TR201815885T4 - M-csf spesifik monoklonal antikorlar ve bunların kullanımı. - Google Patents

M-csf spesifik monoklonal antikorlar ve bunların kullanımı. Download PDF

Info

Publication number
TR201815885T4
TR201815885T4 TR2018/15885T TR201815885T TR201815885T4 TR 201815885 T4 TR201815885 T4 TR 201815885T4 TR 2018/15885 T TR2018/15885 T TR 2018/15885T TR 201815885 T TR201815885 T TR 201815885T TR 201815885 T4 TR201815885 T4 TR 201815885T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
human
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
TR2018/15885T
Other languages
English (en)
Inventor
Liu Cheng
Lee Zimmerman Deborah
Martin Harrowe Gregory
Koths Kirston
Michael Kavanaugh William
Long Li
Calderon-Cacia Maria
H Horwitz Arnold
Original Assignee
Novartis Vaccines & Diagnostics Inc
Xoma Technology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Vaccines & Diagnostics Inc, Xoma Technology Ltd filed Critical Novartis Vaccines & Diagnostics Inc
Publication of TR201815885T4 publication Critical patent/TR201815885T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A61K31/663—Compounds having two or more phosphorus acid groups or esters thereof, e.g. clodronic acid, pamidronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

M-CSF spesifik RX1 bazlı ve RX-1 türevi antikorlar ve aynı zamanda bu antikoru içeren farmasötik bileşimler, bir farmasötik bileşim içeren kitler ve bir osteolitik hastalıktan muzdarip bir bireyde kemik kaybının önlenmesi ve tedavi edilmesine yönelik yöntemler sağlanmaktadır.

Description

TARIFNAME M-CSF SPESIFIK MONOKLONAL ANTIKORLAR VE BUNLARIN KULLANIMI TEKNIK ALAN Mevcut bulus, bir bireydeki osteoliz (kemik erimesi), kanser metastazi ve kanser metastazi ile iliskili kemik kaybinin önlenmesi veya tedavi edilmesi için kullanilan bir antikoru içeren farmasötik bir bilesim ve bir ürün ile ilgilidir.
BULUSUN ARKAPLANI Kanserin, kanser hastalarinda operasyon sonrasi veya tedavi sonrasi tekrar nüksetmesinin baslica nedeni kanser metastazidir.
Tedavilerin gelistirilmesi için yogun çabalara ragmen, kanser metastazi tedaviye büyük ölçüde refrakter olmaya devam etmektedir. Kemik, çesitli insan kanserleri (örnegin, meme, akciger, prostat ve tiroid kanserleri) tiplerinin metastazinin en yaygin alanlarindan biridir. Osteolitik kemik metastazlarin ortaya çikmasi, inatçi agriya, kiriga karsi yüksek duyarliliga, sinir sikismasina ve hiperkalsemiye ragmen ciddi nmrbiditeye neden olur. Bu klinik problemlerin önemine ragmen, kanser netastazi ile alakali kemik kaybi için birkaç nevcut tedavi bulunmaktadir.
Osteoklastlar, kemik emilimine aracilik. eder. Osteoklastlar, hemopoietik hücrelerden farklilasan çok çekirdekli hücrelerdir.
Genel olarak kabul edilen, osteoklastlarin, tamamlanmamis hücre bölümlerinden baska kemik iligi içindeki hemopoietik kök hücrelerinden türetilmis mononükleer öncülerinin. füzyonu. ile olusmasidir (Chambers, Bone and Mineral Research, 6:1- 25, 1989; monosit-makrofaj soy hücreleri ile bir ortak kök hücreyi osteoklastlar içerisine osteoklast öncülerinin farklilasmasi hormonal ve lokal uyaricilar dahil olmak üzere farkli faktörleri 188, 1991) ve canli kemik ve kemik hücrelerinin, osteoklast gelisiminde önemli bir rol oynadigini göstermistir (Hagenaars ve stromal hücreleri de osteoklast farklilasma için gerekmektedir.
Osteoklast olusumunu destekleyen bu hücreler ile üretilmis faktörlerin biri makrofaj-koloni stimüle edici faktör, M-CSF'dir (Wiktor-Jedrzejczak ve dig, Proc Natl Acad Sci USA 87: 4828- ligandi için reseptör aktivatörü, içerisinde steoblastik/stromal hücrelerinin, osteoklastlar ve osteoklast öncülleri (Lacey et reseptör, RANK (TRANCER) vasitasiyla osteoklast olusumunu ve resorpsiyonu stimüle etmesi dogrultusunda bir baska sinyalidir zamanda, osteoprotegerin olarak adlandirilan (OPG, ayni zamanda OCIF olarak da bilinen) osteoklast olusumunu kuvvetli bir sekilde inhibe eden bir proteini salgilamakta ve RANKL için bir sahte reseptör olarak hareket etmekte olup böylece RANK ve RANKL vasitasiyla osteoklastlar ve osteoblastlar arasindaki pozitif sinyali inhibe etmektedir.
Osteoklastlar` hem mineral hem de organik kemik matriksinin eritilmesinden sorumludur (Blair ve dig, J Cell Biol 102: 1164- 1172, 1986). Ostoeklastlar, örnegin, tartrata dirençli asit fosfataz (TRAP) (Anderson ve dig 1979), karbonik anhidraz 11 Vitronektin reseptörü (Davies ve dig, J Cell Biol 109: 1817- 1826, 1989) gibi sitoplasmik isaretleyicileri ve özellestirilmis membran alanlari ve bazi membran ile bir tek polarize edilmis morfolojiyi ifade eden son olarak farklilastirilmis hücreleri temsil etmektedir. Çok çekirdekli osteoklastlar genellikle 10 çekirdekten daha azini içermektedir* ancak. 10 ve 100 pm. çap arasinda olabilen. 100 çekirdekten. fazlasini içerebilmektedir onlarin isik mikroskopu ile tanimlanmasini nispeten kolay hale getirmektedir. Aktif durumdayken oldukça yüksek biçimde vakuol olmaktadir ve ayni zamanda yüksek metabolizma hizinin bir göstergesi olan birçok mitokondri içermektedir (Mundy, in Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, s. 18-22, 1990). Osteoklastlarin osteolitik kemik metastazinda önemli bir rol oynamasindan dolayi, teknikte osteoklast stimülasyonu ve fonksiyonun önlenmesinde yeni ajanlar ve metotlara ihtiyaç duyulur.
Bu nedenle, teknikte osteolitik kemik. metastazi dahil olmak üzere osteoliz veya kanser metastazin tedavi edilmesinde veya önlenmesinde yeni ajanlarin ve metotlarin tanimlanmasina ihtiyaç MEVCUT BULUSUN ÖZETI Mevcut bulusun materyalleri ve metotlari, teknikte yukarida bahsi geçen ve diger ilgili gereksinimleri karsilamaktadir.
Bulus, asagidakileri içeren bir antikor içeren farmasötik bir bilesim saglamaktadir: Ü] SEK ID NO: 116'da ifade edilen sekansi içeren bir agir zincir; ve GH SEK 1D NO: 53'te ifade edilen hafif zincir degisken bölge sekansini içeren bir hafif zincir, ve farmasötik olarak uygun bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici, burada söz konusu bilesim, uygun bir çözelti ile sulandirmak için uygun bir tozdur.
Bulus ayni zamanda, bir konteynir ve bir etiket içeren bir ürün saglamakta olup, burada söz konusu konteynir, bir sise, flakon, siringa ve test tüplerinden seçilir ve söz konusu konteynir, asagidakileri içeren bir bilesimi muhafaza etmektedir: (H SEK ID NO: ll6'da ifade edilen sekansi içeren bir agir zincir; ve GH SEK ID NO: 53'te ifade edilen hafif zincir degisken bölge sekansini içeren bir hafif zincir.
Bulus ayni zamanda, tedavide kullanilmaya yönelik bulusun bir farmasötik bilesimini veya bir ürününü saglamaktadir.
Fonksiyonel fragmani dahil murin olmayan bir monoklonal antikoru burada açiklanmakta olup, sirasiyla Sekil 4, 14 ve l5'te yer alan amino asit sekanslarina sahip olan murin monoklonal antikoru RXl, MCl veya MC3'ün herhangi biri ile ayni M-CSF epitopuna özellikle baglanmaktadir. Yukarida bahsi geçen bir antikor açiklanmakta olup, burada antikor, tercihen en az lO*Ä "8 veya 10_9 veya daha fazla baglama affinitesi muhafaza eden bir poliklonal antikor; bir Insan MühendislikTM antikoru dahil olmak üzere bir monoklonal antikoru; bir insanlastirilmis antikor; bir insan antikor; bir kimerik antikor; Fab, F(ab')2; FV; SC FV veya SCA antikor fragmani; bir diakor; bir lineer antikor; veya bu antikorlarin herhangi birinin bir mutein içeren gruptan seçilmektedir. %75'ten fazla bir oranda M-CSF'ye baglanmaya yönelik Sekil 4'te ifade edilen amino asit sekansina sahip monoklonal antikoru RXl, MCl ve/Veya MC3 ile rekabet eden fonksiyonel fragman dahil olmak üzere murin olmayan bir monoklonal antikoru da tasarlanmistir.
Fonksiyonel fragmani dahil olmak üzere murin olmayan bir monoklonal antikoru açiklanmakta olup, söz konusu murin olmayan monoklonal antikor veya bunun fonksiyonel fragmani, Sekil lZ'de kalintisini içeren M-CSF'nin bir epitopuna baglanmaktadir.
Ayrica, burada, fonksiyonel fragmani dahil olmak üzere murin olmayan bir monoklonal antikoru açiklanmakta olup, burada bahsedilen murin olmayan monoklonal antikor veya bunlarin fonksiyonel fragmani, Sekil 12'de yer alan (5H4 veya MC3 tarafindan taninan M-CSF epitoplarina karsilik gelen) 65-73 veya kalintisini içeren M-CSF'nin bir epitopuna baglanmaktadir.
Burada, Sekil 12'de yer alan 98-105 amino asitlerini içeren M- CSF'nin bir epitopuna baglanan yukarida bahsi geçen antikor veya fragman açiklanmistir. Burada, Sekil 4A'da yer alan CDR3'ü içeren yukarida bahsi geçen bir antikoru açiklanmaktadir.
Antikor, Sekil 4A'da yer alan murin antikor RXl'in en az 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 CDR'sini içerebilmektedir. Murin antikoru RXl'in en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR'sini içeren bir antikor ayrica, Sekil 16A-B'de ifade edilen antikor 5H4'un 6 CDR'sinden en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR'yi içermektedir. Alternatif olarak murin antikoru RXl'in en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR'sini içeren antikor ayrica, Sekil l6A-B'de ifade edilen antikor MCl'ün 6 CDR'sinden en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR'yi içermektedir. Yine bir baska alternatifte, yukarida bahsi geçen antikor ayni zamanda, Sekil l6A-B'de ifade edilen MC3 antikorunun 6 CDR'sinden en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR içermektedir. Murin antikoru RXl'in en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR'sini içeren antikor, Sekil l6A-B'de yer alan konsensüs CDR'lerden en az 1, 2, 3, 4 veya 5 CDR içermektedir. Yukarida bahsi geçen antikorda konsensüs CDR'lerin bir veya daha fazla kalintisi, murin RXl, 5H4, MCl veya MC3 antikorunun CDR'lerinden herhangi birisinin ilgili kalintisi ile ornatilmis Olabilmektedir. Arzu edilen baglanma affinitesi, antikor içindeki bir veya daha fazla amino asitin, örnegin, CDR'ler içindeki koruyucu ornatiklar ile ve/Veya düsük ve orta riskli kalintilardaki koruyucu veya koruyucu olmayan degisiklikler ile mutasyona ugramis olmasina ragmen muhafaza edilebilmektedir.
Ayni zamanda burada Sekil 4A, 13, 14 veya 15'te ifade edilen agir zincir amino asit sekansini kapsayan yukarida bahsi geçen antikorun varyantlar açiklanmaktadir. Antikor, Sekil 4A, 13, 14 veya 15'te ifade edilen amino asit sekanslarina en az %60, 65, homolog olan degisken bir hafif zincir amino asit sekansini içermektedir.
Antikor, bir sabit bölgeyi ve bir insan antikor sekansinin bir veya daha fazla agir ve hafif zincir degisken çerçeve bölgesini içermektedir. Antikor, bir insan IgGl, lgGZ, lgGB veya lgG4'ün modifiye edilmis veya modifiye edilmemis sabit bölgesini içermektedir. Tercihen sabit bölge, belirli özelliklerin arttirilmasi veya azaltilmasi için opsiyonel olarak modifiye edilebilen insan IgGl veya IgG4'tür. lgGl söz konusu oldugunda sabit bölgeye, özellikle mafsal veya CH2 bölgesine yapilan modifikasyonlar, ADCC ve/veya CDC aktivitesi dahil olmak üzere efektör fonksiyonunu arttirabilmekte veya azaltabilmektedir. Bir lgG2 sabit bölgesi, antikor-antijen agrega olusumunun azaltilmasi için modifiye edilebilmektedir. IgG4 söz konusu oldugunda, sabit bölgeye, özellikle mafsal bölgeye yapilan modifikasyonlar, yari-antikorlarin olusumunu azaltabilmektedir.
Yukarida bahsi geçen antikor, asagidaki veritabanlarinda yer alan bir insan konsensus sekansi, insan germ hatti sekansi, insan konsensus sekansindan veya bir veya daha fazla antikordan türetilebilir, bunlari baz alabilir veya bunlardan parçalar içerebilir: Kabat, NCBI lg Blast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi, Kabat Database http://www.bioinforg.uk/abs/seqtest.html, FTP site for Kabat Release 5.0 (l992) ftp://ftp.ncbi.nih. gov/repository/kabat/Rel5.0/, ImMunoGeneTics database (Montpellier France) http://imgt.cnusc.fr:8lO4/, V-Base http://www.mrc- cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=90l, Zurich University http://www.unizh.ch/~antibody/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP) http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html, Protein Sequence and Structure .Analysis of Antibody Domains p://how.to/AnalyseAntibodies/, Humanization by designhtt http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubch7s/, Antibody Resources p://www.antibodyresource.com/educational.html, Antibody Engineering (by TT Wu), Humana Presshtt.
Yukarida bahsi geçen antikor, bir Insan MühendislikTM antikoru olabilmektedir. Örnegin Insan MühendislikTM antikoru sekansi, Sekil 23-24'te yer alan sekanslardan herhangi biri olabilmektedir. Diger Insan MühendislikTM antikorlari veya bunlarin varyantlari tasarlanmistir. Örnegin yukarida bahsi geçen. RXl bazli antikor açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken bölgesinin, bir amino asittir. Söz konusu antikor açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken bölgesi, asit sekansini içerir ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir.
Burada ayrica, yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken bölgesi, XiVQLQESGPGLVRPSQXzLSLTCTVX3DYSITSDYAWNWIRQFPGX4X5LEWMGYISYSGSTS YNPSLKSRIX6IX7RDTSKNQFXSLQLNSVTX9X1oDTAXiiYYCASFDYAHAMDYWGQGTX12V TVSS (SEK ID NO: 126) amino asit sekansini içerir ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir. Söz konusu, antikor açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken bölgesi, DVQLQESGPGLVKPSQXiLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGXzKLEWMGYISYSGSTSYN PSLKSRIX3IX4RDTSKNQFX5LQLNSVTX6X7DTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTXSVTVSS (SEK ID NO: 127) amino asit, sekansini içerir* ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir. Söz konusu, antikor açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken bölgesi, DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTDYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGYISYSGS TSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTATYYCASFDYAHAMDYWGQGTTVTVSS (SEK ID NO: 41) amino asit sekansini içerir. Bulusun antikorunun agir zinciri, QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDYS1TSDYÃWNWIRQFPGKGLEWMGYISYSGS TSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLQLNSVTAADTAVYYCÄSFDYAHAMDYWGQGTT VTVSS (SEK ID NO: 43) agir zincir degisken bölge amino asit sekansini içermektedir.
Ayrica burada yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, 128) amino asit sekansini içerir ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir. Söz konusu antikor› açiklanmakta olup, burada hafif zincir degisken bölgesi, DYYCQQINSWPTTEGXMGwaLX%X3ûQ8Xme (SEK ID NO: 129) amino asit sekansini içerir ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir. Söz konusu antikor açiklanmakta olup, hafif zincir degisken bölgesi, X1IXZLTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQXÖTX7X8X9PRLL1KYASEX KLEIKRXw (SEK ID NO: 130) amino asit sekansini içerir ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir.
Ayrica burada yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, X1IXzLTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQXgTX7XgSPRLLIKYÄSEXgIS GIPXioRFSGSGSGTDFTLxl11X12X13VESEDXMADYYCQQINSWPTTFGXisGTKLEIKRX16 (SEK 1D ANO: 131) amino asit sekansini içerir` ve X ifadesi, herhangi bir amino asittir. Söz konusu antikor açiklanmakta olup, burada hafif zincir degisken bölgesi, X1IXZLTQSPX3X4LSVSPGERVX5FSCRASQSIGTSIHWYQQXgTX7XgX9PRLLIKYASESI SGIPXloRFSGSGSGTDFTLXnIX12X13VESEDXMÃDYYCQQINSWPTTFGXisGTKLE1KRX1 6 (SEK ID NO: 132) amino asit sekansini içerir ve X ifadesi, herhangi bir amino asitir. Söz konusu antikor açiklanmakta olup, burada hafif zincir degisken bölgesi, EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASESISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEK ID NO: 45) amino asit sekansini içerir.
Ayrica burada, yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSIGTSIHWYQQKTGQAPRLLIKYASERATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT(SEK ID NO: 47) amino asit sekansini içerir. Söz konusu antikor açiklanmakta olup, burada hafif zincir degisken bölgesi, EIVLTQSPGTLSVSPGERVTFSCRASQSlGTSIHWYQQKTGQSPRLLIKYASERISGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRVESEDFADYYCQQINSWPTTFGQGTKLEIKRT (SEK ID NO: 47) amino asit sekansini içerir.
Ayni zamanda burada, yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, en az bir X ifadesi, Sekil 4A'da yer alan amino asit sekansi içerisinde karsilik gelen bir amino asittir. Antikor açiklanmakta olup, burada en az bir X ifadesi, Sekil 4A'da ifade edilen amino asit sekansi içerisinde karsilik gelen bir amino asidin koruyucu bir ornatmasidir (Tablo l'e göre).
Ayni zamanda burada antikor açiklanmakta olup, en az bir X ifadesi, Sekil 4A içinde ifade edilen amino asit sekansi içerisinde karsilik gelen bir amino asidin koruyucu olmayan bir ornatmasidir (Tablo l'e göre). Ayni zamanda burada antikor açiklanmakta olup, en az bir X ifadesi, bir insan antikor sekansi içerisinde karsilik gelen bir amino asittir.
Yukarida bahsi geçen Insan MühendislikTM antikoru, asagidaki Veritabanlarinda yer alan bir insan antikoru konsensus sekansi, insan germ hatti sekansi, insan konsensus sekansindan veya bir veya daha fazla antikordan türetilebilir, bunlari baz alabilir veya bunlardan parçalar içerebilir: Kabat, NCBI Ig Blast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi, Kabat Database http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.htm1, FTP site for Kabat Release 5.0 (1992) ftpz//ftp .ncbi.nih. gov/repository/kabat/RelS.O/, ImMunoGeneTics database (Montpellier France) http://imgt.cnusc.fr:8104/, V-Base http//www.mrc- cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=90l, Zurich University http://www.unizh.ch/~antibody/Sequences/index.html, The Therapeutic Antibody Human Homology Project (TAHHP) http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html, Protein Sequence anda Structure .Analysis of Antibody' Domains http://how.to/AnalyseAntibodies/, Humanization by design http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/, Antibody Resources http://www.antibodyresource.com/educational.html, Antibody Engineering (by TT Wu), Humana Press.
Ayni zamanda burada yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, Insan Mühendislik m antikoru sekansi, Sekil 23-24 ya da 29-30'da yer alan sekanslardan biridir. Antikor, Sekil 19B'de yer alan agir zincir amino asit sekanslarinin birine en az %60, homolog' olan degisken bir agir zincir amino asit sekansini içerebilmektedir. Antikor, Sekil 20B-22B'nin herhangi birinde yer alan hafif zincir amino asit sekanslarinin birine en az %60, homolog olan degisken bir hafif zincir amino asit sekansini içerebilmektedir.
Sekil 24C-24E'nin birinde yer alan sekanslara sahip 5H4, MCl veya MC3 antikoru gibi yukarida bahsi geçen antikor, düsük, orta ve yüksek riskli kalintilarin tanimlanmasi için Sekil 240-24E'de yer alan Kabat numaralamasi kullanilarak, Studnicka ve dig., U.S. Patent No. 5,766,886 sayili belgede ve Örnek 4A'da yer alan metotlara göre Insan Mühendislik m olabilmektedir. Yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, burada ya agir ya da hafif zincirin veya her ikisinin düsük riskli kalintilarinin tümü, gerektigi yerde, bir insan referans immünoglobulin sekansi ile ayni kalintilar olmasi için modifiye edilmektedir. Ayrica burada yukarida bahsi geçen antikor açiklanmakta olup, burada ya agir ya da hafif zincirin veya her ikisinin düsük + orta riskli kalintilarin tümü, gerektigi yerde, bir insan referans immünoglobulin sekansi ile ayni kalintilar olmasi için modifiye edilmektedir. Içerisinde düsük riskli kalintilarin tümünün modifiye edilmis oldugu bir agir zincir, içerisinde düsük ve orta riskli kalintilarin tümünün modifiye edilmis oldugu bir hafif zincir ile ve tam tersi bir sekilde kombine edilebilmektedir. Benzer bir sekilde, yukarida bahsi geçen bir Insan Mühendislik m hafif ve agir zincir, insanlastirilmis veya kimerik bir antikorun hafif veya agir zinciri ile kombine edilebilmektedir.
Antikor, Studnicka metoduna göre Insan Mühendislikw'in hemen yukarisinda tarif edilen agir zincir` amino asit sekanslarin 96, 97, 98 veya 99 özdes olan bir degisken agir zincir amino asidi içermektedir. Antikor, Studnicka metoduna göre Insan Mühendislikm'in hemen yukarisinda tarif edilen agir zincir amino zincir amino asidi içermektedir.
Ayrica burada, yukarida ifade edildigi gibi bir agir zinciri ve yukarida ifade edildigi gibi bir hafif zinciri içeren bir antikor açiklanmaktadir.
Yukarida bahsi geçen antikor, en az 10 [-7]'lik bir affinite Kd'ye sahip olabilmektedir. Yukaridaki geçen antikor, en az 10 Ayrica burada yukarida bahsi geçen bir antikor açiklanmakta olup, söz konusu antikor, bir poliklonal antikor; bir Insan MühendislikTM antikoru dahil olmak üzere bir monoklonal antikoru; bir insanlastirilmis antikoru; bir insan antikoru; bir kimerik antikor; Fab, F(ab')2; Fv; SCFV veya SCA antikor fragmani; bir diakor; bir lineer antikoru; veya bu antikorlarin herhangi birinin bir muteindir. Monöklonal antikor izole edilmis antikor olabilmektedir.
Ayrica burada, yukarida bahsi geçen antikorun bir hafif zincirini kodlayan bir nükleik asit sekansini içeren izole edilmis bir nükleik asit açiklanmaktadir. Izole edilmis nükleik asit, Sekil 4A, 13, 14 veya 15'te ifade edilen hafif zincir asit sekansini içermektedir. Izole edilmis nükleik asit, Sekil 4A, 13, 14 veya 15'te ifade edilen hafif zincir nükleotid sekansa 98 veya 99 özdes olan bir hafif zincir nükleik asit sekansrni içermektedir.
Yukarida bahsi geçen izole edilmis nükleik asidi içeren bir vektör de açiklanmaktadir. Ayrica burada, yukarida bahsi geçen vektör açiklanmakta olup, izole edilmis nükleik asit, uygulanabilir bir sekilde düzenleyici kontrol sekansina baglanmaktadir. Ayrica burada yukarida bahsi geçen vektörü içeren bir konakçi hücre açiklanmaktadir. Çok sayida metot tasarlanmistir. Örnegin, yukarida bahsi geçen konakçi hücrenin kültürlenmesini içeren ve böylece izole edilmis nükleik asidin antikorun üretilmesi için ifade edildigi yukarida bahsi geçen bir antikorun üretilmesine yönelik bir metot açiklanmaktadir. Metot ayrica, konakçi hücre kültüründen antikorun kurtarilmasi adimini içerebilmektedir. Yukarida bahsi geçen metot ile üretilmis izole edilmis bir antikor açiklanmaktadir.
Yukarida bahsi geçen bir antikoru salgilayan bir hibridoma ayni zamanda burada açiklanmaktadir. Ilave olarak, bir toksine konjüge edilmis olan yukarida bahsi geçen antikor açiklanmaktadir.
Ayrica burada, yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birini ve farmasötik olarak uygun bir tasiyici, eksipiyan veya seyrelticiyi içeren farmasötik bir bilesim› açiklanmaktadir.
Farmasötik bilesimr ayrica bir ikinci terapötik ajani içerebilmektedir. Ikinci terapötik ajan, bir kanser kemoterapötik ajan olabilmektedir. Ikinci terapötik ajan bir bisfosfonat olabilir. Ikinci terapötik ajan bir baska antikor olabilir.
Mevcut bulusunr antikorlari, hastaliklarini veya Ibozukluklarin tedavi edilmesi için çok sayida arzu edilen özellige sahip olacak sekilde tasarlanmistir. Ayrica burada, osteolize katkida bulunan veya neden olan bir hastaliktan muzdarip olan bir bireyin korunmasinda kullanilmasi için bulusun antikorlar saglanmakta olup, söz konusu antikor etkili bir sekilde hastalikla iliskili kemik kaybinin siddetini azaltmaktadir. Benzer bir sekilde, ayni zamanda burada, osteolize katkida bulunan veya neden olan bir hastaliktan muzdarip olan bir bireyin tedavi edilmesinde kullanilmasi için bulusun antikorlari saglanmakta olup, bahsi geçen antikor etkili bir sekilde hastalikla iliskili kemik kaybinin siddetini azaltmaktadir. Çok sayida hastalik ve bozukluk, mevcut bulusta antikor bazli tedaviye uygun olmak üzere tasarlanmistir. Bulusun farmasötik bilesimi veya ürünü saglanmakta olup, burada bahsi geçen hastalik, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil) ), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit ve romatoid artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/veya Paget hastaligindan olusan gruptan seçilmektedir.
BuluSUn farmasötik bilesimi veya ürünü, kemige metastaz yapan kanserin tedavi edilmesinde veya önlenmesinde kullanilmasina yönelik saglanmakta olup, burada söz konusu metastatik kanser, meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid, protat, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücresi maligniteleri; bas ve boyun kanserleri; özofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, ince bagirsak kanseri, kolorektal kanseri, rektal kanseri, pankreatik kanseri, karaciger kanseri, safra kanali ve safra kesesi kanser dahil gastrointestinal kanserler; over karsinom, uterin endometriyal kanserleri, vajinal kanserler ve servikal kanser dahil kadin genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma ve malignan melanom veya skuamöz hücre Ayrica burada, metastatik tümör hücre ortami, ostorklastlar ve bir aday antikorun temas edilmesi; osteoklast olusumu, proliferasyon ve/veya farklilasmanin tespit edilmesi; ve eger osteoklast olusumunda, proliferasyonda ve/veya farklilasmada bir düsüs tespit edilirse söz konusu aday antikorun bir M-CSF spesifik antikor olarak tanimlanmasi adimlarini içeren bir M- CSF spesifik antikorun taranmasina yönelik bir metot açiklanmaktadir. Benzer bir sekilde, yukarida bahsi geçen metot açiklanmakta olup, burada bahsedilen metastatik tümör hücre ortami, tümör hücrelerini Içermektedir.
Yukarida bahsi geçen metot açiklanmakta olup, burada temas adimi (a) in vivo meydana gelmektedir, bahsedilen tespit adimi (b) kemik metastazinin boyutunun ve/veya sayisinin tespit edilmesini içermektedir ve aday antikor, kemik metastazinin boyutunda ve/veya sayisinda bir düsüs tespit edilirse bir M-CSF spesifik antikor olarak tanimlanmaktadir. Ayrica burada, aday antikorun M-CSF'ye baglanmasi durumunda, tespit etme adimini da içeren yukarida bahsi geçen metot açiklanmaktadir. Benzer bir sekilde, burada ayrica, bahsedilen aday antikorunun M-CSF ve kendi reseptörü M-CSFR arasindaki etkilesimi inhibe etmesi durumunda tespit etme adimini da içeren yukarida bahsi geçen metot açiklanmaktadir.
Ayrica burada, kemige metastaz yapan kanseri önleyen veya tedavi eden bir M-CSF spesifik antikorun tanimlanmasina yönelik bir metot açiklanmakta olup: asagidaki (a) Sekil 12'nin 98-105 amino asitlerin en az 4 bitisik kalintilarini içeren M-CSF'nin bir epitopuna bir aday antikorun baglanmasinin tespit edilmesi; ve (b) in vitro ya da in vivo kemige metastatik kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesi için bahsedilen aday antikorun yeteneginin ölçülmesi adimlarini içermektedir.
Ayrica burada, kemige metastaz yapan kanseri önleyen veya tedavi eden bir M-CSF'ye spesifik antikorun tanimlanmasinin bir metodu asitlerin en az 4 bitisik kalintilarini içeren M- CSF'nin bir epitopuna bir aday antikorun baglanmasinin tespit edilmesi (5H4 veya MC3 ile taninan M-CSF epitoplara karsilik gelen); ve (b) in10 vitro ya da in ViVO kemige metastatik kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesi için bahsedilen aday antikorun yeteneginin ölçülmesi adimlarini içermektedir.
Ayrica burada, Sekil 12'nin 98-105 amino asitlerini içeren M- CSF'nin bir epitopuna baglanan bir antikorun bir CDR'sinin degistirilmesine yönelik bir metot açiklanmakta olup, Sekil 4A'da ifade edilen amino asit sekansinin bir CDR'sinin içerisinde bir amino asidin degistirilmesini ve en az 10[-7]'lik bir affinite Ka ile M-CSF baglayan bir antikor için seçilmesini içermektedir. Sekil 4A'da ifade edilen agir zincir amino asidini yönelik bir metot açiklanmakta olup, söz konusu metot, (SEK ID NO: 133) amino asit sekansinda yer alan X1-X52 arasindan herhangi birinin degistirilmesini ve degistirilen amino asit sekansini içeren bir antikorun, Sekil 12'de yer alan 98-105 amino asitlerini içeren M-CSF'nin bir epitopuna baglanmasi bakimindan test edilmesini içermektedir.
Sekil 4A'da ifade edilen hafif zincir amino asidini %60'a varan bir oranda sistematik olarak degistirilebilmesine yönelik bir metot açiklanmakta olup, söz konusu metot, 134) amino asit sekansinda yer alan Xl-X52 arasindan herhangi birinin degistirilmesini ve degistirilen amino asit sekansini içeren bir antikorun, Sekil 12'de yer alan 98-105 amino asitlerini içeren M-CSF'nin bir epitopuna baglanmasi bakimindan test edilmesini içermektedir.
Ayrica burada, Sekil 12'nin (5H4 ya da MC3 tarafindan taninan M- asitlerini içeren M-CSF'nin bir epitopa baglanan bir antikorun bir CDR'nin degistirilmesine yönelik bir metot açiklanmakta olup, Sekil 13, 14 ve 15'in birinde yer alan amino asit sekansinin bir CDR içerisinde bir amino asit degistirilmesini ve en az 10[-7]'1ik bir affinite Ka ile M-CSF baglayan bir antikor için seçilmesini içermektedir. Sekil 13, 14 ve 15'in birinde yer alan agir zincir amino asit sekansinin %60'ina kadarini sistematik olarak degistirilen bir metot açiklanmakta olup Studnicka ve dig., U.S. Patent No. 5,766,886 ve burada Örnek 4A'da yer alan metotlara göre ve Sekil 24C-24E'de yer alan Kabat numaralandirmaya göre yukarida bahsi geçen sekanslarin degistirilmesini içermektedir ve Sekil 12'nin 65-73 ya da 138- 144 amino asitlerini içeren (5H4 ya da MC3 tarafindan taninan M- CSF epitoplarina karsilik gelen) M-CSF'nin bir epitopa baglanmasi için degistirilen amino asit sekansini içeren bir antikor test edilmektedir. Düsük riskli kalintilarin tümü modifiye edilebilmektedir. Benzer sekilde, düsük veya orta riskli kalintilarin tümü modifiye edilebilmektedir veya prolinler hariç düsük ve orta riskli kalintilarin tümü modifiye edilebilmektedir.
Ayrica burada, yukarida bahsi geçen proses ile tasarlanan CDR'lere sahip bir antikorun ifade edilmesine yönelik bir metot açiklanmaktadir. Söz konusu antikorun yukarida bahsedilen metot kullanilarak yapildigi MCSF'yi baglayan bir antikoru içeren bir farmasötik bilesim açiklanmaktadir.
Ayrica burada, yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birinin terapötik olarak etkili bir miktarinin, kemik erimesine katkida bulunan ya da neden olan bir hastaliktan muzdarip bir bireye uygulanmasini ve böylece kemik kaybinin önlenmesi veya azaltilmasini içeren kemik kaybinin önlenmesi veya azaltilmasina yönelik bir yöntem açiklanmaktadir. Bulus, kemik erimesine katkida bulunan ya da neden olan bir hastaliktan muzdarip bir bireyin hastaliginin önlenmesinde veya tedavi edilmesinde kullanilmasi için bulusun antikorunu saglamakta olup, burada bahsedilen antikor, hastalik ile iliskili kemik kaybinin siddetini etkili bir sekilde azaltmaktadir.
Yukarida bahsi geçen tibbi kullanim saglanmakta olup, burada bahsedilen hastalik, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit. ve romatoid artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/veya Paget hastaligindan olusan gruptan seçilmektedir.
Bulus, kemige metastaz yapan kanserin önlenmesinde veya tedavi edilmesinde kullanilmasi için bulusun farmasötik bir bilesimini veya ürününü saglamaktadir. Söz konusu antikorlarin herhangi birinin terapötik olarak etkili bir miktari metastatik kanserden muzdarip bir bireye uygulanabilmektedir. Metastatik kanser, meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid, protat, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücresi maligniteleri; bas ve boyun kanserleri; ozofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, ince bagirsak kanseri, kolorektal kanseri, rektal kanseri, pankreatik kanseri, karaciger kanseri, safra kanali ve safra kesesi kanser dahil gastrointestinal kanserler; over karsinom, uterin endometriyal kanserleri, vajinal kanserler ve servikal kanser dahil kadin genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma ve malignan Helanom veya skuamöz hücre kanseri dahil deri kanseri olabilmektedir.
Kemik kaybinin ve tümör büyümesinin önlenmesine yönelik metot açiklanmakta olup, yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birinin terapötik olarak etkili miktarlarinin ihtiyaci olan bir bireye uygulanmasini içermektedir. Metot ayrica bir ikinci terapötik ajanin uygulanmasini içermektedir. Ayrica burada, ikinci terapötik ajanin bir kanser kemoterapötik ajan veya bir bifosfonat oldugu metot açiklanmaktadir. Ayrica burada, bifosnatin, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat veya ibandronat oldugu metot açiklanmaktadir. Ayrica burada, terapötik ajanin bir sitotoksik kemoterapötik ajan oldugu yukarida bahsi geçen metotlar açiklanmaktadir. Ayrica burada, söz konusu bireyin bifosfonat tedavisinin disinda tutuldugu yukarida bahsi geçen metot açiklanmaktadir.
Yukarida bahsi geçen metot açiklanmakta olup, burada antikor, bir terapötik etkinin gerçeklestirilmesi için gerekli ikinci terapötik ajanin dozajinin azaltilmasi için etkilidir. Ikinci terapötik ajan, örnegin, G-CSF veya anti-RANKL antikoru gibi M- CSF olmayan koloni stimüle edici bir faktör ya da çözünür RANKL reseptörü olabilmektedir.
Ayrica burada, bireyin bir memeli oldugu yukarida bahsi geçen metot açiklanmaktadir. Söz konusu memeli insan olabilmektedir.
Yukarida bahsi geçen metotlar açiklanmakta olup, burada antikor, M-CSF ve onun reseptörü (M-CSFR) arasindaki etkilesimi inhibe etmektedir. Antikor, tümör hücreleri tarafindan tetiklenen osteoklast proliferasyonunu ve/veya farklilasmasini inhibe etmektedir. Yukarida bahsi geçen netotlar açiklanmakta olup, burada antikor, yaklasik.2 pg/kg ila 30 mg/kg arasinda, 0,1 mg/kg ila 30 mg/kg arasinda veya 0,l mg/kg ila 10 mg/kg Vücut agirligi arasinda bir dozda uygulanmaktadir.
Burada açiklanan bir antikorunun, kemik erimesinin (osteoliz) semptomlarini sergileyen bir hastada kemik kaybinin azaltilmasi veya önlenmesine yönelik bir ilacin üretiminde ve kemik erimesine katkida bulunan ya da neden olan bir hastaliktan muzdarip bir hastada kemik kaybinin önlenmesi veya azaltilmasina yönelik bir ilacin üretiminde kullanilmasi açiklanmaktadir.
Yukarida bahsi geçen kullanim ayrica açiklanmakta olup, burada söz konusu hastalik, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbut, malnutrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil) ), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit. ve romatoid artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/veya Paget hastaligi arasindan seçilmektedir.
Bulusun bir antikorunun, metastatik kanserden muzdarip olan bir hastada kemige metastaz yapan kanserinin önlenmesi veya tedavi edilmesine yönelik bir ilacin üretiminde kullanilmasi açiklanmaktadir. Metastatik kanser, meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid, protat, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücresi maligniteleri; bas ve boyun kanserleri; özofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, ince bagirsak kanseri, kolorektal kanseri, rektal kanseri, pankreatik kanseri, karaciger kanseri, safra kanali ve safra kesesi kanser dahil gastrointestinal kanserler; over karsinom, uterin endometriyal kanserleri, vajinal kanserler ve servikal kanser dahil kadin genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma ve malignan melanom veya skuamöz hücre kanseri dahil cilt kanseri olabilmektedir.
Bulusun bir antikorunun, kanserli bir hastanin tedavi edilmesine yönelik bir ilacin üretilmesine kullanilmasi açiklanmaktadir.
Yukarida bahsi geçen kullanimlarin herhangi birinde söz konusu ilaç, bir ikinci terapötik ajan kullanilarak tedavi ile koordine edilebilmektedir. Ikinci terapötik ajan, bir kanser kemoterapötik ajan olabilmektedir. Ikinci terapötik ajan, M-CSF olmayan koloni stimüle edici bir faktör veya anti-RANKL antikoru veya çözünür RANKL reseptörü veya bir bisfosfonat olabilmektedir. Bisfonat, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat veya ibandronat olabilmektedir.
Yukarida bahsi geçen kullanimlarin herhangi biri tasarlanmakta olup, burada soz konusu hasta bisfosfonat tedavisinin disinda tutulmaktadir ve/veya söz konusu hasta, ikinci terapötik ajan ile önceden tedavi edilmistir. Ikinci terapötik ajan, bir kanser kemoterapötikr ajani, bir M-CSF olmayani koloni stimüle edici faktör veya anti-RANKL antikoru veya çözünür RANKL reseptörü veya bir bisfosfonat olabilmektedir. Bisfonat, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat veya ibandronat Olabilmektedir. Hasta bisfosfonat tedavisinin disinda tutulmustur.
Ayrica burada, osteoliz semptomlarini sergileyen bir hastanin tedavi edilmesine yönelik bir ilacin hazirlanmasi için bulusun bir antikorunun bir sinerjik kombinasyonun kullanilmasi tasarlanmakta olup, burada söz konusu ilaç, bir ikinci terapötik ajan kullanilarak tedavi ile koordine edilebilmektedir. Ikinci terapötik ajan, bir kanser kemoterapötik ajani, bir M-CSF olmayan koloni stimüle edici faktör veya anti-RANKL antikoru veya çözünür RANKL reseptörü veya bir bisfosfonat olabilmektedir. Bisfonat, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat veya ibandronat olabilmektedir. Hasta bisfosfonat tedavisinin disinda tutulmustur.
Yukarida bahsi geçen kullanimlar tasarlanmakta olup, burada ilaçtaki antikorun miktari, bir terapötik etkinin gerçeklestirilmesi için gerekeni ikinci terapotikr ajanin dozajinin azaltilmasi için etkili bir dozdadir. Kanser ile baglantili kemik kaybi ile iliskili yukarida bahsi geçen kullanimlarin herhangi birinde, ilaçtaki antikor miktari tercihen, tümör hücreleri tarafindan tetiklenen osteoklast proliferasyonunu ve/veya farklilasmasini inhibe etmek için etkilidir.
Yukarida bahsi geçen ilaçlarin herhangi birindeki antikor miktari, yaklasik 2 pg/kg ila 30 mg/kg vücut agirligi arasinda bir dozda olabilmektedir. Ilaçtaki antikor miktari, yaklasik 0,1 mg/kg ila 30 mg/kg Vücut agirligi arasinda bir dozda olabilmektedir. Ilaçtaki antikor miktari, yaklasik 0,1 mg/kg ila mg/kg vücut agirligi arasinda bir dozda olabilmektedir.
Açiklama ile ayrica kitler de tasarlanmaktadir. Örnegin. bir flakon veya sise gibi bir konteynir içinde paketlenen açiklamanin bir antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarini içeren. bir kit ve kemik. kaybinin. azaltilmasi veya önlenmesi için konteynirin içeriklerinin kullanimina iliskin talimatlar ve/Veya endikasyonlari saglayan ve konteynirin içeriklerini tarif eden, ayrica konteynir ile paketlenen ya da birlestirilen bir etiketi içeren bir kit açiklanmaktadir. Örnegin bir flakon veya sise gibi bir konteynir içinde paketlenen açiklamanin bir antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarini içeren bir kit ve osteolize katkida bulunan veya neden olan bir hastaliktan muzdarip olan bir bireye konteynirin içeriklerinin kullanimina iliskin talimatlar ve/Veya endikasyonlari saglayan ve konteynirin içeriklerini tarif eden ve ayrica konteynir ile paketlenen ya da birlestirilen bir etiketi içeren bir kit açiklanmaktadir.
Söz konusu kit açiklanmakta olup, burada söz konusu hastalik, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm.dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit ve romatoid artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/Veya Paget hastaligindan olusan gruptan seçilmektedir.
Bir flakon veya sise gibi bir konteynir içinde paketlenen açiklamanin bir antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarini içeren ve ayrica kemige metastaz yapan kanserin önlenmesi veya tedavi edilmesi için konteynirin içeriklerinin kullanimina iliskin talimatlar ve/veya endikasyonlari saglayan ve konteynirin içeriklerini tarif eden ve ayrica konteynir ile paketlenenr ya da birlestirilen bir etiketi içeren bir kit açiklanmaktadir. Metastatik kanser, meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid, protat, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücresi maligniteleri; bas ve boyun kanserleri; özofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, ince bagirsak kanseri, kolorektal kanseri, rektal kanseri, pankreatik kanseri, karaciger kanseri, safra kanali ve safra kesesi kanser dahil gastrointestinal kanserler; over karsinom, uterin endometriyal kanserleri, vajinal kanserler ve servikal kanser dahil kadin genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma ve malignan melanom veya skuamöz hücre kanseri dahil cilt kanseri olabilmektedir.
Bir flakon veya sise gibi bir konteynir içinde paketlenen açiklamanin bir antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarini içeren ve ayrica kanserin tedavi edilmesi için konteynirin içeriklerinin kullanimina iliskin talimatlar ve/veya endikasyonlari saglayan ve konteynirin içeriklerini tarif eden ve ayrica konteynir' ile paketlenen ya da birlestirilen bir etiketi içeren bir kit açiklanmaktadir..
Kit, ayrica bir ikinci terapötik ajan içerebilmektedir. Ikinci terapötik ajan, bir kanser kemoterapötik ajani, bir M-CSF olmayan koloni stimüle edici faktör veya anti-RANKL antikoru veya çözünür RANKL reseptörü veya bir bisfosfonat olabilmektedir. Bisfonat, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronat veya ibandronat olabilmektedir. Söz konusu kit, bisfosfonat tedavisinin disinda tutulan bir hastanin tedavi edilmesine yönelik talimatlari içermektedir.
Yukarida bahsi geçen kit, bir terapötik etkinin gerçeklestirilmesi için gereken ikinci terapötik ajanin dozajin azaltilmasi için etkili bir antikor dozunu içermektedir- Söz konusu kit, sinerjik bir dozda antikor içerebilmektedir. Kit, tümör hücreleri tarafindan tetiklenen osteoklast proliferasyonunun ve/veya farklilasmasinin inhibe edilmesi için etkili bir antikor dozunu içermektedir.
Yukarida bahsi geçen kit, yaklasik 2 pg/kg ila 30 mg/kg vücut agirligi arasinda bir antikor dozunu içermektedir. Kit, yaklasik 0,1 mg/kg ila 30 mg/kg vücut agirligi arasinda bir antikor dozunu içermektedir. Kit, yaklasik 0,1 mg/kg ila 10 mg/kg vücut agirligi arasinda bir antikor dozunu içermektedir.
Bir` uygulamada, bulusun ürünü, istemlerde yer alan antikoru içeren bir paket, flakon veya konteynir içermektedir` ve söz konusu ilacin, cerrahi veya radyasyon terapisi ile birlikte kullanilmasi gerektigini bildiren talimatlar saglanmaktadir. Bir bireye yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birisinin uygulanmasi ve cerrahi veya radyasyon terapisi ile bireyin tedavi edilmesi adimlarini içeren kemige metastaz yapan kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesine yönelik bir metot açiklanmaktadir. Yüzeyi üzerindeki membrana bagli M-CSF ifade eden bir tümör hücresinin hedeflenmesine yönelik, bir metot açiklanmakta olup, yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birinin uygulanmasi adimini içermekte olup, burada söz konusu antikor, bir radyonüklid veya diger toksine konjüge olmaktadir.
Bir kanserden muzdarip olan bir bireyin tedavi edilmesine yönelik bir metot açiklanmakta olup, yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birinin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini içermektedir.
Ayrica burada, osteolize katkida bulunan veya neden olan bir hastaliktan muzdarip bir bireye, yukarida bahsedilen antikorlardan birinin söz konusu bireyin hücreleri tarafindan üretilen M-CSF'nin nötralize edilmesi için etkili bir miktarda uygulanmasini içeren kemik kaybinin Önlenmesine yönelik, bir yöntem açiklanmakta olup, söz konusu miktar, kanser hücreleri tarafindan üretilen M-CSF'yi nötralize etmek için etkili miktardan daha fazladir. Ayrica burada, osteolize katkida bulunan veya neden olan bir hastaliktan muzdarip olan bir bireye, yukarida bahsedilen antikorlardan birinin soz konusu bireyin hücreleri tarafindan üretilen M-CSF'nin notralize edilmesi için etkili bir miktarda uygulanmasini içeren osteolize katkida bulunan veya neden olan bir hastaliktan muzdarip olan bir bireyin tedavi edilmesine yönelik :bir yöntem. açiklanmakta olup, söz konusu Haktar, kanser hücreleri tarafindan üretilen M-CSF'yi nötralize etmek için etkili miktardan daha fazladir.
Ayrica burada, antikor RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 veya bir murin olmayan RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 kaynakli antikor veya bir RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 rekabetçi antikoru ve bir kanser terapötik ajani içeren bir farmasötik bilesim açiklanmaktadir. Ayrica burada, antikor RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 veya bir murin olmayan RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 kaynakli antikor veya bir RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 rekabetçi antikoru içeren bir ilaç ve söz konusu ilacin cerrahi islem veya radyasyon tedavisi ile birlikte kullanilabilecegine yönelik talimatlari içeren bir paket, flakon veya konteynir açiklanmaktadir.
Ayrica burada, yukarida bahsi geçen antikorlarin herhangi birinin uygulanmasi içeren, bir kanserden muzdarip olan bir bireyin tedavi edilmesine yönelik bir metot açiklanmakta olup, burada kanser tasiyan söz konusu hücreler, M-CSF salgilamamaktadir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, kesilmis dimerik M-CSF içindeki disülfidr baglarini gösteren bir topoloji diyagramidir.
Sekil 2, bir noktali çizgi ile belirtilen kristalografik olmayan simetrik eksen ve etiketlenen her onuncu kalinti ile M-CSF'nin C-alfa omurgasinin bir stereodiyagramidir.
