317 publicada el 9 de Octubre del 2003 y la Patente U.S. N° 6.054.287; Patente U.S. N° 5.877.293.
Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, y la solicitud de Patente U.S. N° 200120030044772 publicada el 6 de Marzo del 2003 describen métodos para cribar bibliotecas de anticuerpos expresadas en fagos u otras moléculas de enlace por elevación de captura, un método que implica la inmovilización de las moléculas de enlace candidatas en un soporte sólido.
Los productos del anticuerpo pueden cribarse para actividad e idoneidad en los métodos de tratamiento descritos en la presente usando ensayos como se describe en la sección titulada "Métodos de Cribado" en la presente o usando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica.
Otras modificaciones covalentes
Las modificaciones covalentes del anticuerpo también se incluyen dentro del ámbito de esta divulgación. Pueden hacerse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. En la nomenclatura se introducen otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la molécula reaccionando los residuos de aminoácidos objetivo del anticuerpo con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C- terminales.
Los residuos de cisteinil se reaccionan más comúnmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes) como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinil también se derivan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido alfa- bromo-p- (5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, metil 2- piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4- nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los residuos de histidil se derivan por la reacción don dietilpirocarbonato a un pH de 5.5-7.0 ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidil. También es útil el bromuro de para- bromofenacil; la reacción se realiza preferiblemente en 0,1 M de cacodilato de sodio a pH 6.0.
El lisinil y los residuos amino-terminales se reaccionan con succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivación con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinil. Otros reactivos adecuados para derivar residuos que contienen .alfa.-amino incluyen imidoésteres como picolinimidato de
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metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4- pentanodiona, y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.
Los residuos de arginil se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivación de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanadina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo épsilon-amino de arginina.
Se puede hacer la modificación específica de los residuos de tirosil, con particular interés en introducir etiquetas espectrales en los residuos de tirosil por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosil se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas etiquetadas para su uso en radioinmunoensayos.
Los grupos laterales carboxilo (aspartil o glutamil) son modificados selectivamente por reacción con carbodiimidas (R-N.dbd.C.dbd.N-R'), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4- etil) carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartil y glutamil se convierten en residuos de asparaginil y glutaminil por reacción con iones de amonio.
Los residuos de glutaminil y asparaginil son desamidados frecuentemente a los residuos de glutamil y aspartil correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos cae dentro del alcance de esta divulgación.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos .alfa.-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente implica acoplar química o enzimáticamente glucósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación N- o O- ligada. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares pueden unirse a (a) arginina o histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptofano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en la WO87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259306 (1981).
La eliminación de los restos de carbohidratos presentes en el anticuerpo puede conseguirse química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayoría de todos los azúcares excepto el azúcar de ligamiento (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina),, mientras que deja el anticuerpo intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) y por Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de los restos de carbohidratos en anticuerpos puede conseguirse por el uso de una variedad de endo- o exo- glicosidasas como se describe por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende ligar el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, polioles polioxietilados, polioxietilado sorbitol, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, o polímeros de polisacáridos como dextrano. Dichos métodos son conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Patentes U.S. N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192, 4.179.337, 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285, 4.609.546 o EP 315 456.
Terapia Génica
La administración de un anticuerpo terapéutico a las células apropiadas puede efectuarse por terapia génica ex vivo, in situ, o in vivo por el uso de cualquier enfoque adecuado conocido en la técnica, incluyendo el uso de métodos de transferencia de ADN físicos (por ejemplo tratamientos con liposomas o químicos) o por el uso de vectores víricos ( por ejemplo adenovirus virus adeno-asociados o un retrovirus). Por ejemplo, para una terapia in vivo, se puede inyectar en el sujeto un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado, ya sea solo o en conjunción con un vector, liposoma o precipitado, y puede inyectarse en el sitio donde la expresión del compuesto de anticuerpo se desea. Para el tratamiento ex vivo, se retiran las células del sujeto, se introduce el ácido nucleico en estas células, y las células modificadas se retornan al sujeto ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que están implantadas en el paciente. Ver por ejemplo las Patentes U.S. N° 4.892.538 y 5.283.187. Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o in vivo en células
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del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, y precipitación con fosfato cálcico. Un vector usado comúnmente para la administración ex vivo de un ácido nucleico es un retrovirus.
Otras técnicas de transferencia de ácidos nucleicos incluyen la transfección con vectores víricos (como adenovirus, virus de herpes simple I, o virus adeno-asociados) y sistemas basados en lípidos. El ácido nucleico y el agente de transfección están opcionalmente asociados con una micropartícula. Agentes de transfección de ejemplo incluyen co-precipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, anfífilo de DOTMA (dioleoiloxipropilo) de amonio cuaternario, bromuro de trimetilamonio, comercializado como Lipofectin por GIBCO-BRL))(Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081); diésteres de glutamato lipofílicos con cabezas de trimetilamonio colgantes (Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); lipidos parentales metabolizables como el lípido catiónico dioctadecilamido glicilspermina (DOGS, Transfectam, Promega) y dipalmitoilfosfatidil etanolamilspermina (DPPES)(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); sales de amonio cuaternarias metabolizables (DOTB, N- (1- [2,3-dioleoiloxi] propil) -N, N, N-trimetilamonio metilsulfato (DOTAP) (Boehringer Mannheim), polietilenimina (PEI), ésteres de dioleoilo, ChOTB, Chosc, DOSC) (Leventis et al . (1990) Biochim Inter 22, 235-241); 3beta[N-(N ',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE)/3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-Carbamoil]colesterolDC-Chol en mezclas uno a uno (Gao et al, (1991) Biochim Biophys Acta 1065, 8-14...), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr et al, Bioconjugate Chem, 1994, 5:. 382-389), polilisinas lipófilas (LPLL) ( Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), [[(1,1,3,3-tetrametil-butil)cre-soxi]etoxi]etil]dimetilbe nzilammonio hidróxido (hidróxido de DEBdA) con un exceso de fosfatidilcolina/colesterol (Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), mezclas de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)/DOPE (Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37 ), diéster lipofílico de ácido glutámico (TMAG) con DOPE, CTAB, DEBDA, bromuro de didodecilamonio (DDAB), y estearilamina en mezcla con fosfatidiletanolamina (Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB / DOPE (transfectace, Gibco BRL), y oligogalactosa que lleva lípidos. Agentes potenciadores de la transfección de ejemplo que aumentan la eficiencia de la transferencia incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, péptido interruptor del lisosoma (Ohmori NI et al, Biochem Biophys Res Commun Jun 27, 1997; 235 (3):. 726-9) , proteoglicanos basados en chondroitan, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H et al J Biol Chem, 1998 273 (13):. 750711), péptido de enlace con integrina CYGGRGDTP, nonasacarido de dextrano lineal, glicerol, grupos colesterilo atados en el enlace internucleosídico 3'-terminal de un oligonucleótido (Letsinger, RL 1989 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 86: (17): 6553-6), lisofosfatida, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, y la línea 1-oleoil lisofosfatidilcho.
En algunas situaciones puede ser deseable administrar el ácido nucleico con un agente que dirija el vector que contiene ácidos nucleicos a células objetivo. Dichas moléculas de "focalización" incluyen anticuerpos específicos para una proteína de la membrana de la superficie celular en la célula objetivo, o un ligando para un receptor de la célula objetivo. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que enlazan con una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis puede usarse para focalizar y/o facilitar la absorción. Ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas de la cápside y fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula particular, los anticuerpos para proteína que se someten a internalización en ciclado, y proteínas que enfocan la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. Alternativamente, se puede usar endocitosis mediada por receptores. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Wu et al., 1987 or Wagner et al., 1990. Para la revisión de los protocolos de terapia génica y marcado de genes actualmente conocidos, ver Anderson 1992. Ver también la WO93/25673 y las referencias citadas en la misma. Para revisiones adicionales de tecnología de terapia génica, ver Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, suplemento al vol. 392, no 6679, pp. 2530 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); y Miller, Nature, 357: 455460 (1992).
Métodos de Cribado
Los agentes terapéuticos efectivos dependen de identificar agentes eficaces vacíos de toxicidad significativa. Los anticuerpos pueden cribarse para la afinidad de enlace por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar ensayos de cambio en gel, transferencias Western, ensayo de competición radiomarcado, co-fraccionamiento por cromatografía, co-precipitación, reticulación, ELISA y similares, que se describen en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY.
Para cribar inicialmente para anticuerpos que enlazan con el epítopo deseado en M-CSF (por ejemplo, los que bloquean el enlace de RX1, 5H4, MC1 y/o MC3 a M-CSF), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). También se pueden usar ensayos de enlace competitivo rutinarios, en los que el anticuerpo desconocido se caracteriza por su capacidad de inhibir el enlace de M-CSF con un anticuerpo específico de M-CSF como se divulga en la presente. Se pueden usar M-CSF intacto, fragmentos del mismo, o epítopos lineales representados por los aminoácidos 98-105 del M-CSF de la Figura 12, o los aminoácidos 65-73 ó 138-144 de la Figura 12 (correspondientes a los epítopos de M-CSF reconocidos por 5H4 y MC3). El mapeo de epítopos se describe en Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).
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Se contempla además que los anticuerpos sean probados después para su efecto en la osteoclastogénesis, seguido por la administración a animales. Los compuestos potencialmente útiles en prevenir o tratar la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer pueden cribarse usando varios ensayos. Por ejemplo, un antagonista candidato puede primero ser caracterizado en un sistema celular cultivado para determinar su capacidad de neutralizar al M-CSF en inducir osteoclastogénesis. Dicho sistema puede incluir un co-cultivo de osteoblastos calvarios de ratón y células de bazo Suda et al., Modulation of osteoclast differentiation. Endocr. Rev. 13: 66 80, 1992; Martin and Udagawa, Trends Endocrinol. Metab. 9: 6-12, 1998), el co-cultivo de líneas celulares estromales de ratón (por ejemplo MC3T3-G2/PA6 y ST2) y células de bazo de ratón (Udagawa et al., Endocrinology 125: 1805 13, 1989), y el co-cultivo de células ST2 y células de médula ósea, células mononucleares de sangre periférica o macrófagos alveolares (Udagawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7260 4, 1990; Sasaki et al., Cancer Res. 58: 462 7, 1998; Mancino et al., J. Surg. Res.100: 18-24, 2001). En ausencia de cualquier antagonista de M-CSF, las células multinucleadas formadas en dichos co-cultivos satisfacen los criterios principales de los osteoclastos como la actividad de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, un enzima marcador de osteoclastos), receptores de calcitonina, p60C-STC, receptores de citronectina, y la capacidad para formar pozos de resorción en el hueso y cortes de dentina. La presencia de un antagonista de M-CSF efectivo inhibe la formación de dichas células multinucleadas.
Además de los anteriores sistemas de co-cultivo, se puede ensayar la capacidad de un anticuerpo de M- CSF candidato para inhibir la osteoclastogénesis en un sistema libre de células estromales o libre de osteoblastos. El M-CSF requerido para la osteoclastogénesis puede proporcionarse por células de cáncer metastásicas cocultivadas (por ejemplo MDA231) o medio condicionado de estas células de cáncer (Mancino et al., J. Surg. Res. 0: 18-24, 2001) o por adición de M-CsF purificado.
La eficacia de un anticuerpo de M-CSF dado en evitar o tratar la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer puede probarse también en cualquiera de los sistemas de modelos de metástasis ósea animales familiares para los expertos en la técnica. Dichos sistemas de modelos incluyen aquellos que implican la inyección directa de células tumorales en la cavidad medular de los huesos (Ingall, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 117: 819-22, 1964; Falasko, Clin. Orthop. 169: 20 7, 1982), en la aorta abdominal de rata (Powles et al., Br. J. Cancer 28: 316 21, 1973), en la vena de la cola lateral de ratón o en el ventrículo izquierdo de ratón (Auguello et al., Cancer Res. 48: 6876 81, 1988). En ausencia de un antagonista de M-CSF efectivo, la metástasis ósea osteolítica formada a partir de células tumorales inyectadas puede determinarse por radiografías (áreas de lesiones óseas osteolíticas) o histología e inmunohistoquímica (hueso y tejidos blandos). Sasaki et al., Cancer Res. 55: 3551 7, 1995; Yoneda et al., J. Clin. Invest. 99: 2509 17, 1997. Clohisy y Ramnaraine, Orthop Res. 16: 660 6, 1998. Yin et al., J. Clin. Invest. 103: 197 206, 1999. En presencia de un anticuerpo de M-CSF efectivo, la metástasis ósea osteolítica puede evitarse, o inhibirse para resultar en menos metástasis o más pequeña.
Los anticuerpos de M-CSF de la presente divulgación pueden ser también útiles para prevenir o tratar metástasis del cáncer. La efectividad de un anticuerpo de M-CSF candidato para evitar o tratar metástasis del cáncer puede cribarse usando un modelo de invasión de membrana basal amniótica humana como se describe en Filderman et al., Cancer Res 52: 36616, 1992. Además, también puede usarse cualquiera de los sistemas de modelos animales para la metástasis de varios tipos de cáncer. Dichos sistemas de modelos incluyen, pero no están limitados a, los descritos en Wenger et al., Clin. Exp. Metastasis 19: 169 73, 2002; Yi et al., Cancer Res. 62: 917 23, 2002; Tsutsumi et al., Cancer Lett 169: 77-85, 2001; Tsingotjidou et al., Anticancer Res. 21: 971 8, 2001; Wakabayashi et al., Oncology 59: 75 80, 2000; Culp y Kogerman, Front Biosci. 3:D672 83, 1998; Runge et al., Invest Radiol. 32: 212 7; Shioda et al., J. Surg. Oncol. 64: 122 6, 1997; Ma et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2293 301, 1996; Kuruppu et al., J Gastroenterol Hepatol. 11: 26 32, 1996. En presencia de un anticuerpo de M-CSF efectivo, se puede evitar la metástasis del cáncer, o inhibirse para resultar en menos metástasis y/o más pequeña.
La actividad anti-tumoral de un anticuerpo de M-CSF particular, o combinación de anticuerpos de M-CSF, puede evaluarse in vivo usando un modelo animal adecuado. Por ejemplo, los modelos de cáncer de linfoma xenogénicos en donde se introducen células de linfoma humanas en animales inmunocomprometidos, como ratones desnudos o SCID. La eficacia puede predecirse usando ensayos que miden la inhibición de la formación del tumor, la regresión del tumor o la metástasis, y similares.
En una variación de un ensayo in vitro, la divulgación incluye un método que comprende los pasos de (1) poner en contacto un M-CSF inmovilizado con un anticuerpo candidato y (b) detectar el enlace del anticuerpo candidato con el M-CSF. Alternativamente, el anticuerpo candidato puede inmovilizarse y se detecta el enlace del M- CSF. La inmovilización se consigue usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la unión covalente a un soporte, una microesfera o una resina cromatográfica, así como interacción de alta afinidad no covalente como enlace de anticuerpos, o el uso de enlace de estreptavidina/biotina en donde el compuesto inmovilizado incluye un resto de biotina. La detección del enlace se puede conseguir (i) usando un marcador radioactivo en el compuesto que se inmoviliza, (ii) usando un marcador fluorescente en el compuesto no inmovilizado, (iii) usando un anticuerpo inmunoespecífico para el compuesto no inmovilizado, (iv) usando marcador en el compuesto no inmovilizado que excite un soporte fluorescente al que está unido el compuesto inmovilizado, así como otras técnicas bien conocidas y practicadas rutinariamente en la técnica.
