ES2197885T3 - Uso de inhibidores csf-1. - Google Patents
Uso de inhibidores csf-1.Info
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Abstract
Uso de inhibidores de la actividad CSF-1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades tumorales.
Description
Uso de inhibidores CSF-1.
La invención se refiere al uso de inhibidores de
la actividad CSF-1.
El ``factor de estimulación de colonias 1''
(``Colony Stimulating Factor 1''; ``CSF-1'') es una
citoquina que es capaz de formar, en particular, colonias de
macrófagos. El CSF-1 nativo es un dímero
glicolizado, estando presentes en el ser humano formas diferentes
de esta molécula con longitudes y pesos moleculares diferentes. Por
ejemplo, es conocido que las dos formas principales de
CSF-1 con 224 y 522 aminoácidos, respectivamente,
son formadas por ``splicing'' alternativo. Además es conocido que
la longitud mínima de dicho factor es de aproximadamente 150
aminoácidos. Además, el CSF-1 puede ocurrir también
en varios modelos de glicolización, los cuales resultan específicos
o específicos del tejido según el estado fisiológico.
CSF-1 se ha utilizado para
superar la supresión inmune en pacientes en los que dicha supresión
había sido causada por quimioterapia. Otras aplicaciones se
referían al tratamiento o a la prevención de infecciones
bacterianas, vírales o por hongos venenosos, a la estimulación de
células blancas de sangre y a la asistencia de la curación de
heridas.
Además, CSF-1 se ha utilizado
también para el tratamiento de enfermedades tumorales (US 5 725
850), no sólo como ayuda para pacientes con tumores y supresión
inmune, sino también para matar directamente las células tumorales.
Se ha hallado que son en particular las células tumorales de
sarcoma que pueden matarse por administración de
CSF-1 (US 5 104 650).
Sin embargo, el efecto antitumoral de
CSF-1 no es indiscutido en el estado de la técnica.
Así, Anderson et al. (Gynecol. Oncol. 74(2) (1999),
202-207) han comunicado que ni
CSF-1 y ni su receptor son de importancia en la
patogénesis de sarcomas uterios. Por otro lado, es conocido que
tanto CSF-1 como su receptor están correlacionados
con la progresión de tumor para adenocarcinomas endométricos.
Finalmente, en ratones deficientes en CSF-1 y
deficientes en macrófagos, se ha podido observar un crecimiento de
tumor disminuido en caso de un tumor especial (``Lewis Lung
Carcinoma''), aunque los ratones deficientes en
CSF-1, a pesar del crecimiento de tumor reducido,
morían más rápidamente que los ratones de control que llevaban
tumores (Nowicki et al., Int. J. Cancer 65 (1996),
112-119). Se suponía que esta expectativa de vida
reducida se debía también a la formación masiva de necrosas en los
ratones deficientes en CSF-1.
Por Haran-Ghera et al.
(Blood 89(7) (1997), p. 2537-2545), se conoce
el uso de anticuerpos anti-CSF-1 y
anticuerpos de receptores
anti-CSF-1, con el fin de inhibir
la formación de colonias de células tumorales in vitro.
Puesto que CSF-1 y el receptor de
CSF-1 se inducen en casi todas las leucemias, se ha
postulado que CSF-1 y el receptor de
CSF-1 son agentes que se comportan como moléculas
marcadoras para las células tumorales de leucemia.
En Keshava et al. (Proc. Am. Assoc. Canc.
Res. Annual 38 (1997), p. 500), se ha investigado el papel de
CSF-1 y de su receptor en los tipos de cáncer de
pecho, de ovarios y otros. Se describe que el CSF de macrófagos
funciona como un factor de crecimiento autocrino en el cáncer de
pecho y de ovario.
Por ello, aunque el papel de
CSF-1 como agente antitumoral está ciertamente
discutido, no se ha discutido ni se ha considerado posible en el
estado de la técnica que CSF-1 presente un efecto
adverso sobre el tratamiento de tumores.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un agente para el tratamiento de pacientes con
tumores, en particular con inclusión del papel de
CSF-1 en tumores.
Este objetivo se consigue según la invención
utilizando compuestos que inhiben la actividad
CSF-1 para la preparación de un agente para el
tratamiento de enfermedades tumorales. En el transcurso de la
invención, se ha hallado sorprendentemente que el propio
CSF-1 no presenta - al contrario de los efectos
propuestos previamente en el estado de la técnica - un efecto
antitumoral, sino que el crecimiento de tumor puede retardarse o
eliminarse por administración de compuestos que inhiben
CSF-1 o su receptor, lo cual da lugar a una tasa de
supervivencia aumentada. A pesar de que en el estado de la técnica
era ciertamente conocido que CSF-1 está
correlacionado con la progresión del crecimiento de tumor en
algunos tumores, previamente se creía que este contenido en
CSF-1 o en el receptor de CSF-1 no
tendría un efecto sobre el crecimiento de tumor. Al contrario, en
el estado de la técnica se suponía que la producción de
CSF-1 aumentada provocaría una disminución de
tumores. Así, por la memoria de patente US nº 5 725 850 se conoce
que concentraciones aumentadas en CSF-1 pueden
utilizarse para la estimulación de macrófagos que matan células TU5
de sarcomas en ratones, pero también se menciona que dicha
actividad es en realidad eficaz sólo en el caso de utilizar
CSF-1 en combinación con
interleucina-2, IFN- \alpha,
IFN-\beta o IFN-\gamma. Por
tanto, es posible que este efecto de matar sarcomas, comunicado en
el estado de la técnica, podría ser causado por las linfoquinas
adicionales, administradas junto con CSF-1.
En cambio, dentro de la presente invención, se ha
hallado que la administración de CSF-1 o de
sustancias que inhiben el receptor de CSF-1 en
realidad produce un efecto antitumoral. Este hallazgo está en contra
de lo que previamente se ha divulgado en la enseñanza del estado de
la técnica.
El único efecto que hasta la fecha - según los
conocimientos de la presente invención - indica un efecto negativo
de CSF-1 en conexión con las enfermedades tumorales
ha sido hasta ahora un crecimiento de tumor obstaculizado en ratones
deficientes en CSF-1 y deficientes en macrófagos.
Con respecto a esto, se ha señalizado el papel de macrófagos
dependientes de CSF-1 en la formación de estromas
de tumor (véase Nowicki et al.) llegando a la conclusión
de que el crecimiento de tumor LLC en ratones deficientes en
CSF-1 no es facilitado por la ausencia de
macrófagos dependientes de CSF-1 (tal como en
realidad había de esperarse a base del efecto antitumoral del propio
CSF-1, descrito previamente en el estado de la
técnica). Allí se han señalizado también los efectos antitumorales
significantes, demostrados en el tratamiento in- vivo de
ratones con CSF-1. Es verdad que en ratones
deficientes en CSF-1 en los que se había implantado
un tumor LLC el crecimiento de tumor no resultó aumentado en
comparación con ratones normales, pero se demostró que los ratones
deficientes presentaban en realidad poco tejido de estroma. En
estos animales, los tumores LLC eran mucho más narcóticos, lo cual
explica también el crecimiento reducido. De todas formas, los
ratones deficientes en CSF-1 murieron más temprano
que los ratones de control enfermos con tumores. Nowicki et
al. primero hicieron hincapié en que el tumor LLC no es un
tumor representativo para demostrar el papel de
CSF-1 en la inmunidad de tumor natural. En el modelo
de Nowicki et al., este tumor se utilizaba sólo porque
crecía de forma reproducible tanto en ratones de control como en
ratones deficientes en CSF-1.
Nowicki et al. han hecho también hincapié
en que los datos obtenidos con ratones deficientes en
CSF-1 no están en contra de la hipótesis de que los
macrófagos dependientes de CSF-1 desempeñen un papel
importante en la respuesta autoinmune inducida, especialmente
cuando el estímulo se produce mediante CSF-1
exógeno, tal como se ha comunicado en el estado de la técnica.
Sin embargo, dentro de la presente invención,
resulta que en realidad no es la administración de
CSF-1 misma que inicia una respuesta antitumoral o
que puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades tumorales,
sino que un tratamiento de tumor eficaz puede conseguirse por
inhibición de la actividad de CSF-1.