Sekil 3, saflastirilmis M-CSE` ve MDA. 231 hücreleri ve MCF7 hücrelerinden kosullandirilmis ortam arasindaki osteoklasti tetikleyen aktivitenin bir karsilastirilmasidir.
Sekil 4A, (ATCC depozit numarasi PTA-6ll3 altinda Amerikan Tipi10 Kültür Koleksiyonu, Manassas, USA tarafindan depolanan plasmidin CDNA ucu ile kodlanan) M-CSF spesifik murin antikor RXl'in amino asit sekansini (SEK ID NO'lar: 2 ve 4) ve buna karsilik gelen nükleik asit sekansini (SEK ID NO'lar: 1 ve 3) göstermektedir.
CDR bölgeleri numaralandirilmis ve koyu olarak gösterilmistir.
Sekil 4B ve 4C, Studnicka ve dig., WO93/11794 sayili belgeye göre tanimlanan sirasiyla, yüksek riskli (koyu), orta riskli (alti çizili) ve düsük riskli kalintilar ile M-CSF spesifik murin antikor RXl hafif (SEK ID No:5) ve agir (SEK ID No:6) zincirlerin amino asit sekansini göstermektedir.
Sekil 5A, M-CSF antikorlari RXl ve 5A1'in türe Özgü oldugunu göstermektedir. Sekil SB, antikorlar MCl ve MC3'ün M-CSF nötralizasyon aktivitesini göstermektedir.
Sekil 6, antikor RXl'in bir 5 mg/kg konsantrasyonda bir insan ksenograf modelindeki osteolizi etkili bir sekilde inhibe ettigini göstermektedir.
Sekil 7, antikor RXl'in 5 mg/kg bir konsantrasyonda insan meme kanseri MDA-MB-231 tasiyan çiplak farelere uygulandiginda metastaz sayisinin azaldigini göstermektedir.
Sekil 8A ve 8B, bir M-CSF spesifik antikorun, meme kanseri hücre hatti MDA-MB-231'e ya da çoklu miyelom. kanser hücre hatti ARH77'ye baglandigini göstermektedir.
Sekil 9, M-CSF'nin, birçok kanser hücre yüzeyinde yaygin oldugunu göstermektedir.
Sekil 10, M-CSFg'nin (SEK ID No:7) amino asit sekansidir.
Sekil 11, M-CSFß'nin (SEK ID No:8) amino asit sekansidir.
Sekil 12, M-CSFy'nin (SEK ID No:9) amino asit sekansidir.
DNA sekansi içindeki birçok polimorfizm, amino asit farkliliklarina neden olur. Örnegin, yaygin bir polimorfizm, pozisyon 104'te Pro'dan ziyade bir Ala saglamaktadir.
Sekil 13, 14 ve 15, sirasiyla MCSF spesifik murin antikorlar (ATCC depozit numarasi FTA-6263 altinda depolanan hibridoma tarafindan üretilen) ve MCS'ün (SEK ID NO'lar: 14 ve 15) (ATCC depozit numarasi FTA-6264 altinda depolanan hibridoma tarafindan üretilen) amino asit sekanslarini göstermektedir.
Sekil 16A ve B, insan M-CSF spesifik murin antikorlar Rxl; 5H4; MC1 Ve MC3'ün (SEK ID NO'lar: 16-38) agir ve hafif zincir amino asit sekanslarinin CDR bölgelerinin bir hizalanmasidir.
Sekil 17, RXl ya da 5H4 için intakt ile Fab fragmanlarinin nötralizasycn aktivitelerini göstermektedir.
Sekil 18, alti çizilmis RXl, 5H4 ve MC3 epitoplari ile M-CSF'nin yapisini göstermektedir (SEK ID NO: 120, 122 ve 123).
Sekil 19A, (a) mürin RXl agir zinciri için risk çizgisini (H:yüksek riskli, M:orta riskli, L:düsük riskli), (b) RXl agir zincir amino asit sekanslarini (SEK 1D NO: 6), (c) RX1'e hizalanmis en yakin insan konsensüs sekansinin amino asit sekansi Kabat Vh2 konsensüs sekansini (SEK ID NO: 39) ve (d) iki Örnek niteligindeki Insan MühendislikTM sekanslarinin (SEK ID NO: 41 ve 43) üretilmesi için yapilmis olan degisiklikleri göstermektedir. Sekil 19B, “düsük riskli” ve “düsük, + orta riskli” olarak belirtilen iki örnek niteligindeki agir zincir Insan MühendislikTM sekanslarinin (SEK ID NO: 41 ve 43) amino asit sekanslarinin yani sira ilgili nükleik asit sekanslarini (SEK ID NO: 40 ve 42) göstermektedir.
Sekil ZOA, (a) mürin, RX1 hafif zinciri için risk çizgisini (H:yüksek riskli, M:orta riskli, L:düsük riskli), (b) RX1 hafif zincir amino asit sekanslarini (SEK 1D NO: 5), (c) RXl'e hizalanmis, Kabat Vk3 konsensüs olan en yakin insan konsensüs sekansinin amino asit sekansini (SEK ID NO: 49) ve (d) iki örnek niteligindeki Insan MühendislikTM sekanslarinin (SEK 1D NO: 45 ve 47) üretilmesi için yapilmis olan degisiklikleri göstermektedir.
Sekil 20B, “düsük riskli” ve “düsük + orta riskli” olarak belirtilen iki örnek niteligindeki hafif zincir Insan MühendislikTM sekanslarinin (SEK ID NO: 45 ve 47) amino asit sekanslarinin yani sira ilgili nükleik asit sekanslarini (SEK ID NO: 44 ve 46) göstermektedir.
Sekil 21A, (a) mürin. RXl hafif zinciri için risk çizgisini (H=yüksek riskli, M=orta riskli, L=düsük riskli), (b) RXl hafif zincir amino asit sekanslarini (SEK ID NO: 5), (c) RXl'e hizalanmis, Kabat Vk3 konsensüs olan en yakin insan konsensüs sekansinin amino asit sekansini (SEK ID NO: 49) ve (d) içerisinde pözisyönlar 54-56 degismedigi (örnegin, kalmis murin sekansi) (SEK ID NO:48) bir alternatif örnek niteligindeki amino asit sekansini göstermektedir. Sekil 21B, iki örnek niteligindeki alternatif hafif zincir Insan MühendislikTM sekanslarin (SEK ID NO: 48, 136) amino asit sekanslarini yani sira ilgili nükleik asit sekanslarini (SEK 1D NO: 137 ve 135) göstermektedir.
Sekil 22A, (a) murin RX1 hafif zinciri için risk çizgisini (H:yüksek riskli, M:orta riskli, L:düsük riskli), (b) RX1 hafif zincir amino asit sekanslarini (SEK ID NO: 5), (c) RXl'e hizalanmis en yakin insan konsensus germ hatti sekansi Vk6 Alt iki örnek niteligindeki Insan MühendislikTM sekanslarinin (SEK ID NO: 51 ve 53) üretilmesi için yapilmis olan degisiklikleri göstermektedir. Sekil 22B, “düsük riskli” ve “düsük, + orta riskli” olarak belirtilen iki örnek niteligindeki hafif zincir Insan MühendislikTM sekanslarinin (SEK ID NO: 51 ve 53) amino asit sekanslarinin yani sira ilgili nükleik asit sekanslarini (SEK ID NO: 52) göstermektedir.
Sekil 23A ;ve 23B, Kabat numaralandirma sistemi kullanilarak (“POS" olarak belirtilen çizgide belirtilmis amino asit numaralandirmasi) (SEK ID NO: 55-82) Çesitli insan konsensüs ve insan germ hatti konsensüs sekanslari ile murin RXl hafif zincir amino asit sekansinin (SEK ID NO:54) hizalanmasini göstermektedir.
Sekil 24A ve 24B, Kabat numaralandirma sistemi kullanilarak (“POS” olarak belirtilen çizgide belirtilmis amino asit numaralandirmasi) (SEK ID NO: 84-112) çesitli insan konsensüs ve insan germ hatti konsensüs sekanslari ile mürin RXl agir zincir amino asit sekansinin (SEK ID NO:83) hizalanmasini göstermektedir. Sekil 24C-24E, antikorlar 5H4, MC1 ve MC3'ün amino asit kalintilarinin nasil Kabat numaralandirma sistemine (sirasiyla SEK ID NO: 10 ve 11; SEK ID NO: 12 ve 13; SEK ID NO: 14 ve 15) karsilik geldigini göstermektedir.lO Sekil 25, rmRXl olarak etiketlenen rekombinant murin RXl antikoru ile rekombinant insan MCSE ve Insan MühendislikTM antikorunun (içerisinde düsük riskli degisiklerin tümü yapilmistir) heRXl-1.Gl, heRXl-l.G2 ve heRXl-l.G4 olarak etiketlenen her biri farkli bir sabit bölgeye (IgGl, lgG2 veya lgG4) sahip üç versiyonunun karsilastirmali nötralizasyonunu göstermektedir.
Sekil 26, rmRXl olarak etiketlenen rekombinant murin RXl antikoru ile insan serumu ve heRXl-l'in (içerisinde düsük riskli degisiklerin tümü yapilmistir) RXZ, RXl-l-IgGZ, RXl-l-lgGl, RXl- l-IgGl, RXl-l-lgG4, RXl-a-IgG4 olarak etiketlenen her biri farkli bir sabit bölgeye (IgGl, IgGZ veya IgG4) sahip birkaç versiyonunun karsilastirmali nötralizasyonunu göstermektedir.
Sekil 27, rekombinant murin RXl antikoru rmRXl ile MDA231 (meme kanseri hücre hatti) ortami ve heRXl-l'in (içerisinde düsük riskli degisiklerin tümü yapilmistir) RXZ, RXl-l-lgGZ, RXl-l- biri farkli bir sabit bölgeye (IgGl, IgG2 veya IgG4) sahip birkaç versiyonunun karsilastirmali nötralizasyonunu göstermektedir.
Sekil 28, rekombinant murin RXl antikorunun ve heRXl-l'in her biri farkli bir sabit bölgeye (Igl veya IgG2) sahip heRXl-1.IgGl ve heRXl-l.IgG2 olarak etiketlenen iki farkli versiyonunun osteoklastogenez üzerindeki etkisini (TRAP aktivitesi ile ölçüldügü üzere) göstermektedir.
Sekil 29A, düsük riskli amino asit degisimleri ile heRXl-l.IgGl için nükleotid sekansini (SEK ID No:113) ve amino asidini (SEK asit degisimlerine sahip heRXl-lO.IgGl için amino asit (SEK ID NO: göstermektedir.
Sekil 30, düsük riskli amino asit degisimlerine sahip heRXl- l.IgG4 için amino asit (SEK ID No:119) ve nükleotid sekansini (CDNA (SEK ID NO:ll8) ve genomik DNA (SEK ID NO:117)) göstermektedir.
BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Metastaz yetenegi, bir kanserin tanimlayici bir özelligidir.
Metastaz, Vücudun diger kisimlarina kanser hücrelerinin yayilmasi veya bu yayilma ile üretilmis durum anlamina gelmektedir. Metastaz, karmasik çok adimli bir islem olup bir hücrenin genetik materyalindeki degisimleri, bir primer tümörün olusturulmasi için degistirilen hücrenin kontrol edilemeyen proliferasyonunu, primer` tümör için yeni bir kan desteginin gelisimini, primer tümörden hücreler tarafindan dolasim sisteminin istilasini, Vücudun diger kisimlarina primer tümör hücrelerinin küçük kümelenmelerinin dagilimin ve bu alanlardaki sekonder tümörlerin büyümesini içermektedir.
Kemik, insan memesi, akciger, prostat ve tiroid kanserlerinde ve ayrica diger kanserlerde metastazin en yaygin alanlarindan biridir ve otopsilerde kanser hastalarinin %60'inin kemik metastazina sahip oldugu bulunmustur. Osteolitik kemik metastazlari, diger organlara gerçeklesen metastazda görülmeyen osteoklastik kemik erimesinin özgün bir adimini göstermektedir.
Kanserle iliskili kemik kaybi, tümör ürünleri tarafindan aktive edilmis osteoklastlar (mineralize dokularin tekrar emilmesi için kapasitesi ile çok çekirdekli dev hücreler) tarafindan aracilik edilmektedir.
Koloni stimüle edici faktör (CSF-l), ayni zamanda makrofaj koloni stimüle edici faktör (M- CSF) olarak da bilinen, osteoklast olusumu için çok önemli bulunmaktadir. Ek olarak M- CSF, matür osteoklastlarin osteoklastik fonksiyonlarini, göçlerini ve diger çözünür faktörler ile isbirligi içinde yasamlarini modüle ettigini ve osteoblastlar ve fibroblastlar tarafindan saglanan hücreden hücre etkilesimini göstermektedir (Fixe ve Praloran, Cytokine 10: 3-7, 1998; Martin ve dig., Tam uzunlukta insan M-CSF mRNA, 554 amino asitlerin bir öncül proteinini kodlamaktadir. Alternatif mRNA uçbirlesmesi ve differansiyel post-translasyonal proteolitik islem yoluyla, M- CSF, ya bir glikoprotein olarak veya proteoglikan içerikli kondroitin. sülfat olarak dolasim. içerisinde salgilanmis olabilmektedir ya da M-CSF üretici hücrelerin yüzeyi üzerinde bir membran katedici glikoprotein olarak ifade edilebilmektedir.
Insan M-CSF'nin bakteriyel olarak yer alan amino ucu 150 amino asitlerinin üc-boyutlu yapisi, tam in vitro biyolojik aktivite için gereken minimal sekansin belirtmis oldugu, bu proteinin, dört alfa sarmal demetleri ve bir anti-paralel beta tabakayi içeren her monomer ile disülfid bagli bir dimer oldugunu gösterir türleri, alternatif mRNA uçbirlestirilmesi yoluyla üretilir. Söz konusu üc polipeptid öncüsü, 256 amino asidine ait M-CSFd, 554 amino asidine ait M-CSFß ve 438 amino asidine ait M-CSFy'dir. M- CSFß, membrana bagli bir formda olusmayan salgilanmis bir proteindir. M-CFSd, proteolitik yarilmadan yavasça salinan bir integral membran protein olarak ifade edilmektedir. M-CFSd, Sekil 10'da yer alan sekansin 191-197 amino asitlerde yarilmaktadir. M-CSF'nin membrana bagli formu, yakinindaki hücreler üzerindeki reseptörler ile etkilesimde olabilmektedir böylece spesifik hücreden hücreye temaslara aracilik etmektedir. içermektedir.
M-CSF'nin çesitli formlari, hedef hücreler üzerinde onun reseptör M-CSFR'ye baglanmasiyla islev görmektedir. M-CSFR, bes hücre disi immünoglobulin benzeri domenleri, bir trans membran domeni ve bir hücre içi kesilmis Src ile ilgili tirosin kinaz domeni ile membrani kateden bir moleküldür. M-CSFR, c-fms proto- onkojen ile kodlanmaktadir. M-CSFR'nin hücre disi domenine M- CSF'nin baglanmasi, reseptörün dimerizasyonuna yol açmakta olup otofosforilasyon ve diger hücresel proteinlerin fosforilasyonuna yol açan sitoplasmik kinaz domenini aktive etmektedir (Hamilton Fosforile edilmis hücresel proteinler, hücresel yanitlara yol açan bir dizi biyokimyasal olaylara neden olmaktadir: mitoz, sitokinlerin salinmasi, membran bozulmasi ve kendi reseptörünün transkripsiyonunun düzenlenmesi (Fixe ve Praloran, Cytokine 10: 32-37 (1998)).
M-CSF, stromal hücrelerde, osteoblastlarda ve diger hücrelerde ifade edilmektedir. Ayni zamanda meme, uterin ve over tümör hücrelerinde de ifade edilmektedir. Bu tümörlerdeki ifadenin kapsami, yüksek dereceli ve kötü prognozla iliskilidir (Kacinski 313-25 (1995)). Meme karsinomlarinda M-CSF ifadesi, intraduktal (invazif öncesi) kansere karsi invazif tümör hücrelerinde yaygindir (Scholl ve dig., J. Natl. Cancer Inst. 86: 120-6 (1994)). Ek olarak, M-CSF'nin, meme tümörlerinin maligniteye ilerleyisini arttirdigini göstermektedir (Lin ve dig., J. Exp. üretiminin, tümöre makrofajlarin güçlendirilmesinden sorumlu oldugu görülmüstür.
Burada gösterildigi üzere, RXl, 5H4, MCl veya MC3 antikoru gibi bir M-CSF spesifik antikor, metastatik kanser hücreleri tarafindan osteoklast tetiklenmesini nötralize etmektedir ve/veya kanserli hayvan modellerindeki kemige gerçeklesen metastazlari azaltmaktadir. Dolayisiyla burada, kanserin, kanser metastazlarin ve kanser metastazlari ile iliskili kemik kaybinin önlenmesi veya tedavi edilmesi için bilesimler` ve metotlar açiklanmaktadir.
Tercih edilen bir anti-M-CSF antikoru murin RXl, Studnicka ve digerlerine ait Insan Mühendislik'PM metodu baz alinarak insanlarda daha az immünojenik olmasi için modifiye edilmektedir. Tercihen, agir zincir degisken bölgesinin 8 ila 12 yüzeyine maruz kalan. amino asit kalintilari. ve hafif zincir bölgesindeki 16 ila 19 yüzeyine maruz kalan kalintilar, belirlenen pozisyonlardaki insan kalintilarina, bir insan ortamina göre immünojenikligini azaltirken, antijen baglanma ya da protein katlanmasini olumsuz yönde etkilemesi mümkün olmayacak sekilde modifiye edilmektedir. Modifiye edilmis agir ve/veya hafif zincir degisken bölgelerini içeren sentetik genler yapilandirilmaktadir ve insan y agir zincirine ve/veya kappa hafif zincir sabit bölgelerine baglanmaktadir.
Herhangi insan agir zincir ve hafif zincir sabit bölgeleri, Insan MühendislikTM antikoru degisken bölgeleri ile birlikte kullanilabilmektedir. Insan agir ve hafif zincir genleri memeli hücrelerine dahil edilmektedir ve sonuçlanan rekcmbinant immünoglobulinr ürünler elde edilmektedir ve karakterize edilmektedir. 5H4, MCl veya MC3 gibi örnek niteligindeki anti- M-CSF antikorlari, benzer sekilde Insan MühendislikTM olmaktadir. birini içermektedir: 1) Sekil 4'te yer alan amino asit sekansina sahip murin antikoru RXl'ün bir amino asit varyanti, ilaveten homolog tespiti için benzer amino asitler hesaba katilarak Sekil 4'te agir zincir amino asidini içeren ve/Veya Sekil 4'te yer alan zincir amino asidi içeren varyantlar; 2) Sekil 4'te yer alan amino asit sekansina sahip murin antikoru RX l'in bir veya daha fazla tamamlayicilik belirleme bölgesini iceren, tercihen RX 1 agir zincirinin en az CDR3'ünü içeren ve tercihen iki veya daha fazla ya da üç veya daha fazla ya da dört veya daha fazla ya da bes veya daha fazla ya da bütün alti CDR'yi içeren M-CSF baglayici polipeptidler (murin antikor RX l hariç): 3) Agir ve hafif amino asit sekanslarina sahip Insan MühendislikTM antikorlari veya Sekil 19B'den 22B'ye kadarki sekillerin orijinal Insan MühendislikTM agir ve hafif zinciri ile en az %60 amino asit sekansi özdesligine sahip, daha fazla tercihen az %80, daha fazla tercihen en az %85, daha fazla tercihen en az %90 ve en fazla tercihen en az %95, ilaveten varyantlari; 4) Sekil 19B'den 22B'ye kadarki sekillerin Insan MühendislikTM10 antikorlarinin bir veya daha fazla CDR'sinin yüksek riskli kalintilarini içeren ve tercihen iki veya daha fazla ya da üç veya daha fazla ya da dört veya daha fazla ya da bes veya daha fazla ya da bütün alti CDR'nin yüksek riskli kalintilarini içeren M-CSF baglayici polipeptidler (murin antikor RXl hariç); ) Sekil 4B'te yer alan düsük veya orta riskli kalintilarda bir veya daha fazla degisimi içeren ve Sekil 4B'te yer alan yüksek riskli asit kalintilari muhafaza eden varyantlar veya Insan MühendislikTM antikorlari; örnegin, Sekil 4B'te yer alan bir düsük riskli kalintida bir veya daha fazla degisikligi ve bir orta riskli kalintida koruyucu ornatmalar içermekte, veya örnegin, Sekil 4B'de yer alan orta ve yüksek riskli amino asit kalintilari korunmakta bir veya daha fazla degisikligi ve bir düsük riskli kalintida bir veya daha fazla degisikligi içermekte burada degisiklikler, yerlestirmeleri, silmeleri veya ornatmalari içermektedir ve koruyucu ornatmalar olabilmektedir veya tasarlanmis antikorun, bir insan hafif zincir veya agir zincir sekansi, bir insan germ hatti hafif veya agir zincir sekansi, bir konsensüs insan hafif zincir` veya agir zincir sekansi veya bir konsensüs insan germ hatti hafif zincir veya agir zincir sekansa sekans açisindan daha yakin olmasina neden olmaktadir; M-CSF'ye baglanma yetenegini muhafaza etmektedir. Bu antikorlar tercihen, en az 10”, 10-8 veya 10-9 veya daha fazla bir affinite ile M-CSF'ye baglanmaktadir ve tercihen M-CSF'nin aktivitesini tetikleyen osteoklastogenezi nötralize etmektedir.
Benzer sekilde, “MC3 ile türetilen antikor” terimi asagidakilerden herhangi birini içermektedir: 1) Sekil 15'te yer alan amino asit sekansina sahip murin antikoru MCB'ün bir amino asit varyanti, ilaveten homolog tespiti için benzer amino asitler hesaba katilarak Sekil lS'te agir zincir amino asidini içeren ve/Veya Sekil l5'te yer alan zincir amino asidi içeren varyantlar; 2) Sekil 15'te yer alan amino asit sekansina sahip murin antikorü MCB'ün bir veya daha fazla tamamlayicilik belirleme bölgelerini içeren, tercihen iki veya daha fazla ya da üç veya daha fazla ya da dört veya daha fazla ya da bes veya daha fazla ya da bütün alti CDR'yi içeren ve tercihen MC3 agir zincirinin en az CDR3'ünü içeren M-CSF baglayici polipeptidler (opsiyonel olarak murin antikor MC3 hariç veya dahil); 3) Düsük, orta ve yüksek riskli kalintilarin tanimlanmasi için Sekil 24C-24E'de yer alan Kabat numaralandirmasi kullanilarak, burada Örnek 4A ve Studnicka ve dig., U.S. Patent No. 5,766,886 sayili belgede yer alan metotlara göre murin sekansinin degistirilmesiyle olusturulan Insan MühendislikTM antikorlari; benzeri antikorlar, asagidaki agir zincirlerin en az birini ve asagidaki hafif zincirlerin en az birini içerir: (a) düsük riskli kalintilarinin tümünün, gerektiginde, bir insan referans immünoglobulin sekansi olarak ayni kalintilar olmasi için modifiye edilmis oldugu bir agir zincir veya (b) düsük ve orta riskli kalintilarinin tümünün, gerektiginde, bir insan referans immünoglobulin sekansi olarak ayni kalintilar olmasi için modifiye edilmis oldugu bir agir zincir, (c) düsük riskli kalintilarinin tümünün, gerektiginde, bir insan referans immünoglobulin sekansi olarak ayni kalintilar olmasi için modifiye edilmis oldugu bir hafif zincir veya (d) düsük ve orta riskli kalintilarinin tümünün, gerektiginde, bir insan referans immünoglobulin sekansi olarak ayni kalintilar olmasi için modifiye edilmis oldugu bir hafif zincir; 4) daha tercihen en az %80, daha fazla tercihen en az %85, daha fazla tercihen en az %90 ve en fazla tercihen en az %95, zincir ile en az %60 amino asit sekansina sahip bir agir veya hafif zinciri içeren önceki paragraftaki (3) yukarida bahsi geçen antikcrlarin varyantlari; ) Sekil 15'in murin antikorununr MC3 bir veya daha fazla CDR'sinin yüksek riskli kalintilarini içeren ve tercihen iki veya daha fazla ya da üç veya daha fazla ya da dört veya daha fazla ya da bes veya daha fazla ya da bütün alti CDR'sinin yüksek riskli kalintilarini içeren M-CSF-baglayici polipeptidler (opsiyonel olarak murin antikor MC3 hariç veya dahil): 6) Düsük veya orta riskli kalintilarda bir veya daha fazla degisikligi içeren ve murin MC3 antikorunun yüksek riskli amino asit kalintilarini muhafaza eden varyantlar veya Insan MühendislikTM antikorlari; Örnegin, bir düsük riskli kalintida bir veya daha fazla degisimi ve bir orta riskli kalintida koruyucu ornatmalari içermekte, örnegin, bir düsük riskli kalintida bir veya daha fazla degisimi ve orta ve yüksek riskli amino asit kalintilar muhafaza edilmekte burada degisiklikler, yerlestirmeleri, silmeleri veya ornatmalari içermektedir ve koruyucu ornatmalar olabilmektedir veya tasarlanmis antikorun, bir insan hafif zincir veya agir zincir sekansi, bir insan germ hatti hafif veya agir zincir sekansi, bir konsensüs insan hafif zincir veya agir zincir sekansi veya bir konsensüs insan germ hatti hafif zincir veya agir zincir sekansa sekans açisindan daha yakin olmasina neden olmaktadir; M-CSF'ye baglanma yetenegini muhafaza etmektedir. Bu antikorlar tercihen, en az 10”, 10"8 veya 10“9 veya daha fazla bir affinite ile M-CSF'ye baglanmaktadir ve tercihen M-CSF'nin aktivitesini tetikleyen osteoklastogenezi nötralize etmektedir. terimi benzer sekilde yukaridaki tarifnameye göre tanimlanmaktadir.
Burada detayli olarak tarif edildigi gibi, RXl, 5H4, MCl veyalO MC3 kaynakli antikorlar, ilaveten Insan MühendislikTM antikorlari veya varyantlari, örnegin, IgG, IgA, IgM veya IgE gibi farkli izotipler olabilmektedir. IgG'nin antikorlari, farkli bir sabit bölgeyi içermektedir, örnegin, bir IgG2 antikoru, bir IgGl veya IgG4 sabit bölgenin görüntülenmesi için modifiye edilebilmektedir. Modifiye edilmis veya modifiye edilmemis IgGl veya IgG4 sabit bölgesini içeren Insan MühendislikTM antikorlari veya varyantlari burada açiklanmaktadir. IgGl söz konusu oldugunda sabit bölgeye, özellikle mafsal veya CH2 bölgesine yapilan modifikasyonlar, ADCC ve/Veya CDC aktivitesi dahil olmak üzere efektör fonksiyonunu arttirabilmekte veya azaltabilmektedir. Bir IgG2 sabit bölgesi, antikor-antijen agrega olusumunun azaltilmasi için modifiye edilebilmektedir.
IgG4 söz konusu oldugunda, sabit bölgeye, özellikle mafsal bölgeye yapilan modifikasyonlar, yari-antikorlarin olusumunu azaltabilmektedir. Spesifik bir örnekte, IgGl mafsal sekansi Cys-Pro-Ser-Cys'nin IgG4 mafsal sekansi Cys-Pro-Pro-Cys'ye dogru mutasyona ugratilmasi açiklanmaktadir.
IgGl veya IgG4 sabit bölgelerini içeren Insan MühendislikTM antikorlari, IgG2 sabit bölgelerini içeren Insan MühendislikTM antikorlari ile karsilastirildiginda gelistirilmis özelliklere sahiptir. IgGl veya IgG4 FC bölgesinin seçimi, baglanma affinitesini, MCSF nötralizasyon aktivitesini ve anti-osteoklast aktivitesini gelistirmistir. Ilaveten, IgGl veya IgG4 FC bölgesinin seçimi, ana murin antikoru tarafindan olusturulanlara daha yakindan benzeyen antijen-antikor kompleksleri saglamaktadir.
Mafsal bölgedeki hareketlilik ayrica, dimerik antijen MCSF'ye antikorun baglanmasini belirgin bir sekilde etkilemesinin yani sira antikorun nötralizasyon aktivitesini belirgin bir sekilde etkiledigi görünür. Modifiye edilmis veya modifiye edilmemis IgGl veya IgG4 sabit bölgesini ve özellikle mafsal ve CH2 domenlerini veya tercihen en azindan mafsal domenlerini içeren bir agir zinciri içeren antikorlarin hazirlanmasinin, baglayici affiniteyi gelistirdigi ve/Veya dimerik antijenlerden antikorun ayrismasini yavaslattigi Öngörülmüstür. 1] Sekil 4'te yer alan bütün hafif ve agir zincir sekanslarina sahip murin RXl ile ayni M-CSF epitopuna baglanan bir murin olmayan veya kemirgen olmayan monoklonal antikoru; 2] Sekil l2'de yer alan M-CSF'nin 98-105 amino asitlerinin en az 4 bitisik› amino asidine baglanan› bir› murin olmayan veya kemirgen olmayan monoklonal antikoru; ve fazla bir oranda baglanmasi için Sekil 4'te yer alan tam sekansa sahip murin antikor RXl ile rekabet eden bir murin olmayan veya kemirgen olmayan monoklonal antikoru. Bu antikorlar tercihen, en az 10”, 10*8 veya 10'9 veya daha fazla bir affinite ile M-CSF'ye baglanmaktadir ve tercihen M-CSF'nin aktivitesini tetikleyen osteoklastogenezi nötralize etmektedir. rekabetçi antikoru” terimleri benzer sekilde, sirasiyla Sekil 13, 14 veya 15'te yer alan bütün hafif ve agir zincir sekanslarina sahip murin 5H4, MCl veya MC3 antikorlarina referansi ile ve örnegin, sekil 12'de yer alan amino asitler 65- epitoplarina iliskin) antikor ile baglanan M-CSF'nin epitopuna referansi ile tanimlanmaktadir.
Opsiyonel olarak, bunlarin dosyalanma tarihi öncesi resmen açiklanmis veya bunlarin dosyalanma tarihi öncesi dosyalanmis bir basvuruda açiklanan herhangi kimerik, insan veya insanlastirilmis M-CSF antikoru, bulusun kapsami disindadir. tanimlandigi gibi, bir kemirgen hibridoma ile olusturulan bir bütün intakt kemirgen monoklonal antikoru olmayan herhangi bir antikordur. Ayrica, kemirgen olmayan antikorlar ozellikle, ancak bunlarla sinirli kalmamak üzere, kemirgen antikorlarin varyantlarini, kemirgen antikor fragmanlarini, lineer antikorlari, kimerik antikorlari, insanlastirilmis antikorlari, Insan MühendislikTM antikorlarini ve insan antikorlarini, ilaveten transjenik hayvanlardan veya faj görüntüleme teknolojisi vasitasiyla üretilmis insan antikorlarini içermektedir. Benzer olarak, murin olmayan antikorlar, bunlarla sinirli kalmamak üzere, murin antikorlarin varyantlarini, murin antikor fragmanlarini, lineer antikorlarini, kimerik, insanlastirilmis, Insan MühendislikTM ve insan antikorlarini içermektedir.
Burada kullanildigi sekliyle “tümör" terimi, malign ya da benign olsun tüm neoplastik hücre büyümesi ve proliferasyonu ve tüm kanser öncesi ve kanserli hücreleri ve dokulari ifade etmektedir. hücre büyümesi ile karakterize edilen memelilerdeki fizyolojik durumu ifade etmekte veya tanimlamaktadir. Kanser örnekleri arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere, karsinoma; lenfoma, blastoma, sarkoma ve lösemi bulunmaktadir. Söz konusu kanserlerin daha özel örnekleri arasinda meme kanseri, prostat kanseri, kolon kanseri, skuamöz hücre kanseri, küçük hücreli akciger kanseri, küçük olmayan hücreli akciger kanseri, gastrointestinal kanser, pankreatik kanser, glioblastoma, servikal kanseri, över kanseri, karaciger kanseri, mesane kanseri, hepatom, kolorektal kanseri, endometriyal karsinoma, tükürük bezleri karsinoma, böbrek kanseri, karaciger kanseri, vulval kanseri, tiroid kanseri, hepatik karsinoma ve boyun ve bas kanserinin çesitli tipleri bulunmaktadir. gelisiminin engellenmesi amaciyla olusturulan bir müdahaledir.
Buna bagli olarak “tedavi”, hem terapötik tedavi hem de profilaktik ya da önleyici tedbirler anlamina gelmektedir.
Tedaviye ihtiyaç duyanlar arasinda, bozukluga halihazirda sahip olan kisiler ve bozuklugun önlenecegi kisiler bulunmaktadir.
Tümör (örnegin, kanser) tedavisinde, bir terapötik ajan, tümör hücrelerinin patolojisini dogrudan düsürebilmektedir veya örnegin, radyasyon ve/veya kemoterapi gibi diger terapötik ajanlar ile tedavi edilmesi için daha fazla duyarli tümör hücrelerine karsilik vermektedir. Klinik, biyokimyasal, radyolojik veya osteoliz gibi hastaligin sübjektif semptomlarindan muzdarip olan hastalarin tedavisi, benzeri semptomlarin bazilarinin. veya tümünün iyilestirilmesini veya hastaliga yatkinligin azaltilmasini içermektedir. Kanserin içermektedir. Bu, sinirlandirma olmaksizin anormal ve kontrolsüz hücre büyümesini, metastazini, komsu hücrelerin normal fonksiyonu ile çatismasini, anormal seviyelerdeki sitokinlerin veya diger salgi ürünlerinin salinimini, enflamatuar veya immünolojik yanitin baskilanmasini veya siddetlenmesini ve benzerlerini içermektedir. Böylece tedavi sonrasi gelisme, azalan tümör boyutu, tümör büyüme oranindaki düsüs, var olan tümör hücrelerin veya metastatik hücrelerin yikimi ve/veya metastazlarin boyutunda veya miktarinda bir azalma olarak tezahür edebilmektedir.
Tedavinin amaçlari dogrultusunda “memeli", insanlar, evcil ve çiftlik hayvanlari ve hayvanat bahçesi, spor amaçli veya evde beslenen hayvanlar, örnegin köpekler, atlar, kediler, inekler ve benzerleri dahil bir memeli olarak siniflandirilmis herhangi bir hayvan anlamina gelmektedir.
Burada kullanildigi sekliyle “metastatik kanser" ifadesi, vücudun diger bölgelerine, özellikle de kemige yayilma potansiyeline sahip kanserler olarak tanimlanmaktadir. Çok sayida kanser, kemige metastaz yapabilir, ancak en yaygin metastaz yapan kanserler arasinda meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid ve prostat kanserleri bulunmaktadir. Örnek olarak, kemige netastaz yapma potansiyeline sahip olan diger kanserler, bunlarla sinirli kalmamak üzere, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücre maligniteler; bas ve boyun kanserleri; özofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, intestinal kanser, kolorektal kanser, rektal kanser, pankreatik kanser, karaciger kanseri, safra kanali veya safra kesesi kanseri dahil gastrointestinal kanserler; over karsinoma, uterin endometriyal kanserler, vajinal kanser ve servikal kanser dahil disi genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma; ve malignant melanom ve skuamöz hücre kanseri dahil cilt kanserini içermektedir.
Mevcut açiklama Özellikle, kemik içinde tümöre bagli osteolitik lezyonlarin önlenmesi ve tedavisini tasarlamaktadir.
Burada kullanildigi sekliyle “terapötik olarak etkili miktar” ifadesi, istenilen tedavi rejimine göre uygulandiginda istenilen terapötik veya profilaktik etkiyi veya yaniti ortaya çikaran, uygun terapötik veya profilaktik M-CSF antikorunun bir miktari anlamina gelmektedir.
Burada kullanildigi sekliyle insan “M-CSF” terimi, Kawasaki ve dig., Science 230:29l (l985), Cerretti ve dig., Molecular 6:2693 (1987) sayili belgelerde tarif edilen matür insan M-CSFd, M-CSFß veya M-CSFV polipeptidleri ile büyük bir oranda ayni amino asit sekansina sahip bir insan polipeptidi anlamina gelmektedir.
Bu terminoloji, üç matür M-CSF'nin, yukarida tarif edildigi gibi, farkli amino asit sekanslarina sahip oldugu ve M-CSF'nin aktif formunun bir disülfid ile baglanmis dimer oldugu anlayisini yansitmaktadir; ayrica, “M-CSF” terimi biyolojik olarak aktif forma atifta bulundugunda, dimerik form kastedilmektedir. “M-CSE` dimeri”, dimerlestirilmis iki M-CSF polipeptLd monomer anlamina gelmektedir ve Inan homodimerleri (ayni tip M-CSF monomerin ikisini kapsayan) ve hem de heterodimerleri (iki farkli monomeri kapsayan) içermektedir. M- CSF monomerleri, U.S. Pat. No. 4,929,700 sayili belgede tarif edildigi gibi in vitro M-CSF dimerlere dönüstürülmüs olabilmektedir.
Anti-MCSE antikorlari Mevcut açiklama, RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 gibi bir M-CSF spesifik antikoru, RXl, 5H4, MCl ve/veya MC3 gibi bir M-CSF spesifik antikoru içeren farmasötik formulasyonlari, farmasötik formülasyonlarin hazirlanmasina yönelik metotlari ve farmasötik formülasyonlar ve bilesikler ile hastalarin tedavi edilmesine yönelik metotlari içermektedir. “Antikor” terimi, en genis anlaminda kullanilmaktadir ve tamamen olusan antikorlari, monoklonal antikorlari, poliklonal antikorlari, Hmltispesifik antikorlari (örnegin, bispesifik antikorlar), antijeni (örnegin, Fab', F'(ab)2, FV, tek Zincirli antikorlar, diakorlar) baglayabilen antikor fragmanlari ve istenilen. biyolojik aktiviteyi sergiledigi sürece yukaridakileri içeren rekombinant peptidleri içermektedir.
Burada kullanildigi haliyle “monoklonal antikor” terimi, büyük bir oranda homojen antikorlarin bir popülasyonundan elde edilmis bir antikor anlamina gelmektedir, örnegin, popülasyonu içeren tek antikorlar, az miktarlarda mevcut olabilen olasi dogal olarak olusan mutasyonlar hariç özdestir. Monoklonal antikorlar yüksek oranda spesifik olup, tek bir antijen bölgesine yöneliktir. Ayrica, tipik olarak. farkli belirleyicilere (epitoplara) yönlendirilmis farkli antikorlari içeren (poliklonal) antikor preparatlarinin aksine, her bir monoklonal antikor, antijen üzerinde tek bir belirleyiciye yönlendirilmis haldedir. Spesifik olmalarina ek olarak, monoklonal antikorlar, homojen kültür ile sentezlenmeleri, farkli spesifikliklere ve özelliklere sahip diger` immünoglobulinler ile kontamine edilmemis olmalari bakimindan avantajlidir. bir antikor popülasyonundan elde edilen antikorun bu özelligini ifade etmekte ve ilgili antikorun belirli bir üretim metodunu gerektirdigi yönünde yorumlanmamalidir. Örnegin, mevcut açiklamaya göre kullanilan monoklonal antikorlar, ilk olarak hibridoma metodu ile yapilabilmekte veya rekombinant DNA metotlari ile yapilabilmektedir (bakiniz, örnegin, U.S. Patent No. 4,816,567 sayili belge). “Monoklonal antikorlar" ayni belgelerde tarif edilen teknikler kullanilarak faj antikor kütüphanelerden izole edilmis olabilmektedir.
Agir zincirlerinin sabit domenlerinin amino asit sekansina bagli olarak, immunoglobulinler farkli siniflara atanabilmektedir. Bes ana sinif, IgA, IgD, IgE, IgG ve IgM, bulunmaktadir ve bunlarin birkaçi daha sonra alt siniflara veya izotiplere, örnegin, IgGl, lgG2, IgGB, IgG4, lgAl ve lgAZ, ayrilmaktadir.
Immünoglobulinlerin farkli siniflarina karsilik gelen agir- zincir sabit domenleri, sirasiyla alfa, delta, epsilon, gama ve mu olarak adlandirilmaktadir. Immünoglobulinlerin farkli siniflarinin üç-boyutlu konfigürasyonlari ve alt birim yapilari iyi bilinmektedir. Farkli izotipler, farkli efektör fonksiyonlara sahiptir; örnegin, lgGl ve lgG3 izotipleri ADCC aktivitesine sahiptir. kismini, tercihen intakt antikorun antijen baglayici veya degisken bölgesini içermektedir. Antikor fragmanlarinin örnekleri arasinda Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlari; diakorlar; lineer antikorlar (Zapata ve dig., Protein ve antikor fragmanlarindan olusturulmus multispesifik antikorlari bulunmaktadir. Antikorlarin papain sindirimi, her biri tek bir antijen baglayici bölge içeren "Fab" fragmanlari olarak adlandirilan iki özdes antijen baglayici fragman ve kolayca kristallesebildigi adindan anlasilan bir kalinti “FC" fragmanini üretmektedir. Pepsin tedavisi, antikorun lü& ve VL domenlerini içeren iki “Tek zincirli FV" veya “sFV” antikor fragmanlarina sahip bir F(ab')2 fragmani vermekte olup, burada bu domenler, bir tek polipeptid zincirinde mevcuttur. Tercihen, FV polipeptidi ayrica, FV'nin antijen baglanmasi için istenilen yapisinin olusturulmasina olanak saglayan VH ve VL domenleri arasinda bir polipeptid baglayici içermektedir. sFV ile ilgili bir inceleme için bkz. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Cilt 113, Rosenburg ve Moore eds., baglanmasindan sorumlu olan amino asit kalintilari anlamina gelmektedir. Hiperdegisken bölge, bir tamamlayicilik belirleme bölgesinden veya CDR'den amino asit kalintilarini [örnegin., Kabat Ve dig., Sequences of Proteins of Immunological Interest, . Baski. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) sayili belgelerde tarif edildigi gibi hafif zincir degisken domenindeki kalintilari ve agir zincir degisken domenindeki , 50- 65 (HZ) ve ] kalintilari] ve/Veya hiperdegisken bir döngüden kalintilar (örnegin, [Chothia ve dig., J. Mol.Biol. zincir degisken domenindeki kalintilari ve agir zincir degisken domenindeki , 53- 55 (HZ) ve kalintilarini içermektedir. kalintilarindan baska degisken bölge kalintilaridir.
VL) bir hafif zincir degisken domenine (VL) bagli bir agir zincir degisken domenini (VH) içeren, iki antijen baglanma alanina sahip küçük antikor fragmanlari anlamina gelmektedir. Ayni zincir üzerinde iki domen arasinda eslesme saglamak için çok kisa olan bir baglanti molekülü kullanilarak, domenler, baska bir zincirin tamamlayici domenleriyle eslesmeye zorlanmakta ve böylece iki adet antijen baglanma alani olusturulmaktadir.
Diakorlarin daha ayrintili açiklamasi için bkz. örnegin, EP Multispesifik (örnegin bispesifik) monoklonal antikorun, ilaveten monoklonal, insan, insanlastirilmis, Insan MühendislikTM veya en az iki farkli epitop için baglanma spesifiklerine sahip varyant anti-M-CSF antikorlarinin olusturulmasi arzu edilebilmektedir. Örnek niteligindeki bispesifik antikorlar M- CSF'nin iki farkli epitopuna baglanabilmektedir. Alternatif olarak, bir anti-M-CSF kolu, M-CSF ifade edici hücreye hücresel defans mekanizmalarin odaklanmasi amaciyla, T hücresi reseptör molekülü (örnegin, CD2 veya CD3) gibi bir lökosit. üzerinde tetikleyici bir' moleküle veya örnegin, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) ve FcyRIII (CD16) gibi IgG için Pc reseptörlerine (FcyR) baglanan bir kol ile birlestirilebilmektedir. Bispesifik antikorlar ayni zamanda, M-CSF'yi ifade eden hücrelere sitotoksik ajanlarin yerlestirilmesi için kullanilabilmektedir.
Bu antikorlar, bir M-CSF baglayici kola ve sitotoksik ajana (örnegin, saporin, anti-interferon-60, vinka alkaloid, risin A zinciri, metotrekzat veya radyoaktif izotop hapten) baglanan bir kola sahiptir. Bispesifik antikorlar, tam uzunlukta antikorlar veya antikor fragmanlari (örnegin, F(ab').alt.2 bispesifik antikorlar) olarak hazirlanabilmektedir.
Bispesifik antikorlarin yapilmasina yönelik bir baska yaklasima göre, bir çift antikor molekülü arasindaki ara yüz, rekombinant hücre kültüründen ortaya çikarilmis heterodimerlerin yüzdesinin maksimize edilmesi için tasarlanabilmektedir. Tercih edilen ara yüz, bir antikor sabit domeninin Ch3 domeninin en az bir kismini içermektedir. Bu metotta, birinci antikor molekülünün ara yüzünden bir veya daha fazla küçük amino asit yan zinciri, daha büyük yan zincirleri ile (örnegin, tirosin veya triptofan) degistirilmektedir. Büyük yan zincirle (zincirlerle) özdes veya benzer boyuttaki telafi edici "bosluklar", ikinci antikor molekülünün arayüzü üzerinde büyük amino asit yan zincirlerinin daha küçük olanlarla (örnegin alanin veya treonin) degistirilmesi yoluyla üretilmektedir. Böylece heterodimerin, homodimerler gibi diger istenmeyen son ürünler üzerindeki veriminin artirilmasi için bir mekanizma saglanmaktadir.
Bakiniz, 6 Eylül l996'ta yayinlanan WO96/270ll sayili belge.
Bispesifik antikorlar, Çapraz-bagli veya “heterokonjüge” antikorlari içermektedir. Örnegin heterokonjügat içindeki antikorlardan birisi avidine, digeri biyotine kenetlenebilmektedir. Heterokonjüge antikorlar, herhangi uygun bir çapraz-bagli metot kullanilarak yapilabilmektedir. Uygun çapraz baglama ajanlari teknikte iyi bilinmektedir ve birkaç Çapraz baglama teknigiyle birlikte U.S.
Pat. No 4,676,980 belgesinde açiklanmaktadir.
Antikor fragmanlarindan bispesifik antikorlarin olusturulmasina yönelik teknikler de literatürde tarif edilmektedir. Örnegin, bispesifik antikorlar kimyasal bag kullanilarak hazirlanabilmektedir. Brennan ve dig., Science, 229: 81 (1985), intakt antikorlarin F(ab')2 fragmanlarini olusturmak üzere proteolitik olarak kesildigi bir prosedürü tarif etmektedir. Bu fragmanlar, yakindaki ditiyollerin stabilize edilmesi ve moleküller arasi disülfid olusumunun önlenmesi amaciyla, ortamda ditiyol kompleks Olusturucu ajan sodyum arsenit mevcutken indirgenmektedir. Üretilen Fab' fragmanlari daha sonra tiyonitrobenzoat (TNB) türevlerine dönüstürülmektedir. Fab'-TNB türevlerinden birisi daha sonra merkaptoetilamin ile indirgeme yoluyla yeniden Fab'-tiyole dönüstürülmekte ve esmolar miktardaki diger Fab'-TNB türeviyle karistirilarak bispesifik antikor olusturulmaktadir. Üretilen bispesifik antikorlar, enzimlerin seçici olarak hareketsizlestirilmesine yönelik ajanlar olarak kullanilabilmektedir. Örnegin, E. coli'den dogrudan toplanan Fab' fragmanlari in vitro sekilde bispesifik antikorlar olusturmak üzere kimyasal olarak kenetlenmektedir. insanlastirilmis bir F(ab')2molekülü bispesifik antikorunun üretilmesini tarif etmektedir. Her bir Fab' fragmani, E.coli'den ayri ayri salgilanmakta ve bispesifik antikoru olusturmak üzere, in vitro olarak yönlendirilmis kimyasal kenetlenmeye tabi tutulmaktadir. Bu sekilde olusturulan bispesifik antikor, HERZ reseptörünü. ve normal insan. T hücrelerini asiri ifade eden hücrelere baglanabilme ve ayrica, insan sitotoksik lenfositlerinin, insan gögüs tümörü hedeflerine karsi litik aktivitesini tetikleyebilme kabiliyetine sahiptir.