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Los anticuerpos que modulan (es decir, aumentan, disminuyen o bloquean) la actividad o expresión del M- CSF pueden identificarse incubando un modulador putativo con una célula que expresa M-CSF y determinando el efecto del modulador putativo en la actividad o expresión del M-CSF. La selectividad de un anticuerpo que modula la actividad de un polipéptido o polinucleótido de M-CSF puede evaluarse comparando sus efectos en el polipéptido o polinucleótido de M-CSF con su efecto en otros compuestos relacionados. Los moduladores selectivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos y otras proteínas, péptidos o moléculas orgánicas que enlazan específicamente con polipéptidos de M-CSF o con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de M-CSF. Los moduladores de la actividad de M-CSF serán útiles terapéuticamente en el tratamiento de enfermedades y condiciones fisiológicas en las que la actividad normal o aberrante del polipéptido de M-CSF está implicada.
La divulgación también comprende ensayos de cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar anticuerpos que interactúan con o inhiben la actividad biológica (es decir, inhiben la actividad enzimática, la actividad de enlace, etc.) de un polipéptido de M-CSF. Los ensayos HTS permiten el cribado de grandes números de compuestos de una manera eficientes. Los sistemas HTS basados en células se contemplan para investigar la interacción entre polipéptidos de M-CSF y sus compañeros de enlace. Los ensayos HTS están diseñados para identificar "aciertos" o "compuestos líderes" que tienen la propiedad deseada, a partir de los cuales se pueden diseñar modificaciones para mejorar la propiedad deseada. La modificación química del "acierto" o "compuesto líder" se basa a menudo en una relación de estructura/actividad identificable entre el "acierto" y los polipéptidos de M-CSF.
Otro aspecto de la presente divulgación está dirigido a métodos para identificar anticuerpos que modulan (es decir, disminuyen) la actividad de un M-CSF que comprenden poner en contacto un M-CSF con un anticuerpo, y determinar si el anticuerpo modifica la actividad del M-CSf. La actividad en presencia del anticuerpo de prueba se compara con la actividad en ausencia del anticuerpo de prueba. Cuando la actividad de la muestra que contiene el anticuerpo de prueba es menor que la actividad en la muestra que carece del anticuerpo de prueba, el anticuerpo tendrá actividad inhibida.
Hay disponibles una variedad de sistemas heterólogos para la expresión funcional de polipéptidos recombinantes que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos sistemas incluyen bacterias (Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98), levaduras (Pausch, Trends in Biotechnology (1997) 15:487-494), varias clases de células de insectos (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:189-268), células de anfibios (Jayawickreme et al., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8: 629-634) y varias líneas celulares mamíferas (ChO, HEK293, COS, etc.; ver Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:1-23). Estos ejemplos no excluyen el uso de otros sistemas de expresión celular posibles, incluyendo líneas celulares obtenidas de nematodos (solicitud de PCT WO 98/37177).
También se divulgan en la presente métodos para cribar anticuerpos que modulan la actividad de M-CSF que comprenden poner en contacto anticuerpos de prueba con un polipéptido de M-CSF y ensayar para la presencia de un complejo entre el anticuerpo y el M-CSF. En dichos ensayos, el ligando está típicamente etiquetado. Después de incubación adecuada, el ligando libre se separada del presente en forma enlazada, y la cantidad de marcador libre o no compleja es una medida de la capacidad del anticuerpo particular para enlazar con el M-CSF o el polipéptido de M-CSFR.
Puede emplearse cribado de alto rendimiento para fragmentos de anticuerpos o CDRs que tienen afinidad de enlace adecuada con un polipéptido de M-CSF. Brevemente, grandes números de diferentes compuestos de prueba de péptidos pequeños se sintetizan en un sustrato sólido. Los anticuerpos de prueba de péptidos se ponen en contacto con un polipéptido de M-CSF y se lavan. Los polipéptidos de M-CSF enlazados son después detectados por métodos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos purificados de la divulgación pueden también recubrirse directamente en placas para su uso en las técnicas de cribado de fármacos anteriormente mencionadas. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar la proteína e inmovilizarla en el soporte sólido.
Terapia de Combinación
Habiendo identificado más de un anticuerpo de M-CSF que es efectivo en un modelo animal, pude ser adicionalmente ventajoso mezclas dos o más de dichos anticuerpos de M-CSF juntos para proporcionar todavía mejor eficacia contra la metástasis del cáncer y/o la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer. Las composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de M-CSF pueden administrarse a personas o mamíferos que sufren de, o están predispuestas a sufrir de, metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer. La administración concurrente de dos agentes terapéuticos no requiere que los agentes sean administrados al mismo tiempo o por la misma ruta, siempre que haya una superposición en el periodo temporal durante el que los agentes están ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, como la administración en diferentes días o semanas.
Aunque la terapia de anticuerpos de M-CSF puede ser útil para todas las etapas de cánceres, la terapia de anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cáncer avanzados o metastásicos. Combinar el método de terapia de anticuerpos con un régimen quimioterapéutico o de radiación puede preferirse en pacientes que no han
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recibido tratamiento quimioterapéutico, mientras que el tratamiento con el terapia de anticuerpos puede ser indicada para pacientes que han recibido una o más quimioterapias. Adicionalmente, la terapia de anticuerpos puede también permitir el uso de dosificaciones reducidas de de quimioterapia concomitante, particularmente en pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente terapéutico.
En la presente se contempla la administración de anticuerpos anti-M-CSF individuales, así como las combinaciones o "cócteles" de diferentes anticuerpos. Dichos cócteles de anticuerpos pueden tener ciertas ventajas en la medida en que contienen anticuerpos que explotan diferentes mecanismos efectores o combinan directamente anticuerpos citotóxicos con anticuerpos que se basan en la funcionalidad efectora inmune. Dichos anticuerpos en combinación pueden mostrar efectos terapéuticos sinérgicos.
Combinar RX1 o derivados Human Engineered™ de anticuerpo RX1 con otros agentes terapéuticos puede tener un efecto en un paciente que experimenta enfermedad osteoclástica y/o crecimiento tumoral o metástasis. Por ejemplo, podría usarse el anticuerpo RX1 en la fabricación de un medicamento para tratar un paciente que tiene una enfermedad osteolítica en donde dicho medicamento se coordina con tratamiento que usa un anticuerpo anti- RANKL, receptor de RANKL soluble, otros inhibidores de RANKL, o bifofonatos (por ejemplo, Aredia; Zometa; Clodronato). Alternativamente, podría usarse un anticuerpo anti-RANKL o bifosfonato en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que tiene una enfermedad osteolítica en donde dicho medicamento está coordinado con tratamiento usando anticuerpo RX1 o derivado human engineered de anticuerpo RX1. La combinación podría tener también un efecto sinérgico en un paciente tratado. El anticuerpo RX1 y otros agentes terapéuticos no necesitan ser administrados simultáneamente. El RX1 o la variante human engineered y el otro agente terapéutico pueden administrarse dentro de 1 día, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año o dos años de diferencia entre sí.
También se contempla el uso de un anticuerpo RX1 o derivado Human Engineered™ del anticuerpo RX1 en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que tiene una enfermedad osteolítica en donde dicho medicamento se usa en un paciente que ha sido pre-tratado con un anticuerpo anti-RANKL o bifosfonatos. "Pretratamiento" significa que el paciente ha sido tratado dentro de 2 años, 1 año, 6 meses, 3 meses 2 meses, 1 mes, 2 semanas, 1 semana, o al menos un día antes del tratamiento con RX1 o variante Human Engineered™ del RX1.
El anticuerpo RX1 o variantes Human Engineered™ se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos contra el cáncer. Por ejemplo, podría usarse el anticuerpo RX1 o variantes human engineered en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que tenga enfermedad de cáncer en donde dicho medicamento se coordina con tratamiento que usa otros agentes y/o procedimientos terapéuticos, incluyendo pero no limitado a agentes quimioterapéuticos, andrógeno-bloqueantes, y moduladores inmunes (por ejemplo, IL-2, GM- CSF, SLC), bifosfonatos (s) (por ejemplo, Aredia; Zometa; Clodronato), cirugía, radiación, quimioterapia citotóxica, terapia hormonal (por ejemplo, tamoxifeno; terapia anti-andrógenos), terapia de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos para neutralizar RaNKL/RANK; PTHrP neutralizante, anti-HER2, anti-CD20, anti-CD40, Cd22, VEGF, IGFR-1, EphA2, HAAH, TMEFF2, anticuerpos CAIX), terapia de proteína terapéutica (por ejemplo, receptor de RANKL soluble; OPG, y PDGF e inhibidores de MMP), terapia de fármacos de moléculas pequeñas (por ejemplo, inhibidor de Src-quinasa), inhibidores de la quinasa de receptores de factores de crecimiento, o inhibidores de RANKL, terapia de oligonucleótidos (por ejemplo, RANKL o RANK o PTHrP anti-sentido), terapia génica (por ejemplo, inhibidores de RANKL o RANK), terapia con péptidos (por ejemplo, muteínas de RANKL), así como aquellas proteínas, péptidos, compuestos, y moléculas pequeñas descritos en la presente.
El RX1 y las variantes Human Engineered™ pueden usarse en la fabricación de un medicamento para tratar pacientes que han sido pretratados con los agentes terapéuticos anteriormente mencionados.
Un agente citotóxico se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186, agentes quimioterapéuticos y toxinas como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o toxinas sintéticas, o fragmentos de las mismas. Un agente no citotóxico se refiere a una sustancia que no inhibe o evita la función de las células y/o no provoca la destrucción de las células. Un agente no citotóxico puede incluir un agente que puede ser activado para ser citotóxico. Un agente no citotóxico puede incluir una microesfera, liposoma, matriz o partícula (ver por ejemplo, Publicaciones de Patente U.S: 2003/0028071 y 2003/0032995). Dichos agentes pueden estar conjugados, acoplados, ligados o asociados con un anticuerpo de acuerdo con la divulgación.
Los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer incluyen, sin limitación, agentes alquilantes, como carboplatino y cisplatino; agentes alquilantes de mostaza de nitrógeno; agentes alquilantes de nitrosourea, como carmustina (BCNU); antimetabolitos, como metotrexato; ácido folínico; antimetabolitos análogos de purina, mercaptopurina; antimetabolitos análogos de pirimidina, como fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina (Gemzar®); antineoplásicos hormonales, como goserelina, leuprolida, y tamoxifeno; antineoplásicos naturales, como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etopósido (VP-16), interferón alfa, paclitaxel (Taxol®) y tretinoína (ATRA); antineoplásicos naturales antibióticos, como bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, daunomicina
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y mitomicinas incluyendo mitomicina C; y antineoplásicos naturales alcaloides de la vinca, como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxiurea; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarrubicina, ancitabina, nimustina, clorhidrato de procarbazina, carboquona, carboplatino, carmofur, cromomicina A3, polisacáridos antitumorales, factores plaquetarios antitumorales, ciclofosfamida (Cytoxin®), esquizofilano, citarabina (citosina arabinósido), dacarbazina , tioinosina, tiotepa, tegafur, dolastatinas, análogos de dolastatina como auristatina, CPT-11 (irinotecano), mitoxantrona, vinorelbina, tenipósido, aminopterina, carminomicina, esperamicinas (ver, por ejemplo, Patente U.S. N° 4.675.187), neocarzinostatina, OK-432 , bleomicina, furtulon, broxuridina, busulfán, honvan, peplomicina, bestatina (Ubenimex ®), p interferón, mepitiostano, mitobronitol, melfalán, péptidos de laminina, lentinan, extracto de Coriolus versicolor, tegafur/uracilo, estramustina (estrógeno/mecloretamina).
Además, agentes adicionales usados como terapia para pacientes con cáncer incluyen EPO, G-CSF, ganciclovir; antibióticos, leuprolida; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 a 18, incluyendo mutantes y análogos; interferones o citocinas, como interferones a, p, y y hormonas, como la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) y análogos y, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); factores de crecimiento, como factor de crecimiento p de transformación (TGF-p), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de liberación de la hormona del crecimiento (GHRF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor homólogo del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFHF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y factor de crecimiento de insulina (IGF); factor de necrosis tumoral a y p (TNF-a y p); factor inhibidor de invasión-2 (IIF-2); proteínas morfogenéticas óseas 1-7 (BMP 1-7); somatostatina; timosina- a -1; Y-globulina; superóxido dismutasa (SOD); factores del complemento; factores anti-angiogénesis; materiales antigénicos; y pro-fármacos.
Profármaco se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica o no citotóxica para células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en una forma parental activa o más actica. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos incluyen, pero no están limitados a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con ácidos D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen p-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse en una forma de profármaco para su uso en la presente incluyen, pero no están limitados a, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Administración y preparación
Los anticuerpos anti-M-CSF divulgados en la presente pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprende un portador adecuado para el método de administración deseado. Los portadores adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combina con los anticuerpos anti-M-CSF, retiene la función anti-tumoral del anticuerpo y es no reactivo con los sistemas inmunes del sujeto. Los ejemplo incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de un número de portadores farmacéuticos estándar como soluciones salinas tamponadas con fosfato estéril, agua bacteriostática, y similares. Se pueden usar una variedad de portadores, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares, y pueden incluir otras proteínas para estabilidad mejorada como albúmina, lipoproteína, globulina, etc., sometidas a modificaciones químicas suaves o similares.
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para el almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales, (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de amonio octadecildimetilbencil; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; parabenos de alquilo como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3- pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que está siendo tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente inmunosupresor. Dichas moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son
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efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos pueden estar también atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina uy microcápsulas de poli-(metil-metacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones a ser usadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.
El anticuerpo se administra por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente por infusión de pulso, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente la dosificación se da por inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se contemplan otros métodos de administración, incluyendo administración tópica, particularmente transdérmica, transmucosal, rectal, oral o local, por ejemplo a través de un catéter colocado cerca del sitio deseado.
Las composiciones divulgadas en la presente ueden estar en la forma de, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, cápsulas, jarabes, supositorios, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las composiciones instantáneas se pueden formular para varias vías de administración, por ejemplo, por administración oral, por administración nasal, por administración rectal, inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyecciones intramusculares, o inyección intraperitoneal. Las formas de dosificación siguientes se dan a modo de ejemplo y no se deben considerar como limitativas de esta invención.
Para administración oral, bucal y sublingual, los polvos, suspensiones, gránulos, comprimidos, píldoras, cápsulas, cápsulas de gelatina y comprimidos oblongos son aceptables como formas de dosificación sólidas. Estas se pueden preparar, por ejemplo, mezclando uno o más compuestos de la presente invención, o sales farmacéuticamente aceptables o tautómeros de los mismos, con al menos un aditivo como una almidón u otro aditivo. Los aditivos adecuados son sacarosa, lactosa, azúcar de celulosa, manitol, maltitol, dextrano, almidón, agar, alginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma de tragacanto, goma arábiga, gelatinas, colágenos, caseína, albúmina, polímeros sintéticos o semi-sintéticos o glicéridos. Opcionalmente, las formas de dosificación oral pueden contener otros ingredientes para ayudar en la administración, como un diluyente inactivo, o lubricantes como estearato de magnesio, o conservantes como parabeno o ácido sórbico, o antioxidantes como ácido ascórbico, tocoferol o cisteína, un agente disgregante, aglutinantes, espesantes, tampones, edulcorantes, agentes aromatizantes o agentes perfumantes. Los comprimidos y las píldoras pueden ser tratados adicionalmente con materiales de recubrimiento adecuados conocidos en la técnica.
Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden estar en la forma de emulsiones farmacéuticamente aceptables, jarabes, elixires, suspensiones y soluciones, que pueden contener un diluyente inactivo como agua. Las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden prepararse como suspensiones o soluciones líquidas usando un líquido estéril como, pero no limitado a, un aceite, agua, un alcohol, y combinaciones de estos. Se pueden añadir surfactantes farmacéuticamente aceptables, agentes de suspensión, agentes emulsionantes para la administración oral o parenteral.