Por ello, la presente invención se refiere al uso
de inhibidores de la actividad de CSF-1 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades
tumorales. Por tanto, el agente según la invención para el
tratamiento de enfermedades tumorales que contiene inhibidores de la
actividad de CSF-1 está en contra de la enseñanza
predominante en la que se acordó al propio CSF-1
más bien un efecto antitumoral o por lo menos se sospechaba que
CSF-1 desempeñaba un papel neutro en la mayoría de
las enfermedades tumorales.
En la presente invención, se administra, en un
procedimiento para el tratamiento de enfermedades tumorales, una
dosis eficaz de inhibidores de la actividad de
CSF-1 a pacientes con tumores.
La manera de la que se inhibe la actividad de
CSF-1 no es crítica. En el estado de la técnica, se
han descrito toda una serie de sustancias que inhiben la actividad
de CSF-1.
Las dos direcciones de ``empuje'' esenciales de
la inhibición de la actividad CSF-1 son la
supresión de la actividad de CSF-1 misma y la
supresión de la actividad del receptor de CSF-1
(véase el documento US 5 405 772).
Según la invención, los inhibidores de la
actividad de CSF-1 preferidos son anticuerpos que
neutralizan CSF-1 o su receptor. Anticuerpos
neutralizantes de este tipo (descritos por ejemplo en Weir et
al., J. Bone and Mineral Research 11 (1996),
1474-1481) se unen a CSF-1 o al
receptor de CSF-1 de tal forma que se inhibe o no
se transmite la actividad de CSF-1.
Alternativamente, puede inhibirse la actividad de
CSF-1, recurriendo a la ``técnica de antisentido'',
en la cual se utilizan secuencias cortas de ácidos nucleicos de una
sola hebra para impedir la expresión de CSF-1 o de
su receptor o de otra parte del mecanismo de transducción de
señales de la actividad de CSF- 1. La ``técnica de antisentido'' es
conocida por los expertos en la materia, por ejemplo en ``Antisense
Technology - A Practical Approach'', Lichtenstein and Nellen
(Eds.), IRL Press, Oxford University Press 1997 y ``Oligonucleotides
as Therapeutic Agents'' (Ciba Foundation Symposium 209, John Wiley
& Sons 1997; por la presente incorporados como referencias) y
puede adaptarse fácilmente al CSF-1 o al receptor
de CSF-1 de cualquier secuencia adecuada.
Las secuencias que en su totalidad o como
fragmento eficaz son aptas para el tratamiento de antisentido se
han descritos, entre otras, en las memorias de patente
estadounidenses US 4 847 201, 5 792 450, 5 681 719, 5 861 150, 5 104
650 y 5 725 850.
Además, pueden utilizarse también dentro de la
invención inhibidores sintéticos de la actividad de
CSF-1.
La inhibición según la invención de la actividad
de CSF-1 es particularmente apta para la inhibición
o el retardo del crecimiento de tumores sólidos.
El método según la invención resulta
particularmente eficaz para el tratamiento de tumores sólidos,
seleccionados del grupo constituido por tumores germinales, tumores
epiteliales y adenocarcinomas. Intratables son las enfermedades
malignas del sistema hematopoético (por ejemplo leucemias).
Además de las inhibiciones preferidas, ya
mencionadas, de la actividad de CSF-1 por
neutralización de los anticuerpos o por la técnica de antisentido o
por inhibidores químicos y competidores de CSF-1 o
de su receptor, según la invención es posible modificar
genéticamente células o células de tumor sólido de tal forma que
contrarrestan el crecimiento y el desarrollo del tumor sólido.
Dichos métodos de terapia génica consiguen inhibir la actividad de
CSF-1 o la actividad del receptor de
CSF-1 por medio de la expresión inducida de por lo
menos partes del gen para CSF-1 o su receptor o de
otra mutante genéticamente modificadas, en particular por
deleción.
El medicamento a preparar según la invención se
ha formulado para la administración intratumoral, en particular en
caso de dicho inhibidor celular para el cual, según la invención,
son aptos todos los tipos de célula (a excepción de células de línea
germinal), con el fin de permitir su aplicación directamente en el
lugar del tumor. Dicha variante de administración se prefiere
también para los demás inhibidores.
Sin embargo, el medicamento según la invención
puede administrarse también de otra forma, en particular por vía
tópica, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal,
intrapleural, intratecal o en combinación con lípidos
catiónicos.
Una variante particularmente preferida de la
presente invención es, como ya se ha mencionado, el uso del método
de antisentido, es decir, un procedimiento en el cual se utilizan
áreas determinadas de una mARN que codifica para
CSF-1 o su receptor, las cuales están presentes en
dirección inversa. Por ello, la inhibición de la actividad de
CSF-1 según la invención puede conseguirse también
mediante constructos de antisentido de CSF-1 que
son expresables por terapia génica.
Dichos constructos de antisentido de
CSF-1 pueden prepararse por ejemplo llevando a cabo
las etapas siguientes:
- a)
- Amplificación del ADN de CSF-1 con PCR
- b)
- Subclonación del producto PCR de CSF-1 en una orientación antisense
- c)
- Incorporación del ADN obtenido en la etapa b) en E. coli y
- d)
- Aislamiento del constructo de antisentido de CSF-1 multiplicado en E. coli
En este método, la amplificación del ADN de
CSF-1 con PCR consiste o bien en la amplificación
de un cADN de CSF-1 o bien de un banco de
CSF-1 con adición de una Taq ADN polimerasa
correspondiente. El producto de amplificación, es decir, el
producto PCR de CSF-1 se subclona posteriormente en
su orientación de antisentido en un vector, y a continuación el
ADN recombinante obtenido, es decir, la secuencia de antisentido de
CSF-1, clonada en el vector, se introduce en E.
coli por transformación y se multiplica, y luego el constructo de
antisentido de CSF-1 multiplicado en E. coli, es
decir, el plásmido, se aísla a partir de las células bacterianas
por medio de métodos estándares y se guarda para su uso posterior.
Para su aislamiento puede utilizarse por ejemplo el procedimiento
conocido de la lisis alcalina para el aislamiento de plásmidos.
Puede realizarse una secuenciación posterior de los constructos de
antisentido de CSF-1 amplificados y clonados. Dicho
procedimiento se distingue por su particular sencillez y
precisión, permitiendo el procedimiento según la invención obtener
de forma rápida y segura altos rendimientos en constructos de
antisentido de CSF-1 que presentan una acción
específica. La secuencia detallada puede describirse por las etapas
que se realizan en el proceso y que son las siguientes:
- a)
- Amplificación del ADN de CSF-1 con PCR
- b)
- Subclonación del producto PCR de CSF-1 en una orientación de antisentido
- c)
- Multiplicación de los constructos del cADN de antisentido de CSF-1 obtenidos en la etapa b) e
- d)
- Integración en vectores de transferencia recombinantes, virales
- e)
- Multiplicación de los constructos obtenidos en la etapa c) y cotransfección de dichos constructos juntos con el ADN de adenovirus en células de un cultivo de células
- f)
- Recombinación de los constructos del cADN de antisentido de CSF-1 con el ADN de adenovirus y
- g)
- Multiplicación de los recombinantes en células de un cultivo de células
- h)
- Preparación y purificación de los constructos de antisentido de CSF-1 recombinante, adenoviral y
- i)
- Uso de los mismos en organismos de mamíferos (terapia génica de células de tumor de un cultivo de células, animales de prueba (ratón, rata), uso en pacientes con tumor,
- j)
- Selección de las áreas de la secuencia primaria de CSF-1 que son aptas para la inhibición de antisentido de oligonucleótidos,
- k)
- Preparación y modificación de oligonucleótidos de antisentido de CSF-1 resistentes a nucleasa,
- l)
- Uso de los mismos en organismos de mamíferos (terapia génica de células de tumor de un cultivo de células, animales de prueba (ratón, rata), uso en pacientes con tumor).
La amplificación del CSF-1 total
(dicho método es por supuesto también aplicable 1:1 al receptor de
CSF-1) o bien de partes del mismo puede realizarse
de forma preferida con primers 3' o primers 5', siendo la longitud
de primer en particular de 15 a 30 nucleótidos y utilizándose,
para conseguir una amplificación particularmente segura y exacta
con respecto al producto de destino, en particular específica, de
forma preferida los siguientes primers 3':
- -
- ccagccaaga tgtggtgacc aagactgatt (nucleótidos n^{os} 641-670)
- -
- ccaagcagcg gccacccagg agcacctgcc (nucleótidos n^{os} 851-880)
- -
- aggtggaact gacagtgtag agggaattct (nucleótidos n^{os} 1751--1780)
- -
- tgcacaagct gcagttgacg tagctcgag (nucleótidos n^{os} 3911-3939)
y primers 5', respectivamente:
- -
- catgggtcat ctcggcgcca gagccgctct (nucleótidos nº 1-30)
- -
- agccagctgc cccgtatgac cgcgccgggc (nucleótidos nº 91-120)
- -
- ggagtatcac cgaggaggtg tcggagtact (nucleótidos nº 191-220).