Bispesifik, antikor fragmanlarinin dogrudan rekombinant hücre kültüründe üretimi ve buradan izole edilmesine yönelik çesitli teknikler de tarif edilmistir. Örnegin bispesifik antikorlar lösin fermuarlar kullanilarak üretilmektedir. (Kostelny ve dig., türetilen lösin fermuar peptitleri, iki farkli antikorun Fab' kisimlarina gen füzyonu yoluyla baglanmistir. Antikor homodimerleri mafsal bölgede indirgenerek monomerler olusturulmus ve ardindan yeniden oksitlenerek antikor heterodimerleri olusturulmustur. Bu metot ayrica antikor homodimerlerinin iuretilmesi için de kullanilabilmektedir. (1993) tarafindan tarif edilen "diakor" teknolojisi, bispesifik antikor fragmanlarinin yapilmasina yönelik alternatif bir mekanizma saglamaktadir.
Fragmanlar, ayni zincir üzerinde iki domen arasinda eslemeye olanak saglamak için çok kisa olan bir baglayici molekül ile bir hafif-zincir degisken bölgesine (VL) baglanan bir agir zincir degisken bölgesini (Vb) içermektedir. Buna uygun olarak, bir fragmanin VH ve VL domenleri, baska bir fragmanin tamamlayici VL ve VH domenleriyle eslesmeye zorlanmakta ve böylece iki antijen baglama bölgesi olusturmaktadir. Tek Zincirli FV (sFV) dimerleri kullanilarak bispesifik antikor fragmanlarinin yapilmasina yönelik baska bir strateji daha bildirilmistir. Bkz. Gruber ve Alternatif olarak, bispesifik antikor, Zapata ve dig. Protein üretilen bir “lineer antikor" olabilmektedir. Özetle, bu antikorlar, bir çift antijen baglanma bölgesi olusturan bir çift tandem Fd segmentini (Vy4hl-Vy{hl) içermektedir. Lineer antikorlar bispesifik veya monospesifik olabilmektedir.
Ikiden. fazla. degerlige sahip antikorlar` da tasarlanmaktadir. Örnegin, trispesifik antikorlar hazirlanabilmektedir (Tutt ve dig., J. Immunol. 147:6O (1991)).
Monoklonal, insan, insanlastirilmis, insan MühendislikTM veya varyant anti-M-CSF antikoru, bir RXl, 5H4, MCl veya MC3 antikor fragmani gibi bir antikor fragmani olabilmektedir. Çesitli teknikler, antikor fragmanlarinin üretilmesine yönelik olarak gelistirilmistir. Geleneksel olarak bu fragmanlar, intakt antikorlarin proteolitik sindirimi yoluyla türetilmistir (bkz. Örn. Morimoto ve dig., Journal of Biochemical and Biophysical (1985)). Ancak bu fragmanlar günümüzde rekombinant konakçi hücreler tarafindan dogrudan üretilebilmektedir. Better ve dig., antikor fragmanlarinin salinmasini açiklamaktadir` (bkz. örn.
Alternatif olarak Fab'-SH fragmanlari, dogrudan E. coli'den toplanabilmekte ve F(ab')2 fragmanlarini olusturmak üzere kimyasal olarak kenetlendirilmektedir (Carter ve dig., birlesmesinin desteklenmesi için lösin fermuari GCN4 kullanilarak olusturulabilmektedir. Bir baska yaklasima göre, FV, Fab 'veya F(ab')2 fragmanlari, rekombinant konakçi hücre kültüründen dogrudan izole edilebilmektedir. Antikor fragmanlarinin üretimine yönelik diger teknikler ilgili alanin uzmanlarinca bilinmektedir. bileseninden ayrilmis ve/Veya geri kazanilmis olan bir antikordur. Dogal ortaminin kontaminant bilesenler, antikorun diyagnostik veya terapötik kullanimlarina müdahale edecek olan malzemelerdir ve bunlar, enzimleri, hormonlari ve diger proteinli ya da proteinsiz Çözünen maddeleri içerebilmektedir.
Antikor, (l) Lowry metodu ile tespit edildigi gibi antikorun agirlikça %95'den fazlasina ve en fazla tercihen agirlikça kullanilmasiylar iç amino asit sekansir veya en az 15 'ucunun kalintilarinin elde edilmesi için yeterli bir dereceye veya (3) Koomassie mavisi veya tercihen gümüs boyasi kullanilarak indirgeyici veya indirgeyici olmayan kosullar altinda SBS-PAGE ile homojenlige saflastirilabilmektedir.
Izole edilmis antikor, antikorun dogal ortamindaki en az bir bilesen mevcut olmayacagindan dolayi, rekombinant hücrelerin içinde antikoru in situ sekilde içermektedir. Normal olarak, buna ragmen, izole edilmis antikor en az bir saflastirma adimi ile hazirlanacaktir.
Antikorlarin yapisi ve olusumunun detayli bir tarifi için bkz.
Birlesik Devletleri Patent No. 6,255,458. Özetle, agir ve hafif zincir immünoglobulin genlerini kodlayan DNA'nin olusturulmasina yönelik proses, esas olarak B-hücrelerinin gelisiminde meydana gelmektedir. Çesitli immünoglobulin gen segmentlerin. yeniden düzenlenmesi veya birlestirilmesinden önce, V, D, J ve sabit (C) gen segmentleri, genel olarak bir tek kromozom üzerinde nispeten yakinda bulunmaktadir. B-hücresi farklilasmasi sirasinda, V, D, J (veya hafif zincir genleri söz konusu oldugunda sadece V ve J) gen segmentlerinin uygun aile üyelerinin her biri, islevsel olarak yerlestirilmis agir ve hafif immünoglobulin genlerin olusturulmasi için yenden kombine birlestirilmektedir. Bu gen segmenti yeniden düzenleme prosesinin ardisik oldugu görülmektedir. Ilk olarak agir zincir D ila J birlesmeleri ve akabinde agir zincir V ila DJ birlesmeleri ve hafif zincir V ila J birlesmeleri yapilmaktadir. islevsel agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin olusturulmasi için degisken bölge gen segmentlerinin rekombinasyonu, rekombinasyonal olarak etkili V, D ve J segmentlerini destekleyen rekombinasyon sinyal sekanslari (RSS'ler) tarafindan aracilik edilmektedir. RSS'nin rekombinasyonu yönlendirmek için gerekli ve yeterli olmasi, bir dyad simetrik heptamer, bir AT bakimindan zengin bir nonamer ve 12 veya 23 baz çiftinden olusan araya giren bir aralayici bölgesi içermektedir. Bu sinyaller, DJ (veya VJ) rekombinasyonunu gerçeklestiren ve fonksiyonel olarak degistirilebilir farkli konumlar ve türler arasinda korunmaktadir. Bkz. Oettinger ve referanslar. Heptamer, korunmamis sekansin bir boslugu ile sekans CACAGTG veya analogunu içermektedir ve daha sonra nonamer sekans ACAAAAACC veya analoguna sahiptir. Bu sekanslar, J üzerinde veya her V' ve D gen segmentinin asagi tarafinda bulunmaktadir. Hemen önceki germ hatti D ve J segmentleri tekrar iki rekombinasyon sinyal sekansi olup ilk nonamer ve daha sonra heptamer tekrar bir korunmamis sekans ile ayrilmaktadir. Bir VL, VH veya D segmentini takip eden heptamerik ve nonamerik sekanslar, birlikte rekombine olduklari önceki Jn D veya sekanslar arasindaki bosluklar ya 12 baz çifti uzunlugunda veya 22 ve 24 baz çifti uzunlugu arasindadir.
V, D ve J segmentlerin yeniden düzenlenmesine ek olarak, hafif zincir içinde V ve J segmentlerinin birlestigi ve agir zincirin D ve J segmentlerinin birlestigi yerlerdeki degisken rekombinasyon yoluyla immünoglobulin agir ve hafif zincirinin primer dagarciginda daha fazla çesitlilik olusturulmaktadir.
Hafif zincirdeki benzer varyasyon tipik olarak, V gen segmentinin son kodonu ve J segmentinin ilk kodonunda meydana gelmektedir. Baglantidaki benzer hatali ölçümler, D ve JH segmentleri arasindaki agir zincir kromozomu üzerinde meydana gelir ve lO nükleotide kadar uzayabilmektedir.
Ayrica birkaç nükleotid, genomik DNA ile kodlanmayan D ve &igen segmentleri arasina ve VH ve D gen segmentleri arasina yerlestirilmektedir. Bu nükleotidlerin ilavesi N-bölge çesitliligi olarak bilinmektedir.
Degisken bölge gen segmentleri içinde benzer yeniden düzenlemelerin net etkisi ve benzeri birlesme sirasinda meydana gelen degisken rekombinasyon, bir primer antikor dagarciginin üretilmesidir. antikor fragmanidir. Bu bölge, siki, kovalent olmayan birlesmede bir agir ve bir hafif zincir degisken domeninin bir dimerini kapsamaktadir. Bu konfigürasyonda, her bir degisken domene ait üç CDR, VH-VL dimerinin yüzeyinde bir antijen baglanma bölgesi tanimlayacak. sekilde etkilesime girmektedir. Alti CDR. toplu olarak, antikora antijen baglanma spesifikligi kazandirmaktadir.
Bununla birlikte, tek bir degisken domeni (veya bir antijen için spesifik olan yalnizca üç CDR içeren bir Fv'nin yarisi) bile, tÜHL baglanma bölgesine göre daha düsük afiniteyle olsa da, antijeni tanima ve baglama yetenegine sahiptir.
Fab fragmani ayni zamanda hafif zincirin sabit domenini ve agir zincirin birinci sabit domenini (CHl) içermektedir. Fab fragmanlari, antikor mafsal bölgesine ait bir veya daha fazla sistein içeren agir zincir CHl domeninin karboksi ucunda ilave birkaç kalintiya sahip olmasi bakimindan Fab' fragmanlarindan farklidir. Fab'-SH burada, içerisinde sabit domenlerin sistein kalintisinin/kalintilarinin bir serbest tiyol grubu tasidigi Fab' için verilen isimdir- F(ab')2 antikor fragmanlari baslangiçta aralarinda mafsal sisteinler bulunan Fab' fragmani çiftleri olarak üretilmistir. antijenin bir efektör fonksiyonunu anlamli bir sekilde azaltma veya elimine etme yetenegine sahip bir antikor molekülü anlamina gelmektedir. Buna bagli olarak, bir “nötralize edici” anti-hedef antikor, enzim aktivitesi, ligand baglama veya hücre içi sinyalleme gibi bir efektör fonksiyonunu ortadan kaldirabilmekte veya önemli ölçüde azaltabilmektedir.
Kanser metastazlarin ve/Veya kanser metastazlari ile iliskili kemik kaybinin tedavi edilmesine yönelik bilesimler ve metotlarda, istenilen etkilerin gerçeklestirilmesi için diger terapötikler ile birlikte veya tek basina kullanilan bir veya daha fazla antikor kullanilabilmektedir. Mevcut açiklamaya göre antikorlar, ya bir çevresel antijen ile dogrudan temas ya da antijen ile bagisikligin bir sonucu olarak antikoru üreten bir hayvandan izole edilebilmektedir. Alternatif olarak antikorlar, teknikte iyi bilinen antikor ifade sistemlerin biri kullanilarak rekombinant DNA metodolojisi ile üretilebilmektedir (Bkz. Örn.
Harlow ve Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Bu antikorlar, rekombinant IgG'leri, immünoglobulin kaynakli sekanslara sahip kimerik füzyon proteinleri veya “Insan Mühendislikm" antikorlari içermekte olup, bunlarin tümü mevcut açiklamaya göre kanser metastaz ve/veya kanser metastaz ile iliskili kemik kaybinin tedavisi için kullanilabilmektedir. Intakt, tam uzunlukta moleküllere ek olarak “antikor” terimi, bunlarin fragmanlari (örn. scFV, FV, Fd, Fab, Fabi ve E1ab)'2 fragmanlari) veya M-CSF'ye (veya M- CSFR'ye )baglanan intakt moleküllerin ve/Veya fragmanlarin multimerleri veya tortulari anlamina gelmektedir. Bu antikor fragmanlari antijeni baglamakta ve örnegin, galaktoz kalintilarin birlesmesiyle açikligi ve geri alimi kolaylastiran yapisal özellikleri sergilemesi için türetilebilmektedir.
M-CSF monoklonal antikorlar, büyük ölçüde Halenbeck ve dig., hazirlanabilmektedir. Örnek niteligindeki M-CSF monoklonal antikorlar, biyolojik aktivitenin eszamanli nötralizasyonu ile rekombinant veya dogal dimerik M-CSF ile birlikte belirgin bir konformasyonel epitopa baglanmis antikorlari içermektedir. Bu antikorlar, monomerik ve kimyasal olarak türetilen dimerik M- CSF dahil M-CSF'nin biyolojik olarak inaktif formlari ile büyük bir oranda reaksiyone girmemektedir.
Insan MühendislikTM anti-M-CSF monoklonal antikorlari burada açiklanmaktadir. “Insan MühendislikTM antikoru” ifadesi, bir insan olmayan antikordan, tipik olarak bir fare monoklonal antikordan türetilen bir antikor anlamina gelmektedir.
Alternatif olarak, Insan MühendislikTM antikoru, bir kimerik antikordan türetilmis olup parental, insan olmayan antikorun antijen baglanma özelliklerini muhafaza. etmekte ya da büyük oranda muhafaza etmekte, ancak insanlara uygulandiginda parental antikor ile karsilastirildigi gibi azaltilmis immünojenisiteyi sergilemektedir. Burada kullanildigi haliyle “kimerik antikor” ifadesi, tipik olarak farkli türlerden kaynaklanan iki farkli antikordan (bkz. örn. U.S. Patent No. 4,816,567 sayili belge) türetilen sekansi içeren bir antikor anlamina gelmektedir. En tipik olarak, kimerik antikorlar, insan ve murin antikor fragmanlari, genel olarak insan sabit ve fare degisken bölgeleri içermektedir. sekanslari anlamina gelmekte olup her ikisi de natif bir immünoglobulin alaninin dogal FV bölgesinin baglanma affinitesi ve özgüllügünü tanimlamaktadir (Bkz. örn. Chothia ve dig., J. belgeler). “Sabit bölge” ifadesi, antikor molekülunün efektör fonksiyonlari sunan kismi anlamina gelmektedir. Mevcut açiklamada, fare sabit bölgeleri tercihen insan sabit bölgeleri ile ornatilmistir. Denek antikorlarin, sabit bölgeleri insan immünoglobulinlerden türetilmistir. Agir zincir sabit bölgesi asagidaki bes izotipin herhangi birinden seçilebilmektedir: alfa, delta, epsilon, gama veya mu.
Mevcut açiklamanin antikorlari, 106Mü'e esit veya daha yüksek, tercihen yaklasik 107M4'e esit veya daha yüksek, daha çok tercihen 103Mü'e esit veya daha yüksek ve en çok tercihen yaklasik 109M47 101%mi, lonNkl veya lûldfl'e esit veya daha yüksek bir Ka degeri ile antijene baglanmalari durumunda immünospesifik veya spesifik olarak baglandiklari söylenmektedir. Anti-M-CSF antikorlari, tümör ile ifade edilenlerin yani sira konakçinin/bireyin dokusu ile ifade edilenler dahil olmak üzere M-CSF'nin farkli dogal olarak olusan formlarina baglanabilmektedir. RXl, 5H4, MCl veya MC3 antikoru gibi burada açiklanan Hmnoklonal antikorlar M-CSF için affiniteye sahiptir ve en az 10*4 M, tercihen en az yaklasik 10* 7 ila yaklasik 10*8 M arasinda, daha fazla tercihen en az yaklasik “8 M, 10'NM, 10“”M veya 10'ÜM'lik ayrisma denge sabiti (Kd) ile karakterize edilmektedir. Benzeri affiniteler halihazirda, denge analizi ile gibi konvansiyonel teknikler kullanilarak; BlAcore 2000 cihazinin kullanilmasiyla, üretici tarafindan belirtilen genel prosedürler kullanilarak; 1251 etiketli M-CSF kullanilarak radyoaktif immüno analiz ile; veya yetkili kisi tarafindan bilinen bir baska metot ile belirlenmektedir. Affinite verileri, sayili belgenin metodu ile analiz edilebilmektedir. Ayrica, tercih edilen M-CSF antikorlarin, M-CSF için yüksek bir seviyede özgüllük sergiledigi ve diger moleküllere önemli ölçüde düsük affinite ile baglandigi asikardir. M-CSF'ye baglanan Sekil 4'te10 yer alan murin RXl olarak benzer bir affinite ile M-CSF'ye baglanan tercih edilen antikorlar düsük immünojeniklik sergilemekte ve netastatik hastalik hayvan nmdellerinde test edildiginde kanser hücrelerinin metastazini inhibe etmektedir.
Sirasiyla Sekil 13, 14 veya 15'te yer alan murin 5H4, MCl veya MC3 olarak benzer bir affinite ile M-CSF'ye baglayan diger örnek niteligindeki antikorlari, M-CSF'ye baglanir.
Antikorlarin üretimi için kullanilan antijen, örnegin, istenilen epitopu muhafaza eden ve opsiyonel olarak epitopun dogal konformasyonunda görüntülenmesine izin veren bir baska polipeptide kaynasik olabilen M-CSF'nin bir fragmani veya intakt M-CSF olabilmektedir. Alternatif olarak hücre yüzeyinde M-CSF ifade eden hücreler, antikorlarin olusturulmasi için kullanilabilmektedir. Bu hücreler, M-CSF'yi ifade etmek için dönüstürülebilmektedir veya M-CSF'yi ifade eden dogal olarak Olusan diger hücreler olabilmektedir. Antikorlarin olusumu için kullanilan M-CSF'nin diger formlari teknikte yetkili kisilerce tarafindan anlasilacaktir.
Poliklonal Antikorlar Poliklonal antikorlar tercihen, hayvanlarda ilgili antijenin ve bir adjuvanin çoklu subkütanöz (sc) veya intraperitoneal (ip) enjeksiyonlariyla yetistirilmektedir.
Gelistirilmis bir antikor yaniti, örnegin, maleimidobenzoil sülfosüksinimid esteri (sistein kalintilari yoluyla konjügasyon), N- hidroksisüksinimid (lizin kalintilari vasitasiyla), glutaraldehit, süksinik anhidrit ya da teknikte bilinen diger ajanlar gibi iki islevli veya türevlendiriici bir ajan kullanilarak immünize edilecek türlerde, örnegin, anahtar deligi limpet hemosiyanini, serum albümin, sigir tiroglobülin ya da soya fasulyesi tripsin inhibitöründe immünojenik bir proteine ilgili antijenin konjüge edilmesiyle elde edilebilmektedir.
Hayvanlar, örnegin lOO ug veya 5 ug proteinin veya konjügatin (sirasiyla tavsanlar' veya fareler için), 3 ölçek Freund. tam adjuvaniyla birlestirilmesi ve solüsyonun intradermal olarak çok sayida bölgeye enjekte edilmesi yoluyla, antijene, immünojenik konjügatlara veya türevlere karsi bagisik kazanmaktadir. Bir ay sonra hayvanlar, Freund'un tam adjuvaninin içinde orijinal peptidin veya konjügatin 1/5 ila {fraksiyon(1/10)} ile çok sayida bölgeye subkütanöz enjeksiyon yoluyla desteklenmektedir.
Destekleme enjeksiyonunundan 7 ila l4 gün sonra hayvanlardan kan alinir ve serum antikor titresi açisindan analiz edilmektedir.
Hayvanlar titre düzlüklerine kadar desteklenmektedir.
Tercihen söz konusu hayvan, ayni antijenin konjügati ile desteklenmekte, ancak farkli bir proteine ve/veya farkli bir çapraz baglama ayiraci ile konjuge edilmektedir. Konjügatlar ayrica, rekombinant hücre kültüründe protein füzyonlari biçiminde üretilebilmektedir. Ayrica alum gibi topaklanma ajanlari, bagisiklik yanitinin güçlendirilmesi için uygun sekilde kullanilmaktadir.
Monoklonal Antikorlar Monoklonal antikorlar, ilk olarak Kohler ve dig., Nature, kullanilarak veya rekombinant DNA metotlari yoluyla yapilabilmektedir.
Hibridoma metodunda, örnegin bir hamster veya makak maymunu gibi bir` fare ;veya diger suygun konakçi hayvan, bagisiklanma. için kullanilan proteine özellikle baglanan antikorlari üreten veya üretebilme yetenegi olan lenfositlerin ortaya çikmasi için burada tarif edildigi gibi bagisiklanmaktadir. Alternatif olarak, lenfositler in vitro olarak bagisiklanmaktadir. Daha sonra, lenfositler, örnegin bir polietilen glikol gibi uygun bir kaynastirma maddesi kullanilarak miyelom, hücreleri ile kaynastirilmakta ve bir hibridom hücresi olusturmaktadir (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 5.59- Bu sekilde hazirlanan hibridom hücreleri, tercihen kaynasmamis parental miyelom hücrelerinin gelisimini veya sagkalimini inhibe eden bir veya daha fazla madde içeren uygun bir kültür ortamina ekilmekte ve burada yetistirilmektedir. Örnegin parental miyelom hücrelerinin enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaz (HGPRT veya HPRT) içermemesi durumunda, hibridomlar için kültür ortami tipik olarak HGPRT'den yoksun hücrelerin gelisimini önleyen hipoksantin, aminopterin ve timidin (HAT ortami) içerecektir.
Tercih edilen miyelom hücreleri, verimli bir sekilde kaynasan, seçilen antikor üretici hücreler vasitasiyla yüksek seviyede ve kararli antikor üretimini destekleyen hücrelerdir ve bunlar, bir ortama duyarlidirlar. Insan miyelom ve fare-insan heteromiyelom hücre hatlari da insan monoklonal antikorlarinin üretimi için ve dig., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. . Örnek niteligindeki murin miyelom hücreler arasinda murin miyelom hatlari, Örnegin Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA'den alinan MCP-21 ve M.C.-1l fare tümörlerinden elde edilenler ve Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu, Rockville, Md. USA'den alinan SP-Z veya X63-Ag8- 653 hücreleri bulunmaktadir.
Hibridom hücrelerinin büyütüldügü kültür ortami, antijene yönelik monoklonal antikorlarin üretimi için analiz edilmektedir. Tercihen, hibridom hücreleri tarafindan üretilen monoklonal antikorlarin baglanma spesifikligi, immüno çökeltme yoluyla ya da örnegin radyoimmün deney (RIA) veya enzime bagli immüno adsorban deney (ELISA) gibi bir in vitro baglanma deneyi yoluyla belirlenmektedir. Monoklonal antikorun baglanma affinitesi, örnegin, Scatchard analizi ile belirlenmektedir Istenen özgüllüge, affiniteye ve/veya aktiviteye sahip olan antikorlari üreten hibridom hücreleri belirlendikten sonra, klonlar, sinirlayici seyreltme prosedürleriyle alt klonlanabilmekte ve standart metotlarla büyütülebilmektedir (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 5.59- . Bu amaca uygun kültür ortamlari arasinda örnegin D-MEM veya RPMl-l640 ortami bulunmaktadir. Buna ilaveten, hibridom hücreleri, bir hayvanda assit tümörleri biçiminde jii vivo olarak yetistirilebilmektedir. Alt klonlar tarafindan salgilanan monoklonal antikorlar, örnegin, protein A- Sefaroz, hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz veya affinite kromatografisi gibi konvansiyonel immünoglobülin saflastirma prosedürleri vasitasiyla kültür ortamindan, assit sivisindan veya serumdan uygun bir sekilde ayrilmaktadir.
Antikorlarin Rekombinant Üretimi DNA kodlayici monoklonal antikorlar izole edilmis olabilmektedir ve konvansiyonel prosedürler kullanilarak (örnegin, monoklonal antikorlarin agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere özellikle baglanabilen oligonükleotid problarin kullanilmasiyla) hibridoma hücrelerinden sekanslanmaktadir.
Sekans tespiti genel olarak genin en az bir kisminin veya ilgilenilen cDNA'nin izolasyonunu gerektirmektedir. Genellikle bu, monoklonal antikorlari kodlayan DNA veya tercihen mRNA'nin (örnegin, CDNA) klonlamasini gerektirmektedir. Klonlanma standart tekniklerin kullanilarak yürütülmektedir (bkz. örn.
Sambrook ve dig. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Ciltler l-3, Cold Spring Harbor Press). Örnegin, bir cDNA kütüphanesi, poliA, + mRNA'nin tercihen membran ile alakali mRNA'nin ters transkripsiyonu ile yapilandirilabilmektedir ve kütüphane, insan immünoglobulin polipeptid gen sekanslari için spesifik problar kullanilarak taranmaktadir. Bununla birlikte tercihen, polimeraz zincir reaksiyonu, ilgilenilen bir immünoglobulin gen segmentini (örnegin, hafif zincir degisken segmenti) kodlayan cDNA'larin (veya tam uzunlukta cDNA'larin kisimlari) amplifiye edilmesi için kullanilmaktadir. Amplifiye edilmis sekanslar, örnegin, ifade vektörleri, mini gen vektörleri veya faj görüntüleme vektörleri gibi herhangi uygun vektör içerisine kolayca klonlanabilmektedir. Kullanilan belirli klonlama metodunun, ilgilenilen immünoglobulin polipeptidin bazi kisimlarinin sekansinin belirlenmesi mümkün oldugu sürece, kritik önem tasimamasi öngörülmektedir. Burada kullanildigi haliyle, bir “izole edilmis” nükleik asit molekülü veya “izole edilmis” nükleik asit sekansi, (l) nükleik asidin dogal kaynaginda normalde birlikte oldugu en az bir kontaminan nükleik asit molekülünden tanimlanan veya ayrisan veya (2) ilgilenilen nükleik asit sekansinin belirlenecegi sekilde arka plan nükleik asitlerden klonlanmis, amplifiye edilmis, etiketlenmis veya baska bir sekilde ayirt edilmis, izole edilmis olarak kabul edilen bir nükleik asit molekülüdür. Izole edilmis bir nükleik asit molekülü, dogada bulundugu form veya ayardan farklidir. Bu nedenle izole edilmis nükleik asit molekülleri, dogal hücrelerde var olan nükleik asit molekülünden ayrilmaktadir. Buna ragmen, izole edilmis bir nükleik asit molekülü, hücrelerde bulunan bir nükleik asit molekülünü içermekte olup, burada örnegin, nükleik asit molekülünün, dogal hücrelerinkinden farkli bir kromozomal konumda oldugu antikoru normal olarak ifade etmektedir.
Klonlama ve sekanslama için kullanilan. RNA. için. bir kaynak, transjenikr farelerdenr bir B hücresinin elde edilmesiyle ve ölümsüz bir hücreye B hücresinin kaynasmasiyla üretilen bir hibridoma olmaktadir. Hibridomalarin kullanilmasinin bir avantaji onlarin kolaylikla taranabilmesidir ve ilgilenilen bir insan monoklonal antikorunu üreten hibridoma seçilmektedir.
Alternatif olarak, RNA, bagisiklanmis hayvanin B hücrelerinden (veya tüm dalagindan) izole edilebilmektedir. Hibridomalardan baska kaynaklar kullanildiginda, spesifik baglayici karakterler ile immünoglobulinler veya immünoglobulin kodlayan sekanslar için taranmasi arzu edilebilir olmaktadir. Söz konusu taramaya yönelik, bir yöntem, faj görüntüleme teknolojisinin kullanilmasidir. Faj görüntüleme, örnegin, Dower ve dig., WO yayinlarinda tarif edilmektedir. Faj görüntüleme teknolojisi kullanilarak, bagisiklik kazandirilmis bir transjenik fareden cDNA (örnegin, toplam dalak cDNA) izole edilebilmekte, polimeraz zincir reaksiyonu, bir immünoglobulin polipeptidinin bir kismini, örnegin CDR bölgelerini kodlayan bir cDNA sekansinin amplifiye edilmesi için kullanilabilmekte ve amplifiye edilmis sekanslar bir faj vektörü içerisine yerlestirilmektedir.
Ilgilenilen peptidleri kodlayan cDNA'lar, örnegin, arzu edilen baglanma özelliklerine sahip degisken bölge peptidleri, kaydirma gibi standart teknikler ile tanimlanmaktadir.
Amplifiye edilmis veya klonlanmis nükleik asidin sekansi daha sonra belirlenmektedir. Tipik olarak immünoglobulin peptidin bir bütün degisken bölgesini kodlayan sekans belirlenmektedir, ancak, bazen örnegin CDR-kodlayici kisim. gibi bir degisken bölgenin sadece bir kisminin sekanslanmasi için yeterlidir.
Tipik olarak sekanslanan kisim, en az 30 baz uzunlugunda Olabilmektedir, daha siklikla degisken bölgenin uzunlugunun en az yaklasik üçte bir veya en az yaklasik yarisi için kodlama baz alinarak sekanslanabilmektedir.
Sekanslama, bir cDNA kütüphanesinden izole edilmis klonlar uzerinde veya PCR kullanildiginda, amplifiye edilmis sekansin alt klonlanmasi sonrasi veya amplifiye edilmis segmentin dogrudan PCR sekanslanmasi ile yürütülebilmektedir. Sekanslama standart teknikler kullanilarak yürütülmektedir (bkz. örn.
Sambrook ve dig. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Cilt 1-3, Cold Spring Harbor Press ve Sanger, E. ve dig. (1977) genleriniri ve cDNA'nin yayinlanmis sekanslari, ile klonlanmis nükleik asidinin sekansinin karsilastirilmasiyla, yetkili bir kisi halihazirda, sekanslanan bölgeye bagli olarak (i) hibridoma immünoglobulin polipeptidin germ hatti segment kullanimi (agir zincirin agir zincirinin izotipi dahil) ve (ii) agir ve hafif zincir degisken bölgelerin sekansi, ilaveten somatik mutasyonun prosesi ve N-bölge ilavesi ile sonuçlanan sekanslari halihazirda belirleyebilecektir. Immünoglobulin gen sekans informasyonun bir kaynagi, National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National lnstitutes of Health, Bethesda, DNA izole edildikten sonra rekombinant konakçi hücrelerde monoklonal antikorlarin sentezinin elde edilmesi amaciyla ifade vektörlerine yerlestirilebilmektedir KK: bunlar Chi daha sonra konakçi hücrelere, Örnegin E. coli hücreleri, simian COS hücreleri, insan embriyonik böbrek 293 hücreleri (örn. 293E hücreleri), Çin hamsteri over (CHO) hücreleri veya aksi takdirde immünoglobülin protein üretmeyen miyelom hücrelerine transfekte edilmektedir. Antikorlarin rekombinant üretimi teknikte iyi bilinmektedir.
Ifade kontrol sekanslari, belirli bir konakçi organizmada uygulanabilir bir sekilde baglanan kodlayici bir sekansin ifadesi için gerekli DNA sekanslari anlamina gelmektedir.
Prokaryotlar için uygun olan kontrol sekanslari, örnegin, bir promotör, Opsiyonel olarak bir Operatör sekans ve bir ribozom baglayici alani içermektedir. Ökaryotik hücrelerin, promotörlerleri, poliadenilasyon sinyalleri ve güçlendiricileri kullandigi bilinmektedir.
Nükleik asit, bir baska nükleik asit sekansi ile fonksiyonel bir iliski içerisine yerlestirildiginde uygulanabilir bir sekilde baglanmaktadir. Örnegin, bir ön sekans veya salgi lideri için DNA, polipeptidin salgilanmasina katilan bir önprotein olarak ifade edildiginde bir polipeptid için uygulanabilir bir sekilde DNA'ya baglanmaktadir; bir promotör veya güçlendirici, sekansin transkripsiyonu etkilediginde uygulanabilir bir sekilde bir kodlama sekansina baglanmaktadir; veya bir ribozom baglayici alan, translasyona olanak saglamasi için konumlandirildiginda bir kodlayici sekansa uygulanabilir bir sekilde baglanmaktadir.
Genel olarak, uygulanabilir bir sekilde baglanmis, bagli DNA sekanslarinin bitisik olmasi ve bir salgi liderligi durumunda, bitisik olmasi ve okuma fazinda olmasi anlamina gelmektedir.
Bununla birlikte, güçlendiricilerin bitisik olmasi gerekmemektedir. Baglanma, uygun kisitlama alanlarinda ligasyon ile gerçeklesmektedir. Eger bu tür alanlar mevcut degilse, konvansiyonel uygulamalara uygun olarak sentetik oligonükleotit adaptörleri veya baglayicilari kullanilmaktadir.
Hücre, hücre hatti ve hücre kültürü ifadeleri birbirinin yerine kullanilir ve bu tür isimlendirmelerin hepsi soylari içermektedir. Transformatlar ve dönüstürülmüs hücreler, transferlerin sayisi göz önüne alinmadan bunlardan türevlenen primer denek hücresini ve kültürlerini içermektedir. Kasitli veya kasitsiz mutasyonlara bagli olarak, tüm soylarin DNA içerigi bakimindan tam olarak ayni olmayabilecegi de anlasilmaktadir. Orijinal olarak dönüstürülen hücrede taranan ile ayni fonksiyon veya biyolojik aktiviteye sahip olan mutant soyu dahil edilmektedir. Farkli isimlendirmelerin kastedildigi yerlerde baglamdan çikarim yapilabilecektir.
Ilgilenilen bir immünoglobulinin amino asit sekansi direkt protein sekanslanmasi ile belirlenmektedir. Uygun kodlayici nükleotidr sekanslari evrensel kodon tablosuna gore tasarlanmaktadir.
Istenilen antikorun amino asit sekans varyantlari, kodlanan DNA içerisinde uygun nükleotid degisikliklerini yapilmasiyla veya peptid senteziyle hazirlanabilmektedir. Bu gibi varyantlar, Örnegin, antikorlarin amino asit sekanslarinda kalintilarin silinmesini ve/Veya yerlestirilmesini ve/Veya ornatilmasini içermektedir. Nihai yapiya ulasmak için silme, yerlestirme ve ornatma islemlerinin herhangi bir kombinasyonu gerçeklestirilmekte, ancak burada nihai yapinin istenen özelliklere sahip olmasi kosulu aranmaktadir. Amino asit degisiklikleri ayni zamanda, monoklonal, insan, insanlastirilmis, Insan MühendislikTM veya varyant antikorun glikozilasyon alanlarin konumunun veya sayisinin degistirilmesi gibi post-translasyon islemlerini degistirebilmektedir.
Antikorun amino asit sekansi Varyantlarini kodlayan nükleik asit molekülleri, teknikte bilinen, çesitli metotlar ile hazirlanmaktadir. Bu metotlar arasinda, sinirlayici olmamak kaydiyla, dogal bir kaynaktan izole edilmesi (dogal olarak olusan amino asit sekansi varyantlari söz konusu oldugunda) veya antikorun önceden hazirlanmis bir varyantinin veya varyant olmayan bir versiyonunun, oligonükleotid-aracili (veya bölgeye yöneltilmis) mutagenezi, PCR. mutagenezi ve kaset mutagenezi yoluyla hazirlanmasi bulunmaktadir.
Ayrica burada, açiklamanin bir konakçi hücre, vektörler ve nükleik asitleri içeren konakçi hücreler ile taninan kontrol sekanslara opsiyonel olarak uygulanabilir bir sekilde bagli izole edilmis nükleik asit kodlayici antikorlar ve antikorlarin üretimi için rekombinant teknikler açiklanmakta olup, konakçi hücrenin kültürlenmesini ve böylece nükleik asidin ifade edilmesini ve opsiyonel olarak konakçi hücre kültürü veya kültür ortamindan toplanmasini içermektedir.
Antikorun rekombinant üretimi için, antikoru kodlayan nükleik asit izole edilmektedir ve ifade için veya ayrica klonlanmasi (DNA'nin amplifikasyonu) için kopyalanabilir bir vektör içerisine yerlestirilebilmektedir. Antikoru kodlayan DNA kolaylikla izole edilir ve konvansiyonel prosedürler kullanilarak (örnegin antikorun agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik olarak baglanabilen oligonükleotit problar kullanilarak) sekanslanmaktadir. Birçok vektör mevcuttur. Vektör bilesenleri genellikle, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla sunlarin birini veya daha fazlasini içermektedir: bir sinyal sekansi, bir replikasyon kökeni, bir veya daha fazla seçici isaretleyici gen, bir güçlendirici eleman, bir promotör ve bir transkripsiyon sonlandirma sekansi.
(U Sinyal sekansi bileseni Açiklamanin antikoru, rekombinant olarak yalnizca dogrudan degil, ayni zamanda bir heterolog' polipeptitle birlikte bir füzyon polipeptidi biçiminde de üretilebilmekte olup, tercihen bir sinyal sekansi veya matür protein veya polipeptidin N ucunda spesifik bir kesim bölgesine sahip olan baska bir polipeptittir.
Seçilen sinyal sekansi tercihen, konakçi hücre tarafindan taninan ve islenen (örnegin, bir sinyal peptidaz ile yarilan) bir sinyal sekansidir. Prokaryotikr konakçi hücrelerin natif antikor sinyal sekansini tanimamasi ve islememesi durumunda, sinyal sekansi, örnegin, pektat liyazi (örnegin, pelB) alkalin fosfataz, penisilinaz, Ipp veya isiya dayanikli enterotoksin II liderlerinden seçilen bir sinyal sekansi ile ornatilabilmektedir. Maya salgilanmasi için dogal sinyal sekansi, örnegin, maya invertaz lideri, bir faktör lideri (Saccharomyces ve Kluyveromyces d-faktörü liderleri dahil olmak üzere) veya asit fosfataz önderi, C. albicans glukoamilaz lideri veya WO90/l3646'da tarif edilen sinyal ile ornatilabilmektedir.
Memeli hücre ifadesinde, memeli sinyal sekanslari ve ayni zamanda viral salgilayici liderler, Örnegin herpes simpleks gD sinyali mevcuttur.
Bu tür öncül bölge için DNA, antikoru kodlayan DNA'ya okuma çerçevesinde baglanmaktadir.
(D Replikasyon bileseninin kökeni Hem ifade hem de klonlama vektörleri, vektörün seçilen bir veya daha fazla konakçi hücre içinde replikasyonuna olanak taniyan bir nükleik asit sekansi içermektedir. Genellikle, klonlama vektörlerinde bu. sekans, vektörün. konakçi kromozomal, DNA'dan bagimsiz olarak replikasyonuna olanak taniyan ve replikasyon kökenleri veya bagimsizca kopyalanan sekanslar içeren bir sekanstir. Çesitli bakterilere, mayalara ve virüslere yönelik bu tür sekanslar iyi bilinmektedir. Plasmid pBR322'den replikasyonun kökeni, birçok Gram-negatif bakteri için uygundur ve 2 u plasmid kökeni maya için uygundur ve çesitli viral kökenler memeli hücrelerde klonlama vektörleri için kullanilmaktadir. Genellikle, memeli ifade vektörleri için replikasyon kökeni bileseni gerekmemektedir (SV4O kökeni tipik olarak yalnizca erken promotörü içerdiginden dolayi kullanilabilmektedir).
Ifade ve klonlama vektörleri, ayni zamanda bir seçici isaretleyici olarak da adlandirilan bir seçici geni içermektedir. Tipik seçim genleri, (a) örnegin, ampisilin, neomisin, metotrekzat, tetrasiklin, G418, genetisin, histidinol veya mikofenolik asit gibi antibiyotiklere veya diger toksinlere direnç kazandiran, (b) ototrofik yetmezlikleri tamamlayan veya (c) örnegin, Basil için D-alanin rasemaz kodlayan gen gibi kompleks ortamda mevcut olmayan kritik besinleri saglayan proteinleri kodlamaktadir.
Bir seçim semasi örneginde, bir konakçi hücrenin. büyümesini durdurmak için bir ilaçtan yararlanmaktadir. Bir heterolog gen ile basarili bir sekilde dönüstürülen hücreler, ilaç direnci saglayan bir protein üretmektedir ve böylece seçim rejiminden sag kalarak çikmaktadir. Benzeri dominant seçim örneklerinde metotrekzat, neomisin, histidinol, puromisin, mikofenolik asit ve higromisin ilaçlari kullanilmaktadir.
Memeli hücreleri için uygun seçilebilir isaretleyicilerin bir baska örnegi, DHFR, timidin kinaz, metalotiyonein-I ve II, tercihen primat metalotiyonein genleri, adenozin deaminaz, ornitin dekarboksilaz gibi antikor kodlayici nükleik asidinin geri alabilme yetenegine sahip olan hücrelerin tanimlanmasina olanak taniyanlardir. Örnegin, DHFR seçim geniyle dönüstürülen hücreler ilk olarak, transformatlarin (dönüstürücülerin) tamaminin, DHFR'nin bir rakip antagonisti olan metotreksati (Mtx) içeren. bir kültür ortami içinde kültürlenmesiyle tanimlanmaktadir. Yabani tip DHFR uygulandiginda uygun bir konak hücre, DHFR aktivitesinden yoksun Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücre hattidir.
Alternatif olarak, bulusun antikoru, yabani tip DHFR proteini ve aminoglikozit 3'-fosfotransferaz (APH) gibi bir baska seçici isaretleyiciyi kodlayan DNA sekanslari ile dönüstürülen ya da birlikte dönüstürülen konak hücreler (özellikle, endojenöz DHFR içeren yabani tip konaklar), seçilebilir isaretleyici için örnegin kanamisin, neomisin ya da G418 gibi bir aminoglikozidik antibiyotik gibi bir seçim ajani içeren bir ortamda hücre büyümesi ile seçilebilmektedir. Bkz. U.S. Patent No. 4,965,199.
Mayada kullanilmaya yönelik uygun bir seçim geni, maya plazmidi YRp7'de bulunan trpl genidir (Stinchcomb ve dig., Nature 282:39 (1979)). Trpl geni, triptofan içinde büyüme becerisi olmayan bir maya mutant susu, örnegin ATCC No 44076 veya PEP4-l için bir seçim isaretleyicisi saglamaktadir. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Maya konakçi hücre genomu içindeki trpl lezyonunun mevcudiyeti daha sonra, triptofan yoklugunda büyüme ile transformasyonun tespit edilmesi için etkili bir ortam saglamaktadir. Benzer sekilde, Leu2 bakimindan yeterssz maya plasmidler ile tamamlanmaktadir.
Ura3 bakimindan yetersiz maya susulari, ura3 geni tasiyan plasmidler ile tamamlanmaktadir.
Ayrica, 1,6 um dairesel plazmidi pKDl'den türetilen vektörler, Kluyveromyces mayalarinin transformasyonunda kullanilabilmektedir. Alternatif olarak, rekombinant buzagi kimozinin genis ölçekli üretimi için bir ifade sistemi, K. lactis Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990) sayili belge için bildirilmistir. Matür rekombinant insan serum albümininin endüstriyel Kluyveromyces suslariyla salgilanmasi için stabil çok kopyali ifade vektörleri de açiklanmistir. Fleer ve dig., (4] Promotör bileseni Ifade ve klonlama vektörleri genellikle bir promotör içermekte olup konakçi organizma tarafindan taninmakta ve uygulanabilir bir sekilde antikor kodlayici nükleik. aside baglanmaktadir.
Prokaryotik konakçilar ile kullanilmaya uygun promotörler arasinda, arabinoz (örnegin, araB) promotörü, phoA promotörü, ß- laktamaz ve laktoz promotör sistemleri, alkalin fosfataz, bir triptofan (tip) promotör sistemi ve tac promotörü gibi hibrid promotörleri bulunmaktadir. Ancak, bilinen diger bakteriyel promotorler de uygundur. Bakteriyel sistemlerde kullanilmaya yönelik promotorler ayrica bulusun antikorunu kodlayan DNA'ya uygulanabilir bir sekilde bagli bir Shine-Dalgarno (S.D.) sekansini içermektedir. Ökaryotlar için promotör sekanslar bilinmektedir. Neredeyse tüm ökaryotik genler, transkripsiyonun baslatildigi alandan yaklasik olarak 25 ila 30 baz öncesinde konumlandirilmis olan AT bakimindan zengin bir bölgeye sahiptir. Birçok genin transkripsiyonunun baslangicindan 70 ila 80 baz öncesinde bulunan bir baska sekans ise, CNCAAT bölgesi olup, burada N, herhangi bir nükleotit olabilmektedir. Birçok ökaryotik genin 3' ucunda bir AATAAA sekansi bulunmakta olup bu sekans, poli A kuyrugunun, kodlayici sekansin 3' ucuna eklenmesine yönelik sinyal olabilmektedir. Bu sekanslarin tamami, ökaryotik ekspresyon vektörlerinin içine uygun sekilde yerlestirilmektedir.
Maya konakçilariyla birlikte kullanilmaya yönelik uygun promotör sekanslarin örnekleri arasinda 3-fosfogliserat kinaz veya diger glikolitik enzimlere yönelik promotörler, Örnegin enolaz, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz, hekzokinaz, piruvat dekarboksilaz, fosfofruktokinaz, glikoz-6-fosfat. izomeraz, 3- fosfogliserat mutaz, piruvat kinaz, triosefosfat izomeraz, fosfoglikoz izomeraz ve glükokinaz bulunmaktadir. ilaveten büyüme kosullari tarafindan kontrol edilen transkripsiyon avantajina sahip olan ve uyarilabilir promotörler olan diger maya promotörleri, alkol dehidrojenaz 2 için promotör bölgeler, izositokrom C, asit fosfataz, azot metabolizmasiyla iliskili yikici enzimler, metalotiyonein, gliseraldehit-3- fosfat dehidrojenaz ve maltoz ve galaktoz kullanimindan sorumlu enzimlerdir. Maya ifadesinde kullanilmaya uygun vektörler ve promotörler ayrica EP 73,657 sayili belgede tarif edilmektedir.
Maya kökenli güçlendiricler ayrica avantajli bir biçimde maya promotörleriyle birlikte kullanilmaktadir.
Memeli konak hücrelerinde vektörlerden antikor transkripsiyonu, örnegin, poliomr virüsü, Abelson lösemi virüsü, kus çiçek hastaligi virüsü, adenovirüs (örnegin Adenovirüs 2), sigir papilom virüsü, kus sarkom virüsü, en çok tercihen sitomegalovirüs, bir retrovirus, hepatit-B virüsü, Simian Virüsü 40 (SV40) veya virüslerin genomlarindan elde edilen promotörlerle, heterolog memeli promotörleriyle, örn. aktin promotör ya da bir immünoglobülin promotörü, isi soku promotörleri ile kontrol edilebilmekte olup, bu tür promotörlerin konak hücre sistemleriyle uyumlu olmalari kosulu SV4O virüsünün erken ve geç promotörleri, ayni zamanda SV4O viral replikasyon kökenini de içeren bir SV4O kisitlama fragmani biçiminde uygun sekilde elde edilmektedir. Insan sitomegalovirüsünün hemen erken promotörü, uygun sekilde bir HindIII E kisitlama fragmani olarak elde edilir. Memeli konaklarda DNA ekspresyonuna yönelik olarak sigir papilom virüsünün bir vektör olarak kullanildigi bir sistem U.S. Patent No. 4,419,446 sayili belgede açiklanmaktadir. Bu sistemin bir modifikasyonu, U.S. Patent No. 4,601,978 sayili belgede tarif edilmektedir. Herpes simpleks virüsünden bir timidin kinaz promotörünün kontrolü altinda fare hücrelerinde insan ß- interferon cDNA'sinin ekspresyönu ile ilgili olarak ayrica bkz.
Rous Sarkom Virüsü uzun terminal tekrari promotör olarak kullanilabilmektedir.
(H Güçlendirici eleman bileseni Yüksek ökaryotikler ile antikoru kodlanan bir DNA'nin transkripsiyonu siklikla vektör içerisine bir güçlendirici sekansin yerlestirilmesiyle arttirilmaktadir. Günümüzde memeli genlerden (globin, elastaz, albumin, alfa-fetoprotein ve insulin) birçok güçlendirici sekans bilinmektedir. Ancak, tipik olarak, bir ökaryotik hücre virüsünden bir güçlendirici kullanilabilmektedir. Örnekler arasinda, replikasyon kökeninin geç tarafinda (bp 100-270) SV40 güçlendirici, sitomegalovirüs erken promotör güçlendirici, replikasyon kökeninin geç tarafinda polyom güçlendirici ve adenovirüs güçlendiriciler bulunmaktadir.
Ayrica bkz. ökaryotik promotörlerin aktivasyonu için Gelistirici, antikor-kodlayici sekansa bir 5' veya 3' pozisyondaki vektör içerisine bölünebilmektedir ancak tercihen promotörden bir 5' alaninda yerlestirilmektedir.
