JP2011078435A - M−csf特異的モノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明により、M−CSF特異的RX1ベースの抗体、またはRX−1に由来する抗体が提供され、このような抗体を含む薬学的組成物、この薬学的組成物を含むキット、ならびに骨溶解疾患に罹患している被験体における骨損失を予防および処置する方法が共に提供される。
【選択図】図1
Description
本発明は、M−CSF特異的抗体を被験体に投与することによる、骨溶解、癌転移および癌転移に関連する骨損失を予防および処置するための方法に関する。
癌転移は、癌患者における術後または治療後再発の主因である。治療法を開発する徹底した努力にもかかわらず、癌転移は、実質的に治療が難しいままである。骨は、ヒトの様々なタイプの癌(例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌および甲状腺癌)の最も一般的な転移部位の一つである。溶骨性骨転移の発生により、難治性疼痛、高骨折罹病率、神経圧迫および高カルシウム血症に起因して重篤な病的状態が生じる。これらの臨床的問題の重要性にもかかわらず、癌転移に関連する骨損失に利用できる治療は、ほとんどない。
破骨細胞は、無機と有機、両方の骨基質の溶解の原因となる(非特許文献22)。破骨細胞は、特定の膜領域ならびに幾つかの膜および細胞質マーカー、例えば酒石酸抵抗性ホスファターゼ(TRAP)(Anderson et al.1979)、炭酸脱水酵素II(非特許文献23)、カルシトニンレセプター(非特許文献24)およびビトロネクチンレセプター(非特許文献25)を有する独特の分極形態を発現する最終分化細胞の代表である。多核破骨細胞は、通常は核を10未満含有するが、直径が10μmと100μmの間の核を100まで含有することができる(非特許文献2)。このことによりそれらを比較的容易に光学顕微鏡で同定することができる。それらは、活性状態にあるときには非常に多くの空胞を有し、また多数のミトコンドリアを含有し、これは高い代謝率を示す(非特許文献26)。破骨細胞は、溶骨性骨転移において主要な役割を果たすため、破骨細胞の刺激および機能を抑制するための新規薬剤および方法が、当該技術分野において必要とされている。
本発明の材料および方法は、当該技術分野における上述および他の要求を満たすものである。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
非マウスモノクローナル抗体であって、該抗体は、75%より多くM−CSFに結合することでモノクローナル抗体RX1と競合し、ここで、該モノクローナル抗体RX1は、配列番号2および4にそれぞれ記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む、非マウス抗体。
(項目2)
項目1に記載の抗体であって、該抗体は、モノクローナル抗体RX1と同じM−CSFのエピトープに特異的に結合し、ここで、該モノクローナル抗体RX1は、配列番号2および4にそれぞれ記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。
(項目3)
配列番号120または121の少なくとも4つの連続する残基を含むM−CSFのエピトープに結合する、項目2に記載の抗体。
(項目4)
配列番号120または121を含むM−CSFのエピトープに結合する、項目2に記載の抗体。
(項目5)
モノクローナル抗体である、項目1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
(項目6)
キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、または単鎖抗体である、項目1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
(項目7)
IgG抗体である、項目1〜6のいずれか1項に記載の抗体。
(項目8)
Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖Fvフラグメントである、項目1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
(項目9)
少なくとも10−7Mまたはそれより高い、配列番号9のM−CSFに対する親和性Kd(解離平衡定数)を保持する、項目1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
(項目10)
少なくとも10−8Mまたはそれより高い、配列番号9のM−CSFに対する親和性Kdを保持する、項目9に記載の抗体。
(項目11)
少なくとも10−9Mまたはそれより高い、配列番号9のM−CSFに対する親和性Kdを保持する、項目10に記載の抗体。
(項目12)
配列番号24と90%同一のアミノ酸配列を含む、項目1〜11のいずれか1項に記載の抗体。
(項目13)
配列番号24を含む、項目11に記載の抗体。
(項目14)
配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも1つを含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目15)
配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも2つを含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目16)
配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも3つを含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目17)
配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも4つを含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目18)
配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも5つを含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目19)
配列番号18、21、24、29、32および36の全てを含む、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目20)
配列番号16、19、22、27、30および34のうちの1つ以上をさらに含む、項目11〜18のいずれか1項に記載の抗体。
(項目21)
配列番号17、20、23、28、31および35のうちの1つ以上をさらに含む、項目11〜18のいずれか1項に記載の抗体。
(項目22)
配列番号18、21、25、29、32および37のうちの1つ以上をさらに含む、項目11〜18のいずれか1項に記載の抗体。
(項目23)
配列番号18、21、26、29、33および38に記載の1つ以上のコンセンサスCDRをさらに含む、項目11〜18のいずれか1項に記載の抗体。
(項目24)
CDRの中の少なくとも1つのアミノ酸が、別の抗MCSF抗体の対応するCDRの対応する残基によって置換されている、項目11〜23のいずれか1項に記載の抗体。
(項目25)
配列番号4に記載のアミノ酸配列と少なくとも65%相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目11〜24のいずれか1項に記載の抗体。
(項目26)
配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも65%相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目11〜25のいずれか1項に記載の抗体。
(項目27)
ヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の1つ以上のHおよび軽鎖可変フレームワーク領域を含む、項目1〜26のいずれか1項に記載の抗体。
(項目28)
前記ヒト抗体配列が、個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系配列、またはヒトコンセンサス生殖細胞系配列である、項目27に記載の抗体。
(項目29)
IgG1定常領域のフラグメントを含む、項目27に記載の抗体。
(項目30)
抗体依存性細胞毒性活性または補体依存性細胞毒活性を減少させるIgG1定常領域における変異を含む、項目29に記載の抗体。
(項目31)
IgG4定常領域のフラグメントを含む、項目27に記載の抗体。
(項目32)
半抗体の形成を減少させるIgG4定常領域における変異を含む、項目31に記載の抗体。
(項目33)
アミノ酸配列
(項目34)
アミノ酸配列
(項目35)
アミノ酸配列
(項目36)
アミノ酸配列
(項目37)
アミノ酸配列
(項目38)
アミノ酸配列
(項目39)
アミノ酸配列
(項目40)
アミノ酸配列
(項目41)
アミノ酸配列
(項目42)
アミノ酸配列
(項目43)
アミノ酸配列
(項目44)
アミノ酸配列
(項目45)
アミノ酸配列
(項目46)
アミノ酸配列
(項目47)
Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、配列番号2または4における対応する同じ位置のアミノ酸と同じである、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目48)
Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、配列番号2または4における対応する同じ位置のアミノ酸の保存的置換である、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目49)
Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、配列番号2または4における対応する同じ位置のアミノ酸の非保存的置換である、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目50)
Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、ヒト抗体配列内の対応する同じ位置のアミノ酸である、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目51)
Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、ヒトコンセンサス抗体配列内の対応する同じ位置のアミノ酸である、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目52)
前記ヒト抗体配列が、ヒトコンセンサス配列、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはKabatにおけるヒト抗体配列のいずれか1つである、項目50に記載の抗体。
(項目53)
配列番号114、116または119に記載の重鎖配列のいずれか1つを含む、項目1〜32のいずれか1項に記載の抗体。
(項目54)
配列番号41または43に記載の重鎖可変領域配列のいずれか1つを含む、項目1〜32のいずれか1項に記載の抗体。
(項目55)
配列番号45、47、48、51、53または136に記載の軽鎖配列のいずれか1つを含む、項目1〜32のいずれか1項に記載の抗体。
(項目56)
配列番号114に記載の重鎖配列および配列番号47に記載の軽鎖配列を含む、項目1に記載の抗体。
(項目57)
配列番号116に記載の重鎖配列および配列番号47に記載軽鎖配列を含む、項目1に記載の抗体。
(項目58)
配列番号119に記載の重鎖配列および配列番号47に記載の軽鎖配列を含む、項目1に記載の抗体。
(項目59)
配列番号41または43に記載の可変重鎖アミノ酸配列と少なくとも65%同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目60)
配列番号41または43に記載の可変重鎖アミノ酸配列と少なくとも80%同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目59に記載の抗体。
(項目61)
配列番号45、47、48、51または53に記載の可変軽鎖アミノ酸配列と少なくとも65%同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目33〜46のいずれか1項に記載の抗体。
(項目62)
配列番号45、47、48、51または53に記載の可変軽鎖アミノ酸配列と少なくとも80%同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目61に記載の抗体。