Para conseguir una amplificación particularmente
exacta y específica, se realiza el procedimiento según la invención
preferentemente de tal forma que la amplificación del ADN de
CSF-1 se lleva a cabo con 20 a 40 ciclos, en
particular 25 a 35 ciclos, para una desnaturalización, adición y
extensión en una máquina PCR, utilizándose en particular una
máquina PCR programable por razones de la exactitud de la
realización del proceso. En dicho proceso, la desnaturalización se
lleva a cabo según la invención a una temperatura comprendida
entre 85ºC y 100ºC durante 20 s a 4 min, en particular entre 93ºC y
98ºC durante 30 s a 2 min, lo cual asegura una desnaturalización
completa, casi al 100% de la secuencia de proteína. Según la
invención, la reacción de adición se lleva a cabo preferentemente a
una temperatura comprendida entre 30ºC y 70ºC durante 30 s a 4 min,
en particular entre 37ºC y 65ºC durante 1 min a 2 min,
asegurándose de esta manera que según dicha realización de proceso
la adición se efectúa tan completamente como sea posible y
consiguiéndose, debido al intervalo de temperatura amplio dentro del
cual se realiza el procedimiento, en particular también una
realización energéticamente favorable, puesto que tras la
desnaturalización no es absolutamente necesario reducir la
temperatura para la adición aproximadamente a la temperatura
corporal, tal como sucede en muchos procedimientos conocidos.
Finalmente, la extensión se lleva a cabo preferentemente a una
temperatura comprendida entre 65ºC y 80ºC durante 30 s a 6 min, en
particular entre 72ºC y 74ºC durante 1 min a 4 min. Esta forma de
la realización del proceso en su totalidad en la máquina PCR da el
resultado que a pesar del gran número de etapas necesarias para
conseguir un CSF-1 total o partes del mismo
completamente y específicamente amplificado la duración del
procedimiento puede mantenerse relativamente corta.
Para simplificar más, en particular completar, la
realización del proceso, el procedimiento se realiza, según la
invención, antes de los ciclos para la desnaturalización, reacción
de adición y extensión o después de los mismos, preferentemente de
tal forma que al inicio de la amplificación se realiza una etapa
de desnaturalización adicional a aproximadamente 95ºC durante
aproximadamente 2 min y al término de la amplificación se realiza
una extensión final a una temperatura comprendida entre 72ºC y 74ºC
durante aproximadamente 5 a 10 min. Esta desnaturalización
adicional al inicio de la reacción desnaturaliza ya un gran
porcentaje de las proteínas antes de realizar los ciclos de
proceso, lo cual da lugar, en particular en los primeros ciclos de
proceso, a una conversión más completa. Finalmente, se ha hallado
que el rendimiento de producto puede aumentarse aún más utilizando
una extensión final.
Para la subclonación del cADN, sintetizado como
producto PCR de CSF-1, se procede preferentemente
de tal forma que el cADN, sintetizado como producto PCR de
CSF-1, se subclona en un vector de plásmido, en
particular pCRII, y se integra en el MCS del vector pCRII por
incubación a una temperatura comprendida entre 4ºC y 25ºC durante 1
a 24 horas. En este proceso, tiene lugar primero una subclonación
en un vector de plásmido, siendo apto para este fin
preferentemente el vector pCRII conocido, el cual puede comprarse
de la empresa InVitrogen. La integración del cADN en el MCS, es
decir, el ``Multiple Cloning Site'' (sitio de clonación múltiple),
del vector pCRII se lleva a cabo por incubación suave según una
amplia gama de métodos de incubación diferentes, consiguiéndose una
ligación particularmente segura y completa si se mantiene una
relación molar del inserto al vector de 1:3. Para la integración
del cADN en el vector, el sitio de corte utilizado puede ser por
ejemplo la secuencia de reconocimiento EcoRI del MCS, lo cual
permite conseguir otra mejora del procedimiento según la
invención.
Finalmente, se ha hallado que puede conseguirse
una incorporación particularmente eficaz y segura del ADN en E.
coli si la incorporación en E. coli se realiza preferentemente por
transformación bacteriana por medio de un choque térmico, calentando
una mezcla enfriada con hielo y constituida por células de E. coli
y el ADN a transformar a una temperatura comprendida entre
aproximadamente 40ºC y 44ºC, en particular 42ºC, por choque
térmico, seguido de un enfriamiento rápido en un baño de hielo, y a
continuación incubación y cultivo.
Otro procedimiento igualmente preferido según la
invención consiste en que la incorporación del ADN en E. coli se
lleva a cabo por transformación de E. coli con ADN de plásmido por
medio de electroporación a, en particular, 25 \muF, 2,5 kV y una
resistencia de 200 ohmios, seguido de regeneración, incubación y
cultivo de la colonia de células.
Ambos métodos de incorporación en E. coli se
distinguen por un alto rendimiento del cultivo de las colonias,
permitiendo de esta manera conseguir, a través de un procedimiento
de transformación sencillo, una cantidad suficiente del constructo
según la invención para su uso posterior en la terapia de
carcinomas. Otra ventaja del procedimiento según la invención
radica en que el constructo puede obtenerse de alta pureza y con
gran selectividad, con lo cual no es necesaria una purificación
posterior tras el aislamiento del constructo, reduciéndose
sustancialmente no sólo la duración sino también los costes del
procedimiento.
Además de la posibilidad de amplificar y aislar
CSF-1 por medio de PCR a partir de un banco de
cADN ya existente, el ADN de CSF-1 a amplificar
preferentemente por medio de PCR puede prepararse por aislamiento
del ARN total de células que expresan CSF-1, en
particular fibroblastos, o mARN, seguido de síntesis de cADN por
transcripción reversa con PCR. Métodos de clonación de este tipo
son conocidos de forma generalizada en la técnica y han tenido que
adaptarse y revisarse de forma adecuada, con el fin de conseguir el
ADN de CSF-1 especial a amplificar por medio de
PCR. En el curso de este proceso se ha hallado que el ARN total
procedente de células que expresan CSF, en particular fibroblastos,
puede extraerse de forma particularmente preferida por medio del
método de isotiocianato de guanidina, pudiendo utilizarse para el
aislamiento del mensajero-ARN utilizado
alternativamente la cromatografía de
oligo-dT-celulosa, la cual permite
una realización de la reacción particularmente específica, dando
lugar a rendimientos de producto muy altos. La transcripción reversa
con PCR necesaria tras el aislamiento del ARN total o del
mensajero-ARN puede realizarse de forma similar,
tal como se ha descrito en el procedimiento según la invención. En
dicho procedimiento se ha hallado que el número de ciclos en la
máquina PCR debería incrementarse ligeramente para conseguir
productos completos y selectivos. Lo mismo es aplicable también a la
extensión final, que ventajosamente debería proseguirse durante
por lo menos 10 min. Sin embargo, en el aislamiento según la
invención del ARN total o de mARN y en la síntesis subsiguiente de
cADN puede conseguirse un producto aún más específico y más puro que
en el procedimiento en que se utiliza un banco de mARN, siendo el
tiempo necesario para preparar dicho producto y los costes sólo
ligeramente aumentados.
Finalmente, con el fin de mejorar aún más la
realización del procedimiento y conseguir una especificidad o
pureza aún más alta, es posible efectuar una purificación por
filtración con geles antes del ligado con adaptadores, mediante el
cual el producto de partida se limpia eliminando fragmentos
relativamente pequeños, los cuales no son necesarios para la
realización del procedimiento según la invención. Esta forma de
realizar el procedimiento aumenta también la eficacia de clonación
fosforilando el ADN y realizando la purificación del cADN obtenido
de esta manera según los protocolos de purificación de ADN
estándares o utilizando cromatografía por afinidad. Otro aumento
del rendimiento y en particular otra mejora de la pureza puede
conseguirse mediante una extracción adicional con un tampón TE.