(@ Transkripsiyon sonlandirma bileseni Ökaryotik konakçi hücrelerinde (maya, mantar, böcek, bitki, insan, hayvan veya diger çok hücreli organizmalardan çekirdekli hücreler) kullanilan ekspresyon vektörleri ayrica, transkripsiyonun sonlandirilmasi için ve mRNA'nin stabilize edilmesi için gerekli sekanslari da içerecektir. Bu tür sekanslar, ökaryotik veya Viral DNA'lar ya da cDNA'larin yaygin olarak 5' ucunda ve bazen de 3' translasyona ugramamis bölgelerinde bulunmaktadir. Bu bölgeler, antikor kodlayan mRNA'nin translasyona ugramamis kisminda poliadenillenmis fragmanlar biçiminde kopyalanan (transkripte edilen) nükleötit segmentleri içermektedir.
Yararli transkripsiyon sonlandirma bilesenlerinden birisi, sigir büyüme hormonu poliadenilasyon bölgesidir. Bkz. WO94/11026 sayili belge ve bu belgede açiklanan ekspresyon vektörü. Bir digeri ise fare immünoglobulin hafif zincir transkripsiyon sonlandiricisidir.
(N Konakçi hücrelerin seçimi ve transformasyonu Buradaki vektörlerdeki DNA'yi klonlamak veya eksprese etmek için uygun konakçi hücreler, yukarida tarif edilen prokaryot, maya veya daha yüksek ökaryot hücreleridir. Bu amaç için uygun prokaryotlar sunlari içerir: öbakteri, örnegin Gram-negatif veya Gram-pozitif organizmalar, örnegin, Enterobacteriaceae, örnegin Escherichia, örnegin, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, örnegin, Salmonella typhimurium, Serratia, Örnegin, Serratia marcescans ve Shigella, ayrica Bacilli örnegin B. subtilis ve B. licheniförmis (12 Nisan licheniformis 41 P), Pseudomonas örnegin P. Aeruginosa ve Streptomyces. Tercih edilen bir .E. coli klonlama konakçisi,, diger suslar, örnegin, E. coli B, E. Cöli XI, ve E. coli W de uygun olmasina ragmen, E. coli . Bu örnekler sinirlayici olmaktan ziyade açiklayicidir.
Prokaryotlara ek olarak, ökaryotik mikroplar, örnegin filamentöz mantarlar veya mayalar, antikör kodlayan vektörler için uygun klonlama veya ifade konakçilaridir. Saccharomyces cerevisiae veya yaygin ekmek mayasi, düsük ökaryotik mikroorganizmalar arasindan en yaygin olarak kullanilmaktadir. Bununla birlikte bir dizi diger cins, tür ve sus, örnegin, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces konakçilari, örnegin, K. lactis, K.fragilis (ATCC , K. wickeramii (ATCC 36,906), K. thermotolerans ve K. marxianus gibi; yarrowia (EP reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, örnegin Schwanniomyces occidentalis gibi; ve ipliksi mantarlar, örnegin Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ve Aspergillus konakçilari, örnegin A. nidulans ve A. Niger burada yaygin olarak kullanilabilir ve yararlidir.
Glikozile antikorun ifadesi için uygun konakçi hücreler, çok hücreli organizmalardan türetilir. Omurgasiz hücrelerinin örnekleri arasinda bitki ve böcek. hücrelerini bulunur. Çok sayidar baküloviral suslar* ve varyantlar` ve bunlarar karsilik gelen Spodoptera frugiperda (tirtil), Aedes aegypti (sivrisinek), Aedes albopictus (sivrisinek), Drosophila melanogaster (meyve sinegi) ve Bombyx mori gibi konakçilardan elde edilen yatkin böcek konakçi hücreleri belirlenmistir. Örnegin Autographa californica NPV'nin L-l varyanti ve Bombyx mori NPV'nin Bm-5 susu gibi transfeksiyona yönelik çesitli viral suslar kamuya açiktir ve bu tür virüsler özellikle Spodoptera frugiperda hücrelerinin transfeksiyonuna yönelik mevcut açiklamaya göre buradaki virüs olarak kullanilabilmektedir.
Pamuk, misir, patates, soya fasulyesi, petunya, domates, tütün, su mercimeginin bitki hücre kültürleri ve diger bitki hücreler de konakçilar olarak kullanilabilmektedir.
Buna ragmen, omurgali hücrelere ilgi oldukça büyüktür ve kültür (doku kültürü) içindeki omurgali hücrelerin çogalmasi rutin prosedür haline gelmistir. Yararli memeli konakçi hücre hatlarininr örnekleri arasinda, CHOKl hücreleri (ATCC CCL61) dahil olmak üzere Çin hamster over hücreleri, DXB-ll, DG-44 ve Çin hamster over hücreleri/-DHFR (CHO, Urlaub ve dig., Proc. edilen maymun böbrek CVl hatti (COS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek hatti (süspansiyon kültüründe büyütülmek üzere alt klonlanmis 293 veya 293 hücreleri, [Graham ve dig., J, Gen Viral. 36: 59 (1977)]; bebek hamster böbrek hücreleri (BHK, ATCC CCL 10); fare sertoli hücreleri (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO-76, ATCC GEL-1587); insan. servikal karsinoni hücreleri (HELA, ATCC CCL 2); köpek böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo siçan karaciger hücreleri (BRL 3A, ATCC CRL 1442); insan akciger hücreleri (W138, ATCC CCL 75); insan karaciger hücreleri (Hep G2, HB 8065); fare memeli tümörü (MMT ; TRI hücreleri (Mather ve FS4 hücreleri ve bir insan hepatoma hatti (Hep G2) bulunmaktadir.
Konakçi hücreler, yukarida tarif edilen ifade vektörleri veya antikor üretimi için klon vektörleri ile dönüstürülür ve transfekte edilir ve promotörleri indüklemek, transformantlari seçmek ya da istenen sekanslari kodlayan genleri amplifiye etmek için uygun sekilde modifiye edilmis olan konvansiyonel besleyici ortamda kültürlenir. Ilaveten, bir seçici isaretleyicisi tarafindan ayrilan transkripsiyon birimlerin çoklu kopyalari ile transfekte edilen hücre hatlari ve yeni vektörler özellikle kullanilir ve M-CSF'yi hedefleyen antikorlarin ifadesi için tercih edilir. (& Konakçi hücrelerin kültürlenmesi Antikoru üretmesi için kullanilan konakçi hücreler, çok çesitli ortamlarda kültürlenebilmektedir. Ham's F10 (Sigma), Minimal Esansiyel Ortam ((MEM-Minimal Essential Medium), (Sigma), RPMI- ve Dulbecco Modifiye Eagle Ortami ((DMEM-Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Sigma) gibi piyasadaki mevcut ortamlar, konakçi hücrelerin kültürlenmesi için uygundur.
Ayrica, Ham ve dig., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes ve dig., ortamlardan herhangi biri de konakçi hücreler için kültür ortami olarak kullanilabilmektedir. Bu ortamlardan herhangi birisi, hormonlar ve/Veya diger büyüme faktörleri (örnegin insülin, transferin ya da epidermal büyüme faktörü), tuzlar (örnegin sodyum klorür, kalsiyum, magnezyum ve fosfat), tamponlar, (örnegin HEPES), nükleotidler (örnegin adenozin ve timidin), antibiyotikler (örnegin GENTAMYCINTM ilaci), eser elementler (genellikle mikromolar düzeydeki nihai konsantraSyonlarda bulunan inorganik bilesikler olarak tanimlanir) ve glükoz ya da buna esdeger bir enerji kaynagi ile gereken sekilde takviye edilebilmektedir. Diger gerekli takviyeler de, teknikte uzman kisilerce bilinen. uygun. konsantrasyonlarda. dahil edilebilir.
Sicaklik, pH ve benzeri gibi kültür kosullari, ifade için seçilen konakçi hücrede önceden kullanilan kosullardir ve teknikte siradan uzmanliga sahip kisiler tarafindan anlasilacaktir.
(% Antikorun saflastirmasi Rekombinant teknikler kullanildiginda, antikor, periplasmik boslukta hücre içinde üretebilmektedir veya mikrobiyal kültürlerden dahil ortam içerisinde dogrudan salgilanabilmektedir. Antikorun hücre içinde üretilmesi durumunda, birinci asama olarak, konakçi hücreler veya lize edilmis fragmanlar biçimindeki parçacikli kalintilar, örnegin santrifüjleme veya ultrafiltreleme yoluyla uzaklastirilir. yayinlarinda, E. coli'nin periplazmik bosluguna salgilanan antikorlarin izole edilmesi için bir prosedürü tarif edilmektedir (Ayrica bkz. [Carter ve dig., Bio/Technology 10: Mikrobiyal veya memeli hücrelerden hazirlanan antikor bilesimi, Örnegin, hidroksilapatit kromatografi katyon veya kus degisim kromatografisi ve affinite kromatografisi kullanilarak saflastirilmaktadir ve tercih edilen saflastirma teknigi affinite kromatografisidir. Protein A'nin bir affinite ligandi olarak uygunlugu, antikor içinde bulunan herhangi bir immünoglobülin Fc domeninin izotipine ve türüne baglidir.
Protein A, insan yl, y2 ya da Y4 agir zincirlerine dayali antikorlarin saflastirilmasinda kullanilabilmektedir (Lindmark ve dig., J. Immonol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Protein G, tüm fare izotipleri ve insan y3'ü için tavsiye edilmektedir (Guss ve dig., matris çogunlukla agarozdur; ancak diger matrisler de bulunmaktadir. Mekanik olarak stabil matrisler, örnegin denetimli gözenekli cam ya da poli(stirendivinil)benzen, agarozla elde edilebilecek olandan daha hizli debilere ve daha kisa isleme sürelerine olanak. tanimaktadir. Antikor' bir CH3 domeni içerdiginde, Bakerbond ABXTM reçinesi (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) saflastirma için kullanilir. Protein saflastirma için, geri kazanilacak olan antikora bagli olarak baska teknikler de nevcut olup bunlarin arasinda örnegin bir iyon degistirme kolonu üzerinde fraksiyonasyon, etanol çöktürmesi, Ters Faz HPLC, silika üzerinde kromatografi, heparin SEPHAROSETM üzerinde kromatografi, bir anyon ya da katyon degistirme reçinesi (örnegin bir poliaspartik asit kolonu) üzerinde kromatografi, odaklama kromatografisi, SBS-PAGE ve amonyum sülfat çöktürmesi bulunmaktadir.
Kimerik ve insanlastirilmis antikorlar Kimerik veya insanlastirilmis antikorlar, insanlarda parental fare monoklonal antikorlardan daha az immünojenik oldugundan dolayi, anafilaksi riski çok daha az olan insanlarin tedavisi için kullanilabilmektedir. Bu nedenle bu antikorlar, bir insana in Vivo tatbik edilmesini içeren terapötik uygulamalarda tercih edilebilmektedir.
Bir fare monoklonal antikorunun degisken Ig domenlerinin insan sabit Ig domenlerine kaynastirildigi kimerik monoklonal antikorlar, teknikte bilinen standart prosedürler kullanilarak olusturulabilmektedir (Bkz. Morrison, S. L., ve dig. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 646. (1984)). Bazi kimerik monoklonal antikorlarin insanlarda daha az immünojeniklige sahip oldugu kanitlanmis olmasina ragmen, fare degisken Ig domenleri halen anlamli bir insan anti- fare yanitina yol açabilmektedir.
Insanlastirilmis antikorlar, asagidakiler dahil çok çesitli metotlarla gerçeklestirilebilmektedir, örnegin: (1) bir insan çerçeve ve sabit. bölge üzerine insan olmayan tamamlayicilik belirleme bölgelerin (CDR'ler) asilanmasi (teknikte “CDR asilanmasi" yoluyla insanlastirilma olarak adlandirilan bir proses) veya alternatif olarak, (2) tüm insan olmayan degisken domenlerin nakledilmesi ancak yüzey kalintilarin yer degistirilmesiyle bir insan benzeri yüzey ile onlarin Mevcut bulusta, insanlastirilmis antikorlar hem yayinlarinda açiklanmaktadir. Özellikle, ya tek basina ya da bir konjüge olarak insanda tekrarlanan in 'ViVO uygulama üzerine bir kemirgen antikoru, kemirgen antikoruna karsi alicida bir immün yaniti, sözde HAMA yaniti (Insan Anti Fare Antikoru) meydana getirmektedir. HAMA yaniti, tekrarlanan, dozlamar gerektiginde farmasötigin etkinligini sinirlayabilmektedir.
Antikorun immünojenisitesi, daha fazla insan benzeri antikor baglayici yapinin yapilmasi için genetik mühendislik metotlarin kullanilmasiyla veya polietilen glikol gibi bir hidrofilik polimer ile antikorun kimyasal modifikasyonu ile azaltilabilmektedir. Örnegin, CEA baglayan kemirgen antikorun degisken domenleri için gen sekanslari, bir insan miyelom proteinin degisken domenleri için ornatilabilmektedir ve böylece bir rekombinant kimerik antikoru üretilmektedir. Bu prosedürler, 86/01533 sayili belgelerde detayli bir sekilde yer almaktadir.
Alternatif olarak kemirgen antikorun CDR'lerinin gen sekanslari, orijinal kemirgen antikorunun özgünlügüne sahip bir insan antikorunu üreten bir homolog insan antikor geninin iliskili sekans bölgeleri için izole edilmekte ya da sentezlenmekte ve WO9l/O9967 sayili belgede tarif edilmektedir. Alternatif olarak kemirgen antikorun degisken domeninin. çok sayida yüzey kalintisi, kalintilarin bir yüzey “kaplama”sina sahip olan ve böylece insan vücudu tarafindan kendiliginden tanimlanan bir kemirgen antikoru üreten bir homolog insan antikoru üzerinde normal olarak bulunan bu kalintilara dönüstürülebilmektedir. Bu yaklasim, Padlan ve dig. (1991) Mol. lmmunol. 28, 489 yayini tarafindan gösterilmektedir.
CDR asilama, insan degisken Ig domenlerinin uygun dört çerçeve bölgesi içerisinde fare agir ve hafif zincir degisken lg domenlerinden alti CDR'den bir veya daha fazlasinin dahil edilmesini kapsamakta olup, ayni zamanda CDR asilama olarak da adlandirilmaktadir. Bu teknikte (Riechmann, L., ve dig., Nature döngülerinin desteklenmesi için bir yapi iskelesi olarak korunmus çerçeve bölgeleri (FRl-FR4) kullanilmaktadir. CDR asilanmanin bir dezavantaji, buna ragmen, orijinal fare antikorundan büyük bir oranda daha düsük baglayici affiniteye sahip olan bir insanlastirilmis antikor ile sonuçlanabilmesidir, çünkü çerçeve bölgelerinin amino asitleri antijen baglanmasina neden olabilmekte ve CDR döngülerinin amino asitleri iki degisken Ig domeninin birlesmesini etkilemektedir.
Insanlastirilmis monoklonal antikörun affinitesini saglamak için CDR asilama teknigi, orijinal fare antikorunun çerçeve bölgelerine en çok benzeyen insan çerçeve bölgelerinin seçilmesiyle ve antijen baglanma alanin bilgisayar modellenmesi ile desteklenen çerçeve veya CDR'ler içerisine tek amino asitlerin alan yönelimli mutagenezi ile gelistirilebilmektedir Insanlastirilmis antikorlarin bir metodu, insan agir ve hafif zincir sekanslara. insan olmayan agir ve hafif zincir sekanslarinin hizalanmasini, bu hizalanmaya bagli olarak insan olmayan çerçevenin bir insan çerçevesi ile degistirilmesini, insanlastirilmis sekansin konformasyonun tahmin edilmesi için moleküler modellenmesini ve ana antikorun konformasyonuna karsilastirilmasini içermektedir. Bu proses, CDR bölgesindeki kalintilarin tekrarlanan arka mutasyonu ile devam etmekte olup, insanlastirilmis sekans nmdelinin öngörülmüs konformasyonunu, ana insan olmayan antikorunun insan olmayan CDR'lerinin konformasyonuna benzeyene kadar CDR'lerin yapisini bozmaktadir.
Bu insanlastirilmis antikorlar ayrica geri alimi ve atilmayi kolaylastirmak için örnegin, Ashwell reseptörleri araciligiyla türevlendirilmektedir (Bkz. örn. U.S. Patent NO 5,530,101 ve ,585,089).
Rasyonel tasarim ile fare monoklonal antikorlarinin bir dizi insanlastirilmasi rapor edilmektedir (Bkz. örn. 11 Haziran Amino asit sekans varyantlari Mutagenez için tercih edilen konumlar olan antikorun belirli kalintilari veya bölgelerinin tanimlanmasi için kullanilan bir tarafindan tarif edildigi gibi “alanin tarama mutagenezi” olarak adlandirilmaktadir. Burada, hedef kalintilarin. bir kalintisi veya grubu tanimlanmaktadir (örnegin, arg, asp, his, lys ve glu gibi yüklü kalintilar) ve antijen ile amino asitlerinin etkilesimini etkilemesi için nötral veya negatif olarak yüklü bir amino asit ile (en fazla tercihen alanin veya polialanin) yer degistirilmektedir. Ornatmalara islevsel duyarlilik gösteren bu amino asit konumlari daha sonra ornatim bölgelerinde ya da ornatim bölgeleri için daha fazla veya baska varyantlarin sunulmasi için rafine edilmektedir. Böylece, bir` amino asit sekansi varyasyonunun sunulmasi için alan belirlenirken, tek basina mutasyonun yapisinin önceden belirlenmesine gerek duyulmamaktadir. Örnegin, verilen. bir alanda bir mutasyonun performansinin analiz edilmesi için, ala taramasi veya rastgele mutagenez, hedef kodonu veya bölgesinde yürütülmekte ve ifade edilen antikor varyantlari arzu edilen aktivite açisindan taranmaktadir.
Amino asit sekansi yerlestirmeleri uzunluk olarak bir kalintidan yüzlerce veya daha fazla kalinti içeren polipeptitlere kadar degisiklik gösteren amino ve/veya karboksil terminal füzyonlarini ve ayrica tek veya çoklu amino asit kalintilarini sekans içi yerlestirmelerini içermektedir. Terminal yerlestirmelerinin örnekleri, bir epitop etikete veya bir kurtarma reseptöru epitopuna kaynasik antikorun (antikor fragmani dahil) veya bir N terminal metionil kalintisina sahip bir antikoru içermektedir. Antikor molekülünün diger insersiyonal varyantlari, Örnegin, N-ucunda veya C-ucunda antikorun yarilanma ömrünü arttiran bir polipeptide füzyonu içermektedir. anlamina gelmektedir. Epitop etiketli polipeptid, karsi bir antikorun yapilabilecegi bir epitop saglamak için yeterli kalintiya sahiptir, ancak antikorun aktivitesine müdahale etmeyecek kadar kisadir. Epitop etiketi tercihen, söz konusu antikorun, diger epitoplarla büyük ölçüde çapraz reaksiyona girmemesi için yeterli ölçüde benzersizdir. Uygun etiketli polipeptidler genel olarak, en az 6 amino asit kalintisina sahiptir ve genellikle yaklasik 8-50 amino asit kalintisi arasinda olmaktadir (tercihen yaklasik 9-30 kalinti arasinda). Örnekler arasinda, flu HA etiketli polipeptid ve bunun antikoru Simplex virüsü glikoprotein D (gD) etiketi ve bunun antikoru bulunmaktadir. Diger örnek niteligindeki etiketler, genellikle alti histidin kalintisi olan ve bu sekilde nikel selatlama kullanilarak etiketlenmis bir bilesigin izolasyonuna izin veren bir poli-histidin sekansidir. FLAGC) etiketi (Eastmanr Kodak, Rochester, NY) gibi diger etiketler ve etiket teknikte iyi10 bilinmektedir ve rutin olarak kullanilmakta ve burada açiklanmaktadir.
Burada kullanildigi haliyle “kurtarma reseptörü baglanma epitopu" terimi, IgG molekülünun in vivo serum yarilanma ömrünün arttirilmasindan sorumlu olan bir lgG molekülunun (örnegin, IgGh IgGL IgG3 veya IgGm Fc bölgesinin bir epitopu anlamina gelmektedir.
Baska bir varyant tipi ise bir amino asit ornatim varyantidir.
Bu varyantlarda antikor molekulünde en az bir amino asit kalintisi eksiktir ve bunun yerine farkli bir kalinti yerlestirilmistir. Hiper degisken veya CDR bölgeleri veya çerçeve bölgelerinin herhangi birinde ornatim metagenezi tasarlanmaktadir. Koruyucu ornatmalar Tablo 1'de gösterilir. En koruyucu ornatma, “tercih edilen ornatmalar” basligi altinda bulunur. Bu ornatmalarin biyolojik aktivitede hiç bir degisime yol açmamasi halinde, Tablo 1'de "örnek ornatmalar" olarak belirtilen veya amino asit siniflari ile ilgili olarak asagida baskaca tarif edilen daha fazla ornatma degisiklikleri yapilabilir ve ürünler taranabilir.
Orijinal Tercih Edilen Örnek Kalinti Ornatimlari Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp, arg Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln(Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp His (H) asn; gln; lys; norlösin; ile; val; met; ala; arg; gln; asn leu; phe; ile leu; val; ile; tyr; phe norlösin VaI(V› Haleu;met;phe;ah; Ieu norlösin Antikorun biyolojik özelliklerindeki onemli modifikasyonlar, (a) ornatma alaninda polipeptit omurgasina ait yapinin örnegin bir tabaka veya spiral konformasyon seklinde, (b) moleküle ait yükün veya hidrofobisitenin hedef pozisyonda veya (c) yan zincir yigininin muhafaza edilmesi bakimindan kendi etkilerinde anlamli ölçüde farklilik gösteren ornatmalarin seçilmesiyle gerçeklestirilmektedir. Dogal olarak meydana gelen kalintilar, yaygin yan zincir özellikleri esasinda gruplara ayrilir: (H hidrofobik: norlösin, met, ala, val, leu, ile; (B dogal hidrofilik: cys, ser, thr; (N asidik: asp, glu; (M bazik: asn, gln, his, lys, arg; (H zincir oryantasyonunu etkileyen kalintilar: giy, (m aromatik: tip, tyr, phe.
Koruyucu ornatmalar, bir amino asidin, sinifinin baska bir üyesi olan bir amino asit ile degistirilmesini içerir. Koruyucu olmayan ornatmalar, bu siniflardan birinin bir üyesinin, baska bir sinifin bir üyesi ile degistirilmesini içerir.
Monoklonal, insan, insanlastirilmis, Insani MühendislikTM 'veya varyant antikorunun uygun konformasyonun saglanmasi sürecine katilmayan herhangi sistein kalintisi ayni zamanda normal olmayan çapraz baglanmasinin önlenmesi Ve nwlekülün oksidatif stabilitesinin gelistirilmesi için genel olarak serin ile ornatilabilmektedir. Aksine, sistein bag(lar), stabilitesinin (özellikle antikorun, bir FV fragmani gibi bir antikor fragmani oldugu durumda) gelistirilmesi için antikora ilave edilebilmektedir.
Affinite olgunlasmasi, bir ana antikorun CDR'leri içerisinde ornatmalara sahip olan antikor varyantlarin hazirlanmasini ve taranmasini ve ana antikora göre baglanma affinitesi gibi gelistirilmis biyolojik özelliklere sahip olan varyantlarin seçilmesini kapsamaktadir. Benzeri ornatma varyantlarin olusturulmasi için uygun bir yöntem, faj görüntüleme kullanilarak affinite olgunlasmasidir. Özetle, bazi hiper degisken bölge alanlari (örnegin, 6-7 alanlari), her alanda mümkün olan bütün amino ornatmalarin olusturulmasi için mutasyona ugratilmaktadir. Bu sekilde olusturulan antikor varyantlari, her tanecik içerisine paketlenen Ml3'ün gen III ürününe füzyonlari gibi ipliksi faj taneciklerden bir monovalan (tek degerli) bir yöntemde görüntülenmektedir. Faj görüntüleme varyantlari, daha sonrar biyolojikr aktivitesi (Örn. baglanma Alanin tarama mutagenezi, antijen baglanmasina anlamli bir sekilde katkida bulunan hiper degisken bölge kalintilarin tanimlanmasi için olusturulabilmektedir. Alternatif olarak, veya ilaveten, antikor ve antijen arasindaki temas noktalarinin tanimlanmasi için, antijen-antikor kompleksinin bir kristal yapisini analiz etmek faydali olabilir. Benzeri temas kalintilari ve komsu kalintilar, burada ayrintilariyla yer verilen tekniklere göre ornatilmak için adaydir. Bu varyantlar olusturulduktan sonra, varyantlarin paneli burada tarif edildigi gibi taramaya tabi tutulur ve bir veya daha fazla ilgili deneyde üstün özellige sahip olan antikorlar daha fazla gelistirilmek üzere seçilebilir.
Ayrica antikor varyantlari üretilmis olup, bu antikor varyantlari, örnegin antikor içinde bulunan bir veya daha fazla karbohidratin silindigi ve/veya antikor içinde mevcut olmayan bir veya daha fazla glikozilasyonun ilave edildigi ana antikora göre modifiye edilmis bir glikozilasyon paternine sahiptir.
Antikorlarin glikozilasyonu tipik olarak ya N-bagli ya da O- baglidir. N-bagli, karbohidrat kisminin bir asparajin kalintisinin yan zincirine baglanmasi anlamina gelmektedir. X'in prolin haricinde herhangi bir amino asit oldugu asparajin-X- serin ve asparajin-X-treonin tripeptit sekanslari, karbohidrat parçasinin asparajin yan zincirine enzimatik baglanmasi için tanima sekanslaridir. Bu tripeptit sekanslarinin herhangi birinin bir polipeptitte mevcut olmasi bir potansiyel glikozilasyon pozisyonu üretir. Ayrica, N-bagli glikozilasyOn alanlari amino asit sekansinin bu tripeptid sekanslarin bir veya daha fazlasini içerecek sekilde degistirilmesiyle bir antikora ilave edilebilebilir. O-bagli glikozilasyon, sekerler N- asetilgalaktozamin, galaktoz veya ksiloz sekerlerinden birinin, -hidroksiprolin veya 5-hidroksilizin de kullanilabilmesine ragmen en yaygin olarak serin veya treonin olmak üzere bir hidroksiamino aside baglanmasina ifade etmektedir. O-bagli glikozilasyon alanlari, orijinal antikorun sekansina bir veya daha fazla serin veya treonin kalintisinin yerlestirilmesiyle veya ornatilmasiyla bir antikora ilave edilebilmektedir. Örnek olarak, Sekil 4A'da (NGS) yer alan 41-43 pozisyonlarinda RXl'in amino asitleri ali konulmaktadir. Alternatif olarak sadece 41 ve 42 amino asitleri (NG), tutulabilmektedir.
Normal olarak, Insan MühendislikTM antikorunun amino asit sekansi varyantlari, ya agir ya da hafif zincirin (örnegin, Sekil 22B boyunca Sekil 19B'nin herhangi birindeki gibi) orijinal Insan MühendislikTM antikor amino asit sekansi ile en az %60 amino asit özdesligine, daha fazla tercihen en az %80, daha fazla tercihen en az %85, daha fazla tercihen %90 ve en fazla tercihen en az asit sekans özdesligine sahip bir amino asit sekansa sahiptir.
Sekans özdesin kismi olarak herhangi koruyucu ornatmalarin (yukarida Tablo 1 içinde tarif edildigi gibi) varsayilmadigi ve gerektiginde, maksimum yüzde sekans ozdesligin gerçeklestirilmesi için sekansin hizalanmasi ve bosluklarin girmesi sonrasi, Insan MühendislikTM kalintilari ile özdes olan aday sekans içinde amino asit kalintilarin yüzdesi gibi bu sekansa göre özdes veya homolog bunun içinde tarif edilmektedir.
N-ucu, C-ucu veya antikor sekansi içerisine gerçeklestirilen uzatmalarin, silmelerin veya yerlestirmelerin hiçbiri, sekans özdesligi veya homologlugunu etkileyecek sekilde yorumlanmamalidir. Ayrica sekans özdesligi, iki polipeptidin amino asitlerinin pozisyonundaki benzerligini karsilastirmak için yaygin olarak kullanilan standart metotlar ile belirlenmektedir. BLAST veya FASTA gibi bir bilgisayar programi kullanilarak iki polipeptid, ilgili amino asitlerinin optimal uyumu için (ya bir veya her iki sekansin tam uzunlugu boyunca ya da bir veya her iki sekansinin önceden belirlenmis bir kismi boyunca) hizalanmaktadir. Programlar, bir varsayilan açilis penalti ve varsayilan bosluk penaltiyi saglamaktadir ve PAM 250 gibi bir skorlama. matriksi [bir standart skorlama matriksi; bakiniz Dayhoff ve dig., in Atlas of Protein Sequence and Structure, Cilt 5, supp. 3 (1978)), bilgisayar programi ile baglantili olarak kullanilabilmektedir. Örnegin, yüzde özdeslik daha sonra asagidaki gibi hesaplanabilmektedir: özdes eslesmelerin toplam sayisi 100 ile çarpilir ve daha sonra iki sekansin hizalanmasi için uzun sekanslar içerisine giren bosluklarin sayisi ve eslesmis açiklik içerisinde uzun sekansin boyunun toplami ile bölünür.
Antikorun diger modifikasyonlari tasarlanmaktadir. Örnegin, efektör fonksiyona göre antikorun modifiye edilmesi arzu edilebilir olup öyle ki örnegin, kanserin tedavi edilmesinde antikorun etkinligi genisletilebilmektedir. Örnegin, sistein kalintisi (kalintilari) Fc bölgesine dahil edilebilmekte olup böylece bu bölgedeki ara zincir disülfid bagina olanak saglamaktadir. Bu sekilde olusturulan homodimerik antikor, gelistirilmis içsellestirme kapasitesine ve/Veya yükselen tamamlayici-aracili hücre ölümüne ve antikora bagli hücresel sitotoksisiteye (ADCC) sahiptir. Bkz. Caron ve dig., J. Exp Med. (1992). Gelistirilmis anti-tümör aktivitesine sahip homodimerik antikorlar ayni zamanda, Wolff ve dig., Cancer Research 53: 2560- 2565 (1993) yayininda tarif edildigi gibi heterobifonksiyonal çapraz-baglayicilar kullanilarak hazirlanabilmektedir.
Alternatif olarak, bir antikor, çift FC bölgesine sahip olarak tasarlanabilmektedir ve böylece gelistirilmis tamamlayici lizis ve ADCC kapasitelerine sahiptir. Bkz. Stevenson ve dig., Anti- sekanslarin, bir antikorun MHC Sinif ll'ye baglanmasina ve istenmeyen yardimci T-hücre yanitini tetiklemesine neden oldugu gösterilmistir. Koruyucu bir ornatma, antikorun, baglanma aktivitesini muhafaza. etmesine olanak saglayabilmekte, ancak istenmeyen. bir T Ihücre yanitini. tetikleme kabiliyetini kaybetmesine sebep olmaktadir. Ayni zamanda bakiniz, bir murin degisken bölgesinin, insan gama l, gama 2, gama 3 ve gama 4 sabit bölgeleri ile birlestirildigi kimerik antikorlari tarif eden Örnegin, tümör penetrasyonun arttirilmasi için, bir intakt antikordan ziyade bir antikor fragmaninin kullanilmasi arzu edilebilmektedir. Bu durumda, örnegin, PEG veya diger suda çözünür polimerler gibi moleküllerin ilaveten yarilanma ömrün arttirilmasi için antikor fragmanlara polisakkarid polimerlerin ilave edilmesi ile serum yarilanma ömrünün arttirilmasi için antikor fragmaninin modifiye edilmesi arzu edilmektedir. Bu ayni zamanda, örnegin antikor fragmani içerisine bir kurtarma reseptörü baglanma epitopunun dahil edilmesiyle gerçeklestirilebilmektedir (örnegin, antikor fragmani içerisinde uygun bölgenin mutasyonu ile veya örnegin, DNA veya peptid sentezi ile ya uçta ya da ortada antikor fragmanina daha sonra kaynastirilmis olan bir peptid etiketine epitopun dahil edilmesiyle) (bkz. örn. WO96/32478).
Kurtarma reseptörü baglayici epitopu tercihen, bir PC domeninin bir veya iki döngüsünden herhangi bir veya daha fazla amino asit kalintisinin, antikor fragmaninin bir analog pozisyonuna transfer edildigi bir bölge olusturur. Daha fazla tercihen, Fc domeninin bir veya iki döngüsünden üç veya daha fazla kalinti transfer` edilir. Daha çok tercihen söz konusu epitop, Fc bölgesinin (örnegin, bir IgG'nin) CH2 domeninden alinir ve antikorun CHl, CH3 veya VH bölgesine veya bu bölgelerden birinden daha fazlasina transfer edilir. Alternatif olarak, epitop, Fc bölgesinin CH2 domeninden alinmak ve antikor fragmaninin C.alt.L bölgesine veya V.alt.L bölgesine veya her ikisine transfer edilmektedir. Ayrica bkz. Fc varyantlari ve bu varyantlarin kurtarma reseptörü ile etkilesimlerini tarif eden Uluslararasi Ayrica, antikorlar bir insan Fc kismini, bir insan konsensüs FC kismini veya bunlarin bir varyantini içermekte olup varyantlar dahil Fc kurtarilma reseptörü ile etkilesimi için kabiliyetini korumakta olup, burada disülfid baglanmasini ihtiva eden sisteinler, modifiye edilmekte veya ayrilmaktadir ve/veya içerisinde bir met, N-ucunda ilave edilmektedir ve/veya N-ucu 20 amino asidinin bir veya daha fazlasi ayrilmakta ve/veya Clq baglanma alani gibi tamamlayici ile etkilesimde olan bölgeler ayrilmakta ve/veya ADCC alani ayrilmaktadir [bkz. örn. Molec. Önceki çalismalar, lgG kalintilar 233-239'dan olusan primer olarak düsük mafsal bölgesine FCR için insan ve murin IgG üzerinde baglayici alani haritalandirmaktadir. Diger çalismalar, ilave genis segmentler, örnegin, insan FC reseptör I için Gly3l6- Arg4l6 önermektedir veya düsük mafsal disinda birkaç spesifik kalinti, örnegin, murin Fe reseptör II ile etkilesimde olan murin lgGZb için Asn297 ve Glu318 bulmaktadir. Insan Fc reseptörü IIIA ile insan lgGl FC fragmaninin 3.2-A kristal yapisinin raporu, Ala327-Ile332'nin FC reseptörü IIIA'ya baglanmada yer aldigini tarif etmektedir. Kristal yapi baz alinarak önerilen, düsük mafsala (Feu234- Gly237) ilaveten, lgG CHZ domeni döngüleri FG kalintilar, FC reseptör IIA'ya baglanmasinda bir rol oynayabilmektedir. Bkz. Shields ve dig., J. Biol. Chem., alanlari içerisindeki kalintilarin mutasyonu, degistirilmis ADCC veya CDC aktivitesi veya degistirilmis yarilanma ömrü gibi degistirilmis efektör fonksiyonu ile sonuçlanir. Yukarida tarif edildigi gibi, potansiyel mutasyonlar, alanin ile ornatma, bir koruyucu ornatma, bir koruyucu olmayan ornatma veya farkli bir karsilik. gelen ile yer` degistirmesi (örnegin, bu pozisyonda karsilik gelen bir lgG2 kalintisi ile bir IgGl kalintisinin yer degistirilmesi) dahil bir veya daha fazla kalintinin yerlestirilmesini, Silinmesini veya ornatilmasini içermektedir.
Shields ve dig. yayininda, bütün insan Fc reseptörlerine baglanmada rol alan IgGl kalintilari, masfala yakin CH2 domeninde konumlandirildigini ve 1) bütün FCR ile dogrudan muhtemelen Asp265) içermektedir; 2) karbohidrat dogasini veya pozisyonu etkileyen pozisyonlar Asp265 ve Asn297 seklinde iki kategoriye ayrildigini bildirmektedir. FC reseptör Il'ye baglanmasini etkileyen ilave lgGl kalintilari asagidakiler yukarida tarif edilen kalintilara ilaveten, %40 veya daha fazla oranda FC reseptör IIIA'ya baglanmayi azaltan ilave IgGl kalintilari asagidakiler gibidir: Ser239, Ser267 (sadece Gly), Asp376. FCRIIIA'ya baglanmayi gelistiren varyantlar, T256A, FcRIIA ve FcRIIB'ye baglanmada %40 azalma, Arg4l6'da FcRIIA ve FcRIIIA'ya baglanmada %30 azalma, Gln419'da FoRlIA'ya baglanmada FCRIIIA'ya baglanmada %23 artis görülmüstür. Ayrica bkz. Presta Örnegin, United. States Patent. No. 6,194,551 sayili belgede, amino asit pozisyonlari 329, 331 veya 322`de (Kabat numaralandirilmasi kullanilmistir), insan lgG FC bölgesinde bazilarinin azalan Clq baglanmasi veya CDC aktivitesi sergiledigi mutasyonlar içeren degistirilmis efektör fonksiyonuna sahip varyantlari tarif edilmektedir. fBaska bir örnek olarak United States Patent No. 6,737,056'da, bazilarinin azalmis ADCC veya CDC aktivitesi ile iliskili reseptör baglanma pozisyonlarinda (Kabat numaralandirmasi kullanilmistir) insan lgG FC bölgesindeki mutasyonlari içeren degistirilmis efektör veya Fc-gama-reseptör baglanmasina sahip varyantlar tarif 327 veya 329'da bir mutasyon, FcRI'e baglanmanin azaltilmasi baglanmanin azaltilmasi için belirtilmistir, amino asit FCRIII'e baglanmanin azaltilmasi için belirtilmistir.
United States Patent No. 5,624,821 sayili belgede, bir murin antikorunun Clq baglanma aktivitesinin, agir zincirin amino asit kalintisi 318, 320 veya 322'nin mutasyona ugratilmasi ile degistirilebildigi ve kalinti 297'nin (Asn) degistirilmesinin lirik aktivitenin ortadan kalkmasiyla sonuçlandigi bildirilmektedir. 328 veya 332'de (Kabat numaralandirilmasi kullanilmistir) veya kullanilmistir)bulunan mutasyonlara sahip varyantlar tarif ADCC aktivitesini azaltabilmekte veya bir PC gamma reseptörüne baglanmayi azaltabilmektedir. yayininda lgGl'in sitofilik aktivitesinin, kendi agir zincir CH2 domeninin özgün bir özelligi oldugu bildirilmistir. IgGl'in amino asit kalintilari 234-237'nin herhangi birindeki tek nokta mutasyonlari anlamli bir sekilde düsmüs veya aktivitesi ortadan kalkmistir. lgGl kalintilari IgG2 ve gerekmektedir. Bütün ELLGGP sekansini (kalintilar 233-238) içeren bir IgG2 antikoru, yabani tip IgGl'den daha aktif olmasi için gözlemlenmistir. gammaR baglanmasi için kritik bir motif (glutamat 233'ten proline, lösin/fenilalanin 234'ten valine ve lösin 235'ten alanine) içerisindeki mutasyonlarin, hedef hücrelerin tükenmesini tamamen önledigi bildirilmektedir. Alanin'e mutasyon glütamat 318, fare IgGZb'nin efektör fonksiyonunu elimine etmektedir ve ayni zamanda insan IgG4'ün etkinligini azaltmaktadir. tip IgGl'den 10 kat daha az etkili aktive edici reseptör FçgammaRlIa ile reaksiyona giren ve inhibe edici reseptör FçgammaRlIb'ye Ibaglanmasi. dört kat azalan lgGl varyantlarini tanimlanmistir. Mutasyonlar, amino asitler 233-236'nin bölgesinde ve/Veya amino asit pozisynlar 327, 330 ve o331'deki bölgede yapilmaktadir. Ayrica bkz. WO 99/58572.
Pro33l'in Ser'e mutasyona ugratilmasi, Clq baglanmasini önemli derecede azalttigi ve esas itibariyle litik aktiviteyi elimine ettigi bildirilmektedir. Aksine, lgG4 içinde Ser33l için Pro'nün ornatmasi, IgG4 Pro33l varyanta kismi litik aktivite (%40) verilmistir.
Schuurman ve dig,. Mol Immunol. 2001;38(1): 1-8 yayininda, serin'e Cy5226 gibi, inter-agir zincir bag oluSUmuna dahil olan mafsal sisteinlerinden birinin mutasyona ugratilmasinin, daha fazla dayanikli inter-agir zincir baglarla sonuçlandigi bildirilmistir. IgGl mafsal sekansi Cys-Pro-Pro-Cys'nin lgG4 mafsal sekansi Cys-Pro-Ser-Cys'nin mutasyona ugratilmasi, agir zincirler arasinda kovalent etkilesimi önemli derece stabilize etmektedir. içindeki amino asit pozisyonu 24l'de serinin proline (lgGl ve ugratilmasi, bir homojen antikorun üretimine yol açmasinin yani sira serum yarilanma ömrünün genislettigi ve orijinal kimerik bildirilmektedir.
Insan ve Insan Mühendislik”M antikorlari Insan MühendislikTM Antikor degisken domenlerinin Insan MühendislikTM antikorlari, Studnicka [Bkz. örn. Studnicka ve dig. U.S. Patent No. 5,766,886; tarafindan antikor moleküllerinin baglanma aktivitesini korurken immünojenikliginin azaltilmasina yönelik bir öyntem.olarak tarif edilmistir. Metoda göre, her degisken bölge amino asidine bir ornatma riski atanir. Amino asit ornatmalari, üç risk kategorisinden biri ile ayirt edilir: (1) düsük riskli degisimleri, antijen baglayici bozunmasinin en az degisimi ile immünojenisitesinin azaltilmasi için büyük potansiyele sahip olanlardir; (2) orta riskli degisiklikler, ayrica immünojenisiteyi azaltan ancak antijen baglanmasini veya protein katlanmasini etkilemesinin bir büyük degisimi sahip olanlardir; (3) yüksek riskli kalintilar, antikor yapisinin temin edilmesi için veya baglanmasi için önemli olan ve antijen baglanmasi veya protein katlanmasinin etkilendigi en yüksek riski tasiyan olanlardir. Prolinlerin üç-boyutlu yapisal rolünden dolayi, prolinlerdeki modifikasyonlar, pozisyon tipik olarak bir düsük riskli pozisyonda olmasina ragmen, genel olarak en az orta riskli degisiklikler oldugu kabul edilmektedir.
Bir kemirgen antikorunun hafif ve agir zincirlerinin degisken bölgeleri, insan amino asitlerini, antijen baglanmasini veya protein katlanmasini ters yönde etkilemeyecegi, ancak bir insan ortaminda immünojenisiteyi azaltma olasiligi düsük oldugu belirlenen pozisyonlarda insan amino asitlerini ornatmak için asagidaki gibi Insan MühendislikTM olmaktadir. “Düsük riskli” pozisyonlarda bulunan ve söz konusu yönteme göre modifikasyona yönelik adaylar olan amino asit kalintilari, kemirgen degisken bölgelerinin amino asit sekanslarinin bir insan degisken bölge sekansi ile hizalanmasiyla tanimlanmaktadir. Tek basina bir VH veya VL sekansi veya bir insan konsensus VH veya VL sekansi veya bir tek basina veya konsensus insan germ hatti sekansi dahil olmak, üzere herhangi bir insan degisken bölgesi kullanilabilmektedir. Herhangi bir sayida düsük riski pozisyonda veya düsük riskli pozisyonlarin tümünde amino asit kalintilari degisebilmektedir. Örnegin, hizalanmis mürin ve insan amino asit kalintilarin farklilastigi her düsük riskli pozisyonda, kemirgen kalintinin insan kalintisi ile yer degistirildigi bir amino asit modifikasyonü gerçeklestirilmektedir. Alternatif olarak, düsük riskli pozisyonlarin tümünde ve herhangi bir sayida orta riskli pozisyonda degisebilmektedir. Ideal olarak, en düsük immünojenisiteyi elde etmek için düsük ve orta riskli pOZisyonlarin tümü kemirgenden insan sekansina kadar degismektedir.
Modifiye edilmis agir ve hafif zincir degisken bölgeleri içeren sentetik genler yapilandirilmaktadir ve insan y agir zincirine ve/Veya kappa hafif zincir sabit bölgelerine baglanmaktadir.
Herhangi insan agir zincir ve hafif zincir sabit bölgeleri, lgA (lgAl veya lgAZ gibi herhangi bir alt sinifi), IgD, IgE, IgG (lgGl, IgGZ, lgG3 veya lgG4 gibi herhangi bir alt sinifi) veya lgMi dahil Insan, Mühendislik“i antikor degisken ;bölgeleri ile birlikte kullanilabilmektedir. Insan agir ve hafif zincir genleri, memeli hücreleri gibi konakçi hücreleri içerisine girmektedir` ve sonuçlanan rekombinant immünoglobulin ürünler elde edilmektedir ve karakterize edilmektedir.
Transjenik hayvanlardan insan antikorlari M-CSF'ye karsi insan antikorlari ayni zamanda, endojen immünoglobulin üretimine sahip olmayan transjenik hayvanlar kullanilarak üretilmis olabilmektedir ve insan immünoglobulin konumunu içermesi için tasarlanmaktadir. Örnegin, WO 98/24893 sayili belge, bir insan lg konumuna sahip transjenik hayvanlari açiklamakta olup, burada hayvanlar, endojen agir ve hafif zincir konumlarin inaktivasyonundan dolayi islevsel endojen immünoglobulinleri üretmemektedir. WO 9l/74l sayili belge, bir immünojene bir immün yanitinin birlestirilmesine haiz transjenik primat olmayan memeli konakçilari açiklamakta olup, burada antikorlar primat sabit ve/veya degisken bölgelere sahip olmaktadir ve içerisinde konumlari kodlayan endojen immünoglobulin ornatilmis veya inaktive edilmistir. WO 96/30498 sayili belgede, modifiye edilmis bir antikor molekülün olusturulmasi için sabit veya degisken bölgenin bir kisminin ya da tümünün yer degistirilmesi için gibi bir memelide immünoglobulin lokusunun modifiye edilmesi için Cre/Lox sistemin kullanimini açiklanmaktadir. WO 94/02602 sayili belge, inaktive edilmis endojen lg konumlarina ve islevsel insan lg konumlarina sahip insan olmayan memeli konakçilari açiklamaktadir. U.S.
Patent No. 5,939,598 sayili belge, içerisinde farenin endojen agir zincirlerinden yoksun olan ve bir veya daha fazla ksenogeneik sabit bölgeleri içeren bir ekzojen immünoglobulin konumunu ifade eden transjenik farenin yapilmasinin metotlarini açiklamaktadir.
Yukarida tarif edilen bir transjenik hayvan kullanilarak, bir immün yanit seçilmis bir antijenik molekülü için üretilebilmektedir ve antikor üretici hücreler hayvandan ayrilabilmektedir' ve insan monoklonal antikorlari salgilayan hibridomalarin üretilmesi için kullanilmaktadir. Bagisiklama protokolleri, adjuvanlar ve benzerleri teknikte bilinmektedir ve Örnegin, WO 96/33735 sayili belgede tarif edildigi gibi bir transjenik farenin bagisiklanmasinda kullanilmaktadir. Bu yayinda, IL 6, IL 8, TNFa, insan CD4, F selektin, gp39 ve tetanos toksini dahil çesitli antijenik moleküllere karsi nmnoklonal antikorlari açiklanmaktadir. Monoklonal antikorlar, biyolojik aktivitenin veya ilgili proteinin fizyolojik etkisinin inhibe edilmesi veya nötralize edilmesi için test edilebilmektedir. WO 96/33735 sayili belge, lP-8 ile bagisiklanmis transjenik farenin bagisiklik hücrelerinden türetilen, nötrofillerin IP-8 kaynakli fonksiyonlarini bloke eden IP-8'e karsi olan monoklonal antikorlari açiklar. Transjenik hayvanlarin bagisiklanmasinda kullanilan antijen için özgüllüge sahip insan monoklonal antikorlar ayni zamanda WO 96/34096 ve U.S. patent basvuru no. belgelerde açiklanir.
Ayrica bkz. Jakobovits ve dig., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bruggermann ve dig., Year in Immuno., 7:33 (1993); ve U.S. Pat. istenilen epitöpa yönlendirilmesine yönelik yöntemler tarif edilmektedir. Insan antikorlari ayrica in vitro aktive edilmis B hücreleri ile olusturulabilmektedir (bkz. U.S. Pat. No.
Faj görüntüleme teknolojisinden insan antikorlari Rekombinant insan antikor genlerinin. dagarciklarin. yapilmasi için teknolojilerin gelisimi ve ipliksi bakteriyofajin yüzeyi üzerinde kodlanan antikor fragmanlarinin görüntülenmesi, insan antikorlarin dogrudan yapilmasi için yöntemleri saglamaktadir.
