NO341391B1 - M-CSF-spesifikt monoklonalt antistoff og anvendelse derav - Google Patents

M-CSF-spesifikt monoklonalt antistoff og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO341391B1
NO341391B1 NO20063569A NO20063569A NO341391B1 NO 341391 B1 NO341391 B1 NO 341391B1 NO 20063569 A NO20063569 A NO 20063569A NO 20063569 A NO20063569 A NO 20063569A NO 341391 B1 NO341391 B1 NO 341391B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
csf
human
Prior art date
Application number
NO20063569A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20063569L (no
Inventor
Chen Liu
Deborah Lee Zimmerman
Gregory Martin Harrowe
Kriston Koths
William Michael Kavanaugh
Li Long
Maria Calderon-Cavia
Arnold H Horwitz
Original Assignee
Xoma Technology Ltd
Novartis Vaccines & Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xoma Technology Ltd, Novartis Vaccines & Diagnostics Inc filed Critical Xoma Technology Ltd
Publication of NO20063569L publication Critical patent/NO20063569L/no
Publication of NO341391B1 publication Critical patent/NO341391B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A61K31/663—Compounds having two or more phosphorus acid groups or esters thereof, e.g. clodronic acid, pamidronic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

Teknisk felt
Denne oppfinnelse vedrører et humanisert M-CSF-antistoff som er nyttig for å forebygge og å behandle osteolyse, cancermetastase og bentap assosiert med cancermetastase hos et individ.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Cancermetastaser er den primære årsaken til post-operasjon eller post-terapi tilbakekomst i cancerpasienter. Til tross for intensivt arbeid for å utvikle behandlinger, så forblir cancer metastaser vesentlig motstandsdykrige for terapi. Ben er en av de mest vanlige stedene for metastaser for forskjellige typer humane cancere (for eksempel bryst, lunge, prostata og tyroidcancere). Forekomsten av osteolytiske benmetastaser forårsaker alvorlig sykelighet som skyldes smerte som er vanskelig å behandle, høy mottagelighet for brudd, nervekompresjon og hyperkalsemi. Til tross for viktigheten av disse kliniske problemer så er det få tilgjengelige behandlinger for bentap assosiert med cancermetastaser.
Osteoklaster styrer benreadsorpsjon. Osteoklaster er flerkjernede celler som differensierer fra hemopoietiske celler. Det er generelt akseptert at osteoklaster dannes ved fusjonen av mononuklære forløpere utledet fra hemopoietiske stamceller i benmargen, i stedet for ufullstendig celledelinger (Chambers, Bone and Mineral Research, 6: 1-25, 1989; Gothling et al., Clin Orthop Relat R. 120:201-228, 1976; Kahn et al., Nature 258: 325-327, 1975, Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Walker, Science 180: 875,1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190: 784-785,1975). De deler en felles stamcelle med monocytt-makrofag cellelinjer (Ash et al., Nature 283: 669-680, 1980, Kerby et al., J. Bone Miner Res 7: 353-62, 1992). Differensieringen av osteoklast forløperne til modne flerkjernede osteoklaster krever forskjellige faktorer inkludert hormonell og lokal stimuli (Athanasou et al., Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman et al. Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 190: 784-785, 1975; Zheng et al., Histochem J 23: 180-188, 1991) og levende ben og benceller har vært vist å spille en kritisk rolle i utvikling av osteoklastutvikling (Hagenaars et al., Bone Miner 6: 179-189, 1989). Osteoblast eller benmarg stromale celler kreves også for osteoklast differensiering. En av faktorene som produseres av disse celler som støtter osteoklastdannelse er makrofag kolonistimulerende faktor, M-CSF (Wiktor-Jedrzejczak et al., Proe Nati Acad Sei USA 87: 4828-4832,1990; Yoshida et al., nature 345: 442-444, 1990). Reseptoraktivator for NF-KB-ligand (RANKL, også kjent som TRANCE , ODF og OPGL) er et annet signal (Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992), som osteobalst/stromale celler stimulerer osteoklastdannelse gjennom og resprosjon via en reseptor, RANK (TRANCER), loaklisert på osteoklaster og osteoklast forløpere (Lacey et al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et al., Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997; Wong et al, J Exp med 186: 2075-2080, 1997; Wong et al., J Biol. Chem272: 25190-25194, 1997; Yasuda et al., Endocrinology 139: 1329-1337, 1998; Yasuda et al, Proe nati Acad Sei US 95: 3597-3602, 1998). Osteoblaster skiller også ut et protein som sterkt hemmer osteoklastdannelse og som kalles osteoprotegerin (OPG, også kjent OCIF), som virker som en lokkereseptor for RANKL og hemmer dermed det positive signalet mellom osteoklaster og osteoblaster via RANK og RANKL.
Osteoklaster er ansvarlig for oppløsning av både den minerale og organiske benmatriksen (Blair et al., J Cell Biol 102: 1164-11172, 1986). Osteoklaster representerer terminalt differensierte celler som uttrykker en unik polarisert morfologi med spesialiserte membranområder og flere membran og cytoplasmatiske markører, slik som tartratresistent sur fosfatase (TRAP) (Anderson et al. 1979), karbonanhydrase II (Våånånen et al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), kalsitoninreseptor (Warshafsky et al., Bone 6: 179-185, 1985) og vitronektinreseptor (Davies et al., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989). Flerkjernede osteoklaster inneholder vanligvis mindre enn 10 kjerner, med de kan inneholde opp til 100 kjerner når de er mellom 10 og 100 um i diameter (Gothling et al., Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976). Dette gjør at de er relativt lette å identifisere med lysmikroskopi. De inneholder mange vakuoler når de er i den aktive tilstanden, og de inneholder også mange mitokondrier, som er en indikasjon på en høy metabolsk hastighet (Mundy, in Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, s. 18-22, 1990). Fordi osteoklaster spiller en hovedrolle i osteolytisk benmetastase, så er det et behov i fagfeltet for nye midler og fremgangsmåter for å forhindre osteoklaststimulering og funksjon.
Det er dermed et behov i fagfeltet for å identifisere nye midler og fremgangsmåter for å forhindre eller å behandle osteolyse eller cancermetastaser, inkluder osteolytiske benmetastaser.
WO 9608565 beskriver rekombinante peptider som spesifikt og selektivt binder til HMFG-antigenet, BA46. Spesielt beskrives rekombinante varianter av Mc3-antistoffet, inkludert humaniserte versjoner av Mc3. Variant-Mc3-peptidene er spesielt nyttige for diagnostiske, prognotiske og terapeutiske anvendelser innenfor området brystcancer. WO 2004045532 beskriver M-CSF-antagonister og farmasøytiske sammensetninger som inneholder slike, som er nyttige ved forebygging og behandling av benmetastaser og tumorvekst.
WO 0130381 beskriver anvendelse av inhibitorer med CSF-1 aktivitet for behandling av tumorsykdommer.
US 20020141994 beskriver ulike midler som hemmer eller på annen måte hindrer produksjon, frigjøring eller akrtivitet av CSF, og som kan brukes terapeutisk ved behandling av iskemi og andre inflammatoriske sykdommer, så som autoimmun sykdom og forskjellige kroniske inflammatoriske sykdommer som reumatoid artritt og psoriasis.
Oppsummering av oppfinnelsen
Materialene og fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen innfrir de tidligere nevnte og andre relaterte behov i fagfeltet. Oppfinnelsen tilveiebringer et humanisert anti-M-CSF-antistoff, der: den tunge kjeden omfatter den tunge kjedevariable regionsekvensen satt fram i Sekv. id. nr. 43 og en IgGl-konstantregion; og den lette kjeden omfatter den lette kjedevariable regionsekvensen satt fram i Sekv. id. nr. 53.
Et ikke-muse monoklonalt antistoff er beskrevet her, inkludert funksjonelt fragment, som spesifikt binder seg til den samme epitopen av M-CSF som ethvert av muse-monoklonalt antistoff RX1, MCI eller MC3 som har aminosyresekvensene satt frem i henholdsvis Figurene 4, 14 og 15. Et tidligere nevnt antistoff er beskrevet hvor antistoffet er valgt fra gruppen som består av et polyklonalt antistoff; et monoklonalt antistoff inkludert et Human Engineered™ antistoff; et humanisert antistoff; et humant antistoff; et kimert antistoff; Fab, F(ab')2; Fv; Sc Fv eller SCA antistoffragment; et diastoff; lineært antistoff; eller et mutein av ethvert av disse antistoffene, somhelst har bindingsaffinitet på minst IO"<7>, IO"<8>eller IO"<9>eller høyere. Et ikke-muse monoklonalt antistoff, inkludert funksjonelt fragment som konkurrerer med monoklonalt antistoff RX1, MC2 og/eller MC3 som har aminosyresekvensen satt fram i Figur 4 for binding til M-CSF med mer enn 75%, blir også overveid.
Et ikke-musemonoklonalt antistoff, inkludert funksjonelt fragment, hvor nevnte ikke-musemonoklonale antistoff eller funksjonelle fragment av det binder seg til en epitop av M-CSF som inkluderer minst 4, 5, 6, 7 eller 8 etterfølgende residier av aminosyrene 98-105 i Figur 12er beskrevet.
Det er her også beskrevet et ikke-muse monoklonalt antistoff, inkludert funksjonelt fragment, hvor nevnte ikke-muse monoklonale antistoff eller funksjonelle fragment av det binder en epitop av M-CSF som inkluderer minst 4, 5, 6, 7 eller 8 etterfølgende residier av aminosyrer 65-73 eller 138-144 i Figur 12 (som korresponderer til M-CSF-epitoper gjenkjent av 5H4 eller MC3).
Det tidligere nevnte antistoff eller fragment som binder seg til en epitop av M-CSF som inkluderer aminosyrene 98-105 i Figur 12er beskrevet. Det tidligere nevnt antistoff som omfatter CDR3 i Figur 4A er også beskrevet. Antistoffet kan omfatte minst 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 cDRer av muse-antistoff RX1 satt fram i Figur 4a. Et slikt antistoff som omfatter minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer av muse-antistoff RX1 kan også omfatte minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer av ethvert av de 6 CDRene av antistoff 5H4, satt fram i Figur 16A-B. Alternativt så kan antistoffet som omfatter minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer av muse-antistoff RX1 også omfatte minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer av ethvert av de 6 CDRene av antistoff MCI satt fram i Figur 16A-B. I enda et annet alternativ så kan det tidligere nevnte antistoffet også omfatte minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer fra ethvert av de 6 CDRene av antistoff MC3 satt fram i Figur 16A-B. Antistoffet som omfatter minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer av muse-antistoff RX1 kan omfatte minst 1, 2, 3, 4 eller 5 CDRer av konsensus CDRene satt fram i Figur 16A-B. I det tidligere nevnte antistoffet kan et eller flere residier av konsensus CDRen eller CDRene være substituert med det korresponderende residiet fra ethvert av CDRene av antistoff muse RX1, 5H4, MCI eller MC3. Den ønskede bindingsaffiniteten kan bevares selv om en eller flere aminosyrene i antistoffet er blitt mutert, for eksempel ved konservativ substitusjon i CDRene, og/eller konservativ eller ikke-konservative forandringer i residiene med lav eller moderat risiko.
Det er her også beskrevet varianter av det tidligere nevnte antistoffet, som omfatter en variabel tungkjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% homolog til aminosyresekvensen satt fram i Figurene 4A, 13,14 eller 15. Antistoffet kan omfatte en variabel lett kjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% homolog til aminosyresekvensen satt fram i Figurene 4A, 13, 14 eller 15.
Antistoffet kan omfatte en konstant region og en eller flere tung- eller lett kjedevariabel leserammeregioner til en human antistoffsekvens. Antistoffet kan omfatte en modifisert eller ikke-modifisert konstant region va et humant IgGl, IgG2, IgG3 eller IgG4. Foretrukket er den konstante regionen humant IgGl eller IgG4, som valgfritt kan være modifisert for å øke eller redusere visse egenskaper. I tilfeller med IgGl, så kan modifikasjoner i den konstante regionen, spesielt hengsel eller CH2-regionen, øke eller redusere effektorfunksjon, inkludert ADCC og/eller CDC-aktivitet. En IgG2-konstantregion kan være modifisert for å redusere antistoff-antigen aggregatdannelse. I tilfellet med IgG4, så kan modifikasjoner til den konstanten regionen, spesielt hengselregionen, redusere dannelsen av halv-antistoffer.
Det tidligere nevnte antistoffet kan være utledet fra, basert på eller inneholder del av en human konsensussekvens, human "germline" sekvens, human konsensus "germline" sekvens eller enhver av de humant antistoffsekvensene i Kabat, NCBI lg Blast, http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ igblast/ showGermline. cgi. Kabat database http:// www. bioinf. org. uk/ abs/ seqtest. html. FTP-sete for kabat Release 5.0 (1992) ftp:// ftp. ncbi. nih. hov/ repository/ kabat/ Rel5. 0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier, Frankrike) http:// imgt. cnusc. fr:8104/. V-base http:// www. mrc-cpe. cam. ac. uk/ LIST. php?menu=901. Zurich University
http:// www, unizh. ch/~ antibodv/ Sequences/ index. html, det terapeutiske antistoff human homologiprosj ektet (TAHHP)
http:// www. path. cam. ac. uk/~ mrc7/ humanisation/ TAHHP. html, proteinsekvens og strukturanalyse av antistoff domener http:// how. to/ AnalvseAntibodies/. humanisering ved design http:// people. crvst. bbk. ac. uk/~ ubcg07s/. antistoff kilder http:// www. antibodyresource. com/ educational. html, antistoff konstruksjon (av TT Wu), Humana Press.
I et foretrukket aspekt av oppfinnelsen så er det tidligere nevnte antistoffet et Human Engineered TM antistoff. For eksempel så o er den Human Engineered<TM>antistoffsekvensen enhver av sekvensene satt frem i Figurene 23-24. Andre Human Engineered™ antistoffer eller varianter av dem blir overveid.
For eksempel, så blir et tidligere nevnt RX1-basert antistoffbeskrevet, hvor den tungkjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
XiVX2LX3EX4GX5X6X7X^9XioXiiXi2Xi3LXi4LXi5CXi6VXi7DYSITSDYAWNWIXI8QX19X20X21X22X23LX24WMGYISYSGSTSX25NX26X27LX28X29X30LX31IX32RX33X34X35X36X37X38FX39LX40LX41X42VX43X44X45DX46AX47YYCASFDYAHAMDYWGX48GTX49VX50VX51X52(Sekv. Id. Nr. 124), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den tunge kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen DVX1LX2EX3GPX4X5VX6PX7X8X9LX10LX11CX12VTDYSITSDYAWNWIRQX13PX14Xi5KLEMWMGYISYSGSTSYNPSLKXi6RIXi7lXi8RXi9TX2oX2iNX22FX23LX24LX25 X26VX27X28X29DX30ATYYCASFDYAHAMDYWGX31GTX32VX33VX34X35(Sekv. Id. Nr. 125), hvori X er enhver aminosyre.
Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet, hvor den tungkjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
X1VQLQESGPGLVKPSQX2LSLTCTVX3DYSITSDYAWNWIRQFPGX4X5LEWMG
YISYSGSTSYNPSLKSRrX6IX7RDTSKNQFX8LQLNSVTX9XioDTAXiiYYCASFDY AHAMDYWGQGTX12VTVSS (Sekv. Id. Nr. 126), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den tunge kjedevariabelregionen omfatter aminosyresekvensen
DVQLQESGPGLVKPSQX1LSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGX2KLEWMGYI SYSGSTSYNPSLKSRIX3IX4RDTSKNQFX5LQLNSVTX6X7DTATYYCASFDYAHA
MDYWGQGTXgVTVSS (Sekv. id. nr. 127), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den tunge kjedvariabelregionen omfatter aminosyresekvensen
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYIS YSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYYCASFDYAHAMDY
WGQGTTVTVSS (Sekv. id. nr. 41). Den tunge kjeden av antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatter den tunge kjedevariabelregionen omfatter aminosyresekvensen
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDYSITSDYAWNWIRQFPGKGLEWMGYIS YSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTAVYYCASFDYAHAMDY
WGQGTT VTVS S (Sekv. id. nr. 43).
Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet hvor den lette kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
XiEX2LX3QX4X5X6X7X8X9XioXiiXi2Xi3Xi4VXi5FXi6CXi7AXi8QSIGTSIHWYXi9QX 20X21X22X23X24PX25LLIKYASEX26X27X28X29DC30X31X32FX33GX34GX35GX36X37FX38L X39IX4oX4lVX42X43X44DX45ADYYCQQINSWPTTFGX46GTX47LX48X49X5oX5lX52(Sekv. id. nr. 128), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den lette kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen XiEX2LX3QX4PX5X6LX7VX8PX9XioXiiVXi2FXi3CXi4ASQSIGTSIHWYQQXi5TXi6X17SPRLLIKYASEX18ISX19IPX20RFX21GX22GX23GX24X25FX26LX27IX28X29VX30X31 X32DX33ADYYCQQINSWPTTFGX34GTX35LX36X37X38X39X4o(Sekv. id. nr. 129), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den lette kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
XirX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8X9PRLLIKY
ASEX10X11X12GIPX13RFSGSGSGTDFTLX14IX15X16VESEDX17ADYYCQQINSWPT TFGXi8GTKLEIKRXi9(sekv. id. nr. 130), hvor X er enhver aminosyre.
Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet hvor den lette kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
XiEX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8SPRLLIKYA
SEX9ISGIPX10RFSGSGSGTDFTLX11IX12X13VESEDX14ADYYCQQINSWPTTFGX15GTKLEIKRX16(Sekv. id. nr. 131), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den lett kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen X1IX2LTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQX6TX7X8X9PRLLIKY ASESISGIPX10RFSGSGSGTDFTLX11IX12X13VESEDX14ADYYCQQINSWPTTFGX15GTKLEIKRX16(Sekv. id. nr. 132), hvor X er enhver aminosyre. Antistoffet er beskrevet hvor den lett kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet hvor den lett kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASERAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (Sekv. id. nr. 47). Antistoffet er beskrevet hvor den lett kjedevariable regionen omfatter aminosyresekvensen
Også beskrevet her er antistoffet, hvor minst en X er en korresponderende aminosyre innen aminosyresekvensen satt fram i Figur 4A. Antistoffet er beskrevet hvor minst en X er en konservativ substitusjon (ifølge Tabell 1) av en korresponderende aminosyre innen aminosyresekvensen satt fram i Figur 4A. Også beskrevet her er antistoffet hvor minst en X er en ikke-konservativ substitusjon (ifølge Tabell 1) av en korresponderende aminosyre innen aminosyresekvensen satt fram i Figur 4A. Også beskrevet her er antistoffet hvor minst en X er en korresponderende aminosyre innen den humane antistoffsekvens.
Det tidligere nevnte Human Engineered™ antistoffet er utledet fra, basert på, eller inneholder del av den humane antistoff konsensussekvensen, humant "germline" sekvens, human konsensus "germline" sekvens eller ethvert av de humane antistoffsekvensene i Kabat, NCBI lg Blast, http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ igblast/ showGermline. cgi. Kabat database http:// www. bioinf. org. uk/ abs/ seqtest. html. FTP-sete for Kabat Release 5.0 (1992) ftp:// ftp. ncbi. nih. hov/ repository/ kabat/ Rel5. 0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier, Frankrike) http:// imgt. cnusc. fr:8104/. V-base http:// www. mrc-cpe. cam. ac. uk/ LIST. php?menu=901. Zurich University
http:// www, unizh. ch/~ antibody/ Sequences/ index. html, det terapeutiske antistoff human homologiprosj ektet (TAHHP)
http:// www. path. cam. ac. uk/~ mrc7/ humanisation/ TAHHP. html. proteinsekvens og strukturanalyse av antistoff domener http:// how. to/ AnalvseAntibodies/. humanisering ved design http:// people. cryst. bbk. ac. uk/~ ubcg07s/, antistoff kilder http:// www. antibodyresource. com/ educational. html, antistoff konstruksjon (av TT Wu), Humana Press.
Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet hvor en Human Engineered™ antistoff sekvens er en av sekvensene satt fram i Figurene 23-24 eller 29-30 . Antistoffet kan omfatte en variabel tung kjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% identisk til en av de tungkjede aminosyresekvensene satt fram i Figur 19B. Antistoffet kan omfatte en variabel lettkjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% identisk til en av de lettkjede aminosyresekvensene satt fram i hver av Figurene 20B-22B.
Det tidligere nevnte antistoffet slik som 5H4, MCI eller MC3-antistoffet med sekvenser satt frem i en av Figurene 24C-24E kan være Human Engineered™ ifølge fremgangsmåtene satt frem i Studnicka et al., US patentnr. 5 766 886 og Eksempel 4A heri, ved å anvende Kabat-nummereringen satt frem i Figurene 24C-24E for å identifisere residier med lav, moderat og høy risiko. Det tidligere nevnte antistoffet er beskrevet, hvor alle lav-risiko residiene i enten den tunge eller lette kjeden eller begge er modifisert, der hvor det er nødvendig, til å være de samme residiene som en human referanse immunglobulinsekvens. Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet hvor alle av lav+moderat risikoresidiene i enten den tunge eller lette kjeden eller begge er modifisert, hvor det er nødvendig, til å være de samme residiene som en human referanse immunglobulinsekvens. En tung kjede hvor alle lav-risiko residier er blitt modifisert kan kombineres med en lett kjede hvor alle av lav og moderat risikoresidiene er blitt modifisert og vise versa. På samme måte så kan et tidligere nevnt Human Engineered™ lett eller tung kjede kombineres med en lett eller tung kjede fra et humanisert eller kimert antistoff.
Antistoffet kan omfatte en variabel tungkjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% identisk til en av de tungkjede aminosyresekvensene beskrevet rett over Human Engineered™ ifølge Studnicka fremgangsmåten. Antistoffet kan omfatte en variabel lettkjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% identisk til en av lettkjede aminosyresekvensene beskrevet rett over Human Engineered™ ifølge Studnicka-fremgangsmåten.
Også beskrevet her er et antistoff som omfatter en tung kjede som satt frem over og en lett kjede som satt frem over.
Det tidligere nevnte antistoffet kan ha en affinitet Kd på minst 10[-7]. Antistoffet kan ha en affinitet Kd på minst 10[-9].
Også beskrevet her er det tidligere nevnte antistoffet som er et polyklonalt antistoff; et monoklonalt antistoff inkludert et Human Engineered™ antistoff; et humanisert antistoff; et humant antistoff; et kimert antistoff; Fab, F(ab')2, Fv, ScFv eller SCA antistoffragment; et diastoff; et lineært antistoff; eller et mutein av enhver av disse antistoffer. Det monoklonale antistoffet kan være et isolert antistoff.
Også beskrevet her er en isolert nukleinsyre som omfatter en nukleinsyresekvens som koder for en lett kjede i det tidligere nevnte antistoffet. Den isolerte nukleinsyre kan omfatte en tung kjede nukleinsyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% identisk til den tungkjede nukleinsekvensen satt frem i Figurene 4A, 13, 14 eller 15. Den isolerte nukleinsyren kan omfatte en lett kjede nukleinsyresekvens som er minst 60, 695, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% identisk til den lettkjede nukleotidsekvensen satt fram i Figurene 4A, 13, Heller 15.
En vektor som omfatter den tidligere nevnte isolerte nukleinsyrener også beskrevetOgså beskrevet her er den tidligere nevnte vektoren hvor den isolerte nukleinsyren er operativt koblet til en regulatorisk kontrollsekvens. Også beskrevet her er en vertscelle som omfatter den tidligere nevnte vektoren.
Flere fremgangsmåter blir overveid. For eksempel så blir en fremgangsmåte for å produsere et tidligere nevnt antistoff beskrevet som omfatter å dyrke den tidligere nevnte vertscellen slik at den isolerte nukleinsyre uttrykkes for å produsere antistoffet. Fremgangsmåten kan videre omfatte trinnet med å gjenvinne antistoffet fra vertscellekulturen. Et isolert antistoff produsert av den tidligere nevnte fremgangsmåten er beskrevet.
En hybridoma som utskiller et tidligere nevnt antistoff blir ogsåbeskrevet her. I tillegg så blir et tidligere nevnt antistoff som er konjugert til et toksinbeskrevet.
Også beskrevet her er en farmasøytisk sammensetning som omfatter enhver av de tidligere nevnte antistoffene og en farmasøytisk passende bærer, hjelpemiddel eller fortynner. Den farmasøytiske sammensetning kan videre omfatte et andre terapeutisk middel. Også beskrevet her er den farmasøytiske sammensetningen hvor det andre terapeutiske middelet er et cancer kjemoterapeutisk middel. Også beskrevet her er den farmasøytiske sammensetningen hvor det andre terapeutiske middelet er et bifosfonat. Det andre terapeutiske middelet kan være et annet antistoff.
Oppfinnelsen tilveiebringer et antistoff ifølge oppfinnelsen for anvendelse i terapeutiske applikasjoner som involverer in vzvo-administrering til et menneske.
Antistoffer i den foreliggende oppfinnelsen blir overveid til å ha flere ønskelige karakteristika for behandlingen av sykdommer eller forstyrrelser. Også beskrevet her er antistoffer ifølge oppfinnelsen for anvendelse for å forebygge et individ som lider av en sykdom som forårsaker eller bidrar til osteolyse, hvor antistoffet effektivt reduserer alvorligheten av bentap assosiert med denne sykdommen. På samme måte så er det også her tilveiebragt antistoffer ifølge oppfinnelsen for å behandle et individ som lider av en sykdom som forårsakerer eller bidrar til osteolyse, hvor nevnte antistoff effektivt reduserer alvorligheten av bentap assosiert med sykdommen.
Flere sykdommer og forstyrrelser blir overveid til å være medgjørelig for antistoff-basert behandling i foreliggende oppfinnelse. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan være tilveiebrakt hvor nevnte tilstand er valgt fra gruppen bestående av metabolske bensykdommer assosiert med relativt øket osteoklastaktivitet, inkludert endokrinopatier (hyperkortisolisme, hypogonadisme, primær eller sekundær hyperparatyroidisme, hypertyroidisme), hyperkalsemi, mangeltilstander (rakitt/knokkelskjørhet, skjørbuk, feilernæring), kroniske sykdommer (malabsorpsjon syndromer, kronisk nyrefeil (nyre osteodystrofi), kronisk leversykdom (hepatisk osteodystrofi)), medikamenter (glukokortikoider (glukokortikoid-indusert osteoporose), heparin, alkohol) og arvelige sykdommer (ufullstendig osteogenese, homocystinuria), cancer, osteoporose, osteopetrose, inflammasjon av ben assosiert med artritt og reumatoid artritt, periodontal sykdom, fibrøs dysplasi og/eller Pagets sykdom.
Antistoffet ifølge oppfinnelsen er tilveiebrakt for anvendelse for å forebygge eller behandle metastatisk cancer til ben, hvor den metastatiske canceren er bryst, lunge, nyre, multiple myeloma, tyroid, prostata, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter, inkludert leukemi og lymfoma; hode- og nakke cancere; gastrointestinale cancere, inkludert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pankreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangene eller galleblæren; ondartetheter i det kvinnelige reproduksjonssystemet, inkludert ovariekarsinoma, livmor endometriale cancere, vaginal cancer og cervikal cancer; blærecancer; hjernecancer, inkludert neuroblastoma; sarkoma, osteosarkoma; og hudcancer, inkludert malign melanoma eller skvamøs cellecancer.
Også beskrevet her er en fremgangsmåte for å screene M-CSF-spesifikt antistoff som omfatter trinnene med å la metastatisk tumorcellemedium, osteoklaster og et kandidat antistoff komme i kontakt med hverandre; å detektere osteoklastdannelse, proliferering og/eller differensiering; og å identifisere nevnte kandidatantistoff som et M-CSF-spesifikt antistoff hvis en nedgang i osteoklastdannelse, proliferering og/eller differensiering er detektert. På samme måte så blir den tidligere nevnte fremgangsmåten beskrevet hvor nevnte metastatiske tumorcellemedium inkluderer tumorceller.
Den tidligere nevnte fremgangsmåten er beskrevet hvor kontakttrinnet (a) skjer in vivo, nevnte deteksjonstrinn (b) som omfatter å detektere størrelse og/eller antall
benmetastaser, og kandidat antistoffet blir identifisert som et M-CSF-spesifikt antistoff hvis en nedgang i størrelse og/eller antall benmetastaser blir detektert. Også beskrevet er er den tidligere nevnte fremgangsmåten som videre omfatter trinnet med å bestemme om kandidatantistoffet binder ti M-CSF. På samme måte så er også her beskrevet den tidligere nevnte fremgangsmåten som videre omfatter trinnet med å bestemme om nevnte kandidat antistoff hemmer interaksjon mellom M-CSF og dets reseptor M-CSFR.
Også beskrevet her er en fremgangsmåte for å identifisere et M-CSF-spesifikt antistoff som kan forebygge eller behandle metastatisk cancer i ben, som omfatter trinnene: (a) å detektere binding av et kandidatantistoff til en epitop av M-CSF som
inkluderer minst 4 etterfølgende residier av aminosyrer 98-105 i Figur 12; og
(b) å undersøke evnen nevnte kandidat antistoff har til å forebygge eller behandle
metastatisk cancer til ben in vitro eller in vivo.
Også her beskrevet er en fremgangsmåte for å identifisere et M-CSF-spesifikt antistoff som kan forebygge eller behandle metastatisk cancer til ben, som omfatter trinnene: (a) å detektere binding av et kandidatantistoff til en epitop av M-CSF som inkluderer minst fire etterfølgende residier av aminosyrer 65-73 eller 138-144 i
Figur 12 (som korresponderer til M-CSF epitoper gjenkjent av 5H4 eller MC3); og
(b) å analysere evnen nevnte kandidatantistoff har til å forebygge eller behandle
metastatisk cancer til ben in vitro eller in vivo.
Også her beskrevet er en fremgangsmåte for å forandre en CDR til et antistoff som binder til en epitop av M-CSF som inkluderer aminosyrer 98-105 til Figur 12 som omfatter å forandre en aminosyre innen en CDR med aminosyresekvensen satt frem i
Figur 4A, og velge et antistoff som binder M-CSF med en affinitet Ka på minst 10 [-7]. En fremgangsmåte for systematisk å forandre opp til 60% av den tungkjede aminosyresekvensen satt frem i Figur 4A er beskrevet som omfatter å forandre enhvar av X1-X52 i aminosyresekvensen
X1VX2LX3EX4GX5X6X7X8X9X10X11X12X13LX14LX15CX16VX17DYSITSDYAWNWK18QX19X20X21X22X23LX24WMGYISYSGSTSX25NX26X27LX28X29X30DC31DC32RX33X34X35X36X37X38FX39LX4oLX4lX42VX43X44X45DX46AX47YYCASFDYAHAMDYWGX48GTX49VX50VX51X52(Sekv. id. nr. 133), og å teste et antistoff som omfatter den forandrede aminosyresekvensen for å binde seg til en epitop av M-CSF som inkluderer aminosyrene 98-105 i Figur 12.
En fremgangsmåte som systematisk forandrer opp til 60% av den lettkjede aminosyresekvensen satt fram i Figur 4A er beskrevet som omfatter å forandre enhver av X1-X52 i aminosyresekvensen
XiEX2LX3QX4X5X6X7X8X9VXioXiiXi2Xi3Xi4VXi5FXi6CXi7AXi8QSIGTSIHWYXi9QX2oX21x22x23x24px25LLIKYASEX26X27<X>28X29lX3oX3iX32FX33GX34GX35GX36X37FX38LX39lX40X4lVX42X43X44DX45ADYYCQQINSWPTTFGX46GTX47LX48X49X50X5lX52(Sekv. id. nr. 134), og teste et antistoff som omfatter den forandrede aminosyresekvensen for binding til en epitop av M-CSF som inkluderer aminosyrer 98-105 i Figur 12.
Også her beskrevet er en fremgangsmåte for å forandre en CDR til et antistoff som binder en epitop av M-CSF som inkluderer aminosyrer 65-73 eller 138-144 i Figur 12 (som korresponderer til M-CSF epitoper gjenkjent av 5H4 eller MC3) som omfatter å forandre en aminosyre innen et CDR av aminosyresekvensen satt fram i en av Figurene 13,14 og 15, og for å velge et antistoff som binder M-CSF med en affinitet Ka på minst 10[-7]. En fremgangsmåte for systematisk å forandre opp til 60% av den tungkjede aminosyresekvensen satt frem i en av figurene 13, 14 og 15 er beskrevet som omfatter å forandre de tidligere nevnte sekvensene i henhold til fremgangsmåtene satt fram i Studnicka et al., US patentnr. 5 766 886 og Eksempel 4A her, og i henhold til Kabat-nummereringen satt fram i figurene 24C-24E, og å teste et antistoff som omfatter den forandrede aminosyresekvensen for binding til en epitop av M-CSF som inkluderer aminosyrer 65-73 eller 138-144 i Figur 12 (som korresponderer til M-CSF epitoper som gjenkjennes av 5H4 eller MC3). Alle residier med lav risiko kan være modifisert. På samme måte kan alle risidier med lav eller moderat risiko være modifisert, eller alle residiene med lav og moderat risiko unntatt proliner kan være modifisert.
Også beskrevet her er en fremgangsmåte for å uttrykke et antistoff som har CDRer designet ved den tidligere nevnte prosessen. En farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff som binder seg til MCSF, hvor nevnte antistoff lages ved å anvende den tidligere nevnte fremgangsmåtener beskrevet.
Oppfinneslen tilveiebringer anvendelse av antistoffet ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et medikament for å forebygge eller å redusere bentap hos en pasient som lider av en sykdom som forårsakerer eller bidrar til osteolyse. En terapeutisk effektiv mengde av enhver av de tidligere nevnte antistoffene kan anvendes, og dermed forebygge eller redusere bentap assosisert med sykdommen. Oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer ifølge oppfinnelsen for anvendelse for å forebygge eller behandle et individ som lider av en sykdom som forårsakerer eller bidrar til ostelyse, der nevnte antistoffet effektivt reduserer alvorligheten av bentap assosiert med sykdommen.
Den tidligere nevnte anvendelsen blir tilveiebrakt hvor nevnte sykdom er valgt fra gruppen som består av metabolske bensykdommer assosiert med relativt øket osteoklast aktivitet, inkludert endokrinopatier (hyperkortisolisme, hypogonadisme, primær eller sekundær hyperparatyroidisme, hypertyroidisme), hyperkalsemi, mangeltilstander (rakitt/knokkelskjørhet, skjørbuk, feilernæring), kroniske sykdommer (malabsorpsjonssyndromer, kronisk nyrefeil (nyre osteodystrofi), kronisk leversykdom (hepatisk osteodystrofi)), medikamenter (glukokortikoider (glukokortikoid-indusert osteoporose), heparin, alkohol), og arvelige sykdommer (ufullstendig osteogenese, homocystinuri), cancer, osteoporose, osteopetrose, inflammasjon i ben assosiert med artritt og reumatoid artritt, periodontal sykdom, fibrøs dysplasi og/eller Pagets sykdom.
Oppfinnelsen tilveiebringer et antistoff ifølge oppfinnelsen for anvendelse for å forebygge eller å behandle metastatisk cancer til ben. En terapeutisk effektiv mengde av enhver av de tidligere nevnte antistoffene kan administreres til et individ som lider av metastatisk cancer.Den metastatiske canceren kan være bryst, lunge, nyre, multiple myeloma, tyroid, prostata, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter, inkludert leukemi og lymfoma; hode- og nakke cancer; gastrointestinale cancere, inkluert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pankreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangen eller galleblæren, ondartetheter i det kvinnelige reproduksjonssysternet, inkluder ovariekarsinoma, livmor endometriale cancere, vaginale cancere og livmorhals cancer; blære cancer; hjerne cancer inkludert neuroblastomer; sarkoma, osteosarkoma; og hudcancer inkludert malignt melanoma og skjellet cellecancer.
En fremgangsmåte for å forebygge bentap og tumorvekst er beskrevet som omfatter å gi til et individ som trenger det, terapeutisk effektive mengder av enhver av de tidligere nevnte antistoffene. Fremgangsmåten kan videre omfatte å gi et andre terapeutisk middel. Også beskrevet her er fremgangsmåten hvor det andre terapeutiske middelet er et cancer kjemoterapeutisk middel eller et bisfosfonat. Også beskrevet her er fremgangsmåten hvor bisfosfonatet er zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, trilundronat, alendronat eller ibandronat. Også beskrevet her er de tidligere nevnte fremgangsmåtene hvor det terapeutiske middelet er et cytotoksisk, kjemoterapeutisk middel. Også beskrevet her er den tidligere fremgangsmåten hvor individet er utelukket fra å motta bifosfonatbehandling.
Den tidligere nevnte fremgangsmåten er beskrevet hvor antistoffet er effektivt i å redusere dosen av annet terapeutisk middel som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk effekt. Det andre terapeutiske middelet kan være en ikke M-CSF-kolonistimulerende faktor, for eksempel G-CSF eller anti-RANKL-antistoff eller løselig RANKL-reseptor.
Også beskrevet her er de tidligere nevnte fremgangsmåtene hvor individet er et pattedyr. Pattedyret kan være et menneske.
De tidligere nevnte fremgangsmåtene er beskrevet hvor antistoffet hemmer interaksjonen mellom M-CSF og dets reseptor (M-CSFR). Antistoffet kan hemme osteoklast proliferering og/eller differensiering indusert av tumorceller. De tidligere nevnte fremgangsmåtene er beskrevert der antistoffet blir administrert i en dose mellom ca. 2 ug/kg til 30 mg/kg, 0,1 mg/kg til 30 mg/kg eller 0,1 mg/kg til 10 mg/kg kroppsvekt.
Anvendelsen av et antistoff ifølge oppfinnelsen blir overveid til fremstilling av et medikament for å forebygge eller redusere bentap i en pasient som utvikser symptomer på osteolyse, og i produksjonen av et medikament for å behandle en pasient som lider av en sykdom som forårsaker eller bidrar til osteolyse. Den tidligere nevnte anvendelsen blir videre overveiet hvor sykdommen er valgt fra gruppen som består av metabolske bensykdommer assosiert med relativt øket osteoklastaktivitet, inkludert endokrinopatier (inkludert hyperkortisolisme, hypogonadisme, primær eller sekundær hyperparatyroidisme, hypertyroidisme), hyperkalsemi, mangeltilstander (inkludert rakitt/knokkelskjørhet, skjørbuk, feilernæring), kroniske sykdommer (inkludert malabsorpsjonssyndromer, kronisk nyrefeil (inkludert nyreosteodystrofi), kronisk leversykdom (inkludert hepatisk osteodystrofi)), medikamenter (inkludert glukokortikoider (glukokortikoidindusert osteoporose), heparin, alkohol) og arvelige sykdommer (inkludert ufullstendig osteogense, hmocystinuria), cancer, osteoporose, osteopetrose, inflammasjon i ben assosiert med artritt og reumatoid artritt, periodontal sykdom, fibrøs dysplasi og/eller Pagets sykdom.
Anvendelse av et antistoff ifølge oppfinnelsen blir overveid til fremstilling av et medikament for å forebygge eller å behandle metastatisk cancer til ben i en pasient som lider av metastatisk cancer. I en relatert utførelsesform så er den metastatiske canceren bryst, lunge, nyre, multippel myeloma, tyroid, prostata, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter inkludert leukemi eller lymfoma; hode- eller nakke cancere; gastrointestinale cancere, inkludert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pakreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangene eller galleblæren; ondartetheter i det kvinnelige reproduksjonssystemet, inkludert ovariekarsinomer, livmor endometriale cancere, vaginal cancer eller livmorhals cancer; blærecancer; hjerne cancer, inkludert neuroblastoma; sarkoma, osteosarkoma; eller hud cancer inkludert malignt melanom eller skjellet cellecancer.
Anvendelsen av et antistoff ifølge oppfinnelsen blir overveid til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som har cancer.
I enhver av de tidligere nevnte anvendelsene, så kan medikamentet være koordinert med behandling ved å anvende et andre terapeutisk middel. Det andre terapeutiske middelet kan være et cancer-kjemoterapeutisk middel. Det andre terapeutiske middelet kan være en ikke-M-CSF-kolonistimulerende faktor, eller anti-RANKL-antistoff, eller løselig RANKL-reseptor, eller et bisfosfonat. Bisfosfonatet kan være zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat eller ibandronat.
Enhver av de tidligere nevnte anvendelsene blir overveid hvor pasienten er utelukket fra å motta bisfosfonatbehandling, og/eller hvor pasienten er blitt forhåndsbehandlet med det andre terapeutiske middel. Det andre terapeutiske middelet kan være et cancerkjemoterapeutisk middel, en ikke-M-CSF kolonistimulerende faktor eller anti-RANKL-antistoff eller løselig RANKL-reseptor, eller et bisfosfonat. Bisfosfonatet kan være zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat eller ibandronat. Pasienten kan være utelukket fra å motta bisfosfonatbehandling.
Også overveid her er anvendelsen av en synergistisk kombinasjon av et antistoff ifølge oppfinnelsen for tillaging av et medikament for å behandle en pasient som utviser symptomer på osteolyse hvor medikamentet er koordinert med behandling ved å anvende et andre terapeutisk middel overveid. Det andre terapeutiske middelet kan være et cancerkjemoterapeutisk middel, en ikke-M-CSF kolonistimulerende faktor eller anti-RANKL-antistoff eller løselig RANKL-reseptor eller et bisfosfonat. Bisfosfonatet kan være zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat eller ibandronat. Pasienten kan være utelukket fra å motta bisfosfonatbehandling.