Como se ha indicado anteriormente, las suspensiones pueden incluir aceites. Dicho aceite incluye, pero no está limitado a, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz y aceite de oliva. La preparación de suspensión puede también contener ésteres de ácidos grasos como oleato de etilo, miristato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos de ácidos grasos acetilados. Las formulaciones de suspensión pueden incluir alcoholes como, pero no limitados a, etanol, alcohol isopropílico, alcohol hexadecílico, glicerol y propilenglicol. TAmbién se pueden usar en formulaciones de suspensiones éteres como, pero no limitado a poli(etilenglicol), hidrocarburos de petróleo como aceite mineral y vaselina; y agua.
Para la administración nasal, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden ser un espray o aerosol que contiene un solvente(s) apropiado y opcionalmente otros compuestos como, pero no limitado a, estabilizantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores de pH, surfactantes, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de éstos. Un propulsor para una formulación de aerosol puede incluir aire comprimidos, nitrógeno, dióxido de carbono, o un solvente de bajo punto de ebullición basado en hidrocarburos.
Las formas de dosificación inyectables incluyen generalmente suspensiones acuosas o suspensiones oleosas que pueden prepararse usando un dispersante o agente humectante adecuado y un agente de suspensión. Las formas inyectables pueden estar en fase de solución o en la forma de una suspensión, que se prepara con un
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solvente o diluyente. Los solventes o vehículos aceptables incluyen agua esterilizada, solución de Ringer, o una solución salina acuosa isotónica. Alternativamente, se pueden emplear aceites estériles como solventes o agentes de suspensión. Preferiblemente, el aceite o ácido graso es no volátil, incluyendo aceites naturales y sintéticos, ácidos grasos, mono-, di- o tri-glicéridos.
Para inyección, las formulación farmacéutica yo medicamento puede ser un polvo adecuado para la reconstrucción con una solución apropiada como se ha descrito anteriormente. Ejemplos de estos incluyen, pero no están limitados a polvos liofilizados, por secado rotatorio o secados por espray, polvos amorfos, gránulos, precipitados o particulados. Para inyección, las formulaciones pueden opcionalmente contener estabilizantes, modificadores del pH, surfactantes, modificantes de la biodisponibilidad y combinaciones de estos.
Para la administración rectal, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden estar en la forma de un supositorio, una pomada, un enema, un comprimido o una crema para la liberación del compuesto en los intestinos, flexura sigmoidea y/o recto. Los supositorios rectales se preparan mezclando uno o más compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables o tautómeros del compuesto, con vehículos aceptables, por ejemplo manteca de cacao o polietilenglicol, que está presente en una fase sólida a temperaturas de almacenamiento normales, y presente en una fase líquida a aquellas temperaturas adecuadas para liberar el fármaco dentro del cuerpo, como en el recto. También se pueden emplear aceites en la preparación de las formulaciones del tipo de gelatina blanda y supositorios. Se puede emplear agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas en la preparación de las formulaciones de suspensión que pueden contener también agentes de suspensión como pectinas, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o carboximetilcelulosa, así como tampones y conservantes.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices están en forma de artículos conforma, por ejemplo películas o microcápsula. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente U.S. N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutamic e y etil-L-glutamato, acetato de etileno- vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Aunque los polímeros como el acetato de etileno-vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo periodo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de una exposición a la humedad a 37° C, resultando en una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es intermolecular en la formación del enlace S--S a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede conseguir la estabilización modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicas.
Las formulaciones de la divulgación pueden ser diseñadas para ser de actuación corta, liberación rápida, de actuación larga o liberación sostenida como se describe en la presente. Así, las formulaciones farmacéuticas también pueden formularse para la liberación controlada o para liberación lenta.
Las composiciones instantáneas pueden también comprender, por ejemplo, micelas o liposomas, o alguna otra forma encapsulada, o pueden administrarse en una forma de liberación extendida para proporcionar un almacenamiento y/o efecto de administración prolongado. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas y medicamentos pueden comprimirse en pellets o cilindros e implantarse intramuscularmente o subcutáneamente como inyecciones de depósito o como implantes como stents. Dichos implantes pueden emplear materiales inertes conocidos como siliconas o polímeros biodegradables.
Además de las formas de dosificación representativas descritas anteriormente, los excipientes y portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente conocidos por los expertos en la técnica y por lo tanto incluidos en la presente divulgación. Dichos excipientes y portadores se describen, por ejemplo, en "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991).
Las dosificaciones específicas pueden ajustarse dependiendo de las condiciones de la enfermedad, la edad, peso corporal, condiciones de salud generales, sexo y dieta del sujeto, los intervalos de dosis, vías de administración, tasa de excreción, y combinaciones de fármacos. Cualquiera de las formas de dosificación anteriores que contienen cantidades efectivas están bien dentro de los límites de la experimentación rutinaria y por lo tanto, bien dentro del alcance de la presente divulgación.
Los anticuerpos de M-CSF útiles como agentes terapéuticos para metástasis del cáncer o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer se prepararán a menudo sustancialmente libres de otras inmunoglobulinas de
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origen natural u otras moléculas biológicas. Los anticuerpos de M-CSF preferidos también mostrarán toxicidad mínima cuando se administran a un mamífero afectado con, o predispuesto a sufrir de, metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer.
Las composiciones de la divulgación pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las soluciones resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse bajo condiciones asépticas y liofilizarse, la preparaciones liofilizadas siendo combinadas con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera por las condiciones fisiológicas aproximadas, como agentes de tamponamiento y ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y estabilizadores (por ejemplo, 1 20% de maltosa, etc.).
Los anticuerpos de M-CSF de la divulgación pueden también administrarse por liposomas, que son vesículas pequeñas compuestas de varios tipos de lípidos y/o fosfolípidos y/o surfactantes que son útiles para la administración de un fármaco (como los anticuerpos divulgados en la presente y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico). Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, dispersiones fosfolípidas, capas laminares y similares, y pueden servir como vehículos para focalizar los anticuerpos de M-CSF a un tejido particular así como aumentar la vida media de la composición. Hay disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, las Patentes U.S: N° 4.837.028 y 5.019.369.
Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnicas, como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 82: 3688 (l985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); y Patentes U.S. N° 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se divulgan en la Patente U.S: N° 5.013.556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatildicolina, colesterol y fosfatiildietanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente divulgación pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico (como Doxorubicina) está opcionalmente contenido dentro del liposoma [ver, por ejemplo, Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)].
La concentración del anticuerpo de M-CSF en estas composiciones puede variar ampliamente, es decir, de menos de alrededor del 10%, habitualmente al menos un 25% a tanto como el 75% o el 90% por peso y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los métodos actuales para preparar composiciones oral, tópica y parenteralmente administrables serán conocidos o aparentes para los expertos en la técnica y se describen con detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1995).
La determinación de una cantidad efectiva de una composición para tratar la metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer en un paciente se puede conseguir a través de métodos empíricos estándar que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de neutralización in vivo del suero de un sujeto tratado con una dosificación dada de anticuerpo de MCSF puede evaluarse usando un ensayo que determina la capacidad del suero para bloquear la proliferación inducida por M-CSF y la supervivencia de monocitos murinos (célula CD11b+, un subconjunto de células CD11, que expresa altos niveles de receptor a M-CSF) in vitro como se describe en Cenci et al., J Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000.
Las composiciones de la divulgación se administran a un mamífero que ya sufre de, o está predispuesto a, metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con metástasis del cáncer en una cantidad suficiente para evitar o al menos detener parcialmente el desarrollo de metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas de un anticuerpo de M-CSF variarán y dependerán de la severidad de la enfermedad y el peso y el estado general del paciente que está siendo tratado, pero generalmente variarán de alrededor de 1,0 pg/kg a alrededor de 100 mg/kg de peso corporal, o de alrededor de 10 pg/kg a alrededor de 30 mg/kg de peso corporal, con dosificaciones de desde alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 10mg/kg o alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg por aplicación siendo más comúnmente usadas. Por ejemplo, alrededor de 10 pg/kg a 5 mg/kg o alrededor de 30 pg/kg a 1 mg/kg de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo por una o más administraciones separadas o por infusión continuada. La administración es diaria, o en días alternos, semanalmente o menos frecuentemente, como sea necesario dependiendo de la respuesta a la enfermedad y la tolerancia del paciente a la terapia. Pueden necesitarse dosificaciones de mantenimiento durante un periodo de tiempo más largo, como 4, 5, 6, 7, 8, 10 ó 12 semanas o más hasta que tiene lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad, y las dosificaciones pueden ajustarse como sea necesario. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con los niveles
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de dosis y patrones siendo seleccionados por el médico tratante. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada como se ha definido con anterioridad, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.
En todo caso, las formulaciones deberían proporcionar una cantidad de anticuerpo de M-CSF durante el tiempo que sea suficiente para prevenir eficazmente o minimizar la severidad de la metástasis del cáncer y/o la pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer. Las composiciones de la presente divulgación pueden administrarse solas o como una terapia adjunta en conjunción con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento de la metástasis del cáncer y/o pérdida ósea asociada con la metástasis del cáncer.
La composición de anticuerpos se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores de consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos para los practicantes médicos. La cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a ser administrado se regirá por dichas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aliviar o tratar la enfermedad, condición o trastorno mediado por M-CSF, particularmente para tratar células cancerosas, y más particularmente para tratar metástasis de células tumorales. Dicha cantidad está preferiblemente por debajo de la cantidad que es tóxica para el huésped o vuelve al huésped más susceptible a infecciones.
El anticuerpo no necesita ser, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. Por ejemplo, en cáncer, el anticuerpo puede darse en conjunción con agentes quimioterapéuticos o en ADEPT como se ha descrito anteriormente. La cantidad efectiva de dicho otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad, condición o trastorno o tratamiento, y otros factores tratados anteriormente. Estos son generalmente usados en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se usan en la presente con anterioridad o de alrededor del 1 al 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.
También se divulga en la presente un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones descritas anteriormente, incluyendo el tratamiento del cáncer. El artículo de fabricación comprende un contenedor y una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringuillas y tubos de ensayo. Los contenedores pueden estar formados de una variedad de materiales como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). EL agente activo en la composición es el anticuerpo de la invención. La etiqueta en, o asociada con, el contenedor indica que la composición se usa para tratar la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, como una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones para el uso.
Inmunoterapia
Los anticuerpos anti-M-CSF útiles para tratar pacientes que tienen cánceres incluyen aquellos que son capaces de iniciar una respuesta inmune potente contra el tumor y aquellos que son capaces de citotoxicidad directa. A este respecto, los anticuerpos anti-M-CSF pueden provocar lisis de células tumorales por mecanismos de citotoxicidad celular o mediada por el complemento (ADCC) o dependiente del anticuerpo, ambos de los cuales requieren una porción de FC intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con los sitios receptores Fc de la célula efectora o proteínas complementarias. Además, los anticuerpos anti-M-CSF que ejercen un efecto biológico directo en el crecimiento tumoral son útiles en la práctica de la divulgación. Los mecanismos potenciales por los que dichos anticuerpos directamente citotóxicos pueden actuar incluyen la inhibición del crecimiento celular, la modulación de la diferenciación celular, la modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral y la inducción de apoptosis. El mecanismo por el que un anticuerpo anti-M-CSF particular ejerce un efecto anti-tumoral puede evaluarse usando cualquier número de ensayos in vitro diseñados para determinar ADCC, ADMMC, lisis de células mediada por el complemento, y demás, como se conoce generalmente en la técnica.
La inmunoterapia puede llevarse a cabo usando anticuerpos que tienen una afinidad más alta para la forma enlazada con la membrana del M-CSF (M-CSFa) que para las formas secretadas del M-CSF. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos que enlazan específicamente en o alrededor del sitio de escisión del M-CSFa o con la porción de M-CSFa adyacente a la membrana. Dichos anticuerpos pueden también inhibir beneficiosamente la escisión y liberación de la porción activa soluble del M-CSFa.
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Los anticuerpos anti-M-CSF pueden administrarse en su forma "desnuda" o sin conjugar, o pueden tener agentes terapéuticos conjugados a ellos. Los anticuerpos anti-M-CSF pueden usarse como un radiosensibilizador. Los anticuerpos anti-M-CSF pueden conjugarse con un agente radiosensibilizador. El término "radiosensibilizador", como se usa en la presente, se define como una molécula, preferiblemente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en cantidades terapéuticamente efectivas para aumentar la sensibilidad de las células a ser radiosensibilizadas a radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento de enfermedades que son tratables con radiación electromagnética. Las enfermedades que son tratables con radiación electromagnética incluyen enfermedades neoplásicas, tumores benignos y malignos, y células cancerosas.
Los términos "radiación electromagnética" y "radiación" como se usan en la presente incluyen, pero no están limitados a, radiación que tiene una longitud de onda de 10'2° a 100 metros. Preferiblemente, se emplean radiación electromagnética de: radiación gamma (10'2° a 10'13 m), radiación de rayos X )10'12 a 10'9 m), luz ultravioleta (10 nm a 400 nm), luz visible (400 nm a 700 nm), radiación infrarroja (700 nm a 1,0 mm), y radiación de microondas (1 mm a 30 cm).
Se sabe que los radiosensibilizadores aumentan la sensibilidad de las células cancerosas a los efectos tóxicos de la radiación electromagnética. Muchos protocolos de tratamiento contra el cáncer actualmente emplean radiosensibilizadores activados por la radiación electromagnética de los rayos X. Ejemplos de radiosensibilizadores activados por rayos X incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: metronidazol, misonidazol, desmetylmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, EO9, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR), 5-yododesoxiuridina (IUdR), bromodeoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FUdR), hidroxiurea , cisplatino y análogos y derivados de los mismos terapéuticamente eficaces.
La terapia fotodinámica (PDT) de cánceres emplea luz visible como el activador de la radiación del agente sensibilizador. Ejemplos de radiosensibilizadores fotodinámicos incluyen los siguientes, pero no están limitados a: derivados de hematoporfirina, Fotofrin(r), derivados de benzoporfirina, NPe6, etioporpfirina de estaño (SnET2), pheoborbide-a, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinc, y análogos y derivados terapéuticamente eficaces de los mismos.
El anticuerpo puede conjugarse con un receptor (como estreptavidina) para la utilización en el preenfoque tumoral en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no enlazado de la circulación usando un agente de depuración y después la administración de un ligando (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleido).
La presente divulgación incluye además los anticuerpos anteriormente descritos en forma detectablemente etiquetada. Los anticuerpos pueden ser etiquetados detectablemente a través del uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (como biotina, avidina, etc.), marcadores enzimáticos (como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.) marcadores fluorescentes o luminiscentes o bioluminiscentes (como FITC o rodamina, etc.) átomos paramagnéticos y similares. Los procedimientos para lograr dicho marcado son bien conocidos en la técnica; ver por ejemplo (Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).
"Marcador" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente con el anticuerpo. El marcador puede ser el mismo detectable por el mismo (por ejemplo marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el cado de un marcador enzimático, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición del sustrato que es detectable. Alternativamente, el marcador puede no ser detectable por si mismo pero puede ser un elemento que está enlazado con otro agente que es detectable (por ejemplo, una etiqueta de epítopo o uno de un par de compañero de enlace como biotina-avidina, etc.) Así, el anticuerpo puede comprender un marcador o etiqueta que facilita su asilamiento, y los métodos de la divulgación para identificar anticuerpos incluyen un paso de aislar el anticuerpo de M-CSF a través de la interacción con un marcador o etiqueta.
Los inmunoconjugados terapéuticos de ejemplo comprenden el anticuerpo descrito en la presente conjugado con un agente citotóxico como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Las proteínas de fusión se describen con mayor detalle a continuación.