Faj teknolojisi ile üretilen antikorlar, antijen baglanma fragmanlari olarak, genellikle bakteri içinde Fv veya Fab fragmanlari olarak üretilir ve bu nedenle efektör fonksiyonundan yoksundur. Efektör fonksiyonlari iki stratejiden biri ile tanitilir: Fragmanlar, ya memeli hücrelerde ifade için tamamlanmis antikorlar içerisinde ya da bir efektör fonksiyonu tetikleyebilen bir ikinci baglayici alan ile bispesifik antikor fragmanlari içerisinde tasarlanabilmektedir.
Tipik. olarak, antikorlarin. Fd fragmanlari (VE-Chl) ve hafif zinciri (Vi-Ci), PCR ile ayri olarak klonlanir ve birlesimsel faj görüntüleme kütüphanelerinde rastgele olarak rekombine edilmekte olup daha sonra belirli. bir antijene baglanmasi için seçilebilmektedir. Fab fragmanlari, örnegin, bunlari kodlayan genlere fiziksel olarak baglanan faj yüzeyi üzerinde ifade edilir. Böylece, antijen baglayici ile Fab'in seçimi, Fab kodlayici sekanslar` için beraber seçilmekte olup daha sonra amplifiye edilebilmektedir. Antijen baglayici ve yeniden amplifikasyonun bazi döngüleri ile, kaydirma olarak adlandirilan bir prosedür ile, antijen için spesifik Fab zenginlestirilir ve sonuç olarak izole edilir. 1994'te, “kilavuzlu seçim” olarak da adlandirilan antikorlarin insanlastirilmasi için bir yaklasim tarif edilmistir. Kilavuzlu seçimde, fare monoklonal antikorun insanlastirilmasi için faj görüntüleme teknigin gücünden yararlanilir (Bakiniz, Jespers, L.
Bunun için, fare nmnoklonal antikorun Fd fragmani, bir insan hafif zincir kütüphanesi ile kombinasyonda görüntülenebilmektedir ve sonuçlanan hibrid Fab kütüphanesi daha sonra antijen ile seçilebilmektedir. Fare Fd fragmani böylece seçime kilavuzluk etmesi için bir sablon saglamaktadir.
Sonradan, seçilmis insan hafif zincirleri bir insan Fd fragmani kütüphanesi ile kombine edilmektedir. Sonuçlanan kütüphanenin seçimi bütünüyle insan Fab'i vermektedir. Çok sayida prosedür, faj görüntüleme kütüphanelerinden insan antikorlarinin türetilmesi için tarif edilmistir' (Bkz. örn. (1994)). Özellikle, faj görüntüleme kütüphanelerinden türetilen in vitro seçimi ve evrimi, güçlü bir araç haline gelmistir (Bkz.
Burton, D. R. ve Barbas III, C. E., Adv. Immunol. 57, 191-280 watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage faj ile ifade edilen antikor kütüphanelerinin ve yakalama tutucu ile diger baglanma Hmleküllerinin taranmasina netotlar tarif etmekte olup metot, bir kati destek üzerine aday baglanma moleküllerinin hareketsizlestirilmesini içermektedir.
Antikor ürünleri, teknikte bilinen herhangi uygun deneyler kullanilarak veya burada “Tarama Metotlari” baslikli bölümde tarif edilen deneyler kullanilarak burada açiklanan tedavi metotlarinda aktivitesi için ve uygulanabilirligi bakimindan taranabilmektedir.
Diger kovalent modifikasyonlar Antikorun kovalent modifikasyonlari ayni zamanda bu açiklamanin kapsami içerisine ilave edilir. Kimyasal sentez ile veya antikorunr enzimatik 'veya, kimyasal, yarilmasi ile, mevcut ise yapilabilmektedir. Antikorun kovalent modifikasyonlarin diger tipleri, seçilmis yan zincirler veya N- veya 0- uç kalintilar ile tepkimeye girebilme yetenegi bulunan bir organik tüetici ajan ile antikorun hedeflenen amino asit kalintilarin tepkimeye girmesiyle molekül içine girmektedir.
Sisteinil kalintilari, karboksimetil veya karboksiamidometil türevlerinin verilmesi için kloroasetik asit veya kloroasetamid gibi d-haloasetatlar ile (ve ilgili aminler) yaygin olarak tepkimeye girmektedir. Sisteinil kalintilari ayrica bromotrifloroaseton, alfa-bromo-ß-(5-imidozoil)propiyonik asit, kloroasetil fosfat, N-alkilmaleimitler, 3-nitro-2-piridil disülfid, metil 2-piridil disülfid, p-kloromerküribenzoat, 2- kloromerküri-4-nitrofenol veya kloro-7-nitrobenzo-Z-oksa-l,3- diazol ile tepkime yoluyla türevlendirilmektedir.
Histidil kalintilari, dietilpirokarbonat pH 5,5-7,0'de ile tepkime yoluyla türevlendirilmektedir, çünkü bu ajan, histidil yan zinciri için nispeten spesifiktir. Parabromofenasil bromür de yararlidir; reaksiyon, tercihen pH 6,0'da 0,1 M sodyum kakodilat içinde gerçeklestirilir.
Lizinil ve amino ucu kalintilari, süksinik veya baska karboksilik asit anhidritleri ile tepkimeye sokulur. Bu ajanlar ile türevlendirme, lizinil kalintilarinin yükünü tersine çevirme etkisine sahiptir. Alfa amino içeren kalintilarin türevlendirilmesi için diger uygun ayiraçlar arasinda, imidoesterler örnegin metil pikolinimidat, piridoksal fosfat, piridoksal, kloroborohidrit, trinitrobenzensülfonik asit, O- metilisoüre, 2,4-pentandion ve glioksilat ile transaminaz katalizli reaksiyon bulunmaktadir.
Arjinil kalintilari, bir veya birkaç geleneksel tepkime maddesi, bunlarin arasinda fenilglioksal, 2,3-bütandion, 1,2- sikloheksandion ve ninhidrin ile tepkimeye sokularak modifiye edilir. Arginin kalintilarinin türevlendirilmesi, tepkimenin, guanidin fonksiyonel grubunun yüksek ;pKa'si nedeniyle alkali kosullarda yapilmasini gerektirir. Ayrica bu ayiraçlar, arginin epsilon-amino grubunun yani sira lisin gruplari ile tepkimeye girebilir.
Tirozil kalintilarinin spesifik modifikasyonu, özellikle aromatik diazonyum bilesikleri veya tetranitrometan ile özel ilgi ile tepkimeye sokularak spektral etiketlerin tirozil kalintilarina sokulmasiyla yapilabilmektedir. En yaygin olarak, N-asetilimidizol ve tetranitrometan, sirasiyla, O-asetil tirosil türlerinin ve 3-nitro türevlerinin olusturulmasi için kullanilmaktadir. Tirosil kalintilari, radyo aktif immüno analiz için etiketlenmis proteinlerin hazirlanmasi için 1%1 veya in: kullanilarak iyonize edilmistir.
Karboksil yan gruplari (aspartil veya glutamil), R ve R"nin l- sikloheksil-S- (2-morfolinil-4-etil) karbodiimid veya l-etil-3- (4-azonia-4,4-dimetilpentil)karbodiimid gibi farkli alkil10 gruplari oldugu karbodiimidler (R-N.dbd.C.dbd.N-R') ile tepkime yoluyla seçici sekilde modifiye edilmektedir. Ayrica, aspartil ve glutamil kalintilari, amonyum iyonlari ile tepkimeye sokularak asparaginil ve glutaminil kalintilarina dönüstürülmektedir.
Glutaminil ve asparaginil kalintilar, sirasiyla karsilik gelen glutamil ve aspartile siklikla deamide edilmektedir. Bu kalintilar, nötr veya bazik kosullar altinda deamide edilmektedir. Bu kalintilarin deamine formu, açiklamanin kapsami içerisinde yer alir.
Diger modifikasyonlar arasinda prolin ve lizinin hidroksilasyonu, seril veya treonil kalintilarinin hidroksil gruplarinin fosforilasyonu, lizin, arginin ve histidin yan zincirlerinin alfa-amino gruplarinin metilasyonu (T. E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, s. 79-86 (l983)), N ucu aminin asetilasyonu ve C ucu karboksil asit grubunun amidlenmesi Baska bir kovalent modifikasyon tipi, glikozitlerin kimyasal olarak veya enzimatik olarak antikora kenetlenmesidir. Bu prosedürler avantajli olup Öyle ki, N- veya 0- bagli glikozilasyonu için glikozilasyon kapasitelerine sahip olan bir konakçi hücre içinde antikorun üretimine gerek duymamaktadir.
Kullanilan eslesme yöntemine bagli olarak, seker(ler), (a) arjinin ve histidin'e, (b) serbest karboksil gruplari, (0) sisteinin olanlar gibi serbest sülfhidril gruplari, (d) serin, treonin veya hidroksiprolin'in olanlar gibi serbest hidroksil gruplari, (e) fenilalanin, tirosin veya triptofan'in olanlar gibi aromatik kalintilar veya (f) glutamin'in amid grubuna baglanabilmektedir. Bu yöntemler, ll Eylül 1987'de yayinlanan WO87/05330'da ve Aplin ve Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., s.
Antikor üzerinde mevcut olan herhangi karbohidratin ayrilmasi kimyasal olarak veya enzimatik olarak gerçeklestirilebilmektedir. Kimyasal deglikozilasyon, bilesik triflorometanesülfonik aside veya esdeger bir bilesige antikorun maruz kalmasini gerektirmektedir.
Bu islem, antikor intakt ayrilirken, baglayici seker hariç (N- asetilglukosamin veya N-asetilgalaktosamin) bütün sekerlerin veya sekerlerin bir çogunun yarilmasiyla sonuçlanir. Kimyasal deglikozilasyon, Hakimuddin, ve dig. Arch. BiOChEHL Biophys. yayinlarinda tarif edilmektedir. Antikorlar üzerinde karbohidrat kisimlarin enzimatik yarilmasi, Thotakura ve dig. Meth. Enzymol. çesitli endo- ve ekzo-glikozidazlarinin kullanimi ile gerçeklestirilir.
Baska bir antikor kovalent modifikasyon tipi, örnegin, polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksietile edilmis polioller, polioksietile edilmis sorbitol, polioksietile edilmis glukoz, polioksietile edilmis gliserol, polioksialkilenler veya dekstran gibi polisakkarit polimerler gibi çesitli proteinsiz polimerlerin birine antikorun baglanmasini içermektedir. Bu yöntemler, teknikte bilinmektedir, bkz. örn. U.S. Patent No. 315 456.
Gen Terapisi Uygun hücrelere terapötik bir antikorun tasinmasi, fiziksel DNA transfer metotlarinin kullanilmasiyla (örnegin, lipozomlar veya kimyasal tedaviler) veya viral vektörlerin kullanilmasiyla (örnegin, adenovirüs, adeno ile alakali virüs veya bir retrovirüs) dahil teknikte bilinen herhangi uygun yaklasimin kullanilmasiyla ex vivo, in situ veya in 'vivo gen terapisi araciligiyla etkilenmis olabilmektedir. Örnegin, in vivo terapi için, arzu edilen antikoru kodlayan bir nükleik asit, ya tek basina ya da bir vektör, lipozom veya çökelek ile birlikte denek içerisine dogrudan enjekte edilir ve antikor bilesiginin ifadesinin arzu edildigi yerdeki alanda enjekte edilebilmektedir. Ex vivo tedavi için, deneklerin hücreleri ayrilir, nükleik asit bu hücreler içerisine sokulur ve modifiye edilmis hücreler ya dogrudan ya da örnegin, hastaya implante edilen delikli membranlar içerisine kapsüle edilmis olarak bireye geri döner. Bkz. örn. U.S. Pat. No'lar. 4,892,538 ve ,283,187 sayili belgeler. Canli hücreler içerisine nükleik asitlerin girmesi için çesitli teknikler bulunmaktadir.
Teknikler, nükleik asitlerin, tasarlanan konakçinin hücreleri içerisindeki in vitro ya da in vivo kültürlenmis hücreler içerisine transfer edilip edilmedigine bagli olarak degisir. In vitro memeli hücreler içerisine nükleik asidin transferi için uygun teknikler, lipozomlar, elektroporasyon, mikroenjeksiyon, hücre füzyon, DEAE-dekstran ve kalsiyum fosfat çökelegin kullanimini içermektedir. Bir nükleik asidin ex vivo tasinmasi için yaygin olarak kullanilan bir vektör bir retrovirüstür.
Diger in Vivo nükleik asit transfer teknikleri arasinda viral vektörler (adenovirüs, Herpes simpleks 1 virüsü veya adeno ile iliskili virüs gibi) ve lipide dayali sistemler ile transfeksiyonu bulunmaktadir. Nükleik asit ve transfeksiyon ajani opsiyonel olarak mikro tanecik ile iliskilidir. Örnek niteligindeki transfeksiyon ajanlari arasinda, kalsiyum fosfat veya kalsiyum klorür birlikte çöktürme, DEAE-dekstran aracili transfeksiyon, kuaterner amonyum amfifil DOTMA ((dioleoiloksipropil) trimetilamonyum. bromid, GlBCO-BRL tarafindan Lipofectin olarak satisa sunulmustur))(Felgner ve v.d. (; pendan trimetilamonyum baslarina sahip lipofilik glutamat diesterler Örnegin katyonik lipit dioktadesilamid glisilspermin (DOGS, Transfectam, Promega) ve dipalmitoilfosfatidil etanolamiyelspermin (DPPES) gibi metabolize edilebilir ana P. Behr V.d. (: metabolize edilebilir kuaterner amonyum tuzlar (DOTB, N-(l-[2,3- dioleoiloksi]propil)-N,N,N-trimetilamonyum metilsülfat (DOTAP)(Boehha1kaer Mannheinû, polietilenimin (PEI), dioleoil esterler, ChoTB, ChoSC, DOSC)(Leventis V.d. (1990) Biochim. dimetilaminoetan)-karbamoil]kolesterol (DC-Chol), dioleoilfosfatidil etanolamin (DOPE)/3beta[N-(N',N'- dimetilaminoetan)-karbamoi1]kolesterolDC-Chol (Gao ve dig., lipopoliaminler (Behr ve dig., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382- BiochimJ Biophys. Acta 939, 8-18), artik fosfatidilkolin/kolesterol ile birlikte [[(1,1,3,3- tetrametilbutil)cre-soksi] etoksi]etil]dimetilbenzilamonyum hidroksit (DEBDA hidroksit) (Balias ve dig., (1988) Biochim.
Biophys. Acta 939, 8-18), setiltrimetilamonyum bromit (CTAB)/DOPE karisimlari (Pinnaduwage ve dig, (1989) Biochim.
Biophys. Acta 985, 33-37), fosfatidiletanolamin ile karisim içindeki DOPE, CTAB, DEBDA, didodesilamonyum bromit (DDAB) ve stearilamine sahip glutamik asitin (TMAG) lipofilik diesteri (TransfectACE, GIBCO BRL) ve oligogalaktoz tasiyan lipitler bulunmaktadir. Transfer etkinligini arttiran önek niteligindeki transfeksiyon gelistirici ajanlar arasinda, örnegin, DEAE- dekstran, polibren, lizozom yikici peptit (Ohmori N 1 ve dig, kondroitan bazli proteoglikanlar, sülfize proteoglikanlar, polietilenimin, polilisin (Pollard H V.d. J Biol Chem, 1998 273 (l3):7507-ll), integrinr baglayici peptidr CYGGRGDTP, dogrusal dekstran nonasakkarit, gliserol, bir oligonükleotidin 3' ucundaki internükleosid baginda baglanmis kolesteril gruplari (Letsinger, R. L. , lizofosfatit, lizofosfatidilkolin, lizofosfatidiletanolamin ve 1-oleoi1 1izofosfatidilkolin bulunmaktadir.
Bazi durumlarda, hedef hücrelere nükleik asit içeren vektörü yönlendiren bir ajan ile nükleik asidin tasinmasi arzu edilebilmektedir. Bu “hedefleyici” moleküller, hedef hücre üzerindeki hücre-yüzeyi membran proteini için spesifik antikorlari veya hedef hücre üzerindeki bir reseptör için ligand içermektedir. Lipozomlar uygulandigi yerde, endositoz ile birlikte bir hücre-yüzeyi membran proteine baglanan proteinler hedef' için ve/Veya geri alima olanak saglanmasi için kullanilmaktadir. Bu proteinlerin örnekleri arasinda, belirli hücre tipi için tropik. olan kapsid. proteinleri ve bunlarin fragmanlarini, döngü içinde içsellestirmeye maruz kalan proteinlere yönelik antikorlar ve hücre içi lokalizasyonu hedefleyen ve hücre içi yari ömrünü gelistiren proteinler bulunmaktadir. Alternatif olarak, reseptör-aracili endositler kullanilabilmektedir. Benzeri metotlar, örnegin, Wü ve dig., 1987 veya Wagner ve dig., 1990 yayinlarinda tarif edilmektedir.
Simdilerde bilinen gen isaretleyici ve gen terapi protokollerinin incelenmesi için bakiniz Anderson 1992 sayili belge. Bakiniz ayni zamanda WD 93/25673 sayili belge ve bunlarin içinde alinti yapilmis referanslar. Gen terapi teknolojilerin Tarama Metotlari Etkili terapötikler, önemli ölçüde toksisiteden yoksun etkili ajanlarin tanimlanmasina baglidir. Antikorlar teknikte bilinen metotlar ile baglanma affinitesi bakimindan taranabilmektedir. Örnegin Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley blotlari, radyoaktif olarak etiketlenmis rekabet testi, kromatografi yoluyla birlikte fraksiyonasyon, birlikte çöktürme, çapraz baglama ELISA ve benzerleri kullanilabilmektedir.
M-CSF üzerinde istenilen epitopa (örn. RXl, 5H4, MCl ve/Veya MC3'ün M-CSF'ye baglanmasini engelleyen epitopa) baglanan antikorlarin ilk olarak taranmasi için, örnegin Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow ve David Lane (1988) yayininda tarif edilen rutin bir çapraz engelleme testi kullanilabilmektedir. Burada açiklanan sekilde bilinmeyen antikorun, M-CSF'nin bir` M-CSF spesifik antikora baglanmasini engelleme yetenegi ile karakteri edildigi rutin rekabetçi baglanma testleri kullanilabilmektedir. Intakt M-CSF, bunlarin fragmanlari veya lineer epitoplar, örnegin, Sekil 12'de yer alan M-CSF'nin amino asitleri 98-105 veya Sekil 12'de yer taninan M-CSF epitoplara karsilik gelir) ile temsil edilenler kullanilmaktadir. Epitop haritalama, Champe ve dig., J. Biol.
Ayrica, antikorlarin, osteoklastojenez üzerindeki etkileri için test edilmesi ve ardindan hayvanlara uygulanmasi tasarlanmistir. kanser metastazi ile iliskili kemik kaybinin tedavi edilmesi veya önlenmesinde potansiyel olarak yararli bilesikler çesitli deneyler kullanilarak taranir. Mesela, bir aday antagonisti, ilk olarak osteoklastgenezin tetiklenmesinde M-CSF'yi notralize etme kabiliyetinin tespit edilmesi için kültürlenmis bir hücre sisteminde karakterize edilir. Bu sistem, fare kalvaryal osteoblastlar` ve dalak hücrelerinin birlikte kültürlenmesini (Suda ve dig., Modulation of osteoclast differentiation. Endocr.
Metab. 9: 6-12, l998),fare stromal hücre hatlarinin birlikte kültürlenmesini (örn. MC3T3-G2/PA6 ve ST2) ve fare dalak ve ST2 hücreleri ve kemik iligi hücreleri, periferik kan mononükleer> hücreleri veya alveolar` mokrofajlarinin. birlikte kültürlenmesini (Udagawa ve dig., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: içerebilmektedir. Herhangi M-CSF antagonistin yoklugunda, benzeri birlikte-kültürlerde olusturulan çok çekirdekli hücreler, örnegin, tartrat dirençli asit fosfataz (TRAP, osteoklastlarin bir isaretleyici enzimi) aktivitesi, kalsitonin reseptörleri, p60C-STC, vitronektin reseptörler gibi osteoklastlarin en önemli kriterini karsilamaktadir ve kemik ve dentin dilimleri üzerinde resorpsiyon çukurluklari olusturmak için yetenegi karsilamaktadir. Etkili bir M-CSF antagonistinin bulunmasi, böyle çok çekirdekli hücrelerin olusmasini engellemektedir.
Yukaridaki birlikte kültür sistemlerine ilaveten, bir aday M- CSF antikorunun osteoklastogenezin inhibe etme yetenegi, bir stromal hücresi içermeyen veya osteoblast içermeyen sistemde analiz edilebilmektedir. Osteoklastogenez için gereken M-CSF, metastatik kanser hücrelerin (örnegin MDA 231) veya bu kanser hücrelerden kosullu ortamin birlikte- kültürlenmesiyle (Mancino ve dig., J. Surg. Res. 0: 18-24, 2001) veya saflastirilmis M- CSF'nin ilavesi ile elde edilebilmektedir.
Belirli bir M-CSF antikorunun kanser metastazi ile iliskili kemik kaybinin önlenmesi veya tedavi edilmesindeki etkinligi, ayni zamanda teknikte yetkin kisilere asikar olan hayvan kemik metastaz model sistemlerinden herhangi birinde test edilebilmektedir. Bu model sistemleri arasinda, tümör hücrelerinin kemiklerin ilik kavitesine (Ingall, Proc. Soc. Exp. 1982), siçan abdominal aortuna (Powles ve dig., Br. J. Cancer dogrudan enjekte edilmesini içeren sistemler de bulunmaktadir.
Bir etkili M-CSF antagonistinin yoklugunda, enjekte edilmis tümör hücrelerinden olusturulan osteolitik kemik metastazlari radyograflar (osteolitik kemik lezyon alanlari) veya histoloji ve immünohistokimya (kemik ve yumusak dokular) ile mevcudiyetinde, osteolitik kemik metastazlari, az ve/veya küçük metastazlarla sonuçlanmasi inhibe edilmekte veya Önlenebilmektedir.
Mevcut açiklamanin M-CSF antikorlari ayni zamanda kanser metastazin tedavi edilmesinde ve Önlenmesinde kullanilmis olabilmektedir. Kanser metastazin tedavi edilmesinde veya önlenmesinde bir aday M-CSF antikorunun verimliligi, Filderman gibi bir insan amniyonik bazal membran isgal modeli kullanilarak taranabilmektedir. ilaveten, çesitli kanser türlerinin metastazi için hayvan modeli sistemlerinden herhangi biri de kullanilabilir. Benzer model sistemleri, ancak bunlarla sinirli kalmamak uzere, Wenger ve dig., Clin. Exp. Metastasis 19: 169 içermektedir. Etkili bir M-CSF antikorunun mevcudiyetinde, kanser metastazlarinin az ve/veya küçük metastazlarla sonuçlanmasi inhibe edilmekte veya önlenebilmektedir.
Belirli bir M-CSF antikorunun anti-tümör aktivitesi veya M-CSF antikorlarin kombinasyonu, uygun bir hayvan modelinin in vivo kullanilmasiyla degerlendirilebilmektedir. Örnegin, insan lenfoma hücrelerinin, örnegin çiplak veya SCID fareleri gibi bagisikliktan zarar gören hayvanlara sokuldugu ksenojenik lenfoma kanseri modelleri. Verimlilik, tümör olusumunun inhibisyonunu, tümör regresyon veya metastazi ölçülen deneyler ve benzerleri kullanilarak tahmin edilmektedir.
Bir in vitro deneyin bir varyasyonunda, söz konusu açiklama, (a) hareketsiz bir M-CSF'nin bir aday antikoru ile temas ettirilmesi ve (b) aday antikorun M-CSF'ye baglanmasinin tespit edilmesi adimlarini içeren bir metodu içermektedir. Alternatif olarak, aday antikor hareketsiz olmaktadir ve M-CSF'nin baglanmasi tespit edilmektedir. Immobilizasyon, teknikte iyi bilinen metotlarin herhangi birinin, ilaveten bir destek, bir boncuk veya bir kromatografik reçineye kovalent baglanma, yani sira bir kovalent olmayan, antikor baglanma gibi yüksek affinite etkilesimi veya sterptavidin/biyotin baglanmasinin kullanimi kullanilarak gerçeklestirilmekte olup, burada hareketsiz bilesik bir biyotin kismini içermektedir. Baglanmanin tespit edilmesi, (i) hareketsiz olan bilesikte bir radyoaktif etiketin kullanilmasi (ii) hareketsiz olmayan bilesikte bir floresan etiketin kullanilmasi, (iii) hareketsiz olmayan bilesik için immünospesifik bir antikorun kullanilmasi, (iv) hareketsiz bilesigin baglandigi bir floresan destegi uyaran hareketsiz Olmayan bilesik üzerinde bir etiket kullanilmasinin yani sira teknikte iyi bilinen ve teknikte rutin olarak uygulanan diger teknikler ile gerçeklestirilmektedir.
M-CSF'nin aktivitesini veya ifadesini modüle eden (örnegin, yükselme, düsürme veya bloke etme) antikorlar, bir M-CSF ifade eden bir hücre ile varsayimsal bir modülatorün enkübe edilmesiyle ve M-CSF'nin ifadesi veya aktivitesi üzerinde varsayimsal modülatörün etkisinin belirlenmesi ile tanimlanmaktadir. Bir M-CSF polipeptidin veya polinükleotidin aktivitesini modüle eden bir antikorun seçiciligi, M-CSF polipeptid veya polinükleotid üzerindeki etkilerinin, diger ilgili bilesikler üzerindeki etkileriyle karsilastirilmasiyla degerlendirilmektedir. Seçici modülatörler örnegin, antikorlari ve diger proteinleri, peptidleri veya organik molekülleri içermekte olup bunlar özellikle M-CSF polipeptidlere veya bir M- CSF polipeptidi kodlayan bir nükleik aside baglanmaktadir. M- CSF aktivitesinin modülatörleri, içerisinde M-CSF polipeptidin normal veya anormal aktivitesinin kapsandigi fizyolojik kosullar ve hastaliklarin tedavisinde terapötik olarak kullanilabilmektedir.
Açiklama ayni zamanda, bir M-CSF polipeptidin ile etkilesimde olan veya biyolojik aktivitesini inhibe eden (örnegin, enzimatik aktivitesini, baglanma aktivitesini ve benzerlerini inhibe eden) antikorlarin tanimlanmasi için yüksek verimli tarama (HTS) deneylerini kapsamaktadir. HTS deneyleri, çok sayida bilesigin verimli bir sekilde taranmasina olanak saglar. Hücre-bazli HTS sistemleri, M-CSF polipeptidleri ve bunlarin baglanma partnerleri arasindaki etkilesimin arastirilmasi için tasarlanmaktadir. HTS deneyleri, modifikasyonlarin istenilen özelliklerin gelistirilmesi için tasarlandigindan istenilen özelliklere sahip “taslar" veya “kursun bilesikler”in tanimlanmasi için dizayn edilir. yapi/aktivite iliskisine baglidir.
Mevcut bulusun bir baska görünümü, bir M-CSF'nin bir antikor ile temas ettirilmesini ve söz konusu antikorun M-CSF aktivitesini degistirip degistirmedinin belirlenmesini içeren, bir M-CSF aktivitesini modüle eden (baska bir deyisle azaltan) antikorlarin tespit edilmesine yönelik Inetotlara yöneliktir.
Test antikorunun mevcudiyetindeki aktivite test antikorunun yoklugundaki aktivite ile karsilastirilir. Test antikoru içeren numunenin aktivitesi, test aktivitesinden yoksun numune içindeki aktiviteden daha düsük oldugunda, antikor inhibe edilmis aktiviteye sahiptir.
Teknikte tecrübeli kisilerce iyi bilinen rekombinant polipeptitlerin fonksiyonel ifadesi için çesitli heterolog sistemler mevcuttur. Bu sistemler, bakteri (Strosberg, ve dig., hücrelerinin birkaç çesitleri (Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology memeli hücre hatlari (CHO, HEK293, COS, vb. içermektedir; bkz.
Gerhardt ve idig., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:l-23). Bu örnekler, nematodlardan elde edilen hücre hatlari dahil diger olasi hücre ifade sistemlerinin kullanimini engellemez (PCT basvurusu WO 98/37177).
Ayrica burada, M-CSF aktivitesini modüle eden antikorlarin taranmasi için yöntemler açiklanmakta olup, söz konusu yöntem, bir M-CSF polipeptidi ile test antikorlarinin temas ettirilmesini ve antikor ve M-CSF arasinda bir kompleks varliginin analiz edilmesini içerir. Benzeri deneylerde, ligand tipikr olarakr etiketlenir. Uygun enkübasyon sonrasi, serbest ligand, bag formunda mevcut olandan ayrilmaktadir ve serbest veya kompleks olmayan etiket miktari, belirli antikorun M-CSF veya M-CSFR polipeptide baglanma yetenegine dair bir ölçümdür.
Bir M-CSF polipeptide uygun baglanma affinitesine sahip CDR'ler veya antikor fragmanlari için yüksek verimli tarama uygulanabilmektedir. Özetle, çok sayida farkli küçük peptid test bilesikleri bir kati substrat üzerinde sentezlenir. Peptid test antikorlari bir M-CSF polipeptid ile temas ettirilir ve yikanir.
Bagli M-CSF polipeptitleri daha sonra teknikte iyi bilinen yöntemler ile saptanir. Açiklamanin saflastirilmis polipeptitleri ayrica, yukarida bahsedilen ilaç tarama tekniklerinde kullanilmak üzere dogrudan plakalarin içine kaplanabilir. Ayrica nötrlestirici olmayan antikorlar, proteini yakalamak ve kati destek üzerinde immobilize etmek için kullanilabilir.
Kombinasyon Terapisi Bir hayvan modelinde etkili olan birden fazla M-CSF antikoru tanimlandiktan sonra, kanser metastazi ve/veya kanser metastaz ile ilgili kemik kaybina karsi halen gelistirilmis verimliligi saglamak için iki veya daha fazla M-CSF antikorunun birlikte karistirilmasi ayrica avantajli olabilir. Bir veya daha fazla M- CSF antikorunu içeren bilesimler, kanser metastazi ve/veya kanser metastaz ile ilgili kemik kaybindan muzdarip olan veya muzdarip olmaya yatkin olan memelilere veya kisilere tatbik edilebilmektedir. Iki terapötik ajanin es zamanli uygulanmasi, içerisinde ajanlarin kendi terapötik etkilerini güç kullanildigi siradaki bir zaman periyodunda bir örtüsme olana kadar ajanlarin ayni zamanda veya ayni yöntemle uygulanabildigini gerektirmemektedir. Es zamanli ve sirali uygulama. ve ayrica farkli günler ve haftalarda uygulama tasarlanmistir.
M-CSF antikor terapisinin, kanserlerin her safhasinda kullanabilmesine ragmen, antikor terapisi özellikle gelismis veya metastatik kanserlerde uygun olabilmektedir. Kemoterapötik tedavi almayan hastalarda antikor terapisi metodunun bir kemoterapötik veya radyasyon rejimi ile birlestirilmesi tercih edilirken, bir veya daha fazla kemoterapi almis hastalar için antikor terapisi ile tedavi belirtilebilir. Ek olarak, antikor terapisi, özellikle kemoterapötik ajanin toksisitesini çok iyi tolere etmeyen hastalarda, eszamanli kemoterapi dozlarinin Tek anti-M-CSF antikorlarinin yani sira farkli antikorlarin kombinasyonlari veya “kokteyller”inin uygulanmasi burada tasarlanmistir. Bu antikor kokteylleri, immün efektör islevselligi üzerine dayanilan antikorlar ile sitotoksik antikorlari dogrudan kombine eden veya farkli efektör mekanizmalari kullanan antikorlari içerdigi sürece bazi avantajlara sahiptir. Kombinasyon halindeki bu antikorlar, sinerjistik terapötik etkiler sergilemektedir.
Diger terapötikler ile RXl veya RXl antikorunun Insan MühendislikTM türevinin kombine edilmesi, osteoklastik hastalik ve/veya tümör büyümesi veya metastazi deneyimleyen bir hasta üzerinde bir etkiye sahiptir. Örnegin, bir osteolitik hastaliga sahip bir hastanin, tedavisi için, bir ilacin üretiminde RXl antikoru kullanilabilir, burada söz konusu ilaç bir anti-RANKL antikoru, çözünür RANKL reseptörü, diger RANKL inhibitörleri veya bisfosfonatlar (örn. Aredia; Zometa; Clodronate) kullanilarak koordine edilebilmektedir. Alternatif olarak, kisi, bir osteolitik hastaliga sahip bir hastanin tedavi edilmesi için bir ilacin üretiminde bir anti-RANKL antikor veya bifosfonat kullanabilmekte olup, burada bahsedilen ilaç, RXl antikoru veya RXl antikorunun insan mühendislik türevi kullanilarak tedavi ile koordine edilmektedir. Kombinasyon ayni zamanda tedavi edilmis hastada bir sinerjistik etkiye sahiptir. RXl antikoru ve diger terapötiklerin ayni anda uygulanmasina gerek yoktur. RXl veya insan mühendislik varyanti veya diger terapötik maddeler, l gün, 1 hafta, 2 hafta, 4 hafta, 2 ay, 3 ay, 6 ay, 1 yil veya iki yil içinde uygulanabilmektedir.
Ayrica, bir osteolitik hastaliga sahip olan bir hastanin tedavi edilmesine yönelik bir ilacin üretiminde bir RXl antikorunun veya bir RXl antikorunun bir Insan MühendislikTM türevinin kullanilmasi da tasarlanmis olup, burada söz konusu ilaç bir anti-RANKL antikoru veya bisfosfonatlar ile önceden tedavi edilmis bir hastada kullanilmaktadir. “Önceden tedavi” terimi, hastanin, RXl veya RXl'in Insan MühendislikTM varyanti ile tedavisinden önce 2 yil, 1 yil, 6 ay, 3 ay, 2 ay, 1 ay, 2 hafta, 1 hafta veya en az bir gün içinde tedavi edilmis olmasidir.
RXl ve Insan MühendislikTM varyantlari, diger kanser terapötikleri ile kombinasyon halinde kullanilabilmektedir. Örnegin bir kimse, kanser hastaligina sahip bir hastanin tedavi edilmesine yönelik bir ilacin üretiminde RXl antikorunu ve insan mühendislik varyantlarini kullanabilmekte olup, burada söz konusu ilaç, bunlarla sinirli kalmamakr üzere, çesitli kemoterapötik ajanlar, androjen engelleyiciler` ve immün modülatörler (örn. IL-2, GM- CSF, SLC), Bisfosfonat(lar) (örn.
Aredia; Zometa; Klodronat), cerrahi, radyasyon, sitotoksik kemoterapi, hormon terapisi (örn. Tamoksifen; anti-Androjen terapisi), antikor terapisi (örn. RANKL/RANK nötralize edici antikorlar; PTHrP nötralize edici, anti-HerZ, anti-CDZO, anti- CD40, CD22, VEGF, lGFR-l, EphA2, HAAH, TMEFFZ, CAIX antikorlar), terapötik protein terapisi (örn. çözünür RANKL reseptörü; OPG ve PDGF ve MMP inhibitörleri), küçük moleküllü ilaç terapisi (örn.
Src-kinaz inhibitörü), büyüme faktörü reseptörlerinin kinaz inhibitörleri veya RANKL inhibitörleri, oligonükleotid terapisi (örnegin, RANKL veya RANK veya PTHrP Anti-sens), gen terapisi (örn. RANKL veya RANK inhibitörleri), peptid terapisinin (örnegin RANKL muteinler) yani sira burada tarif edilen proteinler, peptidler, bilesikler` ve küçük moleküller` dahil diger terapötik ajanlar ve/veya prosedürler kullanilarak tedavi ile koordine edilmektedir.
RXl ve Insan MühendislikTM varyantlari, yukarida bahsedilen terapötikler ile önceden tedavi edilmis olan hastalarin tedavi edilmesi için bir ilacin üretiminde kullanilir.
Bir sitotoksik ajan, hücrelerin islevini önleyen veya inhibe eden ve/veya hücrelerin yikimina neden olan bir madde anlamina gelmektedir. Söz konusu terim, radyoaktif izotoplari (ör. 115,11Ü, Y%]ve Re1%), kemoterapötik ajanlari ve bakteri, mantar, bitki veya hayvan kaynakli bir enzimatik olarak aktif toksin veya sentetik. toksinler gibi toksinleri veya bunlarin fragmanlari içerecek sekilde kullanilmistir. Bir sitotoksik olmayan ajan, hücrelerin islevini önlemeyen veya inhibe etmeyen ve/veya hücrelerin yikimina neden olmayan bir madde anlamina gelmektedir. Bir sitotoksik olmayan ajan, sitotoksik olmasi için aktive edilebilen bir ajani içermektedir. Bir sitotoksik olmayan ajan, bir boncuk, lipozom, matriks veya tanecik içerebilmektedir Bu ajanlar, açiklamaya göre bir antikor ile konjüge edilebilmekte, eslenebilmekte, baglanabilmekte veya birlestirilebilmektedir.
Kanser kemoterapötik ajanlar arasinda, sinirlandirilma olmaksizin, alkilleyici ajanlar, örnegin karboplatin ve cisplatin gibi; nitrojen hardal alkilleyici ajanlar; nitrosoüre alkilleyici ajanlar, örnegin karmustin (BCNU) gibi; antimetabolitler, örnegin metotrekzat gibi; folinik asit; purin analog antimetabolitler, merkaptopurin; pirimidin analog antimetabolitler, örnegin fluorourasil (5- FU) ve gemsitabin (Gemzar®); hormonal antineoplastikler, örnegin goserelin, löprolid ve tamoksifen gibi; dogal antineoplastikler, örnegin aldeslökin, interlökin-Z, dosetaksel, etoposid (VP-16), interferon alfa, paklitaksel (Taxol®) ve tretinoin (ATRA) gibi; antibiyotik dogal antineoplastikler, örnegin bleomisin, daktinomisin, daunorubisin, doksorubisin, daunomisin ve mitomisinler gibi ilaveten mitomisin C; ve vinka alkaloid dogal antineoplastikler, örnegin vinblastin, vinkristin, vindesin gibi; hidroksiüre; aseglaton, adriamisin, ifosfamid, enositabin, epitiostanol, aklarubisin, ansitabin, nimustin, prokarbazin hidroklorid, karbokuon, karboplatin, karmofur, kromomisin A3, antitümor polisakkaridler, antitümor platelet faktörler, siklofosfamid (Cytoxin®), Sizofillan, sitarabin (sitosin arabinosid), dakarbazin, tioinosin, tiotepa, tegafur, dolastatinler, dolastatin analoglari örnegin auristatin, CPT-ll (irinotekan), mitozantron, Vinorelbine, teniposid, aminopterin, karminomisin, esperamisinler (bkz. örn. U.S. Patent No. broksuridin, busülfan, honvan, peplomisin, bestatin (Ubenimex®), interferon-ß, mepitiostan, mitobronitol, melfalan, laminin peptidler, lentinan, Koriolus versicolor ekstrakti, tegafur/urasil, estramustin (östrojen/mekloretamin) bulunmaktadir.
Ayrica, kanser hastalari için terapi olarak kullanilan ilave ajanlar arasinda EPO, G- CSF, gansiklovir; antibiyotikler, löprolid; Heperidin; zidovudin (AZT); Hmtantlar ve analoglar dahil 1'den 18'e kadar interlökinler; interferonlar veya sitokinler, örnegin interferonlar d, [5 ve y hormonlari gibi, örnegin luteinize edici hormonu salgilatan hormon (LHRH) ve analoglari gibi ve gonadotropin salgilatan hormon (GnRH); büyüme faktörleri, örnegin transforme edici büyüme faktörü-ß (TGF-ß), fibroblast büyüme faktörü (FGF), sinir büyüme faktörü (NGF), büyüme hormonu salgi faktörü (GHRF), epidermal büyüme faktörü (EGP), fibroblast büyüme faktörü homolog faktörü (FGFHF), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve insülin büyüme faktörü (IGF): tümör nekroz faktörü- d & ß (TNF- d & ß); invazyon inhibe edici faktörü-2 (IIF-2); kemik morfogenetik proteinler ; somatostatin; timosin-d-l; y-globulin; superoksid dismutaz (SOD); tamamlayici faktörler; anti-anjiogenez faktörleri; antijenik materyalleri ve ön-ilaçlar bulunmaktadir. Önilaç terimi, ana ilaca kiyasla tümör hücrelerine daha az sitotoksik olan ya da sitotoksik olmayan ve enzimatik olarak aktive edilebilen veya bir aktif veya daha fazla aktif ana forma dönüstürülebilen farmasötik. olarak aktif bir maddenin türev formu veya bir öncülü anlamina gelmektedir. Bkz. örn. Wilman, Stella ve dig., "Prodrugsz A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt ve dig., (ed.), s. kalmamak üzere, fosfat içeren önilaçlar, tiofosfat içeren önilaçlar, sülfat içeren Önilaçlari, peptid içeren Önilaçlari, D-aminoaside modifiye edilmis önilaçlar, glikozile önilaçlar, ß- laktam içeren önilaçlar, opsiyonel olarak ornatilmis fenoksiasetamid içeren önilaçlar veya opsiyonel olarak ornatilmis fenilasetamid içeren önilaçlar, 5-florosistosin ve diger 5-florouridin Önilaçlari içermekte olup daha fazla aktif sitotoksik serbest ilaca dönüstürülebilmektedir. Burada yer alan kullanima yönelik bir önilaç formuna türetilebilen sitotoksik ilaçlarin örnekleri, bunlarla sinirli kalmamak üzere, yukarida tarif edilen kemoterapötik ajanlari içermektedir. gygulama ve hazirlama Bulusun anti-M-CSF antikorlari, istenilen tasima Hßtodu için uygun bir tasiyiciyi içeren farmasötik bilesenlere formüle edilebilmektedir. Uygun tasiyicilar, anti-M-CSF antikorlari ile kombine edildiginde antikorun anti-tümör fonksiyonunu alikoyan herhangi bir materyali içermektedir ve bireyin immün sistemi ile reaktif degildir. Örnekler, bunlarla sinirli kalmamak üzere, steril fosfat ile tamponlanmis salin çözeltileri, bakteriostatik su ve benzeri gibi herhangi sayida standart farmasotik tasiyici içerir. Su, tamponlu su, %0,4 salin, %0,3 glisin ve benzerleri gibi çesitli sulu tasiyicilar kullanilabilir ve daha iyi stabilite için orta düzeyde kimyasal modifikasyonlar veya benzerlerine maruz kalmis albümin, lipoprotein, globulin, Vb. gibi baska proteinleri içerebilir.
Antikorun terapötik formülasyonlari, istenilen saflik dereesine sahip bir antikorun, istege bagli olarak farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizatörlerle karistirilmasiyla (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. baski, 0501, A. Ed. (1980)), liyofilize formülasyonlar veya sulu çözeltiler formunda saklanmak üzere hazirlanabilmektedir. Kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizörler, uygulanan dozaj ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik degildir ve bunlarin arasinda tamponlar, örnegin fosfat, sitrat ve diger organik, asitler; askorbik asit ve metiyonin dahil antioksidanlar; koruyucular (örnegin oktadesildimetilbenzil amonyum klorür; heksametonyum klorür; benzalkonyum klorür, benzetonyumý klorür; fenol, bütil veya benzil alkol; alkil parabenler, örnegin metil veya propil paraben; katekol; resorsinol; sikloheksanol; 3-pentanol; ve m-kresol); düsük molekül agirlikli (yaklasik 10 kalintinin altinda) polipeptidler; proteinler, örnegin serum albümin, jelatin veya immünoglobülinler; hidrofilik polimerler, örnegin polivinilpirolidon; amino asitler, örnegin glisin, glutamin, asparagin, histidin, arginin veya lizin; monosakaritler, disakaritler ve diger karbonhidratlar, örnegin glukoz, mannoz veya dekstrinler; selatlama ajanlari, örnegin EDTA; sekerler, örnegin sukroz, manitol, trehaloz veya sorbitol; tuz olusturan karsi iyonlar, örnegin sodyum; metal kompleksleri (örn. Zn- protein kompleksleri): ve/Veya iyonik olmayan yüzey aktif ajanlar, örnegin TWEEN”, PLURONICSTM veya polietilen glikol (PEG) bulunmaktadir.
Burada yer alan formülasyon ayni zamanda tedavi edilmis olan belirli endikasyon için gerekli olarak birden fazla aktif bilesigi, tercihen birbirlerini ters yönde etkilemeyen tamamlayici aktiviteler ile olanlari içermektedir. Mesela, ayrica immüno baskilayici ajanin saglanmasi istenmektedir. Bu tür moleküller, kullanim amaci için etkili olan miktarlarda, uygun sekilde kombinasyon halinde bulunabilir.
Ayrica söz konusu etken maddeler, mesela koaservasyon teknikleri veya interfasiyal polimerizasyon ile hazirlanan mikrokapsüllerin, örnegin hidroksimetilseluloz veya jelatin mikrokapsül ve poli-(metilmetasilat) mikrokapsülün, kolloidal ilaç ulastirma sistemlerinin (mesela lipozomlar, albümin mikro- kürecikler, mikro-emülsiyonlar, nanopartiküller ve nano-kapsül) veya makro-emülsiyonlarin içine dahil edilebilir. Bu teknikler, Remington's Pharmaceutical Sciences 16. baski, Osol, A. Ed. (1980) yayininda tarif edilmektedir. steril olmalidir. Sterillik, steril filtreleme membranlari içerisinden filtreleme yoluyla kolaylikla saglanir.
Antikor, parenteral, subkutanöz, intraperitonal, intrapulmoner ve intranazal dahil olmak üzere herhangi bir uygun yolla ve lokal tedavi için istenirse intralezyonal uygulama ile uygulanir.
Parenteral infüzyonlar arasinda intravenöz, intraarteriyel, intraperitonal, intramüsküler, intradermal veya subkutanöz uygulama yer alir. Ek olarak, antikor, özellikle antikorun azalan dozlari ile, nabiz infüzyonu ile uygun sekilde uygulanir.
Tercihen dozaj, kismen uygulamanin kisa veya kronik olup olmamasin bagli olarak enjeksiyonlar, en çok tercihen damar içi ya da deri alti enjeksiyonlar yoluyla verilmektedir. Topikal, Özellikle transdermal, transmukozal, rektal, oral veya lokal uygulama dahil olmak üzere, örnegin istenen yere yakin yerlestirilmis bir kateter yoluyla, diger uygulama yöntemleri tasarlanmistir.
Mevcut bulusun bilesimleri, örnegin, granüller, tozlar, tabletler, kapsüller, surup, fitiller, enjeksiyonlar, emulsiyonlar, eliksirler, süspansiyonlar veya çözeltiler formunda olabilmektedir. Mevcut bilesimler, örnegin oral uygulama ile, nazal uygulama ile, rektal uygulama ile, subkutan (deri alti) enjeksiyonu, intravenöz (damar içi) enjeksiyonu, intramuskuler` (kas içi) enjeksiyonu Aveya intraperitonal enjeksiyon gibi çesitli uygulama yöntemleri için formüle edilebilmektedir. Asagidaki dozaj formlari örnek olarak verilmistir ve mevcut bulusu sinirlayici olarak yorumlanmamalidir.
Oral, bukkal ve sublingual uygulama için, tozlar, süspansiyonlar, granüller, tabletler, haplar, kapsüller, jelkaplar ve kapletler kati dozaj formlari olarak kabul edilir.
Bunlar, örnegin, mevcut bulusun bir veya daha fazla bilesiginin karistirilmasiyla veya nisasta veya diger katki maddesi gibi en az bir katki maddesi ile farmasötik olarak kabul edilen tuzlari veya bunlarin totomerlerin bir veya daha fazla bilesiginin karistirilmasiyla hazirlanabilmektedir. Uygun katki Haddeleri arasinda sukroz, laktoz, selüloz sekeri, manitol, maltitol, dekztran, nisasta, agar, aljinatlar, kitinler, çitosanlar, pektinler, kitre zamki, arap zamki, jelatinler, kollajenler, kazein, albumin, sentetik veya yari-sentetik polimerler veya gliseridler bulunmaktadir. Opsiyonel olarak, oral dozaj formlari, uygulanmasinda yardimci olacak diger içerikleri içermektedir, örnegin, bir inaktif seyreltici gibi, magnezyum stearat gibi yaglayicilar veya paraben veya sorbik asit gibi koruyucular veya askorbik asit, tokoferol veya sistein gibi anti-oksidanlar, bir parçalayici ajan, baglayicilar, incelticiler, tamponlar, tatlandiricilar, lezzetlendirici ajanlar veya parfüm yapici ajanlar. Tabletler ve haplar ayrica teknikte bilinen uygun kaplama materyalleri ile islev görür.