(項目63)
項目33〜38、53または59〜60のいずれか1項に記載の重鎖および項目39〜46、54または61〜62のいずれか1項に記載の軽鎖を含む、抗体。
(項目64)
少なくとも10−7の親和性Kdを有する、項目12〜63のいずれか1項に記載の抗体。
(項目65)
少なくとも10−9の親和性Kdを有する、項目64に記載の抗体。
(項目66)
項目1〜65のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む、単離核酸。
(項目67)
配列番号1または配列番号40もしくは42に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも65%同一である重鎖核酸配列を含む、項目66に記載の単離核酸。
(項目68)
配列番号1または配列番号40もしくは42に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも80%同一である重鎖核酸配列を含む、項目67に記載の単離核酸。
(項目69)
配列番号3または配列番号44、46、52、135もしくは137に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも65%同一である軽鎖核酸配列を含む、項目66に記載の単離核酸。
(項目70)
配列番号3または配列番号44、46、52、135もしくは137に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも80%同一である軽鎖核酸配列を含む、項目69に記載の単離核酸。
(項目71)
項目66〜70のいずれか1項に記載の単離核酸を含む、ベクター。
(項目72)
前記単離核酸が、調節コントロール配列に作動可能に連結されている、項目71に記載のベクター。
(項目73)
項目72に記載のベクターまたは項目66〜70のいずれか1項に記載の核酸を含む、宿主細胞。
(項目74)
項目1〜65のいずれか1項に記載の抗体を産生する方法であって、該方法は、前記単離核酸が発現されて該抗体を生産するように項目73に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
(項目75)
前記宿主細胞培養物から前記抗体を回収する工程をさらに包含する、項目74に記載の方法。
(項目76)
項目75に記載の方法によって産生される、単離抗体。
(項目77)
項目1〜5のいずれか1項に記載の抗体を分泌する、ハイブリドーマまたは宿主細胞。
(項目78)
毒素に結合体化している、項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体。
(項目79)
項目1〜65または76に記載の抗体のいずれか1つおよび薬学的に適切なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物。
(項目80)
第二の治療薬をさらに含む、項目79に記載の薬学的組成物。
(項目81)
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目80に記載の薬学的組成物。
(項目82)
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目80に記載の薬学的組成物。
(項目83)
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目82に記載の薬学的組成物。
(項目84)
前記第二の治療薬が、別の抗体である、項目80に記載の薬学的組成物。
(項目85)
骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を予防するために、項目1〜41または50のいずれか1項に記載のM−CSFに結合する抗体であって、該抗体は、該疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる、抗体。
(項目86)
骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置するために、項目1〜65または76のいずれか1項に記載のM−CSFに結合する抗体であって、該抗体は、該疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる、抗体。
(項目87)
前記疾病が、内分泌障害(副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む)、高カルシウム血症、欠乏状態(くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む)、慢性疾患(吸収不良症候群、慢性腎不全(腎性骨形成異常を含む)、慢性肝疾患(肝性骨形成異常を含む)を含む)、薬物(糖質コルチコイド(糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症)、ヘパリン、アルコールを含む)および遺伝性疾患(骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む)、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目86に記載の抗体。
(項目88)
骨転移癌を予防または処置するために、M−CSFに結合する項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体であって、該転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患(白血病もしくはリンパ腫を含む);頭頚部癌;胃腸癌(食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む);女性生殖管の悪性疾患(卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む);膀胱癌;脳の癌(神経芽細胞種を含む);肉腫、骨肉腫;または皮膚癌(悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む)である、抗体。
(項目89)
骨損失を予防または低減するする方法であって、該方法は、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体に、該疾病に関連する骨損失を予防または低減するために有効な量で、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
(項目90)
骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を治療する処置であって、該方法は、該疾病に関連する骨損失の重篤度を低減させるために有効な量で、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目91)
前記疾病が、内分泌障害(副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む)、高カルシウム血症、欠乏状態(くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む)、慢性疾患(吸収不良症候群、慢性腎不全(腎性骨形成異常を含む)、慢性肝疾患(肝性骨形成異常を含む)を含む)、薬物(糖質コルチコイド(糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症)、ヘパリン、アルコールを含む)および遺伝性疾患(骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む)、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目89または90に記載の方法。
(項目92)
骨への転移癌を予防または処置する方法であって、該方法は、転移癌に罹患している被験体に、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
(項目93)
前記転移癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患(白血病もしくはリンパ腫を含む);頭頚部癌;胃腸癌(食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む);女性生殖管の悪性疾患(卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む);膀胱癌;脳の癌(神経芽細胞種を含む);肉腫、骨肉腫;または皮膚癌(悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む)である、項目92に記載の方法。
(項目94)
癌を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を、その必要がある被験体に投与する工程を包含する、方法。
(項目95)
第二の治療薬を投与する工程をさらに包含する、項目89〜94のいずれか1項に記載の方法。
(項目96)
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記第二の治療薬が、非M−CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目95に記載の方法。
(項目98)
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目95に記載の方法。
(項目99)
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記被験体が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目98または99に記載の方法。
(項目101)
前記抗体が、治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効である、項目95〜100のいずれか1項に記載の方法。
(項目102)
前記被験体が、哺乳動物である、項目89〜101のいずれか1項に記載の方法。
(項目103)
前記抗体が、腫瘍細胞により誘導される破骨細胞増殖および/または分化の抑制に有効な量で投与される、項目89〜101のいずれか1項に記載の方法。
(項目104)
前記抗体が、約2μg/kg体重〜30mg/kg体重の間の用量で投与される、項目89〜103のいずれか1項に記載の方法。
(項目105)
前記抗体が、約0.1mg/kg体重〜30mg/kg体重の間の用量で投与される、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記抗体が、約0.1mg/kg体重〜10mg/kg体重の間の用量で投与される、項目105に記載の方法。
(項目107)
骨溶解を示している患者において骨損失を予防または低減するための医薬の製造における、項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。
(項目108)
骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者を処置するための医薬の製造における、項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。
(項目109)
前記疾病が、内分泌障害(副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む)、高カルシウム血症、欠乏状態(くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む)、慢性疾患(吸収不良症候群、慢性腎不全(腎性骨形成異常を含む)、慢性肝疾患(肝性骨形成異常を含む)を含む)、薬物(糖質コルチコイド(糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症)、ヘパリン、アルコールを含む)および遺伝性疾患(骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む)、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目108に記載の使用。
(項目110)
転移癌を罹患している患者において骨転移癌を処置または予防するための医薬の製造における、項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。
(項目111)
