JP2003507345A

JP2003507345A - デキストリン溶液を使用した治療薬剤の送達方法

Info

Publication number: JP2003507345A
Application number: JP2001516574A
Authority: JP
Inventors: スーザンコンロイ，; ロバートニコルボイエス，
Original assignee: エムエルラボラトリーズピーエルシー
Priority date: 1999-08-10
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2003-02-25
Also published as: MXPA02001472A; AU779579B2; IL147500A0; EP1206284B1; NO20020604L; NO20020604D0; ATE366587T1; AU6456500A; WO2001012231A1; PL353232A1; NZ516777A; DE60035504D1; EP1206284A1; CA2378708A1

Abstract

(57)【要約】本明細書中に記載された発明は、動物に対する、デキストリンと組み合わせた治療薬剤および特に遺伝物質の送達に関する。本発明はまた、デキストリン溶液および遺伝物質を含有する組成物であって、このデキストリンが１，０００から２００，０００の分子量を有する、組成物に関する。本発明はさらに、処置されるべき哺乳動物の少なくとも１つの体腔内に治療薬剤を送達する方法であって、この体腔内に、治療薬剤の調製物をデキストリン溶液と同時に、連続的に、または別個に導入する工程を包含し、この治療薬剤が遺伝物質であること、およびこのデキストリンが１，０００から２００，０００の分子量を有することに特徴を有する、方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は治療上の処置に関し、そして特にヒトを含めた動物被験体に対するそ
の被験体の体腔を経由した生物学的活性薬剤の送達に関する。薬剤は、様々な様
式で、例えば遺伝子治療および免疫治療に関連して活性であり得る。

【０００２】（発明の背景）生物学的活性薬剤は、経腸的（経口的、直腸的または舌下的）、または非経口
的（静脈内、皮下または吸入による）を含めて様々な方法で動物被験体中に導入
され得る。

【０００３】本発明は、生物学的活性薬剤の非経口投与に関し、特に例えば腹膜あるいは眼
窩などの体腔を経由して動物被験体に生物学的活性薬剤を導入する工程によって
である。本明細書中以下において腹膜に言及するが、本発明は、他の体腔を経由
する生物学的活性薬剤の送達への適用を有すと理解されるべきである。

【０００４】ある水溶性溶液の腹腔への導入工程は、腎不全に苦しむ患者の処置に有益とな
り得ることは公知である。そのような治療は、腹膜透析として公知である。その
溶液は、血漿中にある電解質と類似した電解質を含有している。その溶液はまた
、浸透物質、通常はブドウ糖、も含有している。この浸透物質は、腹膜を横切っ
て所望の程度の浸透圧を作り出すに十分な濃度で存在する。この浸透圧の影響下
、腹膜を横切って交換が行われ、正常な腎臓機能の欠乏により血液に蓄積された
老廃物、例えば尿素およびクレアチニンの血流からの回収が結果として行われる
。この交換が起こっている間、腹膜を横切って溶液から血液へのブドウ糖の純移
転もまた起こり、このことが溶液の浸透圧重量モル濃度低下を引き起こす。この
ため初期の溶液の浸透圧重量モル濃度は相当に高くされなければならない（十分
高い濃度のブドウ糖を使用して）。これはその溶液が、回収され、そして新鮮な
溶液によって交換されざるを得なくなる前に適切な時間透析を生じさせ続けるた
めである。

【０００５】他の浸透物質は腹膜透析使用のため提案されてき、そして近年ではデキストリ
ン（グルコースのデンプン加水分解物ポリマー）が使用されてきた。デキストリ
ンは腹腔内に滴注されると、リンパ系を経由して緩徐に吸収され最終的に末梢循
環に到着する。デキストリンの構造は、循環中にアミラーゼがその分子をオリゴ
糖に破壊するような構造である。オリゴ糖はグルコースへのさらなる代謝によっ
て除去される。

【０００６】デキストリン溶液は腹膜を経由した身体への薬物の送達のための媒体として提
唱されてきた。ＧＢ−Ａ−２２０７０５０において、そのような溶液は、経腸的
投与では十分でない薬物の腹腔内投与のために提案されている。そのようなアプ
ローチはエリスロポエチンおよび成長ホルモンのようなペプチド薬物の送達に特
に有益であると記載されている。セファロスポリン抗体もまた言及される。水溶
液中のデキストリン濃度は、好ましくは０．５から１０％ｗ／ｖであり、そし
てエリスロポエチンの送達のための組成物の例は約１０％ｗ／ｖのデキストリ
ン濃度を有すると記載されている。