Oral uygulama için sivi dozaj formlari, farmasötik olarak kabul edilen emülsiyonlar, suruplar, eliksirler, süspansiyonlar ve çözeltiler formunda olabilmekte olup su gibi bir inaktif seyrelticiyi içermektedir. Farmasötik formülasyonlar ve ilaçlar, örnegin, ancak bunlarla sinirli kalmamak üzere bir yag, su, bir alkol ve bunlarin kombinasyonlari gibi bir steril sivi kullanilarak. sivi süspansiyonlar veya çözeltiler olarak hazirlanir. Farmasötik olarak uygun sürfaktanlar, askiya alici ajanlar, emülsifiye edici ajanlar oral veya parenteral uygulama için ilave edilir.
Yukarida belirtildigi gibi, süspansiyonlar yaglari içerir. Bu yaglar arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere, findik yagi, susam yagi, pamuk tohumu yagi, misir yagi ve zeytin yagi bulunmaktadir. Süspansiyon preparasyonlar ayni zamanda örnegin, etil oleat, isopropil miristat, yagli asit gliseridler ve asetile yagli asit gliseridler gibi yagli asitlerin esterlerini içermektedir. Süspansiyon formulasyonlar, örnegin, bunlarla sinirli kalmamak üzere, etanol, isopropil alkol, hekzadesil alkol, gliserol ve propilen glikol gibi alkolleri içermektedir. Örnegin, bunlarla sinirli kalmamak üzere, poli(etilenglikol) gibi eterler, mineral yag ve petrol gibi petrol hidrokarbonlar; ve su ayni zamanda süspansiyon formülaSyonlarda kullanilabilmektedir.
Nazal uygulama için, farmasötik formülasyonlar ve ilaçlar, uygun çözücü(ler) ve opsiyonel olarak örnegin, bunlarla sinirli kalmamak üzere, stabilizörler, antimikrobiyal ajanlar, antioksidanlar, pH modifiye ediciler, sürfaktanlar, biyo uyumluluk modifiye ediciler ve bunlarin kombinasyonlari gibi diger bilesik(ler)i içeren bir sprey veya aerosol olabilmektedir. Bir aerosol formülasyon için bir püskürtücü, sikistirilmis hava, nitrojen, karbon dioksit veya hidrokarbon bazli düsük kaynama çözücü içermektedir.
Enjekte edilebilir dozaj formlari, genel olarak, sulu süspansiyonlar ya da yag süspansiyonlari Içermekte olup uygun bir dagitici veya islatici ajan ve bir süspansiyon ajani kullanilarak hazirlanabilir. Enjekte edilebilir formlar çözelti fazinda ya da bir süspansiyon formuna olabilmekte olup bir çözücü ya da seyreltici ile hazirlanmaktadir. Kabul edilebilir çözücüler veya araçlar, sterilize edilmis su, Ringer solüsyonu ya da izotonik, sulu tuzlu su çözeltisini içermektedir.
Alternatif olarak, steril yaglar, çözücüler ya da askiya alici ajanlar olarak uygulanabilmektedir. Tercihen, yag ya da yagli asit, dogal ya da sentetik yaglar, yagli asitler, mono-, di- veya tri-gliseritler de dahil uçucu olmaktadir.
Enjeksiyon için farmasötik formülasyon Ve/Veya ilaç, yukarida tarif edildigi gibi uygun bir çözelti ile sulandirilmak için uygun olan bir toz olabilmektedir. Bunlarin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere, dondurularak kurutulma, döndürülerek kurutulma ya da püskürtülerek kurutulmus tozlar, amorf tozlar, granüller, çökeltiler veya partiküller bulunmaktadir. Enjeksiyon için, formülasyonlar, stabilizölreri, pH modifiye ediciler, sürfaktanlar, biyo-uyumluluk modifiye ediciler ve bunlarin kombinasyonlarini içermektedir.
Rektal uygulama için, farmasötik formülasyonlar ve ilaçlar bir fitil, bir merhem, bir lavman, bir tablet veya bagirsaklarda sigmoid fieksur ve/veya rektum içinde bilesigin salinimi için bir krem formunda olabilmektedir. Rektal fitiller, örnegin kakao yagi veya polietilen glikol gibi kabul edilen araçlar ile bilesigin totomerleri veya farmasötik olarak kabul edilen tuzlari veya mevcut bulusun bir veya daha fazla bilesiklerin karistirilmasiyla hazirlanmakta olup normal saklama sicakliklarda bir kati fazda mevcuttur ve örnegin rektum gibi vücut içinde bir ilacin salinimi için uygun bu sicakliklarda sivi bir fazda mevcut olmaktadir. Yaglar ayni zamanda yumusak jelatin tip ve fitillerin formülasyonlarin hazirlanmasinda uygulanmaktadir. Su, salin, sulu dekstroz ve ilgili seker çözeltileri ve gliseroller, süspansiyon formülasyonlarin hazirlanmasinda uygulanmakta olup ayni zamanda pektinler, karbomerler, metil selüloz, hidroksipropil selüloz veya karboksimetil selüloz gibi askiya alici ajanlari yani sira tamponlari ve koruyuculari içermektedir.
Sürekli salim preparasyonlari hazirlanabilir. Sürekli salimli preparatlara dair uygun örnekler arasinda, söz konusu antikoru içeren kati hidrofobik polimerlerden olusan yari geçirgen matrisleri içermektedir ve söz konusu matrisler, sekillendirilmis ürünler, örnegin, filmler veya mikrokapsüller bulunur. Sürekli salimli matrislerin örnekleri arasinda polyesterler, hidrojeller (örnegin, poli(2-hidroksietil- metakrilat) veya poli(vinilalkol)), polilaktitler (0.8. Patent No. 3,773,919), L-glutamik asit ve y etil-L-glutamatin kopolimerleri, bozunmaz etilen-vinil asetat, bozunur laktik asit-glikolik asit kopolimerleri, örnegin Lupron DepotTM (laktik asit-glikolik asit kopolimeri ve löprolid asetattan olusan enjekte edilebilir mikro kürecikler) ve poli-D-(-)-3- hidroksibütirik asit bulunmaktadir. Etilen-Vinil asetat ve laktik asit-glikolik asit gibi polimerler, 100 gün boyunca moleküllerin salinmasina olanak verirken, bazi hidrojeller daha kisa zaman periyotlari için proteinleri salmaktadir.
Enkapsüllenmis antikorlar, uzun bir süre için vücut içinde kaldiginda, biyolojik aktivitede bir kayipla ve immünojenisitede muhtemel degisikliklerle sonuçlanarak, 37°C'de neme maruz kalmanin bir sonucu olarak denatüre veya birikebilir. Rasyonel stratejiler dahil olan mekanizmaya bagli olarak stabilizasyon için tasarlanmaktadir. Mesela, agregasyon mekanizmasinin, tiyo- disülfid degisimi vasitasiyla moleküller arasi S--S bagi olusumu tespit. edilirse, stabilizasyon, sülfhidril kalintilarinin modifiye edilmesiyle, asidik çözeltilerden liyofilize edilmesiyle, nem içeriginin kontrol edilmesiyle, uygun katki maddelerin kullanilmasiyla ve spesifik polimer matriks bilesimlerinin gelistirilmesiyle gerçeklesmektedir.
Açiklamanin fOrmülasyonlari, burada tarif edildigi gibi kisa sürede etkili, hizli salinimli veya uzun sürede etkili veya sürekli salinimli olacak sekilde tasarlanabilir. Ayrica, farmasötik formülasyonlar, ayni zamanda kontrollü salim için veya yavas salim için formüle edilebilir.
Mevcut bilesimler, ayni zamanda, Örnegin, miseller veya lipozomlar, veya baska bir diger enkapsüle formu içermektedir ya da uzun süreli bir depolama ve/veya dagitim etkinin elde edilmesi için genisletilmis bir salim formunda uygulanabilmektedir. Bu nedenle, farmasötik formülasyonlar ve ilaçlar, peletler veya silindirler halinde sikistirilabilmektedir ve depo enjeksiyonlar veya stentler gibi implantlar olarak kas içi ya da deri altindan implante edilebilmektedir. Benzeri implantlar, silikon ve biyolojik olarak parçalanabilen polimerler gibi bilinen etkisiz materyaller uygulanabilmektedir.
Yukarida tarif edilen bu temsili dozaj formlari yani sira, farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar ve tasiyicilar genel olarak teknikte tecrübeli kisiler tarafindan iyi bilinmektedir ve bu nedenle bu bulusta yer almaktadir. Bu eksipiyanlar ve tasiyicilar, örnegin "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991) yayininda tarif edilmektedir.
Spesifik dozajlar hastalik, yas, vücut agirligi, genel saglik kosullari, cinsiyet ve bireyin diyetine, doz araliklari, uygulama yollarina, bosaltim orani kosullarina bagli olarak ve ilaçlarin kombinasyonlarina bagli olarak ayarlanabilmektedir.
Etkili Hdktarlari içeren yukaridaki dozaj formlarin herhangi biri, rutin deneyleme sinirlari içerisinde iyi olmaktadir ve böylece mevcut açiklamanin kapsami içerisinde de iyi olmaktadir.
Kanser metastazlari ile ilgili kemik kaybi veya kanser metastaz için terapötikler olarak kullanilan M-CSF antikorlar, çogu zaman, diger dogal olarak olusan immünoglobülin veya diger biyolojik moleküllerden büyük bir oranda bagimsiz olarak hazirlanmaktadir. Tercih edilmis M-CSF antikorlar ayni zamanda, kemik kaybi ve/Veya kanser metastazdan muzdarip olan veya bunlara maruz kalmaya yatkin olan bir memeliye uygulandiginda minimal toksisite sergilemektedir.
Açiklamanin bilesimleri, geleneksel, iyi bilinen sterilizasyon teknikleri ile sterilize edilebilmektedir. Sonuçlanan çözeltiler kullanim için paketlenir ya da aseptik kosullar altinda filtrelenir ve liyofilize edilebilir, liyofilize preparasyonu, uygulamadan önce steril bir çözelti ile kombine edilmistir.
Bilesimler, örnegin pH ayarlamasi ve tamponlama ajanlari, tonisite ayarlama ajanlari ve benzerleri gibi, örnegin sodyum asetat, sodyum laktat, sodyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum klorür ve stabilizatörler gibi fizyolojik kosullara yakinlasma için gerektigi gibi farmasötik olarak kabul edilebilir yardimci maddeler içermektedir (örnegin, 1 %20 maltoz, Vb.).
Açiklamanin M-CSF antikorlari, ayni zamanda, bir ilacin verilmesi için yararli olan lipidler ve/Veya fosfolipidler ve/veya sürfaktanin çesitli tiplerinden meydana gelen küçük bir vezikül olan lipozomlar yoluyla tatbik edilebilir (örnegin, bunun içinde açiklanan antikorlar ve opsiyonel olarak bir kemoterapötik madde gibi). Lipozomlar, emülsiyonlar, köpükler, miseller, çözülemez mono katmanlar, fosfolipid dagilimlar, lamellar katmanlar ve benzerlerini içermektedir ve belirli bir dokuya M-CSF antikorlarin hedeflenmesi için yani sira bilesimin yarilanma ömrünü artirmak için araçlar olarak görev yapabilirler. Çesitli metotlar, örnegin, U.S. Patent No'lar lipozomlarin hazirlanmasi için temin edilmektedir.
Söz konu5u antiköru içeren lipozomlar, teknikte bilinen metotlarla, örnegin Epstein ve dig., Proc. Natl. Acad. Sci. USA yayinlarinda tarif edilenler ile hazirlanabilmektedir. Dolasim zamani genisletilmis lipozomlar ABD Patenti No. 5,013,556 sayili belgede açiklanmaktadir. Özellikle faydali lipozomlar, fosfatidilkolin, kolesterol ve PEG- türevli fosfatidiletanolamin (PEG-PE) içeren bir lipid bilesimi ile ters fazli buharlastirma yöntemi ile olusturulabilir. Lipozomlar, arzu edilen çapla lipozomlar elde etmek için tanimlanmis gözenek. büyüklügünün filtrelerden ekstrüde edilir. Mevcut açiklamanin antikorunun Fab' fragmanlari, bir disülfid degisim reaksiyonu vasitasiyla belgede tarif edildigi gibi konjüge edilebilir. Kemoterapötik bir ajan (örn. Doksorubisin), istege basli olarak lipozom içerisinde bulunabilir [bkz. örn. Gabizon ve dig., J. National Bu bilesimlerde M-CSF antikörunun konsantrasyonu, örnegin, agirlikça yaklasik %lO'dan daha az, genellikle en az yaklasik uygulamanin belirli moduna uygun olarak temel olarak sivi hacimleri, vizkositeler, vb. ile seçilebilmektedir. Oral olarak, topikal olarak ve parenteral olarak uygulanabilir bilesimlerin hazirlanmasi için gerçek. metotlar, teknikte yetkili kisiler tarafindan bilinmektedir veya asikardir ve örnegin, Remington 's Pharmaceutical Science, 19. baski., Mack Publishing Co., Baston, PA (1995 ) sayili belgede detayli bir sekilde tarif edilmektedir.
Bir hastada kanser metastazi ile iliskili kemik kaybi ve/veya kanser metastazin tedavi edilmesi için bir bilesimin etkili bir miktarinin belirlenmesi, teknikte iyi bilinen standart empirik yöntemler dogrultusunda gerçeklestirilebilir. Örnegin, belirli bir dozda M-CSF antikoru ile tedavi edilen bir kisiden serumlar in vivo nötralize edici aktivitesi, Cenci ve dig., J. serumlarin, M-CSF kaynakli in vitro Hmrin Hmnositlerinin (M- CSF'ye yüksek seviyede reseptör ifade eden CD11 hücrelerinin bir alt seti, CDl 1b+ hücresi) proliferasyonunu ve sagkalimini bloke etme kabiliyetini tespit eden bir deneyin kullanilmasiyla degerlendirilmektedir.
Açiklamanin bilesimleri, kanser metastaz ile iliskili kemik kaybi ve/veya kanser metastazlarin gelisimini en az kismi olarak yakalanmasi veya önlenmesi için yeterli bir' miktarda kanser metastaz ile alakali kemik, kaybi, ve/veyar kanser` metastazdan muzdarip olan halihazirda bir memeliye uygulanmaktadir. Yeterli bir miktarin gerçeklestirilmesi, bu “terapötik olarak etkili doz” olarak tarif edilmektedir. Bir M-CSF'nin etkili miktarlari, hastaligin siddetine ve agirligina ve tedavi edilecek hastanin genel durumuna göre degismektedir ancak genel olarak, uygulama basina yaklasik 1,0 pg/kg ila yaklasik 100 mg/kg arasinda veya yaklasik 10 pg/kg ila yaklasik 30 mg/kg arasinda dozajlarda degismekle birlikte, en çok tercih edilen miktarlar, uygulama basina yaklasik 1,0 mg/kg ila 10 mg/kg arasinda veya yaklasik 1 mg/kg ila yaklasik 10 ng/kg arasindadir. Örnegin yaklasik 10 ug/kg ila 5 mg/kg veya yaklasik 30 ug/kg ila 1 mg/kg arasinda antikor, örnegin bir veya daha fazla ayri uygulama veya sürekli infüzyon yoluyla hastaya uygulanmasi için baslangiç aday dozajidir. Uygulama, hastaya yanita ve hastanin terapiye toleransina bagli olmasinin gerekliligi olarak günlük, alternatif günlerde, haftalik veya daha az siklikla olabilmektedir. Uzun periyot üzerinde dozajlarin temini, örnegin, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 hafta veya daha uzunu, meydana gelen hastalik semptomlarinin istenilen baskilanmasina kadar gerekmektedir ve dozajlar gerektigi kadar ayarlanabilmektedir.
Bu terapinin ilerleyisi konvansiyonel teknikler ve deneyler ile gözlemlenir.
Bilesimlerin tek veya çoklu tatbik edilmeleri, doz seviyeleri ve tedaviyi yapan hekim tarafindan seçilmis olan yöntem ile yürütülebilmektedir. Hastaligin Önlenmesi veya tedavisi için, antikorun elverisli dozaji, tedavi edilen hastaligin tipine, yukarida tarif edildigi gibi, hastaligin ciddiyeti ve kürüne bagli olarak degisirken, antikor, koruyucu veya terapötik amaçlar, terapi öncesi, hastanin klinik hikayesi ve antikorun yaniti ve atanan hekimin takdiri için uygulanmaktadir. Antikor hastaya bir kere veya bir seri tedavi boyunca uygun bir sekilde uygulanmaktadir.
Her halükarda söz konusu formülasyonlar, kanser metastazi ve/veya kanser metastazi ile iliskili kemik kaybinin siddetini etkili bir sekilde önlemeye veya en aza indirmeye yeterli bir miktarda M-CSF antikorunu zaman içinde saglamalidir. Mevcut açiklamanin bilesimleri, kanser metastazi ve/veya kanser metastazi ile iliskili kemik kaybinin tedavisi için teknikte bilinen diger terapötik maddeler ile birlikte bir adjuvan terapisi olarak veya tek basina uygulanabilmektedir.
Antikor bilesimi, iyi tibbi pratik ile uyumlu bir yöntemde formüle edilebilmekte, dozlanmakta ve uygulanmaktadir. Bu baglamda dikkate alinmasi gereken faktörler arasinda, tedavi edilen belirli bozukluk, tedavi edilen memeli, hasta bireyin klinik durumu, bozuklugun nedeni, ajanin uygulanma alani, uygulama yöntemi, uygulama plani ve tip doktorlari tarafindan bilinen diger faktörler' bulunmaktadir. Uygulanacak terapötik olarak etkili miktarda antikor, bu gibi hususlar göz Önüne alinarak yönlendirilir ve M-CSF aracili hastalik, durum veya bozuklugun önlenmesi, iyilestirilmesi veya tedavi edilmesi için, özellikle kanser hücrelerinin tedavi edilmesi için ve en çok özellikle tümör hücre metastazinin tedavi edilmesi için gerekli minimum miktardir. Benzeri miktar, konakçiya toksik olan veya enfeksiyonlara anlamli bir sekilde konakçiyi daha fazla duyarli hale getiren miktarin tercihen altindadir.
Antikor, ancak opsiyonel olarak bir veya daha fazla ajanlar isle formüle edilen, günümüzde söz konusu hastaligin tedavi edilmesi veya önlenmesi için kullanilmasina gerek yoktur. Örnegin, kanserde, antikor, yukarida tarif edildigi gibi, kemo terapötik ajan ile birlikte veya ADEPT içinde verilmektedir. Benzeri diger ajanlarin etkili miktari, formülasyonda mevcut antikor miktarina, hastaligin tipine, kosula veya bozuklugu veya tedaviye ve yukarida tartisilan diger faktörlere baglidir.
Bunlar genellikle, burada daha önce kullanilan dozajla ayni dozajda ve ayni uygulama yoluyla veya buraya kadar kullanilan dozajlarin yaklasik %1 ila %99'u arasinda kullanilmaktadir.
Ayrica .burada, kanserin tedavisi için dahil, yukarida tarif edilen hastaliklar, bozukluklar veya kosullarin tedavisi için kullanilan materyalleri içeren üretimin bir artikelidir. Üretim artikeli, bir konteynir ve bir etiketi içerir. Uygun konteynir, örnegin, siseleri, flakonlari, siringalari ve test tüplerini içerir. Konteynirlar, cam veya plastik gibi bir çesit materyalden yapilir. Konteynir, kosulun tedavi edilmesi için etkili olan bir bilesimi muhafaza eder ve steril harici çikisa sahiptir (örnegin, konteynir bir intravenöz çözelti torbasi veya bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile parçalanabilen bir tapaya sahip bir flakon olabilmektedir). Bilesim içindeki aktif ajan, istemlerde belirtilen bulusun antikorudur. Üzerinde veya birlikte olan etiket ile, konteynir, bilesiminun seçenegin kosulunun tedavi edilmesi için kullanilir. Söz konusu ürün ayrica, farmasötik olarak kabul edilen bir tamponu,örnegin fosfat tamponlu salin, Ringer çözeltisi ve dekstroz çözeltisini içeren bir ikinci konteynir içermektedir. Ayrica, kullanici bakis açisi ve ticaretten istenilen diger materyalleri, ilaveten diger tamponlari, filtreleri, igneleri, siringalari ve kullanim için talimatlar ile paket girdilerini içermektedir.
Kanserlere sahip hastalarin tedavisinde kullanilan anti-M-CSF antikorlari, tümöre karsi etkili bir bagisiklik yanitin baslatilmasina kabiliyeti olan ve dogrudan sitotoksisite yetenegine sahip olanlari içermektedir. Bu baglamda, bir anti- M-CSF antikorlar, ya tamamlayici-aracili ya da antikora bagimli hücre sitotoksisite (ADCC) mekanizmalari ile tümör hücre lizizine neden olup her ikisi de tamamlayici proteinler veya efektör hücre Fc reseptör alanlari ile etkilesim için immünoglobulin molekülünün bir intakt Fc kismini gerektirmektedir. Ilaveten, tümör büyümesi üzerinde dogrudan bir biyolojik etki gösteren anti-M-CSF antikorlar açiklamanin pratiginde kullanilir. Bu tür dogrudan sitotoksik antikorlar, hareket edebilir olasi mekanizmalarini hücre büyümesinin inhibisyonu, hücre farklilasmasi modülasyonunu tümör anjiyojenez faktörü profillerin modülasyonu ve apoptoz indüksiyonu içermektedir. Belirli bir anti-M-CSF ve anti-M-CSFR antikoru ile bir anti-tümör etkisi uygulayan mekanizma, ADCC, ADMMC, tamamlayici aracili hücre lizizini veya benzerlerini belirlemek için tasarlanmis teknikte genel olarak bilinen herhangi bir sayida in vitro deney kullanilarak degerlendirilmektedir.
Immünoterapi, M-CSF'nin membran bagli formu (M-CSFa) için M- CSF'nin salgilanmis formlari için olandan daha yüksek bir affiniteye sahip antikorlar kullanilarak gerçeklestirilebilmektedir. Örnegin M-CSFd kirpilma alanina veya civarina ya da membrana bitisik M-CSFd kismina spesifik olarak baglanan antikorlar hazirlanabilmektedir. Bu antikorlar, ayrica M-CSFd'nin çözünebilir aktif kisminin kirpilmasini ve serbest kalmasini yararli bir sekilde inhibe edebilmektedir.
Anti-M-CSF antikorlari, "çiplak" ya da konjüge edilmemis formda uygulanabilmekte veya bunlara konjüge edilmis terapötik ajanlara sahiptir. Anti-M-CSF antikorlari radyodüyarlastirici olarak kullanilabilmektedir. Anti-M-CSF antikorlari radyoduyarlastirici ajana konjüge edilebilmektedir. Burada kullanildigi haliyle "radyoduyarlastirici" terimi, radyoduyalastirilacak hücrelerin elektromanyetik radyasyona duyarlirliginin arttirilmasi ve/veya elekromanyetik radyasyon ile tedavi edilebilir hastaliklarin tedavisini güçlendirmek için hayvanlara terapötik olarak etkili miktarda uygulanan bir molekül, tercihen düsük molekül agirlikli bir molekül olarak ifade edilmektedir. Elektromanyetik radyasyon ile tedavi edilebilen hastaliklar, neoplastik hastaliklari, benign ve malign tümörleri ve kanserli hücreleri içermektedir. kullanildigi gibi, ancak bunlarla sinirli olmamakla birlikte, -3)ila 100 metre arasinda dalga boyuna sahio radyasyonu içerir.
Tercihen, elektromanyetik radyasyonu: gama-radyasyonu (10*20 ila radyasyon (700 nm ila 1,0 mm) ve mikrodalga radyasyonu (1 mm ila cm) uygulanmaktadir.
Radyoduyarlayicilarin, kanserli hücrelerin elektromanyetik radyasyonun toksik etkilerine duyarliligini arttirdigi bilinmektedir. Birçok kanser tedavi protokülünde, günümüzde X isinlarinin elektromanyetik radyasyonu ile aktiflestirilen radyoduyarlayicilar uygulanmaktadir. X- isini ile aktiflestirilen radyoduyarlayici örnekleri arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere, metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomisin. C, RSU BudR), 5-iyododeoksiüridin (IUdR), bromodeoksisitidin, florodeoksiüridin (FudR), hidroksiüre, Cisplatin ve bunlarin terapötik olarak etkili analoglari ve türevleri bulunmaktadir.
Kanserlerin fotodinamik terapisinde (PDT), görünür isik duyarlilastirici ajanin radyasyon aktivatörü olarak kullanilmaktadir. Fotodinamik radyoduyarlayici örnekleri arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere hematoporfirin türevleri, Fotofrin (r), benzoporfirin türevleri, NPe6, kalay etioporfirin (SnETZ), feoborbid-a, bakterioklorofil-a, naftalosiyaninler, ftalosiyaninler, çinko ftalosiyanin ve bunlarin türevleri ve terapotik olarak etkili analoglari bulunmaktadir.
Söz konusu antikor, bir reseptöre (örnegin streptavidin), tümör ön hedeflemede kullanim için konjüge edilebilmekte olup, söz konusu antikor-reseptör konjügati hastaya uygulanmaktadir ve ardindan bir temizleme ajani kullanilarak baglanmayan konjügat dolasimdan uzaklastirilmakta ve daha sonra bir sitotoksik ajana (örn. bir radyonükleotid) konjüge olan bir ligand (örn. avidin) uygulanmaktadir.
Mevcut açiklama ayrica, yukarida tarif edilen tespit edilebilir etiket formunda antikorlari içermektedir. Antikorlar, radyo izotolar, affinite etiketler (biotin, avidin, vs gibi), enzimatik etiketler (kara turp peroksidaz, alkalin fosfataz, vs. gibi), flöresen veya lüminesan veya biyo lüminesan etiketleri (FITC veya rodamin, vs gibi), paramanyetik atomlar ve benzerlerinin kullanilmasi boyunca tespit edilebilir bir sekilde etiketlenir. Bu etiketlemelerin gerçeklestirilmesine yönelik prosedürler, teknikte iyi bilinmektedir; örn. bkz. (Stemberger, F.A. ve dig., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. ve dig., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. ve dig., lmmunol. tespit edilebilir bir bilesik veya bilesim anlamina gelmektedir.
Etiket, kendiliginden tespit edilebilir olabilmekte (örnegin, radyoizotop etiketleri veya floresan etiketler) veya bir enzimatik etiket söz konusu oldugunda, tespit edilebilen bir substrat bilesik veya bilesimin kimyasal degisimini katalize etmektedir. Alternatif olarak, etiket kendiliginden tespit edilememektedir ancak teSpit edilebilir bir baska ajan ile bagli bir element (Örnegin, bir epitop etiket veya biotin-avidin gibi baglanma partner Çiftinin. biri) olabilmektedir. Bu. nedenle antikor, kendi izolasyonunu kolaylastirmak için bir etiket içermektedir ve antikorlarin tanimlanmasi için açiklamanin metotlari, etiket ile etkilesimi boyunca M-CSF/antikorun izole Örnek niteligindeki terapötik immünokonjügatlar, örnegin bir kemoterapötik ajan, toksin (örnegin, bakteri, mantar, bitki veya hayvan kaynakli enzimatik olarak aktif bir toksin veya fragmanlari) veya bir radyoaktif izotop (örnegin, bir radyokonjügat) gibi bir sitotoksik ajana konjue edilmis bunun içinde tarif edilen antikoru içermektedir. Füzyon proteinleri ayrica detayli olarak asagida tarif edilmektedir.
Immünokonjugelerin üretimi U.S. Patent No. 6,306,393 sayili belgede tarif edilmektedir. Immünokonjugeler, bir antikor bilesene bir terapötik ajanin dogrudan olmadan konjüge edilmesiyle hazirlanabilmektedir. Genel teknikler, Shih ve dig., yayinlarinda tarif edilmektedir. Genel metot, en az bir serbest amin fonksiyonuna sahip olan ve ilaç, toksin, selatör, boron toplanmalar veya diger terapötik ajanin bir çogunlugu ile yüklenen bir tasiyici polimer ile okside edilen karbohidrat kismina sahip bir antikor bilesen tepkinmesini kapsar. Bu reaksiyon, baslangiç Schiff baz (imin) bagda sonuçlanmakta olup son konjügatin olusturulmasi için bir sekonder amine indirgenmesiyle stabilize edilmektedir.
Tasiyici polimer tercihen en az 50 amino asit kalintilarin bir aminodekstran veya polipeptid olup buna ragmen diger büyük bir oranda esdeger polimer tasiyicilar ayni zamanda kullanilmaktadir. Tercihen, son immünokonjuge, terapide kullanimi için hedefinin etkili ve uygulamanin kolayligi için memeli serum gibi bir sulu çözeltide çözünmektedir.
Ayrica, tasiyici polimer üzerinde çözünürlük fonksiyonu, son immünokonjunin serum çözünürlügünü genisletmektedir. Özellikle, bir aminodekstran tercih edilir.
Bir aminodekstran tasiyici ile immünokonjugenin. hazirlanmasi için proses tipik olarak dekstran polimer ile, avantajli olarak dekstran ile baslatilir. Dekstran, aldehit gruplarin olusturulmasi için karbohidrat halkalarinin bir kisminin kontrol edilmis bir oksidasyonun etkilenmesi için bir okside edici ajan ile tepkinir. Oksidasyon, konvansiyonel prosedürlere göre NaIO4 gibi glikolitik kimyasal ayiraçlar ile uygun bir sekilde etkiler.
Okside edici dekstran daha sonra bir poliamin, tercihen bir diamin, ve daha fazla tercihen, bir` mono- veya ;polihidroksi diamin. ile tepkinir. Uygun aminler, etien diamine, propilen diamin veya diger benzeri polimetilen diaminler, dietilen triamin veya benzeri poliaminler, 1,3-diamino-2-hidroksipropan veya diger benzeri hidroksile diaminleri veya poliaminleri ve benzerleri içermektedir. Dekstranin aldehit gruplarina rölatif aminin bir fazlaligi, Schiff baz gruplara aldehit fonksiyonlarin büyük bir oranda tamamen dönüsümüne olanak saglamasi için kullanilir.
NaBH4, NaBH3 CN ve benzeri gibi bir indirgenme ajani, sonuçlanan Schiff baz ara ürününün indirgeyici stabilizasyonunu etkilemek için kullanilir. Sonuçlanan ürün çapraz bagli dekstranlarin ayrilmasi için konvansiyonel boyut kolonu boyunca geçisi ile saflastirilir.
Amin fonksiyonlarin girmesi için bir dekstranin türetilmesimim diger konvansiyonel metotlari ayni zamanda, örnegin, siyanogen bromid ile tepkinerek, akabinde bir diamin ile tepkinmesiyle kullanilmaktadir.
Aminodekstran daha sonra örnegin, bir ara ürün katkiSinin olusturulmasi için disikloheksilkarbodiimid (DCC) veya bunun suda çözünen bir varyanti kullanilarak, konvansiyonel yöntemler ile hazirlanan aktive edilmis bir formda, tercihen bir karboksil ile aktive edilmis türevinde belirli bir ilaç, toksin, selatlayici, immünomodülatör, boron toplami veya yüklenen baska bir terapötik ajan türevi ile reaksiyona sokulmaktadir.
Alternatif olarak, sekerci boyasi antiviral protein veya risin A-zinciri ve benzerleri gibi polipeptid toksinler, glutaraldehit yogunlasmasi ile veya aminodekstran üzerindeki aminler ile protein üzerinde aktive edilmis karboksil gruplarin reaksiyonu ile aminodekstrana eslenebilmektedir.
Radyometaller veya manyetik rezonans gelistiriciler için selatlayicilar teknikte iyi bilinmektedir. Bunlarin tipik olanlari, etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) ve dietilenetriaminepentaasetik asidin (DTPA) türevleridir. Bu selatörler tipik olarak, selatörün bir tasiyiciya baglanabilmesi ile yan zincir üzerinde gruplara sahiptir. Bu gruplar, örnegin, benzilisotiosiyanat içermekte olup, DTPA veya EDTA, bir tasiyicinin amin grubuna eslenebilmektedir. Alternatif olarak, birselatör üzerinde karboksil gruplari veya amin gruplari, aktivasyon ile veya türevlenme ve daha sonra iyi bilinen yöntemler ile eslenme öncesi bir tasiyiciya eslenebilmektedir.
Karboranlar gibi boron toplamlari konvasiyonel metotlar ile antikor bilesenine baglanabilmektedir. Örnegin karboranlar, teknikte iyi bilindigi üzere pendant yan zincirlerinde karboksil fonksiyonlari ile hazirlanabilir. Örnegin, aminodekstran gibi bir tasiyicinin karboranlara baglanmasi, karboranlarin karboksil gruplarinin aktivasyonu ile ve bir ara ürün konjügatinin üretilmesi için tasiyici üzerinde aminler ile yogunlastirilmasi ile gerçeklestirilir. Benzeri ara ürün konjugeler daha sonra, asagida tarif edildigi gibi, terapötik olarak kullanilan immünokonjugelerin üretilmesi için antikor bilesenlerine baglanmaktadir.
Bir polipeptid tasiyici, aminodekstrana ragmen kullanilabilmektedir ancak polipeptid, zincir içinde en az 50 amino asit kalintilara, tercihen lOO-SOOO amino asit kalintilara sahiptir. En az bazi amino asitler, lisin kalintilar veya glutamat veya aspartat kalintilar olabilmektedir. Lisin kalintilarinin pendant aminleri ve glutamin ve aspartat'in pensant karboksilatlari, bir ilaç, toksin, immünomodülatör, selatör, boron toplam veya diger terapötik ajanin baglanmasi için elverislidir. Polipeptid tasiyicilarin Örnekleri, polilisin, poliglutamik asit, poliaspartik asit, bunlarin ko- polimerleri ve bu amino asitler ve örnegin, sonuçlanan yüklü tasiyici ve immünokonjuge üzerinde istenilen çözünürlük özellikleri sunan serinler gibi digerlerinin karistirilmis polimerlerini içermektedir.
Antikor bileseni ile ara konjügatin konjügasyonu, antikor bilesenin karbohidrat kisminin okside edilmesiyle ve bir ilaç, toksin, selatör, immünomodülatör, toplanan boron veya diger terapötik ajan ile yüklenmesi sonrasi tasiyici üzerinde kalan amin gruplari ile sonuçlanan alhehit (ve keton) karbonillerin tepkinmesiyle etkilenir. Alternatif olarak, bir acil konjüge, terapötik ajan ile yüklenmesi sonrasi ara konjüge içine giren amin gruplari vasitasiyla okside edilmis antikor bilesene baglanabilmektedir. Oksidasyon, ya kimyasal olarak, örnegin NaIO4 veya baska bir glikolitik ayiraç ile, ya da enzimatik olarak, Örnegin, nöraminidaz ve galaktoz oksidaz ile, uygun bir sekilde etkilenir. Bir aminodekstran tasiyici durumunda, aminodekstranlarin sadece bütün aminler tipik olarak bir terapötik ajanin yüklenmesi için kullanilmamaktadir.
Aminodekstran'in kalan aminleri, Schiff baz katma bilesiklerini olusturmak için okside edilmis antikor bileseni ile yogunlasmakta olup daha sonra normal olarak. bir borohidrid indirgenme ajani ile indirgeyici olarak stabilize etmektedir.
Analog prosedürleri, açiklamaya göre diger immünokonjugelerin üretilmesi için kullanilmaktadir. Yüklenen polipeptid tasiyicilar tercihen, bir antikor bileseninin okside edilmis karbohidrat kismi ile yogusmasi için kalan serbest lisin kalintilara sahiptir. Gerektiginde, polipeptid tasiyici üzerindeki karboksil, örnegin, DCC ile aktivasyonu ile ve diamme'nin bir fazlaligi ile reaksiyonu ile aminlere dönüstürülebilmektedir.
Son immünokonjuge, bir veya daha fazla CD84Hy epitoplar kullanilarak affinite kromatografisi veya Sephacryl 8-300 üzerinde boyut kromatografi gibi konvansiyonel teknikler kullanilarak saflastirilir.
Alternatif olarak, immünokonjugelar, bir terapötik ajan ile bir antikor bileseninin dogrudan konjüge edilmesiyle hazirlanabilmektedir. Genel prosedür, bir terapötik ajanin dogrudan oksitlenmis bir antikor bilesenine baglanmasi haricinde konjügasyonun dogrudan olmayan metoduna analogtur.
Diger terapötik ajanlarin bunun içinde tarif edilen selatorler için ornatilmis olabildigi takdir görmektedir. Teknikte yetkili kisi, gereksiz deneyler disinda konjügasyon semalarinin tasarlanmasina haizdir.
Ayrica bir örnek. olarak, bir terapötik. ajan, disülfid. bagi olusumu vasitasiyla azalan bir antikor bileseninin mafsal bölgesinde baglanabilmektedir. Örnegin, tetanos toksoid peptidler, bir antikor bilesenine peptidin baglanmasi için kullanilan tek sistein kalintisi ile yapilandirilmadadir. Bir alternatif olarak bu peptidler, N-süksinil 3-(2- piridilditio)propiyonat (SPDP) gibi heterobifonksiyonel çapraz baglayici kullanilarak antikor bilesenine baglanabilir. Yu ve dig, Int. J. Cancer56: 244 (1994 ). Benzeri konjügasyon için genel teknikler, teknolojide iyi bilinmektedir. Örnegin bkz.
Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis ve dig., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch ve dig. (eds.), s. 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinical Application, Ritter ve dig. (eds.), s. yayinlari.
Antikor ve sitotoksik ajanin konjügatlari, N-sukkinimidil-3-(2- piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), imidoesterlerin bifonksiyonel türevleri (dimethyl adipimidat HCL gibi), aktif esterleri (disukkinimidil suberat gibi), aldehitler (glutareldehit gibi), bis-azido bilesikleri (bis (p- azidobenzoil) hekzanediamin gibi), bis-diazonium.türevleri (bis- (p-diazoniumbenzoil)- etilenediamin gibi), diisosiyanatlar (tolien 2,6-diisosiyanat gibi) ve bis-aktif fluorin bilesikleri (1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen gibi) gibi çesitli bifonksiyonel protein eslesme ajanlarinin kullanilmasiyla yapilmaktadir. Örnegin, bir risin immünotoksin, Vitetta ve dig., hazirlanabilmektedir. Karbon-14 etiketli 1- isotiosiyanatobenzil-B- metildietilen triaminepentaasetik asit (MX-DTPA), antikora radyonüklidin konjügasyonu için örnek niteliginde bir selatlama ajanidir (bkz. örn. WO 94/11026).
Yukarida tarif edildigi gibi, bir antikorun Fc bölgesindeki karbohidrat. kisimlari, bir terapötik. ajanin. konjuge edilmesi için kullanilmaktadir. Buna ragmen, Fc bölgesi, eger bir antikor fragmani immünokonjügat'in antikor bileseni olarak kullanilirsa bos olabilmektedir. Buna ragmen, bir antikor fragmaninin veya bir antikorun hafif degisken zincir` bölgesi içerisinde bir karbohidrat kisminin girmesi olasidir. Bkz. örn. Leung ve dig.., ,443,953. Tasarlanmis karbohidrat kismi daha sonra bir terapötik ajana baglanir. ilaveten, teknikte yetkili kisi, konjügasyon metotlarinin sayisiz olasi varyasyonlarini taninmaktadir. Örnegin karbohidrat parçasi, kanda, lenfte veya diger hücre disi sivilarda bir intakt antikorü veya antijene baglayici fragmaninin yarilanma ömrünün genisletilmesi amaciyla polietilenglikol baglanmasi için kullanilir. Dahasi, bir karbohidrat kismina ve bir serbest sulhidril grubuna terapötik ajanlarin baglanmasiyla bir “divalan immünokonjuge” yapilandirilmasi olasidir. Benzeri bir serbest sulfhidril grubu antikor bileseninin mafsal bölgesinde konumlandirilabilmektedir.
Anti-M-CSF Antikor Füzyon Proteinleri Bir veya daha fazla anti-M-CSF antikor kisimlari içeren füzyon proteinler ve bir immünomodülatör veya toksin kismi kullanimi bunun içinde açiklanmaktadir. Antikor füzyon proteinlerinin yapilmasina yönelik metotlar, teknikte iyi bilinmektedir. Bkz. örn. U.S. Patent No. 6,306,393. Bir interlösin-Z parçasi içeren antikor füzyon proteinleri, Boleti ve dig., Ann. Oncol. 6:945 Clin. Cancer` Res. 2:1951 (1996) ve Hu ve dig., Cancer› Res. ve dig., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995) yayininda, bir F(ab')2 fragmani ve bir tümör nekroz faktörü alfa kismini içeren bir füzyon proteini tarif edilmektedir.
Içerisinde bir rekombinant molekülün, bir veya daha fazla antikor bilesenleri ve bir toksin veya kemoterapötik ajani içerdigi antikor-toksin füzyon proteinlerin metotlari teknikte yetkili kisiler tarafindan bilinmektedir. Örnegin, antikor- Psödomonas ekzotoksin A füzyon proteinleri, Chaudhary ve dig., yayinlarinda tarif edilmektedir. Difteri toksin kismini içeren antikor-toksin füzyon proteinleri, Kreitman ve dig., Leukemia edilmektedir. Deonarain ve dig., Tumor Targeting 1:177 (1995) sayili belge, bir RNaz kismina sahip bir antikor-toksin füzyon proteini tarif ederken, Linardou 've dig., Celi Biophys. 24- 25z243 (1994) sayili belge, bir DNaz I bilesenini içeren bir antikor-toksin füzyon proteinini üretmektedir. Gelonin, Wang et al., 209. ACS Ulusal Toplantisinin Özetleri, Anaheim, Calif., 2- 6 Nisan, 1995, Kisim 1, BIOT005 yayininin antikor-toksin füzyon proteinindeki toksin kismi olarak kullanilmaktadir. Baska bir örnek olarak Dohlsten ve dig., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994) yayininda, Stafilokokal enterotoksin-A içeren bir antikor-toksin füzyon proteini bildirilmistir.
Benzeri konjügatlarin hazirlanmasinda uygun bir sekilde tatbik edilen toksinlerin Örnekleri, risin, abrin, ribonükleaz, DNase gelonin, difteri toksin, Psödomonas ekzotoksin, ve Psodomonas endotoksin olmaktadir. Bkz. örn. Pastan ve dig., Cell 47:641 (1986) ve Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Diger uygun toksinler teknikte yetkili kisiler tarafindan bilinmektedir.
Burada açiklanan antikorlar ayrica, bir` ön ilaci (örn. bir peptidil kemoterapötik ajan, bkz. WO 81/01145) bir aktif anti- kanser ilaca dönüstüren bir ön ilaç aktive edici enzime antikorun konjüge edilmesiyle ADEPT içinde kullanilabilmektedir. Bkz. örn.
ADEPT için kullanilan immünokonjuge'nin enzim bileseni, onun daha fazla aktif, sitotoksik formuna dönüstürülmesi için bir yöntemde bir ön ilaç üzerinde etkiye haiz herhangi enzimi içermektedir.
Bu açiklamanin metodunda kullanilan enzimler arasinda, bunlarla sinirli kalmamak üzere, fosfat içerikli ön ilaçlarin serbest ilaçlara dönüstürülmesi için kullanilan alkalin fosfataz; sülfat-içerikli ön ilaçlarin serbest ilaçlara dönüstürülmesi için kullanilan arilsülfataz; toksik olmayan 5-florositosin'in anti-kanser ilaç 5-florourasil dönüstürülmesi için kullanilan sitosin deaminaz; peptid içerikli ön ilaçlari serbest ilaçlara dönüstüren serratia proteaz, termolisin, subtilisin, karboksipeptidaz ve katepsinler (katepsinler B ve L) gibi proteazlari; D-amino asit ornatiklari içeren ön ilaçlarin dönüstürülmesi için kullanilan D-alanilkarboksipeptidaz; glikozile ön ilaçlarin serbest ilaçlara dönüstürülmesi için kullanilan ß-galaktosidaz ve nöraminidaz gibi karbohidrat yarilma enzimleri; ß-laktamlar ile türetilmis ilaçlarin serbest ilaçlara dönüstürülmesi için kullanilan ß-laktamaz; ve sirasiyla, fenoksiasetil veya fenilasetil gruplari ile onlarin amin nitrojenlerinde türetilmis ilaçlarin serbest ilaçlara dönüstürülmesi için kullanilan penisilin V amidaz veya penisilin G amidaz gibi penisilin amidazlar bulunmaktadir. Alternatif olarak, teknikte abzimler olarak bilinen enzimatik aktiviteye sahip antikorlar, açiklamanin ön ilaçlarinin serbest aktif ilaçlara dönüstürülmesi için kullanilabilmektedir (Bkz. örn. bir tümör hücre popülasyonuna abzimin tasinmasi için bunun içinde tarif edildigi gibi hazirlanabilmektedir.
Bu açiklamanin enzimleri, yukarida tartisilan heterobifonksiyonal çapraz bagli ayiraçlarin kullanimi gibi teknikte iyi bilinen teknikler ile antikorlara kovalent olarak baglanabilmektedir. Alternatif olarak, açiklamanin bir enziminin en az bir fonksiyonel olarakr aktif kisminar baglanan burada açiklandigi gibi bir antikorun en az antijen baglayici alanini içeren füzyon proteinler, teknikte iyi bilinen rekombinant DNA teknikleri kullanilarak yapilandirilabilmektedir (bkz. örn.
Terapötik olmayan kullanimlar Burada açiklandigi gibi antikorlar, örnegin, spesifik hücrelerde, dokularda veya serumda ifadesinin tespit edildigi M- CSF proteini için tanisal deneylerde veya M-CSF için affinite saflastirma ajanlari olarak kullanilabilmektedir. Antikorlar ayni zamanda in Vivo tani deneyleri için kullanilabilmektedir.
Genel olarak bu amaç dogrultusunda. söz konusu antikor, bir ile etiketlenebilir ve böylece tümör, immünosintiograf kullanilarak konumlandirilabilir.
Bunun içinde açiklandigi gibi antikorlar, örnegin, rakip baglayici deneyler, dogrudan ve dogrudan olmayan sandviç deneyleri, ELISA'lar gibi ve immünoçökeltme deneyleri gibi herhangi bilinen deney metodunda uygulanabilmektedir. Zola, Monoclonal .Antibodiesz IX Manual of Technigues, sayfa.l. Antikorlar ayni zamanda, teknikte bilinen metotlar kullanilarak etiket tümör numunelere immunohistokimya için kullanilabilmektedir.
Elverisliligi bakimindan, mevcut bulusun antikoru, bir kit içinde temin edilebilir, örnegin, tanisal deneyin olusturulmasi için talimatlar ile önceden belirlenmis miktarlarda ayiraçlarin paketlenmis bir kombinasyonu. Antikor bir enzim ile etiketlendiginde söz konusu kit, enzim (örnegin, tespit edilebilir kromofor veya florofor saglayan bir substrat öncül) ile gereken substratlari ve kofaktörleri içermektedir. Ek olarak diger katki maddeleri, stabilizörler, tamponlar (örnegin, bir blok tamponu veya lizis tamponu) ve benzeri dahil edilebilmektedir. Çesitli ayiraçlarin rölatif miktarlari, deneyin duyarliligini büyük ölçüde optimize eden ayiraçlarin çözelti içindeki konsantrasyonlari için elde edilmesinde genis bir sekilde degisebilmektedir. Özellikle, ayiraçlar, çözünme üzerine uygun konsantrasyona sahip bir ayiraç çözeltinin saglandigi eksipiyanlar dahil olmak üzere genellikle liyofilize edilmis kuru tozlar olarak saglanabilmektedir.
Bulus, herhangi bir sekilde sinirlayici olmasi amaçlanmayan asagidaki örneklerle açiklanmaktadir. ÖRNEKLER Bu örnekte, M-CSF antikorlari RXl ve 5A1'in türe özgü oldugu ve antikorlar RXl, MCl ve MC3'ün insan M-CSF aktivitesini nötralize ettigi gösterilir. RXl, bu basvurunun dosyalama tarihinden önce bir yildan daha fazla süredir mevcut, ticari olarak satilan bir antikordur. Örnek niteligindeki ticari kaynaklar arasinda bunlarla sinirli kalmamak üzere, fare anti-insan M-CSF monoklonal antikor klonlari 116, 692 ve 21 (Anogen); anti-human Ine.); ve anti-insan M-CSF antikor klonnu M16 (Antigenix America, Inc.) bulunmaktadir.