De tidligere nevnte anvendelsene blir overveid hvor mengden antistoff i medikamentet er ved en dose som er effektiv for å redusere doseringen av andre terapeutiske middel som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk effekt. I enhver av de tidligere nevnte anvendelsene vedrørende bentap assosiert med cancer, så er mengden antistoff i medikamentet helst effektivt i å hemme osteoklastproliferaring og/eller differensiering indusert med tumorceller.
Mengden av antistoff i enhver av de tidligere nevnte medikamentene kan være ved en dose mellom ca. 2 ug/kg til 30 mg/kg kroppsvekt. Mengden av antistoff i medikamentet kan være ved en dose mellom ca. 0,1 mg/kg til 30 mg/kg kroppsvekt. Mengden av antistoff i medikamentet kan være ved en dose mellom ca. 0,1 mg/kg til 10 mg/kg kroppsvekt.
Kitt blir også overveiet i beskrivelsen. Et kitt som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen pakket i en beholder, slik som et rør eller flaske, og som videre omfatter en merking festet til eller pakket med beholdere, merkingen beskriver innholdet av beholderen og tilveiebringer indikasjoner og/eller instruksjoner med hensyn på anvendelse av innholdet i beholderen for å forebygge eller å redusere bentap er beskrevet.
Et kitt som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge beskrivelsen pakket i enbeholder, slik som et rør eller flaske, og som videre omfatter en merking festet til eller pakket med beholdere, merkingen beskriver innholdene av beholderen og tilveiebringer indikasjoner og/eller instruksjoner med hensyn til anvendelse av innholdende i beholderen til en pasient som lider av en sykdom som forårsakerer eller bidrar til osteolyse er beskrevet.
Kittet er beskrevet hvor nevnte sykdom er valgt fra gruppen som består av metabolske bensykdommer assosiert med relativt øket osteoklastaktivitet, inkludert enrokrinopatier (inkludert hyperkortisolisme, hypogonadisme, primær eller sekundær hyperparatyroidisme, hypertyroidisme), hyperkalsemi, mangeltilstander (inkludert rakitt/knokkelskjørhet, skjørbuk, feilernæring), kroniske sykdommer (inkludert malabsorpsjonssyndromer, kronisk nyrefeil (inkludert nyre osteodystrofi), kronisk leversykdom (inkludert hepatisk osteodystrofi)), medikamenter (inkludert glukokortikoider (glukokortikoid-indusert osteoporose), heparin, alkohol), og arvelige sykdommer (inkludert ufullstendig osteogenese, homocysteinuria), cancer, osteoporose, osteopetrose, inflammasjon i ben assosiert med artritt eller reumatoid artritt, periodontal sykdom, fibrøs dysplasi og/eller Pagets sykdom.
Et kitt er beskrevet som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge beskrivelsen, pakket i en beholder, slik som et rør eller flaske, og som videre omfatter en merking festet til eller pakket med beholderen, merkingen beskriver innholdene i beholderen og tilveiebringer indikasjoner og/eller instruksjoner med hensyn på anvendelse av innholdene i beholderen for å forebygge eller behandle metastatisk cancer til ben. Den metastatiske canceren kan være bryst, lunge, nyre, multippel myeloma, tyroid, prostata, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter, inkludert leukemi eller lymfoma; hode- eller nakke cancere; gastrointestinale cancere, inkludert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pankreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangen eller galleblæren; ondartetheter i det kvinnelige reproduksjonssystemet, inkludert ovariekarsinoma, livmorendometriale cancere, vaginal cancer eller livmorhals cancer; blære cancer; hjerne cancer, inkludert neuroblastomer; sarkoma, osteosarkoma; eller hud cancer, inkludert malignt melanoma eller skjellet celelcancer.
Et kitt er beskrevet som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge beskrivelsen, pakket i en beholder, slik som et rør eller flaske, og som videre omfatter en merking festet til eller pakket med beholderen, merkingen beskriver innholdene i beholderen og tilveiebringer indikasjoner og/eller instruksjoner med hensyn på anvendelse av innholdene i beholderen for å behandle cancer.
Kittet kan videre omfatte et andre terapeutisk middel. Det andre terapeutiske middelet kan være et cancerkjemoterapeutisk middel, en ikke-M-CSF-kolonistimulerende faktor eller anti-RANKL-antistoff eller løselig RANKL-reseptor eller et bisfosfonat. Bisfosfonatet kan være zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat eller ibandronat. Kittet kan inkludere instruksjoner for å behandle en pasient som er utelukket fra å motta bisfosfonatbehandling.
Det tidligere nevnte kittet kan omfatte en dose antistoff som er effektiv til å redusere doseringen av andre terapeutisk middel som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk effekt. Kittet kan omfatte en synergistisk dose av antistoff. Kittet kan omfatte en dose antistoff som er effektiv til å hemme osteoklast proliferering og/eller differensiering indusert av tumorceller.
Det tidligere nevnte kittet kan omfatte en dose antistoff mellom ca. 2 ug/kg til 30 mg/kg kroppsvekt. Kittet kan omfatte en dose antistoff mellom ca. 0,1 mg/kg til 30 mg/kg kroppsvekt. Kittet kan omfatte en dose antistoff mellom ca. 0,1 mg/kg til 10 mg/kg kroppsvekt.
Også beskrevet her er en pakke, rør eller beholder som omfatter et medikament som omfatter et eller flere av de tidligere nevnte antistoffene og instruksjoner at medikamentet bør anvendes i kombinasjon med kirurgi eller strålingsterapi. En fremgangsmåte for å forebygge eller å behandle metastatisk cancer til ben som omfatter trinnene med å gi ethvert av de tidligere nevnte antistoffene til et individ og behandle individet med kirurgi eller strålingsterapi er beskrevet. En fremgangsmåte for å måltefte en tumorcelle som uttrykker membran-bundet M-CSF på dets overflate er beskrevet som omfatter trinnet med å gi ethvert av de tidligere nevnte antistoffene, hvor antistoffet er konjugert til et radionukleid eller annet toksin. En fremgangsmåte for å behandle et individ som lider av cancer er beskrevet som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av ethvert av de tidligere nevnte antistoffene.
Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av antistoffet ifølge oppfinnelsen til fremstilling av er medikament for å forebygge bentap hos en pasient som har osteolyse. En av de tidligere nevnte antistoffer kanadministreres til et individ som lider av en sykdom som forårsaker eller bidrar til osteolyse i en mengde som er effektiv for å nøytralisere M-CSF produsert av individets celler. Mengden er større enn mengden som er effektiv for å nøytralisere M-CSF som produseres av cancerceller. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av antistoffet ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som lider av en sykdom som forårsaker eller bidrar til osteolyse . Et hvilket som helst av de tidligere nevnte antistoffer kan administreres til nevnte individ en mengde som er effektiv for å nøytralisere M-CSF produsert av individets celler, mengden er større enn den effektive mengden til å nøytralisere M-CSF produsert av cancercellene.
også beskrevet her er en farmasøytisk sammensetning som omfatter antistoff RX1, 5H4, MCI og/eller MC3, eller et ikke-muse RX1, 5H4, MCI og/eller MC3-utledet antistoff eller et RX1, 5H4, MCI og/eller MC3-konkurrerende antistoff, og et cancerterapeutisk middel. Også beskrevet her er en pakke, rør eller beholder som omfatter et medikament som omfatter antistoff RX1, 5H4, MCI og/eller MC3, eller et ikke-muse RX1, 5H4, MCI og/eller MC3-utledet antistoff eller et RX1, 5H4, MCI og/eller MC3-konkurrerende antistoff, og instruksjoner at medikamentet ved å anvendes i kombinasjon med kirurgi eller strålingsterapi.
Også beskrevet her er en fremgangsmåte for å behandle et individ som lider av en cancer , hvor cellene som omfatter canceren ikke utskiller M-CSF, som omfatter trinnet med å gi ethvert av de tidligere nevnte antistoffene.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 er et topologidiagram som viser disulfidbindingene i avkortet, dimert M-CSF. Figur 2 er et stereodiagram av C-a-ryggraden til M-CSF med hvert 10. redisie merket og med den ikke-krystallografiske symmetriaksen indikert med en prikket linje. Figur 3 er en sammenligning av osteoklastinduserende aktivitet mellom renset M-CSF og kondisjonert medium (CM) fra MDA 231-celler og MCF7-celler. Figur 4A viser aminosyresekvensen av M-CSF-spesifikt muse-antistoff RX1 (Sekv. id. nr. 2 og 4) (kodet for av cDNA-innskuddet i plasmidet som er deponert hos the AMerican Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, under ATCC-deponeringsnr. PTA-6113) og en korresponderende nukleinsyresekvens (Sekv. id. nr. 1 og 3). CDR-regionene er nummerert og vist uthevet. Figur 4B og 4C viser aminosyresekvensene til M-CSF-spesifikt muse-antistoff RX1, henholdsvis lette (Sekv. id. nr. 5) og tunge kjeder (Sekv. id. nr. 6), med høy risiko (uthevet), moderat risiko (understreket) og lav-risikoresidier identifisert i henhold til Studnicka et al., WO 93/11794. Figur 5A viser at M-CSF-antistoffer RX1 og 5A1 er artsspesifikke. Figur 5B viser M-CSF-nøytraliseringsaktivitet til antistoffer MCI og MC3. Figur 6 viser at antistoff RX1 effektivt hemmer osteolyse i en human xenograftmodell ved en konsentrasjon på 5 mg/kg. Figur 7 viser at antallet metastaser er redusert når antistoff RX1 blir gitt til human brystcancer MDA-MB-231 bærende nakne mus ved en konsentrasjon på 5 mg/kg. Figur 8A og 8B viser at et M-CSF-spesifikt antistoff bant til brystcancer cellelinje MDA-MB-231 eller til mutippel myeloma cancercellelinje ARH77.
Figur 9 viser at M-CSF er rådende på en rekke cancercelle overflater.
Figur 10 er aminosyresekvensen til M-CSFoc (Sekv. id. nr. 7).
Figur 11 er aminosyresekvensen til M-CSFØ (Sekv. id. nr. 8).
Figur 12 et aminosyresekvensen til M-CSFy (Sekv. id. nr. 9). En rekke polymorfismer i DNA-sekvensen kan resultere i aminosyreforskjeller. For eksempel så tilveiebringer en vanlig polymorfisme en Ala heller en Pro ved posisjon 104. Figurene 13, 14 og 15 viser aminosyresekvensene til MCSF-spesifikke muse-antistoffer 5H4 (Sekv. id. nr. 10 og 11), MCI (Sekv. id. nr. 12 og 13) (produsert av hybridomaen deponert under ATCC-deponeringsnummer PTA-6263) og MC3 (Sekv. id. nr. 14 og 15) (produsert av hybridoma deponert under ATCC-deponeringsnummer PTA-6274). Figurene 16A og B er oppstillinger av CDR-regionene i de tunge og lett kjedeaminosyresekvensene til humane M-CSF-spesifikke muse-antistoffer RX1; 5H4; MCI; ogMC3 (Sekv. id. nr. 16-38). Figur 17 viser nøytraliseringsaktivitetene til intakte mot Fab-fragmenter for RX1 mot 5H4. Figur 18 viser strukturen av M-CSF med RX1, 5H4 og MC3-epitoper uthevet (Sekv. id. nr. 120, 122 og 123). Figur 19A viser (a) risikolinjen for den muse RX1 tunge kjeden (H= høy risiko, M= moderat risiko, L= lav risiko), (b) den RX1 tunge kjede aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 6) (c) aminosyresekvensen til den nærmeste humane konsensussekvensen, Kabat Vh2-konsensus, oppstilt mot RX1 (Sekv. id. nr. 39) og (d) forandringer som blir gjort for å produsere to eksempler på Human Engineered™ sekvenser (Sekv. id. nr. 41 og 43). Figur 19B viser aminosyresekvensene til de to eksempel tungkjede Human Engineered™ sekvensene (Sekv. id. nr. 41 og 43), betegnet "lav risiko" og "lav + moderat risiko", så vel som de korresponderende nukleinsyresekvensene (Sekv. id. nr. 40 og 42).
Figur 20A viser (a) risikolinjen for den muse RX1 lette kjeden (H=høy risiko, M=moderat risiko, L=lav risiko), (b) RX1 lette kjede aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 5), (c) aminosyresekvensen til den nærmeste humane konsensussekvensen, Kabat Vk3 konsensus, oppstilt motRXl (Sekv. id. nr. 49) og (d) forandringer som ble gjort for å produsere to eksempler på Human Engineered™ sekvenser (Sekv. id. nr. 45 og 47).
Figur 20D viser aminosyresekvensene til de to eksemplene på lett kjede Human Engineered™ sekvenser (Sekv. id. nr. 45 og 47), betegnet "lav risiko" og "lav + moderat risiko" så vel som korresponderende nukleinsyresekvenser (Sekv. id. nr. 44 og 46).
Figur 21A viser (a) risikolinjen for den muse RX1 lette kjeden (H=høy risiko, M=moderat risiko, L=lav risiko), (b) RX1 lette kjede aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 5), (c) aminosyresekvensen til den nærmeste humane konsensussekvensen, Kabat Vk3 konsensus, oppstilt mot RX1 (Sekv. id. nr. 49) og (d) et alternativ eksempel på aminosyresekvens hvor posisjonene 54-56 ikke ble forandret (dvs. forble musesekvensen) (Sekv. id. nr. 48). Figur 21B viser aminosyresekvensene av to eksempler på alternative lettkjede Human Engineered™ sekvenser (Sekv. id. nr. 48, 136), så vel som de korresponderende nukleinsyresekvenser (Sekv. id. nr. 137 og 135).
Figur 22A viser (a) risikolinjen for den muse RX1 lette kjeden (H=høy risiko, M=moderat risiko, L=lav risiko), (b) RX1 lette kjede aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 5), (c) aminosyresekvensen til det nærmeste humane konsensus "germline"-sekvensen, Vk6 undergruppe 2-1(1) A14, oppstilt mot RX1 (Sekv. id. nr. 50) og (d) forandringer som ble gjort for å produsere to eksempler på Human Engineered™ sekvenser (Sekv. id. nr. 51 og 53). Figur 22B viser aminosyresekvensene til de to eksemplene på lett kjede Human Engineered™ sekvensene (Sekv. id. nr. 51 og 53), betegnet "lav risiko" og "lav + moderat risiko" så vel som den korresponderende nukleinsyresekvensen (Sekv. id. nr. 52). Figurene 23A og 23B viser oppstillingen av muse RX1 lettkjede aminosyresekvens (Sekv. id. nr. 54) med forskjellige humane konsensus og humane "germline" konsensussekvenser ved å anvende Kabat-nummeringssystemet (aminosyrenummerering indikert i linje betegnet "POS") (Sekv. id. nr. 55-82). Figurene 24A og 24B viser oppstillingen av muse RX1 tung kjede aminosyresekvens (Sekv. id. nr. 83) med forskjellige humane konsensus og humane "germline" konsensussekvenser ved å anvende Kabat-nummereringssystemet (aminosyrenummerering indikert i linje betegnet "POS") (Sekv. id. nr. 84-112). Figurene 23C-24E viser hvordan aminosyreresidiene til antistoffene 5H4, MCI og MC3 korresponderer til Kabat-nummereringssystemet (henholdsvis Sekv. id. nr. 10 og 11; Sekv. id. nr. 12 og 13; Sekv. id. nr. 14 og 15). Figur 25 viser den komparative nøytraliseringen av rekombinant, humant MCSF med rekombinant muse RX1-antistoff, merket som rmRXl, og tre versjoner av Human
Engineered™ RX1-1-antistoff (hvor alle lavrisiko forandringene er blitt gjort) som hver har en forskjellige konstantregion (IgGl, IgG2 eller IgG4), merket her som heRXl-1.61, HeRXl-l.G2 og heRxl-l.G4. Figur 26 viser den komparative nøytraliseringen av humant serum ved rekombinant muse RX1-antistoff, merket som rmRXl og flere forskjellige versjoner av heRXl-1 (hvor alle lav-riskoforandringene er blitt gjort) som hver har en forskjellige konstantregion (IgGl, IgG2 eller IgG4), merket som RX2, RXl-l-IgG2, RXl-1-IgGl, RXl-1-IgGl, RXl-l-IgG4, RXl-a-IgG4. Figur 27 viser den komparative nøytraliseringen av MDA231 (brystcancer cellelinje) medium ved rekombinant muse RX1-antistoff, rmRXl og flere forskjellige versjoner av heRXl-1 (hvor alle lav-riskoforandringene er blitt gjort) som hver har en forskjellige konstantregion (IgGl, IgG2 eller IgG4), merket som RX2, RXl-l-IgG2, RXl-1-IgGl, RXl-1-IgGl, RXl-l-IgG4, RXl-a-IgG4. Figur 28 viser effekten på osteoklastogenese (som målt ved TRAP-aktivitet) av rekombinant muse-RXl-antistoff, rmRXl og to forskjellige versjoner heRXl-1 som hver har en forskjellig konstantregion (Igl eller IgG2), merket heRXl.l.IgGl og heRXl-l.IgG2. Figur 29A viser aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 114) og nukleotidsekvensen (Sekv. id. nr. 113) for heRXl-1.IgGl med lav-risiko aminosyreforandringer. Figur 29B viser aminosyren (Sekv. id. nr. 116) og nukleotidsekvensen (Sekv. id. nr. 115) for heRXl-lO.IgGl med lav + moderat risiko aminosyreforandringer.
Figur 30 viser aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 119) og nukleotidsekvensen (cDNA (Sekv. id. nr. 118) og genomisk DNA (Sekv. id. nr. 117)) for heRXl-l.IgG4 med lav-risiko aminosyreforandringer.
Detaljert beskrivelse
Evnen til å metastasere er en definert egenskap til en cancer. Metastase refererer til spredningen av cancerceller til andre deler av kroppen eller tilstanden produsert av denne spredning. Metastase er en kompleks multitrinnsprosess som inkluderer forandringer i det genetiske materialet til en celle, ukontrollert proliferering av den forandrede cellen til å danne en primær tumor, utvikling av en ny blodtilførsel til den primære tumoren, invasjon av det sirkulatoriske systemet av celler fra den primære tumoren, spredning av små klumper primære tumorer til andre deler av kroppen og veksten av sekundære tumorer på disse steder.
Ben er en av de mest vanlige stedene for metastaser i humane bryst, lunge, prostata og tyroid cancer, så vel som andre cancer, og i autopsier så har så mange som 60% av cancerpasienter vært funnet å ha benmetastaser. Osteolytisk benmetastase viser et unikt trinn av osteoklastisk benresorpsjon som ikke er sett i metastaser til andre organer. Bentap assosiert med cancermetastase er styrt av osteoklaster (flerkjernede svære celler med kapasiteten til å resorbere mineralisert vev), som synes å bli aktivert av tumorprodukter.
Kolonistimmulerende faktor (CSF-1), også kjent som makrofag kolonistimmulerende faktor (M-CSF), har vært funnet å være viktig for osteoklastdannelse. I tillegg så har M-CSF vært vist å modulere de osteoklastiske funksjonene av modne osteoklaster, deres migrering og deres overlevelse sammen med andre løselige faktorer og celle til celle interaksjoner tilveiebrakt av osteoblaster og fibroblater (Fixe og Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin et al., Critical Rev. In Eukaryotic Gene Expression 8: 107-23 (1998)).
Det fullengde humane M-CSF mRNA koder for et forløperprotein på 554 aminosyrer. Gjennom alternativ mRNA-spleising og differensiell post-translasjon proteolytisk prosessering, så kan M-CSF enten skilles ut inn i sirkulasjonen som et glykoprotein eller kondroitinsulfat som inneholder proteoglykan eller uttrykkes som et membrandekkende glykoprotein på overflaten av M-CSF-produserende celler. Den tredimensjonale strukturen til bakterielt uttrykt aminoterminale 150 aminosyrer av human M-CSF, den minimale sekvensen som er nødvendig for full in vitro biologisk aktivitet, indikerer at dette protein er en disulfidkoblet dimer med hver monomer som består av fire oc-heliksbunter og en anti-parallell P-plate (Pandit et al., Science 258: 1358-62
(1992)). Tre distinkte M-CSF-typer produseres gjennom alternativ mRNA-spleising. De tre polypeptidforløperne er M-CSFoc på 256 aminosyrer, M-CSFØ av 554 aminosyrer og M-CSFy av 438 aminosyrer. M-CSFØ er et utskilt protein som ikke finnes i en membranbundet form. M-CSFoc uttrykkes som et integral membranprotein som langsomt frigjøres ved proteolytisk kløyving. M-CSFoc kløyves ved aminosyrene 191-197 i sekvensen som er satt fram i Figur 10. Den membranbundne formen til M-CSF kan interagere med reseptorer på celler i nærheten og derfor så styrer den spesifikt celle-til-celle kontakter. Uttrykket "M-CSF" kan også inkludere aminosyrene 36-438 i
Figur 12.
Forskjellige former av M-CSF fungerer ved å binde seg til dets reseptor M-CSFR på målceller. M-CSFR er et membrandekkende molekyl med fem ekstracellulære immunglobulinlignende domener, et transmembran domene og et intracellulært avbrutt Src-relatert tyrosinkinasedomene. M-CSFR kodes for av c-fms proto-onkogene. Binding av M-CSF til det ekstracellulære domenet i M-CSFR fører til dimerisering av reseptoren, som aktiverer det cytoplasmatiske kinasedomenet og fører til autofosforylering og fosforylering av andre cellulære proteiner (Hamilton J. A., J Leukoc Biol, 62(2):145-55 (1997); Hamilton J, A, Immuno Today, 18(7): 313-7(1997).
Fosforylerte cellulærproteiner induserer en kaskade av biokjemiske begivenheter som fører til cellulære responser: mitose, sekresjon av cytokiner, uorden i membranen og regulering av transkripsjon av dets egen reseptor (Fixe og Praloran, Cytokine 10: 32-37
(1998)).
M-CSF uttrykkes i stromale celler, osteoblaster og andre celler. Den uttrykkes også i bryst, livmor og ovarietumorceller. Graden av uttrykk i disse tumorene korrelerer med sterk utvikling og dårlig prognose (Kacinski Ann. Med. 27: 79-85 (1995); Smith et al., Clin. Cancer Res. 1: 313-25 (1995)). I brystkarsinomer, så er M-CSF-uttrykk alminnelig i invasive tumorceller i motsetning til den intraduktale (pre-invasive) canceren (Scholl et al., J. Nati. Cancer Inst. 86: 120-6 (1994)). I tillegg så har det vært vist at M-CSF fremmer progresjon av brysttumorer til ondartetheter (Lin et al., J. Exp. Med. 93: 727-39 (2001)). For bryst og ovariecancer, så synes det som om produksjonen av M-CSF er ansvarlig for rekrutteringen av makrofager til tumoren.
Som vist her så nøytraliserer et M-CSF-spesifikt antistoff slik som RX1, 5H4, MCI eller MC3 antistoff, osteoklastinduksjon ved metastatiske cancerceller og7eller reduserer metastaser til ben i dyremodeller av cancer. Dermed er det her beskrevet sammensetninger og fremgangsmåter for å behandle eller å forebygge cancer, cancermetastaser og bentap assosiert med cancermetastaser.
Et foretrukket anti-M-CSF antistoff muse-RXl ble modifisert til å være mindre immunogent i mennesker basert på den Human Engineering™ fremgangsmåten til Studnicka et al. Foretrukket så ble 8 til 12 overflateutsatte aminosyreresidier i den tungkjedevariable regionen og 16-19 overflateutsatte residier i den lettkjederegionen modifisert til humane residier i prosisjoner bestemt til å være lite sannsynlige å påvirke deres antigenbinding eller proteinfolding, mens de reduserte dets immungenisitet med hensyn til et humant miljø. Syntetiske gener som inneholder modifiserte tunge og/eller lettkjedevariable regioner ble konstruert og koblet til human-y tungkjede og/eller k-lettkjede konstante regioner. Enhver human tungkjede og lettkjede konstantregioner kan anvendes i kombinasjon med de Human Engineered™ antistoffvariable regionene. De humant tunge og lett kjedegenene ble introdusert inn i pattedyrceller og de resulterende rekombinante immunglobulinproduktene ble skaffet tilveie ogkarakterisert. Andre eksempler på anti-M-CSF antistoffer slik som 5H4, MCI eller MC3 er på samme måten Human Engineered™.
Uttrykket "RX1-utledet antistoff inkluderer en av de følgende:
1) en aminosyrevariant av muse antistoff RX1 som har aminosyresekvensen satt fram i Figur 4, inkludert varianter som omfatter en variabel tung kjede aminosyresekvens med minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% homologe til den aminosyresekvensen satt frem i Figur 4, og/eller som omfatter en variabel lettkjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99% homolog til aminosyresekvensen satt fram i Figur 4, når man tar i betraktning lignende aminosyrer for homologibestemmelsen; 2) M-CSF-bindende polypeptider (ekskludert muse antistoff RX1) som omfatter en eller flere komplementære bestemmende regioner (CDRer) av muse antistoff RX1 som har aminosyresekvensen satt fram i Figur 4, som helst omfatter minst CDR3 i den RX1 tunge kjeden, og som helst omfatter to eller fler eller tre eller fler eller fire eller flere eller fem eller fler eller alle seks CDRene; 3) Human Engineered™ antistoffer som har de tunge og lett kjede aminosyresekvensene satt fram i Figurene 19B til 22B eller varianter av dem som omfatter en tung eller lett kjede som har minst 60% aminosyresekvensidentitet med den opprinnelige Human Engineered™ tung-eller lettkjeden i Figurene 19B til 22B, mer ønskelig minst 80%, mer ønskelig minst 85%, mer ønskelig minst 90%, og mest ønskelig minst 95%, inkludert for eksempel 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% og 100%; 4) M-CSF-bindende polypeptider (unntatt muse-antistoff RX1) som omfatter risidiene med høy risiko av en eller flere CDRer til de Human Engineered™ antistoffene i Figurene 19B til 22B, og som helst omfatter høyrisiko residier for to eller fler, eller tre eller fler, eller fire eller fler, eller fem eller fler eller alle seks CDRene; 5) Human Engineered™ antistoffer eller varianter som har bevart de høyrisiko aminosyreresidiene satt fram i Figur 4B, og som omfatter en eller flere forandringer ved de lave eller moderat risikoresidiene som er satt fram i Figur 4B;
for eksempel som omfatter en eller flere forandringer i et lavrisiko residie og konservative substitusjoner ved et moderat risikoresidie satt frem i Figur 4B, eller
for eksempel som har bevart de moderate eller høyrisiko aminosyreresidiene som er satt fram i Figur 4B og som omfatter en eller flere forandringer ved lavrisiko residiet,
hvor forandringer inkluderer innsettinger, slettinger eller substitusjoner og som kan være konservative substitusjoner eller som kan forårsake rekonstruerte antistoffer slik at det er nærmere i sekvens en human lettkjede eller tungkjede sekvens, en human "germline" lettkjede eller tungkjede sekvens, en konsensus human lettkjede eller tungkjede sekvens, eller en konsensus human "germline" lettkjede eller tungkjede sekvens;
som bevarer evnen til å binde seg til M-CSF. Slike antistoffer binder helst til M-CSF med en affinitet på minst IO"<7>, IO"<8>eller IO<9>eller høyere og som helst nøytraliserer osteoklastogenesen som induserer aktivitet av M-CSF.
På samme måte så inkluderer uttrykket "MC3-utledet antistoff ethvert av de følgende: 1) en aminosyrevariant av muse-antistoff MC3 som har aminosyresekvensen satt fram i Figur 15, inkludert varianter som omfatter en variabel tung kjede aminosyresekvens som er minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% homolog til aminosyresekvensen satt fram i Figur 15 og/eller som omfatter en variabel lett kjede aminosyresekvens som har minst 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 eller 99% homologi med aminosyresekvensen satt frem i Figur 15, tatt i betraktning lignende aminosyrer for homologibestemmelsen; 2) M-CSF-bindende polypeptider (som valgfritt inkluderer eller utelukker muse-antistoff MC3) som omfatter en eller flere komplementære bestemmende regioner (CDRer) av muse antistoff MC3 som har aminosyresekvensen satt fram i Figur 15, som helst omfatter minst CDR3 i den MC3 tunge kjeden og som helst omfatter to eller flere, eller tre eller flere, eller fire eller flere, eller fem eller flere eller alle seks CDRene; 3) Human Engineered™ antistoffer generert ved å forandre musesekvensen i henhold til fremgangsmåtene satt fram i Studnicka et al, US patentnr. 5 766 886 og Eksempel 4A her, ved å anvende Kabat-nummereringen satt fram i Figurene 24C-24E for å identifisere lav, moderat og høyrisiko residie; slike antistoffer omfatter minst en av de følgende tunge kjedene og minst en av de følgende lette kjedene: (a) en tung kjede hvor alle lav-risiko residiene er blitt modifisert hvis det er nødvendig til å være de samme residiene som en human referanse immunglobulinsekvens eller (b) en tung kjede hvor alle lav- og moderat-risiko residiene er blitt modifisert hvis det er nødvendig til å være de samme residiene som en human referanse immunglobulinsekvens, (c) en lett kjede hvor alle de lav-risiko residiene er blitt modifisert hvis nødvendig, til å være de samme residiene som en human referanse immunglobulinsekvens eller (d) en lett kjede hvor alle av de lav- og moderat-risiko residiene er blitt modifisert hvis nødvendig, til å være de samme residiene som en human referanse immunglobulinsekvens; 4) varianter av de tidligere nevnte antistoffene i foregående avsnitt (3) som omfatter en tung eller lett kjede som har minst 60% aminosyresekvensidentitet med den opprinnelige Human Engineered™ tunge eller lette kjeden, mer ønskelig minst 80%, mer ønskelig minst 85%, mer ønskelig minst 90%, og mest ønskelig minst 95%, inkludert for eksempel 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% og 100% identisk; 5) M-CSF-bindende polypeptider (som valgfritt inkluderer eller utelukker muse-antistoff MC3) som omfatter høy-risiko risidiene til en eller flere CDRer i muse- MC3 antistoffet i Figur 15 og som helst omfatter høy-risiko residier for to eller fler, eller tre eller fler, eller fire eller fler, eller fem eller fler eller alle seks CDRene; 6) Human Engineered™ antistoffer eller varianter som har bevart de høy-risiko aminosyreresidiene til muse-MC3-antistoff, og som omfatter en eller flere forandringer ved de lav- eller moderat-risiko residiene;
for eksempel som omfatter en eller flere forandringer ved et lav-risiko residie og konservative substitusjoner ved et moderat-risiko residie, eller
for eksempel som har bevart de moderate- og høy-risiko aminosyreresidiene som omfatter en eller flere forandringer ved et lav-risiko residie,
hvor forandringer inkluderer innsettinger, slettinger eller substitusjoner og kan være konservative substitusjoner eller kan forårsake at det konstruerte antistoffet er nærmere i sekvens enn human lettkjede eller tungkjede sekvens, en human "germline" lettkjede eller tungkjede sekvens, en konsensus human lettkjede eller tungkjede sekvens, eller en konsensus human "germline" lettkjede eller tungkjede sekvens;
som bevarer evnen til å binde M-CSF. Slike antistoffer binder helst til M-CSF med en affinitet på minst IO"<7>, IO"<8>eller IO9 eller høyere og nøytraliserer helst osteoklastogenesen som induserer aktivitet av M-CSF.
Uttrykket "5H4-utledet antistoff eller "MCI-utledet antistoff er definert på lignende måte i henhold til beskrivelsen over.
Som beskrevet i detalj her så kan RX1, 5H4, MCI eller MC3-utledede antistoffer, inkludert Human Engineered™ antistoffer eller varianter, være av forskjellige isotyper slik som IgG, IgA, IgM eller IgE. Antistoffer av IgG-klassen kan inkludere en forskjellig konstant region, for eksempel så kan et IgG2-antistoff være modifisert til å vise en IgGl eller IgG4 konstantregion. Human Engineered™ antistoffer eller varianter som omfatter en modifisert eller ikke-modifisert IgGl eller IgG4 konstantregion er her beskrevet. I tilfellet med IgGl så kan modifikasjoner i den konstante regionen, spesielt hengsel eller CH2-regionen, øke eller redusere effekt av funksjon, inkludert ADCC og/eller CDC-aktivitet. En IgG2-konstantregion modifisert til å redusere antistoff- antigen aggregatdannelse. I tilfellet med IgG4 så kan modifikasjonen til den konstante regionen, spesielt hengselregionen, redusere dannelsen av halv-antistoffer. I et spesifikt eksempel, så blir mutasjon av IgG4 hengselsekvens Cys-Pro-Ser-Cys til IgGl hengselsekvens Cys-Pro-Pro-Cys beskrevet.
Human Engineered™ antistoffer som inneholder IgGl eller IgG4 konstantregioner er vist her å ha forbedrede egenskaper sammenlignet med Human Engineered™ antistoffer som inneholder IgG2 konstante regioner. Valg av IgGl eller igG4 Fc-region forbedret bindingsaffinitet, MCSF-nøytraliseringsaktivitet og anti-osteoklast aktivitet. I tillegg så tilveiebrakte valg av IgGl eller IgG4 Fc-regionen antigen-antistoff komplekser som var likere de som ble dannet av foreldre muse-antistoff.
Mobiliteten ved hengselregionen synes dermed å klart påvirke binding av antistoffet til det dimere antigenet MCSF så vel som nøytraliseringsaktivitet av antistoffet. Det er overveid at tillaging av antistoffer som inneholder en tung kjede som omfatter en modifisert eller ikke-modifisert IgGl eller IgG4-konstantregion, spesielt hengsel og CH2-domener, og helst minst hengseldomener, forbedrer bindingsaffinitet og/eller senker dissosiasjon av antistoff fra dimere antigener.
Uttrykket "RX1-konkurrerende antistoff inkluderer
1) et ikke-muse eller ikke-gnager monoklonalt antistoff som binder seg til den samme epitopen av M-CSF som muse-RXl som har de fullstendige lett- og tungkjede sekvenser satt fram i Figur 4; 2) et ikke-mus eller ikke-gnager monoklonalt antistoff som binder seg til minst 4 etterfølgende aminosyrer i aminosyrene 98-105 i M-CSF i Figur 12; og 3) et ikke-mus eller ikke-gnager monoklonalt antistoff som konkurrerer med muse-antistoff RX1 som har den fullstendige sekvensen satt frem i Figur 4 for binding til M-CSF, med mer enn 75%, mer enn 80% eller mer enn 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% eller 95%. Slike antistoffer binder helst M-CSF ved en affinitet på minst 10"<7>, IO"<8>eller IO"<9>eller høyere og nøytraliserer helst osteoklastogenesen som induserer aktivitet av M-CSF.
Uttrykket "MCI-konkurrerende antistoff eller "MC3-konkurrerende antistoff eller "5H4-konkurrerende antistoff er lignende definert med referanse til muse 5H4, MCI eller MC3 antistoffene som har de fullstendige lett- og tungkjede sekvensene satt frem i henholdsvis Figur 13, 14 eller 15, og med referanse til epitopen av M-CSF bundet av antistoffet, for eksempel aminosyrene 65-73 eller 138-144 i Figur 12 (som korresponderer til M-CSF-epitoper gjenkjent av 5H4 eller MC3).
Valgfritt så er ethvert kimert, humant eller humanisert M-CSF-antistoff som er offentlig utgreiet før aktiveringsdatoen herav, eller som er utgreiet i en søknad arkivert før arkiveringsdatoen herav, ekskludert fra omfanget av oppfinnelsen.
"Ikke-gnager" monoklonalt antistoff er ethvert antistoff, bredt definert her, som ikke er et fullstendig intakt gnagermonoklonalt antistoff generert ved en gnagerhybridoma. Ikke-gnager antistoffer inkluderer dermed spesifikt, men er ikke begrenset til, varianter av gnagerantistoffer, gnagerantistoffragmenter, lineær antistoffer, kimere antistoffer, humaniserte antistoffer, Human Engineered™ antistoffer og humane antistoffer, inkludert humane antistoffer produsert fra transgene dyr eller via fag-display teknologi. På samme måte så inkluderer ikke muse-antistoffer, men er ikke begrenset til varianter av muse-antistoffer, muse-antistoffragmenter, lineære antistoffer, kimerer, humaniserte, Human Engineered™ og humane antistoffer.
"Tumor" som anvendt her, refererer til all neoplastisk cellevekst og proliferering, enten ondartet eller godartet, og alle pre-cancerlignende og cancerlignende celler og vev.
Uttrykkene "cancer" og "cancerlignende" refererer til eller beskriver den fysiologiske tilstanden hos pattedyr som vanligvis erkarakterisert veduregulert cellevekst. Eksempler på cancer inkluderer, men er ikke begrenset til karsinoma; lymfoma; blastoma, sarkoma og leukemi. Mer bestemte eksempler på slike cancere inkluderer bryst cancer, prostata cancer, kolon cancer, skjellet cellecancer, små-celle lungecancer, ikke-småcelle lungecancer, gastrointestinal cancer, pankreatisk cancer, glioblastoma, livmor cancer, ovarie cancer, lever cancer, blære cancer, hepatoma, kolorektal cancer, endometrial karsonima, spyttkjertel karsinoma, nyre cancer, lever cancer, vulval cancer, tyroid cancer, hepatisk karsinoma og forskjellige typer hode- og nakke cancer.
"Behandling" er en intervensjon utført med intensjonen av å forhindre utviklingen eller å forandre patologien til en forstyrrelse. Følgelige så refererer "behandling" til både terapeutisk behandling og profylaktisk eller forebyggende målinger. De som trenger
behandling inkluderer de som allerede har forstyrrelsen så vel som de hvor forstyrrelsen skal forebygges. I tumor (for eksempel cancer)-behandling så kan et terapeutisk middel redusere patologien til tumorceller, eller gjøre at tumorcellene blir mer mottagelig for behandling ved andre terapeutiske midler, for eksempel stråling og/eller kjemoterapi. Behandling av pasienter som lider av kliniske, biokjemiske, radiologiske eller subjektive symptomer på sykdommen, slik som osteolyse, kan inkludere og forbedre noen eller alle slike symptomer eller å redusere predisponeringen for sykdommen. "Patologien" til cancer inkluderer alle fenomener som kompromitterer hvor godt pasienten har det. Dette inkluderer uten begrensning, unormal eller ukontrollerbar cellevekst, metastase, interferens med den normale funksjonen til naboceller, frigjøring av cytokiner eller andre sekretoriske produkter ved unormale nivåer, suppresjon eller forverring av inflammatorisk eller immunologisk respons osv. Forbedring etter behandling kan dermed vise seg som redusert tumorstørrelse, nedgang i tumorvekst hastighet, destruksjon av eksisterende tumorceller eller metastatiske celler og/eller en reduksjon i størrelsen eller antallet metastaser.
"Pattedyr" for behandlingsformål refererer til ethvert dyr klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, husdyr eller landbruksdyr, og zoologisk hage, sportsdyr eller kjeledyr, slik som hunder, hester, katter, kyr osv. Helst så er pattedyret menneske.
Som anvendt her så blir frasen "metastatisk cancer" definert som cancere som har potensialet til å spre til andre områder av kroppen, spesielt til ben. En rekke cancere kan metastasere til benet, men de mest vanlige cancere som metastaserer er bryst, lunge, nyre, multippel myeloma, tyroid og prostata. Som eksempel så inkluderer andre cancere som har potensiale til å metastasere til ben, men de er ikke begrenset til, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter, inkludert leukemi og lymfoma; hode- og nakke cancere; gastrointestinale cancere, inkludert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pankreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangen eller galleblæren; ondartetheter i kvinnelige reproduksjonssystemer, inkludert ovariecancer, livmor endometrial cancer, vaginal cancer og livmorhals cancer; blære cancer; hjerne cancer, inkludert neuroblasomta; sarkoma; osteosarkoma; og hud cancer, inkludert malign melanoma og skvamøs cellecancer. Den foreliggende beskrivelsen omfatter spesielt forebygging og behandling av tumor-induserte osteolytiske lesjoner i ben.
Som anvendt her refererer fasen "terapeutisk effektiv mengde" til en mengde av terapeutisk eller profylaktisk M-CSF-antistoff som ville være passende, som vil fremheve den ønskede terapeutiske eller profylaktiske effekten eller responsen når den gis i overensstemmelse med det ønskede behandlingsregimet.
Humant "M-CSF" som anvendt her refererer til et humant polypeptid som har vesentlig den samme amionosyresekvensen som i modne humane M-CSFoc, M-CSFP eller M-CSFy-polypeptidene som er beskrevet av Kawasaki et al., Science 230:291 (1985), Cerretti et al., Molecular Immunology, 25:761 (1988) eller Ladner et al., EMBO Journal 6:2693 (1987). Slik terminologi reflekterer forståelsen av at de tre modne M-CSF ene har forskjellige aminosyresekvenser som beskrevet over og at den aktive formen av M-CSF er en disulfid bundet dimer; når uttryket "M-CSF" refererer til den biologisk aktive formen så er dermed den dimere formen ment. "M-CSF-dimer" refererer to M-CSF-polypeptidmonomerer som har dimerisert og som inkluderer både homodimerer (som består av to av den samme typen av M-CSF-monomer) og heterodimerer (som består av to forskjellige monomerer). M-CSF-monomerer kan omdannes til M-CSF-dimerer in vitro som beskrevet i US patentnr. 4 929 700.