La producción de inmunoconjugados se describe en la Patente U.S. N° 6.306.393. Los inmunoconjugados pueden prepararse conjugando indirectamente un agente terapéutico con un componente del anticuerpo. Las técnicas generales se describen en Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101- 1106 (1990); y Shih et al., Patente U.S. N° 5.057.313. El método general implica reaccionar un componente del anticuerpo que tiene una poción de carbohidratos oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y que se carga con una pluralidad de fármacos, toxina, quelante, sumandos de boro, u otros agentes terapéuticos. Esta reacción resulta en un ligamiento de la base Schiff (imina) inicial, que puede estabilizarse por reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.
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El polímero portador es preferiblemente un aminodextrano o polipéptido de al menos 50 residuos de aminoácidos, aunque también se pueden usar otros portadores de polímeros sustancialmente equivalentes. Preferiblemente, el inmunoconjugado final es soluble en una solución acuosa, como suero mamífero, para facilitar la administración y la focalización efectiva para su uso en terapia. Así, las funciones solubilizantes en el polímero portador potenciarán la solubilidad del suero del inmunoconjugado final. En particular se preferirá un aminodextrano.
El proceso para preparar un inmunoconjugado con un portador de aminodextrano comienza típicamente con un polímero de dextrano, ventajosamente un dextrano de peso molecular medio de alrededor de 10.000100.000. El dextrano se reacciona con un agente oxidante para afectar a la oxidación controlada de sus anillos de carbohidratos para generar grupos aldehído. La oxidación se efectúa convenientemente con reactivos químicos glicolíticos como NaIO4, de acuerdo con procedimientos convencionales.
El dextrano oxidado se reacciona después con una poliamina, preferiblemente una diamina, y más preferiblemente una diamina de mono- o polihidroxi. Las aminas adecuadas incluyen diamina de etileno, diamina de propileno, u otras diaminas tipo polimetileno, dietilentriamina o poliaminas similares, 1,3-diamino-2-hidroxipropano, u otras diaminas o poliaminas hidroxiladas, y similares. Un exceso de amina en relación a los grupos aldehído del dextrano se usa para asegurar la conversión sustancialmente completa de las funciones aldehído a los grupos base de Schiff.
Un agente reductor, como NaBH4, NaBH3 CN o similar se usa para efectuar la estabilización reductora del intermediario de la base de Schiff resultante. El aducto resultante puede purificarse por el paso a través de una columna de dimensionamiento convencional para eliminar los dextranos reticulados.
También se pueden usar otros métodos convencionales de derivación de un dextrano para introducir funciones aminas , por ejemplo, reacción con bromuro de cianógeno, seguido por reacción con una diamina.
El aminodextrano se reacciona después con un derivado del fármaco, toxina, quelante, inmunomodulador, sumando de boro u otro agente terapéutico a ser cargado, en una forma activada, preferiblemente, un derivado de carboxilo activado, preparado por medios convencionales, por ejemplo, usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) o una variante soluble en agua del mismo, para formar un aducto intermediario.
Alternativamente, se pueden acoplar toxinas de polipéptidos como proteína antiviral de hierba carmín o cadena A de ricina y similares al aminodextrano por condensación de glutaraldehído o por reacción de grupos carboxilo activados en la proteína con aminas de aminodextrano.
Los quelantes para radiometales o potenciadores de resonancia magnética son bien conocidos en la técnica. Son típicos los derivados de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Estos quelantes tienen típicamente grupos en la cadena lateral por los que el quelante puede unirse a un portador. Dichos grupos incluyen, por ejemplo, bencilisotiocianato, por el que el DTAP o el EDTA pueden acoplarse al grupo amino de un portador. Alternativamente, los grupos carboxilo o grupos amina en un quelante pueden acoplarse a un portador por activación o derivación anterior y después acoplamiento, todos por medios bien conocidos.
Los sumandos de boro, como carboranos, se pueden unir con componentes del anticuerpo por método convencionales. Por ejemplo, los carbonaros pueden prepararse con funciones carboxilo en cadenas laterales colgantes, como es bien conocido en la técnica. La unión de dichos carbonaros a un portador, por ejemplo aminodextrano, se puede conseguir por activación de los grupos carboxilo de los carbonaros y la condensación con aminas en el portador para producir un conjugado intermediario. Dichos conjugados intermediarios son después unidos a componentes del anticuerpo para producir inmunoconjugados terapéuticamente útiles., como se describe a continuación.
Se puede usar un portador de polipéptido en lugar de un aminodextrano, pero el portador de polipéptido debería tener al menos 50 residuos de aminoácidos en la cadena, preferiblemente 100-5000 aminoácidos. Al menos algunos de los aminoácidos deberían ser residuos de lisina o residuos de glutamato o aspartato. Las aminas colgantes de los residuos de lisina y los carboxilatos colgantes de glutamina y aspartato son convenientes para la unión a un fármaco, toxina, inmunomodulador, quelante, sumando de boro u otro agente terapéutico. Ejemplos de portadores de polipéptido adecuados incluyen polilisina, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, co-polímeros de los mismos, y polímeros mixtos de estos aminoácidos y otros, por ejemplo, serinas, para conferir las propiedades de solubilidad deseables en el portador cargado resultante e inmunoconjugado.
La conjugación de un conjugado intermediario con el componente del anticuerpo se efectúa oxidando la porción de carbohidrato del componente del anticuerpo y reaccionando los carbonilos de aldehído resultante (y cetona) con los grupos amino permaneciendo en el portador después de cargarlo con un fármaco, toxina, quelante, inmunodulador, sumando de boro u otro agente terapéutico. Alternativamente, un conjugado intermediario puede ser
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unido a un componente del anticuerpo oxidado a través de los grupos amino que han sido introducidos en el conjugado intermediario después de cargarlo con el agente terapéutico. La oxidación se efectúa convenientemente ya sea químicamente, por ejemplo con NaIO4 u otro reactivo glicolítico, o enzimáticament, por ejemplo con neuramidasa y galactosa oxidasa. En el caso de un portador de aminodextrano, no se usan típicamente todas las aminas del aminodextrano para cargar un agente terapéutico. Las aminas restantes del aminodextrano condensan con el componente del anticuerpo oxidado para formar aductos de base de Schiff, que son después estabilizados por reducción, normalmente con un agente reductor de borohidruro.
Los procedimientos análogos se usan para producir otros inmunoconjugados de acuerdo con la divulgación. Los portadores de polipéptido cargados tienen preferiblemente tres residuos de lisina que permanecen para la condensación con la porción de carbohidrato oxidada de un componente del anticuerpo. Los carboxilos en el portador de polipéptido pueden, si es necesario, ser convertidos a aminas por, por ejemplo, activación con DCC y reacción con un exceso de una diamina.
El inmunoconjugado final es purificado usando técnicas convencionales como cromatografía por tamaño en Sephacryl S-300 o cromatografía de afinidad usando uno o más epítopos CD84Hy.
Alternativamente, los inmunoconjugados pueden prepararse conjugando directamente un componente del anticuerpo con un agente terapéutico. El procedimiento general es análogo al del método indirecto de conjugación excepto que se une directamente un agente terapéutico a un componente del anticuerpo oxidado.
Se observará que otros agentes terapéuticos pueden sustituirse por los quelantes descritos en la presente. Los expertos en la técnica serán capaces de idear esquemas de conjugación sin experimentación indebida.
Como una ilustración adicional, un agente terapéutico puede unirse en la región bisagra de un componente del anticuerpo reducido a través de la formación de un enlace de disulfuro. Por ejemplo, los péptidos de toxoide de tétanos pueden construirse con un único residuo de cisteína que se usa para unir el péptido a un componente del anticuerpo. Como alternativa, dichos péptidos pueden unirse al componente del anticuerpo usando un reticulante heterobifuncional, como N-succinil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer56:244 (1994). Las técnicas generales para dicha conjugación son bien conocidas en la técnicas. Ver por ejemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995).
Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido ( como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos ( como tolieno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido carbono-14-etiquetado 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) es un agente quelante de ejemplo para la conjugación de radionucleido con el anticuerpo (ver por ejemplo WO94/11026).
Como se ha descrito anteriormente, los restos de carbohidratos en la región Fc de un anticuerpo pueden usarse para conjugar un agente terapéutico. Sin embargo, la región Fc puede estar ausente si un fragmento de anticuerpo se usa como el componente del anticuerpo del inmunoconjugado. Sin embargo, es posible introducir un resto de carbohidrato en la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Ver por ejemplo, Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., Patente U.S. N° 5.443.953. El resto de carbohidrato diseñado es usado después para unir un agente terapéutico.
Además, los expertos en la técnica reconocerán numerosas variaciones posibles de los métodos de conjugación. Por ejemplo, el resto de carbohidrato puede usarse para unir polietilenglicol para extender la vida media de un anticuerpo intacto, o fragmento que enlaza con el antígeno del mismo, en sangre, linfa u otros fluidos extracelulares. Además, es posible construir un "inmunoconjugado divalente" uniendo agentes terapéuticos a un resto de carbohidrato y a un grupo sulfhidrilo libre. Dicho grupo sulfhidrilo libre puede localizarse en la región bisagra del componente del anticuerpo.
Proteínas de Fusión del Anticuerpo Anti-M-CSF
En la presente se divulga el uso de proteínas de fusión que comprende uno o más restos de anticuerpos anti-M-CSF y un inmunomodulador o resto de toxinas. Los métodos para hacer proteínas de fusión de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo Patente U.S. N° 6.306.393. Las proteínas de fusión de anticuerpos que comprenden un resto de interleucina-2 se describen por Boleti et al., Ann.Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al.,
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Cáncer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cáncer Res. 2:1951 (1996), and Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996). Además, Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995), describen una proteína de fusión que incluye un fragmento F(ab')2 y un resto alfa del factor de necrosis tumoral.
Los métodos para hacer proteínas de fusión anticuerpo-toxina en los que la molécula recombinante comprende uno o más componentes del anticuerpo y una toxina o agente quimioterapéutico también son conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas de fusión anticuerpo exotoxina A de Pseudomonas han sido descritas por Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996), y Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996). Las proteínas de fusión anticuerpo-toxina que contienen un resto de la toxina de la difteria se han descrito por Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), y Vallera et al., Blood 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995), han descrito una proteína de fusión anticuerpo-toxina que tiene un resto de RNasa, mientras que Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produjeron una proteína de fusión anticuerpo-toxina que comprende un componente de DNasa I. La gelonina se usó como el resto de toxina en la proteína de fusión anticuerpo-toxina de Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Parte 1, BIOT005. Como un ejemplo adicional, Dohlsten et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), informaron de una proteína de fusión anticuerpo-toxina que comprende enterotoxina-A estafilocócica.
Ilustrativo de las toxinas que se emplean adecuadamente en la preparación de dichos conjugados son ricina, abrina, ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina de difterina, exotoxina de Pseudomonas, y endotoxina de Pseudomonas. Ver por ejemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), y Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Otras toxinas adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos como se divulgan en la presente también pueden usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo con un profármaco-enzima de activación que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidil, Ver WO81/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Ver por ejemplo, WO88/07378 y Patente U.S. N° 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa.
Las enzimas que son útiles en el método de esta divulgación incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluoroaracilo; proteasas como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoáciso; enzimas de escision de carbohidratos como la p-galactosidasa y neuramidas útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; p-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con p- lactámicos en fármacos libres; y penicilina amidasas, como la penicilina V amidasa o la penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como abzimas, se pueden usar para convertir los profármacos de la divulgación en fármacos activos libres (Ver por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en la presente para la administración del abzima a una población de células tumorales.
Las enzimas de esta divulgación pueden ser enlazados covalentemente a los anticuerpos por técnicas bien conocidas en la técnica como el uso de reactivos de reticulación heterobifuncionales tratados con anterioridad. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace con el antígeno de un anticuerpo como se divulga en la presente ligadas a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la divulgación pueden construirse usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).
Usos no terapéuticos
Los anticuerpos como se divulgan en la presente pueden usarse como agentes de purificaicónd e afinidad para el M-CSF o en ensayos diagnósticos para la proteína de M-CSF, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos. Los anticuerpos también pueden usarse para ensayos diagnósticos in vivo. Generalmente, para estos propósitos el anticuerpo se marca con un radionucleido (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de tal manera que el tumor pueda ser localizado usando inmunoescintografía.
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Los anticuerpos como se divulgan en la presente pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, como ensayos de enlace competitivos , ensayos de sándwich directos e indirectos, como ELISAs, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Los anticuerpos también pueden usarse para inmunohistoquímica, para marcar muestras tumorales usando métodos conocidos en la técnica.
Como una cuestión de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor del sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloque o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en la solución de reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes en los que la disolución proporcionara una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
La invención se ilustra por los siguientes ejemplos, que no se pretende que sean limitantes de ninguna
manera.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Este ejemplo muestra que los anticuerpos de M-CSF Rx1 y 5A1 son específicos de la especie y que los anticuerpos RX1, MC1 y MC3 neutralizan la actividad de M-CSF humana. El RX1 es un anticuerpo vendido comercialmente que estaba disponible más de un año antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Las fuentes comerciales de ejemplo incluyen, pero no están limitadas a, clones de anticuerpos monoclonales de M-CSF anti-humanos de ratón 116, 692 t 21 (Anogen); clones de anticuerpos de M-CSF anti-humanos 2113.131, 2673 y 26786 (R & D Systems, Inc.); y clon de anticuerpos de M-CSF anti-humanos M16 (Antigenix America, Inc.).
Para probar la actividad de neutralización de RX1 y 5A1, se usó un ensayo de proliferación de la línea celular M-NFS-60 (American Type Culture Collection N° de Entrada CRL-1838, disponible de la ATCC en Rockville, MD, USA, derivada de una leucemia mielógena inducida con el retrovirus ecotrópico de ratón silvestre Cas-Br-MuLV, sensible a tanto la interleucina 3 como el M-CSF y que contiene un proto-oncogén c-myb truncado provocado por la integración de un retrovirus). La proliferación de M-NFS-60 requiere M-CSF activo de una manera dependiente de la dosis. En el ensayo, las células de M-NFS-60 se lavaron y colocaron en placas en medio RPMI 1640 con un 10% de FBS y 3000 U/ml de M-CSF y un 1% de Pen/Strep. Se incubó M-CSF humano recombinante (a 10 ng/ml de concentración final), humano o específico murino, con varias concentraciones de anticuerpos durante 1 hora a 37° C en un 5% de CO2 en una incubadora. Después de la incubación, la mezcla se añadió al cultivo de M-NFS-60 en placas de microtitulación de 96 pocillos. El volumen del ensayo total por pocillo fue de 100 pl, con 10 ng/ml de M- CSF, y la concentración de anticuerpos indicada en la Figura 5. Las células se incubaron a 37° C bajo un 5% de CO2 durante 72 horas antes de que se cuantificara los números de células por el ensayo CellTiter Glo (Promega). El ensayo anteriormente mencionado se repitió para los anticuerpos MC3 y MC1.
Como se muestra en la Figura 5, los anticuerpos de M-CSF RX1 y 5A1 son específicos de la especie. La proliferación celular se presenta como la lectura fluorescente del ensayo CellTiter Glo, que es lineal con el número de células. La actividad de neutralización específica de la especie de RX1 y 5A1 se muestra por su capacidad de inhibir el M-NFS-60 en presencia de M-CSF o humano o murino. Finalmente, como se muestra en la Figura 5B, los anticuerpos MC3 y MC1 son también inhibidores específicos de la actividad de M-CSF.