RXl ve 5A1'in nötralize edici aktivitesini test etmek için, M- NFS-60 hücre hattina ait bir proliferasyon analizi kullanilmistir (Rockville, MD, USA'de bulunan ATCC'den temin edilebilen, Cas-Br-MuLV yabani tip ekotropik fare retroviroz ile uyarilmis miyelojenöz lösemiden türetilmis, interlösin 3 ve M- CSF'ye duyarli, bir retrovirüsün entegrasyonunun neden oldugu bir kesilmis c-myb proto-onkogeni içeren Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Erisim No. CRL-1838). M-NFS-60'in proliferasyonu, doza bagimli bir sekilde aktif M-CSF gerektirmektedir. Deneyde, M-NFS-60 hücreleri yikanir ve %10 FBS ve 3000 U/ml M-CSF ve %1 Pen/Strep ile RPMI 1640 ortaminda plakalanir. Insan veya murin spesifik rekombinant insan M-CSF (10 ng/ml son konsantrasyonda), bir inkübatör içinde %5 COZ içinde 37°C'de 1 saat boyunca çesitli konsantrasyonlarda antikorlar ile enkübe edilir.
Enkübasyonun ardindan karisim, 96 çukurcuklu mikrotitre plakalarda M-NFS-60 kültürüne ilave edilir. Her çukurcuk için toplani analiz hacmi, 10 ng/ml M-CSF'ye sahip 100 ul'dir` ve antikor konsantrasyonu, Sekil 5'te gösterilmistir. Hücreler, hücre sayilarinin HücreTitre Glo deneyi (Promega) ile ölçülmeden önce, 72 saat boyunca %5 COZ altinda 37°C'de enkübe edilir.
Yukarida bahsi geçen analiz, MC3 ve MCl antikorlari için tekrarlanir.
Sekil 5'te gösterildigi gibi, M-CSF antikorlari RXl ve 5Al, türe özgüdür. Hücre proliferasyonu, hücre sayisi ile dogrusal olan HücreTitre Glo deneyinden okunan floresan olarak temsil edilmektedir. RXl ve 5Al'in nötralize edici aktiviteye spesifik türleri, ya insan ya da murin M-CSF'in mevcudiyetinde M-NFS- 60'in inhibe edilmesi için yetenegini göstermektedir. Son olarak, Sekil 5B'de gösterildigi gibi MC3 ve MCl antikorlari ayni zamanda M-CSF aktivitesinin etkili inhibitörleridir.
Bu örnekte, RXl antikorunun, 5 mg/kg'lik bir dozda bir insan ksenograf modelindeki osteolizi inhibe ettigi gösterilmektedir.
Bu çalismada, 4-7 haftalik, ortalama agirligi ~20g olan disi çiplak fareler kullanilir. 10 ul salin içinde askiya alinmis tümör hücreleri (MDA-MB-231, 3xl05), sag tibia kemik iligi boslugu içine enjekte edilir. Arka bacaklarin röntgen filmi, taban görüntüsünün alinmasinda ve enjeksiyondan kaynaklanan kemik kirigi için kontrol edilmesinde tümör asilanmasi sonrasi bir günde alinir. Fareler, 6 hafta boyunca haftada bir kere, i.p. enjekte edilen 5 mg/kg'da PBS ve RXl ihtiva eden grup basina farede tedavi gruplari içerisinde rastgele olarak alinir. Çalismanin sonunda, arka bacaklarin röntgen filmi alinir ve kemik hasari için taban çizgisine karsi karsilastirilir.
Tümörden kaynaklanan kemik hasarinin derecesi Sekil 6 içinde gösterildigi gibi tarif edilmektedir. RXl 5 mg/kg tedavili grup, tümörle kaplanmis hasardan kemigin istatistiksel olarak anlamli korunmasini göstermektedir.
Bu örnekte, RXl antikorunun 5 mg/kg bir konsantrasyonda insan meme kanseri MDA-MB-23l tasiyan çiplak farelere tatbik edildiginde metastazlarin sayisinin azaldigi gösterilmektedir.
Bu çalismada, 4-7 haftalik, ortalama agirligi ~20g olan disi çiplak fareler kullanilir. 10 ul salin içinde askiya alinmis tümör hücreleri (MDA-MB-ZSl, 3xlO5), sag tibia kemik iligi boslugu içine enjekte edilir. Arka bacaklarin röntgen filmi, taban görüntüsünün alinmasinda ve enjeksiyondan kaynaklanan kemik kirigi için kontrol edilmesinde tümör asilanmasi sonrasi bir günde alinir. Fareler, 6 hafta boyunca haftada bir kere, i.p. enjekte edilen 5 Hg/kg'da PBS ve RXl ihtiva eden tedavi gruplari içerisine rastgele olarak gruplandirilir. Çalismanin sonunda, her tedavi grubunun akcigerleri toplanir ve metastatik akciger nodül sayimi için Bouin çözeltisinde sabitlenir.
Sekil 7 içinde gösterildigi gibi, antikor RXl'in, 5 mg/kg bir konsantrasyonda çiplak fareye tasiyan insan meme kanserine MDA- MB-23l tatbik edildiginde metastazin miktari azalmaktadir.
Bu örnekte, RXl antikorunun insanlastirilmasina yönelik bir 5H4, MCl ve MC3, benzer prosedürler kullanilarak insanlastirilir.
Insanlastirilmis RXl hafif ve agir zincirleri için genlerin dizayni Murin RXl için nükleotid ve amino asit sekansi Sekil 4B içinde ifade edilmektedir. Ulusal Biyo Medikal Vakfi Protein Kimlik Kaynagi veya benzer veri tabanlari kullanilarak tanimlanan bir insan antikorunun sekansi, insanlastirilmis antikorun çerçevesinin saglanmasi için kullanilmaktadir. Insanlastirilmis agir zincirin sekansinin seçilmesi için, murin RXl agir zincir sekansi, insan antikor agir zincirinin sekansi ile hizalanir.
Her pozisyonda, insan antikor amino asidi, murin RXl amino asidin asagidakilerden seçildigi durumda pozisyonun, asagida tarif edilen dört kategorilerin herhangi birinde oldukça insanlastirilmis sekans için seçilmektedir: ile tarif edildigi gibi, tamamlayicilik belirleme bölgelerinde (CDR) yer almaktadir. (3 Insan antikor amino asit, bu pozisyonda insan agir zincirleri için nadir olurken murin RXl amino asit bu pozisyonda insan agir zincirleri için yaygindir; (N Pozisyon, murin RXl agir zincirinin amino asit sekansindaki bir CDR'ye hemen bitisiktir; veya (4) Murin RXl antikorun 3-boyutlu modelinin önerdigi amino asidin antijen baglayici bölgeye fiziksel olarak yakin olmasidir. insanlastirilmis hafif zincirin sekansinin seçilmesi için, murin RXl hafif zincir sekansi, insan antikor hafif zincirinin sekansi ile hizalanir. Her pozisyonda, insan antikor amino asidi, pozisyonun, asagida tekrarlanan ve yukarida tarif edilen kategorilerin birinde yer aldikça insanlastirilmis sekans için her pozisyonda seçilmektedir: (H CDR'ler; (m Insan antikorundan daha tipik olan murin RXl amino asit; (N CDR'lere bitisik; veya (4] Baglanma bölgesine olasi 3-boyutlu yakinligi.
Agir ve hafif zincir genlerin gerçek nükleotid sekansi asagidaki gibi seçilmektedir: (H Yukarida tarif edildigi gibi seçilen amino asit sekanslari için nükleotid sekans kodu; (3 Bu kodlayici sekanslarin 5', bir lider (isaret) sekansi için nükleotid sekanslari kodu. Bu lider sekanslar tipik antikorlar olarak seçilir; kodlayici sekanslarin 3', nükleotid sekanslari, fare hafif JS segmenti ve fare agir zincir J2 segmenti takip eden sekanslar olup murin RXl sekansinin kismi olmaktadir.
(N Bu sekanslar dahil edilmektedir çünkü birlesme donör isaretlerini içermektedir; ve (4) Sekansin her ucunda, bir vektörun Xba I alani içerisinde klonlanmasina ve Xba l alanlarinda kesilmesine olanak taniyan bir Xba l alanidir.
Insanlastirilmis hafif ve agir zincir genlerin yapilandirilmasi Agir zincirin sentezlenmesi için, dört oligonükleotidler, bir Applied Biosystems 380B DNA sentezleyici kullanilarak sentezlenir. oligonükleotidlerin ikisi, agir zincirin her seridinin kismidir ve her oligonükleotid, tavlamaya olanak saglamasi için yaklasik 20 nükleotidler ile bir sonrakine çakismaktadir. Beraber, oligonükleotidler, Xba :E alanlarinda kesilmesine olanak saglayan her uçtaki az bir ekstra nükleotidler ile bütün insanlastirilmis agir zincir degisken bölgeyi kapsamaktadir. Oligonükleotidler poliakrilamid jellerden saflastirilir.
Her oligonükleotid, standart prosedürler ile ATP ve T4 polinukleotid kinaz kullanilarak fosforile edilmistir (Maniatis ve dig., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. baski., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
Fosforile edilmis oligonükleotidlerin tavlanmasi için, 4 dakika boyunca 95°C'ye isitilan ve yavasça 4°C'ye sogutulan her biri yaklasik 3,75 uM bir konsantrasyonda 40 ul TA'da (33 mM Tris asetat, pH 7,9, 66 mM potasyum asetat, l0 mM magnezyum asetat) birlikte askiya alinmaktadir. Her oligonükleotidin karsit seridin sentezlenmesiyle oligonükleotidlerden tam genin sentezlenmesi için, asagidaki bilesenler 100 ul bir son hacimde ilave edilmektedir: lO ul tavlanmmis 0,l6 nmîher bir 0,5 mM ATP 0,5 mM DTT 3,5 T4 g43 proteini (DNA T4 g44/62 proteini 11”/m-i !Inn-"imnv'al'i :bCHÜ11'J'V` 45 proteini (polimeraz 11rv/m`l -i'IJ-r'inrwiidv WWA+^4H4` Karisim, 30 dakika boyunca 37°C'de enkübe edilir. Daha sonra 10 u T4 DNA ligaz ilave edilir ve 37°C'de inkübasyon 30 dakika boyunca devam ettirilir. Polimeraz ve ligaz, l5 dakika boyunca 70°C'de reaksiyonun inkübasyonuyla inaktive edilir. Xba I'e sahip geni sindirmek için reaksiyona, 200 ug/ml BSA ve 1 mM DTT içeren 50 pl 2 X TA, 43 ul su ve 5 ul'de 50 u Xba I ilave edilir.
Reaksiyon 37°C'de 3 saat boyunca enkübe edilir ve daha sonra bir jel üzerinde saflastirilir. Xba I fragmani, bir jelden saflastirilir ve standart metotlar ile plasmid pUClg'un Xba I alani içerisine klonlanir. Plasmidler, standart teknikler kullanilarak saflastirilir ve dideoksi metodu kullanilarak sekanslanir.
Insanlastirilmis hafif ve agir zincirlerin ifade edilmesi için plasmidlerin yapisi, içine giren pUCl9 plasmitten hafif ve agir zincir Xba I fragmanlarinin izole edilmesiyle ve daha sonra bir uygun konakçi hücre içerisine transfekte edildiginde bir tam agir zincirinin yüksek seviyelerini ifade eden bir uygun ifade vektörünün Xba l alani içerisine onun sokulmasiyla gerçeklestirilmektedir.
Insanlastirilmis antikorun sentezi ve affinitesi Ifade vektörleri fare SpZ/O hücreleri içerisine transfekte edilir ve plasmidleri entegre eden hücreler, standart metotlar ile ifade vektörleri tarafindan sunulan seçilebilir isaretleyici(ler) dayanilarak seçilmektedir. Bu hücrelerin M- CSF'ye baglanan antikoru salgilamasini dogrulamak için, hücrelerden üst fazlar, M-CSF'nin ifade edilmesinde bilinen hücreler ile enkübe edilir. Yikanmasi sonrasi, hücreler floresans ile eslenik keçi anti-insan antikoru ile enkübe edilir, yikanir ve FACSCAN sitofluometre üzerindeki floresans için analiz edilir.
Daha sonraki deneyler için, insanlastirilmis antikoru üreten hücreler fare içerisine enjekte edilir ve sonuçlanan assitler toplanir. Insanlastirilmis antikor, standart tekniklere göre, bir Affigel-lû destegit (Bio-Rad Laboratories, Ine., Richmond, Calif.) üzerinde hazirlanan keçi anti-insan immünoglobulin antikorunun bir affinite kolonu dogrultusunda geçisi ile assitlerden büyük ölçüde homojenlige saflastirilir. Orijinal murin RXl antikoruna göre insanlastirilmis antikorun affinitesinin tespit edilmesi için, bir rakip baglayici deney teknikte bilinen tekniklere göre Olusturulur. ÖRNEK 4A Bu örnek, Insan MühendislikTM RXl antikorlarin klonlanmasin ve ifadesini, yani sira benzeri antikorlarin saflastirilmasini ve baglanma aktivitesi için test edilmesini tarif etmektedir.
Insan MühendislikTM 5H4, MCl ve MC3 antikorlari, benzer prosedürler kullanilarak hazirlanir.
Insan MühendislikTM sekanslarinin tasarlanmasi Antikor degisken domenlerinin Insan MühendislikTM antikorlari, Studnicka [Bkz. örn. Studnicka ve dig. U.S. Patent No. 5,766,886; tarafindan antikor moleküllerinin baglanma aktivitesini korurken immünojenikliginin azaltilmasina yönelik bir öyntem olarak tarif edilmistir. Metoda göre, her degisken bölge amino asidine bir ornatma riski atanir. Amino asit ornatmalari, üç risk kategorisinden biri ile ayirt edilir: (1) düsük riskli degisimleri, antijen baglayici bozunmasinin en az degisimi ile immünojenisitesinin azaltilmasi için büyük ;potansiyele sahip olanlardir; (2) orta riskli degisiklikler, ayrica immünojenisiteyi azaltan ancak antijen baglanmasini veya protein katlanmasini etkilemesinin bir büyük degisimi sahip olanlardir; (3) yüksek riskli kalintilar, antikor yapisinin temin edilmesi için veya baglanmasi için önemli olan ve antijen baglanmasi veya protein katlanmasinin etkilendigi en yüksek riski tasiyan olanlardir. Prolinlerin üç-boyutlu yapisal rolünden dolayi, prolinlerdeki modifikasyonlar, pozisyon tipik olarak bir düsük riskli pozisyonda olmasina ragmen, genel olarak en az orta riskli degisiklikler oldugu kabul edilmektedir. Ornatimsal degisiklikler tercih edilmektedir ancak eklemeler ve silmeler de ayni zamanda olasidir. Sekil 4B ve 4G, sirasiyla bir yüksek, orta veya düsük riskli degisim olarak kategorize edilen murin RXl hafif ve agir zincirlerin her amino asit kalintisi için risk atamasini göstermektedir.
Murin RXl antikorunun hafif ve agir zincirlerinin degisken bölgeleri bu metot kullanilarak Insan MühendislikTM olmaktadir.
Söz konusu metoda göre düsük riskli pozisyonlarda modifikasyon için. aday' amino asit kalintilari, bir* insana. degisken. bölge sekansina sahip murin degisken bölgelerinin amino asit sekanslarinin hizalanmasiyla tanimlanir. Tek basina bir VH veya VL sekansi veya bir insan konsensus VH veya VL sekansi dahil olmak üzere herhangi bir insan degisken bölgesi kullanilabilir.
Herhangi bir sayida düsük riski pozisyonda veya düsük riskli pozisyonlarin tümünde amino asit kalintilari degisebilmektedir.
Sekil l9A-B içindeki Insan MühendislikTM “düsük riskli" agir zincir sekansi için, insan konsensüs Vh2 (Kabat'a dayanilarak) taslak olarak kullanilir ve murin ve insan amino asit kalintilarinin düsük riskli pozisyonlarda farklilastigi yerdeki her pozisyon için, bir amino asit modifikasyonu, murin kalintinin insan kalintisi ile yer degistirmesinde girmektedir.
Sekil ZOA-B'de Insan MühendislikTM “düsük riskli” hafif zincir sekansi için, insan konsensüs kappa 3 (Kabat baz alinarak) taslak olarak kullanilir ve murin ve insan amino asit kalintilarinin düsük. riskli pozisyonlarda farklilastigi her pozisyon için, murin kalintisinin insan kalintisi ile degistirildigi bir amino asit modifikasyonu gerçeklestirilir. yer degistirmesinde girmektedir. l6 amino asit düsük riskli modifikasyonlarin bir toplami, hafif zincir için yapilmaktadir ve 8 düsük riskli modifikasyonlari agir zincir için yapilmaktadir.
Benzer sekilde, düsük ve orta riskli pOZisyonlarin tümündeki metoda göre modifikasyonlar için adaylar olan amino asit kalintilari, bir insan degisken bölge sekansi ile murin degisken bölgelerinin amino asit sekanslarinin hizalanmasiyla tanimlanmaktadir. Düsük veya orta riskli pozisyonlarin herhangi sayisindaki amino asit kalintilari veya düsük ve orta riskli pozisyonlarin tümündeki amino asit kalintilari degisebilmektedir. Sekil 19A-B içindeki Insan MühendislikTM agir zincir sekansi, insan konsensüs Vh2 (Kabat'a dayanilarak) taslak olarak kullanilir ve murin ve insan amino asit kalintilarinin düsük veya orta riskli pozisyonlarda farklilastigi yerdeki her pozisyon için, bir amino asit modifikasyonu, murin kalintinin insan kalintisi ile yer degistirmesinde girmektedir. Sekil ZOA- B içindeki Insan MühendislikTM hafif zincir sekansi için, insan konsensüs kappa 3 (Kabat'a dayanilarak) taslak olarak kullanilir ve murin ve insan amino asit kalintilarinin düsük veya orta riskli pozisyonlarda farklilastigi yerdeki her pozisyon için, bir amino asit modifikasyonu, murin kalintinin insan kalintisi ile yer degistirmesinde girmektedir. 19 düsük ve orta riskli amino asit modifikasyonlarin. bir toplami, hafif zincir için yapilmaktadir ve 12 düsük ve orta modifikasyonlari agir zincir için yapilmaktadir.
Bir “alternatif düsük riskli” hafif zincir sekansi ayni zamanda Sekil ZlA-B içinde gösterildigi için hazirlanmakta olup pozisyon 54'de modifikasyon, murin'e geri gider. Bir “alternatif düsük+orta riskli” hafif zincir sekansi ayni zamanda Sekil 21 A- B içinde gösterildigi gibi hazirlanmakta olup pozisyon 54-56'da modifikasyon, murin'e geri gider.
Sonuç olarak, bir Insan MühendislikTM “düsük+orta riskli” hafif zincir V bölgesi sekansi ayni zamanda, Sekil 22A-B içinde gösterildigi gibi taslak olarak insan germ hatti VK6 alt grubu 2-1 -(1) Al4 kullanilarak üretilmektedir.
Mevcut bulus ile ayni zamanda tasarlanan, glikozilasyon alanini temsil eden Sekil 4A'nin tespit edilen amino asitler olmaktadir. Alternatif olarak, amino asitler 41-43 (örnegin., NG) sadece biri veya ikisi tespit edilmektedir.
Kalici Hücre Hatti Gelisimine Yönelik Ifade Vektörlerinin Hazirlanmasi Antikor ile türetilen isaret sekanslari ile boyunca yukarida tarif edilen agir ve hafif zincir V bölgesi sekanslarin her birini kodlayan DNA fragmanlari, sentetik nükleotid sentezi kullanilarak yapilandirilir. Yukarida tarif edilen hafif zincir V bölgesi amino asit sekanslarinin her birini kodlayan DNA, insan Kappa hafif zincir sabit bölgesini içeren vektör pMXPlO içerisine sokulur. Yukarida tarif edilen agir zincir V bölgesi amino asit sekanslarinin her birini kodlayan DNA, insan Gama-2 agir zincir sabit bölgesini içeren vektör pMXP6 içerisine sokulur. Ilave vektörler, Sekil 29A, 29b ve 30 içinde görüntülenen sekanslarar sahip insani Gama-1 (cDNA) ve Gama-4 (genomik ve cDNA) kaynasik agir zincir V bölgesi amino asit sekanslarini kapsayarak yapilandirilir. Bu vektörlerin tümü, bir hCMV promotörü ve bir fare kappa hafif zinciri 3' çevrilmemis bölgesinin yani sira, sirasiyla G418 veya histidinol dirençli transfektanlarin seçilmesi için neo veya his gibi seçilebilir markor genlerini içerir. Hafif ve agir zincir vektörleri, sirasiyla Tablolar 2 ve 3 içinde tarif edilmektedir.
Tablo 2. Tek gen kalici Kappa hafif zincir vektörleri Isaretley Plasmid V Bölgesi ici pMXCS Düsük + Orta Riskli neo pMXC13 Düsük Riskli (Kabat) - R54'ten S'yeneo Düsük+Orta Risk (Kabat)- pMXCl4 RAT54,55,56'dan SlS'ye neo pMXC22 Düsük + Orta Riskli (Germ hatti) neo Tablo 3. Tek gen kalici agir zincir vektörleri Plasmid v Bölgesi 0 Bölgesi Isaretleyici pMXC7 Düsük + Orta Riskli Gama 2 neo pMXCS Düsük Riskli (Kabat) Gama 2 neo pMXC4O Düsük Riskli (Kabat) Gama l neo pMXC4l Düsük + Orta Riskli Gama 1 neo pMXC45 Düsük + Orta Riskli Gama 4 neo pMXC46 Düsük + Orta Riskli Gama 4 (cDNA) neo Istenilen Insan MühendislikTM hafif arti agir zincir genlerini (Gama-l, Gama-2 ve Gama-4) içeren vektörler daha sonra yapilandirilir. Bu “2-Gen” vektörleri, hCMV promotörünün kontrolü, CMV birlesme donörü, SV4O 168 birlesme alici ve poliA alanini ihtiva eden fare kappa hafif zincir 3' çevrilmemis DNA kodlayan genleri içermektedir. Ayni zamanda, neo veya his gibi seçici isaretleyici ve ampisiline dirençli gen içermektedir. Hem agir ve hem de hafif zincir genleri içeren vektörler Tablo 4 içinde tarif edilmektedir. Her hafif ve agir zincir genlerin (dört gen vektörleri) iki kopyasini içeren vektörler ayni zamanda yapilandirilmaktadir.
Tablo 4. Iki-genli kalici ifade vektörleri Agir Zincir Plasmid Kappa Hafif V bölgesi C Seçici Zinciri bölgesi Isaretleyici Düsük Riskli Riskli pMXCl2 (Kabat) (Kabat) Gama 2 neo Düsük Riskli Riskli pMXC37 (Kabat) (Kabat) Gama 2 his pMXC9 Düsük + Orta Düsük + Gama 2 neo Riskli Orta pMXCl6 Düsük Riskli Düsük -F Gama 2 neo (Kabat) Orta Düsük + Orta Riskli pMXCl7 Riskli (Kabat) Gama 2 neo pMXCl8 Düsük Riskli Düsük + Gama 2 neo (Kabat) R54'tenr Orta S'ye Riskli pMXC19 Düsük + Orta Düsük + Gama 2 neo Riskli (Kabat)- Orta RAT54,55,56 to Riskli pMXCZO Düsük Riskli Düsük Gama 2 neo (Kabat) - R54 to Riskli pMXCZl Düsük + Orta Düsük Gama 2 neo Riskli (Kabat)- Riskli RAT54,55,56 to (Kabat) pMXCZS Düsük + Orta Düsük + Gama 2 neo Riskli (Gerni Orta hatti) Riskli pMXC47 Düsük + Orta Düsük + Gama 2 his Riskli (Gerni Orta hatti) Riskli pMXC26 Düsük + Orta Düsük Gama 2 neo Riskli (Gerni Riskli hatti) (Kabat) pMXC42 Düsük + Orta Düsük Gama l neo Riskli (Gerni Riskli hatti) (Kabat) pMXC43 Düsük + Orta Düsük + Gama l neo Riskli (Gerni Orta hatti) Riskli pMXCSO Düsük + Orta Düsük + Gama l his Riskli (Gerni Orta hatti) Riskli pMXC48 Düsük + Orta Düsük + Neo Riskli (Gerni Orta Gama hatti) Riskli (CDNA) pMXC49 Düsük + Orta Düsük + neo Riskli (Gerni Orta hatti) Riskli Gama 4 Geçici Ifade için Ifade Vektörlerinin Hazirlanmasi Yukarida tarif edilen hem hafif hem de agir zincir genleri içeren vektörler ayni zamanda geçici transfeksiyon için yapilandirilmaktadir. Bu vektörler, Epstein-Barr Virüsü nükleer antijeni ifade eden HEK293 hücrelerindeki replikasyon için neo veya his genleri yerine Epstein-Barr Virüsü oriP içermesi disinda kalici transfeksiyonlar için yukarida tarif edilenlere benzerdir. Geçici transfeksiyon için vektörler Tablolar 5 ve 6 içinde tarif edilir.
Tablo 5. Geçici Kappa hafif zincir vektörleri Plasmid V Bölgesi pMXCl Düsük + Orta Riskli pMXCZ Düsük Riskli (Kabat) Düsük+Orta Risk (Kabat)-RAT54,55,56'dan pMXClO pMXCll Düsük Riskli (Kabat) - R54'ten S'ye pMXClS Düsük + Orta Riskli (Germ hatti) Tablo 6. Geçici agir zincir vektörleri.
Plasmid V Bölgesi C Bölgesi pMXC3 Düsük + Orta Riskli Gama 2 pMXC4 Düsük Riskli (Kabat) Gama 2 pMXC29 Düsük Riskli (Kabat) Gama l pMXC38 Düsük Riskli (Kabat) pMXC39 Düsük + Orta Riskli Gama l HEK293E Hücrelerinde Insan Mühendisli RXl'in Geçici Ekspresyonu Her biri Epstein-Barr Virüsünden oriP içeren ayri vektörler ve yukarida tarif edilen hafif zincir ve agir zincir genleri, geçici olarak HEK293E hücrelerine transfekte transfekte edilmis hücreler, güne kadar inkübe edilmelerine izin verilir ve antikor, A kromatografisi kullanilarak saflastirilir. üst faz geri kazanildiktan sonra 10 Protein 293E hücrelerinin geçici transfeksiyonu ile üretilen proteinler, asagida Tablo 7'te açiklanir. Tablo 7. Hazirlanan insan mühendislik RXl antikorlari.
Hafif Zincir Agir Zincir Plasmi Antikor Protein Plasmid Protein Düsük Riskli heRX pMXC4 Düsük Riskli heRX1-3.G2 pMXCl Düsük + Orta Riskli pMXC4 heRX1-4.G2 pMXCl Düsük + Orta Riskli pMXC3 Düsük + Orta Riskli Düsük Riskli (Kabat) Düsük Riskli heRx1-5.G2 pMXCll pMXC4 - R54'ten S'ye (Kabat) Düsük Riskli (Kabat) Düsük Riskli heRXl-6.G2 pMXCll pMXC4 - R54'ten S'ye (Kabat) heRX1-7.G2 pMXClO Düsük -+ Orta, RisklipMXC4 Dusuk Riskli RAT54,55,56'dan heRXl-8.G2 pMXClO Düsük 4% Orta. RisklipMXC3 Düsük + Orta Riskli (Kabat)- RAT 54,55,56 to 818 Düsük -F Orta Riskli Düsük Riskli heRX1-9.G2 pMXClS pMXC4 (Germ hatti) (Kabat) heRXl- Düsük. + Orta Riskli pMXClS pMXC3 Düsük + Orta Riskli .G2 (Germ hatti) Düsük Riskli (Germ Düsük Riskli heRX1-1.G1 pMXCZ pMXC29 hatti) (Kabat) heRXl- Düsük 4- Orta Riskli pMXClS pMXC39 Düsük + Orta Riskli .G1 (Germ hatti) Düsük -F Orta. Riskli Düsük Riskli heRx1-9.G4 pMXC15 pMXC38 (Germ hatti) (Kabat) Geçici olarak Transfekte edilmis CHO-Kl Hücrelerinin Gelisimi Hafif ve agir genlerin her birinin bir kopyasini beraber içeren yukarida (Tablo 4) tarif edilen vektörler, Ex-Cel 302 ile adapte edilmis CHO-Kl hücreleri içerisine transfekte edilir. Ex-Cell 302 ortami içindeki süspansiyon büyümesine adapte edilen CHO-Kl hücreleri tipik olarak 40 ug linearize edilmis vektör ile elektroporasyona tabi tutulur. Alternatif olarak linearize edilmis DNA, lineer polietileneimin (PEI) ile komplekslenebilir ve transfeksiyon için kullanilir. Hücreler, %1 FBS ve G4l8 ile desteklenen Ex-Hücre 302 ortamini içeren 96 çukurcuk plakalar içine tabaklanir. Klonlar, 96 çukurcuk içinde taranir ve her transfeksiyondan üst ~%10 klonlar, Ex-Hücre 302 ortamini içeren 24 çukurcuklu plakalara transfer edilir.
Bir üretkenlik. testi, kültür üst fazlarinin, IgG için. bir immünoglobulin ELISA ile salgilanan antikorun seviyeleri için test edildigi zamanda 7 ve 14 gün boyunca büyüyen kültürler için Ex-Hücre 302 ortamindaki 24 çukurcuk plakalarda olusturulur. Üst klonlar, EX-Hücre 302 ortamini içeren kaplarin çalkalanmasi için transfer edilmektedir. Hücreler süspansiyon büyümesine adapte edilmesi ile beraber, bir çalkalama kabi testi, Ex-Hücre 302 ortami içindeki bu klonlar ile olusturulur. Hücreler, 25 ml ortami içeren 125 ml Erlenmayer kaplarda 10 güne kadar boyunca büyümektedir. Flasklar, gaz degisimine izin vermek için enkübasyon süresince en azindan gün asiri açilir' ve kültür ortamindaki immünoglobülin polipeptidr seviyeleri, inkübasyon süresinin sonunda IgG ELISA ile belirlenir. iki veya üç çok üniteli transkripsiyon vektörüne sahip ayni hücre hattinin birden cok sekansli transfeksiyonlari, immünoglobulin üretim seviyelerinde artis sergileyen, tercihen 300 ug/ml veya daha fazla seviyelere çikan klonlar ve hücre hatlariyla sonuçlanir.
Saflastirma Vektörler ve bütün çizgilerden immünoglobulin polipeptidlerin saflastirilmasi için bir proses dizayn edilebilmektedir.
Teknikte iyi bilinen metotlara göre, hücreler, sona ermesi sonrasi filtrasyon ile ayrilir. Filtrat, bir Protein A kolonu üzerine yüklenir (gerektiginde, coklu geçislerde). Kolon yikanir ve daha sonra ifade edilmis ve salgilanan immünoglobulin polipeptidler kolondan ayrilir. Antikor ürünün hazirlanmasi için, Protein A havuzu, bir viral inaktivasyon adimi olarak bir düsük pH'da (bir minimum 30 dakika ve bir maksimum bir saat boyunca pH 3) tutulur. Bir emici katyon degisim adimi daha sonra ayrica ürünün saflastirilmasi için kullanilir. Emici ayrisma kolonundan eluat, ayrica potansiyel viral taneciklerin araliginin saglanmasi için filtreyi tutan bir virüs dogrultusunda geçmektedir. Filtrat ayrica, ürünün baglanmadigi bir anyon degisim kolonu dogrultusunda geçmesiyle saflastirilir.
Sonuç olarak, saflastirma prosesi, diafiltrasyon dogrultusunda formülasyon tamponu üçerisine ürünün transfer edilmesiyle sonuca varmaktadir. Filtre edilmeyen kisim, en az 1 mg/mL bir protein konsantrasyonuna ayarlanir ve bir stabilizatör ilave edilir.
Baglanma aktivitesi Rekombinant Insan MühendislikTM antikorlarin MCSF baglayici aktivite degerlendirilir. Protein, bir protein A kolonu üzerinde pasaj ve ardindan Ana ile konsantrasyon belirleme ile çalkalama flaski kültür üst fazlarindan saflastirilir. Baglayici deneyleri, asagidaki Örnek 12 veya yukaridaki Örnek 1 içinde tarif edildigi gibi olusturulur. Immulon II plakalari, mikroplaka immobilize edilmesi için, bir PBS kaplama çözeltisinde önceden seyreltilmis sM-CSF antijei ile önceden kaplanir. 0,25 ila 20 ug/ml arasinda degisen çesitli M-CSF test konsantrasyonlari, 50 ul/çukurcuga ilave edilir ve bütün gece boyunca 4°C'de enkübe edilir. Plakalar daha sonra PBS-%0,05 Tween ile 3 kere yikanir. Bloklama, PBS-%0,05 Tween %l BSA içine ilave ve ardindan 37°C'de 30 dakikalik bir enkübasyon ile gerçeklestirilir. Immünoglobulin polipeptitlerinin seyreltileri, PBS-%0,05 Tween %1 BSA çözeltisi içinde hazirlanir. 2 veya 3 kat seri seyreltiler hazirlanir ve ikili veya üçlü halde ilave edilir (100 bul/çukurcuk). 37°C'de 90 dakikalik bir inkübasyondan sonra mikroplaka, PBS-%0,05 Tween ile 3 kere yikanir. Isaret gelisimi için, peroksidaz'a eslenik keçi anti-insan IgG (gama- veya Fc-spesifik) sekonder antikor, her çukurcuga ilave edilir ve sitrat tamponu arti %0,012 H202 içinde 0,4 mg/ml'de OPD'nin ilave edilmesiyle takiben 37°C'de 60 dakika boyunca enkübe edilir. Oda sicakliginda 5-10 dakikada sonra analiz, 100 ul lM H2SO4 eklenmesi ile durdurulur ve plakalar, 490 nm'de okunur. Hem. keçi anti-insan lgG (gama- spesifik) ve hem de keçi anti-insan IgG (Fc- spesifik) antikorlar uygulanmaktadir.
Asagidaki örnekte, örnegin modifiye edilmis veya modifiye edilmemis IgGl veya lgG4 sabit bölgesine sahip bir RXl Insan MühendislikTM dahil olmak üzere RXl ile türetilen veya RXl ile rekabet eden antikor, M-CSF spesifik antikor kullanilarak insanlarin tedavisi için bir prosedür belirtilir. Söz konusu prosedür, bir MCl veya MC3 türevi veya MCl veya MC3 ile rekabet eden antikor` için. de uygulanabilir; Beklenen. etkili dozlama araligi, 2 ug/kg ila 10 mg/kg arasindadir. Bu beklenti, deneysel veriler ile asagidaki rasyonel dogrulanmalara baglidir: Insan plazmasinda (hem saglikli hem de meme kanserli hastalar) ölçülen M-CSF seviyesi yaklasik 1 ng/ml'dir. M-CSF nötralize edici antikor RXl, 1 ng/ml insan M-CSF'ye karsi ölçülmüs ECw degeri 2 ng/ml'dir. Dolayisiyla insan plazmasi içindeki etkili antikor konsantrasyonunun, EC& degerine göre 10 ila 50.000 kat arasinda, baska bir deyisle insan plazmasi içindeki 20 ng/ml ila 100 ug/ml antikor olmasi beklenir. PK çalismalarina dayanilarak, insan hastalarda bu konsantrasyonnu meydana getirilmesi için, 2 pg/kg ila 10 mg/kg arasinda bir dozlama, plazma içinde 20 ng/ml ila 100 ug/ml antikor konsantrasyonaulasilmak için gereklidir.
Bu örnek, bir subkutan model içinde anti-MSF monoklonal antikorun anti-kanser aktivitesinin belirlenmesi için bir prosedürü düzenlemektedir. Yukaridaki Örnek 2'nin göstermis oldugu, anti-MSB' monoklonal antikor tedavisinin anlamli bir sekilde kemik iligi içinde tümör büyümesini inhibe ettigidir. Bu çalismanin amaci, antikorun ayni zamanda yumusak doku içinde tümör büyümesini inhibe edip etmedigini degerlendirilmesidir. haftalik yasta disi çiplak/çiplak fareler, ortalama agirlik ~20g, bu çalisma için kullanilabilir. Fareler, çalismanin baslangicindan önce en az 7 günlük bir alistirma süresine tabi tutulur. 0. günde, çiplak farelerin sag tarafina, her fare için kanseri enjekte edilebilir. Tümör hacmi 100-200 mm3 (genellikle tümör asilanmasi sonrasi 1 haftada) ulastiginda, fareler, asagidaki gibi grup basina 10 fare seklinde rastgele 5 gruba bölünür: 1) PES 2) RXl 3) 5Al 4) mIgG1+rIgG1 izotipi Ab kontrolü ) 5A1+RX1 Fareler, 4 hafta boyunca haftada bir 10 mpk'de belirtilen antikorlar ile intraperitoneal olarak tedavi edilir. Tümör hacmi 2000 mm3'e ulastiginda çalisma sonlandirilir. Alternatif olarak, hayvanlar ayni zamanda, asagidaki durumlarin herhangi birisine rastlandiginda ötenazi edilir: tümör yüzeyi ülserasyon, toplam tümör yüzeyi alaninin, anlamli vücut kaybinin (> %20), dehidrasyon ve ölümün %BO'den daha büyüktür. Tüm kan farelerin bütününden toplanir ve monosit popülasyonu, bir potansiyel yerini tutucu isaretleyici olarak analiz edilebilir. Tümör büyümesi/boyutu, 2-Boyutlu analiz ile ölçülür. Tümör genisligi ve uzunlugunun ölçümleri tümör hacminin hesaplanmasi için kullanilir. Yumusak dokudaki tümör büyümesinin yukarida bahsi geçen deneyin bir sonucu olarak inhibe edilmesi beklenir.
Asagidaki örnek, kanser metastazile iliskili ciddi osteolitik hastaligin tedavisi veya önlenmesi için kombinasyon terapisinin degerlendirilmesi için bir prosedürü düzenlemektedir.
Deneysel Dizayn. Yukarida Örnek 5 içinde tarif edilen çalisma, asagidaki beklentiler ile tarif edildigi gibi esasen tekrarlanir. Asagidaki tedavi gruplari içinde düzenlenen antikor kombinasyonu veya antikora ilaveten, hayvanlar asagidaki ilave Bisfosfonat (örnegin., Aredia; Zometa; Klodronat).
Cerrahi 3. Radyasyon Kemoterapi Hormon terapisi (örnegin., Tamoksifen; anti-Androjen terapisi) 6. Antikor terapi (örnegin., RANKL/RANK nötralize edici antikorlar; PTHrP nötralize edici antikor) 7. Terapötik protein terapisi (örnegin., çözünür RANKL reseptörü; OPG ve PDGF ve MMP inhibitörleri) 8. Küçük molekül ilaç terapisi (örnegin., Src-kinaz inhibitörü) 9. Oligonükleotidler terapisi (örnegin., RANKL veya RANK veya PTHrP Anti-sens) . Gen terapisi (örnegin., RANKL veya RANK inhibitörleri) ll. Peptid terapisi (örnegin. RANKL muteinleri) Tedavi gruplari asagidakiler gibidir. Yukaridaki ilave tedaviler, “arti terapi X” olarak asagida belirtilir: Sadece PES Sadece terapi X ile tedavi siçan lgGl izotip kontrolü murin 1G1 isotip kontrol . sadece RXl anti-insan MCSF 6 sadece 5A1 siçan IgGl anti-fare MCSE 7 siçan IgGl ve murin IgGl izotip kontrol kombinasyonu 8 RXl bir 5A1 kombinasyonu 9. siçan TgGl izotip kontrol arti terapi X . murin IGl isotip kontrol arti terapi X 11. RXl anti-insan MCSF arti terapi X 12. 5A1 siçan IgGl anti-fare MCSF arti terapi X 13. siçan IgGl ve murin IgGl izotip kontrol kombinasyonu arti terapi X 14. RXl ve 5A1 kombinasyon arti terapi X Dozlama: 0,1-30 mg/kg her antikor, her hayvana uygulanmasi için kullanilir. Tercih edilen dozlama lO mg/kg'dir. Uygulama yöntemi Tedavi, yukarida Örnek 5 içinde tarif edildigi gibi tümör hücrelerinin Ölçümler. Çesitli tedavi gruplari arasinda osteolizinin siddetinin degerlendirilmesi için, her fare, tümör hücrelerinin enjeksiyonu akabindeki günde alinan bir temel çizgisi Faxitron görüntüsü alinir. Bir F Faxitron görüntüsü ayni zamanda çalismanin sonunda da alinir (8 hafta). Tümör büyümesi, tümör hücrelerinin stabil olarak lusiferazi ifade ettiginden dolayi es zamanli olarak Ksenojen sistemi kullanilarak ölçülür. Kanser metastazi ile iliskili ciddi osteolitik hastaligin tedavisi ve önlenmesi için kombinasyon terapisinin, tek basina antikor terapisine göre ile gelistirildigi beklenir.
Asagidaki örnekte, floresans ile aktive edilmis hücre ayiklayici kullanilarak, M-CSF spesifik antikorunun örnegin meme kanseri hücrelerine (hücre hatti MDA23l) veya multipl miyelom kanser hücrelerine (hücre hatti ARH77) baglanma yeteneginin degerlendirilmesine yönelik bir protokol saglanmaktadir.
Hücreler, ilk önce (Caß, MgZi içermeyen) PBS ile iki kez yikanir.
Her 10 cm'lik plaka için, 2 ml 3 mM EDTA ilave edilir ve plakalar, hücreler yuvarlanana ve tabaktan ayilana kadar 2-3 dakika boyunca 37°C'de enkübe edilir. Daha sonra, 10 ml tampon A (PBS +7 %5 PES) ilave edilir ve karistirilir. Bu sirada hücreler topaklanir ve PBS+%5 FBS içinde yaklasik 5x106 hücre/ml'de yeniden askiya alinir` ve hücreler, lOO ;pl/numunede tübüller içerisine yerlestirilir.
Bu noktada, (M-CSF antikor veya kontrol antikorunun belirtilen konsantrasyonda kullanilan) 0,l-l0 ug/ml primer antikor ilave edilir. Seyreltme, gerektiginde, %5 FBS/PBS içinde yapilir.
Karisini daha sonra 4°C'de 30 dakika boyunca enkübe edilir.
Enkübasyon periyoduna takiben, hücreler 5 dakika boyunca 400 g'da santrifüj edilmesiyle 3 defa yikanir ve hücreler PBS içinde askiya alinir.
FITC veya PE etiketli anti-lgG antikoru (0,25 ug/numune), optimal seyreltide %1 BSA/PBS içinde seyreltilir ve hücreler, bu çözelti içinde yeniden askiya alinir ve 4°C'de 30 dakika boyunca enkübe edilir. Daha sonra hücreler yukarida tarif edildigi gibi 3 defa yikanir. Çukurlarin yikanmasinin ardindan hücreler, 0,5 ml/numune PI-PBS ile yeniden askiya alinir (gerektiginde ölü hücreler canli hücrelerden ayrilir). Hücreler ayrica sonraki analiz için sabitlenebilir(hücreler %0,l formaldehid ile sabitlendigi takdirde yaklasik 3 gün sürebilir). Hücreler, standart prosedürler kullanilarak bir floresans-aktif FACS içinde daha sonra analiz edilir.
Sekil 8A ve 8B içinde gösterildigi gibi, bir MCSE-spesifik antikor RXl, meme kanser hücre hatti MDA23l'e veya multipl miyelom kanser hücre hatti ARH77'ye belirtildigi gibi çesitli antikor konsantrasyonlarinda baglanir.
Asagidaki örnek, M-CSF'nin sayisiz bir kanser hücre yüzeyleri üzerinde yaygin oldugunu göstermektedir. M-CSF'nin immünohistokimyasal boyamasi, asagidakiler gibi gerçeklestirilen bir M-CSF-spesifik antikor RXl yürütülmektedir.
Baslangiçta lamlar, 1 saat boyunca 55 - 60°C'de bir firinda isitilir ve 2-3 dakika boyunca sogumaya birakilir. Asagidaki de- cilalama ve yeniden hidrasyon parametreleri kullanilmaktadir: a Ksilen 3 X 5 dakika b. %100 Reaktif Alkol 2 x 5 dakika c. %95 Reaktif Alkol 2 X 4 dakika d. %75 Reaktif Alkol 2 x 3 dakika e. %50 Reaktif Alkol 1 x 3 dakika f. dI H2O 2-3 hizli durulama Peroksit bloke etme adimi öncesi, antijen. geri kazanini 1 X Biogenex Citra Plus kullanilarak hazirlanir. Çözelti, baslangiç olarak kaynamasi için tam güçte mikro dalgada firinlanir. Ilk Önce çözelti kaynatilir, mikro dalga güç-seviyesi 2'de bir baska 13 dakika boyunca hizlica ayarlanir ve islem öncesi sogutulmasina olanak saglanir. Peroksit bloke etme adimi dI HzO) içine daldirilir ve 10 dakika boyunca oda sicakliginda birakilir. Lamlar, daha sonra dI HzO ile iki kez durulanir ve 2 x 2 dakika boyunca PBS ile bir kez yikanir.
Avidin/biyotin bloke etme prosedürü asagidaki gibi olusturulur.
Lamlar bir metal raf üzerine düz yerlestirilir. Bir Mavi PAP kalemi (hidrofobik lam isaretleyici), doku çevresinde kullanilir. Daha sonra dokulari kaplamak için yeterli 2 damla Zymed Avidin (Ayiraç A) ilave edilir ve lamlar, 10 dakika boyunca oda sicakliginda enkübe edilir. Enkübasyonun ardindan lamlar, asagidaki sekilde yikanir: 2 x 3 dakika PBS içinde 1 kere yikamala. 2 damla Zymed Biotin (Ayiraç B), 10 dakika boyunca oda sicakliginda. 2 x 3 dakika PBS içinde 1 kere yikamala.
Protein bloke etme prosedürü asagidaki gibi olusturulur.
Sekonder antikor türlerin %10 serum [%2 son konsantrasyona] ilave edilir. Daha sonra BioGenex Power Block, dl H2O ile 1 kere seyreltilir. Lamlarin rafi, oda sicakliginda 8 dakika boyunca Power Block içine gömülür` ve lamlar` 1 X PBS içinde 2 kez durulanir.
Primer antikorun (RXl) ilave edilmesi için lamlar, bir metal raf üzerinde düz bir sekilde yerlestirilir. Antikor, her bir bölümün (~35O pl) kaplanmasi için eklenir ve antikor, (gerekmesi halinde) doku kazinmadan pipet ucu ile dagitilir. Lamlar daha sonra oda sicakliginda 1 saat boyunca enkübe edilir. Inkübasyonu takiben, lamlar, 3 X her zaman 1 X PBS 3-5 dakika ile yikanir.
Bu noktada, BioGenex Multi-Link kisimlara uygulanir & oda sicakliginda lO-ll dakika boyunca enkübe edilir. Kisimlar daha sonra her zamanda 3 dakika yikanir.
Etiketleme, kisimlara BioGenex HRP etiketin uygulanmasiyla olusturulmakta olup daha sonra oda sicakliginda lO-ll dakika boyunca enkübe edilir ve 1 X PBS 3X3 dakika ile yikanir. Daha sonra BioGenex IhO2 subtrati, bölümlere (2,5 ml IhOz basina 1 damla AEC) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sicakliginda enkübe edilir. Bölümler, daha sonra dI H2O ile birkaç kez durulanir. Ikinci boyama adimi asagidaki gibi olusturulur.
Kisimlar` oda sicakliginda ], dakika, boyunca. hematoksilin ile boyanir. Daha sonra, kisimlar HZO ile iki kere durulur ve daha sonra 1 dakika boyunca 1 X PBS içinde enkübe edilir. Kisimlar daha sonra, PBS ayrilmasi için HZO ile durulanir. Kisimlar, kisma BioGenex Süper Montenin bir damlasinin uygulanmasiyla monte edilir ve daha sonra oda sicakliginda bütün gece boyunca hava ile kurutulur.
Sekil 9 içinde gösterildigi gibi, M-CSF, sayisiz kanser hücre yüzeyleri üzerinde yaygindir. Belirtilen kanser hücre tipler için kisimlar asagidaki gibi skorlanir: 0 Boyama yok 1 Boyama arka plana benzer 2 Pozitif ancak zayif boyama 3 Pozitif ve anlamli boyama 4 Pozitif ve kuvvetli boyama.