Anti-MCSF-antistoffer
Foreliggende beskrivelse inkluderer et M-CSF-spesifikt antistoff, slik som RX1, 5H4, MCI og/eller MC3, farmasøytiske formuleringer som inkluderer et M-CSF-spesifikt antistoff, slik som RX1, 5H4, MCI og/eller MC3, fremgangsmåte for å lage de farmasøytiske formuleringene, og fremgangsmåter for å behandle pasienter med de farmasøytiske formuleringene og forbindelsene. Uttrykket "antistoff blir anvendt i den videste betydningen og inkluderer fullstendig sammenstilte antistoffer, monoklonale ntistoffer, polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer (for eksempel bispesifikke antistoffer), antistoffragmenter som kan binde antigen (for eksempel Fab', F'(ab)2, Fv, enkeltkjede antistoffer, diastoffer), og rekombinante peptider som omfatter det foregående så lenge som de utviser den ønskede biologiske aktivitet.
Uttrykket "monoklonalt antistoff som anvendt her refererer til et antistoff skaffet tilveie fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, dvs. de individuelle antistoffene som omfatter populasjonen er identisk unntatt for mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er veldig spesifikke, de er rettet mot et enkelt antigensete. I motsetning til konvensjonelle (polyklonale) antistofftillaginger som vanligvis inkluderer forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), så er videre hvert monoklonalt antistoff rettet mot en enkel determinalt på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet så monoklonale antistoffer fordelaktige fordi de syntetiseres av den homogene kulturen, og er ikke kontaminert av andre immunglobuliner med forskjellige spesifisiteter og karakteristika.
Modifikasjonen "monoklonal" indikerer karakteren av antistoffet som å være skaffet tilveie av en vesentlig homogen populasjon med antistoffer, og må ikke oppfattes som å kreve fremstilling av antistoffet ved hjelp av en bestemt fremgangsmåte. For eksempel så kan de monoklonale antistoffene som kan anvendes i henhold til den foreliggende beskrivelsen være laget ved hjelp av hybridoma fremgangsmåten som først beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495 [1975], eller de kan lages ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter (se for eksempel US patentnr. 4 816 567). "De monoklonale antistoffene" kan også isoleres fra fag-antistoffbiblioteker ved å anvende teknikkene som er beskrevet i for eksempel Clackson et al., Nature, 352:624628[1991] og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Avhengig av aminosyresekvensen i det konstante domenet til deres tunge kjeder, så kan immunglobuliner fastsettes til å tilhøre forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser, IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan videre deles inn i underklasser eller isotyper, for eksempel IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl og IgA2. De tung-kjede konstante domenene kan korrespondere til de forskjellige klassene med immunglobuliner kalt henholdsvis a, 8,8, y og u. Sub-enhetsstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene til forskjellige klasser med immunglobuliner er kjent. Forskjellige isotyper har forskjellige effektorfunksjoner; for eksempel så har IgGl Og IgG3 isotypene ADCC-aktivitet.
"Antistoffragmenter" omfatter en del av et intakt fullengde antistoff, helst med en antigenbindende eller den variable regionen av det intakte antistoffet. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab, Fab', F(ab')2 og Fv-fragmenter; diastoffer; lineære antistoffer (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); enkeltkjede antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoffragmenter. Papainkutting av antistoffer produserer to identiske antigenbindende fragmenter, kalt "Fab"-fragmenter, som hver har et enkelt antigenbindende sete, og et gjenværende "Fc"-fragment, hvis navn reflekterer dets evne til å krystallisere 35 lett. Pepsinbehandling gir et F(ab')2-fragment som har to "enkeltkjede Fv" eller "sFv"-antistoffragmenter som omfatter VH- og VL-domener i antistoffet, hvor disse domener er tilstede i en enkelt polypeptidkjede. Helst som omfatter Fv polypeptidet videre en polypeptid linker mellom VH- og VL-domenene som muliggjør at Fv danner den ønskede strukturen for antigenbinding. For en oversikt av sFv, se Pluckthun i The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg og Moore, red., Springer-Verlag, New York, s. 269-315 (1994).
Uttrykket "hypervariabel" region refererer til aminosyreresidiene til et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Den hypervariable regionen omfatter aminosyreresidier fra en komplementaritetsbestemmende region eller CDR (dvs. residier 24-34 (LI), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i det lettkjede variable domenet og 31-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i det tungkjede variable domenet som beskrevet av Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utg., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) og/eller de residier fra en hypervariabel sløyfe (dvs. residier 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i det lettkjede variable domenet og 26-32 (Hl), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i det tungkjede variable domenet som beskrevet av (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
"Leseramme" eller FR-residier er de variable domeneresidiene som er forskjellig for de i de hypervariable regionresidiene.
Uttrykket "diastoffer" refererer til små antistoffragmenter med to antigenbindende seter, hvor disse fragmenter omfatter et tungkjede variabelt domene (VH) sammenbundet til et lettkjede variabelt domene (VL) i den samme polypeptidkjeden (VH VL). Ved å anvende en linker som er for kort til å tillate paring mellom de to domenene på den samme kjeden, så tvinges domenene til å pare med de komplementære domenene i en annen kjede og danne to antigenbindende seter. Diastoffer er beskrevet mer i detalj, for eksempel i EP 404 097; WO 93/11161; og 30 Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
Det kan være ønskelig å generere multispesifikke (for eksempel bispesifikke) monoklonale antistoffer inkludert monoklonale, humane, humaniserte, Human Engineered™ eller variant-anti-M-CSF-antistoffer som har bindingsspesifisiteter for minst to forskjellige epitoper. Eksempler på bispesifikke antistoffer kan binde to forskjellige epitoper av M-CSF. Alternativt så kan en anti-M-CSF-arm kombineres med en arm som binder til et triggermolekyl på en leukocytt slik som et T-cellereseptor molekyl (for eksempel CD2 eller CD3), eller Fc-reseptorer for IgG (FcyR), slik som FcyRI (CD64), FcyRU (CD32) og FcyRUI (CD 16) for å fokusere cellulære forsvarsmekanismer til den M-CSF-uttrykkende cellen. Bispesifikke antistoffer kan også anvendes for å lokalisere cytotoksiske midler til celler som uttrykker M-CSF. Disse antistoffer innehar en M-CSF-bindende arm og en arm forbinder det cytotoksiske middelet (for eksempel saporin, anti-interferon-60, vinka alkaloid, ricin A-kjede, metotreksat eller radioaktiv isotop hapten). Bispesifikke antistoffer kan lages som fullengde antistoffer eller antistoffragmenter (for eksempel F(ab').sub2 bispesifikke antistoffer).
Ifølge en annen tilnærmingsmåte for å lage bispesifikke antistoffer, så kan kontaktflaten mellom et par med antistoffmolekyler som konstrueres for å maksimalisere prosenten av heterodimerer som gjenvinnes fra rekombinant cellekultur. Den foretrukne kontaktflaten omfatter minst en del av Cn3-domenet til et antistoff konstant domene. I denne fremgangsmåten så blir en eller flere små aminosyresidekjeder fra kontaktflaten til det første antistoffmolekylet omfattet med større sidekjeder (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Kompensasjon "huler" med identisk eller lignende størrelse til den store sidekjeden eller sidekj edene dannes på kontaktflaten i det andre antistoffmolekylet ved å erstatte store aminosyresidekjeder med mindre (for eksempel alanin eller treonin). Dette tilveiebringer en mekanisme for å øke utbyttet av heterodimeren i forhold til andre uønskede sluttprodukter slik som homodimerer. Se WO 96/27011, publisert 6. september 1996.
Bispesifikke antistoffer inkluderer krysskoblede eller "heterokonjugat" antistoffer. For eksempel så kan et av antistoffene i heterokonjugatet kobles til avidin, den andre til biotin. Heterokonjugatantistoffer kan lages ved å anvende enhver passende krysskoblingsfremgangsmåte. Passende krysskoblingsmidler er velkjente i fagfeltet og er utgreiet i US patentnr. 4 676 980, sammen med en rekke krysskoblingsteknikker.
Teknikker for å lage bispesifikke antistoffer fra antistoffragmenter er også blitt beskrevet i litteraturen. For eksempel så kan bispesifikke antistoffer lages ved å anvende kjemisk kobling. Brennan et al., Science 229:81 (1985) beskriver en prosedyre hvor intakte antistoffer blir proteolytisk kløyvet for å generere F(ab')2-fragmenter. Disse fragmenter reduseres i tilstedeværelsen av ditiol komplekserende middelet natriumarsenitt til å stabilisere vicinal ditioler og hindre intermolekyl disulfiddannelse. Fab'-fragmenter generert blir så omdannet til tionitrobenzoat (TNB)-derivater. Et av Fab'-TNB-derivatene blir så enda omdannet til Fab'-tiolet ved å redusere med merkaptoetylamin og blir blandet med en ekvimolar mengde av det andre Fab'-TNB-derivatet til å danne det bispesifikke antistoffet. De bispesifikke antistoffene som produseres kan anvendes som midler for den selektive immobiliseringen av enzymer. Fab'-SH-fragmentene som direkte gjenvinnes fra E. coli kan kjemisk kobles in vitro til å danne bispesifikke antistoffer. (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)). Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) beskriver fremstillingen av et fullstendig humanisert bispesifikt antistoff (F(ab')2-molekyl. Hvert Fab'-fragment ble separert utskilt fra E. coli og utsatt for direkte kjemisk kobling in vitro til å danne det bispesifikke antistoffet. Det bispesifikke antistoffet som dermed ble dannet var i stand til å binde seg til celler som overuttrykker HER2-reseptoren og normale humant T-celler, så vel som å trigge den lytiske aktiviteten av humane cytotoksiske lymfocytter mot humane brysttumor mål.
Forskjellige teknikker for å skape og å isolere bispesifikke antistoffragmenter direkte for rekombinant cellekultur er også blitt beskrevet. For eksempel så har bispesifikke antistoffer blitt produsert ved å anvende leucinzippere (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Leucinzipperpeptidene fra Fos- og Jun-proteinene ble koblet til de Fab'-delene av to forskjellige antistoffer ved genfusjon. Antistoff homodimerene ble redusert ved hengselregionen til å danne monomerer og deretter re-oksidert til å danne antistoff heterodimerene. Denne fremgangsmåten kan også benyttes for fremstillingen av antistoff homodimerer. "Diastoff' teknologien beskrevet av Hollinger et al., proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) har tilveiebrakt en alternativ mekanisme for å lage bispesifikke antistoffragmenter.
Fragmentene omfatter en tungkjede variabel region (Vh) som er forbundet til en lettkjede variabel region (Vl) ved hjelp av en linker som er for kort til å tillate paring mellom de to domenene på den samme kjeden. Følgelig så blir Vr. ogg VL-domenene til et fragment tvunget til å pare med de komplementære Vlog Vn-domenene til et annet fragment, og dermed danne to antigenbindende seter. En annen strategi for å lage bispesifikke antistoffragmenter ved å anvende enkeltkjede Fv (sFv) dimerer er også blitt rapportert. Se Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
Alternativt så kan det bispesifikke antistoffet være et "lineært antistoff produsert som beskrevet i Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). I korthet så omfatter disse antistoffet et par tandem Fd-segmenter (Vh-Ch1-Vh-Ch1) som danner et par antigenbindende regioner. Lineære antistoffer kan være bispesifikke eller monospesifikke.
Antistoffer med mer enn to valenser ble også overveid. For eksempel så kan trispesifikke antistoffer lages (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
Det monoklonale, humane, humaniserte, Human Engineered™ eller variant anti-M-CSF antistoffet kan være et antistoffragment, slik som en RX1, 5H4, MCI eller MC3-antistoffragment. Forskjellige teknikker er blitt utviklet for fremstilling av antistoffragmenter. Tradisjonelt så ble disse fragmenter utledet via proteolytisk kutting av intakte antistoffer (se for eksempel Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) og Brennan et al, Science 229:81 (1985)). Imidlertid så kan disse fragmenter nå produseres direkte ved hjelp av rekombinante vertsceller. Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) utgreier utskilling av funksjonelle antistoffragmenter fra bakterier (se for eksempel Better et al., Skerra et al., Sicence240: 1038-1041 (1988)). For eksempel så kan Fab'-SH-fragmenter direkte gjenvinnes fra E. coli og kjemisk kobles slik at de danner F(ab')2-fragmenter (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). F(ab')2 kan bli dannet ved å anvende leucinzippere GCN4 for å fremme sammenstilling av F(ab')2-molekylet. Ifølge en annen tilnærmingsmåte så kan Fv, Fab eller F(ab')2-fragmenter isoleres direkte fra rekombinant vertscellekultur. Andre teknikker for fremstilling av antistoffragmenter vil være kjent for fagfolk.
Et "isolert" antistoff er et som er blitt identifisert og separert og gjenvunnet fra en komponent fra dets naturlige miljø. Kontaminantkomponenter fra dets naturlige miljø er materialer som ville interfere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser for antistoffer og kan inkludere enzymer, hormoner eller andre proteinlignende eller ikke-proteinlignende oppløste stoffer. Antistoffet kan renses (1) til mer enn 95 vekt% av antistoffet som bestemt ved hjelp av Lowry-fremgangsmåten, og helst mer enn 99 vekt%, (2) til en grad som er tilstrekkelig for å skaffe tilveie minst 15 residier N-terminal eller intern aminosyresekvens ved å anvende en spinning-kopp sekvesator, eller (3) til homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å anvende Coomassie-blå, eller helst sølvfarging. Isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ innen rekombinante celler fordi minst en komponent av antistoffets naturlige omgivelse ikke vil være tilstede. Ordinært vil isolerte antistoffer imidlertid lagres ved minst en rensetrinn.
For en detaljert beskrivelse av strukturen og genereringen av antistoffer se Roth D.B. og Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998) og US patentnr. 6 255 458. I korthet så skjer prosessen for å generere DNA som koder for de tunge- og lettkjede immunoglobulingenene primært i ikke-utviklende B-celler. Før rearrangeringen og koblingen av forskjellige immunglobulin gensegmenter, så blir V, D, J og konstant (C)-gensegmentene funnet vanligvis i relativt tett nærhet på et enkelt kromosom. I løpet av B-celledifferensiering så blir et av hver av de passende familiemedlemmene av V, D, J (eller bare V og J i tilfellet med lettkjede gener) gensegmentene rekombinant til å danne funksjonelle rearrangerte tung- og lett immunglobulingener. Dette gensegment rearrangementprosessen synes å være sekvensiell. Først blir tungkjede D-til-J-koblinger laget, etterfulgt av tungkjede V-til-DJ-koblinger og lettkjede V-til-J-koblinger.
Rekombinasjonen av variable regiongensegmenter til å danne funksjonelle tung- og lettkjede variable regioner styret ved hjelp av rekombinasjon signalsekvenser (RSSer) som flankerer rekombinanasjonskompetente V-, D- og J-segmenter. RSSer som er nødvendig og tilstrekkelig for å dirigere rekombinasjon, omfatter en cyade-symmetrisk heptamer, en AT-rik nonamer og en mellomliggende spacerregion på enten 12 eller 23 basepar. Disse signaler er konservert blant de forskjellige loci og arter som utfører D-J (eller V-J) rekombinasjon og kan funksjonelt brukes om hverandre. Se (Dettinger, et al.
(1990), Science, 248, 1517-1523 og referanser sitert der. Heptameren omfatter sekvensen CACAGTG eller dets analog etterfulgt av en spacer ble ikke konservert sekvens og deretter en nonamer som har sekvensen ACAAAAACC eller dets analog. Disse sekvenser finnes på j, eller nedstrøms på hver av V- og D-gensegmentet. Rett forutgående for "germline" D- og J-segmentene er igjen to rekombinasjonssignalsekvenser, først nonameren og deretter heptameren igjen separert av en ikke-konservert sekvens. Heptamer- og nonamersekvenser som følger en Vl-, Vh- eller D-segment er komplementære til de som kommer før Jl-, D- eller Jh-segmenter som de rekombinerer med. Spacere mellom de heptamere og nonamere sekvensene er enten 12 baserpar lange eller mellom 22 og 24 baserpar lange.
I tillegg til rearrangementet av V-, D- og J-segmenter, vil videre diversitet være generert i det primære repertoaret av immunglobulin tung- og lett kjede ved hjelp av forskjellige rakombinasjoner av lokaliseringene hvor D- og J-segmentene i den lett kjeden kobles og hvor D- og J-segmentene til den tunge kjeden kobles. Slik variasjon i den lette kjeden skjer vanligvis innen det siste kodonet til V-gensegmentet og det første kodonet til J-segmentet. Lignende unøyaktighet i kobling skjer på det tung-kjede kromosomet mellom D- og Jn-segmentene og kan utvides over så mange som 10 nukleotider. Flere nukleotider kan videre settes inn mellom D- og Jr- og mellom Vr- og D-gensegmenter som ikke kodes for av genomisk DNA. Tilleggingen av disse nukleotider er kjent som N-regiondiversitet.
Nettoeffekten av slike rearrangementer i det variable regiongensegmentene og den variable rekombinasjonen som kan finne sted i løpet av slik kobling er fremstillingen av et primært antistoffrepertoar.
"Fv" er det minimale antistoffragmentet som inneholder et fullstendig antigengjenkjennings- og bindingssete. Denne region består av en dimer av et tung- og lettkjede variabelt domene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. Det er i denne konfigurasjon at de tre CDRene av hvert variabelt domene interagerer for å definere et antigenbindende sete på overflaten av VH VI-dimeren. Kollektivt så utviser seks CDRer antigen-bindingsspesifisitet til antistoffet. Selv om et enkelt variabelt domene
(eller halvparten av Fv som omfatter bare tre CDRer som er spesifikke for et antigen)
har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigenet, selv om det ved en lavere affinitet enn hele bindingssetet.
Fab-fragmentet inneholder også det konstante domenet av den lette kjeden og det første konstante domenet (CH1) til den tunge kjeden. Fab-fragmenter skiller seg fra Fab'-fragmenter ved tilsettingen av noen få residier ved den karboksyterminale enden av den tunge kjeden CH1-domenet inkludert en eller flere cyteiner fra antistoff hengselregionen. Fab'-SH er benenvnelsen her for Fab' hvor cysteinresidiene til de konstante domenene bærer en fri tiolgruppe. F(ab')2-antistoffragmenter ble opprinnelig produsert som par av Fab'-fragmenter som har hengselscysteiner mellom dem.
Ved "nøytraliserende antistoff er ment et antistoffmolekyl som er i stand til å eliminere eller signifikant redusere en effektorfunksjon av et målantigen som det binder seg til. Følgelig så er et "nøytraliserende" anti-mål antistoff i stand til å eliminere eller signifikant redusere en effektorfunksjon, slik som enzymaktivitet, ligandbinding eller intracelluær signallering.
Sammensetningene for og fremgangsmåtene for å behandle cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase kan benytte et eller flere antistoffer anvendt alene eller i kombinasjon med andre terapeutika for å oppnå de ønskede effektene. Antistoffer ifølge den foreliggende beskrivelse kan isoleres fra et dyr som produserer antistoffet som et resultat av enten direkte kontakt med et omgivelsesantigen eller immunisering med antigenet. Alternativt så kan antistoffer produseres ved rekombinat DNA-metodologi ved å anvende et av de antistoffuttrykkende systemene som er velkjente i fagfeltet (se for eksempel Harlow og Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Slike antistoffer kan inkludere rekombinante IgGer, kimere fusjonsproteiner som har immunglobulinutledede sekvenser eller "Human Konserverte™" antistoffer som alle kan anvendes for behandlingen av cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase ifølge den foreliggende beskrivelsen. I tillegg til intakt fullengde molekyler, så refererer uttrykket "antistoff også til fragmenter av dem (slik som for eksempel scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' og F(ab)'2-fragmenter) eller multimerer eller aggregater av intakte molekyler og/eller fragmenter som binder seg til M-CSF (eller M-CSRF). Disse antistoffragmenter binder antigen og kan derivatisere til å utvise strukturelle trekk som fasiliterer rensing og opptak, for eksempel ved inkorporering av galaktoseresidier.
M-CSF monolkonale antistoffer kan lages vesentlig som beskrevet i Halenbeck et al., US patentnr. 5 491 065 (1997). Eksempler på M-CSF monoklonale antistoffer inkluderer de som binder til en tilsynelatende konformasjonell epitop assosiert med rekombinant eller nativ dimer M-CSF med samtidig nøytralisering av biologisk aktivitet. Disse antistoffer er vesentlig ikke-reaktive med biologiske inaktive former av M-CSF som inkluderer monomer og kjemisk derivatisrt dimer M-CSF.
Human Engineered™ anti-M-CSF monoklonale antistoffer er her beskrevet. Uttrykket "Human Engineered™ antistoff refererer til et antistoff utledet fra et ikke-humant antistoff, vanligvis et muse-monoklonalt antistoff. Alternativt så kan et Human Engineered™ antistoff utledes fra et kimert antistoff som bevarerer eller vesentlig bevarer de antigenbindende egenskapene til foreldre, ikke-humane antistoffet, men som utviser redusert immunogenisitet sammenlignet med foreldreantistoffet når det gis til mennesker. Uttrykket "kimert antistoff som anvendt her, refererer til et antistoff som inneholder sekvens utledet fra to forskjellige antistoffer (se for eksempel US patentnr. 4 816 567) som vanligvis kommer fra forskjellige arter. Mest vanlig så omfatter kimere antistoffer humane og muse antistoffragmenter, vanligvis humane konstanter og musevariable regioner.
Uttrykket "komplementaritetsbestemmende region" eller uttrykket "CDR" refererer til aminosyresekvenser som sammen definerer bindingsaffiniteten og spesifisiteten til den naturlige Fv-regionen til et nativt immunoglobulinbindende sete (se for eksempel Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Kabat et al., US Dept. of Health and Human Services NIH Publication nr. 91 3242 (1991)). Uttrykket "konstant region" refererer til delen av antistoffmolekylet som utviser effektorfunksjoner. I den foreliggende beskrivelse så blir musekonstantregioner helst substituert med humane konstantregioner. De konstante regionene til de foreliggende antistoffene er utledet fra humane immunglobuliner. Den tungkjede konstantregionen kan velges fra enhver av de fem isotypene: a, p,8, y eller u.
Antistoffene i den foreliggende beskrivelse sies å være immunspesifikke eller spesifikk binding hvis de binder til antigen med en Ka som er mer enn eller lik ca. KTM"<1>, helst større enn eller lik ca. 10 7 M" 1 , mer ønskelig mer enn eller lik ca. 10 8 M" 1, og mest ønskelig større enn eller lik ca. 109M\ 10wM\lO<1>^<1>eller 10<12>M\ Anti-M-CSF-antistoffene kan bindes til forskjellige naturlig forekommende former av M-CSF, inkludert de som er uttrykt av vertens/individets vev så vel som uttrykt av tumor. De monoklonale antistoffene som er utgreid her, slik som RX1, 5H4, MCI eller MC3 antistoff, har affiniteter M-CSF og erkarakterisert veden dissosiasjons likevektskonstant (Kd) på minst 10<_4>M, helst mint minst 10"<7>M til ca. 10"<8>M, mer ønskelig minst ca. 10"8M, 10"<10>M, 10"nM eller 10"12M. Slike affiniteter kan lett bestemmes ved å anvende konvensjonelle teknikker, slik som ved likevektsdialyse; ved å anvende BIAcore 2000 instrumentet, ved å anvende generelle prosedyrer skissert av produsenten; ved radioimmunanalyse ved å o anvende 125 I-merket M-CSF; eller ved åo anvende en fremgangsmåte kjent for fagfolk. Affinitetsdataene kan analyseres for eksempel ved fremgangsmåten til Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sei., 51:660 (1949). Deretter vil det være tydelig at foretrukne M-CSF-antistoffer vil utvise en høyere grad av spesifisiteter enn for M-CSF og vil binde med vesentlig lavere affinitet til andre molekyler. Foretrukne antistoffer binder M-CSF med en lignende affinitet som muse RX1 i Figur 4 binder seg til M-CSF, utviser lav immungenisitet, og hemmer metastase av cancerceller når det testes i metastatiske sykdomsdyremodeller. Andre eksempler på antistoffer binder M-CSF med en lignende affinitet som muse 5H4, MCI eller MC3 i henholdsvis Figur 13, 14 eller 15, binder seg til M-CSF.
Antigenet som kan anvendes for fremstilling av antistoffer kan for eksempel være intakt M-CSF eller et fragment av M-CSF som bevarer den ønskede epitopen, valgfritt fusert til et annet polypeptid som tillater at epitopen vises i dets native konformasjon. Alternativt så kan celler som uttrykker M-CSF på deres celleoverflate anvendes for å generere antistoffer. Slike celler kan transformeres til å utrykke M-CSF eller de kan være andre naturlig forekommende celler som uttrykker M-CSF. Andre former av M-CSF som er nyttig for å generere antistoffer vil være kjent for fagfolk.
Polyklonale antistoffer
Polyklonale antistoffer lages helst i dyr ved flere subkutane (sc) eller intraperitoneale (ip) injeksjoner av det relevante antigenet og et adjuvans. En forbedret antistoff respons kan skaffes tilveie ved å konjugere det relevante antigenet til et protein som er immunogent i artene som immuniseres, for eksempel nøkkelhull fastsugd hemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønne trypsinhemmer ved å anvende et bifunksjonelt eller derivatiserende middel, for eksempel maleimidbenzoylsulfosuksinimidester (konjugert gjennom cysteinresidier), N-hydroksysuksinimid (gjennom lysinresidier), glutaraldehyd, suksinanhydrid eller andre midler kjent i fagfeltet.
Dyr ble immunisert mot antigenet, immunogene konjugater eller derivater ved kombinere for eksempel 100 ug eller 5 ug av proteinet eller konjugatet (for henholdsvis kaniner eller mus) med 3 volum Freunds fullstendige adjuvans og injisere løsningen intradermalt på flere steder. En måned senere så blir dyrene boostet med 1/5 {fraksjon (1/19)} av den opprinnelige mengden av peptid eller konjugat i Freunds fullstendige adjuvans ved subkutan injeksjon på flere steder. 7-14 dager etter boosterinjeksjon, blir dyrene tappet for blod og serumet blir analysert på antistofftitere. Dyrene blir boostet inntil titerplatået. Helst så blir dyret boostet når konjugatet av det samme antigenet, men konjugert til et forskjellig protein og/eller gjennom en forskjellig kryssbindings reagens. Konjugater kan også lages i rekombinant cellekultur som proteinfusjoner. Aggregerende midler slik som alum er også passende og anvendes for å forsterke immunresponsen.
Monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer som lages ved an anvende hybridoma fremgangsmåten som først beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495 (!975) eller de kan lages ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter.
I hybridoma fremgangsmåten så blir en mus eller annet passende vertsdyr, slik som en hamster eller makak ape, immunisert som her beskrevet for å fremkalle lymfocytter som produserer eller som er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt vil binde til proteinet som blir anvendt for immunisering. Alternativt så kan lymfocytter immuniseres in vitro. Lymfocytter ble så fusert med myelomaceller ved å anvende et passende fuseringsmiddel, slik som polyetylenglykol, til å danne en hybridomacelle (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Hybridomacellene som dermed lages blir sådd ut og dyrket i et passende dyrkingsmedium som helst inneholder en eller flere substanser som hemmer veksten eller overlevelsen av ikke-fuserte, foreldre myelomaceller. For eksempel hvis foreldre myelomacellene mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), så vil dyrkningsmediet for hybridomaene vanligvis inkludere hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium), som hindrer veksten av HGPRT-manglende celler.
Foretrukne myelomaceller er de som fuserer effektivt, støtter stabil høy-nivå produksjon av antistoff ved de selekterte antistoffproduserende cellene, og som er sensitive for et medium. Humane myeloma og muse-human heteromyeloma cellelinjer er også blitt beskrevet for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Eksempler på muse-myelomalinjer inkluderer de som er utledet fra MOP-21 og M.C.-11 musetumorer tilgjengelig fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA og SP-2 eller X63-Ag8-653 celler tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA.
Dyrkningsmediet som hybridomacellene dyrkes i undersøkelser for fremstilling av monoklonale antistoffer rettet mot antigenet. Helst så blir bindingsspesifisiteten av monoklonale antistoffer produsert av hybridomaceller bestemt ved immunpresipitering eller ved en in vitro bindingsanalyse, slik som radioimmunanalyse (RIA) eller enzymkoblet immunabsorbent analyse (ELISA). Bindingsaffiniteten av det monoklonale antistoffet kan for eksempel bestemmes ved hjelp av Scatchard analyse (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).
Etter hybridomaceller er identifisert til å produsere antistoffer av ønsket spesifisitet, affinitet og/eller aktivitet, så kan klonene subklones ved begrensede fortynningsprosedyrer og dyrkes ved standard fremgangsmåter (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, s. 59-103 (Academic press, 1986)). Passende dyrkningsmedia for dette formål inkluderer for eksempel D-MEM eller RPMI-1640-medium. I tillegg så kan hybridomacellene dyrkes in vivo som ascites tumorer i dyr. De monoklonale antistoffene utskilt av subklonene blir passende separert fra dyrkningsmediet, ascitesvæske eller serum ved hjelp av konvensjonelle immunglobulin renseprosedyrer som for eksempel protein-A-sefarose, hydroksylapatitt kromatografi, gel-elektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.
Rekombinant fremstilling av antistoffer
DNA som koder for de monoklonale antistoffene kan isoleres og sekvenseres fra hybridomacellene ved å anvende konvensjonelle prosedyrer (for eksempel ved å anvende oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikke gener som koder for de tunge eller lette kjedene til de monoklonale antistoffene). Sekvensbestemmelse vil vanligvis kreve isolering av minst en del av genet eller cDNA av interesse. Vanligvis så krever dette kloning av DNA eller helst mRNA (dvs. cDNA) som koder for de monoklonale antistoffer. Kloning utføres ved å anvende standard teknikker (se for eksempel Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Guide, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press). For eksempel så kan et cDNA-bibliotek konstrueres ved revers transkripsjon av polyA + mRNA, helst membranassosiert mRNA, og biblioteket screenes ved å anvende prober som er spesifikke for de humane immunglobulin polypeptid gensekvensene. Foretrukket så blir imidlertid polymerase kjedereaksjonen (PCR) anvendt for å oppformere cDNA (eller deler av fullengde cDNA) som koder for et immunglobulin gensegment av interesse (for eksempel et lettkjede variabelt segment). De omformerte sekvensene kan lett klones inn i en passende vektor, for eksempel uttryksvektorer, minigenvektorer eller fagdisplay vektorer. Det vil forstås at den bestemte fremgangsmåten for å klone som er anvendt er ikke kritisk, så lenge som det er mulig å bestemme sekvensen av en del av immunglobulin polypeptidet av interesse. Som anvendt her så er et "isolert" nukleinsyremolekyl eller "isolert" nukleinsyresekvens et nukleinsyremolekyl som enten (1) er identifisert og separert fra minst et forurensende nukleinsyremolekyl som det opprinnelig er assosisert med i den naturlige kilden for nukleinsyren eller (2) er klonet, omformert, tagget eller på annen måte kan skilles fra bakgrunns nukleinsyrer som av sekvensen av nukleinsyren av interesse kan bestemmes, blir betraktet å være isolert.
Et isolert nukleinsyremolekyl er forskjellig fra formen eller settingen som det finnes i naturen. Isolerte nukleinsyremolekyler blir derfor skilt fra nukleinsyremolekylet som det eksisterer i naturlige celler. Et isolert nukleinsyremolekyl inkluderer imidlertid et nukleinsyremolekyl som finnes i celler som ordinært uttrykte antistoffet hvor for eksempel nukleinsyremolekylet er i en kromosomal lokalisering som er forskjellig fra den i naturlige celler.
En kilde for RNA anvendt for kloning og sekvensering er en hybridoma produsert ved å skaffe tilveie en B-celle fra den transgene musen og fusere B-cellen til en udødelig celle. En fordel med å anvende hybridoma er at de lett kan screenes, og en hybridoma som produserer et humant, monoklonalt antistoff av interesse blir valgt. Alternativt så kan RNA isoleres fra B-celler (eller hel milt) til det immuniserte dyret. Når andre kilder enn hybridoma anvendes, så kan det være ønskelig å screene for sekvensen som koder for immunglobuliner eller immunglobulin polypeptider med spesifikke bindingskarakteristika. En fremgangsmåte for slik screening er anvendelsen av fagdisplay teknologi. Fagdisplay beskrives i for eksempel Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047 og Caton og Koprowski, PROC. NATL. Acad. Sei. USA, 87:;6450-6454 (1990). Å anvende fag displayteknologi så blir cDNA fra en immunisert, transgen mus (for eksempel total milt cDNA) kan være isolert, polymerase kjedereaksjon kan være anvendt for omformere en cDNA-sekvens som koder for en del av et immunglobulin polypeptid, for eksempel CDR-regioner, og de omformerte sekvensene ble satt inn i en fag-vektor. cDNA som koder for peptider av interesse, for eksempel variable regionpeptider med ønskede bindingskarakteristika blir identifisert ved hjelp av standardteknikker slik som panorering.
Sekvensen av den oppformerte eller klonede nukleinsyren blir så bestemt. Vanligvis så blir sekvensen som koder for en hele variabel region i immunglobulin polypeptidet bestemt, imidlertid så vil det noen ganger være adekvat å sekvensere bare en del av en variabel region, for eksempel den CDR-kodende delen. Vanligvis så vil den sekvenserte delen være minst 30 baser i lengde, oftere så vil baser som koder for minst ca. 1/3 eller minst ca. % av lengden i den variable regionen bli sekvensert.
Sekvensering kan utføres på kloner isolert fra et cDNA-bibliotek eller når PCR blir anvendt, etter subkloning av den oppformerte sekvensen eller ved direkte PCR-sekvensering av det oppformerte segmentet. Sekvensering utføres ved å anvende standardteknikker (se for eksempel Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, vol 1-3, Cold Spring Harbor Press og Sanger, F. et al. (1977) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467). Ved å sammenligne sekvensen til den klonede nukleinsyren med publiserte sekvenser fra humane immunoglobulin gener og cDNA, så vil en fagperson lett være istand til å bestemme, avhengig av den regionen som blir sekvensert, (i) "germline" segmentbruk av hybridoma immunglobulin polypeptidet (inkludert isotypen til den tunge kjeden) og (ii) sekvensen til de tunge og lett kjedevariable regionene, inkludert sekvenser som
resulterer fra N-region tilsetting og prosessen fra somatisk mutasjon.
En kilde immunglobulin gensekvensinformasjon er the National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
Når det er isolert så kan DNA plasseres i uttrykksvektorer som så transfekteres inn i
vertsceller slik som E. coli-celler, ape COS-celler, humane embryoniske nyre 293-celler (for eksempel 293E-celler), kinesiske hamster ovarie (CHO)-celler eller myelomaceller som ikke på annen måte produserer immunglobulinprotein, for å skaffe tilveie syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Rekombinant fremstilling av antistoffer er godt kjent i fagfeltet.
Uttrykks kontrollsekvenser refererer til DNA-sekvenser som er nødvendig for uttrykket av en operativt koblet kodende sekvens i en bestemt vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er passende for prokaryoter inkluderer for eksempel en promoter, valgfritt en operatorsekvens og et ribosombindende sete. Eukaryote celler er kjent for å benytte promotorer, polyadenyleringssignaler og forsterkere.
Nukleinsyre er operativt koblet når den er plassert i et funksjonelt forhold med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel så er DNA for en presekvens eller sekretorisk leder operativt koblet til DNA for et polypeptid hvis det blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller forsterker er operativt koblet til den kodende sekvens hvis den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller så er et ribosombindende sete operativt koblet til den kodende sekvens hvis den er plassert slik at den fasiliterer translasjon. Vanligvis så betyr operativt koblet at DNA-sekvensene som er koblet er etterfølgende og i tilfellet med en sekretorisk leder, etterfølgende og i leseramme. Imidlertid så trenger ikke forsterkere være etterfølgende. Kobling utføres ved ligering ved passende restriksjonsseter. Hvis ikke seter eksisterer så blir syntetiske oligonukleotidadaptorer eller linkere anvendt i henhold til konvensjonell praksis.
Celle, cellelinje og cellekultur blir ofte brukt om hverandre og alle slike benevnelser her inkluderer avkom. Transformanter og tyransformerte celler inkluderer den primære individcelle og kulturer utledet fra dem uten hensyn til antallet overføringer. Det må også forstås at alt avkom ikke trenger være nødvendig identisk i DNA-innhold, på grunn av overlagt eller uønskede mutasjoner. Mutant avkom som har den samme funksjonen eller biologiske aktiviteten som screenet for i den opprinnelige transformerte cellen er inkludert. Der hvor distinkte betegnelser er ment, så vil det være klart fra teksten.
Aminosyresekvensen til et immunglobulin av interesse kan bestemmes ved hjelp av direkte proteinsekvensering. Passende, kodende nukleotidsekvenser kan designes i henhold til en universal kodontrabell.
Aminosyresekvensvarianter av det ønskede antistoffet kan lages ved å introdusere passende nukleotidforandringer inn i det kodende DNA, eller ved hjelp av peptidsyntese. Slike varianter inkluderer for eksempel delesjoner fra og/eller innsettinger inn i og/eller substitusjoner av residier innen aminosyresekvensene til antistoffene. Enhver kombinasjon av sletting, innsetting og substitusjon lages for å ende med den med sluttkonstruksjonen, forutsatt at sluttkonstruksjonen innehar de ønskede karakteristikaene. Aminosyreforandringer kan også forandre post-translasjonelle prosesser av det monoklonale, humane, humaniserte, Human Engineered™ eller variant antistoffer, slik som å forandre antallet eller posisjon av glykosyleringsseter.
Nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvensvarianter av antistoffet leges ved hjelp av en rekke fremgangsmåter kjent i fagfeltet. Disse fremgangsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til isolering fra en naturlig kilde (i tilfellet med naturlig forekommende aminosyresekvensvarianter) eller tillaging ved hjelp av oligonukleotidstyrt (eller setedirigert) mutagenese, PCR-mutagenese og kassett mutagenese av en tidligere laget variant eller en ikke-variantversjon av antistoffet.
Også beskrevet her er isolert nukleinsyre som koder for antistoffer ifølge beskrivelsen, som valgfritt er operativt koblet til kontrollsekvenser som gjenkjennes av en vertscelle, vektorer og vertsceller som omfatter nukleinsyrene, og rekombinante teknikker fra fremstillingen av antistoffene, som kan omfatte å dyrke vertscellen slik at nukleinsyren uttrykkes og valgfritt, å gjenvinne antistoffet fra vertscellekulturen eller kulturmediet.
For rekombinant fremstilling av antistoffet, så blir nukleinsyren som koder for den isolert og satt inn i en replikerbar vektor for videre kloning (oppformering av DNA) eller for uttrykk. DNA som koder for det monoklonale antistoffet isoleres lett og sekvenseres ved å anvende konvensjonelle prosedyrer (for eksempel ved å anvende oligonukleotidprober som er i stand til å binde seg spesifikt til gener som koder for de tunge og lett kjedene av antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelige. Vektorkomponentene inkluderer generelt, men er ikke begrenset til en eller flere av de følgende: en signalsekvens, et replikasjonsstartsted, en eller flere selektive markørgener, et forsterkerelement, en promoter og en transkripsjonstermineringssekvens.
(1) Signalsekvens komponent
Antistoffet i denne beskrivelsen kan produseres rekombinant ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid som helst er en signalsekvens eller annet polypeptid som har et spesifikt kløyvingssete i den N-terminale enden av det modne proteinet eller polypeptidet. Signalsekvensen som er valgt er helst en som gjenkjennes og prosesseres (dvs. kløyves av en signalpeptidase) av vertscellen. Hvis prokaryote vertsceller ikke gjenkjenner og prosesserer den native antistoff signalsekvensen, så kan signalsekvensen substitueres med en signalsekvens valgt for eksempel fra gruppen med pektatlyase (for eksempel pelB) alkalinfosfatase, penicillinase, lpp eller varmestabile enterotoksin JJ ledere. For utskillig i gjær så kan den native signalsekvensen substitueres med for eksempel gjærinvertaseleder, oc-faktorleder (inkludert Saccharomyces og Kluyveromyces oc-faktor ledere) eller sur fosfataseleder, C. albicans glukoamylase leder eller signalet som er beskrevet i WO 90/13646. I pattedyrcelleuttrykk, så er pattedyr signalsekvenser så vel som virale sekretoriske ledere, for eksempel herpes simplex gD-signalet tilgjengelig.
DNA for slik forløperregion blir ligert i leserammen til DNA som koder for antistoffet.
(2) Startsted for replikasjonskomponent
Både uttryks- og kloningsvektorer inneholder en nukleinsyresekvens som muliggjør vektoren å replikere i en eller flere valgte vertsceller. I kloningsvektorer så er vanligvis denne sekvens en som muliggjør at vektoren replikerer uavhengig av vertens kromosomale DNA, og inkluderer startsted for replikasjon eller autonome replikeringssekvenser. Slike sekvenser er velkjent for en rekke bakterier, gjær og virus. Startsted for replikasjon fra plasmid pBR322 er passende for de fleste gram-negative bakterier, 2 u plasmid startstedet er passende for gjær og forskjellige virale startsteder er nyttige for kloningsvektorer i pattedyrceller. Vanligvis så er ikke startsted for replikasjonskomponenten nødvendig for pattedyr uttrykks vektorer (SV40 startstedet blir vanligvis anvendt kun fordi det inneholder den tidligere promotoren).