Según otro objetivo, la invención se refiere a un
procedimiento en que se preparan constructos de antisentido de
CSF-1 que pueden expresarse por terapéutica
genética, consiguiéndose dicho objetivo preparando constructos de
antisentido de CSF-1 que pueden expresarse por
terapéutica genética por formación de adenovirus recombinantes,
infecciosos por medio del corte del cADN de CSF-1 a
partir del vector de plásmido y clonación subsiguiente en una
orientación de antisentido en un vector de transferencia adenoviral.
En este proceso, el cADN de CSF-1 se corta del
vector de plásmido, en particular pCRII, con ayuda de enzimas de
restricción y a continuación se clona en un vector de transferencia
en una orientación de antisentido, que por su parte se cortó por
medio de enzimas de restricción, y a continuación se transforma E.
coli de manera de por sí conocida y posteriormente se realiza un
``screening'' con respecto a los plásmidos recombinantes. Esto
permite obtener el vector de transferencia recombinante que
contiene el cADN de CSF-1 integrado en orientación
de antisentido en un alto rendimiento. A continuación, el vector
de transferencia recombinante se incorpora en ADN adenoviral, con
el fin de conseguir un vector de transferencia adenoviral. Según la
invención, el procedimiento preferido es tal que los adenovirus
recombinantes, infecciosos se forman por recombinación homóloga
entre un vector de transferencia que presenta un cADN de
CSF-1 integrado y un plásmido adenoviral, genomo,
en particular Ad5. El hecho de que se obtienen vectores
recombinantes, adenovirales por recombinación homóloga entre el
vector de transferencia y el plásmido adenoviral, genomo, que en
el caso que nos ocupa aquí tiene lugar en la línea de tumor 293,
permite conseguir un producto que por un lado contiene
CSF-1 en una orientación de antisentido y por otro
lado contiene un virus con defecto de replicación, que sólo puede
multiplicarse en células que proporcionan los sitios de defecto,
tales como por ejemplo genes E1A y E1B, en la posición trans, lo
cual asegura una multiplicación selectiva de los virus. Dicha
multiplicación selectiva de los virus con defectos de replicación
permite su uso con la misma selectividad.
Los virus Ad5 recombinantes, utilizados según la
invención, son virus independientes de ayudadores que pueden
multiplicarse en la línea humana 293, utilizada preferentemente
según la invención.
Según la invención, los oligonucleótidos
utilizados pueden ser también oligonucleótidos de antisentido de
fosforotioato de CSF-1 (análogos
5-propinilo), oligonucleótidos de antisentido de
fosfonato de metilo de CSF-1,
2'-O-metiloligoribonucleótidos de
antisentido de CSF-1 u oligonucleótidos de
antisentido de CSF-1 modificados en sus extremos o
los oligonucleótidos de antisentido correspondientes para el
receptor de CSF-1. Oligonucleótidos de este tipo
son conocidos en el estado de la técnica para una amplia gama de
factores de crecimiento y se preparan según los procedimientos
estándares.
En la ``técnica de inhibición de antisentido'' a
base de oligodeoxinucleótidos específicos del gen, la molécula de
ADN sintético monohebra debe modificarse, con el fin de aumentar su
resistencia a nucleasas. Oligonucleótidos modificados con
fosforotioato presentan una mayor estabilidad en comparación con
los oligonucleótidos sin modificar, consistiendo dicha
modificación en la sustitución de un átomo de oxígeno por uno de
azufre en el puente del fosfodiéster. Esto permite conseguir por
ejemplo una duración de acción más larga con menores cantidades
aplicadas. Este tipo de oligonucleótidos modificados presenta una
mayor resistencia a la degradación de nucleasas intracelulares y
puede utilizarse, según la invención, como moléculas de
antisentido para la inhibición de la expresión de genes como
quimioterapéuticos. Hay que tener en cuenta que los oligonucleótidos
utilizados terapéuticamente naturalmente deben también utilizarse
sólo en forma purificada para asegurar que productos de adición más
cortos o erróneos o productos secundarios de síntesis son
eliminados antes de su uso. Según la invención, es posible
utilizar tanto oligonucleótidos completamente modificados como
oligonucleótidos que llevan puentes de fosforotioato que se han
modificado sólo parcialmente, siendo el modo de acción y la
eficacia de los oligonucleótidos, tal como ya se ha mencionado
anteriormente, ligeramente diferentes y presentando por ejemplo los
oligonucleótidos de antisentido de CSF-1
modificados en sus extremos una mayor afinidad entre la secuencia
de destino y el oligonucleótido de antisentido así como una mejor
absorción en la célula, una mayor resistencia a la degradación de
nucleasas y una mejor detectabilidad. Sin embargo, hay que
destacar como principio general que todos los oligonucleótidos
pueden utilizarse en la terapia de carcinomas igual que los
constructos de antisentido de CSF-1, realizándose
la utilización según la invención preferentemente de forma tópica,
intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o en
combinación con lípidos catiónicos.
Los constructos de antisentido de
CSF-1 expresables en la terapéutica genética, que
se preparan y pueden utilizarse igualmente según la invención, se
administran preferentemente de forma intratumoral, puesto que con
la administración intratumoral puede asegurarse que el virus con
defecto de replicación puede ser utilizado por el cuerpo para la
infección de las células de tumor en el sitio necesario para esto.
En principio, teóricamente, el constructo de antisentido de
CSF-1 expresable en la terapia genética podría
administrarse también de manera convencional, tal como de forma
tópica, intravenosa, intraarterial, subcutánea, etc., pero de esta
forma parece que su eficacia resultaría sustancialmente
limitada.
Por tanto, la preparación y utilización de
constructos de antisentido de CSF-1, de
oligonucleótidos de antisentido de CSF-1 así como de
constructos de antisentido de CSF-1 expresables en
la terapia génica permiten conseguir la preparación y utilización
de sustancias biológicas que inhiben sustancialmente el crecimiento
y la multiplicación de células de carcinomas, con lo cual se
consigue una terapia de carcinomas selectiva y dirigida a las
células de destino utilizando los constructos preparados según la
invención.
Según una utilización particularmente preferida,
según la invención, se procede de tal manera que las secuencias de
CSF-1 del nucleótido 1-180 (derivado
de la secuencia de gen de CSF-1 humana, EMBL acc.
nº M37435, LOCUS: HUMCSDF1) utilizadas son en particular los
14-meros siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
ON-1CSFlas: \+ 5 - GCCCGGCGCGGTCA-3
\+ 14-mero homólogo para los\cr \+ \+ primeros 14
nt después del codón\cr \+ \+ de inicio (ATG) (nucleótidos
120-106)\cr ON-2CSFlas: \+ 5 -
ACGGGGCAGCTGGC-3 \+ 14-mero homólogo
para los 14 nt\cr \+ \+ antes del codón de inicio (ATG)\cr \+ \+
(nucleótidos 105-91)\cr ON-3CSFlas:
\+ 5 - CGAGAGGACCCAGG-3 \+ 14-mero
homólogo para los 14 nt\cr \+ \+ después del inicio de
transcripción\cr \+ \+ del mARN (nucleótidos
14-1)\cr}
A continuación, la invención se ilustrará con
mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos que siguen, a los
cuales naturalmente no estará limitada.
Para el aislamiento del ARN total procedente de
células que expresan CSF-1 (fibroblastos L929), el
cual es el material de partida a utilizar, se utiliza el método de
tiocianato de guanidina para la extracción del ARN. El procedimiento
es el siguiente:
- -
- Eliminación del medio de los fibroblastos L929, adición de 1 ml de solución de desnaturalización y lisis de las células por pipeteado.
- -
- Traslado del homogeneizado en tubos de ensayo de 5 ml y adición de 0,1 ml de acetato sódico 2 M (pH 4), mezclado, y a continuación adición de 1 ml de fenol saturado con agua, mezclado, adición de 0,2 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (49:1), mezclado e incubación de la suspensión a 0-4ºC durante 15 min.
- -
- Centrifugación a 4ºC y 10.000 g durante 20 min y traslado de la fase acuosa en un nuevo tubo de ensayo.
- -
- Precipitación del ARN por adición de 1 volumen de isopropanol al 100%, enfriamiento de los tubos de ensayo a -20ºC durante 30 min, a continuación centrifugación a 4ºC y 10.000 g durante 10 min, descartar la solución sobrenadante.
- -
- Disolución del pellet así obtenido en 0,3 ml de solución desnaturalizante.
- -
- Precipitación del ARN con 0,3 ml de isopropanol al 100% a -20ºC durante 30 min, luego a 4ºC durante 10 min, centrifugación a 10.000 g y descartar la solución sobrenadante.
- -
- Resuspensión del pellet de ARN en etanol al 75%, agitar vigorosamente y incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min.
- -
- Centrifugación a 10.000 g durante 5 min, descartar la solución sobrenadante y secar el pellet al vacío durante 10-15 min.
- -
- Disolución del pellet de ARN en 200 \mul de agua tratada con DEPC, cuantificación del ARN por espectrofotometría UV a 260 m.
Amplificación del ARN de CSF-1
por medio de RT-PCR (PCR con transcriptasa
reversa)
1 \mug del ARN de CSF-1
obtenido se introduce en un microtubo de centrifugación y se incuba
a 70ºC durante 10 min, se centrifuga brevemente y a continuación se
enfría con hielo.
Preparación de una mezcla de reacción de 20
\mul por adición de los reactivos siguientes al ARN de
CSF-1:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
MgCl _{2} , 25 mM \+ 4 \mu l\cr Tampón de ``transcriptasa
reversa'', 10x \+ 2 \mu l\cr Mezcla de dNTP, 10 mM \+ 2 \mu l\cr
Inhibidor ARNsin ribonucleasa \+ 0,5 \mu l\cr AMV transcriptasa
reversa \+ 15 unidades\cr Oligo(dT) primer \+ 0,5 \mu g\cr
ARN de CSF-1 \+ 1 \mu g\cr Agua libre de nucleasa
para hacer un volumen total de \+ 20
\mu l\cr}
A continuación, la mezcla de reacción se incuba a
42ºC durante 15 min y luego se calienta a 99ºC durante 5 min y se
vuelve a incubar a 0-5ºC durante 5 min. Para la
amplificación, la solución se diluye de la manera siguiente: La
mezcla de reacción de síntesis de la primera hebra de cADN se
diluye a 100 \mul con agua libre de nucleasa, y a continuación
la mezcla de reacción de amplificación PCR de 50 \mul se prepara
por combinación de los reactivos siguientes (primer corriente abajo
y corriente arriba específicas de molde deben adicionarse aquí, es
decir, primer que son específicos de CSF-1):
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|}\hline
Para el primer 5': CSF-1 de sentido
5'-atgaccgcgccgggc (nucleótidos n ^{os}
106-120) \\ Para el primer 3':
CSF-1 de antisentido
5'-cactggcagttccacctgtct (nucleótidos n ^{os}
1767-1747)
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se utilizó la siguiente mezcla de reacción PCR:
H_{2}O
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
\+ Volumen \+ Concentración final \\\hline MgCl _{2} , 25 mM \+
3 \mu l \+ 1,5 mM \\\hline 10x tampón PCR \+ 5 \mu l \+ 1x
\\\hline dNTP, 10 mM \+ 1 \mu l \+ 200 \mu M de cada uno
\\\hline Primer corriente arriba \+ 5 - 50 pM \+ 0,1 - 1 \mu M
\\\hline Primer corriente abajo \+ 5 - 50 pM \+ 0,1 - 1 \mu M
\\\hline Taq ADN polimerasa, 5 U/ \mu l \+ 0,25 \mu l \+ 1,25
unidades/50 \mu l \\\hline Mezcla de reacción de la primera \+ 10
\mu l \+ \\ hebra de ADN \+ \+ \\\hline H _{2} O libre de
nucleasa para hacer \+ 50 \mu l \+ \\ un volumen de \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La adición de Taq polimerasa se realizó por
último.
La máquina PCR se programó de la manera siguiente
con respecto a los tiempos y temperaturas para la
desnaturalización, reacción de adición y extensión:
Desnaturalización al principio de la reacción:
aprox. 95ºC durante 5 min 1 ciclo
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|lc|}\hline
Desnaturalización: aprox. 95ºC durante 1:00 min \+ \\ Reacción de
adición: 65ºC durante 1:00 min \+ 35 ciclos \\ Extensión:
72ºC durante 2:00 min \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Extensión final: 72ºC durante 5 min tras el
último ciclo
La mezcla se mantiene a 4ºC hasta que la máquina
PCR se desconecta y las muestras se retiran. A cada mezcla de
reacción PCR se adicionan 100 \mul de cloroformo, la mezcla se
agita, se centrifuga durante 2:00 min, y la fase superior se guarda
para su tratamiento posterior. Para determinar el tamaño del
producto, se aplican 10 \mul del producto PCR a un gel de
agarosa.
A continuación, el producto PCR se purifica de la
manera siguiente:
- \bullet
- Adición de 250 \mul de un tampón PB a 50 \mul de la mezcla de reacción PCR.
- \bullet
- Una columna QIAquick spin se introduce en un tubo de centrifugación de 5 ml.
- \bullet
- La muestra se aplica a la columna y se centrifuga a 3000 g durante 1 min.
- \bullet
- Lavado: adición de 0,75 ml de un tampón PE seguida de centrifugación durante 1 min.
- \bullet
- Traslado de la columna QIAquick spin a un microtubo de centrifugación. Centrifugación a 10.000 g durante 1 min.
- \bullet
- Introducir la columna spin QIAquick en un recipiente de reacción de 1,5 ml.
- \bullet
- Elución del ADN por adición de 50 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y centrifugación a la velocidad máxima durante 1 min en una microcentrífuga.
- \bullet
- Eluado recogido: aproximadamente 48 \mul. La concentración de ADN se determina por espectrofotometría UV a 260 nm.
Para su reacción posterior, es ventajoso llevar a
cabo una ligación de un adaptador EcoRI de la manera siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
T4 ligasa de ADN 10 x tampón \+ 3 \mu l\cr BSA acetilado, 1 mg/ml
\+ 3 \mu l\cr cADN (50 ng/ \mu l) \+ 5 \mu l\cr Adaptadores
(exceso molar de 20 veces: 10 pmol \+ 1 \mu l\cr de
adaptador)\+\cr T4 ligasa de ADN (unidades Weiss) \+ 2,5
\mu l \cr Rellenar con agua libre de nucleasa a \+ 30
\mu l\cr}
La solución resultante se incuba a 15ºC durante
la noche, la enzima se desactiva por calentamiento de la mezcla de
reacción a 70ºC durante 10 min, y a continuación se enfría la
reacción con hielo.
Para la realización de la reacción sin
dificultades, el ADN de inserto se fosforiliza de la manera
siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Mezcla de ligación \+ 30 \mu l\cr T4 PNK 10x tampón \+ 4
\mu l\cr ATP, 0,1 mM (dilución 1:100 en agua de una \+ 2 \mu l\cr
solución madre 10 mM)\+\cr T4 PNK (10 u/ \mu l) \+ 1 \mu l\cr
Agua libre de nucelasa \+ 3 \mu l \cr Volumen total \+ 40
\mu l\cr}
La solución se incuba a 37ºC durante 30 min,
luego se adiciona 1 volumen de fenol/cloroformo saturado con TE, se
agita durante 30 s y se centrifuga a la velocidad máxima durante 3
min en una microcentrífuga, la fase acuosa superior se traslada a
un tubo de ensayo nuevo. A continuación, el adaptador en exceso se
elimina de la manera siguiente:
250 \mul de un tampón PB se adicionan a la
reacción de fosforilación, una columna QIAquick spin se introduce
en un tubo de centrifugación de 5 ml, la muestra se aplica a la
columna y se centrifuga a 3000 g durante 1 min. A
continuación, se lava por adición de 0,75 ml de un tampón PE, se
centrifuga otra vez durante 1 min, la columna QIAquick spin se
traslada a un microtubo de centrifugación y se centrifuga a 10.000
g durante 1 min. A continuación, la columna QIAquick spin se
introduce en un recipiente de reacción de 1,5 ml, el ADN se eluye
por adición de 50 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y
se centrifuga a la velocidad máxima durante 1 min en una
microcentrífuga. Eluado recogido: aproximadamente 48 \mul.