Asagidaki örnekte, MCl ve MC3 antikorünun üretilmesine yönelik prosedürü gösterilir. MCl ve MCE, insan M-CSF antikorünü nötralize eden ve insan M-CSR'ye baglanan iki monoklonal antikorüdur. Bu antikorlarin amino asit sekanslari sirasiyla Sekil 14 ve 15 içinde gösterilir. Bunlar, bir dizi adim ile tanimlanmakta olup, bu adimlar, a) rekombinant insan M-CSF ile Balb C farelerinin bagisiklanmasini; b) bir ELISA formatinda insan M-CSF'ye baglanan antikorlari üreten pozitif klonlarin taranmasini; c) stabil hibridom klonlarinin gelistirilmesi için pozitif klonlarin alt klonlanmasini; d) büyük miktarlarda antikorlarin üretilmesi için hücre kültürünün arttirilmasini; e) önceki örneklerde tarif edildigi gibi affinite analizi, hücre baglanmasi ve nötralizasyon aktivitesi deneyindeki antikorlarin saflastirilmasini ve karakterizasyonunu içermektedir.
Sekil 16A ve 16B'de, RXl, 5H4, MCl ve MC3 antikorlarin sirasiyla, agir ve hafif zincirlerinin CDR'lerinin hizalanmasini gösterilir.
Insanlastirilmis ve Insan MühendislikTM versiyonlari yukaridaki örneklerde tarif edildigi gibi gelistirilir.
Bu örnek, M-CSF antikorlar RXl ve 5H4, yani sira bunlarin Fab fragmanlarinin farkli nötralize edici aktivitelerini gösterir.
Asagidaki örnek ayni zamanda, antikorlar RXl, 5H4 ve MC3'ün M- CSF için degisken affinitelere sahip oldugunu gösterir. Bu örnek ayrica, yukarida bahsi geçen intakt antikorlarin affinitelerinin, yukarida bahsi geçen antikorlarin iliskili Fab fragmanlarindan yüksek oldugunu göstermektedir.
RXl ve 5H4'ün Fab fragmalarina karsi intakt RXl ve 5H4'ün nötralize edici aktiviteler, antikorun çesitli konsantrasyonlarinin mevcudiyetindeki M-CSF'ye bagli hücre proliferasyonunün ölçülmesiyle belirlenmektedir. Hücre proliferasyon, kimyasal parlaklik isigi boyamasi ile belirlenmektedir. Sekil 17 içinde gösterildigi gibi, intakt RXl yüksek potansiyele sahipken RXl'in Fab fragmani, potansiyelini kaybeder ve 5H4 ve 5H4 Fab fragmanina benzer davranir.
Yukarida bahsi geçen antikorlarin baglayici özellikleri, Biacore analizi kullanilarak analiz edilir. M-CSF'ye RXl, 5H4 ve MC3'ün ilgili affinitelerin belirlenmesi için tavsan anti-fare Fc, amin kenetlenmesi vasitasiyla bir CMS biyosensör çip üzerinde hareketsizlesir. Yukarida bahsi geçen antikorlar daha sonra anti-fare Fc/CM5 biyosensör çipi üzerinde Zul/dk'da 3 dakika boyunca 1,5 üg/ml'de yakalanir. MCSF, degisik konsantrasyonlarda (Rmax ~15) modifiye edilmis biyosensör yüzeyi üzerinde akar.
Test antikorlar ve antijen, 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCL, 3 mM EDTA, % içinde seyreltilir. Tüm deneyler 25°C'de gerçeklestirilir. Kinetik ve affinite sabitleri, l:l oraninda bir etkilesim modeli/global uyum ile Biaevaluation yazilimi (Biacore) kullanilarak belirlenir. Tablo 8 içinde asagida gösterildigi gibi, RXl, 5H4 ve MC3 ile iliskili en yüksek affinite ile M-CSF'ye baglanir.
RXl, 5H4 ve MCB'in intakt Mab ve Fab fragmanlarinin baglayici affinitesindeki ilgili farkliliklarin belirlenmesi için, bir alternatif konfigürasyon Biacore analizinde kullanilir. Özellikle M-CSF, amin kenetlemesi vasitasiyla CMS biyosensör çipi üzerinde immobilize edilir. 10 mM Na Asetat pH 4,0 içinde 0,05 ug/ml, RL:6-l2 RU elde edilmesi için 5 dakika boyunca 1 ul/dk'da enjekte edilir. Test antikoru (veya Fab fragmani), çesitli konsantrasyonlarda modifiye edilmis biyosensör yüzeyi üzerinde akar. Test antikorlari, 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCL, 3 mM EDTA, % içinde seyreltilir ve tüm deneyler 25°C'de gerçeklestirilir. Kinetik ve affinite sabitleri, l:l oraninda bir etkilesim Hmdeli/global uyum ile Biaevaluation yazilimi (Biacore) kullanilarak belirlenir. Tablo 9 içinde asagida gösterildigi gibi, RXl, teste edilmis diger antikorlar ile iliskili en yüksek affinite ile M-CSF'ye baglanir. RXl'in Fab fragmani, RXl holoprotein'e iliskili anlamli bir sekilde düsük affinite ile M-CSF'ye baglanir.
Baglanma affinitesi ve nötralizasyon verileri, RXl'in nötralizasyon aktivitesinin, esas olarak M-CSF için önemli ölçüde yüksek affinitesinden kaynaklandigini ve söz konusu yüksek affinitenin, en azindan kismen antikorun her iki kolunun M-CSF dimere es zamanli olarak baglanma yeteneginden kaynaklandigini belirtmektedir.
Asagidaki örnek, antikorlar RXl, 5H4 ve MC3 ile tanina M-CSF üzerinde lineer (örnegin, amino asit sekansi) ortaya çikarmaktadir.
Baslangiç olarak, epitop haritalama stratejisi, antikorlar RXl, 5H4 ve MC3'ün lineer epitoplari veya M-CSF içerisinde konformasyonal epitoplari taniyip tanimadigini tespit edilmesi için tasarlanmistir. Buna bagli olarak anti-M-CSF antikorlari, indirgeyici ve indirgeyici olmayan kosullar altinda 0,1 ug M- CSF'ye karsi test edilir. Sadece M-CSF'nin azalmamis formu antikorlarin her biri ile taninir, taninan epitoplarin dogada devam etmedigi farz edilir.
Daha sonra, M-CSF'nin lineer epitopu her antikor için belirlenir. Özellikle, SPOT'larin membranlari (Sigma Genosys) hazirlanmakta olup, burada bir amino asit dengesi ile sentezlenen 10 mer peptid ile örtüsen ilgi konusu M-CSF fragman sekansi selüloz membran destegi üzerine yüklenir. Bu membranlar daha sonra yukarida bahsi geçen antikorlar ile problanir ve reaktif SPOT'lar tanimlanir. Peptid sekansi daha sonra membran üzerinde karsilik gelen konumu ile tanimlanir ve pozitif reaktif peptidler içerisinde örtüssen amino asitler epitop olarak tanimlanir.
Sekil 18 içinde gösterildigi gibi, RXl, M-CSF üzerinde farkli konuma haritalanan 5H4 ve MC3'ten farkli bir lineer epitopa baglanir. RXl, Sekil 12'de RFRDNTPN (SEQ 1D NO: 120) veya RFRDNTAN (SEQ ID NO: 121), M-CSF'nin 98-105 amino asitleri ile temsil edilen lineer bir epitopa baglanir. 5H4, Sekil 12'de temsil edilen lineer bir epitopa baglanir. MCB, Sekil 12'nin M- CSF'nin (1) ITFEFVDOE (SEK ID NO: 122), amino asitler 65-73 ve Sekil 12'nin M-CSF'nin (2) FYETPLO (SEK ID NO: 123), amino asitler 138-144 ile temsil edilen iki lineer epitoplara baglanir. Örnek. 4A. içinde yukarida. tarif edildigi gibi. hazirlanan RXl antikorlarin Insan MühendislikTM versiyonlarinin baglayici affinitesi belirlenmektedir. Bu örnek, farkli IgG alt sinifi sabit bölgelerine sahip Insan MühendislikTM RXl antikorlarinin, farkli affinitelere sahip M-CSF'ye in vitro baglanmasini gösterir. Biocore analizi ile intakt antikorlarin baglanma affinitesinde nispi farkliliklarin belirlenmesi için M-CSF, amine kenetlenmesi yoluyla CMS biyosensör Çip üzerine immobilize edilir. 10 mM Na-Acetate pH 4,0 içinde 0,05 ug/ml M-CSF, RL=6- 12 RU'e ulasmak için 5 dakika boyunca 1 ul/dk'da enjekte edilir.
Test antikoru veya Fab fragmanlari, 2 kat seyreltmede 100 nm ila 1,5 nM araliginda degisen konsantrasyonlarda modifiye edilmis biyosensör yüzeyi üzerine akar. Test antikorlari, 0,01 M HEPES içinde seyreltilir ve tüm deneyler 25°C'de gerçeklestirilir. Her bir konsantrasyon noktasi ve tampon boslugu, üçlü halde yürütülür ve veriler, 3 dakikalik birlesme ve 8 dakikalik ayrisma üzerinde toplanir. Kinetik ve affinite sabitleri, bir 111 etkilesim model/global uyum ile Biaevalutin softvvare kullanilarak belirlenir. Asagidaki Tablo 10'da gösterilen sekilde heRX1-1.G1 ve heRX1-1.G4, murin RX1-M-CSF baglanma affinitesine en çok benzeyen affiniteler ile M-CSF'ye baglanir.
Antikor ka kd (sec-1) KD (nM) n:5 105 10-3 1,4 n:2 10'5 10'3 1,7 Aksine, asagidaki Tablo 11'de gösterildigi gibi, baglanma afinitesinde bir miktar degisiklik olmasina ragmen, Gamma-2 yapi1arinin tümü, ana murin antikoru i1e karsilastirildiginda baglanma afinitesinde en az 7 kat azalma sergilemistir.
Antikor ka (M-l sec-1) kd (sec-/) KD (nün Bu Örnekte, farkli lgG alt sinifi sabit bölgelerine sahip Insan MühendislikTM RXl antikorlarinin, in vitro farkli nötralizasyon aktivitelere sahip oldugu gösterilmektedir. M-CSF antikorlarinin nötralize edici aktivitesini test etmek için, M-NFS-60 hücre hattinin proliferasyon analizi kullanilmistir (Rockville, MD, USA'de bulunan ATCC'den temin edilebilen, Cas-Br.MuLV yabani tip ekotropik fare retroviroz ile uyarilmis miyelojenöz lösemiden türetilmis Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Erisim No. CRL-l838) Hücre hatti, hem interlökin 3 hem de M-CSF'ye yanit vermektedir ve bir retrovirüsün entegrasyonu nedeniyle kesilmis c- myb proto-onkojeni içermektedir). M-NFS-60'in proliferasyonu, doza bagimli bir sekilde aktif M-CSF gerektirmektedir. Deneyde, M- NFS-60 hücreleri yikanir ve %10 PES ve %1 Pen/Strep ile RPIM1640 içinde plakalanir. Rekombinant, insan, M-CSF (3000 U/ml M-CSF aktivitesine esdeger olan 10 ng/ml nihai konsantrasyonda), bir enkübatorde %5 COZ içinde 1 saat boyunca 37°C'de l ug/ml ila 0,5 ng/ml arasinda degisen konsantrasyonlarda (seri 2 kat seyreltme halinde) antikorlar ile enkübe edilir. Enkübasyonun ardindan karisim, 96 çukurcuklu mikrotitre plakalarda M-NFS-60 kültürüne ilave edilir. Çukurcuk basina toplam deney hacmi, 10 ng/ml M- CSE' ile 100 ul idi ve antikor konsantrasyonubelirtilmistir.
Hücreler, hücre sayilarinin HücreTitre Glo deneyi (Promega) ile ölçülmeden Önce, 72 saat boyunca %5 C02 altinda 37°C'de enkübe edilir. Her antikor, bir sonraki günde bir tekrar ile üç kere test edilir (antikor basina alti deneylerin bir toplami için).
Her antikorun ICSO egri uyumu ile analiz edilir.
Deney, serum içinde insan MCSF, MDA231 kosullu ortam (M-CSF içeren), serum içinde sinomolgus maymunu ce sinomolgus maymun rekombinant MCSF kullanilarak tekrarlanir. Sonuçlar, hücre sayisi ile dogrusal CellTitre Glo deneyinden floresans okuma olarak Sekil 25 (rekombinat MCSF), 26 (serum içinde insan MCSF) ve 27'de (MDA231 kosullu ortam) sunulmaktadir. Antikorlarin nötralize edici aktivitesi M-NFS-öO hücrelerinin proliferasyonunun bir inhibisyonu olarak gösterilir.
Sonuçlar, heRXl-l-lgGl ve heRXl-l-lgG4'ün. lCSO degerlerinin, rekombinant murin ana RXl antikoru ile neredeyse ayni oldugunu gösterirken, heRXl-l- IgGZ'nin ICSO degeri, yaklasik 2 kat ila Tablo 12, Örnek 4A içinde yukarida tarif edildigi gibi hazirlanan çesitli IgG2 yapilarinin iliskili ICSO (ICSO kat kaybi bakimindan) gösterir. Bu yapilar arasindan heRXl-l.G2 ve heRXl- lO.G2, ICSO degerinde en az azalmayi gösterir.
Antikor Kat kaybi heRXl-l.G2 2.8x heRXl-2.G2 3.1x heRXl-3.G2 5.3x heRXl-4.GZ 4.6x heRXl-5.G2 6.5x heRXl-6.G2 5.9x heRXl-7.G2 heRXl-8.G2 heRXl-9.G2 3.6x heRXl- 2.2x heRXl-l.Gl Kayip yok heRXl-l.G4 Kayip yok heRXl- Kayip yok heRXl- Kayip yok .G4 Bu örnekte, farkli IgG alt sinifi bölgelerine sahip Insan MühendislikTM RXl antikorlarinin, in vitro osteoklastogenez deneyinde farkli TRAP aktivitelerine sahip oldugu gösterilmektedir.
Insan kemik iligi CD34+ hücreleri (Biowhittaker katalog numarasi 2M-lOl A, 3x 105 hücre/ flakon), burada tarif edilen deneysel kosullar altinda osteoklastlara farklilastirilmasi için tetiklenir. l.günde, CD34+ hücreleri, dondurulmus bir flakondan ml ortam içerisine (%10 FCs ile Alfa MEM, 1 x Pen Strep ve 1 x fungizon) eritilir. Hücreler bir kere yikanir ve 2 ml ortam içinde yeniden askiya alinir ve Çukurcuk basina 100 ul'de bir 96 çukurcuklu plaka içerisine yerlestirilir. 2.günde, orijinal ortamdan çikarilmadan, 100 ng/ml bir son konsantrasyona 50 ul 4x CSF-l ila 30 ng/ml son konsantrasyon ve 50 ul 4x RANKL (sRANKL, Chemicon katalogu # GFO9l, 10 ug/paket) her bir çukurcuga ilave edilir. 7. günde her bir çukurcuga 100 ng/ml'lik nihai konsantrasyona kadar 50 ul 5x RANKL ilave edilir. l7.günde hücreler TRAP aktivitesi için boyanir (TRAP boyamasi için Lokosit Asit Fosfataz kiti, Sigma katalog # 387-A) ve mikroskop altinda incelenir.
M-CSF-nötralize edici antikorlar deneyin 2.gününde ilave edilir.
Antikorlar, Sekil 28 içinde gösterildigi gibi bir doza bagimli yöntemde osteoklast farklilasmasini inhibe etmektedir.
Osteoklast farklilasmasi deneyindeki antikorlarin inhibitör aktivitesi, deneyin 17. gününde görünür osteoklastlarin yoksunlugu olarak gösterilir.
Farkli IgG alt sinifi sabit bölgeleri ile Insan MühendislikTM RXl antikorlari ayrica karakterize edilir. Çesitli Insan MühendislikTM RXl antikorlarinin MCSF ile olusturuldugu antijen-antikor kompleksleri, esit molar oranlardaki tampon içinde M-CSF ve antikorun kombine edilmesiyle akabinde boyut dislama kromatografisi veya isik saçilmasi kullanilarak antijen-antikor kompleksinin boyutunun analiz edilmesiyle çalisilmaktadir. Sonuçlarda murin ebeveyn RXl'in, yaklasik 200 kDa'lik MCSF ile lzl oraninda kompleksler olusturdugu görülür. heRXl-9.G2 veya l-lO.G2 antikorlarinin, yaklasik 400 kDa'lik MCSE ile 2:l ya da 2:2 oraninda kompleksler olusturdugu görülür. heRXl-l.G2'nin, 2 x 106 Da'dan daha büyük MCSF ile birlikte büyük kafes agregatlari olusturdugu görülür. kompleksler olusturur. heRXl-1.G4'ün indirgeyici veya indirgeyici olmayan SDS-PAGE'inin denatüre edilmesi ile IgG4 versiyonunun beklendigi gibi yari- antikorlari olusturdugu görülür. Önceki anlatilanlardan anlasilabilecegi gibi, bulusun spesifik uygulamalarin açiklama amaciyla bunun içinde tarif edilmesine ragmen, çesitli modifikasyonlar bulusun kapsamindan sapmadan yapilabilmektedir.

Claims (15)

    ISTEMLER (i) SEK ID NO: llö'da ifade edilen sekansi içeren bir agir zincir; ve (ii)SEK ID NO: 53'te ifade edilen hafif zincir degisken bölge sekansini içeren bir hafif zincir, ve farmasötik olarak uygun bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici içeren farmasötik bir bilesim olup, özelligi; söz konusu bilesimin, uygun bir çözelti ile sulandirmak için uygun bir toz olmasidir. 2. Bir konteynir ve bir etiket içeren bir ürün olup, özelligi; söz konusu konteynirin, bir sise, flakon, siringa ve test tüpü arasindan seçilmesi ve söz konusu konteynirin, asagidakileri içeren bir antikoru içeren bir bilesimi muhafaza etmesidir: (i) SEK ID NO: ll6'da ifade edilen sekansi içeren bir agir zincir; ve (ii)SEK ID NO: 53'te ifade edilen hafif zincir degisken bölge sekansini içeren bir hafif zincir. 3. Istem l'e göre farmasötik bilesim veya istem Z'ye göre ürün olup, özelligi; söz konusu hafif zincirin bir insan kappa sabit bölgesini içermesidir. 4. Istem l-3'ten herhangi birine göre farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu bilesimin, steril fosfat tamponlu salin, bakteriyostatik su veya su, tamponlu su, %O,4 salin ve %0,3 glisin arasindan seçilen sulu bir tasiyici olan bir tasiyici içermesidir. 5. Istem 1-3'ten herhangi birine göre farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu bilesimin, fosfat, sitrat ve diger organik asitler; askorbik asit ve metiyonin dahil antioksidanlar; koruyucular (örnegin oktadesildimetilbenzil amonyum klorür; heksametonyum klorür; benzalkonyum klorür, benzetonyum klorür; fenol, bütil veya benzil alkol; alkil parabenler, örnegin metil veya propil paraben; katekol;
  1. ISTEMLER (i) SEK ID NO: llö'da ifade edilen sekansi içeren bir agir zincir; ve (ii)SEK ID NO: 53'te ifade edilen hafif zincir degisken bölge sekansini içeren bir hafif zincir, ve farmasötik olarak uygun bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici içeren farmasötik bir bilesim olup, özelligi; söz konusu bilesimin, uygun bir çözelti ile sulandirmak için uygun bir toz olmasidir.
  2. 2. Bir konteynir ve bir etiket içeren bir ürün olup, özelligi; söz konusu konteynirin, bir sise, flakon, siringa ve test tüpü arasindan seçilmesi ve söz konusu konteynirin, asagidakileri içeren bir antikoru içeren bir bilesimi muhafaza etmesidir: (i) SEK ID NO: ll6'da ifade edilen sekansi içeren bir agir zincir; ve (ii)SEK ID NO: 53'te ifade edilen hafif zincir degisken bölge sekansini içeren bir hafif zincir.
  3. 3. Istem l'e göre farmasötik bilesim veya istem Z'ye göre ürün olup, özelligi; söz konusu hafif zincirin bir insan kappa sabit bölgesini içermesidir.
  4. 4. Istem l-3'ten herhangi birine göre farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu bilesimin, steril fosfat tamponlu salin, bakteriyostatik su veya su, tamponlu su, %O,4 salin ve %0,3 glisin arasindan seçilen sulu bir tasiyici olan bir tasiyici içermesidir.
  5. 5. Istem 1-3'ten herhangi birine göre farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu bilesimin, fosfat, sitrat ve diger organik asitler; askorbik asit ve metiyonin dahil antioksidanlar; koruyucular (örnegin oktadesildimetilbenzil amonyum klorür; heksametonyum klorür; benzalkonyum klorür, benzetonyum klorür; fenol, bütil veya benzil alkol; alkil parabenler, örnegin metil veya propil paraben; katekol; resorsinol; sikloheksanol; 3-pentanol; ve Hrkresol); düsük molekül agirlikli (yaklasik 10 kalintinin altinda) polipeptidler; proteinler, örnegin serum. albümin, jelatin veya immünoglobülinler; hidrofilik polimerler, örnegin polivinilpirolidon; amino asitler, örnegin glisin, glutamin, asparagin, histidin, arginin veya lizin; monosakaritler, disakaritler ve diger karbonhidratlar, örnegin glukoz, mannoz veya dekstrinler; selatlama ajanlari, örnegin EDTA; sekerler, örnegin sukroz, manitol, trehaloz veya sorbitol; tuz olusturan karsi iyonlar, örnegin sodyum; metal kompleksleri (örn. Zn-protein kompleksleri); ve/veya iyonik olmayan yüzey aktif' ajanlar, örnegin TWEENW, PLURONICSTM veya jpolietilen glikol (PEG) arasindan seçilen bir tasiyici içermesidir. 6. Önceki istemlerin herhangi birine göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; tedavide kullanilmaya yönelik olmasidir. 7. Istem 6'ya göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; asagidaki yöntemlerde kullanilmaya yönelik olmasidir: (a) terapötik olarak etkili bir miktarda bir antikorun ihtiyaci olan bir bireye uygulanmasini içeren kanserin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem; (b) osteolisize neden olan veya katkida bulunan bir hastaliktan muzdarip bir bireye kemik kaybini önlemek veya azaltmak için terapötik olarak etkili bir Iniktarda, hastalik ile iliskili kemik kaybini önlemek veya azaltmak için etkili bir Hdktarda antikorun uygulanmasini içeren bir yöntem ve söz konusu hastaligin, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger resorsinol; sikloheksanol; 3-pentanol; ve Hrkresol); düsük molekül agirlikli (yaklasik 10 kalintinin altinda) polipeptidler; proteinler, örnegin serum. albümin, jelatin veya immünoglobülinler; hidrofilik polimerler, örnegin polivinilpirolidon; amino asitler, örnegin glisin, glutamin, asparagin, histidin, arginin veya lizin; monosakaritler, disakaritler ve diger karbonhidratlar, örnegin glukoz, mannoz veya dekstrinler; selatlama ajanlari, örnegin EDTA; sekerler, örnegin sukroz, manitol, trehaloz veya sorbitol; tuz olusturan karsi iyonlar, örnegin sodyum; metal kompleksleri (örn. Zn-protein kompleksleri); ve/veya iyonik olmayan yüzey aktif' ajanlar, örnegin TWEENW, PLURONICSTM veya jpolietilen glikol (PEG) arasindan seçilen bir tasiyici içermesidir.
  6. 6. Önceki istemlerin herhangi birine göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; tedavide kullanilmaya yönelik olmasidir.
  7. 7. Istem 6'ya göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; asagidaki yöntemlerde kullanilmaya yönelik olmasidir: (a) terapötik olarak etkili bir miktarda bir antikorun ihtiyaci olan bir bireye uygulanmasini içeren kanserin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem; (b) osteolisize neden olan veya katkida bulunan bir hastaliktan muzdarip bir bireye kemik kaybini önlemek veya azaltmak için terapötik olarak etkili bir Iniktarda, hastalik ile iliskili kemik kaybini önlemek veya azaltmak için etkili bir Hdktarda antikorun uygulanmasini içeren bir yöntem ve söz konusu hastaligin, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit, ve romatoid. artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/Veya Paget hastaligi arasindan seçilmesi; (c) osteolisize neden olan veya katkida bulunan bir hastaliktan muzdarip bir bireye için terapötik olarak etkili bir miktarda, hastalik ile iliskili kemik kaybininin siddetini azaltmak için etkili bir miktarda antikorun uygulanmasini içeren bir yöntem ve söz konusu hastaligin, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit, ve romatoid. artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/Veya Paget hastaligi arasindan seçilmesi; veya (d) kemige metastaz yapan kanseri önlemeye veya tedavi etmeye yönelik, metastatik kanserden muzdarip bir bireye terapötik olarak etkili bir miktarda antikor uygulanmasini içeren bir yöntem ve metastatik kanserin, meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid, protat, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücresi maligniteleri; bas ve boyun kanserleri; özofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, ince bagirsak kanseri, kolorektal kanseri, rektal kanseri, pankreatik kanseri, karaciger kanseri, safra kanali ve safra kesesi kanser dahil hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit, ve romatoid. artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/Veya Paget hastaligi arasindan seçilmesi; (c) osteolisize neden olan veya katkida bulunan bir hastaliktan muzdarip bir bireye için terapötik olarak etkili bir miktarda, hastalik ile iliskili kemik kaybininin siddetini azaltmak için etkili bir miktarda antikorun uygulanmasini içeren bir yöntem ve söz konusu hastaligin, endokrinopatiler dahil (hiperkortizolizm, hipogonadizm, primer veya sekonder hiperparatiroidizm, hipertiroidizm dahil) nispeten yüksek osteoklast aktivitesi ile iliskili metabolik kemik hastaliklari, hiperkalsemi, eksiklik durumlari (rasitizm/ osteomalazi, skorbüt, malnütrisyon dahil), kronik hastaliklar (malabsorbsiyon sendromlari, kronik böbrek yetmezligi (böbrek osteodistrofisi dahil), kronik karaciger hastaligi (hepatik osteodistrofi dahil), ilaçlar (glukokortikoidler (glukokortikoid kaynakli osteoporoz), heparin, alkol dahil) ve kalitsal hastaliklar (osteogenezis imperfekta, homosistinüri dahil), kanser, osteoporoz, osteopetroz, artrit, ve romatoid. artritit ile iliskili kemik inflamasyonu, periodontal hastalik, fibröz displazi ve/Veya Paget hastaligi arasindan seçilmesi; veya (d) kemige metastaz yapan kanseri önlemeye veya tedavi etmeye yönelik, metastatik kanserden muzdarip bir bireye terapötik olarak etkili bir miktarda antikor uygulanmasini içeren bir yöntem ve metastatik kanserin, meme, akciger, böbrek, multipl miyelom, tiroid, protat, adenokarsinoma, lösemi ve lenfoma dahil kan hücresi maligniteleri; bas ve boyun kanserleri; özofagus kanseri, mide kanseri, kolon kanseri, ince bagirsak kanseri, kolorektal kanseri, rektal kanseri, pankreatik kanseri, karaciger kanseri, safra kanali ve safra kesesi kanser dahil gastrointestinal kanserler; over karsinom, uterin endometriyal kanserleri, vajinal kanserler ve servikal kanser dahil kadin genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma ve malignan melanom veya skuamoz hücre kanseri dahil cilt kanseri arasindan seçilmesidir. 8. Istem l-5'ten herhangi birine göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ayrica ikinci bir terapötik ajan içermesidir. 9. Istem 6 veya istem 7'ye göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu antikorun uygulanmasinin, ikinci bir terapötik ajanin kullanildigi tedavi ile koordine edilmesidir. 10. Istem 8'e göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün veya Istem 9'a göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ikinci terapötik ajanin, baska bir antikor olmasidir. 11. Istem 8'e göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün veya Istem 9'a göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ikinci terapötik ajanin, bir kanser kemoterapötik ajan olmasidir. 12. Istem 8'e göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün veya Istem 9'a göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ikinci terapötik ajanin, bir bisfosfonat olmasi ve istege bagli olarak söz konusu bisfosfonatin, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronattir. veya ibandronat olmasidir. 13. Istem 6, 7 veya 9-ll'den herhangi birine göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu denegin, bisfosfonat tedavisi almasinin engellenmesidir. 14. Istem 9 ila l3'ten herhangi birine göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; soz konusu antikorun, terapötik bir etki elde etmek için gerek ikinci terapötik ajanin dozajinin azaltilmasi için etkili gastrointestinal kanserler; over karsinom, uterin endometriyal kanserleri, vajinal kanserler ve servikal kanser dahil kadin genital yolu maligniteleri; mesane kanseri; nöroblastoma dahil beyin kanseri; sarkoma, osteosarkoma ve malignan melanom veya skuamoz hücre kanseri dahil cilt kanseri arasindan seçilmesidir.
  8. 8. Istem l-5'ten herhangi birine göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ayrica ikinci bir terapötik ajan içermesidir.
  9. 9. Istem 6 veya istem 7'ye göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu antikorun uygulanmasinin, ikinci bir terapötik ajanin kullanildigi tedavi ile koordine edilmesidir.
  10. 10. Istem 8'e göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün veya Istem 9'a göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ikinci terapötik ajanin, baska bir antikor olmasidir.
  11. 11. Istem 8'e göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün veya Istem 9'a göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ikinci terapötik ajanin, bir kanser kemoterapötik ajan olmasidir.
  12. 12. Istem 8'e göre üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün veya Istem 9'a göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; ikinci terapötik ajanin, bir bisfosfonat olmasi ve istege bagli olarak söz konusu bisfosfonatin, zeledronat, pamidronat, klodronat, etidronat, tilundronat, alendronattir. veya ibandronat olmasidir.
  13. 13. Istem 6, 7 veya 9-ll'den herhangi birine göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; söz konusu denegin, bisfosfonat tedavisi almasinin engellenmesidir.
  14. 14. Istem 9 ila l3'ten herhangi birine göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim veya ürün olup, özelligi; soz konusu antikorun, terapötik bir etki elde etmek için gerek ikinci terapötik ajanin dozajinin azaltilmasi için etkili olmasidir. 15. Istem 6, 7 veya 9-14'ten herhangi birine göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim› veya ürün olup, özelligi; söz konusu denegin bir memeli olmasidir. olmasidir.
  15. 15. Istem 6, 7 veya 9-14'ten herhangi birine göre kullanilmak için üretilmeye yönelik farmasötik bilesim› veya ürün olup, özelligi; söz konusu denegin bir memeli olmasidir.
TR2018/15885T 2004-01-07 2005-01-06 M-csf spesifik monoklonal antikorlar ve bunların kullanımı. TR201815885T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53518104P 2004-01-07 2004-01-07
US57641704P 2004-06-02 2004-06-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201815885T4 true TR201815885T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=34798846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/15885T TR201815885T4 (tr) 2004-01-07 2005-01-06 M-csf spesifik monoklonal antikorlar ve bunların kullanımı.

Country Status (25)

Country Link
US (6) US20090324604A1 (tr)
EP (3) EP2311873B1 (tr)
JP (3) JP5422101B2 (tr)
KR (2) KR101307868B1 (tr)
CN (2) CN101189264B (tr)
AU (1) AU2005205533B2 (tr)
BR (1) BRPI0506726B8 (tr)
CA (1) CA2552750C (tr)
CY (1) CY1121162T1 (tr)
DK (2) DK1704166T3 (tr)
EC (1) ECSP066756A (tr)
ES (2) ES2689328T3 (tr)
HK (1) HK1095841A1 (tr)
HU (2) HUE026132T2 (tr)
IL (1) IL176755A (tr)
LT (1) LT2311873T (tr)
MX (1) MXPA06007856A (tr)
NO (1) NO341391B1 (tr)
NZ (1) NZ548785A (tr)
PL (2) PL2311873T3 (tr)
PT (2) PT2311873T (tr)
RU (2) RU2401277C2 (tr)
SI (2) SI1704166T1 (tr)
TR (1) TR201815885T4 (tr)
WO (1) WO2005068503A2 (tr)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6913697B2 (en) 2001-02-14 2005-07-05 Science & Technology Corporation @ Unm Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes
CA2500392C (en) 2002-09-27 2012-11-27 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
PT2311873T (pt) 2004-01-07 2018-11-20 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Anticorpo monoclonal específico para m-csf e respetivos usos
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
JP5657862B2 (ja) * 2005-07-28 2015-01-21 ノバルティス アーゲー Ｍ−ｃｓｆに対する抗体の使用
EP2311876A3 (en) * 2005-07-28 2011-04-27 Novartis AG M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
JP5580535B2 (ja) * 2006-01-05 2014-08-27 ノバルティス アーゲー 癌転移および癌転移に関連する骨量減少を予防および処置するための方法
WO2007143139A1 (en) 2006-05-31 2007-12-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Abcb5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
EP2059535B1 (en) 2006-08-18 2013-11-06 Novartis AG Prlr-specific antibody and uses thereof
WO2008030611A2 (en) 2006-09-05 2008-03-13 Medarex, Inc. Antibodies to bone morphogenic proteins and receptors therefor and methods for their use
NZ576855A (en) * 2006-10-12 2012-08-31 Forerunner Pharma Res Co Ltd Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
CA2675291C (en) 2007-01-11 2017-05-23 Novo Nordisk A/S Killer ig-like receptor (kir) antibodies, formulations, and uses thereof
LT2644205T (lt) 2007-04-12 2018-12-10 The Brigham And Women`S Hospital, Inc. Nutaikymas į abcb5 vėžio terapijai
US8470977B2 (en) 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
CN101970496B (zh) 2008-03-14 2014-04-16 特朗斯吉有限公司 针对csf-1r的抗体
ES2579554T3 (es) * 2008-05-09 2016-08-12 Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg Anticuerpos para el receptor de productos terminales de glicación avanzada (RAGE) y usos de los mismos
JP5808052B2 (ja) 2009-05-29 2015-11-10 中外製薬株式会社 Ｅｇｆファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
RU2565539C2 (ru) 2010-02-18 2015-10-20 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния АНТИТЕЛА, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ ИНТЕГРИН ανβ8
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
BR112013017585A2 (pt) 2011-01-10 2020-11-24 The Regents Of The University Of Michigan inibidor do fator de células-tronco
JP6289098B2 (ja) * 2011-01-10 2018-03-07 ノビミューン エスアー 抗ｔｌｒ４抗体およびその使用法
KR20160044598A (ko) * 2011-03-29 2016-04-25 로슈 글리카트 아게 항체 Fc 변이체
ES2618828T3 (es) 2011-07-18 2017-06-22 The University Of Melbourne Uso de antagonistas de c-Fms
JP6093360B2 (ja) * 2011-08-17 2017-03-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インテグリンα−ｖβ−８と結合する抗体
KR102056932B1 (ko) * 2011-10-10 2019-12-17 시티 오브 호프 메디토프와 메디토프-결합 항체 및 이들의 용도
RU2473367C1 (ru) * 2011-11-22 2013-01-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение "Радиевый институт им. В.Г. Хлопина" Способ изготовления стента для радиационной терапии злокачественных опухолей желчного протока
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
JP6192022B2 (ja) 2012-05-21 2017-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗Ｌｙ６Ｅ抗体及びイムノコンジュゲート並びに使用方法
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
DK2900263T3 (da) 2012-09-26 2019-07-29 Univ Wuerzburg J Maximilians Monoklonale antistoffer mod vækst- og differentieringsfaktor 15 (gdf-15)
CN105228649B (zh) 2013-03-14 2019-01-18 雅培制药有限公司 Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物
US9371374B2 (en) 2013-03-14 2016-06-21 Abbott Laboratories HCV core lipid binding domain monoclonal antibodies
MX2015012824A (es) 2013-03-14 2016-06-24 Abbott Lab Antigenos recombinantes ns3 del vhc y mutantes de los mismos para la deteccion mejorada de anticuerpos.
EP2984106B1 (en) * 2013-04-12 2019-03-06 MorphoSys AG Antibodies targeting m-csf
WO2015006554A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
KR102332302B1 (ko) * 2013-09-13 2021-12-01 제넨테크, 인크. 세포주에서 숙주 세포 단백질 및 재조합 폴리펩티드 생성물을 검출 및 정량화하기 위한 조성물 및 방법
CA3184564A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising an anti-il13 antibody and residual hamster phospholipase b-like 2
AR098126A1 (es) 2013-10-21 2016-05-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6e (locus e del complejo del antígeno 6 linfocítico), inmunoconjugados y métodos para usarlos
JP6685225B2 (ja) 2013-12-16 2020-04-22 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 形質細胞様樹状細胞の枯渇
CN106536553B (zh) 2014-03-26 2021-03-12 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学 生长和分化因子15(gdf-15)的单克隆抗体及其治疗癌性恶病质和癌症的用途
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
BR112017007379A2 (pt) 2014-10-14 2017-12-19 Dana Farber Cancer Inst Inc moléculas de anticorpo para pd-l1 e usos das mesmas
WO2016120828A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Novartis Ag Treatment of breast cancer by m-csf antagonist
CN107405401B (zh) 2015-02-26 2022-02-01 默克专利股份公司 用于治疗癌症的pd-1/pd-l1抑制剂
SG11201706882VA (en) * 2015-03-31 2017-09-28 Vhsquared Ltd Polypeptides
KR20180018762A (ko) 2015-06-16 2018-02-21 메르크 파텐트 게엠베하 Pd-l1 길항제 조합 치료
TN2017000554A1 (en) * 2015-07-29 2019-04-12 Novartis Ag Novel combination for use in the treatment of cancer
PL3317301T3 (pl) 2015-07-29 2021-11-15 Novartis Ag Terapie skojarzone zawierające cząsteczki przeciwciał przeciw lag-3
EP3328418A1 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
EP3316902A1 (en) 2015-07-29 2018-05-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
CA2998350A1 (en) * 2015-09-16 2017-03-23 John Lippincott Anti-cd115 antibodies
CN108495651A (zh) 2015-12-17 2018-09-04 诺华股份有限公司 抗pd-1的抗体分子及其用途
CN109661239A (zh) * 2016-07-29 2019-04-19 西奈山伊坎医学院 通过抑制fsh/fshr减少肥胖的组合物和方法
BR112019006504A2 (pt) 2016-10-06 2019-06-25 Merck Patent Gmbh regime de dosagem de avelumabe para o tratamento de câncer
WO2018089300A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
MY191926A (en) 2016-12-01 2022-07-18 Regeneron Pharma Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
WO2018165417A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 Shriners Hospitals For Children Type x collagen assays and methods of use thereof
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
CN110913906A (zh) 2017-05-02 2020-03-24 默沙东公司 抗lag3抗体的制剂和抗lag3抗体与抗pd-1抗体的共制剂
JP6356317B1 (ja) * 2017-06-05 2018-07-11 国立大学法人北海道大学 多発性骨髄腫患者の医薬への応答性を判定する方法、並びに多発性骨髄腫患者における骨病変の予防及び／又は治療のための医薬
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
CN118307674A (zh) 2017-06-22 2024-07-09 诺华股份有限公司 针对cd73的抗体分子及其用途
US11976121B2 (en) 2017-07-20 2024-05-07 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CD123-binding chimeric antigen receptors
WO2019099838A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
BR112020015052A2 (pt) * 2018-02-09 2020-12-08 Genmab A/S Composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, métodos para tratar câncer em um sujeito, para preparar uma composição farmacêutica e para preparar uma forma de dosagem unitária, forma de dosagem unitária, recipiente, e, kit-de-partes
AR126019A1 (es) 2018-05-30 2023-09-06 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020044252A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Dosage regimes for anti-m-csf antibodies and uses thereof
CN113056482A (zh) * 2018-10-18 2021-06-29 默沙东公司 抗rsv抗体的制剂及其使用方法
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
CN113329792B (zh) 2019-02-15 2024-06-28 诺华股份有限公司 取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
CN113490528A (zh) 2019-02-15 2021-10-08 诺华股份有限公司 3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
JP7513709B2 (ja) * 2019-10-17 2024-07-09 ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ 抗コハク酸モノクローナル抗体およびヒト化抗コハク酸抗体
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
CN111087470B (zh) * 2020-01-19 2022-05-10 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人CD47单克隆抗体7G4mAb及其应用
CA3182346A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US20230271940A1 (en) 2020-08-03 2023-08-31 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
US20240059744A1 (en) * 2022-07-25 2024-02-22 Interius Biotherapeutics, Inc. Mutated polypeptides, compositions comprising the same, and uses thereof

Family Cites Families (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
GB2056642B (en) 1979-08-08 1983-05-11 Dawson Int Radio frequency drying of textile material
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
JPS6213552A (ja) 1985-07-12 1987-01-22 Nippon Light Metal Co Ltd 流電陽極用アルミニウム合金
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4929700A (en) 1987-04-16 1990-05-29 Cetus Corporation Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
WO1990009400A1 (en) 1989-02-10 1990-08-23 Cetus Corporation M-csf monoclonal antibodies that recognize a neutralizing conformational epitope
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB8915572D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Natural Environment Res Use of bluetongue virus proteins as vaccine components
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
EP0506855A1 (en) 1989-12-15 1992-10-07 Chiron Corporation Cytokine antibody for the treatment of sepsis
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69133566T2 (de) * 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JPH0517367A (ja) 1991-07-08 1993-01-26 Green Cross Corp:The 骨粗鬆症治療剤
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JPH0595794A (ja) * 1991-10-04 1993-04-20 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
JP4157160B2 (ja) * 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
ATE244763T1 (de) 1992-02-11 2003-07-15 Cell Genesys Inc Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
NZ258392A (en) 1992-11-13 1997-09-22 Idec Pharma Corp Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona
JPH06319584A (ja) * 1993-05-07 1994-11-22 Morinaga Milk Ind Co Ltd 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ
US5807549A (en) 1993-05-21 1998-09-15 Research Corporation Technologies, Inc. Lymphocyte chemoattractant factor and uses thereof
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6054287A (en) 1994-05-27 2000-04-25 Methodist Hospital Of Indiana, Inc. Cell-type-specific methods and devices for the low temperature preservation of the cells of an animal species
CA2200097A1 (en) * 1994-09-16 1996-03-21 Cancer Research Fund Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the mc3 anti-ba46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6025146A (en) * 1995-06-05 2000-02-15 Chiron Corporation Identification of M-CSF agonists and antagonists
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
GB9712818D0 (en) 1996-07-08 1997-08-20 Cambridge Antibody Tech Labelling and selection of specific binding molecules
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6017757A (en) 1997-02-20 2000-01-25 Mississippi State University Isolated viable nematode intestinal cells
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
IL123888A0 (en) 1997-04-01 1998-10-30 Sankyo Co Anti-fas antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
RU2238949C2 (ru) 1997-04-15 2004-10-27 Санкио Компани Лимитед Белок, специфически связывающийся с ингибирующим остеокластогенез фактором (ocif) (варианты), днк его кодирующая (варианты), днк в качестве зонда (варианты), способ получения белка (варианты), способ скрининга вещества (варианты), антитело (варианты), способ получения поликлонального антитела, гибридома (варианты), способ получения моноклонального антитела, способ измерения ocif-связывающего белка, фармацевтическая композиция (варианты) и лекарственное средство (варианты)
US20030044772A1 (en) 1997-08-04 2003-03-06 Applied Molecular Evolution [Formerly Ixsys] Methods for identifying ligand specific binding molecules
WO1999029345A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 La Jolla Institute For Experimental Medicine Inhibition of tumor growth by macrophage intervention
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1223980B1 (de) * 1999-10-28 2003-05-21 Hofbauer, Reinhold Verwendung von csf-1-inhibitoren
WO2001034177A2 (en) * 1999-11-08 2001-05-17 The Government Of The United States Of America, A S Represented By The Secretary, Department Of Hea Lth & Human Services, The National Institutes Of Health Method of treating a viral infection using antagonists of macrophage colony stimulating factor
US7108852B2 (en) * 2000-03-20 2006-09-19 Warner-Lambert Company Llc Methods of treating inflammation using antibodies to M-CSF
US7455836B2 (en) * 2000-05-08 2008-11-25 The University Of Melbourne Method of treatment and agents useful for same
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
JP4503155B2 (ja) 2000-08-28 2010-07-14 北川工業株式会社 導電スペーサ
GB0028647D0 (en) 2000-11-24 2001-01-10 Nextgen Sciences Ltd Apparatus for chemical assays
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US7074175B2 (en) 2001-07-25 2006-07-11 Erik Schroeder Handy Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
TW200303759A (en) * 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
AU2003216778A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-30 Institut Curie Antisense compounds directed against human CSF-1
WO2003059879A2 (en) 2002-01-15 2003-07-24 Duke University Method of inhibiting atherosclerotic plaque destabilization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
MXPA04009418A (es) 2002-03-29 2005-06-08 Schering Corp Anticuerpos monoclonales humanos par interleucina-5, y metodos y composiciones que comprenden los mismos.
AU2003235838A1 (en) 2002-05-01 2003-11-17 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Quinoline derivatives and quinazoline derivatives inhibiting autophosphorylation of macrophage colony stimulating factor receptor
MXPA05000202A (es) * 2002-06-28 2005-09-30 Johnson & Johnson Cuerpos mimeicos ch1-deletados de epo de mimetica de mamifero.
EP1572106B1 (en) 2002-11-15 2010-05-05 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
PT2311873T (pt) * 2004-01-07 2018-11-20 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Anticorpo monoclonal específico para m-csf e respetivos usos
EP2311876A3 (en) * 2005-07-28 2011-04-27 Novartis AG M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof
JP5095794B2 (ja) 2010-10-05 2012-12-12 ヤフー株式会社 レコメンデーション連携装置及びその方法
JP6319584B2 (ja) 2015-02-27 2018-05-09 京セラドキュメントソリューションズ株式会社 画像形成システム

Also Published As

Publication number Publication date
JP5422101B2 (ja) 2014-02-19
MXPA06007856A (es) 2007-03-23
JP2013208125A (ja) 2013-10-10
EP2311873A1 (en) 2011-04-20
BRPI0506726B1 (pt) 2021-05-11
US9926371B2 (en) 2018-03-27
NZ548785A (en) 2011-08-26
DK2311873T3 (en) 2018-11-26
US20140242071A1 (en) 2014-08-28
AU2005205533B2 (en) 2012-03-22
US20170152311A1 (en) 2017-06-01
DK1704166T3 (en) 2015-06-01
US20180171009A1 (en) 2018-06-21
EP1704166B1 (en) 2015-04-29
ECSP066756A (es) 2006-12-29
PT2311873T (pt) 2018-11-20
CN101189264A (zh) 2008-05-28
PT1704166E (pt) 2015-09-04
KR101352853B1 (ko) 2014-02-04
BRPI0506726B8 (pt) 2021-05-25
PL1704166T3 (pl) 2015-10-30
US11034759B2 (en) 2021-06-15
EP1704166A2 (en) 2006-09-27
US9079956B2 (en) 2015-07-14
EP2311873B1 (en) 2018-08-29
HUE026132T2 (en) 2016-05-30
US20160015809A1 (en) 2016-01-21
KR101307868B1 (ko) 2013-09-12
IL176755A (en) 2015-03-31
SI2311873T1 (sl) 2018-12-31
US20090324604A1 (en) 2009-12-31
ES2543833T3 (es) 2015-08-24
IL176755A0 (en) 2006-10-31
CN101189264B (zh) 2017-10-10
CY1121162T1 (el) 2020-05-29
CA2552750A1 (en) 2005-07-28
CN107090034B (zh) 2021-10-01
WO2005068503A3 (en) 2005-11-10
RU2006128586A (ru) 2008-02-20
CN107090034A (zh) 2017-08-25
US20190263900A1 (en) 2019-08-29
HK1095841A1 (en) 2007-05-18
EP3476861A1 (en) 2019-05-01
RU2010121565A (ru) 2011-12-10
ES2689328T3 (es) 2018-11-13
NO341391B1 (no) 2017-10-30
PL2311873T3 (pl) 2019-01-31
CA2552750C (en) 2021-11-09
JP2008500806A (ja) 2008-01-17
LT2311873T (lt) 2018-10-25
RU2401277C2 (ru) 2010-10-10
NO20063569L (no) 2006-10-06
JP2011078435A (ja) 2011-04-21
HUE039803T2 (hu) 2019-02-28
WO2005068503A2 (en) 2005-07-28
SI1704166T1 (sl) 2015-06-30
US9522186B2 (en) 2016-12-20
KR20070034455A (ko) 2007-03-28
AU2005205533A1 (en) 2005-07-28
BRPI0506726A (pt) 2007-05-02
KR20120107147A (ko) 2012-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11034759B2 (en) Humanized M-CSF specific monoclonal antibodies, kits, and uses thereof
US8652469B2 (en) M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof
JP2008500806A5 (tr)
ZA200606531B (en) M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof