ES2233097T3 - Formulaciones de cocleato que integran proteina-adn y procedimientos para la transformacion de celulas. - Google Patents

Formulaciones de cocleato que integran proteina-adn y procedimientos para la transformacion de celulas.

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ES2233097T3 ES99966144T ES99966144T ES2233097T3 ES 2233097 T3 ES2233097 T3 ES 2233097T3 ES 99966144 T ES99966144 T ES 99966144T ES 99966144 T ES99966144 T ES 99966144T ES 2233097 T3 ES2233097 T3 ES 2233097T3
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Abstract

Estructura de vector de liberación que comprende: a) una composición cocleato que comprende una estructura de bicapa lipídica, elementos lipídicos individuales que contienen un grupo principal cargado negativamente y cationes; b) proteínas que facilitan la integración de una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de una célula diana en la que las proteínas comprenden tanto Rep 68 como Rep 78 y c) un polinucleótido que comprende una o más secuencias de ADN reconocidas por una o más proteínas que facilitan la integración de secuencias nucleotídicas y uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos, conteniendo cada uno una secuencia nucleotídica terapéutica que expresa una molécula terapéuticamente beneficiosa.

Description

Formulaciones de cocleato que integran proteína-ADN y procedimientos para la transformación de células.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un sistema vector lipídico que comprende una estructura de bicapa lipídica multicapa denominada precipitado cocleato. Las capas de la estructura de bicapa lipídica se encuentran unidas iónicamente entre sí mediante un catión.
Una o más de las secuencias nucleotídicas terapéuticas que codifican una molécula terapéuticamente beneficiosa y las proteínas que facilitan la integración de las secuencias nucleotídicas terapéuticas físicamente asociadas con el precipitado cocleato.
Las proteínas son los virus adenoasociados (AAV) Rep 68 y Rep 78. La secuencia nucleotídica terapéutica preferiblemente se encuentra situada entre las repeticiones terminales invertidas del AAV.
Al entrar en contacto con una bicapa lipídica de una célula diana, la estructura de vector cocleato libera una o más de las secuencias nucleotídicas terapéuticas y una o más de las proteínas en el interior de la célula diana. Al entrar en la célula, la proteína o proteínas facilitan la integración de la secuencia o secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de la célula huésped.
Antecedentes de la invención
Los avances recientes de la biología molecular han incrementado la comprensión científica de la base genética de las enfermedades y han proporcionado las herramientas para nuevos avances en la terapia génica. Por ejemplo, en la actualidad es posible producir secuencias nucleotídicas de ingeniería genética capaces de expresar moléculas terapéuticas. Sin embargo, siguen existiendo obstáculos importantes y uno de ellos ha sido la falta de medios efectivos para liberar estas secuencias nucleotídicas terapéuticas en el interior de células diana de una forma capaz de integrarse en el genoma de la célula diana. La presente invención se refiere a un sistema de vector de liberación capaz de liberar materiales genéticos en el interior de una célula junto con las moléculas necesarias para la integración de tales materiales genéticos en el genoma de la célula diana. En Advanced Drug Delivery Reviews 32: 273-287 (1998), Gould-Fogerite et al. describen la utilización de cocleatos como sistemas de vector de liberación y en particular afirman que los cocleatos de proteína y ADN son vacunas altamente efectivas.
La patente WO-A-9730725 da a conocer cocleatos que se utilizan como sistemas de vector de liberación que comprenden polinucleótidos y elementos reguladores. En uno de los ejemplos, se incluye proteína fusogénica de virus sendai.
En J. Virol., 1998, 7653-7658, Lamartina, S. et al. describen liposomas para liberar AAV. La proteína Rep-68 promueve la integración sitio-específica de polinucleótido.
La invención incluye una estructura de vector de liberación tal como se define en la reivindicación 1.
El sistema de vector de liberación de la presente invención comprende una estructura lipídica denominada precipitado cocleato o, simplemente, cocleato. El cocleato comprende una estructura de bicapa lipídica multicapa. La estructura de bicapa lipídica multicapa generalmente comprende un fosfolípido membranal que contiene un grupo principal cargado negativamente y un catión, tal como el calcio (Ca^{++}). El catión sirve de puente, uniéndose iónicamente con los grupos principales cargados negativamente de los grupos fosfolípidos y de esta manera une entre sí las bicapas lipídicas individuales de la estructura multicapa.
Los cocleatos consisten en láminas alternadas de lípido acomplejado con cationes. En un modo preferido de la invención, la estructura de bicapa lipídica multicapa existe como una lámina bicapa lipídica continua enrollada en una conformación espiral. El catión mantiene la estructura del cocleato uniendo iónicamente los grupos principales cargados negativamente en las bicapas lipídicas opuestas. Por ejemplo, en el caso de que el catión sea Ca^{++}, una carga positiva del Ca^{++} atrae un grupo principal fosfolípido cargado negativamente en una bicapa y la otra carga positiva atrae un grupo principal fosfolípido en la bicapa opuesta.
Los cocleatos son altamente estables y pueden almacenarse en tampón que contiene calcio. Los cocleatos también pueden liofilizarse para formar unos polvos, almacenarse a temperatura ambiente y reconstituirse con líquido previamente a la administración.
Aunque son conocidos otros sistemas de vector lipídico de liberación (ver Lee et al., "Lipidic Vector Systems for Gene Transfer", Critical Reviews in Drug Carrier Systems 14(2): 173-206 (1997)), típicamente se encuentran en forma de liposomas y son sustancialmente diferentes del sistema vector cocleato de liberación indicado en el presente documento. Un liposoma es un compartimiento lleno de líquido limitado por una bicapa lipídica fluida. Los materiales como el ADN o las proteínas puede estar contenidos dentro de un liposoma, y tales materiales pueden administrarse en el interior de una célula mediante incorporación endocítica o, en casos especiales, mediante fusión del liposoma con la membrana celular.
Al contrario que las estructuras cocleato, las condiciones ambientales duras, tales como los pH extremos o la presencia de enzimas degradativos de los lípidos, hacen que la bicapa lipídica de un liposoma sea susceptible de inestabilizarse y comprometer la barrera membranal. Al comprometerse la barrera membranal, el contenido del liposoma puede ser atacado por los elementos externos. Por ejemplo, los enzimas degradativos, tales como las proteasas y nucleasas, pueden degradar las proteínas y polipéptidos dentro del liposoma que ha sido comprometido.