EJEMPLO 2
Este ejemplo muestra que el anticuerpo RX! inhibe eficazmente la osteolisis en un modelo de xenoinjerto humano a una dosis de 5 mg/kg. Se usaron en este estudio ratones desnudos hembra con 4-7 semanas de edad, peso medio ~20 g. Se inyectaron células tumorales (MDA-MB-231, 3x105) suspendidas en 10pl de solución salina en la cavidad de la médula ósea de la tibia derecha. Se tomaron radiogramas de las patas traseras un día después de la inoculación tumoral para obtner la imagen de la línea de base y comprobar si había fractura de hueso causada por la inyección. Los ratones fueron asignados al azar a grupos de tratamiento a 10 ratones por grupo incluyendo 5 mg/kg de PBS y RX1, inyectados intraperitonealmente una vez a la semana durante 6 semanas. Al final del estudio, se tomaron de nuevo radiogramas de las patas traseras y se compararon con la línea de base para daño óseo. El grado de daño óseo causado por el tumor se definió como se muestra en la Figura 6. El grupo de tratamiento con 5 mg/kg de RX1 mostro protección estadísticamente significativa del hueso de daño causado por tumor.
EJEMPLO 3
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Este ejemplo muestra que el número de metástasis se reduce cuando se administra el anticuerpo RX1 a ratones desnudos que llevan cáncer de mama humano MDA-MB-231 a una concentración de 5 mg/kg.
Para este estudio se usaron ratones desnudos hembra de 4-7 semanas de edad, peso medio ~20 g. Se inyectaron células tumorales (MDA-MB-231, 3x105) suspendidas en 10jl de solución salina en la cavidad de la médula ósea de la tibia derecha. Se tomaron radiogramas de las patas traseras un día después de la inoculación tumoral para obtener la imagen de la línea de base y comprobar si había fractura de hueso causada por la inyección. Los ratones fueron asignados al azar a grupos de tratamiento 5 mg/kg de PBS y RX1, inyectados intraperitonealmente una vez a la semana durante 6 semanas. Al final del estudio, se recogieron los pulmones de cada grupo de tratamiento y se fijaron en solución de Bouin para recuento de nódulos pulmonares metastásicos.
Como se muestra en la Figura 7, el número de metástasis se reduce cuando se administra el anticuerpo RX1 a ratones desnudos que llevan el cáncer de mama humano MDA-MB-231 a una dosis de 5 mg/kg.
EJEMPLO 4
Este ejemplo establece un procedimiento para la humanización del anticuerpo RX1. Los 5H4, MC1 y MC- se humanizan usando procedimientos similares.
Diseño de genes para cadenas ligera y pesada de RX1 humanizadas
La secuencia de nucleótidos y aminoácidos para el RX1 murino se expone en la Figura 4B. La secuencia de un anticuerpo humano identificado usando la National Biomedical Foundation Protein Identification Resource o base de datos similar se usas para proporcionar el marco del anticuerpo humanizado. Para seleccionar la secuencia de la cadena pesada humanizada, la secuencia de la cadena pesada de RX1 murino se alinea con la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo humano. En cada posición, se selecciona el aminoácido del anticuerpo humano para la secuencia humanizada, a menos que la posición caiga en cualquiera de las cuatro categorías definidas a continuación, en cuyo caso se selecciona el aminoácido de RX1 murino:
(1) la posición cae dentro de una región determinante complementaria (CDR), como se define por Kabat, J. Immunol., 125, 961-969 (1980);
(2) El aminoácido del anticuerpo humano es raro para las cadenas pesadas humanas en esa posición, mientras que el aminoácido RX1 murino es común para las cadenas pesadas humanas en esa posición;
(3) La posición está inmediatamente adyacente a una CDR en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de RX1 murino; o
(4) el modelado tridimensional del anticuerpo RX1 murino sugiere que el aminoácido está cercano físicamente a la región de enlace con el antígeno.
Para seleccionar la secuencia de la cadena ligera humanizada, la secuencia de la cadena ligera del RX1 murino se alinea con la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo humano. El aminoácido del anticuerpo humano se selecciona en cada posición para la secuencia humanizada, a menos que la posición caiga dentro de una de las categorías descritas anteriormente y repetidas a continuación:
(1) CDR;
(2) aminoácido de RX1 murino más típico que el anticuerpo humano;
(3) adyacente a CDR; o
(4) Posible proximidad tridimensional a la región de enlace.
La secuencia de nucleótidos real de los genes de la cadena pesada y ligera se selecciona como sigue:
(1) Las secuencias de nucleótidos codifican para las secuencias de aminoácidos como se ha descrito anteriormente;
(2) Los 5' de estas secuencias de codificación, las secuencias de nucleótidos codifican para una secuencia líder (señal). Estas secuencias líder se eligieron como típicas de anticuerpos.
(3) Los 3' de las secuencias de codificación, las secuencias de nucleótidos son las secuencias que siguen al segmento J5 de la cadena ligera de ratón y el segmento J2 de la cadena pesada de ratón, que son parte de la secuencia del RX1 murino. Estas secuencias se incluyen porque contienen señales de donantes de
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empalme; y
(4) En cada extremo de la secuencia hay un sitio Xba I para permitir el corte en los sitios Xba I y la clonación en el sitio Xba I de un vector.
Construcción de genes de la cadena ligera y pesada humanizadas
Para sintetizar la cadena pesada, se sintetizan cuatro oligonucleótidos usando un sintetizador de ADN Applied Biosystems 380B. Dos de los oligonucleótidos son parte de cada hebra de la cadena pesada, y cada oligonucleótido se superpone al siguiente por alrededor de 20 nucleótidos para permitir la hibridación. Juntos, los oligonucleótidos cubren la región variable de la cadena pesada humanizada completa con unos pocos nucleótidos extra en cada extremo para permitir el corte en los sitios Xba I. Los oligonucleótidos se purifican de geles de poliacrilamida.
Cada oligonucleótido se fosforila usando ATP y polinucleótido quinasa de T4 por procedimientos estándar (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Para hibridar los oligonucleótidos fosforilados, se suspenden juntos en 40 ul de Ta (33 mM acetato de Tris, pH 7.39, 66 mM acetato potásico, 10 mM acetato de amgnesio) a una concentración de alrededor de 3,75 uM cada uno, se calientan a 95° C durante 4 minutos y se enfrían lentamente a 4° C. Para sintetizar el gen completo de los oligonucleótidos sintetizando la hebra opuesta de cada oligonucleótido, se añaden los siguientes componentes en un volumen final de 100 ul:
10 ul oligonucleótidos hibridados
0.16 mM cada desoxirribonucleótido
0.5 mM ATP
0.5 mM DTT
100 ug/ml BSA
3.5 ug/ml proteína g43 de T4 g43 (polimerasa de ADN)
25 ug/ml proteína g44/62 de T4 (proteína accesorio de polimerasa)
25 ug/ml proteína 45 (proteína accesorio de polimerasa)
La mezcla se incuba a 37° C durante 30 minutos. Después se añaden 10 u de ADN ligasa de T4 y se reanuda la incubación a 37° C durante 30 min. La polimerasa y la ligasa se inactivan por incubación de la reacción a 70° C durante 15 minutos. Para digerir el gen con Xba I, se añaden a la reaccción 50 ul de 2 X TA que contiene BSA en 200 ug/ml y DTT en 1mM, 43 ul de agua, y 50 u de Xba I en 5 ul. La reacción se incuba durante 3 horas a 37° C, y después se purifica en un gel. El fragmento de Xba I se purifica a partir de un gel y se clona en el sitio de Xba I del plásmido pUC19 por métodos estándar. Los plásmidos se purifican usando técnicas estándar y se seceuncian usando el método didesoxi.
La construcción de los plásmidos para expresar cadenas ligeras y pesadas humanizadas se consigue aislando los fragmentos de Xba I de la cadena ligera y pesada del plásmido pUC 19 en el que se ha insertado y después insertándolo en el sitio Xba I de un vector de expresión apropiado que expresará niveles altos de una cadena pesada cuando se transfecta en una célula huésped apropiada.
Síntesis y afinidad del anticuerpo humanizado
Los vectores de expresión se transfectan en células Sp2/0 de ratón, y se seleccionan las células que integran los plásmidos en base del marcador(s) seleccionable conferido por los vectores de expresión por métodos estándar. Para verificar que estas células secretaron anticuerpo que enlaza con el M-CSF, el sobrenadante de estas células se incuba con células que se sabe expresan M-CSf. Después de lavarlas, las células se incuban con anticuerpo anti-humano de cabra conjugado con fluoresceína, se lavan y analizan para fluorescencia en un citofluorómetro FACSCAN.
Para los siguientes experimentos, las células que producen el anticuerpo humanizado se inyectan en ratones y se recoge la ascitis resultante. El anticuerpo humanizado se purifica a homogeneidad sustancial a partir de la ascitis por el paso a través de una columna de afinidad de anticuerpo de inmunoglobulina anti-humana de cabra, preparado en un soporte Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.) de acuerdo con técnicas estándar. Para determinar la afinidad del anticuerpo humanizado en relación al anticuerpo RX1 murino original, se realiza un experimento de enlace competitivo de acuerdo con las técnicas conocidas en la técnica.
EJEMPLO 4A
Este ejemplo describe la clonación y expresión de anticuerpos RX1 Human Engineered™, así como la purificación de dichos anticuerpos y la prueba para la actividad de enlace. Los anticuerpos 5H4, MC1 y MC3 Human Engineered™ se preparan usando procedimientos similares.
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Diseño de secuencias Human Engineered™
El Human Engineering™ de los dominios variables de anticuerpos se ha descrito por Studnicka [Ver por ejemplo Studnicka et al. Patente U.S. N° 5.766.886; Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como un método para reducir la inmunogenicidad mientras se mantiene la actividad de enlace de las moléculas de anticuerpo. De acuerdo con el método, a cada aminoácido de la región variable se le ha asignado un riesgo de sustitución. Las sustituciones de aminoácidos se distinguen por una de tres categorías de riesgo: (1) cambies de riesgo bajo son aquellos que tienen el potencial más alto de reducir la inmunogenicidad con la menor probabilidad de interrumpir el enlace del antígeno; (2) los cambios de riesgo moderado son aquellos que reducirían adicionalmente la inmunogenicidad, pero tienen una probabilidad mayor de afectar al enlace del antígeno o plegado de la proteína; (3) los residuos de riesgo alto son aquellos que son importantes para enlazar o para mantener la estructura del anticuerpos y conllevan el riesgo más alto de que se afecte el enlace del antígeno o el plegado de la proteína. Debido al papel estructural tridimensional de las prolinas, las modificaciones en las prolinas se consideran generalmente que son al menos cambios de riesgo moderado, incluso si la posición es típicamente una posición de riesgo bajo. Se prefieren los cambios por sustitución pero también son posibles inserciones y deleciones. Las Figuras 4B y 4C muestran la asignación de riesgo para cada residuo de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de RX1 murino, respectivamente, categorizados como cambio de riesgo alto, moderado o bajo.
Las regiones varaibles de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo RX1 murino fueron Human Engineered™ usando este método. Los residuos de aminoácidos que son candidatos para la modificación de acuerdo con el método en posiciones de riesgo bajo se identificaron alineando las secuencias de aminoácidos de las regiones variables murinas con una secuencia de región variable humana. Se puede usar cualquier región variable humana, incluyendo una secuencia VH o VL individual o una secuencia CHo VL de consenso humana. Se pueden cambiar los residuos de aminoácidos en cualquier número de posiciones de riesgo bajo, o en todas las posiciones de riesgo bajo. Para la secuencia de la cadena pesada de "riesgo bajo" Human Engineered™ en las Figuras 19A-B, se usó como plantilla la Vh2 de consenso humana (basada en Kabat), y para cada posición donde los residuos de aminoácidos murinos y humanos difirieron en las posiciones de riesgo bajo, se introdujo una modificación de aminoácidos que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Para la secuencia de la cadena ligera de "riesgo bajo" Human Engineered™ en las Figuras 20A-B, se uso como plantilla la kappa 3 de consenso humana (basada en Kabat), y para cada posición donde los residuos de aminoácidos murinos y humanos difirieron en las posiciones de riesgo bajo, se introdujo una modificación de aminoácidos que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Se hicieron un total de 16 modificaciones de riesgo bajo de aminoácidos a la cadena ligera y se hicieron 8 modificaciones de riesgo bajo a la cadena pesada.
De manera similar, los residuos de aminoácidos que son candidatos para modificación de acuerdo con el método en todas las posiciones de riego bajo y moderado se identificaron alineando las secuencias de aminoácidos de las regiones variables murinas con una secuencia de la región variable humana. Los residuos de aminoácidos en cualquier número de las posiciones de riesgo bajo o moderado, o todas las posiciones de riesgo bajo y moderado, pueden cambiarse. Para la secuencia de la cadena pesada Human Engineered™ en las Figuras 19A-B, se usó como plantilla la Vh2 de consenso humana (basada en Kabat), y para cada posición donde los residuos de aminoácidos murinos y humanos difirieron en las posiciones de riesgo bajo o moderado, se introdujo una modificación de aminoácidos que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Para la secuencia de la cadena ligera de "riesgo bajo" Human Engineered™ en las Figuras 20A-B, se uso como plantilla la kappa 3 de consenso humana (basada en Kabat), y para cada posición donde los residuos de aminoácidos murinos y humanos difirieron en las posiciones de riesgo bajo o moderado, se introdujo una modificación de aminoácidos que reemplazó el residuo murino con el residuo humano. Se hicieron un total de 19 modificaciones de riesgo bajo y moderado de aminoácidos a la cadena ligera y se hicieron 12 modificaciones de riesgo bajo y moderado a la cadena pesada.
También se preparó una secuencia de la cadena ligera de "riesgo bajo alternativo" como se muestra en las Figuras 21A-B, en las que la modificación en la posición 54 se invirtió de nuevo a murina. Se preparó también una secuencia de la cadena ligera de "riesgo bajo+moderado alternativa" como se muestra en las figuras 21A-B, en las que las modificaciones en las posiciones 54-56 se invirtieron de nuevo a murinas.
Finalmente, también se produjo una secuencia de la región V de la cadena ligera de "riesgo bajo+moderado" Human Engineered™ usando el subgrupo 2-1-(1) A14 de VK6 de la línea germinal humana como plantilla, como se muestra en las Figuras 22A-B.
También se contempla por la presente invención mantener los aminoácidos 41-43 (NGS) de la Figura 4A que representan el sitio de glicosilación. Alternativamente, se pueden retener sólo uno o dos de los aminoácidos 4143 (por ejemplo, NG)
Preparación de Vectores de Expresión para el Desarrollo de Líneas Celulares Permanentes
Los fragmentos de ADN que codifican cada una de las secuencias de la región V de la cadena pesada y ligera descritas anteriormente junto con las secuencias señal derivadas de anticuerpos se construyeron usando
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síntesis de nucleótidos sintética. El ADN que codifica cada una de las secuencias de aminoácidos de la región V de la cadena ligera descritas anteriormente se insertaron en el vector pMXP10 que contiene la región constante de la cadena ligera Kappa humana. El ADN que codifica cada una de las secuencias de aminoácidos de la región V de la cadena pesada descritas con anterioridad se insertaron en el vector pMXP6 que contiene la región constante de la cadena pesada Gamma-2 humana. Se construyeron vectores adicionales que contenían las secuencias de aminoácidos de la región V de la cadena pesada fusionados con las regiones constantes Gamma-1 (ADNc) y Gamma-4 (ADNc y genómico) humanas que tienen las secuencias mostradas en las figuras 29A, 29b y 30. Todos estos vectores contienen un promotor hCMV y una región no traducida 3' de la cadena ligera kappa de ratón así como genes marcadores seleccionables como neo o his para la selección de transfectantes resistentes a G418- o histidol-, respectivamente. Los vectores de la cadena ligera y pesada se describen en las Tablas 2 y 3, respectivamente.