【０００７】遺伝子治療はとりわけ、特定の疾患の状態を予防または変化させるため患者の
特定の標的細胞への遺伝物質の伝達に関する。この処置は、治療遺伝物質の送達
に順応し、しばしばベクターと称される、キャリアまたは送達ビヒクルの使用を
包含する。これらのベクターは普通ウィルスであるが、非ウィルスベクターもま
た公知である。免疫遺伝子治療は遺伝子ベースワクチンの提供を含む免疫療法の
ための遺伝子の使用を包含する。

【０００８】腹腔の中皮内層は広い表面を覆う細胞の内層を有する。腹腔中皮は優れたリン
パ系の排膿法を有し、また高分子の拡散を可能にする。ラットの腹腔中皮へのア
デノウイルス媒介遺伝子移入は可能であると示された（Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、
ＩｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｖｉｖｏＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ
ｔｏＤｅｌｉｖｅｒ α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎｔｏｔｈｅｓｙ
ｓｔｅｍｉｃｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａ
ｌｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＣｅｌｌｕｌａｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，９９４；１０：３６９−３７７））。

【０００９】典型的に、遺伝子治療物質を体腔を経由して患者へ導入するため選択された媒
体は、緩衝化生理食塩水溶液、例えばウイルスのリン酸緩衝化生理食塩水（ｖＰ
ＢＳ）であってもよい。しかしながら、そのような溶液の使用は特に効果的であ
るとは、立証されておらず、溶液の安定性、体腔中の滞留時間および導入遺伝子
発現の有効性に関して問題が生じている。

【００１０】（発明の記載）本発明は動物被験体への薬用の薬剤以外の治療薬剤の送達方法を提供する。そ
の方法は、動物被験体の体腔中に治療薬剤およびデキストリン溶液を導入する工
程を包含する。

【００１１】従って、本発明は例えばＧＢ−Ａ−２２０７０５０が関係するような薬物の性
質を有する生物学的活性薬剤には関係しない。むしろ、遺伝子治療薬剤および免
疫治療薬剤のような間接的に作用する薬剤に関係する。後者としては例えば、サ
イトカイン遺伝子に関連する免疫治療薬剤が挙げられる。本発明が関する薬剤と
しては、ウイルス性および非ウイルス性ベクター、リポソーム／カチオン性の脂
質、ならびにインターロイキン−２と遺伝子のような生物学的活性薬剤との結合
体のような構成物によって保有された、または被包された遺伝子が挙げられる。
ベクターは、典型的にベクターによって保有された遺伝子の発現に適合される。

【００１２】典型的に、前記の適合としては、例としてであって制限としてではく、細胞／
組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供が挙げられ
る。これらのプロモーター配列は細胞／組織特異的、誘導的または構成的であり
得る。

【００１３】プロモーターは分野の認識用語であり、明瞭さのため、例としてだけ、そして
制限としてではなく提供される次のような特色を有する。エンハンサーエレメン
トは遺伝子の転写開始部位の５’側にしばしば見られるシス作用核酸配列である
（エンハンサーはまた、遺伝子配列の３’に見出されまたはイントロンの配列中
にさえ位置され得る）。エンハンサーはこのエンハンサーが連結する遺伝子の転
写速度を増加させるため機能する。エンハンサー活性はエンハンサーエレメント
に特異的に結合することが示されたトランス作用転写因子（ポリペプチド）に反
応する。転写因子の結合／活性（ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎＦａｃｔｏｒｓ，ＤａｖｉｄＳＬａｔｃｈｍａｎ，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓＬｔｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏを参照のこと）は例えば中
間代謝産物（例えばグルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば光、熱）が
挙げられるが、それに限定されるわけではない多くの生理的／環境的な合図に反
応する。

【００１４】プロモーターエレメントはまた、転写開始部位を選択するように機能するいわ
ゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む
。これらの配列はまた、特にＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にす
るために機能するポリペプチドに結合する。

【００１５】適合はまた、真核生物細胞または原核生物宿主のいずれかの中の上記ベクター
の維持を容易にする選択マーカーおよび自律的複製配列の提供を包含する。自律
的に維持されたベクターは、エピソームベクターと呼ばれる。エピソームベクタ
ーは大きなＤＮＡフラグメント（３０−５０ｋｂＤＮＡ）を取り込むことがで
きるのでエピソームベクター分子は望ましい。この型のエピソームベクターはＷ
Ｏ９８／０７８７６に記載されている。

【００１６】ベクターにコードされた遺伝子の発現を促進する適合は転写終止／ポリアデニ
ル化配列の提供を包含する。これはまた重シストロン化（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉ
ｃ）または複シストロン化（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現カセット中
に配列されたベクターにコードされた遺伝子の発現を最大にするように機能する
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供も包含する。発現制御配列はまた、
いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）も含む。これらはマウス中でトランスジェ
ニック構築物としてアッセイする際に連結遺伝子に位置非依存性の、コピー数依
存発現を与える調節エレメントである。ＬＣＲは隣接する異質染色質のサイレン
シング効果から導入遺伝子を保護した調節エレメントを有する。Ｇｒｏｓｖｅｌ
ｄら、Ｃｅｌｌ（１９８７），５１：９７５−９８５。

【００１７】発現制御配列はまた、遍在性クロマチン開口エレメント（ＵＣＯＥ）を含む。
ＷＯ／ＧＢ００／０５３９３を参照のこと。ＵＣＯＥは遍在的に発現されるハウ
スキーピング遺伝子から独占的になる遺伝子座を横切ってオープンクロマチン構
造を樹立する原因である核酸エレメントである。これらのエレメントはＬＣＲに
由来しない。ＵＣＯＥは、クロマチンを開口するかまたは開口状態でクロマチン
を維持し、そして少なくとも２つの異なった組織型の細胞中の作動可能に連結さ
れた遺伝子の再現性のある発現を促進するポリヌクレオチドである。

【００１８】これらの適合は当該分野で周知である。一般に発現ベクター構築および組換え
ＤＮＡ技術に関して発表された著しい量の文献が存在する。以下を参照のこと：
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ，
ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ
ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐ
ｒｏａｃｈＶｏｌＩＩＩＩＲＬＰｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＵＫ；
ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＦＭＡｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）。

【００１９】ベクターは典型的にウイルスベースであり、そして以下を含む。例としてアデ
ノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチ
ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスがあるが、これらに制限され
るわけではない。

【００２０】ベクターはまた、非ウイルス性でもあり得、当業者に容易に利用可能な多くの
商業的な供給源から利用可能である。

【００２１】本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオ
チド配列を包含する。

【００２２】本明細書中で使用する場合、用語“アンチセンスオリゴヌクレオチド”または
“アンチセンス”はオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド
、修飾されたオリゴリボヌクレオチドまたは修復されたオリゴデオキシリボヌク
レオチドであるオリゴヌクレオチドを記述し、生理的条件下で特定の遺伝子を有
するＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、その結果そ
の遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチ
ドを記述する。アンチセンス分子は標的遺伝子とのハイブリダイゼーションの際
に標的遺伝子の転写または翻訳を妨げるように設計される。当業者はアンチセン
スオリゴヌクレオチドの正確な長さ、およびその標的との相補性の程度は、標的
の配列およびこの配列を含む特定の塩基を含む選択された特定の標的に依存する
ことを認識する。

【００２３】このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で標的へ選択的に結
合できるように（言いかえれば、生理学的条件下で、標的細胞中の任意の他の配
列へよりも標的配列に実質的によりハイブリダイズするように）構築され、そし
て配列されることが、好ましい。

【００２４】阻害について十分に選択的にかつ強力であるために、そのようなアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、標的に相補的な、少なくとも７（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４０−８４４，１９９６）お
よびより好ましくは少なくとも１５の連続した塩基を含むべきである。もっとも
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが２０から３０塩基の相補的配列
を含む。

【００２５】遺伝子もしくはｍＲＮＡ転写物のどんな領域に対してもアンチセンスなオリゴ
ヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態においてはこのアンチセンス
オリゴヌクレオチドは翻訳開始、転写開始あるいはプロモーター部位のようなＮ
末端もしくは５’上流部位に対応する。加えて、３’非翻訳領域は標的になり得
る。この３’非翻訳領域はシス作動配列を含むことが公知であり、この配列はｍ
ＲＮＡ分子の安定化に関与するタンパク質の結合部位として機能する。これらの
シス作動部位はしばしば前記安定化タンパク質を結合するように機能するヘアル
ープ構造を形成する。安定性調節のこの形態の周知の例は、ヒストンのｍＲＮＡ
により示され、ヒストンのｍＲＮＡのアバンダンスは少なくとも部分的に転写後
に制御される。

【００２６】用語“アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、当該分野で周知である通常のオ
リゴヌクレオチド合成方法を使用してインビトロで生産される物質、あるいは発
現ベクター構築物を使用して組換え的に合成されるオリゴヌクレオチドのいずれ
かとして解釈される。修飾されたオリゴヌクレオチドは以下の様式で解釈される
。

【００２７】本明細書中で使用される場合、用語“修飾オリゴヌクレオチド”は、以下のよ
うなオリゴヌクレオチドのことを記述する；ｉ）少なくともヌクレオチドの２つが合成ヌクレオシド間結合（すなわち、ある
ヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間のリン酸ジエステ
ル結合以外の結合）して共有結合的に連結されるオリゴヌクレオチド。代替的に
または好ましくは、この結合があるヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチド
の５’末端との結合、もしくはあるヌクレオチドの３’末端と別のヌクレオチド
の３’末端との結合であり得る；および／あるいはｉｉ）通常核酸に結合されないある化学基がオリゴヌクレオチドあるいはオリゴ
リボヌクレオチドに共有結合的に結合されたオリゴヌクレオチド。好ましい合成
ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロ
ジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデ
ート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、ペプチドおよび
カルボキシメチルエステルである。

【００２８】用語“修飾オリゴヌクレオチド”はまた、共有結合的に修飾された塩基および
／あるいは糖を持ったオリゴヌクレオチドも含む。例えば、修飾オリゴヌクレオ
チドは３’位置の水酸基以外および５’位置のリン酸基以外で低分子量有機基と
共有結合的に結合した、バックボーン糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する
。このように、修飾オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含
み得る。加えて、修飾オリゴヌクレオチドはリボースの代わりにアラビノースな
どの糖を含み得る。修飾オリゴヌクレオチドはまた、Ｃ−５プロピン修飾塩基な
どの塩基アナログを含み得る（Ｗａｇｎｅｒら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ１４：８４０−８４４，１９９６）。

【００２９】従って、本発明は薬学的調製物を考慮する。その調製物は、天然および／もし
くは修飾アンチセンス分子を、薬学的に受容可能なキャリア（例えばポリマー、
リポソーム／カチオン性脂質）と共に含む。そのアンチセンス分子は、調節が有
益な治療効果を生じるタンパク質をコードする核酸に対して相補的であり、かつ
生理学的条件下でハイブリダイズ可能である。

【００３０】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物の一部として投与され得る
。そのような薬学的組成物は、当該分野で公知の任意の標準的な生理学的および
／あるいは薬学的に受容可能なキャリア（例えばリポソーム）と組み合わせたア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。この組成物は、滅菌され、そして患
者への投与のため治療的に効果のある量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含
むべきである。用語“薬学的に受容可能な”は、活性成分の生物学的活性の有効
性を妨げない無毒性物質を意味する。用語“生理学的に受容可能な”は、生体系
（細胞、細胞培養物、組織もしくは生物体など）に適合性のある無毒性物質をい
う。

【００３１】加えて、遺伝子治療ベクターおよび／もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは典型的にキャリア（例えばポリマー、カチオン性脂質／リポソームなど）と
組み合わされる。

【００３２】カチオン性脂質の使用（例えばリポソーム、Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，８４：ｐ７４１３）は
ＤＮＡを細胞内に導入する通常の方法となっている。脂質のカチオン性ヘッドは
導入されるＤＮＡの負に荷電した核酸骨格に結合する。この脂質／ＤＮＡ複合体
は細胞膜に結合し、そして細胞の中に結合したＤＮＡを導入するため細胞と融合
する。リポソームに媒介されるＤＮＡ移入は既存の方法を超えたいくつかの利点
がある。例えば、従来の化学的方法になじまない細胞は、リポソームに媒介され
る移入を使用することによってより簡単にトランスフェクションされる。

【００３３】代替的には、ペプチドベーストランスフェクション薬剤が有効である。ＷＯ９
６／４１６０６を参照のこと。

【００３４】リポソームは脂質ベースの小包であり、この小包は選択された治療薬剤を被包
し、次いでこの薬剤は患者の中に導入される。このリポソームは純粋リン脂質あ
るいはリン脂質およびホスホグリセリドの混合物のいずれかから生産される。典
型的にリポソームは２００ｎｍ未満の直径で生産され得、これによりリポソーム
が肺毛細管床を通過可能としている。さらに、リポソームのこの生化学性質は、
選択された組織に接近するための、血管膜を横切る透過性を与える。リポソーム
は相対的に短い半減期を有している。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で表面
を覆ったリポソームを含むいわゆるＳＴＥＡＬＴＨ（商標登録）リポソームが開
発された。このＰＥＧ処理されたリポソームは患者に投与した際に有意な半減期
の増加を示す。加えて、ＳＴＥＡＬＴＨ（商標登録）リポソームは細網内皮系へ
の取り込み減少および選択された組織への蓄積増強がみられる。いわゆる免疫リ
ポソームがまた、開発された。このリポソームは選択された細胞／組織へのベク
ター送達の特異性を増加するために、１つの抗体あるいは複数の抗体と脂質ベー
スの小包とを組み合わせる。

【００３５】送達手段としてのリポソームの使用はＵＳ５５８０５７５およびＵＳ５５
４２９３５に記述してある。

【００３６】用語“デキストリン”はグルコースポリマーを意味し、このグルコースポリマ
ーはデンプンの加水分解によって生産され、そしてこのグルコースポリマーは主
にα−１，４結合を用いて結合されているグルコースユニットからなる。典型的
にデキストリンはコムギ、コメ、トウモロコシおよびタピオカなどの様々な自然
産物から得られるデンプンの加水分解によって生産される。α−１，４結合に加
え、特定のデキストリンにはある割合のα−１，６結合があり得、その量はデン
プン開始物質に依存する。α−１，６結合の生分解速度は典型的にα−１，４結
合の生分解速度を下回るため、多くの適用のためにはα−１，６結合の割合は１
０％未満および好ましくは５％未満であることが好ましい。

【００３７】どんなデキストリンも異なる鎖長のポリグルコース分子の混合物である。結果
として、１種類の数値でそのようなポリマーの分子量を十分に特徴付け得ない。
従って、様々な平均が使用され、最も一般的に使用されるのは、重量平均分子量
（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）である。Ｍｗは特にポリマーの高分子量の
ものの含有量の変化に対して感受性があり、一方Ｍｎはポリマーの低分子量中の
ものの変化によって大きく影響する。

【００３８】デキストリンのＭｗが１，０００から２００，０００の範囲内であることが好
ましく、より好ましくは２，０００から５５，０００の範囲内である。

【００３９】用語“重合度”（ＤＰ）もまた、ポリマー混合物に関連して使用され得る。ひ
とつのポリマー分子に対しては、ＤＰはポリマーユニットの数を意味する。ＤＰ
の異なる分子の混合物に対しては、重量平均ＤＰおよび数平均ＤＰがＭｗおよび
Ｍｎに対応する。加えて、ＤＰはまた、特定の数より多いあるいは特定の数より
少ないＤＰの特定の割合のポリマーを持ったポリマー混合物を参照することによ
って、ポリマーを特徴付けるために使用され得る。

【００４０】本発明において、好ましくはデキストリンが１２より大きいＤＰのポリマーを
１５％より多く含み、そしてより好ましくは１２より大きいＤＰのポリマーを５
０％より多く含む。

【００４１】好ましくは、デキストリンは、溶液中に１０％未満の量で存在している。

【００４２】好ましくは、デキストリンが溶液中に以下から選択された量で存在する；１％
（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ
）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、１０
％（ｗ／ｖ）。

【００４３】より好ましくは、デキストリンが２から５重量％存在し、最も好ましくは約４
重量％存在する。

【００４４】本発明はまた、動物被験体への薬用の薬剤以外の治療薬剤の送達に適した組成
物を提供し、この組成物は治療薬剤の水溶液あるいは懸濁液およびデキストリン
を含有する。好ましくは、ヒトでの長いＩＰ居留時間に起因して４％デキストリ
ン溶液が送達ビヒクルとして使用される。

【００４５】さらに、本発明は薬用薬剤以外の治療薬剤を動物被験体中の標的細胞に送達す
るための本発明の組成物の使用を提供する。

【００４６】（発明の詳細な説明）（材料および方法）トランスフェクションの効率に対するデキストリンの影響をモニターするため
２つのレポーター構築物を使用した。イコデキストリン（ｉｃｏｄｅｘｔｒｉｎ
）溶液にあるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）レポーター遺伝子を使用した。あるいはトランスフェクションの効率を
モニターするためＬａｃＺレポーターを使用した。

【００４７】１×１０⁸から１×１０¹⁰ＰＮ／ｍｌのベクター濃度で、腹膜壁にある正常細
胞中での導入遺伝子発現を立証した。

【００４８】（実施例１）（ｉ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子をコードするｒＡＡ
Ｖを用いた組織培養細胞のトランスフェクションリポフェクチン／ペプチド６／ＤＮＡ複合体を使用して１０ｃｍの組織培養シ
ャーレ中の８０％コンフルエントなＢＨＫ細胞をプレートあたり合計３０μｇの
プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ｒＡＡＶベクタープラスミド（ＧＦ
Ｐをコード）とパッケージングプラスミド（必要な複製シグナルおよびパッケー
ジングシグナルをコード）の比は１：３とした。

【００４９】（ｉｉ）ヘルパーウイルスを用いた感染トランスフェクション後５時間の細胞を完全培地中のヘルペスヘルパーウイル
スを使用して３の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。

【００５０】（ｉｉｉ）収穫感染後約４２時間の細胞をかき取ることによって収穫し、３５００ｒｐｍで１
０分間回転させることによってペレット化し、そして緩衝液（１４０ｍＭＮａ
Ｃｌ、５ｍＭＫＣｌ、０．７ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄、２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ−
ｐＨ７．４）１０ｍｌに再懸濁させた。細胞を溶解するためこの溶液をドライ
アイス／エタノール浴と３７℃水浴の間で４回凍結融解した。次いで、３５００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞の残骸からこの溶解液を清澄化した。

【００５１】（ｉｖ）ｒＡＡＶのＣｓＣｌ密度勾配精製１）前記清澄な溶解液に塩化セシウムを加えて１．４ｇ／ｍｌに調整し、ベック
マンウルトラクリア遠心チューブに分配した。２）それからこの産物をＳＷ４１Ｔｉローター、ベックマン超遠心分離機で４０
０００ｒｐｍおよび２０℃で２０から２４時間（“ＯＦＦ”位置を切断）回転し
た。３）側穿刺によってチューブの中間領域を集めた。４）密度を再調整し、そしてこの産物を移動させ、その後上記のように遠心分離
した。５）針を使用した側穿刺によって３画分（各約２ｍｌ）を密度勾配にわたって集
め、そしてこの溶液を滅菌容器に滴下した。

【００５２】（ｖ）イコデキストリンまたは生理食塩水に対する画分の透析各画分を２つの等しい部分に分け、透析カセット（ＳｌｉｄｅＡ−Ｌｙｚｅ
ｒＤｉａｌｙｓｉｓＣａｓｓｅｔｔｅｓ、１００００ＭＷカットオフ）
を使用して、それぞれ５回交換する（各交換２リットル）デキストリンもしくは
生理食塩水に接触させ４℃で透析した。

【００５３】（ｖｉ）ｒＡＡＶのためのアッセイ用画分９６ウェルディッシュ中のサブコンフルエントなＨｅＬａ細胞を、完全培地で
希釈された各画分５μｌで感染させ、感染を促進させるため野生型アデノウイル
ス（ｗｔＡｄ）を加えた。２４時間後、倒立蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現に
ついて細胞をスクリーニングした。最も多くのｒＡＡＶを含む画分を決定し、そ
して以下の実験に使用した。

【００５４】最も多くのｒＡＡＶを含む（デキストリンおよび生理食塩水中）画分を、小さ
なアリコートに分けた。これらのアリコートを−８０℃で保管した。

【００５５】（実施例１結果）ｉ）４℃／３７℃での保存ａ）サンプル２５μｌ（ｎ＝１）を各日解凍し、それぞれ４℃および３７℃で保
管した。７日後、これらの温度に曝されていないアリコート（０日目のサンプル
）と共にサンプルを滴定した。ｂ）３７℃の実験を繰り返し、そしてイコデキストリンおよび生理食塩水の両方
についてサンプル（ｎ＝３）を９６時間および４０時間保管した。これらのサン
プルを、この温度に曝されていないアリコートと共に滴定した。ｉｉ）凍結解凍の繰り返しｒＡＡＶ／デキストリンおよびｒＡＡＶ／生理食塩水のアリコートのうち１つを
、ドライアイスおよび３７℃水浴間で、繰り返し凍結解凍し、そして０、１０お
よび２０凍結解凍サイクル後に、２５μｌのサンプル（ｎ＝３）を取った。次い
でサンプルを滴定した。

【００５６】（滴定）１）細胞がサブコンフルエントであることを確実にするため、滴定実験の前にＨ
ｅＬａ細胞を９６ウェルディッシュに播種（２×１０⁴細胞／ウェル）した。２）各アリコートの１０μｌを使用して、全容量が１ｍｌになるように、完全培
地で１０倍連続希釈溶液を調製した；１０μｌのアリコ−トと９９０μｌの培地で１：１００希釈を与え、この１０^-2希釈溶液１００μｌを９００μｌの培地を含む第２のチューブへ移動
し１０^-3希釈を与え、この１０^-3希釈溶液１００μｌを第３のチューブへ移動し、など。３）各希釈溶液の５０μｌを、１．５ｍｌチューブの第２のセットへ移動し、そ
して混合前にｗｔＡｄ（ストック５×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ）２μｌを加えた。４）細胞から培地を取り除き、そしてその細胞にｒＡＡＶ／ｗｔＡｄ混合物を加
えた。５）２４時間後、倒立蛍光顕微鏡を使用して緑色の細胞を数えた。６）以下のように力価を算出した：３０個の緑色細胞／５０μｌ（１０^-6希釈）６００個の緑色細胞／１０００μｌ（１０^-6希釈）力価：６００×１０⁶／ｍｌ＝６×１０⁸／ｍｌ（異なる力価が記載された場合、それは希釈の違いから起こる。）図１、２ａ、２ｂおよび３を参照のこと。

【００５７】ウイルスの安定性に影響なく、溶液を２０回まで凍結解凍することは、可能で
あった（図３を参照のこと）。

【００５８】４℃では、ウイルスの安定性に違いはない。しかし、３７℃では、デキストリ
ンと生理食塩水との間でウイルスの安定性に違いがある（図２ａ）。これは、９
６時間のデータからはっきりと明らかである（図２ｂ）。この温度および時間範
囲は、インビボでのトランスフェクションに大いに関連する。この違いは、統計
的に有意であることが示された（ｐ＝０．０４）。

【００５９】（実施例２）アデノウイルスベクターＡｄ５．ＣＭＶ−ＬａｃＺを、ＱｕａｎｔｕｍＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．ＵＳＡから得た。ウイルス滴定を、３つ
の異なる方法でモニターする：ｉ）ＯＤ₂₆₀：１×１０¹¹ウイルス性粒子／ｍｌｉｉ）ＴＣＩＤ₅₀：１．６２×１０¹⁰ＴＣＩＤ／ｍｌ（ＴＣＩＤ₅₀＝５０％組織
培養感染量）およびｉｉｉ）プラークアッセイ：３．２５×１０⁹ＰＦＵ／ｍｌ（プラーク形成単位
）。

【００６０】ＣＯＳ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート中で、５×１０⁵細胞／ウ
ェルの細胞密度に培養した。細胞を標準細胞培養条件下で培養したが、熱変性し
たウシ胎仔血清を使用した。ウイルス株を、デキストリン中で最終ＭＯＩがデキ
ストリン中０、０．１、０．５、１、５または１０になるように、デキストリン
またはＰＢＳで調製した。デキストリンの最終濃度は４％である。

【００６１】（実施例２結果）図４ａを参照のこと。ウイルスベクター添加２４時間後、ウイルスの細胞変性
効果は、デキストリンがないときは、よりはっきり示される。図４ｂは、４％デ
キストリンの存在下、ＰＢＳ対照と比較して、生成されるβーガラクトシダーゼ
の量は増加することを示す。

【００６２】本発明の実施形態は、例としてのみ、そして以下の図を参照してここで記載さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｒＡＡＶ／デキストリン（黒菱形）溶液サンプルおよびｒＡＡＶ／生
理食塩水（白四角）サンプルについての４℃での貯蔵中の時間に対してのウイル
スの安定性のグラフである。

【図２】図２は、ｒＡＡＶ／デキストリン（黒菱形）溶液サンプルおよびｒＡＡＶ／生
理食塩水（白四角）サンプルについての３７℃での貯蔵中の時間に対してのウイ
ルスの安定性のグラフである。

【図３】図３は、ウイルス安定性に対する繰り返しの凍結解凍工程の影響を示すグラフ
である。

【図４ａ】図４は、ＡＤ５．ＣＭＶ−ＬａｃｚベースベクターによるＣＯＳ細胞の
トランスフェクションに対するデキストリンの影響を図解する。図４ａは、感染
多重度（ＭＯＩ）に関する総タンパク質を測定することで、細胞生存力に対する
デキストリンの影響を示す。

【図４ｂ】図４は、ＡＤ５．ＣＭＶ−ＬａｃｚベースベクターによるＣＯＳ細胞の
トランスフェクションに対するデキストリンの影響を図解する。図４ｂは、ＰＢ
Ｓ（白四角）と比較して増加したＭＯＩに関するβ−ガラクトシダーゼ活性に対
するデキストリン（黒菱形）の影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０９／４８２，７９４ (32)優先日平成12年１月13日(2000．1．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ボイエス，ロバートニコルイギリス国ダブリュー１アール９エイジェイロンドン，ハノーバースクエア 17，エムエルラボラトリーズピーエルシーＦターム(参考） 4C076 AA19 AA95 BB21 CC26 EE30 FF03 FF34 4C084 AA13 MA05 MA24 MA56 NA10 NA13 4C086 AA01 EA16 MA02 MA05 MA24 MA56 NA10 NA13 4C087 AA10 BC83 MA24 MA56 NA10 NA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デキストリン溶液および遺伝物質を含有する組成物であって
、該デキストリンは１，０００から２００，０００の分子量を有する、組成物。
【請求項２】前記デキストリンが２，０００から５５，０００の分子量を
有するデキストリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】前記遺伝物質が、少なくとも１つの治療核酸分子または該治
療核酸分子の有効部分が組み込まれたベクターである、請求項１または２に記載
の組成物。
【請求項４】前記治療核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項３に記載の
組成物。
【請求項５】前記治療核酸分子がｃＤＮＡである、請求項３に記載の組成
物。
【請求項６】前記ベクターがウイルスベースのベクターである、請求項３
〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】前記ウイルスベースのベクターが以下の群：アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスまたはバキュロウイ
ルスから選択される請求項６に記載の組成物。
【請求項８】前記治療核酸分子がアンチセンス核酸分子である、請求項３
〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】前記治療核酸分子が少なくとも１つのキャリアおよび／また
は賦形剤と組み合わせられた、請求項３〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】前記キャリアまたは賦形剤がリポソームベースである、請
求項９に記載の組成物。
【請求項１１】前記デキストリンが、１０％に等しいかまたは１０％より
少ない、α １−６結合で結合されたグルコース分子を含有する、請求項１〜１
０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】前記デキストリンが、５％に等しいかは５％より少ない、
α １−６結合で結合されたグルコース分子を含有する、請求項１〜１０のいず
れか１項に記載の組成物。
【請求項１３】前記デキストリン溶液が、１２に等しいかまたは１２より
大きい重合度を有するポリマーを少なくとも１５％有する、請求項１〜１２のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】前記デキストリン溶液が、１２に等しいかまたは１２より
大きい重合度を有するポリマーを少なくとも５０％有する、請求項１〜１２のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】前記デキストリン溶液が少なくとも１０％（ｗ／ｖ）デキ
ストリンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】前記デキストリン溶液が少なくとも５％（ｗ／ｖ）デキス
トリンである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】前記デキストリン溶液が４％（ｗ／ｖ）デキストリンであ
ることに特徴を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】動物への遺伝病の処置に使用するための遺伝物質の同時、
連続的または別個の投与のための、医薬品を製造するためのデキストリンの使用
であって、ここで該デキストリンが、１，０００から２００，０００の分子量を
有する、デキストリンの使用。
【請求項１９】前記動物がヒトである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】処置されるべき哺乳動物の少なくとも１つの体腔内に治療
薬剤を送達する方法であって、該体腔内に、治療薬剤の調製物をデキストリン溶
液と同時に、連続的に、または別個に導入する工程を包含し、該治療薬剤が遺伝
物質であること、および該デキストリンが１，０００から２００，０００の分子
量を有することに特徴を有する、方法。
【請求項２１】前記体腔が腹腔である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記体腔が眼窩である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】遺伝病の処置に使用するための医薬品を製造するための請
求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。