(3) Selektiv markørkomponent
Uttrykk- og kloningsvektorer kan inneholde et selektivt gen, også kalt genselekterbar markør. Vanlige seleksjonsgener koder for proteiner som (a) utviser resistens for antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampcillin,
neomycin, metotreksat, tetrasyklin, G418, geneticin, histidinol eller mykofenolsyre
(b) komplement auxotrofe mangler, eller
(c) leverer nødvendige næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra komplekse
media, for eksempel genet som koder for D-alanin racemase for Bacilli.
Et eksempel på et seleksjonsskjema anvender et medikament for å arrestere vekst av en vertscelle. Disse celler som er vellykket transformert med et heterologt gen produserer et protein som utviser medikamentresistens og som dermed overlever seleksjonskuren. Eksempler på slik dominant seleksjon anvender medikamentene metotreksat, neomycin, histidinol, puromycin, mykofenolsyre og hygromycin.
Et annet eksempel på passende selekterbare markører for pattedyrceller er de som muliggjør identifikasjon av celler som er kompetente til å ta opp den antistoffkodende nukleinsyren, slik som DHFR, tymidinkinase, metallotionein-I og -II, helst primate metallotioneingener, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase osv.
For eksempel så blir celler som er transformert med DHFR-seleksjonsgenet først identifisert ved å fyrke alle transformantene i et dyrkningsmedium som inneholder metotreksat (Mtx), en kompetitiv antagonist av DHFR. En passende vertscelle når villtype DHFR benyttes er den kinesiske hamster ovarie (CHO) cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet.
Alternativt så kan vertsceller (spesielt villtype verter som inneholder endogen DHFR) som er transformert eller ko-transformert med DNA-sekvenser som koder for antistoff ifølge beskrivelsen, villtype DHFR-protein og annen selekterbar markør slik som aminoglukosid 3' fosfotransferase (APH) selekteres ved cellevekst i medium som inneholder et seleksjonsmiddel for den selekterbare markøren slik som et aminoglykosid antibiotika, for eksempel kanamycin, neomycin eller G418. Se US patentnr. 4 965 199.
Et passende seleksjonsgen for anvendelse i gjær er trpl-genet som er tilstede i gjærplasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). Trpl-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evnen til å gro i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12
(1977). Tilstedeværelsen av trpl-lesjonen i gjærvert cellegenomet tilveiebringer så et effektivt miljø for å detektere transformasjon ved vekst i fraværet av tryptofan. På samme måte så blir Leu2-manglende gjærstammer (ATCC 20 622 eller 38 626) komplementert ved kjente plasmider som bærer Leu2-genet. Ura3-manglende gjærstammer komplementeres med plasmider som bærer ura3-genet.
I tillegg så kan vektorer utledet fra det 1,6 um sirkulære plasmidet pKDl anvendes for transformasjon av Kluyveromyces- gjær. Alternativt så blir et uttrykkssystem for storskalaproduksjon av rekombinant kalve kymosin rapportert for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Stabile multi-kopi uttrykksvektorer for utskillelse av modent rekombinant humant serumalbumin ved hjelp av industrielle stammer av Kluyveromyces har også blitt utgreiet. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).
(4) Promoterkomponent
Uttrykks- og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promoter som gjenkjennes av vertsorganismen og som er operativt koblet til den antistoffkodende nukleinsyren. Promotorer som er passende for anvendelse med prokaryote verter inkluderer arabinose (for eksempel araB) promoter phoA-promoter, P-laktamase og laktose promotersystemer, alkalisk fosfatase, et tryptofan (trp) promotersystem og hybrid promotorer som tac-promotorer. Andre kjente bakterielle promotorer er imidlertid passende. Promotorer for anvendelse i bakterielle systemer vil også inneholde en Shine-Dalgarno (S.D.) sekvens som er operativt koblet til DNA'et som koder for antistoffetifølge beskrivelsen.
Promotorsekvenser er kjent for eukaryoter. Så å si alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert ca. 25 til 30 baser oppstrøms fra setet hvor transkripsjonen initieres. En annen sekvens funnet 70 til 80 baser oppstrøms fra starten av transkripsjonen i mange gener er en CNCAAT-region hvor N kan være ethvert nukleotid. Ved den 3' enden av de fleste eukaryote gener så finnes en AATAAA-sekvens som kan være signalet for tilsettingen av poly A-halen til den 3' enden av den kodende sekvensen. Alle disse sekvenser er passende innsatt i eukaryote ekspresjonsvektorer.
Eksempler på passende promoterende sekvenser for anvendelse med gjærverter inkluderer promotorer fra 3-fosfoglyseratkinase eller andre glykolytiske enzymer, slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfolyseratmutase, pyvuratkinase, triosefofatisomerase, fosfoglukoseisomerse og glukokinase.
Andre gjærpromotorer som er induserbare promotorer som har tilleggsfordelen av transkripsjon kontrollert ved vekstbetingelser, er promotorregionene for
alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degrative enzymer assosiert med nitrogenmetabolisme, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlig for maltose og galaktose benyttelse. Passende vektorer og promotorer for anvendelse i gjæruttrykk er videre beskrevet i EP 73 657. Gjærforsterkere blir også fordelaktig anvendt med gjærpromotorer.
Antistoff transkripsjon fra vektorer i pattedyr vertsceller er kontrollert for eksempel ved promotorer skaffet tilveie fra genomer av virus slik som Abelson leukemivirus, polyomavirus, fjærfe difterivirus, adenovirus (slik som adenovirus 2), bovint papillomavirus, ape sarkomavirus, mest ønskelig cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt B-virus, Simian virus 40 (SV40), fra heterologe pattedyrpromotorer, for eksempel aktin promotoren eller en immunglobulin promotor, fra varmesjokk promotorer, forutsatt at promotorer er kompatibel med vertscellesystemene.
De tidlige og sene promotorene til SV40-viruset blir lett skaffet tilveie som et SV40 restriksjonsfragment som også inneholder SV40 virale starsteder for replikasjon. Den nærmest tidlige promotoren til det humane cytomegalovirus blir lett skaffet tilveie som et HindJJI E restriksjonsfragment. Et system for å uttrykke DNA i pattedyrverter ved å anvende det bovine papillomaviruset som en vektor er utgreiet i US patentnr. 4 419 446. En modifikasjon av dette system er beskrevet i US patentnr. 4 601 978. Se også Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) på ekspresjon av humant P-interferon cDNA i museceller under kontrollen av et tymidinkinasepromotor fra herpes simplex virus. Alternativt så kan rous sarkomavirus lange terminalrepeterte sekvens anvendes som promotoren.
(5) Forsterker elementkomponent
Transkripsjon av et DNA som koder for antistoffet i denne beskrivelsen ved høyere eukaryoter blir ofte øket ved å sette inn en forsterkersekvens inn i vektoren. Mange forsterkersekvenser er kjent fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, oc-fetoprotein og insulin). Vanligvis vil man imidlertid anvende en forsterker fra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40-forsterkeren på den sene siden av replikasjonsstartestedet (bp 100-270), cytomegalovirus tidlig promotorforsterker, polyoma forsterkeren på den sene siden av replikasjonsstartestedet og adenovirusforsterker. Se også Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) om forsterkerelementer for aktivering av eukaryote promotorer. Forsterkeren kan være spleiset inn i vektoren ved en posisjon som er 5' eller 3' for den antistoffkodende sekvenser, men er helst lokalisert ved et sete 5' fra promotoren.
(6) Transkripsj onstermineringskomponent
Uttrykks vektorer anvendt i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, innsekt, plante, dyr, menneske eller kjerneinneholdende celler fra andre multicellulære organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendig for termineringen av transkripsjon og for stabiliseringen av mRNA. Slike sekvenser er vanligvis tilgjengelige fra de tre 5' og av og til 3' utranslaterte regioner av eukaryote eller viral DNAer eller cDNAer. Disse regioner inneholder nukleotidsegmenter transkribert som polyadenylerte fragmenter i den utranslaterte delen av mRNA som koder for antistoffet. En nyttig transkripsj onstermineringskomponent er den bovine veksthormon polyadenyleringsregionen. Se WO 94/11026 og uttryksvektoren som er utgreiet der. En annen er museimmunglobulin lettkjede transkripsjonsterminator.
(7) Seleksjon og transformasjon av vertsceller
Passende vertsceller for å klone eller uttrykke DNA i vektorene heri er prokaryote, gjær eller høyere eukaryote celler beskrevet over. Passende prokaryoter for dette formål inkluderer eubakterier slik som gram-negative eller gram-positive organismer, for eksempel Enterobacteriacea slik som Escherichia, for eksempel E. coli, enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans og Shigella, så vel som Bacilli slik som B. subtilis og B. licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41 P utgreiet i DD 266 710 publisert 12. april 1989), Pseudomonas slik som P. aemginosa og Streptomyces. En foretrukket E. coli kloningsvert er E. coli 294 (ATCC 31 446), selv om andre stammer slik som R coli B, E. coli XI776 (ATCC 31 537) og E. coli W3110 (ATCC 27 325) er passende. Disse eksempler er kun for illustrasjon og ikke begrensende.
I tillegg til prokaryoter så er eukaryote mikrober slik som filamentøs sopp eller gjær passende klonings og uttryksverter for antistoffkodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er den mest vanlige anvendt blant lavere eukaryote verts mikroorganismer. Imidlertid så er det en rekke andre slekter, arter og stammer vanlig tilgjengelig og nyttig her, slik som Schizosaccharomycespombe; Kluyveromyces verter slik som for eksempel K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. vickeramii (ATCC 24 178), K. valtii (ATCC 56 500), K. drosopilarum (ATCC 36 906), K. termotolerans og K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma ressia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwnniomyces slik som Schwannimyces occidentalis; og filamentøse sopp slik som for eksempel Neurospora, Penicillium, Tolypocladium og Aspergillus verter slik som A. nidulans og A. niger.
Passende vertsceller for uttrykket av glykosylerte antistoffer er utledet fra multicellulære organismer. Eksempler på virvelløse celler inkluderer planter og innsektsceller. Flere baculovirale stammer og varianter og korresponderende permessive insektsvertsceller fra verter slik som Spodoptera frugiperda (larve), Åedes aegyptir (moskito), Åedes albopictus (moskito), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori er blitt identifisert. En rekke virale stammer for transfeksjon er offentlig tilgjengelig, for eksempel L-l-varianten av autographa californica NP V og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV og slike virus kan anvendes som viruset her i henhold til den foreliggendebeskrivelsen, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda celler.
Plantecellekulturer av bomull, mais, potet, soyabønne, petunia, tomat, tobakk, lemna og andre planteceller kan også benyttes som verter.
Interesse har imidlertid vært størst i virveldyr celler, og progargering av virveldyrceller i kultur (vevskultur) er blitt en rutineprosedyre. Eksempler på nyttige pattedyr verstceller er kinesiske hamster ovarieceller, inkludert CHOKl-celler (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44 og kinesiske hamster ovarieceller/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77: 4216 (1980)); apenyre CV1-linje transformert av SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonisk nyrelinje (293 eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskultur, (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); babyhamster nyreceller (BHK, ATCC CCL 10); muse sertoli celler (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251
(1980)); apenyre celler (DV1 ATCC CCL 70); afrikansk grønn apenyre celler (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane cervikale karsinomaceller (HELA, ATCC CCL 2); hunde nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34); buffalorotte leverceller (BRL 3 A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); muse brysttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRl-celler (Mather et al., Annals NY. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); MRC5-celler; FS4-celler; og en human hepatomalinje (Hep G2).
Vertsceller blir transformert eller transfektert med de ovenfor beskrevne uttrykk eller kloningsvektorer for antistoffproduksjon, og dyrket i konvensjonelle næringsmedia modifisert som passende for å indusere promotoren; seleksjonstransformanter eller omformere genene som koder for de ønskede sekvenser. I tillegg så er nye vektorer og transfekterte celleliner med flere kopier av transkripsjons enheter separert av en selektiv markør spesielt nyttig og foretrukket for uttrykket av antistoffer som målrettet M-CSF.
(8) Å dyrke vertscellene
Vertscellene som anvendes for å produsere antistoffet kan dyrkes i en rekke medier. Kommersielt tilgjengelige media slik som Hams F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), og Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Sigma) er passende for å dyrke vertscellene. I tillegg så kan ethvert av mediene som er beskrevet i Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biohem. 102: 255 (1980), US patentnr. 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 eller 5 122 469 WO 90103430, WO 87/00195 eller US patent Re. nr. 30 985 anvendes som dyrkingsmedia for vertscellene. Ethvert av disse media kan supplementeres ettersom det er nødvendig med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (slik som insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleotider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (sliks om Gentamycin™ medikament), sporelementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis er tilstede ved sluttkonsentrasjoner i mikromolart område) og glukose eller en ekvivalent energikilde. Ethvert annet nødvendig supplement kan også inkluderes ved passende konsentrasjoner som ville være kjent for fagfolk. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH og lignende, er de som tidligere anvendt med vertscellen som er valgt for uttrykk, og vil være tilsynelatende for vanlige fagfolk.
(9) Rensing av antistoff
Når man anvender rekombinante teknikker så kan antistoffet produseres intracellulært, i det periplasmatiske rommet, eller utskilles direkte inn i mediet, inkludert fra mikrobielle kulturer. Hvis antistoffet produseres intracellulært, så blir som et første trinn, de partikulære debris, enten vertsceller eller lyserte fragmenter, fjernet, for eksempel ved hjelp av sentrifugering eller ultrafiltrering. Better et al. Sicence 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10: 105 (1990); og Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 457-461 (1993) beskriver en prosedyre for å isolere antistoffer som er utskilt i det periplasmiske rommet til E. coli. (Se også (Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)).
Antistoffsammensetningen lages fra mikrobielle eller pattedyrceller kan renses ved for eksempel å anvende hydroksylapatitt kromatografi kation eller ape utbyttingskromatografi, og affinitetskromatografi med affinitetskromatografi som den foretrukne rensingsteknikken. Egnetheten for protein A som en affinitetsligand er avhengig av artene og isotypen til ethvert immunglobulin Fc-domene som er tilstede i antistoffet. Protein A kan anvendes for å rense antistoffer som er basert på humane yl, y2 eller y4 tunge kjeder (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Protein G er anbefalt for alle museisotyper og for humant y3 (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575
(1986)). Matriksen som affinitetsliganden er festet til er oftest agarose, men andre matrikser er tilgjenglige. Mekanisk stabile matrikser slik som kontrollerte poreglass eller poly(styrendivinyl)benzen tillater raskere strømningshastigheter og kortere prosesseringstider enn det som kan oppnås med agarose. Der hvor antistoffet omfatter et Cr3 domene, så er Bakerbond ABX™-harpiks (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) nyttig for rensing. Andre teknikker for proteinrensing slik som fraksjonering på en ioneutbyttingskolonne, etanolpresipitering, Revers fase HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparin SEPHAROSE™-kromatografi på en anion eller kationutbyttingsresin (slik som en polyasparginsyre kolonne), kromatofokusering, SDS-PAGE og ammoniumsulfat prespitering er også tilgjengelig avhengig av antistoffet som skal gjenvinnes.
Kimere og humaniserte antistoffer
Fordi kimere eller humaniserte antistoffer er mindre immunogene i mennesker enn de foreldre-muse monoklonale antistoffene så kan de anvendes for behandlingen av mennesker med mye mindre risiko for anafylakse. Disse antistoffer kan dermed foretrekkes i terapeutiske anvendelser som involverer in vzvo-administrering til et menneske.
Kimere, monoklonale antistoffer hvor de variable Ig-domenene til et muse-monoklonalt antistoff er fusert til humane konstante lg-domener, kan genereres ved å anvende standard prosedyrer kjent i fagfeltet (se Morrison, S.L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding domains with Human Constant Region Domains, proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 6841-6855; og Boulianne, G.L., et al., Nature 312, 643-646 (1984)). Selv om noen kimere, monoklonale antistoffer har vist seg å være mindre immunogene i mennesker, så kan de musevariable Ig-domenene fremdeles føre til en signifikant human anti-mus respons.
Humaniserte antistoffer kan oppnås ved hjelp av en rekke fremgangsmåter inkludert for eksempel: (1) å sette inn ikke-humane komplementaritetsbestemmende regioner (CDRer) i en human leseramme og konstant region (en prosess referert til i fagfeltet som humanisering gjennom "CDR grafting"), eller alternativt (2) å transplantere hele de ikke-humane variable domenene, men "å skjule" dem med en human-lignende overflate ved erstatning av overflateresidier (en prosess som refereres til i fagfeltet som "finering").
I den foreliggende oppfinnelsen så vil humaniserte antistoffer inkludere både "humaniserte" og "finerte" antistoffer. Disse fremgangsmåter er utgreiet i for eksempel Jones et al., Nature 321: 522 525 (1986); Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 6851 6855 (1984); Morrison og Oi, Adv. Immunol. 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239: 1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28: 489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169 217 (1994); og Kettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7): 773 83 (1991).
Spesielt så vil et gnagerantistoff ved gjentatt in vzvo-administrering i menneske, enten alene eller som et konjugat, frembringe en immunrespons i mottageren mot gnagerantistoff et; den såkalte HAMA-responsen (Humant Anti Muse Antistoff). HAMA-responsen kan begrense effektiviteten av farmasøytikaet hvis repetert dosering er nødvendig. Immunogenisiteten til antistoffet kan reduseres ved kjemisk modifikasjon av antistoffet med en hydrofil polymer slik som polyetylenglykol eller ved å anvende fremgangsmåtene for genetisk konstruering for å lage antistoff bindingsstrukturen mer human lignende. For eksempel så kan gensekvensene for de variable domenene til gnagerantistoffet som binder CEA substitueres med de variable domenene til et humant myelomaprotein, og dermed produsere et rekombinant kimert antistoff. Disse prosedyrer er beskrevet i detalj i EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 og WO 86/01533. Alternativt så kan gensekvensene til CDRene til gnagerantistoffet isoleres eller syntetiseres og substitueres med de korresponderende sekvensregionene til et homologt humant antistoffgen, og produsere et humant antistoff med spesifisiteten til det opprinnelige gnagerantistoffet. Disse prosedyrer er beskrevet i EP 023940, WO 90/07861 og WO 91/09967. Alternativt så kan et stort antall av overflateresidiene i det variable domenet til gnagerantistoffet forandres til de residier som normalt finnes på et homologt, humant antistoff, og produsere et gnagerantistoff som har en overflate "finer" med residier og som dermed vil gjenkjennes som seg selv at den humane kroppen. Denne tilnærming er blitt vist av Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489.
CDR-grafting involverer å introdusere en eller flere av de seks CDRene fra de muse tunge- og lett kjedevariable Ig-domenene inn i de passende fire leserammeregionene til humane variable Ig-domener. Denne teknikken (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323
(1988)) benytter de konserverte leseramme regionene (FR1-FR4) som et stillas til å støtte CDR-sløyfene som er de primære kontaktene med antigen. En ulempe med CDR-grafting er imidlertid at den kan resultere i et humanisert antistoff som har en vesentlig lavere bindingsaffinitet enn det opprinnelige museantistoffet, fordi aminosyrer i leserammeregionene kan bidra til antigen binding og fordi aminosyrer i CDR-sløyfene kan influere assosieringen av de to variable Ig-domener. For å opprettholde affiniteten av det humaniserte, monoklonale antistoffet, så kan CDR-graftingteknikken forbedres ved å velge humane leserammeregionene til det opprinnelige muse-antistoffet, og ved setedirigert mutagenese av enkle aminosyrer innen leserammen eller CDRene hjulpet av computermodulering av det antigenbindende setet (for eksempel Co, M.S, et al. (1994), J. Immunol. 152, 3968-3976).
En fremgangsmåte for å humanisere antistoffer omfatter å stille opp de ikke-humane tunge- og lett kjedesekvensene mot humane tunge- og lette kjedesekvenser, og velge og å erstatte den ikke-humane leserammen med en human leseramme basert på slik oppstilling, molekylære modellering for å forutsi konformasjonen av den humaniserte sekvensen og å sammenligne konformasjonen av foreldre antistoffet. Denne prosess etterfølges av repeterte tilbakemutasjon av residier i CDR-regionen som forstyrrer strukturen av CDRene inntil den forutsagte konformasjonen av den humaniserte sekvensmodellen, tett opp til konformasjonen av ikke-humane CDRer til det foreldre, ikke-humane antistoffet. Noen humaniserte antistoffer kan videre derivatiseres for å fasilitere opptak og rensing, for eksempel via Ashwell reseptorer (se for eksempel US patentnr. 5 530 101 og 5 585 089).
En rekke humaniseringer av muse-monoklonale antistoffer ved fornuftig design er blitt rapportert (se for eksempel 20020091240 publisert 11. juli 2002, WO 92/11018 og US patentnr. 5 693 762, US patentnr. 5 766 866).
Aminosyre sekvensvarianter
En nyttig fremgangsmåte for identifikasjon av visse residier eller regioner i antistoffet som er foretrukne lokaliseringer for mutagenese kalles "alaninscanning mutagenese", som beskrevet av Cunningham og Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Her så blir et residie eller gruppe med målresidier identifisert (for eksempel ladede residier slik som arg, asp, his, lys og glu) og erstattet av en nøytral eller negativt ladet aminosyre (mest foretrukket er alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med antigen. De aminosyrelokaliseringer som demonstrer funksjonell sensitivitet til substitusjonene blir så forfinet ved å introdusere videre eller andre varianter ved eller for stedene for substitusjon. Mens stedet for å introdusere en aminosyresekvensvariasjon er forhåndsbestemt, så er dermed naturgen av mutasjonen i seg selv ikke forhåndsbestemt. For eksempel for å analysere ytelsen til en mutasjon ved et gitt sted, så blir ala-scanning eller tilfeldig mutagenese utført ved målkodonet eller regionen og de uttrykte antistoffvariantene screenes for den ønskede aktiviteten.
Aminosyresekvensinnsettinger inkluderer amino- og/eller karboksyterminale fusjoner i avstander fra et residie til polypeptider som inneholder hundre eller flere residier, så vel som intra-sekvens innsettinger av enkle eller flere aminosyreresidier. Eksempler på terminale innsettinger inkluderer et antistoff med et N-terminale metionylresidie eller antistoffet (inkludert antistoffragment) fusert til en epitoptag eller en redningsreseptor epitop. Andre innsettingsvarianter av antistoffmolekylet inkluderer fusjonen til et polypeptid som øker antistoffets halveringstid i serumet, for eksempel ved den N-terminale eller C-terminale enden.
Uttrykket "epitoptagget" refererer seg til antistoffet fusert til en epitoptag. Epitoptag polypeptidet har nok residier for å tilveiebringe en epitop som det kan lages et antistoff mot, og enda er kort nok slik at det ikke refererer med aktivitet av antistoffet. Epitoptagen er helst tilstrekkelig unik slik at antistoffet mot den ikke vesenlig kryssreagerer med andre epitoper. Passende tag polypeptider har vanligvis minst 6 aminosyreresidier og er vanligvis mellom ca. 8-50 aminosyreresidier (helst mellom ca. 9-30 residier). Eksempler inkluderer flu HA-tag polypeptidet og dets antistoff 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)) c-myc tågen og 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 og 9E10 antistoffene mot dem (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616
(1985)); og herpes simplex virus glykoprotein D (gD)-tagen og dets antistoff (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). Andre eksempler på tager er en poly-histidinsekvens, vanligvis rundt seks histidinresidier, som tillater isolering av en forbindelse som er merket slik ved å anvende nikkelchelatering. Andre merkinger og tager, slik som FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), velkjent og rutinemessig anvendt i fagfeltet, er beskrevet her.
Som anvendt her så refererer uttrykket "redningsreseptor bindingsepitop" til en epitop av Fc-regionen til et IgG-molekyl (for eksempel IgGi, IgG2, IgG?eller IgGi) som er ansvarlig for å øke IgG-molekylet in vivo serum halveringstid.
En annen type variant er en aminosyresubstitusjonvariant. Disse varianter har minst et aminosyreresidie i antistoffmolekylet fjernet og et forskjellig residie satt inn i dets sted. Substitusjonen mutagenese innen enhver av de hypervariable eller CDR-regionene eller leserammeregionene blir overveid. Konservative substitusjoner er vist i Tabell 1. Den mest konservative substitusjonen finnes under overskriften med "foretrukne substitusjoner". Hvis slike substitusjoner resulterer i ingen forandring i biologiske aktiviteter, så kan flere vesentlige forandringer, kalt "eksempler på substitusjoner" i Tabell 1, eller som videre er beskrevet under med referanse til aminosyreklasser, introduseres og produktene screenes.
Vesentlige modifikasjoner i de biologiske egenskapene til antistoffet utføres ved å selektere substitusjoner som skiller seg signifikant i deres effekt på å opprettholde
(a) strukturen av polypeptid ryggraden i området rundt substitusjonen, for eksempel
som en plate eller helikskonformasjon,
(b) ladningen eller hydrofobisiteten av molekylet ved målstedet, eller (c) omfanget av sidekjeden.
Naturlig forekommende residier deles inn i grupper basert på felles sidekjede egenskaper: (1) hydrofobe: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) nøytrale hydrofile: cys, ser, thr; (3) sure: asp, glu; (4) basiske: asn, gin, his, lys, arg;
(5) residier som influerer kjedeorientering: gly, pro; og
(6) aromatiske: trp, tyr, phe.
Konservative substitusjoner involverer å erstatte en aminosyre med et annet medlem av dens klasse. Ikke-konservative substitusjoner involverer å erstatte et medlem av en av disse klassert med et medlem av en annen klasse.
Ethvert cysteinresidie som ikke er involvert i opprettholdelsen av den passende konformasjonen av det monoklonale, humane, humaniserte, Human Engineered™ eller variant antistoffet kan også substitueres, generelt med serin, for å forbedre den oksidative stabiliteten til molekylet og å hindre avvikende krysskobling. Motsatt, så kan cysteinbinding eller bindinger tilsettes til antistoffet for å forbedre dets stabilitet (spesielt der hvor antistoffet er et antistoffragment slik som et Fv-fragment).
Affinitetmettning involverer å lage og screene antistoffvarianter som har substitusjoner innen CDRene til et foreldreantistoff og å velge varianter som har forbedrede biologiske egenskaper slik som bindingsaffinitet i forhold til foreldreantistoffet. I en passende måte å generere slike substitusjonelle varianter er affinitetsmetning ved å anvende fagdisplay. I korthet så blir flere hypervariable regionseter (for eksempel 6-7 seter) mutert for å generere alle mulige aminosyresubstitusjoner ved hvert sted. Antistoffvariantene som dermed genereres vises på en monovalent måte fra filamentøse fagpartikler som fusjoner til gen IJJ produktet til Ml3 pakket innen hver partikkel. Fagdisplay variantene blir så screenet for deres biologiske aktivitet (for eksempel bindingsaffinitet).
Alaninscanning mutagenese kan utføres for å identifisere hypervariable regionresidier som bidrar signifikant til antigen binding. Alternativt eller i tillegg så kan den på en fordelaktig måte analysere en krystallstruktur av antigen-antistoffkomplekset for å identifisere kontaktpunkter mellom antistoffet og antigenet. Slike kontaktresidier eller naboresidier er kandidater for substitusjon ifølge teknikkene som er forklart i detalj her. Med en gang slike varianter er generert, så blir paneler med varianter utsatt for screening som beskrevet her og antistoffer med overlegne egenskaper i en eller flere relevante analyser kan selekteres for videre utvikling.
Antistoffvarianter kan også produseres som har et modifisert glykosyleringsmønster i forhold til foreldreantistoffet, for eksempel å slette en eller flere karbonhydratdeler som finnes i antistoffet og/eller å tilsette et eller flere glykosyleringssteder som ikke er tilstede i antistoffet.
Glykosylering av antistoffer er vanligvis enten N-koblede eller O-koblede. N-koblede refererer til festingen av karbohydratdelen til sidekjeden til et asparaginresidie. Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, hvor X er enhver aminosyre unntatt prolin, er gjenkjenningssekvensene for enzymatisk festing av karbohydratdelen til asparagin sidekjeden. Tilstedeværelsen av enhver av disse tripeptidsekvenser i et polypeptid danner et potensielt glykosyleringssete. N-koblede glykosyleringsseter kan dermed tilsettes til et antistoff ved å forandre aminosyresekvensen slik at den inneholder en eller flere av disse tripeptidsekvensene. O-koblet glykosylering refererer til festingen av et av sukkerne N-aceylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, mest vanlig serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan anvendes. O-koblede glykosyleringssteder kan tilsettes til et antistoff ved å sette inn eller å substituere en eller flere serin eller treoninresidier til sekvensen i det opprinnelige antistoffet. Ved hjelp av eksempel, så kan aminosyrene til RX1 ved posisjoner 41-43 i Figur 4A (NGS) bevares. Alternativt så kan bare aminosyrer 41 og 42 (NG) bevares.
Ordinært så vil aminosyre sekvensvarianter i Human Engineered™ antistoffet ha en aminosyresekvens som har minst 60% aminosyresekvensidentitet med de opprinnelige Human Engineered™ antistoff aminosyresekvensene til enten den tunge eller den lette kjeden (for eksempel som i enhver av Figurene 19B til 22B) mer ønskelig minst 80%, mest ønskelig minst 85%, mer ønskelig minst 90%, og mest ønskelig minst 95%, inkludert for eksempel 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% og 100%. Identitet eller homologi med hensyn til denne sekvens er definert her som prosent aminosyreresidier i kandidatsekvensen som er identisk med de Human Engineered™ residiene, etter å oppstille sekvensene og å introdusere gap, hvis det er nødvendig, for å oppnå maksimal prosentsekvens identitet, og ikke betrakte noen konservative substitusjoner (som definert i Tabell 1 over) som del av sekvensidentiteten. Ingen N-terminale, C-terminale eller interne ekstensjoner, slettinger eller innsettinger inn i antistoffsekvensen bør tolkes som å påvirke sekvensidentitet eller homologi. Sekvensidentitet kan dermed bestemmes ved hjelp av standard fremgangsmåter som vanligvis anvendes for å sammenligne likhet i posisjon av aminosyrene i to polypeptider. Ved å anvende et computerprogram slik som BLAST eller FASTA, så blir to polypeptider oppstilt for optimalt å treffe deres respektive aminosyrer (enten sammen med fullengde av den ene eller begge sekvenser, eller langs en på forhånd bestemt del av en eller begge sekvenser). Programmene tilveiebringer en standard åpningsstraff og en standard gap-straff og en skåringsmatriks slik som PAM 250 (en standard skåringsmatriks; se Dayhoff et al., i Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 3 (1978)) kan anvendes sammen med computerprogrammet. For eksempel så kan prosentidentiteten deretter beregnes som: det totale antall identiske treff multiplisert med 100 og deretter dividert med summen av lengden av den lengste sekvensen innen det tilpassede spennet og antall gap introdusert inn i de lengre sekvensene for å oppstille de to sekvensene.
Andre modifikasjoner i antistoffet blir overveid, for eksempel så kan det være ønskelig å modifisere antistoffet med hensyn til effektorfunksjon, som for å øke effektiviteten av antistoffet i å behandle for eksempel cancer. For eksempel så kan cysteinresidiet eller residier introduseres i Fc-regionen, og dermed tillate interkjede disulfidbindingsdannelse i denne region. Det homodimere antistoffet kan dermed genereres kan ha forbedret internaliseringskapabilitet og/eller øket komplementstyrt celledreping og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Se Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) og Shopes, B.J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimere antistoffer med forsterket anti-tumor aktivitet kan også lages ved å anvende heterobifunksjonelle krysskoblere som beskrevet i Wolff et al., Cancer REsearch 53: 2560-2565 (1993). Alternativt så kan et antistoff konstrueres som har tosidige Fc-regioner og kan dermed ha forsterket komplementlysis og ADCC-evner. Se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). I tillegg så har det vært vist at sekvenser innen CDRen kan forårsake et antistoff å binde seg til MHC Klasse II og trigge en uønsket hjelpe T-cellerespons. En konservativ substitusjon kan tillate antistoffet å bevare bindingsaktivitet, men tape dens evne til å trigge en uønsket T-cellerespons. Se også Steplewski et al., Proe. Nati Acad Sei USA 1988; 85(13);4852-6, , som beskriver kimere antistoffer hvor en musevariabel region blir koblet med humane yl, y2, y3 og y4 konstante regioner.
Det kan være ønskelig å anvende et antistoffragment, heller enn et intakt antistoff, for å for eksempel øke tumorpenetrering. I dette tilfellet så kan det være ønskelig å modifisere antistoffragmentet for å øke dets halveringstid i serum, for eksempel å tilsette molekyler slik som PEG eller andre vannløselige polymerer, inkludert polysakkarid polymeren, til antistoffragmenter for å øke halveringstiden. Dette kan også oppnås for eksempel ved å inkorporere en redningsreseptor bindingsepitop inn i antistoffragmentet (for eksempel ved mutasjon av den passende regionen i antistoffragmentet eller ved å inkorporere epitopen inn i en peptidtag som så fuseres til antistoffragmentet ved den ene eller andre enden eller i midten, for eksempel ved DNA-eller peptidsyntese) (se for eksempel WO 96/32478). Redningsreseptorbindingsepitopen utgjør helst en region hvor et eller flere aminosyreresidier fra en eller to sløyfer av et Fc-domene blir overført til en analog posisjon i antistoffragmentet. Enda mer ønskelig så blir tre eller flere residier fra en eller to sløyfer av Fc-domenet overført. Enda mer ønskelig så blir epitopen tatt fra CH2-domenet i Fc-regionen (for eksempel et IgG) og overført til CH1, CH3 eller VH-regionen, eller mer enn en slik region, av antistoffet. Alternativt så blir epitopen tatt fra CH2-domenet til Fc-regionen og overført til C.sub.L-regionen eller V.sub.L-regionen eller begge, til antistoffragmentet. Se også internasjonale søknader WO 97/34631 og WO 96/32478 som beskriver Fc-varianter og deres interaksjon med redningsreseptor.
Antistoffer kan derfor omfatte en human Fc-del, en human konsensus Fc-del, eller en variant av den, som bevarer evnen til å interagere med Fc-redningsreseptoren, inkludert varianter hvor cysteiner involvert i disulfidbinding blir modifisert eller fjernet, og/eller hvor en met ble tilsatt til den N-terminale enden og/eller en eller flere av de N-terminale 20 aminosyrene blir fjernet, og/eller regioner som interagerer med komplement, slik som Clq bindingssetet blir fjernet og/eller ADCC-setet blir fjernet (se for eksempel Molec. Immunol. 29(5): 633-9 (1992)).
Tidligere studier kartla bindingsseter på humane og muse-IgG for FcR primært til den nedre hengselregionen sammensatt av igG-residier 233-239. Andre studier foreslo tilleggs grove segmenter, for eksempel Gly316-Lys338 for human Fc-reseptor 1, Lys274-Arg301 og Tyr407-Arg416 for human Fc-reseptor Ul, eller fant noen få spesifikke residier på utsiden av den nedre hengselen, for eksempel Asn297 og Glu318 for muse-IgG2b som interagerer med muse-Fc-reseptor H Rapporten om den 3,2-Å krystallstrukturen av den humane IgGl-Fc-fragmentet med human Fc-reseptor EIA skisserte IgGl-residier Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 og Ala327-Ile332 som å være involvert i binding til Fc-reseptor IDA. Det har vært foreslått, basert på krystallstruktur, at i tillegg til den nedre hengselen (Leu234-Gly237), så kan residier i IgG CH2-domenesløyfer FG (residier 326-330) og BC (residier 265-271) spille en rolle i å binde Fc-reseptor IIA. Se Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604
(2001). Mutasjon av residier innen Fc-reseptorbindingsseter kan resultere i forandring i effektorfunksjonen, slik som forandret ADCC eller CDC-aktivitet eller forandret halveringstid. Som beskrevet over så inkluderer potensielle mutasjoner innsetting, sletting eller substitusjon av en eller flere residier, inkludert substitusjon med alanin, en konservativ substitusjon, en ikke-konservativ substitusjon, eller erstatting med et korresponderende aminosyreresidie ved den samme posisjonen fra en annen IgG underklasse (for eksempel å erstatte et IgGl-residie med en korresponderende IgG2-residie ved den posisjon).
Shields et al rapporterte at IgGl-residier involvert i binding til alle humane Fc-reseptorer er lokalisert i det CH2-domenet proksimalt til hengselet og faller i to kategorier som følger: 1) posisjoner som kan interagere direkte med alle FcR inkludert Leu234-Pro238, Ala327 og Pro329 (og muligens Asp265), 2) posisjoner som influerer karbohydratnatur eller posisjon som inkluderer Asp265 og Asn297.
Tilleggs IgGl-residiene som påvirker bindingen til Fc-reseptor U er som følger: (størst effekt) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298 og (mindre effekt) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378 og Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A og D279A reduserte binding. I tillegg til residiene identifisert over for alle FcR, så er tilleggs-IgGl-residier som reduserte binding til Fc-reseptor EIA med 40% eller mer som følger: Ser239, Ser267 (kun Gly), His268, Glu293, Gln295, Tyr296,Arg301, Val303, Lys338 og Asp376. Varianter som forbedrer binding ti FcRUIA inkluderte T256A, K290A, S298A, E333A, K334A og A339T. Lys414 viste en 40% reduksjon i binding for FcRIJA og FcRUB, Arg416 en 30% reduksjon for FcRIIA og FcRUIA, Gln419 en 30% reduksjon til FcRIJA og en 40% reduksjon til FcRUB, og Lys360 en 23% forbedring til FcRUIA. Se også Presta et al., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490.
For eksempel så beskriver US patentnr. 6 194 551 varianter med forbedret effekt og funksjon som inneholder mutasjoner i den humane IgG Fc-regionen, ved aminosyreposisjon 329, 331 eller 322 (ved å anvende Kabat-nummerering), noen av dem viser redusert Cl q-binding eller CDC-aktivitet. Som et annet eksempel så beskriver US patentnr. 6 737 056 varianter med forandret effektor eller Fc-y-reseptorbinding som inneholder mutasjoner i den humane IgG Fc-regionen, ved aminosyreposisjon 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 3373, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 eller 439 (ved å anvende Kabat-nummerering), noe vis reseptorbindingsprofiler assosiert med redusert ADCC eller CDC-aktivitet. Av disse så er en mutasjon ved aminosyreposisjon 238, 265, 269, 270, 327 eller 329 erklært å redusere binding til FcRI, en mutasjon ved aminosyreposisjon 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 eller 439 er erklært å redusere bindingen til FcRIJ, og en mutasjon ved aminosyreposisjon 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 eller 437 er erklært å redusere binding til FcRUI.
US patentnr. 5 624 821 rapporterer at Clq-bindingsaktivitet til et museantistoff kan forandres ved å mutere aminosyreresidier 318, 320 eller 322 i den tunge kjeden og at erstatning av residie 297 (Asn) resulterer i fjerning av lytisk aktivitet.
US søknad publikasjonsnr. 20040132101 beskriver varianter med mutasjoner ved aminosyreposisjoner 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 eller 332 (ved å anvende Kabat-nummerering) eller posisjoner 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 eller 332 (ved å anvende Kabat-nummerering), av disse så kan mutasjoner ved posisjoner 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 313, 325, 327, 328, 329, 330 eller 332 redusere ADCC-aktivitet eller å redusere binding til en Fc-y-reseptor.
Chappel et al., Proe. Nati Acad Sei USA 1991; 88(20):9036-40 rapporterer at cytofil aktivitet av IgGl er en indre egenskap av dets tungkjede CH2-domene. Enkle punktmutasjoner av enhver av aminosyreresidiene 234-237 i IgGl senket eller opphevet signifikant dets aktivitet. Substitusjon av alle IgGl-residier 234-237 (LLGG) til IgG2 og IgG4 var nødvendig for å gjenvinne full bindingsaktivitet. Et IgG2 antistoff som inneholder hele ELLGGP-sekvensen (residier 233-238) ble observert å være mer aktiv enn villtype IgGl.
Isaacs et al., J. Immunol. 1998; 161(8):3862-9 rapporterte at mutasjoner innen et motiv som er kritisk for Fc-y-R binding (glutamat 233 til prolin, leucin/fenylalanin 234 til valin og leucin 235 til alanin) hindret fullstendig atarming av målcellene. Mutasjonen glutamat 318 til alanin eliminerte effektorfunksjon av muse-IgG2b og reduserte også potensen av humant IgG4.
Armour et al., Mol. Immunol. 2003; 40(9):585-93, inkorporert ved referanse her i sin helhet, identifiserte IgGl-varianter som reagerer med den aktiverende reseptoren, Fc-y-RUa, med minst 10-ganger mindre effektivitet enn villtype IgGl, men hvis binding til den hemmende reseptoren, Fc-y-RUb bare er fire ganger redusert. Mutasjoner ble gjort i regionen med aminosyrer 233-236 og/eller aminosyreposisjoner 327, 330 og 331. Se også WO 99/58572.
Xu et al., J. Biol Chem. 1994:269(5):3469-74 rapporterte at å mutere IgGl Pro331 til Ser markert senket Clq-binding og eliminerte så å si lytisk aktivitet. I motsetning til dette så ga substitusjonen av Pro med Ser331 i IgG4 delvis lytisk aktivitet (40%) til IgG4 Pro331 varianten.
