ES2237754T3

ES2237754T3 - Mejoras relacionadas con la terapia del cancer.

Info

Publication number: ES2237754T3
Application number: ES94931658T
Authority: ES
Inventors: Thomas Mrc Toxicology Unit Connors; Richard The Institute of Cancer Research KNOX; Roger Phls Ctr. For Applied Microbiology Sherwood
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-04
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2014-11-04
Also published as: WO1995012678A2; WO1995012678A3; EP0725826A1; EP0725826B1; CA2175687C; NZ275147A; ATE287958T1; GB9323008D0; JP3867211B2; DE69434244T2; AU690935B2; CA2175687A1; AU8065794A; US5958682A; DE69434244D1; JPH09505037A

Abstract

EL SISTEMA DE LA INVENCION COMPRENDE: I) UN VECTOR VIRAL QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICA UNA NITRORREDUCTASA, LA NITRORREDUCTASA ES CAPAZ DE CONVERTIR UNA PRODROGA EN UNA DROGA CITOTOXICA; Y II) UNA PRODROGA CAPAZ DE SER CONVERTIDA EN UNA DROGA CITOTOXICA MEDIANTE LA NITRORREDUCTASA CODIFICADA POR EL VECTOR.

Description

Mejoras relacionadas con la terapia del cáncer.

La presente invención se refiere a la terapia génica mediada por virus y a su utilización en el tratamiento de tumores.

Una aproximación terapéutica denominada "terapia enzima-profármaco dirigida por virus" (Virus Directed Enzyme Prodrug Therapy, VDEPT) se ha propuesto como procedimiento para tratar células tumorales en pacientes utilizando profármacos. Las células tumorales se seleccionan como diana con un vector vírico que lleva un gen que codifica una enzima capaz de activar un profármaco. El gen puede regularse transcripcionalmente mediante secuencias promotoras o activadoras de la transcripción específicas. El vector vírico entra en las células tumorales y expresa la enzima, de manera que un profármaco se convierta en un fármaco activo sólo en la vecindad de las células tumorales (Huber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88,8039).

Aunque el sistema VDEPT aumenta las concentraciones de agente antitumoral que pueden entregarse en la localización de un tumor, todavía es necesario mejorar la especificidad y la eficiencia en transporte dirigido de fármacos.

La presente invención estudia dichos problemas mediante la utilización de un vector vírico VDEPT que codifica una nitroreductasa.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un sistema enzima-profármaco dirigido por virus que comprende dos componentes, siendo dichos componentes:

(i): un vector vírico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una nitroreductasa, cuya nitroreductasa es capaz de convertir un profármaco en un fármaco citotóxico; y

(ii): un profármaco capaz de convertirse en un fármaco activo por acción de la nitroreductasa codificada por el vector.

La invención proporciona también un kit que comprende un vector tal y como se ha definido en la presente invención, junto con un profármaco tal y como se ha definido en la presente invención.

Según otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un sistema tal y como se ha definido en la presente invención, o un kit tal y como se ha definido en la presente invención, para su utilización en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o de un cuerpo animal, y en particular para su utilización en un procedimiento para el tratamiento de tumores.

La invención puede utilizarse en un procedimiento para el tratamiento de tumores que comprende administrar a un individuo con un tumor (i) una cantidad efectiva de un vector, tal y como se ha definido en la presente invención, y (ii) una cantidad efectiva de un profármaco capaz de convertirse en un fármaco activo por acción de la nitroreductasa codificada por el vector.

En otra realización, la invención proporciona la utilización de un vector, tal y como se ha definido en la presente invención, para la preparación de un fármaco para la eliminación de un tejido cuando se administra con una cantidad efectiva de un profármaco, tal y como se ha definido en la presente invención.

En otra realización, la invención proporciona un producto que contiene un vector vírico tal y como se ha definido en la presente invención, y un profármaco tal y como se ha definido en la presente invención, como una preparación combinada para su utilización simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de tumores o en la eliminación de tejido.

El vector vírico puede ser cualquier vector adecuado para el transporte dirigido a las células tumorales, como por ejemplo, vectores retrovíricos, adenovíricos o virosomales. Huber et al. Proc., Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88, 8039, describen la utilización de retrovirus amfotróficos para la transformación de células de hepatoma, pecho, colon o piel. Culver et al. (Science (1992) 256; 1550-1552) describen también la utilización de vectores retrovíricos en VDEPT, de la misma manera que Ram et al. (Cancer Research (1993) 53; 83-88). Englehardt et al. (Nature Genetics (1993) 4; 27-34) describen la utilización de vectores basados en adenovirus para el transporte del productor de conductancia transmembrana de la fibrosis cística (CFTR) hacia el interior de las células.

De acuerdo con lo anterior, cualquier vector de ARN o ADN, incluidos los vectores del tipo mencionado más arriba, pueden utilizarse en la preparación de un vector según la invención. Cualquier experto medio en la técnica será capaz de preparar vectores que serán modificados por técnicas de ingeniería genética conocidas per se, como por ejemplo las descritas por Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Preferentemente, el vector vírico de la invención comprende un promotor unido operativamente al gen que codifica la nitroreductasa. El término "unido operativamente" se refiere a un yuxtaposición en la cual el promotor y la secuencia que codifica la enzima están relacionadas de tal manera que permiten que la secuencia codificadora se exprese bajo el control del promotor. Así, pueden existir elementos, como por ejemplo una secuencia no codificadora 5', situados entre el promotor y la secuencia codificadora que no es innata al promotor o a la secuencia codificadora. Dichas secuencias pueden incluirse en el vector si no perjudican el correcto control de la secuencia codificadora por el promotor. Algunos promotores adecuados incluyen los promotores específicos de tejido y tumor, como por ejemplo el promotor de la proteína de la leche, el promotor del gen CEA o el promotor del gen CA-125. Algunos promotores de la proteína de la leche incluyen el promotor LH\beta, preferentemente de oveja, el promotor de la \beta-lactoglobulina (BLG), el promotor de la \alpha-lactalbúmina y el promotor de la proteína acídica del suero.

Aunque se prefiere incluir en el vector una secuencia promotora innata mamífera o humana, pueden incluirse también en el vector secuencias promotoras modificadas que son capaces de hibridizar selectivamente la secuencia promotora mamífera o humana. Una secuencia promotora capaz de hibridizar selectivamente la secuencia promotora humana será generalmente al menos 70%, preferentemente al menos 80 ó 90% y más preferentemente al menos 95% homóloga a la región promotora o fragmento del mismo a lo largo de una región de como mínimo 20, preferentemente como mínimo 30, por ejemplo 40, 60 ó 100 o más nucleótidos contiguos.

En general, un experto medio en la técnica comprenderá que deberán retenerse algunas regiones de promotores para asegurar la especificidad de tejido de la expresión a partir del vector, mientras que otras regiones del promotor podrán modificarse o eliminarse sin pérdida significativa de especificidad.

Para utilizar los vectores en terapia, los vectores se empaquetarán habitualmente en partículas víricas y las partículas se entregarán en la localización del tumor, tal y como se describe por ejemplo en Ram et al (ibid). Las partículas pueden entregarse al tumor mediante cualquier medio adecuado accesible al médico. Por ejemplo, parenteralmente. Preferentemente, las partículas víricas serán capaces de infectar selectivamente las células tumorales. Por "infectar selectivamente" se entiende que las partículas víricas infectarán primariamente las células tumorales y que la proporción ce células no tumorales infectadas es tal que el daño a las células no tumorales por la administración de un profármaco será aceptablemente bajo, dada la naturaleza de la enfermedad que se está tratando. En último término, esto lo determinará el médico.

Una vía adecuada de administración es mediante inyección de las partículas en una solución estéril.

La nitroreductasa del sistema según la invención incluye fragmentos y homólogos de los mismos que retienen la actividad nitroreductasa. Una nitroreductasa según la invención es una enzima capaz de reducir un grupo nitro del correspondiente grupo hidroxilamino en varios compuestos.

El gen que codifica la nitroreductasa comprende preferentemente el oligonucleótido de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, un fragmento del mismo o un oligonucleótido hibridizable al mismo. Un oligonucleótido capaz de hibridizar al oligonucleótido de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento del mismo presentará generalmente como mínimo un 70% de homología, preferentemente como mínimo un 80% ó 90% de homología y más preferentemente como mínimo un 95% de homología con el oligonucleótido de la SEQ ID NO: 1 o fragmento del mismo a lo largo de una región de como mínimo 20 nucleótidos contiguos, preferentemente como mínimo 30 nucleótidos contiguos, por ejemplo 40, 60 ó 100 nucleótidos contiguos. La secuencia del oligonucleótido puede variarse eliminando como mínimo un nucleótido, insertando como mínimo un nucleótido o substituyendo como mínimo un nucleótido en la secuencia.

Los oligonucleótidos pueden ser ARN o ADN. Los fragmentos oligonucleotídicos tendrán típicamente una longitud de como mínimo 10 nucleótidos, por ejemplo como mínimo 20, 30, 40, 60 ó 100 nucleótidos.

La nitroreductasa codificada por el vector es preferentemente una nitroreductasa bacteriana, por ejemplo una nitroreductasa que es una flavoproteína que tiene un peso molecular en el rango de 20 kDa a 60 kDa, que requiere NADH ó NAD(P)H o análogos de los mismos como cofactor y que tiene una Km para NADH o NAD(P)H en el rango de 1 \muM a 100 \muM, tal y como se describe en la solicitud de patente EP-A-540 263. Típicamente, la nitroreductasa es la misma que la de los organismos E. Coli, Salmonella o Clostridia.

Preferentemente, la nitroreductasa del sistema según la invención es una nitroreductasa que tiene la secuencia de la SEQ. ID No: 2, un fragmento de la misma o un homólogo de la misma.

Una nitroreductasa de SEQ. ID No. 2 en forma substancialmente purificada comprenderá generalmente la proteína en una preparación en la cual más de un 90% de la proteína, por ejemplo un 95%, un 98% o un 99% de la proteína en la preparación es la de la SEQ. ID No. 2.

Un homólogo de la SEQ. ID No. 2 presentará generalmente como mínimo un 70% de homología, preferentemente como mínimo un 80% o un 90% de homología y más preferentemente como mínimo un 95% de homología con la proteína de la SEQ. ID No. 2 a lo largo de una región de como mínimo 20 aminoácidos contiguos, preferentemente como mínimo 30 aminoácidos contiguos, por ejemplo 40, 60 ó 100 o más aminoácidos contiguos.

Generalmente, los fragmentos de SEQ. ID No. 2 o sus homólogos tendrán una longitud de como mínimo 10 aminoácidos, preferentemente como mínimo 15 aminoácidos, por ejemplo 20, 25, 30, 40, 50 ó 60 aminoácidos. La secuencia del polipéptido puede variar por deleción, inserción o substitución de como mínimo un aminoácido.

El profármaco que se utilizará conjuntamente con el vector según la invención será un compuesto que puede convertirse en un fármaco citotóxico por acción de la nitroreductasa codificada por el vector. Es de desear que la toxicidad del profármaco para el paciente será como mínimo un orden de magnitud menos tóxico para el paciente que el fármaco activo. Preferentemente, el fármaco citotóxico será varios órdenes de magnitud más tóxico, por ejemplo 2, 3, 4 o más órdenes de magnitud.

Algunos profármacos adecuados incluyen compuestos mostaza nitrogenada y otros compuestos, como por ejemplo los descritos en WO93/08288 o en la solicitud de patente EP-A-540 263. Algunos profármacos preferidos son los compuestos de fórmula general:

1

y

2

donde R^{1} y R^{2} son grupos tales que los compuestos R^{1}NH_{2} y R^{2}OH son compuestos citotóxicos.

Se prefiere que los compuestos R^{1}NH_{2} y R^{2}OH sean compuestos citotóxicos aromáticos y los compuestos R^{1}NH_{2} pueden ser cualquiera de los bien conocidos compuestos mostaza nitrogenada, por ejemplo basados en p-fenilendiamina. Así, el compuesto R^{1}NH_{2} puede ser:

3

o análogos de este compuesto con la estructura general IV

4

donde R' y R'' son H, F o CH_{3}, y particularmente donde

R'= H y R''= CH_{3};

o R'= CH_{3} y R''= H;

o R'= H y R''= F;

o R'= F y R''= H.

Otros tipos de compuestos citotóxicos amínicos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención son compuestos tales como la actinomicina D y la mitomicina C. La estructura de los profármacos derivados de la actinomicina D y de la mitomicina C se muestran más abajo como V y VII, respectivamente.

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

6

De forma similar, pueden formarse derivados p-nitrobenciloxi en el substituyente amino de otras actinomicinas y de otros compuestos citotóxicos del tipo mencionados más arriba.

Además de formar derivados p nitrobenciloxicarbonilo en un grupo amino de un compuesto citotóxico, pueden formarse derivados similares en un grupo hidroxilo, particularmente un grupo hidroxilo fenólico en un compuesto citotóxico. En este punto, se centra la atención en los compuestos mostaza nitrogenada fenólicos y en el compuesto de fórmula VIII:

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Algunos profármacos adecuados incluyen también otros compuestos nitroaromáticos como por ejemplo 5-cloro-2,4-dinitrobenzamida, 3,5-dinitrobenzamida, 3-nitrobenzamida, 4-nitrobenzamida y 5-nitro-2-furfuraldehidosemicarbazona (nitrofurazona).

Algunos profármacos particularmente preferidos son CB 1954 (5-(aziridin-i-il)-2,4-dinitrobenzamida), SN 23862 (5-(bis(2'-cloroetil)amino)-2,4-dinitrobenzamida) y análogos de CB 1954 o SN 23862, como por ejemplo los descritos en WO 93/11099 o por ejemplo descarboxamido CB 1954 (1-aziridin-1-il-2,4-dinitrobenzamida - conocida como CB 1837), N,N-dimetil CB 1954 (N,N-dimetil-(5-aziridin-1-il)-2,4-dinitrobenzamida - conocida como CB 10-107), CB 10-199, CB 10-200, CB 10-201, CB 10-217, CB 10-021 y CB-214.

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Los profármacos que pueden utilizarse en el sistema según la presente invención comprende generalmente un fármaco citotóxico unido a un grupo protector adecuado. Generalmente, el grupo protector puede eliminarse mediante una nitroreductasa tal y como se ha definido en la presente invención o puede convertirse en otro substituyente mediante una nitroreductasa tal y como se ha definido en la presente invención. Alternativamente, el profármaco se convierte directamente en una forma activa por acción de la nitroreductasa. En el caso de CB1954 y sus análogos, la forma activa es una mezcla de los derivados 2- y 4-hidroxilamino. Dichos derivados se forman en proporciones iguales por acción de la nitroreductasa (Knox et al, Biochem. Pharmacol 44: 2297-2301, 1992). En el caso de la 4-hidroxilamina (5-(aziridin-1-il)-4-hidroxilamino-2-nitrobenzamida), ésta puede convertirse en una especie capaz de unirse al ADN y producir entrecruzamientos entre cadenas a través de una reacción directa no enzimática con la acetil coenzima A, la butil y propil coenzima A o la S-acetiltio-colina. Se cree que la especie reactiva con el ADN definitiva de este derivado de CB 1954 es 4-(N-acetoxi)-5-(aziridin-1-il)-2-nitrobenzamida (Knox et al, Biochem. Pharmacol 42: 1691-1697, 1991). En el caso de SN 23862 sólo se produce un único producto por acción de la nitroreductasa y es 2-hidroxilamina. Esta hidroxilamina puede activarse también en forma de un agente entrecruzador de ADN a través de una reacción directa con un tioéster.

Los profármacos del sistema según la invención se preparan convenientemente mediante los procedimientos de síntesis química. Por ejemplo, los compuestos p-nitrobenciloxicarbonilo se preparan convenientemente mediante los procedimientos de síntesis química. Por ejemplo, los compuestos citotóxicos amínicos o hidroxílicos pueden hacerse reaccionar con 4-nitrobencilcloroformato bajo condiciones anhidras en presencia de un aceptor de cloruro de hidrógeno, particularmente una alquilamina como por ejemplo trietilamina. Esta reacción puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico anhidro como por ejemplo cloroformo y el compuesto resultante puede aislarse del disolvente orgánico mediante los procedimientos convencionales como por ejemplo cromatografía.

El profármaco puede incluir cualquier grupo adecuado que pueda eliminarse o modificarse por acción de una nitroreductasa definida en la presente invención, de tal manera que el grupo sea inestable y experimente una "autodegradación", proporcionando el fármaco citotóxico.

Las nitroreductasas según la presente invención son capaces de reducir un grupo nitro en diversas moléculas de substrato y hemos descubierto que las nitroreductasas son particularmente útiles en su capacidad de reducir el grupo nitro de diversos derivados p-nitrobenciloxicarbonilo de compuestos citotóxicos para dar compuestos "autodegradables" que descomponen automáticamente liberando compuestos citotóxicos. Generalmente, la nitroreductasa reduce el grupo nitro del correspondiente grupo hidroxilamino.

El interés de la presente invención reside en el hecho de que los diversos compuestos citotóxicos que contienen substituyentes amino o hidroxilo, particularmente substituyentes amino aromático o hidroxilo aromático, dan lugar a derivados p-nitrobenciloxicarbonilo del grupo amino o hidroxilo que exhiben una citotoxicidad considerablemente menor que el compuesto hidroxilado o amínico original. Así, es posible utilizar los derivados p-nitrobenziloxicarbonilo como profármacos en un sistema del tipo discutido más arriba, donde el profármaco se convierte en un agente antitumoral bajo la influencia de un polipéptido expresado dentro de la célula tumoral.

Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I)

(I)R^{1}-NH-CO.O-CH_{2}-Ph-NO_{2}

donde Ph es un anillo fenílico y R^{1} es un grupo tal que R^{1}-NH_{2} es un compuesto citotóxico; y (II)

(II)R^{2}-O-CO.O-CH_{2}-Ph-NO_{2}

donde Ph es tal y como se ha definido más arriba y R^{2} es un grupo tal que R^{2}-OH es un compuesto citotóxico, pueden utilizarse como profármacos en un sistema VDEP según la invención conjuntamente con una nitroreductasa tal y como se ha definido en la presente invención, incluyendo la nitroreductasa de E. Coli descrita en WO 93/08288. Aunque la presente invención no depende, por su definición, del modo exacto de acción de la nitroreductasa sobre el profármaco, para los compuestos de fórmula I ó II, se cree que el grupo nitro del residuo p-nitrofenil-benciloxi-carbonilo se convierte en el correspondiente grupo hidroxilamino y que el compuesto resultante p-hidroxil-aminobenciloxicarbonilo se degrada automáticamente bajo las condiciones de reacción utilizadas para la reducción enzimática, liberando el compuesto citotóxico y formando alcohol p-hidroxilmainobencílico y dióxido de carbono como subproductos, de acuerdo con el siguiente esquema de reacción:

\hskip4,5cm nitroreductasa

R^{1}-NH-CO.O.CH_{2}-Ph-NO_{2} - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - \rightarrow

R^{1}-NH-CO.O.CH_{2}-Ph-NHOH - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - \rightarrow

R^{1}-NHOH + CO_{2} + HO.CH_{2}-Ph-NH_{2}

(Mauger et al J.Med. Chem. 1994 vol 37. p3452-3458).

Para poderse utilizar en VDEPT, preferentemente todos los tipos de profármacos deben ser capaces de entrar en las células. De acuerdo con lo anterior, deben realizarse modificaciones en el profármaco, por ejemplo para hacer al profármaco más o menos lipofílico.

Para efectuar la reducción del profármaco con la nitroreductasa descrita en la presente invención, es necesario tener un cofactor presente en el sistema de reacción. La nitroreductasa requiere NAD(P)H como cofactor. Dado que NAD(P)H tiene una vida media en suero muy corta, las concentraciones en la corriente sanguínea son muy bajas. De acuerdo con lo anterior, cualquier nitroreductasa producida según el sistema de la invención que se libere en la corriente sanguínea por lisis celular será incapaz de activar cualquier profármaco circulante debido a la ausencia de NAD(P)H. Así, la presencia o ausencia de cofactor permite una mayor selectividad del sistema VDEPT de la invención, de manera que el profármaco se activa sólo dentro de las células.

En VDEPT, el profármaco se administrará habitualmente después de la administración del virus modificado que codifica una nitroreductasa. Típicamente, el virus se administrará al paciente y después se seguirá la incorporación del virus en las células infectadas, por ejemplo mediante la recuperación y análisis de una muestra por biopsia del tejido diana.

El régimen de dosis exacta para VDEPT tendrá que ser determinado por cada médico clínico individual para cada paciente individual, por supuesto, y esto a su vez estará controlado por la naturaleza exacta del profármaco y del agente citotóxico a liberarse a partir del profármaco pero puede proporcionarse alguna orientación general. Una quimioterapia de este tipo normalmente implicará la administración parenteral tanto del profármaco como del virus modificado y la administración intravenosa ha mostrado ser frecuentemente la más práctica.

El vector del sistema según la invención puede administrarse a animales o a humanos a través de cualquier vía apropiada para el estado a tratar, algunas vías adecuadas incluyendo vía oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradermal, intratecal y epidural). Es evidente que la vía preferida puede variar, por ejemplo con el estado del receptor.

Para cada uno de los usos e indicaciones sobre la cantidad requerida de los principios activos individuales, indicados más arriba, dependerá de varios factores, incluyendo la gravedad del estado a tratar y la identidad del receptor y en último término estarán bajo el criterio del médico que lo trate. Sin embargo, en general, para cada uno de dichos usos e indicaciones, una dosis efectiva adecuada estará en el rango de 1 \mug a 10 g por kilogramo de peso corporal del receptor por día, preferentemente en el rango de 0,01 g a 100 mg por kilogramo de peso corporal por día y más preferentemente en el rango de 0,1 mg a 10 mg por kilogramo de peso corporal por día. Si se desea, la dosis puede presentarse como dos, tres, cuatro o más sub-dosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del día. Dichas subdosis pueden administrarse en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, conteniendo de 1 \mug a 1000 mg, preferentemente de 0,01 mg a 100 mg y más preferentemente de 0,1 mg a 10 mg de principio activo por forma de dosificación unitaria.

Aunque es posible administrar los componentes individualmente, es preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas. Dichas formulaciones comprenden como mínimo un principio activo tal y como se ha definido más arriba, junto a uno o más excipientes aceptables de los mismos y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El excipiente (los excipientes) deben ser "aceptables" en el sentido que sean compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos.

Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradermal, intratecal y epidural). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitarias y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Dichos procedimientos incluyen la etapa de asociar el principio activo con el excipiente que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniformemente e íntimamente el principio activo con excipientes líquidos o dividiendo finamente excipientes sólidos o ambos, y entonces, si fuera necesario, dando forma al producto.

Algunas formulaciones adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas como por ejemplo cápsulas, cápsulas selladas o pastillas, cada una de ellas conteniendo una cantidad predeterminada del principio activo; como polvo o granulado; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o como una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo puede presentarse también como píldora gruesa, electuario o pasta.

Una pastilla puede preparase mediante compresión o moldura, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las pastillas comprimidas pueden prepararse comprimiendo el principio activo en una máquina adecuada en forma de libre flujo, por ejemplo como polvo o granulado, opcionalmente mezclado con un aglutinante (por ejemplo povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), un lubricante, un diluyente inerte, un preservativo, un agente antiapelmazante (por ejemplo glicolato de almidón de sodio, povidona entrecruzada, carboximetilcelulosa de sodio entrecruzada), un agente tensoactivo o un agente dispersante. Las pastillas moldeadas pueden prepararse moldeando una mezcla del compuesto en polvo con un diluyente líquido inerte en una máquina adecuada. Las pastillas pueden cubrirse o marcarse opcionalmente y pueden formularse de tal manera que se proporcione una liberación lenta o controlada del principio activo contenido, utilizando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado.

Las formulaciones pueden aplicarse como una pomada tópica o como una crema tópica que contiene el principio activo en una cantidad de, por ejemplo, un 0,075% a un 20% peso/peso, preferentemente de 0,2% a un 15% peso/peso y más preferentemente de un 0,5% a un 10% peso/peso. Cuando se formulan en una pomada, los principios activos pueden emplearse con una base de pomada parafínica o miscible con agua. Alternativamente, los principios activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua.

Algunas formulaciones adecuadas para la administración tópica ocular incluyen también gotas oculares donde el principio activo se disuelve o suspende en un excipiente adecuado, especialmente en un disolvente acuoso para el principio activo. El principio activo se encuentra presente preferentemente en dichas formulaciones en una concentración del 0,5% al 20% peso/peso, ventajosamente del 0,5% al 10% peso/peso, particularmente alrededor del 1,5% peso/peso.

Algunas formulaciones adecuadas para la administración tópica bucal incluyen pastillas que comprenden el principio activo en una base aromatizada, habitualmente sucrosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte como por ejemplo gelatina y glicerina, o sucrosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un excipiente líquido adecuado.

Algunas formulaciones para la administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende por ejemplo mantequilla de cacao o un salicilato.

Algunas formulaciones adecuadas para la administración nasal, en las cuales el excipiente es un sólido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el rango de 20 a 500 micrones que se administra de la misma manera que se toma aspirado por la nariz, es decir, mediante la inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente con el polvo colocado bajo la nariz, muy cerca de ésta. Algunas formulaciones en las cuales el excipiente es un líquido, para la administración como un spray nasal o como gotas nasales, por ejemplo, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo.

Algunas formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espuma o formulaciones en forma de spray que contienen, además del principio activo, aquellos excipientes adecuados para dicha administración, según es conocido en el estado de la técnica.

Algunas formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes emulsionantes y agentes espesantes y liposomas u otros sistemas microparticulados que están diseñados para dirigir el compuesto hasta los componentes de la sangre o uno o más órganos. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes monodosis o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en condiciones deshidratadas por congelación (liofilizadas), requiriendo sólo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo agua para las inyecciones, inmediatamente antes de su utilización. Las soluciones o suspensiones inyectables pueden prepararse en cualquier momento a partir de polvos estériles, granulados y pastillas del tipo descrito previamente.

Algunas formulaciones de monodosis preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, una subdosis diaria, tal y como se ha descrito más arriba en la presente invención, o una fracción apropiada de la misma, de un principio activo.

Debe entenderse que además de los ingredientes mencionados particularmente más arriba, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en el estado de la técnica, haciendo referencia al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo aquellas adecuadas para la administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.

El profármaco del sistema de la presente invención puede administrarse también a un animal o a un humano mediante cualquiera de los medios mencionados en la presente invención, en cualquiera de las formulaciones mencionadas en la presente invención, y en las proporciones de dosificación mencionadas en la presente invención.

Algunos ejemplos de tumores que pueden tratarse mediante el sistema de la presente invención son, por ejemplo, los sarcomas, incluyendo los sarcomas osteogénicos y de tejidos blandos, los carcinomas, por ejemplo el carcinoma de pecho, de pulmón, de vejiga, de tiroides, de próstata, de colon, de recto, de páncreas, de estómago, de hígado, uterinos y de ovarios, los linfomas, incluyendo los linfomas de Hodgkin y no Hodgkin, neuroblastoma, el melanoma, el mieloma, el tumor de Wilms y las leucemias, incluyendo la leucemia linfoblástica aguda y la leucemia mieloblástica aguda, los gliomas y los retinoblastomas.

Según otra realización de la invención, el vector vírico se incorpora en un célula, por ejemplo un fibroblasto, antes de la administración a un paciente. El gen puede introducirse en la célula utilizando técnicas estándar como, por ejemplo, el fosfato de calcio o la electroporación. En este caso, el transporte dirigido se consigue mediante la restricción de la inserción viral en aquellas células que sintetizan ADN. También se contempla que el transporte dirigido podría conseguirse utilizando anticuerpos contra tumores específicos. A diferencia de la Terapia de Profármaco Enzimática Dirigida por Anticuerpos, el anticuerpo sería internalizado. Sin embargo, la naturaleza de los virosomas es tal que una vez internalizados se dirigen hacia el núcleo celular y evitar la compartimentalización y ruptura normalmente asociada con la inserción.

El sistema de la presente invención puede utilizarse para eliminar tejido normal, por ejemplo tejido pectoral, particularmente en mujeres que muestran tener el "gen de cáncer de pecho", o para eliminar células normales específicas en animales para estudios sobre el desarrollo de tejido normal (farmacogénica).

Los profármacos del sistema de la invención, que se convierten en la forma activa por acción de la nitroreductasa, son citotóxicos para células que no se encuentran en fase de ciclo celular y también para células que se encuentran en fase de ciclo celular.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

El efecto de CB 1954 sobre la supervivencia de células V79 en presencia de la nitroreductasa de E. coli se muestra en la tabla I. Todos los tratamientos se realizaron durante 2 horas a 37ºC y después se hizo una extensión de las células sobre placas para determinar su capacidad formadora de colonias resultante. Se utilizó NADH como cofactor para ambas enzimas.

TABLA I

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Ejemplo 2

El efecto de SN23862 sobre la supervivencia de células V79 en presencia de la nitroreductasa de E. coli. Todos los tratamientos se realizaron durante 2 horas a 37ºC y después se hizo una extensión de las células sobre placas para determinar su capacidad formadora de colonias resultante. La concentración de nitroreductasa era 2 \mug/ml y se utilizó NADH como cofactor para ambas enzimas. La densidad celular inicial era de 2x10^{5}/mL.

TABLA II

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Ejemplo 3 Generación de citotoxicidad mediante la acción de NR sobre el derivado N-4-nitrobenciloxicarbonil de la actinomicina D (AMD)

Se incubaron diversas concentraciones del profármaco con 1 mL de células V79 (2x105/mL), NADH (500 \muL) y NR (2,5 ó 10 \mug/mL) en PBS. Después de 2 h a 37ºC, las células se reunieron y se ensayó su capacidad formadora de colonias. Los resultados se muestran en la Figura 1, a partir de la cual puede comprobarse que la citotoxidad del profármaco aumenta enormemente en presencia de NR y depende de la concentración de la enzima.

Ejemplo 4 Citotoxicidad de CB 1954 frente células NIH3T3 transducidas con nitroreductasa

Tal como sugería la observación de que la masa de población celular no seleccionada e infectada podía matarse eficientemente, se comprobó un efecto espectador al mezclar las células 3T3-NTR14 con las células NIH3T3 no transducidas. La Figura 2 muestra que podría conseguirse el 90% de inhibición sobre la incorporación de ^{3}H-timidina (mostrado como 10% desintegraciones radiactivas/minuto) con sólo el 50% de células transducidas.

Ejemplo 5 Comparación de los sistemas enzima/profármaco nitroreductasa/CB 1954 y timidina quinasa/ganciclovir

Las células deben estar en fase S para la incorporación del GCV-trifosfato citotóxico en el ADN, mientras que CB 1954 activado, que actúa como un agente de entrecruzamiento, requiere un estado de división celular activo para conseguir citotoxicidad. De hecho, la detención del ciclo celular de las células NIH3T3 que expresan NTR mediante una deprivación por suero no afecta su matanza a través de CB 1954 (Fig. 3a), mientras que una detención similar del ciclo celular de las células NIH3T3 que expresan TK impide que GCV las mate (Fig. 3b).

Ejemplo 6 Expresión in vitro de la nitroreductasa (NR) en células epiteliales a) Clonación de la nitroreductasa

Se utilizaron dos cebadores para amplificar la región codificadora a partir de un plásmido proporcionado por el Servicio del Laboratorio para la Salud Pública (Public Health Laboratory Service, PHLS) y se designó como NTR1003.

El cebador sentido es:

5'CGCAAAAAAGCTTTCACATTGAGTCATTATGG3'

Dicho cebador se diseñó de manera que añadiera una diana HindIII, que eliminara un ATG corriente arriba y que mejorara el sitio de iniciación de la translación en las células de mamífero.

El cebador antisentido es:

5'CGGCAAGGGATCCTTACACTTCGGTTAAGGTGATG3'

Dicho cebador se diseño de manera que añadiera una diana BamHI. La región codificadora se amplificó utilizando Pfu polimerasa y el fragmento HindIII-BamHI se clonó direccionalmente en pREP8 (invitrogen). Se secuenció un clon con el mapa de restricción correcto a partir de la región activadora de la transcripción RSV para confirmar que el extremo 5' del clon era correcto y se designó como NRR8/3. pREP8 y pNRR8/3 se transfectaron en E. coli NFR-343 (que carece de nitroreductasa) y las colonias resistentes a ampicilina se seleccionaron para el ensayo. pREP8 y pR8NR se purificaron para las transfecciones de células humanas utilizando reactivos "Qiagen".

b) Expresión de nitroreductasa en células epiteliales

La línea celular (lumenal) de pecho humano HB4a inmortalizada condicionalmente con SV40 se transfectó con pREP8 y pNRR8/3 utilizando precipitación con fosfato cálcico, y los transfectantes estables se seleccionaron en Histidinol 1mM. Para cada plásmido se obtuvieron 50-60 colonias resistentes a fármaco que se reunieron y se mantuvieron continuamente bajo selección.

Las poblaciones reunidas de HB4a/REP8 y HB4a/NR se expandieron y se examinó la expresión de proteína nitroreductasa. El inmunoblot de las fracciones celulares lisadas completas utilizando anticuerpo policlonal de conejo, rb 6s4/ntr, mostró que Hb4a/NR expresaba cantidades mayores de proteína nitroreductasa, con bandas de peso apropiado comparadas con la proteína reductasa de E. coli recombinante (Figura 4). Tal y como se esperaba, HB4a/REP8 no expresaba proteína nitroreductasa.

c) Reducción enzimática de CB 1954

Se incubó CB 1954 (100 \muM) y NADH (500 \muM) con una fracción celular lisada preparada mediante sonicación (250 \mul, 1 mg/mL proteína) en tampón de fosfato sódico 10 mM (pH7) a 37ºC. Se inyectaron alícuotas (10 \mul) a diversos tiempos en una columna de HPLC Partisphere SCX (110 x 4,7 mm) y se eluyó isocráticamente (2ml/min) con NaH_{2}PO_{4} 50 mM en metanol al 1% (v/v). La fracción eluída se monitorizó continuamente mediante la absorción a 260 nm, 310 nm, 340 nm utilizando un detector de diodo en serie. Alternativamente, se añadió [U-^{3}H]CB 1954 hasta dar una actividad de 1,6x10^{5} dpm por nmol. Se recogieron muestras (0,3 ml) y se determinó su actividad en tritio mediante cuenta de líquido de centelleo. La concentración de proteína se determinó mediante un procedimiento estándar (Biorad), calibrado con albúmina bovina.

d) Determinación de la supervivencia celular

Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en medio fresco a una concentración de 2 x 10^{5} células por mL. A continuación se trataron durante dos horas con CB 1954 (10 \mul de un stock apropiado en DMSO). Las células tratadas se centrifugaron, se lavaron con medio fresco y se extendieron sobre placas por triplicado a diversas concentraciones. Las células se fijaron y se tiñeron después de una incubación durante 14 días a 37ºC en una atmósfera húmeda con un 5% de CO_{2} y un 95% de aire.

e) Expresión en células HOSPIP

El gen modificado descrito más arriba se ligó en los vectores pREP4 y pREP8. Estos dos vectores, con un elevado nivel de transcripción constitutiva a partir de RSV LTR, llevan los marcadores seleccionables Higromicina e Histidinol, respectivamente, para la coexpresión de proteínas recombinantes. Ambos constructos se transfectaron en la línea celular de carcinoma de mama de rata HOSPIP mediante la técnica de fosfato de calcio y se sometieron a las condiciones de selección apropiadas para aislar los clones resistentes.

f) Determinación de los entrecruzamientos intracadena de ADN

Las células HB4a/NR se marcaron radiactivamente dejándolas crecer durante 48 horas en [^{3}H]-timidina. A continuación se trataron las células con CB 1954 0, 10 ó 50 \muM durante 24 horas y se analizó su ADN mediante sedimentación en sucrosa alcalina.

Resultados Reducción enzimática de CB 1954

Las células HB4a/NR pero no las células HB4a/REP8 mostraron una disminución dependiente del tiempo de las concentraciones de CB 1954 (Fig. 5). El examen de las trazas indicó también la formación de los productos de reducción 2- y 4-hidroxilamino de CB 1954. Esto se confirmó mediante la utilización de profármaco marcado radiactivamente (Fig. 6). Se determinó que la concentración en proteína de la fracción lisada HB4a/NR en la mezcla a ensayar era de 0,3 mg/mL y se estimó que la actividad enzimática era de 0,05 \mug/mL por comparación con la proteína pura (véanse las Figs. 5 y 6). Así, la actividad NR es 1,7 \mug/mg de proteína celular (\sim1,7 \mug/10^{6} células).

Supervivencia celular

La eficiencia de crecimiento en placas de las líneas celulares HB4a/NR y HB4a/REP8 era pobre y las células sólo crecieron cuando se extendieron sobre placas a una densidad celular elevada (1 x 10^{4} por pozo). Se determinó el crecimiento celular en dichas placas mediante cuenta a ojo desnudo. Los resultados se muestran en la Tabla III. Existe una diferencia dramática en la supervivencia celular entre las dos líneas celulares. Después de una exposición de 2 horas, la línea HB4a/NR muestra citotoxicidad a 1,0 \muM mientras que la línea HB4a/rep8 no muestra citotoxicidad hasta que la dosis es > 100 \muM.

Formación de ADN entrecruzado

La confirmación de que la citotoxicidad de CB 1954 en las células Bh4a/NR se debe a su reducción enzimática, se obtiene demostrando la capacidad de este compuesto de formar entrecruzamientos de ADN intracadena (Fig. 7). Cantidades crecientes de CB 1954 producen un aumento progresivo en la cantidad de ADN que está entrecruzado, tal y como indica la proporción creciente de ADN de mayor peso molecular que va sedimentando en el gradiente de sucrosa alcalina (la sedimentación es de izquierda a derecha) (Fig. 7). También se observa la ruptura de cadena de ADN (por rupturas reales o sitios lábiles a álcali) y para mayor claridad se muestran los perfiles de sedimentación respecto un control modelado del mismo peso molecular que el ADN experimental de cadena rota. CB 1954 10 \muM produce alrededor de 6 entrecruzamientos y 25 rupturas por 109 daltons de ADN, mientras que CB 1954 50 \muM produce 12 entrecruzamientos y 28 rupturas. Estos efectos no se observan en células no tratadas.

TABLA III

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Cancer Research Campaign Technology Limited

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(B): CALLE: Cambridge House

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(C): CIUDAD: 6-10 Cambridge Terrace

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(D): ESTADO: Reagent's Park

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(E): PAÍS: LONDON

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): NW1 4JL

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mejoras en relación a la terapia del cáncer

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: No aplicable

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(v): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: No aplicable

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1167 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucléico

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(C): TIPO DE CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(vi): FUENTE ORIGINAL

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(A): ORGANISMO: Escherichia coli

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(B): CEPA: B

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 176.829

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 217 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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Claims

1. Sistema enzima-profármaco dirigido contra un virus que comprende dos componentes, cuyos componentes son:

(i) un vector vírico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una nitroreductasa, cuya nitroreductasa es capaz de convertir un profármaco en un fármaco citotóxico; y

(ii) un profármaco capaz de convertirse en un fármaco citotóxico por acción de la nitroreductasa codificada por el vector.

2. Sistema según la reivindicación 1, en el cual la secuencia nucleotídica contiene el oligonucleótido de SEC ID No. 1, un fragmento del mismo o un oligonucleótido que se puede hibridizar con el mismo.

3. Sistema según la reivindicación 1 ó 2 en el cual la nitroreductasa es de SEC ID No. 2, un fragmento del mismo o un homólogo del mismo, en el cual el fragmento u homólogo retiene la actividad nitroreductasa.

4. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el vector vírico comprende un promotor unido operativamente a la secuencia que codifica el polipéptido.

5. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el vector está en forma de partícula vírica.

6. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el vector se incorpora a una célula.

7. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el profármaco es un compuesto mostaza nitrogenada.

8. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el profármaco es 1-aziridin-1-il-2,4-dinitrobenzamida o 2,4-dinitro-5-(N,N-di(2-cloroetil))aminobenzamida.

9. Kit que comprende:

(i) un vector vírico tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(ii) un profármaco tal y como se ha definido en la reivindicación 1, 7 u 8.

10. Vector vírico tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para utilizar en un sistema tal y como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o en un kit tal y como se ha reivindicado en la reivindicación 9.

11. Vector vírico tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para utilizar en un sistema tal y como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o en un kit tal y como se ha reivindicado en la reivindicación 9, en un procedimiento de tratamiento médico.

12. Utilización de un vector vírico tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores.

13. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para utilizar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal.

14. Kit según la reivindicación 9 para utilizar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.

15. Producto que contiene un vector vírico tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un profármaco tal y como se define en la reivindicación 1, 7 u 8 como una preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de tumores.

16. Utilización de un vector tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la fabricación de un medicamento destinado a eliminar tejido cuando se administra con una cantidad efectiva de un profármaco según se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

17. Producto que contiene un vector vírico según se ha define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un profármaco según se define en la reivindicación 1, 7 u 8 como preparación combinada para la utilización simultánea, separada o secuencial en la eliminación de tejido.