Tabla 2. Vectores de la cadena ligera Kappa permanentes de genes individuales
Plásmido
Región V Marcador Selectivo
pMXC5
Riesgo Bajo + Moderado (Kabat) neo
pMXC6
Riesgo Bajo (Kabat) neo
pMXC13
Riesgo Bajo (Kabat) - R54 to S neo
pMXC14
Riesgo Bajo + Moderado (Kabat)- RAT54,55,56to SIS neo
pMXC22
Riesgo Bajo + Moderado (Línea germinal) neo
Tabla 3. ^ Vectores de la cadena pesada permanentes de genes individuales
Plásmido
Región V Región C Marcador Selectivo
pMXC7
Riesgo Bajo + Moderado (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC8
Riesgo Bajo (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC40
Riesgo Bajo (Kabat) Gamma 1 neo
pMXC41
Riesgo Bajo + Moderado (Kabat) Gamma 1 neo
pMXC45
Riesgo Bajo + Moderado (Kabat) Gamma 4 (genómico) neo
pMXC46
Riesgo Bajo + Moderado (Kabat) Gamma 4 (ADNc neo
Se construyeron los vectores que comprenden los genes de la cadena ligera más la pesada Human Engineered™ deseados (Gamma-1, Gamma-2 y Gamma-4). Estos vectores "2-Gen" contienen genes que codifican cada cadena de anticuerpos, pesada y ligera, bajo control del promotor hCMV, donante de empalme CMV, aceptante de empalme SV440 16S y el ADN no traducido 3' de la cadena ligera kappa de ratón incluyendo el sito poliA. También contienen un gen marcador seleccionable como neo o his y el gen de resistencia a ampicilina. Los vectores que contienen tanto los genes de la cadean pesada como la ligera se describen en la Tabla 4. También se pueden construir vectores que comprenden dos copias de cada gen de la cadena ligera y pesada (cuatro vectores de genes).
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Tabla 4 . Vectores de expresión permanentes de dos genes
Cadena Pesada
Plásmido
Cadena Ligera Kappa V región C region Marcador Selectivo
pMXC212
Riesgo bajo (Kabat) Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC37
Riesgo bajo (Kabat) Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2 his
pMXC9
Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma2 neo
pMXC16
Riesgo bajo (Kabat) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma2 neo
pMXC17
Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC18
Riesgo bajo (Kabat) R54 to S Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC19
Riesgo bajo + Moderado (Kabat)- RAT54,55,56 a SIS Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC20
Riesgo bajo (Kabat) - R54 to S Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC21
Riesgo bajo + Moderado (Kabat)- RAT54,55,56 a SIS Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC25
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC47
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 2 his
pMXC26
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2 neo
pMXC42
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo (Kabat) Gamma 1 neo
pMXC43
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 1 neo
pMXC50
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 1 his
pMXC48
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 4 (ADNc) Neo
pMXC49
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 4 (genómico) neo
Preparación de Vectores de Expresión para Expresión Transitoria
Los vectores que contienen los genes o de la cadena ligera o la pesada descritos anteriormente también se construyeron para la transfección transitoria. Estos vectores son similares a los descritos anteriormente para las transfecciones permanentes excepto que en lugar de los genes neo o his, contienen el oriP de virus de Epstein-Barr para la replicación en células HEK293 que expresan el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr. Los vectores para la transfección transitoria se describen en las Tablas 5 y 6.
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Tabla 5. Vectores de la cadena ligera Kappa transitorios
Plásmido
Región V
pMXC1
Riesgo bajo + Moderado (Kabat)
pMXC2
Riesgo bajo (Kabat)
PMXC10
Riesgo bajo + Moderado (Kabat)- RAT54,55,56 aSIS
pMXC11
Riesgo bajo (Kabat) - R54 a S
pMXC15
Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal)
Tabla 6. Vectores de la cadena pesada transitorios
Plásmido
Región V Región C
pMXC3
Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 2
pMXC4
Riesgo bajo (Kabat) Gamma 2
pMXC29
Riesgo bajo (Kabat) Gamma 1
pMXC38
Riesgo bajo (Kabat) Gamma 4 (genómico)
pMXC39
Riesgo bajo + Moderado (Kabat) Gamma 1
Expresión Transitoria de RX1 Human-Engineered en Células HEK293E
Los vectores separados cada uno conteniendo orP del virus de Epstein-Barr y los genes de la cadena ligera o pesada descritos anteriormente se transfectaron en células HEK293E. Se permitió que las células transfectadas transitoriamente incubasen has 10 días después de lo cual se recuperó el sobrenadante y se purificó el anticuerpo usando cromatografía de Proteína A. Las proteínas producidas por transfección transitoria de las células 293E se describen en la Tabla 7 a continuación
TAbla 7 . Anticuerpos RX1 Human-engineered preparados.
Cadena Ligera Cadena Pesada
Anticuerpo
Plásmido Proteína Plásmido Proteína
heRX1-1.G2
pMXC2 Riesgo bajo (Kabat) pMXC4 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-2.G2
pMXC2 Riesgo bajo (Kabat) pMXC3 Riesgo bajo + Moderado (Kabat)
heRX1-3.G2
pMXC1 Riesgo bajo + Moderado (Kabat) pMXC4 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-4.G2
pMXC1 Riesgo bajo + Moderado (Kabat) pMXC3 Riesgo bajo + Moderado (Kabat)
heRX1-5.G2
pMXC11 Riesgo bajo (Kabat) - R54 a S pMXC4 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-6.G2
pMXC11 Riesgo bajo (Kabat) - R54 a S pMXC4 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-7.G2
PMXC10 Low+Mod Risk (Kabat) RAT54,55,56 a SIS pMXC4 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-8.G2
PMXC10 Low+Mod Risk (Kabat) RAT 54,55,56 a SIS pMXC3 Riesgo bajo + Moderado (Kabat)
heRX1-9.G2
pMXC15 Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) pMXC4 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-10.G2
pMXC15 Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) pMXC3 Riesgo bajo + Moderado (Kabat)
heRX1-1.G1
pMXC2 Riesgo bajo (Línea germinal) pMXC29 Riesgo bajo (Kabat)
heRX1-10.G1
pMXC15 Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) pMXC39 Riesgo bajo + Moderado (Kabat)
heRX1-9.G4
pMXC15 Riesgo bajo + Moderado (Línea germinal) pMXC38 Riesgo bajo (Kabat)
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Desarrollo de Células CHO-K1 Transfectadas Permanentemente
Los vectores descritos anteriormente (Tabla 4) que contienen una copia cada uno de los genes ligeros y pesados juntos se transfectan en células CHO-K1 adaptadas por EX-Cell 302. Las células CHO-K1 adaptadas a suspensión cultivadas en medio Ex-Cell 302 son electroporadas típicamente con 40 ug de vector linealizado. Alternativamente, el ADN linealizado puede ser complejado con polietilenimina lineal (PEI) y usarse para la transfección. Las células se ponen en placas en placas de 96 pocillos que contienen medio Ex-Cell 302 suplementado con un 1% de fBs y G418. Los clones se criban en placas de 96 pocillos y el ~10% superior de los clones de cada transfección se transfiere a placas de 24 pocillos que contienen medio Ex-Cell 302.
Se realiza una prueba de productividad en placas de 24 pocillos en medio Ex-Cell 302 para cultivos cultivados durante 7 y 14 días en cuyo momento los sobrenadantes del cultivo se prueban para los niveles de anticuerpo secretado por un ensayo ELISA de inmunoglobulina para IgG.
Los clones superiores se transfieren a matraces de agitación que contienen medio Ex-Cell 302. Tan pronto como las células se adaptan al cultivo en suspensión, se realiza una prueba de matraz de agitación con estos clones en medio Ex-Cell 302. Las células se cultivan durante hasta 10 días en matraces Erlenmeyer de 125 ml que contienen 25 ml de medio. Los matraces se abren al menos cada dos días del periodo de incubación para permitir el intercambio de gases y los niveles de polipéptido de inmunoglobulina en el medio de cultivo se determinan por ELISA de IgG al final del periodo de incubación. Múltiples transfecciones secuenciales de la misma línea celular con dos o tres vectores de transcripción multi-unidad resultan en clones y líneas celulares que muestran aumentos adicionales en los niveles de producción de inmunoglobulina, preferiblemente a 300 pg/ml o más.
Purificación
Se puede diseñar un proceso para la purificación de polipéptidos de inmunoglobulina a partir de vectores y todas las líneas. De acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, las células se eliminan por filtración después de la terminación. El filtrado se carga en una columna de Proteína A /en múltiples pases, si es necesario). La columna se lava y después los polipéptidos de inmunoglobulina expresados y secretados se eluyen de la columna. Para la preparación del producto de anticuerpos, el grupo de Proteína A se mantiene a un pH bajo (pH 3 durante un mínimo de 30 minutos y un máximo de una hora) como un paso de inactivación vírica. Se usa seguido un paso de intercambio de cationes de adsorción para purificar adicionalmente el producto. El eluido de la columna de separación de adsorción se pasa a través de un filtro que retiene los virus para proporcionar depuración adicional de las partículas víricas potenciales. El filtrado se purifica adicionalmente pasándolo a través de una columna de intercambio de aniones en la que el producto no enlaza. Finalmente, el proceso de purificación se concluye transfiriendo el producto en el tampón de la formulación a través de diafiltración. El retenido se ajusta a una concentración de proteína de al menos 1 mg/ml y se añade un estabilizante.
Actividad de enlace
Se evalúa la actividad de enlace del MCSF de los anticuerpos Human Engineered™ recombinantes. La proteína se purifica de sobrenadantes del cultivo en matraces de agitación por el paso sobre una columna de proteína A seguido por la determinación de la concentración por A280. Los ensayos de enlace se realizan como se describe en el Ejemplo 1 anterior o 12 siguiente. Se prerecubren placas Immulon II con el antígeno de sM-CSF prediluido en una solución de recubrimiento de PBS para inmovilizarlo en la microplaca. Se añaden varias concentraciones de prueba de M-cSf que varían de desde 0,25 a 20 ug/ml a 50 ul/pocillo y se incuban a 4° C durante la noche. Las placas se lavan después 3 veces con PBS-0,05% Tween. Se realiza el bloqueo añadento en PBS- 0,05% Tween un 1% de BSA seguido por una incubación de 30 minutos a 37° C. Se preparan las diluciones de polipéptidos de inmunoglobulina en solución de PBS-0,05% Tween 1% de BSA. Se preparan diluciones de 2 o 3 veces en serie y se añaden (100 ul/pocillo) por duplicado o triplicado. Después de una incubación de 90 minutos a 37° C, la microplaca se lava 3 veces con PBS-0,05% Tween. Para el desarrollo de la señal se añade anticuerpo secundario de IgG (específico de gamma- o Fc-) anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa a cada pocillo y se incuba durante 30 minutos a 37° C seguido por la adición de OPD a 0,4 mg/ml en tampón de citrato más un 0,012% de H2O2. después de 5-10 minutos a temepratua ambiente el ensayo se para por la adición de 100 ul de 1M H2SO4 y las placas se leen a 490 nm. Se han empleado anticuerpos de tanto IgG anti-humna de cabra (gamma específica) como IgG anti-humana de cabra (Fc específica).
EJEMPLO 5
El siguiente ejemplo establece un procedimiento para el tratamiento de humanos usando anticuerpo específico de M-CSF, como un anticuerpo derivado de RX1 o competidor de RX1, incluyendo un anticuerpo Human Engineered™ RX1 con una región constante de IgG1 o IgG4 modificada o sin modificar. El procedimiento también puede ser seguido por un anticuerpo derivado de MC1 o MC3 o competidor de MC1 o MC3. El rango de dosificación eficaz esperado es de 2ug/kg a 10 mg/kg. Esta estimación se basa en la siguiente justificación sustanciada por datos experimentales:
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El nivel de M-CSF medido en plasma humano (tanto pacientes sanos como con cáncer de mama) es de alrededor de 1 ng/ml. El anticuerpo RX1 de neutralización de M-CSF tiene un EC50 medido de 2 ng/ml contra 1 ng/ml de M-CSF humano. Por consiguiente, la concentración de anticuerpo efectiva en plasma humano se espera que sea de 10 a 50.000 veces por encima de su EC50, es decir 20 ng/ml a 100 ug/ml de anticuerpo en plasma humano. En base a estudios de pK, para efectuar esta concentración en pacientes humanos, se requiere una dosificación de 2|jg/kg a 10 mg/kg para alcanzar una concentración de anticuerpo en plasma de 20 ng/ml a 100 ug/ml.
EJEMPLO 6
Este ejemplo establece un procedimiento para la evaluación de una actividad anti-cáncer del anticuerpo monoclonal anti-M-CSF en un modelo subcutáneo. El ejemplo 2 anterior mostró que el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-MCSF inhibió significativamente el crecimiento tumoral en la médula ósea. El propósito de emoral en tejido blando.
Se usarán para este estudio ratones nu/nu hembra de 10 semanas de edad , peso medio ~20g . Los ratones se someterán a un periodo de aclimatación de al menos 7 días antes del comienzo del estudio. En el día 0, el costaado derecho de los ratones desnudos se inyectará con células de cáncer de colon humanas SW620 subcutáneamente a 5x106 células por ratón por 100 jl. Cuando el volumen del tumor llega a 100-200 mm1 2 3 (habitualmente 1 semana después de la inoculación del tumor), los ratones se distribuyen al azar en 5 grupos de 10 ratones por grupo de la manera siguiente:
1) PBS
2) RX1
3) 5A1
4) mIgG1+rIgG1 isotipoAb control
5) 5A1+RX1
Los ratones se trataron intraperitonealmente con los anticuerpos designados a 10 mpk una vez a la semana durante 4 semanas. Cuando el volumen del tumor alcanza 2000 mm3, el estudio se terminará. Alternativamente, los animales se someterán a eutanasia cuando se encuentre cualquiera de las siguientes situaciones: la ulceración de la superficie del tumor es mayor del 30% del área de la superficie del tumor total, pérdida de peso corporal significativa (>20%), deshidratación y moribundo. Se recolectara la sangre total de todos los ratones y se analizará la población de monocitos como un marcador sustituto potencial. El crecimiento/tamaño tumoral se medirá por análisis 2-D. Las mediciones de la anchura y longitud del tumor se usarán para calcular el volumen del tumor. Se espera que el crecimiento tumoral en tejido blanco se inhiba como resultado del experimento anterior.
EJEMPLO 7
El siguiente ejemplo establece un procedimiento para la evaluación de terapia de combinación para el tratamiento y prevención de enfermedad osteolítica severa asociada con metástasis del cáncer.
Diseño Experimental. El estudio descrito en el Ejemplo 5 anterior se repite esencialmente como se ha descrito con las siguientes excepciones. Además del anticuerpo o combinación de anticuerpos establecida en los grupos de tratamiento a continuación, los animales recibirán uno de los siguientes tratamientos adicionales:
1. Bifosfonatos (por ejemplo, Aredia; Zometa; clodronato).
2. Cirugía
3. Radiación
4. Quimioterapia
5. Terapia hormonal. (por ejemplo, tamoxifeno, terapia anti-andrógenos)
6. Terapia de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes RANKL/RANK; anticuerpo neutralizante
PTHrP)
7. Terapia de proteína terapéutica (por ejemplo, receptor de RANKL soluble; OPG, y PDGF e inhibidores de
MMP)
8. Terapia de fármaco de molécula pequeña (por ejemplo, inhibidor de Src-quinasa)
9. Terapia de oligonucleótidos (por ejemplo, RANKL o RANK o PTHrP anti-sentido)
10. Terapia génica (por ejemplo, inhibidores de RANKL o RANK)
11. Terapia de Péptidos (por ejemplo, muteínas de RANKL)
Los grupos de tratamiento son como sigue. Los tratamientos adicionales anteriores se indican a continuación como "más terapia X":
1. PBS solamente
2. Tratamiento con la terapia solamente X
3. Control de isotipos de IgG1 de rata
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4. Control de isotipos de IgG1 de rata
5. Sólo MCSF anti-humano de RX1
6. Sólo MCSF anti-ratón de IgG1 de rata de 5A1
7. Combinación de control de isotipos de IGG1 murino e IgG1 de rata
8. Combinación de RX1 y 5A1
9. Control de isotipos de IgG1 de rata más terapia X
10. Control de isotipos de IG1 murino más terapia X
11. MCSF anti-humano de RX1 más terapia X
12. MCSF anti-ratón de IgG1 de rata de 5a1 más terapia X
13. Combinación de control de isotipos IgG1 de rata e IgG1 murina más terapia X
14. Combinación de RX1 y 5A1 más terapia X
Dosificación: se usan 0,1-30 mg/kg de cada anticuerpo para la administración a cada animal. La dosificación preferida es 10 mg/kg. La vía de administración puede ser IV, IP, SC. La vía preferida es IP. El tratamiento empezará el día después de la inyección de las células tumorales, como se describe en el Ejemplo 5, anterior.
Mediciones. Para evaluar la severidad de la osteolísis entre los varios grupos de tratamiento, cada ratón recibe una imagen Faxitron de línea de base tomada el día siguiente de la inyección de las células tumorales. Una imagen Faxitron se toma también al final del estudio (8 semanas). El crecimiento tumoral se mide simultáneamente usando el sistema Xenogen ya que las células tumorales expresan establemente luciferasa. Se espera que la terapia de combinación para el tratamiento y prevención de enfermedad osteolítica severa asociada con la metástasis del cáncer se mejore respecto a la terapia de anticuerpos sola.
EJEMPLO 8
El siguiente ejemplo proporciona un protocolo para evaluar la capacidad del anticuerpo específico de M- CSF de enlzar con, por ejemplo, células cancerosas de mama (línea celular MDA231) o células cancerosas de mieloma múltiple (línea celular ARH77) usando un clasificador celular activado por fluorescencia.
Las células se lavaron primer dos veces con PBS (sin Ca2+, Mg2+). Para cada placa de 10 cm, se añadieron 2 ml de 3 mM de EDTA, y todas las placas se incubaron a 37° C durante 2-3 minutos, hasta que las células se redondearon y empezaron a desprenderse de la fuente. Después, se añadieron y mezclaron 10 ml de Tampón A (PBS + 5% de FBS). En ese momento, las células se sedimentaron y resuspendieron a alrededor de 5x106 células/ml en PBS+5% de FBS, u las células se colocaron en túbulos a 100 pl/muestra.
En este punto, se añadieron 0,1-10 ug/ml del anticuerpo primario (usado a la concentración indicada de anticuerpo de M-CSF o anticuerpo de control). La dilución, si era necesaria, se hizo en 5% de FBS/PBS. La mezcla se incubó después durante 30 minutos a 4° C. Después del periodo de incubación, las células se lavaron 3 veces por centrifugación a 400 g durante 5 minutos, y las células se resuspendieron en PBS.
El anticuerpo anti-IgG FITC o PE-marcado (0,25 ug/muestra) se diluyó en un 1% de BSA/PBS en la dilución óptima y las células se resuspendieron en esta solución y se incubaron durante 30 minutos a 4° C. Después, las células se lavaron 3 veces como se ha descrito anteriormente. Después de los lavados de las células, las células se resuspendieron con 0,5 ml/muestra de PI-PBS (si era necesario para distinguir células muertas de las vivas). Las células también pueden ser fijadas para análisis posterior (las células pueden durar alrededor de 3 días si se fijan con un 0,1% de formaldehido). Las células se analizaron después en un FACS de fluorescencia activo usando procedimientos estándar.
Como se muestra en la figura 8A y 8B, un anticuerpo RX1 específico de MCSF enlazó con la línea celular del cáncer de mama MDA231 o la línea celular del cáncer de mieloma múltiple ARH77 en una cariedad de concentraciones de anticuerpos como se indica.
EJEMPLO 9
El siguiente ejemplo muestra que el M-CSF es prevalente en un número de superficie de células de cáncer. Se llevó a cabo tinción inmunohistoquímica de M-CSF usando un anticuerpo RX1 específico de M-CSF como sigue:
Al principio, los portaobjetos se calentaron en un horno a 55-60° C durante 1 hora y se permitió que enfriasen durante 2-3 minutos. Se usaron los siguientes parámetros de desparafinado y rehidratación:
a. Xileno
b. 100% de reactivo de alcohol
c. 95% de reactivo de alcohol
d. 75% de reactivo de alcohol
3 x 5 minutos 2 x 5 minutos 2 x 4 minutos 2 x 3 minutos
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e. 50% de reactivo de alcohol 1 x 3 minutos
g. dl H2O 2-3 aclarados rápidos
Antes del paso de bloqueo con peróxido, se preparó la recuperación de antígenos usando 1 x Biogenex Citra Plus. La solución fue inicialmente calentada con microondas a plena potencia para hervir. Una vez que la solución hubo hervido, el microondas se ajustó rápidamente para otros 13 minutos a un nivel de potencia 2, y se permitió que enfriase antes de proceder. El paso de bloqueo con peróxido se realizó como sigue. Los portaobjetos eran portaobjetos sumergidos en 3% de H2O2 (25 ml 30% a 250 ml dl H2O) y se colocaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los portaobjetos fueron luego aclarados 2x con dl H2O y se lavaron con 1 X PBS 2 x 2 minutos.
El procedimiento de bloqueo con avidina/biotina se realizó como sigue. Los portaobjetos se colocaron planos en un estante metálico. Se uso un bolígrafo PAP azul (marcador de portaobjetos hidrofóbico) alrededor del tejido. Después se añadieron 2 gotas de Zymed Avidin (reactivo A) suficiente para cubrir el tejido y los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron como sigue:
2 lavados x 3 minutos en 1 x PBS.
2 gotas de Zymed Biotin (reactivo B), temperatura ambiente durante 10 minutos.
2 lavados x 3 minutos en 1 x PBS
El procedimiento de bloqueo de la proteína se realizó como sigue. Primero, se añadió un 10% de suero [a 2% de concentración final* de especie del anticeurpo secundario. El BoGenex Power Block se diluyó después a X con dl H2O. El estante de portaobjetos se sumergió en Power Block durante 8 minutos a temperatua ambiente, y los portaobjetos se aclararon 2x en 1X PBS.
Para la adición del anticuerpo primario (RX1), los portaobjetos se colocaron planos en un estante metálico. El anticuerpo se añadió para cubrir cada sección (~350 jl), y el anticuerpo se esparció con la punta de la pipeta (si fue necesario) sin raspar el tejido. Los portaobjetos se incubaron durante1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron 3 x con 1 x PBS de 3-5 minutos cada vez. En este punto, se aplicó BioGenex Multi-Link a las secciones y se incubó durante 10-11 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron después lavadas 3 minutos cada vez.
El marcado se realizó aplicando Marcador BioGenex HRP a las secciones, que fueron entonces incubadas a temperatura ambiente durante 10-11 minutos y se lavaron con 1 x PBS 3 x 3 minutos. Después se añadió sustrato de H2O2 BioGenex (1 gota de AEC por cada 2,5 ml de H2O2) a las secciones y se incubó a temperatuar ambiente durante 10 minutos. Las secciones fueron después aclaradas varias veces con dl H2O. El paso de contratinción se realizó como sigue: Las secciones se tiñeron con hematoxilina durante 1 minuto a temperatura ambiente. Después, las secciones se aclararon con H2O dos veces, y después se incubaron en 1 X PBS durante 1 minuto. Las secciones fueron después aclaradas bien con H2O para eliminar el PBS. Las secciones de montaron aplicando una gota de BioGenex Super Mount a la sección y después se secaron con aire durante la noche a temperatura ambiente.
Como se muestra en la Figura 9, el M-CSF es prevalente en un número de superficies de células cancerosas. Ls secciones para los tipos de células de cáncer indicados se puntuaron como sigue:
0 Sin tinción
1 Tinción similar al fondo
2 Positivo, pero tinción débil
3 Tinción positiva y significativa
4 Tinción positiva y fuerte
EJEMPLO 10
El siguiente ejemplo muestra el procedimiento para producir anticuerpos MC1 y MC3 Los MC1 y MC3 son dos anticuerpos murinos monoclonales que neutralizan el anticuerpo de M-CSF humano y enlazan con el M-CSF humano. Las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos se muestran en las Figuras 14 y 15, respectivamente. Fueron identificados por una serie de pasos incluyendo a) inmunización de ratones Balb C con M-CSF humano recombinante; b) cribado para clones positivos que producen anticuerpos que enlazan con el M-CSF humano en un formato ELISA; c) subclonación de clones positivos para generar clones de hibridoma estables; d) aumento proporcional del cultivo celular para producir gran cantidad de anticuerpos; e) purificación y caracterización de anticuerpos en ensayos de análisis de afinidad, enlace celular y actividad de neutralización como se ha descrito en ejemplos anteriores.
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Las Figuras 16A y 16B muestran la alineación de las CDRs de las cadenas pesada y ligera, respectivamente, de los anticuerpos RX1, 5H4, MC1 y MC3.
Las versiones humanizadas y Human Engineered™ se generan como se describe en los ejemplos anteriores.
EJEMPLO 11
Este ejemplo muestra que los anticuerpos RX1 y 5H4 de M-CSF, así como los fragmentos Fab de los mismos, tienen diferentes actividades de neutralización. El siguiente ejemplo también muestra que los anticuerpos RX1, 5H4 y MC3 tienen afinidades variables apra el M-CSF. Este ejemplo demuestra además que las afinidades de los anticuerpos intactos anteriormente mencionados son más altas en relación a los fragmentos Fab de los anticuerpos anteriormente mencionados.
Las actividades de neutralización de Rx1 y 5H4 intactos frente a fragmentos Fab de RX1 y 5H4 se determinaron midiendo la proliferación celular dependiente de M-CSF en presencia de varias concentraciones de anticuerpo. La proliferación celular se determinó por tinción quimioluminiscente. Como se muestra en la Figura 17, el RX1 intacto tiene la potencia más alta, mientras que el fragmento Fab de Rx1 pierde su potencia y se comporta como el 5H4 y el fragmento Fab del 5H4.
Las propiedades de enlace de los anticuerpos anteriormente mencionados se analizaron usando análisis Byacore. Para determinar las afinidades relativas de RX1, 5H4 y MC3 con M-CSF se inmovilizó Fc anti-ratón de conejo en un chip biosensor CM5 a través de acoplamiento de aminas. Los anticuerpos anteriormente mencionados fueron después capturados en el chip biosensor Fc anti-ratón/CM% a 1,5 pg/ml durante 3 minutos a 2 pl/min. El MCSF se fluyó sobre la superficie del biosensor modificada a concentraciones variables (Rmax ~15). Los anticuerpos y antígeno de prueba se diluyeron en 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCL, 3 mM de EdTA, 0,005% de surfactante P20 (HBS-EP). Todos los experimentos se realizaron a 25° C. Las constantes cinéticas y de afinidad se determinaron usando software Biaevaluation (Biacore) con un 1:1 modelo de interacción/ajuste global. Como se muestra a continuación en la Tabla 8, el RX1 enlaza con el M-CSF con la afinidad más alta en relación a 5H4 y MC3.
Tabla 8
Ka(M-1 Sec-1) Kd (sec-1) KD (nM)
RX1
1.64e6 2.7e-4 0.16
5H4
5.94e5 1.77e-3 3.0
MC3
7.04e5 1.93e-4 0.27
Para determinar las diferencias relativas en la afinidad de enlace de los fragmentos Mab y Fab intactos de RX1, 5H4 y MC3, se usó una configuración alternativa en el análisis Biacore. Específicamente, se inmovilizó el M- CSF en el chip biosensor CM5 a través de acoplamiento de aminas. 0,05 pg/ml de M-CSF en 10 mM de Na. Se inyectó acetato pH 4.0 a 1 pl/min durante 5 minutos para conseguir RL=6-12 RU. El anticuerpo de prueba (e fragmento Fab) se fluyó sobre la superficie del biosensor modificada a concentraciones variables. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en 0,01 M de HEPES pH 7.4, 0,15 M de NaCL, 3mM de EDTA, 0,005% de Surfactante P20 (HBS-EP) y todos los experimentos se hicieron a 25° C. Las constantes cinéticas y de afinidad se determinaron usando el software Bioevaluation (Biacore) con un 1:1 modelo de interacción/ajuste global. Como se muestra a continuación en la Tabla 9, el RX1 enlaza con el M-CSF con la afinidad más alta en relación a los otros anticuerpos probados. El fragmento Fab de RX1 enlaza con M-CSF con una afinidad significativamente más baja en relación a la holoproteína de RX1.
Tabla 9
Ka(M-1 Sec-1) Kd (sec-1) KD (nM)
rRX1(ratón)
2.34e5 2.35e-4 1.0
rRX1 Fab (ratón)
2.81 e5 3.03e-3 10.8
5H4
1.27e5 1.26e-3 9.9
5H4Fab
2.04e5 2.85e-3 14.0
La afinidad de enlace y los datos de neutralización indican que la actividad de neutralización del Rx1 se
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debe primariamente a su remarcablemente alta afinidad para M-CSF, y que esta alta afinidad puede ser debida al menos en parte a la capacidad de ambos brazos del anticuerpo de enlazar con el dímero de M-CSD simultáneamente.
EJEMPLO 12
El siguiente ejemplo revela el epítopo lineal (es decir, secuencia de aminoácidos) en el M-CSF reconocido por los anticuerpos RX1, 5H4 y MC3.
Inicialmente, la estrategia de mapeo de epítopos se diseñó para determinar si los anticuerpos RX1, 5H4 y MC3 reconocían epítopos lineales o epítopos conformacionales dentro del M-CASF. Por lo tanto, los anticuerpos anti-M-CSF se probaron contra 1 |jg de M-CSF bajo condiciones reductoras así como no reductoras. Sólo la forma no reducida del M-CSF se reconoció por cada uno de los anticuerpos, sugiriendo que los epítopos reconocidos son discontinuos en naturaleza.
Después, el epítopo lineal de M-CSF se determinó para cada anticuerpo. Específicamente, las membranas de SPOTs (Sigma Genosys) se prepararon cuando las secuencias del fragmento de M-CSF de interés, superponiendo péptidos 10mer sintetizados con un desplazamiento de aminoácidos, se cargaron en el soporte de membrana de celulosa. Estas membranas fueron después sondeadas con los anticuerpos anteriormente mencionados y se identificaron los SPOTs reactivos. La secuencia de epítopos se identificó después por su localización correspondiente en la membrana, y se identificaron los aminoácidos superpuestos dentro de los péptidos de reacción positivos como el epítopo. Como se muestra en la Figura 18, el RX1 enlaza con un epítopo lineal diferente al 5H4 y MC3, que mapean a una localización diferente de M-CSF. El RX1 enlaza con un epítopo lineal representado por RFRDNTPN (SEQ ID NO: 120) o RFRDNTAN (SEQ ID NO: 121), aminoácidos 98-105 de M- CSF de la Figura 12. El 5H4 enlaza con un epítopo lineal representado por ITFeFvDQE (SEQ ID NO: 122), aminoácidos 65-73 de M-CSF de la Figura 12. El MC3 enlaza con dos epítopos lineales representados por (1) ITFEFVDQE (SEQ ID NO: 122), aminoácidos 65-73 de M-CSF de la Figura 12 y (2) FYETPLQ (SEQ ID NO: 123), aminoácidos 138-144 de M-CsF de la Figura 12.
EJEMPLO 13
Se determinó la afinidad de enlace de las versiones Human Engineered™ de los anticuerpos RX1 preparados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4A. Este ejemplo muestra que los anticuerpos RX1 Human Engineered™ con regiones constantes de subclase IgG diferentes enlazan con el M-CSF con afinidades diferentes in vitro. Para determinar las diferencias relativas en la afinidad de enlace de anticuerpos intactos por análisis Biacore, se inmovilizó M-CSF en chip biosensor CM5 por acoplamiento de aminas. Se inyectaron 0,05 jg/ml de M-CSF en 10 mM de Na-Acetato pH 4,0 a 1 jl/min durante 5 minutos para conseguir RL=6-12 RU. El anticuerpo de prueba o los fragmentos Fab se fluyeron sobre la superficie del biosensor modificada a concentraciones variables que variaban de 100 nm a 1,5 nm en diluciones de 2 veces. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en 0,01 M de HePS pH 7.4, 0,15 M de NaCL, 3 mM de EDTA, 0,005% de Surfactante P20 (HbS-EP) y todos los experimentos se hicieron a 25° C. Cada punto de concentración y espacios en blanco del tampón se ejecutaron por triplicado, y los datos se recogieron durante 3 minutos de asociación y 8 minutos de disociación. Las constantes cinéticas y de afinidad se determinaron usando software Biaevaluation con un 1:1 modelo de interacción/ajuste global. Como se muestra en la Tabla 10 a continuación, heRX1-1.G1 y heRX1-1.G4 enlaza con M-CSF con afinidades que se asemejan más cercanamente a la afinidad de enlace del RX1-M-CSF murino.
Tabla 10
Anticuerpo
ka (M-1 sec-1) kd (sec-1) KD (nM)
RX1 Murino n=21
(2.23 ± 0.35)x105 (1.56 ± 0.67)x10-4 0.7 ± 0.27
heRX1-1.G2 n=5
(2.36 ± 0.18)x105 (1.37 ± 0.24)x10-3 5.9 ± 1.4
heRX1-10.G2 n=2
(1.73 ± 0.29)x105 (1.1 ± 0.11) x 103 6.3± 1.7
heRX1-1.G1
2.50 x 105 2.38 x 10-4 0.95
heRX1-1.G4
2.07 x 105 2.93 x 104 1.42
Por el contrario como se muestra en la Tabla 11 a continuación, aunque había alguna variación en la afinidad de enlace, todos los constructos de Gamma-2 mostraron al menos una disminución de 7 veces en la afinidad de enlace en comparación con el anticuerpo murino parental.
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Anticuerpo
ka (M-1 sec-1) kd (sec-1) KD (nM)
RX1 Murino n=21
(2.23 ± 0.35)x105 (1.56 ± 0.67)x10-4 0.7 ± 0.27
heRX1-1.G2
(2.36 ± 0.18)x105 (1.37 ± 0.24)x10-3 5.9 ± 1.4
heRX1-2.G2
2.18 x 105 1.65 x 10-3 7.6
heRX1-3.G2
2.01 x 105 1.18 x 10-3 5.9
heRX1-4.G2
2.38 x 105 1.08 x 10-3 4.6
heRX1-5.G2
1.75 x 105 1.29 x 10-3 7.4
heRX1-6.G2
1.88 x 105 1.49 x 10-3 7.9
heRX1-7.G2
1.57 x 105 1.49 x 10-3 9.5
heRX1-8.G2
1.52 x 105 1.48 x 10-3 9.8
he RX1-9.G2
2 x 105 1.44 x 10-3 7.2
heRX1-10.G2n=2
(1.73 ± 0.29)x105 (1.160.11) x 10-3 6.3 ± 1.7
EJEMPLO 14
Este ejemplo muestra que los anticuerpos RX1 Human Engineered™ con regiones constantes de subclase de IgG diferente poseen diferentes actividades de neutralización in vitro. Para probar la actividad de neutralización de los anticuerpos de M-CSF, se usó un ensayo de proliferación de la línea celular M-NFS-60 (American Type Culture Collection, Na de Acceso CRL-1838, disponible de ATCC in Rockville, MD, USA, derivada de una leucemia mielógena inducida con el retrovirus ecotrópico de ratón silvestre Cas-Br.MuLV. La línea celular responde a tanto la interleucina 3 como el M-CSF y contiene un proto-oncogen c-myb truncado provocado por la integración de un retrovirus). La proliferación de M-NFS-60 requiere M-CSF activo de una manera dependiente de la dosis. En el ensayo, las células de M-NFS-60 se lavaron y colocaron en placas en medio RPIM 1640 con un 10% de FBS y un 1% de Pen/Strep. El M-CSF humano recombinante (a 1n ng/ml de concentración final, que se equivalente a 3000 U/ml de actividad de M-CSF), se incubó con varias concentraciones de anticuerpos que variaron de 1 ug/ml a 0,5 ng/ml (dilución de 2 veces en serie) durante 1 hora a 37° C en 5% de CO2 en una incubadora. Después de la incubación, la mezcla se añadió al cultivo de M-NFS-60 en placas de microtitulación de 96 pocillos. El volumen de ensayo total por pocillo fue de 100 ul, con 10 ng/ml de M-CSF, y la concentración de anticuerpos indicada. Las células se incubaron a 37° C bajo un 5% de CO2 durante 72 horas antes de que los números de células fueran cuantificados por ensayo CellTiter Clo (Promega). Cada anticuerpo se probó por triplicado, con una repetición al día siguiente (para un total de seis ensayos por anticuerpo). El IC50 de cada anticuerpo se analizó por ajuste de la curva.
El ensayo se repitió usando MCSF humano en suero, medio condicionado MDA231 (que contiene M-CSF), MCSF de mono cynomologous en suero, y MCSF recombinante de mono cynomologous. Los resultados se presentan en las Figuras 25 (MCSF recombinante), 26 (MCSF humano en suero) y 27 medio condicionado MDA231) como la lectura fluorescente del ensayo CellTiter Glo, que es lineal con el número de células. La actividad de neutralización de los anticuerpos se muestra como una inhibición de la proliferación de células M-NFS-60.
Los resultados muestran que el IC50 para heRX1-1-IgG y heRX1-1-IgG4 eran aproximadamente los mismos que los del anticuerpo RX1 parental murino recombinante, mientras que el IC50 para heRX1-1-IgG2 era de 2 veces a 4 veces mayor.
La Tabla 12 siguiente muestra el IC50 relativo (en términos de veces de pérdida de IC50) de los varios constructos de IgG2 preparados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4A. De estos constructos los heRX1-1.G2 y heRX1-10.G2 mostraron la menor reducción en IC50.
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Anticuerpo
Veces de Pérdida de IC50
heRX1-1.G2
2.8x
heRX1-2.G2
3.1x
heRX1-3.G2
5.3x
heRX1-4.G2
4.6x
heRX1-5.G2
6.5x
heRX1-6.G2
5.9x
heRX1-7.G2
6.1x
heRX1-8.G2
5.9x
heRX1-9.G2
3.6x
heRX1-10.G2
2.2x
heRX1-1.G1
Sin pérdida
heRX1-1.G4
Sin pérdida
heRX1-10.G1
Sin pérdida
heRX1-10.G4
Sin pérdida
EJEMPLO 15
Este ejemplo muestra que los anticuerpos RX1 Human Engineered™ con regiones constantes de subclase de IgG diferente poseen diferentes actividades TRAP en un ensayo de osteoclastogénesis in vitro.
Se indujeron células CD43+ de médula espinal humana (Biowhitaker número de catálogo 2M-101A, 3x105 células/frasco) para diferenciar en osteoclastos bajo las condiciones experimentales descritas en la presente. En el Día 1, las células CD34+ se descongelaron de un frasco congelado en 10 ml de medio (alfa MEME con 10% de FCS, 1 x Pen Strep y 1x fungizona). Las céluals se lavaron una vez y se re-suspendieron en 2 ml de medio y se colocaron en una placa de 96 pocillos a 100 ul por pocillo. En el Día 2, sin eliminar el medio original, se añadieron 50 ul de 4 x CSF-1 a 30 ng/ml de concentración final y 50 ul de 4x RANKL (sRANKL, Chemicon Número de catálogo GF091, 10 ug/envase) a una concentración de 100 ng/ml a cada pocillo. En el Día 7, se añadieron 50 ul de 5x RANKL a una concentración final de 100 ng/ml a cada pocillo. En el Día 17, las células se tiñeron para actividad TRAP (kit de Fosfatasa Ácida de Leucocitos para tinción TRAP, Sigma N° de catálogo 387-A) y se examinaron bajo el microscopio.
Los anticuerpos de neutralización de M-CSF se añadieron en el Día 2 del ensayo. Los anticuerpos inhibieron la diferenciación de osteoclastos de una manera dependiente de la dosis como se muestra en la Figura 28. La actividad inhibidora de los anticuerpos en el ensayo de diferenciación de osteoclastos se muestra como una falta de osteoclastos visibles en el Día 17 del ensayo.
EJEMPLO 16
Los anticuerpos RX1 Human Engineered™ con regiones constantes de subclase de IgG diferente se caracterizaron adicionalmente.
Los complejos antígeno-anticuerpo que formaron los varios anticuerpos RX1 Human Engineered™ con el MCSF se estudiaron combinando M-CSF y anticuerpo en tampón a proporciones molares iguales, seguido por el análisis del tamaño del complejo antígeno-anticuerpo usando cromatografía de exclusión por tamaño o dispersión de luz. Los resultados mostraron que el RX1 parental murino pareció que formaba complejos 1:1 con MCSF de alrededor de 200 kDa. Los anticuerpos heRX1-9.G2 r 1-10.G2 pareció que formaron complejos 2:! o 2:2 con MECSF de alrededor de 400 kDA. El heRX1-1.G2 parece que formó agregados de celosía grandes con MCSF de más de 2x106 Da. Los constructos de IgG1 e IgG4 formaron complejos pequeños similares a los del RX! parental murino.
El SDS-PAGE reductor y no reductor desnaturalizante de heRX1-1.G4 mostró que la versión de IgG4 parecía formar medios anticuerpos, como se esperaba.

Claims (15)

  1. 5
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    15
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    60
    65
    1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que comprende
    (i) una cadena pesada que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 116; y
    (ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 53,
    y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición es un polvo adecuado para su reconstitución con una solución apropiada.
  2. 2. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta, en donde el recipiente se selecciona de una botella, vial, jeringuilla y tubo de ensayo y el recipiente contiene una composición que comprende un anticuerpo que comprende
    (i) una cadena pesada que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 116; y
    (ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera expuesta en la SEQ ID NO: 53,
  3. 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o el artículo de fabricación de la reivindicación 2, en donde la cadena ligera comprende una región constante kappa humana.
  4. 4. La composición farmacéutica o el artículo de fabricación de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición comprende un portador que es solución salina tamponada con fosfato, agua bacterioestática o un portador acuoso seleccionado de agua, agua tamponada, solución salina al 0,4% y glicina al 0,3%.
  5. 5. La composición farmacéutica o el artículo de fabricación de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición comprende un portador o excipiente que se selecciona del grupo que consiste de fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, alquil parabenos como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m- cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn- proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURoNlCS™ o polietilenglicol (PeG).
  6. 6. La composición farmacéutica o el artículo de fabricación de cualquier reivindicación anterior, para su uso en terapia.
  7. 7. La composición farmacéutica o el artículo de fabricación para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, para su uso en:
    a) un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto con necesidad de ello cantidades terapéuticamente eficaces de un anticuerpo;
    (b) un método para prevenir o reducir la pérdida ósea que comprende administrar a un sujeto afectado de una enfermedad que provoca o contribuye a la osteólisis una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo, en una cantidad efectiva para prevenir o reducir la pérdida ósea asociada con la enfermedad, y en donde dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad de osteoclastos relativamente incrementada, incluyendo endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismo/osteomalacia, escorbuto, desnutrición ), enfermedades crónicas (incluyendo síndromes de malabsorción, insuficiencia renal crónica (incluyendo la osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (incluyendo la osteodistrofia hepática), drogas (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol) y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria), cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de huesos asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Paget;
    (c) un método para tratar a un sujeto afectado con una enfermedad que provoca o contribuye a la osteolisis que comprende adminsitrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo, en una cantidad efectiva para reducir la gravedad de la pérdida de hueso asociada con la enfermedad, y en donde dicha enfermedad se selecciona del grupo que consiste de enfermedades óseas metabólicas asociadas con actividad de osteoclastos relativamente incrementada, incluyendo endocrinopatías (incluyendo hipercortisolismo, hipogonadismo, hiperparatiroidismo primario o secundario, hipertiroidismo), hipercalcemia, estados de deficiencia (incluyendo raquitismo/osteomalacia, escorbuto, desnutrición ), enfermedades crónicas
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    10
    15
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    50
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    60
    65
    (incluyendo síndromes de malabsorción, insuficiencia renal crónica (incluyendo la osteodistrofia renal), enfermedad hepática crónica (incluyendo la osteodistrofia hepática), drogas (incluyendo glucocorticoides (osteoporosis inducida por glucocorticoides), heparina, alcohol) y enfermedades hereditarias (incluyendo osteogénesis imperfecta, homocistinuria), cáncer, osteoporosis, osteopetrosis, inflamación de huesos asociada con artritis y artritis reumatoide, enfermedad periodontal, displasia fibrosa y/o enfermedad de Paget; o
    (d) un método para prevenir o tratar el cáncer metastásico al hueso que comprende administrar a un sujeto afectado con cáncer metastásico una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, y en donde el cáncer metastásico se selecciona de mama, pulmón, renal, mieloma múltiple, tiroides, próstata, adenocarcinoma, tumores malignos de células sanguíneas, incluyendo leucemia o linfoma; cánceres de cabeza o cuello; cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer del conducto biliar o vesícula biliar; tumores malignos del tracto genital femenino, incluyendo carcinoma de ovario, cánceres de endometrio uterino, cáncer de vagina o cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; cáncer cerebral, incluyendo neuroblastoma; sarcoma, osteosarcoma; o cáncer de piel, incluyendo melanoma maligno o cáncer de células escamosas.
  8. 8. La composición farmacéutica o el artículo para la fabricación de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un segundo agente terapéutico.
  9. 9. La composición farmacéutica o el artículo para fabricación para su uso de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde la administración del anticuerpo se coordina con tratamiento usando un segundo agente terapéutico.
  10. 10. La composición farmacéutica o el artículo para la fabricación de la reivindicación 8 o la composición farmacéutica o el artículo para la fabricación para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el segundo agente terapéutico es otro anticuerpo.
  11. 11. La composición farmacéutica o el artículo para la fabricación de la reivindicación 8 o la composición farmacéutica o artículo para la fabricación para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico para el cáncer.
  12. 12. La composición farmacéutica o el artículo para fabricación de la reivindicación 8 o la composición farmacéutica o el artículo para fabricación para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el segundo agente terapéutico es un bisfosfonato, en donde opcionalmente el bifosfonato es zeledronato, pamidronato, clodronato, etidronato, tilundronato, alendronato o ibandronato.
  13. 13. La composición farmacéutica o el artículo para fabricación para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 9-11, en donde al sujeto se le impide recibir tratamiento con bisfosfonato.
  14. 14. La composición farmacéutica o el artículo para fabricación para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde el anticuerpo es efectivo para reducir la dosificación del segundo agente terapéutico requerido para lograr un efecto terapéutico.
  15. 15. La composición farmacéutica o el artículo para fabricación para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 9-14, en donde dicho sujeto es un mamífero.
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