Schuurman et al., Mol Immunol. 2001;38(l):l-8 rapporterte at å mutere en av hengselcysteinene involvert i inter-tungkjede bindingsdannelsen, Cys226, til serin resulterte i en mer stabil inter-tungkjede binding. Å mutere den IgG4 hengselsekvensen Cys-Pro-Ser-Cys til IgGl hengselsekvensen Cys-Pro-Pro-Cys stabiliserte også merkbart den kovalente interaksjonen mellom de tunge kjedene.
Angal et al., Mol. Immunol. 1993; 30(1): 105-8 rapporterte at å mutere serinet ved aminosyreposisjonen 241 i IgG4 til prolin (funnet ved den posisjon i IgGl og IgG2) førte til fremstillingen av et homogent antistoff, så vel som å utvide halveringstiden i serum og å forbedre vevsdistribusjon sammenlignet med det opprinnelige kimere IgG4.
Human Engineered™ antistoffer
Human Engineered™
Human Engineered™ av antistoff variabeldomener er blitt beskrevet av Studnicka (se for eksempel Studnicka et al., US patentnr. 5 766 886; Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)) som en fremgangsmåte for å redusere immungenisitet mens bindingsaktiviteten av antistoffmolekylene opprettholdes. I henhold til fremgangsmåten så har hver variabel region aminosyre blitt ansett som en risiko for substitusjon. Aminosyresubstitusjoner skilles ved en av tre risikokategorier: (1) lavrisiko forandringer er de som har det største potensialet for å redusere immungenisitet med minst sjanse for å ødelegge antigenbinding; (2) moderate risikoforandringer er de som videre ville redusere immungenisitet, men som har hatt større sjanser for å påvirke antigenbinding eller proteinfolding; (3) høyrisiko residier er de som er viktige for å binde eller for å opprettholde antistoffstruktur eller som bærer den høyeste risikoen for at antigenbinding eller proteinfolding vil bli påvirket. På grunn av prolinenens rolle i den tredimensjonale strukturen så blir modifikasjoner ved proliner generelt betraktet å være minst moderat risikoforandringer, selv hvis posisjonen vanligvis er en lav risiko posisjon.
Variable regioner i de lette og tunge kjedene til et gnagerantistoff er Human Engineered™ som følger for å substituere humane aminosyrer ved posisjoner bestemt til å mest sannsynlig ikke alvorlig påvirke enten antigen binding eller proteinfoldning, men som sannsynligvis reduserer immungenisitet i et humant miljø. Aminosyreresidier som er ved "lav risiko" posisjoner og som er kandidater for modifikasjon i henhold til fremgangsmåten blir identifisert ved å oppstille aminosyresekvensene til gnagervariable regionene med en human variabel regionsekvens. Enhver human variabelregion kan anvendes, inkludert en individuell VH- eller VL-sekvens eller en human konsensus VH-eller VL-sekvens, eller en individuell eller konsensus human "germline" sekvens. Aminosyreresidiene ved ethvert antall av de lavrisiko posisjonene, eller ved alle lavrisiko posisjonene, kan forandres. Ved hver lavrisiko posisjon hvor de oppstilte muse- og humane aminosyreresidiene skiller seg, så blir for eksempel en aminosyremodifikasjon introdusert som erstatter gnagerresidiet med det humane residiet. Alternativt så kan aminosyreresidier ved alle de lavrisiko posisjonene og ethvert antall av de moderate risikoposisjonene forandres. Ideelt, for å oppnå den minste immungenisiteten så blir alle lav og moderat risikoposisj onene forandret fra gnager til human sekvens.
Syntetiske gener som inneholder modifiserte tunge- og/eller lette kjedevariable regioner blir konstruert og koblet til human y-tungkjede og/eller K-lettkjede konstantregioner. Enhver human tung kjede og lett kjede konstantregioner kan anvendes i kombinasjon med de Human Engineered™ antistoffvariable regionene, inkludert IgA (av enhver subklasse, slik som IgAl eller IgA2), IgD, IgE, IgG (av enhver subklasse, slik som IgGl, IgG2, IgG3 eller IgG4) eller IgM. De humane tung- og lett kjedegenene blir introdusert inn i vertsceller, slik som pattedyrceller, og de resulterende rekombinante immunglobulinproduktene blir skaffet tilveie ogkarakterisert.
Humane antistoffer fra transgene dyr
Humane antistoffer mot M-CSF kan også produseres ved å anvende transgene dyr som ikke har endogen immunglobulinproduksjon og som er konstruert til å inneholde humane immunglobulin loci. For eksempel så utgreier WO 98/24893 transgene dyr som har et humant Ig-lokus hvor dyret ikke produserer funksjonelle, endogene immunglobuliner på grunn av inaktiveringen av endogen tung- og lett kjede loci. WO 91/741 utgreier også transgene ikke-primat pattedyrverter som er i stand til å få en immunrespons mot et immunogen, hvor antistoffene har primat konstante og/eller variabelregioner og hvor det endogene immunglobulinkodende loci er substituert og inaktivert. WO 96/30498 utgreier anvendelsen av Cre/Lox-systemet for å modifisere immunglobulin lokuset i et pattedyr, som å erstatte hele eller en del av den konstante eller variable regionen for å danne et modifisert antistoffmolekyl. WO 94/02602 utgreier ikke humane pattedyrverter som har inaktivert endogent lg loci og funksjonelt lg loci. US patentnr. 5 939 598 utgreier fremgangsmåter for å lage transgene mus hvor musen mangler endogene tunge kjeder, og uttrykker et eksogent immunglobulin lokus som omfatter en eller flere xenogene konstante regioner.
Ved å anvende et transgent dyr som beskrevet over så kan en immunrespons produseres mot et valgt antigent molekyl, og antistoffproduserende celler kan fjernes fra dyret og anvendes for å produsere hybridomer som utskiller humane monoklonale antistoffer. Immuniseringsprotokoller, adjuvanter og lignende er kjent i fagfeltet og er anvendt i immunisering av for eksempel en transgen mus som beskrevet i WO 96/33735. Denne publikasjon utgreier monoklonale antistoffer mot en rekke antigene molekyler inkludert IL-6, IL-8, TNFoc, humant CD4, L-selektin, gp39 og tetanus toksin. De monoklonale antistoffene kan testes for evnen til å hemme eller nøytralisere den biologiske aktiviteten eller fysiologiske effekten av det korresponderende proteinet. WO 96/33735 utgreier at monoklonale antistoffer mot IL-8, utledet fra immunceller fra transgene mus immunisert med IL-8, blokkerte IL-8 induserte funksjoner av neutrofiler. Humane monoklonale antistoffer med spesifisitet for antigenet anvendt for å immunisere transgene dyr er også utgreiet i WO 96/34096 og US patent søknadsnr. 20030194404; og US patent søknadsnr. 20030031667).
Se også Jakobovits et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993); og US patentnr. 5 591 669, US patentnr. 5 589 369, US patentnr. 5 545 807 og US patent søknadsnr. 20020199213. US patent søknadsnr. og 20030092125 beskriver fremgangsmåten for bias immunresponsen til et dyr for den ønskede epitopen. Humane antistoffer kan også lages ved in v/7/*o-aktiverte B-celler (se US patentnr. 5 567 610 og 5 229 275).
Humane antistoffer fra fagdisplay teknologi
Utviklingen av teknologien for å lage repertoarer av rekombinante, humane antistoffgener, og visningen av de kodede antistoffragmentene på overflaten av filamentøs bakteriofag, har tilveiebrakt en måte for å lage humane antistoffer direkte. Antistoffene produsert ved fag-teknologi produsert som antigenbindende fragmenter - vanligvis Fv- eller Fab-fragmenter - i bakterier og mangler derfor effektorfunksjoner. Effektorfunksjoner kan introduseres ved en av to strategier: Fragmentene kan konstrueres enten inn i fullstendig antistoffer for uttrykk i pattedyrceller, eller inn i bispesifikke antistoffragmenter med et andre bindingssete som er i stand til å trigge en effektorfunksj on.
Vanligvis så blir Fd-fragmentet (Vr-CrI) og lett kjede (Vl-Cl) av antistoffer separat klonet ved hjelp av PCR og rekombinert tilfeldig i kombinatoriske fag-displaybiblioteker som så kan selekteres for binding til et bestemt antigen. Fab-fragmentene blir uttrykt på fag-overflaten, dvs. fysisk koblet til genene som koder for dem. Seleksjon av Fab ved antigen binding ko-selekterer dermed for Fab-kodende sekvenser, som så kan omformeres. Ved flere runder antigen binding og re-omformering, en prosedyre kalt panning, så blir Fab spesifikt for antigenet anriket og til slutt isolert.
11994 så ble en tilnærmingsmåte for humaniseringen av antistoffer, kalt "guidet seleksjon" beskrevet. Guidet seleksjon benytter kraften av fag-displayteknikken for humaniseringen av musemonoklonale antistoffer (se Jespers, L.S. et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). For dette så kan Fd-fragmentet til det muse-monoklonale antistoffet vises i kombinasjon med et humant lettkjede bibliotek, og det resulterende hybrid Fab-biblioteket kan så selekteres med antigen. Muse-Fd-fragmentet tilveiebringer dermed et templat for å guide seleksjonen. Deretter så blir de selekterte humane lettkjedene kombinert med et humant Fd-fragmentbibliotek. Seleksjon av det resulterende biblioteket gir fullstendig humant Fab.
En rekke prosedyrer er blitt beskrevet for å utlede humane antistoffer fra fag-display
biblioteker (se for eksempel Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); US patentnr. 5 565 332 og 5 573 905; Clackson, T. og Wells, J.A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). Spesielt så har in v/fro-seleksjon og
evolusjon av antistoffer utledet fra fag-display biblioteker blitt et kraftig verktøy (se Burton, D.R. og Barbas in, C.F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); og Winter, G. et al, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); US patent søknadsnr. 20020004215 og WO 92/01047; US patent søknadsnr. 20030190317 publisert 9. oktober, 2003 og US patentnr. 6 054 287; US patentnr. 5 877 293.
Watkins, "Screening of Phage-Expressed antibody Libraries by Capture Lift", Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, og US patent søknadsnr. 200120030044772 publisert 6. mars, 2003, beskriver fremgangsmåter for å screene fag-uttrykte antistoffbiblioteker eller andre bindingsmolekyler ved hjelp av "capture lift", en fremgangsmåte som involverer å immobilisere kandidatbindingsmolekylene på en fast støtte.
Antistoffproduktene kan screenes for aktivitet og for egnethet i
behandlingsfremgangsmåten beskrevet heri ved å anvende analyser som beskrevet i seksjonen kalt "screeningsfremgangsmåter" her, eller ved å anvende enhver passende analyse som er kjent i fagfeltet.
Andre kovalente modifikasjoner
Kovalente modifikasjoner av antistoffet er også inkludert innen omfanget av dennebeskrivelsen. De kan lages ved hjelp av kjemisk syntese eller ved enzymatisk eller kjemisk kløyving av antistoffet hvis det er egnet. Andre typer kovalente modifikasjoner av antistoffer blir introdusert inn i molekylet ved å la de målrettede aminosyresekvensene til antistoffet reagere med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å agere med valgte sidekjeder eller de N- eller C-terminale residiene.
Cysteinylresidier reagerer vanligst med a-haloacetater (og korresponderende aminer), slik som kloreddiksyre eller kloracetamid, til å gi karboksymetyl eller karboksyamidometylderivater. Cysteinylresidier derivatiseres også ved hjelp av reaksjon med bromtrifluoraceton, a-brom-P-(5-imidozoyl)propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmaleimider, 3-nitro-2-pyridyldisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuribenzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.
Histidylresidier derivatiseres også ved reaksjon med dietylpyrokarbonat ved pH 5,5-7,0 fordi dette middel er relativt spesifikt for histidyl sidekjeden. Para-bromfenacylbromid er også nyttig; reaksjonen blir helst utført i 0,1 M natriumkakodylat ved pH 6,0. Lysinyl og aminoterminale residier reagerer med suksinin eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse midler var effekten av å reversere ladningen av lysinylresidiene. Andre passende reagenser for derivatisering .oc.-amino-inneholdende residier inkluderer imidoestere slik som metylpikolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og trnasaminasekatalysert reaksjon med glyoksylat.
Arignylresidier modifiseres ved reaksjon med en eller flere konvensjonelle reagenser, blant dem fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-sykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av argininresidier krever at reaksjonen utføres i alkaliske betingelser på grunn av den høye pKatil den guanidinfunksjonelle gruppen. Videre så kan disse reagenser reagere med grupper med lysin så vel som den arginin-e-aminogruppen.
Den spesifikke modifikasjonen av tyrosylresidier kan lages, med spesiell interesse i å introdusere spektrale merkninger inn i tyrosylresidier ved reaksjon med aromatisk diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Mest vanlig så blir N-acetylimidizol og tetranitrometan anvendt til å danne henholdsvis O-acetyltyrosyldeler og 3-nitroderivater. Tyrosylresidier jodineres ved å anvende<125>I eller 13 *I til å lage merkede proteiner for anvendelse i radioimmunanalyse.
Karboksyl sidegrupper (aspartyl eller glutamyl) modifiseres selektivt ved reaksjon med karbodiimider (R-N.bdb.C.bdb.N-R') hvor R og R' er forskjellige alkylgrupper slik som l-sykloheksyl-3-(2-morfolinyl-4-etyl)karbodiimid eller l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre så blir aspartyl- og glutamylresidier omdannet til asparaginyl- og glutaminylresidier ved reaksjon med ammoniumioner.
Glutaminyl og asparaginylresidier blir ofte deamidert til de korresponderende, henholdsvis glutamyl og aspartaylresidier. Disse residier blir deamidert under nøytrale eller basiske betingelser. Den deamiderte formen til disse residier faller innen omfanget av denne beskrivelsen.
Andre modifikasjoner inkluderer hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksylgrupper av seryl eller treonylresidier, metylering av .a.-aminogrupper med lysin, arginin og histidin sidekjeder (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, s. 79-86 (1983)), acetylering av det N-terminale aminet og amidering av enhver C-terminal karboksylgruppe.
En annen type kovalent modifikasjon involverer kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til antistoffet. Disse prosedyrer er fordelaktige i at de ikke krever fremstilling av antistoffet i en vertscelle som har glykosyleringsmuligheter for N- eller O-koblet glykosylering. Avhengig av koblingsmåten som anvendes, så kan sukkere eller sukkerne festes til (a) arginin og histidin, (b) frie karboksylgrupper, (c) frie sulfhydrylgrupper slik som de i cystein, (d) frie hydroksylgrupper slik som de i serin, treonin og hydroksyprolin, (e) aromatiske residier slik som de i fenylalanin, tyrosin eller tryptofan eller (f) amidgruppen til glutamid. Disse fremgangsmåtene er beskrevet i WO 87/05330 publisert 11. september 1987 og i Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., s. 259-306 (1981).
Fjerning av enhver karbohydratdel som er tilstede i antistoffet kan utføres kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever eksponering av antistoffet til forbindelsen trifluormetansulfonsyre, eller en ekvivalent forbindelse. Denne behandling resulterer i kløyvingen av de fleste eller alle sukkerne unntatt koblingssukkere (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens antistoffet forblir intakt. Kjemisk deglykosylering er beskrevet i Hakimuddin, et al., Arch. Bochem. Biophys. 259: 52 (1987) og av Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981). Enzymatisk kløyving av karbohydratdeler på antistoffer kan oppnås ved anvendelsen av en rekke endo- og ekso-glykosidaser som beskrevet av Thotakura et al., Meth Enzymol. 138: 350 (1987).
En annen type ko valent modifikasjon av antistoffer omfatter å koble antistoffet til en av en rekke ikke-proteinaktige polymerer, for eksempel polyetylenglykol, propylenglykol, polyoksyetylerte polyoler, polyoksyetylert sorbitol, polyoksyetylert glukose, polyoksyetylert glyserol, polyoksyalkylener eller polysakkaridpolymerer slik som dekstran. Slike fremgangsmåter er kjent i fagfeltet, se for eksempel US patentnr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192, 4 179 337, 4 766 106, 4 179 337, 4 495 285, 4 609 546 eller EP 315 456.
Genterapi
Levering av et terapeutisk antistoff til passende celler kan utføres via genterapi ex vivo, in situ eller in vivo ved anvendelse av enhver passende tilnærmingsmåte kjent i fagfeltet, inkludert anvendelse av fysikalske DNA-overføringsfremgangsmåter (for eksempel liposomer eller kjemiske behandlinger) eller ved anvendelse av virale vektorer (for eksempel adenovirus, adenoassosierte virus eller et retrovirus). For in vzvo-terapi så kan for eksempel en nukleinsyre som koder for det ønskede antistoffet, enten alene eller sammen med en vektor, liposom eller presipitat injiseres direkte inn i individet, og så kan den injiseres ved stedet hvor uttrykket av antistofforbindelsen er ønsket. For ex vzvo-behandling så blir individets celler fjernet, nukleinsyren blir introdusert inn i disse celler og de modifiserte cellene blir returnert til individet enten direkte eller for eksempel innkapslet i porøse membraner som blir implantert inn i pasienten. Se for eksempel US patentnr. 4 892 538 og 5 283 187. Det er en rekke teknikker tilgjengelig for å introdusere nukleinsyrer inn i levende celler. Teknikkene varierer avhengig av om nukleinsyren overføres inn i dyrkede celler in vitro eller in vivo i cellene til den mente verten. Teknikker som er passende for overføringen av nukleinsyre til pattedyrceller in vitro inkluderer anvendelsen av liposomer, elektroporering, mikroinjeksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran og kalsiumfosfat presipitering. En vanlig anvendt vektor for ex vivo levering av en nukleinsyre er et retrovirus.
Andre in vivo nukleinsyre overføringsteknikker inkluderer transfeksjon med virale vektorer (slik som adenovirus, herpes simplex 1 virus eller adeno-assosierte virus) og lipidbaserte systemer. Nukleinsyren og transfeksjonsmiddelet blir valgfritt assosiert med en mikropartikkel. Eksempler på transfeksjonsmidler inkluderer kalsiumfosfat eller kalsiumklorid kopresipitering, DEAE-dekstranstyrt transfeksjon, kvarternær ammonium amfifil DOTMA ((dioleoyloksypropyl)trimetylammoniumbromid, kommersialisert som lipofektin av Gibco-BRL)) (Felgner et al, (1987) Proe. Nati. Acad. Sei, USA 84, 7413-7417; Malone et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei., USA 86 6077-6081); lipofile glutamat diestere med uthengende trimetylammoniumhoder (Ito et al.
(1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 123-132); metaboliserbare foreldrelipider slik som det kationiske lipid dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam, Promega) og dipalmitoylfosfatidletanolamylspermin (DPPES) (J.P. Behr (1986) Tetrahedron lett. 27, 5861-5864; J.P. Behr et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei., USA 86, 6982-6986); metaboliserbare, kvarternære ammoniumsalter (DOTB, N-(l-[2,3-dioleoyloksy]propyl)-N,N,N-trimetylammoniummetylsulfat (DOTAP) (Boehringer Mannheim), polyetylenimin (PEI), dioleoylestere, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3p[N-(N',N'-dimetylaminoetan)-karbamoyl]kolesterol (DC-Chol), dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE)/3p[N-(N',N'-dimetylaminoetan)-karbamoyl]kolesterolDC-Chol i en til en blanding (Gao et al.,
(1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), spermin, spermidin, lipopolyaminer (Behr et al., Bioconjugate Chem., 1994, 5: 382-389), lipofile polylysiner (LPLL) (Zhou et al.,
(1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), [[(l,l,3,3-tetrametylbutyl)kre-soksy]etoksy]etyl]dimetylbenzylammoniumhydroksid (DEBDA hydroksid) med overskudd fosfatidylcholin/kolesterol (Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB)/DOPE-blandinger (Pinnaduwage et al,
(1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), lipofil diester av glutaminsyre (TMAG) med DOPE, CTAB, DEBDA, didodecylammoniumbromid (DDAB) og stearylamin i blanding med fosfatidyletanolamin (rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DD AB/DOPE (TransfectACE, Gibco BRL) og oligogalaktosebærende lipider. Eksempler på transfeksjonsforsterkningsmidler som øker effektiviteten av overføring inkluderer for eksempel DEAE-dekstran, polybren, lysosomforstyrrende peptid (Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun, 27. juni, 1997; 235(3):726-9), kondroitanbaserte proteoglykaner, sulfaterte proteoglykaner, polyetylenimin, polylysin (Pollard H et al., J Biol. Chem, 1998 273 (13):7507-11), integrinbindende peptid CYGGRGDTP, lineær dekstrannonasakkarid, glyserol, kolesterylgrupper bundet ved den 3'-terminale internukleosidkoblingen av et oligonukleotid (Letsinger, R.L. 1989 Proe Nati Acad Sei USA 86: (17):6553-6), lysofosfatid, lysofosfatidylcholin, lysofosfatidyletanolamin og 1-oleoyllysofosfatidylcholin.
I noen situasjoner så kan det være ønskelig å levere nukleinsyren med et middel som dirigerer den nukleinsyreinneholdende vektoren til målcellene. Slike "målrettings" molekyler inkluderer antistoffer som er spesifikke for en celleoverflatemembranprotei n på målcellen eller en ligand for en reseptor på målcellen. Der hvor liposomer benyttes, så kan proteiner som binder seg til et celleoverflate membranprotein assosiert med endocytose anvendes for målretting og/eller for å fasilitere opptak. Eksempler på slike proteiner inkluderer kapsidproteiner og fragmenter av dem tropik for en bestemt celletype, antistoffer for proteiner som gjennomgår internalisering i syklering og proteiner som målretter intracellulær lokalisering og forsterker intracellulær halveringstid. Alternativt så kan reseptorstyrt endocytose anvendes. Slike fremgangsmåter er for eksempel beskrever i Wu et al., 1987 eller Wagner et al., 1990. For oversikt over de nåværende kjente genmerking og genterapi protokoller se Anderson 1992. Se også WO 93/25673 og referanser sitert der. For tilleggsoversikter over genterapi teknologi, seFridmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, supplement til vol. 392, nr. 6679, s. 25-30 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); og Miller, Nature, 357: 455460 (1992).
Screeningsfremgangsmåter
Effektive, terapeutika er avhengig av å identifisere virksomme midler som ikke har signifikant toksisitet. Antistoffer kan screenes for bindingsaffinitet ved hjelp av fremgangsmåter kjent i fagfeltet. For eksempel så kan gelskift analyser, Western blott, radioaktivt merket konkurranseanalyse, ko-fraksjonering ved hjelp av kromatografi, ko presipitering, krysskobling, ELISA og lignende anvendes, som for eksempel er beskrevet i Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY.
For initielt å screene for antistoffer som binder seg til den ønskede epitopen på M-CSF (for eksempel de som blokkerer binding av RX1, 5H4, MCI og/eller MC3 til M-CSF), så kan en rutine kryssblokkerende analyse slik som den som er beskrevet i Antibodies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane
(1988) utføres. Rutine konkurranse bindingsanalyser kan også anvendes, hvor det ukjente antistoffet blirkarakterisert veddets evne til å hemme binding av M-CSF til M-CSF-spesifikt antistoff som her beskrevet. Intakt M-CSF, fragmenter av det, eller lineære epitoper slik som representert ved aminosyrene 98-105 i M-CSF i Figur 12, eller aminosyrer 65-73 eller 138-144 i Figur 12 (som korresponderer til M-CSF epitoper gjenkjent av 5H4 eller MC3), kan anvendes. Epitopkartlegging er beskrevet i Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).
Det blir videre overveid at antistoffene deretter testes for deres effekt på osteoklastogenese, etterfulgt av administrering til dyrene. Forbindelser som potensielt er nyttige i å forhindre eller behandle bentap assosiert med cancermetastase kan screenes ved å anvende forskj elige analyser. For eksempel så kan en kandidat antagonist først karakteriseres i et dyrket cellesystem for å bestemme dets evne til å nøytralisere M-CSF i å indusere osteoklastogenese. Et slikt system kan inkludere samtidig dyrking av muse kalvariale osteoblaster og miltceller (Suda et al., Modulation of osteoclast differentiation. Endocr. Rev. 13: 66 80, 1992; Martin og Udagawa, Trands Endocrinol. Metab. 9: 6-12, 1998), samtidig-dyrkningen av musestromale cellelinjer (for eksempel MC3T3-G2/PA6 og ST2) og muse miltceller (Udagawa et al., Endocrinology 125: 1805 13, 1989) og samtidig dyrking av ST2-celler og benmargsceller, perifere blodmononukleære celler eller alveolære makrofater (Udagawa et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA 87: 7260 4,1990; Sasaki et al, Cancer Res. 58: 462 7, 1998; Mancino et al., J. Surg. Res. 100: 18-24, 2001). I fraværet av enhver M-CSF-antagonist så tilfredsstiller multikjernede celler dannet I slike samtidig-kulturer hovedkriterier for osteoklaster slik som tartratresistent sur fosfatase (TRAP, et markørenzym for osteoklaster) aktivitet, kalsitoninreseptorer, p60C-STC, vitronektin reseptorer og evnen til å danne resorpsjonspit på ben og tannbenskiver. Tilstedeværelsen av en effektiv M-CSF-antagonist hemmer dannelsen av slike multikjernede celler.
I tillegg til de ovenfor nevnte samtidig dyrkningssystemene, så kan evnen et kandidat M-CSF-antistoff har til å hemme osteoklastogenesen undersøkes i en stromal cellefritt eller osteoblastfritt system. M-CSF et som er nødvendig for osteoklastogenesen kan tilveiebringes ved samtidig dyrkede metastatiske cancerceller (for eksempel MD A 231) eller kondisjonert medium fra disse cancerceller (Mancino et al., J. Surg. Res. 0: 18-24, 2001) eller ved tilsetting av renset M-CSF.
Evnen et gitt M-CSF-antistoff har til å forebygge eller å behandle bentap assosiert med cancermetastase kan også testes i ethvert av dyreben metastasemodellsystemene som er familiære for fagfolk. Slike modellsystemer inkluderer de som involverer direkte injeksjon av tumorceller inn i den medullare hule til ben (Ingall, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 117: 819-22, 1964; Falasko, Clin. Orthop. 169: 20 7, 1982), inn i rotteabdominale aorta (Powles et al., Br. J. Cancer 28: 316 21, 1973), inn i den muselatterale halevenen eller inn i den muse venstre ventrikkelen (Auguello et al., Cancer Res. 48: 6876 81, 1988). I fraværet av en effektiv M-CSF-antagonist, så kan osteolytiske benmetastaser dannet fra injiserte tumorceller bestemmes ved hjelp av radiografer (områder for osteolytiske benlesjoner) eller histologi og immunhistokjemi (ben eller mykt vev). Sasaki et al., Cancer Res. 55: 3551 7,1995; Yoneda et al., J. Clin. Invest. 99: 2509 17, 1997. Clohisy og Ramnaraine, Orthop Res. 16: 660 6, 1998. Yin et al., J. Clin. Invest. 103: 197 206, 1999. I fraværet av et effektivt M-CSF antistoff, så kan osteolytiske benmetastaser forhindres, eller hemmes og resultere i færre og/eller mindre metastaser.
M-CSF-antistoffene i den foreliggende beskrivelsen kan også være nyttige i å forebygge eller å behandle cancermetastaser. Effektiviteten til en kandidat M-CSF-antistoff i å forebygge eller å behandle cancermetastaser kan screenes ved å anvende en human amnion fundament membraninvasjonsmodell som beskrevet i filderman et al., Cancer Res 52: 366616, 1992. I tillegg så kan ethvert av dyremodellsystemene for metastase for forskjellig typer cancer også anvendes. Slike modellsystemer inkluderer, men er ikke begrenset til de som er beskrevet i Wenger et al, Clni. Exp. Metastasis 19: 169 73, 2002; Yi et al., Cancer Res. 62: 917 23, 2002; Tsutsumi et al., Cancer Lett 169: 77-85, 2001; Tsingotjidou et al., Anticancer Res. 21: 971 8, 2001; Wakabayashi et al, Oncology 59: 75 80, 2000; Culp og Kogerman, Front Biosci. 3:D672 83, 1998; Runge et al., Invest Radio. 32: 212 7; Shioda et al, J. Surg. Oncol. 64: 122 6, 1997; Ma et al., Invest Ophthalmol Vis Sei. 37: 2293 301, 1996; Kuruppu et al., J Gastroenterol Hepatol. 11: 26 32,1996. I nærværet av et effektivt M-CSF-antistoff så kan cancermetastaser forhindres, eller hemmes og resultere i færre og/eller mindre metastaser.
Anti-tumoraktiviteten til en bestemt M-CSF-antistoff, eller kombinasjon av M-CSF-antistoffer, kan evalueres in vitro ved å anvende en passende dyremodell. For eksempel xenogene lymfoma cancermodeller hvor humane lymfomaceller blir introdusert inn i immune kompromiserte dyr, slik som nakne eller SCID-mus. Effektiviteten kan forutsi ved å anvende analyser som måler hemming av tumordannelse, tumorregresjon eller metastase og lignende.
I en variasjon av en in vz£ro-analyse så inkluderer beskrivelsen en fremgangsmåte som omfatter trinnene
(a) å la et immobilisert M-CSF komme i kontakt med et kandidatantistoff og (b) å detektere bindingen av kandidat antistoffet til M-CSF. Alternativt kan kandidatantistoffet være immobilisert og binding av M-CSF blir detektert. Immobilisering utføres ved å anvende enhver av fremgangsmåtene som er velkjente i fagfeltet, inkludert ko valent binding til en støtte, en kule eller en kromatografisk resin, så vel som ikke-kovalent, høy affinitet interaksjon slik som antistoffbinding, eller anvendelse av streptavidin/biotinbinding hvor den immobiliserte forbindelsen inkluderer en biotindel. Deteksjon av binding kan utføres (i) ved å anvende et radioaktivt merket stoff på forbindelsen som ikke er immobilisert, (ii) ved å anvende en fluorescernede merking på den ikke-immobiliserte forbindelse, (iii) ved å anvende et antistoff som er immunspesifikt for den ikke-immobiliserte forbindelsen, (iv) ved å anvende en merking på den ikke-mobiliserte forbindelsen som eksiterer en fluorescerende støtte som den immobiliserte forbindelsen er festet til, så vel som andre teknikker som er velkjent og rutinemessig praktisert i fagfeltet.
Antistoffer som modulerer (dvs. øker, senker eller blokkerer) aktiviteten eller uttrykket av M-CSF kan identifiseres ved å innkubere en potensiell modulator med en celle som uttrykker M-CSF og å bestemme effekten av den potensielle modulatoren på aktiviteten eller uttrykket av M-CSF. Selektiviteten til et antistoff som modulerer aktiviteten av et M-CSF polypeptid eller polynukleotid kan evalueres ved å sammenligne dets effekt på M-CSF polypeptidet eller polynukleotidet til dens effekt på andre relaterte forbindelser. Selektive modulatorer kan for eksempel inkludere antistoffer og andre proteiner, peptider eller organiske molekyler som spesifikt binder seg til M-CSF polypeptider eller til en nukleinsyre som koder for et M-CSF-polypeptid. Modulatorer av M-CSF-aktivitet vil terapeutisk være nyttig i behandling av sykdommer eller fysiologiske tilstander hvor normal eller avvikende aktivitet av M-CSF-polypeptid er involvert.
Beskrivelsen omfatter også høy kapsitetsscreening (HTS) analyser for å identifisere antistoffer som interagerer med eller hemmer biologisk aktivitet (dvs. hemmer enzymatisk aktivitet, bindingsaktivitet osv.) av et M-CSF-polypeptid. HTS-analyser tillater screening av et stort antall forbindelser på en effektiv måte. Cellebaserte HTS-systemer blir overveid for å undersøke interaksjonen mellom M-CSF-polypeptider og deres bindingspartnere. HTS-analyser er designet for å identifisere "treff eller "ledeforbindelser" som har den ønskede egenskapen, som modifikasjonene kan designes fra for å forbedre den ønskede egenskapen. Kjemisk modifikasjon av "treffet" eller "ledeforbindelsen" er ofte basert på et identifiserbart struktur/aktivitetsforhold mellom "treffet" og M-CSF-polypeptidene.
Et annet aspekt i den foreliggende beskrivelse er rettet mot fremgangsmåter for å identifisere antistoffer som modulerer (dvs. minker) aktivitet av en M-CSF som omfatter å la et M-CSF komme i kontakt med et antistoff og å bestemme om antistoffet modifiserer aktivitet til M-CSF et. Aktiviteten i nærvær av test-antistoffet sammenlignes med aktiviteten i fraværet av test-antistoffet. Der hvor aktiviteten av prøven som inneholder test-antistoffet er lavere enn aktiviteten i prøven som mangler test-antistoffet, så vil antistoffet ha hemmende aktivitet.
En rekke heterologe systemer er tilgjengelige for funksjonell ekspresjon av rekombinante polypeptider som er velkjent for fagfolk. Slike systemer inkluderer bakterier (Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98), gjær (Pausch, Trend in Biotechnology (1997) 15:487-494), flere typer insektsceller (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:189-268), amfibie celler (Jayawickreme et al., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8: 629-634) og flere pattedyr cellelinjer (CHO, HEK293, COS etc, se Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology (1997) 334: 1-23). Disse eksempler utelukker ikke anvendelsen av andre mulige celleuttrykkssystemer, inkludert cellelinjer skaffet tilveie fra nematoder (PCT-søknad WO 98/37177).
Også beskrevet her er fremgangsmåter for å screene etter antistoffer som modulerer aktiviteten av M-CSF å la testantistoffet komme i kontakt med et M-CSF polypeptid og å undersøke tilstedeværelsen av et kompleks mellom antistoffet og M-CSFet. I slike analyser så er liganden vanligvis merket. Etter passende innkubering så blir fri ligand separert fra den som er tilstede i bundet form og mengden av fri eller ikke-kompleksert merking er et mål for evnen et bestemt antistoff har til å binde seg til M-CSF eller M-CSFR polypeptidet.
Høy kapasitetscreening for antistoffragmenter eller CDRer som har passende bindingsaffinitet til et M-CSF-polypeptid kan bli benyttet. I korthet så blir et stort antall forskjellige peptid testforbindelser syntetisert på et fast substrat. Peptidtest antistoffene blir satt i kontakt med et M-CSF-polypeptid og vasket. Bundne M-CSF-polypeptider blir så detektert ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjent i fagfeltet. Rensede polypeptider ifølge beskrivelsen kan også overtrekkes direkte på plater for anvendelse i de tidligere nevnte medikamentscreeningsteknikkene. I tillegg kan ikke-nøytraliserende antistoffer anvendes for å fange proteinet og å immobilisere det på den faste støtten.
Kombinasjonsterapi
Å ha identifisert mer enn et M-CSF-antistoff som er effektivt i en dyremodell så kan det videre være fordelaktig å blande to eller flere slike M-CSF-antistoffer sammen for å tilveiebringe enda mer forbedret effektivitet mot cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase. Sammensetningen som omfatter et eller flere M-CSF-antistoffer kan administreres til personer eller pattedyr som lider av eller som er predisponert til å lide av, cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase. Samtidig administrering av to terapeutiske midler krever ikke at midlene administreres samtidig eller via den samme ruten, så lenge det er en overlapp i tidsperioden som midlene utøver deres terapeutiske effekt i løpet av. Samtidig eller sekvensiell administrering blir overveid, det samme er administrering på forskjellige dager eller uker.
Selv om M-CSF-antistoffterapi kan være nyttig for alle trinn i cancere, så kan antistoffterapi være spesielt passende i langt fremskreden eller metastatiske cancere. Å kombinere antistoffterapi fremgangsmåten så kan en kjemoterapeutisk eller strålingskur være ønskelig i pasienter som ikke har mottatt kjemoterapeutisk behandling, mens behandling med antistoffterapien kan indikeres for pasienter som har mottatt en eller flere kjemoterapier. I tillegg kan antistoffterapi også muliggjøre anvendelsen av reduserte doser av samtidig kjemoterapi, spesielt i pasienter som ikke tolererer toksisiteten til det kjemoterapeutiske middelet godt.
Administreringen av enkelt anti-M-CSF-antistoffer, så vel som kombinasjoner eller "cocktailer" av forskjellige antistoffer er her beskrevet. Slike antistoff-cocktailer kan ha visse fordeler, for så vidt som de inneholder antistoffer som utnytter forskjellig effektormekanismer eller kombinerer direkte cytotoksiske antistoffer med antistoffer som baserer seg på immuneffektor funksjonaliteten. Slike antistoffer i kombinasjon kan utvise synergistiske terapeutiske effekter.
Å kombinere RX1 eller Human Engineered™ derivat av RX1-antistoff med andre terapeutika kan ha en effekt på en pasient som har osteoklastisk sykdom og/eller tumorvekst eller metastase. For eksempel så kunne man anvende RX1-antistoff til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som har en osteolytisk sykdom hvor nevnte medikament er koordinert med behandling som anvender et anti-RANKL antistoff, løselig RANKL-reseptor, andre RANKL-hemmere eller bisfosfonater (for eksempel Aredia; Zometa; Clodronat). Alternativt kunne man anvende et anti-RANKL-antistoff eller bisfosfonat til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som har en osteolytisk sykdom hvor nevnte medikament er koordinert med behandling som anvender RX1-antistoff eller humant konstrurert derivat av RX1-antistoffet. Kombinasjonen kan også ha en synergistisk effekt i en behandlet pasient. RX1-antistoffet og andre terapeutika trenger ikke administreres samtidig. RX1 eller den humant konstruerte variant eller de andre terapeutika kan administreres innen 1 dag, 1 uke, 2 uker, 4 uker, 2 måneder, 3 måneder, 6 måneder, 1 år eller 2 år av hverandre.
det er også beskrevet anvendelse av et RX1-antistoff eller et Human Engineered™ derivat av RX1-antistoff til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som har en osteolytisk sykdom hvor nevnte medikament anvendes i en pasient som her blitt forhåndsbehandlet med et anti-RANKL-antistoff eller bisfosfonater. "Forhåndsbehandling" betyr at en pasient har blitt behandlet innen 2 år, 1 år, 6 måneder, 3 måneder, 2 måneder, 1 måned, 2 uker, 1 uke eller minst 1 dag før behandling med RX1 eller Human Engineered™ variant av RX1.
RX1-antistoff eller Human Engineered™ varianter kan anvendes i kombinasjon med andre cancerterapeutika. For eksempel så kan man anvende RX1-antistoff eller humant konstruerte varianter til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som cancersykdom, hvor nevnte medikament er koordinert med behandling ved å anvende andre terapeutiske midler og/eller prosedyrer, inkludert, men ikke begrenset til forskjellige kjemoterapeutiske midler, androgenblokkere, og immunmodulatorer (for eksempel IL-2, GM-CSF, SLC), bisfosfonat(er) (for eksempel Aredia; Xometa; Clodronat), kirurgi, stråling, cytotoksisk kjemoterapi, hormonterapi (for eksempel tamoxifen; anti-androgen terapi), antistoff terapi (for eksempel antistoffer mot RANKL/RANK-nøytralisering; PTHrP-nøytralisering, anti-Her2, anti-CD20, anti-CD40, CD22, VEGF, IGFR-1, EphA2, HAAH, TMEFF2, CALX-antistoffer), terapeutisk proteinterapi (for eksempel løselig RANKL-reseptor; OPG og PDGF og MMP-hemmere), små molekylmedikamentterapi (for eksempel Src-kinasehemmer), kinasehemmere av vekstfatorreseptorer eller RANKL-hemmere, oligonukleotidterapi (for eksempel RANKL eller RANK eller PTHrP anti-sense), genterapi (for eksempel RANKL eller RANK-hemmere), peptidterapi (for eksempel muteiner av RANKL) så vel som de proteiner, peptider, forbindelser og små molekyler beskrevet her.
RX1 og Human Engineered™ varianter kan anvendes til fremstilling av et medikament for å behandle pasienter som er forhåndsbehandlet med de ovenfor nevnte terapeutikaene.
Et cytotoksisk middel refererer til en substans som hemmer eller forhindrer funksjon av celler og/eller forårsaker destruksjon av celler. Uttrykket er ment å inkludere radioaktive isotoper (for eksempel I131,11<25>, Y<9>0og Re<186>), kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som enzymatisk aktive toksiner av bakterier, sopp, plante eller dyreopprinnelse eller syntetiske toksiner, eller fragmenter av det. Et ikke-cytotoksisk middel refererer til en substans som ikke hemmer eller forhindrer fusjonen av celler og/eller forårsaker destruksjon av celler. Et ikke-cytotoksisk middel kan inkludere et middel som kan aktiveres til å være cytotoksisk. Et ikke-cytotoksisk middel kan inkludere en kule, liposom, matriks eller partikkel (se for eksempel US patentpublikasjoner 2003/0028071 og 2003/0032995). Slike midler kan være konjugert, koblet, bundet eller assosiert med et antistoff ifølge beskrivelsen.
Cancerkjemoterapeutiske midler inkluderer uten begrensning, alkylerende midler, slik som karboplatin og cisplatin; nitrogen sennepalkylerende midler; nitrosoureaalkylerende midler, slik som karmustin (BCNU); antimetabolitter slik som metotreksat; folinsyre; purinanalog antimetabolitter, merkaptopurin; pyrimidin analog antimetabolitter slik som fluoruracil (5-FU) og gemcitabin (Gemzar®); hormonelle antineoplastika slik som goserelin, leuprolid og tamoksifen; naturlige antineoplastika slik som aldesleukin, interleukin-2, docetaxel, etoposid (VP-16), interferon-oc, paclitaxel
(Taxol®) og tretinoin (ATRA); antibiotiske, naturlige antineoplastika slik som bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, doksorubicin, daunomycin og mitomyciner inkludert mitomycin C; og vinca alkaloide naturlige antineoplastika slik som vinblastin, vinkristin, vindesin; hydroksyurea; aceglaton, adriamycin, ifosfamid, enocitabin, epitiostanol, aklarubicin, ancitabin, nimustin, prokarbazinhydroklorid, karboquon, karboplatin, karmofur, kromomycin A3, antitumor polysakkarider, antitumor blodplate faktorer, syklofosfamid (Cytoxin®), schizophyllan, cytarabin (cytosinarabinosid), dakarbazin, tioinosin, tiotepa, tegafur, dolastatiner, dolastatinanaloger slik som auristatin, CPT-11 (irinotekan), mitozantron, vinorelbin, teniposid, aminopterin, karminomycin, esperamiciner (se for eksempel US patentnr. 4 675 187), neokarzinostatin, OK-432, bleomycin, furtulon, broksuridin, busulfan, hon van, peplomycin, bestatin (Ubenimex®), interferon-P, mepitiostan, mitobronitol, melfalan, lamininpeptider, lentinan, Coriolus versicolor-ekstrakt, tegafur/uracil, estramustin (østrogen/mekloretamin).
Videre så inkluderer tilleggsmidler anvendt som terapi for cancerpasienter EPO, G-CSF, ganciklovir; antibiotika, leuprolid; meperidin; zidovudin (AZT); interleukiner 1 til 18, inkludert mutanter og analoger; interferoner eller cytokiner slik som interferon-oc, P og y, hormoner slik som luteiniserende hormonfrigjørende hormon (LHRH) og analoger og gonadotropinfrigj ørende hormon (GnRH); vekstfaktorer slik som transformerende vekstfaktor-p (TGF-p), fibroblast vekstfaktor (FGF), nervevekstfaktor (NGF), veksthormonfrigjørende faktor (GHRF), epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblast vekstfaktor homolog faktor (FGFHF), hepatocytt vekstfaktor (HGF) og insulin vekstfaktor (IGF); tumornekrosefaktor-a og P (TNF-a og P); invasjonshemmende faktor 2 (IIF-2); benmorfogene proteiner 1-7 (BMP 1-7); somatostatin; tymosin-a-1; y-globulin; superoksid dismutase (SOD); komplementfaktorer; anti-angiogenesefaktorer; antigene materialer og pro-medikamenter.
Promedikament refererer til en forløper eller derivatform av en farmasøytisk aktiv
substans som er mindre cytotoksisk eller ikke-cytotoksisk for tumorceller sammenlignet emd foreldremedikamentet og som er i stand til å bli enzymatisk aktivert eller omdannet til en aktiv eller den mer aktive foreldreformen. Se for eksempel Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, s. 375-382, 615. Meeting in Belfast (1986) og Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Target5ed Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (red.), s. 247-267, Humana Press
(1985). Promedikamenter inkluderer, men er ikke begrenset til, fosfatinneholdende promedikamenter, tiofosfatinneholdende promedikamenter, sulfatinneholdende promedikamenter, peptidinneholdende promedikamenter, D-aminosyremodifiserte promedikamenter, glykosylerte promedikamenter, p-laktaminneholdende promedikamenter, valgfritt substituerte fenoksyacetamidinneholdende promedikamenter eller valgfritt substituerte fenylacetamidinneholdende promedikamenter, 5-fluorcytosin og andre 5-fluoruridinpromedikamenter som kan omdannes til de mer aktive cytotoksiske frie medikamenter. Eksempler på cytotoksiske medikamenter som kan utledes til en promedikament for anvendelse her inkluderer, men er ikke begrenset til de kjemoterapeutiske midlene som er beskrevet over.
Administrering og tillaging
Anti-M-CSF-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan formuleres til farmasøytiske sammensetninger som omfatter en bærer som er passende for den ønskede leveringsfremgangsmåten. Passende bærere inkluderer ethvert material som når det kombineres med anti-M-CSF-antistoffene, bevarer anti-tumorfunksjonen av antistoffet og som ikke reagerer med individets immunsystemer. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til enhver av en rekke standard farmasøytiske bærere slik som sterile fosfatbufrede saltvannsløsninger, bakteriostatisk vann og lignende. En rekke vandige bærere kan anvendes, for eksempel vann, bufret vann, 0,4% saltløsning, 0,3% glysin og lignende, og kan inkludere andre proteiner for forsterket stabilitet, slik som albumin, lipoprotein, globulin osv., som er blitt kjemisk modifiserte eller lignende.
Terapeutiske formuleringer av antistoffet lagret for lagring ved å blande antistoffet som har den ønskelig graden av renhet med valgfrie fysiologisk akseptable bærere, hjelpestoffer og stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A., red. (1980)), i formen av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, hjelpemidler eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottagerne ved doseringene og konsentrasjonene som benyttes, og inkluderer buffere som fosfat, citrat og andre organiske syrer; antioksidanter inkludert askorbinsyre og metionin; konserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid; heksametoniumklorid; benzalkoniumklorid, benzetioniumklorid; fenol, butyl eller benzylalkohol; alkylparabener slik som metyl eller propylparaben; katekol; resorkinol; sykloheksanol; 3-pentanol; og m-kresol); lav molekylvekt (mindre enn 10 residier) polypeptider; proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner; hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner; chelaterende midler slik som EDTA; sukkere slik som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol; saltdannende motioner slik som natrium; metallkomplekser (for eksempel Zn-proteinkomplekser); og/eller ikke-ioniske overflateaktive stoffer slik som TWEEN™, PLURONICS™ eller polyetylenglykol (PEG).
Formuleringen her kan også inneholde mer enn en aktiv forbindelse hvis det er nødvendig for den bestemte indikasjonen som skal behandles, helst de med komplementære aktiviteter som ikke alvorlig påvirker hverandre. For eksempel så kan det være ønskelig å videre tilveiebringe et immunsuppressivt middel. Slike molekyler er passende tilstede i kombinasjon i mengder som er effektive for det mente formålet.
De aktive ingrediensene kan også fanges i mikrokapsler laget for eksempel ved koacerveringsteknikker eller ved hjelp av grenseflate polymerisering, for eksempel ved henholdsvis hydroksymetylcellulose eller gelatin-mikrokapsel og poly-(metylmetacylat) mikrokapsel, i kolloidale medikament leveringssystemer (for eksempel liposomer, albumin mikrosfærer, mikroemulsjoner, nano-partikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er utgreiet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osl, A., red. (1980).
Formuleringene som skal anvendes for in vzvo-administrering må være sterile. Dette oppnås lett ved filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner.
Antistoffet blir administrert på passende måter, inkludert parenteral, subkutan, intraperitoneal, intralunge og intranasal, og hvis det er ønskelig for lokal behandling, intralesjonal administrering. Parentrale infusjoner inkluderer intravenøs, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulær, intradermal eller subkutan administrering. I tillegg så kan antistoffet lett administreres ved hjelp av pulsinfusjon, spesielt med synkende doser av antistoffet. Helst så blir doseringen gitt ved injeksjoner, mest ønskelig intravenøse eller subkutane injeksjoner, avhengig delvis av om administreringen er kort eller kronisk. Andre administreringsfremgangsmåter ble overveid, inkludert topikal, spesielt transdermalt, transmukusal, rektal, oral eller lokal administrering, for eksempel gjennom et kateter plassert nær det ønskede stedet.
Sammensetninger i den foreliggende oppfinnelsen kan være i formen av for eksempel granulater, pulvere, tabletter, kapsler, sirup, stikkpiller, injeksjoner, emulsjoner, eliksierer, suspensjoner eller løsninger. De foreliggende sammensetningene kan formuleres for forskjellige administreringsruter, for eksempel ved oral administrering, ved nasal administrering, ved rektal administrering, subkutan injeksjon, intravenøs injeksjon, intramuskulære injeksjoner eller intraperitoneal injeksjon. De følgende doseringsformene ble gitt som eksempel og bør ikke betraktes som begrensende for den foreliggende oppfinnelsen.
For oral, bukal og sublingual administrering, så er pulvere, suspensjoner, granulater,
tabletter, piller, kapsler, gelkapsler og små kapsler akseptable som faste doseringsformer. Disse kan lages for eksempel ved å blande en eller flere forbindelser i den foreliggende oppfinnelse, eller farmasøytisk akseptable salter eller tautomerer av den, med minst en tilsetning slik som en stivelse eller annen tilsetning. Passende tilsetninger er sukkrose, laktose, cellulosesukker, mannitol, maltitol, dekstran, stivelse, agar, alginater, chitiner, chitosaner, pektiner, tragakant gummi, arabisk gummi, gelatiner, kollagener, kasein, albumin, syntetiske eller semi-syntetiske polymerer eller glyserider. Valgfritt så kan orale doseringsformer inneholde andre ingredienser for å hjelpe til med administrering, slik som en inaktiv fortynner, eller smøremidler slik som magnesiumstearat eller konserveringsmidler slik som paraben eller sorbinsyre, eller anti-oksidanter slik som askorbinsyre, tokoferol eller cystein, et disintegreringsmiddel, bindere, fortykkere, buffere, søtningsstoffer, smaksstoffer eller luktemidler. Tabletter og piller kan videre behandles med passende overtrekksmaterialer som er kjent i fagfeltet.
Flytende doseringsformer for oral administrering kan være i formen av farmasøytisk
akseptable emulsjoner, siruper, eliksirer, suspensjoner og løsninger, som kan inneholde en inaktiv fortynner slik som vann. Farmasøytiske formuleringer og medikamenter kan lages som flytende suspensjoner eller løsninger ved å anvende en steril væske slik som, men ikke begrenset til, en olje, vann, en alkohol eller kombinasjoner av disse. Farmasøytisk passende overflateaktive stoffer, suspenderingsmidler, emulgeringsmidler kan tilsettes for oral eller parenteral administrasjon.
Som nevnt over så kan suspensjoner inneholde oljer. Slik olje inkluderer, men er ikke begrenset til peanøttolje, sesamolje, bomullsfrøolje, maisolje eller olivenolje. Suspensjonspreparat kan også inneholde estere av fettsyrer slik som etyloleat, isopropylmyristat, fettsyreglyserider og acetylerte fettsyreglyserider. Suspensjonsformuleringer kan inkludere alkoholer slik som, men ikke begrenset til, etanol, isopropylalkohol, heksadecylalkohol, glyserol og propylenglykol. Etere slik som, men ikke begrenset til, poly(etylenglykol), petroleum hydrokarboner slik som mineralolje og petrolatum; og vann kan også anvendes i suspensjonsformuleringer. For nasal administrering så kan farmasøytiske formuleringer og medikamenter være en spray eller aerosol som inneholder et passende løsemiddel eller løsemidler og valgfritt andre forbindelser slik som, men ikke begrenset til stabilisatorer, antimikrobielle midler, antioksidanter, pH-modifikatorer, overflateaktive stoffer, biotilgjengelige modifikatorer og kombinasjoner av disse. Et drivstoff for en aerosolformulering kan inkludere kompressert luft, nitrogen, karbondioksid eller et hydrokarbonbasert lavt kokepunkt løsemiddel.
Injiserbare doseringsformer inkluderer generelt vandige suspensjoner eller oljesuspensj oner som kan lages ved å anvende et passende dispergeringsmiddel eller bløtgjøringsmiddel og et suspensjonsmiddel. Injiserbare former kan være i løsningsfase eller i formen av en suspensjon, som lages med et løsemiddel eller fortynner. Akseptable løsemidler eller verktøy inkluderer sterilisert vann, Ringers løsning eller en isoton, vandig saltløsning. Alternativt så kan sterile oljer benyttes som løsemidler eller suspensjonsmidler. Helst så er oljen eller fettsyren ikke flyktig, inkludert naturlige eller syntetiske oljer, fettsyrer, mono-, di- eller triglyserider.
For injeksjon så kan den farmasøytiske formuleringen og/eller medikamentet være et pulver som er passende for rekonstitusjon med en passende løsning som beskrevet over. Eksemler av disse inkluderer, men er ikke begrenset til frysetørket, sentrifugetørket eller spraytørkede pulvere, amorfe pulvere, granulater, presipitater eller partikler. For injeksjon så kan formuleringene valgfritt inneholde stabilisatorer, pH-modifikatorer, overflateaktive stoffer, biotilgjengelige modifikatorer og kombinasjoner av disse.
For rektal administrering så kan de farmasøytiske formuleringene og medikamentene være i formen av en stikkpille, en salve, et klyster, en tablett eller krem for frigjøring av forbindelse i tarmene, sigmoid fleksur og/eller rektum. Rektale stikkpiller lages ved å blande en eller flere forbindelse i den foreliggende oppfinnelsen, eller farmasøytisk akseptable salter eller tautomerer av forbindelsen, med akseptable verktøy, for eksempel kakaosmør eller polyetylenglykol, som er tilstede i en fast fase ved normale lagringstemperaturer og tilstede i en flytende fase ved de temperaturer som er passende for å frigjøre et medikament på innsiden av kroppen, slik som i rektum. Oljer kan også benyttes i tillagingen av formuleringer av den bløte gelatintypen og stikkpiller. Vann, saltvann, vandig dekstrose og relaterte sukkerløsninger, og glyseroler kan benyttes i tillagingen av suspensjonsformuleringer som også kan inneholde suspenderingsmidler slik som pektiner, karbomerer, metylcellulose, hydroksypropylcellulose eller karboksymetylcellulose, så vel som buffere og konserveringsmidler.
Langvarig frigjørende preparater kan lages. Passende eksempler på langvarig frigjøringspreparater inkluderer semipermeable matrikser av faste hydrofobe polymerer som inneholder antistoffet, hvor matrikser er i formen av formede artikler, for eksempel filmer eller mikrokapsel. Eksempler på langvarig frigjøringsmatrikser inkluderer polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetylmetakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (US patentnr. 3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og y-etyl-L-glutamat, ikke-degraderbar etylenvinylacetat, degraderbar melkesyre-glykolsyre kopolymerer slik som Lupron Depot™ (injiserbare mikrosfærer sammensatt av melkesyre-glykolsyre kopolymer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Mens polymerer slik som etylenvinylacetat og melkesyreglykolsyre muliggjør frigjøring av molekyler over 100 dager, så frigjør visse hydrogeler proteiner i kortere tidsperioder. Når innkapslede antistoffer forblir i kroppen i lang tid, så kan de denaturere eller aggregere som et resultat av eksponering for fuktighet ved 37°C og resultere i tap av biologisk aktivitet og mulige forandringer i immungenisitet. Rasjonelle strategier kan konstrueres for stabilisering avhengig av mekanismens om er involvert. For eksempel hvis aggregeringsmekanismen oppdages til å være intramolekyl-S~S bindingsdannelse gjennom tiodisulfid utbytting, så kan stabilisering oppnås ved å modifisere sulfhydrylresidier og lyofilisere fra sure løsninger, og kontrollere fuktighetsinnhold og anvende tilleggsstoffer og å utvikle spesifikke polymer matrikssammensetninger.
Formuleringene ifølge beskrivelsen kan designes til å være korttidsvirkende, raskt frigjørende, langtidsvirkende eller langvarig frigjørende som beskrevet her. De farmasøytiske formuleringene kan dermed formuleres for kontrollert frigjøring eller for langsom frigjøring.
De foreliggende sammensetningene kan også omfatte for eksempel miceller eller liposomer, eller noen annen innkapslet form eller de kan administreres i en utvidet frigjøringsform for å tilveiebringe en forlenget lagring og/eller leveringseffekt. De farmasøytiske formuleringene og medikamentene kan derfor kompresseres til pelleter eller sylindere og implanteres intramuskulært eller subkutant som depotinjeksjoner eller som implantater slik som stenter. Slike implantater kan benytte kjente uvirksomme materialer slik som silikoner og biodegraderbare polymerer.
Ved siden av de representative doseringsformer beskrevet over, så er farmasøytisk akseptable hjelpemidler og bærere vanligvis kjent for fagfolk og er dermed inkludert i den foreliggende beskrivelsen. Slike hjelpemidler og bærere er beskrevet for eksempel i "Remingtons Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co., New Jersey (1991).
Spesifikke doseringer kan justeres avhengig av tilstanden til sykdom, alder, kroppsvekt, generelle helsetilstander, kjønn og diett til individet, doseintervaller, administreringsruter, utskillingshastighet og kombinasjoner av medikamenter. Enhver av de ovenfor nevnte doseringsformene som inneholder effektive mengder er godt innen grensene for rutineeksperimentering og derfor godt innen omfanget av den foreliggende beskrivelsen.
M-CSF-antistoffer som er nyttige som terapeutika for cancermetastase eller bentapassosierte cancermetastase vil ofte lages vesentlig fri for andre naturlig forekommende immunglobuliner eller andre biologiske molekyler. Foretrukne M-CSF-antistoffer vil også utvise minimal toksisitet når de gis til et pattedyr som lider av eller er predisponert til å lide av, cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase.
Sammensetningene ifølge beskrivelsen kan steriliseres ved hjelp av konvensjonelle, velkjente steriliseringsteknikker. De resulterende løsningene kan pakkes for anvendelse eller filtreres under aseptiske betingelser og lyofiliseres. Det lyofiliserte preparatet blir kombinert med en steril løsning før administrering. Sammensetningene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpesubstanser som er nødvendig for passende fysiologiske betingelser, slik som pH-justerende og buffermidler, tonisitetsjusterende midler og lignende, for eksempel natriumacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid og stabilisatorer (for eksempel 20% maltose osv.).
M-CSF-antistoffene i den foreliggende beskrivelsen kan også administreres via liposomer, som er små vesikler sammensatt av forskjellige typer lipider og/eller fosfolipider og/eller overflateaktivt stoff som er nyttig for levering av et medikament (slik som antistoffene utgreid her og valgfritt et kjemoterapeutisk middel). Liposomer inkluderer emulsjoner, skum, miceller, uløselige monolag, fosfolipiddispersjoner, lamellerte lag og lignende og kan tjene som verktøy for å målrette M-CSF-antistoffene til et bestemt vev, så vel som for å øke halveringstiden av sammensetningen. En rekke fremgangsmåter er tilgjengelige for å lage liposomer, som beskrevet i for eksempel US patentnr. 4 837 028 og 5 019 369.
Liposomer som inneholder antistoffet lages ved hjelp av fremgangsmåter kjent i fagfeltet, slik som beskrevet i Epstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 3688
(1985); Hwang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77: 4030 (1980); og US patentnr. 4 485 045 og 4 544 545. Liposomer med forsterket sirkuleringstid er utgreiet i US patentnr. 5 013 556. Bestemte, nyttige liposomer kan lagres ved reversfase evaporeringsfremgangsmåte med en lipid sammensetning som omfatter fosfatidylcholin, kolesterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomer blir drevet gjennom filteret eller med definert porestørrelse for å gi liposomer med den ønskede diameter. Fab'-fragmenter av antistoffet i den foreliggende beskrivelsen kan konjugeres til liposomene som beskrevet i martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) via en disulfid interutbyttingsreaksjon. Et kjemoterapeutisk middel (slik som doksorubicin) finnes valgfritt innen liposomet (se for eksempel Gabizon et al., J. Natinal Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)).
Konsentrasjonen av M-CSF-antistoff et i disse sammensetningene kan variere vidt, dvs. fra mindre enn ca. 10%, vanligvis minst ca. 25 vekt% til så mye som 75 eller 90 vekt% og vil velges primært ved væskevolumer, viskositeter osv., i henhold med den bestemte administreringsmåten som velges. Aktuelle fremgangsmåter for å lge orale, topikale og parenterale administreringssammensetningen vil være kjent eller tydelige for fagfolk og er beskrevet i detalj for eksempel i Remington's Pharmaceutical Science, 19. utg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995).
Bestemmelse av en effektiv mengde av en sammensetning ifølge oppfinnelsen for å behandle cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase i en pasient kan utføres gjennom standard empiriske fremgangsmåter som er velkjente i fagfeltet. For eksempel så kan in vivo nøytraliseringsaktiviteten i sera fra et individ behandlet med en gitt dose av M-CSF-antistoff evalueres ved å anvende en analyse som bestemmer evnen sera har til å blokkere M-CSF indusert proliferering og overlevelse av musemonocytter (CD1 lb+ celle, en undergruppe av CD11-celler, som uttrykker høye nivåer av reseptor fra M-CSF) in vitro som beskrevet i Cenci et al., J. Clin. Invest. 1055: 1279-87, 2000.
Sammensetninger ifølge beskrivelsen blir administrert til et pattedyr som allerede lider av eller er predisponert for cancermetastase og/eller bentap assosiert med
cancermetastase i en mengde som er tilstrekkelig for å forhindre eller i det minste delvis arrestere utviklingen av cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase. En mengde som er adekvat for å utføre dette er definert for som en "terapeutisk effektiv
dose". Effektive mengder av M-CSF-antistoff vil variere og avhenge av alvorligheten av sykdommen og vekten og den generelle tilstanden til pasienten som blir behandlet, men er vanligvis i området fra ca. 1,0 ug/kg til ca. 100 ug/kg kroppsvekt, eller ca. 10 ug/kg til ca. 30 mg/kg, med doseringer fra ca. 0,1 mg/kg til ca. 10 mg/kg eller ca. 1 mg/kg til ca. 10 mg/kg per applikasjon som er det mest anvendte. For eksempel så er ca. 10 ug/kg til 5 mg/kg eller ca. 30 ug/kg til 1 mg/kg av antistoffet en initiell kandidatdose for administrering til pasienten, enten for eksempel ved en eller flere separate administreringer eller ved fortsatt infusjon. Administrering er daglig, på alternative dager, ukentlig eller sjeldnere, ettersom det er nødvendig avhengig av responsen på sykdommen og pasientens toleranse for terapi. Vedlikeholdsdoser over en lengre tidsperiode, slik som 4, 5, 6, 7, 8, 10 eller 12 uker eller lengre kan være nødvendig inntil en ønsket suppresjon av sykdomssymptomer finner sted, og dosene kan justeres hvis det er nødvendig. Progresjonen av denne terapi måles lett ved hjelp av konvensjonelle teknikker og analyser.
Enkle eller flere administreringer av sammensetningene kan utføres med dosenivåer og mønstere som blir valgt av den behandlende lege. For forebyggingen eller behandlingen av sykdom, så vil den passende doseringen av antistoffet være avhengig av typen sykdom som skal behandles, som definert over, alvorligheten og forløpet av sykdommen, om antistoffet gis for preventive eller terapeutiske formål, tidligere terapi, pasientens kliniske historie og respons på antistoffer, og varsomheten til den behandlende legen. Antistoffet blir passende administrert til pasienten en gang eller fordelt på en rekke behandlinger.
I enhver begivenhet så bør formuleringene tilveiebringe en kvantitet av M-CSF-antistoff over tid som er tilstrekkelig til effektivt å forhindre eller minimalisere alvorligheten av cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase. Sammensetningene i den foreliggende beskrivelsen kan administreres alene eller som en supplementterapi sammen med andre terapeutika kjent i fagfeltet for behandling av cancermetastase og/eller bentap assosiert med cancermetastase.
Antistoffsammensetningen vil formuleres, doseres og administreres på en måte som er i overensstemmelse med god medisinsk praksis. Faktorer som må betraktes i denne sammenheng inkluderer den bestemte forstyrrelsen som blir behandlet, det bestemte pattedyret som blir behandlet, den kliniske tilstanden til den individuelle pasienten, årsaken av forstyrrelsen, leveringssetet til middelet, fremgangsmåten for administrering, tidsplanleggingen for administrering og andre faktorer som er kjent for medisinske leger. Den terapeutisk effektive mengden av antistoffet som skal administreres vil styres av slike betraktninger, og er den minimale mengden som er nødvendig for å forhindre, forbedre eller å behandle den M-CSF-styrte sykdommen, tilstanden eller forstyrrelsen, spesielt for å behandle cancerceller, og mest spesielt for å behandle tumorcellemetastaser. Slik mengde er helst under mengden som er toksisk til verten eller som gjør at verten signifikant blir mer mottagelig for infeksjoner.
Antistoffet trenger ikke være, men kan valgfritt formuleres med en eller flere midler som på det nåværende tidspunkt anvendes for å forhindre eller behandle forstyrrelsen det er snakk om. For eksempel i cancer, så kan antistoffet gis sammen med kjemoterapeutisk middel eller i ADEPT som beskrevet over. Den effektive mengden av slike andre midler er avhengig av mengden av antistoff som er tilstede i formuleringen, typen sykdom, tilstand eller forstyrrelse eller behandling, eller andre faktorer som er diskutert over. Disse anvendes vanligvis i de samme dosene og med administreringsruter som anvendt her tidligere eller ca. fra 1 til 99% av de tidligere benyttede dosene.
Det er her også beskrevet en artikkel for fremstilling som inneholder materialer som er nyttig for behandlingen av sykdommene, forstyrrelsene eller tilstandene som er beskrevet over, inkludert for behandling av cancer. Artikkelen for fremstilling omfatter en beholder og en merking. Passende beholdere inkluderer for eksempel flasker, rør, sprøyter og testrør. Beholderne kan lages fra en rekke materialer slik som glass eller plastikk. Beholderen holder en sammensetning som er effektiv for å behandle tilstanden og kan ha en steril tilgangsport (for eksempel kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør som har en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm injeksjonsnål). Det aktive middelet i sammensetningen er antistoffet ifølge oppfinnelsen. Merkingen på, eller assosiert med, beholderen indikerer at sammensetningen blir anvendt for å behandle tilstanden det er snakk om. Artikkelen for fremstilling kan videre omfatte en andre beholder som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som fosfatbufret saltvann, Ringers løsning og dekstroseløsning. Den kan videre inkludere andre materialer som er ønskelig fra er kommersielt og bruker standpunkt, inkludert andre buffere, fortynnere, filtere, nåler, sprøyter og pakkeinnskudd med instruksjoner for anvendelse.
Immunterapi
Anti-M-CSF-antistoffer nyttige for å behandle pasienter som har cancer inkluderer de som er i stand til å initiere en potent immunrespons mot tumoren og de som er i stand til direkte cytotoksisitet. Med hensyn til dette så kan anti-M-CSF-antistoffer fremkalle tumorcelle lysis ved enten komplementstyrt eller antistoffavhengig cellecytotoksisitet (ADCC) mekanismer, som begge krever en intakt Fc-del av immunglobulinmolekylet for interaksjon med effektorcelle Fc-reseptorseter eller komplementproteiner. I tillegg så er anti-M-CSF-antistoffer som utviser en direkte biologisk effekt på tumorvekst nyttige i utførelsen av beskrivelsen. Potensielle mekanismer som slike direkte cytotoksiske antistoffer kan virke på inkluderer hemming av cellevekst, modulering av cellulær differensiering, modulering av tumorangiogenesefaktor profiler og induksjonen av apoptose. Mekanismen som et bestemt anti-M-CSF-antistoff utviser en anti-tumor effekt på, kan evalueres ved å anvende en rekke in v/7/*o-analyser designet for å bestemme ADCC, ADMMC, komplementstyrt cellelysis osv., som er generelt kjent i fagfeltet.
Immunterapi kan bli utført ved å anvende antistoffer som har en høyere affinitet for den membranbundne formen av M-CSF (M-CSFoc) enn for de utskilte formene av M-CSF. For eksempel så kan antistoffer lages som spesifikt binder ved eller rundt kløyvingssetet til M-CSFoc eller tildeling av M-CSFoc som ligger inntil membranen. Slike antistoffer kan også på en gunstig måte hemme kløyvning og frigjøring av den løselige, aktive delen av M-CSFoc.
Anti-M-CSF-antistoffene kan administreres i deres "nakne" eller ikke-konjugerte form, eller de kan ha terapeutiske midler konjugert til seg. Anti-M-CSF-antistoffer kan bli anvendt som er en radiosensibilisator. Anti-M-CSF-antistoffene kan bli konjugert til et radiosensibiliseringsmiddel. Uttrykket "radiosensibilisator" anvendes som anvendt her, er definert som et molekyl, helst et lav molekylvekt molekyl, administrert til dyr i terapeutisk effektive mengder for å øke sensitiviteten for celler som skal radiosensibiliseres for elektromagnetisk stråling og/eller for å fremme behandlingen av sykdommer som kan behandles med elektromagnetisk stråling. Sykdommer som kan behandles med elektromagnetisk stråling inkluderer neoplastiske sykdommer, godartede og ondartede tumorer og cancerceller.
Uttrykkene "elektromagnetisk stråling" og "stråling" som anvendt her inkluderer, men er ikke begrenset til stråling som har bølgelengden på IO"<20>til 100 meter. Foretrukket benyttes den elektromagnetiske strålingen til: gamma-stråling (10"<2>° til IO"13m), røntgenstråling (IO"<12>til IO"9 m), ultraviolett lys (10 nm til 400 nm), synlig lys (400 nm til 700 nm), infrarød stråling (700 nm til 1,0 mm), og mikrobølge stråling (1 mm til 30 cm).
Radiosensibilisatorer er kjent for å øke sensitiviteten til cancerceller for de toksiske effektene for elektromagnetisk stråling. Mange cancerbehandlingsprotokoller på det nåværende tidspunkt benytter radiosensibilisatorer som aktivert av den elektromagnetiske strålingen til røntgenstråler. Eksempler på røntgenstråleaktiverte radiosensibilisatorer inkluderer, men er ikke begrenset til følgende: metroindazol, misonidazol, desmetylmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nomorazol, mitomycin C, RSU 1069, SR 4233, EP9, RB 6145, mikotinamid, 5-bromdeoksyuridin (FUdR), hydroksyurea, cisplatin og de terapeutisk effektive analogene og derivatene av de samme.
Fotodynamisk terapi (PDT) av cancere anvender synlig lys som strålingsaktivatorer av det sensibiliserende middelet. Eksempler på fotodynamiske radiosensibilisatorer inkluderer følgende, men er ikke begrenset til: hematoporfyrinderivater, fotofrin(r), benzoporfyrinderivater, NPe6, tinnetioporfyrin (SnET2), feoborbid-a, bakterioklorofyll-a, naftalocyaniner, ftalocyaniner, sinkftalocyanin og terapeutisk effektive analoger og derivater av det samme.
Antistoffet kan konjugeres til en reseptor (slik som streptavidin) for bruk i tumor på forhånd målretting hvor antistoffreseptorkonjugatet administreres til pasienten, etterfulgt av fjerning av ubundet konjugat fra sirkuasjonen ved å anvende et rensemiddel og deretter administrering av en ligand (for eksempel avidin) som er konjugert til et cytotoksisk middel (for eksempel et radionuklid).
Den foreliggende beskrivelsen inkluderer videre de ovenfor beskrevne antistoffene i detekterbar merket form. Antistoffer kan være detekterbart merket gjennom anvendelsen av radioisotoper, affinitetsmerkinger (slik som biotin, avidin osv.), enzymatiske merkinger (slik som pepperrotperoksidase, alkalisk fosfatase osv.) fluorescerende eller luminiscerende eller bioluminiscerende merkinger (slik som FITC eller rhodamin osv.), paramagnetiske atomer og lignende. Prosedyrer for å utføre slik merking er velkjent i fagfeltet; for eksempel se (Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).
"Merking" refererer til en detekterbar forbindelse eller sammensetning som er konjugert direkte eller indirekte til antistoffet. Merkingen kan i seg selv være detekterbar ved seg selv (for eksempel radioaktive isotopmerkinger eller fluorescerende merkinger) eller, i tilfeller med enzymatisk merking, kan katalysere kjemisk forandring av en
substratforbindelse eller sammensetning som er detekterbar. Alternativt så kan merkingen ikke være detekterbar i seg selv, men ved hjelp av et element som er bundet til et annet middel som er detekterbart (for eksempel en epitoptag eller en av en bindingspartnerpar slik som biotin-avidin osv.). Antistoffet kan dermed omfatte en merking eller tag som fasiliterer dets isolering, og fremgangsmåter ifølge beskrivelsen for å identifisere antistoffer inkluderer et trinn med å isolere M-CSF/antistoffet gjennom interaksjon med merkingen eller tågen.
Eksempler på terapeutiske immunkonjugater som omfatter antistoffet som er beskrevet her konjugert til et cytotoksisk middel slik som et kjemoterapeutisk middel, toksin (for eksempel et enzymatisk aktivt toksin med bakteriell, sopp, plante eller dyreopprinnelse, eller fragmenter av det), eller en radioaktiv isotop (dvs. et radiokonjugat). Fusjonsproteiner er beskrevet i videre detalj under.
Fremstilling av immunkonjugater er beskrevet i US patentnr. 6 306 393. Immunkonjugater kan lages ved indirekte å konjugere et terapeutisk middel til en antistofforbindelse. Generelle teknikker er beskrevet i Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990) og Shih et al., US patentnr. 5 057 313. Den generelle fremgangsmåten involverer å la en antistofforbindelse som har en oksidert karbohydratdel reagere med en bærerpolymer som har minst en fri aminfunksjon og som er ladet med flere medikamenter, toksiner, chelatorer, borontillegg eller annet terapeutisk middel. Denne reaksjon resulterer i en initiell Schiff base (imin) kobling, som kan stabiliseres ved reduksjon til et sekundært amin for å danne sluttkonjugatet.
Bærerpolymeren er helst en aminodekstran eller polypeptid der minst 50 aminosyreresidier, selv om andre vesentlig ekvivalente polymerbærere også kan anvendes. Helst så er sluttimmunkonjugatet løselig i en vandig løsning, slik som pattedyrserum, for å lette administrering og effektiv målretting for anvendelse i terapi. De oppløsende funksjonene på bærerpolymeren vil dermed forsterke serumløseligheten til sluttimmunkonjugatet. Spesielt så vil en aminodekstran være å foretrekke.
Prosessen for å lage et immunkonjugat med en aminodekstranbærer begynner vanligvis med en dekstranpolymer, helst en dekstran med gjennomsnittlig molekyl vekt på ca. 10 000 - 100 000. Dekstranet reagerer med et oksideringsmiddel for å påvirke en kontrollert oksidering av en del av dets karbohydratringer til å generere aldehydgrupper. Oksideringen blir på en lett måte utført med glykolytiske kjemiske reagenser slik som NaIC>4, i henhold til konvensjonelle prosedyrer.
Det oksiderte dekstranet reagerer så med et polyamin, helst et diamin, og enda mer ønskelig, et mono- eller polyhydroksydiamin. Passende aminer inkluderer etylendiamin, prpylendiamin eller andre lignende polymetylendiaminer, dietylentriamin eller lignende polyaminer, l,3-diamino-2-hydroksypropan eller andre lignende hydroksylerte diaminer eller polyaminer, og lignende. Et overskudd av aminet i forhold til aldehydgruppene i dekstranet anvendt for å sikre vesentlig fullstendig omdannelse av aldehydfunksjonene til Schiff-basegruppene.
Et reduksjonsmiddel, slik som NaBEL;, NaBH_3, CN eller lignende blir anvendt for å få til innskrenkende stabilisering av det resulterende Schiff-base intermediatet. Det resulterende adduktet kan renses ved passasje gjennom en konvensjonell størrelseskolonne for å fjerne krysskoblede dekstraner.
Andre konvensjonelle fremgangsmåter for å derivatisere et dekstran til å introdusere aminfunksjoner kan også anvendes, for eksempel reaksjon med cyanogen bromid, etterfulgt av reaksjon med et diamin.
Aminodekstranet reagerer så med et derivat av det bestemte medikamentet, toksinet, chelatoren, immunmodulatoren, borontillegget og annet terapeutisk middel som skal lades, i en aktiv form, helst et karboksylaktivert derivat, laget ved konvensjonelle måter, for eksempel ved å anvende disykloheksylkarbodiimid (DCC) eller en vannløselig variant av den, til å danne et intermediataddukt.
Alternativt så kan polypeptidtoksiner slik som kermesbær antiviral protein eller ricin-A-kjede og lignende kobles til aminodekstran ved hjelp av glutaraldehydkondensering eller ved reaksjon av aktiverte karboksylgrupper på proteinet med aminer på aminodekstranet.
Chelatorer for radiometaller eller magnetisk resonansforsterkere er velkjente i fagfeltet. Derivater av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og dietylentriaminpentaeddiksyre (DPTA) er vanlige. Disse chelatorene har vanligvis grupper på sidekj edene som chelatorer kan feste seg til en bærer med. Slike grupper inkluderer for eksempel benzylisotiocyanat som DTPA eller EDTA kan festes til aminogruppene i en bærer med. Alternativt så kan karboksylgrupper eller aminogrupper på en chelator kobles til en bærer ved hjelp av aktivering eller tidligere derivatisering og deretter kobling, ved hjelp av velkjente måter.
Boron tilleggsstoffer, slik som karboraner, kan festes til antistoffkomponenter ved hjelp av konvensjonelle metoder. For eksempel så kan karboraner lages med karboksylfunksjoner og pendant sidekjeder, som er velkjente i fagfeltet. Festing av slike karboraner til en bærer, for eksempel aminodekstran, kan oppnås ved å aktivere karboksylgruppene i karboranene og kondensering med aminer på bæreren for å produsere et intermediatkonjugat. Slike intermediatkonjugater ble så festet til antistoff komponenter for å produsere terapeutisk nyttige immunkonjugater, som beskrevet under.
En polypeptidbærer kan anvendes istedenfor aminodekstran, men polypeptidbæreren bør ha minst 50 aminosyreresidier i kjeden, helst 100-5000 aminosyreresidier. Minst noen av aminosyrene bør være lysinresidier eller glutamat- eller aspartatresidier. Pendantaminene til lysinresidiene og pendantkarboksylatene til glutamin og aspartat er passende å bruke for å feste et medikament, toksin, immunmodulator, chelator, borontillegg eller annet terapeutisk middel. Eksempler på passende polypeptidbærere inkluderer polylysin, polyglutaminsyre, polyasparaginsyre, kopolymerer av dem og blandede polymerer av disse aminosyrer og andre, for eksempel seriner, for å gi ønskede løsningsegenskaper på den resulterende ladede bæreren og immunkonjugatet.
Konjugering av intermediatkonjugatet med antistoffkomponenten utføres ved oksidering av karbohydratdelen til antistoffkomponenten og lar de resulterende aldehyd (og keton) karbonylene reagere med amingrupper som er igjen på bæreren etter ladning med et medikamtn, toksin, chelator, immunmodulator, borontilleggsstoff eller annet terapeutisk middel. Alternativt så kan et intermediatkonjugat festes til en oksidert antistoffkomponent via amingrupper som er blitt introdusert i intermediatkonjugatet etter ladning med det terapeutiske middelet. Oksidering blir passende utført enten kjemisk, for eksempel med NaK>4eller annet glykolytisk middel, eller enzymatisk, for eksempel med neuraminidase eller galaktoseoksidase. I tilfellet med en aminodekstranbærer, så blir ikke alle aminene i aminodekstranet vanligvis anvendt for å lade et terapeutisk middel. De gjenværende aminene til aminodekstran kondenserer med den oksiderte antistofforbindelsen til å danne Schiff-baseaddukter som så blir innskrenkende stabilisert, normalt med et borhydridreduserende middel.
Analoge prosedyrer blir anvendt for å produsere andre immunkonjugater i henhold til beskrivelsen. Ladede polypeptidbærere har frie lysinresidier igjen for kondensering med den oksiderte karbohydratdelen til en antistoffkomponent. Karboksyler på polypeptidbæreren kan hvis det er nødvendig omdannes til aminer ved for eksempel aktivering med DCC og reaksjon med et overskudd av et diamm.
Sluttimmunkonjugatet renses ved å anvende konvensjonelle teknikker, slik som størrelseskromatografi på Sefakryl S-300 eller affinitetkromatografi ved å anvende en eller flere CD84Hy-epitoper.
Alternativt så kan immunkonjugater lages ved direkte å konjugere en antistoffkomponent med et terapeutisk middel. Den generelle prosedyren er analog til den indirekte fremgangsmåten for konjugering unntatt at et terapeutisk middel blir direkte festet til en oksiderende antistoffkomponent.
Det vil forstås at andre terapeutiske midler kan substitueres for chelatorene som er beskrevet her. Fagfolk vil være i stand til å konstruere konjugeringsskjemaer uten mye eksperimentering.
Som en videre illustrasjon så kan et terapeutisk middel festes til hengselregionen på en redusert antistoffkomponent via disulfidbindingsdannelse. For eksempel så kan tetanus toksoid peptidene konstrueres med et enkelt cysteinresidie som anvendes for å feste peptidet til en antistoffkomponent. Som et alternativ så kan slike peptider festes til antistoffkomponenten ved å anvende en heterobifunksjonell krysskobler, slik som N-suksinyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Generelle teknikker for slik konjugering er vekjent i fagfeltet. Se for eksempel Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods" i Monoclonal antibodies: principles and Applications Birch et al. (red.), s. 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic peptide-Derived Antibodies" I Monoclonal Antibodies: Production, Enieering and Clinical Application, Ritter et al.
(red.), s. 60-84 (Cambridge University Press 1995).
Konjugater av antistoffet og det cytotoksiske middelet lages ved å anvende en rekke bifunksjonelle proteinkoblingsmidler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditiol)propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bis-azidoforbindelser (slik som bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bis-diazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som tolyen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorinforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). For eksempel så kan et ricin immuntoksin lages som beskrevet i Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Karbon-14-merket 1 -isotiocyanatobenzyl-3 -metyldietylentriaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på et chelaterende middel for konjugering av radionuklid til antistoffet (se for eksempel WO 94/11026).
Som beskrevet over så kan karbohydratdelene i Fc-regionen til et antistoff anvendes for å konjugere et terapeutisk middel. Imidlertid så kan Fc-regionen være fraværende hvis et antistoffragment blir anvendt som antistoffkomponenten i immunkonjugatet. Ikke desto mindre så er det mulig å introdusere en karbohydratdel inn i den lett kjedevariable regionen til et antistoff eller antistoffragment. Se for eksempel Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., US patentnr. 5 443 953. Den konstruerte karbohydratdelen blir så anvendt for å feste et terapeutisk middel.
I tillegg så vil fagfolk forstå at det er flere mulige variasjoner av konjugeringsfremgangsmåtene. For eksempel så kan karbohydratdelen anvendes for å feste polyetylenglykol for å utvise halveringstiden til et intakt antistoff, eller antigenbindende fragment av det, i blod, lymfe eller andre ekstracellulære væsker. Videre så er det mulig å konstruere et "divalent immunkonjugat" ved å feste terapeutiske midler til en karbohydratdel og til en fri sulfhydrylgruppe. En slik fri sulfhydrylgruppe kan være lokalisert i hengselregionen til antistofforbindelsen.
Anti- M- CSF- antistoff fusi onsproteiner
Anvendelsen av fusjonsproteiner som omfatter en eller flere anti-M-CSF-antistoffdeler og en immunmodulator eller toksindel er her beskrevet. Fremgangsmåter for å lage antistoff fusjonsproteiner er velkjent i fagfeltet. Se for eksempel US patentnr. 6 306 393. Antistoff fusjonsproteiner som omfatter en interleukin-2-del er beskrevet av Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995); Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996) og Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996). I tillegg så beskriver Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995) et fusjonsprotein som inkluderer et F(ab')2-fragment og en tumornekrosefaktor oc-del.
Fremgangsmåter for å lage antistoff-toksin fusjonsproteiner hvor et rekombinant molekyl som omfatter en eller flere antistofforbindelser og et toksin eller kjemoterapeutisk middel er også kjent for fagfolk. For eksempel så er antistoff-Pseudomonas eksotoksin A-fusjonsproteiner blitt beskrevet av Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 89:5867 (1992), Friredman et al., J. Immunol. 150:3054
(1993) , Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996) og Schmidt et al, Int. J. Can. 65:538 (1996). Antistoff-toksin fusjonsproteiner som inneholder en difteritoksindel av blitt beskrevet av Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. biol. Chem. 268:5302 (1993), thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995) og Vallera et al., Blodd 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177
(1995) har beskrevet et antistoff-toksin fusjonsprotein som har en RNase-del, mens Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), produserte et antistoff-toksin fusjonsprotein som omfatter en DNase I-komponent. Gelonin ble anvendt som toksindelen i antistoff-toksin fusjonsproteinet til Wang et al., Abstracts of the 290th ACS National meeting, Anaheim, Calif, 2-6 april, 1995, del 1, BIOT005. Som et videre eksempel så rapporterte Dohlsten et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 91:8945
(1994) et antistoff-toksin fusjonsprotein som omfatter Staphylococcal enterotoksin-A.
Eksempler på toksiner som er passende anvendt i tillaging av slike konjugater er ricin, abrin, ribonuklease, DNase I, Staphylococcal enterotoksin-A, kermesper antiviralt protein, gelonin, difteritoksin, Pseudomonas eksotoksin og Pseudomonas endotoksin. Se for eksempel Pastan et al., Cell 47:641 (1986) og Goldenberg, CA—A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Andre passende toksiner er kjent for fagfolk.
Antistoffer som her beskrevet kan også anvendes i ADEPT ved konjugering av antistoffet til et promedikamentaktiverende enzym som omdanner et promedikament (for eksempel et peptidylkjemoterapeutisk middel, se WO 81/01145) til et aktivt anti-cancermedikament. Se for eksempel WO 88/07378 og US patentnr. 4 975 278.
Enzymkomponenten til immunkonjugatet som er nyttig for ADEPT inkluderer ethvert enzym som er i stand til å virke på et promedikament på en slik måte som at det omdanner det til dens mer aktive cytotoksiske form.
Enzymer som er nyttige i fremgangsmåten ifølge denne beskrivelsen inkluderer, men er ikke begrenset til alkalisk fosfatase som er nyttig for å omdanne fosfatinneholdende promedikamenter til frie medikamenter; arylsulfatase som er nyttig for å omdanne substratinneholdende promedikamenter til frie medikamenter; cytosin deaminase som er nyttig for å omdanne ikke-toksisk 5-fluorcytosin til anti-cancer medikamentet, 5-fluoruracil; proteaser, slik som serratia protease, termolysin, subtilisin, karboksypeptidaser og ketapsiner (slik som katepsinenen B og L) som er nyttig for å omdanne peptidinneholdende promedikamenter til frie medikamenter; D-alanylkarboksypeptidaser, som er nyttig for å omdanne promedikamenter som inneholder D-aminosyre substituenter; karbohydratkløyvende enzymer slik som 0-galaktosidase og neuraminidase som er nyttig for å omdanne glykosylerte promedikamenter til frie medikamenter; Ø-laktamase som er nyttig for å omdanne medikamenter som er derivatisert med P-laktamer til frie medikamenter; og penicillinamidaser, slik som penicillin V-amidase eller penicillin G-amidase, som er nyttig for å omdanne medikamenter derivatisert ved deres aminnitrogener med henholdsvis fenoksyacetyl eller fenylacetylgrupper til frie medikamenter. Alternativt så kan antistoffer med enzymatisk aktivitet, også kjent i fagfeltet som abzymer, anvendes for å omdanne promedikamentene ifølge beskrivelsen til frie aktive medikamenter (se for eksempel Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Antistoff-abzymkonjugater kan lages som beskrevet her for å levere abzymet til en tumorcellepopulasjon.
Enzymene ifølge denne beskrivelsen kan være kovalent bundet til antistoffene ved hjelp av teknikker velkjente i fagfeltet slik som anvendelsen av de heterobifunksjonelle krysskoblingsreagensene som er diskutert over. Alternativt så kan fusjonsproteiner som omfatter minst den antigenbindende regionen til et antistoff som her beskrevet koblet til minst en funksjonell aktiv del av et enzym ifølge beskrivelsen konstrueres ved å anvende rekombinante DNA-teknikker som er velkjente i fagfeltet (se for eksempel Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).
Ikke- terapeutiske anvendelser
Antistoffene som her er beskrevet kan anvendes som affinitetsrensingsmidler for M-CSF eller i diagnostiske analyser for M-CSF-protein, for eksempel å detektere dets uttrykk i spesifikke celler, vev eller serum. Antistoffene kan også anvendes for in vivo diagnostiske analyser. For disse formål så blir antistoffet vanligvis merket med et radionuklid (slik som mIn,<99>Tc,14C,1311,12<5>1,3H,<32>P eller<35>S) slik at tumoren kan lokaliseres ved å anvende immunscintiografi.
Antistoffene som her er beskrevet kan benyttes i enhver kjent analysemetode, slik som kompetitive bindingsanalyser, direkte og indirekte sandwichanalyser, slik som ELISAer og immunpresipiteringsanalyser. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, s. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Antistoffene kan også anvendes for immunhistokjemi, for å merke tumorprøver ved å anvende fremgangsmåter kjent i fagfeltet.
Med hensyn til anvendelighet, så kan antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes i et kitt, dvs. en pakket kombinasjon av reagenser i forhåndsbestemte mengder med instruksjoner for å utføre den diagnostiske analysen. Der hvor antistoffet er merket med et enzym, så vil kittet inkluderer substrater og kofaktorer som er nødvendig for enzymet (for eksempel en substratforløper som tilveiebringer den detekterbare kromoforen eller fluorforen). I tillegg så kan andre tilleggsstoffer inkluderes, slik som stabilisatorer, buffere (for eksempel en blokkeringsbuffer eller lysisbuffer) og lignende. De relative mengdene av de forskjellige reagensene kan varieres vidt for å tilveiebringe konsentrasjoner i løsning av reagensene som vesentlig optimaliserer sensitiviteten til analysen. Spesielt så kan reagensen tilveiebringes som tørre pulvere, vanligvis lyofiliserte, inkludert hjelpestoffer som ved løsning vil tilveiebringe en reagensløsning som har den passende konsentrasjon.
Oppfinnelsen ble illustrert ved de følgende eksemplene, som ikke er ment å være begrensende på noen måte.
EKSEMPLER
Eksempel 1
Dette eksempel viser at M-CSF-antistoffer RX1 og 5A1 er artsspesifikke og at antistoffer RX1, MCI og MC3 nøytraliserer human M-CSF-aktivitet. RX1 er et
kommersielt solgt antistoff som var tilgjengelig i mer enn 1 år før arkiverings datoen til denne søknad. Eksempler på kommersielle kilder inkluderer, men er ikke begrenset til muse-antihumant M-CSF-monoklonalt antistoff kloner 116, 692 og 21 (Anogen); anti-humant M-CSF-antistoff kloner 21113.131 og 26786 (R& D Systems, Inc.); og anti-humant M-CSF-antistoff klon Ml 6 (Antigenix America, Inc.).
For å teste den nøytraliserte aktiviteten til RX1 og 5Al, så blir en prolifereringsanalyse med M-NSF-60 cellelinjen anvendt (American Type Culture Collection Accession nr. CRL-1838, tilgjengelig fra ATCC i Rockville, MD, USA, utledet fra en myelogen leukemi indusert med Cas-Br-MuLV vild mus ekotropisk retrovirus, responsiv på både interleukin 3 og M-CSF og som inneholder et avkortet c-myb proto-onkogen forårsaket av integreringen av et retrovirus). Proliferering av M-NFS-60 krever aktiv M-CSF på en doseavhengig måte. I analysen så blir M-NSF-60-celler vasket og platet ut i RPMI 1640-medium med 10% FBS og 3000 U/ml M-CSF og 1% Pen/Strep. Rekombinat, humant M-CSF (ved 10 ng/ml sluttkonsentrasjon), humant eller muse-spesifikt, ble innkubert med forskjellige konsentrasjoner av antistoffer i 1 time ved 37°C i 5% CO2i en inkubator. Etter inkubasjonen så ble blandingen tilsatt til M-NFS-60-kulturen i 96-brønners mikrotiterplater. Total analysevolumet per brønn var 100 ul, med 10 ng/ml M-CSF og antistoffkonsentrasjonen indikert i Figur 5. Cellene ble innkubert ved 37°C i 5% CO2i 72 timer før celletallet ble kvantifisert ved CellTiter Glo-analyse (Promega). Den tidligere nevnte analysen ble repetert for antistoffer MC3 og MCI.
Som vist i Figur 5 så er M-CSF-antistoffer RX1 og 5A1 artsspesifikke. Celleproliferering er presentert som fluorescenslesingen fra CellTiter Glo-analyse, som er lineær med celletall. Artspesifikk nøytraliseringsaktivitet til RX1 og 5A1 er vist ved dets evne til å hemme M-NFS-60 i nærvær av enten humant eller muse-M-CSF. Til slutt, som vist i Figur 5B, så er antistoffer MC3 og MCI også effektive hemmere av M-CSF-aktivitet.
Eksempel 2
Dette eksempel viser at antistoff RX1 effektivt hemmer osteolyse i en human xenograftmodell ved en dose på 5 mg/kg. Hunnlige, nakne mus i alderen 4-7 uker, med gjennomsnittlig vekt -20 g ble anvendt i denne studie. Tumorceller (MDA-MB-231, 3x10<5>) suspendert i 10 ul saltvann ble injisert inn i den høyre tibia benmargshulen. Radiogrammer av de bakre ben ble tatt en dag etter tumorinokulering for å få grunnlinjebilde og for å sjekke benbrudd forårsaket av injeksjon. Mus ble randomisert i behandlingsgrupper med 10 mus per gruppe inkludert PBS og RX1 ved 5 mg/kg, injisert i.p. en gang i uken i 6 uker. På slutten av studien, så blir radiogrammer av de bakre ben tatt igjen og sammenlignet mot grunnlinjen for benskade. Graden av benskade forårsaket av tumor ble definert som vist i Figur 6. Gruppen med RX1 5 mg/kg behandling viste statistisk signifikant beskyttelse av benet for tumorforårsaket skade.
Eksempel 3
Dette eksempel viser at antallet metastaser er redusert når antistoff RX1 administreres til human brystcancer MDA-MB-231-bærende nakne mus ved en konsentrasjon på 5 mg/kg.
Hunnlige, nakne mus i alderen 4-7 uker, gjennomsnittlig vekt~20 g ble anvendt i denne studie. Tumorceller (MDA-MB-231, 3x10<5>) suspendert i 10 jxl saltvann ble injisert inn i den høyre tibia benmargshulen. Radiogrammer av de bakre ben ble tatt 1 dag etter tumorinokulering for å få grunnlinjebilde og for å sjekke for benbrudd forårsaket av injeksjon. Mus ble tilfeldig gruppert inn i behandlingsgrupper inkludert PBS og RX1 ved 5 mg/kg injisert i.p. en gang i uken i 6 uker. Ved slutten av studien ble lungene til hver behandlingsgruppe samlet og fiksert i Bouins løsning for metastatisk lungeknute telling.
Som vist i Figur 7 så er antallet metastaser indusert når antistoff RX1 ble gitt til human brystcancer MDA-MB-231-bærende nakne mus ved en dose på 5 mg/kg.
Eksempel 4
Dette eksempel viser en prosedyre for humanisering av RX1-antistoffet, 5H4, MCI og MC3 blir humanisert ved å anvende lignende prosedyrer.
Design av gener for humaniserte RX1 lett- og tunge kjeder
Nukleotid og aminosyresekvensen til muse RX1 er satt fram i Figur 4B. Sekvensen til et humant antistoff identifisert ved å anvende the National Biomedical Foundation Protein Identification Resource eller lignende database ble anvendt for å tilveiebringe leserammen til et humanisert antistoff. For å velge sekvensen til den humaniserte tunge kjeden, så blir muse-RXl-tungkjede sekvensen oppstilt med sekvensen til den humane antistoff tunge kjeden. Ved hver posisjon så blir den humane antistoff aminosyren valgt for den humaniserte sekvensen, med mindre posisjonen faller i enhver av de fire kategoriene som er definert under, i hvilke tilfeller murin RX1-aminosyren blir valgt: (1) Posisjonen faller innen en komplementaritetsbestemmende region (CDR) som definert av Kabat, J. Immunol, 125, 961-969 (1980); (2) Den humane antistoff aminosyren er sjelden for humane tunge kjeder ved den posisjon, mens den muse-RXl-aminosyren er vanlig for humane tunge kjeder ved den posisjon; (3) Posisjonen er tilstøtende en CDR i aminosyresekvensen til muse-RXl tunge kjeden; eller (4) 3-dimensjonal modellering av muse-RXl -antistoffet foreslår at aminosyren er fysisk nær den antigenbindende regionen.
For å velge sekvensen til den humaniserte lett kjeden, så blir muse-RXl lettkjede sekvensen oppstilt med sekvensen til humant antistoff lette kjeden. Den humane antistoff aminosyren velges ved hver posisjon av den humaniserte sekvensen, med mindre posisjonen igjen faller inn i en av kategoriene beskrevet over og repetert under: (1) CDRer; (2) muse-RXl aminosyre mer vanlig enn humant antistoff;
(3) tilstøtende CDRer; eller
(4) mulig 3-dimensjonal nærhet til bindingsregion.
Den aktuelle nukleotidsekvensen til de tunge og lettkjedegenene er valgt som følger: (1) Nukleotidsekvensen koder for aminosyresekvensene valgt som beskrevet over; (2) 5' disse kodende sekvenser, så koder nukleotidsekvenser for en leder (signal) sekvens. Disse ledersekvensene ble valgt som typiske for antistoffer; (3) 3' til de kodende sekvensene, så er nukleotidsekvensene sekvensene som følger muse-lettkjede J5-segmentet og muse-tungkjede J2-segmentet som er del av den muse-RXl-sekvensen. Disse sekvenser er inkludert fordi de inneholder spleis donorsignaler; og (4) Ved hver ende av sekvensen så er det et Xba I-sete som tillater kutting ved Xba I-setet og kloning inn i Xba I-setet til en vektor.
Konstruksjon av humaniserte lette og tunge kiedegener
For å syntetisere den tunge kjeden, blir fire oligonukleotider syntetisert ved å anvende en Applied Biosystems 380B DNA-syntesemaskin. To av oligonukleotidene er del av hver tråd i den tunge kjeden, og hvert oligonukleotid overlapper de neste ved ca. 20 nukleotider for å tillate annealing. Sammen så dekker oligonukleotidene hele den humaniserte tungkjede variable regionen med noen få ekstra nukleotider ved hver ende for å tillate kutting ved Xba I-setene. Oligonukleotidene renses fra polyakrylamid geler. Hvert oligonukleotid blir fosforylert ved å anvende ATP og T4 polynukleotidkinase ved hjelp av standard prosedyrer (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). For å anneale de fosforylerte oligonukleotidene, så blir de suspendert sammen i 40 ul TA (33 mM Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat) ved en konsentrasjon på ca. 3,75 uM hver, varmet til 95°C i 4 min. og deretter langsomt kjølt ned til 4°C. For å syntetisere det fullstendiget genet fra oligonukleotidene ved å substituere den motsatte tråden av hvert oligonukleotid, blir de følgende komponentene tilsatt i en sluttvolum på 100 ul:
Blandingen innkuberes ved 37°C i 30 min. Så blir 10 u T4 DNA-ligase tilsatt og
innkubering ved 37°C fortsetter i 30 min. Polymerase og ligasen blir så inaktivert ved å innkubere reaksjonen ved 70°C i 15 min. For å kutte genet med Xba I, så blir 50 ul 2 X TA som inneholder BSA ved 200 ug/ml og DTT ved 1 mM, 43 ul vann og 50 u Xba I i 5 ul tilsatt til reaksjonen. Reaksjonen innkuberes i 3 timer ved 37°C og renses deretter på en gel. Xba I-fragmentet blir renset fra en gel og klonet inn i Xba I-setet til et plasmid pUC19 ved hjelp av standard fremgangsmåter. Plasmider renses ved å anvende standard teknikker og sekvenseres ved å anvende dideoksy fremgangsmåten.
Konstruksjon av plasmider for å uttrykke humaniserte lette og tunge kjeder blir utført ved å isolere de lette og tunge kjede Xba I-fragmentene fra pUC19-plasmidet hvor de er blitt satt inn og deretter sette dem inn i Xba I-setet til en passende uttrykksvektor som vil uttrykke høye nivåer av en fullstendig tung kjede når den transfekteres inn i en passende vertscelle.
Syntese og affinitet av humanisert antistoff
Uttrykksvektorene transfekteres inn i muse Sp2/0 celler og cellene som integrerer plasmidene blir valgt på basisen av den selekterbare markørgruppen eller markøerene som overdras med uttrykks vektorene ved hjelp av standard fremgangsmåter. For å verifisere at disse celler utskiller antistoff som binder seg til M-CSF, så blir supernatanten fra cellene innkubert med celler som er kjent for å uttrykke M-CSF. Etter vasking så blir cellene innkubert med fluoresceinkonjugert geite-antihumant antistoff, vasket og analysert og fluorescert på et FACSCAN cytofluorometer.
For de neste eksperimentene så blir celler som produserer det humaniserte antistoffet injisert inn i mus, og de resulterende ascitesvæskene blir samlet. Humanisert antistoff renses ved vesentlig homogenitet fra ascitesvæskene ved passasje gjennom en affinitetskolonne med geite-anti-humant immunglobulin antistoff, laget på en Affigel-10 støtte (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.) i henhold til standard teknikker. For å bestemme affiniteten av det humaniserte antistoffet i forhold til det opprinnelige muse-RXl-antistoffet, så blir et kompetitivt bindingseksperiment utført i henhold til teknikker som er kjent i fagfeltet.
Eksempel 4A
Dette eksempel beskriver kloning og uttrykk av Human Engineered™ RXl-antistoffer, så vel som rensing av slike antistoffer og testing for bindingsaktivitet. Human Engineered™ 5H4, MCI og MC3-antistoffer blir laget ved å anvende lignende prosedyrer.
Design av Human Engineered™ sekvenser
Human Engineering™ av antistoff variabeldomener er blitt beskrevet av Studnicka (se for eksempel Studnicka et al., US patentnr. 5 766 886; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814 (1994)) som en fremgangsmåte for å redusere immunogenisitet mens bindingsaktivitet av antistoffmolekylene bevares. I henhold til fremgangsmåten så er hver variabel region aminosyre blitt utbyttet som en risiko for substitusjon. Aminosyresubstitusjoner skilles av en av tre risikokategorier: (1) lav risikoforandringer er de som har det største potensialet for å redusere immungenisiteten med den minste sjansen for å ødelegge antigenbinding; (2) moderate risikoforandringer er de som ville redusere immungenisitet, men som har større sjanser for å påvirke antigenbinding eller proteinfolding; (3) høyrisiko residier er de som er viktige for binding eller for å opprettholde antistoffstruktur og som har den høyeste risikoen for at antigenbinding eller proteinfolding vil bli påvirket.
På grunn av den tredimensjonale strukturelle rollen til proliner, så blir modifikasjoner av proliner generelt betraktet som å være minst moderat risikoforandringer, selv om posisjonen vanligvis er en lavrisiko posisjon. Substitusjonelle forandringer er foretrukket, men innsettinger og slettinger er også mulig. Figurene 4B og 4C viser risikotildelingen for hvert aminosyreresidie i muse-RXl henholdsvis lette og tunge kjeder, kategorisert som en høy, moderat eller lavrisikoforandring.
Variable regioner i de lette og tunge kjedene til muse-RXl-antistoffet ble Human Engineered™ ved å anvende denne fremgangsmåten. Aminosyreresidier som er kandidater for modifikasjon i henhold til fremgangsmåten ved lavrisiko posisjoner ble identifisert ved å stille opp de humane aminosyresekvensene til de musevariable regionene med en human variabel regionsekvens. Enhver human variabelregion kan anvendes, inkludert en individuell VH- eller VL-sekvens eller en human konsensus VH-eller VL-sekvens. Aminosyreresidier ved ethvert antall av lavrisiko posisjonene, eller ved alle lavrisiko posisjonene, kan forandres. For den Human Engineered™ "lavrisiko" tungkjede sekvensen i figurene 19A og B, så blir human konsensus Vh2 (basert på Kabat) anvendt som templatet, og for hver posisjon hvor muse- og human aminosyreresidiene skilte seg ved lavrisiko posisjoner, så ble en aminosyremodifikasjon introdusert som erstattet museresidiet med det humane residiet. For den Human Engineered™ "lavrisiko" lettkjede sekvensen i Figurene 20A og B, så blir human konsensus kappa3 (basert på Kabat) anvendt som templatet og for hver posisjon hvor muse- og human aminosyreresidiene skilte seg ved lavrisiko posisjoner, så ble en aminosyremodifikasjon introdusert som er erstattet museresidiet med det humane residiet. Totalt ble 16 aminosyre lavrisiko modifikasjoner gjort til den lette kjeden og 8 lavrisiko modifikasjoner ble gjort til den tunge kjeden.
På samme måte så ble aminosyreresidier som er kandidater for å modifisere i henhold til fremgangsmåten ved alle lav- og moderat risikoposisj onene identifisert ved å stille opp aminosyresekvenser til de muse-variable regionene med en human variabel regionsekvens. Aminosyreresidiene ved ethvert antall av lav eller moderatrisiko posisjonene, eller ved alle lav og moderatrisiko posisjonene kan forandres. For den Human Engineered™ tungkjede sekvensen i Figurene 19A-B, så ble human konsensus Vh2 (basert på Kabat) anvendt som templatet og for hver posisjon hvor muse- og human aminosyreresidiene skilte seg ved lav eller moderarisiko posisjonene så ble en aminosyremodifikasjon introdusert som erstattet museresidiet ved det humane residiet. For den Human Engineered™ lettkjede sekvensen i Figurene 20A-B så ble human konsensus kappa3 (basert på Kabat) anvendt som templatet og for hver posisjon hvor muse- og humane aminosyreresidier var forskjellige ved lav og moderatrisiko posisjoner, så ble en aminosyremodifikasjon introdusert som erstattet museresidiet med det humane residiet. Totalt ble 19 lav og moderatrisiko aminosyremodifikasjoner gjort i den lette kjeden og 12 lave og moderate modifikasjoner ble gjort i den tunge kjeden.
En "alternativ lavrisiko" lettkjede sekvens ble også laget som vist i Figurene 21 A-B, hvor modifikasjonen ved posisjon 54 ble reversert tilbake til mus. En "alternativ lav+moderat risiko" lettkjedesekvens ble også laget som vist i figurene 21 A-B, hvor modifikasjonene ved posisjonene 54-56 ble reversert tilbake til mus.
Til slutt så ble en Human Engineered™ "lav+moderat risiko" lett kjede V-regionsekvens også produsert ved å anvende humant "germline" VK6 undergruppe 2-1-(1) A14 som templatet, som vist i Figurene 22A-B.
Også overveid i den foreliggende oppfinnelse er å bevare aminosyrene 41-43 (NGS) i
Figur 4A som representerer glykosyleringssetet. Alternativt så kan bare en eller to av aminosyrene 41-43 (for eksempel NG) bevares.
Tillagging av uttrykksvektorer for permanent cellelinieutvikling DNA-fragmenter som koder for hver av de ovenfor beskrevne tunge og lette kjeder V-regionsekvensene sammen med antistoffutledede signalsekvenser ble konstruert ved å anvende syntetiske nukleotidsyntese. DNA som koder for hver av lettkjede V-region aminosyresekvensene beskrevet over ble satt inn i vektor pMXPlO som inneholder den humane kappa lettkjede konstantregionen. DNA som koder for hver av de tungkjede V-region aminosyresekvensene beskrevet over ble satt inn i vektor pMXP6 som inneholder den humane gamma-2 tungkjede konstantregionen. Tilleggsvektorer ble konstruert som inneholder de tungkjede-V-region aminosyresekvensene fusert til de humane gamma-1 (cDNA) og gamma-4 (genomisk og cDNA) konstantregionene som har sekvenser vist i Figurene 29A, 29b og 30. Alle disse vektorer inneholder en hCMV-promotor og en muse kappa lettkjede 3' utranslatert region så vel som selekterbare markørgener slik som neo eller his for seleksjon av henholdsvis G418 - eller histidinol
- resistente transfektanter. De lett- og tungkjede vektorene er beskrevet i henholdsvis
Tabellene 2 og 3.
Vektorer som omfatter de ønskede Human Engineered™ lett pluss tungkjede genene (Gamma-1, Gamma-2 og Gamma-4) ble så konstruert. Disse "2-gen"-vektorer inneholder gener som koder for hver antistoffkjede, tung og lett, under kontroll av hCMV-promotoren, CMV-splice donorer, SV40 16S splice akseptor og muse kappa lettkjede 3' utranslatert DNA inkludert polyA-setet. De inneholder også et selekterbart markørgen slik som neo eller his og ampicillin resistensgenet. Vektorer som inneholder både tung- og lettkjedegener er beskrevet i Tabell 4. Vektorer som omfatter to kopier av hver lett- og tungkjedegener (fire genvektorer) kan også konstrueres.
Tillaging av uttryksvektorer for transient uttrykk
Vektorer som inneholder enten de lette eller tunge kjedegenene som beskrevet over ble også konstruert for trasient transfeksjon. Disse vektorer er lignende for de som er beskrevet over for permanente transfeksjoner, unntatt at i stedet for neo- eller his-genene så inneholder de Epstein-Barr virus or/P for replikasjon i HEK293-celler som uttrykker Eptein-Barr virus nukleære antigener. Vektorer for transient transfeksjon er beskrevet i Tabellene 5 og 6.
Transient uttrykk av humant konstruerte RX1 i HEK293E- celler
Separate vektorer som hver inneholder ori? fra Esptein-Barr viruset og de lettkjede eller tungkjedegenene beskrevet over ble transfektert trasient inn i HEK293E-celler. Transient transfekterte celler fikk lov til å innkubere opp til 10 dager hvoretter supernatanten ble høstet og antistoff renset ved å anvende Protein A-kromatografi. Proteinene produsert ved hjelp av transient transfeksjon av 293E-celler er beskrevet i Tabell 7 under.
Utvikling av permanent transfekterte CH0- K1- celler
Vektorene beskrevet over (Tabell 4) som inneholder en kopi hver av de lette og tunge kjedene sammen blir transfektert inn i Ex-celle 302-adaptetre CHO-K1-celler. CHOKl-celler adaptert til suspensjonsvekst i Ex-celle 302-medium elektroporeres vanligvis med 40 ug linearisert vektor. Alternativt så kan linearisert DNA komplekseres med lineær polyetylenimin (PEI) og anvendes for transfeksjon. Cellene blir platet ut i 96-brønners plater som inneholder Ex-celle 302-medium supplementert med 1% FBS og G418. Kloner ble screenet i 96-brønners plater og toppen -10% av kloner fra hver transfeksjon blir overført til 24-brønners plater som inneholder Ex-celle 302-medium.
En produktivitetstest utføres i 24-brønners plater i Ex-celle 302-medium for kulturer dyrket i 7 og 14 dager og kultursupernatantene ble testet ved hvert tidspunkt for nivåer av utskilt antistoff ved hjelp av en immunglobulin ELISA-analyse for IgG.
Toppklonene blir overført til risteflasker som inneholder Ex-celle 302-medium. Så raskt cellene er adaptert til suspensjonsvekst, så blir en risteflasketest utført med disse kloner i Ex-celle 302-medium. Cellene dyrkes i opp til 10 dager i 125 ml Erlenmeyer-flasker som inneholder 25 ml medium. Flaskene åpnes minst hver andre dag i innkubasjonsperioden for å tillate gassutbytting og nivåene av immunglobulin polypeptid i dyrkningsmediet blir bestemt ved hjelp av IgG ELISA ved slutten av innkubasjonsperioden. Flere sekvensielle transfeksjoner av den samme cellelinjen med to eller flere multienhets transkripsjonsvektorer resulterer i kloner og cellelinjer som utviser videre økning i nivåer av immunglobulinproduksjon, helst til 300 ug/ml eller mer.
Rensing
En prosess for rensingen av immunglobulin polypeptider fra vektorer og alle linjer kan designes. Ifølge fremgangsmåter som er velkjent i fagfeltet, blir celler fjernet ved filtrering etter terminering. Filtratet lades på en Protein A-kolonne (i flere vendinger, hvis det er nødvendig). Kolonnen vaskes og deretter blir de uttrykte og utskilte immunglobulinpolypeptidene eluert fra kolonnen. For tillaging av antistoffprodukt så blir Protein A-poolen holdt ved en lav pH (pH 3 for et minimum på 30 min og et maksimum på 1 time) som et viralt inaktiveringstrinn. Et adsorptivt kation utbyttetrinn blir deretter anvendt for videre å rense produktet. Eluatet for den adsorptive separasjonskolonnen passeres gjennom et virusbevarende filter for å tilveiebringe videre rensing av potensielle, virale partikler. Filtratet blir videre renset ved å passere gjennom en anione utbyttingskolonne hvor produktet ikke binder. Til slutt blir renseprosessen avsluttet ved å overføre produktet til formuleringsbufferen gjennom diafiltrering. Retentatet blir justert ved en proteinkonsentrasjon på minst 1 mg/ml og en stabilisator blir tilsatt.
Bindingsaktivitet
MCSF-bindingsaktiviteten til de rekombinante Human Engineered™ antistoffene blir evaluert. Protein renses fra risteflaske kultursupernatanter ved passasje over en Protein A-kolonne etterfulgt av konsentrasjonsbestemmelse ved A28o-Bindingsanalyser blir utført som beskrevet i Eksempel 1 over eller i 12 under. Immulon U-plater forhåndsoverdekkes med sM-CSF-antigenet som er forhåndsfortynnet i en PBS-overtrekkende løsning for å immobilisere det til mikroplaten. Forskjellige testkonsentrasjoner av M-CSF i området fra 0,25 til 20 ug/ml blir tilsatt ved 50 ul/brønn og innkubert ved 4°C over natt. Platene ble så vasket 3 ganger med PBS-0,05% Tween. Blokkering utføres ved å tilsette PBS-0,05% Tween 1% BSA etterfulgt av en 30-minutters innkubering ved 37°C. Fortynning av immunglobulin polypeptider lages i PBS-0,05% Tween 1% BSA løsning. 2- til 3-ganger seriefortynninger lages og tilsettes (100 ul/brønn) i duplikat eller triplikat. Etter en 90-minutters innkubering ved 37°C blir mikroplaten vasket 3 ganger med PBS-0,05% Tween. For signalutvikling så blir geite- anti-humant IgG (gamma- ellre Fc-spesifikt) sekundært antistoff konjugert til peroksidase tilsatt til hver brønn og innkuberte i 60 minutter ved 37°C etterfulgt av tilsetting av OPD av 0,4 mg/ml i citratbuffer pluss 0,012% H2O2. Etter 5-10 minutter i romtemperatur blir analysen stoppet ved tilsettingen av 100 ul IM H2SO4og platene leses ved 490 nm. Både geite-anti-humane IgG (gamma-spesifikk) og geite-anti-humant IgG (Fc-spesifikke) antistoffer er blitt brukt.
Eksempel 5
Det følgende eksempel setter sammen prosedyren for behandlingen av mennesker ved å anvende M-CSF-spesifikt antistoff, slik som et RX1 -utledet eller RX1-konkurrerende antistoff, inkludert et RX1 Human Engineered™ antistoff med en modifisert eller ikke-modifisert IgGl eller IgG4 konstantregion. Prosedyren kan også følges for et MC1-eller MC3-utledet eller MCI - eller MC3-konkurrerende antistoff. Det forventede effektive doseområdet er 2 ug/kg til 10 mg/kg. Denne estimering er basert på følgende logiske forklaring underbygget ved eksperimentelle data: Det målte M-CSF-nivået i human plasma (både friske og brystcancerpasienter) er ca. 1 ng/ml. M-CSF-nøytraliserende antistoff RX1 har en målt EC50på 2 ng/ml mot 1 ng/ml humant M-CSF. Følgelig så er den effektive antistoffkonsentrasjonen i humant plasma forventet å være 10 til 50 000 ganger over dets EC50, dvs. 20 ng/ml til 100 ug/ml antistoff i humant plasma. Basert på PK-studier, for å effektuere denne konsentrasjon i humane pasienter, så er en dose på 2 ug/kg til 10 mg/kg nødvendig for å nå 20 ng/ml til 100 ug/ml antistoffkonsentrasjon i plasma.
Eksempel 6
Dette eksempel setter fram en prosedyre for evalueringen av anti-canceraktiviteten til anti-M-CSF-monoklonalt antistoff i en subkutan modell. Eksempel 2 over viser at anti-M-CSF-monoklonalt antistoffbehandling signifikant hemmet tumorveksten i benmarg. Formålet med denne studie er å evaluere om antistoffet kan også hemme tumorveksten i bløtt vev.
Hunnlige nu/nu-mus i alderen 10 uker gamle, med gjennomsnittlig vekt på -20 g vil anvendes for denne studien. Mus vil gjennomgå en akklimatiseringsperiode på minst 7 dager før studien starter. På dag 0 vil den høyre siden av nakne mus injiseres med SW620 humane kolon cancerceller subkutant ved 5 x IO<6>celler per mus per 100 ul. Når tumorvolumet når 100-200 mm<3>(vanligvis 1 uke etter tumorinokulering), vil mus randomiseres i 5 grupper med 10 mus per gruppe som følger:
1) PBS
2) RX1
3) 5A1
4) mlgGl + rlgGl isotype Ab-kontroll
5) 5A1+RX1
Mus vil bli behandlet interperitonealt med de benevnte antistoffene ved 10 mpk en gang i uken i 4 uker. Nåo r tumorvolumet nåo r 2000 mm 3 , så o vil studien termineres. Alternativt så vil dyrene også bli drept når noen av de følgende situasjonene oppstår: tumoroverflate sårdanning er større enn 30% av total tumoroverflateareal, signifikant kroppsvekttap (>20%) dehydrering og musene er døende. Fullblod vil bli samlet fra alle musene og monocytt populasjon vil analyseres som en potensiell surrugatmarkør. Tumorvekst/størrelse vil måles ved hjelp av 2-D analyse. Målinger av tumorvidde og lengde vil anvendes for å beregne tumorvolumet. Det er forventet at tumorvekst i bløtvev også hemmes som et resultat av det foregående eksperimentet.
Eksempel 7
Det følgende eksempelet resulterer en prosedyre for evalueringen av kombinasjonsterapi for behandlingen og forebyggingen av alvorlig osteolytisk sykdom assosiert med cancermetastase.
Eksperimentell design. Studien beskrevet i Eksempel 5 over repeteres vesentlig som beskrevet med de følgende unntakene. I tillegg til antistoffet eller antistoffkombinasjonen satt frem i behandlingsgruppene under, så vil dyrene motta en av de følgende tilleggsbehandlinger:
1. Bisfosfonat (for eksempel aredia; zometa; klodronat).
2. Kirurgi
3. Stråling
4. Kjemoterapi
5. Horomonterapi (for eksempel tamoxifen, anti-androgen terapi)
6. Antistoff terapi (for eksempel RANKL/RANK-nøytraliserende antistoffer; PTHrP-nøytraliserende antistoff) 7. Terapeutisk proteinterapi (for eksempel løselig RANKL-reseptor; OPG og PDG og MMP-hemmere)
8. Små-molekyl medikamentterapi (for eksempel Src-kinasehemmer)
9. Oligonukleotidterapi (for eksempel RANKL eller RANK eller PTHrP antisense)
10. Genterapi (for eksempel RANKL eller RANK-hemmere)
11. Peptidterapi (for eksempel muteiner av RANKL)
Behandlingsgruppene er som følger. De ovenfor nevnte tilleggsbehandlingene er indikert under som "puls-terapi X":
1. kunPBS
2. behandling med kun terapi X
3. rotte-IgGl isotype kotroll
4. muse-IGl isotype kontroll
5. kun RX1-antihumant MCSF
6. kun 5 Al rotte-IgGl anti-muse MCSF
7. rotte IgGl og muse-IgGl isotype kontrollkombinasjon
8. RX1 og 5A1 kombinasjon
9. rotte IgGl isotype kontroll pluss terapi X
10. muse-IGl isotype kontroll pluss terapi X
11. RX1 anti-humant MCSF pluss terapi X
12. 5 Al rotte IgGl anti-muse MCSF pluss terapi X
13. rotte IgGl og muse-IgGl isotype kontrollkombinasjon pluss terapi X
14. RXl og 5A1 kombinasjon pluss terapi X
Dosering: 0,1-30 mg/kg hvert antistoff anvendes for administrering til hvert dyr. Foretrukket dosering er 10 mg/kg. Administreringsruten kan være IV, IP, SC. Den foretrukne ruten er IP. Behandling vil begynne dager etter injeksjon av tumorceller, som beskrevet i Eksempel 5 over.
Målinger: For å undersøke alvorligheten av osteolyse blant de forskjellige behandlingsgrupper, så får hver mus tatt et grunnlinje Faxitron bilde dagen etter injeksjon av tumorceller. Et Faxitron-bilde ble også tatt på slutten av studien (8 uker). Tumorvekst blir samtidig målt ved å anvende xenogen-systemet fordi tumorcellene stabilt uttrykker luciferase. Det er forventet at kombinasjonsterapi for behandlingen og forebygging av alvorlig osteolytisk sykdom assosiert med cancermetastase vil være forbedret sammenlignet med antistoff terapien alene.
Eksempel 8
Det følgende eksempel tilveiebringer en protokoll for å evaluere evnen M-CSF-spesifikt antistoff har til å binde seg til for eksempel brystcancerceller (cellelinje MDA231) eller multippel myeloma cancerceller (cellelinje ARH77) ved å anvende en fluorescensaktivert cellesorterer.
Cellene ble først vasket to ganger med PBS (ingen Ca 2+ , Mg 2+). For hver 10 cm plate ble 2 ml 3 mM EDTA tilsatt, og platene ble innkubert ved 37°C i 2-3 minutter, inntil cellene rundet seg opp og begynte å løsne fra skåler. Deretter ble 10 ml buffer A (PBS 0 5% FBS) tilsatt og blandet. På det tidspunktet så ble cellene pelletert og resuspendert ved ca. 5 x IO6 celler/ml i PBS + 5% FBS, og cellene ble plassert in rør ved 100 ul/prøve.
På dette tidspunkt så ble 0,1-10 ng/ml av det primære antistoffet (anvendt som indikert konsentrasjon av M-CSF-antistoff eller kontrollantistoff) tilsatt. Fortynning, hvis det er nødvendig, ble gjort i 5% FBS/PBS. Blandingen ble så innkubert i 30 min ved 4°C. Etter innkuberingsperioden så ble cellene vasket 3 ganger ved hjelp av sentrifugering ved 400 g i 5 min, og cellene ble resuspendert i PBS.