前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患(白血病もしくはリンパ腫を含む);頭頚部癌;胃腸癌(食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む);女性生殖管の悪性疾患(卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む);膀胱癌;脳の癌(神経芽細胞種を含む);肉腫、骨肉腫;または皮膚癌(悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む)である、項目110に記載の使用。
(項目112)
癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造における、項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。
(項目113)
前記医薬が、第二の治療薬を使用する処置と合わせられる、項目107〜112のいずれか1項に記載の使用。
(項目114)
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目113に記載の使用。
(項目115)
前記第二の治療薬が、非M−CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目113に記載の使用。
(項目116)
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目113に記載の使用。
(項目117)
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目116に記載の使用。
(項目118)
前記患者が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目116または117に記載の使用。
(項目119)
前記患者が、前記第二の治療薬での前処置を受けている、項目107〜112のいずれか1項に記載の使用。
(項目120)
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目119に記載の使用。
(項目121)
前記第二の治療薬が、非M−CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目119に記載の使用。
(項目122)
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目119に記載の使用。
(項目123)
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目122に記載の使用。
(項目124)
前記患者が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目122または123に記載の使用。
(項目125)
骨溶解を示す患者を処置するための医薬を調製するための、項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体の相乗的組合せの使用であって、ここで、該医薬は、第二の治療薬を使用する処置と合わせられる、使用。
(項目126)
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目125に記載の使用。
(項目127)
前記第二の治療薬が、非M−CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目125に記載の使用。
(項目128)
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目125に記載の使用。
(項目129)
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目125に記載の使用。
(項目130)
前記患者が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目128または129に記載の使用。
(項目131)
前記医薬中の抗体の量が、治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量である、項目113〜130のいずれか1項に記載の使用。
(項目132)
前記医薬中の抗体の量が、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化を阻害するために有効である、項目107〜139のいずれか1項に記載の使用。
(項目133)
前記医薬中の抗体の量が、約2μg/kg体重〜30mg/kg体重の間の用量である、項目89〜103のいずれか1項に記載の使用。
(項目134)
前記医薬中の抗体の量が、約0.1mg/kg体重〜30mg/kg体重の間の用量である、項目104に記載の使用。
(項目135)
前記医薬中の抗体の量が、約0.1mg/kg体重〜10mg/kg体重の間の用量である、項目105に記載の使用。
(項目136)
キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨損失を予防または低減するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。
(項目137)
キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者に対する該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。
(項目138)
前記疾病が、内分泌障害(副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む)、高カルシウム血症、欠乏状態(くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む)、慢性疾患(吸収不良症候群、慢性腎不全(腎性骨形成異常を含む)、慢性肝疾患(肝性骨形成異常を含む)を含む)、薬物(糖質コルチコイド(糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症)、ヘパリン、アルコールを含む)および遺伝性疾患(骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む)、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目137に記載のキット。
(項目139)
キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨転移癌を予防または処置するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。
(項目140)
前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患(白血病もしくはリンパ腫を含む);頭頚部癌;胃腸癌(食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む);女性生殖管の悪性疾患(卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む);膀胱癌;脳の癌(神経芽細胞種を含む);肉腫、骨肉腫;または皮膚癌(悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含む)である、項目139に記載のキット。
(項目141)
キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1〜65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして癌を処置するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。
(項目142)
第二の治療薬をさらに備える、項目136〜141のいずれか1項に記載のキット。
(項目143)
前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目142に記載のキット。
(項目144)
前記第二の治療薬が、非M−CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目142に記載のキット。
(項目145)
前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目142に記載のキット。
(項目146)
前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目145に記載のキット。
(項目147)
ビスホスホネート処置の受容から除外される患者を処置するための説示を備える、項目136〜146のいずれかに記載のキット。
(項目148)
治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量の抗体を備える、項目136〜147のいずれか1項に記載のキット。
(項目149)
相乗的用量の抗体を備える、項目136〜147のいずれか1項に記載のキット。
(項目150)
腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化を阻害するために有効な用量の抗体を備える、項目136〜147のいずれか1項に記載のキット。
(項目151)
約2μg/kg体重〜30mg/kg体重の間の用量の抗体を備える、項目136〜147のいずれか1項に記載のキット。
(項目152)
約0.1mg/kg体重〜30mg/kg体重の間の用量の抗体を備える、項目151に記載のキット。
(項目153)
約0.1mg/kg体重〜10mg/kg体重の間の用量の抗体を備える、項目152に記載のキット。
(項目154)
M−CSF特異的抗体についてのスクリーニング方法であって、該方法は、
a)転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補抗体を接触させる工程;
b)破骨細胞の形成、増殖および/または分化を検出する工程;ならびに
c)破骨の細胞形成、増殖および/または分化の減少が検出された場合に、該候補抗体をM−CSF特異的抗体と同定する工程
を包含する、方法。
(項目155)
前記転移性腫瘍細胞培地が、腫瘍細胞を含む、項目154に記載のスクリーニング方法。
(項目156)
前記接触させる工程(a)がインビボで行われ、前記検出する工程(b)が、骨転移のサイズおよび/または数を検出する工程を包含し、そして前記候補抗体が、骨転移のサイズおよび/または数の減少が観察された場合にM−CSF特異的抗体として同定される、項目154に記載のスクリーニング方法。
(項目157)
前記候補抗体が、M−CSFに結合するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目154〜156に記載のスクリーニング方法。
(項目158)
前記候補抗体が、M−CSFとそのレセプターM−CSFRとの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目154〜157に記載のスクリーニング方法。
(項目159)
骨転移癌を予防または処置し得るM−CSF特異的抗体を同定する方法であって、該方法は、
(a)配列番号120または121の少なくとも4つの連続する残基を含むM−CSFのエピトープに対する候補抗体の結合を検出する工程;および
(b)骨転移癌を予防または処置する該候補抗体の能力をインビトロまたはインビボでアッセイする工程
を包含する、方法。
(項目160)
アミノ酸配列
(項目161)
アミノ酸配列
本発明の一つの実施形態において、図4、14および15に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するマウスモノクローナル抗体RX1、MC1またはMC3のうちのいずれか1つと同じM−CSFのエピトープに特異的に結合する、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体を提供する。関連実施形態において、ポリクローナル抗体;Human EngineeredTM抗体をはじめとするモノクローナル抗体;ヒト化抗体;ヒト抗体;キメラ抗体;Fab、F(ab’)2、Fv、ScFvもしくはSCA抗体フラグメント;ダイアボディ(diabody);線状抗体(linear antibody)またはこれらの抗体のうちのいずれか1つの突然変異タンパク質からなる群より選択される、好ましくは少なくとも10−7、10−8もしくは10−9またはそれ以上の結合親和性を保持する上述の抗体を提供する。図4に記載のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体RX1、MC1および/またはMC3と、75%より多くM−CSFに結合することで競合する、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体も考えられる。
