MXPA02001472A

MXPA02001472A - Metodo para suministrar agentes terapeuticos utilizando una solucion de dextrina.

Info

Publication number: MXPA02001472A
Application number: MXPA02001472A
Authority: MX
Inventors: Susan Conroy
Original assignee: Ml Lab Plc
Priority date: 1999-08-10
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2002-07-02
Also published as: NO20020604D0; IL147500A0; AU779579B2; CA2378708A1; PL353232A1; EP1206284B1; ATE366587T1; NZ516777A; JP2003507345A; NO20020604L; DE60035504D1; WO2001012231A1; AU6456500A; EP1206284A1

Abstract

La invencion descrita en la presente se refiere al suministro de agentes terapeuticos y en particular material genetico, a un animal combinacion con dextrina.

Description

MÉTODO PARA SUMINISTRAR AGENTES TERAPÉUTICOS UTtUZANDO UNA SOLUCIÓN DE DEXTRINA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un tratamiento terapéutico y en particular al suministro de agentes biológicamente activos a un animal, incluyendo un ser humano, por medio de una cavidad corporal del sujeto. Los agentes pueden ser activos en una variedad de formas, por ejemplo, con respecto a la terapia de genes e inmunoterapia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los agentes biológicamente activos pueden introducirse en un animal en una variedad de formas incluyendo entéricamente (oral, rectal, o sublingualmente) o parenteralmente (intravenosamente, subcutáneamente, o mediante inhalación). Esta invención se relaciona con la administración parenteral de agentes biológicamente activos y en particular mediante la introducción de un agente biológicamente activo al animal por medio de una cavidad corporal tal como el peritoneo o la cavidad ocular. Referencia se hará de aquí en adelante al peritoneo pero debe entenderse que la invención se aplica al suministro de agentes biológicamente activos por medio de otras cavidades corporales.

Se sabe que la introducción de ciertas soluciones acuosas en la cavidad peritoneal puede ser útil en el tratamiento de pacientes que sufren de insuficiencia renal. Dicho tratamiento es conocido como diálisis peritoneal. Las soluciones contienen electrolitos similares a aquellos presentes en el plasma; también contienen un agente osmótico, normalmente dextrosa, que está presente en una concentración suficiente para crear un grado deseado de presión osmótica a través de la membrana peritoneal. Bajo la influencia de esta presión osmótica, un intercambio se lleva a cabo a través de la membrana peritoneal y da como resultado una remoción desde la corriente sanguínea de productos de desperdicio, tales como urea, y creatinina, que se han acumulado en la sangre debido a la falta de función normal , del riñon. Aunque este intercambio se lleva a cabo, existe también una transferencia clara de dextrosa desde la solución a la sangre a través de la membrana peritoneal, que provoca que caiga la osmolalidad de la solución. Debido a esto, la osmolalidad inicial de la solución debe elaborarse totalmente elevada (al utilizar una concentración suficientemente elevada de dextrosa) para que la solución continúe efectuando la diálisis durante un tiempo razonable antes de que se retire y reemplace por una solución nueva. Otros agentes osmóticos se han propuesto para utilizarse en diálisis peritoneal y en años recientes se ha utilizado dextrina (un polímero hidrolisado de almidón de glucosa). Cuando se instila en la cavidad peritoneal, la dextrina se absorbe lentamente por medio del sistema linfático, finalmente alcanzado la circulación periférica. La estructura de dextrina es tal que las -JJltoM^.-^ amilasas rompen la molécula en oligosacáridos en la circulación. Estos se despejan por medio de un metabolismo adicional en glucosa. Las soluciones de dextrina se han propuesto como el medio para suministrar fármacos al cuerpo por medio del peritoneo. En GB-A-2207050, dicha solución se propone para la administración intraperitoneal de fármacos para los cuales la administración entérica no es satisfactoria. Dicho enfoque es particularmente útil para el suministro de fármacos de péptido tales como eritropoetina y hormona de crecimiento. También se hace referencia a los antibióticos de cefalosporina. La concentración de dextrina en la solución acuosa se establece preferiblemente de 0.5 a 10% peso/volumen y un ejemplo de una composición para el suministro de eritropoetina tiene una concentración de dextrina de alrededor de 10% peso/volumen. La terapia del gen se relaciona, ¡nter alia, con la transferencia de material genético a las células objetivo específicas de un paciente para evitar o alterar un estado de enfermedad particular. El tratamiento implica el uso de portadores o vehículos de suministro, con frecuencia mencionados como vectores, adaptados para el suministro de material genético terapéutico. Estos vectores generalmente son virales pero los vectores no virales también son conocidos. La terapia de inmunogen implica el uso de genes para inmunoterapia, incluyendo la provisión de vacunas a base de genes. El forro mesotelial de la cavidad peritoneal comprende un forro de células que cubren una superficie amplia. El mesotelio peritoneal tiene un buen drenaje linfático y permite la difusión de macromoléculas. La transferencia del gen mediado por adenovirus al mesotelio peritoneal en la rata se ha demostrado que es posible (Setoguchi et al. Intraperitoneal in vivo Gene Therapy to Deliver al-antitrypsin to the systemic circulation. (American Journal of Respiratory Cellular Molecular Biology, 994; 10:369-377). Típicamente, un medio elegido para introducir materiales de terapia de gen a un paciente por medio de una cavidad corporal puede ser una solución salina regulada en su pH, por ejemplo, una solución salina regulada en su pH de fosfato viral (vPBS). Sin embargo, no se ha probado que sea particularmente efectivo el uso de dicha solución, problemas que surgen con respecto a la estabilidad de la solución, el tiempo de permanencia en la cavidad corporal como también la efectividad de la expresión transgénica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para suministrar un agente terapéutico, diferente a un agente medicinal, a un animal, el método comprende introducir a la cavidad corporal del animal el agente terapéutico y una solución de dextrina. La presente invención por lo tanto se relaciona con los agentes biológicamente activos que se encuentran en la naturaleza de los fármacos tales como aquellos con los cuales se relaciona GB-A-2207050. De preferencia, se relaciona con agentes que actúan indirectamente tales como agentes de terapia de genes y agentes de inmunoterapia. Los últimos :*MA¡áááÉ?M UHkÉáUI* f tiPfJSii ?mM^ m-iá^M ^é??tí ÉL^^-. incluyen, por ejemplo, agentes ¡nmunoterapéuticos que se relacionan con genes de citocina. Agentes con los cuales se relaciona la invención, incluyen genes transportados por o encapsulados dentro de vectores virales y no virales, lípidos catiónicos/liposomas como también construcciones tales como un conjugado de interieucina-2 y un agente biológicamente activo tal como un gen. Los vectores típicamente se adaptan para la expresión del gen transportado por el vector. Típicamente dicha adaptación incluye, por medio de ejemplo y no por medio de limitación, la provisión de secuencias de control de transcripción (secuencias promotoras) que median la expresión específica de célula/tejido. Estas secuencias promotoras pueden ser específicas de células/tejido, inducibles o constitutivas. Promotor es un término reconocido en la técnica y, para claridad, incluye las siguientes características que se proveen por medio de ejemplo únicamente y no por medio de limitación. Los elementos mejoradores son secuencias de ácido nucleico que actúan en cis que con frecuencia se encuentran hacia 5' del sitio de iniciación de transcripción de un gen (los mejoradores también pueden encontrarse hacia 3' de una secuencia de gen o aún localizarse en secuencias intrónicas). Los mejoradores funcionan para incrementar la velocidad de transcripción del gen al cual se une el mejorador. La actividad mejoradora es responsable de los factores de transcripción que actúan en trans (polipéptidos) que han mostrado unirse específicamente a los elementos mejoradores. El enlace/actividad de factores de transcripción (por favor véase Eukaryotic Transcription Factors, por David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego) es responsable de un número de indicaciones fisiológicas/ambientales que incluyen, por medio de ejemplo y no por medio de limitación, metabolitos intermediarios (por ejemplo, glucosa, lípidos), efectores ambientales (por ejemplo luz, calor). Los elementos promotores también incluyen la caja TATA así llamada y las secuencias de selección de iniciación de polimerasa de ARN (RIS) que funcionan para seleccionar un sitio de iniciación de transcripción. Estas secuencias también unen polipéptidos que funcionan, inter alia, para facilitar la selección de iniciación de transcripción por medio de la polimerasa de ARN. Las adaptaciones también incluyen la provisión de marcadores seleccionables y secuencias de réplica autónomas que facilitan el mantenimiento de dicho vector ya sea en células eucarióticas u hospedero procariótico. Los vectores que se mantienen autónomamente se mencionan como vectores episomales. Los vectores episomales se desean ya que sus moléculas pueden incorporan grandes fragmentos de ADN (ADN 30-50kb). Los vectores episomales de este tipo se describen en WO98/07876. Las adaptaciones que facilitan la expresión de los genes que codifican al vector incluyen la provisión de secuencias de poliadenilación/terminación de transcripción. Estas también incluyen la provisión de sitios de entrada de ribosoma internos (I RES) que funcionan para aumentar al máximo la expresión de los genes codificados por el vector dispuesto en casetes de expresión bicistrónica o multi-cistrónica. Las secuencias de control de expresión también incluyen las regiones de control de locus así llamadas (LCR). Estos son elementos regulatorios que confieren expresión dependiente del número de copias, independiente de la posición a genes enlazados cuando se analizan como construcciones transgénicas en ratones. LCR incluyen elementos regulatorios que aislan los transgenes de los efectos silenciosos de la heterocromatina adyacente, Grosveld et al., Cell (1987), 51 :975-985. Las secuencias de control de expresión también abarcan, elementos de apertura de cromatina ubicuas (UCOE), véase WO/GB00/05393. UCOE son elementos de ácido nucleico que son responsables de establecer una estructura de cromatina abierta a través de un locus que consiste exclusivamente en genes de mantenimiento expresados ubicuamente. Estos elementos no se derivan de una LCR. Un UCOE es un poiinucleótido que abre la cromatina o mantiene la cromatina en un estado abierto y facilita la expresión reproductible de un gen enlazado operablemente en células de al menos dos tipos diferentes de tejido. Estas adaptaciones son bien conocidas en la técnica. Existe una cantidad importante de literatura publicada con relación a la construcción del vector de expresión y técnicas de ADN recombinante en general. Por favor véase Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory, NY y referencia de las mismas; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol lll IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Los vectores típicamente se basan viralmente e incluyen por medio de ejemplo y no por medio de limitación lo siguiente: adenovirus; retrovirus; virus adeno-asociado; herpesvirus; lentivirus; vaccinia virus; baculovirus. Los vectores también pueden ser vectores no virales y se encuentran disponibles a partir de un número de fuentes comerciales ya disponibles para los expertos en la técnica. La invención también abarca las secuencias de nucleótidos antisentido, que incluyen oligonucieótidos antisentido. Como se utiliza en la presente el término "oligonucleótido antisentido" o "antisentido" describe un oligonucleótido que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido, oligorribonucleótido modificado, u oligodesoxirribonucleótido modificado que se hibrida bajo condiciones fisiológicas al ADN que comprende un gen particular o a un transcripto de ARNm de ese gen y por lo tanto, inhibe la transcripción del gen y/o la traducción de ese ARNm. Las moléculas antisentido se diseñan para interferir con la transcripción o traducción de un gen objetivo al momento de la hibridación con el gen objetivo. Los expertos en la técnica reconocerán que la longitud exacta del oligonucleótido antisentido y su grado de complementariedad con su objetivo dependerá del objetivo específico seleccionado, incluyendo la secuencia del objetivo y las bases particulares que comprenden esa secuencia. Se prefiere que el oligonucleótido antisentido se construya y disponga para unirse selectivamente con el objetivo bajo condiciones fisiológicas, es decir, para hibridarse sustancialmente más a la secuencia objetivo que a cualquier otra secuencia en la célula objetivo bajo condiciones fisiológicas. Para ser suficientemente selectivo y potente para la inhibición, dichos oligonucleótidos antisentido deben comprender al menos 7 (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996) y más preferiblemente, al menos 15 bases consecutivas que son complementarias al objetivo. Más preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido comprenden una secuencia complementaria de 20-30 bases. Aunque los oligonucleótidos pueden elegirse, los cuales son antisentido a cualquier región del gen o transcriptos de ARNm, en modalidades preferidas los oligonucleótidos antisentido corresponden a la N- terminal o sitios hacia el extremo 5' tal como la iniciación de la traducción, iniciación de la transcripción o sitios promotores. Además, las regiones sin traducir hacia el extremo 3' pueden ser dirigidas. Las regiones sin traducir hacia el extremo 3' son conocidas por contener secuencias que actúan en cis que actúan como sitios de enlace para proteínas implicadas en estabilizar moléculas de ARNm. Estos sitios que actúan en cis con frecuencia forman estructuras de horquilla que funcionan para enlazar dichas proteínas de estabilización. Un ejemplo bien conocido de esta forma de regulación de estabilidad se muestra mediante el ARNm de histona cuya abundancia se controla, al menos parcialmente, post-transcripcionalmente. El término "oligonucleótidos antisentidos" se construye como materiales fabricados ya sea in vitro utilizando métodos de sintetización de oligonucleótidos convencionales que son bien conocidos en la técnica u oligonucleótidos sintetizados recombinantemente utilizando construcciones de vector de expresión. El oligonucleótido modificado se construye de la siguiente forma. El término "oligonucleótido modificado" como se utiliza en la presente describe un oligonucleótido en el cual: i) al menos dos de sus nucleótidos se enlazan covalentemente por medio de un enlace de internucleósido sintético (es decir, un enlace diferente a un enlace de fosfodiéster entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido). Alternativamente o preferiblemente dicho enlace puede encontrarse en el extremo 5' de un nucleótido enlazado al extremo 5' de otro nucleótido o el extremo 3' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido; y/o ¡i) un grupo químico normalmente no relacionado con ácidos nucleicos se ha unido covalentemente al oligonucleótido u oligorribonucleótido. Los enlaces de internucleósido sintético preferidos son fósforotionatos, alquilfosfonatos, fósforoditioatos, esteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fósforoamidatos, carbamatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, péptidos, y esteres de carboximetilo.

El término "oligonucleótido modificado" también abarca los oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificada covalentemente. Por ejemplo, los oligonucleótidos modificados ¡ncluyen oligonucleótidos que tienen azucares de estructura de base que se unen covalentemente a los grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes a un grupo hidroxilo en la posición del extremo 3' diferente al grupo fosfato en la posición del extremo 5'. De este modo los oligonucleótidos modificados pueden incluir un grupo de ribosa 2'-0-alquilada. Además, los oligonucleótidos modificados pueden incluir azucares tales como arabinosa en lugar de ribosa. Los oligonucleótidos modificados también pueden incluir análogos base tales como bases modificadas con C-5 propina (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840- 844, 1996). La presente invención, de este modo, contempla las preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas antisentido naturales y/o modificadas que son complementarias con y se hibridan con, bajo condiciones fisiológicas, proteínas que codifican ácidos nucleicos la regulación de resultados en efectos terapéuticos benéficos, junto con portadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, polímeros, liposomas/lípidos catiónicos). Los oligonucleótidos antisentido pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede incluir los oligonucleótidos antisentido en combinación con cualquier portador fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable estándares que son conocidos en la técnica (por ejemplo, liposomas). Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente efectiva de los oligonucleótidos antisentido para la administración a un paciente. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. El término " fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido, u organismo. Además, los vectores de terapia del gen y/u oligonucleótidos antisentido típicamente se combinan con portadores, por ejemplo polímeros, liposomas/lípidos catiónicos. El uso de lípidos catiónicos (por ejemplo, liposomas, Felgner (1987) Proc.Natl.Acad.Sci E.U.A, 84:p7413) se ha vuelto un método común para introducir ADN en células. El cabezal catiónico del lípido se asocia con la estructura base de ácido nucleico cargada negativamente del ADN que se va a introducir. El complejo de ADN/lípido se relaciona con la membrana celular y se fusiona con la célula para introducir el ADN relacionado en la célula. La transferencia de ADN mediado con liposomas tiene muchas ventajas sobre los métodos existentes. Por ejemplo, las células que son recalcitrantes a los métodos químicos tradicionales se transfectan más fácilmente utilizando la transferencia mediada con liposoma. Alternativamente, los agentes de transfección a base de péptidos se encuentran disponibles, véase WO96/41606.

Los liposomas son vesículas a base de lípidos que encapsulan un agente terapéutico seleccionado que posteriormente se introduce en un paciente. El liposoma se fabrica ya sea a partir de fosfolípidos puros o una mezcla de fosfolípido y fosfoglicéridos. Típicamente los liposomas pueden fabricarse son diámetros menores a 200 nm, esto les permite pasar a través del lecho capilar pulmonar. Además, la naturaleza bioquímica de los liposomas se confiere permeabilidad a través de las membranas de los vasos sanguíneos para ganar acceso a los tejidos seleccionados. Los liposomas tienen una vida media relativamente corta. Se han desarrollado los liposmas STEALTHR así llamados, los cuales comprenden liposomas revestidos en polietilenglicol (PEG): Los liposomas tratados con PEG han incrementado significativamente su vida media cuando se administran a un paciente. Además los liposmas STEALTHR muestran un consumo reducido en el sistema retículo-endotelial y una acumulación mejorada de tejidos seleccionados. Los inmuno-liposomas así llamados también se han desarrollado los cuales combinan vesículas a base de lípidos con un anticuerpo o anticuerpos, para incrementar la especificidad del suministro del vector a una célula/tejido seleccionado. El uso de liposomas como medios de suministro se describe en E.U.A. 5580575 y E.U.A. 5542935. El término "dextrina" significa un polímero de glucosa que se produce mediante la hidrólisis de almidón y que consiste en unidades de glucosa unidas por medio principalmente de enlaces a-1 ,4. Las dextrinas - L*^***t.***.~*.* típicamente se producen mediante la hidrólisis de almidón obtenido de varios productos naturales tales como trigo, arroz, maíz y tapioca. Además de los enlaces a-1 ,4, puede haber una proporción de enlaces a-1 ,6 en una dextrina particular, la cantidad dependiendo del material de partida de almidón. Ya que 5 la velocidad de biodegradabilidad de los enlaces a-1 ,6 típicamente es menor a la de los enlaces a-1 ,4, para muchas aplicaciones se prefiere que el porcentaje de enlaces a-1 ,6 sea menor al 10% y preferiblemente menor al 5%. Cualquier dextrina es una mezcla de moléculas de poliglucosa de diferentes longitudes de cadena. Como resultado, ningún solo número 10 puede caracterizar adecuadamente el peso molecular de dicho polímero. Asimismo se han utilizado varios promedios, el más común siendo el peso molecular promedio en peso (Mw) y el peso molecular promedio en número (Mn). Mw es particularmente sensible a cambios en el contenido de pesos moleculares elevado del polímero mientras que Mn se ve influenciado en gran 15 medida por cambios en el peso molecular inferior del polímero. Se prefiere que el Mw de la dextrina se encuentre en la escala de alrededor de 1 ,000 a 200,000 más preferiblemente de 2,000 a 55,000. El término "grado de polimerización" (DP, por sus siglas en inglés) también puede utilizarse con respecto a las mezclas de polímero. Para 20 una sola molécula de polímero, DP significa el número de unidades de polímero. Para una mezcla de moléculas de diferente DP, el DP promedio en peso y el DP promedio en número corresponde a Mw y Mn. Además, DP también puede utilizarse para caracterizar un polímero al mencionarlo como la mezcla de polímero que tiene un cierto porcentaje de polímeros de DP mayor a un número particular o menor a un número particular. Se prefiere que, en la presente invención, la dextrina contenga más de 15% de polímeros de DP mayor a 12 y, más preferiblemente, más de 50% de polímeros de DP mayor a 12. Preferiblemente, la dextrina está presente en la solución en una cantidad menor a 10%. Preferiblemente, la dextrina está presente en la solución en una cantidad seleccionada a partir de: 1% (p/v); 2% (p/v); 3% (p/v); 4% (p/v); 5% (p/v); 6% (p/v); 7% (p/v); 8% (p/v); 9% (p/v); 10% (p/v). Más preferiblemente la dextrina está presente de 2 a 5% en peso, más preferiblemente de alrededor de 4% en peso. La presente invención también provee una composición adecuada para suministrar un agente terapéutico, diferente a un agente medicinal, a un animal, la composición comprende una solución acuosa o suspensión del agente terapéutico y dextrina. Preferiblemente, la solución de dextrina al 4% se utiliza como un vehículo de suministro debido a su gran tiempo de residencia IP en el hombre. Además, la presente invención provee el uso de una composición de la invención para suministrar un agente terapéutico, diferente a un agente medicinal, a células objetivo en un animal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la invención se describirá ahora por medio de ejemplo únicamente y con relación a las siguientes figuras: La figura 1 es una gráfica de estabilidad viral con el tiempo durante el almacenamiento a 4°C para una solución de rAAV/dextrina (^) y muestras de rAAV/solución salina ( ); la figura 2 es una gráfica de estabilidad viral con el tiempo durante el almacenamiento a 37°C para una solución de rAAV/dextrina (^) y muestras de rAAV/salina ( ); la figura 3 es una gráfica para mostrar la influencia de congelamiento-descongelamiento repetido en estabilidad viral y la figura 4 ilustra el efecto de la dextrina en transfecciones de células COS mediante el vector a base de AD5.CMV-Lac z; la figura 4a muestra el efecto de la dextrina en la viabilidad de las células al medir la proteína total correlacionada con la multiplicidad de infección (MOI); la figura 4b muestra el efecto de la dextrina ( ) en actividad ß-galactosidasa correlacionada con el incremento de MOI en comparación con PBS ( ).

Materiales v métodos Dos construcciones reporteras se utilizaron para monitorear el efecto de dextrina en la eficiencia de transfección. El gen reportero de proteína verde fluorescente (GFP) se utilizó en un vector de virus adeno- «t g5 A asociado (AAV) localizado en una solución de icodextrina. Alternativamente, ei reportero LacZ se utilizó para monitorear la eficiencia de transfección. La expresión del transgen en células normales en la pared peritoneal se demostró en concentraciones del vector de alrededor de 1 x 108 a 1x 1010 PN/ml.

EJEMPLO 1 (i) Transfección de las células de cultivo de tejido con rAAV que 10 codifica un gen reportero de proteína verde fluorescente (GFP). Las células BHK confluentes al 80% en placas de cultivo de tejido de 10 cm se transfectaron con un total de 30 µg de ADN plásmido por placa utilizando complejos de lipofectina/péptido 6/ADN. La relación del plásmido de vector rAAV (que codifica GFP) al plásmido de empaquetamiento 15 (que codifica replicación necesaria y señales de empaquetamiento) fue de 1 :3. (ii) Infección con Virus auxiliar Después de 5 horas de la transfección las células se infectaron a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 con un virus auxiliar de herpes en un 20 medio completo. * (iii) Cosecha Aproximadamente 42 horas después de la infección, las células se cosecharon al rasparlas, dando forma de pellas al girar a 3500 rpm durante 10 minutos y se volvieron a suspender en 10 ml de regulador de pH (NaC1 140 5 mM, KCl 5 mM, K2HP04 0.7 mM, TrisHCI-pH 7.4 25 mM). La solución se ablandó en frío cuatro veces entre un baño de hielo seco/etanol y un baño de agua a 37°C para lisar las células. El lisado se clarificó entonces del desecho celular mediante la centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos. 10 (iv) Purificación por gradiente de densidad de CsCl de rAAV 1 ) El lisado clarificado se ajustó a 1.4g/ml mediante la adición de cloruro de cesio y se distribuyó en un tubo de centrifugado Beckman Ultra- Clear. m ^ 2) El producto entonces se hiló mediante un rotor Beckman 15 Ultracentrifuge, SW41TÍ a 40000 rpm y 20°C durante 20-24horas (posición de paro). 3) La región media del tubo se recolectó mediante la punción lateral. 4) La densidad se volvió a ajustar y el producto se transfirió, 20 entonces se centrifugó como se mencionó anteriormente. 5) 3 fracciones (más o menos 2 milímetros cada una) se recolectaron a través del gradiente mediante la punción lateral con una aguja y dejando la solución caer gota a gota en un contenedor estéril. •tf v) Diálisis de fra^giones contra icodextrina o solución salina Cada fracción se dividió en dos porciones iguales y se dializaron a 4°C contra cinco cambios de dextrina o solución salina respectivamente (2 litros en cada cambio) utilizando cassettes de diálisis (Slide A-Lyzer Dialysis 5 Cassettes, 10000 MW cut-off). vi) Fracciones de prueba para rAAV Las células Hela subconfluentes en placas de 96 cavidades se infectaron con 5 µl de cada fracción diluida en un medio completo y se añadió 10 adenovirus tipo silvestre (wt Ad) para facilitar la infección. Después de 24 horas las células se tamizaron para la expresión GFP utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. La fracción que contiene la mayor parte de rAAV se determinó y utilizó para los siguientes experimentos. La fracción que contiene la mayor parte de rAAV (en dextrina y 15 solución salina) se separó en alícuotas pequeñas. Estas alícuotas se almacenaron a -80°C.

EJEMPLO 1 RESULTADOS 20 1 ) Almacenar a 4°C/37°C a) Muestras de 25 µl (n=1 ) se descongelaron cada día y se almacenaron a 4°C y 37°C respectivamente. Después de 7 días las muestras ßßm*M*táí»-mÉ-m*A?^i^-^mm??é?Á se titularon juntas con una alícuotas no expuestas a estas temperaturas (muestra del día cero). b) El experimento a 37°C se repitió y las muestras (n=3) tanto para la icodextrina como para la solución salina se almacenaron durante 96 y 40 horas. Se titularon juntas con alícuotas no expuestas a esta temperatura. ii) Congelamiento-descongelamiento repetidos Una alícuota de rAAV/dextrina y rAAV/solución salina se ablandó-congeló repetidamente entre hielo seco y baño de agua a 37°C y las muestras a 25 µl (n=3) se tomaron después de 0, 10 y 20 ciclos de congelamiento-descongelamiento. Posteriormente las muestras se titularon.

Titulación 1 ) Las células Hela se sembraron en placas de 96 cavidades (células/cavidades 2x104) antes de los experimentos de titulación para asegurar que las células fueran subconfluentes. 2) Utilizando 10 µl de cada alícuota, se prepararon diluciones en serie diez veces en un medio completo en un volumen total de 1 mililitro; -10 µl de alícuota más 990 µl de medio dieron una disolución 1 :100, -100 µl de esta dilución al 10"12 se transfirieron a un segundo tubo que contiene 900 µl del medio, dando una dilución de 10'3, -100 µl de esta 10"3 se transfirió a un tercer tubo, etc.

* *.*-. .~*M *^ 3^.,-A^. A^si zit» 3) 50 µl de cad ¡dilución se transfirieron a un segundo grupo de tubos de 1.5 mililitros y 2 µl de wt Ad se añadieron antes de mezclar (solución de almacenamiento 5x109 pfu/ml). 4) El medio se tomó de las células y se añadió la mezcla de rAAV/wtAd a las células. 5) Células verdes se contaron después de 24 horas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. 6) El título se calculó de la siguiente manera: 30 células verdes/50 µl en una dilución 10"6 600 células verdes/1000 µl en una dilución 10"6 Título: 600x106/ml = 6x108/ml (Si se nombraron diferentes títulos, éstos provienen de diferentes diluciones) Véase figuras 1 , 2a, 2b y 3. Fue posible congelar-descongelar la solución hasta 20 veces sin efecto en la estabilidad del virus (véase figura 3). A 4°C no existe diferencia en la estabilidad del virus. Sin embargo, a 37°C existe una diferencia en la estabilidad del virus entre la dextrina y la solución salina (figura 2a). Esto se demuestra claramente a partir de los datos de 96 horas (figura 2b). Esta temperatura y escala de tiempo son muy relevantes para la transfección in vivo. Esta diferencia demostró ser estadísticamente significativa (p=0.04). ^.*.**.íi^*^** .?**^*At¿t¿¡¡Émmf...^ *.. ~.'**>?.je .AA-i ta.-k EJEMPLO 2 El vector de adenovirus Ad5-CMV-LacZ se obtuvo a partir de Quantum Biotechnologies Inc. USA. La titulación viral se monitoreó mediante tres métodos diferentes: 1) OD26o: partículas vírales 1x1011/ml ii) TCID50: TCID 1.62 x 1010/ml (TCID50=50% de dosis de infección de cultivo de tejido); ¡ii) Prueba de plaqueta: PFU 3.25 x 109/ml (unidades de formación de plaqueta) Las células COS se cultivaron a una densidad celular de cavidades/células 5 x 105 en una placa de microtitulación de 96 cavidades. Las células se cultivaron bajo condiciones de cultivo de células estándares sin embargo utilizando suero de ternera fetal desnaturalizado caliente. La solución de almacenamiento viral se prepararon en dextrina o PBS a un MOI final de 0, 0.1 , 0.5, 1 , 5, ó 10 en dextrina. La concentración final de dextrina es de 4%.

EJEMPLO 2 RESULTADOS Con relación a la figura 4a, 24 horas después de la adición del vector viral los efectos citopáticos del virus son más marcados en ausencia de la dextrina. La figura 4b muestra que en presencia de dextrina al 4% existe un incremento en la cantidad de ß-galactosidasa producida en comparación con el control de PBS.

Claims

-* NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Una composición que comprende una solución de dextrina y material genético, caracterizada porque la dextrina tiene un peso molecular de alrededor de 1000-200,000. 2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque la dextrina tiene una dextrina de peso molecular 10 de alrededor de 2000-55,000. 3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque dicho material genético es un vector que incorpora al menos una molécula de ácido nucleico terapéutico, o la parte efectiva de la misma. 15 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico terapéutico, es ADN genómico. 5.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico terapéutico, 20 es ADNc. 6.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizada además porque dicho vector es un vector basado en virus. Ú?é ?»áá ?si ?'í'??éh h li^ il-Üf^"'- *—""*-- ?»faA-«i»f-*.-"*i - -fi-?r-¿^^ i 7.- La competición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho vector basado en virus se selecciona a partir del siguiente grupo: adenovirus; virus adeno-asociado; herpesvirus; lentivirus, o baculovirus. 8.- La composición de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 3-7, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico terapéutico, es una molécula de ácido nucleico antisentido. 9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-8, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico terapéutico se combina con al menos un portador y/o excipiente. 10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho portador o excipiente se basa en liposomas. 11.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada además porque dicha dextrina comprende moléculas de glucosa unidas por medio de menos o igual a 10% de enlaces a1-6. 12.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada además porque dicha dextrina comprende moléculas de glucosa unidas por medio de menos o igual a 5% de enlaces de a1-6. 13.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada además porque dicha solución de &£ dextrina consiste en al menos 15% de polímeros con un grado de polimerización igual a o mayor a 12. 14.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada además porque dicha solución de 5 dextrina consiste en al menos 50% de polímeros con un grado de polimerización igual a o mayor a 12. 15.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada además porque dicha solución de dextrina es al menos 10% (p/v) de dextrina. 10 16.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada además porque dicha solución de dextrina es al menos 5% (p/v) de dextrina. 17.- La composición de conformidad con cualquiera de las * reivindicaciones 1-14, caracterizada además porque dicha solución de 15 dextrina es 4% (p/v) de dextrina. 18.- El uso de una solución de dextrina y material genético en donde la dextrina tiene un peso molecular de alrededor de 1000-200,000, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad genética, suministrando simultáneamente, secuencialmente o separadamente dicho 20 medicamento en al menos una cavidad corporal de un animal. 19.- El uso como el que se reclama en reivindicación 18, en donde dicho animal es un humano. "ß* * 4 20.- El uso como el que se reclama en reivindicación 18, en donde dicho cavidad corporal es la cavidad peritoneal. 21.- El uso como el que se reclama en reivindicación 18, en donde dicha cavidad corporal es la cavidad ocular. 22.- El uso de una composición como la que se reclama en una de las reivindicaciones 1-17, para la fabricación de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de enfermedades genéticas. 'íArJ-rtf-if t*--A-i?--«,«-¿ '¿U .^UUÍ,.. **. i Aifeií