La próxima etapa es la concentración del cADN por
precipitación con etanol de la manera siguiente:
El ADN se mezcla con 0,5 volúmenes de acetato de
amonio 7,5 M y 2,5 volúmenes de etanol al 100% frío (-20ºC), la
mezcla se mezcla y se deja a -70ºC durante 30 min, a continuación
se centrifuga a la velocidad máxima durante 15 min en una
microcentrífuga, la solución sobrenadante se tira, el pellet
resultante se lava con 1 ml de etanol al 70% frío (-20ºC) y se
centrifuga a la velocidad máxima durante 5 min en una
microcentrífuga, la solución sobrenadante se tira, el pellet se
seca brevemente al vacío, y el sedimento se vuelve a suspender en
50 \mul de un tampón TE para su tratamiento posterior. La
concentración de ADN se determina por espectrofotometría UV a 260
nm.
A continuación, el vector pCRII se somete a un
tratamiento con fosfatasa, en el cual el vector se lineariza antes
del tratamiento con fosfatasa por medio de un corte de restricción
con EcoRI de la manera siguiente:
1 \mug de ADN pCRII
2 \mul de un tampón EcoRI 10x
2 unidades de EcoRI
Rellenar con agua a un volumen total de 20
\mul.
Incubar a 37ºC durante 2 horas.
Adición de 1/10 de volumen de un tampón de
desfosforilación 10x. Incubación, tras la adición de 1 unidad de
fosfatasa alcalina, a 37ºC durante 60 min. Desactivación de la
fosfatasa alcalina por calentamiento a 65ºC durante 15 min.
A continuación, el cADN sintetizado se clona en
el sitio de corte de EcoRI del vector pCRII.
100 ng de ADN de vector
50 ng de cADN de CSF-1
1 \mul de T4 ligasa de ADN (1 unidad Weiss)
1,5 \mul de T4 ligasa de ADN tampón 10x
rellenar con agua libre de nucleasa a 15 \mul.
La mezcla de reacción se incuba a temperatura ambiente durante 3
horas, obteniéndose de esta manera el plásmido recombinante de
pCRII-CSF-1.
El plásmido
pCRII-CSF-1 se introduce en E. coli
por transformación y se multiplica de la manera siguiente:
- -
- 100 \mul de E. coli electrocompetentes se mezclan con la mitad en volumen de la preparación de ligación (7,5 \mul) en placas sobre hielo
- -
- Electroporación: 25 \muF, 2,5 kV, 200 \Omega
- -
- Adición de 1 ml de un medio SOC para regenerar las células, traslado de las células en un tubo de ensayo e incubación a 37ºC durante 1 hora, colocación en placas de selección que contienen ampicilina y cultivo de colonias a 37ºC durante la noche.
Una colonia individual se retira de la placa de
selección y se incuba en 3 ml de LB con ampicilina a 37ºC durante 8
horas con agitación vigorosa, se diluye 1/500 en 100 ml de un medio
LB, y se deja crecer a 37ºC durante 12 horas con agitación
vigorosa. A continuación, las bacterias se cosechan por
centrifugación a 4ºC y 6000 g durante 15 min, los pellets de
bacterias se disuelven en 10 ml de un tampón P1, se adicionan 10 ml
de un tampón P2, se mezcla cuidadosamente y se incuba a temperatura
ambiente durante 5 min. A continuación, se adicionan 10 ml de un
tampón P3 enfriado con hielo, se mezcla inmediatamente
cuidadosamente y se incuba sobre hielo durante 20 min, y se
centrifuga a 20.000 g y 4ºC durante 30 min. La solución
sobrenadante se centrifuga otra vez a 20.000 g y 4ºC durante 15 min
y se traslada a una columna QIAGEN 500 equilibrada con 10 ml de un
tampón QBT. Tras el lavado de la columna con 2x30 ml de un tampón
QC, el ADN se eluye con 15 ml de un tampón QF y se precipita por
adición de 10,5 ml de isopropanol (temperatura ambiente) al ADN
eluido. Tras el mezclado y la centrifugación inmediata a 15.000 g y
4ºC durante 30 min, la solución sobrenadante se descarta, el pellet
de ADN se lava con 5 ml de etanol al 70% (temperatura ambiente), se
centrifuga a 15.000 g durante 10 min, y la solución sobrenadante se
elimina. El pellet resultante se seca al aire durante 5 min, y el
ADN se disuelve en 100 \mul de TE, pH 8,0. La concentración de
ADN se determina por espectrofotometría UV a 260 nm.
Finalmente, las secuencias de todos los
constructos de CSF-1 amplificados y clonados se
determinan por secuenciación según el método estándar de Sanger
(método de interrupción de cadena). Los constructos de
CSF-1 ahora pueden utilizarse como tales o
incorporarse en formulaciones farmacéuticamente compatibles.
El cADN de CSF-1 se corta de
plásmido del pCRII-CSF-1 del ejemplo
1, y a continuación se clona en una orientación de antisentido en
el vector de transferencia adenoviral:
El inserto se corta por medio de un corte de
restricción con EcoRI de la manera siguiente:
1 \mug de ADN de
pCRII-CSF-1
2 \mul de un tampón EcoRI 10x
2 unidades de EcoRI
Rellenar con agua a un volumen total de 20
\mul.
Incubar a 37ºC durante 2 horas.
A continuación, se forman extremos truncados por
medio de una reacción de relleno con enzima de Klenow con la
adición de los reactivos siguientes:
2 \mul de NTB 10x; 1 \mul de dNTP 1 mM; 1
unidad Klenow e incubación a 37ºC durante 15 min y calentamiento a
65ºC durante 5-10 al objeto de desactivar la enzima
Klenow.
Luego se corta el vector de transferencia
pQBI-AdCMV5BFP utilizando la enzima de restricción
Bg1II:
1 \mug de vector de transferencia de ADN
2 \mul de un tampón M 10x
2 unidades de Bg1II
Rellenar con agua a un volumen total de 20 \mul
e incubar a 37ºC durante 2 horas. Los fragmentos resultantes se
separan en un gel de agarosa TAE al 1%, el fragmento de
CSF-1 con un tamaño de 1641 bp así como el vector de
transferencia se separan del gel de agarosa y se purifican de la
manera siguiente:
El fragmento de ADN correspondiente se corta del
gel de agarosa con un bisturí, la pieza de gel se pesa, y se
adicionan 3 volúmenes del tampón QG a 1 volumen de gel, y a
continuación se incuba a 50ºC durante 10 min. Durante la incubación,
la mezcla se agita cada 2 minutos, se controla el color para ver si
es amarillo y a continuación adición de 1 volumen de gel de
isopropanol a la muestra, mezclado, introducción de una columna
QIAquick spin en un recipiente de reacción de 2 ml y aplicación de
la muestra a la columna y centrifugación durante 1 min. Introducir
la columna en un recipiente de reacción nuevo. Lavado por
aplicación de 0,75 ml de un tampón PE a la columna y centrifugación
durante 1 min. A continuación, eliminación del líquido de lavado y
centrifugación de la columna a 10.000 g durante 1 min.
Elución del ADN: Adición de 50 \mul de
Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y centrifugar la mezcla a la
velocidad máxima durante 1 min. A continuación, se efectúa una
ligación del cADN de CSF-1 en el vector de
transferencia pQBI-AdCMV5BFP, a saber:
El fragmento de CSF-1 purificado
se clona en el vector de transferencia linearizado de la manera
siguiente.
200 ng de vector de transferencia de ADN
100 ng de cADN de CSF-1
1 \mul de T4 ligasa de ADN (1 unidad Weiss)
1,5 \mul de T4 ligasa de ADN tampón 10x
Rellenar con agua libre de nucleasa a 15 \mul e
incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 6
horas.
La transformación subsiguiente de bacterias por
electroporación se consigue de la manera siguiente:
100 \mul de E. coli electrocompetentes se
mezclan con la mitad en volumen de la preparación de ligación (7,5
\mul) en placas con enfriamiento por hielo, y la electroporación
se lleva a cabo a 25 \muF, 2,5 kV, 200 \Omega. Para regenerar
las células, se adiciona 1 ml de un medio SOC, se trasladan las
células a un tubo de ensayo y se incuban a 37ºC durante 1 hora,
luego se colocan en placas de selección que contienen ampicilina y
se cultivan colonias a 37ºC durante la noche.
A continuación, el plásmido se aísla de la manera
siguiente:
Una colonia individual se retira de la placa de
selección y se incuba en 3 ml de LB con ampicilina a 37ºC durante 8
horas con agitación vigorosa, el cultivo inicial se diluye 1/500 en
100 ml de un medio LB, y se deja crecer a 37ºC durante 12 horas con
agitación vigorosa. Las bacterias se cosechan por centrifugación a
6000 g y 4ºC durante 15 min, el pellet de bacterias se disuelve en
10 ml de un tampón P1, se adicionan 10 ml de un tampón P2, se mezcla
cuidadosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. A
continuación, se adicionan 10 ml de un tampón P3 enfriado con
hielo, se mezcla inmediatamente cuidadosamente y se incuba sobre
hielo durante 20 min, y se centrifuga a 20.000 g y 4ºC durante 30
min. La solución sobrenadante se centrifuga otra vez a 20.000 y 4ºC
durante 15 min y la solución sobrenadante se traslada a una columna
QIAGEN 500 equilibrada con 10 ml de un tampón QBT. La columna se
lava con 2x30 ml de un tampón QC, el ADN se eluye con 15 ml de un
tampón QF y se precipita por adición de 10,5 ml de isopropanol
(temperatura ambiente) al ADN eluido. Tras el mezclado y la
centrifugación inmediata a 15.000 g y 4ºC durante 30 min, la
solución sobrenadante se elimina, el pellet de ADN se lava con 5 ml
de etanol al 70% (temperatura ambiente), se centrifuga a 15.000 g
durante 10 min, y la solución sobrenadante se elimina. El pellet
resultante se seca al aire durante 5 min, y el ADN se disuelve en
100 \mul de TE, pH 8,0. La concentración de ADN se determina por
espectrofotometría UV a 260 nm. La separación de los fragmentos se
realiza en un gel de agarosa TAE al 1%, y a continuación el vector
de transferencia se extrae del gel de agarosa y se purifica de la
manera siguiente:
El vector linearizado se corta del gel de agarosa
con un bisturí, la pieza de gel se pesa, y se adicionan 3 volúmenes
del tampón QG a 1 volumen de gel, y la mezcla se incuba a 50ºC
durante 10 min, agitándose cada 2 minutos y controlándose el color
para ver si es amarillo y a continuación se adiciona un volumen de
gel de isopropanol, mezclado, se introduce una columna QIAquick spin
en un recipiente de reacción de 2 ml, se aplica la muestra a la
columna y se centrifuga durante 1 min. Se introduce la columna en
un recipiente de reacción nuevo. Se lava el producto por aplicación
de 0,75 ml de un tampón PE a la columna y centrifugación durante 1
min. A continuación, eliminación del líquido de lavado y
centrifugación de la columna a 10.000 g durante 1 min. Elución del
ADN: Adición de 50 \mul de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5 y
centrifugación de la mezcla a la velocidad máxima durante 1 min.
Rendimiento: aproximadamente 48 \mul.
A continuación, se realiza la cotransfección del
vector de transferencia recombinante linearizado
(pAdCMV5-CSF-BFP) con el ADN viral
(Ad5CMV1acZE1/E3) en 293 células por medio del método de fosfato
cálcico de la manera siguiente:
Adición de 0,005 volumen de 2 mg/ml de ADN
portador a 1xHEBS, mezclado por agitación durante 1 min,
introducción de alícuotas de 2 ml de HEBS más ADN portador en un
recipiente de reacción estéril, claro de plástico, adición de 20
\mug del vector de transferencia recombinante, linearizado
(pAdCMV5-CSF-BFP), adición de 20
\mug del ADN viral a dicho recipiente de reacción, agitar la
mezcla cuidadosamente, luego adicionar lentamente 0,1 ml de
CaCl_{2} 2,5 M, mezclar cuidadosamente e incubar a temperatura
ambiente durante 25 min. Adición de 0,5 ml de suspensión de ADN a
una placa de 60 mm con 293 células, sin quitar el medio de
crecimiento, incubar a 37ºC durante 5 horas en un incubador de
CO_{2}, quitar el medio y adicionar 10 ml de agarosa MEMF11
(equilibrada anteriormente a 44ºC). Tras la solidificación de la
agarosa, incubación a 37ºC. Tras 5-14 días,
aparecerán plaquetas. Para el ``screening'' del adenovirus ``Plaque
Isolate'', se aíslan las plaquetas del cultivo transfectado por
corte con una pipeta de Pasteur estéril y se trasladan a
recipientes de reacción que contienen 0,5 ml de PBS estéril más
glicerol al 10%. Almacenar a -70ºC hasta ser utilizado. A
continuación, quitar el medio de las 293 células confluentes al 80%
en placas de 60 mm y adición de 0,2 ml de virus (suspensión de
agar). Absorción a temperatura ambiente durante 30 min. Adición de
MEMF11 completo y suero de caballo al 5% e incubación a 37ºC.
Cosecha de virus y extracción del ADN celular infectado cuando la
mayoría de las células se hayan separado. Retirar 4 ml de medio
cuidadosamente con una pipeta e introducir en un recipiente de
reacción que contiene 0,5 ml de glicerol estéril. Estos candidatos
de virus se almacenan a -70ºC. Quitar el medio restante de la
placa. Para la extracción del ADN de las células infectadas, adición
de 0,5 ml de solución de pronasa e incubación a 37ºC durante 10
horas. Traslado del lisado a un recipiente de reacción de 1,5 ml y
extraer una vez con fenol saturado con tampón, centrifugar durante
10 min, recoger la fase acuosa superior y traslado a un recipiente
nuevo, adición de 1 ml de etanol, con el fin de precipitar el ADN.
Mezclar cuidadosamente, centrifugar a 14.000 rpm durante 10 min,
eliminación de la solución sobrenadante por succión, lavado del
pellet con etanol al 70%, centrifugar durante 5 min, eliminar el
sobrenadante por succión y dejar que el pellet se seque al aire.
Disolver el ADN en 50 \mul de 0,1 x SSC y llevar a cabo un corte
de restricción con 5 \mul utilizando HindIII (1 unidad durante la
noche). Aplicación de la muestra digerida a un gel de agarosa al 1%
con bromuro de etidio. Las bandas de ADN viral son claramente
visibles bajo luz UV por encima de la suciedad de fondo de ADN
celular. Verificación de candidatos para virus recombinantes por
medio de otros cortes de restricción de enzima diagnósticos así
como por control de la expresión de BFP (Blue Fluorescent Protein)
bajo el microscopio fluorescente. Los recombinantes correctos se
purifican adicionalmente por medio de 2 ciclos más de purificación
de plaquetas y se someten a un ``screening'' antes de preparar una
preparación madre de alta titulación.
A continuación, a fines de purificación y
titulación de adenovirus recombinantes
(AD5CMV-CSF), se realizan ensayos de plaquetas de la
manera siguiente.
Eliminación por succión del medio de las 293
células confluentes en placas de 60 mm. Adición de 0,2 ml de virus
(diluciones de 10^{-3} a 10^{-6} de una suspensión de agar en
PBS para la purificación de plaquetas o diluciones de 10^{-3} a
10^{-9} de la solución madre para la titulación). Absorción del
virus a temperatura ambiente durante 40 min. Adición de 10 ml de
MEMF11-Agarosa- Overlay, enfriamiento e incubación a
37ºC. Las plaquetas se cuentan tras 7 y tras 14 días para la
titulación. Purificación de plaquetas: aislamiento de las plaquetas
tal como se ha descrito anteriormente.
Finalmente, se preparan soluciones virales madre
de alta titulación de células monocapa de la manera siguiente:
En diez placas de 150 mm se preparan cultivos con
293 células y se infectan al alcanzarse una confluencia del 80%. A
continuación, al objeto de preparar una solución madre de alta
titulación, el medio se elimina de las 293 células, y las células
se infectan con una ``multiplicity of infection'' (MOI) de
1-10 PFU por célula (1 ml de suspensión de virus
por placa de 150 mm), los virus se absorben durante 40 min, y a
continuación adición de MEMF11 + 5% de suero de caballo, incubación
a 37ºC y control diario por signos del efecto citopático. Cuando el
efecto citopático es casi completo, se realiza la cosecha rascando
las células de la placa, se unen las células junto con el medio y
se centrifuga la mezcla a 800 g durante 15 min. Eliminación del
medio por succión y resuspensión del pellet de células en 2 ml de
PBS + 10% de glicerol por placa de 150 mm. La purificación
posterior de la solución de virus se realiza por centrifugación con
un gradiente de densidad de CsCl, seguido de diálisis contra
Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. Adición de glicerol estéril
para dar una concentración final del 10% y almacenaje a -70ºC.
De esta manera, se obtienen constructos de
antisentido de CSF-1 infecciosos adenovirales
recombinantes de alta titulación que pueden utilizarse directamente
para la terapia genética.
- Células del carcinoma ``Lewis Lung''
- Células del carcinoma del intestino grueso
- Células del carcinoma de mama
- Células de tumor germinales
A monocapas de células en placas de 60 mm con una
confluencia del 80% se adicionan 0,5 ml de solución de virus
(AD5CMV-CSF) de diferentes MOI (multiplicities of
infection), y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30
min.
Las infecciones de control se realizaron con:
AD5CMVlacZ E1/E3 (adenovirus sin inserto de CSF), AdenoGFP
(adenovirus con GFP), infección simulada (medio de cultivo).
Adición de 6 ml de medio e incubación de las placas en el incubador
de CO_{2} (37ºC, CO_{2} al 5%).
La expresión de gen de CSF-1 en
las células hospedadoras estaba sustancialmente disminuida
(reducción de los niveles del mARN (proteína de
CSF-1) en todas las células transfectadas a <30%
en comparación con las células de tipo salvaje no tratado.
Inhibición de la formación nueva de vasos,
efectos antioncogénicos (crecimiento de células retardado).
Durante el análisis del ciclo de célula se
detectó el inicio de apoptosis.
En la transfección viral (adenovirus) de ratones,
se realizó una administración intratumoral de 1x10^{9} -
5x10^{10} PFU en un volumen de 0,5 ml como máximo.
Una administración intratraqueal se llevó a cabo
administrando hasta 2x10^{9} PFU del virus recombinante en un
volumen de 23-35 \mul, observándose, en
particular en la administración antitumoral, una regresión casi
completa de los tumores.
La síntesis del oligonucleótido específico de
CSF-1,
5'-GCCCGGCGCGGTCA-3' (14- mero,
homólogo de los primeros 14 nucleótidos de la secuencia primaria del
cADN de CSF-1 después del codón de inicio (ATG) de
las pares de bases 120-106), se lleva a cabo en el
sintetizador automático de oligonucleótidos basado en el método
fosforamidita. La síntesis se realiza en la orientación
3'-5' de la secuencia de nucleótidos predeterminada
y, tras finalizar la síntesis, la columna que contiene el
oligonucleótido ligado se lava primero con 3 ml de NH_{3}
concentrado. Esta operación se repite varias veces para asegurar
que la columna está totalmente impregnada con NH_{3}. La columna
se incuba (se lava varias veces) con NH_{3} a temperatura
ambiente durante 2 horas, obteniéndose finalmente una solución que
contiene el oligonucleótido. La solución se calienta en un
recipiente de reacción bien cerrado a 55ºC durante 16 horas. En un
evaporador rotativo, se elimina el NH_{3} (añadiendo 30 \mul de
trietilamina para impedir una destritilación).
La sulfuración se lleva a cabo directamente en la
columna, todavía antes de la etapa de ``capping'', con 240 \mul
de una solución de 1,1-dióxido de
3H-1,2-
benzoditio-3-ona 0,05 M (Pharmacia,
Sigma), llenando a tal fin un matraz de reacción adecuado con una
mezcla de 12 ml de diclorodimetilsilano y 200 ml de diclormetano, y
después de 5 min se quita la solución y el matraz se lava con
metanol. A continuación, el matraz se seca a 110ºC durante la noche
y se enfría en un desecador. 0,5 g (2,5 mmol) del reactivo de
Beaucage se disuelven en 50 ml de acetonitrilo seco y se introducen
en el matraz de reacción. El matraz de reacción se conecta al
oligosintetizador y su contenido se bombea por la columna (2x).
(Columna: C-18 fase unida a
sílice de partículas esféricas (5 \mum, tamaño de poros 300
\ring{A}), adicionalmente nucleosil 100-5
C-18, 100 mm x 4 mm)
El oligonucleótido sin purificar (sedimento
evaporado) se suspende en 300 \mul de un tampón de acetato de
trietilamonio 0,1 M, pH 7.
Un monitor UV se ajusta a un valor de 260 nm y
la velocidad de flujo a un valor de 1 ml/min. Se utiliza un
gradiente de tampón de 0 - 50% de acetato de trietilamonio 0,1 M,
pH 7, en acetonitrilo al 80% durante 50 min. A continuación, el
mismo tampón se aumenta del 50 - 100% durante 5 min. Una pequeña
porción de muestra de 5 \mul de oligonucleótido
(2-5% del total) sin purificar se aplica a la
columna y se registra la absorción a 260 nm.
Se utiliza la misma disposición que en la
síntesis de un oligonucleótido específico de CSF-1,
excepto que la cantidad total de 300 \mul de solución de
oligonucleótidos se aplica a la columna, la absorción se vigila a
260 nm, las partes centrales de los picos eluidos se recogen, las
muestras unidas se sedimentan en un evaporador rotativo, se
adiciona 1 ml de ácido acético al 80% a las muestras evaporadas
hasta la sequedad, la mezcla resultante se incuba a temperatura
ambiente durante 1 hora y las muestras se vuelven a sedimentar en
un evaporador rotativo. El pellet se disuelve en 1 ml de H_{2}O
dest./estér., la solución se extrae 2 veces con
DMT-OH y 1 vez con acetato de etilo. Las muestras
se evaporan hasta la sequedad en un evaporador rotativo. El
precipitado se disuelve en un volumen determinado de H_{2}O
dest./estér. y se mide la extinción a 260 nm, con el fin de
determinar su cantidad (dilución de 1:100, teniendo en cuenta el
coeficiente de extinción dependiente de la secuencia).
Uso de oligonucleótidos de antisentido de
CSF-1 modificados con fosforotioato.
Los oligonucleótidos de antisentido de
CSF-1 modificados con fosforotioato preparados se
aplican en forma de una sustancia pura hidrosoluble (purificados
por HPLC) y disueltos en PBS de manera diferente. Se investigó la
administración sistemática por medio de inyección intravenosa, la
administración intraarterial, considerándose el vaso específico del
órgano como la arteria preferida de suministro, con el fin de poder
administrar la sustancia tan cerca del destino como sea posible. En
función de la localización del tumor, se investigaron también otras
vías, por ejemplo la administración tópica o intraperitoneal.
Además, pueden servir de depósito colector ``Osmotic Mini Pumps''
(en particular con ratones como animales de prueba), en las que se
introduce el CSF-1 de antisentido y se administra
por implantación subcutánea o intravenosa. La ventaja de dicho
método radica en la administración simple y fiable. Además, las
bombas presentan la ventaja de que una vez implantadas garantizan la
aplicación de tasas constantes durante hasta 4 semanas. La dosis de
los oligonucleótidos de antisentido de CSF-1 se
sitúa en la gama de miligramos. Así, en la terapia antioncogénica
en ratones, se utilizan dosis comprendidas entre 0,1 y 20 mg/kg de
peso corporal/día. Ratas con un peso corporal de 200 a 350 g reciben
cada una administraciones de 100 \mul por vía intravenosa en
concentraciones de 0,1 - 1 \mug/ml. En el sistema humano, es
adecuada una dosificación de 0,05 mg/kg/hora, puesto que con esta
dosificación todavía no se observan efectos tóxicos solamente a
base de la administración de oligonucleótidos modificados. Los
esquemas de tratamiento con los oligonucleótidos de antisentido de
CSF-1 deberían seguirse continuamente durante por
lo menos 2 semanas.
Claims (8)
1. Uso de inhibidores de la actividad
CSF-1 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades tumorales.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el inhibidor de la actividad de
CSF-1 utilizado es un anticuerpo neutralizante
contra CSF-1 o su receptor.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el inhibidor de la actividad de
CSF-1 utilizado es un ácido nucleico de antisentido
contra CSF-1 o su receptor.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, caracterizado porque el medicamento se ha preparado
para la inhibición del crecimiento de tumores sólidos.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 4, caracterizado porque el medicamento se ha preparado
para el retardo de enfermedades de tumores malignos.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 5, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de
CSF-1 utilizado es una célula genéticamente
modificada en la cual la actividad de CSF-1 o de su
receptor está inhibida por medio de la modificación genética, en
particular por medio de deleción de por lo menos partes del gen
para CSF-1 o su receptor.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 6, caracterizado porque el medicamento se ha formulado
para la administración intratumoral.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 7, caracterizado porque el medicamento se ha preparado
para el tratamiento de tumores sólidos, seleccionados del grupo
constituido por tumores germinales, tumores epiteliales y
adenocarcinomas.
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