本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体のいずれか1つを投与する工程を含む、癌に罹患しており、その癌を含む細胞がM−CSFを分泌しない被験体を処置する方法を提供する。
転移する能力は、癌の明確な特徴である。転移は、身体の他の部分への癌細胞の拡大、またはこの拡大によって生じる状態を指す。転移は、細胞の遺伝物質の変化、原発性腫瘍を形成するように修飾された細胞の無制御増殖、その原発性腫瘍のための新たな血液補給の発達、その原発性腫瘍からの細胞による循環系の侵襲、身体の他の部分への原発腫瘍細胞の小凝塊の分散およびこれらの部位における続発性腫瘍の成長を含む、複合多工程プロセスである。
1)相同性決定のために類似のアミノ酸を考慮に入れて、図4に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99%相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および/または図4に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99%相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体をはじめとする、図4に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体RX1のアミノ酸変異体;
2)図4に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体RX1の1つもしくはそれ以上の相補鎖決定領域(CDR)を含む、好ましくはRX1 重鎖の少なくともCDR3を含む、および好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRを含む、M−CSF結合ポリペプチド(マウス抗体RX1を除く);
3)図19Bから22Bに記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有するHuman EngineeredTM抗体、または図19Bから22Bの元のHuman EngineeredTM重鎖もしくは軽鎖との少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性(例えば、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%および100%同一を含む)を有する重鎖もしくは軽鎖を含むそれらの変異体;
4)図19Bから22BのHuman EngineeredTM抗体の1つもしくはそれ以上のCDRの高リスク残基を含む、好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRの高リスク残基を含む、M−CSF結合ポリペプチド(マウス抗体RX1を除く);
5)図4Bに記載の高リスクアミノ酸残基を保持し、図4Bに記載の低もしくは中リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更を含む、
例えば、図4Bに記載の低リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更および中リスク残基における保存的置換を含む、または
例えば、図4Bに示す中および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基での1つもしくはそれ以上の変更を含む、
M−CSFに結合する能力を保持する、Human EngineeredTM抗体または変異体(この場合の変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であってもよく、あるいはその操作された抗体の配列が、ヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列に、より近くなるようすることができる);
こうした抗体は、好ましくは、少なくとも10−7、10−8もしくは10−9またはそれ以上の親和性でM−CSFに結合し、好ましくは、M−CSFの破骨細胞発生誘導活性を中和する。
1)相同性決定のために類似のアミノ酸を考慮に入れて、図15に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99%相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および/または図15に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99%相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体をはじめとする、図15に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体MC3のアミノ酸変異体;
2)図15に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体MC3の1つもしくはそれ以上の相補鎖決定領域(CDR)を含む、好ましくはMC3 重鎖の少なくともCDR3を含む、および好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRを含む、M−CSF結合ポリペプチド(場合により、マウス抗体MC3を含む、または除く);
3)低、中または高リスク残基を特定するために図24C〜24Eに記載のKabatの番号付けを使用し、Studnickaらの米国特許第5,766,886号および本明細書の実施例4Aに記載の方法に従ってマウス配列を変更することにより調製したHuman EngineeredTM抗体であって、以下の重鎖のうちの少なくとも1つおよび以下の軽鎖のうちの少なくとも1つを含む抗体:(a)ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低リスク残基を修飾した重鎖または(b)ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低および中リスク残基を修飾した重鎖、(c)ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低リスク残基を修飾した軽鎖または(d)ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低および中リスク残基を修飾した軽鎖;
4)元のHuman EngineeredTM重鎖もしくは軽鎖との少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性(例えば、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%および100%同一を含む)を有する重鎖もしくは軽鎖を含む、前のパラグラフ(3)における前記抗体の変異体;
5)図15のマウスMC3抗体の1つもしくはそれ以上のCDRの高リスク残基を含む、好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRの高リスク残基を含む、M−CSF結合ポリペプチド(場合により、マウス抗体MC3を含む、または除く);
6)マウスMC3抗体の高リスクアミノ酸残基を保持し、低もしくは中リスク残基での1つもしくはそれ以上の変更を含む、
例えば、低リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更および中リスク残基における保存的置換を含む、または
例えば、中および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更を含む、
M−CSFに結合する能力を保持する、Human EngineeredTM抗体または変異体(この場合の変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であってもよく、あるいはその操作された抗体配列が、ヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列に、より近くなるようすることができる);
こうした抗体は、好ましくは、少なくとも10−7、10−8もしくは10−9またはそれ以上の親和性でM−CSFと結合し、および好ましくは、M−CSFの破骨細胞発生誘導活性を中和する。
1)図4に記載の完全軽鎖および重鎖配列を有するマウスRX1と同じM−CSFのエピトープに結合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体;
2)図12のM−CSFのアミノ酸98〜105の少なくとも4つの連続するアミノ酸に結合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体;および
3)図4に記載の完全配列を有するマウス抗体RX1と、75%より多く、80%より多く、または81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%もしくは95%より多くM−CSFに結合することで競合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体。こうした抗体は、好ましくは、少なくとも10−7、10−8もしくは10−9またはそれ以上の結合親和性でM−CSFに結合し、および好ましくはM−CSFの破骨細胞発生誘導活性を中和する。
本発明は、M−CSF特異的抗体、例えばRX1、5H4,MC1および/またはMC3;M−CSF特異的抗体、例えばRX1、5H4,MC1および/またはMC3を含む薬学的調合物;その薬学的調合物を調製する方法;ならびにその薬学的調合物および化合物で患者を処置する方法を提供する。用語「抗体」は、最も広い意味で用い、ならびに完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、抗原に結合することができる抗体フラグメント(例えば、Fab’、F’(ab)2、Fv、単鎖抗体、ダイアボディ)、および所望の生物活性を示すのであれば上記のものを含む組換えペプチドを包含する。
特定の実施形態において、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Human EngineeredTM抗体または変異抗M−CSF抗体は、抗体フラグメント、例えば、RX1抗体フラグメント、5H4抗体フラグメント、MC1抗体フラグメントまたはMC3抗体フラグメントである。抗体フラグメントを生産するために、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解により誘導された(例えば、Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992)およびBrennan et al.,Science 229:81(1985)参照)。しかし、現在、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞により直接生産され得る。Better et al.,Science 240:1041−1043(1998)には、細菌からの機能的抗体フラグメントの分泌が開示されている(例えば、Better et al.,Skerra et al.Science 240:1038−1041(1998)参照)。例えば、Fab’−SHフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてF(ab’)2フラグメントを形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992))。もう一つの実施形態では、F(ab’)2は、F(ab’)2分子の組立てを促進するためにロイシンジッパーGCN4を使用して形成される。もう一つのアプローチによると、Fv、FabまたはF(ab’)2フラグメントを組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技法は、当業者には明らかであろう。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、適切な抗原およびアジュバントの複数の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により、動物において産生させる。二官能性物質または誘導体化試薬、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による結合体化)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基による)、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当該技術分野において知られている他の物質を使用して、免疫を受ける種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に、適切な抗原を結合体化することにより、改善された抗体応答を得ることができる。
モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)により最初に説明されたハイブリドーマ法を使用して調製することができ、または組換えDNA法により生産することができる。
従来の手順を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、モノクローナル抗体をコードするDNAをハイブリドーマ細胞から単離し、塩基配列決定することができる。配列決定には、一般に、昆虫の遺伝子またはcDNAの少なくとも一部の単離が必要である。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするDNAまたは好ましくはmRNA(すなわち、cDNA)のクローニングが必要である。クローニングは、標準的な技法を使用して行われる(例えば、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide,Vols 1−3,Cold Spring Harbor Press参照;これは、本明細書に参考として組み込まれている)。例えば、ポリA+mRNA、好ましくは膜会合型mRNAの逆転写によりcDNAライブラリを構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してそのライブラリをスクリーニングすることができる。しかし、好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、昆虫の免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えば、軽鎖可変セグメント)をコードするcDNA(または全長cDNAの部分)を増幅する。増幅された配列は、あらゆる適切なベクター、例えば発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクター、に容易にクローニングすることができる。対象となる免疫グロブリンポリペプチドのなんらかの部分の配列を決定することができるのであれば、使用される個々のクローニング法が重要でないことは、理解されるであろう。本明細書において用いる「単離」核酸分子または「単離」核酸配列は、(1)その核酸の天然源に通常付随する少なくとも1つの混在核酸分子から特定および分離されるか、(2)クローニングされ、増幅され、標識され、または対象となる核酸の配列を決定することができるようにバックグラウンド核酸と別様に区別される、単離されたと見なされる核酸分子である。単離核酸分子は、天然に見られる形態またはセッティング以外のものである。従って、単離核酸分子は、天然細胞中に存在するような核酸分子とは区別される。しかし、単離核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞とは異なる染色体座にある抗体を通常は発現する細胞に含まれている核酸分子を含む。
本発明の抗体は、直接、組換え生産することができるばかりでなく、異種ポリペプチド(好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである)との融合ポリペプチドとしても組換え生産することができる。選択されるシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセッシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものである。原核宿主細胞が、天然の抗体シグナル配列を認識およびプロセッシングしない場合、そのシグナル配列を、例えばペクチン酸リアーゼ(例えば、pelB)アルカリホスファアーゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからなる群より選択されるシグナル配列により置換してもよい。酵母分泌のために、その天然シグナル配列を、例えば酵母転化酵素リーダー、α−因子リーダー(サッカロマイセス(Saccharomyces)およびクライベロマイセス(Kluyveromyces)α−因子リーダーを含む)、酸性ホスファターゼリーダー、C.アルビカンスグルコアミラーゼリーダーまたは国際公開パンフレット第90/13646号に記載されているシグナルにより、置換してもよい。哺乳動物細胞発現には、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純疱疹gDシグナルを利用することができる。
発現ベクターとクローニングベクターの両方が、選択された1つ以上の宿主細胞においてベクターを複製することができる核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおけるこの配列は、宿主染色体DNAとは無関係にそのベクターを複製することができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母およびウイルスについてのこうした配列は、よく知られている。プラスミドpBR322からの複製起点は大部分のグラム陰性菌に適し、2μプラスミド起点は酵母に適し、ならびに様々なウイルス起点が哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない(一般には、SV40起点が唯一使用され得る。初期プロモータを含有するためである)。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗体または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、テトラサイクリン、G418、ゲネチシン、ヒスチジノールもしくはマイコフェノール酸、に対する耐性を付与する、(b)栄養要求体欠失を相補する、または(c)自然培地から入手することができない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする(例えば、杆菌(Bacilli)についてのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子)。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主生物により認識される、および抗体をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモータを、通常、含有する。原核宿主での使用に適するプロモータには、アラビノース(例えば、araB)プロモータphoAプロモータ、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモータ系、ならびにハイブリッドプロモータ、例えばtacプロモータが挙げられる。しかし、他の既知細菌プロモータが適する。細菌系において使用するためのプロモータは、本発明の抗体をコードするDNAに作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ(S.D.)配列も含有するであろう。
高等真核生物による本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加される。今では哺乳動物遺伝子からの多くのエンハンサー配列(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、およびインスリン)が知られている。しかし、一般的には真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の遅い側(bp100〜270)にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の遅い側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモータの活性化のための促進要素に関するYaniv,Nature 297:17−18(1982)も参照。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して5’または3’位でベクターにスプライシングすることができるが、プロモータから5’の座に位置することが好ましい。
真核宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または他の多細胞生物からの有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結に必要な配列およびmRNAを安定させるために必要な配列も含有するであろう。こうした配列は、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合により3’非翻訳領域から一般に得ることができる。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。一つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開パンフレット第94/11026号、および本明細書に開示する発現ベクター参照。もう一つは、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネータである。
本明細書において、ベクターでのDNAのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、上で説明した原核動物、酵母または高等真核動物細胞である。この目的に適する原核動物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真性細菌、例えば、エシェリキア属(Escherichia)、例えば大腸菌(E.coli)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、例えばネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア属(Serratia)、例えばセラチア・マルセッカンス(Serratia marcecans)および赤痢菌属(Shigella)などの腸内細菌科(Enterobacteriacease);枯草菌(B.subtilis)およびB.リシェニフォルミス(B.Licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開の旧東ドイツ特許266,710号に開示されているB.リシェニフォルミス 41P)などの杆菌(Bacilli);緑膿菌(P.aeruginosa)などのシュードモナス属(Pseudomonas);ならびにストレプトミセス属(Streptomyces)が挙げられる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、E.coli 294(ATCC 31,446)であるが、大腸菌B株、大腸菌X1776株(ATCC 31,537)および大腸菌W3110株(ATCC 27,325)などの他の株は適する。これらの例は、限定ではなく実例となるものである。
本発明の抗体の生産に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムのF10(Sigma)、最少必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコ変性イーグル培地((DMEM)、Sigma)などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979); Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980); 米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第4,560,655号もしくは同第5,122,469号; 国際公開パンフレット第90103430号、同第87/00195号;または米国特許再発行番号30,985に記載されている培地はいずれかも、宿主細胞のための培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じてホルモンおよび/または他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、緩衝液(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗体(例えば、GentamycinTM薬)、微量元素(ミクロモル範囲内の最終濃度で、通常、存在する、無機化合物と定義する)、およびグルコースまたは等価エネルギー源を補足することができる。当業者に知られている他のいずれかの必要補足物を適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば温度およびpHなどは、発現のために選択される宿主で以前に使用されたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
組換え法を用いる場合、抗体は、ペリプラスム間隙内で細胞内生産することができ、または微生物培養物からのものを含む培地に直接分泌することができる。抗体を細胞内生産する場合、第一工程として、例えば遠心分離または限外濾過により、特定の破壊組織片、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか、を除去する。Better et al.Science 240:1041−1043(1998); ICSU Short Reports 10:105(1990);およびProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:457−461(1993)には、大腸菌のペリプラスム間隙に分泌される抗体の単離手順が記載されている([Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992)]も参照)。
キメラ抗体またはヒト化抗体は、親マウスモノクローナル抗体よりヒトにおける免疫原性が低いため、はるかに低い過敏症リスクでヒトの処置に使用することができる。従って、これらの抗体が、ヒトへのインビボ投与を含む治療用途に好ましいこともある。
突然変異誘導に好ましい位置である抗体の一定の残基または領域を特定するための一つの有用な方法は、Cunningham and Wells Science,244,1081−1085(1989)により記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘導」と呼ばれる。この場合、ターゲット残基のうちの1つの残基またはターゲット残基のグループを特定し(例えば、arg、asp、his、lysおよびgluなどの荷電残基)、中性または負の電荷を有するアミノ酸(最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン)により置換して、抗原とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次に、置換部位に(または、に対して)さらなるまたは他の変異体を導入することにより、その置換に対して官能基的感受性を示すアミノ酸位置をさらに正確にする。このように、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は、前もって定められるが、本質的には突然変異の性質を前もって定める必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の実行を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘導をターゲットコドンまたは領域で行い、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
(1)疎水性: ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile:
(2)中性親水性: cys、ser、thr;
(3)酸性: asp、glu;
(4)塩基性: asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖の配向に影響する残基: gly、pro;および
(6)芳香族: trp、tyr、phe。
Ser239、Ser267(Glyのみ)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338およびAsp376。FcRIIIAへの結合を改善した変異体には、T256A、K290A、S298A、E333A、K334AおよびA339Tが挙げられる。Lys414は、FcRIIAおよびFcRIIBに対する結合の40%減少を示し、Arg416は、FcRIIAおよびFcRIIIAに対する結合の30%減少を示し、Gln419は、FcRIIAへの結合の30%減少およびFcRIIBへの結合の40%減少を示し、ならびにLys360は、FcRIIIAへの結合の23%改善を示した。Presta et al.,Biochem.Soc.Trans.(2001)30,487−490も参照。
(Human EngineeringTM)
抗体可変ドメインのHuman EngineeringTMは、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として、Studnickaにより説明された[例えば、Studnickaらの米国特許第5,766,886号; Studnicka et al. Protein Engineering 7:805−814(1994)参照]。この方法に従って、各可変領域アミノ酸に置換のリスクが割り当てられた。アミノ酸置換は、次の3つのリスクカテゴリーのうちの一つに分類される:(1)低リスク変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を破壊する機会が最も少ないものであり;(2)中リスク変更は、免疫原性をさらに低下させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす機会がより多いものであり、(3)高リスク残基は、結合にまたは抗体構造の維持に重要であるものであり、ならびに抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造的役割のため、プロリンにおける修飾は、その位置が一般には低リスク位置であったとしても、少なくとも中リスク変更での修飾であると一般に考えられる。
内在性免疫グロブリン生産を有さず、ヒト免疫グロブリン座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を使用して、M−CSFに対するヒト抗体を生産することもできる。例えば、国際公開パンフレット第98/24893号には、ヒトIg座を有するトランスジェニック動物が開示されており、この場合の動物は、内在性重鎖および軽鎖座の不活性化のため、機能的な内在性免疫グロブリンを生産しない。国際公開パンフレット第91/741号には、免疫原に対する免疫応答をマウントすることができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主も開示されており、この場合の抗体は、霊長類定常および/または可変領域を有し、ならびにこの場合の内在性免疫グロブリンをコードしている座は、置換されているか、不活性化されている。国際公開パンフレット第96/30498号には、哺乳動物において免疫原座を修飾するための、例えば、全てまたは一部の定常または可変領域を置換して修飾抗体分子を形成するための、Cre/Lox系の使用が開示されている。国際公開パンフレット第94/02602号には、不活性化された内在性Ig座および機能的ヒトIg座を有する非ヒト哺乳動物宿主が開示されている。米国特許第5,939,598号には、内在性重鎖を欠き、ならびに1つ以上の異種定常領域を含む外在性免疫グロブリン座を発現するトランスジェニックマウスを作る方法が開示されている。
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを調製するための技法の開発および線状バクテリオファージの表面でのコード化抗体フラグメントの提示は、ヒト抗体を直接調製する手段をもたらした。ファージ法により生産される抗体は、細菌において抗原結合フラグメント(通常はFvまたはFabフラグメント)として生産され、それ故、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の2つの戦略のうちの1つにより導入することができる:
フラグメントを操作して、哺乳動物細胞における発現のために完全な抗体にするか、エフェクター機能を誘導することができる第二結合部位を有する二特異性抗体フラグメントにすることができる。
抗体の共有結合修飾も、本発明の範囲に包含される。これらは、適用可能ならば、化学合成により、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により行うことができる。抗体の他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはNもしくはC末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬と抗体の標的アミノ酸残基を反応させることによって、分子に導入される。
適切な細胞への治療用抗体の送達は、物理的DNA移入法(例えば、リポソームもしくは化学的治療)の使用またはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスもしくはレトロウイルス)の使用によるものをはじめとする当該技術分野において知られているいずれかの適するアプローチの使用による、エクスビボ、インサイチューまたはインビボでの遺伝子療法によって行うことができる。例えば、インビボ療法については、所望の抗体をコードする核酸を単独でまたはベクター、リポソームもしくは沈殿物と併用で被験体に直接注射することができ、一部の実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射することができる。エクスビボ治療については、被験体の細胞を除去し、核酸をこれらの細胞に導入し、修飾された細胞を被験体に直接戻すか、例えば、多孔質膜に内包させ、それをその患者に移植する。例えば、米国特許第4,892,538号および同第5,283,187号参照。生細胞への核酸の導入に利用できる様々な技法がある。これらの技法は、その核酸がインビトロで培養細胞に移入されるのか、またはインビボで所定の宿主の細胞に移入されるのかによって変わる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適する技法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストランおよびリン酸カルシウム沈降法の使用が挙げられる。核酸のエクスビボ送達に一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
有効な療法は、意図した効果を生じ、有意な毒性がない薬剤の特定に依存する。抗体は、当該技術分野において知られている方法により、結合親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ゲル−シフトアッセイ、ウエスタンブロット法、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、ELISAなどを使用することができ、これらは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(1999)John Wiley & Sons,NYに記載されている(これは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている)。
動物モデルにおいて有効であるM−CSF抗体を1つより多く特定したら、癌転移および/または癌転移に関連する骨損失に対してさらに改善された効力をもたらすために、2つ以上のそうしたM−CSF抗体を混合することがさらに有利であることがある。癌転移および/または癌転移に関連する骨損失に罹患している、または罹患する素因を有する人または哺乳動物に、1つ以上のM−CSF抗体を含む組成物を投与することができる。2つの治療薬の併用投与は、それらの薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間に重なりがあるならば、それらの薬剤を同時にまたは同じ経路で投与する必要はない。別の日または週での投与であるような同時または逐次投与が考えられる。
本発明の方法を実施する際に使用される抗M−CSF抗体は、所望の送達方法に適するキャリアを含む薬学的組成物に調合することができる。適するキャリアには、抗M−CSF抗体と併用したとき、その抗体の抗腫瘍機能を保持し、被験体の免疫系と非反応性である、あらゆる材料を含む。例には、無菌リン酸緩衝食塩液、静菌水などのような多数の標準的な薬学的キャリアのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。様々な水性キャリア、例えば、水、緩衝水、0.4%食塩水、0.3%グリシンなどを使用することができ、ならびに中等度の化学的修飾などを受けた、安定性向上のための他のタンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含むことができる。
癌に罹患している患者の処置に有用な抗M−CSF抗体には、腫瘍に対する強力な免疫応答を起こさせることができるもの、および直接細胞毒性作用をもたらすことができるものが挙げられる。これに関して、抗M−CSF抗体は、補体媒介または抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)メカニズムにより腫瘍細胞の溶解を惹起することができ、これら両方のメカニズムが、エフェクター細胞Fcレセプター部位または相補タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなFc部分を必要とする。加えて、腫瘍成長に対して直接生物学的効果を発揮する抗M−CSF抗体が、本発明の実施において有用である。そうした直接細胞毒性抗体が作用できる可能性のあるメカニズムには、細胞成長の抑制、細胞分化の修飾、腫瘍血管新生因子プロフィールの修飾、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗M−CSF抗体が抗腫瘍効果を発揮するメカニズムは、当該技術分野において一般に知られているような、ADCC、ADMMC、補体媒介細胞溶解などを判定するために設計されたインビボアッセイを任意の数使用して評価することができる。
本発明では、1つ以上の抗M−CSF抗体部分および免疫修飾物質または毒素部分を含む融合タンパク質の使用が考えられる。抗体融合タンパク質の製造方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第6,306,393号参照。インターロイキン−2部分を含む抗体融合タンパク質は、Boleti et al.,Ann.Oncol.6:945(1995)、Nicolet et al.,Cancer Gene Ther. 2:161(1995)、Becker et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93:7826(1996)、Hank et al.,Clin.Cancer Res.2:1951(1996)、およびHu et al.,Cancer Res.56:4998(1996)によって記載されている。加えて、Yang et al.,Hum.Antibodies Hybridomas 6:129(1995)には、F(ab’)2フラグメントおよび腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質が記載されている。
本発明の抗体は、M−CSFに対する親和精製剤として使用することができ、またはM−CSFタンパク質についての診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織もしくは血清におけるその発現の検出に使用することができる。本抗体は、インビボ診断アッセイに使用することもできる。一般に、これらの目的には、イムノシンチオグラフィーを使用して腫瘍を局在定位することができるように、本抗体を放射性核種(例えば、111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32Pまたは35S)で標識する。
この実施例は、M−CSF抗体RX1および5A1が、種特異的であること、ならびに抗体RX1、MC1およびMC3が、ヒトM−CSF活性を中和することを示すものである。RX1は、本出願の出願日より1年以上前に入手した市販の抗体である。例示的な市場の供給源には、マウス抗ヒトM−CSFモノクローナル抗体クローン116、692および21(Anogen);抗ヒトM−CSF抗体クローン21113.131、26730および26786(R&D Systems,Inc.);ならびに抗ヒトM−CSF抗体クローンM16(Antigenix America,Inc.)が挙げられるが、これらに限定されない。
この実施例は、抗体RX1が、5mg/kgの用量でヒト異種移植モデルにおいて骨溶解を有効に抑制することを示すものである。週齢4〜7週、平均体重約20gの雌ヌードマウスをこの試験において使用した。10μLの食塩水に浮遊させた腫瘍細胞(MDA−MB−231、3x105)を右頸骨骨髄腔に注射した。腫瘍接種の1日後に後肢の放射線写真を撮ってベースライン画像を得、注射により生じた骨折をチェックした。マウスを、6週間にわたって週1回、5mg/kgで腹腔内注射するPBSおよびRX1を含む処置グループに、1グループにつき10匹で無作為に割り当てた。試験終了時に、再び後肢の放射線写真を撮り、骨損傷についてベースラインと比較した。腫瘍により生じた骨損傷の程度は、図6に示すとおり定義した。5mg/kgのRX1で処置したグループは、腫瘍に起因する損傷からの骨の統計学的に有意な保護を示した。
この実施例は、ヒト乳癌MDA−MB−231を有するマウスに抗体RX1を5mg/kgの濃度で投与したとき、転移数が減少したことを示すものである。
この実施例は、RX1抗体のヒト化の手順を詳説するものである。類似した手順を用いて5H4、MC1およびMC3をヒト化する。
マウスRX1についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図4Bに記載する。National Biomedical Foundation Protein Identification Resourceまたは類似のデータベースを使用して同定されたヒト抗体の配列を使用して、ヒト化抗体のフレームワークを提供する。ヒト化重鎖の配列を選択するために、マウスRX1 重鎖配列とヒト抗体重鎖の配列とのアラインメントを行う。各位置においてヒト抗体アミノ酸をヒト化配列に対して選択するが、但し、その位置が、下に定義する4つのカテゴリーのうちのいずれの1つにも入らないことを条件とし、入る場合には、マウスRX1アミノ酸を選択する:
(1)その位置が、Kabat,J.Immunol.,125,961−969(1980)により定義されたような、相補鎖決定領域(CDR)内に入る;
(2)そのヒト抗体アミノ酸が、ヒト重鎖のその位置では珍しいのに対し、そのマウスRX1アミノ酸は、ヒト重鎖のその位置に一般的である;
(3)その位置が、マウスRX1 重鎖のアミノ酸配列においてCDRに直接隣接している;または
(4)そのマウスRX1抗体の3次元モデリングが、そのアミノ酸が抗原結合領域に物理的に近いことを示唆している。
(1)CDR;
(2)ヒト抗体より典型的なマウスRX1アミノ酸;
(3)CDRに隣接;または
(4)結合領域への3次元近接の可能性。
(1)ヌクレオチド配列が、上に記載したとおり選択したアミノ酸をコードする;
(2)これらのコード配列の5’(前記ヌクレオチド配列は、リーダー(シグナル)配列をコードする)。これらのリーダー配列を抗体の代表として選択した;
(3)それらのコード配列3’(前記ヌクレオチド配列は、マウスRX1配列の一部である、マウス軽鎖J5セグメントおよびマウス重鎖J2セグメントに続く配列である)。これらの配列は、スプライス供与シグナルを含有するため含める;
(4)その配列の各末端において、Xba I部位は、そのXba I部位で切断し、ベクターのXba I部位にクローニングすることができる。
重鎖を合成するために、Applied Biosystems 380B DNAシンセサイザーを使用して4つのオリゴヌクレオチドを合成する。それらのオリゴヌクレオチドのうちの2つは、重鎖の各鎖の一部であり、各オリゴヌクレオチドは、アニーリングできるように、約20ヌクレオチドまで次のものとオーバーラップしている。協力してそれらのオリゴヌクレオチドが、全ヒト化重鎖可変領域をカバーし、その各末端の少数の余分なヌクレオチドによりXba I部位での切断が可能となる。それらのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製する。
10uL アニーリングしたオリゴヌクレオチド
0.16mM 各デオキシリボヌクレオチド
0.5mM ATP
0.5mM DTT
100ug/mL BSA
3.5ug/mL T4 g43プロテイン(DNAポリメラーゼ)
25ug/mL T4 g44/62プロテイン(ポリメラーゼ補助タンパク質)
25ug/mL 45プロテイン(ポリメラーゼ補助タンパク質)。
発現ベクターをマウスSp2/0細胞にトランスフェクトし、プラスミドを組み込む細胞を、標準的な方法により発現ベクターによってもたらされる選択可能なマーカー(複数を含む)の基に選択する。これらの細胞が、M−CSFに結合する抗体を分泌したことを検証するために、それらの細胞からの上清を、M−CSFを発現することが知られている細胞と共にインキュベートする。洗浄後、それらの細胞をフルオレセインに結合体化したヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、FACSCANサイトフルオロメータで蛍光について分析する。
この実施例は、Human EngineeredTMRX1抗体のクローニングおよび発現、ならびにそうした抗体の精製、および結合活性についての検査を説明するものである。Human EngineeredTM5H4、MC1およびMC3抗体は、類似の手順を使用して調製する。
抗体可変ドメインのHuman EngineeringTMは、抗体の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として、Studnickaにより説明されている[例えば、Studnickaらの米国特許第5,766,886号; Studnicka et al. Protein Engineering 7:805−814(1994)参照]。この方法に従って、各可変領域アミノ酸に置換のリスクを割り当てた。アミノ酸置換は、次の3つのカテゴリーのうちの一つに分類される:(1)低リスク変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を破断する機会が最も少ないものであり;(2)中リスク変更は、免疫原性をさらに低下させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす機会がより多いものであり;(3)高リスク残基は、結合にまたは抗体の構造の維持に重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造的役割のため、プロリンにおける修飾は、その位置が典型的には低リスク位置であったとしても、一般には少なくとも中リスク変更での修飾であると見なされる。置換的変更は好ましいが、挿入および欠失も可能である。図4Bおよび4Cは、マウスRX1 軽鎖および重鎖の各アミノ酸残基についてのリスク割り当てを示すものであり、それぞれ、高、中または低リスク変更として類別されている。
上で説明した重鎖および軽鎖V領域配列の各々を抗体由来のシグナル配列と共にコードするDNAフラグメントを、人工ヌクレオチド合成を使用して構築した。上で説明した軽鎖V領域アミノ酸配列の各々をコードするDNAを、ヒトκ軽鎖定常領域を含有するベクターpMXP10に挿入した。上で説明した重鎖V領域アミノ酸配列の各々をコードするDNAを、ヒトγ−2重鎖定常領域を含有するベクターpMXP6に挿入した。図29A、29bおよび30に提示する配列を有するヒトγ−1(cDNA)およびγ−4(ゲノムおよびcDNA)定常領域に融合した重鎖V領域アミノ酸配列を含有する追加のベクターを構築した。これらのベクターの全てが、hCMVプロモータおよびマウスκ軽鎖3’非翻訳領域ならびに選択可能マーカー遺伝子、例えば、G418−またはヒスチジノール−耐性トランスフェクタントそれぞれの選択のためのneoまたはhisを含有する。これらの軽鎖および重鎖ベクターを表2および3にそれぞれ記載する。
上で説明した軽鎖または重鎖のいずれかを含有するベクターを一過性トランスフェクションのためにも構築した。これらのベクターは、Epstein−Barrウイルス核抗原を発現するHEK293細胞での複製のために、neoまたはhis遺伝子の代わりにEpstein−BarrウイルスoriPを含有すること以外は、永久トランスフェクションについて上で説明したものと同様である。一過性トランスフェクションのためのベクターを表5および6に記載する。
上で説明したEpstein−BarrウイルスからのoriPおよび軽鎖または重鎖遺伝子を各々が含有する別個のベクターをHEK293E細胞に一過的にトランスフェクトした。一過的にトランスフェクトした細胞を10日以下の間インキュベートさせておき、その後、上清を回収し、プロテインAクロマトグラフィーを使用して抗体を精製した。293E細胞の一過性トランスフェクションにより生産されたタンパク質を下の表7に記載する。
軽鎖および重鎖遺伝子各々のコピー1つを共に含有する上(表4)に記載のベクターをEx−Cell302適応CHO−K1細胞にトランスフェクトする。Ex−Cell 302培地中での浮遊成長に適合させたCHO−K1細胞を、典型的には40ugの線状化ベクターと共にエレクトロポレーションにかける。あるいは、線状化DNAを線状ポリエチレンイミン(PEI)と複合させ、トランスフェクションに使用することができる。1%FBSおよびG418を補足したEx−Cell 302培地が入っている96ウエルプレートに、それらの細胞をプレーティングする。96ウエルプレート内でクローンをスクリーニングし、各トランスフェクションからのクローンのトップから約10%を、Ex−Cell 302培地が入っている24ウエルプレートに移す。
本発明のベクターおよび全ての系統から免疫グロブリンポリペプチドを精製するためのプロセスを設計することができる。当該技術分野においてよく知られている方法に従って、細胞を終結後に濾過によって除去する。濾液をプロテインAカラムに充填する(必要な場合には、複数回通す)。カラムを洗浄し、その後、発現および分泌された免疫グロブリンポリペプチドをカラムから溶離する。抗体産物の調製のために、ウイルス不活性化工程としてプロテインAプールを低pHで保持する(最低30分間、最高1時間にわたってpH3)。次に吸着カチオン交換工程を用いて、その産物をさらに精製する。吸着分離カラムからの溶離物をウイルス保持フィルタに通して、潜在的ウイルス粒子をさらに取り除く。その濾液を、その産物が結合しないアニオン交換カラムに通すことによりさらに精製する。最後に、産物をダイアフィルトレーションによって調合緩衝液に移すことにより、精製プロセスを終える。保持物を少なくとも1mg/mLのタンパク質濃度に調整し、安定剤を添加する。
組換えHuman EngineeredTM抗体のMCSF結合活性を評価する。プロテインAカラムに通すことにより、振盪フラスコ培養上清からタンパク質を精製し、その後、A280により濃度を決定する。結合アッセイは、上の実施例1において説明しように、または下の実施例12において説明するように行う。Immulon IIプレートを、PBSコーティング溶液中で予め希釈したsM−CSFでプレコートして、それをマイクロプレートに固定する。0.25から20ug/mLにわたる様々な被検濃度のM−CSFを50uL/ウエルで添加し、4℃で一晩インキュベートする。その後、プレートをPBS−0.05%Tweenで3回洗浄する。PBS−0.05%Tweenに1%BSAを添加し、その後、37℃で30分インキュベートすることによって、ブロッキングを行う。免疫グロブリンポリペプチドの希釈物をPBS−0.05%Tween 1%BSA溶液中で調製する。2または3倍系列希釈物を調製し、二重反復または三重反復で添加する(100uL/ウエル)。37℃で90分インキュベートした後、そのマイクロプレートをPBS−0.05%Tweenで3回洗浄する。シグナルを発生させるために、ペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗ヒトIgG(γ特異的またはFc特異的)二次抗体を各ウエルに添加し、60分間、37℃でインキュベートし、その後、クエン酸緩衝液プラス0.012%H2O2中0.4mg/mLでOPDを添加する。室温で5〜10分後、100uLの1M H2SO4の添加によりアッセイを停止させ、プレートを490nmで読み取る。ヤギ抗ヒトIgG(γ特異的)抗体とヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)抗体の両方を利用した。
以下の実施例は、修飾または非修飾IgG1またはIgG4定常領域を有するRX1 Human EngineeredTM抗体をはじめとする、RX1由来の抗体またはRX1競合抗体などのM−CSF特異的抗体を使用してヒトを処置する手順を詳説するものである。MC1もしくはMC3由来の抗体またはMC1もしくはMC3競合抗体についても、この手順をなぞることができる。予測される効能を生じる投薬範囲は、2ug/kgから10mg/kgである。この概算は、実験データにより実証される以下の原理に基づくものである:
ヒト血漿中のM−CSFレベルの測定値(健康な患者と乳癌患者の両方)は、約1ng/mLである。M−CSF中和抗体RX1は、1ng/mLのヒトM−CSFに対して2ng/mLのEC50測定値を有する。従って、ヒト血漿中の有効抗体濃度は、そのEC50の10から50,000倍、すなわちヒト血漿中、抗体20ng/mLから100ug/mLであると予測される。PK試験に基づき、ヒトの患者においてこの濃度を実現するためには、2μg/kgから10mg/kgの投薬が、血漿中、20ng/mLから100ug/mLの抗体濃度を達成するために必要である。
この実施例は、皮下モデルにおける抗M−CSFモノクローナル抗体の抗癌活性を評価するための手順を詳述するものである。上の実施例2は、抗M−CSFモノクローナル抗体治療により骨髄における腫瘍成長が有意に抑制されることを示した。この試験の目的は、その抗体が軟組織における腫瘍成長も抑制することができるかどうかを評価することである。
1)PBS
2)RX1
3)5A1
4)mIgG1+rIgG1アイソタイプAbコントロール
5)5A1+RX1。
以下の実施例は、癌転移に関連する幾つかの骨溶解性疾患の処置および予防のための併用療法を評価する手順を詳述するものである。
1.ビスホスホネート(例えば、Aredia;Zometa;Clodronate)
2.手術
3.放射線
4.化学療法
5.ホルモン療法(例えば、Tamoxifen;抗アンドロゲン療法)
6.抗体療法(例えば、RANKL/RANK中和抗体;PTHrP中和抗体)
7.治療用タンパク質療法(例えば、可溶性RANKLレセプター;OPG、ならびにPDGFおよびMMP阻害剤)
8.小分子薬物療法(例えば、Src−キナーゼ阻害剤)
9.オリゴヌクレオチド療法(例えば、RANKLまたはRANKまたはPTHrPアンチセンス)
10.遺伝子療法(例えば、RANKLまたはRANK阻害剤)
11.ペプチド療法(例えば、RANKLの突然変異タンパク質)。
1.PBSのみ
2.療法Xのみでの治療
3.ラットIgG1アイソタイプコントロール
4.マウスIG1アイソタイプコントロール
5.RX1抗ヒトMCSFのみ
6.5A1ラットIgG1抗マウスMCSFのみ
7.ラットIgG1とマウスIgG1アイソタイプコントロールの併用
8.RX1と5A1の併用
9.ラットIgG1アイソタイプコントロールプラス療法X
10.マウスIG1アイソタイプコントロールプラス療法X
11.RX1抗ヒトMCSFプラス療法X
12.5A1ラットIgG1抗マウスMCSFプラス療法X
13.ラットIgG1とマウスIgG1アイソタイプコントロールの併用プラス療法X
14.RX1と5A1の併用プラス療法X。
以下の実施例は、蛍光発光セルソータを使用して、M−CSF特異的抗体が例えば乳癌細胞(細胞系MDA231)または多発性骨髄腫癌細胞(細胞系ARH77)に結合する能力を評価するためのプロトコルを提供するものである。
以下の実施例は、M−CSFが多数の癌細胞表面上に頻出することを示すものである。M−CSF特異的抗体RX1を使用して、M−CSFの免疫組織化学染色を次のとおり行った。
a.キシレン 3 x 5分
b.100%試薬アルコール 2 x 5分
c.95%試薬アルコール 2 x 4分
d.75%試薬アルコール 2 x 3分
e.50%試薬アルコール 1 x 3分
g.dI H2O 2〜3回、短時間すすぐ。
1X PBS中で3分間、2回の洗浄
2滴のZymed Biotin(試薬B)、室温で10分間
1X PBS中で3分間、2回の洗浄。
0 無染色
1 染色は、バックグラウンドと同様であった
2 陽性、しかし弱い染色
3 陽性で有意な染色
4 陽性で強い染色。
以下の実施例は、抗体MC1およびMC3を生産するための手順を示すものである。MC1およびMC3は、ヒトM−CSF抗体を中和し、ヒトM−CSFに結合する2つのモノクローナルマウス抗体である。これらの抗体のアミノ酸配列を図14および15にそれぞれ示す。以下を含む一連の工程により、これらを同定した:a)組換えヒトM−CSFでBalb Cマウスを免疫する工程;b)ELISA形式でヒトM−CSFに結合する抗体を生産する陽性クローンをスクリーニングする工程;c)陽性クローンをサブクローニングして、安定なハイブリドーマクローンを調製する工程;d)細胞培養の規模を拡大して、大量の抗体を生産する工程;e)前の実施例で説明したような親和分析、細胞結合アッセイおよび中和活性アッセイにおいて抗体を精製および特性付けする工程。
この実施例は、M−CSF抗体RX1および5H4ならびにそれらのFabフラグメントが、異なる中和活性を有することを示すものである。以下の実施例は、抗体RX1、5H4およびMC3が、M−CSFに対して様々な親和性を有することを示すものでもある。この実施例により、上述のインタクトな抗体の親和性が上述の抗体のFabフラグメントを基準にして高いことが、さらに実証される。
以下の実施例は、抗体RX1、5H4およびMC3により認識されるM−CSF上の線状エピトープ(すなわち、アミノ酸配列)を明らかにするものである。
上の実施例4Aで説明したように調製したRX1抗体のHuman EngineeredTM変種の結合親和性を判定した。この実施例は、異なるIgGサブクラス定常領域を有するHuman EngineeredTMRX1抗体が、インビトロで異なる親和性でM−CSFに結合することを示すものである。Biacore分析によりインタクトな抗体の結合親和性における相対差を判定するために、M−CSFをアミンカップリングによりCM5バイオセンサーチップ上に固定した。10mM 酢酸Na(pH4.0)中0.05μg/mLのM−CSFを5分間、1μL/分で注射して、RL=6〜12RUを達成した。被検抗体またはFabフラグメントを、その変性バイオセンサー表面上に、2倍希釈で100nMから1.5nMにわたる様々な濃度で流した。被検抗体は、0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCL、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20(HBS−EP)中で希釈し、全ての実験を25℃で行った。各濃度点および緩衝ブランクを三重反復でランし、3分の会合および8分の解離でデータを回収した。反応速度定数および親和定数は、1:1相互作用モデル/全フィットでBiaevaluationソフトウェアを使用して決定した。下の表10に示すように、heRX1−1.G1およびheRX1−1.G4は、マウスRX1−M−CSFの結合親和性に最も近似した親和性でM−CSFに結合する。
この実施例は、異なるIgGサブクラス定常領域を有するHuman EngineeredTMRX1抗体が、インビトロで異なる中和活性を有することを示すものである。M−CSF抗体の中和活性を検査するために、M−NFS−60細胞系の増殖アッセイを使用した(米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection)アクセッション番号CRL−1838;米国、メリーランド州、ロックヴィルのATCCから入手でき、Cas−Br.MuLV野生型マウス環境栄養性レトロウイルスで誘導された骨髄性白血病に由来するものである。この細胞系は、インターロイキン3とM−CSFの両方に応答し、ならびにレトロウイルスの組み込みにより生じたトランケート型c−myb癌原遺伝子を含有する)。M−NFS−60の増殖は、用量依存的に活性M−CSFを必要とする。このアッセイでは、M−NFS−60細胞を洗浄し、10%FBSおよび1%Pen/Strepを含有するRPMI 1640培地にプレーティングした。組換えヒトM−CSF(最終濃度10ng/mLでのもの;これは、3000U/mLのM−CSF活性と等価である)を(系列2倍希釈で)1ug/mLから0.5ng/mLにわたる様々な濃度で、インキュベータの中で、1時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。インキュベーション後、その混合物を96ウエルマイクロタイタプレート内のM−NFS−60培養物に添加した。1ウエルあたりの全アッセイ量は、100uLであり、10ng/mLのM−CSFを含有し、示されている抗体濃度であった。細胞を37℃、5%CO2下で72時間インキュベートした後、CellTiter Gloアッセイ(Promega)により細胞数を定量した。各抗体を三重反復で検査し、翌日、反復した(1抗体あたり合計6回のアッセイのため)。各抗体のIC50を曲線当てはめにより分析した。
この実施例は、異なるIgGサブクラス定常領域を有するHuman EngineeredTMRX1抗体が、インビトロ破骨細胞発生アッセイにおいて異なるTRAP活性を有することを示すものである。
異なるIgGサブクラス定常領域を有するHuman EngineeredTMRX1抗体をさらに特性付けした。
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