Una diferencia adicional entre liposomas y cocleatos es la presencia de cationes divalentes. Los cocleatos se preparan mediante fusión de liposomas inducida por calcio. Los cocleatos pueden contener, por ejemplo, un concentración molar de cationes divalentes que es la mitad de la concentración molar de los fosfolípidos. Los cationes divalentes organizan las bicapas lipídicas negativamente cargadas en láminas sólidas que se enrollan o apilan sobre sí mismas, excluyendo el agua.
Los cocleatos son estructuras multicapa altamente estables compuestas de productos naturales no tóxicos y no inflamatorios. Son precipitados sólidos y liofilizables que contiene poco o nada de espacio acuoso interno. Aunque la deshidratación de los liposomas, por ejemplo mediante liofilización, destruye la morfología e integridad de los liposomas, tal deshidratación no presenta efectos adversos sobre la morfología o funciones del cocleato. Las capas del cocleato están compuestas de láminas alternantes de fosfolípido cargado negativamente y calcio. Esta estructura única protege de la degradación a las moléculas "encocleadas" asociadas. Debido a que la estructura entera de cocleato es una serie de capas sólidas, los componentes en el interior de la estructura cocleato permanecen intactos, aunque las capas externas del cocleato pueden quedar expuestas a condiciones ambientales duras o a enzimas.
La formulación de los complejos integrativos de ADN y proteína o la utilización de estos complejos como vehículos de transferencia de genes no ha sido descrita hasta el momento.
Las perturbaciones inducidas por el calcio de membranas que contienen lípidos cargados negativamente y los sucesos de fusión membranal posteriores que resultan son mecanismos importantes en muchos procesos naturales de fusión membranal. De acuerdo con lo anterior, aunque se desconoce el mecanismo definitivo de liberación del cocleato, se cree que los cocleatos actúan como intermediarios en la fusión membranal. De acuerdo con esta teoría, a medida que la membrana rica en calcio de un cocleato se aproxima a una membrana natural, se induce una perturbación o reordenación de la membrana celular, resultando en una fusión entre la capa externa del cocleato y la membrana celular. Esta fusión resulta en la liberación de una pequeña cantidad del material encocleado en el citoplasma de la célula. En teoría, el cocleato puede después liberarse de la célula y encontrarse disponible para otra fusión, sea con la misma célula o con otra. Alternativamente, el cocleato puede ser incorporado por endocitosis y fusionarse con las membranas celulares desde el interior. En contraste, la bicapa lipídica de la mayoría de liposomas es altamente estable termodinámicamente y resiste la fusión con otros liposomas o con otras estructuras unidas a membranas.
La hipótesis de fusión membranal es consistente con la observación de que muchas fusiones de membrana que se dan naturalmente implican la interacción del calcio con fosfolípidos cargados negativamente (generalmente fosfatidilserina y fosfatidilglicerol). Esta hipótesis también es consistente con los estudios experimentales. Por ejemplo, la capacidad de los cocleatos de mediar en la inducción de linfocitos citotóxicos CD8^{+} antígeno-específicos apoya la hipótesis de que los cocleatos facilitan la liberación citoplásmica de las macromoléculas asociadas a cocleatos. Además, los estudios inmunológicos que indican una presentación lenta a largo plazo de antígeno son consistentes con la teoría de que un único cocleato experimenta múltiples fusiones a lo largo de un periodo extendido de tiempo.
La presente invención hace uso de los cocleatos como vehículos de liberación para materiales genéticos y proteínas que facilitan la integración de los materiales genéticos en el genoma huésped. Los materiales genéticos y proteínas proceden del virus adenoasociado (AAV). El AAV es un parvovirus ADN de hebra única naturalmente defectivo que se utiliza comúnmente como vector.
El AAV de tipo salvaje generalmente requiere la coinfección con un virus ayudante para poder replicarse. Sin un virus ayudante, el AAV se integra en el genoma de la célula huésped y permanece latente durante periodos extendidos de tiempo. El AAV no ha sido asociado con ninguna enfermedad humana y la integración del AAV no parece afectar a la replicación celular. La propensión del genoma del AAV a integrarse con seguridad en el genoma de las células huésped hace que sea un vector atractivo para la terapia génica.
El AAV encapsidado dentro de proteínas estructurales virales ha sido utilizado como vector para la liberación génica. La presente invención es significativamente diferente en el aspecto que utiliza elementos genéticos no encapsidados de AAV acomplejados con proteínas virales seleccionadas y empaquetados en cocleatos.
El genoma de AAV es de 4,68 kb de longitud y contiene dos marcos de lectura abierta y dos repeticiones terminales invertidas de 145 bp (RTI) (Chatterjee et al., Science 258: 1485-88 (1992)). Los dos marcos de lectura abierta, situados entre los RTI, contiene los genes rep y cap, que contienen proteínas implicadas en la replicación y encapsidación, respectivamente. El gen rep del AAV se transcribe a partir de dos promotores, p_{5} y p_{19}. La transcripción desde el promotor p_{5} genera transcritos de ARNm que codifican las proteínas Rep 68 y 78. Las Rep 68 y 78 es conocido que median en la formación de complejos entre ADN y AAV y su sitio de integración en el ADN humano (ver Weitzman et al., "Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5808-5812 (1994). Estas proteínas se unen específicamente al AAV terminal ahorquillado, formado por las 125 bases terminales y posee actividades helicasa y endonucleasa sitio-específica requeridas para la replicación del AAV.
Una manera de utilizar la actividad integrativa del sistema AAV es co-transfectar células con un vector que exprese las proteínas Rep junto con un vector que contenga un gen a transferir flanqueado por las RTI. La dificultad de este enfoque es la potencial producción crónica de las proteínas Rep y Cap. La Rep es conocido que presenta efectos sobre la expresión de algunos genes celulares y podría resultar tóxico a niveles elevados. En particular, la expresión crónica de las proteínas en células madre hematopoyéticas podría alterar significativamente su programa genético. Esto podría llevar a cambios en los patrones de diferenciación y potenciales. Los genes rep y cap pueden ser eliminados y sustituidos por una secuencia nucleotídica que contenga uno o más genes que expresen una o más moléculas terapéuticamente efectivas. Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, Rep 68 y Rep 78 son necesarios para la integración del genoma del AAV en el genoma de la célula diana. La presente invención resuelve esta dificultad empaquetando in vitro las proteínas sintetizadas Rep 68 y Rep 78 junto con material genético del AAV que carece de los genes rep y cap. En una realización preferida de la invención, se utiliza un cocleato para liberar una hebra de ADN del AAV del que se han extraído los genes rep y cap y que presenta uno o más genes terapéuticos empalmados entre los RTIs, coempaquetados con las proteínas recombinantes Rep 68 y Rep 78 del AAV.
Una dificultad con la utilización estándar del cápside del AAV para liberar materiales genéticos del AAV es que el tamaño de ésta limita la longitud de la secuencia nucleotídica terapéutica que puede empalmarse entre los RTIs. Debido al pequeño tamaño del cápside del AAV, las secuencias nucleotídicas de más de 5 kb se integran pobremente. Debido a que los RTIs del AAV comprenden por lo menos 290 bases, se dejan aproximadamente 4,7 kb para la secuencia nucleotídica terapéutica de interés. Este límite superior descarta la utilización de secuencias nucleotídicas más grandes que podrían ser candidatos atractivos para la terapia génica, tal como el gen que codifica para la distrofina, la ausencia o disfunción de la cual conduce a la distrofia muscular de Duchenne y de Becker. En contraste, aunque no se conoce el límite superior para el número de bases que pueden empalmarse entre los RTIs del AAV para la liberación mediante el sistema de vector cocleato de la invención, se predice que este número será mucho mayor que el número de bases que pueden empalmarse entre los RTIs del AAV para la liberación por el cápside del AAV. La capacidad de liberar secuencias nucleotídicas más grandes debería incrementar grandemente el número de trastornos genéticos para los que pueden utilizarse como vector los RTIs del AAV.
Otra desventaja de la utilización del cocleato como sistema de empaquetamiento para un plásmido basado en AAV es la capacidad de liberar los materiales genéticos del AAV sin contaminación con virus ayudante. El método estándar para construir vectores AAV implica la co-infección de una célula huésped con (1) el genoma del AAV en el que los genes rep y cap han sido sustituidos por el gen de interés; (2) un plásmido ayudante que contiene los genes rep y cap del AAV sin los RTIs del AAV, conteniendo típicamente promotores de adenovirus; y (3) un adenovirus ayudante. Los genes rep y cap del AAV producen las proteínas Rep y Cap pero no pueden ser encapsidados por el cápside del AAV. El gen foráneo flanqueado por los RTIs del AAV se encapsida en el cápside del AAV mediante la acción de las proteínas Rep y Cap. El resultado es una mezcla de AAV recombinante y adenovirus. El AAV recombinante debe purificarse a continuación mediante centrifugación en gradiente de densidad de flotación con cierto riesgo de contaminación con adenovirus residual. En contraste, los sistemas de vector de liberación de la presente invención pueden construirse sin la ayuda del adenovirus ayudante, eliminando de esta manera el riesgo de contaminación con adenovirus.
Un aspecto importante de la presente invención es la transducción de células madre hematopoyéticas. Éstas son células progenitoras pluripotentes no diferenciadas desde las que se desarrollan otras células sanguíneas especializadas. La capacidad de proporcionar una corrección a largo plazo de muchos trastornos genéticos de las células hematopoyéticas es necesaria para la reconstitución de otras células en el sistema hematopoyético.
Desgraciadamente, la transducción de células hematopoyéticas utilizando vectores retrovirales convencionales requiere la estimulación de tales células mediante citoquinas. La estimulación con citoquinas se cree que destruye la naturaleza pluripotente de estas células madre. Los presentes inventores han descubierto de manera sorprendente e inesperada un medio para transformar las células madre hematopoyéticas en ausencia de estimulación con citoquinas, lo que resulta en la transducción de las células hematopoyéticas. Debido a que esta transducción se da en ausencia de estimulación con citoquinas, la integración en el genoma huésped de los elementos genéticos del AAV puede llevarse a cabo sin perturbar la capacidad pluripotente de las células madre hematopoyéticas. La presente invención, por lo tanto, constituye un avance importante en el campo de la terapia génica, y particularmente en el campo de la terapia génica para los trastornos sanguíneos.
Anteriormente no era conocido que los cocleatos que contienen proteínas rep y ADN con RTIs podían servir como vector para la liberación eficiente en el núcleo de las proteínas y el ADN de una forma adecuada para la integración del ADN catalizada por proteína rep.
También resultó inesperado que los complejos de proteína rep-ADN pudiesen conservar una asociación funcional estable a largo plazo. Las formulaciones almacenadas durante más de un año a 4ºC mostraron pérdidas indetectables de eficiencia en la transferencia génica.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama de un vector génico plásmido de ADN (CWRSVN) que contiene un gen marcador de la neomicina fosfotransferasa (NEO) regulado por SV40 y flanqueado por RTIs 5' y 3' del AAV.
La figura 2 es un diagrama de una conformación de un cocleato.
La figura 3 es una ilustración de precipitados cocleato fracturados por congelación tal como se observan mediante microscopía electrónica de transmisión.
Descripción detallada de la invención y de las realizaciones preferidas de la misma
La presente invención se refiere a un sistema vector lipídico que comprende una estructura de bicapa lipídica de capas conocida como precipitado cocleato. Los elementos lipídicos individuales de la bicapa lipídica contienen un grupo principal cargado negativamente. Las capas de la estructura de bicapa lipídica se encuentran unidas entre sí mediante un catión asociado que está unido iónicamente con el grupo principal cargado negativamente.
Asociado con el precipitado cocleato, se prevén una o más proteínas que pueden facilitar la integración de los nucleótidos en el genoma de la célula huésped. Se utilizan proteínas del AAV.
También asociados con la bicapa cocleato se prevé un oligonucleótido o polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica terapéutica y secuencias nucleotídicas reconocidas por proteínas que presenta una función de unión a ADN. Estas secuencias de ADN reconocidas por proteínas son los RTIs del AAV. Preferiblemente, los nucleótidos terapéuticos se posicionan entre las secuencias nucleotídicas reconocidas por las proteínas que presentan una función de unión a ADN.
La secuencia nucleotídica terapéutica codifica una o más moléculas terapéuticamente beneficiosas. Una molécula terapéuticamente beneficiosa de acuerdo con la presente invención es una cadena de aminoácidos terapéuticos de cualquier longitud que incluye secuencias más cortas de aminoácidos habitualmente denominadas péptidos, así como secuencias más largas de aminoácidos, habitualmente denominadas polipéptidos o proteínas. Muchas de tales moléculas terapéuticamente beneficiosas son bien conocidas para un experto ordinario en la materia. Además, o alternativamente, la molécula de ARN expresada a partir de la secuencia de ADN puede ser el elemento activo, por ejemplo, el ARN puede presentar actividad anti-sentido, catalítica o de unión a proteínas.
Al entrar en contacto con la bicapa lipídica de una célula diana, la bicapa lipídica en capas puede liberar una o más de las secuencia nucleotídicas terapéuticas y una o más proteínas en el interior de la célula diana. Al entrar en la célula, la proteína o proteínas facilitan la transferencia en el núcleo y/o integración de la secuencia nucleotídica terapéutica en el genoma de la célula huésped.
Las estructuras de vector precipitado cocleato utilizadas en la invención instantánea pueden prepararse mediante procedimientos conocidos, tales como los descritos en las patentes U.S. nº 5.643.574, nº 4.633.161, nº 4.871.488; s. Goulg-Fogerite et al., Analytical Biochemistry, vol. nº 148, páginas 15-25 (1985); S. Gould-Fogerite et al., Advances in Membrane Biochemistry and Bioenergetics, editado por Kim, C.H., Tedeschi, T. Diwan, J.J. y Salerno, J.C., Plenum Press, Nueva York, páginas 569-586 (1988); S. Gould-Fogerite et al., Gene, vol. nº 84, páginas 429-438 (1989); Liposome Technology, 2ª edición, vol. nº I, Liposome Preparation and Related Techniques, vol. nº II, Entrapment of Drugs and Other Materials y vol. Nº III, Interactions of Liposomes with the Biological Milieu, todos editados por Gregory Gregoriadis (CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Londres, Tokio), capítulo 4, páginas 67-80, capítulo 10, páginas 167-184 y capítulo 17, páginas 261-276 (1993); R.J. Mannino y S. Gould-Fogerite, Liposome Mediated Gene Transfer, Biotechniques, vol. nº 6, nº 1 (1988), páginas 682-690; y Miller et al., "Vaccination of rhesus monkeys with synthetic peptide in a fusogenic proteoliposome elicits simian immunodeficiency virus-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes", J. Exp. Med. Vol. nº 176, páginas 1739-1744 (1992).
Un método para la encocleación ("atrapamiento") implica la adición de calcio a una suspensión de lípido y material a encoclear. Este procedimiento generalmente se lleva a cabo de la manera siguiente:
1. Se seca el lípido (y el material a encoclear si es soluble en disolvente orgánico) hasta formar una película fina dentro de un recipiente. Alternativamente, se utiliza lípido en forma de polvos.
2. Se añade tampón y el lípido se suspende mediante agitación.
3. Se añade el material acuoso soluble a encoclear a la suspensión de liposomas.
4. La adición de una solución de calcio resulta en la formación de láminas de bicapas fosfolipídicas queladas con calcio.
5. Las láminas se enrollan o apilan para formar cocleatos que contienen el material de interés.
Un procedimiento alternativo de encocleación implica la eliminación de detergente de una solución de lípido y material a encoclear, seguido de, o simultáneamente con, la adición de calcio.
1.
Se añade el material a encoclear a una solución que contiene un detergente (por ejemplo, \beta-D-octilglucopiranósido en un tampón de concentración salina elevada).
2.
Se añade esta solución a los lípidos naturales, fosfatidilserina y colesterol.
3.
Se elimina el detergente mediante diálisis, resultando en la formación de pequeñas vesículas lipídicas.
4.
La adición de calcio como solución o mediante diálisis resulta en la formación de láminas de bicapas lipídicas queladas con calcio.
5.
Las láminas se enrollan o apilan formando cocleatos que contienen el material de interés.
Los elementos lipídicos individuales de la bicapa lipídica en capas de los precipitados cocleato puede ser cualquier de las muchas estructuras lipídicas conocidas que presentan un grupo principal polar cargado negativamente. Preferiblemente la mayoría de los elementos lipídicos de la bicapa lipídica contienen un grupo principal fosfolípidos cargado negativamente. Al entrar en contacto con una bicapa lipídica de una célula diana, la bicapa lipídica en capas es capaz de liberar una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas y una o más proteínas del AAV en el interior de la célula diana.
Los precipitados cocleato adoptan la forma de muchas estructuras físicas dentro de los límites tecnológicos, pero que son distinguibles funcional y físicamente de los liposomas. En su estado físico, se han observado cocleatos en formas espirales o no espirales, cilindros, particulados de hasta varios micrómetros de diámetro, así como estructuras similares a agujas.
Las capas de la estructura de bicapa lipídica de los cocleatos están unidas entre sí mediante un catión asociado (por ejemplo, Ca^{++}, Mg^{++}, etc.) unido iónicamente con el grupo principal polar cargado negativamente. Preferiblemente el catión es un catión divalente (por ejemplo, Ca^{++}, Mg^{++}) y preferiblemente el catión divalente es Ca^{++}. Asociado con el precipitado cocleato hay un oligonucleótido o polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica terapéutica que codifica una molécula terapéuticamente beneficiosa, tal como un ARN o un péptido o polipéptido o un enzima u otra proteína.
El oligonucleótido o polinucleótido preferiblemente es un plásmido superenrollado (pero puede ser circular relajado o lineal). El oligonucleótido o polinucleótido también contiene los RTIs del AAV. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica terapéutica está situada entre los RTIs del AAV.
La secuencia nucleotídica terapéutica puede incluir uno o más genes terapéuticos. Un gen terapéutico puede, por ejemplo, sustituir o suplementar material genético defectivo. Por ejemplo, el gen terapéutico puede sustituir material genético que ha sido dañado por mutaciones. Un gen terapéutico también podrían codificar ARN o proteína que podría interferir con la producción, estabilidad o actividad de un gen o producto génico endógeno o foráneo.
Alternativamente, un gen terapéutico podría añadir nuevo material genético para crear un nuevo fenotipo deseable. Por ejemplo, el gen terapéutico podría codificar un enzima de no mamífero que convirtiese un profármaco desde una forma inactiva a una activa. Resulta fácilmente evidente a un experto ordinario en la materia que el número de posibles genes terapéuticos que pueden ser utilizados con la presente invención es inmenso y se incrementará naturalmente con el avance del conocimiento de los procesos de las enfermedades.
Se apreciará que las secuencias nucleotídicas terapéuticas pueden incluir elementos transcripcionales y/o traduccionales apropiados. Por ejemplo, una secuencia nucleotídica terapéutica puede contener diversos elementos de control transcripcional, tal como uno o más promotores, elementos promotores corriente arriba, elementos reguladores y/o elementos intensificadores. La expresión tejido-específica y/o inducible de un gen terapéutico puede conseguirse mediante la incorporación en la secuencia nucleotídica terapéutica de secuencias promotoras/intensificadoras apropiadas.
La secuencia nucleotídica terapéutica puede incluir una o más secuencias nucleotídicas que codifican diversas moléculas reguladoras, tales como factores de transcripción. Tales moléculas reguladoras pueden, por ejemplo, incluir diversos elementos en trans.
La secuencia nucleotídica terapéutica también puede incluir diversos elementos marcadores para identificar células en las que la secuencia nucleotídica terapéutica se haya integrado con éxito en el genoma de la célula huésped. También puede incluir moléculas para permitir la selección positiva o negativa de la célula transfectada, tal como resistencia o sensibilidad a un fármaco.
Las secuencias nucleotídicas reconocidas por proteínas que presentan una función de unión a ADN incluyen, pero sin limitación, secuencias que sirven como sustratos para integrasa, helicasa, enzimas de restricción, isomerasa, telomerasa, enzimas de reparación o secuencias reguladoras génicas.
Las proteínas que se unen a las secuencias nucleotídicas o al genoma de la célula diana y facilitan la integración de la secuencia nucleotídica terapéutica en tal genoma están empaquetadas dentro de la bicapa lipídica junto con la secuencia nucleotídica terapéutica. Al entrar en la célula, la proteína o proteínas son capaces de facilitar la integración de la secuencia nucleotídica terapéutica en el genoma de la célula huésped.
La invención incluye ambas proteínas, Rep 68 y Rep 78, del virus adenoasociado.
Se apreciará que la célula diana puede ser cualquier célula en la que la bicapa lipídica en capas sea capaz de liberar su contenido. Los procedimientos para la determinación de si una célula es susceptible de transfección por un vector particular son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica de la terapia génica y sólo implican experimentación rutinaria. La célula diana preferiblemente es una célula humana pero puede ser una célula de cualquier otro primate o animal que sea susceptible de transfección e integración por la estructura de vector cocleato en presencia de proteínas adecuadas que presenten una función de unión a ADN. Alternativamente, la presente invención puede aplicarse a la liberación de complejos ADN-proteína a microorganismos o plantas.
La invención puede liberarse in vivo mediante cualquier medio, lo que hace entrar en contacto la bicapa lipídica en capas con una célula diana. Los medios ejemplares de administración incluyen la administración oral, parenteral, rectal, tópica, sublingual, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, espinal, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoide, bronquial, linfática e intrauterina. Alternativamente, la invención puede utilizarse en la terapia génica ex vivo, que implica la extracción de células, tales como células madre pluripotentes, de un animal mediante diversos medios conocidos en la técnica, la transfección ex vivo de tales células con materiales genéticos exógenos y la sustitución de las células transformadas resultantes en el mismo u otro animal.
La presente invención contempla la utilización de composiciones o formulaciones farmacéuticas para la utilización médica en el hombre que comprende las estructuras de vector cocleato de la presente invención como ingredientes terapéuticos. Tales composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores farmacéuticamente efectivos, y opcionalmente, puede incluir otros ingredientes terapéuticos. El portador o portadores deben ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de que son compatibles con los ingredientes terapéuticos y no son excesivamente perjudiciales para el recipiente de los mismos. El ingrediente o ingredientes terapéuticos se proporcionan en una cantidad necesaria para conseguir el efecto terapéutico deseado, descrito posteriormente.
El modo de administración y formas de dosificación evidentemente afectará a las cantidades terapéuticas de los compuestos que son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada. Los materiales genéticos se liberan en una cantidad capaz de provocar que el recipiente produzca moléculas terapéuticas en una cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad necesaria para prevenir, retrasar o reducir la severidad de la aparición de la enfermedad o una cantidad necesaria para detener o reducir la severidad de una enfermedad crónica. Resultará fácilmente evidente a un experto ordinario en la materia que esta cantidad variará según factores como el peso y salud del recipiente, el tipo de células que se transforman, el modo de administración de las presentes composiciones y el tipo de trastorno médico bajo tratamiento.
Las formulaciones de la presente invención pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas, pastillas, tabletas o comprimidos, conteniendo cada una cantidad predeterminada de la estructura de vector de liberación; o como una suspensión.
Tal como ilustran los ejemplos siguientes, los vectores de expresión del ADN que contiene RTIs del AAV, al formularse con las proteínas del AAV Rep 68 y Rep 78 y con un precipitado cocleato, pueden mediar en la transferencia génica exitosa a células humanas. El coempaquetado de las proteínas Rep del AAV y los vectores de transferencia de gen ADN que contienen RTI del AAV permite la rápida transferencia génica a células diana en reposo tras la manipulación ex vivo limitada en ausencia de estimulación con citoquinas, resultando en la transferencia génica a largo plazo de células madre pluripotentes a células madre potencialmente pluripotentes.
Tal como se indica en los ejemplos posteriormente, las células progenitoras CD34^{+} humanas adultas o neonatales pueden transfectarse con genes marcadores mediante este método tras una exposición ex vivo breve a estructuras de liberación vector cocleato en ausencia de estimulación con citoquinas. Tanto el RTI del AAV como las proteínas Rep contribuyen a la eficiencia de este procedimiento. Dicho procedimiento es aproximadamente cinco veces más eficiente que la transferencia génica mediante un vector retroviral estándar en ausencia de estimulación con citoquinas. Aunque los protocolos de transferencia génica retroviral estándar que hacen uso de estimulación con citoquinas resultan en una transferencia génica más eficiente tras tres días de estimulación in vitro (ver Experimento 3), las dianas transfectadas de esta manera presentan una capacidad reducida de reconstitución hematopoyética. En contraste, los procedimientos de la presente invención son superiores a la transferencia génica retroviral estándar debido a que permiten la rápida transducción de células madre hematopoyéticas en ausencia de estimulación con citoquinas con un mantenimiento probable de la pluripotencialidad.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes demuestran la eficacia de los complejos cocleato específicos de ADN-proteína para conseguir la transferencia y expresión génicas estables en células madre hematopoyéticas humanas. Los cocleatos que contienen un plásmido que codifica la secuencia de repetición terminal iterada (RTI) dentro del genoma del AAV y las proteínas Rep 68 y Rep 78, se ha demostrado que presentan una eficiencia de transducción más elevada que los cocleatos que contienen un plásmido con sólo una proteína, o que un plásmido que contenga LTRs en lugar de RTIs.
La eficiencia de transducción de un gen marcador seleccionable (resistencia a la neomicina) puede evaluarse mediante e número de colonias G418 resistentes producidas. La transducción y expresión génicas estables del gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) permite la replicación celular y el crecimiento de colonias en presencia del antibiótico G418. Las células que no se transducen establemente y no expresan la proteína, no pueden sobrevivir en presencia de concentraciones apropiadas de G418.
Se expresaron las proteínas Rep 68 y Rep 78 como proteínas de fusión de proteína de unión a la maltosa (MPB) en E. coli, tal como se describe en Chiorini et al., "Biologically active proteins of adeno-associated virus type II produced as fusion proteins in Escherichia coli", Journal of Virology 68: 797-804 (1994) (la descripción de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia). Se purificaron las proteínas expresadas en bacterias sobre una columna de afinidad de amilosa.
Se incorporó en cocleatos (se encocleó) solo o coempaquetado con una o ambas de las proteínas Rep 68 y Re 78, el vector plásmido ADN de transferencia génica (CWRSVN) que contenía un gen marcador de la neomicina fosfotransferasa (neo) regulado por SV40 flanqueado por RTIs 5' y 3' (ver figura 1) (Chatterjee et al., "Dual target inhibition of HIV-1 in vitro by means of an adeno-associated virus antisense vector", Science 258: 1485-1488 (1992)
Las proteínas rep 68 y 78 del AAV se unen específicamente a los RTIs del AAV pero no se unen a las secuencias de repetición terminal larga (LTRs) del virus de la leucemia murina (VLM). Como control de especificidad de la interacción proteína rep-ADN, se incorporó en los cocleatos solo o coempaquetado con las proteínas Rep 68 y Rep78 el vector de ADN G1EN, que contiene un gen marcador de la neomicina fosfotransferasa (neo) regulado por SV40 flanqueado por los LTRs 5' y 3' del VLM (Morgan et al., "Retroviral vectors containing putative internal ribosome entry sited: development of a polycistronic gene transfer system and applications to human gene therapy", Nucleic Acids Research 20: 1293-1299 (1992).
Ejemplo 1 Protocolo de formulación para vectores integrativos de ADN en estructuras de bicapa lipídica en capas
En estudios iniciales, se incubaron proteínas Rep con plásmidos en tampón con el fin de promover la formación de complejo ADN-proteína. Se añadieron gradualmente los plásmidos (con o sin proteínas) a una suspensión de liposomas compuesta de fosfatidilserina (FS) y colesterol (COL) y después se agitaron con vórtex. Se añadió calcio en alícuotas pequeñas, bajo agitación, con el fin de formar cocleatos. Los complejos se incubaron a 37ºC y después se almacenaron a 4ºC.
Protocolo general para la formulación de vectores integrativos lípido-ADN
1.
Introducir plásmido en tubos apropiados.
2.
Introducir proteínas Rep en tubos apropiados que contengan ADN.
3.
Incubar a temperatura ambiente durante una hora.
4.
Secar el lípido en tubos separados.
5.
Añadir tampón a los lípidos (por ejemplo, suficiente para preparar 0,33 mg/ml de ADN al añadirlos).
6.
Mezclar con vórtex para resuspender los lípidos.
7.
Sonicar para reducir el tamaño de los liposomas.
8.
Añadir tampones que contenga ADN y proteínas a los lípidos.
9.
Insuflar nitrógeno en los tubos para sustituir el aire.
10.
Agitar con vórtex brevemente.
11.
Añadir calcio soluble bajo agitación suave para mezclar.
12.
Almacenar a 4ºC.
Puede modificarse la formulación del vector cambiando la proporción entre proteínas de unión a ADN y ADN. La formulación actual consiste en una proporción de 0,66 a 1,0 en peso, 33 a 1,0 proporción en moles. Un intervalo probable de proporciones útiles para la formulación estaría comprendida entre 1:1 y 1.000:1 proporción molar entre proteínas de unión a ADN y secuencias en el ADN a las que se unen.
Macroscópicamente, las formulaciones finales consisten en suspensiones blancas pesadas. La observación mediante microscopía óptica de contraste de fases (1.000x) indicó suspensiones pesadas de cristales granulares refráctiles, tanto en forma libre como de agregado. Se confirmó la existencia de estructura cocleato de los cristales mediante adición de EDTA, que provocó la conversión de los cristales de cocleato a liposomas.
Ejemplo 2 Formulaciones específicas utilizadas en los experimentos de transferencia génica
Las condiciones que promueven la formación de complejos ADN-proteína de unión pueden variar pero pueden determinarse experimentalmente. Las condiciones utilizadas fueron tampón TES (NaCl 100 mM, TES 2 mM, histidina 2 mM, pH 7,4) a aproximadamente 2 veces el volumen de proteína en el tampón en el que se purificó (tamponado con HEPES, pH 7,5, KCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, EDTA 0,1 mM y maltosa 10 mM) utilizando una proporción de ADN a lípido de 1,0:10,0 en peso. Un intervalo probable de proporciones útiles para las formulaciones estaría comprendido entre 1:1 y 1:100 en peso.
Los cocleatos se formularon utilizando:
1.
ningún vector ADN ni proteínas Rep;
2.
El vector ADN G1EN y nada de proteínas Rep;
3.
G1EN y proteínas Rep 68 y Rep 78 (la presente invención)
4.
CWRSVN y nada de proteínas Rep;
5.
CWRSVN y proteína Rep 68;
6.
CWRSVN y proteína Rep 78; y
7.
CWRSVN y Rep 68 y 78 (la presente invención)
TABLA 1 Composiciones de formulación de los ejemplos indicados anteriormente
(Proporción de ADN a lípido de 1:10 en peso y proporción de proteína individual a ADN de 0,66:1 en peso)
1
Ejemplo 3 Experimentos de transferencia génica utilizando vectores integrativos lípido-ADN
Las dianas de células progenitoras CD34^{+} humanas se obtuvieron de sangre de cordón neonatal o mediante citoferesis de voluntarios adultos pretratados con factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) bajo un protocolo autorizado Baltimore para el uso humano de la Universidad de Maryland.
A continuación, se enriquecieron adicionalmente células sanguíneas periféricas mononucleares para dianas CD34^{+} mediante selección positiva utilizando una columna de inmunoafinidad CellPro (Bothell, WA).
En una transducción típica (experimento in vitro de transferencia génica), se resuspendieron 40.000 dianas celulares de sangre de cordón o células CD34^{+} adultas en 200 \mul de RPMV en FCS al 10% y se incubaron con 5 \mul de una suspensión de vector cocleato (1,33% del volumen total del cultivo) que contenía 1,66 \mug de ADN, 16,6 \mug de lípido y 2,2 \mug de cocleatos de proteína a 37ºC durante 12 horas. Seguidamente, las células se cultivaron inmediatamente en placa en Methocult HC (Stem Cell Tech, Vancouver) con G418 con el fin de medir la capacidad de las células madre de expresar el gen marcador neo transferido y formar colonias. Un intervalo probable de condiciones útiles de transducción incluiría 40.000 células diana en 200 \mul de medio incubado en presencia de una suspensión de vector cocleato consistente en cantidades comprendidas entre 0,1 \mug de ADN, 1,0 \mug de lípido y 0,13 \mug de proteína y 10 \mug de ADN, 100 \mug de lípido y 13 \mug de proteína. Puede modificarse el número de células, de la misma manera que el volumen de suspensión de cocleato.
Inicialmente, se llevaron a cabo estudios de toxicidad sin selección de G418 con el fin de determinar el intervalo a utilizar de concentraciones de los cocleatos. Para 40.000 células en 200 \mul de medio, 25 \mul de suspensión de vector (8,3 \mug de ADN, 83,0 \mug de lípido, 11,0 \mug de proteína) y cantidades superiores mostraron algo de toxicidad, mientras que 15 \mul de suspensión de vector (5 \mug de ADN, 50 \mug de lípido y 6,6 \mug de proteína) y cantidades inferiores mostraron una toxicidad mínima o nula. A continuación se muestran los resultados de los experimentos de transferencia génica llevados a cabo con las formulaciones anteriormente indicadas.
Experimento de transferencia génica 1
Células CD34^{+} de sangre de cordón neonatal en 1 mg/ml de G418
Tipo cocleato Colonias/30 campos*
Sin cocleatos 20
Solo cocleatos CWRSVN 23
Cocleatos CWRSVN/Rep 68 26
Cocleatos CWRSVN/Rep 78 27
Cocleatos CWRSVN/Rep 68 y Rep 78 38
*media de dos placas
Experimento de transferencia génica 2
2
Experimento de transferencia génica 3
3
Experimento de transferencia génica 4
4
Conclusiones de los experimentos de transferencia génica
Estos resultados demuestran que un vector génico flanqueado por los RTIs del AAV y formulado con las proteínas Rep 68 y Rep 78 y cocleatos pueden transferir un gen marcador capaz de ser expresado durante 10 a 14 días en cultivo en células hematopoyéticas formadoras de colonia. Tanto el RTI del AAV como las proteínas Rep contribuyen a la eficiencia de este proceso. Dicho proceso es aproximadamente cinco veces más eficiente que la transferencia génica mediante un vector retroviral estándar en ausencia de estimulación con citoquinas. Aunque los protocolos de transferencia génica retrovirales estándar que utilizan la estimulación con citoquinas resultan en una transferencia génica más eficiente tras tres días de estimulación in vitro (ver Experimento 3), las dianas transducidas presentan una capacidad reducida de repoblación a largo plazo.
Ejemplo 4 Tratamiento de células hematopoyéticas progenitoras genéticamente anormales con genes terapéuticos utilizando vectores integrativos lípido-ADN.
Puede utilizarse un vector génico terapéutico flanqueado por los RTIs del AAV y co-empaquetarse con las proteínas Rep 68 y Rep 78 en un cocleato para la transfección y tratamiento de células hematopoyéticas progenitoras genéticamente anormales incluyendo las células madre. Los ejemplos de genes terapéuticos y el trastorno hematopoyético con el que están asociados incluyen un gen normal de la betaglobina que se expresará en glóbulos rojos de la sangre para corregir la beta-talasemia o la anemia de células falciformes, un gen normal para la adenosina desaminasa que se expresará en linfocitos para corregir algunas formas de inmunodeficiencia combinada severa, genes normales p47 y p67 phox (oxidasa fagocítica) que se expresarán en células fagocíticas para corregir la enfermedad granulomatosa crónica y un gen que codifica ARN antisentido contra un oncogen transformante que contribuye a la leucemia o a linfoma, tal como anti-myc en el linfoma de Burkitt.
Ejemplo 5 Factores biológicamente activos circulantes naturales o sintéticos para la sustitución, corrección o modulación de las rutas metabólicas
Puede utilizarse un vector génico terapéutico flanqueado por los RTIs del AAV y coempaquetado con las proteínas Rep 68 y Rep 78 en un cocleato para la transfección transitoria o estable con el fin de sustituir, corregir o modular funciones en rutas metabólicas. Esto puede conseguirse mediante la transfección de una diversidad de tipos celulares dependiendo de la aplicación, tal como el pulmón, la piel y el hígado. Entre los ejemplos de genes terapéuticos y el trastorno sanguíneo con el que se asocian se incluyen un gen normal para el inhibidor C1 (proteína complemento) en el tratamiento del edema angioneurótico hereditario, un gen normal para el factor de coagulación en el tratamiento de la hemofilia y un gen normal para la insulina en el tratamiento de la diabetes.
Ejemplo 6 Tratamiento de las células tumorales con genes terapéuticos utilizando vectores integrativos lípido-ADN
Puede utilizarse un vector génico terapéutico flanqueado por los RTIs del AAV y coempaquetado con las proteínas Rep 68 y Rep 78 en un cocleato para la transfección y tratamiento de las células tumorales. Entre los ejemplos de genes terapéuticos y el efecto que presentaría el gen expresado se incluyen un gen regulador normal para restaurar el crecimiento controlado, tal como p53 y el retinoblastoma, y un gen normal para una proteína o ARN que regula la expresión de otros genes alterados o sobreexpresados que sean responsables del comportamiento oncogénico o metastásico, tales como ras, myc, ligando fas y receptores de superficie.
Ejemplo 7 Protocolo de formulación para los vectores integrativos proteína/ADN procarióticos y eucarióticos en estructuras de bicapa lipídica en capas Protocolo general para la formulación de vectores integrativos lípido-ADN procarióticos y eucarióticos
1.
Añadir plásmidos en tampón dentro de tubos apropiados.
2.
Añadir proteínas integrativas en tampón a tubos apropiados que contenga ADN.
3.
Incubar a temperatura ambiente durante una hora.
4.
Secar el lípido en tubos separados.
5.
Añadir tampón a los lípidos (por ejemplo, una cantidad suficiente para preparar 0,33 mg/ml de ADN tras la adición).
6.
Agitar con vórtex para resuspender los lípidos.
7.
Sonicar para reducir el tamaño de los liposomas.
8.
Añadir tampones que contengan ADN y proteínas a los lípidos.
9.
Insuflar nitrógeno en los tubos para sustituir el aire.
10.
Agitar brevemente con vórtex.
11.
Añadir calcio soluble gradualmente bajo agitación suave para mezclar.
12.
Almacenar a 4ºC.
Puede modificarse la formulación del vector cambiando la proporción entre proteínas de unión a ADN y el ADN. Otras estructuras integrativas proteína/ADN que pueden utilizarse son los elementos transponibles entre organismos procarióticos y eucarióticos que incluyen bacterias, levaduras, virus, células animales y células vegetales. Entre los ejemplos de elementos transponibles se incluyen las retrotransposasas y sus sustratos secuencias procedentes de ADN de retrotransposones de proteínas transposasa de levadura, bacterianas o de bacteriófago y sus secuencias sustrato, e integrasas retrovirales y las secuencias de repetición terminal larga (RTL) a las que se unen, catalizando la integración en los cromosomas de la célula huésped (por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous o VIH-1 ó VIH-2).

Claims (25)

1. Estructura de vector de liberación que comprende:
a) una composición cocleato que comprende una estructura de bicapa lipídica, elementos lipídicos individuales que contienen un grupo principal cargado negativamente y cationes;
b) proteínas que facilitan la integración de una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de una célula diana en la que las proteínas comprenden tanto Rep 68 como Rep 78 y
c) un polinucleótido que comprende una o más secuencias de ADN reconocidas por una o más proteínas que facilitan la integración de secuencias nucleotídicas y uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos, conteniendo cada uno una secuencia nucleotídica terapéutica que expresa una molécula terapéuticamente beneficiosa.
2. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que el polinucleótido se selecciona de entre el grupo que consiste en un plásmido o constructo de ácido nucleico.
3. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que la estructura no incluye un polinucleótido que expresa una o más proteínas que facilitan la integración.
4. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que el catión es un catión divalente.
5. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que el catión es calcio.
6. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que una o más secuencias de ADN reconocidas por una o más proteínas de unión son las regiones de repetición terminal invertida de virus adenoasociado.
7. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos comprenden un segmento de ADN que está flanqueado en cada extremo por como mínimo una de las regiones de repetición terminal invertida.
8. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que la célula diana es una célula humana.
9. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 1, en la que la célula diana es una célula madre pluripotente.
10. Estructura de vector de liberación para liberar en el interior de una célula diana una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas y una o más proteínas que se unen a ADN para facilitar la integración de una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas en el genoma de la célula huésped, comprendiendo la estructura de vector de liberación:
a) un cocleato que comprende un elemento de bicapa lipídica en el que las capas del elemento de bicapa lipídica están unidas entre sí mediante un catión divalente de calcio;
b) una proteína de unión a ADN del virus adenoasociado de tipo II que comprende una proteína Rep 68 y una proteína Rep 78; y
c) un polinucleótido que comprende una o más regiones de repetición terminal invertida de virus adenoasociado de tipo II y uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos, conteniendo cada uno una secuencia nucleotídica terapéutica que expresa una molécula terapéuticamente beneficiosa.
11. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 10, en la que el polinucleótido se selecciona de entre el grupo que consiste en un plásmido o constructo de ácido nucleico.
12. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 10, en la que uno o más oligonucleótidos o polinucleótidos comprende un segmento de ADN que está flanqueado en cada extremo por como mínimo una de las regiones de repetición terminal invertida.
13. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 10, 11 ó 12, en la que la estructura no incluye un polinucleótido que expresa una o más proteínas que facilitan la integración.
14. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 10, en la que la célula humana es una célula humana.
15. Estructura de vector de liberación según la reivindicación 10, en la que la célula diana es una célula madre pluripotente.
16. Composición farmacéutica que comprende una estructura de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.
17. Procedimiento in vitro para la transformación de una célula diana con una o más secuencias nucleotídicas terapéuticas, comprendiendo el procedimiento la transfección de una célula diana in vitro con una estructura de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
18. Estructura de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su utilización en un procedimiento destinado al tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y/o procedimientos diagnósticos aplicados sobre el cuerpo humano o animal.
19. Utilización de estructura de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de una composición de utilización en un procedimiento destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y/o en un procedimiento diagnóstico aplicado sobre el cuerpo humano o animal.
20. Utilización según la reivindicación 19, en la que el procedimiento implica la etapa de transfectar células diana en cultivo y una etapa de introducir las células transfectadas en un cuerpo humano o animal.
21. Utilización según la reivindicación 20, en la que dicha célula diana es una célula humana.
22. Utilización según la reivindicación 21, en la que la célula diana humana es una célula madre pluripotente.
23. Utilización según la reivindicación 22, en la que el procedimiento se lleva a cabo en ausencia de estimulación con citoquinas.
24. Procedimiento para la producción de la estructura de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende las etapas siguientes:
a. introducir un vector de ADN en tampón en tubos apropiados;
b. introducir una proteína integrativa en tampón en tubos apropiados que contiene un vector de ADN;
c. incubar a temperatura ambiente durante una hora;
d. secar un lípido en un tubo separado;
e. introducir un tampón en el lípido a un volumen en el que al mezclar con el tampón que contiene el vector, una solución final contenga el vector de ADN a una concentración de 0,33 mg/ml;
f. mezclar con vórtex para suspender el lípido en una forma liposomal;
g. sonicar para reducir el tamaño del liposoma;
h. después introducir el tampón que contiene el vector de ADN y la proteína en el tubo que contiene el tampón que contiene lípido;
i. insuflar nitrógeno en el tubo de (h) para sustituir el aire;
j. mezclar brevemente el tubo con vórtex;
k. después, añadir gradualmente calcio soluble como catión en el tubo de (j) bajo agitación suave para mezclar y para formar un cocleato que comprende un elemento de bicapa lipídica y el catión y que comprende además la proteína integrativa y el vector; y
l. almacenar la proteína integrativa, vector-cocleato a 4ºC.
25. Procedimiento para la producción de la estructura de vector de liberación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que comprende las etapas siguientes:
(a) incubar un vector de ADN y una o más proteínas integrativas en tampón para formar complejo de vector ADN-proteína integrativa;
(b) mezclar el complejo de vector ADN-proteína integrativa con una suspensión de liposomas; y
(c) añadir catión para formar un cocleato de vector ADN-proteína integrativa.
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