Det FITC eller PE-merkede anti-IgG-antistoffet (0,25 ug/prøve) ble fortynnet i 1% B SA/PB S ved den optimale fortynningen, og cellene ble resuspendert i denne løsning og innkuberte i 30 min ved 4°C. Deretter ble cellene vasket 3 ganger som beskrevet over. Etter cellevaskene, ble celle resuspendert med 0,5 ml/prøve PI-PBS (hvis det er nødvendig å skille døde celler fra levende). Cellene kan også fikseres for senere analyse (cellene kan vare ca. 3 dager hvis de blir fiksert med 0,1% formaldehyd). Cellene ble så analysert i en fluorescensaktiv FACS ved å anvende standard prosedyrer.
Som vist i Figur 8A og 8B, så bandt et MCSF-spesifikt antistoff RX1 til brystcancercellelinjen MDA231 eller til multippel myeloma cancercellelinje ARH77 ved en rekke antistoffkonsentrasjoner som indikert.
Eksempel 9
Det følgende eksempelet viser at M-CSF er prevalent en rekke cancercelleoverflater. Immunhistokjemisk farging av M-CSF ble utført ved å anvende et M-CSF-spesifikt antistoff RX1 som følger.
Ved starten så ble objektglassene varmet i en ovn ved 55-60°C i 1 time og fikk lov til å kjøle seg i 2-3 minutter. De følgende awoksing og re-hydreringsparameterne ble anvendt:
Før det peroksidblokkerende trinnet, så ble antigen gjenvinning preparert ved å anvende 1 x Biogenex Citra Plus. Løsningen ble opprinnelig tatt i mikrobølgeovnen ved full kraft for å koke. Med en gang løsningen kokte, så ble mikrobølgen raskt satt i enda 13 min ved topp-nivå 2, og fikk lov til å kjøle seg ned før man gikk videre. Peroksidblokkeringstrinnt ble utført som følger. Objektglassene ble senket ned i 3% H2O2(25ml 30% til 250 ml dl H2O) og plassert ved romtemperatur i 10 minutter. Objektglassene ble deretter skylt to ganger med dl H20 og vasket med 1 x PBS 2x2 minutter.
Avidin/biotin blokkeringsprosedyren ble utført som følger. Objektglassene ble plassert flatt på et metallstativ. En blå PAP-pen ble anvendt (hydrofob objektglass markør) rundt vevet. Deretter så ble 2 dråper Zymed Avidin (Reagens A) - nok til å dekke vev - tilsatt og objektglassene ble innkubert ved romtemperatur i 10 min. Etter innkuberingen, så ble objektglassene vasket som følger:
2x3 minutt vasker i 1 X PBS
2 sråper Zymed biotin (Reagens B), romtemperatur i 10 min.
2x3 minutt vask i 1 X PBS
Protein blokkeringsprosedyren ble utført som følger. Først ble 10% serum (til 2% sluttkonsentrasjon) av sekundært antistoff tilsatt. BioGenex Power blokken ble deretter fortynnet IX med dl H2O. Stativene med objektglass ble senket ned i Power Block i 8 minutter ved romtemperatur og objektglassene ble skylt 2 X i IX PBS.
For tilsettingen av det primære antistoffet (RX1), ble objektglassene plassert flatt på et metallstativ. Antistoff ble tilsatt for å dekke hver seksjon (-350 ul), og antistoffet ble spredd med pipettetipp (hvis det er nødvendig) uten å skrape vevet. Objektglassene ble så innkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter innkuberingen så ble objektglassene vasket 3 x med 1 X PBS i 3-5 minutter hver gang. Ved dette tidspunkt ble BioGenex Multi-Link brukt på snitt og innkubert i 10-11 minutter ved romtemperatur. Snittene ble så vasket 3 minutter hver gang.
Merking ble utført ved å bruke BioGenex HRP-merking på snitt, som så ble innkubert ved romtemperatur i 10-11 min og vasket med IX PBS 3x3 min. Deretter ble BioGenex H202-substrat tilsatt (1 dråpe AEC for hver 2,5 ml H202) til snittene og innkuberte ved romtemperatur i 10 min. Snittene ble så skylt flere ganger med dl H20. Motfargingstrinnet ble utført som følger. Snittene ble farget med hematoksylin i 1 minutt ved romtemperatur. Deretter ble snittene renset med H2O to ganger og deretter innkubert i 1 X PBS i 1 minutt. Snitt ble så renset godt med H20 for å fjerne PBS. Snitt ble montert ved å bruke en dråpe BioGenex supermontering på snittet og deretter lufttørke over natt ved romtemperatur.
Som vist i Figur 9 så er M-CSF prevalent på en rekke cancercelleoverflater. Seksjoner for de indikerte cancercelletypene ble skåret som følger:
Eksempel 10
Det følgende eksempelet viser prosedyren for å produsere antistoffet MCI og MC3. MCI og MC3 er to monoklonale muse-antistoffer som nøytraliserer humant M-CSF antistoff og binder til et humant M-CSF. Aminosyresekvensene til disse antistoffene er vist i henholdsvis Figurene 14 og 15. De ble identifisert med en rekke trinn inkludert a) å immunisere Balb C-mus med rekombinant humant M-CSF; b) å screene for positive kloner som produserer antistoffer som binder seg til human M-CSF i et ELISA-format;
c) å subklone positive kloner for å generere stabile hybridoma-kloner; d) å skalere opp cellekulturen til å produsere store kvantiteter antistoff; e) å rense og karakterisere
antistoffer i affinitetsanalyse, cellebinding og nøytraliserings aktivitetsanalyse som beskrevet i tidligere eksempler.
Figurene 16A og 16B viser oppstillingen av CDRene til henholdsvis de tunge og lett kjedene, til antistoffer RX1, 5H4, MCI og MC3.
Human Engineered™ versjoner laget som beskrevet i eksemplet ovenfor.
Eksempel 11
Dette eksempel viser at M-CSF-antistoffer RX1 og 5H4, så vel som Fab-fragmenter av dem, har forskjellige nøytraliseringsaktiviteter. Det følgende eksempelet viser også at antistoffene RX1, 5H4 og MC3 har forskjellige affiniteter for M-CSF. Dette eksempel demonstrerer videre at affinitetene til de tidligere nevnte intakte antistoffene er høyere i forhold til Fab-fragmenter av de tidligere nevnte antistoffene.
Nøytraliseringsaktiviteter av intakte RX1 og 5H4 i forhold til Fab-fragmenter av RX1 og 5H4 ble bestemt ved å måle M-CSF-avhengig celleproliferering i nærværet av forskjellige konsentrasjoner av antistoff. Celleprolifereringen ble bestemt ved kjemiluminescent farge. Som vist i Figur 17 så har intakt RX1 den høyeste potensen, mens Fab-fragmentet RX1 mister dets potens og oppfører seg som 5H4 og 5H4 Fab-fragmentet.
Bindingsegenskaper til de ovenfor nevnte antistoffene ble analysert ved å anvende Biacore-analyser. For å bestemme de relative affinitetee til RX1, 5H4 og MC3 for M-CSF, ble kanin-anti-mus Fc immobilisert på en CM5 biosensor chip via aminkobling. De tidligere nevnte antistoffene ble så fanget på anti-muse Fc/CM5 biosensortypen ved 1,5 ug/ml i 3 min ved 2 ul/min. MCSF fløt over den modifiserte biosensoroverflaten ved forskjellige konsentrasjoner (Rmax -15). Testantistoffene og antigen ble fortynnet i 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20 (HBS-EP). Alle eksperimentene ble utført ved 25°C. Kinetikk og affinitetkonstanter ble bestemt ved å anvende bievaluerings software (Biacore) med en 1:1 interaksjonsmodell/global tilpasning. Som vist under i Tabell 8 så binder RX1 til M-CSF med den høyeste affiniteten i forhold til 5H4 og MC3.
For å bestemme de relative forskjellene i bindingsaffiniteten for intakt Mab og Fab-fragmenter av RX1, 5H4 og MC3, så ble en alternativ konfigurasjon anvendt i Biacore-analysen. Spesifikt så blir M-CSF immobilisert på CM5 biosensor chip via aminkobling. 0,05 ng/ml M-CSF i 10 mM Na-acetat, pH 4,0 ble injisert ved 1 ul/min i 5 minutter for å oppnå RL=6-12 RU. Testantistoff (eller Fab-fragment) fløt over den modifiserte biosensor overflaten ved forskjellige konsentrasjoner. Test-antistoffer ble fortynnet i 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaklant P20 (HBS-EP) og alle eksperimenter ble gjort ved 25°C. Kinetikk og affinitetskonstanter ble bestemt ved å anvende bioevalueringssoftware (Biacore) med en 1:1 interaksjon modell/global tilpasning. Som vist under i Tabell 9 så binder RX1 M-CSF med den høyeste affiniteten i forhold til de andre testede antistoffene. Fab-fragmentet av RX1 binder M-SCF med en signifikant lavere affinitet i forhold til RX1 holoproteinet.
Bindingsaffiniteten og nøytraliseringsdata indikerer at nøytraliseringsaktiviteten til RX1 skyldes primært dets bemerkelsesverdige høyaffinitet for M-CSF og at denne høye affiniteten kan skyldes i det minste delvis evnen begge armene av antistoffet har til å binde M-CSF-dimeren samtidig.
Eksempel 12
Det følgende eksempelet viser den lineære epitopen (dvs. aminosyresekvens) på M-CSF gjenkjent av antistoffene RX1, 5H4 og MC3.
Initielt så blir epitopkartleggingsstrategien designet for å bestemme om antistoffene RX1, 5h4 og MC3 gjenkjente lineære epitoper eller konformasjonelle epitoper innen M-
CSF. Følgelig så ble anti-M-CSF antistoffene testet mot 0,1 ug M-CSF under reduserende så vel som ikke-reduserende betingelser. Bare den ikke-reduserte formen av M-CSF ble gjenkjent av hver av antistoffene, noe som tyder på at epitopene som gjenkjennes er diskontinuerlig av natur.
Deretter så ble den lineære epitopen av M-CSF bestemt for hvert antistoff. Spesifikt så ble SPOT-membraner (Sigma Genosys) laget hvor M-CSF-fragmentsekvensen av interesse, som overlapper 1 Omer peptider syntetisert med en aminosyreforskyvning, ladet på cellulosemembran støtte. Disse membraner ble så proben med de tidligere nevnte antistoffene og reaktive SPOT ble identifisert. Peptidsekvensen ble så identifisert ved dens korresponderende lokalisering for membranen, og overlappende aminosyrer innen de positivt reagerende peptidene ble identifisert som epitopen. Som vist i Figur 18 så binder RX1 seg til den forskjellige, lineære epitop enn 5H4 og MC3, som kartlegges til en forskjellig lokalisering på M-CSF. RX1 binder til en lineær epitop representert ved RFRDNTPN (Sekv. id. nr. 120) eller RFRDNTAN (Sekv. id. nr. 121), aminosyrer 98-105 i M-CSF i Figur 12. 5H4 binder seg til en lineær epitop representert ved ITFEFVDQE (Sekv. id. nr. 122), aminosyrer 65-73 i M-CSF i Figur 12. MC3 binder seg til to lineære epitoper representert ved (1) ITFEFVDQE (Sekv. id. nr. 122), aminosyrer 65-73 i M-CSF i Figur 12 og (2) FYETPLQ (Sekv. id. nr. 123), aminosyrer 138-144 i M-CSF i Figur 12.
Eksempel 13
Bindingsaffiniteten til de Human Engineered™ versjonene av RX1-antistoffer laget som beskrevet over i Eksempel 4A ble bestemt. Dette eksempel viste at Human Engineered™ RX1-antistoffer med forskjellig IgG subklasse konstantregioner binder M-CSF med forskjellige affiniteter in vitro. For å bestemme de relative forskjellene i bindingsaffiniteten til intakte antistoffer ved hjelp av Biacore analyse, så ble M-CSF immobilisert på CM5 biosensor chip via aminkobling. 0,05 ug/ml M-CSF i 10 mM Na-acetat, pH 4,0 ble injisert ved 1 ul/min i 5 minutter for å oppnå RL=6-12 RU. Testantistoff eller Fab-fragmenter fløt over den modifiserte biosensor overflaten ved forskjellige konsentrasjoner i området fra 100 nM til 1,5 nM i 2-gangers fortynninger. Test-antistoffer ble fortynnet i 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20 (HBS-EP) og alle eksperimenter ble gjort ved 25°C. Hvert konsentrasjonspunkt og bufferblanker ble kjørt i triplikat og data ble samlet over 3 minutter fra assosiering og 8 minutter fra disassosiering. Kinetikk og affinitetskonstanter ble bestemt ved å anvende bioevaluerings software med en 1:1 interaksjonsmodell/global tilpasning. Som vist i Tabell 10 under, så binder heRXl-
1.G1 og heRXl-l.G4 M-CSF med affiniteter som nærmest ligner muse-RXl-M-CSF bindingsaffiniteten.
I motsetning til dette, som vist i Tabell 11 under, selv om det var noe variasjon i bindingsaffinitet, så viste alle gamma-2 konstruksjoner minst en 7-gangers nedgang i bindingsaffinitet sammenlignet med foreldre muse-antistoffet.
Eksempel 14
Dette eksempel viser at Human Engineered™ RX1-antistoffer med forskjellige IgG-subklasse konstantregioner innehar forskjellige nøytraliseringsaktiviteter in vitro. For å teste nøytraliseringsaktiviteten til M-CSF-antistoffer, så ble en prolifereringsanalyse av m-NFS-60 cellelinje anvendt (American Type Culture Collection, aksesjonsnr. CRL-1838, tilgjengelig fra ATCC i Rockville, MD, USA, utledet fra et myelogen leukemi indusert med Cas-Br.MuLV vill-mus ekotropisk retrovirus. Cellelinjen responderer på både interleukin 3 og M-CSF og inneholder et avkortet c-myb proto-onkogen forårsaket av integreringen av et retrovirus). Proliferering av M-NFS-60 krever aktivt M-CSF på en doseavhengig måte. I analysen så ble M-NFS-60-celler vasket og platet ut i RPIM 1640-medium med 10% FBS og 1% Pen/Strep. Rekombinant, humant M-CSF (ved 10 ng/ml sluttkonsentrasjon, som var ekvivalent med 3000 U/ml M-CSF-aktivitet), ble innkubert med forskjellige konsentrasjoner av antistoffer i området fra 1 ng/ml til 0,5 ng/ml (i serie 2-gangers fortynning) i 1 time ved 37°C i 5% CO2i en inkubator. Etter inkubasjonen ble blandingen tilsatt til M-NFS-60-kulturen i 96-brønners mikrotiterplater. Det totale analysevolumet per brønn var 100 ni, med 10 ng/ml M-CSF, og antistoffkonsentrasjonen indikert. Celler ble innkubert ved 37°C under 5% CO2i 72 timer før celletallet ble kvantifisert ved CelleTiter Glo-analyse (Promega). Hvert antistoff ble testet i triplikat, med repetisjon den følgende dagen (en total på seks analyse per antistoff). IC50 til hvert antistoff ble analysert ved hjelp av kurvetilpasning.
Analysen ble repetert ved å anvende humant MCSF i serum, MDA231-kondisjonert medium (som inneholder M-CSF), cynomolg ape MCSF i serum og cynomolg ape rekombinant MCSF. Resultatene er presentert i Figurene 25 (rekombinant MCSF), 26 (humant MCSF i serum) og 27 (MDA231-kondisjonert medium) som den fluorescerende lesingen fra CellTiter Glo-analyse, som er lineær med celletall. Nøytraliseringsaktivitet av antistoffene er vist som en hemming av proliferasjonen av M-NFS-60-celler.
Resultatene viser at IC50 til heRXl-1-IgGl og heRXl-l-IgG4 var ca. den samme som det rekombinante museforeldre RX1-antistoffet, mens IC50 til heRXl-l-IgG2 var ca. 2 til 4 ganger høyere.
Tabell 12 under viser den relative IC50 (uttrykt som IC50 ganger tap) av de forskjellige IgG2-konstruksjonene laget som beskrevet over i Eksempel 4A. Av disse konstruksjonene så viser heRXl-1.G2 og heRXl-10.G2 den minste reduksjonen i IC50.
Eksempel 15
Dette eksempelet viser at Human Engineered™ RX1-antistoffer med forskjellig IgG-subklasse konstantregioner innehar forskjellige TRAP-aktiviteter i en in vitro osteoklastogeneseanalyse.
De humane benmargs CD34+-cellene (Biowhittaker katalog nr. 2M-101 A, 3 x IO<5>celler/rør) ble indusert til å differensiere til osteoklaster under de eksperimentelle betingelsene som er beskrevet her. På Dag 1 ble CD34+-celler tinet fra frosne rør i 10 ml medium (Alfa MEM med 10% FCS, 1 x Pen Strep og 1 x fungizone). Cellene ble vasket en gang og resuspendert i 2 ml medium og plassert i en 96-brønnes plate med 100 ul per brønn. På Dag 2, uten å fjerne det opprinnelige mediet, ble 50 ul 4 x CSF-1 til 30 ng/ml sluttkonsentrasjon og 50 ul 4 x RANKL (sRANKL, Chemicon katalog nr. GF091, 10 ug/pakke) til sluttkonsentrasjonen på 100 ng/ml tilsatt til hver brønn. På Dag 7 ble 50 ul 5 x RANKL til sluttkonsentrasjon 100 ng/ml tilsatt hver brønn. På dag 17 ble cellene farget for TRAP-aktivitet (leukocytt sur fosfatasekitt for TRAP-farging, Sigma katalog nr. 387-A) og undersøkt under mikroskopet.
M-CSF-nøytraliserende antistoffer tilsettes på Dag 2 av analysen. Antistoffene hemmer osteoklastdifferensiering på en doseavhengig måte som vist i Figur 28. Den hemmende aktiviteten til antistoffene i osteoklast differensieringsanalysen er vist som mangel på synlig osteoklaster på Dag 17 i analysen.
Eksempel 16
De Human Engineered™ RX1-antistoffene med forskjellig IgG subklasse konstantregioner ble viderekarakterisert.
Antigen-antistoffkompleksene som de forskjellige Human Engineered™ RX1-antistoffene dannet med MCSF ble studert ved å kombinere M-CSF og antistoff i buffer ved like molare forhold, etterfulgt av analyse av størrelsen av antigen-antistoffkomplekset ved å anvende størrelseseksklusjonskromatografi eller lysspredning. Resultatene viser museforeldre RX1 syntes å danne 1:1 komplekser med MCSF på ca. 200 kDa. heRXl-9.G2 eller l-10.G2-antistoffene syntes å danne 2:1 eller 2:2 komplekser med MCSF på ca. 400 kDa. heRXl-l.G2 syntes å danne store gitteraggregater med MCSF som var større enn 2 x IO<6>Da. IgGl og IgG4-konstruksjonene dannet små komplekser lignende de til museforeldre RX1.
Denaturerende reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE av heRXl-1.G4 viste at IgG4-versjonen syntes å danne halv-antistoffer, som forventet.
Fra det foregående så vil det forstås at, selv om spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen er blitt beskrevet her for illustrasjonsformål, så kan forskjellige modifikasjoner gjøres uten å avvike fra omfanget av oppfinnelsen.

Claims (18)

1. Humanisert anti-M-CSF-antistoff, der: (i) den tunge kjeden omfatter den tunge kjedevariable regionsekvensen satt fram i Sekv. id. nr. 43 og en IgGl-konstantregion; og (ii) den lette kjeden omfatter den lette kjedevariable regionsekvensen satt fram i Sekv. id. nr. 53.
2. Antistoff ifølge krav 1, som omfatter den tunge kjedesekvensen satt frem i Sekv. id. nr.
116.
3. Antistoff ifølge krav 1 eller 2, der den lette kjeden omfatter en human kappa konstantregion.
4. Farmasøytisk sammensetning, som omfatter et antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, og en farmasaøytisk egnet bærer, hjelpemiddel eller fortynner.
5. Antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, for anvendelse i terapeutiske applikasjoner som involverer in vzvo-administrering til et menneske.
6. Antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, for anvendelse ved forebygging eller behandling av et individ påført en sykdom som forårsaker eller bidrar til osteolyse, der nevnte antistoff effektivt reduserer alvorligheten av bentap assosiert med sykdommen.
7. Antistoff for anvendelse ifølge krav 6, der nevnte sykdom er valgt fra gruppen bestående av metabolske bensykdommer assosiert med relativt øket osteoklastaktivitet, inkludert endokrinopatier (inkludert hyperkortisolisme, hypogonadisme, primær eller sekundær hyperparatyroidisme, hypertyroidisme), hyperkalsemi, mangeltilstander (inkludert rakitt/knokkelskjørhet, skjørbuk, feilernæring), kroniske sykdommer (inkludert malabsorpsjon syndromer, kronisk nyrefeil (inkludert nyre osteodystrofi)), kronisk leversykdom (inkludert hepatisk osteodystrofi), medikamenter (inkludert glukokortikoider (inkludert glukokortikoid-indusert osteoporose), heparin, alkohol) og arvelige sykdommer (inkludert ufullstendig osteogenese, homocystinuria), cancer, osteoporose, osteopetrose, inflammasjon av ben assosiert med artritt og reumatoid artritt, periodontal sykdom, fibrøs dysplasi og/eller Pagets sykdom.
8. Antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, for anvendelse ved forebygging eller behandling av metastatisk cancer til ben, der den metastatiske canceren er bryst, lunge, nyre, multippel myeloma, tyroid, prostata, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter, inkludert leukemi og lymfoma; hode- eller nakke cancere; gastrointestinale cancere, inkludert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pankreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangen eller galleblæren; ondartetheter i det kvinnelige reproduksjonssystemet, inkludert ovariekarsinoma, livmor endometriale cancere, vaginal cancer og cervikal cancer; blærecancer; hjernecancer, inkludert neuroblastoma; sarkoma, osteosarkoma; eller hudcancer, inkludert ondartet melanoma eller skjellet cellecancer.
9. Anvendelse av antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, til fremstilling av et medikament for å forebygge eller redusere bentap hos en pasient som har osteolyse.
10. Anvendelse av antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som lider av en sykdom som forårsaker eller bidrar til osteolyse.
11. Anvendelse ifølge krav 10, der nevnte sykdom er valgt fra gruppen bestående av metabolske bensykdommer assosiert med relativt øket osteoklastaktivitet, inkludert endokrinopatier (inkludert hyperkortisolisme, hypogonadisme, primær eller sekundær hyperparatyroidisme, hypertyroidisme), hyperkalsemi, mangeltilstander (inkludert rakitt/knokkelskjørhet, skjørbuk, feilernæring), kroniske sykdommer (inkludert malabsorpsjon syndromer, kronisk nyrefeil (inkludert nyre osteodystrofi)), kronisk leversykdom (inkludert hepatisk osteodystrofi), medikamenter (inkludert glukokortikoider (inkludert glukokortikoid-indusert osteoporose), heparin, alkohol) og arvelige sykdommer (inkludert ufullstendig osteogenese, homocystinuria), cancer, osteoporose, osteopetrose, inflammasjon av ben assosiert med artritt og reumatoid artritt, periodontal sykdom, fibrøs dysplasi og/eller Pagets sykdom.
12. Anvendelse av antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, til fremstilling av et medikament for forebygging eller behandling av metastatisk cancer til ben hos en pasient som lider av metastatisk cancer.
13. Anvendelse ifølge krav 12, der den metastatiske canceren er bryst, lunge, nyre, multippel myeloma, tyroid, prostata, adenokarsinoma, blodcelle ondartetheter, inkludert leukemi og lymfoma; hode- eller nakke cancere; gastrointestinale cancere, inkludert esofageal cancer, mage cancer, kolon cancer, tarm cancer, kolorektal cancer, rektal cancer, pankreatisk cancer, lever cancer, cancer i gallegangen eller galleblæren; ondartetheter i det kvinnelige reproduksjonssystemet, inkludert ovariekarsinoma, livmor endometriale cancere, vaginal cancer og cervikal cancer; blærecancer; hjernecancer, inkludert neuroblastoma; sarkoma, osteosarkoma; eller hudcancer, inkludert ondartet melanoma eller skjellet cellecancer.
14. Anvendelse av antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1-3, til fremstilling av et medikament for å behandle en pasient som har cancer.
15. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9-14, der mengden antistoff i medikamentet er effektivt til å hemme osteoklast proliferering og/eller differensiering som induseres av tumorceller.
16. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9-14, der mengden antistoff i medikamentet er ved en dose som er effektiv til å redusere dosen av andre terapeutiske middel som er nødvendig for å oppnå en terapeutisk effekt.
17. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 9-14, der mengden antistoff i medikamentet er ved en dose mellom ca. 2 ug/kg til 30 mg/kg kroppsvekt.
18. Anvendelse ifølge krav 17, der mengden antistoff i medikamentet er ved en dose mellom ca. 0,1 mg/kg til 30 mg/kg kroppsvekt, eller der mengden antistoff i medikamentet er ved en dose mellom ca. 0,1 mg/kg til 10 mg/kg kroppsvekt.
NO20063569A 2004-01-07 2006-08-07 M-CSF-spesifikt monoklonalt antistoff og anvendelse derav NO341391B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53518104P 2004-01-07 2004-01-07
US57641704P 2004-06-02 2004-06-02
PCT/US2005/000546 WO2005068503A2 (en) 2004-01-07 2005-01-06 M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20063569L NO20063569L (no) 2006-10-06
NO341391B1 true NO341391B1 (no) 2017-10-30

Family

ID=34798846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20063569A NO341391B1 (no) 2004-01-07 2006-08-07 M-CSF-spesifikt monoklonalt antistoff og anvendelse derav

Country Status (25)

Country Link
US (6) US20090324604A1 (no)
EP (3) EP3476861A1 (no)
JP (3) JP5422101B2 (no)
KR (2) KR101307868B1 (no)
CN (2) CN101189264B (no)
AU (1) AU2005205533B2 (no)
BR (1) BRPI0506726B8 (no)
CA (1) CA2552750C (no)
CY (1) CY1121162T1 (no)
DK (2) DK2311873T3 (no)
EC (1) ECSP066756A (no)
ES (2) ES2543833T3 (no)
HK (1) HK1095841A1 (no)
HU (2) HUE039803T2 (no)
IL (1) IL176755A (no)
LT (1) LT2311873T (no)
MX (1) MXPA06007856A (no)
NO (1) NO341391B1 (no)
NZ (1) NZ548785A (no)
PL (2) PL1704166T3 (no)
PT (2) PT1704166E (no)
RU (2) RU2401277C2 (no)
SI (2) SI2311873T1 (no)
TR (1) TR201815885T4 (no)
WO (1) WO2005068503A2 (no)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6913697B2 (en) 2001-02-14 2005-07-05 Science & Technology Corporation @ Unm Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
EP3476861A1 (en) 2004-01-07 2019-05-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
EP2277916A3 (en) * 2005-07-28 2011-04-27 Novartis AG Use of antibody to M-CSF
WO2007016285A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Novartis Ag M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
EP2705854A1 (en) * 2006-01-05 2014-03-12 Novartis AG Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis
EP2035549B1 (en) 2006-05-31 2014-07-09 Children's Medical Center Corporation Abcb5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
AR062435A1 (es) * 2006-08-18 2008-11-05 Xoma Technology Ltd Anticuerpo especifico prlr (receptor de prolactina) y sus usos
CN101627055A (zh) 2006-09-05 2010-01-13 梅达雷克斯公司 骨形成蛋白及其受体的抗体以及它们的使用方法
CN101594883B (zh) * 2006-10-12 2018-04-10 中外制药株式会社 使用抗ereg抗体的癌症的诊断和治疗
ES2627923T3 (es) 2007-01-11 2017-08-01 Novo Nordisk A/S Anticuerpos anti-KIR, formulaciones y usos de los mismos
EP2644205B1 (en) 2007-04-12 2018-06-13 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Targeting ABCB5 for cancer therapy
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
NZ587830A (en) 2008-03-14 2012-08-31 Transgene Sa Antibody against the colony-stimulating factor-1 receptor (CSF-1R)
WO2009136382A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Abbott Gmbh & Co. Kg Antibodies to receptor of advanced glycation end products (rage) and uses thereof
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
SG183356A1 (en) 2010-02-18 2012-09-27 Univ California INTEGRIN aVß8 NEUTRALIZING ANTIBODY
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
CA2824060C (en) * 2011-01-10 2021-05-11 Novimmune S.A. Anti-tlr4 antibodies and methods of use thereof
CN103547288B (zh) 2011-01-10 2016-03-16 密执安大学评议会 干细胞因子抑制剂
MX336740B (es) * 2011-03-29 2016-01-29 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
CA2841013C (en) * 2011-07-18 2020-04-21 Morphosys Ag Use of c-fms antagonists
JP6093360B2 (ja) 2011-08-17 2017-03-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インテグリンα−ｖβ−８と結合する抗体
CN104039809A (zh) * 2011-10-10 2014-09-10 希望之城公司 中间位和中间位结合抗体及其用途
RU2473367C1 (ru) * 2011-11-22 2013-01-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение "Радиевый институт им. В.Г. Хлопина" Способ изготовления стента для радиационной терапии злокачественных опухолей желчного протока
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
CN104540519B (zh) 2012-05-21 2018-06-01 基因泰克公司 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
US20150239968A1 (en) 2012-09-26 2015-08-27 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15)
CA2906417C (en) 2013-03-14 2022-06-21 Robert Ziemann Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies
BR112015023239A8 (pt) 2013-03-14 2018-04-17 Abbott Lab ensaio de combinação de anticorpo-antígeno de hcv e métodos e composições para uso do mesmo
WO2014143342A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbott Laboratories Hcv ns3 recombinant antigens and mutants thereof for improved antibody detection
BR112015025622A2 (pt) 2013-04-12 2017-07-18 Morphosys Ag anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor, e célula hospedeira isolada
WO2015006554A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
MY176026A (en) 2013-09-13 2020-07-22 Genentech Inc Methods and composions comprising purified recombinant polypeptides
JP6546178B2 (ja) 2013-09-13 2019-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞株中の宿主細胞タンパク質及び組換えポリペプチド産物を検出及び定量化するための組成物並びに方法
US9290578B2 (en) 2013-10-21 2016-03-22 Genentech, Inc. Anti-Ly6E antibodies and methods of use
EP3083946A4 (en) 2013-12-16 2017-08-16 The University of North Carolina at Chapel Hill Depletion of plasmacytoid dendritic cells
BR122023027559A2 (pt) 2014-03-26 2024-01-30 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Anticorpos monoclonais para fator de crescimento e diferenciação 15 (gdf-15), estojo compreendendo os mesmos, vetor de expressão que codifica os mesmos e linhagem de célula capaz de produzir os mesmos
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
AU2015333687B2 (en) 2014-10-14 2021-03-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody molecules to PD-L1 and uses thereof
WO2016120828A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Novartis Ag Treatment of breast cancer by m-csf antagonist
WO2016137985A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 Merck Patent Gmbh Pd-1 / pd-l1 inhibitors for the treatment of cancer
KR20170132749A (ko) * 2015-03-31 2017-12-04 브이에이치스퀘어드 리미티드 폴리펩티드
MX2017016324A (es) 2015-06-16 2018-03-02 Merck Patent Gmbh Tratamientos de combinacion de antagonista de ligando 1 de muerte programada (pd-l1).
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
WO2017017623A1 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combined use of anti pd-1 and anti m-csf antibodies in the treatment of cancer
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
WO2017049038A2 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Ablexis, Llc Anti-cd115 antibodies
CN108495651A (zh) 2015-12-17 2018-09-04 诺华股份有限公司 抗pd-1的抗体分子及其用途
WO2018022505A1 (en) * 2016-07-29 2018-02-01 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions and methods for reducing adiposity by inhibiting fsh/fshr
BR112019006504A2 (pt) 2016-10-06 2019-06-25 Merck Patent Gmbh regime de dosagem de avelumabe para o tratamento de câncer
WO2018089300A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
MX2019006448A (es) 2016-12-01 2020-02-05 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pd-l1 radiomarcados para imagenes de inmuno-pet.
MA47747A (fr) * 2017-03-09 2020-01-15 Shriners Hospitals Children Tests de mesure du collagène de type x et méthodes d'utilisation de ceux-ci
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
SG11201909955XA (en) 2017-05-02 2019-11-28 Merck Sharp & Dohme Formulations of anti-lag3 antibodies and co-formulations of anti-lag3 antibodies and anti-pd-1 antibodies
JP6356317B1 (ja) * 2017-06-05 2018-07-11 国立大学法人北海道大学 多発性骨髄腫患者の医薬への応答性を判定する方法、並びに多発性骨髄腫患者における骨病変の予防及び／又は治療のための医薬
WO2018237157A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019018525A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS BINDING TO CD123
AU2018368731A1 (en) 2017-11-16 2020-05-14 Novartis Ag Combination therapies
CA3090840A1 (en) * 2018-02-09 2019-08-15 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies directed against cd3 and cd20 and their uses
UY38247A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020044252A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Dosage regimes for anti-m-csf antibodies and uses thereof
JP7467438B2 (ja) * 2018-10-18 2024-04-15 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 抗ｒｓｖ抗体の製剤及びその使用方法
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
MX2021009763A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina -2,6-diona y usos de los mismos.
KR20210129672A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
CN114929274A (zh) * 2019-10-17 2022-08-19 台湾卫生研究院 琥珀酸作为用于癌症诊断和治疗的生物标记的用途
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
CN111087470B (zh) * 2020-01-19 2022-05-10 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用
BR112022026202A2 (pt) 2020-06-23 2023-01-17 Novartis Ag Regime de dosagem compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996008565A2 (en) * 1994-09-16 1996-03-21 Cancer Research Fund Of Contra Costa RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES
WO2001030381A2 (de) * 1999-10-28 2001-05-03 Hofbauer, Reinhold Verwendung von csf-1-inhibitoren
US20020141994A1 (en) * 2000-03-20 2002-10-03 Devalaraja Madhav N. Inhibitors of colony stimulating factors
WO2004045532A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Chiron Corporation Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
GB2056642B (en) 1979-08-08 1983-05-11 Dawson Int Radio frequency drying of textile material
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
JPS6213552A (ja) 1985-07-12 1987-01-22 Nippon Light Metal Co Ltd 流電陽極用アルミニウム合金
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4929700A (en) 1987-04-16 1990-05-29 Cetus Corporation Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE69028095T2 (de) 1989-02-10 1997-02-06 Cetus Oncology Corp M-csf-monoklonale antikörper, die ein neutralisierendes konformationales epitop erkennen
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB8915572D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Natural Environment Res Use of bluetongue virus proteins as vaccine components
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPH05503098A (ja) 1989-12-15 1993-05-27 カイロン　コーポレイション セプシスの処理のためのサイトカイン抗体
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JPH0517367A (ja) 1991-07-08 1993-01-26 Green Cross Corp:The 骨粗鬆症治療剤
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JPH0595794A (ja) * 1991-10-04 1993-04-20 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
JPH06319584A (ja) * 1993-05-07 1994-11-22 Morinaga Milk Ind Co Ltd 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ
US5807549A (en) 1993-05-21 1998-09-15 Research Corporation Technologies, Inc. Lymphocyte chemoattractant factor and uses thereof
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6054287A (en) 1994-05-27 2000-04-25 Methodist Hospital Of Indiana, Inc. Cell-type-specific methods and devices for the low temperature preservation of the cells of an animal species
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6025146A (en) * 1995-06-05 2000-02-15 Chiron Corporation Identification of M-CSF agonists and antagonists
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
GB9712818D0 (en) 1996-07-08 1997-08-20 Cambridge Antibody Tech Labelling and selection of specific binding molecules
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6017757A (en) 1997-02-20 2000-01-25 Mississippi State University Isolated viable nematode intestinal cells
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
IL123888A0 (en) 1997-04-01 1998-10-30 Sankyo Co Anti-fas antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
DE122010000049I1 (de) 1997-04-15 2011-05-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Neues protein und verfahren zu dessen herstellung
US20030044772A1 (en) 1997-08-04 2003-03-06 Applied Molecular Evolution [Formerly Ixsys] Methods for identifying ligand specific binding molecules
WO1999029345A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 La Jolla Institute For Experimental Medicine Inhibition of tumor growth by macrophage intervention
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2001034177A2 (en) * 1999-11-08 2001-05-17 The Government Of The United States Of America, A S Represented By The Secretary, Department Of Hea Lth & Human Services, The National Institutes Of Health Method of treating a viral infection using antagonists of macrophage colony stimulating factor
US7455836B2 (en) * 2000-05-08 2008-11-25 The University Of Melbourne Method of treatment and agents useful for same
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
JP4503155B2 (ja) 2000-08-28 2010-07-14 北川工業株式会社 導電スペーサ
GB0028647D0 (en) 2000-11-24 2001-01-10 Nextgen Sciences Ltd Apparatus for chemical assays
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
US7074175B2 (en) 2001-07-25 2006-07-11 Erik Schroeder Handy Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
TW200303759A (en) * 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
AU2003216778A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-30 Institut Curie Antisense compounds directed against human CSF-1
US20030138857A1 (en) 2002-01-15 2003-07-24 Goldschmidt-Clermont Pascal J. Method of inhibiting atherosclerotic plaque destabilization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
SI1527100T1 (sl) 2002-03-29 2009-12-31 Schering Corp Humana monoklonska protitelesa proti interlevkinu-5 in postopki in sestavki, ki jih obsegajo
US7598258B2 (en) 2002-05-01 2009-10-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Quinoline derivatives and quinazoline derivatives inhibiting autophosphorylation of macrophage colony stimulating factor receptor
EP1575499A2 (en) * 2002-06-28 2005-09-21 Centocor, Inc. Mammalian epo mimetic ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
EP3476861A1 (en) * 2004-01-07 2019-05-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. M-csf-specific monoclonal antibody and uses thereof
WO2007016285A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-08 Novartis Ag M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
JP5095794B2 (ja) 2010-10-05 2012-12-12 ヤフー株式会社 レコメンデーション連携装置及びその方法
JP6319584B2 (ja) 2015-02-27 2018-05-09 京セラドキュメントソリューションズ株式会社 画像形成システム

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996008565A2 (en) * 1994-09-16 1996-03-21 Cancer Research Fund Of Contra Costa RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES
WO2001030381A2 (de) * 1999-10-28 2001-05-03 Hofbauer, Reinhold Verwendung von csf-1-inhibitoren
US20020141994A1 (en) * 2000-03-20 2002-10-03 Devalaraja Madhav N. Inhibitors of colony stimulating factors
WO2004045532A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Chiron Corporation Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis

Also Published As

Publication number Publication date
DK2311873T3 (en) 2018-11-26
NO20063569L (no) 2006-10-06
EP1704166A2 (en) 2006-09-27
DK1704166T3 (en) 2015-06-01
EP2311873A1 (en) 2011-04-20
KR101352853B1 (ko) 2014-02-04
BRPI0506726A (pt) 2007-05-02
EP3476861A1 (en) 2019-05-01
JP2013208125A (ja) 2013-10-10
ES2689328T3 (es) 2018-11-13
SI1704166T1 (sl) 2015-06-30
BRPI0506726B1 (pt) 2021-05-11
JP2008500806A (ja) 2008-01-17
IL176755A0 (en) 2006-10-31
CY1121162T1 (el) 2020-05-29
US9079956B2 (en) 2015-07-14
ECSP066756A (es) 2006-12-29
CN107090034B (zh) 2021-10-01
CN101189264A (zh) 2008-05-28
LT2311873T (lt) 2018-10-25
EP2311873B1 (en) 2018-08-29
US20180171009A1 (en) 2018-06-21
EP1704166B1 (en) 2015-04-29
PL2311873T3 (pl) 2019-01-31
WO2005068503A3 (en) 2005-11-10
HUE039803T2 (hu) 2019-02-28
AU2005205533B2 (en) 2012-03-22
MXPA06007856A (es) 2007-03-23
PT2311873T (pt) 2018-11-20
US20170152311A1 (en) 2017-06-01
US20090324604A1 (en) 2009-12-31
PL1704166T3 (pl) 2015-10-30
JP5422101B2 (ja) 2014-02-19
HUE026132T2 (en) 2016-05-30
US20190263900A1 (en) 2019-08-29
KR20070034455A (ko) 2007-03-28
RU2010121565A (ru) 2011-12-10
TR201815885T4 (tr) 2018-11-21
US9926371B2 (en) 2018-03-27
US20160015809A1 (en) 2016-01-21
CN107090034A (zh) 2017-08-25
US11034759B2 (en) 2021-06-15
PT1704166E (pt) 2015-09-04
RU2006128586A (ru) 2008-02-20
ES2543833T3 (es) 2015-08-24
RU2401277C2 (ru) 2010-10-10
US20140242071A1 (en) 2014-08-28
WO2005068503A2 (en) 2005-07-28
KR101307868B1 (ko) 2013-09-12
CA2552750C (en) 2021-11-09
NZ548785A (en) 2011-08-26
AU2005205533A1 (en) 2005-07-28
CA2552750A1 (en) 2005-07-28
JP2011078435A (ja) 2011-04-21
SI2311873T1 (sl) 2018-12-31
CN101189264B (zh) 2017-10-10
US9522186B2 (en) 2016-12-20
BRPI0506726B8 (pt) 2021-05-25
HK1095841A1 (en) 2007-05-18
KR20120107147A (ko) 2012-09-28
IL176755A (en) 2015-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11034759B2 (en) Humanized M-CSF specific monoclonal antibodies, kits, and uses thereof
US8652469B2 (en) M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof
JP2008500806A5 (no)
EP1913028A2 (en) Use of antibody to m-csf
ZA200606531B (en) M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof